KR20210098976A - 단백질 제조를 위한 벡터 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 관심 대상 단백질의 생산을 위한 벡터 및 숙주 세포주 개발을 위한 상기 벡터의 사용에 관한 것으로, 특히 약한 프로모터를 이용하여 선별 마커를 구동시키는 벡터에 관한 것이다.
Description
관련 출원의 교차-참고
본 출원은 2018년 12월 4일자 제출된 미국 임시출원 제62/775,194호에 대해 우선권을 주장하며, 이의 전체 내용은 본원에 인용되어 포함된다.
본 발명의 분야
본 발명은 관심 대상 단백질의 생산을 위한 벡터 및 숙주 세포주의 개발에 사용되는 상기 벡터의 용도에 관한 것이며, 특히 선별 마커를 구동시키기 위해 약한 프로모터를 이용하는 벡터에 관한 것이다.
치료 단백질 약물은 신규한 치료가 필요한 환자들에게 대부분 제공되는 중요한 부류의 의약이다. 최근 승인된 재조합 단백질 치료제들은 암, 자가 면역/염증, 감염제에 대한 노출, 및 유전적 장애를 포함하는 매우 다양한 임상적 징후들을 치료하기 위해 개발되었다. 단백질-조작 기술의 최신 발전으로 인해, 약물 개발자들과 제조사들은 관심 대상 단백질의 원하는 기능성 특징들을 미세-조정하고 이용하면서도, 제품 안전성 또는 효능 또는 상기 둘 다를 유지할(일부 경우 향상시킬) 수 있게 되었다.
치료 단백질의 제조 및 생산은, 매우 복잡한 공정들이다. 예를 들어, 전형적인 단백질 약물은 소-분자 약물의 제조에 요구되는 수보다 훨씬 더 많은 5,000개 초과의 중요한 공정 단계들을 포함할 수 있다.
유사하게, 단일클론 항체 뿐만 아니라 큰 단백질 또는 융합 단백질을 포함하는 단백질 치료제는, 소-분자 약물보다 크기가 수십 배(orders-of-magnitude) 크고, 100 kDa을 초과하는 분자량을 갖는다. 또한, 단백질 치료제는 복잡한 2차 및 3차 구조를 나타내고, 이를 유지해야 한다. 단백질 치료제는, 화학 공정들에 의해 완전히 합성될 수 없고, 살아있는 세포 또는 유기체에서 제조되어야 하며; 그 결과, 세포주의 선택, 종의 기원, 및 배양 조건은 모두 최종 생성물의 특징들에 영향을 미친다. 게다가, 대부분의 생물학적 활성 단백질은 번역-후 변형을 요구하는데, 이는 이종성(heterologous) 발현 시스템이 사용될 때 약화될 수 있다. 추가로, 생성물이 세포 또는 유기체에 의해 합성되므로, 복잡한 정제 공정들이 관여한다. 게다가, 바이러스 정화 공정, 예컨대 필터 또는 수지를 이용한 바이러스 입자의 제거, 뿐만 아니라 낮은 pH 또는 계면 활성제를 사용하는 불활성화 단계들이 실시되어, 단백질 약물 물질에 대한 바이러스 오염의 심각한 안전성 문제를 예방한다. 치료 단백질의 큰 분자 크기, 번역-후 변형 및 이들의 제조 공정에 관여하는 다양한 생물학적 물질에 대한 복잡성을 고려하면, 단백질-조작 전략 전체에서 달성된 제품 안전성과 효능을 유지하면서도 특정한 기능성 특성들을 강화시키는 능력이 크게 요망된다.
단백질 약물 제품을 변형시키기 위한 신규한 전략과 접근법의 통합은 사소한 문제가 아니지만, 잠재적인 치료적 장점들은 약물 개발 동안 이러한 전략의 사용을 증가시켰다. 다수의 단백질-조작 플랫폼 기술은, 최근 신규한 치료 단백질 약물의 순환 반-감기, 표적화 및 기능성을 증가시킬 뿐만 아니라, 생산 수율과 제품 순도를 증가시키기 위해 사용되고 있다. 예를 들어, 단백질 접합과 Fc-융합, 알부민-융합 및 PEG화를 포함하는 파생화(derivatization) 접근법은, 최근 약물의 순환 반-감기를 연장시키는데 사용되고 있다.
단백질 약제(생물학제)의 생산은 비용이 많이 들고, 시간이 오래 소요된다. 당업계에 필요한 것은, 이러한 중요한 부류의 약물들을 생산하기 위한 보다 효율적인 수단과 공정이다.
본 발명의 개요
본 발명은 관심 대상 단백질의 생산을 위한 벡터 및 숙주 세포주의 개발에 대한 상기 벡터의 사용에 관한 것으로, 특히 선별 마커를 구동시키기 위해 약한 프로모터를 이용하는 벡터에 관한 것이다.
따라서, 일부 바람직한 구현예에서, 본 발명은 제1 프로모터 서열의 비-변형된 버전 또는 야생-형 버전에 비해 프로모터 활성이 감소되도록 변화된 제1 프로모터 서열에 작용가능하게 연결된 선별 마커를 암호화하는 핵산 서열, 및 제2 프로모터 서열에 작용가능하게 연결된 관심 대상 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는, 관심 대상 단백질의 발현을 위한 벡터(들)을 제공한다.
일부 바람직한 구현예에서, 상기 제1 프로모터 서열의 비-변형된 버전 또는 야생-형 버전에 비해 프로모터 활성이 감소되도록 변화된 제1 프로모터 서열은, 바이러스 자가-불활성화(SIN: Self-Inactivating) 긴 말단 반복부(LTR: Long Terminal Repeat) 프로모터 서열이다. 일부 바람직한 구현예에서, 상기 SIN LTR 프로모터 서열은 서열번호 3과 적어도 95% 동일하다. 일부 바람직한 구현예에서, 상기 SIN LTR 프로모터 서열은 서열번호 3이다.
일부 바람직한 구현예에서, 상기 선별 마커는 글루타민 합성 효소(GS: Glutamine Synthetase)이다. 일부 바람직한 구현예에서, 상기 선별 마커는 디히드로폴레이트 환원효소(DHFR: Dihydrofolate Reductase)이다.
일부 구현예에서, 상기 벡터는 선별 마커와 관심 대상 단백질을 암호화하는 핵산에 작용가능하게 연결된 단일 폴리 A 신호 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 벡터는 선별 마커에 작용가능하게 연결된 제1 폴리 A 신호 서열, 및 관심 대상 단백질을 암호화하는 핵산에 작용가능하게 연결된 제2 폴리 A 신호 서열을 포함한다.
일부 바람직한 구현예에서, 관심 대상 단백질은 Fc-융합 단백질, 효소, 알부민 융합체, 성장 인자, 단백질 수용체, 단쇄 항원(scFv), 단쇄-Fc(scFv-Fc), 디아바디, 및 미니바디(scFv-CH3), Fab, 단쇄 Fab(scFab), 이뮤노글로빈 중쇄, 및 이뮤노글로빈 경쇄로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 바람직한 구현예에서, 관심 대상 단백질은 Fc-융합 단백질이다.
일부 구현예에서, 상기 벡터는 플라스미드이다. 일부 바람직한 구현예에서, 상기 벡터는 바이러스 벡터이다. 일부 바람직한 구현예에서, 상기 벡터는 레트로바이러스 벡터(retroviral vector)이다. 일부 바람직한 구현예에서, 상기 벡터는 렌티바이러스 벡터(lentiviral vector)이다.
