CN112063656A - Map2k3或Map2k6在提高诱导成体细胞生成多能性干细胞效率中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明提出了Map2k3或Map2k6在提高诱导成体细胞生成多能性干细胞效率中的用途、提高诱导成体细胞生成多能性干细胞效率的方法和试剂盒，所述方法包括：将Map2k3或Map2k6和转录因子导入哺乳动物成体细胞中进行诱导培养，获得多能性干细胞，所述干细胞诱导因子为Oct4、Klf4和Sox2，或Oct4、Klf4、Sox2和c‑Myc。本发明的方法还包括在诱导培养基中添加维生素C，其相比于不添加维生素C进一步提高了诱导多能干细胞的效率。本发明通过采用激酶类基因Map2k3或Map2k6和转录因子提高诱导多能干细胞的效率，以得到高质量的具有生殖系传递能力的诱导多能干细胞。

Description

Map2k3或Map2k6在提高诱导成体细胞生成多能性干细胞效率 中的用途

技术领域

本发明涉及生物领域。具体地，本发明涉及Map2k3或Map2k6在提高诱导成体细胞生成多能性干细胞效率中的用途。

背景技术

人胚胎干细胞(human embryonic stem cells，hESCs)是一类全能性干细胞，它具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化潜能。理论上无论是在体外还是体内环境，hESCs都能被诱导分化为人体几乎所有的细胞类型。hESCs的进一步研究和应用将为移植疗法和治疗视网膜黄斑变性、帕金森、肌萎缩性侧索硬化症等疑难病症开辟新的途径。然而，由于hESCs难以获得且涉及敏感的伦理道德问题，使得hESCs的临床研究一度陷入尴尬境地而无法大规模开展。

2007年，日本Yamanaka和美国Thomson实验室首次发表了用人体细胞重编程得到人诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)的方法。诱导多能干细胞成功地避开了人胚胎干细胞无法回避的伦理问题，而且具有与其相似的自我更新能力和向三个胚层分化的能力，有望成为无限获取人自体细胞的工具，用于基础生物学研究、疾病模型、药物筛选、基因矫正、细胞治疗等。而如何进一步安全、高效、低成本地进行重编程技术获得iPSCs细胞是本领域一直在不断努力达到的目标。

在诱导iPS过程中常借助于逆转录病毒、慢病毒将外源基因导入细胞，通过这种方式可以得到很高的基因转导效率，但是由于病毒序列整合到细胞的基因组中会导致基因插入突变发生，甚至具有致癌性，所以这种具有潜在危险性的基因导入方法显然不利于iPS技术在再生医学领域的应用，因此不同的研究小组采用了非整合载体来诱导iPS并取得了成功，这些载体包括腺病毒载体、普通表达载体、转座子、附加体载体、小环DNA(minicircleDNA)载体。

目前能够重编程的转录因子组合有Oct4、Klf4、Sox2、c-Myc；Oct4、Nanog、Lin28、Sox2；Sox2、Klf4和Lrh1；Oct4、bmi1等几种不同的组合以及esrrb、tbx3等与重编程相关的基因，现有的重编程方法所需要的转录因子组合需要导入的转录因子较多，而且诱导效率低下，如何利用效率较高的重编程系统，提高重编程技术的可操作性，对重编程机理进行研究，筛选高效的非整合载体以及替代转录因子的化合物，对重编程机理的研究和重编程技术的改进具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种提高诱导成体细胞生成多能性干细胞效率的方法，提高重编程技术的可操作性的方法。

在本发明的一个方面，本发明提出了Map2k3或Map2k6在提高诱导成体细胞生成多能性干细胞效率中的用途。

Map2k3和Map2k6是p38MAPK信号通路中的两个重要成员，作为p38MAPK的上游激酶，自身被上游激酶磷酸化激活后，通过磷酸化激活p38MAPK，使p38MAPK入核并激活转录因子，调控基因转录，从而影响多个生命活动过程，如应激、炎症、存活、分化、凋亡等，但未有报道其在体细胞重编程中的作用。发明人发现Map2k3或Map2k6在体细胞重编程过程中过表达能显著促进重编程的进程和效率，提高诱导成体细胞生成多能性干细胞效率。在现已发现的促进体细胞重编程的因子中，Map2k3或Map2k6是唯一的激酶类因子，其他因子都是属于转录因子和调控表观遗传相关的因子，因此利用Map2k3或Map2k6在重编程中的调控作用，可能将从另一角度对重编程的机理进行探讨以及重编程的过程进行调控。

