CN106456802B - 一种改进的用于镰状细胞疾病基因校正的胎儿血红蛋白 - Google Patents

Abstract

本文公开的方法和组分通常涉及测定对造血疾病校正的最小造血干细胞(HSC)嵌合性和基因剂量的方法；具体地，是在体内模型中。本发明还涉及用于增加病毒滴度的经修饰的慢病毒表达载体和增加该滴度的各种方法以及能够提高该滴度的表达载体。本发明还涉及CHS4染色质绝缘子衍生的功能性绝缘子序列。本发明还涉及疾病的基因校正或减轻其症状的方法，例如镰性细胞性贫血或β‑地中海贫血。

Description

一种改进的用于镰状细胞疾病基因校正的胎儿血红蛋白

政府权益

本发明在国立卫生研究院资助的项目HL070595、HL70135-01、HL073104、和HL06-008的支持下完成。政府对本发明享有一定权利。

相关申请的交叉引用

本申请要求于2014年1月30日提交的美国临时申请61/933,788的35U.S.C.§119(e)优先权权益，并通过引用的方式整体并入本文。

技术领域

本文中所公开的发明总体涉及到确定用于校正造血性疾病的最低造血干细胞(HSC)嵌合体和基因剂量的方法；尤其是，在体内模型中。本发明还涉及用于增加病毒滴度的经修饰的SIN慢病毒表达载体和用于增加此类滴度的各种方法以及能够增强这种滴度的表达载体。本发明还涉及衍生自CHS4染色质绝缘子的功能性绝缘子序列，以帮助提高整合载体的安全性并增加其表达。本发明还涉及对疾病进行基因校正或减轻其症状的校正方法，如镰状细胞性贫血和β-地中海贫血。本发明还涉及各种表达载体，其能够校正基因从而对镰状细胞贫血症或β-地中海贫血进行校正，或减轻其症状。

背景技术

在本文中通过引用并入所有出版物，其程度如同每个单独的出版物或专利申请被具体和单独地指出并通过引用并入本文。下面的描述包括可以用于理解本发明的有用的信息。这并非对任何本文所提供的信息是现有技术或与目前要求保护的发明相关、或明确或隐含引用的任何出版物均是现有技术的认同。

基因校正和载体设计

由造血干细胞(HSC)介导的成功的疾病基因校正，取决于治疗量的稳定、安全、靶向的基因表达。表达载体对基因校正过程极为重要，因此成为很多研究的主题。尽管在载体设计上的显著进步已经提高了基因治疗的疗效，但是出现了某些关键的障碍并成为成功临床应用的障碍。如本文所公开，在这些障碍中，载体基因毒性是其中最可怕的、已由X-SCID试验中基因治疗相关的白血病患者事件证明。结果，γ-逆转录病毒载体和慢病毒载体已被修饰为自失活(SIN)，设计成删除无所不在的长末端重复序列(LTR)U3区域的活性增强子(如本文所公开的)。SIN设计已经被改进以提高载体滴度。提高转基因表达的几种方法已被随后使用。

作为稳定表达的补充措施，许多载体现在被设计具有染色质绝缘元件以减少染色质位置效应。而这些绝缘子可提高某些载体的安全性和表达谱，在某些情况下，不希望的副作用是与非绝缘的版本相比，滴度降低。已设计出的定制绝缘子能够提供最佳绝缘而不降低滴度。

因此，在本领域中有必要改进表达载体的设计，以安全地稳定转基因表达为目的，同时保持临床上相关的病毒滴度。

确定镰状细胞贫血校正的关键参数

已证实，大量的胎儿/抗镰化血红蛋白的表达将毋庸置疑地对该疾病进行校正，但实际上在临床环境不可能。作为一个例子，即使植入少数基因标记的干细胞，并且基于ADA的消退，基因校正的淋巴细胞的选择性优势已较为明显(如本文所公开的)，但使用未经调节的初始基因疗法对腺苷脱氨酶(ADA)缺陷进行的治疗并没有显出疗效。在随后的试验中，在移植前使用4mg/kg白消安作为调节，即产生了足够的基因校正的干细胞剂量和基因修饰的T细胞(如本文所公开)。因此，在本领域中有必要在开始临床研究之前建立确定基因校正阈值的方法。

发明概述

本文描述的方法和组合物是通过示例的方式提供，并且不应以任何方式限制本发明的范围。

本发明的实施方式包括突变的人γ-球蛋白基因。在一些实施方案中，所述人突变γ-球蛋白基因可编码包括SEQ ID NO：1的蛋白。在一些实施方案中，所述人突变γ-球蛋白基因与SEQ ID NO：2相比可以具有70％或更大的序列同一性。

本发明的实施方案还包括使用编码包括SEQ ID NO：1蛋白的人突变γ-球蛋白基因来基因校正镰状细胞贫血或β-地中海贫血或减轻其症状的方法，所述方法包括确定需要治疗镰状细胞性贫血和β地中海贫血的对象；用包含编码包括SEQ ID NO：1蛋白的人突变γ-球蛋白基因的修饰的慢病毒转染自体造血干细胞(HSC)；将转染的HSC移植到所述对象。

在一些实施方案中，所述对象为人类对象。在一些实施方案中，移植前对所述对象进行减低强度预处理。

在一些实施方案中，经修饰的慢病毒还包括位于标准SIN慢病毒载体骨架中的病毒3'端LTR序列下游的异源多聚A信号序列；和一个或多个USE序列，衍生自标准SIN慢病毒载体骨架U3缺失区的SV40晚期多聚A信号。在一些实施方案中，经修饰的慢病毒还包括一个或多个侧翼CHS4衍生的长度缩短的功能性绝缘子序列。在一些实施方案中，经修饰的慢病毒还包括β球蛋白基因座控制区。在一些实施方案中，经修饰的慢病毒还包括红细胞谱系特异性增强子元件。

在一些实施方案中，移植后胎儿血红蛋白至少超过20％；F细胞至少可以占循环红血细胞的2/3；每个F细胞胎儿血红蛋白至少可以是镰状红细胞中血红蛋白总量的1/3；和至少20％基因修饰的HSC可以重新填充受试者的骨髓。

本发明的实施方案还包括能够基因校正镰状细胞贫血症或β地中海贫血或降低其症状的慢病毒表达载体，包括编码SEQ ID NO：1蛋白的突变的人γ-球蛋白基因。在一些实施方案中，慢病毒表达载体，进一步包括位于标准SIN慢病毒载体骨架中的病毒3'端LTR序列下游的异源多聚A信号序列；和一个或多个USE序列，衍生自标准SIN慢病毒载体骨架的U3缺失区的SV40晚期多聚A信号。在一些实施方案中，所述慢病毒表达载体还包括一个或多个侧翼CHS4衍生的长度减小的功能性绝缘子序列。在一些实施方案中，所述慢病毒表达载体还包括一个或多个以反方向克隆到病毒转录单元的β-球蛋白基因座控制区的元件。在一些实施方案中，所述慢病毒表达载体还包括红细胞谱系特异性增强子元件。

附图说明

本领域技术人员将理解，如下所述的附图仅用于说明目的。附图并不意图以任何方式限制本教导的范围。

图1描述了标准和消化(gutted)的SIN-LV滴度(a)SIN的慢-原病毒的示意图。sSIN-GFP、SBG-6和s图分别是携带绿色荧光蛋白的SIN-LV、β球蛋白基因(BG)或范科尼贫血症A(Fanconi Anemia A)的cDNA、-IRES-GFP。dsSIN-GFP、SBG-1和ds-图分别是它们消化后的对应物。SD＝剪接供体。SA＝剪接受体。ψ包装序列。cPPT：中央多聚嘌呤簇。对gag(360bp)和包含RRE(～850bp)的env片段进行了标识。(b)感染MEL细胞后获得的病毒和对具有不同迭代“SIN”设计的GFP和hβ球蛋白表达细胞的分析。滴度表示为浓缩上清液的IU/mL(n＝3)。

图2描绘了BG SIN-LV构建体。10个SIN-慢病毒的原病毒形式(sBG-1至sBG-10)的示意图。所有的载体含有BG(HS2、3和4个LCR元件、(β-启动子和基因)和cPPT。示出了Gag(630bp或360bp)、RRE、evn片段。*表示破坏SA的一个点突变。

图3描绘了BG SIN-LV的病毒滴度(a)sBG-1至sBG-10慢病毒载体的病毒上清液浓缩1400倍，滴定至MEL细胞通过流式细胞术检测β球蛋白阳性细胞(n＝4)。(b)包含cis-元件的滴度成倍增加。将滴度标准化到完全消化载体(sBG-1)的滴度，其被设为1。sBG-6设计显示了显著增加的滴度。

图4描绘了LV顺式-元件对原病毒的稳定性和表达的影响。(a)原病毒的完整性：用Southern印迹分析用sBG-127至SBG-10转导的MEL细胞，用AflII限制性内切酶酶切病毒LTRs，并用hβ球蛋白片段探测。所有SIN载体均稳定地传播。(b)MEL细胞中hβ球蛋白的表达：来自一个代表性实验的sBG-1至sBG-10转导的MEL细胞散点图分析；散点图的右上角示出了MFI。

图5描绘了包装细胞中vRNA的转录。Northern印迹分析(A)SIN LV质粒转染的293T包装细胞中的总RNA，用³²P标记的hβ球蛋白片段探测。下图显示了一个使用18S探针作为上样对照的相同的杂交印迹。预期大小的全长条带对于所有的载体可见。*表示存在SA的载体，并且全长和拼接的条带均为可见。载体-顺式序列的小示意图示于载体泳道上方，用来描述Ψ包装序列；载体中R：RRE；SA：env片段中的剪接受体；SG：短gag片段(360bp)；LG：长gag片段(630bp)。(B)A图显示了相同实验中具有和不具有RRE的载体的细胞质RNA，呈现出了vRNA输入至细胞质的效率。磷成像定量的细胞质/总计比率示如图6E所示。

图6描绘了vRNA包装入病毒粒子(a)对提取自sBG系列病毒上清的vRNA的典型的斑点印迹分析，显示vRNA的数量与感染滴度成比例。从所有十个载体制备病毒并进行如所描述的相同的浓缩，用β球蛋白片段探测斑点印迹。NC＝阴性对照。对于每个载体的4种不同稀释体一式两份上样至所示的代表性实验中。总计进行三个实验(B)磷成像计数获自图(A)显示的28个斑点印迹。C)来自所有三个实验的vRNA的相对定量。(D)来自所有的载体的浓缩病毒的p24活性(n＝2)。(E)从2个Northern印迹分析(NB)包装细胞中细胞质/总计的RNA比率(细胞质/总计的RNA比率标准化至两个独立实验中完全消化的无RRE载体(SBG-1)的值以及18S RNA(用于加载的)的值。有或没有RRE的类似载体被标记为I、II和III以备比较。)

图7描绘了载体构造和实验实验设计。A.携带hβ-球蛋白基因和基因座控制区的HS2、HS3和HS4的自失活慢病毒载体(SIN)显示为sBG。使用该骨架，产生了一系列的载体，包含cHS4 59 250bp核心、核心的2个串联重复件、c5’400bp或 59 800bp的HS4、以及全长1.2Kb cHS4绝缘子中的任何一个。载体sBG400S和sBG800S除了核心以外还增加了来自噬菌体的DNA惰性间隔子。B.体外与体内分析图：使用不同病毒载体转导MEL细胞以产生单拷贝MEL克隆，在已分化的克隆中进行hβ-球蛋白表达和ChIP分析。体内分析中，使用载体转导的Hbb^th3/+供体LSK细胞移植入经致死剂量照射的Hbb^th3/+并在移植后6个月进行分析。进行二次次移植以进行CFU-S分析。C.代表性的FACS图显示未绝缘的(sBG,绿色)和绝缘的(sBG-I,粉色)单拷贝MEL克隆hβ-球蛋白表达细胞(％hβ+)，箭头显示表达变异系数(CV)。

图8描述了MEL克隆中人β-球蛋白表达细胞。A.hβ-球蛋白表达细胞(％hβ+)在MEL克隆中的比例。各圆圈代表了个体单拷贝MEL克隆。B.各克隆hβ-球蛋白表达的CV值。横线代表平均值，在上方的方框里标示了6个％hβ+MEL细胞的平均SEM和各载体hβ-球蛋白表达的CV值。实心圆圈代表挑选用于ChIP分析的代表性克隆。通过方差分析与sBG相比*P<0.05。

图9描绘了RBCs和单拷贝二次CFU-S中人β-球蛋白的表达。A.代表性的FACS柱状图展示(％hβ+RBC显示在柱状图中)。B.关于标准化至载体拷贝的hβ+RBCs的百分比累积数据。C.RBCs中hβ表达的变异系数(CV)。D.关于％hβ+cells/CFU-S的累积数据。各圆圈代表一CFU-S个体单一要素。E.CFU-S个体中hβ表达的CV值。柱形图上的数字代表6个SEM平均值，并且通过方差分析用星号标记了与对照显著不同的值。*P<0.05；**P<0.01。

图10描绘了chIP分析显示的MEL细胞克隆中5′250bp cHS4核心和hβ启动子的组蛋白标记的激活和抑制。A.载体的原病毒形式图。箭头显示用于PCR或qPCR的引物对位置；线条代表绝缘子片段。B-C.ChIP使用针对对照IgG、acH3、acH4、H3K4-me2、H3K9-me3和H3K27-me3的抗体，以及对β-球蛋白启动子区域的半定量PCR引物D–F ChIP使用针对AcH3和AcH4(D)，H3K4-me2(E)的抗体；H3K9-me3和H3K27-me3(F)随后通过qPCR使用引物在合并的克隆上(显示于图2A)扩增cHS4核心(左图)和hβ-球蛋白启动子(右图)。*P<0.05；**P<0.01。

图11描述了鼠中人β-球蛋白表达。A.RBC参数、网织红细胞和载体拷贝。数值代表平均值±SEM。Hb＝血红蛋白，MCV＝平均红细胞容积，MCHC＝平均红细胞血蛋白浓度，载体拷贝＝通过qPCR测得的白血球中载体拷贝。B.HPLC分析血(细胞)破碎液中的人β-球蛋白作为总血红蛋白[hβ-mα/(hβ-mα+mβ-mα)]的百分比。数据标准化至白细胞中载体拷贝/细胞。*P<0.05；**P<0.01。

图12描述了cHS4绝缘子的3′400bp区域的效果。A.sBG^3’400载体的载体设计。显示了全长的cHS4用于对比。B-C.MEL克隆中hβ+细胞的比例(B)以及sBG^3’400的hβ表达变异系数(C)。各圆圈代表单要素MEL克隆。横线代表平均值，图中显示了平均值±SEM。D-E.小鼠中hβ-globin+RBC百分比(D)和hβ表达的CV(E)。F-G.二次移植后的单一拷贝CFU-S中hβ-球蛋白表达细胞(F)和hb表达的CV(G)。各圆圈代表个体CFU-S。示出了平均值±SEM和P-值。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。

图13描述了将cHS4绝缘子5′核心和3′400bp区域组合的效果。A.sBG⁶⁵⁰载体设计。显示了全长的cHS4用于对比。B.hβ+细胞比例以及C.sBG⁶⁵⁰MEL克隆中hb-球蛋白表达的CV。各圆圈代表单一拷贝MEL克隆。横线代表平均值，各组上方显示了平均值±SEM。D.移植小鼠中表达hb球蛋白的RBC的百分比。E.来自二次小鼠的单拷贝CFU-S中hβ-球蛋白表达细胞的百分比。F-G.ChIP激活和抑制核染色质后cHS4核心区域或hβ-球蛋白启动子区域的半定量PCR(F)或qPCR(G)。

图14描述了涵盖3′400bp核染色质及其与5′核心区域的相互作用。A.3’LTR图显示1.2kb全长绝缘子的定位和ChIP分析中使用的引物的位置。经检测的具有指示区域的核心的载体描述于下方。图B ChIP使用针对AcH3和AcH4、H3K4-me2和H3K9-me3和H3K27-me3的抗体，随后对sBG^3’400、sBG⁶⁵⁰、sBG-I原病毒3’400区域进行半定量PCR。C–D ChIP使用针对USF-1和CTCF的抗体随后进行对(D)核心区域进行半定量PCR(C)或qPCR。E–F ChIP使用针对USF-1和CTCF的抗体随后对三个单拷贝MEL克隆池中sBGC、sBG^3’400、sBG⁶⁵⁰和sBG-I原病毒的 3/400bp区域进行半定量PCR(C)或qPCR(D)(G)图S1代表性柱状图(FACS)显示在模拟(对照)、sBG、sBGC、sBG2C、sBG400和sBGI sBGI单拷贝CFU-S中的hb表达细胞。hβ+细胞的百分比在柱状图中显示。(H)通过qPCR检测sBG、sBGC、sBG2C、sBG400和sBG-I的单一拷贝二次CFU-S中人β-球蛋白信使RNA(mRNA)的表达。鼠a-球蛋白表达作为内部对照，并参照其对hβ-球蛋白表达进行标准化。图中显示了P值。**代表P<0.01。(I)显示了染色质免疫共沉淀(ChIP)中的引物和探针。‘F’代表正向引物，‘R’代表反向引物。(J)根据http://genome.ucsc.edu，使用基因打击(gene hits)分析来自未绝缘的sBG和绝缘的sBG-I载体单拷贝MEL克隆的插入位点。

图15描述了在3’LTR中有插入物的慢病毒载体的病毒滴度，与LTR插入物长度呈反比。(A)慢病毒载体的示意图。所有的载体均基于sBG，sBG是一种携带β-球蛋白基因、β-球蛋白启动子和基因座控制区元件HS2、HS3和HS4的SIN慢病毒载体。cHS4位点的不同片段被插入到sBG的3’LTR的U3区域(显示于sBG载体上方)。通过插入来自λ噬菌体DNA的DNA间隔序列，替换cHS4核心区的下游区域，从而制得相似大小的插入物(显示于sBG载体下方)。(B)随着绝缘子插入物长度的增加，绝缘的载体病毒滴度降低。所述滴度反映了在各实验中所有载体同时进行制备的浓缩的病毒(n＝4)。所有滴度均显著低于对照载体sBG的滴度(p<0.01；单因素方差分析)。(C)随着核心区下游的插入DNA间隔序列长度的增加，滴度下降。在四个独立实验中，绝缘的慢病毒载体(阴影线柱)的滴度，与在LTR中含有插入DNA间隔序列(空心柱)的那些慢病毒载体是类似的。具有400bp间隔序列的sBG的滴度略高(*p<0.05)。(D)对携带cHS4核心的串联重复序列的sBG^2C载体，进行高频率重组。给出了sBG-I载体和sBG^2C前病毒示意图，其中显示了完整的，或当核心元件重组丢失一个或两个核心，所述核心具有探针区域和所用的酶(AflII)的限制性位点。在各载体示意图的旁边，给出了预期的条带大小。右图是Southern印迹分析，显示了sBG-I转导的MEL细胞群的单一的8Kb预期条带，以及在sBG^2C转导的MEL细胞群中的两个条带，这表示丢失一个或两个核心的sBG^2C。

图16描述了包装细胞中绝缘的或未绝缘的载体所产生的病毒RNA的相似数量。对用sBG和sBG-I载体转染之后的293T包装细胞进行Northern印迹分析，显示了预期长度的病毒RNA。膜与³²P标记的p-球蛋白探针进行杂交(上图)，并将18S(下图)作为负载对照。检测到了对应于sBG和sBG-I病毒RNA的预期的7.3Kb和8.5Kb条带。使用该探针非特异性检测18S和28S rRNA。用两个载体均没有检测到外源的重组条带。两个载体的病毒RNA和18S rRNA的磷成像定量比例，被列于泳道下方，并且显示出v-RNA数量在两个载体之间没有区别。

图17描述了在3’LTR中插入cHS4并不损害病毒产量。(A)sBG和sBG-I病毒上清的逆转录酶活性是相似的(23±5vs.27±3；n＝3,p>0.5)。(B)sBG和sBG-I病毒浓缩制备物中p24水平是相同的。(2.9±0.5x10⁵对1.7±0.5x10⁵；n＝3,p>0.1)。(C)对提取自sBG和sBG-I病毒上清的病毒RNA进行点印迹分析，显示两个载体中相似数量的病毒RNA被包裹进了病毒粒子。请注意，对于两个载体，病毒RNA的4个不同稀释度都一式两份地进行上样。用³²P标记的p-球蛋白探针，对膜进行杂交。仅示出了两个代表性实验中的一个。(D)描绘了两个独立实验的磷成像定量结果，显示sBG和sBG-I病毒粒子中病毒RNA的数量相似(1.9±0.7x10⁶对1.9±0.6x10⁶n＝2,p>0.5)。

图18描绘了在LTR中携带绝缘子元件的慢病毒载体的反转录和核转位的动力学。图(A)中描述了慢病毒逆转录和核转位过程的示意图。右边为分析该过程中的几个步骤的q-PCR分析的总结。细线：RNA；粗线：DNA。开放框：多嘌呤序列(PPT)。开放圆圈：引物结合位点(PBS)。3’LTR DNA插入物示于第一链转移图中。显示了q-PCR分析的位置。感染后在不同时间点，收集来自用sBG和sBG-I病毒感染的MEL细胞的DNA，并通过qPCR分析。实线：sBG。虚线：sBGI。(B)在第一链转移之前(R/U5)的反转录动力学，显示两个病毒之间没有差别。(C-D)在第一链转移之后(U3/R和Psi)，在绝缘子存在下反转录效率降低(n＝3)。

图19描述了在LTR中插入cHS4，影响了病毒整合。线性病毒cDNA环化和成为整合的形式；1-LTR和2-LTR环分别代表了同源重组和非同源末端连接的失败的整合产物。因此，1-LTR和2-LTR环被用作核转位的标记物。(A)存在减少的2-LTR环；通过对提取自病毒感染后的不同感染时间的MEL细胞的DNA进行qPCR分析，提示核转位或非同源末端连接减少了。(B)使用相同剂量的sBG和sBG-I病毒感染72h后，Southern印迹分析MEL细胞。StuI消化基因组DNA，能够鉴别出sBG和sBG-I的1-LTR环、2-LTR环、线性DNA和整合的DNA(拖尾)。显示了两个载体的预期条带大小。而在sBG泳道中能够看到线性、1-LTR和2-LTR环，在sBG-I泳道中没有检测到线性DNA或2-LTR环。然而，1-LTR环几乎如在sBG泳道中一样突出。线性、1-LTR和2-LTR环的相对比例，表明使用sBG-I载体会增加重组失败整合产物，并因而导致无效的整合。(C)sBG和sBGI转导的MEL细胞，显示出完整的前病毒组分(分别为7.5Kb和8.0Kb)。两个条带的磷成像计数具有8倍的不同。通过qPCR定量每个细胞的载体拷贝数，描述于泳道下方。