일부 바람직한 구현예에서, 본 발명은 상기 기재된 벡터를 포함하는 숙주 세포(들)을 제공한다. 일부 바람직한 구현예에서, 상기 숙주 세포주는 GS 녹아웃 세포주이다. 일부 바람직한 구현예에서, 상기 숙주 세포주는 DHFR 녹아웃 세포주이다. 일부 바람직한 구현예에서, 상기 숙주 세포주는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포주이다. 일부 바람직한 구현예에서, 상기 숙주 세포주는 HEK 293 또는 CAP 세포주이다. 일부 바람직한 구현예에서, 상기 숙주 세포는 약 1, 20, 50 내지 1000 카피의 벡터를 포함한다. 일부 바람직한 구현예에서, 상기 숙주 세포는 약 10 내지 200 카피의 벡터를 포함한다. 일부 바람직한 구현예에서, 상기 숙주 세포는 약 10 내지 100 카피의 벡터를 포함한다. 일부 바람직한 구현예에서, 상기 숙주 세포는 약 20 내지 100 카피의 벡터를 포함한다.
일부 바람직한 구현예에서, 상기 숙주 세포는 제2 관심 대상 단백질을 암호화하고, 이의 발현을 허용하는 적어도 하나의 제2 벡터를 추가로 포함하되, 상기 제2 벡터는 선별 마커를 포함하지 않는다. 일부 바람직한 구현예에서, 상기 숙주 세포는 제2 관심 대상 단백질을 암호화하고 이의 발현을 허용하는 적어도 하나의 제2 벡터를 추가로 포함하되, 상기 제2 벡터는 상기 제1 벡터 내의 선별 마커와는 다른 선별 마커를 포함한다. 일부 바람직한 구현예에서, 상기 제1 벡터 내의 상기 제1 관심 대상 단백질은 이뮤노글로빈 중쇄 또는 경쇄 중 하나이고, 상기 제2 벡터 내의 제2 단백질은 이뮤노글로빈 중쇄 또는 경쇄 중 다른 하나이다. 일부 바람직한 구현예에서, 상기 제1 관심 대상 단백질은 이뮤노글로빈 중쇄이고, 상기 제2 관심 대상 단백질은 이뮤노글로빈 경쇄이다. 일부 바람직한 구현예에서, 상기 숙주 세포는 약 1, 20, 50 또는 100 내지 1000 카피의 제2 벡터를 포함한다. 일부 바람직한 구현예에서, 상기 숙주 세포는 약 10 내지 200 카피의 제2 벡터를 포함한다. 일부 바람직한 구현예에서, 상기 숙주 세포는 약 10 내지 100 카피의 제2 벡터를 포함한다. 일부 바람직한 구현예에서, 상기 숙주 세포는 약 20 내지 100 카피의 제2 벡터를 포함한다.
일부 바람직한 구현예에서, 본 발명은 상기 기재된 숙주 세포를 포함하는 숙주 세포 배양체를 제공한다. 일부 바람직한 구현예에서, 상기 배양체는 1 내지 50 그램/리터/일의 관심 대상 단백질을 생산한다. 일부 바람직한 구현예에서, 상기 배양체는 2 내지 10 그램/리터/일의 관심 대상 단백질을 생산한다.
일부 바람직한 구현예에서, 본 발명은 관심 대상 단백질을 생산하는 공정을 제공하는데, 이는 상기 기재된 숙주 세포를 배양하는 단계와, 관심 대상 단백질을 숙주 세포 배양체로부터 정제하는 단계를 포함한다.
일부 바람직한 구현예에서, 본 발명은 이하의 요소들을 5'에서 3'의 순서로 포함하는 감염성 레트로바이러스 입자를 제공한다: 1) 5' LTR; 2) 레트로바이러스 패키징 영역; 3) 선별 마커를 암호화하는 핵산; 4) 내부 프로모터; 5) 상기 내부 프로모터에 작용가능하게 연결된 관심 대상 단백질을 암호화하는 핵산 서열; 및 6) SIN 3' LTR. 일부 바람직한 구현예에서, 상기 5'LTR은 MoMuSV LTR 또는 SIN LTR이다. 일부 구현예에서, 상기 3' LTR은 폴리 A 신호 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 패키징 영역은 복수의 잠재적인 번역 개시 부위들을 포함한다. 일부 바람직한 구현예에서, 상기 선별 마커는 GS이다. 일부 바람직한 구현예에서, 상기 내부 프로모터는 CMV 프로모터이다. 일부 구현예에서, 상기 입자는 관심 대상 단백질을 암호화하는 핵산의 하류에 단일 폴리 A 신호 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 입자는 선별 마커에 작용가능하게 연결된 제1 폴리 A 신호 서열과, 관심 대상 유전자를 암호화하는 핵산에 작용가능하게 연결된 제2 폴리 A 신호 서열을 포함한다.
추가적인 구현예는 이하의 요소들을 5'에서 3'의 순서로 포함하는 플라스미드를 제공한다: 1) 5' LTR(예를 들어, SIN LTR); 2) 패키징 영역; 3) 선별 마커(예를 들어, GS); 4) 내부 프로모터(예를 들어, CMV 프로모터); 5) 상기 내부 프로모터에 작용가능하게 연결된 관심 대상 단백질을 암호화하는 핵산 서열; 및 6) 폴리 A 신호 서열. 일부 구현예에서, 플라스미드는 관심 대상 단백질을 암호화하는 핵산의 하류에 단일 폴리 A 신호 서열을 포함한다.
추가적인 구현예는: a) 제1 프로모터 서열의 비-변형된 버전 또는 야생-형 버전에 비해 프로모터 활성이 감소되도록 변화된 제1 프로모터 서열에 적용가능하게 연결된 선별 마커를 암호화하는 핵산 서열과, 제2 프로모터 서열에 작용가능하게 연결된 제1 관심 대상 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 제1 벡터; 및 b) 프로모터 서열에 작용가능하게 연결된 제2 관심 대상 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 제2 벡터를 포함하되, 상기 제2 벡터는 선별 마커를 포함하지 않는 시스템을 제공한다.
일부 바람직한 구현예에서, 본 발명은 관심 대상 단백질을 생산하는 공정을 제공하는데: 이는 숙주 세포 또는 세포들을 상기 기재된 감염성 레트로바이러스 입자, 플라스미드, 또는 벡터 시스템에 의해 형질도입 또는 형질감염시키는 단계, 숙주 세포 또는 세포들로부터 관심 대상 단백질을 발현시키는 숙주 세포주를 개발하는 단계; 상기 관심 대상 단백질이 상기 숙주 세포주에 의해 생산되는 조건 하에서, 상기 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 상기 관심 대상 단백질을 상기 숙주 세포 배양체로부터 정제하는 단계를 포함한다.
일부 바람직한 구현예에서, 본 발명은 관심 대상 단백질의 생산을 위해 숙주 세포 또는 세포들을 형질도입시키는데 사용하기 위한, 상기 기재된 감염성 레트로바이러스 입자 또는 플라스미드를 제공한다.
도 1. 전체 길이 MMLV 작제물의 지도.
도 2. SIN MMLV LTR 작제물의 지도.
도 3. 전체 길이 MMLV 작제물의 서열(서열번호 1).
도 4. SIN MMLV LTR 작제물의 서열(서열번호 2).
도 5. 전체 길이 MMLV 작제물과 SIN MMLV LTR 작제물 사이의 혼주된(pooled) 세포주 역가 비교.
도 6. 전체 길이 MMLV 작제물과 SIN MMLV LTR 작제물을 사용하는 공정들 간의 혼주된 세포주 역가 비교.
