JP6509884B2 - 鎌状赤血球病の遺伝子的是正のための改善された胎児ヘモグロビン - Google Patents
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Description
本発明は、国立衛生研究所によって授与された助成金番号HL070595、HL70135-01、HL073104およびHL06-008の下での政府支援によりなされた。政府は本発明において特定の権利を有する。
本出願は、2014年1月30日付で出願された米国仮特許出願第61/933,788号の米国特許法§ 119(e)下での優先権の恩典を主張するものであり、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
本明細書において開示される本発明は広くは、特に、インビボモデルにおいて、造血疾患の是正のための最低限の造血幹細胞(HSC)キメラ現象および遺伝子投与量を明らかにする方法に関する。本発明はまた、ウイルス力価を増加させるための改変SINレンチウイルス発現ベクターおよびそのような力価を増加させるためのさまざまな方法、ならびにそのような力価を増強することができる発現ベクターにも関する。本発明はまた、組み込みベクターの安全性の向上を補助するための、および発現を増加させるためのCHS4クロマチンインスレーター由来の機能的インスレーター配列にも関する。本発明はまた、鎌状赤血球貧血およびβ-サラセミアのような、疾患の遺伝子的是正またはその症状の低減のための方法にも関する。本発明はさらに、鎌状赤血球貧血もしくはβ-サラセミアを遺伝子的に是正可能な、またはその症状を低減可能なさまざまな発現ベクターに関する。
本明細書における全ての刊行物は、各個別の刊行物または特許出願が、参照により組み入れられることが具体的かつ個別的に示されたかのように、同じ程度まで参照により組み入れられる。以下の記述は、本発明を理解するうえで有用でありうる情報を含む。本明細書において提供される情報のいずれかが本明細書で主張される発明に対する先行技術もしくは関連技術であること、または具体的もしくは黙示的に参照されるいずれかの刊行物が先行技術であることを認めるものではない。
造血幹細胞(HSC)によって媒介される、疾患の遺伝子的是正の成功は、安定、安全な、治療量の標的遺伝子発現に依る。発現ベクターは遺伝子的是正のプロセスの中核となり、その結果、多数の研究の主題となる。ベクターデザインの大幅な進歩が遺伝子治療の有効性を改善したとはいえ、鍵となるある種の障害が、成功裏の臨床応用への障壁として浮上した。それらの障害のなかで、本明細書において開示されるように、X-SCID試験の患者での遺伝子治療に関連した白血病の発生から明らかなように、ベクター遺伝毒性が最も厄介なことの一つである。結果として、γ-レトロウイルスベクターおよびレンチウイルスベクターを、自己不活化(SIN)のデザインに改変して、長い末端反復配列(LTR)のU3領域における遍在的に活性なエンハンサーを欠失させた(本明細書において開示される通り)。SINデザインは、ベクター力価を増加させることによって改善された。導入遺伝子の発現を改善するいくつかの方法がその後、利用されている。
実証されているように、膨大な量の胎児/抗鎌状赤血球化グロビンを発現させることで、疑う余地なく疾患が是正されるであろうが、しかし臨床の場で実際には可能ではない。例として、アデノシンデアミナーゼ(ADA)欠損症の初期遺伝子治療は、前処置を用いずに行われ、遺伝子標識幹細胞のわずかな生着があり、ADAの撤退に関して遺伝子修正リンパ球に対する選択的優位性が明白であったとはいえ、治療的ではなかった(本明細書において開示される通り)。後続試験において、4 mg/kgのブスルファンを前処置として、移植の前に用いた結果、十分な、遺伝子修正された幹細胞用量および遺伝子改変T細胞がもたらされた(本明細書において開示される通り)。かくして、臨床研究を開始する前に遺伝子修正のための閾値を特定する方法を確立することが当技術分野において必要とされている。
[本発明1001]
SEQ ID NO:1を含むタンパク質をコードする、変異したヒトγ-グロビン遺伝子。
[本発明1002]
SEQ ID NO:2と70%またはそれ以上の配列同一性を有する、変異したヒトγ-グロビン遺伝子。
[本発明1003]
鎌状赤血球貧血もしくはβ-サラセミアを遺伝子的に是正するかまたはその症状を低減するために、本発明1001の変異したヒトγ-グロビン遺伝子を使用する方法であって、
鎌状赤血球貧血またはβ-サラセミアの処置を必要としている対象を同定する段階;
本発明1001の変異したヒトγ-グロビン遺伝子を含む改変レンチウイルスを用いて自家造血幹細胞(HSC)にトランスフェクションを行う段階; および
トランスフェクションされたHSCを対象へ移植する段階
を含む前記方法。
[本発明1004]
対象がヒト対象である、本発明1003の方法。
[本発明1005]
移植の前に強度軽減移植前処置(reduced intensity conditioning)で対象を処置する段階をさらに含む、本発明1003の方法。
[本発明1006]
改変レンチウイルスが、
標準SINレンチウイルスベクター骨格におけるウイルス3' LTR配列の下流の異種ポリAシグナル配列; および
標準SINレンチウイルスベクター骨格のU3欠失領域におけるSV40後期ポリAシグナルに由来する1つまたは複数のUSE配列
をさらに含む、本発明1003の方法。
[本発明1007]
改変レンチウイルスが、1つまたは複数の隣接CHS4由来の低減された長さの機能的インスレーター配列をさらに含む、本発明1006の方法。
[本発明1008]
改変レンチウイルスが、β-グロビン遺伝子座制御領域をさらに含む、本発明1007の方法。
[本発明1009]
改変レンチウイルスが、赤血球系統特異的なエンハンサーエレメントをさらに含む、本発明1007の方法。
[本発明1010]
移植後、胎児ヘモグロビンが少なくとも20%を超える;
F細胞が循環血中赤血球の少なくとも2/3を構成する;
F細胞あたりの胎児ヘモグロビンが鎌状赤血球における全ヘモグロビンの少なくとも1/3に相当する; および
少なくとも20%の遺伝子改変HSCが対象の骨髄に再配置する、
本発明1003の方法。
[本発明1011]
本発明1001の変異したヒトγ-グロビン遺伝子を含む、鎌状赤血球貧血もしくはβ-サラセミアを遺伝子的に是正するかまたはその症状を低減しうるレンチウイルス発現ベクター。
[本発明1012]
標準SINレンチウイルスベクター骨格におけるウイルス3' LTR配列の下流の異種ポリAシグナル配列; および
標準SINレンチウイルスベクター骨格のU3欠失領域におけるSV40後期ポリAシグナルに由来する1つまたは複数のUSE配列
をさらに含む、本発明1011のレンチウイルス発現ベクター。
[本発明1013]
1つまたは複数の隣接CHS4由来の低減された長さの機能的インスレーター配列をさらに含む、本発明1012のレンチウイルス発現ベクター。
[本発明1014]
ウイルス転写単位に対して逆方向にクローニングされたβ-グロビン遺伝子座制御領域の1つまたは複数のエレメントをさらに含む、本発明1013のレンチウイルス発現ベクター。
[本発明1015]
赤血球系統特異的なエンハンサーエレメントをさらに含む、本発明1013のレンチウイルス発現ベクター。
本明細書において引用される全ての参考文献は、完全に記載されているかのように参照によりその全体が組み入れられる。参照によりその全体が本明細書に同様に組み入れられるものには、2010年12月6日付で出願された米国非仮特許出願第12/928,302号、および2009年12月4日付で出願された米国仮特許出願第61/267,008号が含まれる。参照によりその全体が本明細書に同様に組み入れられるものは、「A novel human gamma-globin gene vector for genetic correction of sickle cell anemia in a humanized mouse model: critical determinants for successful correction」. Blood (2009) 114: 1174-1185 Perumbeti A, Higashimoto T, Urbinati F, Franco R, Meiselman H et alに記述されているようにヒト化マウスモデルにおける鎌状赤血球貧血の遺伝子的是正のための新規のヒトγ-グロビン遺伝子ベクターおよびその成功裏の是正に不可欠な決定因子である。
本明細書において記述されるように、実験を行って、レンチウイルス非コード化cis配列がRNA輸送、パッケージングまたはβ-グロビン発現において特別な役割を果たすかどうか判定した。β-グロビン遺伝子および遺伝子座制御領域(BG)、またはGFP cDNAを保有している自己不活化(SIN)-レンチウイルスにおいて、ベクターライフサイクルを研究した。SIN-LV骨格に含めるのに最適なcis-エレメントを同定するため、パッケージング領域しか保有していない完全「ヘルパー依存性」の最小SIN-レンチウイルス; および漸増するHIV cis-エレメントを含んだSIN-レンチウイルスを用いて、SIN-γ-レトロウイルスと併せ、系統的分析を始めた。sSIN-GFPベクターをクローニングするため、本明細書において記述されるように、以前に用いられた標準的なSIN-LV骨格の3'LTRを改変して、転写産物の終結を改善させた。具体的には、β-成長ホルモンポリアデニル化シグナルを3'LTRの下流に付加し、SV40後期ポリアデニル化シグナルに由来するUSE配列をU3欠失中に付加した。
本明細書において記述されるように、クロマチンインスレーターエレメントはヘテロクロマチンのまん延および遺伝子のサイレンシングを抑止し、クロマチン位置効果を低減し、エンハンサー遮断活性を有する。これらの特性は、無作為組み込みベクターでの一貫性のある予測可能な発現および安全な導入遺伝子送達には望ましい。クロマチン位置効果を克服することで、治療効果に必要とされるコピー数を減らすことができ、ベクターの遺伝毒性のリスクを減らすことができる。ベクター遺伝毒性は、X-SCIDの治験の患者における遺伝子治療に関連した白血病の発生以来、集中的な研究領域となった。γ-レトロウイルスベクターおよびレンチウイルスベクターを、自己不活化(SIN)のデザインに改変して、長い末端反復配列(LTR)のU3領域における遍在的に活性なエンハンサーを欠失させた。ニワトリp-グロビン遺伝子座由来の1.2 Kb DNAse高感受性部位-4 (cHS4)を3'LTRに挿入して、γ-レトロウイルスおよびレンチウイルスベクターにおける5'LTRへのその複製を可能にした。絶縁ベクターは、低減されたクロマチン位置効果を有し、一貫性のある、それゆえ、改善された全体的発現をもたらす。hβ-グロビンおよび遺伝子座制御領域を保有しているcHS4絶縁および非絶縁レンチウイルスベクターの対照比較を行い、絶縁ベクターが、分化した後代の造血幹細胞における組み込み部位にかかわらず、一貫性のある、予測可能な発現を示し、2〜4倍高い全体的発現を引き起こすという発見を結果的にもたらした。また、最新の証拠から、cHS4絶縁レンチウイルスベクターが細胞性がん遺伝子の、挿入による活性化のリスクを低減しうることが示唆される。絶縁ベクターの有益な効果にもかかわらず、それらはまた、レンチウイルスベクターの3'LTRにおける全長1.2 KbのcHS4インスレーターエレメントの挿入によって力価の顕著な低減をもたらす。3'LTR中の挿入を含んだγ-レトロウイルスベクターによるウイルス力価の低下または不安定な伝染に関する類似の報告が存在している。この力価の低減は、事実上、インスレーターエレメントがなくても力価が中等度である、特にヒトβ-グロビン遺伝子(hβ)および遺伝子座制御領域(LCR)のような、比較的大きい発現カセットを保有しているベクターによっては、臨床試験用のベクター産生の規模拡大に対する制限になる。