在本发明的另一方面，本发明提出了一种提高诱导成体细胞生成多能性干细胞效率的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将Map2k3或Map2k6和转录因子导入哺乳动物成体细胞中进行诱导培养，获得多能性干细胞克隆，将获得的多能性干细胞克隆在干细胞培养基中培养扩增。根据本发明实施例的方法采用激酶类基因Map2k3或Map2k6和转录因子提高诱导多能干细胞的效率，以得到高质量的具有生殖系传递能力的诱导多能干细胞。

根据本发明的实施例，所述转录因子为：Oct4、Klf4和Sox2的组合，或Oct4、Klf4、Sox2和c-Myc的组合。由此，以便于提高诱导多能干细胞的效率。

根据本发明的实施例，所述转录因子和Map2k3或Map2k6为具有多能干细胞诱导功能的编码或非编码RNA、蛋白质或多肽。

根据本发明的实施例，所述将Map2k3或Map2k6导入哺乳动物成体细胞是以能够表达Map2k3或Map2k6基因的载体导入细胞中来实现的。由此，有助于Map2k3或Map2k6基因的导入和表达。

根据本发明的实施例，所述载体为病毒载体、质粒载体、外随体载体、mRNA载体或直接化学合成的载体，所述病毒载体为逆转录病毒，所述逆转录病毒为pMXs载体。由此，有助于导入Map2k3或Map2k6基因并高效表达，提高诱导效率。

根据本发明的实施例，所述成体细胞为成纤维细胞、神经细胞、造血细胞和神经胶质细胞。

根据本发明的实施例，所述成体细胞为小鼠胚胎成纤维细胞。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种提高诱导成体细胞生成多能性干细胞效率的试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒包括：Map2k3或Map2k6和转录因子。采用根据本发明实施例的试剂盒可以提高诱导多能干细胞的效率，以得到高质量的具有生殖系传递能力的诱导多能干细胞。

根据本发明的实施例，所述转录因子为：Oct4、Klf4和Sox2的组合，或Oct4、Klf4、Sox2和c-Myc的组合。由此，可高效诱导成体细胞生成多能性干细胞。

根据本发明的实施例，所述Map2k3或Map2k6是以克隆在表达载体上的形式提供的。由此，有助于Map2k3或Map2k6基因的导入和表达。

本发明的有益效果为利用Map2k3或Map2k6和转录因子提高了诱导多能干细胞的效率，提高了诱导多能干细胞的质量，得到高质量的具有生殖系传递能力的诱导多能干细胞。本发明的方法将细胞暴露于维生素C，其相比于不使用维生素C，可进一步提高诱导多能干细胞的效率。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1显示了Map2k3或Map2k6过表达显著地提高mEF重编程效率，其中A.OKS分别与对照载体、Map2k3或Map2k6在干细胞培养基中共同诱导mEF产生的GFP阳性克隆数统计图；B.OKSM分别与对照载体、Map2k3或Map2k6在干细胞培养基中共同诱导mEF产生的GFP阳性克隆数统计；C.OKS分别与对照载体、Map2k3或Map2k6在添加维生素C的干细胞培养基中共同诱导mEF产生的GFP阳性克隆数统计；数值为平均值±SD；***P<0.001；****P<0.0001；D.OKS分别与对照载体、Map2k3或Map2k6在干细胞培养基中共同诱导mEF产生的GFP阳性克隆显微镜观察图。