도 7. SIN LTR 서열(서열번호 3).
도 8. 프로바이러스 플라스미드 작제물의 지도(서열번호 4).
도 9. 프로바이러스 플라스미드 작제물의 서열(서열번호 4).
도 2. SIN MMLV LTR 작제물의 지도.
도 3. 전체 길이 MMLV 작제물의 서열(서열번호 1).
도 4. SIN MMLV LTR 작제물의 서열(서열번호 2).
도 5. 전체 길이 MMLV 작제물과 SIN MMLV LTR 작제물 사이의 혼주된(pooled) 세포주 역가 비교.
도 6. 전체 길이 MMLV 작제물과 SIN MMLV LTR 작제물을 사용하는 공정들 간의 혼주된 세포주 역가 비교.
도 7. SIN LTR 서열(서열번호 3).
도 8. 프로바이러스 플라스미드 작제물의 지도(서열번호 4).
도 9. 프로바이러스 플라스미드 작제물의 서열(서열번호 4).
정의
본 발명을 용이하게 이해하기 위해, 다수의 용어들이 이하에 정의되어 있다.
본원에 사용된 용어 "숙주 세포(host cell)"는, 임의의 진핵 세포(예를 들어, 포유류 세포, 조류 세포, 양서류 세포, 식물 세포, 어류 세포, 및 곤충 세포)를 지칭하며, 이는 시험관 내 또는 생체 내에 위치하든 상관 없다.
본원에 사용된 용어 "세포 배양체(cell culture)"는, 세포의 임의의 시험관내 배양체를 지칭한다. 이 용어 내에는 (예를 들어, 불멸의 표현형을 갖는) 연속 세포주, 1차 세포 배양, 유한(finite) 세포주(예를 들어, 비-형질전환된 세포), 및 난모세포와 배아를 포함하는 시험관 내에 유지된 임의의 다른 세포 집단이 포함된다.
본원에 사용된 용어 "벡터(vector)"는, 적합한 조절 요소와 연결될 때 복제가능하며, 세포들 사이에서 유전자 서열을 전달할 수 있는 임의의 유전적 요소, 예컨대 플라스미드(plasmid), 파지(phage), 트랜스포존(transposon), 코스미드(cosmid), 염색체, 바이러스, 비리온(virion) 등을 지칭한다. 따라서, 상기 용어는 클로닝 및 발현 비히클, 뿐만 아니라 바이러스 벡터도 포함한다.
본원에 사용된 용어 "감염 다중도(multiplicity of infection)" 또는 "MOI"는, 숙주 세포의 형질감염 또는 형질 도입 동안 사용된 통합 벡터: 숙주 세포의 비를 지칭한다. 예를 들어, 1,000,000개의 벡터가 사용되어 100,000개의 숙주 세포에 형질도입되는 경우, 감염 다중도는 10이다. 이 용어의 사용은 형질 도입에 관여하는 사례에 제한되지 않으며, 그 대신 리포펙션(lipofection), 미세주입(microinjection), 인산칼슘 침전, 및 전기천공법(electroporation)과 같은 방법에 의해 벡터가 숙주로 도입되는 경우를 포괄한다.
본원에 사용된 용어 "게놈(genome)"은, 유기체의 유전 물질(예를 들어, 염색체)을 지칭한다.
용어 "관심 대상 뉴클레오티드(nucleotide sequence of interest)"(예를 들어, RNA 또는 DNA)는, 이들의 조작이 (예를 들어, 질병을 치료하고, 숙주 세포에서의 관심 대상 단백질의 발현, 리보자임의 발현에 대해 개선된 품질을 부여하는 등) 어떠한 이유로든 당업계의 숙련자가 바람직하다고 간주할 수 있는 임의의 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 이러한 뉴클레오티드 서열들은 구조 유전자(예를 들어, 리포터 유전자, 선별 마커 유전자, 온코유전자(oncogene), 약물 내성 유전자, 성장 인자 등)의 암호화 서열, 및 mRNA 또는 단백질 산물을 암호화하지 않는 비-암호화 조절 서열(예를 들어, 프로모터 서열, 폴리아데닐화 서열, 종결 서열, 인핸서 서열 등)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 용어 "관심 대상 단백질(protein of interest)"은, 관심 대상 핵산에 의해 생산된 단백질을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "암호화하는 핵산 분자(nucleic acid molecule encoding)", "암호화하는 DNA 서열(DNA sequence encoding)", "암호화하는 DNA(DNA encoding)", "암호화하는 RNA 서열(RNA sequence encoding)" 및 "암호화하는 RNA(RNA encoding)"는, 데옥시리보핵산 또는 리보핵산의 가닥을 따라 나열된 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드의 순서 또는 서열을 지칭한다. 이들 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드의 순서는, 폴리펩티드(단백질) 사슬을 따라 나열된 아미노산의 순서를 결정한다. 따라서, DNA 또는 RNA 서열은 아미노산 서열을 암호화한다.
본원에 사용된 용어 "프로모터(promoter)", "프로모터 요소(promoter element)" 또는 "프로모터 서열(promoter sequence)"은, 관심 대상 뉴클레오티드에 라이게이션(ligation)될 때, 관심 대상 뉴클레오티드의 mRNA로의 전사를 조절할 수 있는 DNA 서열을 지칭한다. 프로모터는 전형적으로, 이것이 mRNA로의 전사를 조절하는 관심 대상 뉴클레오티드의 5'(즉, 상류)에 위치하는 것으로 생각되나 반드시 그러하지는 않고, RNA 중합효소(polymerase)와 전사 개시를 위한 다른 전사 인자의 특이적인 결합을 위한 부위를 제공한다.
본원에 사용된 용어 "변화된(altered)"은, 프로모터에 대해 사용될 때, 참고 야생형 서열에 비해 변화된 핵산 서열을 갖는 프로모터를 지칭한다. 예를 들어, 프로모터의 서열은 특정 프로모터 및/또는 인핸서 요소를 결실시킴으로써 변화될 수 있다.
진행 생물에서 전사조절 신호는, "프로모터" 및 "인핸서(enhancer)" 요소를 포함한다. 프로모터 및 인핸서는, 전사에 관여하는 세포 단백질과 특이적으로 결합하는 짧은 일련의 DNA 서열들로 이루어진다(문헌[Maniatis 등, Science 236:1237 [1987]]). 프로모터 및 인핸서 요소는, 효모, 곤충 및 포유류 세포의 유전자를 포함하는 다양한 진핵 생물 공급원, 및 바이러스로부터 분리되었다(유사한 조절 요소, 즉, 프로모터는, 또한 원핵 생물에서도 발견된다). 특정 프로모터 및 인핸서의 선택은, 어떤 세포 타입이 관심 대상 단백질을 발현하는데 사용될지에 따라 달라진다. 일부 진핵 생물의 프로모터 및 인핸서는 넓은 숙주 범위를 가지지만, 다른 것들은 제한된 서브세트의 세포 타입에서 기능성을 갖는다(검토를 위하여, 문헌[Voss 등, Trends Biochem. Sci., 11:287 [1986]]; 및 상기 문헌[Maniatis 등]을 참고한다). 예를 들어, SV40 초기 유전자 인핸서는 많은 포유류 종 유래의 매우 다양한 세포 타입에서 높은 활성을 갖고, 포유류 세포에서의 단백질 발현에 널리 사용되었다(문헌[Dijkema 등, EMBO J. 4:761 [1985]]). 넓은 범위의 포유류 세포 타입에서 활성인 프로모터/인핸서 요소의 두 가지 다른 예는, 인간 신장 인자(elongation factor) 1α 유전자(문헌[Uetsuki 등, J. Biol. Chem., 264:5791 [1989]]; 문헌[Kim 등, Gene 91:217 [1990]]; 및 문헌[Mizushima 및 Nagata, Nuc. Acids. Res., 18:5322 [1990]])와, 라우스 육종 바이러스(Rous sarcoma virus)(문헌[Gorman 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:6777 [1982]]) 및 인간 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus)(문헌[Boshart 등, Cell 41:521 [1985]])의 긴 말단 반복부 유래의 것들이다.