鎌状赤血球病(SCD)は、β-グロビン遺伝子に影響を与え、最も一般的な遺伝的欠陥のうちの1つであり、欠損した鎌状グロビン(α2βS 2として示される、2本の正常αグロビンおよび2本のβ鎌状グロビン分子から構成されるHbS)の産生を引き起こす。HbSは脱酸素によって重合し、円盤状の赤血球(RBC)の形状を異様な鎌状/かぎ形の形状へ変化させる。鎌状RBCは微小血管系を閉塞させて、有痛性の急性臓器虚血事象および慢性臓器障害を引き起こし、SCD患者の寿命を45歳まで短縮する。この疾患は110,000超の米国人に影響を与え、SCDを有する新生児1000人が毎年生まれており、アフリカでは毎年この疾患を持って1000人近くの乳児が生まれている。
本明細書において開示されるように、HSCにおけるβ-グロビン調節制御エレメント下のヒトγ-グロビンの、レンチウイルスによる送達は、マウスにおいてSCAを是正するのに十分な出産後HbF発現をもたらす。HbFおよび形質導入HSCの量を次に、強度軽減移植前処置およびさまざまな感染多重度(MOI)を用いて脱スケール化し、是正に必要とされる重要パラメータを評価した。機能的および血液学的RBC指数、臓器病態、ならびに寿命の系統的定量化は、鎌状赤血球表現型を好転させるために必要とされるHbF、F細胞、HbF/F細胞および遺伝子改変HSCの最少量を特定するために重要であった。
本明細書において開示されるように、改善された変異体γ-グロビン遺伝子は、レンチウイルスベクターsGbGMから操作されている。このベクターはHbFを形成させる一層高い傾向を有し、改善された抗鎌状化特性を有し、ストリンジェントなホモ接合性SCDマウスモデルにおいて優れたSCD是正をもたらす。操作されたγ-グロビン遺伝子は、その機能を変化させることなくα-グロビンを結合する親和性の増大を有し、それによってRBC中のHbF形成の効率を大いに改善し、はるかに効率的な抗鎌状化効果をもたらし、SCD表現型を是正すると考えられる。
本研究は、レンチウイルス非コード化cis配列がRNA輸送、パッケージングまたはβ-グロビン発現において特別な役割を果たすかどうか調べた。β-グロビン遺伝子および遺伝子座制御領域(BG)、またはGFP cDNAを保有している自己不活化(SIN)-レンチウイルスにおいて、ベクターライフサイクルを研究した。パッケージング領域しか保有していない完全「ヘルパー依存性」の最小SIN-レンチウイルス; および漸増するHIV cis-エレメントを含んだSIN-レンチウイルスを用いて、SIN-γ-レトロウイルスと併せ、系統的分析を始めた。(i) GFPをコードするヘルパー依存性/最小SIN-レンチウイルスまたはSIN-γ-レトロウイルスは高い力価を生じ、高いGFP発現を媒介することが発見された。(ii) しかしながら、BGもしくは類似したサイズの大きな導入遺伝子のどちらかをコードするヘルパー依存性SIN-レンチウイルスまたはSIN-γ-レトロウイルスは、cis-エレメントを保有しているSIN-レンチウイルスと比べてほとんど検出できない力価を有していた。(iii) cis-エレメントの系統的付加から、mRNA輸送ではなく、レンチウイルス粒子の効率的なアッセンブリ/パッケージングのためには、Rev/RREが最も不可欠であり、それにgagおよびenvスプライスアクセプター配列が続くことが実証された。しかしながら、これらのHIV cis配列は一層小さな導入遺伝子の場合には不必要であった。これらの研究は、鍵となるレンチウイルスcis-エレメントと、それらが、大きなインサートを保有しているベクターにおいて果たす役割とを同定し、遺伝子治療に重要な意味を持つ。
γRVは、強力なγRV LTRプロモーター/エンハンサーエレメントと内部LCRエンハンサーとの間の転写干渉のためhβ-グロビンを成功裏に発現することができないものと仮定されている。SRS11.SFは、内部脾臓フォーカス形成ウイルス(SFFV)プロモーター/エンハンサーの制御下にGFP cDNAをコードするSIN-γRVである。SRS11.SFにおけるSFFV-GFPを、サラセミアで治療用ヒトβ-グロビン発現を達成するために標準的SIN-LVにおいて成功裏に利用された発現カセットBGと置き換えて、SRS11.BGを作製した。β-グロビンγRVの悪評にもかかわらず、SRS.11を用いる根本的な理由は、以下であった: (i) SRS.11は最小のパッケージング領域(Ψ)を含み、gag配列を欠き、より大きなベクター負荷量を運ぶことができ、それにもかかわらず極めて高い力価を保持している; (ii) SRS.11はSIN-LVにおける欠失に匹敵する、3'LTRの、大きな400 bpのU3欠失を保有している。(iii) 大きなLCRエレメントはベクター負荷量に対する制約のため、γRVにおいて一度も試験されていない。
本明細書において用いられるSIN-γRVとは対照的に、一般的に用いられる「標準的な」SIN-LVは、HIVゲノムの約20〜25%に達する比較的大きな部分のウイルス配列を保持する。これらのcisエレメントは以下である: LTR (wt HIV LTRの場合634 bpまたはSIN-LV LTRの場合235 bp)、パッケージングシグナルΨ(150 bp)、gag遺伝子の5'部分(300または600 bp)、rev応答エレメントを含むenv配列(RRE, 840 bp)およびpol遺伝子由来セントラルflap/ポリプリントラクト(cPPT) (120 bp)。
どの特定のLV cis配列がこの効果に重要であったか、およびそれらが影響を与えたのはベクターライフサイクルのどの段階かを研究するため、一連の10種のSIN-LVベクターをクローニングした; それらのどれもBGカセットを保有していたが、しかし異なるレンチウイルス非コードcisエレメントを保有していた(図2)。BGとの関連で特定のenv (RREおよびSA)ならびにgag配列を研究する論理的根拠は、(i) 「標準的な」LVにおけるenv断片中のRREエレメントがRevタンパク質との結合後に核からの非スプライス/単一スプライス転写産物の輸送を促進することであった。(ii) envスプライス部位はvRNAの安定性およびパッケージングに対するその利用可能性において根本的な役割を果たし、既知の下流スプライスアクセプター(SA)配列がないことでcis作用性リプレッサー配列(CRS)活性がもたらされ、これによりHIV-1 RNAの細胞質蓄積が妨げられる。(iii) gag遺伝子の一部分はベクターに保持されて、vRNAパッケージングを補助する。Gag配列はパッケージングシグナルのRNA二次構造の折り畳みを促進し、粒子形成中のGagタンパク質とのvRNAの相互作用を容易にし、vRNAの二量体化に重要である。5'スプライスドナー部位およびgag遺伝子の最初の360 bpにマップされる配列は、非スプライスおよび単一スプライスウイルスmRNAを特定の核内区画へ向かわせ、そこからそのmRNAがRev/RREの助けで輸送される。
RREエレメントのないベクター(sBG-1、sBG-9およびsBG-10)は、5.5±2.1×105 IU/mLから1.7±1.4×106 IU/mLに及ぶ濃縮力価を有していたが、これは、RRE配列を保有するベクター(sBG-2〜sBG-8; p<0.01)よりも2〜3桁低かった。実際に、RRE配列だけをsBG-1に付加してsBG-2を作製した場合、力価は100倍超だけ増した(5.5±2.1×105 IU/mL vs 8.7±6.5×107 IU/mL; p<0.01; 図3)。
プロウイルス安定性および発現におけるLV cis-エレメントの役割を評価するために、形質導入されたMEL細胞に対するゲノムサザンブロット分析を行った。
パッケージング効率に及ぼすcis配列の効果を次に、同じように処理された全10種のベクターから精製されたウイルス粒子においてvRNA、p24レベルおよびウイルスに関連した逆転写酵素(RT)を分析することにより判定した。図6Aは、sBG1〜sBG-10 LVの代表的なドットブロット分析を示す。検出されたvRNAの量は、ホスホイメージャ分析によって判定した場合、ベクターの大部分ではベクター力価に比例しており、cis-配列を欠くベクターにおけるパッケージング効率の妨げを示している(図6B〜C)。
BGを保有している標準的なLVの力価は最初に低く、かなりの濃縮を必要とする。しかしながら、LV cis-エレメントの除去によって力価は急激に(3桁だけ)落ちる。おそらく、これらのLV配列はアッセンブリを促進しながらパッケージング細胞において大きなvRNAを分解から防御するが、短いGFP vRNAはそのような要件がなくても効率的にパッケージングされる。ヘルパー依存性BG LVの低い力価は、293T細胞において5'LTR vRNA転写産物に対し逆方向で挿入されたβ-グロビン遺伝子プロモーターから生じるアンチセンスRNAからのものではない。ベクターのいずれでもノザンブロットにおいてアンチセンス転写産物は認められなかった。加えて、β-グロビン転写産物は赤血球特異的であり、293T細胞において産生されない。さらに、サイズがBGに類似していたが、しかしセンス方向であったFIGカセットも、力価に対しBGと同じ効果を有していた。
いくつかのユニークな、いささか予想外の結果が本研究から浮かび上がった: (i) パッケージング細胞において、BG γRVで辛うじて検出可能なRNAとは対照的に、全てのBG LVで多量の転写産物が産生された。1つの可能性は、LV最小配列(R、U5およびΨ領域)が特定の細胞内区画においてBG vRNAに安定性を付与するということである。それゆえ、BG γRVとは根本的な違いのある、ヘルパー依存性LVからでさえも293T細胞において多量のvRNAが見られる。(ii) BG vRNAは予想されたサイズのものであって、Rev/RREの非存在下でさえも細胞質へ効率的に輸送されたことから、LVにおける「ガンマ遺伝子」の成功が、スプライシングおよびvRNA輸送を抑止するRREの典型的機能によって二次的に起きたものであるという考えに矛盾している。(iv) vRNAは、ヘルパー依存性LVがGFPのような小さな導入遺伝子をコードした場合にウイルス粒子へ効率的にパッケージングされた。このデータから、最小のパッケージング配列以外の、LV cis-配列は小さな導入遺伝子の場合には不必要であることが裏づけられる。
Rev/RRE相互作用はパッケージングおよび高力価ウイルス産生には最も重要であったが、ゲノムvRNAの輸送およびスプライシングされたメッセージの抑制において確立されたRev/RREの機能はBG LVにおいて顕著ではなかった。野生型HIVウイルスにおいて、Rev/RREの存在は、RREを含んだmRNAの安定化、正しい細胞内局在性および効率的な翻訳のために、mRNA輸送および利用経路の全体にわたって必要とされる。本明細書で提示されるデータは、RREが細胞質vRNAレベルに軽微な効果を及ぼしたが、しかしウイルス力価をおよそ100倍低減したことを示す最近の研究を裏づけるものであり、それを広げるものである。Rev/RRE要件は大きな導入遺伝子に特異的であるが、しかし小さな発現カセットには不必要であることがさらに明らかである。文献中の以前の報告とは異なり、本研究では、vRNA安定化におけるRREの役割を確かめなかった。というのは、RREのないベクターで等量またはさらに多量のvRNAが見られたからである。可能性の高い機構は、RREがウイルスアッセンブリおよびパッケージングに関与する能力である。