图20描述了绝缘子序列降低病毒滴度的机制假设。在野生型HIV中，线性cDNA分子转位至核，在此，少部分经历重组和末端接合连接反应，从而分别形成1-LTR和2-LTR。只有线性形式是形成整合的前病毒的直接前体。在绝缘的LV载体的例子中，显示出1-LTR环形成的增加，这是因为大的U3序列的存在促进了同源重组的增加。如本发明所示，该过程消耗了能参加整合的病毒DNA的数量以及2-LTR环形成的数量。能用于整合的DNA数量的减少，能够解释在LTR中携带大插入物的慢病毒载体的滴度下降。(B)向BG-I载体进一步增加1.2KbPGK-MGMT内部盒(命名为BGM-I)，并没有进一步降低滴度。(C)优化的载体设计产生了合理的病毒滴度且不会丢失绝缘子活性。cHS4的650bp序列，是通过结构功能分析对绝缘子活性而进行了优化。含有该650bp片段(sBG650)的载体具有与未绝缘载体sBG相比滴度低了约2倍(n＝3)。(D)在衍生自单拷贝MEL克隆的前病毒中，通过PCR检测3’LTR插入物的存在与否，结果显示所有插入物均稳定传递除了那些表现为串联重复序列的。MEL细胞从具有≤5％转基因的混合物中进行克隆。使用β-球蛋白引物，检测单拷贝克隆，并使用横跨ψ区域的引物进行qPCR确认。在单拷贝克隆中，使用横跨250bp核心的引物进行PCR，由于这些核心序列对所有载体来说是相同的。sBG-I中的1.2Kb cHS4插入物进一步通过横跨核心5’端和cHS4的3’端的PCR引物进行确认。(E)PCR引物。

图21描绘了清髓性预处理后接受移植的sG^bG鼠，在初级和二级鼠中具有稳定和持续的高HbF产生。对于RBCs供体而言完全嵌合的sG^bG鼠，在不同的时间点进行分析。分别通过离子交换HPLC和FACS分析，测定个体小鼠血液中HbF(A)和F细胞(B)比例，在初级(或初次、首次)和二级(或二次)移植后的不同时间点显示。(C)血液中HbF的数量直接关联于F细胞的比例。(D)产生的HbF的数量与骨髓中载体拷贝数成正比。各符号代表一只老鼠(所有图中，均一致地描述了同一个特定老鼠)。(E)清髓性预处理后接受移植的sG^bG鼠的血液学参数。Hb代表血红蛋白；MCV，平均红细胞容积；MCH，平均红细胞血红蛋白；RDW，红细胞体积分布宽度；Plt，血小板；pri，初级小鼠；和sec，二级小鼠。*P值代表初级模拟(对照)小鼠和sG^bG群的比较。没有做与二级小鼠的统计对比，由于在分析时只有一个二级模拟小鼠存活。

图22描述了清髓性预处理后接受移植的sG^bG鼠，产生了与HbF表达相关的血液学参数的校正。随着时间，网织红细胞持续减少(A)，红细胞容积(B)和RBC数(C)增加。(D)白血球降低而WBC计数正常化。显示数值代表了sG^bG鼠(n＝5；·)和进行模拟移植的鼠(n＝10；O)的平均(±SEM)值。星号代表BERK鼠(它是sG^bG和模拟移植的HSC供体)中的平均值。(E-G)的网织红细胞减少，以及红细胞容积和RBC数的增加，这些与个体鼠中F细胞比例相关。(H)WBC计数降低但是当F细胞超过60％时正常化。WBC计数，在自动化的分析器上计数，代表了循环白细胞，由于在外周血涂片中只偶然看到成核的RBCs。图E-H中各数据点/符号代表一个sG^bG鼠，个体小鼠的符号保持一致以便追踪个体小鼠。星号代表BERK鼠中的平均值，它们是sG^bG和模拟移植的HSC供体。

图23描述了清髓性预处理后接受移植的sG^bG鼠，在初级和二级鼠中产生了对功能性RBC参数的校正。(A)外周血涂片显示经模拟移植的鼠中有众多不可逆的镰形细胞(ISCs)和在sG^bG鼠中有大量ISCs。(B)对未经移植的BERK(n＝5)、模拟鼠(n＝3)、和sG^bG鼠(n＝5)的外周血涂片中ISCs的定量(*P<.05；**P<.01)。(C)在模拟鼠中血液脱氧导致镰状的RBCs；sG^bG鼠中镰状极大地减少。(D)基于缺氧等级(通过张力测定法)对sG^bG鼠(·)中镰状RBCs进行定量，与模拟鼠比较(O)。(E)通过LORCA分析，对sG^bG、模拟对照的、和正常鼠(C57，中心具有X的圆圈)的RBC可变形性进行分析，在初级移植受体第18周进行。在二级受体中能看到相似的数据。通过阴影区表示低(3Pa)和高(28Pa)剪切应力的流动。(F)初级移植后的sG^bG鼠、模拟的/BERK鼠、和正常鼠中的RBC半衰期(通过体内生物素标记检测)。在二级受体中能看到相似的结果。(G)清髓性预处理后接受移植的sG^bG鼠中器官病理的校正。2+肝梗塞表示2至3个梗塞/切片；3+肝梗塞表示多于3个梗塞/切片；E-M表示髓外的。当修复脾结构后，能够看到具有镰状RBCs的脾血管的轻微淤血。没有注意到，通过髓外的红细胞生成来影响脾结构的时间。脾红血球高生成：脾小囊完全闭塞为严重；中等，多于1个小囊/切片；和轻度，存在小囊有红岛的证据。骨髓：正常红细胞生成表示M/E＝5:2；轻微红细胞畸形，M/E＝2:1；中度红细胞畸形，M/E＝1:1；和严重红细胞畸形，M/E＝1:3。骨髓红细胞生成表示为骨髓-红色比例(M/E)。括号中的数值表示可见组织特征的老鼠数量/该组中分析的老鼠总数。

图24描述了减低强度的预处理之后，对移植的sG^bG鼠中HbF的表达和功能性校正，其中分为2个组：具有10％或更多的HbF的鼠(sG^bG>10)和具有低于10％的HbF的鼠(sG^bG<10)。(A)减低强度的预处理之后，sG^bG-转导BERK HSCs的移植后18周的个体BERK鼠中的HbF。(B-C)长期存活体中，在第11月分析稳定和高HbF表达和F-细胞重建。(D)箱型和盒须图显示sG^bG<10和sG^bG>10鼠中的载体拷贝数，平均载体拷贝数由线指示。在图A至C中的符号代表鼠群：O＝模拟(HbF 0％)，▼＝sG^bG<10(HbF<10％)，和●＝sG^bG>10(HbF>10％)。(E)sG^bG<10鼠中ISCs的比例降低(P<0.04)，但是sG^bG>10鼠中显著降低(P<0.001)，与模拟鼠相比。(F)通过张力测定法获得的脱氧分级证明，sG^bG>10鼠中在镰状病理相关的部分氧压(PO₂)显著降低，而G^bG<10鼠的镰刀化RBC与对照相似。(G-H)RBC可变形性显示，sG^bG<10鼠中可变形性的高度可变改进。相反，sG^bG>10鼠中RBC可变形性在低或高剪切应力下被高度显著地改进(P<0.001)。符号代表鼠群：O,模拟；▼,sG^bG<10；●,sG^bG>10；和(中心具有X的圆圈),野生型鼠(C57BL/6)。灰度矩形代表分别通过微血管和大血管的低或高剪切应力。误差线表示SEM。

图25描述了减低强度的预处理之后，移植的sG^bG^10鼠中器官病理的校正和总生存率的改善。(A)减低强度预处理48至50周后sG^bG>10和sG^bG<10鼠，以及以及3个月大的BERK对照的肾脏、肝脏和脾脏的代表性苏木精-伊红染色切片。可在补充数据中获得图像采集信息。(B)在第50周与模拟/sG^bG<10鼠相比，Kaplan-Meier生存曲线显示sG^bG>10鼠的生存率显著改善。在第24周的存活率由垂直虚线表示，并与清髓移植模型的sG^bG小鼠存活率比较。(C)减低强度预处理之后移植的sG^bG鼠的血液参数。血液学参数和缩写如图中所述。P值代表在12(*)、和的模拟小鼠与sG^bG≥10的比较。(D)减低强度预处理之后移植的sG^bG鼠的器官病理。E-M表示髓外；和1+表示肝梗死。1梗死/切片。*血管阻塞和血管中存在镰状RBC。值得注意的是，只有在影响脾结构的红系增生降低时在脾脏中可见血管阻塞。用于量化器官病理学的术语与在该图中记载的相同。

图26描述了RBC生存和变形性的功能改善所需的HbF、F细胞和HbF/F细胞百分比的影响。(A)RBC半衰期。左图显示FACS测定的用生物素标记的F细胞(右上象限)和非-F细胞(右下象限)进行生物素注射的代表性sG^bG鼠。右图显示了与在sG^bG鼠中(n＝4)的非-F细胞(中心具有圆点的空心圆)相比，F细胞(中心具有圆点的空心正方形)的存活情况；野生型小鼠(A)；和伯克利小鼠(O)。(B)基于HbF/F细胞的百分比，分析sG^bG小鼠的队列中体内的RBC生存情况。每个符号代表具有HbF百分比的鼠群，并在相邻的表格中列出的了老鼠数量。(C)所有经分析RBC可变形性的sG^bG和模拟鼠(n＝34)，基于F细胞的比例0％、1％至33％、33％至66％、和更多66％，被分为不同的组，并且在低(3Pa,Δ)和高(28Pa,倒置空三角)剪切应力下描绘这些鼠中的总RBC的可变形性。相对模拟对照，*(P<0.05)和**(P<0.01)表示显著改善的可变形性。误差线表示SEM。

图27描述了sG^bG鼠中转导HSC的比例。显示了清髓性(A)和减低强度(B)移植模型的比例。通过使用HbF和HbS细胞内染色脾脏集落(30-36个克隆/鼠)测定sG^bG-转导的HSC的比例。各柱代表一只鼠。(A)在清髓移植模型中，各柱(代表一只鼠)下的符号与标记小鼠的符号一致。(B)在减低强度组，在第24周成功抽吸8只小鼠的骨髓，并且额外观察小鼠24周。各柱下标记了在第24周各小鼠经HPLC测得的外周血中HbF表达和骨髓的拷贝数。

图28示出成功基因治疗后，提高了小鼠存活率。

图29描述了使用sGbG载体对Hbb^th3/+鼠地中海贫血进行校正。血红蛋白(图29A)和红细胞容积(图29B)被校正至正常水平，其中有约20％的HbF表达(图29C)。网织红细胞计数(图29D)也显著降低，显示降低的红细胞周转。

图30描述了sG^bG^M载体的带注解的载体图谱。

图31描绘了sG^bG^M载体的序列，以及序列的不同区域。

图32描述了源自sG^bG^M载体的优异的HbF表达。与sG^bG载体相比，在伯克利镰状小鼠中源自sG^bG^M载体的HbF表达，显示了优异的每个载体拷贝数的HbF表达(图32A)。移植sG^bG^M转导的造血干细胞的镰状小鼠，显示出网织红细胞计数的减少是与HbF生产成比例的(图32B)。具有30％或更多产生自sG^bG^M载体的HbF的小鼠，具有几乎正常的网织红细胞计数。正常的网织红细胞值通过阴影矩形表示。

图33描述了，与sG^bG载体相比，在镰状小鼠中源自sG^bG^M载体的HbF表达。与sG^bG载体相比，伯克利镰状小鼠中源自sG^bG^M载体的HbF表达(图33A)和敲入UAB镰状小鼠(图33B)，显示出优异的每个载体拷贝的HbF表达。移植sG^bG^M转导的造血干细胞的镰状小鼠，显示优异的贫血校正(图33C-D)和减轻的网状细胞过多症(图33E-F)，并与HbF产生呈正相关。具有30％或更多产生自sG^bG^M载体的HbF的小鼠，具有几乎正常的网织红细胞计数和镰状表型的校正。

发明描述

本文引用的所有参考文献通过引用整体并入，就像在本文充分阐述一样。也通过引用整体并入本文中的包括：2010年12月6日提交的美国非临时申请，申请号12/928302，和2009年12月4日提交的美国临时申请，申请号61/267008。“人源化小鼠模型中用于对镰状细胞性贫血基因校正的一种新的人γ球蛋白基因载体：成功校正关键因素(A novel humangamma-globin gene vector for genetic correction of sickle cell anemia in ahumanized mouse model:critical determinants for successful correction)”.血液学杂志(Blood)(2009)114:1174-1185Perumbeti A,Higashimoto T,Urbinati F,FrancoR,Meiselman H等中表述的人源化小鼠模型中用于对镰状细胞性贫血基因校正的一种新的人γ球蛋白基因载体及其成功校正的关键因素也通过引用整体并入本文。

除非另有定义，本文所用的技术和科学术语具有如本发明所属的本领域中普通技术人员所通常理解的相同含义。Singleton等的《微生物学和分子生物学词典》第3版(Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 3^rd ed.)，J.Wiley&Sons(纽约，NY2001)；三月，《高等有机化学反应、机理和结构》第5版(Advanced Organic ChemistryReactions,Mechanisms and Structure 5^th ed.)，J.Wiley&Sons(纽约，NY 2001)；和Sambrook和Russel的《分子克隆：实验室手册》第3版(Molecular Cloning:A LaboratoryManual 3^rd ed)，冷泉港实验室出版社(冷泉港，NY 2001)向本领域技术人员提供了在本申请中使用的许多术语一般指导。本领域技术人员将认识到许多方法和材料类似或等同于本文描述的，可以在本发明的实践中使用。事实上，本发明不以任何方式对所描述的方法和材料作出限制。

如本文所用，术语“SIN”是自失活的缩写。

如本文所用，术语“HIV”是人类免疫缺陷病毒的缩写。

如本文所用，术语“GFP”是绿色荧光蛋白的缩写。

如本文所用，术语“cDNA”是互补DNA的缩写。

如本文所用，术语“LTR”是长末端重复件的缩写。

如本文所用，术语“USE序列”是指上游序列元件。

如本文所用，术语“polyA”是聚腺苷酸的缩写。

如本文所用，术语“cHS4”是鸡高敏位点-4元件的缩写。

如本文所用，术语“HSC”是造血干细胞的缩写。

如本文所用，术语“GOI”是感兴趣的基因的缩写。

如本文所用，术语“HbF的”是胎儿血红蛋白的缩写。

如本文所用，术语“RBC”是红细胞的缩写。如本文所用，术语“IDUA”是α-L-艾杜糖醛酸酶的缩写。

如本文所用，术语“LCR”是基因座控制区的缩写。

如本文所用，术语“对象”是指动物界的任何成员。在一些实施方案中，对象是人类患者。

如本文所用，术语“治疗(treatment)”、“治疗的(treating)”、“治疗(treat)”、“校正”等，在特定的条件下，指达到所需的药理学和/或生理学效果。对于完全或部分预防疾病或其症状方面，效果可以是预防性的；和/或对于部分或完全治愈疾病和/或归因于该疾病的不利影响的方面，可以是治疗性的。“治疗”，如本文所用，涉及对对象疾病的任何治疗，特别是人类，并且包括：(a)预防疾病在可能易患该疾病但还没有被诊断为患有它的对象中发生；(b)抑制疾病，即，阻止其发展；和(c)减轻疾病，即，使该疾病恢复和/或减轻一种或多种疾病症状。“治疗”还可以涵盖递送试剂或施用一种疗法以提供药理效应，即使不存在疾病或病症。术语“治疗”在一些实施例中指施用本发明的化合物以减轻宿主的疾病或失调，优选为哺乳动物对象，更优选为人类。因此，术语“治疗”可以包括：预防失调在宿主中发生，尤其是当该宿主易患该疾病、但是还没有诊断患有该疾病；抑制疾病；和/或减轻或缓解失调。只要本发明的方法涉及预防失调，应该理解的是，术语“预防”不要求该疾病状态是完全得以阻止(见韦氏第九大学词典)。如本文所用，术语预防不如说是指本领域技术人员识别群体易受疾病的能力，进而可以在失调发生前施加本发明的化合物。该术语并不意味着疾病状态必须完全避免。

如本文所用，术语“突变的”、“突变”、“突变体”等，是指序列中的改变，如从天然的、野生型、标准的或各个序列的参考版本(即非突变的序列)(改变的)一个核苷酸或氨基酸序列，。这些术语可以指一个或多个突变的基因，如脱氧核糖核酸、核糖核酸等，或者一个或多个突变的基因产物，如蛋白。突变的基因可以得到突变的基因产物。突变的基因产物与非突变基因的产物相比具有一个或多个不同氨基酸残基。

在一些实施方案中，导致突变的基因产物的突变基因与相应的非突变的核苷酸序列相比,可具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、或更大的序列同一性。在一些实施方案中，与相应的非突变的核苷酸序列相比，导致突变的基因产物的突变基因可具有96％、97％、98％、99％、或更大的序列同一性。在本发明的一些实施方案中，突变的基因是突变的人γ-球蛋白基因。在一些实施方案中，突变的人γ-球蛋白基因编码的蛋白包含SEQ IDNO：1。

在一些实施方案中，突变的人γ-球蛋白基因被用于基因校正镰状细胞贫血或β-地中海贫血或缓解其症状，包括步骤：鉴定需要治疗镰状细胞贫血或β-地中海贫血的对象；转染具有修饰的慢病毒的自体造血干细胞(HSC)，该修饰的慢病毒含有突变的人γ-球蛋白基因；将转染的HSC移植到所述对象。

在一些实施方案中，移植后胎儿血红蛋白超过至少为20％；F细胞构成循环的血红细胞中的至少2/3；每个F细胞的胎儿血红蛋白占镰状血红细胞血红蛋白总量的至少1/3；和将至少20％的经基因修饰的HSC重新填充所述对象的骨髓。在一些实施方案中，移植后胎儿血红蛋白超过25％、30％、35％、40％、45％、50％、或更高。在一些实施方案中，移植后胎儿血红蛋白超过55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或更高。在一些实施方案中，F细胞构成循环血红细胞的至少70％、75％、80％、85％、90％、95％，或更高。在一些实施方案中，每个F细胞胎儿血红蛋白占镰状血红细胞血红蛋白总量的至少1/3。在一些实施方案中，每个F细胞胎儿血红蛋白占镰状血红细胞血红蛋白总量的至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更高。在一些实施方案中，20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或更高的基因修饰的HSC重新填充对象的骨髓。

必需的顺式元件和载体设计的优化

如本文所用，为了确定慢病毒非编码顺式-序列是否在β-球蛋白的RNA输出、包装或表达中发挥特定作用进行了实验。在携带β-球蛋白基因和基因座控制区(BG)、或GFPcDNA的自失活(SIN)-慢病毒中研究了载体的生存周期。从仅携带包装区域的完全“消化”的最小SIN-慢病毒；和包含增强HIV顺式-元件，连同SIN-γ-逆转录病毒的SIN-慢病毒开始进行系统的分析以鉴别出优化的顺式-元件以包含到SIN-LV骨架中。为了克隆sSIN-GFP载体，改进了之前使用的标准SIN-LV骨架的3’LTR，如本文所述，以改进转录终止。具体地，将β-生长激素聚腺苷酸化信号加入3'LTR的下游，并且将来自SV40晚期聚腺苷酸化信号的USE序列加入U3缺失区域。

如本文进一步所述，编码GFP的SIN-γ-逆转录病毒或经消化/最小SIN-慢病毒产生高滴度并介导高GFP表达。然而，与携带顺式-元件的SIN-慢病毒相比，编码BG或类似规模的大型转基因的SIN-γ-逆转录病毒或消化的SIN-慢病毒具有几乎检测不到的滴度。对慢病毒颗粒的高效装配/包装而不是mRNA输出来说，系统的添加顺式-元件证明Rev/RRE是最重要的，其次为gag和env剪接受体序列。但是，这些HIV顺式-序列对于较小的转基因是非必要的。这些研究确定了关键的慢病毒顺式-元件以及它们在携带大插入子载体中的作用，并对基因治疗具有重要意义。

在一个实施方案中，本发明提供了一种方法，该方法与标准SIN慢病毒表达载体相比，增加了修饰的SIN慢病毒表达载体的滴度，。在另一个实施方案中，在一个标准SIN慢病毒载体骨架中，通过插入一个异源多聚腺苷酸(polyA)信号序列至病毒3'长末端重复序列的下游来修饰SIN慢病毒表达载体。在另一个实施方案中，polyA信号是牛生长激素polyA信号序列。在另一个实施方案中，通过将一个或多个上游polyA-增强子序列(USE顺序)插入标准SIN慢病毒载体骨架的3'LTR修饰SIN慢病毒载体。在另一个实施方案中，所述USE序列衍生自SV40晚期polyA信号。在另一个实施方案中，将2-3个拷贝的USE序列插入到标准SIN慢病毒载体骨架的3'LTR。在另一个实施方案中，将2-10个拷贝的USE序列插入到标准的SIN慢病毒载体骨架的3'LTR。在另一个实施方案中，将3-5个拷贝的USE序列插入到标准SIN慢病毒载体骨架的3'LTR。在另一个实施方案中，将一个或多个拷贝的USE序列插入到U3区域。在另一个实施方案中，将β-生长激素polyA信号和源自SV40晚期polyA信号的一个或多个USE序列拷贝一起整合入表达载体中。在另一个实施方案中，表达载体包含感兴趣的基因(GOI)。在另一个实施方案中，所述基因可操作地连接于一个启动子。在另一个实施方案中，所述启动子是谱系特异性启动子。在另一个实施方案中，启动子是红细胞特异性启动子。在另一个实施方案中，所述GOI是β-球蛋白。在另一个实施方案中，所述GOI是γ-球蛋白。在本发明的另一实施方案中，所述γ-球蛋白基因受β-球蛋白调控元件的控制。在另一个实施方案中，所述载体是用于通过基因疗法来治疗镰状细胞性贫血的。在另一个实施方案中，所述载体结合使用降低强度的预处理来治疗镰状细胞性贫血。在另一个实施方案中，SIN慢病毒包括牛、马、猫、绵羊/山羊或灵长类动物衍生的各种慢病毒。在另一个实施方案中，SIN慢病毒是HIV衍生的SIN慢病毒。在另一个实施方案中，修饰的SIN的慢病毒载体经转染被引入到真核细胞。

在一个实施方案中，本发明提供了一种设计经消化的/最小的、并因此而基因重组较少且安全的SIN慢病毒载体的方法，用于小的治疗性转基因并且不需要大量的顺式元件来增加效率。在另一个实施方案中，小的治疗性转基因的大小等于或小于绿色荧光蛋白(GFP)。在另一个实施方案中，小的治疗性转基因比人β-球蛋白小。

染色质绝缘子元件

如本文所述，染色质的绝缘元件防止异染色质的扩散和基因的沉默，减少染色质位置效应并具有增强的阻断活性。这些属性对于持续可预测的表达以及随机整合载体转基因的安全递送是必要的。克服染色质位置效应可减少对治疗效果所需的拷贝数，并降低载体基因毒性的风险。在X-SCID临床中，自从出现基因治疗相关的白血病患者，载体基因毒性已成为研究热点区域。将γ-逆转录病毒载体和慢病毒载体修饰成自失活(SIN)设计从而删除无处不在的长末端重复件(LTR)U3区域活性增强子。将来自鸡p-球蛋白基因座的一个1.2kb的DNA酶超敏位点-4(cHS4)被插入到3'LTR以使其复制到γ-逆转录病毒和慢病毒载体的5'LTR中。绝缘载体已减少了染色质位置效应，并提供了持续性，并因此提高了整体表达。并行比较了携带hβ-球蛋白和基因座控制区的cHS4绝缘的和未绝缘的慢病毒载体，并因此发现了绝缘载体显示了持续的、可预测的而表达无论干细胞分化后代的整合位点如何，结果均产生了2-4倍的、更高的整体表达。最近的证据也表明，cHS4绝缘慢病毒载体可降低细胞致癌基因插入性激活的风险。尽管绝缘载体具有有益效果，但当全长1.2kb的cHS4绝缘子元件插入慢病毒载体的3'LTR，它们还是使得滴度显著减少。对在3’LTR含有绝缘子的γ-逆转录病毒载体，也有滴度降低或不稳定转导的类似报告。这种滴度减少实际上限制了用于临床的大规模的载体生产，特别是运载相对较大表达盒的载体，如人β-球蛋白基因(hβ)和基因座控制区(LCR)，具有适度的滴度甚至无绝缘元件。