图2显示了OKS和Map2k3或Map2k6在干细胞培养基中共同诱导mEF产生的iPSC单克隆鉴定，其中A.OKS+MAP2K6诱导的iPSC单克隆形态；上：明场，下：GFP；B.OKS+MAP2K3或MAP2K6诱导的iPSC单克隆外源基因表达水平的QPCR检测；3F+6d5：OKS+MAP2K6诱导第5天的细胞群；3F+3-1：OKS+MAP2K3诱导的单克隆1；3F+6-1：OKS+MAP2K6诱导的单克隆1；3F+6-2：OKS+MAP2K6诱导的单克隆2；C.OKS+MAP2K6诱导的iPSC单克隆外源OKS和MAP2K3或MAP2K6基因组插入的PCR鉴定；S：Sox2；K：Klf4；O：Oct4；3：MAP2K3：6：MAP2K6；D.OKS+MAP2K3或MAP2K6诱导的iPSC单克隆3F+3-2(左)和3F+6-1(右)的核型图；E.OKS+MAP2K3或MAP2K6诱导的iPSC单克隆3F+3-2(左)和3F+6-1(右)囊胚注射产生的嵌合体小鼠及嵌合体二代小鼠。

图3显示了构建的质粒结构示意图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

本文使用的所有科技术语具有本领域普通技术人员所理解的相同含义。关于本领域的定义及术语，专业人员例如具体可参考Current Protocols in Molecular Biology,edited by Ausubel,et al,John Wiley&Sons,2009。氨基酸残基的缩写是本领域中所用的指代20个常用L-氨基酸之一的标准3字母和/或1字母代码。

尽管本发明的广义范围所示的数字范围和参数近似值，但是具体实施例中所示的数值尽可能准确的进行记载。然而，任何数值本来就必然含有一定的误差，其是由它们各自的测量中存在的标准偏差所致。另外，本文公开的所有范围应理解为涵盖其中包含的任何和所有子范围。

本发明的Map2k3和Map2k6具有如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。

SEQ ID NO：1：

SEQ ID NO：2：

除非另外指明，在本文中提到多肽、核酸或其它分子时，其含义包括了功能性变体和功能性片段。例如，Map2k3或Map2k6还表示天然Map2k3或Map2k6的功能性变体和功能性片段。

本文使用的术语“功能性变体”表示含有例如仅仅保守性改变或非关键残基或非关键区域的改变，并且保留原始多肽的功能。功能性变体还可包含相似氨基酸的替换，其导致功能未改变或不显著的改变。可以通过本领域已知的方法鉴定对于功能来说重要的氨基酸，所述方法例如定点诱变或甘氨酸扫描诱变(Cunningham，B.和Wells，J.，Science，244：1081-1085，1989)。可以例如通过结构分析如结晶、核磁共振或光亲和标记来确定对于多肽活性来说关键的位点(Smith，L.等，J.Mol.Biol.，224：899-904，1992；de Vos,A.等，Science，255：306-312，1992)。

本文中所使用的术语“多肽”、“蛋白质”可互换地表示通过共价键(例如肽键)相互连接的一串至少两个氨基酸残基，其可以是重组多肽、天然多肽或合成多肽。特别地，本文所述多肽是人和/或小鼠来源的多肽。

本文使用的术语“诱导的多能干细胞”、“诱导的多能性干细胞”、“诱导性多能干细胞”、“诱导多能干细胞”或者“iPS”(induced pluropotent stem cells)可互换地使用，表示人工地将非多能性细胞(例如体细胞)诱导而成的多能性干细胞。所述诱导通常是通过强制(forced)表达特定基因来实现的，这一过程在本文中也称为“将细胞诱导成多能性干细胞”。

本文使用的术语“Oct4”表示八聚体转录因子家族(the family of octamertranscription factors)的一个成员，其在维持细胞的多能性上起到关键作用。在文献中，Oct4也曾被称为Oct3。

本文使用的术语“Klf4”表示Krüppel样转录因子家族(Krüppel-like family oftranscription factors)的一个成员。

本文使用的术语“Sox2”表示SRY-box转录因子家族(SRY-box transcriptionfactor)的成员之一。

本文使用的术语“c-Myc”表示本领域技术人员熟知的一种转录因子，其调控许多基因的表达，募集组蛋白乙酰基转移酶，并且其突变与许多癌症有关。

本文中的术语“载体”以本领域技术人员熟知的意义使用，其可以是表达载体。所述载体可包括病毒(例如痘病毒、腺病毒、杆状病毒等)；酵母载体、噬菌体、染色体、人工染色体、质粒、粘粒、附加体载体、mRNA载体或直接化学合成。优选的，所述病毒载体为逆转录病毒和/或慢病毒载体。更优选地，所述逆转录病毒为pMXs载体。