env SAの存在は、ウイルスゲノムを安定化させ、より高いウイルス産生をもたらすことが明らかにされている。SAの存在はまた、env SAなしのいくつかのベクターが、env SAを有する類似のベクターと比較した場合、標的細胞において同じv-RNAを有していたが、しかしより低い形質導入/力価を有していたので、侵入後のレベルでvRNAを安定化しうる。gagタンパク質の翻訳を防ぐために開始コドン変異を有する、gag配列は、ウイルスパッケージング中のLVの産生に役立つ。本研究において、この要件が大きな導入遺伝子カセットに特有であることが分かった。gagを含んだRNAの安定性を低下させることが以前に明らかにされているgag遺伝子414 bp〜631 bpに存在する阻害配列の除去が、力価を3.5倍だけ増加させたことも実証された。
LV: sSIN-GFPベクターをクローニングするために、以前に用いられた標準的なSIN-LV骨格の3'LTRを改変して、転写産物の終結を改善させた: β-成長ホルモンポリアデニル化シグナルを3'LTRの下流に付加し、SV40後期ポリアデニル化シグナルに由来するUSE配列をU3欠失中に付加した。sSIN-GFPプラスミドからClaI-NruI断片を除去することにより、dsSIN-GFPを得た。マルチクローニング部位
をsSINのClaIおよびEcoRI部位にクローニングした。β-グロビン-LCR (BG)カセットをXhoIおよびSmaI部位へ逆方向にクローニングし、この親構築体をsSIN-BGと名付けた。sBG-0は、Eco47IIIとNruIとの間の領域を除去し、sSIN-BG由来5'LTRの後にHIV-1パッケージング配列(Ψ)だけを残すことによって得た。cPPTをsBG-0 ClaI部位へクローニングした(sBG-1)。RRE、RRE-env、短いgag (360 bp)、長いgag (630 bp)に対するPCR断片をXhoI平滑化末端にクローニングし、これらのベクターをそれぞれ、sBG-2、sBG-3、sBG-10、sBG-9と名付けた。プライマー配列(Fはフォワードプライマーを意味し、Rはリバースプライマーを意味する)は以下の通り。
プライマーを用いて行い、sBG-4を作製した(Env断片内のwt SA配列CAGはCGAへ変異導入された)。長いgag PCR断片をsBG-3のXhoI部位へクローニングすることにより、sBG-5を得た。γRV: SRS11.SF γRVプラスミドは、Axel Schambach博士およびChristopher Baum博士(Hannover, Germany)から厚意により提供していただいた。SRS11.BGベクターにおいて、ヒトβ-グロビン-LCR (BG)をSRS11.SFレトロウイルスベクタープラスミドのPstI部位へ逆方向にクローニングした。全ベクターの画が図2に描かれている。
LVは、ベクタープラスミド、パッケージング(Δ8.9)およびエンベロープ(VSV-G)プラスミドを用いて既述のように、293T細胞の一過性コトランスフェクションにより産生された; ウイルスを含有する上清を、トランスフェクションから60時間後に回収し、超遠心分離によって濃縮した。実験中の全ベクターが同時にパッケージングされ、25,000 rpmでの超遠心分離により全てのウイルス上清から1400倍にウイルスが濃縮された。既述のように、マウス赤白血病(MEL)細胞またはHT1080細胞に濃縮ウイルスの連続希釈液を感染させ、それらを分化させ、それらを蛍光活性化細胞ソーター(FACS)によりHbAまたはGFP発現について分析することにより、ウイルス力価を測定した。γRVは同様に産生されたが、しかし濃縮されなかった。全てのトランスフェクションおよびその後の力価測定は、三つ組で行われた。Rev有りおよび無しの、ベクターのパッケージングは、パッケージングプラスミドΔ8.9をpMDLg/pRREおよびpRSV-Revと置き換えたことを除き、同様の方法にしたがい行った。ベクタープラスミド:pMDLg/pRRE:pRSV-Rev:VSV-Gの比率は、4:4:3:1であった。
ネズミ科赤白血病細胞(MEL)株および293T細胞は、10%の熱不活化ウシ胎仔血清(FBS) (U.S. Bio-technologies, Inc, Parker Ford, PA)を補充したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM, Mediatech, Inc., Herndon, VA)中で維持された。MEL細胞は、当技術分野において既述されているように、20% FBSおよび5 mM N,N'-ヘキサメチレンビスアセタミド(Sigma)を含有するDMEM中で分化するように誘導された。
抗ヒトHbA抗体を用いてヒトβ-グロビンを標識するために用いられた方法論は、既述の通りであった。手短に言えば、細胞を室温で60分間4%パラホルムアルデヒド中で固定し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で1回洗浄し、ペレットを5分間100%メタノールに再懸濁させた。固定された細胞を次に、PBSで洗浄し、非特異抗体(Ab)結合を室温で10分間、5%スキムミルクを用いてブロッキングした。その後、細胞をPBS中で洗浄し、ペレット化し、透過処理した。細胞を2本のチューブに分け、暗所中にて室温で30分間、陰性対照として抗ζグロビン-フルオレセインイソチオシアネート(FITC) Ab (1 μg/106個の細胞)または抗HbA-FITC Ab (0.1 μg/106個の細胞) (Perkin Elmer, Waltham, MA)のいずれかで染色した。未結合のAbをPBSでの最終の洗浄により除去した後に、それらをFACS Calibur (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ)にて分析した。
トランスフェクションから72時間後に293T細胞を回収し、PBS中で洗浄した。核RNAおよび細胞質RNAの単離は、氷上でNEB緩衝液(10 Mm Tris-HCl pH 7.4; 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2; 5% IGEPAL)とともに7分のインキュベーションで得られる。遠心分離後、RNA-STAT (Tel-Test, INC, Texas)を、細胞質RNAを含有する上清に添加し、製造元の使用説明書にしたがってRNA抽出を進めた。RNA-STATを用いて293T細胞から全RNAを抽出した。ノザンブロットを次に、標準的なプロトコルにしたがって行った。ブロットを32P標識β-グロビンプローブとハイブリダイズさせた。RNAの負荷を正規化するため、膜を次いでストリップにし、32P標識18Sプローブで再プローブした。細胞質RNAの純度を試験するため、膜をストリップにし、細胞質調製物においてイントロン転写産物を検出しなかったGAPDHイントロンプローブに特異的な32P標識プローブで再プローブした。
ゲノムDNAを形質導入MEL細胞から単離されたDNAに対して行い、ゲノムDNA 10 μgをAflII酵素で消化し、標準的なプロトコルにしたがってサザンブロットを行った。ブロットをβ-グロビンLCRプローブのHS2断片とハイブリダイズさせた。QIAamp vRNA Mini Kit (Qiagen)を製造元の使用説明書にしたがって用い、同じ量の濃縮ウイルスからRNAドットブロットvRNAを抽出した。手短に言えば、ウイルスを高い変性条件の下で溶解させ、その後、シリカゲルに基づく膜に結合させた。2回の洗浄段階により混入物が効率的に洗い流され、vRNAがDEPC-水30 μl中に溶出された。溶出後、vRNAをDNAse Iにより室温で20分間処理し、サンプルを65℃でインキュベートすることにより増幅品質等級のDNase I (Invitrogen, Carlsbad, CA)を不活化させた。vRNAを次に、65℃で15分間、3容量の変性用緩衝液(65%ホルムアミド、8%ホルムアルデヒド、MOPS 1×)中で変性させた。変性後、2容量の氷冷20×SSCを添加し、ドットブロット装置を通じた吸引によってナイロン膜にRNAを結合させた。ブロットを32P標識β-グロビン特異的プローブとハイブリダイズさせ、X線フィルムを終夜感光させた。
クロマチンインスレーターは、活性な転写ドメインを分離し、ゲノムにおけるヘテロクロマチンのまん延をブロックする。原型のインスレーターであるニワトリ高感受性部位-4 (cHS4)エレメントに関する研究から、エンハンサー遮断活性をもたらし、位置効果を低減する、「コア」と名付けられた、cHS4の近位250 bp中のCTCFおよびUSF-1/2モチーフが同定された。しかしながら、コアだけでウイルスベクターが効果的に絶縁されるものではない。全長cHS4は優れた絶縁特性を有するが、しかしその大きなサイズによってベクター力価が著しく損なわれてしまう。cHS4隣接レンチウイルス・ベクターの構造-機能分析を行い、クローン性の造血幹細胞後代における導入遺伝子発現ならびにcHS4および導入遺伝子プロモーターの後成的変化について分析した。コアはクローンによる発現の多様性を低減させただけであった。独特のインスレーター活性が遠位400 bpのcHS4配列内にあり、これはコアと組み合わされると、完全なインスレーター活性およびオープンなクロマチンのマークを導入遺伝子プロモーターおよびインスレーターにわたって回復した。これらのデータは、コアと類似の特性を有する新規の3'側400 bpのエレメントによって標準的5'コアの既知の絶縁活性を確固たるものとする。同時に、それらは優れた絶縁特性およびウイルス力価を有する。このデータは、インスレーター機能の分子基盤の理解および遺伝子治療ベクターのデザインに関して重要な意味を持つ。
5' 250 bpの「コア」(sBGC)、コアの2つの縦列反復配列(sBG2C)、5' 400 bp (sBG400)、5' 800 bp (sBG800)または全長1.2 KbのcHS4インスレーター(sBG-I)のいずれかを組み入れるように自己不活化レンチウイルスベクターをデザインした。全てのベクターはヒト(h)β-グロビン遺伝子およびプロモーターならびに遺伝子座制御領域エンハンサーを保有していた。逆転写により、標的細胞中の組み込みプロウイルスは絶縁3' LTRが5'LTRにコピーされ、両端でhβ-グロビン発現カセットに隣接するように、異なるインスレーター断片を3' LTRのU3領域へ順方向にクローニングした。5' 250 bpコアの外側のエレメントが空間的な足場を単に提供しただけかどうかを評価するため、コアの下流に不活性なDNAスペーサーを有するベクターsBG400SおよびsBG800Sについても試験した。全てのベクターを非絶縁対照sBGと比較した(図7A)。
以前の結果と一致して、非常に高い%のhβ+細胞が、対照sBGクローンと比べ、sBG-I単一組み込み体クローンに存在していた(P<0.01); sBGC、sBG2C、sBG400およびsBG800クローンにおけるhβ+細胞の%は、sBG対照クローンと有意差がなかった(図8A)。LTRにおけるcHS4の存在が組み込みを偏らせなかったこと、および分析が異なるクローンに対して行われたことを確実にするために、無作為に選択された10個のsBGまたはsBG-I MELクローンに対するLM PCRおよび組み込み部位配列決定によった。明白な偏りなく、非絶縁クローンと絶縁クローンとの間で異なる遺伝子の近く/中で挿入が行われた。cHS4コア(sBGC)、または最大800 bpまでの、コア下流のインスレーターの伸長配列の存在は、% hβ+細胞をさらには増加させなかった;プラスミドに基づく系においてエンハンサー遮断効果を付与することが明らかにされているとはいえ、コア配列の縦列反復配列でも同様であった。