外源片段插入到LTR对病毒生活周期的影响还没有被解决。因此对向病毒3'LTR插入cHS4或其它插入物降低慢病毒载体的滴度的机理进行了研究。大的LTR插入经由逆转录中的进入后限制而降低了滴度，并增加了病毒cDNALTR的同源重组，从而降低了用于整合的病毒的DNA量。这些结果对用于临床基因治疗的载体设计具有重要意义。对鸡超敏位点-4(cHS4)元件(一原型绝缘子)的研究鉴定了CTCF和在cHS4250bp近端(称为“核心”)的USF-1/2基序，其提供了增强的阻断活性并降低位置效应。然而，单独的该核心并不能够有效地隔离病毒载体。而全长的cHS4具有优异的绝缘特性，其较大的规格显著地影响了载体滴度。对cHS4侧翼慢病毒载体的结构-功能进行了分析，并分析了造血干细胞的无性繁殖后代中的转基因表达和cHS4表型变化以及转基因启动子。

如本文所进一步描述的，该核心仅减少表达中的克隆斑。独特绝缘子活性存在于cHS4序列远端的400bp，其与核心相结合时，完全恢复了绝缘子活性和遍布于转基因启动子和绝缘子的开放染色质标记。这些数据巩固了经典5’核心和具有与核心相似特性的新3'400bp元件的已知绝缘活性，。它们在一起具有优良的绝缘性和病毒滴度。这些数据对于理解绝缘子功能和基因治疗载体的设计的分子基础具有重要意义。

在一个实施方案中，本发明提供了一种通过整合含有全长染色质绝缘子功能性部分的一个或多个缩短长度的染色质绝缘子从而增加慢病毒载体的滴度的方法。在另一个实施方案中，功能性部分衍生自单一类型的全长染色质绝缘子。在另一个实施方案中，缩短长度的功能性绝缘子包含两个或更多个单独不同的染色质绝缘子的功能性部分。在另一个实施方案中，功能性缩短长度的染色质绝缘子衍生自鸡超敏位点-4(cHS4)元件。在另一个实施方案中，功能性缩短长度的绝缘子是650个碱基对或更小的cHS4-衍生绝缘子。在另一个实施方案中，SIN慢病毒表达载体中一个或多个缩短长度的cHS4-衍生绝缘子与其他修饰联合，以增加滴度并提高转基因表达的稳定性。在另一个实施方案中，将一个或多个缩短长度的cHS4-衍生绝缘子添加到含有位于病毒3'LTR下游的异源多聚腺苷酸化(polyA)信号序列和U3缺失区域中USE序列的载体中。

镰状细胞疾病

镰状细胞疾病(SCD)影响β-球蛋白基因，并且是最常见的遗传缺陷之一，造成有缺陷的镰状球蛋白的产生(HBS，包括两个正常α球蛋白和两个β^镰状球蛋白分子，记为α₂β^S ₂)。脱氧后HbS聚合并改变盘状红细胞(RBC)的形状为奇异镰/钩形。镰状RBC堵塞微血管，引起急性器官缺血疼痛性事件和慢性器官损伤，SCD患者的寿命降至45岁。这种疾病影响了超过110,000的美国人，每年有1000例SCD新生儿出生，而在非洲每年有1000个患有该病的婴儿出生。

SCD的治疗选择非常有限，涉及骨髓造血干细胞移植(HCT)。HCT只能提供给10-15％配型正常的同胞供体患者，并经常发生严重的免疫副作用。胎儿血红蛋白(HbF的，包括α和γ球蛋白，α₂γ₂)在胎儿期和最初6-9个月的年龄时产生，并具有较强的抗镰状性能并保护婴儿在第一年避免镰状疾病。事实上，具有SCD的遗传持续性的HbF个体是没有症状的。羟基脲，是FDA批准的用于改善SCD症状的增加HbF的化疗药物。然而，羟基脲并不非对于所有患者都有效，由于每日终生摄入，导致依从性差。因此，对于SCD需要更好的治疗选择。

用具有编码γ-球蛋白基因的慢病毒载体对自体骨髓干细胞(造血干细胞)进行基因校正将能够永久地导致抗镰性HbF的产生，从而预防镰状RBC。这种方法比目前可用的治疗具有很多优点，其中包括它适用于所有患者，特别是那些不具有配型同胞供体的患者，而事实上，这将是一个一次性治疗，形成终身的校正且没有任何免疫副作用。一个有效的基因治疗方法将彻底改变SCD的治疗方式，改善患有这一致命性疾病的患者的转归。

确定镰状细胞性贫血疾病校正的关键参数

如本文所公开，HSC中在β-球蛋白调节控制元件下的人γ-球蛋白的慢病毒递送导致产后HbF的足够表达从而校正小鼠中的SCA。然后使用减低强度预处理和不同感染复数(MOI)，降低HbF和转导的HSC的量的规模，以评估校正所需的关键参数。功能性和血液RBC指数、器官病理和寿命的系统性定量对于确定扭转镰状表型所需HbF、F细胞、HbF/F细胞和基因修饰的HSC的最小量是至关重要的。

如本文所进一步公开的，当HbF超过10％，F细胞构成循环红细胞的三分之二、HbF/F细胞是RBC中血红蛋白总量的三分之一并且当约20％sG^bG修饰的HSC重新填充骨髓时，疾病就能出现改善。校正长期随访看来，基因校正可在首次或二次移植受体中维持首次二次。本研究描述在体内模型中确定用于校正造血疾病的最小HSC嵌合的方法，这将有助于设计细胞剂量和预处理方案，以实现在人体临床试验等效的HSC基因校正。此外，该研究涉及校正遗传缺陷所需的基因剂量和基因修饰的造血干细胞剂量。

在一个实施方案中，本发明提供了在体内模型中确定用于校正造血疾病的最小HSC嵌合的方法。在另一个实施方案中，移植前采用减低强度预处理作为改变HSC嵌合的方法。在另一个实施方案中，通过在一MOI(30-100)范围内转导细胞来改变转导HSC和载体拷贝/细胞的比例。在另一个实施方案中，MOI是20-120。在另一个实施方案中，测定的最小嵌合体和基因剂量可用于设计细胞剂量和预处理方案来实现在人体临床试验中等效的HSC基因校正。在另一个实施方案中，在临床环境中移植前进行的减低强度预处理用于减少移植相关(疾病)的发病率。在另一个实施方案中，所述造血疾病是镰状细胞性贫血。在另一个实施方案中，所述造血疾病是β-地中海贫血。

通过突变γ球蛋白基因治疗镰状细胞病

如本文所述，已经从慢病毒载体sG^bG^M工程化了改良的突变体γ-球蛋白基因。该载体具有更高的HbF形成倾向以及改进的抗镰状特性，导致在严格纯合SCD小鼠模型中对SCD的优异校正。工程化的γ-球蛋白基因具有增强的结合α-球蛋白的亲和力并且不改变其功能，从而大大提高了RBC中HbF形成的效率，并导致一种更为有效的抗镰状效应来校正SCD表型。

如本文进一步所述，工程化的sG^bG^M载体形成HbF的倾向比源自sG^bG载体的天然γ-球蛋白基因高两倍，并且容易高效地校正UAB镰刀状小鼠。这两个载体均能够校正SCD伯克利镰刀状小鼠。因此，与sGbG载体相比，在镰状小鼠中sG^bG^M载体提供两倍数量的HbF每载体拷贝。除了提供增加的HbF量，相比于天然HbF，由于减少了镰状，产自sG^bG^M载体的突变HbF还赋予了镰状红细胞更长的寿命。因此，该载体可以在人类患者中有效地校正SCD。

本领域技术人员将会意识到许多类似或等同于本文描述的方法和材料，可以在本发明的实践中使用。实际上，本发明不以任何方式限于所描述的方法和材料。对于本发明的目的，下列术语定义如下。

实施例

以下实施例提供用于更好地说明要求保护的发明，但不应当被解释为限制本发明的范围。该范围内提及的特定材料，仅仅是为了说明的目的，并非意在限制本发明。无需创造性活动并且在不脱离本发明范围的前提下，本领域技术人员可以开发等同的装置或反应物。

实施例1

用于高效包装像如β-球蛋白的大型转基因表达盒的慢病毒顺式元件

该研究调查了慢病毒非编码顺式-序列是否在β-球蛋白的RNA输出、包装或表达中发挥特定作用。在携带β-球蛋白基因和基因座控制区(BG)、或GFP cDNA的自失活(SIN)-慢病毒中对载体的生存周期进行了研究。从仅携带包装区域的完全消化最小SIN-慢病毒；和包含增强HIV顺式-元件，连同SIN-γ-逆转录病毒的SIN-慢病毒开始系统分析。发现：(i)编码GFP的SIN-γ逆转录病毒或经消化的/最小SIN-慢病毒产生了高的滴度并介导高GFP表达。(ii)然而，与携带顺式-元件的SIN-慢病毒相比，编码BG或类似规模的大型转基因的SIN-γ-逆转录病毒或消化的SIN-慢病毒具有几乎检测不到的滴度。(ⅲ)对慢病毒颗粒的高效装配/包装而不是mRNA的输出来说，系统的添加顺式-元件证明Rev/RRE是最重要的，其次为gag和env剪接受体序列。但是，这些HIV顺式-序列对于较小的转基因是非必要的。这些研究确定了关键的慢病毒顺式-元件以及它们在携带大插入子载体中的作用，并对基因治疗具有重要意义。

实施例2

经消化SIN-γRV的BG表达

已有的假设认为，由于强γRV LTR启动子/增强子元件和内部LCR增强子之间的转录干扰，γRV无法成功表达hβ-球蛋白。SRS11.SF是一个SIN-γRV，它在内部脾脏病灶形成病毒(SFFV)启动子/增强子控制下编码GFP cDNA。SRS11.SF中的SFFV-GFP替换成了BG(已成功应用在标准SIN-LV中的表达盒，用于实现治疗性地中海贫血中人β-球蛋白的表达)以产生SRS11.BG。不论β-球蛋白γRV的污名，使用SRS.11的基本原理是：(i)它含有最小的包装区域(ψ)，缺少gag序列并且可携带更大的载体载荷，还保留非常高的滴度；(ii)它携带400bp的3'LTR的U3大型缺失，堪比SIN-LV中的缺失。(iii)由于载体有效载荷限制，大型LCR元件从未在γRV进行测试。

在小鼠红白血病(MEL)细胞系上比较了SRS11.BG和SRS11.SFγRV载体的感染滴度和表达。相比于SRS.11SF转导的细胞中GFP的高表达，SRS11.BG转导的MEL细胞几乎检测不到人p-球蛋白的表达。SRS11BG相对于SRS11.SF载体的未浓缩的病毒滴度为6.8±5x10³IU/mL比4±0.2x10⁶IU/mL。通过Northern印迹分析，具有SRS11.BG的293T细胞中几乎检测不到病毒RNA(vRNA)转录物(数据未显示)。因此，即使对SIN设计和高载荷载体进行了优化，自γRV生产的BG vRNA和病毒颗粒的产生也严重受损。

实施例3

来自标准或仅消化的/最小LV的大/小转基因的表达

作为本文使用的SIN-γRV的对照，常用的“标准”SIN-LV保留了病毒序列相对较大的部分，达到HIV基因组的约20％-25％。这些顺式元件是：LTR(对于wt HIV LTR是634bp或对于SIN-LV LTR是235bp)、包装信号ψ(150bp)、gag基因5'部分(300或600bp)、包括rev响应元件的env序列(RRE，840bp)和来自pol基因的中心flap/多聚嘌呤区(cPPT)(120bp)。

为了检测GFP与BG相比对顺式-序列的要求，将CMV-GFP表达盒克隆至a)含有以上列出的顺式序列的“标准”SIN-LV(sSIN-GFP)，和b)删除gag、RRE和其余的env序列并且仅保留ψ区域的‘经消化的’最小SIN-LV(dsSIN-GFP；图1A)。最小dsSIN-GFP LV的滴度仅比“标准”LV sSIN-GFP低两倍图1B；p<0.01；n＝3。与GFP载体形成强烈对比，类似标准和消化的BGSIN-LV、sBG-6和sBG-1载体在滴度上的差别为1100倍p<0.01；n＝4；(图1B)。显然，LV非编码序列对LV颗粒的产生和/或用于β-球蛋白的表达均是必要的；并且这些序列对编码β-球蛋白基因的LV感染性滴度有着显著的效果，而非那些编码GFP的。然后，构建了具有相似大小转基因表达盒的载体，CMV-FANCA-IRES-GFP(FIG)作为sBG(图.1A)在“标准”(s图)或经消化的(dsFIG)SIN LV中。在LV顺式序列上FIG的相同依赖性：dsFIG载体的滴度要比观察到的那些sFIG的低了三个数量级(图1B)。因此LV的顺式元件对小插入物是可有可无的，但对于大型插入物的高滴度是必需的。

实施例4

为研究顺式-序列的作用设计的LV构建物

为了研究哪些特定的LV顺式序列对这种效果是重要的，以及它们影响载体生命周期的哪些步骤，克隆了一系列十个SIN-LV载体；它们全部携带BG表达盒但携带不同的慢病毒非编码顺式元件(图2)。在BG背景中研究特定env(RRE和SA)和gag序列的基本原理是：(i)“标准”LV中env片段中的RRE元件促进未剪接/单独剪接转录物从细胞核的运输后与Rev蛋白的结合。(ii)env剪接位点在vRNA的稳定性和它在包装中的可用性方面起到了根本性的作用，已知的下游剪接受体(SA)序列的缺失导致了顺式-作用抑制序列(CRS)的活性，这阻碍了HIV-1RNA的细胞质积累。(iii)gag基因的一部分被保留在载体中以帮助vRNA的包装。Gag序列促进包装信号的RNA二次结构的折叠，促进颗粒形成中vRNA和Gag蛋白的相互作用，并且对vRNA的二聚化具有重要作用。匹配到5'剪接供体位点和gag基因前360bp的序列将未剪接和单剪接病毒mRNA引导至特定亚核隔室，并从该处经Rev/RRE的帮助导出。

第一载体(sBG-1)仅保持包装信号(包含5'剪接供体位点)和cPPT/flap(图2)。从这个载体开始，RRE、含有SA的env片段的其余部分、和两个不同大小的gag片段(360bp和630bp)依次克隆入SBG-2、SBG-3、SBG-5和SBG-6。通过PCR定点突变(SBG-4)evn片段序列从而验证剪接受体(SA)序列的活性。在后面的四个载体中，首先去掉包括RRE的整个env片段，只留下长和短版本的gag片段(SBG-9，SBG-10)；或在长和短gag片段的下游额外添加RRE(SBG-7，SBG-8)。

实施例5

包含不同HIV顺式序列的病毒滴度

不含RRE元件的载体(sBG-1、sBG-9和sBG-10)具有5.5±2.1x10⁵IU/mL至1.7±1.4x10⁶IU/mL范围内的浓缩滴度，比携带RRE序列的载体低2-3个数量级(sBG-2至sBG-8；p<0.01)。实际上，当仅将RRE序列添加到sBG-1上产生sBG-2时，滴度增加了100倍以上(5.5±2.1x10⁵IU/mL比8.7±6.5x10⁷IU/mL；p<0.01；图3)。

含有SA位点的env片段的添加增加了3-5倍的载体滴度：

sBG-3为2.9±0.9x10⁸IU/mL，sBG-2为8.7±0.7x10⁷IU/mL(p<0.01)。该效果仅针对SA，由于含有具有突变SA的env序列的sBG-4载体的滴度是1.1±0.61x10⁸IU/mL，与仅携带RRE的sBG-2的相似(sBG4vs.sBG-3p<0.01)。向env(RRE和SA)添加gag的长和短片段，分别包括载体sBG-5和sBG-6，显示又增加了～4-5倍的滴度，sBG-6的滴度达到了6.3x10⁸IU/mL(sBG-4比sBG-5和sBG-6p<0.01)。数据表明gag较长的部分对BG的高表达并不是必需的。然而，仅携带短/长gag片段而不含RRE和env SA的载体的滴度较低(sBG-9和sBG-10)，相比于那些含有RRE的也一样(sBG-7和sBG-8；p<0.01)。sBG-7、8、9、和10的滴度在9.4±4.7x10⁵IU/mL至1.4±0.4x10⁸IU/mL范围内。包含了env SA就进一步增加了3-5倍的滴度。因而，仅gag片段或gag/RRE联合并不足以使BG载体产生优化的滴度，表明HIV-1顺式序列是协同作用的。

为了研究RRE对病毒滴度的强烈效应是否是Rev-依赖性的，包装了具有或不具有Rev的sBG-6载体。在这些实验中，包装系统从3-质粒变成了4-质粒系统，其中从不同质粒提供了Rev和Gag-Pol。具有Rev的sBG-6的滴度(3.8±0.3x10⁷IU/mL)比不具有Rev蛋白的(9.4x±5.8x10⁴IU/ml；p<0.01)高出了约400倍，显示Rev和RRE的相互作用对高滴度是必需的。

总之，这些数据表明，HIV-1Rev/RRE、gag和env SA对携带大的负载(如BG或图)的LV高滴度是关键的，虽然他们对小的基于GFP表达盒是不重要的。

实施例6

LV顺式-元件在载体生命周期中的作用

为了评估LV顺式-元件在原病毒稳定性和表达中的作用，进行了在转导的MEL细胞上的基因组Southern印迹分析。

出人意料的是，考虑到含有γRV的hβ-球蛋白的基因重排困难，在大部分的LV中仅检测到一个预期大小的原病毒带图4A。一些低滴度的载体在Southern印迹灵敏度水平下检测不到。在包装细胞的后续Northern印迹分析证实了预期的全长vRNA转录本产生于所有LV(图5A)，确认了携带大的BG表达盒的LV不需要顺式-序列来稳定传输。

为了确定LV顺式-序列是否影响整合的BG原病毒的表达水平，使用在感染复数范围内的SBG-1至SBG-10载体转导MEL细胞。除了低滴度载体(其只能达到较小百分比的基因导入)，在具有相似hβ-球蛋白表达细胞百分比的MEL细胞池中比较平均荧光强度(MFI)，。所转导的MEL细胞群的MFI比得上所有的载体(从62至110任意单位范围)，其中包括低滴度载体(图4B)。因此，LV顺式-元件在调节BG表达上没有发挥重要作用。

为了确定RRE、gag和env SA在vRNA生产和细胞质输出中的作用，对能够损害包装细胞中全长vRNA的产生的载体生命周期、其随后的细胞质输出、装配和包装成载体颗粒的步骤进行了研究。

总之，经sBG-1至sBG-10转染的293T包装细胞分离了细胞质和细胞核RNA。图5A显示使用hβ-球蛋白探针探测总RNA的northern印迹分析。测定了来自所有载体(包括没有RRE的载体(sBG-1、sBG-9和SBG-10))的整体vRNA的正确大小的条带。剪接和未剪接的vRNA转录本仅存在于SBG-3、SBG-5和SBG-6载体，因为这些载体携带env SA位点。因此，在任何LV骨架上均没有发生明显的异常剪接，证实hβ-球蛋白基因和LCR元件重组缺失，而γRV报告的结果则相反。

值得注意的是，所有具有非常低滴度的不含RRE的载体(包括sBG-1、sBG-9和sBG-10)，产生的vRNA的数量与最高滴度的载体(sBG-5和sBG-6)相当或更高。由于这一发现是出人意料的，在一个单独的实验中重复了Northern印迹，使用分离的总RNA和细胞质RNA，产生了一致的结果。

Rev/RRE已被最佳表征用于输出全长vRNA到细胞质。因此，下一个步骤是确定RRE是否通过vRNA的输出促成高滴度。Northern印迹分析表明有或没有RRE的类似载体在细胞质中具有相似数量的vRNA(SBG-1对SBG-2，sBG10对SBG-8和SBG-9对SBG-7；图5B)。来自两个独立实验的Northern印迹分析中细胞质RNA占总RNA的比例如6E所示。相比于sBG-1，sBG-2中细胞质vRNA转录本仅高出了2倍。sBG-10和sBG-9载体中能够看到相反的结果，其中细胞质vRNA转录本比含有RRE的类似载体sBG-8和sBG-7高出了～2倍。既然有或没有RRE的载体之间的滴度差异为2-3个数量级，那么通过这些载体提高vRNA转录本的核输出中，RRE或许仅起到了较小的作用。

实施例7

LV顺式-元件，包括RRE改善包装

接下来，通过分析vRNA、p24的水平以及从进行了相同处理的所有十个载体中纯化的病毒颗粒中的逆转录酶(RT)相关的病毒，测定了顺式序列对包装效率的影响。图6A显示了sBG1至sBG10LV的典型点印迹分析。对于大多数载体，检测出的vRNA的量与载体滴度成正比，如磷成像分析测定的那样，表明了缺乏顺式-序列的载体中包装的效率受阻(图6B-C)。

有一些例外提示顺式-序列可能影响靶细胞进入后的步骤：尽管sBG-4vRNA高出了4倍，293T细胞中的RNA和sBG-2和sBG-4的感染性滴度具有可比性。sBG-4vRNA即使包装的更有效率，进入靶细胞后可能并不稳定，这是由于没有env SA(已知的的能够稳定RNA)。sBG-6和sBG-7具有相同数量的vRNA但是sBG-7的滴度低了4-5倍；sBG-7同样没有env SA。含有gag抑制区域具的sBG-5有较高的vRNA但是较低的滴度。

总之，包装入病毒颗粒的BG vRNA的数量与靶细胞中的转导/感染滴度相关，而与所有10个载体的包装细胞产生的高mRNA水平无关。在所有浓缩病毒制剂中p24活性是相似的(图6D)，说明所有载体的病毒样颗粒(不含vRNA)均得以高效的形成。

实施例8

γRV和LV大小、载荷和滴度

开始时携带BG的标准LV滴度较低，需要大量的浓缩。然而，移除LV顺式-元件后，滴度剧烈下降(三个数量级)。可能这些LV序列保护大的vRNA免受包装细胞中的降解而促进装配，而短GFP vRNA能够有效包装无此要求。‘经消化的’BG LV的低滴度并不来源于反义RNA的出现，该出现是由于293T细胞中相对于5’LTR vRNA转录本以相反方向插入了β-球蛋白基因启动子。任何载体的northern印迹中均没有反义转录本。此外，β-球蛋白转录本是红细胞特异的，在293T细胞中不产生。而且，与BG大小相似的FIG表达盒，但是在有义方向，具有与BG同样的对滴度的影响。