본원에 사용된 용어 "프로모터/인핸서"는, 프로모터 기능과 인핸서 기능을 둘 다 제공할 수 있는 서열을 함유하는 DNA의 절편을 말한다(즉, 프로모터 요소와 인핸서 요소에 의해 제공된 기능, 이들 기능의 논의에 대해서는 상기 내용을 참고한다). 예를 들어, 레트로바이러스의 긴 말단 반복부는 프로모터 기능과 인핸서 기능을 둘 다 포함한다. 인핸서/프로모터는 "내인성(endogenous)" 또는 "외인성(exogenous)" 또는 "이종성(heterologous)"일 수 있다. "내인성" 인핸서/프로모터는 게놈 내의 소정의 유전자에 자연적으로 연결된 것이다. "외인성" 또는 "이종성" 인핸서/프로모터는, 유전자 조작의 수단(즉, 분자생물학 기술, 예컨대 클로닝 및 재조합)에 의해 유전자 옆에 병렬되어, 그 유전자의 전사가 연결된 인핸서/프로모터에 의해 주도되는 것이다.
본원에 사용된 용어 "LTR"의 "긴 말단 반복부(long terminal repeat)"는, 레트로바이러스 게놈의 5' 및 3' U3 영역에 위치하거나, 이로부터 분리된 전사 조절 요소를 지칭한다. 당업계에 알려진 바와 같이, 긴 말단 반복부는 레트로바이러스 벡터 내에서 조절 요소로 사용되거나, 레트로바이러스 게놈으로부터 분리되어, 다른 타입의 벡터로부터의 발현을 조절하는데 사용될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "상보성(complementary)" 또는 "상보성(complementarity)"은, 염기-페어링(pairing) 규칙에 의해 연관된 폴리뉴클레오티드(즉, 뉴클레오티드의 서열)에 대해 사용된다. 예를 들어, 서열 "5'-A-G-T-3'"은 서열 "3'-T-C-A-5'"에 상보성이 있다. 상보성은 "부분적(partial)"일 수 있는데, 이는 단지 핵산의 일부 염기만이 염기 페어링 규칙에 맞게 매치된 것이다. 또는, 핵산들 간에 "완전한(complete)" 또는 "전체적인(total)" 상보성이 있을 수 있다. 핵산 가닥들 사이의 상보성의 정도는, 핵산 가닥들 간의 혼성화의 효율과 강도에 유의한 효과를 갖는다. 이것은 증폭 반응, 뿐만 아니라 핵산들 간의 결합에 따라 달라지는 탐지 방법에서 특히 중요하다.
용어 "상동성(homology)" 및 "퍼센트 동일성(percent identity)"은, 핵산에 관해 사용될 때, 상보성의 정도를 지칭한다. 부분적인 상동성(즉, 부분 동일성) 또는 완전한 상동성(즉, 완전 동일성)이 있을 수 있다. 부분적으로 상보성인 서열은 완전히 상보성인 서열이 표적 핵산 서열에 혼성화하는 것을 적어도 부분적으로 억제하고, 기능 용어 "실질적으로 상동성(substantially homologous)"을 사용하는 것을 지칭한다. 표적 서열에 대해 완전히 상보성인 서열의 혼성화 억제는, 낮은 엄격성(stringency) 조건 하의 혼성화 검정법(서던 블롯(Southern blot) 또는 노던 블롯(Northern blot), 용액 혼성화(solution hybridization) 등)을 사용하여 평가될 수 있다. 실질적으로 상동성인 서열 또는 프로브(probe)(즉, 관심 대상 다른 올리고뉴클레오티드에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드)는, 낮은 엄격성의 조건 하에 완전 상동성인 서열이 표적 서열과 결합(즉, 혼성화)할 때 이와 경쟁하고, 억제할 것이다. 낮은 엄격성의 조건이 비-특이적 결합을 허용한다는 것은 아니고; 낮은 엄격성 조건은, 2개 서열이 서로에 대해 결합할 때 특이적인(즉, 선택적인) 상호작용을 할 것을 요구한다. 비-특이적 결합의 부재는, 심지어 부분적인 정도의 상보성(예를 들어, 약 30% 미만의 동일성)조차도 결핍된 제2 표적의 사용에 의해 시험될 수 있고; 비-특이적 결합 없을 때, 프로브는 제2의 비-상보성 표적과 혼성화하지 않을 것이다.
본원에 사용된 용어 "작용가능한 조합(in operable combination)", "작용가능한 순서(in operable order)" 및 "작용가능하게 연결된(operably linked)"은, 소정의 유전자의 전사 및/또는 원하는 단백질 분자의 합성을 유발할 수 있는 핵산 분자가 생산되는 방식으로 핵산 서열이 연결된 것을 지칭한다. 상기 용어는 또한 기능성 단백질이 생산되는 방식으로 아미노산 서열이 연결된 것을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "선별 마커(selectable marker)"는, 필수 영양소가 결핍된 배지에서 성장할 수 있는 능력을 부여하는 효소 활성 또는 다른 단백질을 암호화하는 유전자를 지칭하며; 또한, 선별 마커는 그 선별 마커가 발현된 세포에 대해, 항생제 또는 약물에 대한 내성을 부여할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "레트로바이러스(retrovirus)"는, 세포에 들어가서, (이중-가닥의 프로바이러스(provirus)로서의) 레트로바이러스 게놈을 숙주 세포의 게놈에 통합시킬 수 있는 레트로바이러스 입자를 지칭한다(즉, 입자는 막-연결된 단백질, 예컨대 외피 단백질, 또는 숙주 세포 표면에 결합하여, 바이러스 입자가 숙주 세포의 세포질로 도입시키는 것을 용이하게 할 수 있는 바이러스 G 당단백질을 함유한다). 용어 "레트로바이러스"는, 온코바이러스 아과(Oncovirinae)(예를 들어, 몰로니 쥣과(Moloney murine) 백혈병 바이러스(MoMLV), 몰로니 쥣과 육종 바이러스(MoMSV), 및 마우스 유선 종양 바이러스(MMTV), 스푸마바이러스 아과(Spumavirinae), 및 렌티바이러스 아과(Lentivirinae)(예를 들어, 인간 면역 결핍성 바이러스, 유인원 면역 결핍성 바이러스, 말 감염 빈혈 바이러스 및 염소 관절염-뇌염(arthritis-encephalitis) 바이러스를 포함하며; 예를 들어, 미국 특허 제5,994,136호 및 제6,013,516호를 참고하고, 상기 두 문헌은 본원에 인용되어 포함됨).