クロマチン位置効果を次に、単一コピー二次CFU-Sにおいて確認した。二次コロニー形成単位-脾臓(CFU-S)アッセイ法は、造血幹細胞に由来する細胞におけるクロマチンインスレーターエレメントの後成的効果を研究するための「究極の判断基準」となる最もストリンジェントなアッセイ法であると考えられている。とりわけ、赤血球特異的SINレンチウイルスベクターによる導入遺伝子サイレンシングの欠如に関して報告された結果に一致して、ベクター特異的配列に対するPCRにより陽性とされ、FACSによりhβ-グロビンを発現していなかった、形質導入CFU-Sは観察されなかった。(1) % hβ+細胞および(2) TER-119陽性の赤芽球に対するFACS分析から、異なるベクター群の間でTER-119+細胞の割合に差異のないことが明らかにされた(示されていない)。しかしながら、有意に高いhβ+細胞%は、sBG-Iベクターによる二次CFU-Sにおいて存在していただけであった。かさねて、非絶縁sBGを形質導入したCFU-Sと比べて、コアを保有している全てのベクターで形質導入されたCFU-SにおいてCVは有意に低かった(図3D〜E)。各マウス群から無作為に選択された6つのCFU-Sに対するリアルタイムRT-PCR分析から、sBGベクターと比べて、sBG-I CFU-SからのmRNA発現がおよそ2倍高いことが明らかにされた。しかしながら、sBGC、sBG2CおよびsBG400を形質導入したCFU-Sからの発現は、sBG CFU-Sのものとは有意差がなかった。総合すれば、これらのデータから、sBGC、sBG400、sBG400S、sBG800およびsBG800Sにおける5' 250 bpのコア配列がhβ-グロビン発現の、クローンによる多様性を特異的に低減させたことが示唆される。しかしながら、異なる組み込み事象からの発現の可能性の改善には、全長cHS4エレメントが必要とされた。
次に、さまざまなインスレーター領域で見られた特異的効果に付随する後成的修飾を、MELクローンにおける異なるプロウイルスの間で活性ヒストンマークacH3、acH4およびH3K4me2と抑制ヒストンマークH3K9me3およびH3K27me3の相対レベルを比較することにより判定した。ChIP分析を半定量的PCR (図10B〜C)およびリアルタイムPCR (図10D〜F)により、ベクターごとに一緒にプールされた3つの代表的なクローン(選択されたクローンは図8A中で黒丸として示されている)においてcHS4コアに対し行った。sBG-Iベクター組み込み体を保有しているクローンは、「コア」を保有していた3つのベクターsBGC、sBG400およびsBG800と比べて、cHS4「コア」断片にわたり、活性クロマチンマークのおよそ6倍の富化を示し、抑制クロマチンマークを減らした。
貧血、網状赤血球増加および他のRBC指数は、非絶縁hβ-グロビンレンチウイルスベクターで刊行された報告と一致して、sBGベクターでさえも改善された(図11A)。モック移植マウスのヘモグロビンは7.7±0.2 gm/dLであり、sBG群のマウスは10.4±0.7 gm/dLであり、細胞あたり1.2個のベクターコピーであった。sBG-I群のマウスは、sBG群のマウスと比べて細胞あたりのベクターコピーが半分であったにもかかわらず、さらに高いヘモグロビンおよびさらに低い網状赤血球計数を有していたこと(ヘモグロビン11±0.2 gm/dL; 細胞あたり0.6個のベクターコピー)は注目に値するものであった。形質導入の効率について正規化した場合、これは、sBGマウスにおけるベクターコピーあたりヘモグロビン2.3 gmの増加とは対照的に、モックマウスと比べて、sBG-Iマウスにおけるベクターコピーあたりヘモグロビン5.2 gmの増加になる。実験マウスからのRBCパラメータから、顕著な改善が明らかにされた(図11A; これらのデータはベクターコピー数について正規化されていないことに留意されたい)。これらの指数の改善は、ベクターコピーについて正規化されていなければ有意差がなかったとはいえ、sBG-Iマウスで最も高かった。
cHS4の5' 800 bpはCVを低減させただけであったが、完全なインスレーター活性が全長1.2 Kbのインスレーターで回復された。cHS4 (sBG3'400)由来MELクローンの遠位/3' 400 bpの領域だけを保有しているベクターを作製し、マウスにsBG3'400形質導入LSK細胞を移植した。先に記述したベクターとは異なり、このベクターは5'250 bpの「コア」配列を含まないことに留意されたい(図12A)。sBG3'400ベクターはMELクローンにおけるhβ+細胞%またはマウスにおけるhβ+ RBC%に及ぼす効果がなく(図6B,D)、sBGクローン、または5' 250 bpの「コア」を保有しているもの(sBGC)と同程度の効果であった。しかしながら、5'コアを保有している全てのベクターと同様に、sBG3'400はMELクローンにおいておよびRBCにおいてhβ-グロビン発現のCVを顕著に低減させた(図12C,E)。
cHS4インスレーターの5' 250 bpコアおよび3' 400 bp配列(sBG650ベクター; 図13A)が組み合わされた場合、このベクターはMELクローンにおいて、移植されたマウスのRBCにおいておよび二次CFU-Sにおいて、sBG-Iベクターと同じように働いた。sBG650 MELクローンおよびRBCにおけるhβ-グロビン発現細胞の比率(図13B〜D)は、sBGクローンと比べて有意に高く(P<0.001)、sBG-Iクローンに類似していた。同様に、sBG650クローンのCVはsBG-Iクローンに匹敵していた(図13C)。一次マウスのRBCにおけるhβ-グロビン発現は、sBG-Iマウスに匹敵していた(図13D)。HPLC分析によって測定された、sBG650マウスにおけるhβ-グロビンタンパク質の量は、sBG-Iマウスと有意差がなかった(それぞれ41±2.6% vs 43±3%)が、しかしsBGマウスにおいて見られたもの(19±6%; P<0.01)よりも少なくとも2倍高かった。移植から5ヶ月後に、二次移植を行ってCFU-Sを作製し、これによってsBG650ベクターがsBG-Iベクターで見られたものに類似のインスレーター活性を回復することが確認された(図13E)。sBG650プロウイルスにおけるコア全体のクロマチン配置(図13F)から、インスレーターコアおよびβ-グロビンプロモーターの両方にわたり、sBG-Iプロウイルスにおいて見られたものと同一の、オープンクロマチンパターンの回復が明らかにされた(図10)。
cHS4の遠位3' 400 bp部分のクロマチン配置は、これまでに研究されていない。ヒストンパターンは当初、3' 400 bp領域(sBG3'400)にわたり、単独で存在する場合(sBG3'400)で、または5'コアと組み合わせて存在する場合(sBG650およびsBG-Iにおいて)で分析された(図14)。sBG3'400プロウイルスの3'400領域におけるヒストンのアセチル化およびメチル化パターン(図14B)は、sBGCプロウイルスにおける250 bpのコア領域において見られたものに類似していた(図10)。しかしながら、sBG650およびsBG-Iプロウイルスにおいて、3' 400 bpの配列はアセチル化マークを増加させ、抑制マークを低減させたことから、再度、cHS4の近位および遠位末端の組み合わせがオープンクロマチンパターンに必要であることが明らかにされた。この効果は、sBG-I (図10DおよびF)またはsBG650 (図13FおよびG)における5'コア領域またはβ-グロビンプロモーター領域にわたるChIP分析を連想させるものであった。総合すれば、遺伝学的および後成的分析から、インスレーターおよびプロモーター上でクロマチンの後成的修飾のために相互作用して十分なインスレーター活性を損なう2つのコアとして、インスレーターの5'および3'末端が機能していたことが示唆された。
1.2 KbのcHS4はSIN-レンチウイルスベクターの力価を顕著に低下させ、対ヒト臨床試験のための大規模ウイルス産生を制限する。力価の低減の機構は、とりわけ、3'LTRにおけるインサートの長さに起因することが最近になって明らかにされている。sBGと比べて、sBG650は、sBG-Iの10.4±2倍低い力価とは対照的に、sBGよりも2.5±0.9倍だけ低い極めて理にかなった力価(n = 3)を有していた。それゆえ、最適化されたこのインスレーターを、均一な、それゆえさらに高い発現をもたらし、大規模産生へ拡張可能であろう一層安全な遺伝子治療ベクターのデザインのために用いることができる。
全てのベクターは、記述のように、レンチウイルスプラスミドのU3 3'LTR領域中のNheI/EcoRV部位へ異なるインスレーター断片をクローニングすることによって得られた。このプラスミドは、ヒト(h) β-グロビン遺伝子およびその調節エレメント(BG)を保有していた。全てのインスレーター断片は、記述のように、インスレータープラスミドpJCI3-1 (Gary Felsenfeld博士, NIH, MDから厚意により提供していただいた)を用いてPCRにより増幅され、配列決定により検証された。1.2 kbのcHS4インスレーター有りおよび無しのhβ-グロビンベクターのクローニングは、既述されている。sBG1Cベクターは、EcoRI/XbaI 250 bpコアインスレーターPCR産物を、pBSプラスミドのBamHI/EcoRI制限部位へsBGに挿入することによってクローニングされた。250 bpコアの第2のコピーを次に、pBS 1-コアプラスミドにEcoRI/KpnI部位へ付加し、かくしてpBS 2-コアプラスミドを得た。250 bpコアの2つの縦列コピーを次に、KpnI/XbaIでpBS-2コアプラスミドを消化することによって単離し、その後、sBGベクターへクローニングし、sBG2Cを得た。sBG400およびsBG800ベクターは、2つのPCR産物をsBG NheI/EcoRV部位へクローニングすることによって得られた。DNAスペーサーを含んだベクターは、次のプライマーの組み合わせ: スペーサーF1およびスペーサーR1、スペーサーF1およびスペーサーR2、を用いて異なるλ-ファージDNA部位を増幅させ、それぞれ、150 bp、550 bpのλ-DNAを増幅させることによって得られた。ClaI/EcoRI消化されたPCR断片をpBS-1コアプラスミド中のEcoRI/ClaI部位へライゲーションし、pBS-1コアプラスミドからの400 bpおよび800 bpの断片を、それぞれ、HincII/XbaIおよびXbaI/XhoIで制限消化し、sBGのNheI/EcoRV部位へクローニングした。ウイルスは、293T細胞の一過性コトランスフェクションにより産生され、MEL細胞にて力価測定された。
MEL細胞および293T細胞は記述のように、10%の熱不活化ウシ胎仔血清(FBS; U.S. Bio-technologies, Inc.)を補充したDMEM (Mediatech, Inc)中で維持され、分化された。MEL細胞は、試験かつクローニングされたベクターの各々について5%未満の形質導入効率を達成するように形質導入された。各ベクターからの3回の独立した形質導入に由来する、およそ400個のクローンをhβ-グロビン遺伝子についてPCRによりスクリーニングした; インタクトなインスレーター領域について陽性のクローンをスクリーニングした。このようにして同定されたクローンを次に、単一の組み込み体についてqPCRに供し、増幅させ、凍結保存した。クローンのセット全部を融解し、分化させ、FACSによって同時に分析した。
Hbbth3/+サラセミアマウスを移植のために用いた。全ての動物実験は、施設における動物の使用と管理に関する委員会(Institutional Animal Use and Care Committee)により承認されたプロトコルを用いて行われた。系統Sca-1+c-kit+ (LSK)の造血幹細胞/前駆細胞の濃縮は、骨髄の単個細胞懸濁液に対して免疫磁気分離およびFACS選別により行われた(補足の材料および方法S1における詳細)。LSK細胞を既述の通り12時間の間隔で2回、MOI 10にて濃縮されたベクター上清によりStem Span (Stem Cell Technologies Inc, Vancouver, BC)中で形質導入した。形質導入された10,000個のLSK細胞を、10.75 Gyの放射線照射を受けたサラセミア・レシピエントへ2×105個のLK細胞とともに同時移植した。CFU-Sアッセイ法: 個別の脾臓コロニー形成単位(CFU-S)を先に記述したように、移植後24週の一次マウスからの骨髄細胞の移植後12日の時点で調査した。