实施例9

顺式元件和载体生命周期

本研究中出现的几个独特的、更确切的说是意料之外的结果：(i)在包装细胞中，相对于BGγRV几乎检测不到的RNA，所有BG LV均大量产生转录本。一种可能是LV最小序列(R、U5和Ψ区域)赋予了BG vRNA在特定亚细胞隔室中的稳定性。因而，在293T细胞(甚至在经消化的LV中)中能够看到大量的vRNA，这与BGγRV有实质区别。(ii)即使在Rev/RRE缺失的情况下，BG vRNA为预期的大小并能够被高效地输出到细胞质中，矛盾于现有的观念：LV中的‘球蛋白基因’的成功对阻止剪接和vRNA输出的RRE的原始功能是次要的。(iv)当消化的LV编码小转基因(如GFP)时，vRNA被高效地包装至病毒粒子中。这些数据确认了LV顺式-序列而不是小的包装序列对小的转基因来说是非必要的。

实施例10

RRE在包装中的作用

Rev/RRE相互作用对包装和高滴度病毒生产来说是必须的，而在BG LV中得到确认的Rev/RRE在基因组vRNA输出上的功能和剪接信号的抑制并不显著。野生型HIV病毒中，随着完整的mRNA输出和为稳定的路径使用、正确的亚细胞定位、和含有RRE的mRNA高效翻译，均需要Rev/RRE的存在。此处的数据证明和扩展了最近的研究，显示RRE对细胞质vRNA的水平具有微小的作用但是降低了约100倍的病毒滴度。这进一步表明，对Rev/RRE的要求仅针对大的转基因，对小的表达盒是不重要的。与以前的文献报道不同，本研究中没有发现RRE在vRNA稳定中的作用，这是由于在无RRE的载体中观察到了相等或更高数量的vRNA。可能的机制是RRE的功能包含在了病毒装配和包装上。

实施例11

env SA和gag的作用

env SA的存在显示了对病毒基因组的稳定，导致病毒更高的产量。SA的存在也在进入后的水平上稳定vRNA，由于一些没有env SA的载体，当相比于有env SA的类似载体时，在靶细胞中具有相同的v-RNA但是较低的转导/滴度。具有阻止gag蛋白翻译的初始密码子突变的gag序列帮助了病毒包装中LV的产生。本研究中，确定了该条件仅针对大的转基因表达盒。同样证明了去除存在于414bp和631bp之间的gag基因抑制序列，如之前的描述，能够降低含有gag的RNA的稳定性，增加3.5倍的滴度。

总而言之，本研究描述了当LV编码大的转基因表达盒时非编码顺式-序列影响病毒生命周期中的步骤；并且对小的转基因(如GFP)来说是无关紧要的。这些结果提供了设计LV载体的新视角。可以设计经消化的/最小LV用于小的转基因治疗，在基因疗法应用中具有较少的基因重组并且更为安全。

实施例12

病毒载体设计

LV：为了克隆sSIN-GFP载体，修饰了之前使用的标准SIN-LV骨架3’LTR以改善转录终止：将β-生长激素聚腺苷酸信号添加到了3’LTR的下游并且将衍生自SV40晚期聚腺苷酸化信号的USE序列添加到了U3缺失区。通过从sSIN-GFP质粒移除ClaI-NruI片段获得dsSIN-GFP。在sSIN的ClaI和EcoRI位点克隆入了多克隆位点(MCS-ClaI-Eco47III、XhoI、SmaI、SalI、EcoRI:CCATCGATAGCGCTCTCGAGCCCGGGGTCGACGAATTCC)。将β-球蛋白-LCR(BG)表达盒以反方向克隆至XhoI和SmaI位点，该母构建物名称为sSIN-BG。从sSIN-BG通过移除Eco47III和NruI之间的区域，仅保留HIV-1包装序列(ψ)跟随5’LTR获得sBG-0。将cPPT克隆到sBG-0ClaI位点(sBG-1)。分别将RRE、RRE-env、短gag(360bp)、长gag(630bp)的PCR片段克隆入XhoI钝化位点，获得的载体分别命名为sBG-2、sBG-3、sBG-10、sBG-9。引物序列，其中F表示正向引物，R表示反向引物：

RRE_F:ATAAACCCGGGAGCAGTGGGAATA；

RRE_R:ACATGATATCGCAAATGAGTTTTCC；

ENV_R:ACATGATATCATACCGTCGAGATCC；

GAG_F:ACTGCTCTCGAGCAATGGGAAAAAATTCGGT；

GAG_1R:ACTGCTCTCGAGGCAGCTTCCTCATTGATG；

GAG_2R:ACTGCTCTCGAGATCAGCGGCCGCTTGCTGT。

使用Gag F引物在gag ATG插入二核苷酸CA在gag 5’序列的起始密码子插入移码突变从而失活gag起始位点。将长gag和短gag PCR片段克隆至sBG-2的XhoI位点获得sBG-7和sBG-8载体。使用MutSA_F(TATCGTTTCGAACCCACCTCC)和MutSA_R(GGAGGTGGGTTCGAAACGATA)引物进行点突变以破坏env序列中的SA位点从而产生sBG-4(将野生型SA序列Env内部的CAG突变为CGA)。将长gag PCR片段克隆至sBG-3的XhoI位点获得sBG-5。γRV:SRS11.SFγRV质粒由Axel Schambach和Christopher Baum博士提供,(汉诺威，德国)。SRS11.BG载体中，将人β-球蛋白-LCR(BG)以反方向克隆至SRS11.SF逆转病毒载体质粒的PstI位点。所有载体图谱描述于图2中。

实施例13

病毒制备

如前所述，采用载体质粒、包装(Δ8.9)和包膜(VSV-G)质粒，通过293T细胞的瞬间共转染制备LV；在转染后60小时收集含有病毒的上清并进行超速离心浓缩。在实验中同时包装所有载体并且在25,000rpm下超速离心所有病毒上清从而将病毒浓缩1400倍。使用系列稀释的浓缩病毒，通过感染鼠红白细胞(MEL)或HT1080细胞测定病毒滴度，通过之前描述的流式细胞分选(FACS)辨别和分析HbA或GFP表达。类似地制备γRV但不进行浓缩。所有的转染和随后的滴定均一式三份。使用如下相似的方法包装有或没有Rev的载体，除了包装质粒由Δ8.9替换为了pMDLg/pRRE和pRSV-Rev。载体质粒比例：pMDLg/pRRE:pRSV-Rev:VSV-G为4:4:3:1。

实施例14

细胞系

鼠红白血病细胞(MEL)系和293T细胞维持在改良伊格尔培养基(DMEM，Mediatech公司，赫恩登，VA)中，补充有10％热灭活的胎牛血清(FBS)(美国生物技术股份有限公司，帕克福特，PA)。在含20％FBS和5mM的N，N'-六亚甲基二乙酰胺(Sigma)的DMEM中诱导分化MEL细胞，如先前在本领域中所描述的那样。

实施例15

HbA染色和FACS分析

使用抗人HbA抗体标记人β-球蛋白的方法如之前的描述。简而言之，室温下在4％多聚甲醛中固定细胞60分钟，使用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤一次，在100％甲醇中重悬沉淀5分钟。使用PBS洗涤经固定的细胞，室温下使用5％脱脂奶粉封闭非特异性抗体(Ab)结合10分钟。然后，在PBS中洗涤细胞、沉淀并透化处理。将细胞分为2管，使用抗ζ-球蛋白异硫氰酸荧光素(FITC)Ab(1μg/10⁶细胞)染色作为阴性对照或使用抗–HbA-FITC Ab(0.1μg/10⁶细胞)(珀金埃尔默,沃尔瑟姆,MA)黑暗中染色30分钟。在上FACS Calibur(碧迪公司,富兰克林湖,NJ)分析前，使用PBS作最终洗涤去除未结合的Ab.

实施例16

总的和细胞质RNA northern印迹

转染后72小时收获293T细胞并在PBS中洗涤。分离的核和细胞质中的RNA和NEB缓冲液(10Mm Tris-HCl pH 7.4；10mM NaCl,3mM MgCl2；5％IGEPAL)在冰上孵育7分钟。离心后向含有细胞质RNA的上清中加入RNA-STAT(Tel-Test公司,德克萨斯州)，然后根据说明书的指导进行RNA抽提。使用RNA-STAT抽提293T细胞中的总RNA。根据标准程序进行Northern印迹。使用³²P标记的β-球蛋白探针杂交印迹。为了标准化RNA载量，剥离膜并使用³²P标记的18S探针重新探测。为了检测细胞质RNA的纯度，剥离膜并使用³²P标记的特异性针对GAPDH内含子的探针重新探测，没有检测出细胞质制备中内在的转录。

实施例17

基因组Southern印迹

从转导的MEL细胞分离的DNA制备基因组DNA，使用AflII消化10μg基因组DNA，根据标准程序进行Southern印迹。使用β-球蛋白LCR探针的HS2片段杂交斑点。使用QIAamp vRNA迷你试剂盒(凯杰，Qiagen)根据说明书从相同体积浓缩的病毒中提取RNA斑点印迹vRNA。简而言之，在高度变性条件下溶解病毒，然后结合到基于硅胶的膜。两个洗涤步骤高效地洗去污染物，用30μl DEPC水洗脱vRNA。洗脱后室温下使用DNAse I处理vRNA20分钟，在65°下孵育样品失活扩增级DNase I(Invitrogen,卡尔斯巴德,CA)。在65°下使用3体积的变性缓冲液(65％甲酰胺,8％甲醛,MOPS 1X)变性vRNA15分钟。变性后，加入2体积的冰冷20X SSC，使用斑点印迹装置通过吸引将RNA结合到尼龙膜上。使用³²P标记的β-球蛋白特异性探针杂交斑点，X-射线胶卷曝光过夜。

实施例18

通用的染色质绝缘子

染色质的绝缘子分开活性转录结构域并阻止基因组中异染色质的传播。对鸡超敏位点-4(cHS4)元件(一原型绝缘子)的研究已经在cHS4近端约250bp处鉴定出了CTCF和USF-1/2基序，称为“核心”，其提供增强的阻断活性并降低位置效应。然而，仅核心并不能高效地使病毒载体绝缘。全长的cHS4具有优异的绝缘性能，但它较大的规模严重影响了载体滴度。进行了cHS4侧翼慢病毒载体的结构-功能分析，并分析了造血干细胞的克隆后代中转基因的表达、cHS4中的表型变化和转基因启动子。核心仅减少了表达中的克隆斑。独特绝缘子活性存在于cHS4序列远端的400bp，其与核心相结合时，恢复了完全绝缘子以及遍布转基因启动子和绝缘子的开放性染色质标记的活性。这些数据巩固了常规的5’核心和具有与核心相似特性的新3'400bp元件的已知绝缘活性。它们在一起具有优良的绝缘性和病毒滴度。这些数据对于理解绝缘子功能和基因治疗载体的设计的分子基础具有重要意义。

实施例19

载体构建和实验设计

设计了自失活慢病毒载体，包含5′250bp“核心”(sBGC)、两个核心的串联重复序列、5′400bp(sBG400)、5′800bp(sBG800)或全长1.2kb cHS4绝缘子(sBG-I)。所有载体携带人(h)β-球蛋白基因和启动子以及基因座控制区增强子。将不同的绝缘子片段以正向克隆入3′LTR的U3区域，以便经过逆转录，靶细胞中完整的前病毒具有拷贝到5′LTR的绝缘的3′LTR和分布hβ-球蛋白表达盒两端侧翼。为了评估5′250bp之外的元件是否仅仅提供空间支架，测试了在核心下游插入惰性DNA间隔子的载体，sBG400S和sBG800S。所有载体均与未绝缘的对照sBG相比(图7A)。

首先，使用各慢病毒载体感染MEL细胞，并鉴定了单一构成的MEL克隆(图7B)。所有的分析仅在携带hβ-球蛋白的单拷贝MEL克隆上进行，通过PCR证实具有完整的绝缘子序列，并通过qPCR确定载体拷贝数；通过FACS分析hβ-球蛋白的表达：1)使用hβ-球蛋白表达细胞的百分比(％hβ+细胞)测定染色质位置效应，和2)一个克隆内细胞中hβ-球蛋白表达的变异，通过变异系数(CV)测定，用来测定表达中的克隆斑(图7C)。对遍布不同原病毒中绝缘子区域和hβ-球蛋白基因启动子的组蛋白上进行了ChIP分析，从而研究表观遗传修饰。移植后24周，在移植了转导载体的HSC的Hbbth3/+地中海贫血小鼠的RBC中，体内确认了这些载体的染色质位置效应。然后进行二次移植，并在移植后针对hβ-球蛋白和mRNA对单因素CFU-S进行了分析。鼠中，额外进行了对hβ-球蛋白的血液学分析和HPLC，以进行表达定量。

实施例20

保护免受染色质位置效应的必要cHS4区域

与之前的结果一致，与sBG对照克隆相比，在sBG-I单整合克隆中存在非常高百分比的hβ+细胞(P<0.01)；sBGC、sBG2C、sBG400和sBG800克隆中的hβ+细胞的百分比，与sBG对照克隆相比并没有显著的差别(图8A)。为了确定LTR中cHS4的存在并不偏好整合，在不同的克隆中通过LM PCR进行了分析，并且对十个随机选择的sBG或sBG-I MEL的整合位点进行了测序。在未绝缘的和绝缘的克隆中插入发生在不同基因中或其附近，并没有明显的偏好。cHS4核心(sBGC)或核心下游的绝缘子的延伸序列(高至800bp)的存在，并没有进一步增加hβ+细胞的百分比，核心序列的串联重复序列也没有，甚至后者还显示出了质粒基础系统的增强子封闭效应。

转基因表达时看到的另一种现象是克隆斑(clonal variegation)，界定了在有相同整合位点的子细胞中不同的表达水平。测定克隆斑的一种定量方法是通过FACS来分析转导的克隆，并计算克隆中围绕转基因平均表达的转基因表达的变异系数(CV)。CV是作为样品的标准偏差(SD)和样品平均之比计算变异性的无单位的量度。未绝缘sBG克隆中观察到了高的CV(图2B)。在所有包含5′250bp核心的载体中CV均显著降低。这些结果在衍生自携带惰性DNA间隔序列(核心下游)的载体(sBG400S和sBG800S)的克隆中得到了确认，显示CV上的减少是针对于绝缘子核心，并与hβ+细胞的百分比形成对比，其需要全长绝缘子的存在。

值得注意的是，PCR检测绝缘子序列显示仅在sBG2C原病毒中缺乏绝缘子序列，24个克隆中的6个(25％)MEL克隆具有从两个LTR中删除的两个核心拷贝。序列来自所有其他载体的克隆没有观察到绝缘子的缺失。sBG2C MEL池的Southern印迹分析确认了在大部分细胞核心的一个/两个拷贝的缺失。重复序列的逆转录，已知导致逆转录载体中的重组事件，可能导致具有重复核心序列的载体传输不稳定。在地中海贫血小鼠体内确认了核心和全长cHS4的该效应。移植后6个月分析了外周血RBC以了解hβ-球蛋白的表达。sBG、sBGC、sBG2C、sBG400和sBG-I组小鼠中RBC的FACS分析(图9A显示了代表性的点)显示相比于sBG组小鼠，只有在sBG-I组小鼠中hβ+RBC的百分比显著较高，如MEL细胞中的数据；所有携带核心的载体CV均显著较低(P<0.01；图9B–C)。总之，这些数据指示全长cHS4对抵抗染色质位置效应是必需的。

实施例21

二次移植后鼠HSC的无性后代中的染色质位置效应

接下来通过单拷贝二次CFU-S确认了染色质位置效应。二次脾集落形成单位(CFU-S)实验被认为是最严格的实验，是研究衍生自造血干细胞的细胞中染色质绝缘子元件的表观效应的“金标准”。特别地，没有观察到转导的CFU-S，其通过PCR检测载体特异性序列阳性(通过FACS不表达hβ-球蛋白的)，与缺乏红细胞特异的SIN慢病毒载体转基因沉默的报道一致。对(1)％hβ+细胞和(2)TER-119阳性成红细胞的FACS分析表明在不同载体组之间TER-119+细胞的百分比没有不同(未显示)。然而，hβ+细胞显著较高的％仅存在于具有sBG-I载体的二次CFU-S中。此外，与未绝缘的sBG转导的CFU-S，用所有携带核心的载体转导的CFU-S中CV显著较低(图3D–E)。随机从各组鼠中选择六个CFU-S进行实时RT-PCR分析显示与sBG载体相比，sBG-I CFU-S的mRNA表达量约高出了2倍。然而，sBGC、sBG2C和sBG400转导的CFU-S的表达与sBG CFU-S的相比没有显著差别。总之，这些数据指示sBGC、sBG400、sBG400S、sBG800和sBG800S中的5′250bp核心序列特异性降低hβ-球蛋白表达的克隆斑。然而，全长cHS4元件对于从不同整合事件中表达提高的可能性是必需的。

实施例22

绝缘的载体中核心区域和β-球蛋白启动子区域中组蛋白乙酰化和甲基化的图谱

接下来，通过比较MEL克隆中不同原病毒之间的激活组蛋白标记acH3、acH4和H3K4me2和抑制组蛋白标记H3K9me3和H3K27me3来测定不同绝缘子区域伴随特异效应的表观遗传修饰。通过半定量PCR(图10B–C)和实时PCR(图10D–F)进行ChIP分析，在三个典型的克隆中(各载体合并在一起)(选择的克隆显示为8A中的实心圆)的各cHS4核心上。携带sBG-I载体要素的克隆显示了约6倍的激活组蛋白标记的富集以及降低的抑制组蛋白标记遍布cHS4“核心”片段，与sBGC、sBG400和sBG800相比，三个载体携带“核心”。

分析了遍布未绝缘的载体(sBG)和所有其它载体(携带“核心”)中的hβ-球蛋白启动子的组蛋白修饰，以评估是否载体中遍布转基因启动子的组蛋白类型的不同可能会降低克隆斑。与未绝缘的sBG前病毒相比，在具有sBGC、sBG400和sBG800前病毒的抑制染色质类型H3K27me3中有较小但是显著的降低(图10F,右图)。然而，具有sBG-I原病毒的，其展现了最高的绝缘子活性，hβ-球蛋白启动子区域具有显著降低的抑制染色质类型。

这些数据显示cHS4的“核心”序列和延伸核心序列高至5′800bp小幅度降低了遍布转基因启动子的激活标记。然而，遍布cHS4和转基因启动子区域的抑制的组蛋白修饰的主要降低仅发生于当cHS4的3′远端400bp序列额外存在时。

实施例23

移植了经未绝缘和绝缘载体转导的HSC的地中海贫血小鼠中的血液学参数

即使使用了sBG载体，贫血、网状细胞增多和其它RBC指标均有所改善(图11A)，与使用未绝缘的hβ-球蛋白慢病毒载体报道的结果一致。模拟移植小鼠的血红蛋白是7.7±0.2gm/dL，sBG组小鼠的为10.4±0.7，具有1.2拷贝数/细胞。值得注意的是，sBG-I组小鼠具有较高的血红蛋白和最低的网织红细胞计数，尽管与sBG组其它小鼠相比具有一半的载体拷贝数/细胞(血红蛋白11±0.2gm/dL；0.6载体拷贝数/细胞)。当标准化转导效率，与模拟鼠相比sBG-I鼠该数值高出了5.2gm血红蛋白每载体拷贝，相对于sBG鼠中高出了2.3gm血红蛋白每载体拷贝。来自实验鼠的RBC参数显示了显著改善(图11A；注意这些数值没有对载体拷贝数标准化)。sBG-I鼠中的这些指标的改善最高，虽然没有显著的差异，除非对载体拷贝标准化。

对血中hβ-球蛋白的HPLC分析证实了仅在sBG-I小鼠中hβ-球蛋白表达显著提高：RBC中43±3％的总血红蛋白衍生自sBG-I鼠的hβ-球蛋白(hβ2mα2)，相比之下sBG鼠中为19±6％，而sBGC、sBG400和sBG2C组小鼠的与对照相比并无显著差异(图11B)。sBG2C组小鼠中人hβ-球蛋白表达和血液学参数与在未绝缘的对照组中看到的类似。

实施例24

3′400cHS4区域的绝缘子活性

既然cHS4的5′800bp仅降低了CV，而完全绝缘子活性被全长1.2Kb绝缘子恢复。制备了仅携带源自MEL克隆的cHS4的3′远端400bp区域的载体(sBG3′400)，并使用sBG3′400转导的LSK细胞移植小鼠。注意与之前描述的载体不同，该载体不包含5′250bp“核心”序列(图12A)。sBG3′400载体对MEL克隆中hβ+细胞的百分比或小鼠中hβ+RBC百分比没有影响(图6B,D)，效果比得上sBG克隆或携带5′250bp“核心”的那些(sBGC)。然而，像所有携带5′核心的载体，sBG3′400显著地降低了MEL克隆和RBC中hβ-球蛋白表达的CV(图12C,E)。

HPLC分析测定的sBG3′400小鼠中hβ-球蛋白的数量，与sBG差别不显著(17.5±3％对19.5±5.6％)，但是比sBG-I小鼠中看到的至少低2倍(43±3％；P<0.01)(图12F)。总之，cHS4的3′400bp与5′250bp核心具有非常相似的活性(图9):它降低了克隆斑，体现在MEL克隆和RBC中hβ-球蛋白表达降低的CV，但是对hβ-球蛋白表达红细胞的比例没有影响。确认了个体单拷贝二次CFU-S中3′400bp的“核心样”效果(图12G–H)，结果与具有sBGC载体的那些相似(图9D–E)。3′400区域不具有对于CTCF或USF-1的已知的共有序列，该区域之间没有分析过。值得注意的是，5′核心和3′400bp单独存在时，均不能改善要素表达的可能性/避免位置效应。

实施例25

5′“核心”联合3′400bp的绝缘子活性

当结合cHS4绝缘子的5′250bp核心和3′400bp序列时(sBG650载体；图13A)，该载体在MEL克隆、移植小鼠的RBC和二次CFU-S中表现的与sBG-I载体相似二次。sBG650MEL克隆和RBC中hβ-球蛋白表达细胞的比例(图13B–D)显著高于sBG克隆(P<0.001)，与sBG-I克隆类似。同样地，sBG650克隆的CV与sBG-I克隆相当(图13C)。首次小鼠的RBC中hβ-球蛋白的表达sBG-I小鼠相当(图13D)。HPLC分析测得的sBG650鼠中hβ-球蛋白的数量与sBG-I鼠差别不显著(分别为41±2.6％对43±3％)，但是高于sBG鼠中看到的至少2倍(19±6％；P<0.01)。移植五个月后，进行二次移植以产生CFU-S，其证实了sBG650载体恢复了绝缘子活性，与sBG-I载体相似(图13E)。遍布sBG650原病毒中核心的染色质结构(图13F)显示开放的染色质图谱的恢复，遍布绝缘子核心和β-球蛋白启动子，与在sBG-I原病毒中看到的一致(图10)。

实施例26

cHS4的3′400bp区域的表观遗传修饰和其与核心的相互作用

此前没有研究过cHS4的3′末端400bp部分的染色质结构。首先分析了遍布3′400bp区域(sBG3′400)的组蛋白图谱，当其单独存在(sBG3′400)时或与5′核心联合时(sBG650和sBG-I中)(图14)。sBG3′400原病毒的3′400区域中组蛋白的乙酰化和甲基化图谱(图14B)与sBGC原病毒250bp核心区中看到的相似(图10)。然而，sBG650和sBG-I原病毒中，3′400bp序列已经增加了乙酰化标记并降低了抑制性，再次显示联合cHS4的邻近和末端对开放染色质图谱是必需的。该效应让人联想起sBG-I(图10D and F)或sBG650(图13F and G)中的遍布5′核心区域或β-球蛋白启动子区域的ChIP分析。总之，基因的和表型的分析表明，绝缘子的5′和3′作为两个核心起作用，其相互作用于绝缘子和启动子上染色质的表观遗传修饰，以给予适当的绝缘子活性。

