ES2645869T3 - Generación y mantenimiento de células madre - Google Patents

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Abstract

Un método de cultivo de células pluripotentes humanas, en donde las células pluripotentes humanas son células madre pluripotentes inducidas (hiPSC) o células madre embrionarias humanas (hESC), por medio de al menos una división celular, comprendiendo el método el cultivo de células en presencia de una cantidad suficiente de: a) un inhibidor de ALK5; b) un inhibidor de MEK; c) un inhibidor de GSK3ß; d) un factor inhibidor de leucemia (LIF); y e) nutrientes suficientes durante un tiempo suficiente, para permitir al menos una división celular mientras se mantiene la pluripotencia celular.

Description

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DESCRIPCION
Generacion y mantenimiento de celulas madre Antecedentes de la invencion
Aunque las celulas madre embrionarias (ESC) se han establecido a partir de ratones desde 1981, los intentos de obtener sus homologos de otros mairnferos, incluidas las ratas, no han tenido exito. Recientemente, se obtuvieron celulas madre pluripotentes de la etapa de cilindro de huevo despues de la implantacion de Epiblastos de raton y rata (Brons et al., Nature 448, 191-195 (2007); Tesar et al., Nature 448, 196-199 (2007)). Estas nuevas celulas madre fueron denominadas celulas madre de Epiblasto (EpiSC). Las EpiSC parecen corresponder muy estrechamente a las celulas madre embrionarias humanas (hESC) en la morfologfa de la colonia y en los requerimientos de cultivo/senalizacion para el mantenimiento de la pluripotencia, pero muestran una gama de diferencias significativas de respuesta fenotfpica y de senalizacion de las celulas ES de raton (mESC).
El factor inhibidor de leucemia (LIF) es esencial para mantener la pluripotencia de las mESC en presencia de suero a traves de la ruta JAK-STAT3 (Niwa et al., Genes Dev 12, 2048-2060 (1998)). Sin embargo, en medio libre de suero, tambien se requiere BMP4, junto con LIF, para sostener la auto-renovacion de las mESC induciendo la expresion de la protema de inhibicion de la diferenciacion (Id) (Ying et al., Cell 115, 281-292 (2003)) e inhibiendo la activacion de ERK (Qi et al., Proc Natl Acad Sci USA 101, 6027-6032 (2005)). A diferencia de las mESC, LIF no puede soportar las EpiSC/hESC, que tfpicamente requieren factor de crecimiento de fibroblastos basico (bFGF)/Activina A para la auto-renovacion a largo plazo. Las hESC indiferenciadas muestran una actividad basal de alto nivel de ERK a traves de la senalizacion de bFGF (Dvorak et al., Stem Cells 23, 1200-1211 (2005)). BMP4 no apoya la auto-renovacion de EpiSC/hESC tampoco, sino que induce a que las EpiSC/hESC se diferencien en trofoblastos o endodermo primitivo (Brons et al., Nature 448, 191-195 (2007), Tesar et al., Nature 448, 196-199 (2007); Xu et al., Nat Biotechnol 20, 1261-1264 (2002)). Ademas de bFGF, se ha demostrado que la senalizacion de Activina A/Nodal apoya el estado indiferenciado de las hESC/EpiSC (Brons et al., Nature 448, 191-195 (2007); Sato et al., Dev Biol 260, 404-413 (2003); Tesar et al., Nature 448, 196-199 (2007)), mientras que es dispensable para las mESC. Estos resultados apoyan firmemente la nocion de que las EpiSC y las hESC son intrmsecamente similares y plantean una hipotesis atractiva acerca de que las mESC y las EpiSC/hESC representan dos estados pluripotentes distintos: el estado de tipo mESC que representa la masa celular interna (MCI) pre-implantacion y el estado de tipo EpiSC que representa celulas epiblasticas tardfas, respectivamente.
Las mESC se pueden obtener usualmente de ciertas cepas de raton utilizando condiciones de cultivo celular basadas en capas alimentadoras (Martin, G. R., Proc Natl Acad Sci USA 78, 7634-7638 (1981)). Sin embargo, se ha demostrado que es diffcil obtener celulas ES autenticas de ratas en condiciones similares. Se ha descrito el establecimiento de celulas de tipo ESC de rata (Demers et al., Cloning Stem Cells 9, 512-522 (2007); Ruhnke et al., Stem Cells 21, 428-436 (2003); Schulze et al., Methods MoI Biol 329, 45-58 (2006); Ueda et al., PLoS ONE 3, e2800 (2008)), pero estas celulas tampoco podfan mantenerse establemente o caredan de verdadera pluripotencia in vivo (p. ej., no logran formar teratoma o contribuyen nada/poco al quimerismo). De forma similar, aunque se habfan obtenido EpiSC de rata pluripotentes (in vitro), las EpiSC tanto de rata como de raton muestran poca o ninguna capacidad de ser reincorporadas al embrion antes de la implantacion y contribuir a las quimeras (Brons et al., Nature 448, 191-195 (2007); Tesar et al., Nature 448, 196-199 (2007)).
Recientemente, las celulas madre pluripotentes inducidas (iPSC) generadas a partir de celulas somaticas tanto de raton como humanas mediante transduccion genetica definida han atrafdo un enorme interes (Dimos et al., Science 321, 1218-1221 (2008); Han, J. y Sidhu, K. S Curr Stem Cell Res Ther 3, 66-74 (2008); Takahashi et al., Cell 131, 861-872 (2007); Takahashi, K., y Yamanaka, S., Cell 126, 663-676 (2006); Yu et al., Science 318, 1917-1920 (2007)).
Breve compendio de la invencion
La presente invencion proporciona metodos para cultivar celulas pluripotentes humanas a traves de al menos una celula divisional. Las celulas pluripotentes humanas son celulas madre pluripotentes inducidas (hiPSC) o celulas madre embrionarias humanas (hESC). Los metodos comprenden cultivar celulas pluripotentes humanas en presencia de una cantidad suficiente de:
a. un inhibidor de ALK5, y
b. un inhibidor de MEK, y
c. un inhibidor de GSK3p, y
d. Factor inhibidor de leucemia (LIF); y
e. nutrientes suficientes durante un tiempo suficiente, para permitir al menos una division celular mientras se mantiene la pluripotencia celular.
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En algunas realizaciones, el inhibidor de GSK3p es CHIR99021.
En algunas reallizaciones, el inhibidor de MEK es PS0325901.
En algunas realizaciones, el inhibidor de ALK5 es A-83-01. En algunas realizaciones, el inhibidor de ALK5 es SB431542.
En algunas realizaciones, las celulas pluripotentes se cultivan a traves de al menos cinco divisiones celulares manteniendo al mismo tiempo la pluripotencia celular.
En algunas realizaciones, el metodo comprende adicionalmente la introduccion de un acido nucleico heterologo en las celulas pluripotentes y el cultivo de las celulas resultantes para permitir al menos una division celular adicional mientras se mantiene la pluripotencia. En algunas realizaciones, se introduce un acido nucleico heterologo en celulas animales, despues se induce la pluripotencia, y a continuacion se someten a la etapa de cultivo.
La celula es una celula humana.
En algunas realizaciones, las celulas pluripotentes son celulas madre embrionarias. En algunas realizaciones, las celulas pluripotentes son celulas madre pluripotentes inducidas.
La presente invencion tambien proporciona cultivos de celulas humanas pluripotentes. Los cultivos comprenden una cantidad suficiente de:
a. LIF, y
b. un inhibidor de ALK5, y b. un inhibidor de MEK, y d. un inhibidor de GSK3p;
para permitir al menos una division celular mientras se mantiene la pluripotencia celular.
En algunas realizaciones, el inhibidor de GSK3p es CHIR99021.
En algunas realizaciones, el inhibidor de MEK es PD0325901.
En algunas realizaciones, el inhibidor de ALK5 es A-83-01. En algunas realizaciones, el inhibidor de ALK5 es SB431542.
La celula es una celula humana. Las celulas son celulas madre pluripotentes inducidas o celulas madre embrionarias.
La presente invencion tambien proporciona un medio de cultivo celular que comprende una cantidad suficiente de:
a. LIF, y
b. un inhibidor de ALK5, y
c. un inhibidor de MEK, y
d. un inhibidor de GSK3p;
para permitir al menos una division celular mientras se mantiene la pluripotencia celular cuando se cultivan celulas humanas pluripotentes en el medio, en donde las celulas pluripotentes humanas son celulas madre pluripotentes inducidas o celulas madre embrionarias humanas.
En algunas realizaciones, el inhibidor de GSK3p es CHIR99021.
En algunas realizaciones, el inhibidor de MEK es PD0325901.
En algunas realizaciones, el inhibidor de ALK5 es A-83-01. En algunas realizaciones, el inhibidor de ALK5 es SB431542.
En algunas realizaciones, el medio esta en un envase sellado envasado previamente. En algunas realizaciones, el medio comprende DMEM u otros medios compatibles para el crecimiento de celulas humanas, de rata, de raton u otras celulas animales.
La presente invencion tambien proporciona celulas animales pluripotentes aisladas que replican y mantienen la pluripotencia en presencia de factor inhibidor de leucemia (LIF) y protema morfogenica osea (BMP), o bajo inhibicion de la ruta de senalizacion de TGFp y activina, inhibicion de la ruta de senalizacion de MAPK, y opcionalmente
inhibicion de la ruta de FGF. La celula animal pluripotente aislada puede no ser una celula madre embrionaria murina (mESC). La celula puede ser una celula humana. La celula puede ser una celula madre embrionaria humana. La celula puede ser una celula iPS humana. La celula puede ser una celula de rata. La celula puede ser una celula madre embrionaria de rata. La celula puede ser una celula iPS de rata. La celula puede mantener la pluripotencia 5 bajo la inhibicion de ALK5 y MEK. La celula puede comprender un casete de expresion heterologo, que incluye pero no se limita a un casete de expresion que codifica un marcador seleccionable o detectable (p. ej., fosfatasa alcalina).
La celula pluripotente aislada expresa un nivel mas alto de E-cadherina en comparacion con hESC cultivadas convencionalmente, celulas madre de epiblastos y celulas pluripotentes inducidas humanas. Por ejemplo, la celula animal pluripotente aislada expresa un nivel 2 veces mayor de E-cadherina en comparacion con hESC, EpiSC y 10 celulas pluripotentes inducidas humanas cultivadas convencionalmente. La celula animal pluripotente aislada puede expresar un nivel mas alto de marcadores en comparacion con hESC, celulas madre de epiblastos y celulas pluripotentes inducidas humanas cultivadas convencionalmente, en donde los marcadores incluyen Gbx2, Dppa3, Klf4, y Rex 1.
La celula pluripotente aislada de la presente descripcion se puede cultivar en presencia de un inhibidor de ALK5, un 15 segundo compuesto seleccionado entre un inhibidor de MEK, un inhibidor de Erk, un inhibidor de p38 y un inhibidor del receptor de FGF. La celula pluripotente aislada de la presente descripcion se puede obtener o es obtenible cultivando una celula en presencia de un inhibidor de ALK5, y un segundo compuesto seleccionado entre uno o mas de un inhibidor de MEK, un inhibidor de Erk, un inhibidor de p38, y un inhibidor del receptor de FGF. Por ejemplo, la celula pluripotente aislada de la presente descripcion se obtiene o es obtenible cultivando hESC, EpiSC, eSc de 20 rata, o ESC de primate cultivadas convencionalmente.
La presente invencion tambien proporciona metodos para aumentar la pluripotencia de una celula de mairnfero parcialmente pluripotente a una celula plenamente pluripotente. Los metodos comprenden,
(a) poner en contacto la celula parcialmente pluripotente con un modificador epigenetico seleccionado entre un inhibidor de histona desacetilasa, un inhibidor de desmetilacion de histona H3K4 o un activador de la metilacion de
25 H3K4;
(b) despues de la etapa (a), cultivar la celula con (i) un inhibidor de ALK5, (ii) un inhibidor de MEK, y (iii) un inhibidor del receptor de FGF, y (iv) LIF y en ausencia del modificador epigenetico, generando de ese modo una celula mas plenamente pluripotente en comparacion con la celula de mamffero parcialmente pluripotente.
En algunas realizaciones, los metodos comprenden adicionalmente
30 (c) cultivar la celula de mamffero parcialmente pluripotente despues de la etapa (b) con un inhibidor de GSK3.
En algunas realizaciones, las etapas de cultivo (a) y/o (c) comprenden adicionalmente el cultivo de la celula de mamffero parcialmente pluripotente en presencia de factor inhibidor de leucemia (LIF).
La celula parcialmente pluripotente es una celula madre de Epiblasto (EpiSC).
En algunas realizaciones, la celula parcialmente pluripotente no expresa al menos un marcador seleccionado del 35 grupo que consiste en Oct4, Nanog, SSEA-I y REX-I y la celula mas plenamente pluripotente expresa uno o mas o todos los marcadores.
En algunas realizaciones, la celula parcialmente pluripotente no expresa ALP-1 y la celula mas plenamente pluripotente expresa ALP-1.
En algunas realizaciones, el modificador epigenetico es acido valproico o parnate.
40 Breve descripcion de los dibujos
Figura 1. Se podnan generar riPSC de tipo mESC a partir de celulas WB-F344 de rata despues de transducirlas con Oct4, Sox2 y Klf4 por medio de retrovirus y capturarlas/mantenerlas combinadas con LIF, PD0325901 0,5 pM, A-83- 01 0,5 |jM, y CHIR99021 3 pM. Las colonias de tipo ESC se observaron 10 dfas despues de la transduccion (A), pero no se pudieron mantener en las condiciones de cultivo de mESC convencionales (B). En presencia de
45 PD0325901 0,5 pM y CHIR99021 3 pM, las riPSC se pueden mantener a corto plazo en cultivo pero muestran una
intensa diferenciacion espontanea (C). Con la combinacion de PD0325901 0,5 pM, CHIR99021 3 pM y A-83-01 0,5 pM, las riPSC se pueden auto-renovar a largo plazo y homogeneamente (D) y formar colonias abovedadas de tipo mESC en cultivo (E). La inmunocitoqmmica revelo que las riRPSC expresan marcadores de ESC tfpicos, tales como Oct4 (F), Sox2 (G), SSEA-I (H, Green) y Nanog (H, rojo). El analisis por RT-PCR de cuatro lmeas de riPSC clonales
50 confirmo la expresion de marcadores de pluripotencia tfpicos endogenos (I), pero los genes transducidos viralmente
se silenciaron en gran parte. El promotor Oct4 de clones riPSC exhibio un patron de desmetilacion y es distinto del de las celulas parentales WB-F344 (J).
Figura 2. Las riPSC tienen un potencial de desarrollo pluripotente in vitro e in vivo. La inmunotincion mostro que las riPSC se podfan diferenciarin vitro en derivados de endodermo (Albumina y Pdxl) (Ay B), neuroectodermo (tubulina
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plll, Tujl) (C) y mesodermo (Brachyury) (D). Asimismo, las riPSC pueden formar teratoma en ratones SCID, que consiste en las tres capas germinales (EH). Adicionalmente, despues de ser inyectadas en blastocistos de rata Brown-Norway, las riPSCs con fondo de WB F344 eran capaces de producir ratas quimericas (I). Aumento relativo: A~E (100x), F~H y J~Q (200x).
Figura 3. Generacion de hiPSC "de tipo mESC" novedosas. Los fibroblastos humanos IMR90 se transdujeron con Oct4, Sox2, Nanog y Lin28 por medio de lentivirus. Las colonias de hiPSC se observaron tres semanas despues de la transduccion (A), se recogieron a la cuarta semana despues de la transduccion y se mantuvieron establemente en un coctel de hLlF, PD0325901 0,5 pM, A-83-01 0,5 pM y CHIR99021 3 |jM. Tales hiPSC formaron colonias abovedadas similares a mESC (B). Bajo tales condiciones, las hiPSC eran positivas para ALP (C) y otros marcadores de pluripotencia tfpicos (D-I). El analisis por RT-PCR de cuatro lmeas clonales de hiPSC confirmo la expresion de genes de pluripotencia endogenos (J), pero los genes transducidos viralmente se silenciaron en gran parte. El promotor Oct4 de los clones de hiPSC exhibio un patron de desmetilacion similar a las celulas ES humanas cultivadas convencionalmente, pero es distinto del de los fibroblastos parentales IMR90 (K). Se proporciona un analisis del cariotipo de las hiPSC (L).
Figura 4. La inmunotincion mostro que las hiPSC se podnan diferenciar eficazmente a derivados de endodermo (Albumina) (A), neuroectodermo (tubulina plll, Tujl) (B) y mesodermo (Brachyury) (C) in vitro. Despues de trasplantarlas a los ratones SCID, las hiPSC podfan formar teratoma, que consistfa en las tres capas germinales incluyendo la estructura de tipo neuroepitelio (ectodermo) (D), estructura de tipo tubular (endodermo) (D), estructura de tipo cartflago (mesodermo) E). Aumento relativo: A (100X), B~E (200X).
Figura 5. Efectos de diferentes combinaciones de moleculas pequenas sobre el mantenimiento de la pluripotencia de las riPSC en cultivo. Las riPSC se trataron con tripsina en celulas individuales y se sembraron en placas de 6 pocillos a una densidad de 103 celulas por pocillo y se trataron con diferentes combinaciones de inhibidores. Cinco dfas despues, se realizo la tincion con ALP para visualizar las colonias de riPSC (A). Las colonias positivas para ALP para cada condicion se contaron a partir de diez campos visuales aleatorios 40 x y el numero relativo de colonias se resumio en B.
Figura 6. Las EpiSC se diferencian en condiciones de crecimiento de mESC y no se convierten facilmente en un estado de tipo MCl/mESC. (A) Las ESC R1 murinas crecieron como colonias compactas y abovedadas en medio de crecimiento de mESC convencional con un suplemento de LIF, y las colonias mostraron actividad positiva para ALP (superior izquierda). Las EpiSC crecieron como colonias grandes y planas en medio de cultivo de hESC convencional con un suplemento de bFGF, y las colonias mostraron actividad negativa para ALP (arriba a la derecha). Las EpiSC se diferenciaron en medio de crecimiento de mESC convencional con un suplemento de LIF (parte inferior izquierda); las EpiSC se diferenciaron en medio de crecimiento de mESC convencional con un suplemento de LIF e inhibidor de MEK PD0325901 0,5 pM, inhibidor de FGFR PD173074 0,1 pM e inhibidor de GSK3 CHIR99021 3 |jM (m/MFGi) (abajo a la derecha). (B) Esquema para la generacion de celulas convertidas. Las EpiSC se trataron con tripsina en celulas individuales y se cultivaron en placa sobre celulas alimentadoras bajo la condicion de auto-renovacion de mESC con suplementos de los compuestos qmmicos indicados durante aproximadamente 4 dfas para inducir la conversion, seguido de otros 4 dfas de seleccion. El cultivo se volvio a cultivar en placa con posterioridad y se selecciono y se expandio adicionalmente durante otras dos semanas, tiempo durante el cual se escogieron los clones estables. (C) La inhibicion de la senalizacion de TGFp por un inhibidor selectivo de ALK4/5/7 A-83-01 (0,5 pM) indujo la formacion por parte de las EpiSC de colonias mas compactas y abovedadas que expresaban ALP. (D) Estas colonias se pudieron expandir aun mas de forma estable en medio de crecimiento de mESC con un suplemento de LIF y A-83-01 0,5 pM, PD0325901 0,5 pM, PD173074 0,1 pM y CHIR99021 3 pM (mAMFGi). (E) El inhibidor de LSD parnate indujo la formacion por parte de las EpiSC de colonias mas compactas y abovedadas que expresaban ALP. Estas colonias pudieron expandirse aun mas establemente en condiciones mMFGi o (F) mAMFGi. Observense las colonias abovedadas tipo mESC y las actividades positivas para ALP. Barra de escala, 50 pm.
Figura 7. Las EpiSC se convierten en un estado de tipo MCI/mESC por medio de tratamiento con parnate e inhibidores de ALK4/5/7, MEK, FGFR y GSK3. (A) Eficacia en la produccion de quimerismo a partir de tres tipos de celulas tratadas con compuestos. (B) Las celulas de tipo mESC estables convertidas a partir de EpiSC por la condicion de parnate/mAMFGi contribuyeron al quimerismo en ratones adultos despues de que los embriones agregados se trasplantaran a ratones pseudo-prenados. El color de la capa Agouti se origino a partir de las celulas Parnate/mAMFGi. (C) Genotipificacion por PCR para determinar la presencia de la integracion de GFP en multiples tejidos adultos. (D) Se examino un embrion E13.5 mediante fluorescencia para determinar la contribucion de las celulas parnate/mAMFGi que se habfan marcado con GFP, y se observaron celulas positivas para GFP en multiples tejidos del embrion (se muestran imagenes de mayor aumento en la Figura 10A). (E) Las celulas dobles positivas para GFP/SSEA-1 en la gonada fueron aisladas por medio FACS y examinadas por medio de PCR en tiempo real para los marcadores de la lmea germinal. Los resultados demostraron la expresion espedfica de los marcadores de la lmea germinal Blimpl y Stella en el linaje de la lmea germinal que contribrna a las celulas Parnate/mAMFGi. Barra. ± DT.
Figura 8. Caracterizaciones moleculares de las celulas Parnate/mAMFGi convertidas. (A) La inmunocitoqmmica mostro una expresion homogenea de marcadores de pluripotencia, Oct4 (Verde), Nanog (Rojo) y SSEA-I (Rojo) en
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celulas Parnate/mAMFGi. (B) Expresion de genes marcadores MCI espedficos (Rex-1, Pecaml, Dax 1, Dppa5, Esrrb, Fgf4 y Fbxol5), los genes marcadores asociados a competencia de lmeas germinales (Stella y Stra8) y gen de Epiblasto (fgf5) en mESC, EpiSC, y las celulas parnate/mAMFGi se analizaron mediante RT-PCR semicuantitativa. Se utilizo GADPH como control. (C) El analisis de transcriptoma de mESC, EpiSC y celulas parnate/mAMFGi mostro que las celulas Parnate/mAMFGi son mucho mas similares a las mESC que las EpiSC. Se utilizaron dos replicas biologicas para los tres tipos de celulas. (D) Analisis de metilacion de promotores Stella y Fgf4 mediante secuenciacion genomica con bisulfito. Los drculos abiertos y cerrados indican CpG no metilados y metilados, respectivamente. (E) Analisis ChIP-QPCR de las modificaciones de histonas indicadas en el locus stella en varias celulas. Los ADN genomicos se inmunoprecipitaron a partir de EpiSC, Rl-mESC y celulas Parnate/mAMFGi cultivadas sin alimentacion, con anticuerpos como se indica, seguido de analisis de Q-PCr utilizando un conjunto de cebadores espedfico para el locus genomico endogeno que codifica Stella. Los niveles de las modificaciones de histonas se representaron como porcentaje de entrada. La IgG sirvio como control sin anticuerpos.