본원에 사용된 용어 "레트로바이러스 벡터(retroviral vector)"는, 관심 대상 유전자를 발현하도록 변형된 레트로바이러스를 지칭한다. 레트로바이러스 벡터는 바이러스 감염 과정을 활용함으로써 유전자를 숙주 세포로 효율적으로 전달하는데 사용될 수 있다. 레트로바이러스 게놈으로 클로닝된(즉, 분자생물학 기술을 사용하여 삽입된) 외래 또는 이종성 유전자는, 레트로바이러스에 의한 감염에 취약한 숙주 세포로 효율적으로 전달될 수 있다. 잘 알려진 유전자 조작을 통해, 레트로바이러스 게놈의 복제 능력이 파괴될 수도 있다. 생성된 복제-결함성 벡터는 새로운 유전 물질을 세포에 도입하는데 사용될 수 있지만, 이들은 복제가 불가능하다. 헬퍼 바이러스 또는 패키징 세포주는, 벡터 입자의 조립을 허용하고, 세포로부터 빠져나오는데 사용될 수 있다. 이러한 레트로바이러스 벡터는 적어도 하나의 관심 대상 유전자를 암호화하는 핵산 서열(즉, 폴리시스트론 핵산 서열은 하나 초과의 관심 대상 유전자를 암호화할 수 있다), 5' 레트로바이러스 긴 말단 반복부(5' LTR); 및 3' 레트로바이러스 긴 말단 반복부(3' LTR)를 함유하는 복제-결핍성 레트로바이러스 게놈을 포함한다.
용어 "슈도타입의 레트로바이러스 벡터(pseudotyped retroviral vector)"는, 이종성 막 단백질을 함유하는 레트로바이러스 벡터를 지칭한다. 용어 "막-연결된 단백질(membrane-associated protein)"은, 바이러스 입자를 둘러싼 막에 연결된 단백질(예를 들어, 랍도바이러스과(Rhabdoviridae)의 바이러스, 예컨대 VSV, 피리(Piry), 찬디푸라(Chandipura) 및 모콜라(Mokola)의 바이러스 외피 당단백질 또는 G 단백질)을 지칭하며; 이들 막-연결된 단백질은 바이러스 입자가 숙주 세포로 도입되는 것을 매개한다. 레트로바이러스 외피 단백질에 대한 경우와 마찬가지로, 막 연결된 단백질은 특이적인 세포 표면 단백질 수용체에 결합할 수 있거나, 또는 막-연결된 단백질은 랍도바이러스과의 일원으로부터 유래된 G 단백질의 경우와 마찬가지로 숙주 세포의 원형질막의 인지질 구성요소와 상호작용할 수 있다.
용어 "이종성 막-연결된 단백질"은, 벡터 입자의 뉴클레오캡시드 단백질이 유래된 것과 동일한 바이러스 강(class) 또는 과(family)의 일원이 아닌 바이러스로부터 유래된 막-연결된 단백질을 지칭한다. "바이러스 강 또는 과"는, 국제 바이러스 분류 위원회(International Committee on Taxonomy of viruses)에서 할당한 강 또는 과의 분류학적 계급(taxonomic rank)을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "렌티바이러스 벡터"는, 비-분열 세포에 통합될 수 있는 렌티바이러스과(예를 들어, 인간 면역 결핍성 바이러스, 유인원 면역 결핍성 바이러스, 말 감염성 빈혈 바이러스, 및 염소 관절염-뇌염 바이러스)로부터 유래된 레트로바이러스 벡터를 지칭한다(예를 들어, 미국 특허 제5,994,136호 및 제6,013,516호를 참고하며, 상기 두 문헌은 본원에 인용되어 포함된다).
용어 "슈도타입의 렌티바이러스 벡터(pseudotyped lentivirus vector)"는, 이종성 막 단백질(예를 들어, 랍도바이러스과의 바이러스, 예컨대 VSV, 피리, 찬디푸라 및 모콜라의 바이러스 외피 당단백질 또는 G 단백질)을 함유하는 렌티바이러스 벡터를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "트랜스포존(transposon)"은, 게놈 내의 한 위치에서 다른 위치로 움직이거나, 이동할 수 있는 전위 요소(transposable element)(예를 들어, Tn5, Tn7 및 Tn10)를 지칭한다. 일반적으로, 전위(transposition)는 전위 효소(transposase)에 의해 조절된다. 본원에 사용된 용어 "트랜스포존 벡터(transposon vector)"는, 트랜스포존의 말단에 측접한 관심 대상 핵산을 암호화하는 벡터를 지칭한다. 트랜스포존 벡터의 예는, 미국 특허 제6,027,722호; 제5,958호,775호; 제5,968,785호; 제5,965,443호; 및 제5,719,055호에 기재된 것들을 포함하나 이에 제한되지 않으며, 상기 문헌 모두는 본원에 인용되어 포함된다.
본원에 사용된 용어 "아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터(adeno-associated virus(AAV) vector)"는, AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAVX7 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 아데노-연관 바이러스 혈청 타입으로부터 유래된 벡터를 지칭한다. AAV 벡터는 바람직하게는 rep 및/또는 cap 유전자가 전체적으로 또는 부분적으로 결실된 하나 이상의 AAV 야생-형 유전자를 갖지만, 기능성 측접 ITR 서열을 보유할 수 있다.
AAV 벡터는 당업계에 알려진 재조합 기술을 사용하여 제작되어, 양 말단(5' 및 3')에 기능성 AAV ITR이 측접한 하나 이상의 이종성 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 실행에서, AAV 벡터는 이종성 뉴클레오티드 서열의 상류에 위치한 적합한 적어도 하나의 AAV ITR과 프로모터 서열, 및 이종성 서열의 하류에 위치한 적어도 하나의 AAV ITR을 포함할 수 있다. "재조합 AAV 벡터 플라스미드(recombinant AAV vector plasmid)"는, 플라스미드를 포함하는 재조합 AAV 벡터의 하나의 타입을 지칭한다. 일반적으로 AAV 벡터에서와 같이, 5' ITR 및 3' ITR은 선택된 이종성 뉴클레오티드 서열에 측접한다.
AAV 벡터는 또한 전사 서열, 예컨대 폴리아데닐화 부위, 뿐만 아니라 선별 마커 또는 리포터 유전자, 인핸서 서열, 및 전사를 유도하는 다른 조절 요소도 포함할 수 있다. 이러한 조절 요소는 상기에 기재되어 있다.
본원에 사용된 용어 "AAV 비리온"은, 완전한 바이러스 입자를 지칭한다. AAV 비리온은 야생형 AAV 바이러스 입자(AAV 캡시드, 즉, 단백질 코트와 연결된 선형의 단일-가닥 AAV 핵산 게놈 포함), 또는 (이하에 기재된) 재조합 AAV 바이러스 입자일 수 있다. 이에 대하여, 단일-가닥 AAV 핵산 분자(이러한 용어들이 일반적으로 정의된 바와 같은 센스/코딩 가닥 또는 안티센스/안티코딩 가닥 중 어느 하나)는, AAV 비리온으로 패키징될 수 있고; 센스 가닥과 안티센스 가닥은 둘 다 동등하게 감염성을 갖는다.
본원에 사용된 용어 "재조합 AAV 비리온" 또는 "rAAV"는, 그 다음에 5' 및 3'에서 AAV ITR가 측접한 이종성 뉴클레오티드 서열을 캡슐화하는(즉, 단백질 코트로 둘러싸는) AAV 단백질 쉘로 구성된 감염성 복제-결함성 바이러스로 정의된다. 재조합 AAV 비리온을 제작하기 위한 다수의 기술들이 당업계에 알려져 있다(예를 들어, 미국 특허 제5,173,414호; WO 92/01070; WO 93/03769; 문헌[Lebkowski 등, Molec. Cell. Biol. 8:3988-3996 [1988]]; 문헌[Vincent 등, Vaccines 90 [1990] (Cold Spring Harbor Laboratory Press)]; 문헌[Carter, Current Opinion in Biotechnology 3:533-539 [1992]]; 문헌[Muzyczka, Current Topics in Microbiol. and Immunol. 158:97-129 [1992]]; 문헌[Kotin, Human Gene Therapy 5:793-801 [1994]]; 문헌[Shelling 및 Smith, Gene Therapy 1:165-169 [1994]]; 및 문헌[Zhou 등, J. Exp. Med. 179:1867-1875 [1994]]를 참고하고, 상기 문헌 모두는 본원에 인용되어 포함된다).