本文中使用的术语“过量的”表示显著地高于正常水平，特别地表示多肽的表达量统计学显著地高于正常细胞中的表达量。优选地，高出20％、50％、100％、200％或者甚至5倍、10倍或100倍。

本文中使用的术语“过表达”表示表达水平显著地高于正常水平，特别地表示多肽的表达量统计学显著地高于正常细胞中的表达量。优选地，高出20％、50％、100％、200％或者甚至5倍、10倍或100倍。

本文使用的术语“导入”表示将外源物质(如核酸或蛋白质)引入细胞的过程，例如通过磷酸钙转染、病毒感染、脂质体转染、电穿孔或基因枪等方式进行。

在本文中，将外源的多肽递送进细胞可通过多种方式进行，例如通过运载体和/或转运因子进行，优选通过脂质体、细菌多肽片段等(可参见WO2002/079417，其内容通过引用并入本文)。

本发明方法可使用的细胞优选地是哺乳动物细胞，更优选人和小鼠细胞。特别地，所述细胞是体细胞，例如：上皮细胞、神经细胞、成纤维细胞、内皮细胞、肌细胞、造血细胞、免疫细胞、淋巴细胞等。更特别地，所述细胞是胰腺beta细胞、成体神经干细胞、肝细胞、胃细胞、成熟B细胞、造血细胞、脑膜细胞、脂肪干细胞、脐带血细胞、外周血CD34阳性细胞、角质细胞等。

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1

1、包含Map2k3或Map2k6编码区的载体的构建：

a.克隆引物设计

从https://www.ncbi.nlm.nih.gov/获取Map2k3或Map2k6的cDNA的序列信息。其中Map2k3和Map2k6序列分别为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，通过设计特异性的引物扩增Map2k3或Map2k6的编码序列。

Map2k3的上游引物碱基序列如SEQ ID NO：3，下游引物如SEQ ID NO：4。

ACCATGGAGTCGCCCGCCGCGAG(SEQ ID NO：3)

CTATGAATCCTCTCCCAGGATCTCC(SEQ ID NO：4)

Map2k6的编码序列的上游引物碱基序列如SEQ ID NO：5，下游引物如SEQ ID NO：6。

ACCATGTCTCAGTCGAAAGGCAAGAAGC(SEQ ID NO：5)

TTAGTCCCCAAGTATCAGTTTTACAAAAGA(SEQ ID NO：6)

b.通过RT-PCR扩增编码序列

从分离的ICR小鼠的胚胎成纤维细胞(MEF)中按照下述方法提取总mRNA：去除培养盘中的培养基，以3-5毫升的生理盐水(PBS)(Gibco公司)清洗细胞并弃去漂洗液然后向培养盘中加入1毫升细胞裂解液Trizol(Takara公司)，用移液枪吸取混合液并轻柔吹打细胞使其完全溶解在裂解液中，随后将其转移至干净的1.5毫升离心管中于负80℃保存或立即进行下面的提取步骤。接下来，加入200微升的三氯甲烷，颠倒混匀约30秒，然后于4℃12000rpm转离心5分钟。小心吸取上清转移至洁净的1.5毫升离心管中，随后加入等体积的异丙醇并混匀，室温放置5分钟后12000rpm转4℃离心5分钟，管底可见白色小块沉淀；小心弃去上清，接着加入80％乙醇溶液500微升用于漂洗掉残余的异丙醇，12000rpm转离心，去除乙醇溶液，室温放置30分钟使管底的白色总mRNA充分干燥。随后，向离心管中加入30-50微升的双蒸水于55℃孵育，30分钟后取出，用分光光度计测定总mRNA浓度。所提取的总mRNA于负80℃保存或直接用于反转录制备cDNA备用。