Figura 9. Caracterizacion funcional de las celulas Parnate/mAMFGi convertidas. (A) Las celulas Parnate/mAMFGi tienen una tasa de crecimiento similar a la de las mESC. Las celulas R1-mESC y Parnate/mAMFGi se pasaron cada 3 dfas, y se conto el numero de celulas cada 24 h. (B) Las celulas Parnate/mAMFGi se pueden diferenciar eficazmente in vitro a celulas de las tres capas germinales, incluyendo celulas neuronales caractensticas (positivas para tubulina plll y MAP2ab), cardiomiocitos (positivos para troponina cardiaca y MHC) y celulas endodermicas (positivas para Sox 17 o Albumina). Los nucleos se tineron con DAPI. (D) La BMP4 tiene un efecto diferencial sobre la induccion de la expresion del marcador de mesodermo (Brachyury), el marcador de trofoblastos (Cdx2) y el marcador de endodermo primitivo (Gata6) en las EpiSC, mESC y celulas parnate/mAMFGi. (E) La diferenciacion de cardiomiocitos por etapas dirigida en condiciones monocapa y qmmicamente definidas demostro que las celulas Parnate/mAMFGi comparten una respuesta de diferenciacion similar a la de las Rl-mESC y son diferentes de las de las EpiSC. Las celulas se caracterizaron con tincion CT3 y fenotipo de latido.
Figura 10. Las celulas Parnate/mAMFGi contribuyeron eficazmente a ratones quimericos. (A) Tejidos de embriones quimericos. Se observaron celulas positivas para GFP aportadas a partir de celulas de Parnate/mAMFGi en gonadas, cerebro, corazon, intestino, pulmon y rinon. (B) Genotipificacion GFP de ratones adultos quimericos. Se recolectaron al azar cinco ratones, y se analizo la integracion de GFP en cinco diferentes tejidos, a saber, corazon, pulmon, dgado, cerebro y bazo, por medio de PCR genomica. La deteccion positiva de la integracion de GFP en los cinco tejidos de 2 ratones adultos, en cuatro tejidos de 3 ratones, confirmo que las celulas parnate/mAMFGi podnan contribuir a las tres capas germinales (mesodermo, endodermo y ectodermo) in vivo.
Figura 11. Expresion homogenea de marcadores de pluripotencia en celulas parnate/mAMFGi convertidas bajo celulas alimentadoras o condiciones de cultivo libres de alimentadores. (A) Las celulas parnate/mAMFGi se marcaron con GFP, y se propagaron sobre alimentadores. Los resultados de inmunotincion mostraron una expresion homogenea de GFP y marcadores de pluripotencia Oct4 (Rojo), Nanog (Rojo) y SSEA-1 (Rojo). (B) Las colonias positivas para Oct4 no diferenciadas se desarrollaron a partir de celulas parnate/mAMFGi unicas tan eficazmente como a partir de celulas OG2-ES unicas. Las colonias se expandieron durante varios pases despues de la siembra de celulas individuales en una condicion libre de alimentadores y definida qmmicamente en N2B27. Barra de escala, 50 pm. (C) Las celulas Parnate/mAMFGi se diferenciaron y perdieron la expresion de Oct4 en ausencia de LIF. Las celulas Parnate/mAMFGi se expandieron despues de la siembra de celulas individuales en una condicion libre de alimentadoras y qmmicamente definida en N2B27; se indico el suplemento del factor de crecimiento.
Figura 12. La expresion de STELLA se detecto en celulas parnate/mAMFGi convertidas y celulas R1-mESC, pero no en EpiSC. Los resultados de inmunotincion mostraron la expresion de STELLA, y DAPI.
Definiciones
El termino "pluripotente" o "pluripotencia" se refiere a celulas con la capacidad de dar origen a una progenie que puede experimentar diferenciacion, en las condiciones apropiadas, a tipos celulares que muestran colectivamente caractensticas asociadas con linajes celulares de las tres capas germinales (endodermo, mesodermo y ectodermo). Las celulas madre pluripotentes pueden contribuir a muchos o a todos los tejidos de un animal prenatal, postnatal o adulto. Se puede utilizar una prueba convencional aceptada en la tecnica, tal como la capacidad para formar un teratoma en ratones SCID de 8-12 semanas de edad, para establecer la pluripotencia de una poblacion celular, sin embargo, la identificacion de diversas caractensticas de las celulas madre pluripotentes tambien se puede utilizar para detectar celulas pluripotentes. La pluripotencia celular es un continuo, que abarca desde la celula plenamente pluripotente que puede formar todas las celulas del embrion propiamente dicho, p. ej., las celulas madre embrionarias y las iPSC, hasta la celula incompleta o parcialmente pluripotente que puede formar celulas de las tres capas germinales pero que pueden no exhibir todas las caractensticas de las celulas plenamente pluripotentes, tales como, por ejemplo, la transmision de la lmea germinal o la capacidad de generar un organismo completo. En realizaciones particulares, la pluripotencia de una celula se incrementa desde una celula incompleta o parcialmente pluripotente a una celula mas pluripotente o, en ciertas realizaciones, una celula plenamente pluripotente. La pluripotencia se puede evaluar, por ejemplo, mediante la formacion de teratomas, la transmision de lmeas germinales y la complementacion de embriones tetraploides. En algunas realizaciones, se puede utilizar la expresion de genes de pluripotencia o marcadores de pluripotencia como se comenta en otra parte de la presente memoria para evaluar la pluripotencia de una celula.
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Las "caractensticas de las celulas madre pluripotentes" se refieren a las caractensticas de una celula que distingue las celulas madre pluripotentes de otras celulas. La capacidad de dar origen a una progenie que pueda experimentar diferenciacion, en las condiciones apropiadas, a tipos de celulas que colectivamente demuestran caractensticas asociadas con linajes celulares de las tres capas germinales (endodermo, mesodermo y ectodermo) es una caractenstica de las celulas madre pluripotentes. La expresion o la no expresion de ciertas combinaciones de marcadores moleculares son tambien caractensticas de las celulas madre pluripotentes. Por ejemplo, las celulas madre pluripotentes humanas expresan al menos algunos, y opcionalmente todos, los marcadores de la siguiente lista no limitante: SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81, TRA-2-49/6E, ALP, Sox2, E-cadherina, UTF-1, Oct4, Rex1 y Nanog. Las morfologfas celulares asociadas con celulas madre pluripotentes tambien son caractensticas de las celulas madre pluripotentes.
El termino "biblioteca" se utiliza de acuerdo con su uso comun en la tecnica, para designar una coleccion de moleculas, opcionalmente organizada y/o catalogada de tal manera que se puedan identificar miembros individuales. Las bibliotecas pueden incluir, pero no se limitan a, bibliotecas qrnmicas combinatorias, bibliotecas de productos naturales y bibliotecas de peptidos.
Un polinucleotido "recombinante" es un polinucleotido que no esta en su estado nativo, p. ej., el polinucleotido comprende una secuencia de nucleotidos no encontrada en la naturaleza, o el polinucleotido esta en un contexto distinto de aquel en el que se encuentra naturalmente, p. ej., separado de las secuencias de nucleotidos a las que se encuentra tfpicamente en proximidad en la naturaleza, o secuencias de nucleotidos adyacentes (o contiguas) a las que no esta proximo tfpicamente. Por ejemplo, la secuencia en cuestion se puede clonar en un vector, o se puede recombinar de otra manera con uno o mas acidos nucleicos adicionales.
"Casete de expresion" se refiere a un polinucleotido que comprende un promotor u otra secuencia reguladora conectada operativamente a una secuencia que codifica una protema.
Los terminos "promotor" y "secuencia de control de la expresion" se utilizan en la presente memoria para hacer referencia a una matriz de secuencias de control de acidos nucleicos que dirigen la transcripcion de un acido nucleico. Segun se utiliza en la presente memoria, un promotor incluye secuencias de acido nucleico necesarias cerca del sitio de inicio de la transcripcion, tal como, en el caso de un promotor del tipo de polimerasa II, un elemento TATA. Un promotor tambien incluye opcionalmente elementos potenciadores o represores distales, que pueden localizarse a varios miles de pares de bases del sitio de inicio de la transcripcion. Los promotores incluyen
promotores constitutivos e inducibles. Un promotor "constitutivo" es un promotor que es activo en la mayona de las
condiciones ambientales y de desarrollo. Un promotor "inducible" es un promotor que es activo bajo regulacion ambiental o de desarrollo. El termino "conectado operablemente" hace referencia a un conexion funcional entre una secuencia de control de la expresion del acido nucleico (tal como un promotor, o una matriz de sitios de union al
factor de transcripcion) y una segunda secuencia de acido nucleico, en donde la secuencia de control de la
expresion dirige la transcripcion del acido nucleico correspondiente a la segunda secuencia.
Una "secuencia heterologa" o un "acido nucleico heterologo", segun se utiliza en la presente memoria, es aquella que se origina a partir de una fuente foranea con respecto a la celula anfitriona particular, o, si es de la misma fuente, se modifica a partir de su forma original. De ese modo, un casete de expresion heterologo en una celula, es un casete de expresion que no es endogeno con respecto a la celula anfitriona particular, por ejemplo, que esta unido a secuencias de nucleotidos de un vector de expresion en lugar de a ADN cromosomico, que esta unido a un promotor heterologo, que esta unido a un gen informador, etc.
Los terminos "agente" o "compuesto de ensayo" se refieren a cualquier compuesto util en los analisis de seleccion descritos en la presente memoria. Un agente puede ser, por ejemplo, un compuesto organico, un polipeptido (p. ej., un peptido o un anticuerpo), un acido nucleico (p. ej., ADN, ARN, de doble hebra, de hebra sencilla, un oligonucleotido, ARN antisentido, ARN inhibidor pequeno, micro ARN, ribozima, etc.), un oligosacarido, un lfpido. Por lo general, los agentes utilizados en los presentes metodos de escrutinio tienen un peso molecular de menos de 10.000 dalton, por ejemplo, menos de 8000, 6000, 4000, 2000 dalton, p. ej., entre 50-1500, 500-1500, 200-2000, 500 -5000 dalton. El compuesto de ensayo puede estar en forma de una biblioteca de compuestos de ensayo, tal como una biblioteca combinatoria o aleatorizada que proporcione un intervalo suficiente de diversidad. Los compuestos de ensayo estan opcionalmente unidos a un companero de fusion, p. ej., compuestos de direccionamiento, compuestos de rescate, compuestos de dimerizacion, compuestos estabilizantes, compuestos direccionables y otros radicales funcionales. Convencionalmente, se generan nuevas entidades qrnmicas con propiedades utiles identificando un compuesto de ensayo (denominado "compuesto principal ") con alguna propiedad o actividad deseable, p. ej., capacidad para inducir pluripotencia bajo ciertas condiciones tales como las descritas en la presente memoria, creando variantes del compuesto principal y evaluando la propiedad y actividad de dichos compuestos variantes. A menudo, se emplean metodos de escrutinio de alto rendimiento (HTS) para dicho analisis.
Los terminos "acido nucleico" y "polinucleotido" se usan indistintamente en la presente memoria para referirse a desoxirribonucleotidos o ribonucleotidos y polfmeros de los mismos en forma de una hebra sencilla o doble. El termino abarca acidos nucleicos que contienen analogos de nucleotidos conocidos o restos o enlaces de la cadena principal modificados, que son sinteticos, de origen natural y no natural, quetienen propiedades de union similares a las del acido nucleico de referencia y que se metabolizan de una manera similar a la de los nucleotidos de
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referencia. Los ejemplos de tales analogos incluyen, sin limitacion, fosforotioatos, fosforamidatos, metilfosfonatos, metil-fosfonatos quirales, ribonucleotidos 2-O-metilados, acidos peptidonucleicos (PNA).
A menos que se indique lo contrario, una secuencia de acido nucleico particular tambien abarca las variantes conservativamente modificadas de la misma (p. ej., sustituciones de codones degenerados) y las secuencias complementarias, as^ como la secuencia explfcitamente indicada. Espedficamente, se pueden lograr sustituciones de codones degenerados generando secuencias en las que la tercera posicion de uno o mas (o todos) los codones seleccionados esta sustituida con residuos de base mixta y/o desoxiinosina (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19: 5081 (1991), Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260: 2605-2608 (1985); Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8: 91-98 (1994)).
Se utilizan "inhibidores", "activadores" y "moduladores" de la expresion o de la actividad para referirse a moleculas inhibidoras, activadoras o moduladoras, respectivamente, identificadas utilizando analisis in vitro e in vivo para la expresion o actividad de una protema diana descrita (o polinucleotido codificante), p. ej., ligandos, agonistas, antagonistas y sus homologos y mimeticos. El termino "modulador" incluye inhibidores y activadores. Los inhibidores son agentes que, p. ej., inhiben la expresion o se unen, bloquean parcial o totalmente la estimulacion o la actividad inhibidora de la proteasa, disminuyen, previenen, retrasan la activacion, inactivan, desensibilizan o regulan a la baja la actividad de la protema diana descrita, p. ej., los antagonistas. Los activadores son agentes que, p. ej., inducen o activan la expresion de una protema diana descrita o se unen a, estimulan, aumentan, abren, activan, facilitan, potencian la activacion o la actividad inhibidora de proteasa, sensibilizan o regulan al alza la actividad de la protema diana descrita (o polinucleotido codificante), p. ej., los agonistas. Los moduladores incluyen ligandos, antagonistas y agonistas de origen natural y sintetico (p. ej., moleculas qmmicas pequenas, anticuerpos y similares que funcionan como agonistas o antagonistas). Tales analisis para inhibidores y activadores incluyen, p. ej., la aplicacion de supuestos compuestos moduladores a celulas que expresan la protema diana descrita y luego la determinacion de los efectos funcionales sobre la actividad de protema diana descrita, como se ha descrito anteriormente. Las muestras o analisis que comprenden la protema diana descrita que se tratan con un activador, inhibidor o modulador potencial se comparan con muestras de control sin el inhibidor, activador o modulador para examinar el alcance del efecto. A las muestras de control (no tratadas con moduladores) se les asigna un valor de actividad relativa de 100%. La inhibicion de una protema diana descrita se logra cuando el valor de actividad relativo al control es aproximadamente 80%, opcionalmente 50% o 25, 10%, 5% o 1%. La activacion de la protema diana descrita se logra cuando el valor de actividad relativo al control es 110%, opcionalmente 150%, opcionalmente 200, 300%, 400%, 500%, o 1000-3000% o mas alto.
Un "polipeptido Oct" se refiere a cualquiera de los miembros naturales de la familia de Octameros de factores de transcripcion, o variantes de los mismos que mantienen la actividad del factor de transcripcion, similar (dentro de al menos 50%, 80% o 90% de actividad) en comparacion con el miembro de la familia de origen natural mas proximo, o polipeptidos que comprenden al menos el dominio de union a ADN del miembro de la familia de origen natural, y pueden comprender adicionalmente un dominio de activacion de la transcripcion. Los polipeptidos Oct ilustrativos incluyen, Oct -1, Oct-2, Oct-3/4, Oct-6, Oct-7, Oct-8, Oct-9 y Oct-11, p. ej., Oct3/4 (denominado en la presente memoria "Oct4") contiene el dominio POU, una secuencia de 150 aminoacidos conservada entre Pit-1, Oct-1, Oct-2 y uric-86. Vease, Ryan, A.K. & Rosenfeld, M.G. Genes Dev. 11, 1207-1225 (1997). En algunas realizaciones, las variantes tienen una identidad de secuencia de aminoacidos de al menos 85%, 90% o 95% en toda su secuencia en comparacion con un miembro de la familia de polipeptidos Oct de origen natural, tal como los enumerados anteriormente o tal como los enumerados en el numero de acceso Genbank NP_002692.2 (Oct4 humano) o NP_038661.1 (Oct4 de raton). Los polipeptidos Oct (p. ej., Oct3/4) pueden ser de ser humano, de raton, de rata, bovinos, porcinos o de otros animales. Generalmente, se utilizara la misma especie de protema que la especie de celulas que se esten manipulando.
Un "polipeptido KIf' se refiere a cualquiera de los miembros de origen natural de la familia de factores de tipo Kruppel (Klf), protemas de dedo de zinc que contienen secuencias de aminoacidos similares a las del regulador del patron embrionario de Drosophila Kruppel, o variantes de los miembros de origen natural que mantienen una actividad del factor de transcripcion similar (dentro de una actividad de al menos 50%, 80% o 90%) en comparacion con el miembro de la familia de origen natural mas cercano relacionado, o polipeptidos que comprenden al menos el dominio de union a ADN de miembro de la familia de origen natural, y puede comprender adicionalmente un dominio de activacion transcripcional. Vease, Dang, D.T., Pevsner, J. y Yang, V.W. Cell Biol. 32, 1103-1121 (2000). Los miembros de la familia de KIf ilustrativos incluyen Klf1, Klf2, Klf3, Klf-4, Klf5, Klf6, Klf7, Klf8, Klf9, KIf10, Klf11, Klf12, Klf13, Klf14, Klf15, Klf16, y Klf17. Se encontro que Klf2 y Klf-4 eran factores capaces de generar celulas iPS en ratones, y los genes relacionados Klf1y Klf5 tambien, aunque con una eficacia reducida. Vease, Nakagawa, et al., Nature Biotechnology 26: 101-106 (2007). En algunas realizaciones, las variantes tienen una identidad de secuencia de aminoacidos de al menos 85%, 90% o 95% en toda su secuencia en comparacion con un miembro de la familia del polipeptido KIf de origen natural tal como los enumerados anteriormente o tal como los enumerados en el numero de acceso de Genbank CAX16088 (Klf4 de raton) o CAX 14962 (Klf4 humano). Los polipeptidos KIf (por ejemplo, Klf1, Klf4 y Klf5) pueden ser de ser humano, de raton, de rata, bovinos, porcinos o de otros animales. Generalmente, se utilizara la misma especie de protema con las especies de celulas que se esten manipulando. En la medida en la que se describe en la presente memoria un polipeptido KIf, este puede ser reemplazado por un polipeptido receptor beta relacionado con estrogeno (Essrb). Por lo tanto, se pretende que para cada realizacion de polipeptido KIf descrita en la presente memoria, se describa igualmente una realizacion correspondiente que utilice Essrb en lugar de un polipeptido Klf4.
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Un "polipeptido Myc" se refiere a cualquiera de los miembros de origen natural de la familia Myc (vease, p. ej., Adhikary, S. & Eilers, M. Nat. Rev. MoI Cell Biol. 6:635-645 (2005)) o sus variantes que mantienen una actividad del factor de transcripcion similar (dentro de una actividad de al menos 50%, 80%, o 90%) en comparacion con el miembro de la familia de origen natural mas cercano relacionado, o polipeptidos que comprenden al menos el dominio de union a ADN del miembro de la familia de origen natural, y puede comprender adicionalmente un dominio de activacion transcripcional. Los polipeptidos Myc ilustrativos incluyen, p. ej., c-Myc, N-Myc y L-Myc. En algunas realizaciones, las variantes tienen una identidad de secuencia de aminoacidos de al menos 85%, 90% o 95% en toda su secuencia en comparacion con un miembro de la familia de polipeptidos Myc de origen natural, tal como los enumerados anteriormente o como los enumerados en el numero de acceso de Genbank CAA25015 (Myc humano). Los polipeptidos Myc (p. ej., c-Myc) pueden ser de ser humano, de raton, de rata, bovinos, porcinos o de otros animales. Generalmente, se utilizara la misma especie de protema que la especie de las celulas que se esten manipulando.
[0063] Un "polipeptido Sox" se refiere a cualquiera de los miembros de origen natural de los factores de transcripcion de la caja HMG relacionada con SRY (Sox), que se caracteriza por la presencia del dominio del grupo de alta movilidad (HMG), o variantes del mismo que mantienen una actividad del factor de transcripcion similar (dentro de una actividad de al menos 50%, 80% o 90%) en comparacion con el miembro de la familia de origen natural mas cercano relacionado, o polipeptidos que comprenden al menos el dominio de union a ADN del miembro de la familia de origen natural, y pueden comprender adicionalmente un dominio de activacion transcripcional. Vease, p. ej., Dang, D.T., et al., Int. J. Biochem. Cell Biol. 32:1103-1121 (2000). Los polipeptidos Sox ilustrativos incluyen, p. ej., Sox1, Sox-2, Sox3, Sox4, Sox5, Sox6, Sox7, Sox8, Sox9, Sox10, Sox11, Sox12, Sox13, Sox14, Sox15, Sox17, Sox18, Sox-21 y Sox30. Se ha demostrado que Sox1 produce celulas iPS con una eficacia similar a la de Sox2, y tambien se ha demostrado que los genes Sox3, Sox15 y Sox18 generan celulas iPS, aunque con algo menos de eficacia que Sox2. Vease, Nakagawa, et al., Nature Biotechnology 26:101-106 (2007). En algunas realizaciones, las variantes tienen una identidad de secuencia de aminoacidos de al menos 85%, 90% o 95% a lo largo de toda su secuencia en comparacion con un miembro de la familia del polipeptido Sox de origen natural, tal como los enumerados anteriormente o tal como se enumera en el numero de acceso de Genbank CAA83435 (Sox2 humano). Los polipeptidos Sox (p. ej., Sox1, Sox2, Sox3, Sox15 o Sox18) pueden ser de ser humano, de raton, de rata, bovinos, porcinos o de otros animales. Generalmente, se utilizara la misma especie de protema que la especie de celulas que se este manipulando.
Descripcion detallada de la invencion
I. Introduccion
La presente invencion se basa en el hallazgo sorprendente de que los inhibidores de ALK5 mejoran significativamente el mantenimiento, y opcionalmente, la induccion de pluripotencia en las celulas. La combinacion de un inhibidor de ALK5 con un inhibidor de MAPK (p. ej., un inhibidor de MEK, un inhibidor de Erk o un inhibidor de p38) o una combinacion de un inhibidor de ALK5 con un inhibidor de la ruta de FGF (p. ej., un inhibidor del receptor de FGF) permite:
el mantenimiento de la pluripotencia en celulas con nuevas propiedades funcionales que se definen a continuacion y son significativamente diferentes de las celulas madre embrionarias humanas convencionales o celulas madre pluripotentes inducidas descritas anteriormente (p. ej., en las Patentes de Estados Unidos Num. 5.843; 6.200.806; y 7.029.913) y mas similares a las caractensticas de mESC; y
mejora considerablemente la eficacia y la estabilidad de las celulas en comparacion, por ejemplo, con los metodos para mantener la pluripotencia conocidos previamente (p. ej., que implican a los inhibidores de GSK3 y MEK-vease, el documento WO2008/015418). De hecho, es sorprendente que un inhibidor de ALK5 sea eficaz para mejorar el mantenimiento de la pluripotencia en parte debido a que la tecnica hasta la fecha se ha centrado en suscitar un efecto agomstico, no antagonico, de la ruta de TGFp para estimular la pluripotencia. Vease, p. ej., el documento WO 2008/056173.
La descripcion proporciona en parte cultivos de celulas que comprenden un inhibidor de ALK5 (u otro inhibidor de la ruta de TGFp/activina) y un inhibidor de MAPK o un inhibidor de ruta de senalizacion de FGF, que comprende opcionalmente una celula de mairnfero que ya es pluripotente o en la que debe ser inducida, o se ha inducido pluripotencia en presencia de los inhibidores. Opcionalmente, los cultivos celulares tambien pueden incluir un inhibidor de GSK3p y/o un Factor Inhibidor de Leucemia (LIF). Otros componentes y condiciones de los medios pueden ser como los conocidos generalmente en la tecnica y pueden incluir, p. ej., componentes de medios basales, vitaminas, minerales, etc.