全血球算定は、Hemavet (Drew Scientific, Inc, Oxford, CT, USA)にて行われた。網状赤血球算定数は、全血1 μlをRetic-COUNT試薬(BD Biosciences, CA) 200 μlで染色することにより分析され、FACSCalibur (BD)にて数え上げられた。RBC中のhβ-グロビンタンパク質の定量分析は、既述のように高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)によって血液の溶血血液に対し行われ、mRNA分析は、正規化用のネズミ科α-グロビンを用い、hβ-グロビンに特異的な検証済みのプライマーおよびプローブを用いてリアルタイムRT-PCR (ABI Biosystems)により行われた。hβ-グロビンの細胞内染色後のFACS分析は、既述のように行われた。
ChIP分析は、若干の変更を加えて記述のようにMELクローンに対して行われた。手短に言えば、インプットおよび抗体結合クロマチン画分からのDNAサンプルを、三つ組でプライマーセットを用いSYBRグリーン(Applied Biosystems)を使ってqPCRにより分析し、データを既述のように分析した。濃縮比を、DNA-ChIPのDNAインプットに対する比を計算することによって割り出し、ヒストン修飾データを、「抗体なし」(IgG)対照ならびにネクジン5'領域およびプロモーター領域に対応するプライマーに対し、抑制されたクロマチンの対照として正規化して、免疫沈降の効率を正規化した。全てのDNA-ChIP 対 DNA-インプット比は、[希釈率(ChIP)/希釈率(インプット)]で除した2[Ct (インプット) - Ct (ChIP)]として計算された。全てのPCR産物のCt値は、SDS 1.2ソフトウェア(Applied Biosystems)によって特定された。平均およびSEM値を倍相違、および対応のある両側t検定について特定し、統計的有意性(p<0.05)の判定を行った。
ライゲーション媒介性(LM)ポリメラーゼ連鎖反応を、Modlichらにより記述されているように行って、記述したプライマーおよび条件を用い組み込み部位をマッピングした(Arumugam, Mol Ther 2009, 近刊で引用)。
ベクターをsBGベクターと比較した; スチューデントの「t」検定(対応のないおよび両側)。多重比較のために群間でANOVA (ダネット型多重比較検定)も行われた。データは平均±SEMとして表現された。P<0.05を有意と見なした。
1.2 Kbニワトリ高感受性部位-4インスレーターエレメント(cHS4)が隣接する自己不活化レンチウイルスは、導入遺伝子の、一貫した、改善された発現を提供するが、しかし著しく低い力価を有する。内部カセットでさらに1.2 Kbだけレンチウイルス導入遺伝子カセットを長くしても、さらなる力価の低減は引き起こされなかった。しかしながら、cHS4配列またはサイズを増加させる不活性なDNAスペーサーを3'LTRの中に配置した場合、感染力価はインサートの長さに比例して減少した。大きなcHS4 3'LTRインサートを保有するベクターによって影響を受けるベクターライフサイクルのステージを、対照ベクターと比較した: 3'LTR中の1.2 Kb cHS4の挿入によって読み過し転写の増加は認められなかった。等量の全長ウイルスmRNAがパッケージング細胞において産生され、ウイルスアッセンブリ/パッケージングが影響されることはなく、どちらのベクターによっても同じ量のインタクトなウイルス粒子が産生された。しかしながら、3'LTR中のcHS4を保有しているレンチウイルスは、標的細胞への侵入後に非効率的にプロセッシングされ、逆転写および組み込み効率が低く、ゆえに形質導入の力価は一層低かった。それゆえ、3'LTR中に大きな挿入を有するベクターは、効率的に転写されパッケージングされるが、しかしLTRインサートはウイルスRNAプロセッシングおよび標的細胞の形質導入を妨げる。これらの研究は、組み込みベクターのデザインにおいて重要な意味合いを持つ。
本研究の1つの目的は、cHS4による力価の低減が、他の点では大きなhp-LCR (BG)レンチウイルスベクターにおけるウイルスゲノムのさらなる延長のため二次的に起きたものかを判定することであった。大きなウイルスRNAゲノムは、組み込みベクターにおいて低い効率でパッケージングされることが知られている。複製可能なγ-レトロウイルスは、付加された配列を取り除き、再結合させて、その当初のウイルスサイズに戻す。ウイルスの天然サイズを超えるγ-レトロウイルスベクターにおいて、力価の低減はウイルスライフサイクルの複数の段階 - 全長ゲノムの作製、ウイルスキャプシド形成/放出および侵入後の組み換え事象で起こる。とりわけ、BGレンチウイルスはおよそ7 Kbの導入遺伝子インサートを含み、それゆえ野生型HIV-1ウイルスの天然サイズ/パッケージング能よりも大きなウイルス-RNAゲノムを産生しない。しかしながら、レンチウイルスベクターにおいて、導入遺伝子インサート6 Kbまたはそれ以上に由来するウイルス力価の低下が、パッケージング効率の低減の結果起きることが示されている。
用いたLVベクターはHIV-1ウイルスの天然サイズを超えていなかったが、cHS4インサートのサイズ(1.2 Kb)は野生型LTRの天然サイズを超えていた(注目すべきはwt LTRが付加的な400 bpのU3エンハンサーを保有することであり、これは自己不活化3'LTRからは欠失される)。実験を行って、ウイルス力価の低下がその天然の最大限度(400 bp)を超えるSIN LTRの延長によるものであったかどうか、またはウイルス-RNAの折り畳み/細胞タンパク質への結合に影響を与え、かくしてパッケージングを制限する可能性のある、インスレーター中の特異的配列によって力価が低くなったかどうかを判定した。自己不活化レンチウイルス骨格sSINにおいて、3'LTRの中に異なる長さのcHS4断片: コアとも呼んだ、インスレーターの最初の250 bp、3' SIN LTR中のU3プロモーター/エンハンサー欠失のサイズに適合している、400 bpのcHS4断片、および800 bpのcHS4断片、を保有している、一連のp-グロビンベクターを構築し(図15a)、それぞれ、sBGc、sBG400、sBG800ベクターを作製した。これらのベクターを、類似の「非絶縁」ベクターsBG、および全長1.2 Kbのインスレーターを保有しているベクターsBG-Iと比較した。加えて、縦列反復配列(250 bp×2)としての2コピーのコアを伴ってベクターをクローニングした(sBG2C)。cHS4コアは全長(1.2 Kb)インスレーターのエンハンサー遮断活性の50%を有することが明らかにされている; コアの効果はコピー数に依存することが明らかにされており、cHS4コアの縦列反復配列が全長1.2 KbのcHS4と同じ絶縁性能を有することが報告されている。
組み換え事象がLTR中の2コピーのコアまたは異なるサイズの断片の挿入の結果LTR中で行われるかどうか検出するために、絶縁ベクターの系列の全て(sBGC、sBG400、sBG2C、sBG800およびsBG-I)で形質導入されたおよそ12〜20個のMEL細胞クローンを作製した。組み込まれたプロウイルスの単一コピーを持った全てのクローンを、既述のように、qPCRを用いて同定した。各クローンのゲノムDNA由来の250 bpのコアを次いで、標準的なPCRにより増幅させた。インスレーターコア配列は、sBG2C形質導入細胞に由来するものを除き、全てのベクターに由来するクローンから増幅させることができた。sBG2C MELクローンにおいて、インスレーターコアはPCRにより24個中6個(25%)の単一コピークローンにおいて検出不能であったことから、プロウイルスの5'および3' LTR中のcHS4コア配列の縦列反復配列の両方の欠失が示唆された(図20D)。組み換えプロウイルスの頻度をさらに分析するため、sBG2C形質導入MEL細胞プールに対するゲノムサザンブロット分析を行った。sBG2CおよびsBG-I MEL細胞集団由来のゲノムDNAは、LTR内で切断する酵素によって制限消化された。図15Eは、sBG2Cベクターおよび対照として用いたsBG-Iベクターで、予想された長さのプロウイルスを示す。sBG-I形質導入MEL細胞において単一のプロウイルスバンドが見られたが、MEL細胞中のsBG2CプロウイルスはcHS4コア配列の一方または両方のコピーの喪失を示した。実際に、2つのインタクトなコアコピーを含んだプロウイルスのバンドは、サザンブロット分析の感度のレベルでは検出されなかった。これらのデータから、sBG2C中の縦列反復配列が高い頻度で組み換えられることが明らかである。sBG2Cベクターは、それゆえ、LTRインサートのサイズではなく、逆転写中の組み換え事象によって一層低いウイルス力価を有していた。これらの結果は、γ-レトロウイルスおよびレンチウイルスベクター内の反復エレメントが頻繁に組み換えを行うことが明らかにされていたので、予想外というわけではなかった。
RNAベクター中の大きなウイルスゲノムは、RNAパッケージングのレベルで制限されることが明らかにされている。本研究において、1.2 Kbまでウイルス負荷量を増加させても力価に及ぼす効果は認められなかったが、LTR中のインサートの長さを増加させることで力価が減少した。次に、これがウイルス力価に影響を与えた機構について探索した。ウイルスライフサイクル中の以下の段階について研究した: 1) パッケージング細胞中で産生されたウイルス-RNAの特徴、2) ウイルス粒子産生、3) 侵入後の段階: 逆転写、核移行、組み込みおよびプロウイルス完全性。これらの研究の全てで、最大のインサートを有するベクターsBG-Iを、インスレーターのないベクターsBGと比較した。
パッケージングプラスミド(D8.9およびVSV-G)とともにsBG、sBG-Iベクタープラスミドを用いた一過性トランスフェクション後の293Tパッケージング細胞に由来するRNAに対してノザンブロット分析を行った。ブロットをhp断片でプローブした。図16は、sBGおよびsBG-Iベクターの、予想された長さの類似した強度のウイルス-RNA転写産物を示す。プローブは28Sおよび18S RNAを非特異的にプローブした。それにもかかわらず、予想された長さの全長ウイルスRNA以外のさらなるバンドは認められず、インスレーターの挿入によって組み換えまたは異常なスプライシングが行われなかったことが示唆された。かくして、ウイルス-RNAはLTR中のインサートの存在に関係なく、パッケージング細胞において効率的に産生された。
実験を行って、LTR中のウイルスポリアデニル化シグナル上流のcHS4インサートがウイルスRNAの転写産物終結を損ないうるかどうか判定した。読み過し転写産物は、キャプシド形成から排除されることが明らかにされており、ウイルス力価を低下させうる。図16中のノザンブロットから、予想されるサイズのウイルス-RNAバンドと、外来の転写産物のないことが示されたが、転写の読み過しは、γ-レトロウイルスベクターと比べて、レンチウイルスベクターでははるかに低く、ノザンブロットを介して容易に検出できないかもしれないことが示された。それゆえ、感受性酵素に基づくアッセイ法を用いて、読み過し転写を研究した。