反转录具体过程和方法如下所述：取1微克的总mRNA进行反转录，加入寡聚脱氧核糖脲嘧啶核苷酸(oligodT，Takara公司)、dNTP(Takara公司)、RTace(Toyobo公司)、RTbuffer和RRI(RNAse抑制剂，takara公司)和不含RNase/DNase的水，于PCR仪上42℃反应60分钟，然后98℃孵育5分钟，随后冷却至室温。反转录成功后，从中取出0.5微升作为模板，使用上述方法设计的引物，采取聚合酶链式反应扩增目的基因，所用的试剂有高保真聚合酶KOD及其缓冲液(Toyobo公司)、dNTP(Takara公司)、引物，在PCR仪上运行下述程序：95℃变性5分钟，95℃30秒，60℃退火25秒，68℃延伸3.5分钟，2-4步循环32次。

c.质粒构建

完成扩增反应后，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，应用凝胶回收试剂盒(天根公司,DP214-03)提取PCR片段。pMXs载体(载体购自Addgene，插入多克隆位点和FLAG标签序列)，改造后的pMXs载体被称为pMXs-FLAG。以PmeI酶切，应用CIAP小牛肠碱性磷酸酶对其去磷酸化以防止载体自连。用凝胶回收试剂盒(天根公司，DP214-03)回收处理好的载体备用。pMX-FLAG载体和Map2k3或Map2k6的基因片段应用连接试剂盒(Takara公司，DNA LigationKit)进行，然后将连接产物转化大肠杆菌感受态细菌，挑选阳性克隆，提取质粒，测序确定，最后大量制备质粒(图3)。

2、将Map2k3或Map2k6以及转录因子的编码序列导入小鼠胚胎成纤维细胞：

如无特殊说明，基于小鼠的体细胞重编程均采用如下方式进行：

饲养层细胞、mEF细胞和PlatE细胞的培养基组成为：高糖基础培养基DMEM(Gibco)，外加10％胎牛血清(FBS，PAA)。

诱导培养基：本发明使用实验室常规的诱导培养基，优选使用的诱导培养基成分包括DMEM高糖培养基(Gibco)、15％的胎牛血清(FBS,Gibco)、0.1mM非必需氨基酸(NEAA,Gibco)、2mML-谷氨酰胺(Glutamax,Gibco)、1mM丙酮酸钠(sodium pyruvate,Gibco)、55μMβ巯基乙醇(β-ME,Gibco)、白血病抑制因子1000U/ml(LIF,Millipore)，根据需要添加维生素C(sigma)，其浓度是50微克每毫升。

干细胞培养基：本发明使用实验室常规的干细胞培养基，优选mES干细胞培养基，其组分为：高糖DMEM培养基添加15％胎牛血清、0.1mM非必需氨基酸(NEAA,Gibco)、2mML-谷氨酰胺(Glutamax,Gibco)、1mM丙酮酸钠(sodium pyruvate,Gibco)、55μMβ巯基乙醇(gibco)、白血病抑制因子1000U/ml(LIF,Millipore)。

3、用于重编程的细胞：

重编程采用的体细胞类型均为OG2小鼠胚胎成纤维细胞(由实验室自制)，传代数不超过三代。OG2小鼠的一个特点是在干细胞特异表达基因Oct4基因的启动子后连有绿色荧光蛋白(GFP)。在重编程过程中，当OG2小鼠胚胎成纤维细胞內源Oct4被激活时，绿色荧光蛋白伴随表达，在荧光显微镜下，可见成功重编程的细胞或克隆细胞团块呈现绿色，通过直接统计重编程克隆即绿色荧光克隆数或采用流式细胞仪分析绿色荧光细胞的比率，可以容易地比较不同条件下的重编程效率。

如下所述准备重编程细胞：以20000个细胞/孔的密度种植细胞于12孔培养板(Corning)，细胞种植6-18小时后，视其密度和状态用带有小鼠重编程因子的病毒进行感染。