La capacidad para mantener celulas en pluripotencia permite el estudio y uso de tales celulas de muchas maneras que de otro modo sena imposible. Por ejemplo, muchas celulas madre pluripotentes se diferencian o mueren rapidamente en cultivo y por lo tanto no permiten analisis de escrutinio, ingeniena genetica y otros usos donde es necesario o conveniente mantener la pluripotencia durante un cierto periodo de tiempo o a traves de multiples pases celulares (p. ej., divisiones celulares). La presente invencion permite eludir tales problemas.
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II. Cultivos
Se proporcionan cultivos celulares que incluyen un inhibidor de ALK5 (u otro inhibidor de la ruta de TGFp/activina), opcionalmente con un inhibidor de la ruta de senalizacion de MAPK (p. ej., un inhibidor de MEK o Erk o p38) o FGF (p. ej., un inhibidor del receptor de FGF) y, para inducir o mantener la pluripotencia de una celula de mairnfero. En algunas realizaciones, las celulas cultivadas con tales inhibidores tienen las caractensticas descritas en los ejemplos, incluyendo, pero sin limitacion, la formacion de colonias abovedadas en cultivos, la expresion de marcadores ESC (p. ej., Oct4, Sox2 y Nanog), que tienen una desmetilacion casi completa del promotor Oct4, que expresan Rex-1 y ALP (p. ej., los marcadores de las ESC y Epiblastos tempranos que estan ausentes en los Epiblastos y las EpiSC despues de la fase de implantacion), la capacidad de diferenciarse in vitro en endodermo, neuroectodermo, y mesodermo, asf como caractensticas de pluripotencia in vivo, tales como la capacidad de formar teratoma (p. ej., en ratones SCID) y para celulas no humanas, la capacidad de formar una progenie quimerica cuando se inyectan en blastocistos y se implantan en un utero receptivo. Ademas, en algunas realizaciones, las celulas de los cultivos conservan tales caractensticas durante multiples pases celulares, p. ej., al menos 1, 2, 3, 4, 5, 7, 10, 20, 30 o mas, mientras estan en las mismas condiciones de cultivo.
Los cultivos celulares pueden opcionalmente incluir tambien uno o ambos de un inhibidor de GSk3p y LIF. Como se explica en los ejemplos, la presencia de LIF puede mejorar el mantenimiento a largo plazo de celulas pluripotentes (p. ej., en mas de 10 pases) y, por lo tanto, se puede incluir una cantidad suficiente de LIF en los cultivos para permitir la conservacion a largo plazo de la pluripotencia. Adicionalmente, con o sin LIF, tambien se puede incluir una cantidad suficiente de un inhibidor de GSK3p. En algunas realizaciones, la cantidad de inhibidor de GSK3p es suficiente para mejorar la eficacia del cultivo, es decir, el numero de colonias pluripotentes positivas que se forman.
La cantidad de cada inhibidor puede variar y se puede determinar para una ventaja optima dependiendo de las condiciones de cultivo precisas, de los inhibidores espedficos utilizados y del tipo de celulas cultivadas. En algunas realizaciones, los cultivos de la invencion incluyen 0,05-10 |jM, p. ej., 0,1-1 |jM, p. ej., 0,5 |jM de un inhibidor de ALK5 (p. ej., A-83-01 y 0,1-20 jiM, por ejemplo, 2-10 jiM de SB431542). Los autores de la presente invencion han encontrado que se puede utilizar un inhibidor II de TGF-p RI quinasa [2-(3-(6-metilpiridin-2-il)-1H-pirazol-4-il)-1,5- naftiridina] como inhibidor de ALK5, como se describe en la presente memoria, por ejemplo a concentraciones de aproximadamente 1,5 jiM. Asf, en algunas realizaciones, los cultivos de la invencion incluyen 0,05-20 jiM, p. ej., 0,110 jiM de inhibidor II de TGF-p RI Quinasa. En algunas realizaciones, los cultivos de la invencion incluyen 10 nM-5 jiM, por ejemplo, 50 nM-1 jiM de un inhibidor de la ruta de FGF (p. ej., PD173074). En algunas realizaciones, los cultivos de la invencion incluyen 0,05-50 jiM, p. ej., 0,1- 5 jiM, p. ej., 0,5 jiM de un inhibidor de MEK (p. ej., PD0325901). En algunas realizaciones, los cultivos de la invencion incluyen 0,05-20 jiM, por ejemplo 0,5-5 jiM, p. ej., 3 jiM de un inhibidor de GSK3p (p. ej., CHIR99021).
Los inhibidores del receptor TGFp (p. ej., ALK5) pueden incluir anticuerpos frente a variantes negativas dominantes de acidos nucleicos antisentido que se dirigen a receptores de TGFp (p. ej., ALK5). Los inhibidores del receptor de TGFp/ALK5 incluyen, pero no se limitan a, SB431542 (vease, p. ej., Inman et al., Molecular Pharmacology 62(1): 6574 (2002)), A-83-01, tambien conocido como 3-(6-Metil-2-piridinil)-N-fenil-4-(4-quinolinil)-1H-pirazol-1-carbotioamida (vease, p. ej., Tojo et al., Cancer Science 96(11): 791-800 (2005), y comercialmente disponible, por ejemplo, de Toicris Bioscience); Inhibidor II de TGFp RI quinasa [2-(3-(6-Metilpiridin-2-il) -1H-pirazol-4- il)-1,5-naftiridina]; 2-(3-(6- Metilpiridin-2-il)-1H-pirazol-4-il)-1,5-naftiridina, Wnt3a/BIO (vease, p. ej., Dalton, et al., documento WO2008/094597 incorporado como referencia a la presente memoria), BMP4 (vease, Dalton, mas arriba), GW788388 (-{4-[3-(piridin- 2-il)-1H-pirazol-4-il]piridin-2-il}-N-(tetrahidro-2H-piran-4-il)benzamida) (vease, p. ej., Gellibert, et al., Journal of Medicinal Chemistry 49(7):2210-2221 (2006)), Sm16 (vease, p. ej., Suzuki et al., Cancer Research 67(5): 2351-2359 (2007)), IN-1130 (3-((5,6-metilpiridin-2-il)-4-(quinoxalin-6-il)-1H-imidazol-2-il)metil)benzamida) (vease, p. ej., Kim, et al., Xenobiotica 38 (3): 325-339 (2008)), GW6604 (2-fenil-4-(3-piridin-2-il-1H-pirazol-4-il)piridina) (vease, p. ej., Gouville et al., Drug News Perspective 19(2): 85-90 (2006)), SB-505124 (hidrocloruro de 2-(5-benzo[1,3]dioxol-5-il-2- terc-butil-3H-imidazol-4-il)-6-metilpiridina (vease, p. ej., DaCosta et al., Molecular Pharmacology 65(3):744-752 (2004)) y derivados de pirimidina (veanse, p. ej., los enumerados en Stiefl et al., documento WO2008/006583, incorporado a la presente memoria como referencia). Sin pretender limitar el alcance de la invencion, se cree que los inhibidores de ALK5 afectan al proceso de conversion/transicion mesenquimal a epitelial (MET). La ruta de TGFp/activina es un conductor para la transicion epitelial a mesenquimal (EMT). Por lo tanto, la inhibicion de la ruta de TGFp/activina puede facilitar el proceso MET (es decir, la reprogramacion).
En vista de los datos de la presente memoria que muestran el efecto de inhibicion de ALK5, se cree que la inhibicion de la ruta de TGFp/activina tendra efectos similares. Por lo tanto, cualquier inhibidor (p. ej., aguas arriba o aguas abajo) de la ruta de TGFp/activina se puede utilizar combinado con, o en lugar de, inhibidores de ALK5 como se describe en cada parrafo de la presente memoria. Los inhibidores de la ruta de TGFp/activina ilustrativos incluyen, pero no se limitan a: inhibidores del receptor de TGFp, inhibidores de la fosforilacion de SMAD 2/3, inhibidores de la interaccion de SMAD 2/3 y SMAD4 y activadores/agonistas de SMAD 6 y SMAD 7. Ademas, las categorizaciones descritas a continuacion son meramente para propositos de organizacion y un experto en la tecnica sabna que los compuestos pueden afectar a uno o mas puntos dentro de una ruta y, por tanto, los compuestos pueden funcionar en mas de una de las categonas definidas.
Los inhibidores del receptor de TGFp pueden incluir anticuerpos frente a variantes dominantes negativas de acidos
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nucleicos antisentido dirigidos a receptores de TGFp. Los ejemplos espedficos de inhibidores incluyen, pero no se limitan a, SU5416; hidrocloruro de 2-(5-benzo[1,3]dioxol-5-il-2-terc-butil-3H-imidazol-4-il)-6-metilpiridina (SB-505124); lerdelimumb (CAT-152); metelimumab (CAT-192); GC-1008; ID11; AP-12009; AP-11014; LY550410; LY580276; LY364947; LY2109761; SB-505124; SB-431542; SD-208; SM16; NPC-30345; Ki26894; SB-203580; SD-093; Gleevec; 3,5,7,2' 4'-pentahidroxiflavona (Morin); activina-M108A; P144; TBR2-Fc soluble; y celulas tumorales transfectadas antisentido que dirigen receptores de TGFp. (Vease, p. ej., Wrzesinski, et al., Clinical Cancer Research 13(18): 5262-5270 (2007); Kaminska, et al., Acta Biochimica Polonica 52(2): 329-337 (2005); y Chang, et al., Frontiers in Bioscience 12:4393-4401 (2007)).
Los inhibidores de la fosforilacion SMAD 2/3 pueden incluir anticuerpos frente a variantes negativas dominantes de acidos nucleicos antisentido dirigidos a SMAD2 o SMAD3. Los ejemplos espedficos de los inhibidores incluyen PD169316; SB203580; SB-431542; LY364947; A77-01; y 3,5,7,2',4'-pentahidroxiflavona (Morin). (Veanse, p. ej., Wrzesinski, mas arriba, Kaminska, mas arriba, Shimanuki, et al., Oncogene 26:3311-3320 (2007); y Kataoka, et al., EP1992360.
Los inhibidores de la interaccion de SMAD 2/3 y smad4 pueden incluir anticuerpos frente a variantes negativas dominantes de acidos nucleicos antisentido dirigidos a SMAD2, SMAD3 y/o smad4. Los ejemplos espedficos de inhibidores de la interaccion de SMAD 2/3 y SMAD4 incluyen, pero no se limitan a Trx-SARA, Trx-xFoxHlb y Trx-Lefl. (Veanse, p. ej., Cui et al., Oncogene 24:3864-3874 (2005) y Zhao et al., Molecular Biology of the Cell, 17:3819-3831 (2006)).
Los inhibidores de MEK pueden incluir anticuerpos frente a variantes negativas dominantes y acidos nucleicos antisentido que se dirigen a MEK. Los ejemplos espedficos de inhibidores de MEK incluyen, pero no se limitan a, PD0325901, (vease, p. ej., Rinehart et al., Journal of Clinical Oncology 22: 4456-4462 (2004)), PD98059 (disponible, p. ej., en Cell Signaling Technology), U0126 (disponible, p. ej., en Cell Signaling Technology), SL 327 (disponible, p. ej., en Sigma Aldrich), ARRY-162 (disponible, p. ej., en Array Biopharma), PD184161 (vease, p. ej., Klein, et al., Neoplasia 8:1-8 (2006)), PD184352 (Cl-1040) (vease, p. ej., Mattingly, et al., The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 316:456-465 (2006)), sunitinib (vease, p. ej., Voss, et al., documento US2008004287 incorporado a la presente memoria como referencia), sorafenib (vease, Voss mas arriba), Vandetanib (vease, Voss mas arriba), pazopanib (vease, p. ej., Voss mas arriba), Axitinib (vease, Voss mas arriba) y PTK787 (vease, Voss mas arriba).
Actualmente, varios inhibidores de MEK estan experimentando evaluaciones en pruebas clmicas. CI-1040 se ha evaluado en ensayos clmicos de fase I y II para el cancer (vease, p. ej., Rinehart, et al., Journal of Clinical Oncology 22(22):4456-4462 (2004)). Otros inhibidores de MEK que se estan evaluando en pruebas clmicas incluyen PD184352 (vease, p. ej., English, et al., Trends in Pharmaceutical Sciences 23(1):40-45 (2002)), BAY 43-9006 (vease, p. ej., Chow, et al., Cytometry (Communications in Clinical Cytometry) 46:72-78 (2001)), PD-325901 (tambien PD0325901), GSK1120212, ARRY-438162, RDEA119, AZD644 (Tambien ARRY-142886 o ARRY-886), RO5126766, XL518 y AZD8330 (tambien ARRY-704). (Vease, p. ej., informacion de National Institutes of Heath localizada en clinicaltrials.gov asi como la informacion del Nation Cancer Institute localizada en la Red en cancer.gov/clinicaltrials.
Los inhibidores de p38 (tambien conocidos como CSBP, mHOG1, RK y SAPK2) pueden incluir anticuerpos frente a variantes negativas dominantes de acidos nucleicos antisentido que se dirigen a p38. Los ejemplos espedficos de inhibidores incluyen, pero no se limitan a, SB203580 (4-(4-Fluorofenil)-2-(4-metilsulfmilfenil)-5-(4-piridil) 1H-imidazol); SB202190 (4-(4-fluorofenil)-2-(4-hidroxifenil)-5 (4-piridil)-1H-imidazol); SB 220025; N-(3-terc-butil-1-metil-5-pirazolil)- N'-(4-(4-piridinilmetil)fenil)urea; RPR 200765A; UX-745; UX-702; UX-850; SC10-469; RWJ-67657 (R.W. Johnson Pharmaceutical Research Institute); RDP-58 (SangStat Medical Corp., adquirido por Genzyme Corp.); Scios-323 (SCIO 323, Scios Inc.); Scios-469 (SCIO-469; Scios Inc.); inhibidores de MKK3/MKK6 (Signal Research Division); moduladores de p38/MEK (Signal Research Division); analogos SB-210313; SB-238039; HEP-689 (SB 235699); SB- 239063; SB-239065; SB-242235 (SmithKline Beecham Pharmaceuticals); VX-702 y VX-745 (Vertex Pharmaceuticals Inc.); AMG-548 (Amgen Inc.); inhibidores de la quinasa p38 Astex (Astex Technology Ltd.); analogos de RPR- 200765 (Aventis SA); inhibidores de la quinasa p38 Bayer (Bayer Corp.); BIRB-796 (Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals Inc.); inhibidor de la quinasa MAP p38 Celltech (Celltech Group pic); FR-167653 (Fujisawa Pharmaceutical Co. Ltd.); SB-681323 y SB-281832 (GlaxoSmithKline pic); inhibidores de la MAP quinasa de LEO Pharmaceuticals (LEO Pharma A/S); inhibidores de la quinasa MAP p38 de Merck Co. (Merck Research Laboratories); SC-040 y SC-XX906 (Monsanto Co.); antagonistas de adenosina A3 (Novartis AG); inhibidores de la quinasa MAP p38 (Novartis Pharma AG); CNI-1493 (Picower Institute for Medical Research); RPR-200765A (Rhone- Poulenc Rorer Ltd.); e inhibidores de la quinasa Map p38 de Roche (p. ej., RO3201195 y RO4402257, Roche Bioscience). Veanse, p. ej., Roux, et al., Microbiology and Molecular Biology Reviews 68(2):320-344 (2004); Engelman et al., Journal of Biological Chemistry 273(48):32111-32120 (1998); Jackson, et al., Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 284(2):687-692 (1998); Kramer et al., Journal of Biological Chemistry 271(44):27723-2777 (1996); y Menko et al., documento US20080193504.
[0078] Otros inhibidores adicionales de p38 incluyen, pero no se limitan a, compuestos de pirazol sustituidos en 1,5- diarilo y de pirazol sustituidos (documentos US6509361 y US6335336); compuestos de piridilo sustituidos (documento US20030139462); derivados de quinazolina (documentos US6541477, US6184226, US6509363 y
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[0079] Los inhibidores de Erk pueden incluir anticuerpos frente a variantes negativas dominantes de acidos nucleicos antisentido que se dirigen a Erk. Los ejemplos espedficos de los inhibidores de Erk incluyen, pero no se limitan a PD98059 (vease, p. ej., Zhu, et al., Oncogene 23:4984-4992 (2004)), UO 126 (vease, Zhu, mas arriba), FRl 80204 (vease, p. ej., Ohori, Drug News Perspective 21(5):245-250 (2008)), sunitinib (vease, p. ej., Ma, et al., documento US2008004287), sorafenib (vease, Ma, mas arriba), Vandetanib (vease, Ma, mas arriba), pazopanib (vease, Ma, mas arriba), Axitinib (vease, Ma, mas arriba) and PTK787 (vease, Ma, mas arriba). Los inhibidores de Erk pueden incluir moleculas que inhiben Erk solo o que inhiben tambien una segunda diana. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el inhibidor de Erk es:
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en la que:
R 1 se selecciona entre hidrogeno, alquilo Ci-C6, alquenilo C2-C6, aril(C6-io)alquilo C0-C4, heteroaril(C5-io)-alquilo C0- C4, cicloalquil(C3-c10)alquilo C0-C4 y heterocicloalquil(C3-C10)alquilo C0-C4; en donde cualquier alquilo o alquenilo de R1 esta opcionalmente sustituido con uno a tres radicales seleccionados independientemente entre halo, hidroxi, alquilo C1-C6 y -NR2R3; en donde cualquier arilo, heteroarilo, cicloalquilo o heterocicloalquilo de R1 esta opcionalmente sustituido con uno a tres radicales seleccionados entre halo, hidroxi, ciano, alquilo C1-C6, alcoxi C1- C6, alquenilo C2-C6, alquilo sustituido con halo, alcoxi sustituido con halo, -XNR2R3 , -XOXNR2R3 , -XNR2S(O)0-2R3 , - XC(O)NR2R3, -XNR2C(O)XOR2, -XNR2C(O)NR2R3, -XNR2XNR2R3, -XC(O)NR2XNR2R3, -XNR2XOR2, -XOR2, -
XNR2C(=NR2)NR2R3 , -XS(O)0-2R4, -XNR2C(O)R2, -XNR2C(O)XNR2R3, -XNR2C(O)R4, -XC(O)R4, -X-R4, -XC(O)OR3 y -XS(O)0-2NR2R3; en donde X es un enlace o alquileno C1-C4; R2 y R3 se seleccionan independientemente entre hidrogeno, alquilo C1-C6 y cicloalquilo C3-C12; y R4 es heterocicloalquilo C3-C10 opcionalmente sustituido con 1 a 3 radicales seleccionados entre alquilo C1-C6, -XNR2R3, -XNR2XNR2R2 , XNR2XOR2 y -XOR2; en donde X, R2 y R3 se
describen como antes; y los derivados N-oxido, derivados de profarmacos, derivados protegidos, isomeros individuales y mezclas de isomeros de los mismos; y las sales y solvatos farmaceuticamente aceptables (p. ej., hidratos) de tales compuestos o como se describe de otro modo en el documento WO 06/135824.
Los inhibidores de la ruta de senalizacion de FGF incluyen, pero no se limitan a inhibidores del receptor de FGF. Los inhibidores del receptor de FGF (FGFR) pueden incluir anticuerpos frente a variantes negativas dominantes de acidos nucleicos antisentido que se dirigen a FGFR. Los ejemplos espedficos de inhibidores de FGFR incluyen, pero no se limitan a, SU6668 (vease, p. ej., Klenke, BMC Cancer 7:49 (2007)), SU5402 (3-[3-(2-Carboxietil)-4-metilpirrol- 2- metilidenil]-2-indolinona) y pD 173074 (vease, p. ej., Bansal et al., J. Neuro, Res. 74(4):486-493 (2003)).
Los inhibidores de GSK3 pueden incluir anticuerpos frente a variantes negativas dominantes de acidos nucleicos antisentido que se dirigen a GSK3. Los ejemplos espedficos de inhibidores de GSK3 incluyen, pero no se limitan a, CHIR99021, CHIR98014, AR-A014418 (vease, p. ej., Gould et al., The International Journal of
Neuropsychopharmacology 7:387-390 (2004)), CT 99021 (vease, p. ej., Wagman, Current Pharmaceutical Design 10:1105-1137 (2004)), cT 20026 (vease Wagman, mas arriba), SB216763 (vease, p. ej., Martin et al., Nature Immunology 6:777-784 (2005)), AR-A014418 (vease, p. ej., Noble et al., PNAS 102:6990-6995 (2005)), litio (vease, p. ej., Gould et al., Pharmacological Research 48:49-53 (2003), SB 415286 (vease, p. ej., Frame et al., Biochemical Journal 359:1-16 (2001)) y TDZD-8 (vease, p. ej., Chin et al., Molecular Brain Research, 137(1 -2): 193-201 (2005)). Otros ejemplos de inhibidores de GSK3 disponibles de Calbiochem (vease, p. ej., Dalton et al., documento WO2008/094597), incluyen, pero no se limitan a, BIO (2'Z,3'£)-6-Bromoindirrubin-3'-oxima (inhibidor IX de GSK3); BIO-Acetoxima (2'Z,3'E)-6-Bromoindirrubin-3'-acetoxima (Inhibidor X de GSK3); (5-Metil-1H-pirazol-3-il)-(2- fenilquinazolin-4-il)amina (Inhibidor XIII de GSK3); Complejo de piridocarbazol-ciclopenadienilrutenio (Inhibidor Xv de GSK3); TDZD-8 4-Bencil-2-metil-1,2,4-tiadiazolidino-3,5-diona (Inhibidor I de GSK3beta); 2-Tio(3-yodobencil)-5- (1-piridil)-[1,3,4]-oxadiazol (Inhibidor II de GSK3beta); OtDzT 2,4-Dibencil-5-oxotiadiazolidino-3-tiona (Inhibidor III de GsK3beta); alfa-4-Dibromoacetofenona (Inhibidor VII de GSK3beta); AR-AO 14418 N-(4-Metoxibencil)-N'-(5-nitro- 1,3-tiazol-2-il)urea (Inhibidor VIII de GsK-3beta); 3-(1-(3-Hidroxipropil)-1H-pirrolo[2,3-b]piridin-3-il]-4-pirazin-2-il- pirrolo-2,5-diona (Inhibidor XI de GSK-3beta) TWSI 19 compuesto de pirrolopirimidina (Inhibidor XII de GsK3beta), L803 H-KEAPPApPQSpP-NH2 o su forma Miristoilada (Inhibidor XIII de GSK3beta); 2-Cloro-1-(4,5-dibromo-tiofen-2-
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il)-etanona (Inhibidor VI de GSK3beta); AR-AO144-18; SB216763; y SB415286. Se han identificado residuos de GSK3b que interaccionan con inhibidores. Vease, p. ej., Bertrand et al., J. MoI Biol. 333(2):393-407 (2003).