ウイルス-RNAがウイルス粒子へ効果的にキャプシド形成されたかどうか判定するため、p24レベル、ウイルスに関連した逆転写酵素(RT)活性およびウイルス-RNAレベル(図17a〜c)を測定した。ウイルスを2つのベクターで同時に同一の方法で作製し、3回の別実験において同様に濃縮した。ウイルス調製物の純度が高いことおよびタンパク質またはプラスミド混入が無いことを確実にするため、ウイルスをスクロースのクッション上でペレット化し、これらの実験のためにDNAse消化に供した。プラスミド骨格中に存在するアンピシリン耐性遺伝子に対するqPCRにより、プラスミド混入の欠如を確認した。同じ量のウイルス調製物を次いで、p24 ELISAおよびウイルスに関連したRTのアッセイ法に供した; ウイルス-RNAをドットブロット分析のために抽出した。図17aは、2つのベクター間でウイルス関連RTの量に差異がなかったことを示している。また、sBGおよびsBG-Iウイルス調製物中のp24レベルも類似していた(図17b)。sBG-Iウイルス粒子がウイルスゲノムを含有し、空のウイルス様粒子ではないことを確実にするため、ウイルスをRNAドットブロット分析に供した。図17c〜dは、2つの代表的実験のうちの1つを示す。sBGおよびsBG-I由来のウイルスRNAを4つの異なるp24希釈液に二つ組で負荷した(図17c); ドットの強度をホスホイメージャによって定量化した(図17d)。どちらのベクターからキャプシド形成されたウイルスmRNAの量も同様であった。これらのデータから、LTR中1.2 Kbの断片の挿入がウイルスmRNAのパッケージング効率またはウイルス粒子の産生に影響を与えなかったことが示唆される。
逆転写、核移行、組み込みおよびプロウイルス完全性を含む、侵入後の段階について調べた。逆転写: 逆転写の段階、qPCRプライマーおよびプローブの位置ならびにウイルスDNA産物が図18aに要約されている。逆転写はゲノムRNAの5'末端近くのプライマー結合部位から開始し、マイナス鎖合成がゲノムの5'末端へ進行する(マイナス鎖強力停止DNA (-sssDNA))。新たに形成された-sssDNAは、ゲノムの3'R領域とアニールし(第1鎖移転)、ウイルスRNA鋳型のRNase H消化を伴って、マイナス鎖DNA合成が再開する。逆転写プロセスが効率的であるためには、3'末端のウイルスRNAの二次構造が、-sssDNA移転の重要な決定因子であることが明らかにされている。それゆえ、3'LTRのU3領域中のインスレーター/インサートの存在が、この複雑なプロセスに関与する領域の二次構造を変化させ、逆転写効率の全体的な減少を引き起こす可能性が高い。
BG、BGM、BG-IおよびBGM-Iベクターのクローニングは、既述されている。その他全てのベクターは、sSIN骨格へクローニングされた(詳細はUrbinati F、Xia PおよびMalik P, 検討中の原稿に提供されている)。ベクターは全て、既述のように、ヒトβ-グロビン遺伝子ならびに高感受性部位2、3および4断片を保有した、sSIN LVベクタープラスミドのU3 3'LTR領域に挿入された固有のNhe I/EcoR V部位へ異なるインスレーター断片をクローニングすることによって得られた。鋳型としてインスレータープラスミドpJCI3-1を用いてPCRにより、インスレーター断片を増幅させた。全ての単位複製配列はPCRの後、および3'LTRへの挿入後に配列決定された。非絶縁β-グロビンベクターおよび全長1.2 KbのcHS4インスレーターを保有しているもののクローニングは、既述されている。手短に言えば、1.2 Kbのインスレーター断片は、pJCI3-1プラスミドをXba Iで消化することにより得られ、sBGのNhe I/EcoR V制限部位へクローニングされた。sBGCは、pBS 1コアプラスミドからの250 bpコアを含んだEcoR I/Xba I断片を、sBGベクターへ挿入することによりクローニングされた。後者は、(本明細書において記述されるように、Core 1FおよびCore 1Rプライマーを用いて) 250 bpのコアインスレーターPCR産物をpBSプラスミドのBamH I/EcoR I制限部位へクローニングすることにより得られた。250 bpコアの第2のコピーを次に、pBS 1コアプラスミドにEcoR I/Kpn I部位へPCR産物(Core 2FおよびCore 2R)をクローニングすることによって付加し、pBS 2コアプラスミドを得た。250 bpコアの2つの縦列コピーを次に、Kpn I/Xba Iで後者のプラスミドを消化することによって単離し、その後、sBGベクターへクローニングし、sBG2Cを得た。sBG400およびsBG800ベクターは、2つのPCR産物を(それぞれ、InsFおよびIns400RプライマーならびにInsFおよびIns800Rプライマーを用いて) sBG Nhe I/EcoR V部位へクローニングすることによって得られた。sBG650ベクターは、sBG1cベクターのEcoRV/BspEI部位にインスレーターの3' 400断片をクローニングすることによって得られた。3' 400断片は、以下のプライマー: 3' 400 R (BspEI)および3' 400 F (EcoRV)を用いてプラスミドpJCI3-1からPCR増幅された。
ネズミ科赤白血病細胞(MEL)株および293T細胞は、10%の熱不活化ウシ胎仔血清(FBS) (U.S. Bio-technologies, Inc.)を補充したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM, Mediatech, Inc)中で維持された。MEL細胞は、既述のように、20% FBSおよび5 mM N,N'-ヘキサメチレンビスアセタミド(Sigma)を含有するDMEM中で分化するように誘導された。単一の組み込み体クローンを導出するため、形質導入されたMEL細胞をクローニングし、クローンをPCRによりβ-グロビン配列についてスクリーニングし、形質導入されたクローンを同定した。単一のコピークローンをqPCRによりレンチウイルスy-配列について同定し、cHS4コア配列に対するPCRを単一の組み込み体クローンに対し行って、プロウイルスにおけるインスレーター配列の存在を確認した。
抗ヒトHbA抗体を用いた染色は、既述されている通りであった。手短に言えば、細胞を室温で60分間4%パラホルムアルデヒド中で固定し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で1回洗浄し、ペレットを5分間100%メタノールに再懸濁させた。固定された細胞を次に、PBSで洗浄し、非特異抗体(Ab)結合を室温で10分間、5%スキムミルクを用いてブロッキングした。その後、細胞をPBS中で洗浄し、ペレット化し、透過処理した。細胞を2本のチューブに分け、暗所中にて室温で30分間、陰性対照として抗ζグロビン-フルオレセインイソチオシアネート(FITC) (1 μg/106個の細胞)または抗HbA-FITC (0.1 μg/106個の細胞) (Perkin Elmer)のいずれかで染色した。未結合のAbをPBSでの最終の洗浄により除去した後に、それらをFACS Calibur (Becton Dickinson)にて分析した。
ベクタープラスミド、パッケージング(それぞれ活性または不活性組み込み酵素用のΔ8.9またはΔ8.2)プラスミドおよびVSV-Gエンベローププラスミドを用いて、既述のように、293T細胞の一過性コトランスフェクションによりウイルスを産生させた; ウイルスを含有する上清を、トランスフェクションから60時間後に回収し、超遠心分離によって濃縮した。実験中の全ベクターが同時にパッケージングされた。ウイルスをDNaseおよび/またはDpnIで処理して、プラスミドDNAの混入を取り除き、20%スクロースのクッション上に重層して、結果の中に示されたベクターライフサイクルに関する特定の実験用に精製されたウイルス粒子を得た。90分間25,000 rpmでの超遠心分離後に全てのウイルス上清から1400倍にウイルスが濃縮された。マウス赤白血病(MEL)細胞に濃縮ウイルスの連続希釈液を感染させ、それらを分化させ、それらを蛍光活性化細胞ソータースキャナ(FACS)によりHbA発現について分析することにより、ウイルス力価を測定した。
トランスフェクションから72時間後に、RNA-STAT (Tel-Test, INC, Texas)を用いて293T細胞から全RNAを抽出した。ノザンブロットを次に、標準的なプロトコルにしたがって行った。ブロットを32-P標識β-グロビンプローブとハイブリダイズさせた。
QIAamp Viral RNA Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA)を製造元の使用説明書にしたがって用い、同じ量の濃縮ウイルスからウイルス-RNAを抽出した。手短に言えば、ウイルスを高い変性条件の下で溶解させ、その後、シリカゲルに基づく膜に結合させた。2回の洗浄段階により混入物が効率的に洗い流され、v-RNAがDEPC-H2O 30 μl中に溶出された。溶出後、ウイルス-RNAを増幅品質等級のDNAse I (Invitrogen)により室温で20分間処理した。サンプルを65℃でインキュベートすることにより、DNaseを不活化させた。ウイルスRNAを次に、65℃で15分間、3容量の変性用緩衝液(65%ホルムアミド、8%ホルムアルデヒド、MOPS 1×)中で変性させた。変性後、2容量の氷冷20×SSCを添加し、ドットブロット装置を通じた吸引によってナイロン膜にRNAを結合させた。ブロットを32-P標識β-グロビン特異的プローブとハイブリダイズさせ、フィルムを終夜感光させた。ドットの定量化は、ホスホイメージャ(Biorad, Hercules, CA)で行った。
濃縮ウイルス(1 μL)、および連続希釈液(10分の1、100分の1、1000分の1)を溶解させ、「Reverse transcriptase (RT) assay, colorimetric」Kit (Roche)のプロトコルにしたがって処理した。手短に言えば、濃縮ウイルス粒子を溶解用緩衝液で溶解させ、ジゴキシゲニンおよびビオチン標識ヌクレオチドを用いてウイルス-RNAを逆転写させた。RT活性のパラメータとしての合成DNAの検出および定量化は、サンドイッチELISAプロトコルにしたがった: ストレプトアビジンで予めコーティングされたマイクロプレートモジュールの表面にビオチン標識DNAを結合させた。次の段階で、ペルオキシダーゼに結合された、ジゴキシゲニンに対する抗体(抗DIG-POD)を、ジゴキシゲニン標識DNAに結合させた。最終の段階で、ペルオキシダーゼ基質ABTSを添加し、この結果、有色の反応生成物が生じ、これを405 nmの波長で、ELISA読み取り機を用いて定量化した。有色生成物の量は、サンプル中のRT活性のレベルと直接的に相関があった。
P24抗原濃度をHIV-1 p24 Antigen EIA Kit (Beckman Coulter)によって測定した。手短に言えば、連続的に希釈されたウイルスを溶解させ、p24抗原でコーティングされたマイクロウェル上でインキュベートし、製造元のプロトコルにしたがって洗浄した。分光光度計を用い450 nmの波長で色吸光度を測定した。p24アッセイ法は二つ組で行われた。
プロウイルスの完全性を分析するため、本発明者らはMEL細胞に感染させ、それらを21日間増殖させ、Qiagen Blood and Cell culture DNA Mini Kit (Qiagen)を用いてDNAを抽出した。LTR中で切断をする酵素Afl IIを用いてDNA 10 μgを消化した。ウイルス線状DNAの存在を判定するため、ゲノムDNAをMEL細胞の感染から72時間後に抽出し、プロウイルス内で2回切断をする酵素Stu Iで制限消化した。DNAを0.8%アガロースゲル上で分離し、ナイロン膜に転写し、β-グロビン断片で終夜プローブした。