4、病毒的制备：

用于重编程的转录因子包括小鼠Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc的cDNA的逆转录病毒载体pMXs(来自Addgene公司，编号分别为Plasmid 13366，Plasmid 13367，Plasmid 13370和Plasmid 13375)；Oct4，NCBI登录号为NM_013663；Sox2，NCBI登录号为NM_011443；Klf4，NCBI登录号为010637，c-Myc，NCBI登录号为NM_001177353。应用自制的磷酸钙转染试剂将pMXs载体上的重编程因子质粒转染进病毒包装细胞(PlatE)，具体过程：接种750万PlatE细胞于10厘米直径的培养盘(Corning)，12小时后以7.5毫升不含青霉素/链霉素的培养基更换掉旧的培养基，随后将细胞放进培养箱。接下来准备转染混合物：取25微克质粒加入15毫升离心管，按序依次加入156.25微升2M的氯化钙溶液，补加适量水使三者的总体积为1.25毫升，混合均匀，然后加入1.25毫升HBS溶液，立即混合均匀，然后静置2分钟，随后逐滴加入PlatE培养盘中，混合均匀。转染后9-12小时，更换10毫升新鲜培养液，转染后48小时收集培养液并以0.45微米滤膜过滤培养液，作为第一次感染用病毒液，添加新鲜培养液24小时后如此再收集培养液作为第二次感染病毒液。

5、用病毒感染mEF细胞：

感染分两轮进行，所用的诱导因子均同时感染细胞，12孔板的每个孔感染每一种病毒用量为0.5毫升，第一轮感染后24小时后进行第二轮感染，第二轮感染后24小时将病毒液更换成mES培养基(前述)1ml。换液当天记为第0天(D0)；感染后不同时间点，按实验需要在原孔内数GFP荧光克隆数或采用流式细胞仪分析GFP荧光细胞的比率。

6、对感染后的细胞进行培养直到干细胞克隆形成：

感染后的第2天，将培养体系更换为新鲜的诱导培养基，之后每天更换诱导培养基直到干细胞克隆形成。

使用玻璃针将形态隆起，边缘清晰的胚胎干细胞样的单个克隆挑选出来，直接转移至提前铺好饲养层细胞(饲养层细胞为丝裂霉素处理过的ICR小鼠成纤维细胞)的培养板(Corning)中以mES培养基进行培养。

按上文所述干细胞克隆形成的方法，用不同的多能干细胞诱导因子组合进行实验。

各多能干细胞诱导因子组合说明如下：

Oct4、Kif4、Sox2的组合简写为OKS，Oct4、Kif4、Sox2、c-Myc的组合简写OKSM

图1显示了Map2k3或Map2k6提高OKS或OKSM介导的在不添加维生素C或添加维生素C的干细胞培养基中诱导多能性干细胞效率的数据，其中对照是没有插入任何基因序列的pMXs-FLAG空载体。可以看出，无论诱导因子为OKS或OKSM，导入Map2k3或Map2k6对于重编程的效率都有明显地提高，在维生素C存在的条件下，效率进一步提高。

实施例2

对实施例1所得诱导性多能干细胞的鉴定：

如图2所示，对转录因子和Map2k3或Map2k6诱导的多能干细胞克隆进行一系列鉴定实验，以证明其是否为iPS细胞(诱导性多能干细胞)，鉴定实验包括：PCR、定量PCR、核型鉴定、嵌合体形成等。

1、PCR

所有PCR实验均应用Takara公司的试剂盒在博日公司Life ECO型PCR仪上完成，所用反应条件是95℃5分钟；95℃30秒，60℃30秒，72℃60秒，如此重复40个循环，取扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。

2、定量PCR实验

所有定量PCR实验均应用Takara公司的试剂盒在Biorad公司CFX-96型定量PCR仪上完成，所用反应条件是95℃2分钟；95℃10秒，60℃30秒，读取荧光值，如此重复40个循环。

3、iPS细胞的核型鉴定

iPS细胞的核型鉴定按照下述方法进行：待做核型分析的细胞在收获前2-3小时加入0.1ml 5ug/ml秋水仙素(市售，终浓度0.1ug/ml)混匀后继续培养2-3小时，转入10ml离心管中，以1500-2000转/分钟离心10分钟，去上清液，加入8ml低渗液(0.075M Kcl，37℃预热)将细胞沉淀吹打均匀，放入温箱中37℃半小时，加入1ml新配制的固定液(甲醇:冰醋酸体积比为3:1的混合物，原料市售)，轻轻混匀后以与前面相同的转速和时间离心，吸去上清液。加入8mL固定液并充分将细胞混匀，室温固定至少半小时，重复离心后，去掉上清液，加入新鲜固定液再次固定至少半小时(最好过夜)，经离心和去上清液后的细胞沉淀中加入约0.2ml新鲜固定液混匀，细胞悬液滴于预冷的载玻片上(以每张玻片3滴细胞悬液为宜)，酒精灯烘烤滴片，冷却后进行分带处理。