Cuando se describen en la presente memoria inhibidores de un producto genico particular, se debe entender que el inhibidor puede ser reemplazado por un ARNip que se dirige al gen que codifica el producto genico. Por ejemplo, la presente invencion proporciona el uso de un ARNip que inhibe la expresion de aLK5 en lugar de un inhibidor de ALK5. De forma similar, los inhibidores de MEK, los inhibidores de Erk, los inhibidores de p38, los inhibidores del receptor de FGF y los inhibidores de GSK3p pueden ser reemplazados por un ARNip de MEK, ARNip de Erk, ARNip de p38, ARNip del receptor de FGF y ARNip de GSK3p, respectivamente. Adicionalmente, se puede utilizar un anticuerpo inhibidor (p. ej., un anticuerpo humanizado o quimerico) como inhibidor de ALK5, MEK, Erk, p38, receptor de FGF y GSK3p.
Las celulas se pueden cultivar inicialmente con un modificador epigenetico seguido de una etapa de cultivo que carece del modificador, pero que incluye los inhibidores descritos en la presente memoria (p. ej., inhibidor de ALK5, inhibidores MEK, inhibidores de Erk, inhibidores de p38, inhibidores del receptor de FGF e inhibidores de GSK3p, Factor inhibidor de la Leucemia (LIF), etc.). Los moduladores epigeneticos ilustrativos incluyen un inhibidor de la desmetilacion de la histona H3K4 o un activador de la metilacion de H3K4. Los ejemplos de modificadores epigeneticos incluyen, p. ej., inhibidores de histona desmetilasa tales como inhibidores de LSD1 (p. ej., parnate) o inhibidores de MAO.
Los terminos "inhibidor de la histona desacetilasa", "inhibidor de histona desacetilasa" e "inhibidor de HDAC" se refieren a un compuesto capaz de interaccionar con una histona desacetilasa e inhibir su actividad enzimatica. "Inhibicion de la actividad enzimatica de la histona desacetilasa" representa la reduccion de la capacidad de una histona desacetilasa para eliminar un grupo acetilo de una histona. En algunas realizaciones, semejante reduccion de la actividad de la histona desacetilasa es de al menos aproximadamente 50%, mas preferiblemente al menos aproximadamente 75%, y aun mas preferiblemente al menos aproximadamente 90%. En otras realizaciones preferidas, la actividad de la histona desacetilasa se reduce en al menos 95% y mas preferiblemente en al menos 99%.
Algunos inhibidores representativos de HDAC incluyen acido butmco, MS-27-275, SAHA, Tricostatina A, apicidina, oxanflatina, FK228 y trapoxina. Estos inhibidores se pueden dividir en varias clases basadas en sus estructuras, incluyendo acidos grasos de cadena corta (butiratos y acido valproico), acidos hidroxamicos (Tricostatina Ay SAHA), tetrapeptidos dclicos (depsipeptido), benzamidas (MS 27-275) y agentes que contienen epoxido (trapoxina). La mayona de ellos inhiben las HDAC de una manera reversible, excepto la trapoxina, que posee un grupo epoxido capaz de alquilar irreversiblemente las HDAC. Los inhibidores reversibles generalmente tienen una cola alifatica larga que contiene un extremo nucleofilo, tal como -SH u -OH, que interacciona con el centro de cinc activo situado en la parte inferior del bolsillo de union a HDAC. Otros inhibidores de HDAC estan surgiendo basandose en la modificacion de las estructuras enumeradas. La mayona de los nuevos agentes son derivados de acidos hidroxamicos, incluyendo analogos de amida de Tricostatina A (TSA) y SAHA basado en tio/fosforo. El reemplazo del enlace amida en la estructura de MS-27-275 por una sulfonamida condujo al descubrimiento de una nueva clase de potentes inhibidores de HDAC. Los inhibidores HDAC prometedores que han entrado en pruebas clmicas incluyen derivados de acido hidroxamico LAQ824, derivado de acido butmco Titan, acido valproico, MS-27-275, SAHA y depsipeptido FK228.
Los inhibidores de histona desmetilasa incluyen inhibidores de la desmetilasa I espedfica de lisina (LSD1, tambien conocida como histona desmetilasa espedfica de lisina, BHC110 y KIAA0601). La Solicitud de Patente Internacional Num. WO 2006/071608 esta dirigida a un metodo para controlar la actividad de la histona desmetilasa eucariotica, a metodos para regular al alza y regular a la baja genes activados con histona metilada, y a un metodo para tratar o prevenir una enfermedad (p. ej., una enfermedad hiperproliferativa tal como cancer) modulando el nivel de protema o la actividad de una histona desmetilasa. En vista de la importancia de la regulacion genica, y de la capacidad para afectar a la regulacion genica mediante la inhibicion o modulacion de LSD1, los inhibidores de la enzima pueden tener un potencial terapeutico significativo; Bi, X. et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 16:3229-3232 (2006) y las Solicitudes de Patente Internacional Num. WO2007/021839 y WO2008/127734 describen ciertos compuestos utiles como inhibidores de LSD1.
La presente invencion tambien proporciona un medio de cultivo para mantener la pluripotencia de las celulas. Los medios de cultivo celular no incluyen opcionalmente una celula. El medio de cultivo puede comprender el contenido del medio de cultivo descrito anteriormente, aunque con las celulas. Dichos medios son celulas de cultivo utiles como se describen en la presente memoria.
Tal como se dispone en otra parte de la presente memoria, las celulas de los cultivos se pueden seleccionar entre celulas madre embrionarias (p. ej., celulas madre embrionarias humanas (hESC), celulas madre embrionarias de primate, celulas madre embrionarias de rata o celulas madre embrionarias de otros animales, opcionalmente celulas madre embrionarias no de raton). Alternativamente, las celulas incluyen celulas madre pluripotentes inducidas (iPSC). Las iPSC pueden ser de seres humanos, primates, ratas, ratones u otros animales que no sean ratones. Las iPSC se pueden generar a partir de celulas no pluripotentes tan recientemente como dentro de la division celular anterior o, alternativamente, las celulas se pueden haber mantenido durante 1, 2, 3, 4, 5, 7, 10, 20, o mas divisiones
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celulares o pases anteriores como iPSC. En otras palabras, los cultivos celulares pueden contener iPSC que se crearon previamente (p. ej., una semana, un mes o mas anteriormente). Un beneficio de las combinaciones de moleculas pequenas proporcionadas en la presente memoria es que ademas, y separadas de su uso en la reprogramacion, permiten mantener una pluripotencia deseada durante lo que parece ser un penodo de tiempo indefinido.
La presente descripcion proporciona celulas pluripotentes en una mezcla con uno o mas inhibidores como se describe en la presente memoria. El compuesto puede estar mezclado a una concentracion suficiente para inducir o mejorar la eficacia de induccion de pluripotencia. Por ejemplo, los compuestos pueden estar a una concentracion de al menos 0,1 nM, p. ej., al menos 1, l0, 100, 1000, 10000 o 100000 nM, p. ej., entre 0,1 nM y 100000 nM, p. ej., entre 1 nM y 10000 nM, p. ej., entre 10 nM y 10000 nM, entre 0,01 pM y 5 pM, entre 0,1 pM y 5 pM. Por ejemplo, A- 83-01 se puede utilizar a una concentracion de aproximadamente 0,1 pM a aproximadamente 0,5 pM, p. ej., de 0,25 pM a aproximadamente 0,5 pM. La concentracion de A-83-01 puede ser de 0,25 pM. La concentracion de A-83-01 puede ser de 0,5 pM. Se puede utilizar CHIR99021 a una concentracion de aproximadamente 3 pM. Se puede utilizar PD325901 a una concentracion de aproximadamente 0,5 pM. Se puede utilizar PD173074 a una concentracion de aproximadamente 0,1 pM. Las mezclas pueden estar en un recipiente sintetico (p. ej., un tubo de ensayo, una placa de Petri, etc.). Asf, las celulas pueden ser celulas aisladas (no parte de un animal). Las celulas se pueden afslar de un animal (ser humano o no humano), colocar en un recipiente, poner en contacto con uno o mas compuestos como se describe en la presente memoria. Las celulas se pueden cultivar posteriormente y opcionalmente, volver a insertarse en el mismo animal o en un animal diferente, opcionalmente despues de que las celulas hayan sido estimuladas para que se vuelvan de un tipo o linaje de celula concretos.
En algunas realizaciones, las celulas comprenden un casete de expresion para la expresion heterologa de al menos uno o mas de un polipeptido Oct, un polipeptido Myc, un polipeptido Sox y un polipeptido KIf. En algunas realizaciones, las celulas no incluyen un casete de expresion para expresar ninguno de los polipeptidos Oct, Myc, Sox o KIf. Las celulas con o sin tales casetes de expresion son utiles, por ejemplo, en metodos de escrutinio como se describe en la presente memoria.
III. Celulas
Las celulas pueden ser pluripotentes antes del contacto inicial con los inhibidores de la invencion o las celulas se pueden poner en contacto con uno o mas de los inhibidores de la invencion y despues se pueden inducir la pluripotencia (p. ej., mediante la introduccion de los factores de transcripcion apropiados y/o por contacto con las moleculas pequenas apropiadas para inducir pluripotencia).
Se puede utilizar cualquier celula animal en los metodos de la descripcion. Asf, por ejemplo, las celulas pueden ser celulas de mairnfero. Las celulas de mamffero ilustrativas incluyen, pero no se limitan a, celulas humanas o celulas no humanas, incluyendo pero no limitadas a, de rata, de raton (p. ej., SCID u otros ratones), de cerdo, bovinas, ovinas, caninas, felinas y de primates (p. ej., mono rhesus, chimpance, etc.).
Las celulas pluripotentes utilizadas de acuerdo con los metodos de la descripcion pueden ser celulas madre de origen natural o pueden ser celulas pluripotentes inducidas. Las celulas madre de origen natural ilustrativas incluyen, p. ej., celulas madre embrionarias. Los metodos de aislamiento de celulas madre embrionarios son bien conocidos. Vease, p. ej., Matsui et al., Cell 70:841, 1992; Thomson et al., Patente de los Estados Unidos Num. 5.843.780; Thomson et al., Science 282:114, 1998; Shamblott et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13726, 1998; Shamblott et al., Patente de los Estados Unidos Num. 6.090.622; Reubinoff et al., Nat. Biotech. 18:399, 2000; documento PCT WO00/27995, lannaccone et al., Dev. Biol. 163:288, 1994; Loring et al., documento PCT WO99/27076, Pain et al., Development 122: 2339, 1996; Patente de los Estados Unidos 5.340.740; Patente de los Estados Unidos Num. 5.656.479, de Wheeler et al., Reprod. Fertil. Dev. 6:563, 1994; Shim et al., Biol. Reprod. 57:1089, 1997. Las celulas madre descritas en la presente memoria pueden derivar de un blastocisto (p. ej., obtenido de un blastocisto) que se cultiva posteriormente en presencia de al menos un inhibidor de ALK5 y un inhibidor de Erk o MEK, opcionalmente con otros inhibidores como se describe en la presente memoria.
Se ha informado actualmente de numerosas maneras para inducir la pluripotencia en las celulas. La pluripotencia se puede inducir, por ejemplo, mediante la introduccion de factores de transcripcion o se puede inducir o imitar de otra manera la expresion de ciertos factores de transcripcion. En algunas realizaciones, se expresan uno o mas de los siguientes factores de transcripcion de forma endogena o recombinante (p. ej., mediante la introduccion de casetes de expresion heterologos que expresan uno o mas factores de transcripcion). Las tecnologfas ilustrativas para la induccion de pluripotencia incluyen, pero no se limitan a la introduccion de al menos uno o mas casetes de expresion para la expresion de al menos uno de Oct3/4, Sox2, c-Myc y Klf4 (vease, p. ej., Takahashi, Cell 131(5): 861-872 (2007) Cell Stem Cell 2, 10-12 (2008)), opcionalmente con una o mas moleculas pequenas, incluyendo pero sin limitarse a, un agente que inhibe la metilacion de H3K9, p. ej., una histona metiltransferasa G9a tal como BIX01294. Vease, p. ej., Kubicek, et al., Mol. Cell473-481 (2007).
Las celulas pluripotentes de la descripcion se pueden caracterizar por varios criterios. Ademas de la expresion genica, la metilacion y las caractensticas in vitro e in vivo descritas en la presente memoria, las celulas pluripotentes de la descripcion mantendran la pluripotencia a lo largo de al menos una (p. ej., 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, etc. ) divisiones
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celulares en presencia de factor inhibidor de leucemia (LIF) y protema morfogenica osea (BMP) o, alternativamente, bajo inhibicion de la ruta de senalizacion de TGFp y activina, inhibicion de la ruta de senalizacion de MAPK y opcionalmente inhibicion de la ruta de FGF. Por ejemplo, como se describe en la presente memoria, las celulas animales (p. ej., celulas humanas y de rata) en contacto con un inhibidor de ALK5 y un inhibidor de MEK se mantuvieron en pluripotencia a traves de divisiones multiples. Adicionalmente, como se describe en la presente memoria, la inhibicion de la ruta de senalizacion de TGFp y activina (p. ej., la senalizacion de TGFp) junto con la inhibicion de MEK, FGFR y GSK3 tiene una fuerte actividad de reprogramacion y puede promover la conversion parcial de EpiSC a un estado similar al de las mESC. Por el contrario, las hESC convencionales, las celulas madre de epiblasto (EpiSC) y las celulas pluripotentes inducidas humanas cultivadas en condiciones convencionales se diferencian cuando se ponen en contacto con un inhibidor de ALK5. Vease, p. ej., Saha et al., Biophys. J. 94:41234133 (2008). Se ha informado de que las hESC convencionales, las EpiSC y las celulas pluripotentes inducidas humanas cultivadas en condiciones convencionales, parecen depender de la actividad de la ruta de MAPK, FGF y TGFp/Activina/Nodal para la auto-renovacion y se diferencian rapidamente cuando se tratan con inhibidores de MEK, FGFR y/o ALK4/5/7 (Brons et al., Nature 448, 191-195, 2007; Li et al., Differentiation 75, 299-307, 2007; Peerani et al., EMBO J 26, 4744-4755, 2007; Tesar et al., Nature 448, 196-199, 2007). Adicionalmente, los autores de la presente invencion han encontrado que las celulas de la descripcion (p. ej., celulas humanas o de rata cultivadas como se describe en los ejemplos) mantienen la pluripotencia (es decir, no se diferencian) en presencia de un inhibidor de la ruta de senalizacion de FGF (p. ej., PD173074). En contraste, las hESC, EpiSC y las celulas pluripotentes inducidas humanas cultivadas en condiciones convencionales se diferencian cuando se ponen en contacto con PD173074. Particularmente, las mESC no se diferencian cuando se ponen en contacto con PD173074. Por lo tanto, las celulas de la presente descripcion (p. ej., cultivadas como se describe en la presente memoria) estan en un estado mas similar al de las mESC que las hESC, EpiSC y celulas pluripotentes inducidas humanas cultivadas convencionalmente. Como las mESC, las celulas de la presente descripcion tienen una morfologfa de colonias mas compacta y abovedada, mientras que las hESC, las EpiSC y las celulas pluripotentes inducidas humanas cultivadas convencionalmente tienen una morfologfa de colonia plana. Al igual que las mESC, las celulas de la presente descripcion tienen la capacidad de dar lugar a todos los tipos de celulas in vitro, y contribuyen a un animal completo in vivo, incluyendo la lmea germinal, cuando se colocan de nuevo en blastocitos. Por el contrario, las hESC, EpiSC y las celulas pluripotentes inducidas humanas cultivadas convencionalmente son incapaces de incorporarse a la masa celular interna (MCI) y contribuir al quimerismo. Se apreciara que se pueden generar otras celulas animales aparte de la rata y el ser humano con caractensticas similares utilizando los metodos descritos en la presente memoria. Las celulas animales adicionales ilustrativas incluyen, p. ej., perros, gatos, cerdos, vacas, ovejas, cabras, monos y chimpances.
Ciertos marcadores son utiles para distinguir las celulas de la presente invencion de las hESC, EpiSC y celulas pluripotentes inducidas humanas cultivadas convencionalmente. Por ejemplo, Stra8, Dppa3, Gbx2, Pecaml y Klf4 se expresan a un nivel mas alto en las celulas humanas de la presente invencion en comparacion con sus niveles de expresion en hESC, epiSC y celulas pluripotentes inducidas humanas cultivadas convencionalmente. Por el contrario, muchos genes espedficos del linaje, por ejemplo, Foxa2, Otx2, Lefty 1, Gata6, Soxl7, Cer1, se expresan a un nivel mas alto en epiSC y celulas ES humanas convencionales, en comparacion con sus niveles de expresion en las celulas de la presente invencion. Las celulas iPSC o ESC humanas cultivadas de forma convencional se diferencian cuando se tratan con los inhibidores de MEK, FGFR y/o ALK4/5/7 (Brons et al., Nature 448, 191-195, 2007; Li et al., Differentiation 75, 299-307, 2007; Peerani et al., EMBO J 26, 4744-4755, 2007; Tesar et al., Nature 448, 196-199, 2007).
En particular, Gbx2, Dppa3 y Klf4 son marcadores utiles para caracterizar las celulas animales pluripotentes de la invencion. Estos marcadores estan altamente expresados en las celulas pluripotentes de la invencion. Por ejemplo, en algunas realizaciones, las celulas de la presente invencion expresan estos marcadores a un nivel que es al menos 2 veces su nivel en las hESC, EpiSC y celulas pluripotentes inducidas humanas cultivadas convencionalmente, p. ej., celulas Hues9 (instalacion de hES, Universidad de Harvard,

http://mcb.harvard.edu/melton/hues/). En algunas realizaciones, los niveles de expresion de estos marcadores en las celulas pluripotentes de la invencion son al menos 2 veces, 2,5 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces o mas. Otros marcadores utiles incluyen un marcador Rex1 de MCI.
En algunas realizaciones, Gbx2 se expresa en las celulas pluripotentes de la invencion a un nivel que es al menos 5 veces el de las celulas Hues9. En algunas realizaciones, Klf4 se expresa en las celulas pluripotentes de la invencion a un nivel que es al menos 2,5 veces mayor que el de las celulas Hues9. En algunas realizaciones, Dppa3 se expresa en las celulas pluripotentes de la invencion a un nivel que es al menos 2 veces mayor que el de las celulas Hues9.
Otro marcador util para las celulas pluripotentes de la invencion es la E-cadherina. Sin pretender limitar el alcance de la invencion, se cree que la E-cadherina desempena un papel en la pluripotencia de las celulas de la invencion. En algunas realizaciones, la E-cadherina se expresa en las celulas pluripotentes de la invencion a un nivel que es 2 veces superior al de las celulas Hues9.
Se pueden utilizar otros marcadores pluripotentes tfpicos para la caracterizacion de las celulas de la invencion, p. ej., Oct4, Sox2, Nanog, SSEA-I, SSEA-3, SSEA4, TRA-1-61, TRA-1-81 y fosfatasa alcalina (ALP). Estos marcadores pluripotentes tfpicos, o un subconjunto de ellos, pueden ser utiles para distinguir las celulas pluripotentes de la
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invencion de hESC, EpiSC y celulas pluripotentes inducidas humanas convencionalmente cultivadas.
Se pueden utilizar metodos conocidos en la tecnica para caracterizar las celulas de la invencion. Los niveles de expresion genica se pueden detectar mediante, p. ej., mediante PCR en tiempo real o RT-PCR en tiempo real (p. ej., para detectar ARNm), y/o mediante transferencia Western u otra tecnica de deteccion de protemas.
Las celulas pluripotentes de la invencion se diferencian hacia los linajes del mesodermo en respuesta al tratamiento con BMP. Por el contrario, las hESC, las EpiSC y las celulas pluripotentes inducidas humanas cultivadas convencionalmente generan trofoblastos o celulas endodermicas primitivas (Brons et al., Nature 448, 191-195, 2007, D'Amouret al., Nat Biotechnol 23, 1534-1541 , 2005, Xu et al., Nat Biotechnol 20, 1261-1264, 2002).
IV. Transformacion
Cuando se desean celulas transformadas (p. ej., para generar iPSC o para expresar una protema o acido nucleico deseados), las celulas que se han puesto en contacto con los inhibidores de la descripcion (p. ej., inhibidores de ALK5, inhibidores de MAPK, inhibidores de la ruta de FGF y opcionalmente inhibidores de GSK3p) se pueden transformar antes del contacto y/o se pueden transformar despues del contacto. Por ejemplo, una ventaja de la presente invencion es que permite el mantenimiento de celulas pluripotentes a traves de multiples pases de celulas y por lo tanto permite manipulaciones y la seleccion subsiguiente de la progenie mientras se mantienen las caractensticas pluripotentes de las celulas. Esto es util, entre otras cosas, para la generacion de animales transgenicos, incluyendo la generacion de animales con un gen desactivado ("knockout") por medio de eventos de recombinacion espedficos de la secuencia como se describe en la presente memoria.
Esta invencion se basa en tecnicas rutinarias en el campo de la genetica recombinante. Los textos basicos que describen los metodos generales de uso en esta invencion incluyen Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3a edicion, 2001); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990); y Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al, eds., 1994)).
En algunas realizaciones, en las que se desea una expresion positiva de una protema, la especie de celula y protema que se va a expresar es la misma. Por ejemplo, si se utiliza una celula de raton, se introduce un ortologo de raton en la celula. Si se utiliza una celula humana, se introduce un ortologo humano en la celula.
Se apreciara que cuando dos o mas protemas se han de expresar en una celula, se pueden utilizar uno o multiples casetes de expresion. Por ejemplo, cuando un casete de expresion es para expresar multiples polipeptidos, se puede utilizar un casete de expresion policistronico.
A. Vectores plasmfdicos
En ciertas realizaciones, se contempla un vector plasmfdico para su uso para transformar una celula anfitriona. En general, se utilizan vectores plasmfdicos que contienen replicones y secuencias de control que derivan de especies compatibles con la celula anfitriona en conexion con estos anfitriones. El vector puede llevar un sitio de replicacion, asf como secuencias marcadoras que son capaces de proporcionar seleccion fenotfpica en celulas transformadas.