然而，3′400bp区域不具有已知的CTCF或USF-1基序，其显示了对cHS4分别给予增强子封闭和屏障的活性。这是可以想到的；然而CTCF和/或USF-1可能被吸收到了3′400区域。使用针对USF-1和CTCF的抗体，对来自MEL克隆的sBGC、sBG3′400、sBG650和sBG-I前病毒的染色质进行免疫沉淀。使用半定量PCR和qPCR进行ChIP分析。当使用针对核心区域的引物扩增ChIP时，证明CTCF和USF-1补充到了5′核心区域(图14C–D)，如之前预料和显示的。有趣的是，当使用3′400区域引物扩增ChIP产物，虽然与遍布核心区域看到相比水平有些低，但sBG3′400原病毒显示了对CTCF的富集。更值得注意的是，然而，sBG650和SBG-I原病毒显示在3'400bp区域富集两个USF-1，当两个邻近核心和远端400bp存在时看到的效果。3'400bp的区域，当独自出现在sBG3'400时，不结合USF-1(图14E-F)。这些数据表明尽管缺乏CCCTC共同基序，3′400bp区域仍与CTCF相互作用，这解释了该区域中的“核样”活性，以及cHS4绝缘子的5′核心区域和3′400区域之间的相互作用可能通过USF-1发生(sBG-I或sBG650中)。

实施例27

具有650bp cHS4绝缘子的载体滴度

1.2Kb cHS4显著地降低了SIN-慢病毒载体的滴度，限制了用于人类临床的大型病毒的产生。最近表明了滴度降低的机制与3′LTR中的插入物长度特异地相关。与sBG相比，sBG650具有非常合理的滴度，相对的低于sBG-I 10.4±2倍，其仅低于sBG2.5±0.9倍(n＝3)。因而，该优化的绝缘子可以被用于更安全的基因治疗载体设计，其能够提供均一且由此更高的表达并且能够扩展到大规模生产。

我们和其他人之前均展示了全长的cHS4绝缘子可以保护病毒载体抵抗染色质位置效应。然而，对病毒滴度严重有害的影响妨碍了其应用。在病毒载体中试图仅使用cHS4的5′250bp(以作为绝缘子的核心为特点)已经失败，尽管在质粒基础系统中该核心具有显著的活性，并且在这些区域中突变后丧失了绝缘子活性。

围绕cHS4绝缘子和β-球蛋白启动子的区域已经在天然位置显示了结构性更高的激活组蛋白标记。cHS4阻止异染色质向β-球蛋白结构域的传播，即使当毗邻的异染色质结构域具有高的抑制组蛋白标记、H3K9me3和H3K27me3。相比于sBGC、sBG400和sBG800载体，携带sBG-I载体要素的克隆显示了遍布cHS4核心的激活染色质标记的富集和抑制染色质标记的显著降低，其中在这些表观遗传标记中没有观察到显著的不同。

机理上，绝缘子中的USF-1/2元件已被证明招募组蛋白修饰酶到核心，并与蛋白赖氨酸甲基转移酶相互作用SET7/9和p300/CREB-结合蛋白关联因子(PCAF)，从而增加了激活染色质标记。然而，当其在sBGC、sBG400、sBG800和sBG3′400载体侧翼添加转基因，没有在遍布核心或3′400bp的acH3、acH4和H3K4me2中观察到此类增加。该效果要求载体携带全长cHS4(sBG-I,图10和14)或核心和3′400bp联合的sBG650载体(图13和14)。对hβ-球蛋白启动子全部的ChIP分析显示，与未绝缘的载体相比，在一定程度上核心单独降低遍布启动子的抑制染色质标记(图10F)，这可能能够解释来自携带核心的载体的CV的降低。然而，核心依赖于3′400bp区域，并且相反地，3′400区域依赖于核心，对于遍布这两个区域的高度组蛋白乙酰化和最小抑制标记的缺失。

对解释周围染色质cHS4效果所提出的模型包括通过排除甲基-CpG-结合蛋白保护抵抗转基因沉默；实际上，通过逆转录病毒载体cHS4已经显示为阻止沉默。一直没有观察到β-球蛋白表达停止，甚至在未绝缘载体小鼠中，或一直维持到6个月的MEL克隆(数据未显示)。这可能是因为β-球蛋白LCR超敏位点中数个USF-1元件，其已经显示了与HS2中和β-球蛋白基因启动子中的E-box元件的相互作用。能想到LCR赋予的该沉默抗性推翻了cHS4核心的任何活性。这些结果与Panell等报道的那些形成了对照，其认为逆转录病毒包括衍生自HIV-1的那些，在转基因鼠中绝对地沉默了相连的转座控制区(LCR)β-球蛋白报告基因。分析了甲基化，随后报道了在首次和二次受体中CpG甲基化的缺乏和体内红细胞特异的SIN-慢病毒载体表达的消失首次二次。这些数据表明在红细胞载体中，其另外通过启动子甲基化抵抗沉默，全长的cHS4能够修饰遍布转基因启动子以及遍布其自身的组蛋白图谱，以降低位置效应。

有趣的是，3'400bp区域的in silico分析表明没有CTCF或USF1结合位点，但有多种已知转录因子位点。任何这些转录因子，或者一个新的蛋白可作为与CTCF和/或USF-1相互作用的伙伴。CTCF经由结合于粘连蛋白直接调节激活和抑制性染色质标记之间的平衡。此数据表明，3'400bp的区域也可以与CTCF相互影响：虽然共免疫沉淀来自sBG3'400原病毒的3'400bp和CTCF(图14C-F)没有成功。

有趣的是，3'400bp和USF-1抗体的共免疫沉淀仅在5'核心序列额外存在时发生，表明USF-1有可能形成cHS4 5′和3′端之间的桥梁来降低位置效应。需要重点测定是否3′400bp中的元件招募组蛋白乙酰基转移酶结合USF-1或粘连蛋白和/或磷化氢核(nucleophosphmin)复合物来影响位置效应。

最后，在体内和体外进行了cHS4绝缘子活性的系统的基因和表观遗传分析，并鉴定了3′400bp中的新的“核心样”活性。cHS4的3′400bp，其包括同USF或CTCF的共同基序，然而却结合CTCF，而USF-1表现的结合并且桥接cHS4的5′核心和3′400bp。侧翼具有优化的‘650bp’cHS4序列的新载体系统，能够对转基因提供优异的绝缘而不会显著降低病毒滴度，并且具有对基因治疗来说重要的安全性和实施效率。

实施例28

材料和方法-慢病毒载体

如上所述，通过将不同的绝缘子片段克隆进入慢病毒质粒U3 3′LTR区域中的NheI/EcoRV位点获得所有载体。该质粒携带人(h)β-球蛋白基因及其调控元件(BG)。如上所述，使用绝缘子质粒pJCI3-1(由Gary Felsenfeld博士提供,NIH,MD)PCR扩增所有的绝缘子片段并通过测序验证。此前已经描述了有或没有1.2kb cHS4绝缘子的hβ-球蛋白载体的克隆。通过将EcoRI/XbaI 250bp核心绝缘子PCR产物插入到sBG，从而把sBG1C载体克隆至pBS质粒的BamHI/EcoRI限制性位点。然后将250bp核心的第二拷贝插入到pBS 1-核心质粒的EcoRI/KpnI位点获得pBS 2-核心质粒。使用KpnI/XbaI消化pBS-2核心质粒分离250bp核心的两个串联拷贝，然后克隆入sBG载体获得sBG2C。通过克隆2个PCR产物至sBG NheI/EcoRV位点获得sBG400和sBG800载体。使用下述的引物组合扩增不同大小的λ-噬菌体DNA获得包含DNA间隔子的载体：间隔子F1和间隔子R1、间隔子F1和间隔子R2分别扩增150bp、550bpλ-DNA。将ClaI/EcoRI消化的PCR片段连接至pBS-1核心质粒的EcoRI/ClaI位点，分别使用HincII/XbaI和XbaI/XhoI对来自pBS-1核心质粒的400bp和800bp的片段进行限制性内切，并克隆至sBG的NheI/EcoRV位点。通过瞬时共转染293T细胞生产病毒，并在MEL细胞上滴定。

实施例29

材料和方法-细胞系

MEL细胞和293T细胞维持在DMEM培养基(Mediatech公司)中，补充有10％热灭活的胎牛血清(FBS，美国生物技术股份有限公司)，并且如上所述进行分化。对各测试的和克隆的载体的MEL细胞进行转导以达到低于5％的转导效率。通过PCR对hβ-球蛋白筛选了衍生自各载体的三个独立转导的约400克隆；对完整绝缘子区域的阳性克隆进行了筛选。为单一要素对鉴定出的克隆进行qPCR，扩增并且冻存。解冻一整套克隆，分化并同时通过FACS分析。

实施例30

材料和方法-鼠造血干细胞转导和移植

使用Hbbth3/+对地中海贫血鼠进行移植。所有动物研究依照动物使用和护理机构委员会批准的计划进行。通过免疫磁珠分离和FACS分选(详见补充材料和方法S1)对骨髓的单细胞悬液进行Sca-1+c-kit+细胞系(LSK)造血干/组细胞的富集。在Stem Span(干细胞技术有限公司,温哥华,BC)中进行LSK细胞的转导，使用MOI为10的浓缩载体悬液，间隔12h进行两次，如前所述。10，000转导的LSK细胞与2×10⁵LK细胞共移植入10.75Gy辐照的地中海贫血受体。CFU-S实验：在来自首次鼠移植后24周的骨髓细胞移植后的第12天解剖离散的脾集落形成单位(CFU-S)，如前所述。

实施例31

材料和方法-hβ-球蛋白表达分析

在Hemavet(德鲁科学有限公司,牛津,CT,USA)上进行全血球计数。通过使用200μl网织红细胞计数试剂(BD生物科学,CA)染色1μl的全血进行网织红细胞计数分析并在FACSCalibur(BD)上计数。通过高效液相色谱(HPLC)对血裂解液分析RBC中hβ-球蛋白的定量，如前所述，并且使用经过验证的特异性针对hβ-球蛋白引物和探针通过实时RT-PCR对mRNA进行分析(ABI生物系统)，使用鼠α-球蛋白进行标准化。如前所述，对hβ-球蛋白的细胞内染色后进行FACS分析。

实施例32

材料和方法-染色质免疫沉淀(ChIP)

如前所述，经过微小改进对MEL克隆进行ChIP分析。简而言之，通过SYBRgreen(生物系统提供)使用引物集通过qPCR分析自输入的DNA样本和抗体结合染色质部分，一式三份，数据分析如前所述。通过计算DNA-ChIP对DNA-输入的比例测定富集比率，组蛋白修饰数据标准化至“无抗体”(IgG)对照并且对应于抑蛋白5′区域和启动子区域的引物，作为抑制染色质的对照，来标准化免疫沉淀反应的效率。所有的DNA-ChIP对DNA-输入的比例通过下式计算：2[Ct(输入)-Ct(ChIP)]除以[稀释比例(ChIP)/稀释比例(输入)]。通过SDS 1.2软件(生物系统提供)测定所有PCR产物的Ct值。对倍数差异进行平均和SEM值测定，双尾配对t检测测定统计显著性(p<0.05)。

实施例33

材料和方法-整合位点分析

根据Modlich等的描述，使用所描述的引物和条件，采用连接法介导(LM)聚合酶链式反应来描绘整合位点。(Arumugam,Mol Ther 2009,引文待印刷)

实施例34

材料和方法-统计分析

载体与sBG载体相比进行学生“t”检验(未配对并且双尾)。在组之间进行了ANOVA(邓尼特多重比较检验，Dunnett multiple comparison test)以进行多重比较。数据以平均值±SEM表示。P<0.05为具有显著性。

实施例35

侧翼具有1.2Kb鸡超敏位点-4绝缘子元件(cHS4)的自失活慢病毒提供了持续的、表达提高的转基因，但是具有显著降低的滴度

侧翼具有1.2Kb鸡超敏位点-4绝缘子元件(cHS4)的自失活慢病毒提供了持续的、表达提高的转基因，但是具有显著降低的滴度。通过额外的1.2Kb(通过一内在表达盒)延长慢病毒转基因表达盒没有引起进一步的滴度降低。然而，当在3’LTR中放置cHS4序列或惰性DNA间隔子时，感染性滴度与插入的长度成比例降低。携带大的cHS4 3’LTR插入物的载体影响了载体生命周期的阶段，同对照载体作了比较：3’LTR中插入1.2Kb cHS4没有增加通读转录。在包装细胞中产生了相同数量的全长病毒mRNA，并且病毒装配/包装未受影响，导致两组载体产生了数量相当的完整病毒颗粒。然而，3’LTR中携带cHS4的慢病毒进入靶细胞后无法高效加工，具有降低的逆转录和整合效率，并且因此较低的转导滴度。因此，3’LTR中具有大的插入子的载体能够高效地转录和包装，但是LTR插入阻碍了病毒RNA加工和靶细胞的转导。这些研究对整合载体的设计具有重要影响。

实施例36

载体基因组长度增加1.2Kb不影响病毒滴度

本研究的目标之一是确定是否cHS4引起的滴度降低是继发于病毒基因组的额外长度在其它的hp-LCR(BG)慢病毒载体中。已知在整合载体中大病毒RNA基因组缺乏高效包装。复制充足的γ-逆转录病毒删除添加的序列并恢复到原来的病毒大小。在超出正常病毒大小的γ-逆转录病中，在病毒生命周期的多个步骤中发生了滴度降低-生成全长基因组、病毒衣壳化/释放和进入后重组事件。值得注意的是，BG慢病毒包含7KB的转基因插入，因此不会产生比野生型HIV-1病毒的自然大小/包装容量大的病毒RNA基因组。而在慢病毒载体中，转基因插入6KB或更大的转基因插入就显示了从包装效率降低产生的病毒滴度降低。

最近对未绝缘载体BG和BGM与类似的绝缘载体BG-I和BGM-I的位置影响进行了比较。BG慢病毒载体携带了hβ和LCR，而相似的载体BGM额外携带了PGK启动子驱动甲基鸟嘌呤甲基转移酶(P140K)cDNA(PGK-MGMT)插入hp-LCR的下游。该PGK-MGMT表达盒大小为1.2kb。该BG-I和BGM-I载体在3'LTR额外携带了1.2KB cHS4绝缘子。如先前所述，相同地生产和处理来自所有十个载体的病毒，并测定感染滴度。浓缩的BG载体的滴度是2±0.5x10⁸IU/mL，而携带额外1.2Kb内部表达盒的BGM为稍高的5±0.8x10⁸IU/mL(n＝4)。与此相反，将3'LTR中1.2KB cHS4添加到BG载体中，称为BG-I，在滴度上减少了约6倍，为3.8±0.8x10⁷IU/mL。进一步将1.2Kb PGK-MGMT内部表达盒添加到BG-I载体，称为BGM-I，滴度不再进一步降低(图20B)。这些数据指示，cHS4插入至LTR，而不是全部病毒基因组，降低了病毒滴度。Ramezani等观察到当1.2Kb cHS4插入到编码相对较小转基因表达盒(2Kb大小或更小)的慢病毒载体中慢病毒滴度降低了3倍。本数据与他们的一致，虽然cHS4的添加显示滴度降低了6-10倍。在本研究中还观察到，通过在LTR中插入绝缘子元件而降低滴度其具有独特的机制，不依赖于病毒基因组大小的增加。

实施例37

3’LTR中的插入物大小是滴度降低的原因

虽然使用的LV载体没有超出HIV-1病毒的天然大小，cHS4插入物的大小(1.2Kb)超出了野生型LTR的天然大小(请注意，wt LTR携带额外的400bp U3增强子，在自失活3'LTR中删除)。进行了实验以确定病毒滴度的降低是否是由于SIN LTR的延长超出了其自然容量(400bp)，或是否是由于绝缘子中的特异序列而降低了滴度，其可以潜在地影响病毒RNA的折叠/结合细胞蛋白，从而限制包装。在自失活慢病毒骨架中构建了一系列的p-球蛋白载体，sSIN，3’LTR中携带不同长度的cHS4片段(图15a):绝缘子起始的250bp(也称为核心)、400bp cHS4片段(匹配3’SIN LTR中U3启动子/增强子缺失的大小)、以及800bp cHS4片段，以分别产生sBG^C、sBG⁴⁰⁰、sBG⁸⁰⁰。这些载体相比于类似的‘未绝缘的’载体，sBG，和携带全长1.2Kb绝缘子的载体，sBG-I。另外，克隆了一个两个拷贝的核心作为串联重复序列(250bpx2)的载体，sBG^2C。cHS4核心已被证明具有全长(1.2Kb)绝缘子增强封闭活性的50％；核心的作用已被证明与拷贝数相关的，cHS4核心的串联重复序列被报道具有同全长1.2KbcHS4相同的绝缘能力。

如上所述，通过同时的瞬时转染和浓缩，从sBG、sBG^C、sBG⁴⁰⁰、sBG^2C、sBG⁸⁰⁰、sBG-I质粒产生病毒，并通过系列稀释病毒感染的小鼠红白血病(MEL)细胞的流式细胞仪进行滴定。MEL细胞支持成熟型球蛋白的生产。每个实验重复四次。

经测定随着3'LTR中插入的cHS4大小在增加，病毒滴度下降(图15B)。插入250bp和400bp在滴度上有轻微但统计学上显著的减少。然而，此后滴度大幅下降，正比于绝缘子片段的长度(图15b)。具有1.2kb全长cHS4绝缘子的载体(SBG-Ⅰ)的滴度，比未绝缘对照载体(SBG)低一个数量级。值得注意的是，具有来两个cHS4核心序列串联重复的(500bp插入)sBG^2C载体，具有类似于SBG⁸⁰⁰的滴度。

为了确定滴度上的降低并不是受特定cHS4而是LTR插入物大小影响的，另构建了三个的载体，sBG^400-S、sBG^800-S和sBG^1200-S。这些载体类似于sBG⁴⁰⁰、sBG⁸⁰⁰和sBG-I，除了它们在cHS4核心的下游包含来自λ噬菌体DNA的间隔元件以分别产生400bp、800bp和1.2Kb的3’LTR插入物(图15a)。保留了cHS4核心序列，因为具有核心的滴度降低的最小(在初始的实验中没有观察到)；这对确定核心下游增加的序列对优化绝缘子活性是否是必需的而言很重要。含有DNA间隔子载体的滴度与那些含有相似大小的cHS4片段的一致，随3’LTR中片段大小的增加降低(图15d)。这些数据显示，延长3’LTR降低了滴度，并且该效果不是来自于cHS4中的特定序列。据报道，HIV-1RT不是强的进行性聚合酶；它经常从它的模板上解离，并合成相对短片段的病毒DNA。因此，它很可能是由于U3LTR中插入物大小的增加，降低了通过3'LTR的持续合成能力。

实施例38

随3’LTR中重复元件发生的重组

为了检测重组事件是否在LTR中从LTR中的核心2拷贝或不同大小的片段中发生，构建了具有绝缘的载体完整系列的～12-20MEL细胞克隆(sBG^C、sBG⁴⁰⁰、sBG^2C、sBG⁸⁰⁰和sBG-I)。如前所述，经qPCR鉴定所有克隆均具有整合的原病毒单一拷贝。然后采用标准PCR，从各克隆的基因组DNA扩增了250bp的核心。能够从衍生自所有载体的克隆(除了那些衍生自sBG^2C转导的细胞)中扩增到绝缘子核心序列。在sBG^2C MEL克隆中，使用PCR在24个中的6个(25％)单克隆中未检测到绝缘子核心，提示了原病毒5’和3’LTR中cHS4核心序列串联重复序列的缺失(图20D)。为了进一步分析重组的原病毒频率，对sBG^2C转导的MEL细胞池进行了基因组Southern印迹分析。使用内切LTR的酶对sBG^2C和sBG-I MEL细胞群的基因组DNA进行限制性酶切。图15E显示具有sBG^2C载体和sBG-I载体的原病毒的预期长度，作为对照使用。在sBG-I转导的MEL细胞中看到了单一原病毒条带，而MEL细胞中的sBG^2C原病毒显示少了一个或两个cHS4核心序列的拷贝。实际上，包含两个核心的完整拷贝的原病毒条带在Southern印迹分析的灵敏度范围内没有检测到。这些数据显示，在sBG^2C中的串联重复序列以较高的频率重组。因此，sBG^2C载体具有较低的病毒滴度，由于逆转录过程中的重组事件，而不是LTR插入物的大小。这些结果并不意外，因为γ-逆转录病毒和慢病毒载体中的重复单元已显示出频繁的重组。

实施例39

向3’LTR插入的大插入物影响载体生命周期中的步骤

RNA载体的大病毒基因组已经显示了在RNA包装水平上是受限的。在本研究中，增加病毒载荷1.2kb对滴度没有影响，但滴度随着LTR中插入物的长度增加而减小。接下来，探讨了影响病毒滴度的机理。对病毒生命周期中的以下步骤进行了研究：1)产生于包装细胞中的病毒RNA的特征；2)病毒颗粒的生产；3)进入后步骤：逆转录、核转运、整合和原病毒的完整性。对于所有这些研究，将具有最大插入物的载体(sBG-Ⅰ)和无绝缘子载体(sBG)相比较。

实施例40

3’LTR中cHS4的插入没有改变包装细胞中的病毒RNA数量或质量

使用sBG、sBG-I载体质粒和包装质粒一起(D8.9和VSV-G)进行瞬时转染后对衍生自293T包装细胞的RNA进行了Northern印迹分析。使用hp片段探测印迹。图16显示了sBG和sBG-I载体预期长度的相似强度病毒RNA转录物。探针非特异性地探测28S和18S RNA。然而，除了预期长度的全长病毒RNA之外并没有额外的条带，表明没有重组或异常的剪接随绝缘子的插入发生。因而，病毒RNA在包装细胞中高效地产生，与LTR中插入物的存在无关。

实施例41

3’LTR中cHS4的插入没有增加通读转录

进行了实验以确定是否cHS4插入LTR中病毒多腺苷酸信号的上游可能损害病毒RNA的转录终止。通读转录物已经显示无法包入包壳，并能降低病毒滴度。虽然在图16中的Northern印迹显示了预期大小的病毒RNA条带，没有多余的转录物，它已经显示，慢病毒载体通读转录比γ-逆转录病毒载体更少，即无法容易地通过northern印迹检测到。因此使用一个基于敏感酶的测定以研究通读转录。

克隆了载体构建物，其中野生型的HIV-1LTR、有或没有绝缘子(分别来自sBG-I或sBG载体)的SIN HIV-1 3’LTR放置在了EF1-α启动子的下游。在LTR下游放置了无启动子的IRES-cre表达盒，以便cre仅在LTR转录通读发生后表达。EF1a-IRES-cre质粒作为阳性对照。将相同数量的这些质粒转染到报告细胞系TE26中，其表达的β-半乳糖苷酶与cre表达成比例。将GFP质粒与通读质粒共转染从而为了转染效率将β-半乳糖苷酶活性标准化。携带截短的鼠神经生长因子报告子的质粒作为阴性对照。制得的标准曲线显示转染至细胞中的IRES-cre质粒阳性对照的数量和分光光度计测得的β-半乳糖苷酶活性线性相关。与携带无cHS4绝缘子的SIN LTR的那些相比，从含有绝缘SIN慢病毒LTR转染的构建物中没有观察到β-半乳糖苷酶活性显著增加。通过TE26细胞盖玻片Lac-Z染色证实的结果与β-半乳糖苷酶实验的结果一致。这些结果表明，病毒多腺苷酸信号上游的cHS4元件的插入没有增加LTR通读转录。