4、囊胚嵌合体试验

囊胚嵌合体试验，将iPS细胞注射到供体小鼠的囊胚腔中，再将注射后的囊胚移植到假孕雌鼠的子宫中制作嵌合体小鼠，出生的小鼠根据毛色来判定是否产生嵌合。

按以上方法进行实验，结果分析为：

图2-A显示OKS和Map2k6诱导的多能干细胞克隆呈现类似胚胎干细胞的典型形态。

图2-B显示OKS+Map2k3或Map2k6诱导的多能性干细胞单克隆外源基因定量PCR结果，可以看出，OKS+Map2k3和Map2k6诱导的多能性干细胞克隆3F+3-1、3F+6-1和3F+6-2外源基因被沉默表达，其中3F+6d5对照是从感染OKS和Map2k6并培养5天后的细胞中提取的mRNA反转录得到的cDNA模板，mEF是小鼠胚胎成纤维细胞；

图2-C显示对OKS和Map2k3或Map2k6诱导的多能干细胞克隆基因组DNA进行PCR扩增的结果，表明OKS+Map2k3和OKS+Map2k6诱导的多能干细胞单克隆3F+3-1、3F+3-2、3F+6-1和3F+6-2的基因组中有Oct4、Sox2、klf4和Map2k3或Map2k6整合。

图2-D显示OKS和Map2k3或Map2k6诱导得到的干细胞克隆3F+3-2和3F-6-1核型正常。

图2-E显示OKS和Map2k3或Map2k6最终形成的诱导多能干细胞注射囊胚后发育形成的嵌合体后代照片及嵌合体与野生型小鼠个体交配后产生的后代的照片，显示了通过本发明方法得到的干细胞可以形成嵌合体，其中供体细胞为诱导的多能干细胞，其来源是OG2/129小鼠胚胎，而囊胚供体小鼠是实验饲养的ICR小鼠，得到的嵌合体具有将原来供体细胞通过生殖系传递到下一代，说明此干细胞具有良好的质量。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院广州生物医药与健康研究院