同量のp24を用いて、8 μg/mLのポリブレンの存在下、DMEM培地中で、MEL細胞にsBGおよびsBG-Iベクターを形質導入した。異なる時点(0.5時間、3時間、6時間、8時間、12時間、24時間、48時間、72時間)で細胞を収集し、Qiagen Blood and Cell culture DNA Mini Kit (Qiagen)を用いてDNAを抽出した。単一コピーMELクローン(単一の組み込み体についてサザンにより確認された)からのゲノムDNA (50 ng)を非形質導入DNAで希釈して、コピー数の標準(1〜0.016コピー/細胞)を作製した。RT産物用のプライマーおよびプローブは、Applied Biosystems, Foster City, CAのPrimer Express Softwareを用いてデザインされた。初期RT産物(R/U5) qPCRアッセイ法のためのプライマーおよびプローブ配列は、フォワードプライマー:
、リバースプライマー:
である。反応はTaqMan MGB Probe:
を用いて行った。中間体RT産物(U3/R) qPCRアッセイ法のためのプライマーおよびプローブ配列は、フォワードプライマー:
、リバースプライマー:
である。反応はTaqMan MGB Probe:
を用いて行った。後期RT産物アッセイ法(psi)の場合、プライマーはプロウイルスのΨ領域を認識するようにデザインされた: フォワードプライマー:
、リバースプライマー:
。反応はTAMRA色素をクエンチャとしTaqMan Probe:
を用いて行った。負荷の正規化は、マウスアポB遺伝子対照を用いて行った。サイクリング条件は、50℃で2分および95℃で10分、その後、40サイクル×15秒間95℃および1分間60℃であった。2LTRサークル用のプライマーおよびプローブは、既述されている通りであった。Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR System Base Unit中で96ウェルプレート用サーマルサイクラ・プロトコルにしたがいPCR混合物をサーモサイクリングさせた。
鎌状赤血球貧血(SCA)は、鎌状ヘモグロビン(HbS)を結果的にもたらす、グロビン遺伝子(βS)における点突然変異から生じる。HbSは脱酸素によって重合し、微小血管系を閉塞させる鎌状形RBCを結果的にもたらす。SCAを有する患者は、急性間欠性血管閉塞および累積臓器障害を有し、寿命を42〜58.5年まで減らす。鎌状赤血球化の他に、溶血亢進および慢性炎症状態が存在する。SCA患者は1年あたり入院およそ75,000回分を占め、米国だけで12億ドルの予想年間支出額を生じる。世界中で、SCAは単一遺伝子病の発症率でサラセミアに次ぎ第2位であり、アフリカでは毎年200,000超の小児が生まれている。
レンチウイルスベクターを保有するβ-γ-グロビンハイブリッド遺伝子I8H β/γW,11は、「成体様」グロビンを発現している赤血球系細胞において高いγ-グロビンmRNAを発現することが実証されている。全てのβ-グロビンコード配列を部位特異的突然変異誘発法によりγ-グロビンに変化させ、γ-β-グロビンハイブリッド遺伝子、およびLCRエレメントをウイルス転写単位へ逆方向にクローニングして、sGbGレンチウイルスベクターを作製した。ウイルスは293T細胞のコトランスフェクションで作製された。
6〜20週齢BERK鎌状赤血球マウス由来の骨髄を集め、ビオチン化CD5、CD8、B220、Mac-1、CD11b、Gr-1、およびTER-119抗体ならびに磁気ビーズで系統枯渇させた。無ビーズ細胞をSca-1、c-kitに対する抗体で染色した。7-AAD-、系統-、c-kit+次いでSca-1+であった細胞(LSK細胞)をFACSVantage (BDBiosciences)にて選別した。Berkeleyトランスジェニック鎌状赤血球マウスおよびC57/BL6マウスを用いた全ての実験は、Cincinnati Children's Hospital Medical Centerにより承認されたプロトコルにしたがって行われた。
移植の容易さおよび正常レシピエント(9.5 +/- 0.6週齢)の入手しやすさのためにBERK3C57Bl/6マウスから、11.75 Gyの放射線照射後に骨髄破壊的移植が行われた。放射線照射対照実験から、8〜9 Gyの放射線照射を受けているBERKマウスは、LSK細胞を受けないで生存することが示された; 致死量はC57Bl/6マウスにおけるよりも低かった。10.5 Gy超を受けているBERKマウスは、LSK細胞が投与されない場合には死亡した; LSKのレスキューを受けたものは長期生存した。BERKマウスは所与の時点で大量に飼育することが難しく、それゆえ、致死未満量を特定するために放射線量レベル当たりマウス2匹とした。全BERKレシピエント(12.9 +/- 0.4週齢)が移植前後3回のRBC輸血を受けた(1〜7日目)。移植から1年後のBERKレシピエントにおける臓器病態を、移植を受けなかった12週齢BERKマウスと比較した。かなりの程度のドナーHSCキメラ現象を可能とするために、放射線照射は4 Gyの、古典的な強度軽減放射線量よりも高かった。ある範囲のMOIを用いて、移植片中の形質導入ドナーHSCの比率を変化させた。LSK細胞を終夜予備刺激し、BERK3C57BL/6移植の場合にはMOI 30で、およびBERK→BERK移植の場合にはMOI 30〜100で22〜24時間2回形質導入した; 10,000〜24,000個のLSK細胞および非形質導入LK細胞を、レシピエントC57BL/6またはBERKマウスへ同時移植した。
コピー数分析は、既述したプライマーおよびプローブを用いてリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応によりゲノムDNAに対して行われた。
血液分析は、マウスの設定の下でHemavet 950FS (Drew Scientific)にて得られた。網状赤血球分析は次のように行った: 血液0.1 μLおよびBD Retic-COUNT Reagent 200 μLを混合し(Becton Dickinson)、30分間室温でインキュベートし、蛍光活性化細胞選別(FACS)によって分析した。
既述のように、酢酸セルロースプレート上でヘモグロビン電気泳動を行った。PolyCATAカラム(品目番号3.54CT0510; Poly LC Inc)を用いAlliance 2690 HPLC機器(Waters)でイオン交換高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)を行った。
連続視野内500個のRBCをスコア化することにより、不可逆性鎌状赤血球(ISC)を数え上げた。段階的な脱酸素化は、圧力測定を用いて行われた。レーザー支援光学的回転細胞分析装置(LORCA; RR Mechatronics)を用いて、RBC変形能を判定した。
マウスに1時間差で別々2回の注射としてPBS 300 μL中3 mgのSulfo-NHSビオチン(Sigma)を注射した; 一連の時点で2〜5μL採血し、APC-Cy7結合ストレプトアビジンで染色した。
脾臓、肝臓、骨、脳、および腎臓を収集し、10%ホルマリン5 mL中に入れた。パラフィンブロックを切片にし、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。
sGbGベクターは、γ-グロビンエクソンならびにβ-グロビン非コード領域および調節領域を保有する。高レベルのヒトβ-グロビンを発現する、以前に研究されたsBGベクターに基づき、Berkeley鎌状(BERK)マウス由来の13 sGbG形質導入LSK細胞を、致死的な放射線を浴びた(骨髄破壊された)正常C57Bl/6Jマウスへ移植した(sGbGマウスと名付けた)。移植に先立ち同じ骨髄プール由来のBERK LSK細胞に対するモック形質導入により、SCAを有するマウスが得られた。sGbGマウスにおけるRBCの大部分は、HbFを発現していた。電気泳動およびHPLCによる残存レシピエントネズミ科ヘモグロビンの証拠のない、100%ドナー(HbS+) RBCを有するsGbGマウスだけを、血液学的、機能的、および病理学的分析のために分析した。少ない割合のレシピエントネズミ科RBCを有するsGbGマウスは、HbF/ベクターコピーおよび形質導入HSCの頻度を評価するためにだけ用いられた。FACSにより定量化された、血中HbF (HbF/HbS+HbF)の割合は、6ヶ月間追跡された一次マウスにおいて、および7.5ヶ月間追跡された二次レシピエントにおいておよそ40%であった(図21A)。3分の2のRBCがF細胞であった; その比率はまた、一次および二次レシピエントにおいて安定していた(図21B)。F細胞の比率およびベクターコピーは、HbFと相関していた(図21C〜D)。総合すれば、これらのデータから、RBCの大部分において安定な長期発現でsGbGベクターからの顕著なHbF発現が明らかである。
図21EはsGbGマウスにおける血液学的パラメータの改善を示す。網状赤血球の比率は、モックマウスでのおよそ50%からsGbGマウスでのおよそ15%まで減少した(P < .005; 図22A)。12週までに貧血の是正が認められ、これは移植後の期間中、持続した(図22B〜C)。
24週時の骨髄、脾臓、肝臓、および腎臓から臓器病態の完全予防が示された。モックマウスでの重症赤血球過形成からの閉塞濾胞構造と比較すると、骨髄および脾臓中の赤血球過形成の低減、脾臓サイズの減少、ならびに脾臓濾胞構造の保存が認められた。モックマウスにおいて見られた巣状尿細管萎縮および分節状糸球体梗塞は、sGbGマウスの腎臓には存在していなかった。モックマウスの肝臓において見られた梗塞および髄外造血は、sGbGマウスの肝臓には存在していなかった(図23Gは全マウス群におけるデータを要約している)。全体として、軽度の赤血球過形成を除き、sGbGマウスでは臓器病態は観察されなかった。
BERK鎌状赤血球マウスの寿命は最近の処置法前の、SCAを有するヒトと同様、顕著に低減される。カプラン・マイヤー生存曲線から、モックマウスでの20%生存とは対照的に、24週の時点でsGbGマウスの100%生存が示された(n=14, P<.001)。
骨髄破壊的前処置は遺伝子修正されたドナーHSCの非競合的再生を可能にし、高い導入遺伝子改変HSCの生着および導入遺伝子発現をもたらす。骨髄破壊的前処置により達成された高レベルγ-グロブリン発現は、是正には必要ではない可能性があり、もしそうなら、移植に関連した罹患率を低減するものと仮定された。
血液学的パラメータは、移植後初期の期間における持続輸血RBCによって、18週の時点で安定化した。sGbG<10マウスでの小さくて一貫性のない改善とは対照的に、sGbG≧10群のマウスでは血液学的パラメータの顕著な改善が認められた(図23G)。
鎌状赤血球化: sGbG≧10マウスではISCのかなり有意な低減(P<.005)が、およびsGbG<10マウスではISCの小さいが、しかし有意な低減が、モック/BERK対照と比べて認められた(P<.05, 図24E)。sGbG≧10マウス由来RBCは、sGbG<10またはモック/BERKマウス由来RBCと比較したところ、段階的な低酸素状態に曝露された場合に鎌状赤血球化の低減を示した(n=20, P<.01; 図24F)。対照的に、sGbG<10マウスとモック/BERKマウスとの間には鎌状赤血球化の有意差はなかった。(2) RBC膜変形能: 驚いたことに、sGbG<10マウスおよびモック/BERKマウス由来のRBCでの低酸素状態による同程度の鎌状赤血球化にもかかわらず、sGbG<10マウスではRBC変形能のわずかな改善が認められた。しかしながら、これらの差異は、高いバラツキのためモック/BERKマウスとは統計的に有意なものではなかった(図24G)。対照的に、sGbG≧10マウスではRBC変形能の、一貫して有意な改善が認められた(P<.001, 図24H)。変形能のパターンから、大血管および微小血管を通るRBC流の改善が示唆された。(3) RBC生存性: BERKマウスのRBC半減期は1.5日であった。1%、3%および7%のHbFを有するsGbGマウスのRBCは、顕著に高い半減期(2日)を有していた。18% HbFを有する2匹のsGbGマウスは、骨髄破壊的移植モデルにおいて40% HbFを保有するマウスで見られたものと同様の、4倍増となる、6日のRBC半減期を示した。