实施例42

含有病毒基因组的病毒颗粒的产生不受cHS4的影响

为了测定病毒RNA是否有效的壳体化至病毒粒子，检测了p24水平、病毒相关的逆转录酶活性(RT)和病毒RNA水平(图17a-c)。使用两种载体同时以相同方式生成病毒，并在三个独立的实验中进行相似的浓缩。为了确保制备病毒的纯度且没有蛋白或质粒污染，对病毒进行蔗糖梯度离心并使用DNA酶消化再进行这些实验。通过qPCR氨苄青霉素抗性基因(存在于质粒骨架中)确认无质粒污染。使用相同体积的病毒制剂进行p24ELISA和病毒相关的RT实验；提取病毒RNA进行点-印迹分析。图17a显示了两个载体中病毒相关的RT数量没有区别。sBG和sBG-I病毒制剂中p24水平也相似(图17b)。为了确定sBG-I病毒粒子中含有病毒基因组，没有空的病毒样颗粒；使用RNA点-印迹对病毒进行了分析。图17c-d显示了一个或两个代表性的实验。来自sBG和sBG-I的病毒RNA一式两份加载于p24的4个不同稀释产物中(图17c)；通过磷光影响分析仪定量点的强度(图17d)。两个载体中均具有相似数量的病毒mRNA被依壳包裹。数据表明LTR插入1.2Kb片段没有影响病毒mRNA的包装效率或病毒颗粒的产量。

在LTR使用大插入物的本结果与由萨顿和他的同事得到的那些结果相反，其认为具有延长的内部转基因表达盒的慢病毒载体病毒粒子的包装效率低下。从sBG和sBG-I载体产生了等量病毒颗粒，但显著降低了感染/转导滴度提示大的LTR插入病毒的进入后阻碍，导致了整合单位的减少。

实施例43

大的LTR插入物影响逆转录和病毒cDNA的整合

研究了进入后的步骤；包括逆转录、核易位、整合和前病毒完整性。逆转录：逆转录的步骤，qPCR引物和探针的定位以及病毒DNA产物总结于图18a中。反转录从靠近基因组RNA的5'端的引物结合位点启动，负链的合成从基因组的5'端(负链强终止DNA(-sssDNA))开始。新形成的-sssDNA在基因组的3'R区域(第一链转移)退火，负链DNA合成恢复，伴随着病毒RNA模板的核糖核酸酶H消化。已经显示，病毒RNA的3'末端的二次结构对高效的逆转录过程而言是-sssDNA转移的一个关键因素。因此，绝缘子/3'LTR U3区域的插入的存在会改变参与这一复杂过程的区域的二次结构，导致整体上降低逆转录效率。

为了评估逆转录效率，使用等量sBG和sBG-Ⅰ病毒颗粒感染MEL细胞，基于p24的水平，并在在感染后不同时间点收集的细胞。对质粒骨架中的氨苄青霉素抗性基因进行qPCR确认无质粒污染(数据未显示)。使用跨越R/U5区域的引物和探针研究早期逆转录(-sssDNA的生产)的动力学(图18b)。正如预期的，没有检测到这两种病毒之间的动力学差异，由于sBG或sBG-1病毒RNA的5'端是相同的。不过，该数据验证了qPCR准确地确定了病毒逆转录。

然而可以想到，当RT切换模板(负链跳转)至反转录3'LTR，U3区域中插入物的存在产生的二次结构将减少逆转录产物。进行了扩增U3/R和ψ区域的定量PCR以对中间产物和分别感染sBG和sBG-Ⅰ载体细胞中的后期逆转录病毒cDNA的数量进行定量(图18c-d)。发现第一链转移后不久，RT的效率受损。值得注意的是，扩增病毒DNA的U3/R引物在绝缘子序列之前逆转录，表明3'LTR中插入物通过改变或“毒化”3'LTR影响逆转录。实际上，RT产物中间体的低效率形成与晚期RT产物中看到的相似。在两个分析中，对于未绝缘的载体sBG cDNA合成峰值出现在第12h然后急剧下降，与病毒cDNA的整合和之前报道的逆转录动力学一致。在所有时间点，如早在进入靶细胞后的6小时，来自绝缘载体sBG-I的病毒DNA数量在进入后比sBG低约2倍。这些数据有力地表明，在sBG-I载体中负链跳转后逆转录是限速的。

核转位：在细胞质中合成病毒DNA之后，其被转位到感染细胞的细胞核中，在细胞核中其为线性DNA或环状DNA(1-LTR和2-LTR环)(图.18a)。线性形式在LTR环化并且是整合过程的直接前体；相反地，1-LTR和2-LTR环分别是同源重组和非同源DNA末端连接的次品。然而，1LTR和2LTR环特异性定位于细胞核，并被用作核易位的标记。慢病毒的LTR中插入物的存在可能影响预整合复合物(PIC)的形成和病毒DNA的核转运，能够降低转导滴度。它已被明确表明在细胞质中PIC复合物结合HIV LTR，并且它们负责至细胞核的运输以及cDNA整合进入受感染细胞的基因组中。

为了检测核转位，在sBG和sBG-I感染的细胞中，使用qPCR对来自不同时间点的感染的MEL细胞的DNA，分析了两种载体中2-LTR环的量。如在图19a中所示，在早期时间点的两个载体之间2-LTR环的量差别不显著。然而，在感染后48小时，通常检测到2-LTR环的峰值，sBG感染的细胞中2-LTR环高了6.7倍，但仅仅处于sBG-1感染的细胞中的检测限。同样分析了稍后的时间点(72和96小时)，但在绝缘的载体中在2LTR环形成的动力学曲线中没有测定到延迟。事实上，sBG-I感染细胞24小时后，通过qPCR勉强能够检测到2-LTR环。这些数据表明，核转位很可能由于大的U3插入物的存在而降低。

整合：然而还可以设想，大的U3插入物的两个拷贝提供了用于同源重组的模板，并且两个LTR之间的同源重组的速率在整合前增加，从而导致更多的1-LTR环和减少的2-LTR环(在图20中所示)。这将降低可用于整合的模板的量。由于具有绝缘的和未绝缘载体的逆转录病毒cDNA的性质，不能通过基于PCR的技术对1LTR环进行定量。因此，使用等量的sBG和sBG-I(利用p24水平定量)在感染后72小时后，进行了Southern印迹分析以检测线性病毒cDNA、1-LTR和2-LTR环(图19b)。Southern印迹分析显示(i)逆转录的病毒cDNA的线性形式，即整合的形式，在Southern印迹分析的灵敏度内在sBG-I泳道中无法检测，而在sBG泳道中容易检测到。(ii)sBG-I泳道中Southern分析同样无法检测到2-LTR环，但是在sBG泳道中可检测到，证实了对2-LTR环的qPCR数据。(iii)然而，在sBG-I泳道中，存在大量的1-LTR环，与在sBG泳道中看到的数量相似。sBG对sBG-I泳道中线性、1-和2-LTR环的数量的相对比例表明存在sBG-I病毒DNA的同源重组的增加。实际上，这些数据表明，U3插入物没有在任何重大程度上影响核转位。但是逆转录的cDNA进入核后，增加的1-LTR环，代表由于大LTR插入物形成的次品重组整合产物并且由此降低了整合。

可以想象的是LTR中外来序列的存在也直接影响了整合机制。因此，使用整合酶缺陷包装质粒对sBG和sBG-I病毒进行包装，以便可以不依赖整合研究绝缘子对逆转录、核定位和1LTR环形成的影响。使用含有活性整合酶的病毒进行了相同的分析：进行q-PCR以研究晚期逆转录产物(使用psi引物)、2LTR环，并且进行Southern印迹分析以测定1LTR环和其它形式的病毒cDNA。结果同那些使用具有活性整合酶的sBG和sBG-I包装的看到的一致(示于图19b)：通过qPCR观察到了在晚期RT产物和2LTR环中相同的降低，但是通过Southern分析1LTR环增加(数据未显示)。因而，插入到慢病毒LTR中的序列主要干扰逆转录过程，并通过不依赖整合酶装置的机制增加同源重组的频率。

最终，分析了整合的sBG和sBG-I前病毒的传输稳定性和整合效率。图19b中Southern印迹分析显示了作为印迹的整合DNA，在sBG中的强度要高于sBG-I条带。为了确认并量化整合，使用相同数量的sBG或sBG-I的p24水平转导MEL细胞，培养21天，进行qPCR和Southern印迹分析，以比较原病毒的整合效率和稳定性(图19c)。通过qPCR测定具有sBGMEL细胞群中每细胞具有6.2原病毒拷贝，而在sBG-I MEL细胞中仅检测到了0.8原病毒拷贝，7.8倍的差异与两个载体之间的转导滴度中看到的差异一致。接下来，使用Afl-II(切割位点位于LTR中的酶)限制性酶切DNA(图19c,左图)。与转导滴度和qPCR一致，整合的sBG-I原病毒的数量低于sBG8倍，其通过对Southern印迹条带的磷成像定量显示(图19c)。sBG-I载体没有重组，由于显示了预期大小的单一原病毒条带。接下来，通过PCR检测了sBG-I转导的MEL细胞中所有单一拷贝克隆的全长绝缘子(图20D)。因而，线性sBG-I cDNA，即便是无效形成的，也作为完整的原病毒进行了整合。

整体降低的病毒整合主要因为低效逆转录和增加的同源重组的组合阻碍了整合原病毒DNA的可用性。由于绝缘子对产生病毒载体来说是重要的，这将是安全的并提供稳定的可预见的表达，重要的是找到针对绝缘病毒的低病毒滴度的解决方法。既然内部表达盒的进一步地延长没有降低滴度，那么克服该问题的一种方法是在另一末端侧翼连接具有cHS4的内部表达盒。然而，并没有尝试该方法，因为已知逆转录病毒中的重复元件会导致重组。既然HIV RT已知具有低持续合成能力并且频繁地从它的模板解离，尝试了增加每载体颗粒递送的RT数量，以评估这是否通过大LTR插入物改善逆转录。将RT共包装入病毒粒子作为vpr-RT融合蛋白。当在病毒粒子中提供更多的RT时，没有观察到滴度的显著增加。接下来的步骤尝试使用相同的策略以增加每病毒粒子中的整合酶(IN)，在病毒粒子中共包装RT-IN-vpr融合蛋白。在病毒颗粒中提供RT-IN轻微增加了滴度，但是差异并不显著。

接下来，对1.2Kb cHS4绝缘子进行了更详细的结构-功能分析，并测定了明确的650bp序列作为完整绝缘子效果的最小必需序列。sBG⁶⁵⁰的滴度是3.6×10⁸IU/mL，相比于sBG和sBG-I载体的8.2x10⁸IU/mL和9.8x10⁷IU/mL的滴度(图20C)。具有650bp插入物的载体在没有丧失绝缘子活性的情况下具有非常合理的病毒滴度(低于未绝缘载体sBG 2.2倍的滴度，相对于sBG-I低于9-10的滴度)。

最终测定了低转导滴度不是来自原病毒大小的增加，而是3’LTR的长度的增加。产生的病毒RNA基因组的数量和质量没有受影响，并且病毒RNA衣壳化/包装与有或没有1.2KbLTR插入物的载体相当。进入步骤后，低效率的逆转录导致的病毒滴度出现降低，增加了病毒DNA的LTR中的同源重组，导致用于整合的病毒DNA较少。通过包含更小的绝缘子插入物(包含优化的绝缘子活性必需元件)设计了改进的载体。

本研究对于进一步设计3’LTR中具有插入物的载体具有重要的影响，给出了核染色质绝缘子元件的有用性，自定义线性特异的LTR载体或双拷贝载体。

实施例44

载体构建物

BG、BGM、BG-I和BGM-I载体的克隆在之前已经描述过。将所有其它的载体克隆至sSIN骨架(具体请见Urbinati F、Xia P和Malik P综述文献)。通过将不同绝缘子片段克隆至单一的Nhe I/EcoR V位点插入于sSIN LV载体质粒(携带人β-球蛋白基因和超敏位点2、3和4片段)的U3 3’LTR区域获得所有的载体，如前所述。使用绝缘子质粒pJCI3-1作为模板通过PCR扩增绝缘子片段。PCR并插入到3’LTR后对所有扩增子进行测序。未绝缘的β-球蛋白载体的克隆和携带全长1.2Kb cHS4绝缘子的一个已经在之前描述。简要地说，通过使用Xba I消化pJCI3-1质粒获得1.2Kb绝缘子片段并克隆至sBG的Nhe I/EcoR V限制性位点。通过将含有来自pBS 1核心质粒的250bp核心的EcoR I/Xba I片段插入至sBG载体从而克隆sBG^C。后者通过克隆250bp核心绝缘子PCR产物(使用本文描述的核心1F和核心1R引物)至pBS质粒的BamH I/EcoR I限制性位点获得。然后将250bp核心的第二拷贝添加到pBS 1核心质粒中，克隆至EcoR I/Kpn I位点PCR产物(核心2F和核心2R)，获得pBS 2核心质粒。然后分离250bp核心的2串联拷贝，使用Kpn I/Xba I消化后者质粒，然后克隆至sBG载体，获得sBG^2C。克隆2PCR产物(分别使用InsF和Ins400R引物和InsF和Ins800R引物)至sBG Nhe I/EcoR V位点获得sBG⁴⁰⁰和sBG⁸⁰⁰载体。克隆绝缘子的3’400片段至sBG^1c载体的EcoRV/BspEI位点获得sBG650载体。使用如下引物从pJCI3-1质粒PCR扩增3’400片段：3’400R(BspEI)和3’400F(EcoRV)。

使用如下的引物组合扩增不同大小的λ噬菌体DNA获得含有λDNA间隔子的载体：间隔子F1和间隔子R1，间隔子F1和间隔子R2以及间隔子F1和间隔子R3分别扩增150bp、550bp和950bpλDNA片段。使用Cla I和EcoR I限制性内切酶消化这三个PCR片段，并连接到pBS-1核心质粒中的EcoR I/Cla I位点。采用HincII H从pBS-1核心质粒消化400bp、800bp和1200bp的片段，对400bp片段使用XbaI，对剩余的两个片段使用Xba I和Xho I，并克隆至sBG载体中的EcoR V/Nhe I限制性。通过测序确认了所有的载体。所有的引物列表参见(图20E)。

实施例45

细胞系

鼠红白血病细胞(MEL)细胞系和293T细胞维持于鼠红白血病细胞(MEL)系和293T细胞维持在改良伊格尔培养基(DMEM，Mediatech公司)中，补充有10％热灭活的胎牛血清(FBS)(美国生物技术股份有限公司)。在含20％FBS和5mM的N，N'-六亚甲基二乙酰胺(Sigma)的DMEM中诱导分化MEL细胞，如前所述。为了获得单一构成的克隆，克隆了经转导的MEL细胞，并且通过PCR筛选β-球蛋白序列从而鉴定转导的克隆。通过qPCR鉴定单一拷贝克隆以获得慢病毒y-序列，在单一构成克隆上对cHS4核心序列进行PCR以确认原病毒中绝缘子的存在。

实施例46

HbA染色和FACS分析

如前所述，使用抗人HbA抗体染色。简而言之，室温下在4％多聚甲醛中固定细胞60分钟，使用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤一次，在100％甲醇中重悬沉淀5分钟。然后用PBS洗涤所固定的细胞，室温下使用5％脱脂奶粉封闭非特异性抗体(Ab)结合10分钟。然后，在PBS中洗涤细胞、沉淀并透化处理。将细胞分为2管，使用抗ζ-球蛋白异硫氰酸荧光素(FITC)(1μg/10⁶细胞)染色作为阴性对照或使用抗–HbA-FITC(0.1μg/10⁶细胞)(珀金埃尔默,PerkinElmer)室温黑暗中染色30分钟。在上FACSCalibur(碧迪公司，Becton Dickson)分析前，使用PBS作最终洗涤去除未结合的Ab。

实施例47

病毒制备

如之前描述的，通过293T细胞的瞬间共转染制备病毒，使用载体质粒、包装(Δ8.9或Δ8.2分别对激活或失活整合酶)和VSV-G包膜质粒。在转染后60小时收集含有病毒的上清并通过超速离心浓缩。在实验中同时包装所有载体。使用DNA酶和/或DpnI处理病毒以移除质粒DNA污染并20％蔗糖分层以获得纯化的病毒颗粒对载体生命周期进行针对性的实验，如结果所示。在25,000rpm下超速离心90分钟后从所有病毒上清将病毒浓缩1400倍。使用系列稀释的浓缩病毒通过感染鼠红白细胞(MEL)测定病毒滴度，通过流式细胞分选(FACS)辨别它们并分析它们的HbA表达。

实施例48

Northern印迹

转染后72小时使用RNA-STAT(Tel-Test公司,德克萨斯)从293T细胞中抽提总RNA。根据标准程序进行Northern印迹。使用³²P标记的β-球蛋白探针杂交印迹。

实施例49

RNA点印迹

使用QIAamp病毒RNA迷你试剂盒(凯杰公司，Qiagen，巴伦西亚，CA)根据说明书从相同体积浓缩的病毒中提取病毒RNA。简而言之，在高度变性条件下溶解病毒，然后结合到基于硅胶的膜。两个洗涤步骤高效地洗去污染物，用30μl DEPC-H₂O洗脱v-RNA。洗脱后室温下使用扩增级DNA酶I(Invitrogen)处理病毒-RNA 20分钟。在65°下孵育样品失活扩增级DNA酶。在65°下使用3体积的变性缓冲液(65％甲酰胺,8％甲醛,MOPS 1X)变性病毒RNA 15分钟。变性后，加入2体积的冰冷20X SSC，使用斑点印迹装置通过吸引将RNA结合到尼龙膜上。使用³²P标记的β-球蛋白特异性探针杂交斑点，X-射线胶卷曝光过夜。使用磷成像分析仪(Biorad,赫拉克勒斯,CA)对斑点进行定量。

实施例50

逆转录实验

裂解浓缩的病毒(1μL)和系列稀释产物(1:10,1；100,1:1000)，并按照“逆转录(RT)实验，比色”试剂盒(罗氏)说明书处理。简而言之，使用裂解缓冲液裂解浓缩的病毒颗粒，使用地高辛和生物素标记的核苷酸逆转录病毒RNA。检测和定量合成的DNA作为RT活性的参数，随后进行夹心ELISA实验：生物素标记的DNA结合到该被预先涂覆有链霉亲和素的微孔板模块表面上。在随后的步骤中，针对地高辛的抗体偶联于过氧化物酶(抗-DIG-POD)，结合到地高辛标记的DNA上。最后步骤中，加入过氧化物酶底物ABTS，使用ELISA读数器在405nm波长下对产生的颜色反应产物进行定量。颜色产物的数量直接相关于样本中RT活性的水平。

实施例51

P24实验

通过HIV-1p24抗原EIA试剂盒(Beckman Coulter)检测P24抗原浓度。简言之，将系列稀释的病毒裂解并孵育到p24抗原包被的微孔板，随后根据制造商的建议洗涤。用分光光度计在450nm的波长进行测定颜色吸光度。一式两份进行p24检测。

实施例52

Southern印迹

为了分析我们感染的MRL细胞原病毒的整合，扩增它们21天并使用凯杰(Qiagen)血液和细胞培养DNA迷你试剂盒(凯杰)抽提DNA。使用Afl II(在LTR内切割的酶)消化10μg的DNA。为了测定病毒线性DNA的存在，感染MEL细胞72h后抽提基因组DNA，并使用Stu I限制性酶切，该酶在原病毒中酶切两次。在0.8％琼脂糖凝胶上分离DNA，转到尼龙膜上，使用β-球蛋白片段过夜探测。

实施例53

对RT产物和2LTR环进行实时PCR

在DMEM培养基中，在8μg/mL聚凝胺存在的情况下，使用相同数量的p24转导具有sBG和sBG-I载体的MEL细胞。在不同时间点收获细胞(0.5h、3h、6h、8h、12h、24h、48h、72h)，使用凯杰血液和细胞培养DNA迷你试剂盒(凯杰)抽提DNA。使用未转导的DNA稀释来自单一拷贝MEL克隆(通过Southern确认单一构成)的基因组DNA(50ng)，以产生拷贝数标准(1-0.016拷贝/细胞)。使用来自应用生物系统，(Applied Biosystems，福斯特城,CA)的引物专门软件(Primer Express Software)设计引物和针对RT产物的探针。早期RT产物(R/U5)qPCR实验的引物和探针序列是：正向引物5’-GAACCCACTGCTTAAGCCTCAA-3’，反向引物：5’-ACAGACGGGCACACACTACTTG-3’。使用TaqMan MGB探针进行反应：5’-AAAGCTTGCCTTGAGTGC-3’。对中间RT产物(U3/R)qPCR实验的引物和探针序列是：正向引物5’-GAACCCACTGCTTAAGCCTCAA-3’，反向引物:5’-ACAGACGGGCACACACTACTTG-3’。使用TaqManMGB探针进行反应:5’-AAAGCTTGCCTTGAGTGC-3’。对中间RT产物(U3/R)qPCR实验的引物和探针序列是：正向引物5’-CCCAGGCTCAGATCTGGTCTAA-3’,反向引物:5’-TGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTT-3’。使用TaqMan MGB探针进行反应:5’-AGACCCAGTACAAGCAAAAAGCAGACCGG-3’。对于晚期RT产物实验(psi)，设计的引物能够识别原病毒的ψ区域：正向引物：5’-ACCTGAAAGCGAAAGGCAAAC-3’,反向引物:5’-AGAAGGAGAGAGATGGGTGCG-3’。使用TaqMan探针进行反应:5’-AGCTCTCTCGACGCAGGACTCGGC-3’，使用TAMRA染料淬火。使用鼠apoB基因对照对负载进行标准化。循环条件为50℃ 2min，95℃ 10min，然后95℃ 15s 40个循环，60℃ 1min。对2LTR环的引物和探针如前所述。根据应用生物系统7900HT快速实时PCR系统基本单元(Applied Biosystems 7900HT FastReal-Time PCR System Base Unit)对96孔板的热循环说明进行PCR混合物热循环。

实施例54

综述

镰状细胞性贫血(SCA)产生于球蛋白基因的点突变(β^S)，导致镰状的血红蛋白(HbS)。HbS基于脱氧作用聚合导致镰形RBC阻塞微脉管系统。SCA患者有间歇性急性血管阻塞和累积器官损伤，寿命减少到42至58.5年。此外还有镰状、过度溶血和慢性炎症的状态存在。SCA的患者有每年约7.5万名住院，导致每年仅在美国所估计的开支就有$12亿美元。在世界范围内，SCA是发病率仅次于地中海贫血的单基因疾病，在非洲每年出生20多万儿童(带病)。

目前的治疗包括对偶发镰状的支持治疗，服铁螯合剂同时长期输血，和羟基脲诱导胎儿血红蛋白(HbF)。这些疗法影响疾病的发病率，但其效力不同并且取决于对非确切治疗方案的依从性。匹配的异体造血干细胞(HSC)移植有治疗效果，但受限于匹配的相关供体的可获得性，并且有潜在的严重并发症。187例SCA移植的荟萃分析显示受体患者中6％至7％的条件相关的周期移植死亡率，7％至10％的急性排斥反应，和13％至20％的慢性移植物抗宿主病(GVHD)。