<120> Map2k3或Map2k6在提高诱导成体细胞生成多能性干细胞效率中的用途

<130> PIDC3204879

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1044

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 1

<400> 1

atggagtcgc ccgccgcgag cccgccggcc agcttgcctc agaccaaagg aaaatccaaa 60

aggaaaaagg acttacggat atcctgcgtg tccaagccac ctgtgtccaa ccccacaccc 120

ccccggaacc tggactcccg gaccttcatc actatcggag acagaaactt cgaagtggag 180

gctgatgact tggtgaccat ctcagagctg ggtcgtggag cctatggggt ggtagagaaa 240

gtgcggcatg ctcagagtgg taccatcatg gctgtcaagc gcatccgggc cacagtgaac 300

acacaggagc agaaacgtct gcttatggac ctagacatca acatgcgcac ggtcgactgc 360

ttctacactg tcaccttcta tggtgccctc ttcagagagg gggatgtatg gatctgcatg 420

gagctcatgg acacttccct ggataagttc taccggaagg tgctggagaa gaacatgaaa 480

attccggaag acatcctggg ggagatcgct gtgtctatcg tgcgggccct ggagcacctg 540

catagcaagc tgtctgtgat ccacagagat gtgaagccat ccaatgtcct catcaacaag 600

gaagggcatg tgaagatgtg cgactttggc atcagtggct acctggtgga ctctgtggca 660

aagacaatgg atgctggctg caagccttac atggcccctg agaggatcaa ccctgaactg 720

aatcagaagg gctacaatgt caagtctgat gtctggagcc tcggcatcac catgatcgag 780

atggccattc tgcgattccc ttatgagtct tggggcacac cgttccagca gctgaagcag 840

gtggtggagg agccatcccc acagctccca gcggaccagt tctcccctga gtttgtggac 900

ttcactagcc agtgcctaag gaagaaccct gcagagcgca tgagctacct ggagctgatg 960

gaacacccat tcttcacctt gcacaaaact aagaagacag acattgctgc ctttgtgaag 1020

gagatcctgg gagaggattc atag 1044

<210> 2

<211> 1005

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 2

<400> 2

atgtctcagt cgaaaggcaa gaagcgaaac ccgggcctta agattccaaa agaagcgttt 60

gaacagcctc agaccagttc cacgccgcct cgggatttag actccaaggc ttgcatatct 120

attggaaacc agaactttga ggtgaaggca gatgacctgg agccgatagt ggagctggga 180

cgaggtgcgt acggggtggt ggagaagatg cgtcacgtgc ccagcgggca gatcatggca 240

gtgaagcgga tacgggccac agttaatagc caggaacaga aacggctgct gatggatttg 300

gatgtctcca tgaggacggt ggactgtcca ttcaccgtga ccttctacgg tgcactcttc 360

cgggagggcg acgtgtggat ctgcatggag ctcatggata cgtcactaga taaattctac 420

aaacaagtta ttgataaagg ccaaacaatt ccagaggata tcttaggaaa gatagcagtt 480

tctattgtaa aagcgttaga acatttacac agtaagctgt ctgttatcca tcgagacgtc 540

aagccttcta atgtgctcat taacacactg ggccaggtga agatgtgtga ctttggaatc 600

agtggctacc tggtcgactc tgttgctaaa acgatcgatg ccggttgcaa accatacatg 660

gctcctgaac gaataaatcc agagctcaac cagaaggggt acagtgtgaa gtctgacatt 720

tggagcctgg gcatcaccat gatcgagctg gccatccttc ggtttcctta tgattcttgg 780

ggaacgccct tccagcagct aaagcaggtg gtcgaagagc cctctcctca gctcccagca 840

gacaagttct ccgcggactt tgttgacttt acctcacagt gcttgaagaa aaattccaaa 900

gaacggccca catatccaga gcttatgcaa catccatttt tcaccgtaca tgaatccaaa 960

gcagcagacg tggcatcttt tgtaaaactg atacttgggg actaa 1005

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 3

<400> 3

accatggagt cgcccgccgc gag 23

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 4

<400> 4

ctatgaatcc tctcccagga tctcc 25

<210> 5

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 5

<400> 5

accatgtctc agtcgaaagg caagaagc 28

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 6

<400> 6

ttagtcccca agtatcagtt ttacaaaaga 30

Claims (10)

1.Map2k3或Map2k6在提高诱导成体细胞生成多能性干细胞效率中的用途。

2.一种提高诱导成体细胞生成多能性干细胞效率的方法，其特征在于：

将Map2k3或Map2k6和转录因子导入哺乳动物成体细胞中进行诱导培养，获得多能性干细胞克隆，将获得的多能性干细胞克隆在干细胞培养基中培养扩增。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述诱导培养采用的诱导培养基中含有维生素C。

4.根据权利要求2或3所述方法，其特征在于，所述转录因子为：Oct4、Klf4和Sox2的组合，或Oct4、Klf4、Sox2和c-Myc的组合。

5.根据权利要求2或3所述方法，其特征在于，所述转录因子和Map2k3或Map2k6为具有多能干细胞诱导功能的编码或非编码RNA、蛋白质或多肽。

6.根据权利要求2或3所述方法，其特征在于，所述将Map2k3或Map2k6导入哺乳动物成体细胞是以能够表达Map2k3或Map2k6基因的载体导入细胞中来实现的；

任选地，所述载体为病毒载体、质粒载体、外随体载体、mRNA载体或直接化学合成的载体。

7.根据权利要求6所述方法，其特征在于，所述病毒载体为逆转录病毒，所述逆转录病毒为pMXs载体。

8.根据权利要求2或3所述方法，其特征在于，所述成体细胞为成纤维细胞、神经细胞、造血细胞和神经胶质细胞；

优选地，所述成体细胞为小鼠胚胎成纤维细胞。

9.一种提高诱导成体细胞生成多能性干细胞效率的试剂盒，其特征在于，包括：Map2k3或Map2k6和转录因子。

10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述转录因子为：Oct4、Klf4和Sox2的组合，或Oct4、Klf4、Sox2和c-Myc的组合；

任选地，所述Map2k3或Map2k6是以克隆在表达载体上的形式提供的。

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