B. Vectores Virales
La capacidad de ciertos virus para infectar celulas o penetrar en las celulas a traves de la endocitosis mediada por receptores, e integrarse en el genoma de la celula anfitrionas y expresar genes virales de manera estable y eficiente, los han convertido en candidatos atractivos para la transferencia de acidos nucleicos foraneos a celulas (p. ej., celulas de mairnfero). A continuacion se describen ejemplos no limitantes de vectores de virus que se pueden utilizar para suministrar un acido nucleico de la presente invencion.
i. Vectores adenovirales
Un metodo particular para el suministro del acido nucleico implica el uso de un vector de expresion de adenovirus. Aunque se sabe que los vectores de adenovirus tienen una baja capacidad de integracion en el ADN genomico, esta caractenstica se contrapesa por la alta eficacia de la transferencia genica proporcionada por estos vectores. Se entiende que "vector de expresion de adenovirus" incluye aquellos constructos que contienen secuencias de adenovirus suficientes para (a) soportar el empaquetamiento del constructo y (b) expresar en ultima instancia un constructo espedfico de tejido o celula que ha sido clonado en el mismo. El conocimiento de la organizacion genetica o adenovirus, un virus de ADN lineal de doble hebra de ~36 kb, permite la sustitucion de grandes fragmentos de ADN adenoviral con secuencias foraneas de hasta 7 kb (Grunhaus et al., Seminar in Virology, 200(2): 535-546, 1992)).
ii. Vectores de AAV
El acido nucleico se puede introducir en la celula utilizando la transfeccion asistida por adenovirus. Se han descrito incrementos en las eficacias de transfeccion en sistemas celulares utilizando sistemas acoplados a adenovirus (Kelleher y Vos, Biotechniques, 17(6):1110-7, 1994; Cotten et al., Proc Natl Acad Sci USA, 89(13):6094-6098, 1992, Curiel, Nat Immun, 13(2-3):141-64, 1994). El virus adeno-asociado (AAV) es un sistema vector atractivo porque tiene
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una alta frecuencia de integracion y puede infectar celulas que no se dividen, haciendolo por lo tanto util para el suministro de genes en celulas de mairnfero, por ejemplo, en cultivo de tejidos (Muzyczka, Curr Top Microbiol Immunol, 158:97-129, 1992) o in vivo. Los detalles relativos a la generacion y uso de vectores de rAAV se describen en las Patentes de los Estados Unidos Num. 5.139.941 y 4.797.368.
iii. Vectores retrovirales
Los retrovirus son prometedores como vectores de suministro de genes debido a su capacidad para integrar sus genes en el genoma del anfitrion, transferir una gran cantidad de material genetico foraneo, infectar un amplio espectro de especies y tipos de celulas y ser envasados en lmeas celulares especiales (Miller et al., Am. J. Clin. Oncol, 15(3):216-221, 1992).
Con el fin de construir un vector retroviral, se inserta un acido nucleico (p. ej., un gen codificante de interes) en el genoma viral en lugar de ciertas secuencias virales para producir un virus que tiene una replicacion defectuosa. Para producir viriones, se construye una lmea celular de empaquetamiento que contiene los genes gag, pol y env pero sin la LTR y los componentes de empaquetamiento (Mann et al., Cell, 33:153-159, 1983). Cuando un plasmido recombinante que contiene un ADNc, junto con la LTR retroviral y las secuencias de empaquetamiento se introduce en una lmea celular especial (p. ej., por precipitacion con fosfato calcico, por ejemplo), la secuencia de empaquetamiento permite que el transcrito de ARN del plasmido recombinante sea empaquetado en partmulas virales, que a continuacion se secretan al medio de cultivo (Nicolas y Rubinstein, En: Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses, Rodriguez y Denhardt, eds., Stoneham: Butterworth, pags. 494-513, 1988; Temin, En: Gene Transfer, Kucherlapati (ed.), Nueva York: Plenum Press, pags. 149-188, 1986; Mann et al., Cell, 33:153-159, 1983). Los medios que contienen los retrovirus recombinantes se recogen despues, opcionalmente se concentran, y se utilizan para la transferencia genica. Los vectores retrovirales son capaces de infectar una amplia variedad de tipos celulares. Sin embargo, la integracion y la expresion estable implican tfpicamente la division de las celulas anfitrionas (Paskind et al., Virology, 67:242-248, 1975).
Los lentivirus son retrovirus complejos que, ademas de los genes retrovirales comunes gag, pol y env, contienen otros genes con funcion reguladora o estructural. Los vectores lentivirales son bien conocidos en la tecnica (vease, p. ej., Naldini et al., Science, 272 (5259):263-267, 1996; Zufferey et al., Nat Biotechnol, 15(9):871-875, 1997; Blomer et al., J Virol, 71(9): 6641-6649, 1997; Patentes de los Estados Unidos Num. 6.013.516 y 5.994.136). Algunos ejemplos de lentivirus incluyen los Virus de Inmunodeficiencia Humana: VIH-1, VIH-2 y el Virus de la Inmunodeficiencia de Simios: VIS. Se han generado vectores lentivirales por atenuacion multiple de los genes de virulencia del VIH, por ejemplo, se eliminan los genes env, vif, vpr, vpu y nef haciendo que el vector sea biologicamente seguro.
Los vectores lentivirales recombinantes son capaces de infectar celulas que no se dividen y se pueden utilizar para la transferencia de genes tanto in vivo y ex vivo como para la expresion de secuencias de acido nucleico. Por ejemplo, el lentivirus recombinante capaz de infectar una celula que no se divide en donde una celula anfitriona adecuada es transfectada con dos o mas vectores que llevan las funciones de empaquetamiento, a saber gag, pol y env, asf como rev y tat se describe en la Patente de los Estados Unidos Num. 5.994.136. Se puede dirigir el virus recombinante por enlace de la protema de la envuelta con un anticuerpo o un ligando particular para el direccionamiento a un receptor de un tipo de celula particular. Mediante la insercion de una secuencia (que incluye una region reguladora) de interes en el vector viral, junto con otro gen que codifica el ligando para un receptor sobre una celula diana espedfica, por ejemplo, el vector es ahora espedfico de la diana.
iv. Suministro utilizando virus modificados
Un acido nucleico que se va a suministrar se puede alojar dentro de un virus infeccioso que ha sido modificado geneticamente para expresar un ligando de union espedfico. La partmula del virus se unira asf espedficamente a los receptores cognados de la celula diana y suministrara el contenido a la celula. Se desarrollo un nuevo enfoque disenado para permitir el direccionamiento espedfico de los vectores de retrovirus basandose en la modificacion qmmica de un retrovirus mediante la adicion qmmica de residuos de lactosa a la envoltura viral. Esta modificacion puede permitir la infeccion espedfica de hepatocitos a traves de receptores de sialoglicoprotema.
Se diseno otro enfoque para dirigir retrovirus recombinantes en el que se utilizaron anticuerpos biotinilados contra una protema de la envuelta retroviral y contra un receptor celular espedfico. Los anticuerpos se acoplaron a traves de los componentes de biotina mediante el uso de estreptavidina (Roux et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 86:90799083, 1989). Utilizando anticuerpos contra antfgenos de clase I y clase II del complejo principal de histocompatibilidad, demostraron la infeccion de una variedad de celulas humanas que portaban esos antfgenos de superficie con un virus ecotropico in vitro (Roux et al., 1989).
C. Suministro de vectores y transformacion de celulas
Se cree que los metodos adecuados para el suministro de acido nucleico para la transformacion de una celula, un tejido o un organismo para su uso con la presente invencion incluyen virtualmente cualquier metodo mediante el cual un acido nucleico (p. ej., ADN) pueda ser introducido en una celula, un tejido o un organismo, como se describe en la presente memoria o como sena conocido por un experto en la tecnica. Tales metodos incluyen, pero no se limitan a,
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el suministro directo de ADN, por ejemplo mediante transfeccion ex vivo (Wilson et al., Science, 244:1344-1336, 1989, Nabel y Baltimore, Nature 326:711-713, 1987), opcionalmente con Fugene6 (Roche) o Lipofectamine (Invitrogen), por inyeccion (Patentes de los Estados Unidos Num. 5.994.624, 5.981.274, 5.945.100, 5.780.448, 5.736.524, 5.702.932, 5.656.610, 5.589.466 y 5.580.859), incluyendo microinyeccion (Harland y Weintraub, J Cell Biol., 101:1094-1099, 1985; Patente de los Estados Unidos Num. 5.789.215, incorporada a la presente memoria como referencia); por electroporacion (Patente de Estados Unidos Num. 5.384.253, Tur-Kaspa et al., MoI Cell Biol., 6:716-718, 1986, Potter et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 81:7161-7165, 1984); por precipitacion con fosfato de calcio (Graham y Van Der Eb, Virology, 52:456-467, 1973, Chen y Okayama, MoI, Cell Biol., 7(8):2745-2752, 1987; Rippe et al., MoI. Cell Biol., 10:689-695, 1990); utilizando DEAE-dextrano seguido de polietilenglicol (Gopal, MoI. Cell Biol., 5:1188-1190, 1985); por carga sonica directa (Fechheimer et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 84:8463-8467, 1987); por transfeccion mediada por liposomas (Nicolau y Sene, Biochim, Biophys Acta, 721:185-190, 1982; Fraley et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 76:3348-3352, 1979; Nicolau et al., Methods Enzymol, 149:157-176, 1987; Wong et al., Gene, 10:87-94, 1980; Kaneda et al., Science, 243:375-378, 1989; Kato et al., J Biol. Chem., 266:3361-3364, 1991) y transfeccion mediada por receptores (Wu y Wu, Biochemistry, 27:887-892, 1988; Wu y Wu, J. Biol Chem., 262:4429-4432, 1987); y cualquier combinacion de tales metodos.
V. Cultivo de celulas
Las celulas pluripotentes, incluyendo las celulas madre embrionarias y las celulas en las que se ha inducido, o se va a inducir, pluripotencia se pueden cultivar de acuerdo con cualquier metodo conocido en la tecnica. Como se describe en la presente memoria, las celulas pluripotentes se pueden cultivar con un inhibidor de ALK5 y uno de un inhibidor de MEK o Erk, opcionalmente con un inhibidor de GSK3p y/o LIF. Los medios de cultivo pueden incluir cualquier otro componente de los medios de cultivo como se conoce en la tecnica. En algunas realizaciones, los medios de cultivo incluyen componentes de medios basales para la supervivencia celular (p. ej., vitaminas y minerales, opcionalmente en una condicion isotonica). Un medio basal ilustrativo es DMEM o una variacion del mismo, tal como DMEM Knockout. El cultivo se puede suplementar adicionalmente con reemplazo de suero Knockout (KSP). Los cultivos de la invencion pueden incluir una o mas fuentes de carbono. En algunas realizaciones, los cultivos comprenden L-alanil-L-glutamina. Los cultivos pueden incluir suero o pueden estar libres de suero.
En algunas realizaciones, las celulas se cultivan en contacto con celulas alimentadoras. Las celulas alimentadoras ilustrativas incluyen, pero no se limitan a, fibroblastos, p. ej., fibroblastos embrionarios de raton (MEF), o celulas alimentadoras CF1 inactivadas por rayos X. Los metodos de cultivo de celulas sobre celulas alimentadoras son conocidos en la tecnica.
En algunas realizaciones, las celulas se cultivan en ausencia de celulas alimentadoras. Las celulas, por ejemplo, se pueden anclar directamente a una superficie de cultivo solida (p. ej., una placa de cultivo), p. ej., a traves de una traba molecular. Los autores de la presente invencion han descubierto que cultivar celulas en las que se ha inducido pluripotencia tiene una eficacia mucho mayor de induccion de pluripotencia (es decir, una mayor porcion de celulas alcanza la pluripotencia) cuando las celulas se anclan directamente a la superficie de cultivo solida en comparacion con la eficacia de celulas tratadas de forma identica que se cultivan sobre celulas alimentadoras. Las trabas moleculares ilustrativas incluyen, pero no se limitan a, matrigel, una matriz extracelular (ECM), analogos de ECM, laminina, fibronectina o colageno. Sin embargo, los expertos en la tecnica reconoceran que esta es una lista no limitante y que se pueden utilizar otras moleculas para anclar celulas a una superficie solida. Los metodos para el anclaje inicial de las trabas a la superficie solida son conocidos en la tecnica.
VI. Usos de celulas pluripotentes
La presente invencion permite el estudio y desarrollo adicionales de tecnologfas de celulas madre, incluyendo, pero sin limitarse a, usos profilacticos o terapeuticos. Por ejemplo, las celulas de la descripcion (celulas pluripotentes cultivadas en los inhibidores de la invencion o celulas derivadas de tales celulas e inducidas para que se diferencien a lo largo de un destino celular deseado) se pueden introducir en individuos que lo necesiten, incluyendo, pero sin limitarse a, individuos que necesitan la regeneracion de un organo, tejido o tipo celular. Las celulas se pueden obtener originalmente en una biopsia de un individuo; inducir pluripotencia como se describe en la presente memoria, inducir opcionalmente su diferenciacion (por ejemplo en una celula progenitora deseada particular) y a continuacion trasplantar de nuevo al individuo. Las celulas pueden ser modificadas geneticamente antes de su introduccion en el individuo.
En algunas realizaciones, las celulas pluripotentes generadas de acuerdo con los metodos de la invencion son inducidas subsiguientemente a formar, por ejemplo, celulas hematopoyeticas (madre/progenitoras), celulas neurales (madre/progenitoras) (y opcionalmente, celulas mas diferenciadas, tales como neuronas de subtipos espedficos, oligodendrocitos, etc.), celulas pancreaticas (p. ej., celulas progenitoras endocrinas o celulas que expresan hormonas pancreaticas), hepatocitos, celulas cardiovasculares (madre/progenitoras) (p. ej., cardiomiocitos, celulas endoteliales, celulas del musculo liso), celulas de la retina, etc.
Se conoce una diversidad de metodos para inducir la diferenciacion de celulas madre pluripotentes en tipos de celulas deseados. Una lista no limitante de publicaciones de patentes recientes que describen metodos para inducir la diferenciacion de celulas madre en varios destinos celulares es la siguiente: Publicacion de Patente de los
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Estados Unidos Num. 2007/0281355; 2007/0269412; 2007/0264709; 2007/0259423; 2007/0254359; 2007/0196919; 2007/0172946; 2007/0141703; 2007/0134215.
Una variedad de enfermedades puede ser mejorada mediante la introduccion, y opcionalmente el direccionamiento, de celulas pluripotentes de la invencion a un tejido o tejido danado particular en los que las celulas pluripotentes generaran un beneficio. Los ejemplos de enfermedades que resultan de la lesion tisular incluyen, pero no se limitan a, enfermedad neurodegenerativa, infarto cerebral, enfermedad vascular obstructiva, infarto de miocardio, insuficiencia cardiaca, enfermedad pulmonar obstructiva cronica, enfisema pulmonar, bronquitis, enfermedad pulmonar intersticial, asma, hepatitis B (dano hepatico), hepatitis C (dano hepatico), hepatitis alcoholica (dano hepatico), cirrosis hepatica (dano hepatico), insuficiencia hepatica (dano hepatico), pancreatitis, diabetes mellitus, enfermedad de Crohn, colitis inflamatoria, glomerulonefritis IgA, glomerulonefritis, insuficiencia renal, decubito, quemaduras, heridas suturadas, laceracion, heridas incisas, heridas por mordedura, dermatitis, queloides cicatriciales, queloides, ulcera diabetica, ulcera arterial y ulcera venosa.
Se pueden generar animales transgenicos no humanos a partir de celulas pluripotentes incubadas con los inhibidores de la invencion. Tales celulas pueden ser celulas transgenicas, lmeas con un gen desactivado (p. ej., que comprenden uno o mas genes desactivados que introducen un marcador seleccionable a traves de recombinacion espedfica del sitio). Las celulas pluripotentes no humanas incubadas con los inhibidores descritos en la presente memoria se pueden introducir en un blastocisto de un animal no humano compatible y posteriormente se pueden introducir en un utero receptivo de un animal y la progenie resultante se puede seleccionar para determinar celulas derivadas de las celulas pluripotentes (p. ej., a traves de un marcador seleccionable u otras caractensticas fenotfpicas tales como el color de la piel). Se puede identificar la progenie quimerica y se pueden establecer lmeas que pasen las caractensticas (p. ej., un transgen) de las celulas pluripotentes a la progenie. Se pueden establecer lmeas de animales homocigotos cruzando animales hermanos.
La descripcion proporciona la generacion de cualquier tipo de animal transgenico no humano de acuerdo con los presentes metodos. Los animales ilustrativos incluyen mairnferos no humanos y primates no humanos. Los animales ilustrativos incluyen, p. ej., ratones (incluyendo ratones SCID), ratas, perros, gatos, cerdos, vacas, ovejas, cabras, monos y chimpances.
El cultivo de celulas con los inhibidores de la invencion, y por lo tanto el mantenimiento de la pluripotencia de las celulas, permite convenientemente el escrutinio de fenotipos celulares, respuestas a farmacos y tambien permite el escrutinio de bibliotecas de compuestos u otros agentes (p. ej., protemas, acidos nucleicos, o anticuerpos) para determinar la capacidad de modular el fenotipo de una celula pluripotente o para inducir una respuesta celular deseada. Los escrutinios de bibliotecas se pueden disenar para escrutar la capacidad de un miembro de la biblioteca de afectar esencialmente a cualquier fenotipo deseado. Los fenotipos ilustrativos pueden incluir, por ejemplo, diferenciacion celular, apoptosis u otra muerte celular, supervivencia celular, muerte u otro fenotipo en presencia de un compuesto o farmaco adicionales de interes, etc.
Los agentes de la biblioteca pueden ser cualquier compuesto qmmico pequeno, o una entidad biologica, tal como una protema, azucar, acido nucleico o lfpido. Tfpicamente, los agentes de ensayo seran pequenas moleculas qmmicas y peptidos. Esencialmente, se puede utilizar cualquier compuesto qmmico como agente potencial en los analisis de la descripcion, aunque muy a menudo se utilizan compuestos que se puedan disolver en soluciones acuosas u organicas (especialmente con una base de DMSO). Los analisis estan disenados para escrutar bibliotecas qmmicas grandes automatizando las etapas del analisis y proporcionando compuestos de cualquier fuente conveniente a los analisis, los cuales tfpicamente se ejecutan en paralelo (p. ej., en formatos de microtitulacion sobre placas de microtitulacion en analisis roboticos). Se apreciara que hay muchos proveedores de compuestos qmmicos, incluyendo Sigma (St. Louis, MO), Aldrich (St. Louis, MO), Sigma-Aldrich (St. Louis, MO), Fluka Chemika-Biochemica Analytika (Buchs, Suiza).
Una biblioteca qmmica combinatoria es una coleccion de diversos compuestos qmmicos generados por smtesis qmmica o smtesis biologica, combinando una serie de "bloques de construccion" qmmicos tales como reactivos. Por ejemplo, se forma una biblioteca qmmica combinatoria lineal tal como una biblioteca de polipeptidos combinando un conjunto de bloques de construccion qmmicos (aminoacidos) en todas las formas posibles para una longitud de compuesto dada (es decir, el numero de aminoacidos de un compuesto polipeptidico). Se pueden sintetizar millones de compuestos qmmicos a traves de tal mezcla combinatoria de bloques de construccion qmmicos.
La preparacion y el escrutinio de bibliotecas qmmicas combinatorias son bien conocidos por los expertos en la tecnica. Tales bibliotecas qmmicas combinatorias incluyen, pero no se limitan a, bibliotecas de peptidos (vease, p. ej., la Patente de Estados Unidos 5.010.175, Furka, Int. J. Pept. Prot. Res. 37: 487-493 (1991) y Houghton et al., Nature 354:84-88 (1991)). Tambien se pueden usar otras qmmicas para generar bibliotecas de diversidad qmmica. Tales qmmicas incluyen, pero no se limitan a: peptoides (p. ej., Publicacion PCT Num. WO 91/19735), peptidos codificados (p. ej., publicacion PCT WO 93/20242), bio-oligomeros aleatorios (p. ej., Publicacion PCT Num. WO 92/00091), benzodiazepinas (p. ej., Patente de los Estados Unidos 5.288.514), diversomeros tales como hidantomas, benzodiazepinas y dipeptidos (Hobbs et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 90:6909-6913 (1993)), polipeptidos vimlogos (Hagihara et al., J. Amer. Chem. Soc. 114:6568 (1992)), peptidomimeticos no peptfdicos con armazon de glucosa (Hirschmann et al., J. Amer. Chem. Soc. 114:9217-9218 (1992)), smtesis organica analoga de
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bibliotecas de compuestos pequenos (Chen et al., J. Amer. Chem. Soc. 116:2661 (1994)), oligocarbamatos (Cho et al., Science 261:1303 (1993)), y/o peptidil fosfonatos (Campbell et al., J. Org. Chem. 59:658 (1994)), bibliotecas de acidos nucleicos (vease Ausubel, Berger y Sambrook, todos mas arriba), bibliotecas de acidos peptidonucleicos (vease, p. ej., 5.539.083), bibliotecas de anticuerpos (vease, p. ej., Vaughn et al., Nature Biotechnology, 14(3):309- 314 (1996) y documento PCT/US96/10287), bibliotecas de carbohidratos (vease, p. ej., Liang et al., Science, 274:1520-1522 (1996) y Patente de los Estados Unidos 5.593.853), bibliotecas de moleculas organicas pequenas (vease, p. ej., benzodiazepinas, Baunn C&EN, 18 Enero, pagina 33 (1993); isoprenoides, Patentes de los Estados Unidos 5.569.588; tiazolidinonas y metatiazanonas, Patente de los Estados Unidos 5.549.974; pirrolidinas, Patentes de los Estados Unidos 5.525.735 y 5.519.134; compuestos de morfolino, Patente de los Estados Unidos 5.506.337; benzodiazepinas, 5.288.514).
Los dispositivos para la preparacion de bibliotecas combinatorias estan disponibles comercialmente (vease, p. ej., 357 mPs, 390 MPS, Advanced Chem Tech, Louisville KY, Symphony, Rainin, Woburn, MA, 433A Applied Biosystems, Foster City, CA, 9050 Plus, Millipore, Bedford, MA). Ademas, numerosas bibliotecas combinatorias estan disponibles comercialmente (vease, p. ej., ComGenex, Princeton, NJ, Tripos, Inc., St. Louis, MO, 3D Pharmaceuticals, Exton, PA, Martek Biosciences, Columbia, MD, etc.)
EJEMPLOS
RESUMEN: Aqm, los autores de la presente invencion informaron del establecimiento satisfactorio de iPSC de rata novedosas (riPSC), que podfan mantenerse homogeneamente mediante LIF y un coctel de inhibidor de ALK5, inhibidor de GSK3 e inhibidor de MEK. Las riPSC comparten las caractensticas de las ESC de raton y lo mas importante pueden contribuir ampliamente a las quimeras. Los autores de la presente invencion tambien generaron iPSC humanas novedosas (hiPSC) con caractensticas de tipo "ESC de raton", que podfan mantenerse sorprendentemente en cultivo en presencia de inhibidor de MEK e inhibidor de ALK5. Los autores de la presente invencion proponen que sus experimentos proporcionaran un marco para generar celulas madre pluripotentes mediante la reprogramacion a partir de rata u otras especies, cuyas autenticas celulas madre embrionarias aun no estan disponibles.
Ejemplo 1:
Este ejemplo demuestra la generacion y mantenimiento de celulas pluripotentes de rata.