このBERK→BERK移植モデルの1つの独自の特徴は、(移植を受けた時のレシピエントマウスと比較可能な年齢のBERK対照を用いて判定された)移植時のレシピエントにおける顕著な鎌状赤血球病態の存在であった。それゆえ、遺伝子治療後の臓器病態の好転の可能性を評価することができた。移植後およそ50週の時点の生存マウスにおける臓器病態を、移植を受けなかった3ヶ月齢のBERKマウスと比較した(図25A; 図25C)。sGbG<10群のマウスは、臓器病態のわずかな改善を示した: 脾臓重量のわずかな低減が認められた(sGbG<10マウスで717±162 mg vs BERK/モックマウスで870±71 mg; P値, NS)。骨髄および脾臓は中等度から重度の赤血球過形成を示した; 肝臓には梗塞および髄外造血が有った; 腎臓は偶発巣状分節性病変、巣状尿細管萎縮、および血管うっ血を示した(図25D)。対照的に、臓器病態の劇的な好転がsGbG≧10マウスで見られた: 363±85 mgへの脾臓重量の50%低減、脾濾胞の保存、ならびに骨髄および脾臓における軽度の赤血球過形成が認められた。注目すべきことに、巣状尿細管萎縮の単病巣を有するマウス1匹を除いて、肝梗塞も腎臓病態も検出されなかった。全体として、sGbG≧10マウスは臓器病態の是正を示した。3ヵ月齢のBERK対照と比べて15ヵ月齢時のsGbGマウスにおいて臓器病態が無いことから、強度軽減移植という設定でのsGbGベクターによる遺伝子治療がさらなる臓器障害を防ぎ、移植時に既存する臓器障害がおそらく再生から好転することが実証される。
sGbG<10マウスまたはモックマウスと比較してsGbG≧10マウスにおいて全生存性の有意な改善が認められた(図25B; P<.05)。実際に、24週の時点で、sGbG≧10マウスの生存性は、24週間追跡調査された骨髄破壊的移植モデルでおよそ40%のHbFを有するマウスでの生存性と同程度であった。モックマウスと比較してsGbG<10マウスでの初期生存性のいくらかの改善が認められた(P<.05)。しかしながら、1年までに、モックマウスと比べてsGbG<10マウスの生存性の差異は認められなかった。
ビオチン表面標識化および細胞内HbF染色を用いて、F細胞および非F細胞の生存性を同じ動物で研究し、これによって鎌状RBC生存性および変形能の改善に必要なHbF/F細胞の定量化が可能となった。F細胞は、予想通り、選択的な長期生存性を示した(図26A)。BERK3C57Bl/6モデルでのsGbGマウスにおける平均HbF/F細胞20は、64%であった(これらのマウスにおいて、HbFは41%±5%であり、F細胞は64%±6%であった)。強度軽減移植モデルにおいて、sGbG 10マウスは32%のHbF/F細胞を有し(これらのマウスにおいてHbFは21%±2%であり、F細胞は65%±14%であった)、sGbG<10マウスは13%のHbF/F細胞を有していた(HbF, 4%±0.1%; F細胞, 30%±9.4%)。留意すべきは骨髄破壊的モデルにおけるsGbGマウスおよびsGbG≧10マウスが類似のF細胞再生(64%〜65%)を有し、鎌状赤血球表現型を是正するのに32%のHbF/F細胞で十分なことが示唆された。しかしながら、13%のHbF/Fおよび30%のF細胞を有するsGbG<10マウスは、疾患表現型の改善が一貫性なくほんのわずかであった。
sGbGマウスにおいてsGbGで形質導入されたHSCの比率を、両モデルにおいて6ヶ月の時点で行われた二次的な脾臓コロニー形成単位(CFU-S)アッセイ法により分析した(図27A〜B)。骨髄吸引を、1年間追跡調査したBERK→BERKマウスにおいて6ヶ月の時点で行った。形質導入されたCFU-S'sの比率をHbF発現によって割り出した。全てのベクター陽性CFUが、β-グロビンをコードする同一のベクターにおいて導入遺伝子を発現することが以前に示されている。骨髄破壊的前処置群におけるsGbGマウスは、16%〜87%のsGbG形質導入CFU-S'sを有し(平均HSC形質導入はおよそ50%であった)、強度軽減群におけるものは5%〜60%の形質導入HSCを有していた(平均HSC形質導入はおよそ30%であった)。強度軽減モデルでは、最初の6ヶ月中のsGbG<10%マウスの一層高い死亡率のために二次的に、HSC形質導入が過大評価されることに注意すべきである。
有効な遺伝子治療に必要な遺伝子改変HSCの割合は、この疾患において重要である。SCA骨髄に関するインビトロでの研究は、小規模でのみ行うことができ、HSCではなく、前駆細胞での是正を読み取るものであろう。HSCの是正が長期分析によりSCAのヒト化モデルで示された。ヒトサラセミア骨髄CD34+細胞の注射により産生されるRBCの数が極端に限られていることは、鎌状赤血球化に関する研究を抑制するものである。それゆえ、GFPレンチウイルスベクターおよび重症複合免疫不全(SCID)-再配置アッセイ法を用いて、臨床前の規模拡大のために正常ヒトCD34+細胞へのレンチウイルスの形質導入を最適化した。GFPレンチウイルスベクターで形質導入された顆粒球コロニー刺激因子-動員末梢血CD34+細胞を非肥満糖尿病(NOD)/LtSz-scid IL2Rγヌル(NSG)マウスへ移植した。ここで、モックマウスは、生着およびクローン形成能に及ぼす形質導入の効果の対照として、選別直後に非形質導入CD34+細胞の移植を受けたものであった。6週の時点で、CFUをNSGマウスに由来する骨髄からプレーティングし、36個の個別のCFU/マウスを遺伝子標識コロニーの割合について分析した。18時間の形質導入は、生着またはクローン形成能に影響を与えなかった(データは示されていない)。ヒトサラセミアCD34+細胞での以前のデータと同様に、平均で77%の遺伝子移入がSCID-再配置細胞アッセイ法において観察された。
HbFは、最も高い抗鎌状化効果を有するヘモグロビンであるので、正常ヒトγ-グロビン遺伝子を保有するレンチウイルスベクターsGbGを用いて、Berkeley鎌状赤血球マウスにおいてHbFを産生させた。本明細書において開示されるように、γ-グロビンエクソンならびにβ-グロビン非コード領域および調節エレメントを組み入れているレンチウイルスベクターsGbGをデザインした。このベクターは、HSCへのsGbGベクターの移入および骨髄破壊的移植の後にBerkeley鎌状赤血球マウスにおいて鎌状赤血球表現型の完全な是正を示した(実施例65、図23A〜D、図28および表1)。図23AおよびBは、マウスの血液中の不可逆性鎌状赤血球の低減を示し、図23CおよびDはマウスから実験的に誘導されたRBC鎌状化および鎌状細胞の比率を示し、図28は成功裏の遺伝子治療後のマウス生存性の改善を示す。
マウスの血液パラメータの分析をsGbGまたはモック形質導入した系統(-)、Sca (+)およびKit (+)細胞の一次(Prim.)および二次(Sec.)移植後18週で示す。
ヒトγ-グロビン遺伝子を保有するレンチウイルスベクターを介したHbFの発現が、これまでに示されている(Persons et al. Blood 10:2175-83 (2003); Pestina et al. Mol. Ther. 17:245-52 (2009))。β-サラセミアを是正するsGbGベクターの能力を確認するために、鎌状赤血球トランスジェニックマウスにおいて用いられたのと同じ手法を用いてサラセミアマウス(Hbbth3/+)を処置した。サラセミアマウスに、約8時間おいてsGbGを2回形質導入(2×20のMOI)したサラセミア幹/前駆細胞(Lin- Sca+ Kit+ [LSK]細胞)を移植した。対照(モック)動物を培地のみで同時に処置した。およそ10,000個の形質導入LSK+細胞を、致死線量照射されたサラセミアレシピエントマウス(700+375ラドの分割線量)へ200,000個の放射線照射Lin-Sca-Kit-細胞とともに注射/同時移植した。一次動物を7〜8ヶ月の期間にわたってモニターし、その後18ヶ月の全追跡調査の間に二次移植を行った。
上記のように、10%超のHbFの産生はマウスモデルにおいてSCD表現型を是正することが明らかにされた。sGbGベクターはBerkeley鎌状赤血球マウスモデルにおいて表現型を効率的に是正した(実施例65, 図23A〜D, 図28; Perumbeti et al., Blood 114: 1174-85 (2009))が、細胞あたりに非常に高いベクターコピーが存在していなければ、ノックイン鎌状赤血球マウスモデル(UABマウス)においてsGbGベクターは有効性がすっと低かった。
Claims (15)
- SEQ ID NO:1を含むタンパク質をコードする、変異したヒトγ-グロビン遺伝子。
- SEQ ID NO:2と70%またはそれ以上の配列同一性を有する、請求項1記載の変異したヒトγ-グロビン遺伝子。
- 鎌状赤血球貧血またはβ-サラセミアの処置を必要としている対象において鎌状赤血球貧血もしくはβ-サラセミアを遺伝子的に是正するかまたはその症状を低減するための、請求項1または2記載の変異したヒトγ-グロビン遺伝子を含む細胞を含む薬学的組成物であって、前記細胞が、請求項1または2記載の変異したヒトγ-グロビン遺伝子を含む改変レンチウイルスを用いてトランスフェクションされた自家造血幹細胞(HSC)であり、かつ前記細胞が対象へ移植するためのものである、前記薬学的組成物。
- 対象がヒト対象である、請求項3記載の薬学的組成物。
- 対象が、移植の前に強度軽減移植前処置(reduced intensity conditioning)で処置される、請求項3または4記載の薬学的組成物。
- 改変レンチウイルスが、
標準SINレンチウイルスベクター骨格におけるウイルス3' LTR配列の下流の異種ポリAシグナル配列; および
標準SINレンチウイルスベクター骨格のU3欠失領域におけるSV40後期ポリAシグナルに由来する1つまたは複数のUSE配列
をさらに含む、請求項3〜5のいずれか一項記載の薬学的組成物。 - 改変レンチウイルスが、1つまたは複数の隣接CHS4由来の低減された長さの機能的インスレーター配列をさらに含む、請求項6記載の薬学的組成物。
- 改変レンチウイルスが、β-グロビン遺伝子座制御領域をさらに含む、請求項7記載の薬学的組成物。
- 改変レンチウイルスが、赤血球系統特異的なエンハンサーエレメントをさらに含む、請求項7または8記載の薬学的組成物。
- 移植後、胎児ヘモグロビンが少なくとも20%を超える;
F細胞が循環血中赤血球の少なくとも2/3を構成する;
F細胞あたりの胎児ヘモグロビンが鎌状赤血球における全ヘモグロビンの少なくとも1/3に相当する; および
少なくとも20%の遺伝子改変HSCが対象の骨髄に再配置する、
請求項3〜9のいずれか一項記載の薬学的組成物。 - 請求項1または2記載の変異したヒトγ-グロビン遺伝子を含む、鎌状赤血球貧血もしくはβ-サラセミアを遺伝子的に是正するかまたはその症状を低減しうるレンチウイルス発現ベクター。
- 標準SINレンチウイルスベクター骨格におけるウイルス3' LTR配列の下流の異種ポリAシグナル配列; および
標準SINレンチウイルスベクター骨格のU3欠失領域におけるSV40後期ポリAシグナルに由来する1つまたは複数のUSE配列
をさらに含む、請求項11記載のレンチウイルス発現ベクター。 - 1つまたは複数の隣接CHS4由来の低減された長さの機能的インスレーター配列をさらに含む、請求項12記載のレンチウイルス発現ベクター。
- ウイルス転写単位に対して逆方向にクローニングされたβ-グロビン遺伝子座制御領域の1つまたは複数のエレメントをさらに含む、請求項13記載のレンチウイルス発現ベクター。
- 赤血球系統特異的なエンハンサーエレメントをさらに含む、請求項13または14記載のレンチウイルス発現ベクター。
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