自体HSC基因治疗后移植可能产生一次性治愈，避免不良免疫后果，而且不受限于供体的可获得性；它也可以不需要骨髓抑制预处理方案，因而具有较低的毒性。校通过转基因校正SCA的HbF/抗-镰状球蛋白的量是未知的。

出生后HbF的表达可以治疗，新生儿镰状RBC中的HbF的保护作用及具有遗传的和持续的HbF和SCA的患者证实了这点。能够校正该病理生理情况的基因校正的HSC比例、外源表达HbF的量、和F细胞比例是未知的。已经证实，使用携带β-球蛋白基因和基因座控制区(LCR)元件的慢病毒载体体外完全校正了人类重型地中海贫血和体内异种移植小鼠。在这份报告中，该β-球蛋白慢病毒载体被修饰为编码γ-球蛋白外显子，并且转导了鼠镰刀造血干细胞。功能性校正的特点，第一，对RBC镰状、半衰期和变形性有仔细且详尽的量化，具有镰状至正常的移植和高HbF生产性，以定义校正参数。其次，使用减低强度预处理和不同转导HSC的百分比，在具有显著器官损伤的镰状小鼠中进行移植，并证明校正镰状RBC和改善SCA中器官损害所要求的(1)基因校正的HSC、(2)HbF、及(3)F细胞的比例，和(4)HbF/F细胞的百分比。

实施例55

载体

已证明，在表达“成熟样”球蛋白的红细胞中，携带慢病毒载体的β-γ-球蛋白杂交基因，I8Hβ/γW,11表达高γ-球蛋白mRNA。使用定向位点突变将所有β-球蛋白的编码序列变为γ-球蛋白，并且γ-β-球蛋白杂交基因、和LCR元件被克隆在病毒转录单元的相反方向，以产生sGbG慢病毒载体。用293T细胞的共转染制备病毒。

实施例56

鼠HSC富集

从6-20周龄BERK镰状小鼠收集骨髓，并用生物素化的CD5、CD8、B220、Mac-1、CD11b、GR-1和TER-119抗体和磁珠进行谱系耗竭(lineage depleted)。使用针对Sca-1、c-kit的抗体对无珠细胞染色。在FACSVantage(BD生物科学)分选7-AAD^-、Lineage^-、c-kit⁺然后是Sca-1⁺(LSK细胞)的细胞。所有实验均使用伯克利转基因镰状小鼠和C57/BL6小鼠，根据辛辛那提儿童医院医学中心批准的方案进行。

实施例57

转基因和骨髓移植

因为易于移植并且11.75Gy辐射后正常受体(9.5^+/-0.6周龄)容易得到，对BERK3C57Bl/6小鼠进行骨髓抑制移植。辐射控制实验表明，受到8至9Gy辐射的BERK小鼠在没有接受LSK细胞的情况也能存活；并且致死剂量比在C57Bl/6小鼠中低。受到超过10.5Gy的BERK小鼠，在没有接受LSK细胞时会死亡；那些给予LSK的则长期生存。BERK小鼠是难以在给定时间大量繁殖，因此使用2只小鼠/辐射剂量水平以确定亚致死剂量。所有BERK受体(12.9^+/-0.4周龄)接受3次周围移植RBC输注(1-7天)。移植1年后比较BERK受体和没有接受移植的12周龄BERK小鼠的器官病理。比4Gy的经典降低强度辐射剂量高的辐射在很大程度上允许供体HSC嵌合。使用了一系列的MOI来改变移植中转移的供体HSC比例。LSK细胞预刺激过夜，并转移两次，以30MOI对BERK3C57BL/6移植，30至100MOI对BERK→BERK的移植持续22至24小时；10000到24000LSK细胞和未转导LK细胞共移植到C57BL/6或BERK小鼠受体。

实施例58

拷贝数分析

通过使用先前描述的引物和探针，通过实时聚合酶链式反应对基因组DNA进行拷贝数分析。

实施例59

血液学分析

在Hemavet 950FS(德鲁科学，Drew Scientific)的鼠设置下进行血液分析。网织红细胞分析进行如下：混合0.1μL血液和200μL的BD网状细胞-COUNT试剂(碧迪公司)，在室温下孵育30分钟，通过流式细胞术(FACS)进行分析。

实施例60

血红蛋白分析

如前所述，在醋酸纤维板中进行血红蛋白电泳。使用Alliance 2690HPLC机器(Waters)进行离子交换高效液相色谱(HPLC)，使用PolyCATA色谱柱(产品编号：3.54CT0510；Poly LC Inc)。

实施例61

红细胞功能分析

通过在连续场中对500RBC进行计分计算不可逆的镰状细胞(ISC)。使用张力计进行分级脱氧。使用激光辅助光旋转细胞分析仪(LORCA；RR Mechatronics)测定RBC变形性。

实施例62

RBC半衰期

间隔1小时，分2次向小鼠注射300μL PBS中的3mg硫代NHS生物素(Sigma)；在一系列时间抽取2至5μL血液，用APC-Cy7-共轭链霉亲和素染色。

实施例63

组织学

收集脾、肝、骨、脑、肾，并置于5mL 10％福尔马林中。石蜡块切片并用苏木精和伊红染色。

实施例64

基因治疗后的高HbF和骨髓抑制移植对SCA的校正

sG^bG载体携带γ-球蛋白外显子和β-球蛋白非编码和调节区域。基于之前研究的sBG载体，其表达高水平的人β-球蛋白，13个sG^bG-转导的LSK细胞(来自伯克利镰状(BERK)小鼠)被移植到经致死剂量辐照的(骨髓抑制)正常C57Bl/6J小鼠(称为sG^bG小鼠)。模拟转导的BERK LSK细胞(来自相同的骨髓池)移植后产生了具有SCA的小鼠。sG^bG鼠中大部分的RBC表达HbF。只对具有100％供体(HbS⁺)RBC的sG^bG小鼠，通过电泳和HPLC分析没有发现剩余的受体鼠血红蛋白，进行了血液学、功能和病理分析。具有小比例的受体鼠RBC的sG^bG小鼠，仅用来分析HbF/载体拷贝和转导的HSC频率。在追踪6个月的首次小鼠中和追踪7.5个月的二次小鼠中，经FACS定量的血液中HbF(HbF/HbS+HbF)的百分比约为40％(图21A)。三分之二的RBC为F细胞；它们的比例在首次和二次受体中同样稳定(图21B)。F细胞的比例和载体拷贝数与HbF相关(图21C-D)。合并来看，这些数据表明，在大多数RBC中sG^bG载体显著表达HbF且稳定长期表达。

实施例65

高水平的HbF导致持续的血液校正

图21E示出了在sG^bG小鼠中血液学参数的改善。网织红细胞的比例从模拟小鼠中的约50％下降到sG^bG小鼠中的约15％(P<0.005；图22A)。对贫血的校正有12周，持续贯穿移植后时期(图22B-C)}。

SCA人患者和BERK小鼠的高白细胞(WBC)计数反映这种疾病的炎症基线。sG^bG小鼠中WBC回到了正常水平(图22D，21E图)。

值得注意的是，模拟小鼠中WBC计数比BERK小鼠(没有经受移植的)更低，可能是因为在前者中，镰状HSC被移植于一个正常的“非炎症”的C57/BL6背景。事实上，移植6周后，模拟组小鼠的WBC计数接近正常，然后逐渐升至SCA中可见的高水平(图22D)。总体而言，血液学参数显示出显著的改善，以接近正常水平，并且在首次和二次sGbG小鼠中长时期内该改善是稳定的。校正的程度与F细胞(图22E-H)和HbF的比例相关(数据未示出)。高水平的HbF改善了镰状小鼠RBC的功能参数。(1)镰状：在sG^bG小鼠中不可逆镰状细胞(ISCs)相比于BERK对照的12％加减0.8％和模拟小鼠的10.2％加减0.3％，显著减少至2.3％加或减0.7％(图23A-B)。代表性的sG^bG鼠血液中的脱氧作用显示了镰状显著减少(图23C)。一个系统的定量显示缺氧加重的sG^bG小鼠中镰状RBC的比例的显著下降(图23D)。(2)RBC膜可变形性：正常的RBC在低剪切应力(3帕斯卡[帕]，小血管中代表性剪切应力)容易变形。镰状RBC即使在高剪切应力下(28Pa；大血管中代表性的剪切应力)，也具有相对刚性的膜且可变形性显著降低。sG^bG小鼠的RBC的变形性有明显改善，虽然它没有达到正常水平(图23E)。这可能反映了循环的不包含HbF的镰状RBC的比例。(3)RBC存活：人类镰状RBC的生存率比正常RBC小一个数量级。在SG^bG和模拟/BERK镰刀小鼠中测定了减少50％(半衰期)的时间。在SG^bG红细胞的总生存期显着提高，与BERK或模拟小鼠(图23F)，SG^BbG小鼠RBC的减少50％的时间大约长4倍。(4)RBC溶解：通过在血液中测量乳酸脱氢酶(LDH)来检测血液中RBC溶解，其从模拟小鼠中的2706加减148mg/dL的减少到sG^bG小鼠中的1286加减345mg/mL(n＝5；P<0.004)。

实施例66

HbF的高水平预防SCA相关的慢性器官损伤

在第24周，骨髓、脾脏、肝脏和肾脏显示完全的器官病变预防。与红细胞严重增生模拟小鼠的去滤泡结构相比，在骨髓和脾脏中增生红细胞有所降低、脾脏大小降低并且脾脏的滤泡结构得以保存，。模拟小鼠中观察到的肾小管萎缩病灶和部分的肾小球梗死，没有出现在sG^bG鼠肾脏中。模拟小鼠肝脏中看到的梗死和髓外造血，在sG^bG小鼠肝脏中不存在(图23G总结了各组小鼠的数据)。总体而言，除了轻度红细胞增生，在sG^bG小鼠中没有观察到器官病变。

实施例67

高HbF表达改善了镰状小鼠的存活

BERK镰状小鼠的寿命显著降低，就像现代治疗之前的SCA人类患者。

Kaplan-Meier生存曲线显示，对比于模拟小鼠中20％的存活率，sG^bG小鼠在24周时100％存活(n＝14，P<0.001)。

实施例68

校正SCA要求的最低参数

骨髓抑制预处理允许基因校正供体HSC的非竞争性再增殖，从而导致高转基因修饰的HSC植入和转基因表达。据推测，通过骨髓抑制预处理达到高水平γ-球蛋白表达对于校正可能不是必要的，如果这样，可能会降低移植相关的发病率。

降低强度移植是通过移植基因修饰的BERK LSK细胞至经亚致死量辐照但具有显著高辐射剂量的BERK小鼠。移植中经转导的HSC和载体拷贝/细胞的比例通过具在MOI(30-100)范围内的转导LSK细胞来改变。由于BERK RBC的半衰期为1.5至2天(图24G-H)，小鼠在外周移植期间进行输血并在12周后进行分析。对小鼠进行了1年的三个连续实验。基于第18周HbF的百分比，将sG^bG小鼠分为3组并进行分析：HbF＝0％(模拟,n＝4),HbF低于10％(称为sG^bG<10；n＝17)，和HbF为10％或更多(称为sG^bG≥10；n＝9)；(图24A)。选择10％的HbF截止值，是因为该值似乎是反映疾病校正的HbF阈值水平：与下面描述的sG^bG≥10的相比，sG^bG<10鼠显示更高的死亡率和不一致的血液校正。各组中鼠数量随时间的变化主要由于在无/低HbF鼠中与增加的SCA相关死亡率。在第12、18、和24周，sGbG≥10组的鼠分别具有16％(±1.2％)、17％(±1.8％)、和21％(±2.3％)的HbF，而sG^bG<10组的鼠分别具有5％(±1.4％)、4％(±0.6％)、和4％(±0.5％)的HbF，持续稳定至1年(图24B)。相比于sG^bG<10小鼠(30％±9.4％)，F细胞再增殖在sG^bG≥10小鼠中显著较高(65％±14％)(图24C)。sG^bG≥10小鼠具有2至2.5载体拷贝/细胞，而sG^bG<10小鼠具有1.4拷贝/细胞(图24D)。

实施例69

随降低强度移植发生的血液学改善

由于在早期移植后期间持续输注RBC，在第18周时血液学参数稳定。sG^bG≥10组小鼠中血液学参数有显著改善(图23G)，与此相反的是在sG^bG<10小鼠中仅有较小的和不稳定的改善。

实施例70

随降低强度移植发生的RBC功能改善

镰状：sG^bG≥10小鼠ISC具有非常显著的降低(P<.005)，而与模拟/BERK对照相比，sG^bG<10小鼠ISC有显著地降低(P<.05,图24E)。与来自sG^bG<10或模拟/BERK鼠的RBC相比，当暴露于分级的缺氧，来自sG^bG≥10小鼠的RBC显示镰状降低(n＝20,P<.01；图24F)。相对的，在sG^bG<10和模拟/BERK小鼠之间的镰状没有显著区别。(2)RBC膜可变形性：出乎意料地，尽管来自sG^bG<10小鼠和模拟/BERK小鼠的RBC具有相似程度的缺氧镰状，在sG^bG<10小鼠中RBC的变形性具有轻微的改善。然而，由于变异较大，在模拟/BERK小鼠中这些区别并无统计上的显著性(图24G)。相对的是，sG^bG≥10小鼠中的RBC可变形性具有持续的显著改善(P<.001,图24H)。可变形性模式表明改进的RBC可以流经大血管和微血管。(3)RBC存活：BERK小鼠的RBC半衰期是1.5天。sG^bG小鼠的具有1％、3％和7％HbF的RBC具有轻微提高的半衰期(2天)。两个具有18％HbF的sG^bG小鼠显示了6天的RBC半衰期，增加了4倍，与骨髓抑制移植模型中携带40％HbF的小鼠中看到的相似。

综上所述，当HbF的产量超过总血红蛋白的10％，sG^bG载体导致显著且一致的SCA血液学和功能校正。值得注意的是，在表型上的改善与骨髓抑制预处理所实现的相当。

实施例71

当HbF浓度超出10％时器官病变的显著改善

BERK→BERK移植模型的一个独特特征是在受体在移植时存在显著的镰状病理(当它们经历移植时使用与受体小鼠年龄相当的BERK对照来测定)。因而，需要评估基因治疗后器官病变的逆转可能性。与未经历移植的3月龄BERK小鼠比较了移植后约50周存活的小鼠的器官病变(图25A；图25C)。sG^bG<10组小鼠显示器官病变上的轻微改善：脾脏的重量轻微降低(sG^bG<10中717±162mg相比BERK/模拟鼠中870±71mg；P值,NS)。骨髓和脾脏呈中度至重度红系增生；肝脏有梗死和髓外造血；和肾脏偶尔呈现局灶节段性病变、局灶性肾小管萎缩和血管充血(图25D)。相比之下，sG^bG≥10小鼠中看到了器官病变的急剧逆转：脾脏重量减少了50％至363mg加减85mg、脾滤泡保留、骨髓和脾脏轻度红系增生。值得注意的是，没有检测到肝梗死和肾脏病变，除了一只小鼠具有单侧局灶性肾小管萎缩病灶。总体而言，sG^bG≥10小鼠表现出器官病变的校正。与3月龄BERK控制相比，15月龄的sG^bG小鼠中没有器官病变，表明在降低强度的移植设置中，含有sG^bG载体的基因治疗可以防止任何进一步的器官损伤，并且在移植时存在的器官损伤很可能通过再生逆转。

实施例72

存活

与sG^bG<10或模拟小鼠相比，sG^bG≥10小鼠中总体存活有显著提高(图25B；P<.05)。实际上，在第24周，sG^bG≥10小鼠的存活情况与随访24周的清髓移植模型中具有约40％HbF的小鼠存活情况相当。与模拟小鼠相比，sG^bG<10小鼠中早期存活有一些改善。然而，1年后，sG^bG<10小鼠的存活相对模拟小鼠没有差别。

实施例73

F细胞和HbF/F细胞对于RBC存活和SCA校正是关键的

使用生物素表面标记和细胞内HbF染色，在相同动物中研究了F细胞和非F细胞的存活，这将允许对改善镰状RBC存活和可变形性所需要的HbF/F细胞进行量化。如预期那样，F细胞表现出选择性的生存期延长(图26A)。平均的HbF/F细胞20在BERK3C57Bl/6模型sG^bG小鼠中为64％(在这些小鼠中，HbF为41％±5％，F细胞为64％±6％)。在降低强度的移植模型中，sG^bG 10小鼠具有32％的HbF/F细胞(在这些小鼠中，HbF为21％±2％，F细胞为65％±14％)，和sG^bG<10小鼠具有13％的HbF/F细胞(HbF，4％±0.1％；F细胞，30％±9.4％)。注意，在骨髓抑制模型sG^bG小鼠和sG^bG≥10小鼠中具有相似的F-细胞再增殖性(64％-65％)，这提示32％的HbF/F细胞就足以校正镰状表型。然而具有13％HbF/F细胞和30％F细胞的sG^bG<10小鼠具有不一致且不显著的疾病表型的改善。

因而，通过HbF/F细胞百分比分组，测定了小鼠中F细胞的半衰期。具有低(16％；n＝2)、中度(33％；n＝4)、和非常高的(89％；n＝2)的HbF/F细胞的sG^bG小鼠经生物素注射，并随后进行外周血采样。经测定，具有低HbF/F细胞的小鼠的RBC半衰期与BERK对照相比没有改善(图26B)，那些具有33％HbF/F细胞的半衰期则改善了3至4倍，并且，具有非常高HbF/F细胞数量的小鼠显示了同正常小鼠相似的存活情况。这些数据证明了如果镰状RBC中的三分之一的血红蛋白是HbF，就会有RBC生存的显著改善。具有这些水平HbF/F细胞的小鼠表现出约65％F细胞，高于10％的HbF。

为了确证循环F细胞的百分比对总RBC可变形性的影响，将自骨髓抑制和降低强度实验的小鼠(n＝34)分成了3组：具有低于33％循环F细胞的、33％至65％F细胞的、66％或更多F细胞的小鼠，并检测RBC可变形性。图26C中仅标绘了来自低(3Pa)和高(28Pa)剪切速率的数据。具有多于66％的F细胞的小鼠在高或低剪切力下RBC可变形性均具有显著的改善(P<.01)。具有33％至66％F细胞的小鼠仅在高剪切力下具有显著的RBC可变形性改善(P<.01)。具有低于33％的F细胞的小鼠在低或高剪切力下RBC可变形性的改善不一致，并且与模拟鼠相比差别不显著。这些数据对镰性细胞疾病校正所需的HbF/F细胞、F细胞的比例、和总体HbF的关键数量进行了量化。

实施例74

表型校正所需的转导HSC的比例

在两个模型的第6个月通过二次脾集落生成单位(CFU-S)实验分析了sG^bG鼠中sG^bG转导的HSC的比例(图27A-B)。在BERK→BERK小鼠中第6个月进行骨髓穿刺，随访1年。通过HbF表达测定转导的CFU-S的比例。之前已经显示，所有的载体阳性CFU在编码β-球蛋白的同一载体中表达转基因。骨髓抑制预处理组中的sG^bG小鼠具有16％至87％的sG^bG转导的CFU-S(平均HSC转导约为～50％)，降低强度组的那些具有5％至60％转导的HSC(平均HSC转导为约30％)。在降低强度模型中注意到HSC转导是高估的，次于sG^bG<10％小鼠中前6个月的更高死亡率。

重要的是，具有16％、20％、和22％转导的CFU-S的3个小鼠具有高于10％HbF(HbF分别为20％、11％、和18％)并显示完全的表型校正。在第24周对骨髓细胞进行载体拷贝数分析，分别使用骨髓抑制预处理和降低强度预处理模型的经历移植的sG^bG鼠中显示1至3拷贝/细胞和1至2.5拷贝/细胞。当HSC转导进行了校正，有1.5至5拷贝/细胞。

实施例75

人CD34⁺细胞转导

该疾病中对基因治疗有效的基因修饰HSC百分比是关键的。对SCA骨髓的体外研究仅可在小范围内进行，且仅祖细胞中而不是HSC中显示校正。根据长期分析，SCA人源化模型表现出了HS校正。通过注射人地中海贫血骨髓CD34⁺细胞产生的极其有限量的RBC对镰状的研究是不可能的。因此，使用GFP慢病毒载体和严重联合免疫缺陷型再增殖实验，将转导至正常人CD34⁺细胞的慢病毒优化到了临床前的扩大规模。粒细胞集落刺激因子动员的经GFP慢病毒载体转导的外周血CD34⁺细胞被移植到非肥胖型糖尿病(NOD)/LtSz-scid IL2Rγnull(NSG)小鼠。此处，模拟小鼠是选择后立即接受未转导CD34⁺细胞移植的那些，作为转导对移植和克隆形成影响的对照。在第6周，平铺衍生自NSG小鼠骨髓的CFU，并对基因标记克隆的百分比分析36个个体CFU/鼠。18小时转导没有影响移植或克隆形成(数据未显示)。在SCID再增殖细胞实验中观察到了77％基因转导，与之前人地中海贫血CD34⁺细胞中的数据相似。

本研究的数据表明HSC中慢病毒递送β-球蛋白调节控制元件下的人γ-球蛋白产生足够的出生后HbF表达以校正小鼠中的SCA。使用降低强度预处理和不同MOI减少HbF和转导HSC的数量，以评估校正所需的关键参数。功能和血液RBC指数、器官病变和寿命的系统量化对测定逆转镰性表型所需的最小量的HbF、F细胞、HbF/F细胞和基因修饰的HSC是至关重要的。

结果显示：(1)当HbF超过10％，疾病发生改善，F细胞构成了循环RBC的三分之二，并且HbF/F细胞是RBC中总血红蛋白的三分之一；并且当约20％sG^bG修饰的HSC再增殖于骨髓中。(2)在首次或二次移植受体中基因校正长期持续。(3)给出了在体内模型中测定对造血疾病校正的最小HSC嵌合的方法，这将有助于设计细胞剂量和预处理方法，以达到在人临床中等价的HSC基因校正。

本研究的一个创新方面是，第一次发表了校正遗传缺陷所需的基因剂量和基因修饰的造血干细胞剂量。表达大量胎儿/抗镰性血红蛋白将无疑校正的疾病，如其他人展现的，但实际上不可能应用在临床中。作为一个例子，对腺苷脱氨酶(ADA)缺陷的最初的基因治疗没有采用预处理，没有疗效，即使少数基因标记的干细胞植入，并且对基因校正淋巴细胞的选择性优势对ADA的消退是明显的。在随后的试验中，移植前使用4mg/kg白消安，作为预处理，产生充足的基因校正的干细胞剂量和基因修饰的T细胞。虽然这些开拓性的研究将宝贵的信息提供给我们，他们强调了在开始临床试验之前确定基因校正的阈值的重要性。

虽然疾病在1至3个拷贝/细胞得到校正，目前的研究表明，转导的干细胞百分比在致死辐照/移植的设置中是非常高的(通过严格的二次CFU–S实验分析的平均HSC转导是50％)。该水平的HSC转导将可能无法在临床设置中达到除非进行清髓。