Generacion de riPSC novedosas a partir de celulas WB-F344 por transduccion viral de Oct4/Klf4/Sox2 y cocteles qrnmicos. Se transdujo WB-F344, una lmea celular progenitora de hngado de rata diploide (Grisham et al., Proc Soc Exp Biol Med 204, 270-279 (1993)) con Oct4, Sox2 y Klf4 por medio de retrovirus y a continuacion se dividieron sobre celulas alimentadoras MEF en medio para mESC convencional. Se observaron colonias de tipo ESC compactas y positivas para fosfatasa alcalina (ALP) 10 dfas despues de la transduccion (la eficacia es de aproximadamente 0,4%) (Figura 1A). Sin embargo, cuando se recolectaron las colonias de tipo ESC y se subcultivaron en el mismo medio, rapidamente se diferenciaron y perdieron la morfologfa de las ESC (Figura 1B), lo que sugiere que las condiciones del medio para mESC convencional no son suficientes para mantener la pluripotencia de las riPSC. Dada la nocion de que las moleculas pequenas pueden inhibir las rutas clave de induccion de la diferenciacion, los autores de la presente invencion y otros han identificado previamente y utilizado pequenas moleculas para apoyar la auto-renovacion de las mESC de una manera mas robusta (Schugar et al., Gene Ther 15, 126-135 ), Xu et al., Nat Biotechnol 20, 1261-1264 (2002)). Basandose en dicha estrategia qmmica y en las diferencias de senalizacion para el mantenimiento de la auto-renovacion de las mESC y las EpiSC/hESC, los autores de la presente invencion seleccionaron el inhibidor de MEK PD0325901, el inhibidor de ALK5 (el principal receptor de tipo I de la senalizacion de TGFp) A-83-01, el inhibidor de GSK3p CHIR99021, y el inhibidor de FGFR PD173074, y se sometieron a ensayo los efectos de diferentes combinaciones de moleculas pequenas sobre el mantenimiento de la pluripotencia de las riPSC. Utilizando una combinacion de PD0325901 0,5 jM y CHIR99021 3 |jM, las riPSC se pueden mantener a corto plazo en el cultivo, pero mostrando amplia diferenciacion espontanea (Figura 1C). Despues de pases seriados, las celulas crecidas en estas condiciones proliferaron mas lentamente y el cultivo se deterioro debido a la proliferacion de celulas diferenciadas. Estudios recientes demostraron que PD0325901 combinado con CHIR99021 e inhibidor de FGFR PD173074 pueden mantener la pluripotencia de las mESC de una manera independiente de LIF (Ying et al., Cell 115, 281-292 (2003)). Sin embargo, de un modo similar a la combinacion de PD0325901 y CHIR99021, con la inclusion de PD173074 (0,1 jM) en el medio no mostro ningun beneficio adicional. Debido a que la senalizacion de Activina A/Nodal es importante para mantener el estado indiferenciado de las hESC y las EpiSC, pero prescindible para la auto-renovacion de las mESC, los autores de la presente invencion sometieron a ensayo si la combinacion de PD0325901, CHIR99021 y el inhibidor de TGF-p A-83- 01 podfa suprimir la diferenciacion y promover la auto-renovacion de las riPSC. Curiosamente, con la combinacion de PD0325901 0,5 jM, CHIR99021 3 jM y A-83-01 0,5 jM, las riPSC crecfan como una poblacion mas homogenea y la diferenciacion espontanea se inhibia sustancialmente (Figura 1D). En estas condiciones, la eficacia de expansion clonal tambien aumento significativamente en comparacion con la combinacion de PD0325901 y CHIR99021 (Figura 5). Por otra parte, aunque LIF en sf no era suficiente para sostener la auto-renovacion de riPSC, solo se observaron colonias muy pequenas positivas para ALP y no se podfan mantener a largo plazo en ausencia de LIF (Figura 5). Por otra parte, se requena el unico coctel de inhibidores qrnmicos para la auto-renovacion a largo plazo de las riPSC. Las riPSC se han cultivado en presencia de LIF, PD0325901, A-83-01 y CHIR99021 durante mas
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de 30 pases sin diferenciacion obvia ni disminucion de la proliferacion, pero pierden la morfologfa ESC y se diferencian en un pase despues de que los inhibidores qmmicos se eliminen del medio. En estas condiciones, las riPSC son similares a las mESC convencionales en la formacion de colonias abovedadas tipicas en cultivo (Figura
IE) . La inmunocitoqmmica revelo que las riPSC expresaban marcadores tipicos de mESC, tales como Oct4 (Figura
IF) , Sox2 (Figura 1G), SSEA-I (Figura 1H, Verde), Nanog (Figura iH Rojo), pero eran negativos para los marcadores de hESC, tales como SSEA3, SSEA4 y TRA-1-81. El analisis de rT-PCR de cuatro lmeas de riPSC clonales utilizando cebadores de genes de rata confirmo la expresion de Oct4, Sox2, Nanog, Klf4, Rex-1, TDGF2, FGF4 y Eras (Figura 1I) endogenos de rata. Utilizando los cebadores espedficos para transgenes, el analisis de RT- PCR revelo que los genes Oct4, Sox2 y Klf4 de raton transducido fueron en gran medida silenciados (Figura 1I). El analisis del estado de metilacion del promotor Oct4 de rata mostro metilacion diferencial entre las riPSC y las celulas WB-F344. Los clones de riPSC exhibieron un patron de desmetilacion casi completo y es distinto del de las celulas WB-F344 parentales (Figura 1J). En particular, las riPSC comparten caractensticas moleculares comunes con las mESC, especialmente expresan Rex-1 y ALP, marcadores de ESC y de epiblastos tempranos que estan ausentes en los epiblastos en fase de post-implantacion y EpiSC.
Las riPSC son celulas madre pluripotentes in vitro e in vivo. Para examinar el potencial de desarrollo de las riPSC, se realizo un analisis de diferenciacion in vitro. La inmunotincion mostro que las riPSC podfan diferenciarse en derivados de endodermo (Albumina y Pdxl) (Figura 2A, 2B), neuroectodermo (tubulina plll, Tuji) (Figura 2C) y mesodermo (Brachyury) (Figura 2D) a partir de los metodos de diferenciacion convencionales del cuerpo embrioide. A continuacion, los autores de la presente invencion examinaron el potencial de desarrollo de las riPSC in vivo. Despues del trasplante a ratones con Inmunodeficiencia Severa Combinada (SCID), las riPSC formaban teratoma, que consistfa en las tres capas germinales incluyendo la estructura de tipo neuroepitelio (ectodermo), epitelio de las vfas respiratorias (endodermo), estructura de tipo cardlago (mesodermo) y musculo liso (mesodermo) (Figura 2E ~ 2H). Mas notablemente, despues de haber sido inyectados en blastocistos de rata Brown-Norway (piel negra) (n = 18), nacieron tres ratas ytodas mostraron quimerismo extensivo de color de capa (Figura 2I). Sin embargo, no se ha detectado todavfa ninguna transmision de lmea germinal. Tomados en conjunto, los resultados anteriores definieron las riPSC de los autores de la presnte invencion, distintas de las EpiSC de rata, como una lmea de celulas madre de rata de tipo mESC pluripotente.
Ejemplo 2
Este ejemplo demuestra medios de cultivo para inducir y mantener celulas pluripotentes humanas en un estado analogo al de las celulas madre embrionarias de raton.
A diferencia de las mESC, la senalizacion de bFGF y TGFp/Activina/Nodal es esencial para mantener la auto- renovacion de las hESC y EpiSC convencionales. La inhibicion de las senales de TGFp/Activina/Nodal o FGFR provoca una diferenciacion drastica y rapida de las hESC y EpiSC en las condiciones convencionales de cultivo de hESC. Recientemente, se han generado celulas madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSC) a partir de fibroblastos mediante la expresion de Oct4, Sox2, c-Myc y KIf4 o Oct4, Sox2, Nanog y Lin28 en condiciones de cultivo de bFGF (Dimos et al., Science, 321, 1218-1221 (2008), Lowry et al., Proc Natl Acad Sci USA 105, 2883-2888 (2008); Nakagawa et al., Nat Biotechnol 26, 101-106 (2008); Takahashi et al., Cell 131, 861-872 (2007); Yu et al., Science 318, 1917-1920 (2007)). Tales hiPSC se parecen mucho a las hESC y EpiSC convencionales en los requisitos de senalizacion para la auto-renovacion y la morfologfa celular. Basandose en los estudios con ratas, los autores de la presente invencion exploraron si se podna capturar y mantener un estado de pluripotencia similar al de las mESC para las celulas madre pluripotentes humanas. Sorprendentemente, los autores de la presente invencion encontraron que las hiPSC podfan ser eficazmente generadas a partir de fibroblastos humanos IMR90 por medio de la expresion viral de Oct4, Sox2, Nanog y Lin28 en el medio de mESC que contema hLIF con un calendario y una eficacia similares (Figura 3 A, 15~20 colonias de celulas iPS de 1x105 celulas transducidas de promedio) a la de las condiciones convencionales (Yu et al., Science 318, 1917-1920 (2007)), y se seleccionaron y expandieron posteriormente mediante la adicion del coctel qmmico de inhibidores de ALK5, GSK3 y MEK. Tales hiPSC se renuevan a largo plazo y de forma homogenea (> 20 pases) bajo hLIF y el coctel qmmico de PD0325901, A-83-01 y CHIR99021 (Figura 3B). En contraste con las hESC convencionales, estas hiPSC formaron colonias abovedadas positivas para ALP similares a mESC (Figura 3C), eran resistentes al inhibidor de MEK y al inhibidor de ALK5, mientras que la lmea de hESC convencional H1 se diferenciaba rapidamente en las mismas condiciones. Estas hiPSC expresan de forma homogenea los marcadores de pluripotencia tfpicos, tales como Oct4, Sox2, Nanog, TRA- 1-81, SsEa3 y SSEA-4 (Figura 3D-3I). El analisis mediante Rt-PCR de cuatro lmeas clonales de hiPSC en tales condiciones confirmo la expresion de Oct4, Sox2, Nanog, Rex-1, TDGF2 y FGF4 humanos endogenos (Figura 3J). Mediante el uso de los cebadores espedficos para transgenes, el analisis de RT-PCR revelo que los genes Oct4, Sox2 y Nanog transducidos eran silenciados en gran parte (Figura 3J). Por otra parte, estas hiPSC mostraron patrones de metilacion del ADN similares en el promotor Oct4 como las ESC humanas H1 y eran distintos de los de fibroblastos IMR90 parentales (Figura 3K). De un modo similar a las riPSC, el coctel inhibidor fue necesario para mantener la morfologfa de las colonias abovedadas y la auto-renovacion in vitro a largo plazo de las hiPSC. La eliminacion del coctel inhibidor utilizado hizo que las celulas perdieran la morfologfa de las colonias en un pase. La eliminacion de hLIF del medio no mostro efectos inmediatos/drasticos sobre las celulas. Sin embargo, hLIF parece ser util para el cultivo a largo plazo de las hiPSC. Cuando se cultiva en medio que contiene los inhibidores qmmicos pero sin hLIF, el cultivo de hiPSC se deteriora gradualmente y no se puede pasar homogeneamente mas alla de 10 pases. Sin embargo, queda por determinar el mecanismo de senalizacion exacto en la auto-renovacion de estas
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nuevas hiPSC.
Es importante destacar que la inmunocitoqmmica confirmo que tales nuevas hiPSC podnan diferenciarse in vitro en derivados de endodermo (Albumina) (Figura 4A), neuroectodermo (tubulina plll, Tuj1) (Figura 4B) y mesodermo (Brachyury) (Figura 4C). Ademas, despues de ser transplantadas a los ratones SCID, tales hiPSC formaron teratoma, que consistfa en las tres capas germinales incluyendo estructura de tipo neuroepitelio (ectodermo) (Figura 4D), estructura de tubo epitelial (endodermo) (Figura 4D) y estructura similar a cartflago (mesodermo) (Figura 4E). Tomados en conjunto, los resultados anteriores sugieren que una celula madre pluripotente humana de tipo mESC puede ser capturada y mantenida a largo plazo.
Discusion
Aunque se han establecido celulas madre embrionarias a partir de ratones desde 1981 (Martin, G. R., Proc Natl Acad Sci USA 78, 7634-7638 (1981)), los intentos de derivar sus contrapartes a partir de otros animales tales como rata, no han tenido exito completo (Demers et al., Cloning Stem Cells 9, 512-522 (2007); Ruhnke et al., Stem Cells 21, 428-436 (2003), 2003; Schulze et al., Methods MoI Biol 329, 45-58 2006); Ueda et al., "Establishment of rat embryonic stem cells and making of chimera rats", PLoS ONE 3, e2800 (2008)). Al combinar la reprogramacion genetica y el enfoque qmmico, los autores de la presente invencion han sido capaces de generar nuevas celulas pluripotentes de rata y humanas de tipo mESC que comparten caractensticas clave de las mESC convencionales en la morfologfa de las colonias y los requisitos de cultivo/respuestas de senalizacion. Bajo el singular coctel de pequenas moleculas, las riPSC estables de los autores de la presente invencion fueron capaces de contribuir ampliamente al quimerismo in vivo. Las ratas son mas adecuadas para estudios fisiologicos y de comportamiento y son un excelente modelo para enfermedades humanas multigenicas. Sin embargo, la utilizacion de este modelo inestimable se vio obstaculizada debido a la indisponibilidad de celulas madre de rata que sean pluripotentes in vivo. El establecimiento por parte de los autores de la presente invencion de celulas pluripotentes de rata y la estrategia de utilizar los cocteles qmmicos adecuados allanara el camino para generar ratas dirigidas por genes para investigaciones biomedicas. Las hiPSC de los autores de la presente invencion crecieron de forma mas robusta y paredan representar un nuevo estado pluripotente que era similar al de las mESC convencionales y diferente del de las hESC convencionales.
Tomados en conjunto, tales hallazgos subrayan la ventaja unica del enfoque qmmico, y senalan la importancia de inhibir la via de TGF-p para mantener el estado pluripotente de tipo mESC de celulas de rata y de ser humano. Los estudios de los autores de la presente invencion proporcionan colectivamente un marco para generar celulas madre pluripotentes mediante la reprogramacion o derivar ESC de la fase de MCI temprana de ratas u otras especies, cuyas celulas madre embrionarias todavfa no estan disponibles.
Procedimientos experimentales
Cultivo celular y transduccion viral: Se transdujeron celulas WB-F344 de rata diploides (Grisham et al., Proc Soc Exp. Biol. Med. 204, 270-279 (1993)), una amable donacion del Profesor William B. Coleman de la Universidad de Carolina del Norte, en el pase 7 por medio de retrovirus basados en pMX para Oct4, Klf4 y Sox2 (Addgene) de raton como se describe (Takahashi, K. y Yamanaka, S., Cell 126, 663-676 (2006)). A las 24 horas, se sembraron 1x105 celulas WB-F344 transducidas sobre MEF de CF1 inactivados con rayos X en una placa de 100 mm y se incubaron con medio de crecimiento para mESC: DMEM Knockout™, sustitucion de suero Knockout al 20%, Glutamax al 1%, aminoacidos no esenciales al 1%, penicilina/estreptomicina al 1%, p-mercaptoetanol 0,1 mM y 103 U/ml mLIF (Millipore). Despues de 10 dfas, las colonias de riPSC se recolectaron para determinar la expansion sobre celulas alimentadoras de MEF en medio de crecimiento para mESC, y se trataron con el inhibidor de MEK PD0325901 (Stemgent, 0,5 pM), el inhibidor de ALK5 A-83-01 (Tocris Bioscience, 0,5 pM) y el inhibidor de GSK3p CHIR99021 (Stemgent, 3 pM).
Se cultivaron fibroblastos humanos IMR90 (ATCC Num. CCL-186) y se transdujeron por medio de lentivirus basados en pSin-EF2-Puro para Oct4, Sox2, Nanog y Lin28 (Addgene) humanos como se ha descrito (Yu et al., Science 318, 1917-1920 (2007)). A las 24 horas, se sembraron 1x105 celulas IMR-90 transducidas sobre las celulas alimentadoras de MEF de CF1 inactivadas por rayos X en una placa de 100 mm. A las 24 horas, el medio se cambio por medio para mESC con un suplemento de 103 U/ml de hLIF (Millipore). Despues de tres semanas, se observaron las colonias de hiPSC y se recogieron en la cuarta semana despues de la infeccion para determinar expansion sobre celulas alimentadoras en el mismo medio que contema el inhibidor de MEK PD0325901 (0,5 pM), el inhibidor de ALK5 A-83-01 (0,25 pM) y GSK3p inhibidor CHIR99021 (3 pM).
Inyeccion de blastocistos: Los blastocistos se recuperaron del utero de hembras Brown-Norway (BN) a los 4,5 dfas despues del coito. Los blastocistos se colocaron en una gota de HEPES bajo aceite mineral. Se inyectaron 8-15 riPSC en la cavidad del blastocisto utilizando una pipeta de microinyeccion. Despues de la inyeccion, los blastocistos se transfirieron a hembras receptoras pseudo-prenadas. Todos los procedimientos con animales estaban de acuerdo con las directrices del Instituto Nacional de Salud.
Datos suplementarios
Los datos suplementarios incluyen los procedimientos experimentales suplementarios, una tabla y una figura.
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Procedimientos experimental suplementarios:
Diferenciacion de iPSC in vitro: La diferenciacion in vitro de riPSC o hiPSC se llevo a cabo mediante los metodos convencionales de diferenciacion de cuerpos embrioides. Las riPSC o hiPSC se disociaron con tripsina-EDTA al 0,05% y se cultivaron en una placa de 100 mm de anclaje ultrabajo en medio DMEM con un suplemento de FBS al 10% para formar los cuerpos embrioides (EB). El medio se cambio cada dos dfas. Una semana mas tarde, se recogieron los EB y se transfirieron a una placa de 6 pocillos recubierta con Matrigel en medio DMEM con FBS al 10%. Tres a siete dfas despues, las celulas se fijaron para el analisis inmunocitoqmmico. Todos los productos de cultivo celular fueron de Invitrogen/Gibco BRL excepto cuando se menciona.
Analisis citoqmmico y de inmunofluorescencia: Se realizo tincion con fosfatasa alcalina de acuerdo con el protocolo del fabricante utilizando el kit de Deteccion de Fosfatasa Alcalina (Millipore). Para el analisis de inmunofluorescencia, las celulas se fijaron en paraformaldelmdo al 4% durante 10 minutos y se lavaron tres veces con PBS que contema Triton X-100 al 0,1% (Sigma-Aldrich). Las celulas fijas se incubaron a continuacion en tampon de bloqueo, Triton X- 100 al 0,1% y suero de burro normal al 10% (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc) en PBS (Invitrogen/Gibco BRL) durante 30 min a temperatura ambiente (RT). Las celulas se incubaron despues con anticuerpo primario durante la noche a 4°C en tampon de bloqueo. Al dfa siguiente, las celulas se lavaron con PBS y se incubaron con anticuerpo secundario en PBS que contema Triton X-100 al 0,1% durante una hora a RT. Se utilizaron anticuerpo anti-Oct4 de raton (1:250) (Santa Cruz Biotechnology), anticuerpo anti-Sox2 de conejo (1:2000) (Chemicon), anticuerpo anti-SSEA1 de raton (1:250) (Santa Cruz Biotechnology), anticuerpo anti-Nanog de conejo (1:500) (Abcam), anticuerpo anti-SSEA3 de rata (1:1000) (Chemicon), anticuerpo anti-SSEA4 de raton (1:1000) (Chemicon), anticuerpo anti-TRA-1-81 de raton (1:1000) (Chemicon), anti-Pdx1 de conejo (1:5000), una donacion del Dr. C. Wright (Vanderbilt University, TN), anticuerpo anti-tubulina pIII (Tuj1) de raton (1:1000) (Covance Research Products), anticuerpo anti-albumina de conejo (1:1000) (DAKO) como anticuerpos primarios. Los anticuerpos secundarios fueron Alexa Fluor 486/555 de burro anti-IgG de raton, anti-IgG de rata, anti-IgG de cabra o anti-IgG de conejo (1:500) (Invitrogen). Los nucleos se visualizaron mediante tincion con DAPI (Sigma-Aldrich). Las imagenes fueron capturadas con un microscopio Nikon Eclipse TE2000-U.
Analisis de RT-PCR: Se extrajo ARN de las riPSC e hiPSC utilizando el RNeasy Plus Mini Kit combinado con QIAshredder (Qiagene). La transcripcion inversa se realizo con 1 |jg de ARN utilizando iScriptTMcDNA Synthesis Kit (BioRad). La amplificacion de genes espedficos se realizo utilizando los cebadores mostrados en la Tabla 1. Las condiciones de la PCR fueron 95°C durante 5 minutos, 94°C durante 30 segundos, temperatura de reasociacion durante 30 segundos y 72°C durante 30 segundos, 25-35 ciclos y despues 72°C durante 10 minutos. Para el estudio de metilacion del promotor Oct4 utilizando secuenciacion de bisulfito, se aislaron los ADN de las celulas WB-F344, riPSC, IMR90, e hiPSC utilizando el Kit de Aislamiento de ADN No Organico (Millipore). Los ADN se trataron a continuacion con el kit EZ DNA Methylation-Gold (Zymo Research Corp., Orange, CA). Los ADN tratados se utilizaron despues como moldes para amplificar secuencias de interes. Los cebadores utilizados para la amplificacion del fragmento del promotor Oct4 se mostraron en la Tabla 1. Los fragmentos resultantes se clonaron utilizando el Kit TOPO TA Cloning para la secuenciacion (Invitrogen) y se secuenciaron.
Formacion de teratoma: Se recolectaron las riPSC o hiPSC pasadas en serie utilizando tripsina-EDTA al 0,05%. Se inyectaron entre tres y cinco millones de celulas bajo la capsula renal de ratones SCID (n = 3). Despues de 4-5 semanas, todos los ratones desarrollaron teratomas, que se retiraron y luego se analizaron histologicamente.
Tabla 1: Lista de informacion de los cebadores para la PCR
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Ejemplo de Referencia 3 Obtencion de celulas madre embrionarias de rata
Para obtener celulas ES de rata a partir de blastocistos, se siembran blastocistos de rata con la zona pelucida retirada (E4.5) sobre celulas alimentadoras CF1 inactivadas con rayos X con el medio DMEM Knock-out con un remplazo de suero Knock-out al 20% (KSR), aminoacidos no esenciales al 1%, 1000 U/ml de LIF de raton, Glutmax al 1%, CHIR99021 3 pM, PD0325901 0,5 pM, A-83-01 0,25 pM (o SB431542 2 pM). Despues de 3-5 dfas, los grupos de celulas derivadas de MCI se disociaron por medio de Accutase y se transfirieron a nuevos alimentadores. Se recogieron colonias con morfologfa de celulas ES tipicas, se disociaron con Accutase y a continuacion se sembraron en nuevos alimentadores. Las celulas ES de rata establecidas se cultivaron con el medio anterior y se pasaron aproximadamente cada 3 dfas (1:6). Tanto las celulas ES de rata como las riPSC requieren la presencia de LIF y coctel de inhibidores (CHIR99021, PD0325901, A-83-01) para la auto-renovacion a largo plazo. Las celulas ES de rata y las riPSC expresan los marcadores pluripotentes de celulas ES de raton, tales como Oct4, Sox2, Nanog y SSEA-I, etc., pero no los marcadores, tales como SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-61 y TRA-1-81, que fueron expresados por celulas ES humanas cultivadas convencionalmente. Tanto las celulas ES de rata como las riPSC expresan los marcadores de MCI Rex-1 y ALP, que no se expresan en EpiSC de raton.