AAV 벡터 (및 사실 본원에 기재된 임의의 벡터)에 사용하기 위한 적합한 뉴클레오티드 서열은, 임의의 기능적으로 관련있는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 따라서, 본 발명의 AAV 벡터는 결함이 있거나, 표적 세포 게놈으로부터 소실된 단백질을 암호화하거나, 또는 원하는 생물학적 또는 치료 효과(예를 들어, 항바이러스 기능)를 갖는 비-자연적인 단백질을 암호화하는 임의의 원하는 유전자를 포함할 수 있고, 또는 상기 서열은 안티센스 또는 리보자임 기능을 갖는 분자에 상응할 수 있다. 적합한 유전자는 AIDS, 암, 신경성 질병, 심혈관성 질병, 고콜레스테롤증(hypercholestemia)과 같은 장애를 포함하는 염증성 질병, 자가면역 질환, 만성 및 감염성 질병; 다양한 빈혈(anemia), 지중해성 빈혈(thalassemia) 및 혈우병(hemophilia)을 포함하는 다양한 혈액 장애; 유전적 결함, 예컨대 근위축증(cystic fibrosis), 고셔병(Gaucher's Disease), 아데노신 데아미나제(adenosine deaminase)(ADA) 결핍증, 기종(emphysema) 등의 치료에 사용되는 것들을 포함한다. 암과 바이러스 질병에 대한 안티센스 치료에 유용한 다수의 안티센스 올리고뉴클레오티드(예를 들어, mRNA의 번역 개시 부위(AUG 코돈) 주위의 서열에 상보적인 짧은 올리고뉴클레오티드)가 당업계에서 문헌에 기재되어 왔다(예를 들어, 문헌[Han 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4313-4317 [1991]]; 문헌[Uhlmann 등, Chem. Rev. 90:543-584 [1990]; 문헌[Helene 등, Biochim. Biophys. Acta. 1049:99-125 [1990]]; 문헌[Agarwal 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:7079-7083 [1989]]; 및 문헌[Heikkila 등, Nature 328:445-449 [1987]] 참고). 적합한 리보자임의 논의에 대해서는, 예를 들어, 본원에 인용되어 포함된 문헌[Cech 등 (1992) J. Biol. Chem. 267:17479-17482] 및 미국 특허 제5,225,347호를 참고한다.
본원에 사용된 용어 "정제된(purified)"은, 핵산 또는 아미노산 서열이 이들의 정상 환경으로부터 제거되거나, 분리되거나 또는 격리된 것을 지칭한다. 따라서, "분리된 핵산 서열(isolated nucleic acid sequence)"은 정제된 핵산 서열이다. "실질적으로 정제된(Substantially purified)" 분자는, 이들이 통상 관련된 다른 구성요소를 적어도 60% 불포함하고, 바람직하게는 적어도 75% 불포함하고, 더욱 바람직하게는 적어도 90% 불포함한다.
본 발명의 상세한 설명
본 발명은 관심 대상 단백질의 생산을 위한 벡터 및 숙주 세포주의 개발을 위한 상기 벡터의 사용에 관한 것으로, 특히 선별 마커를 구동시키기 위해 약한 프로모터를 이용하는 벡터에 관한 것이다.
일부 바람직한 구현예에서, 본 발명의 발현 시스템은 다양한 기능을 발휘하는 추가적인 핵산 서열들에 작용가능하게 연결된, 관심 대상 단백질(즉, 치료 단백질 또는 생산되기를 원하는 다른 단백질)을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터를 이용한다. 따라서, 예를 들어, 관심 대상 핵산 서열은 폴리펩티드를 발현시키는 다양한 발현 벡터들 중 어느 하나에 포함될 수 있다. 본 발명의 일부 구현예에서, 벡터는 레트로바이러스 벡터, 염색체, 비염색체 및 합성 DNA 서열(예를 들어, SV40, 박테리아 플라스미드, 파지 DNA의 파생물; 배큘로바이러스, 효모 플라스미드, 플라스미드와 파지 DNA의 조합으로부터 유래된 벡터, 및 배시니아, 아데노바이러스, 계두(fowl pox) 바이러스, 및 가성광견병(pseudorabies) 바이러스와 같은 바이러스 DNA)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 숙주에서 복제가능하고 생존가능한 이상, 어떠한 벡터도 사용될 수 있다고 고려된다. 일부 바람직한 구현예에서, 벡터는 미국 특허 제6,852,510호 및 제7,332,333호 및 미국 특허 공보 제200402335173호 및 제20030224415호에 기재된 레트로바이러스 벡터이며, 상기 문헌은 모두 본원에 전체가 인용되어 포함된다. 일부 특히 바람직한 구현예에서, 벡터는 슈도타입의 레트로바이러스 벡터이다. 본 발명의 일부 바람직한 구현예에서, 포유류 발현 벡터는 복제 기원, 적합한 프로모터와 인핸서, 및 임의의 필요한 리보솜 결합 부위, 폴리아데닐화 부위, 스플라이스 공여 부위와 수여 부위, 전사 종결 서열, 및 5' 측접 비-전사 서열도 또한 포함한다. 다른 구현예에서, SV40 스플라이스로부터 유래한 DNA 서열과 폴리아데닐화 부위는, 필요한 비-전사 유전자 요소를 제공하기 위해 사용될 수 있다.
일부 바람직한 구현예에서, 벡터는 레트로바이러스 벡터이다. 다수의 레트로바이러스들의 게놈 구조는 당업계에 잘 알려져 있는데, 이것은 레트로바이러스 게놈이 레트로바이러스 벡터를 생산하도록 적응하게 해준다. 관심 대상 유전자를 보유하는 재조합 레트로바이러스 벡터의 생산은, 전형적으로 2 단계로 달성된다.
먼저, 관심 대상 유전자는 관심 대상 유전자의 효율적인 발현에 필요한 서열(바이러스의 긴 말단 반복부(LTR)에 의해, 또는 내부 프로모터/인핸서 및 관련 스플라이싱 신호에 의해 제공될 수 있는 프로모터 및/또는 인핸서 요소 포함), 바이러스 RNA의 감염성 비리온으로의 효율적인 패키징에 필요한 서열(예를 들어, 패키징 신호(Psi), tRNA 프라이머 결합 부위(-PBS), 역전사에 필요한 3' 조절 서열(+PBS)), 및 바이러스 LTR을 함유하는 레트로바이러스 벡터로 삽입된다. LTR은 바이러스 게놈 RNA의 결합, 역전사효소(reverse transcription)와 인테그라제(integrase) 기능에 필요한 서열, 및 바이러스 입자로 패키징될 게놈 RNA의 발현의 유도에 관여하는 서열을 함유한다. 안전성의 이유로, 많은 재조합 레트로바이러스 벡터들은 바이러스 복제에 필수적인 유전자의 기능성 카피가 결핍되며(이들 필수 유전자는 결실되거나, 기능 장애가 있다(disabled)); 따라서, 생성된 바이러스는 복제 결함성인 것으로 불린다.