因此开发了新的模型(BERK至BERK移植)以确定所需最小的转基因，并回答了12周龄具有显著镰状病变小鼠中SCA校正相关的问题(图25)。值得注意的是，其他团体使用的镰性至正常的骨髓抑制移植，显示了SCD的校正，是一种预防疾病模型，其中在移植时间内没有潜在病变。本研究表明，如果基因校正造成10％以上的HbF，就可以修复先前存在的病变。

BERK小鼠有一定程度的地中海贫血。因此，在采用这种模型对镰状细胞贫血的基因治疗进行研究中存在的一个问题是地中海贫血的校正将掩盖HbF抗镰性效果产生的改善。令人惊奇的是，在sG^bG<10或sG^bG≥10小鼠中MCH没有显著地变化，包括具有高达89％的HbF/F细胞的小鼠(如本文所公开的)。这些结果令人惊讶，但表明RBC中镰状的校正不是继发于地中海贫血的修正，如在鼠地中海贫血模型中看到的，其中看到了MCH随着HbF的4％或更高的增加而增加。可以想象，HbF是以HbS为代价产生的。

虽然BERK小鼠只携带人血红蛋白，小鼠RBC中总血红蛋白是人RBC的三分之一。因此，HbF和HbF/F细胞被表示为百分比，而不是绝对量，从而最好地将鼠数据和人比较。HbF从3.6％至13.6％的增加，已显示可以减少对地西他滨患者的急性镰状病理情况。相似的对镰状病理情况的改善发生于在羟基脲响应性的患者25％或更多的HbF/F细胞中。这里提供的数据，表明33％HbF/F细胞的改善，与这些报道是一致的，但更接近于具有SCA的婴儿的RBC，其中在第10至第12个月不到三分之一的HbF/F细胞被认为是细胞内镰性聚合的阈值。当HbF超过10％时，sG^bG载体生产的γ-球蛋白的最显著影响是慢性器官损害的缺失和镰状小鼠存活的提高。已由对羟基脲的多中心研究证实，具有高HbF的患者改善了存活情况，。sG^bG载体表达的HbF与有效的羟基脲治疗相当甚至更好。一次性校正的潜力，其中对羟基脲的响应能力和对终生日常施用的耐受不再是限制因素，将是基因治疗的一个巨大的优势。事实上，我们没有预期我们会得到与基因治疗相同的结论，如来源于集体性知识(1)转基因小鼠，其中每个RBC具有相同数量的HbF，虽然我们在SS RBC上利用了HbF；(2)嵌合移植，其中正常数量的HbA产生RBC(AA RBC)和SS RBC17,37,38混合存在；或(3)羟基脲SCD患者，其中羟基脲诱导的巨红细胞症将稀释HbS并降低对镰状的阈值。预计了对F-细胞再增殖和SCA表型校正所需要的镰性HSC基因校正的更高的阈值，因为HbF是外源性加入到具有正常数量HbS的镰状细胞的。值得注意的是，尽管在转基因/嵌合体中存在这些明显的差异，用外源性γ-球蛋白表达的结论是相似的：实际上，在RBC中以33％至高达89％的浓度表达外源性HbF没有显著地增加MCV或MCH中，但校正了镰状。该数据表明，HbF的遗传递送降低了内源性的HbS。

在致死辐照/移植情况中转导HSC的百分比是非常高的(平均50％，在第24周通过严格的二次CFU-S实验分析)，在临床中很难达到该数值。然而，BERK→BERK移植模型显示20％的自体HSC校正可能会满足镰状、器官病变、和存活显著的改善需要。但是，由于基因修饰的HSC在这种疾病中没有生存优势，有效的基因治疗所需的基因修饰HSC的百分比是否能够获得是需要确定的关键。人HSC传导较高一直是使用传统的伽玛逆转录病毒载体的基因治疗的限制因素。慢病毒载体能够克服该障碍：在肾上腺脑白质营养不良中使用慢病毒载体已经显示出了20％的长期转导。优化了转导至CD34+细胞的慢病毒转导，使用SCID-再增殖细胞实验，并且在SCID-再增殖细胞中平均达到了约75％的基因转导，与之前人类地中海贫血CD34+细胞中的数据相似，其中免疫-缺陷小鼠在移植后3至4个月看到了70％的转导。值得注意的是，SCID小鼠中该水平的基因导入是令人鼓舞的，的确比临床前研究中使用肾上腺脑白质营养不良慢病毒载体的NOD-SCID小鼠中观察到基因转移要高。

使用这种方法的基因治疗还可以克服传统同种异体骨髓移植/降低强度移植的毒性和免疫后果。在正常和镰状骨髓小鼠移植中的错配混合嵌合显示，器官损害的纠正通常需要接近完全的嵌合体。令人鼓舞的是，在临床系列中，降低强度的预处理(RIC)移植和8mg/kg白消安连同氟达拉滨、抗胸腺细胞球蛋白、和SCA中患者全身淋巴辐照，在移植后2至8.5年已经显示出平均78％的同种异体移植，SCA表型得以纠正。甚至在同种异体RIC设置中(其中能够发送免疫排斥)，供者嵌合的这种高水平，表明高基因转移效率至自体CD34+细胞随后进行RIC可以是一个潜在安全的骨髓抑制预处理方案。使用NOD-SCID再增殖细胞试验，以及小鼠中具有1.3至1.5拷贝每细胞的表型校正和约20％基因标记的CFU-Ss证实了人类干细胞/祖细胞中77％的基因转移效率(图27)。

显著地，校正发生在1至3载体拷贝每细胞，这是临床上可以实现的目标。具有染色质绝缘子侧翼的sG^bG病毒有望增加HbF/载体拷贝2至4倍。在实验模型中，虽然绝缘子元件是否降低插入肿瘤发生的风险是未知的，但绝缘子表现为降低了克隆优势。观察到的随机整合型载体插入肿瘤发生的风险显示，使用慢病毒载体要低于γ逆转录病毒属载体。当增强子元件仅在有限制的红细胞系中激活，其将进一步降低。

实施例76

镰状细胞疾病的基因治疗

既然HbF是具有最高抗镰效果的血红蛋白，使用慢病毒载体(sG^bG，携带正常人γ-球蛋白基因)在伯克利镰状小鼠中产生HbF。如本文所描述，设计了整合γ-球蛋白外显子和β-球蛋白非编码区域和调节元件的慢病毒载体(sG^bG)。在sG^bG载体转移到HSC和骨髓抑制移植后，该载体显示了对伯克利镰状小鼠的镰状表型的完全校正骨髓抑制(实施例65,图23A-D,图28，和表1)。图23A和B显示了小鼠血液中不可逆的镰状细胞减少，图23C和D显示对来自小鼠RBC进行的实验性镰状和镰状细胞的比例，和图28显示了成功基因治疗后小鼠存活的改善。

然后测定了使用降低强度移植的校正SCA病理所需的关键参数。在SCD小鼠骨髓抑制和移植后，观察到血液和功能性RBC参数、炎症、和器官病变的完全校正。在首次和二次移植受体中，校正得以长时间的维持。测定了使用降低强度移植校正SCA病变所需的关键参数。与模拟移植伯克利镰状小鼠20％存活相比，基因校正的伯克利镰状小鼠具有100％的6个月存活。

使用降低强度预处理和自体同源移植的模拟，将不同比例的基因修饰的伯克利镰状HSC移植到亚致死剂量辐照的伯克利镰状小鼠。确定了校正镰状细胞性贫血所需的基因校正的HSC、HbF、含有HbF的RBC(F-细胞)和HbF/F-细胞的最小比例。使用15-20％基因修饰的HSC再植入伯克利镰状小鼠骨髓、约2载体拷贝每细胞、≥10％HbF、和>66％F细胞可以实现镰状表型的完全校正，包括器官病变和存活。使用15-20％基因修饰的HSC再植入伯克利镰状小鼠骨髓、约2载体拷贝每细胞、≥10％HbF、和>66％F细胞可以实现镰状表型的完全校正，包括器官病变和存活。

实施例77

β地中海贫血的基因疗法

通过携带人γ-球蛋白基因的慢病毒载体表达HbF已经在之前已有描述(Persons等.血液学(Blood)10:2175-83(2003)；Pestina等.Mol.Ther.17:245-52(2009))。为了证实sG^bG载体校正β-地中海贫血的能力，使用同镰状转基因小鼠中相同的方法处理地中海贫血小鼠(Hbbth3/+)。将经sG^bG(2x 20的MOI)转导两次(每次约8小时)的地中海贫血干/祖细胞(Lin-Sca+Kit+[LSK]细胞)移植到地中海贫血小鼠中。仅使用媒介同时处理对照(模拟)动物。将约10,000个转导的LSK+细胞和200,000辐照的Lin-Sca-Kit-细胞注射/共移植入经致死剂量辐照的地中海贫血受体鼠(700+375rad的分次剂量)。监控首次(移植)动物7-8个月，进行二次移植后随访总计18个月。

载体导致了增加的HbF至22±3％(平均+SEM)；其与地中海贫血表型相关(图29)。血红蛋白从模拟移植小鼠平均的8.8±0.2g/dL的增加至sG^bG移植小鼠的12.5±0.5g/dL(图29A)；红细胞压积从31.8±0.3提高到42.1±1.07(图29B)。伴随网状细胞过多症从20.8±0.3％降低至8.7±1.4％(图29D)。同样校正了地中海贫血中的小红细胞，MCV从38.1±0.3增加到了45.3±1.7fl。随着时间的推移该校正是稳定的，并且在首次和二次(移植)小鼠中持续。

实施例78

具有优异抗镰状特性的改进型HbF表达载体

如上所述，>10％HbF的产生显示了对鼠模型中SCD表型的校正。而sG^bG载体有效地校正了伯克利镰状鼠模型中的表型(实施例65,图23A-D,图28；Perumbeti等.,血液学(Blood)114:1174-85(2009))，基因敲入镰状小鼠模型(UAB小鼠)远不如其有效，除非每个存在细胞中有非常高的载体拷贝数。

对人α-和β^S-球蛋白转基因转基因的伯克利镰状小鼠，和鼠球蛋白基因敲除以及人转基因导致球蛋白链生成不平衡。与β^S球蛋白链相比，伯克利镰状小鼠具有相对过量的人α球蛋白链，允许sG^bG载体产生的γ-球蛋白容易地形成HbF(α₂γ₂)，在β^S球蛋白存在下同样结合α-球蛋白形成HbS(α₂β^S ₂)。换句话说，UAB小鼠中，是敲入人α替换鼠α球蛋白并敲入人β^S替换鼠β^主球蛋白基因，产生人球蛋白替换鼠球蛋白。这些小鼠因此具有完全平衡的人α和β^S链和纯合子镰状细胞贫血类似患者(Hb SS疾病)。纯合子SCD患者(和UAB敲入镰状小鼠模型)已经平衡(等量的)α和β^S分子，并且遗传引入的γ-球蛋白同β^S竞争α球蛋白。因此，需要远过量γ球蛋白竞争过β^S球蛋白以形成HbF。

因此，在伯克利镰状小鼠中，该载体产生的γ-球蛋白有效结合多余的α球蛋白以形成HbF，不受β^S球蛋白的大量竞争，其结合α球蛋白形成HbS。因此，在伯克利镰状小鼠中，用临床上可实现的载体拷贝，观察到了疾病校正。然而，在UAB小鼠中，由于等量竞争β^S球蛋白链，α球蛋白链成为速率限制。因此，需要高水平/过量载体来源的γ球蛋白，以便能够进行竞争过β^S球蛋白以形成HbF。

针对该问题，对转基因方案和策略进行了数个改变。在外显子1中50bp进行了G→A点突变从而对γ-球蛋白基因进行修饰。该修饰将氨基酸甘氨酸(GGC)改变为了天冬氨酸(GAC)以改善其对α-球蛋白的亲和力而并不改变其功能特性，以便RBC中以比HbS高的效率形成HbF。然后在镰状小鼠中，比较了原始γ球蛋白载体(sG^bG)和存在点突变的γ球蛋白编码序列(sG^bG^M)的能力。图30中标绘了对sG^bG^M的注释载体图谱，具有在图30和31鉴别出的不同序列的区域。图31显示了sG^bG^M序列。

在伯克利镰状小鼠和UAB镰状小鼠中进行了sG^bG和sG^bG^M载体的对比研究，其中谱系缺失、Sca+Kit+(LSK)细胞(在造血干细胞中高度富集)被分选并单独使用媒介(模拟)\sG^bG载体或sG^bG^M载体进行转导，并移植到亚致死剂量辐照的伯克利或UAB镰状受体小鼠，如之前对sG^bG效力的研究(Perumbeti等,血液学(Blood)114:1174-85(2009))。在移植后6、12和24周对小鼠抽血以评估血液学参数和HbF表达，然后每组6至8只随访6-12个月。图32显示了伯克利镰状小鼠第12周的数据，其证明了每载体拷贝中HbF优异的产量和来自sG^bG^M载体的网状细胞过多症的改善。

图33中显示了伯克利和敲入UAB镰状小鼠的对比。显示的数据是6个月的分析结果。来自sG^bG和sG^bG^M载体的每载体拷贝产生的HbF数量显示于伯克利镰状小鼠(图33A)和UAB敲入镰状小鼠(图33B)。相比于两种镰状小鼠的sG^bG载体，sG^bG^M小鼠显示接近1.5-2倍更好的HbF形成能力，。值得注意的是，sG^bG^M载体的每拷贝产生的HbF的数量在伯克利小鼠中是具有sG^bG^M载体的UAB小鼠的两倍，显示如果存在过量的α-球蛋白链，则HbF四聚体易于形成，而如果α-球蛋白是限速的则难以形成这些四聚体。

sG^bG^M载体产生的HbF是功能性的，在两种类型的镰状小鼠中均显示对镰状的校正、网状细胞过多的显著降低、和血红蛋白的升高。sG^bG^M载体移植的UAB小鼠中观察到了贫血的校正，而sG^bG载体中没有。这些小鼠中的一些已经随访了将近一年，其表达是稳定的。当HbF水平相同时，与sG^bG载体相比，在sG^bG^M载体中观察到了更好的RBC半衰期和RBC膜可变形性的校正。图32显示尽管sG^bG载体具有30-35％的HbF水平(实心菱形,图32B)，小鼠仍然具有平均约15％的网织红细胞计数，而具有相似HbF水平(空心菱形)的sG^bG^M小鼠中网织红细胞计数为5％。这证明了尽管具有相似水平的HbF，该突变通过降低镰状同样改善了RBC的寿命。因此，工程化突变的伽马球蛋白载体同样产生优异的抗镰状HbF，提高了RBC的质量和寿命。相对于正常的HbF，突变HbF对器官损伤、RBC膜可变形性、RBC半衰期、和氧亲和性的影响，相关研究正在进行中，以确定HbF的该预料之外的优异特性背后的机制。

这些结果证明了sG^bG^M载体中点突变的γ-球蛋白基因阻止了镰状并因而延长了镰状RBC的半衰期，导致更低的网织红细胞计数(图33)。更高的HbF产量和降低的网状细胞增生导致血红蛋白的成比例的提高和镰状表型的血液学校正。sG^bG^M载体中没有在载体骨架或任何转录调控元件上作任何的改变。

以上描述的各种方法和技术提供了多种方式来实施本发明。当然，可以理解的是，描述的所有目标或优点不一定可以根据本文描述的任何特定实施例来实现。因此，例如，本领域的技术人员将认识到，可以以实现或优化本文教导的一个优点或优点组合而不需要实现本文教导的其它目标或优点组合的方式来实时本方法。各种有利和不利的选择均在本文中有提及。但应该理解的是，一些优选实施例具体地包括一个、另一个、或若干个有利特征，而其他的具体排除一个、另一个、或若干不利的特征，而还有其他的具体通过包含一个、另一个、或几个有利的特征来减轻本不利特征。

此外，本领域技术人员将认识到来自不同实施例的各种特征的适用性。类似地，以上所讨论的各种元件、特征和步骤，以及其他已知的对于每个这样的元件、特征或步骤的等价物，可以混合搭配，本领域中普通技术人员可以根据在此描述的原理实施该方法。在不同的实施方案中各种元件、特征和步骤中的某些将被明确包括而专门排除其他的。

虽然本发明已经在某些实施方式和实施例的上下文中被公开，本领域的技术人员应当理解，本发明的实施方式延伸超出具体公开的实施方式到其它可替代的实施方式和/或应用以及其修改和等同。

许多变型和替代性元件已在本发明的实施例公开。更进一步的变化和替代元件对本技术领域的技术人员是显而易见的。在这些变型中，但不限于，是基因的具体数目或治疗性产物的靶向、基因的类型、遗传病或缺陷的类型、以及具体的基因。本发明的各种实施例可以具体地包括或排除任何这些变化或元件。

在一些实施例中，数字表示成分、特性的量，例如分子量、反应条件等，用于描述和要求保护本发明的某些实施方案，在某些情况下通过术语“约”将被理解为可被改进的。因此，在一些实施方案中，在书面描述和所附权利要求中设置的的数值参数是近似值，其可以根据通过特定的实施方案来寻求获得的所需性质而改变。在一些实施方案中，所述数值参数应该根据所报告的有效数字的数目和通过应用普通舍入技术来解释。尽管设置了本发明的一些实施方式宽范围的数值范围和参数是近似的，但是具体实施例中列出的数值尽可能精确地可行。在本发明的一些实施例中提出的数值可能包含某些误差必然由在它们各自的试验测量中发现的标准偏差产生。

在一些实施方案中，术语“一(a)”和“一个(an)”和“该(the)”以及类似的引用在描述本发明(特别是在某些以下的权利要求的上下文中)的一个具体实施方案的上下文中使用的可以被解释为包括的单数和复数。文本中值的范围的详述仅意欲作为落在该范围内每一个单独的值的单独提及的简写方法。除非本文另有说明，本说明书中整合了每个单独的值，就好像它在本文中单独列举一样。本文中所描述的所有方法可以以任何合适的顺序进行，除非在此另有说明或另外与上下文明显矛盾。任何和所有实例或示例性语言(例如“例如”)的使用提供在相对于文本特定实施例中的，在这里仅仅是为了更好地阐明本发明，并不造成对本发明的范围的限制，除非有所要求。说明书中的任何语言不应被解释为表示本发明的实施中必要的任何非要求保护的元素。

本文公开的本发明的可选元件或实施方案的分组不应被解释为限制。各组成员可被并单独地或与组中其它成员或本文发现的其它元件任意组合进行涉及和要求保护。为方便和/或可专利性的理由，一组的一个或多个成员可以包括一组中或从一组中删除。当任何这类包括或删除发生时，本文本说明书被认为含有作为修改的组从而实现在所附权利要求书中使用的所有马库什组的书面描述。

在本文中描述本发明的优选的实施方案，包括发明人已知的用于实施本发明的最佳模式。对于本领域的普通技术人员在这些优选的实施方案中的变化将在阅读前面的描述后变得显而易见。可以预期的是本领域技术人员可以适当采用这些变形，并且本发明可以以除了本文具体描述的其他方式来实施。因此，本发明的许多实施方案包括由适用的法律所允许的所附权利要求书描述的主题的所有修改和等同。此外，本发明包括上述描述的元素及其所有可能改变的任何组合由，除非本文另外指出或另外与上下文明显矛盾。

本文引用的所有专利、专利申请、专利申请出版物和其他材料，例如文章、书籍、说明书、出版物、文件、事物和/或类似物，通过引用其全文并入本文出于所有目的，除了其任何相关联的审查历史档案、其任何不符合或与本文件冲突的、或其任何可能对现在或以后与本文件相关的权利要求的最广泛的范围产生限制影响的。以举例的方式，如果与任何并入的材料相关的和与本文件相关的描述、定义和/或使用的术语之间有任何不一致或冲突，以本文件中描述、定义、和/或使用的术语为准。

最后，应当理解的是，本文中公开的发明的实施例说明了本发明的原理。可以在本发明的范围内可以使用其它修改。因此，以举例的方式，但不限制，可以根据本文的教导利用本发明的替代配置。因此，本发明的实施例并不限于所示出和描述的精确条件。

Claims (21)

1.一种突变的人γ-球蛋白基因，其中所述突变的人γ-球蛋白基因编码SEQ ID NO.1的蛋白。

2.如权利要求1所述的突变的人γ-球蛋白基因，其中所述突变的人γ-球蛋白基因具有同SEQ ID NO.2 70％或更高的序列同一性。

3.一种基因工程化的造血干细胞,包括一慢病毒表达载体,所述慢病毒表达载体包括权利要求1所述的突变的人γ-球蛋白基因。

4.如权利要求3所述的基因工程化的造血干细胞的用途，用于制备治疗对象中镰状细胞性贫血或β-地中海贫血的药物。

5.如权利要求4所述的用途，其中制备所述基因工程化的造血干细胞的步骤包括：

用包括权利要求1所述的突变的人γ-球蛋白基因修饰的慢病毒表达载体转染造血干细胞，从而产生所述的基因工程化的造血干细胞。

6.如权利要求5所述的用途，其中所述造血干细胞获自所述对象。

7.如权利要求6所述的用途，其中所述对象是人类对象。

8.如权利要求7所述的用途，其中所述人类对象具有镰状细胞性贫血。

9.如权利要求7所述的用途，其中所述人类对象具有β-地中海贫血。

10.如权利要求4至9任一项所述的用途，其中在移植所述基因工程化的造血干细胞前对所述对象进行减低强度预处理。

11.如权利要求4至9任一项所述的用途，所述慢病毒表达载体进一步包括：

一标准SIN慢病毒载体骨架中处于3’LTR序列下游的异源多聚A信号序列；和

一个或多个衍生自一标准SIN慢病毒载体骨架U3缺失区域中的SV40晚期多聚A信号的USE序列。

12.如权利要求11所述的用途，其中所述慢病毒表达载体进一步包括一个或多个侧翼CHS4-衍生的长度缩短的功能性绝缘子序列。

13.如权利要求12所述的用途，其中所述慢病毒表达载体进一步包括β-球蛋白基因座控制区。

14.如权利要求13所述的用途，其中所述慢病毒表达载体进一步包括一红细胞谱系特异性增强子元件。

15.如权利要求4至9任一项所述的用途，其中所述用途导致：

移植后的胎儿血红蛋白至少超过20％；

F细胞构成至少2/3的循环血红细胞；

每个F细胞胎儿血红蛋白至少占镰状血红细胞中总血红蛋白的1/3；和

至少20％经基因修饰的造血干细胞再植于所述对象的骨髓。

16.一种能基因校正镰状细胞性贫血或β-地中海贫血的慢病毒表达载体，包括权利要求1所述的突变的人γ-球蛋白基因。

17.如权利要求16所述的慢病毒表达载体，进一步包括：

一标准SIN慢病毒载体骨架中处于3’LTR序列下游的异源多聚A信号序列；和

一个或多个衍生自一标准SIN慢病毒载体骨架U3缺失区域中的SV40晚期多聚A信号的USE序列。

18.如权利要求17所述的慢病毒表达载体，进一步包括一个或多个侧翼CHS4-衍生的长度缩短的功能性绝缘子序列。

19.如权利要求18所述的慢病毒表达载体，进一步包括一个或多个以反方向克隆到病毒转录单元的β-球蛋白基因座控制区的元件。

20.如权利要求18所述的慢病毒表达载体，进一步包括一红细胞系特异性增强子元件。

21.如权利要求17-20任一项所述慢病毒表达载体的用途，用于制备治疗对象中镰状细胞性贫血或β-地中海贫血的药物。