Ejemplo de referencia 4 Obtencion de celulas madre embrionarias humanas y de mono
Para convertir celulas ES humanas y de mono a un estado pluripotente similar al de las celulas ES de raton (MCI temprana), se cultivaron celulas ES humanas (Hues9) y celulas ES de mono (R366.4) con el medio DMEM/F-12 con un suplemento de sustitutivo de suero Knock-out (KSR) al 20%, aminoacidos no esenciales al 1%, Glutmax al 1%, 10 ng/ml de bFGF. Cuando las celulas alcanzaron una confluencia del 50%, los medios se cambiaron a DMEM/F-12 Advance, 1 x N2, 1 x B27, Glutmax al 1%, 50 pg/ml de medio BSA con un suplemento de inhibidor de Desmetilasa-1 Espedfica de Lisina (Parnate) 2 pM. Despues de tres dfas, las celulas se cultivaron con el mismo medio que contema 10 pg/ml de LiF humano, CHIR99021 3 pM, PD0325901 0,5 pM y SB431542 2 pM, pero sin Parnate. A pesar de la intensa diferenciacion, se visualizaron colonias de tipo celulas ES de raton compactas aproximadamente a una semana de tratamiento. Las celulas ES humanas/de mono convertidas se cultivaron con el medio anterior y se pasaron aproximadamente cada 4 ~ 5 dfas (1:6). Las celulas expresan los marcadores pluripotentes, tales como Oct4, Sox2, Nanog, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-61, TRA-1-81 ytambien los marcadores de MCI Rex-1 y ALP.
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Ejemplo 5 Conversion de celulas madre de epiblasto en celulas madre embrionarias por medio de pequenas moleculas
Las celulas madre embrionarias murinas convencionales (ESC) derivan de y representan celulas pluripotentes de la masa celular interna (MCI) de blastocistos antes de la implantacion. Se pueden auto-renovar indefinidamente y tienen la capacidad de dar lugar a todos los tipos de celulas in vitro, y lo mas importante, contribuyen a un animal entero in vivo, incluyendo la lmea germinal, cuando se colocan de nuevo en blastocistos. Mas recientemente, se obtuvo un tipo diferente de celulas pluripotentes a partir de epiblastos de la fase posterior a la implantacion, denominadas celulas madre de epiblastos (EpiSC) (Brons et al., Nature 448, 191-195, 2007; Tesar et al., Nature 448, 196-199, 2007). Si bien las EpiSC se pueden auto-renovar a largo plazo y parecen ser pluripotentes tanto in vitro como in vivo en los analisis de teratoma, en contraste con las mESC, son incapaces de incorporarse a la MCI y contribuir al quimerismo, confirmando que las EpiSC proceden de y representan una fase mas avanzada/tardfa de desarrollo de la pluripotencia que las ESC derivadas de MCI y sugiriendo que no podnan ser "reprogramadas" de nuevo a celulas pluripotentes en fase MCI, incluso en el entorno in vivo. Las ESC humanas convencionales, aunque deriven de blastocistos, parecen corresponder muy estrechamente a las EpiSC con respecto a muchas caractensticas, incluyendo cierta expresion genica, morfologfa de las colonias (es decir, colonias planas) y las respuestas de senalizacion en auto-renovacion y diferenciacion. Las EpiSC/hESC tambien son funcionalmente y mecanicamente distintas de las mESC (que tienen una morfologfa de colonias mas compacta y abovedada) en muchas otras maneras. Por ejemplo, mientras que las mESC se auto-renuevan bajo el factor inhibidor de la leucemia (LIF) y la protema morfogenica osea (BMP) (Ying et al., Cell 115, 281-292, 2003) o bajo la inhibicion de MEK y/o FGFR (Ying et al., Nature 453, 519-523, 2008), las EpiSC/hESC dependen de la actividad de la ruta de MAPK, FGF y TGFp/Activina/Nodal para la auto-renovacion, y se diferencian rapidamente cuando se tratan con inhibidores de MEK, FGFR y/o ALK4/5/7 (Brons et al., Nature 448, 191-195, 2007; Li et al., Differentiation 75, 299-307, 2007; Peerani et al. EMBO J 26, 4744-4755, 2007; Tesar et al., Nature 448, 196-199, 2007). Ademas, en respuesta al tratamiento con BMP bajo condiciones de diferenciacion definidas, las mESC se diferencian hacia los linajes de mesodermo mientras que las EpiSC/hESC generan trofoblastos o celulas de endodermo primitivas (Brons et al., Nature 448, 191-195, 2007; D'Amour et al. Nat Biotechnol 23, 1534-1541, 2005; Xu et al., Nat Biotechnol 20, 12611264, 2002). Estas observaciones apoyan firmemente la idea de que las EpiSC y las hESC son intnnsecamente similares, y plantean una hipotesis atractiva: como las mESC y las EpiSC/hESC representan dos estados de pluripotencia distintos: el estado de tipo mESC representa la MCI de blastocistos pre-implantacion y el estado de tipo EpiSC representa los epiblastos post-implantacion, si el estado de epiblasto (incluyendo las hESC convencionales) puede ser convertido de nuevo al estado MCI. Debido a la clara diferencia en su capacidad de contribuir al quimerismo de las mESC o las mEpiSC (que ofrecena una confirmacion definitiva de la conversion funcional de las EpiSC en mESC), el sistema murino representa una plataforma ideal para estudiar un proceso tan intrigante, y proporciona una base para generar tal vez un nuevo tipo de celulas pluripotentes humanas de tipo MCI/mESC a partir de las hESC convencionales.
Las EpiSC expresan genes de pluripotencia maestros, incluyendo Oct4, Sox2, y Nanog. Se ha demostrado que la expresion en exceso de Oct4, Sox2 y Klf4 induce la reprogramacion de las celulas somaticas murinas para que se conviertan en celulas pluripotentes competentes en la lmea germinal (Nakagawa et al., Nat Biotechnol 26, 101-106, 2008). Ademas, se ha demostrado que las celulas madre de la lmea germinal, que expresan menos genes de pluripotencia (p. ej., carecen de expresion de Nanog), se pueden convertir en celulas de tipo mESC en cultivo (Chambers et al., Nature 450, 1230-1234, 2007; Kanatsu-Shinohara et al., Cell 119, 1001-1012, 2004). Ademas, recientemente se obtuvo un tipo de celulas no pluripotentes (llamado FAB-SC) a partir de blastocitos, y se mostro que generaba celulas de tipo mESC pluripotentes simplemente bajo condiciones de LIF y BMP (Chou et al., Cell 135, 449-461, 2008). Ademas, estudios recientes sugirieron que subpoblaciones de celulas dentro de las colonias de mESC exhibfan una expresion dinamica de varios factores de transcripcion clave (p. ej., Nanog, Rex1 y Stella) que los hace fluctuar continuamente entre estados diferentes (p. ej., entre fenotipos de tipo ESC y epiblasto) (Chambers et al., Nature 450, 1230-1234, 2007; Hayashi et al., Cell Stem Cell 3, 391-401, 2008; Singh et al., Stem Cells 25, 2534-2542, 2007; Toyooka et al., Development 135, 909-918, 2008). Estos estudios plantean la posibilidad de que las EpiSC existentes en un estado de pluripotencia menos "estable" que las mESC de MCI pueden tener la capacidad de regresar de nuevo a un estado de mESC "espontaneamente" bajo la fluctuacion del cultivo in vitro. Para someter a ensayo esta hipotesis, las EpiSC se trataron con tripsina en celulas individuales y se cultivaron en placa bajo condiciones de auto-renovacion de mESC, basandose en la nocion de que celulas de tipo mESC "convertidas" dentro de las colonias de EpiSC senan capturadas/seleccionadas y expandidas bajo condiciones que promovenan la auto-renovacion de las mESC pero inducinan la diferenciacion de las EpiSC. Los autores de la presente invencion encontraron EpiSC se diferenciaban (p. ej., celulas diseminadas/emigradas fuera de las colonias) en el primer pase y no se pudieron identificar colonias a lo largo de varios pases cuando se cultivaron bajo condiciones convencionales de crecimiento de mESC con celulas alimentadoras y con un suplemento de LIF (Fig. 6A). Dado que la conversion "espontanea" de las EpiSC a mESC podna ser muy ineficiente, podnan requerirse unas condiciones de promocion de la auto-renovacion diferencial y de la diferenciacion mas rigurosas para seleccionar/capturar y expandir aquellas celulas de tipo mESC convertidas "raras" a partir de EpiSC (p. ej., lograr una distincion fenotipica mas limpia y minimizar el crecimiento en exceso de las EpiSC diferenciadas). Basandose en las respuestas de senalizacion diferencial (auto-renovacion vs. diferenciacion) entre las mESC y las EpiSC en el contexto de las rutas de senalizacion de FGF y MAPK, asf como la observacion de que la inhibicion de la senalizacion MEK-ERK promueve la reprogramacion de las celulas hacia un estado mas primitivo (Chen et al., Proc
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Natl Acad Sci USA 104, 10482-10487, 2007; Shi et al., Cell Stem Cell 2, 525-528, 2008; Silva et al., PLoS Biol 6, e253, 2008), los autores de la presente invencion trataron a continuacion las EpiSC con una combinacion de inhibidor de FGFR selectivo PD173074 (0,1 jM) e inhibidor de MEK PD0325901 (0,5 jM) en condiciones de auto- renovacion de mESC regulares. En estas condiciones 2PD/LIF que promueve el crecimiento clonal robusto de las mESC e inhibe el crecimiento de celulas diferenciadas, los autores de la presente invencion observaron una diferenciacion acelerada de las EpiSC y una disminucion del crecimiento del cultivo celular total. La mayona de las celulas murieron cuando se mantuvieron en cultivo en el medio 2PD/LIF y no se identifico ninguna colonia de tipo mESC en pases seriados. De manera similar, la adicion de CHIR99021 (3 |jM) a las condiciones 2PD/LIF para un mejor crecimiento/supervivencia de mESC no promovio ni capturo la conversion de las EpiSC a un estado de tipo mESC (Figura 6A). Estos resultados sugieren que las EpiSC representan un estado de pluripotencia "estable" que no se convierte facilmente en un estado de tipo ESC de manera espontanea en condiciones que promueven la auto- renovacion de las mESC. Esto es tambien coherente con un estudio mas reciente en el que se demostro que la conversion de las EpiSC en un estado de tipo mESC solo se podna lograr por medio de la expresion en exceso de Klf4 junto con el uso de inhibidores qmmicos de MEK y GSK3 (Guo et al., Development 136, 1063 -1069, 2009).
La actividad TGFp/Activina/Nodal se regula dinamicamente de manera temporal y espacial durante la embriogenesis de raton y se requiere durante la implantacion para controlar el destino de las celulas progenitoras tempranas en los epiblastos (Mesnard et al., Development 133, 2497-2505, 2006). La obtencion de EpiSC que requiere actividades de la ruta de FGF y TGFp/Activina/Nodal sugiere que TGFp/Activina/Nodal proporciona una senal de anti-diferenciacion para las EpiSC (Brons et al., Nature 448, 191-195, 2007; Tesar et al., Nature 448, 196-199, 2007). Adicionalmente, se informo de que la E-cadherina se expresa en embriones desde la etapa de una celula y la regulacion a la baja de la E-cadherina por la senalizacion facilita la implantacion de blastocisto (Li et al., J Biol Chem 277, 46447-46455, 2002). Por otra parte, las actividades de TGFp/Activina/Nodal tambien promueven la transicion epitelial-mesenquimal (EMT) regulando a la baja la E-cadherina durante la gastrulacion (Derynck y Akhurst, Nat Cell Biol 9, 1000-1004, 2007; Gadue et al., Proc Natl Acad Sci USA 103, 16806-16811, 2006; Sirard et al., Genes Dev 12, 107-119, 1998). Basandose en estos estudios, los autores de la presente invencion especularon que la inhibicion de la senalizacion TGFp/Activina/Nodal podna promover el proceso de transicion mesenquimal-epitelial (MET) y, por tanto, la conversion de las EpiSC en un estado de tipo mESC. A-83-01 es un inhibidor selectivo de ALK4/5/7, que no tiene efecto inhibidor cruzado sobre los receptores de BMP (Tojo et al., Cancer Sci 96, 791-800, 2005). De acuerdo con los informes anteriores, el bloqueo de la senalizacion de TGFp/Activina/Nodal por A-83-01 0,5 jM indujo una rapida diferenciacion de las EpiSC en condiciones de cultivo de EpiSC/hESC con un suplemento de bFGF. En contraste drastico, en condiciones de cultivo de mESC que se complementaba con LIF, A-83-01 indujo a la poblacion total de EpiSC para formar colonias mas compactas y abovedadas que se asemejaban a la morfologfa de las colonias de mESC y expresaban ALP (un marcador de pluripotencia altamente expresado en mESC, pero no en EpiSC) (Fig. 6C). Otro inhibidor de ALK4/5/7 espedfico ampliamente utilizado SB431542 tiene un efecto similar sobre las EpiSC. Cuando las colonias tratadas con A-83-01 se expusieron a las condiciones de 2PD/LIF para la seleccion, mas de 50% de las colonias se podfan auto-renovar y mantener la actividad de ALP, lo que sugiere que las celulas adquinan ciertas propiedades de mESC. Aquellas colonias positivas para ALP abovedadas se mantuvieron adicionalmente y se expandieron en medio de crecimiento de mESC con un suplemento de inhibidores de ALK5, MEK, FGFR y GSK3 (denominadas condiciones mAMFGi). Estas celulas se pueden auto-renovar a largo plazo en las condiciones mAMFGi, tienen una morfologfa de colonias de mESC indistinguible (Fig. 6D), y expresan los marcadores de pluripotencia tales como Oct4, Nanog, SSEA-1, asf como recuperan el marcador de MCI Rex-1. Sin embargo, cuando estas celulas fueron marcadas con un GFP constitutivamente activo por lentivirus, y agregadas con morulas, los autores de la presnete invencion no obtuvieron animales quimericos despues de que los embriones resultantes fueron trasplantados a ratones (Figura 7A). Estos resultados indicaron que la inhibicion de la senalizacion de TGFp junto con la inhibicion de MEK, FGFR y GSK3 tiene una fuerte actividad de reprogramacion y puede promover la conversion parcial de las EpiSC en un estado de tipo mESC.
Se han establecido modificaciones de histonas, tales como acetilacion y metilacion, para desempenar papeles importantes en la regulacion genica. Se ha indicado que Stella es un gen importante en la competencia de mESC con la lmea germinal, y es transcripcionalmente silenciosa en EpiSC y celulas de tipo epiblasto dentro de las mESC. Ademas, la modificacion de las histonas regula la expresion de Stella en las mESC (Hayashi et al., Cell Stem Cell 3, 391-401, 2008; Tesar et al., Nature 448, 196-199, 2007). Los autores de la presente invencion especularon que una desrepresion de los loci de los genes silenciados responsables de la verdadera pluripotencia in vivo puede promover las EpiSC para superar la restriccion/umbral epigenetica hacia un estado de tipo mESC. En consecuencia, los autores de la presente invencion eligieron la molecula pequena parnate, que se ha demostrado que aumenta la metilacion global de H3K4 inhibiendo la histona desmetilasa LSD1 que desmetila espedficamente la histona H3K4 mono- y di-metilada (Lee et al., Chem Biol 13, 563-567, 2006). Sorprendentemente, despues de cuatro dfas de tratamiento con parnate 2 jM, hasta 70-80% de las EpiSC formaron colonias pequenas y compactas en las condiciones de crecimiento de mESC. Cuando las celulas tratadas con parnate se seleccionaron a continuacion con 2PD/LIF, aproximadamente 20% de las celulas sobrevivieron a la seleccion en forma de colonias abovedadas y positivas para ALP. Estas colonias se expandieron adicionalmente con inhibidores de MEK, FGFR y GSK3 (denominadas condiciones mMFGi) o con las condiciones mAMFGi. Ambas condiciones dieron lugar a un cultivo celular estable (> 80 pases a lo largo de 8 meses), que es morfologicamente indistinguible de mESC (Fig. 6E, F). A continuacion los autores de la presente invencion examinaron celulas parnate/mMFGi y celulas parnate/mAMFGi marcadas con GFP in vivo por agregacion de la morula y trasplante de los embriones resultantes. De forma notable,
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los autores de la presente invencion obtuvieron 7 quimeras adultas (de 9 cnas nacidas) a partir de celulas parnate/mAMFGi segun se determino por el color de la capa y la genotipificacion por PCR para determinar la presencia de integracion de GFP en multiples tejidos adultos (Fig. 7A, B, C). De forma consistente, se observaron celulas GFP positivas diseminadas en multiples tejidos (es decir, tres capas germinales, incluyendo gonadas) de embriones E13.5 procedentes del trasplante de las morulas agregadas de celulas parnate/mAMFGi (Fig. 7A, D, 10A). Para examinar la contribucion de la lmea germinal de celulas parnate/mAMFGi, se aislaron las celulas dobles positivas para GFP/SSEA-1 de la gonada por medio de FACS y se confirmo que expresaban los marcadores de lmea germinal Blimpl y Stella por medio de PCR en tiempo real (Fig. 7E). Estos datos sugieren que las celulas parnate/mAMFGi convertidas a partir de EpiSC recuperan una verdadera pluripotencia in vivo. Por el contrario, las celulas positivas para GFP solo se encontraron en el saco vitelino de embriones E13.5 recuperados del trasplante de morulas agregadas de celulas parnate/mMFGi (figura 7A).
Por lo tanto, las celulas parnate/mAMFGi se caracterizaron adicionalmente. La inmunocitoqmmica confirmo la expresion homogenea de los marcadores asociados a la pluripotencia en las celulas parnate/mAMFGi expandidas a largo plazo, incluyendo Oct4, Nanog, SSEA1 y STELLA (Figura 8A, 11A, 12). Ademas, el analisis semi-cuantitativo por RT-PCR demostro la restauracion de la expresion genica de marcadores espedficos de MCI y de competencia con la lmea germinal (expresados en mESC, pero ausentes en EpiSC) en celulas parnate/mAMFGi, incluyendo Rex1, Pecaml, Stella, Stra8, Dax1, Fbxo15, Esrrb y Fgf4 (Figura 8B). Por el contrario, los transcritos de genes asociados con el epiblasto y las primeras capas germinales tales como Fgf5 y Brachyury (T) se redujeron o fueron indetectables en celulas parnate/mAMFGi (Fig. 8B, 9C). Ademas, el analisis del transcriptoma por micromatrices demostro que las celulas parnate/mAMFGi convertidas son mucho mas similares a las mESC (valor de correlacion de Pearson: 0,87), mientras que las EpiSC originales estan mas distantes de las mESC (valor de correlacion de Pearson: 0,74) (Figura 8C) conforme a los informes anteriores. Para analizar mas a fondo los cambios epigeneticos espedficos asociados con la conversion, los autores de la presente invencion examinaron la metilacion del ADN promotor de Stella y Fgf4, cuyas expresiones estan estrechamente asociadas con las propiedades de MCI (Hayashi et al., Cell Stem Cell 3, 391-401, 2008; Imamura et al., BMC Dev Biol 6, 34, 2006), utilizando secuenciacion genomica con bisulfito. Se revelo que las regiones promotoras de Stella y Fgf4 estaban en gran medida no metiladas en celulas parnate/mAMFGi y mESC, pero estaban hipermetilados en EpiSC (Fig. 8D). Para examinar mas a fondo el estado epigenetico de Stella, que se limita al estado de tipo mESC, los autores de la presente invencion realizaron un analisis ChIP-QPCR de su region promotora en las EpiSC, celulas parnate/mAMFGi convertidas, y mESC. Los autores de la presente invencion encontraron que el patron de metilacion de H3K4 y H3K27 de Stella en celulas parnate/mAMFGi era similar al observado en mESC, pero era distinto del de las EpiSC, lo que confirma que el estado epigenetico de Stella en las celulas parnate/mAMFGi convertidas habfa cambiado al estado de tipo mESC (Fig. 8E).
Las celulas parnate/mAMFGi tambien fueron examinadas para determinar sus propiedades funcionales in vitro. Se encontro que teman una tasa de crecimiento similar a la de las mESC (Fig. 9A). Cuando las celulas parnate/mAMFGi se diferenciaron a traves de cuerpos embrioides en suspension, eran capaces de generar eficazmente derivados de celulas en las tres capas germinales primarias como se muestra mediante inmunocitoqmmica, incluyendo celulas neuronales caractensticas (tubulina pIII y MAP2ab positivas), cardiomiocitos que laten (troponina cardfaca y MHC positivos), y celulas de endodermo (Sox17 o Albumina positivas) (Fig. 9B). Debido a que las mESC y las EpiSC/hESC tienen diferentes respuestas a las entradas de senalizacion (p. ej., factores de crecimiento) en auto- renovacion y diferenciacion, condiciones que se desarrollaban y funcionaban eficazmente para la diferenciacion de mESC podfan a menudo ser ineficaces en la induccion de la correspondiente diferenciacion de las EpiSC/hESC. Una de las ventajas de convertir EpiSC/hESC en un estado de tipo mESC es que las condiciones de diferenciacion se pueden traducir mas facilmente de trabajo de mESC en trabajo de EpiSC/hESC. La respuesta diferencial al tratamiento con BMP4 representa un analisis funcional para distinguir entre mESC y EpiSC. De acuerdo con los estudios anteriores (Beddington y Robertson, Development 105, 133-131, 1989; Czyz y Wobus, Differenciation 68, 167-174, 2001; Qi et al., Proc Natl Acad Sci USA 101, 6027-6032, 2004; Winnier et al., Genes Dev 9, 2105-2116, 1995), los autores de la presente invencion encontraron que las celulas parnate/mAMFGi eran inducidas a expresar el gen marcador espedfico de mesodermo Brachyury (T) cuando se trataban con BMP4 como las mESC, pero en las mismas condiciones no podfan dar lugar a trofectodermo (sin induccion del marcador de trofoblastos Cdx2) o a celulas endodermicas primitivas (Gata6) como las EpiSC, lo que sugiere un potencial similar de diferenciacion/respuesta in vitro de las celulas parnate/mAMFGi a mESC (Figura 9C). Para demostrar aun mas esto, los autores de la presente invencion intentaron y compararon las EpiSC, las celulas parnate/mAMFGi convertidas, y las mESC en un proceso de diferenciacion cardfaca por etapas dirigido definido qmmicamente en monocapa. En este proceso de multiples etapas, donde la actividad de BMP desempena un papel esencial en las primeras etapas de la diferenciacion del mesodermo, los autores de la presente invencion encontraron que las celulas parnate/mAMFGi se diferenciaban en cardiomiocitos que latian tan eficazmente como las mESC, pero la diferenciacion de las EpiSC en las mismas condiciones apenas produda celulas que expresaran marcadores cardiacos apropiados o tuvieran un fenotipo de latido caractenstico (Fig. 9D), confirmando de nuevo que las celulas parnate/mAMFGi son funcionalmente similares a las mESC. Por otra parte, un unico analisis de supervivencia celular tambien demostro que las celulas parnate/mAMFGi se expandfan clonalmente como colonias positivas para Oct4 con la misma eficacia que las mESC en condiciones libres de alimentacion y N2/B27 qmmicamente definidas, mientras que las EpiSC apenas sobrevrnan a partir de celulas individuales bajo las mismas condiciones (Fig. 11B). Estos datos demostraron adicionalmente que las EpiSC se podnan convertir funcionalmente al estado de tipo mESC
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por medio de manipulacion farmacologica que dirige las modificaciones epigeneticas y las rutas de senalizacion diferenciales requeridas por las mESC o las EpiSC.