두 번째로, 재조합 벡터를 제작한 후, 벡터 DNA가 패키징 세포주에 도입된다. 패키징 세포주는 바이러스 게놈 RNA가 원하는 숙주 범위를 갖는 바이러스 입자로 패키징되는데 트랜스로(in trans) 요구되는 단백질(즉, 바이러스-암호화된 gag, pol 및 env 단백질)을 제공한다. 숙주 범위는 부분적으로, 바이러스 입자의 표면에 발현된 외피 유전자 산물의 타입에 의해 조절된다. 패키징 세포주는 동종지향성(ecotropic), 넓은 범위의 숙주에 감염되는(amphotropic) 또는 숙주 외의 세포에서만 증식하는(xenotropic) 외피 유전자 산물을 발현할 수 있다. 대안적으로, 패키징 세포주는 바이러스 외피(env) 단백질을 암호화하는 서열이 결핍되어 있을 수 있다. 이 경우에, 패키징 세포주는 바이러스 게놈을 막-연결된 단백질(예를 들어, env 단백질)이 결핍된 입자로 패키징할 것이다. 바이러스를 세포로 도입하게 할 막 연결된 단백질을 함유하는 바이러스 입자를 생산하기 위해, 레트로바이러스 서열을 함유하는 패키징 세포주는 막-연결된 단백질(예를 들어, 수포성 구내염(vesicular stomatitis) 바이러스(VSV)의 G 단백질)을 암호화하는 서열에 의해 형질감염된다. 형질감염된 패키징 세포는, 이후 그 형질감염된 패키징 세포주에 의해 발현된 막-연결된 단백질을 함유하는 바이러스 입자를 생산할 것이고; 다른 바이러스의 외피 단백질에 의해 캡슐화된, 하나의 바이러스로부터 유래된 바이러스 게놈 RNA를 함유하는 이들 바이러스 입자는, 슈도타입의 바이러스 입자라고 불린다.
본 발명의 레트로바이러스 벡터는 추가적인 조절 서열을 포함하도록 추가로 변형될 수 있다. 상기 기재된 본 발명의 레트로바이러스 벡터는, 작용가능하게 연결된 이하의 요소: a) 5' LTR; b) 패키징 신호; c) 3' LTR 및 d) 5' LTR과 3' LTR 사이에 위치한 관심 대상 단백질을 암호화하는 핵산을 포함한다. 본 발명의 일부 구현예에서, 상기 관심 대상 핵산은 내부 프로모터로부터의 전사를 원할 때, 5' LTR과 반대 방향으로 정렬될 수 있다. 적합한 내부 프로모터는 알파-락트알부민 프로모터, CMV 프로모터(인간 또는 유인원), 및 티미딘 키나제 프로모터를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
관심 대상 단백질의 분비를 원하는 본 발명의 다른 구현예에서, 벡터는 관심 대상 단백질과 작용가능하게 연결된 신호 펩티드 서열을 포함함으로써 변형된다. 몇몇 적합한 신호 펩티드의 서열은, 당업계에서 조직 플라스미노겐 활성자, 인간 성장 호르몬, 락토페린, 알파-카제인, 및 알파-락트알부민으로부터 유래된 것들을 포함하나, 이에 제한되지 않는 것들로 알려져 있다.
본 발명의 다른 구현예에서, 벡터는 RNA 방출(export) 요소(예를 들어, 미국 특허 제5,914,267호; 제6,136,597호; 및 제5,686,120호; 및 WO99/14310을 참고하며, 상기 문헌 모두는 본원에 인용되어 포함된다)를 관심 대상 단백질을 암호화하는 핵산 서열의 3' 또는 5'에 포함시킴으로써 변형된다. RNA 방출 요소의 사용은, 관심 대상 단백질을 암호화하는 핵산 서열 내에 스플라이스 신호 또는 인트론을 포함하지 않고도 관심 대상 단백질의 높은 수준의 발현을 허용한다고 고려된다.
또 다른 구현예에서, 벡터는 적어도 하나의 내부 리보솜 도입 부위(IRES: internal ribosome entry site) 서열을 추가로 포함한다. 구제역 바이러스(FDV: foot and mouth disease virus), 뇌척수 심근염(encephalomyocarditis) 바이러스, 및 폴리오바이러스(poliovirus)로부터 유래된 것들을 포함하나, 이에 제한되지 않는 몇몇 적합한 IRES의 서열들이 이용가능하다. IRES 서열은 2개의 전사 단위들(예를 들어, 상이한 관심 대상 단백질 또는 다중 서브유닛 단백질, 예컨대 항원의 서브 유닛을 암호화하는 핵산들) 사이에 삽입되어, 폴리시스트론 서열을 형성할 수 있어서, 2개의 전사 단위들은 동일한 프로모터로부터 전사된다.
가장 흔하게 사용되는 재조합 레트로바이러스 벡터는, 양쪽성(amphotropic) 몰로니 쥣과 백혈병 바이러스(MoMLV)로부터 유래된다(예를 들어, 문헌[Miller and Baltimore Mol. Cell. Biol. 6:2895 [1986]] 참고). MoMLV 시스템은 이하의 몇몇 장점들을 갖는다: 1) 이러한 특이적인 레트로바이러스는 많은 상이한 세포 타입들을 감염시킬 수 있고, 2) 확립된 패키징 세포주는 재조합 MoMLV 바이러스 입자의 생산에 이용가능하며, 3) 전달된 유전자는 표적 세포 염색체에 영구적으로 통합된다. 확립된 MoMLV 벡터 시스템은 레트로바이러스 서열의 작은 일부(예를 들어, 바이러스의 긴 말단 반복부 또는 "LTR" 및 패키징 또는 "psi" 신호)를 함유하는 DNA 벡터 및 패키징 세포주를 포함한다. 전달될 유전자는, DNA 벡터에 삽입된다. DNA 벡터 상에 존재하는 바이러스 서열은, 벡터 RNA의 바이러스 입자로의 상기 삽입 또는 패키징, 및 삽입된 유전자의 발현에 필요한 신호를 제공한다. 패키징 세포주는 입자 조립에 요구되는 단백질을 제공한다(문헌[Markowitz 등, J. Virol. 62:1120 [1988]]).
일부 바람직한 구현예에서, 레트로바이러스 벡터는 슈도타입이며, 예를 들어 막 결합 단백질로서 VSV의 G 단백질을 이용한다. 특정한 세포 표면 단백질 수용체에 결합하여 세포에 도입되는 레트로바이러스 외피 단백질과는 달리, VSV G 단백질은 원형질 막의 인지질 성분과 상호작용을 한다(Mastromarino 등, J. Gen. Virol. 68:2359 [1977]). VSV의 세포로의 도입이 특정 단백질 수용체들의 존재에 의존하지 않으므로, VSV는 극히 넓은 숙주 범위를 갖는다. VSV G 단백질을 보유하는 슈도타입의 레트로바이러스 벡터는, VSV의 변화된 숙주 범위의 특징을 갖는다(즉, 이들은 척추 동물, 무척추 동물 및 곤충 세포의 거의 모든 종에 감염될 수 있다). 중요하게는, VSV G-슈도타입의 레트로바이러스 벡터는 유의한 감염성의 손상 없이도 초원심분리에 의해 2000-배 이상 농축될 수 있다(문헌[Burns 등 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8033 [1993]]).