En concordancia con los estudios de los autores de la presente invencion, recientemente se ha informado que las celulas EpiSC se convierten a un estado de tipo mESC mediante la expresion en exceso de genes de reprogramacion (es decir, Klf4) junto con compuestos qmmicos (Guo et al., Development 136, 1063-1069, 2009). En este estudio, los autores de la presente invencion idearon un tratamiento qmmicamente definido para convertir EpiSC estables a un estado de pluripotencia similar al de las mESC, de desarrollo anterior, sin ninguna manipulacion genetica. A pesar de los estudios que proporcionan pruebas de que existen celulas de tipo epiblasto que evolucionan o revierten dentro de la colonia de mESC convencionales (Hayashi et al., Cell Stem Cell 3, 391-401, 2008); las mESC y las EpiSC comparten un conjunto sustancial de factores transcripcionales de pluripotencia, incluyendo Oct4, Sox2 y Nanog; y las mESC son mas estables en cultivo, en el presente estudio los autores de la presente invencion encontraron que las EpiSC se diferenciaban rapidamente en las condiciones de cultivo de mESC convencionales y no se podfan identificar ni aislar facilmente mESC convertidas "espontaneamente" a lo largo de pases en serie a nivel de poblacion o clonal. Sorprendentemente, los autores de la presente invencion encontraron que el bloqueo de la ruta de TGF p o la inhibicion de la H3K4 desmetilasa LSD1 con inhibidores de molecula pequena induda cambios morfologicos drasticos de las EpiSC hacia los fenotipos de tipo mESC con la activacion de cierta expresion genica espedfica de MCI. Sin embargo, la conversion completa de las EpiSC en un estado de tipo mESC con competencia para la contribucion quimerica solo se puede generar facilmente con una combinacion de inhibidores de LSD1, ALK5, MEK, FGFR y GSK3. Estas observaciones subrayan una poderosa y directa induccion de la reprogramacion desde las EpiSC en fase tardfa de desarrollo a las mESC en fase MCI por una sinergia de senalizacion y modulaciones epigeneticas directas. Tambien pone de relieve un papel importante para la inhibicion de la ruta de TGFp en la promocion de reprogramacion y el mantenimiento de la verdadera pluripotencia, lo que apoya aun mas los estudios recientes de los autores de la presente invencion en la generacion de celulas pluripotentes de rata competentes en el quimerismo (Li et al., Cell Stem Cell 4, 16-19, 2009). Colectivamente, los estudios de los autores de la presente invencion proporcionan una demostracion de prueba de concepto de que las EpiSC de pluripotencia restringida se pueden convertir facilmente en un estado de tipo mESC en ausencia de cualquier manipulacion genetica por medio del control farmacologico preciso de las rutas de senalizacion que distinguen los dos estados de pluripotencia y una diana epigenetica simultaneamente, y ofrecen un conveniente sistema experimental para seguir estudiando el mecanismo. Tal metodo y concepto tambien pueden proporcionar una via para generar un nuevo tipo de celula pluripotente humana de tipo mESC.
Procedimientos Experimentales
Cultivo celular: La lmea de EpiSC murina fue una donacion del Dr. Paul Tesar (Case Western Reserve University). Las EpiSC (lmea EpiSC-5, macho) se mantuvieron en MEF CF1 irradiados en medio de ESC humanas con un suplemento de 10 ng/ml de bFGF como se describio anteriormente (Tesar et al., Nature 448, 196-199, 2007). Las EpiSC se pasaron cada 3-4 dfas con 1 mg/ml de colagenasa tipo IV (invitrogen). Las R1 mESC se cultivaron sobre MEF CF1 irradiados con medios de crecimiento de mESC convencionales, que consistfan en DMEM Knockout (Invitrogen) con un suplemento de KSR al 20% (Invitrogen), 2-ME 0,1 mM (Sigma- Aldrich), L-glutamina 2 mM (Invitrogen), NEAA 0,1 mM (Invitrogen), y 103 unidades/ml de factor inhibidor de leucemia murina recombinante (LIF) (ESGRO, Millipore). Las mESC y las celulas convertidas se pasaron cada 3 dfas como una suspension de celulas individuales utilizando tripsina al 0,05%/EDTA y se sembraron a 1,0x104 celulas por cm2 para el cultivo de rutina. Para cultivo libre de alimentador, las celulas se hicieron crecer sobre placas de cultivo de tejidos recubiertas de gelatina en medios qmmicamente definidos, que consistfan en DMEM Knockout con un suplemento de 1XN2 (Invitrogen), 1XB27 (Invitrogen), 2-ME 0,1 mM, L-glutamina 2 mM, NEA 0,1 mM, 50 pg/ml de fraccion V de BSA (GIBCO), 103 unidades/ml de LIF y 10 ng/ml de BMP4 (R & D). Para el experimento de curva de crecimiento, las celulas se cultivaron en condiciones libres de alimentador en placas de 12 pocillos recubiertas con gelatina. Las muestras duplicadas de celulas se cultivaron en placa a una densidad de 1X105 celulas por pocillo. Para cada punto de tiempo (24 horas de diferencia), las celulas de los pocillos duplicados se trataron con tripsina y se contaron utilizando un hemocitometro. Estos recuentos se promediaron y se trazaron. El inhibidor de ALK A-83-01, SB431542, el inhibidor de MEK PD0325901, el inhibidor de GsK3, CHIR99021 y el inhibidor del receptor de FGF, PD173074 se adquirieron de Stemgent Inc. Parnate se adquirio de Sigma (P8511).
RT-PCR semi-cuantitativa y PCR en tiempo real: El ARN total se extrajo utilizando RNeasy plus mini kit (Qiagen), sometido a transcripcion inversa con el kit iScript cDNA Synthesis (Bio-Rad) utilizando cebadores oligo dT de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los productos de PCR se resolvieron sobre geles de agarosa (1,5%) y se visualizaron mediante tincion con bromuro de etidio. Las imagenes fueron tomadas utilizando el sistema de documentos Bio-Rad Gel. Se utilizo ADNc diluido en cada una de las PCR cuantitativas duplicadas en un sistema de deteccion de PCR en tiempo real Bio-Rad con IQ SYBR Green (Bio-Rad). Los cebadores utilizados se enumeran en la Tabla 2 Suplementaria.
Analisis de secuenciacion con bisulfito: Se aislaron ADN de celulas R1 mESC, EpiSC y Parnate/mAMFGi utilizando el Kit de Aislamiento de ADN No Organico (Millipore). A continuacion, los ADN se trataron para la secuenciacion con bisulfito con el kit EZ DNA Methylation-Gold (Zymo Research Corp., Orange, CA). Los ADN tratados se utilizaron a continuacion para amplificar secuencias de interes. Los cebadores utilizados para la amplificacion del fragmento promotor fueron los publicados previamente (Hayashi et al., Cell Stem Cell 3, 391-401, 2008; Imamura et al., BMC
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Citometna de flujo y clasificacion de celulas: Las celulas adherentes se lavaron dos veces en PBS y despues se incubaron durante 20 minutos a 37°C en Tampon de Disociacion Celular (Invitrogen). Se disociaron las celulas y se volvieron a suspender en PBS + suero de cabra normal al 3% (tampon de bloqueo). Las celulas se incubaron durante 40 minutos a 4°C con anticuerpo anti-SSEAl (1:50, Santa Cruz) y despues se incubaron con el correspondiente anticuerpo secundario seguido de etapas de lavado. Las celulas se analizaron y clasificaron utilizando un clasificador de celulas FACSAria y el soporte logico FACSDiva (BD Biosciences). Utilizando un laser de 488 nm para la excitacion, se determino la positividad para GFP de acuerdo a la intensidad de fluorescencia en el canal GFP. La positividad para SSEA-1 se determino de acuerdo con la fluorescencia en el canal rojo.
Diferenciacion in vitro: Las celulas Parnate/mAMFGi se trataron con tripsina en celulas individuales y se cultivaron en suspension para formar cuerpos embrioides/EB en placas de baja adherencia (Corning) en medio DMEM con un suplemento de FBS al 10%. Los medios se renovaron cada dos dfas y se permitio que los EB crecieran durante 6 dfas en suspension. Los EB fueron cultivados en placa de nuevo sobre placas recubiertas con gelatina al 0,1%. Las diferenciaciones espontaneas se examinaron mediante inmunotincion de marcadores espedficos de linaje representativos con los anticuerpos indicados en diferentes puntos temporales (3 a 16 dfas). Para la diferenciacion cardiaca dirigida, las celulas se cultivaron sobre placas revestidas con Matrigel a 2 x 104/cm2 A las 24 horas del cultivo en placa, las celulas se cambiaron a medio definido qmmicamente (CDM) [que consistfa en RPMI 1640, 0,5x N2, 1x B27 (sin Vitamina A), 0,5x Glutamax, beta-mercaptoetanol 0,55 mM y 1x aminoacidos no esenciales], y se trataron con BIO 3 pM (Calbiochem) y 20 ng/ml de BMP-4 (R & D) durante cinco dfas. A continuacion, el medio se cambio a CDM que conterna 100 ng/ml de Dkk-1 y las celulas se cultivaron durante cinco dfas adicionales. El dfa 11, las celulas se trataron/desprendieron con tripsina brevemente (tripsina al 0,05%) y se volvieron a cultivar en placa sobre placas de 6 pocillos recubiertos con gelatina en CDM sin factores de crecimiento adicionales, y se cultivaron durante 4-6 dfas adicionales cuando el fenotipo de latido apareda en la mayona de las colonias cardiacas.
Analisis de caracterizacion: La tincion con ALP se realizo utilizando el Kit de Deteccion de Fosfatasa Alcalina (Chemicon) segun instrucciones del fabricante.
La inmunocitoqmmica se realizo utilizando un protocolo convencional. En resumen, las celulas se fijaron en paraformaldehndo al 4% (Sigma-Aldrich), se lavaron tres veces con PBS y a continuacion se incubaron en PBS que conterna TritonX-100 al 0,3% (Sigma-Aldrich) y suero de burro normal al 5% (Jackson Immuno Research) durante 1 hora a temperatura ambiente. Las celulas se incubaron a continuacion con anticuerpo primario a 4°C durante una noche: Albumina (Abcam, AB 19188, 1:200); Brachyury (Santa Cruz, C-19, 1:200); anticuerpo contra troponina t cardiaca (CT3) (Developmental Studies Hybridoma Bank, 1:700); MAP2ab (Abcam, ab5392, 1:1000); MF20 (Developmental Studies Hybridoma Bank, 1:200); Nanog (Abcam, ab 21603, 1:500); Oct4 (Santa Cruz, sc-5279, 1:100); Sox17 (R&D Systems, AF1924, 1:300); SSEA1 (Santa Cruz, sc-21702, 1:100); Stella (Millipore, MAB4388, 1:200); Tuj-1 (Covance, MMS-435P, 1:1000). Despues de lavar tres veces con PBS, las celulas se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con Alexa Fluor apropiados (Invitrogen) durante 2 h a RT. Los nucleos se detectaron mediante tincion con DAPI (Sigma). Las imagenes fueron capturadas por medio de Zeiss HXP 120.
Formacion de quimeras: Las celulas convertidas se marcaron de forma estable mediante GFP utilizando lentivirus. Las celulas se agregaron con embriones de raton de la fase de 8 celulas, y a continuacion se trasplantaron al utero de ratones CD1 pseudo-prenados de 2,5 dpc.
Analisis de micromatriz: Se utilizo Illumina Sentrix BeadChip Array MouseRef-8 v2 (Illumina, CA, USA) para las hibridaciones de micromatrices para examinar la expresion genica global de celulas ES murinas, celulas EpiSC y celulas Parnate/mAMFGi. El ARNc marcado con Biotina-16-UTP se sintetizo a partir de 500 ng de ARN total con el kit de Amplificacion deARN Illumina TotalPrep (Ambion AMIL 1791, Foster City, CA, USA). La mezcla de hibridacion que conterna 750 ng de ARNc amplificado marcado se preparo de acuerdo con el Illumina BeadStation 500X System Manual (Illumina, San Diego, CA, USA) utilizando los reactivos suministrados y la solucion de tincion GE Healthcare Streptavidin-Cy3. La hibridacion a Illumina Array MouseRef-8 v2 fue durante 18 horas a 550C sobre una BeadChip Hyb Wheel. La matriz se escaneo utilizando el Illumina BeadArray Reader. Todas las muestras se prepararon en dos replicas biologicas. El procesamiento y analisis de los datos de la micromatriz se realizaron con el soporte logico Illumina BeadStudio. Los datos de las micromatrices de las celulas R1-mESC fueron los de los estudios anteriores GEO DataSet (GSM402334 y GSM402335) de los autores de la presente invencion. Todos los datos sin procesar fueron substrafdos del fondo y normalizados juntos utilizando la opcion de rango invariante. Los autores de la presente invencion han depositado los datos de las micromatrices de parnate/mAMFGi y EpiSC en GEO DataSets con el numero de acceso (GSM402334 y GSM402335 para celulas ES de raton R1, GSE17664 para parnate/mAMFGi y EpiSC).
PCR en tiempo real para inmunoprecipitacion de cromatina (ChIP-qPCR): Se realizo ChIP utilizando un kit Magna ChIP™ G comercialmente disponible (num. catalogo 17-611, Millipore). Brevemente, 1x106 celulas cultivadas sin alimentador se fijaron con formaldehudo al 1%, se lisaron y se sometieron a sonicacion para obtener fragmentos de ADN de 200-500 pb conjugados con nucleosomas. Los productos lisados sometidos a sonicacion se inmunoprecipitaron con lisina 4 anti-trimetil-histona H3 (Millipore, num. de Cat. 17-614, 3 pl/reaccion) o lisina 27 anti-
trimetil-histona H3 (MiMipore, num. de Cat. 17-622, 4 pg/reaccion) que se hicieron reaccionar previamente con anticuerpos secundarios conjugados con esferas magneticas. Despues de la incubacion con cada anticuerpo durante 24 horas, se recuperaron los inmunoprecipitantes y se purificaron los fragmentos de ADN contenidos mediante incubacion con proteinasa K. Los fragmentos de aDn se sometieron a PCR en tiempo real. Se utilizaron 5 los productos lisados de celulas enteras antes de la incubacion con anticuerpos como entrada. Un microlitro de fragmentos de ADN de productos lisados completos e inmunoprecipitantes se sometio a reaccion de PCR en tiempo real. Los inmunoprecipitantes con IgG de conejo normal sirvieron como muestras de control negativo y no mostraron un fondo detectable. Las secuencias de cebadores se enumeran en la Tabla 2.
TABLA 2
10 Cebadores utilizados para PCR
imagen4
Inverse
Di recto
Blimp!
TCACCCTCTTCC CTAOGTTGTATC mtctt a agg atcc atcogttc aac
Rrachyury
atOccaaaGaaagaaacgac AG AGGCTGTAG AAC ATG ATT
Cdx2
AGGCIt? aG CCATGAGG AG T a CGACGTCCATAATTCCACTCA
Daxl
GTGGC AGG GGAGCATCCTCTAC A A CAAAAGAAGCGGTACA
Esrrb
CGC CAT CAA ATG CGA GTA CAT CC GA ATC ACCATCC AGGCAC TCTG
Fbxol5/ECAT3
TAG ATTCTTG GA CTTCCG TTCA accaaggtc accgcatcc aa
Fgf4
cgtgotoagcatcttcggagtog rCTTf TT GOTCCG CCCGTTCTT a
Fgft
CTGTACTGCAGAOTGCGCATCCM GACTTCTGCGAGGCTGCG ACAQG
GAPDH
GT GTTCCTAGGG CCAATGTGT ATTGTCATACCACGAA ATGAGGTT
Gata6
accttatggcotAGAAATOCTQ aoggtg ctgaatacttgaggtcactgttctcggg
Pecaml
GTCATGGCCATGOTCCACTA A0CACKS ACA ggtccaacaac
Rex-1
TGAAAGYCACAfiAGtOttX;AG GTCCCATCCCCTTCAATAGC At
Stella
GAAACTCCTCAGAAO AAA CTCTTfjTfCT OC AC AGCTAC
StraS
GCAACCAAOCCAGTGATGATGG CATCTOCTCCAACAGCCTCAG
Para PCR de secuenciacion con bisulfite
M4
TTTAGGTTTTAAG AGTGTT-GCGGAGAAG AT 'taCaaaaCaaaaaCaTtCaaacccattctaa
Stella
ATTTTOTOATTAijOOTTGOrrri’AGAA ccaaaacatcctcttcatctttcttct
Stella anidado
TTTTTCC A ATT GGTTCEGG ATTG CTTCTAAAAAATtTC AAAATCCTTCATT
Para PCRChIP-Q
Stella
GArCCAGCTGGrCTGAGCTA GTGCAG GGATCATAGG AGTG
Ejemplo de referencia 6: Caracterizacion de una celula animal pluripotente que replica y mantiene la pluripotencia
Para caracterizar las hiPSC recien generadas, se utilizo la PCR en tiempo real para analizar la expresion genica de las hiPSC. Se uso la lmea celular ES humana, Hues9 (instalacion para hES, Universidad de Harvard, 15
http://mcb.harvard.edu/melton/hues/), como control. Los analisis de PCR en tiempo real revelan que, en comparacion con las celulas Hues9, las hiPSC de la presente invencion expresan ciertos genes a niveles superiores, tales como Gbx2 (5 veces), Dppa3 (2 veces) y Klf4 (2,5 veces). Estos marcadores tambien se encuentran altamente expresados en celulas ES de raton, pero no en EpiSC de raton. Los cebadores utilizados en el analisis de PCR en tiempo real son: Dppa3: 5'-CAACCTACATCCCAGGGTCT-3'; 5'-TCAACGTCTCGGAGGAGATT-5';
20 Gbx2: 5'-AAAGGCTTCCTGGCCAAAG-3'; 5'-TTGACTCGTCTTTCCCTTGC-5';
Klf4: 5'-AGCCTAAATGATGGTGCTTGGT-3'; 5'-TTGAAAACTTTGGCTTCCTTGTT-3'.
Utilizando analisis de transferencia western, los autores de la presente invencion tambien han analizado la expresion de E-cadherina en hiPSC. La expresion de E-cadherina en hiPSC es el doble que la de las celulas ES humanas Hues9.

Claims (17)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    REIVINDICACIONES
    1. Un metodo de cultivo de celulas pluripotentes humanas, en donde las celulas pluripotentes humanas son celulas madre pluripotentes inducidas (hiPSC) o celulas madre embrionarias humanas (hESC), por medio de al menos una division celular, comprendiendo el metodo el cultivo de celulas en presencia de una cantidad suficiente de:
    a) un inhibidor de ALK5;
    b) un inhibidor de MEK;
    c) un inhibidor de GSK3p;
    d) un factor inhibidor de leucemia (LIF); y
    e) nutrientes suficientes durante un tiempo suficiente, para permitir al menos una division celular mientras se mantiene la pluripotencia celular.
  2. 2. El metodo de la reivindicacion 1:
    (i) en donde el inhibidor de MEK es PD0325901 o el inhibidor de ALK5 es A-83-01 o SB431542; o
    (ii) que comprende adicionalmente la introduccion de un acido nucleico heterologo en las celulas pluripotentes y el cultivo de las celulas resultantes para permitir al menos una division celular adicional mientras se mantiene la pluripotencia.
  3. 3. El metodo de la reivindicacion 1, en donde el inhibidor de GSKp3 es CHIR99021.
  4. 4. El metodo de la reivindicacion 1, en donde las celulas pluripotentes se cultiva a traves de al menos cinco divisiones celulares mientras se mantiene la pluripotencia de la celula.
  5. 5. El metodo de la reivindicacion 1, en donde las celulas madre pluripotentes son hESC.
  6. 6. El metodo de la reivindicacion 1, en donde las celulas madre pluripotentes son hiPSC.
  7. 7. Un cultivo de celulas humanas pluripotentes, en donde las celulas humanas pluripotentes son celulas madre pluripotentes inducidas (hiPSC), o celulas madre embrionarias humanas (hESC), que comprende una cantidad suficiente de
    a) LIF;
    b) un inhibidor de ALK5;
    c) un inhibidor de MEK; y
    d) un inhibidor de GSK3p;
    para permitir al menos una division celular mientras se mantiene la pluripotencia celular.
  8. 8. El cultivo de la reivindicacion 7, en donde el inhibidor de MEK es PD0325901 o el inhibidor de ALK5 es A-83-01 o SB431542.
  9. 9. El cultivo de la reivindicacion 7, en donde el inhibidor de GSK3 p es CHIR99021.
  10. 10. El cultivo de la reivindicacion 7, en donde las celulas de mairnfero pluripotentes son hESC.
  11. 11. El cultivo de la reivindicacion 7, en donde las celulas de marnffero pluripotentes son hiPSC.
  12. 12. Un medio de cultivo celular, que comprende una cantidad suficiente de:
    a) LIF;
    b) un inhibidor de ALK5;
    c) un inhibidor de MEK; y
    d) un inhibidor de GSK3p;
    para permitir al menos una division celular mientras se mantiene la pluripotencia celular cuando las celulas humanas pluripotentes se cultivan en el medio, en donde las celulas pluripotentes humanas son celulas madre pluripotentes inducidas (hiPSC) o celulas madre embrionarias humanas (hESC).
    10
    15
  13. 13. El medio de la reivindicacion 12, en donde:
    (i) el inhibidor de MEK es PD0325901 o el inhibidor de ALK5 es A-83-01 o SB431542; o
    (ii) el medio es un recipiente sellado, precargado.
  14. 14. El medio de la reivindicacion 12, en donde el inhibidor de GSK3p es CHIR99021.
  15. 15. Un metodo para incrementar la pluripotencia de una celula madre de Epiblasto de mairnfero parcialmente pluripotente (EpiSc) a una celula mas completamente pluripotente, comprendiendo el metodo:
    a) poner en contacto la EpiSC con un modificador epigenetico seleccionado entre un inhibidor de histona desacetilasa, un inhibidor de la desmetilacion de la histonas H3K4 o un activador de la metilacion de H3K4; y
    b) despues de la etapa (a) cultivar la EpiSC con (i) un inhibidor de ALK5, (ii) un inhibidor de MEK, (iii) un inhibidor del receptor de FGF, y (iv) LIF y en ausencia del modificador epigenetico, generando de ese modo la celula mas completamente pluripotente en comparacion con la EpiSC.
  16. 16. El metodo de la reivindicacion 15, que comprende adicionalmente
    c) cultivar la EpiSC despues de la etapa (b) con un inhibidor de GSK3.
  17. 17. El metodo de la reivindicacion 15, en donde:
    (i) la EpiSC no expresa al menos un marcador seleccionado del grupo que consiste en Oct4, nanog, y REX- 1 y la celula mas completamente pluripotente expresa uno o mas o todos los marcadores;
    (ii) la EpiSC no expresa ALP-I y la celula mas completamente pluripotentes expresa ALP-I; o
    (iii) el modificador epigenetico es acido valproico o parnate.
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