본 발명은, 바이러스 G 단백질이 바이러스 입자 내에서 이종성 막-연결된 단백질로서 이용될 때, VSV G 단백질의 사용에 제한되지 않는다(예를 들어, 본원에 인용되어 포함된 미국 특허 제5,512,421호 참고). VSV이 아닌 베시큘로바이러스 속의 바이러스, 예컨대 피리 및 찬디푸라 바이러스의 G 단백질은, VSV G 단백질과 높은 상동성을 갖고, VSV G 단백질과 마찬가지로 공유 결합된 팔미트산을 함유한다(문헌[Brun 등 Intervirol. 38:274 [1995]] 및 문헌[Masters 등, Virol. 171:285 (1990]]). 따라서, 피리 및 찬디푸라 바이러스의 G 단백질은, 바이러스 입자의 슈도 타입 형성(pseudotyping)을 위해 VSV G 단백질 대신에 사용될 수 있다. 또한, 리사 바이러스 속 내의 바이러스, 예컨대 광견병(Rabies) 및 모콜라 바이러스의 VSV G 단백질은, VSV G 단백질에 대해 높은 정도의 보존성(아미노산 서열 뿐만 아니라 기능성 보존성)을 나타낸다. 예를 들어, 모콜라 바이러스 G 단백질은 VSV G 단백질과 유사한 방식으로 기능하는(즉, 막 융합을 매개하는) 것으로 나타났고, 따라서 바이러스 입자의 슈도 타입 형성을 위해 VSV G 단백질 대신에 사용될 수 있다(Mebatsion 등, J. Virol. 69:1444 [1995]). 바이러스 입자는 pHCMV-G 대신에 적합한 프로모터 요소(예를 들어, CMV 극-초기 프로모터; CMV IE 프로모터를 함유하는 다수의 발현 벡터들, 예컨대 pcDNA3.1 벡터(Invitrogen))의 전사 조절 하에 피리, 찬디푸라 또는 모콜라 G 단백질 중 하나를 암호화하는 서열들을 함유하는 플라스미드가 사용된 것을 제외하고는, 실시예 2에 기재된 바와 같이 피리, 찬디푸라 또는 모콜라 G 단백질 중 어느 하나를 사용하여 슈도 타입화될 수 있다. 랍도바이러스과의 다른 일원으로부터 유래된 다른 G 단백질을 암호화하는 서열이 사용될 수 있고; 다수의 랍도바이러스 G 단백질을 암호화하는 서열들은, GenBank 데이터베이스로부터 이용가능하다.
일부 바람직한 구현예에서, 벡터는 렌티바이러스 벡터이다. 렌티바이러스(예를 들어, 말 감염성 빈혈 바이러스, 염소 관절염-뇌염 바이러스, 인간 면역 결핍성 바이러스)는 비-분열 세포에 통합될 수 있는 레트로바이러스의 아과(subfamily)이다. 렌티바이러스 게놈과 프로바이러스 DNA는, 레트로바이러스에서 발견되는 3개의 유전자인 gag, pol 및 env를 갖고, 이들의 옆에는 2개의 LTR 서열들이 측접한다. gag 유전자는 내부 구조 단백질(예를 들어, 기질, 캡시드, 및 뉴클레오캡시드 단백질)을 암호화하고; pol 유전자는 역전사효소, 프로테아제 및 인테그라제 단백질을 암호화하고; pol 유전자는 바이러스 외피 당단백질을 암호화한다. 5' LTR과 3' LTR은 전사 및 바이러스 RNA의 폴리아데닐화를 조절한다. 렌티바이러스 게놈 내의 추가적인 유전자는, vif, vpr, tat, rev, vpu, nef 및 vpx 유전자를 포함한다.
다양한 렌티바이러스 벡터 및 패키징 세포주가 당업계에 알려져 있는데, 본 발명에서 용도를 발견하였다(예를 들어, 미국 특허 제5,994,136호 및 제6,013,516호를 참고하며, 상기 문헌은 둘 다 본원에 인용되어 포함된다). 게다가, VSV G 단백질은 또한 인간 면역 결핍성 바이러스(HIV)에 기초한 슈도타입의 레트로바이러스 벡터에도 사용되었다(문헌[Naldini 등, Science 272:263 [1996]]). 따라서, VSV G 단백질은 다양한 슈도타입의 레트로바이러스 벡터를 생성하는데 사용될 수 있고, MoMLV에 기초한 벡터에 제한되지 않는다. 렌티바이러스 벡터는 또한 상기 기재된 바와 같이 다양한 조절 서열들(예를 들어, 신호 펩티드 서열, RNA 방출 요소 및 IRES의 서열)을 함유하도록 변형될 수 있다. 렌티바이러스 벡터가 생산된 후, 이들은 레트로바이러스 벡터에 대해 상기 기재된 바와 같이 숙주 세포를 형질감염시키는데 사용될 수 있다.
일부 바람직한 구현예에서, 벡터는 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터이다. AAV는 데펜도바이러스(Dependovirus) 속에 속하는 인간 DNA 파르보바이러스(parvovirus)이다. AAV 게놈은 대략 4680개의 염기를 함유하는 선형의 단일-가닥 DNA 분자로 구성된다. 게놈은 각 말단부에, DNA의 복제 기원 및 바이러스에 대한 패키징 신호로서 시스로(in cis) 기능을 하는 역위 말단 반복부(ITR: inverted terminal repeat)를 포함한다. 게놈의 내부 비번역 부분은, 각각 AAV rep 및 cap 영역이라고 알려진 2개의 큰 오픈 리딩 프레임을 포함한다. 이들 영역은 비리온의 복제와 패키징에 관여하는 바이러스 단백질들을 암호화한다. 적어도 4개의 바이러스 단백질의 패밀리가, 이들의 겉보기 분자량에 따라 명명된 AAV rep 영역, Rep 78, Rep 68, Rep 52 및 Rep 40로부터 합성된다. AAV cap 영역은 적어도 3개의 단백질인 VP1, VP2 및 VP3을 암호화한다(AAV 게놈의 상세한 설명에 대해서는, 예를 들어, 문헌[Muzyczka, Current Topics Microbiol. Immunol. 158:97-129 [1992]]; 문헌[Kotin, Human Gene Therapy 5:793-801 [1994]]를 참고한다).
생산적인 감염이 발생시키기 위해, AAV는 관계없는 헬퍼 바이러스, 예컨대 아데노바이러스, 헤르페스바이러스 또는 배시니아와 함께 공동감염될 필요가 있다. 이러한 공동감염이 없으면, AAV는 숙주 세포 염색체로 이의 게놈을 삽입함으로써 잠재성 상태(latent state)를 확립한다. 헬퍼 바이러스에 의한 추후 감염으로 통합된 카피를 탈출시키고, 이는 이후 복제되어 감염성 바이러스 자손을 생산할 수 있다. 비-슈도타입의 레트로바이러스와 달리, AAV는 넓은 숙주 범위를 갖고, 또한 그 종 내에서 번식할 헬퍼 바이러스와 함께 공동감염되는 이상, 어느 종 유래의 세포 내에도 복제할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 인간 AAV는 개의 아데노바이러스와 함께 공동 감염된 개 세포 내에서 복제할 것이다. 게다가, 레트로바이러스와는 달리, AAV는 인간 또는 동물의 어떠한 질병과도 관계없으며, 통합 시 숙주 세포의 생물학적 특성들을 변화시키지 않는 것으로 보이며, 비분열 세포로 통합될 수 있다. 또한, 최근 AAV는 숙주 세포 게놈으로 부위-특이적인 통합을 할 수 있는 것으로 발견되었다.
상기-기재된 특성들을 고려하여, 다수의 재조합 AAV 벡터가 유전자 전달을 위해 개발되었다(예를 들어, 미국 특허 제5,173,414호; 제5,139,941호; WO 92/01070 및 WO 93/03769를 참고하고, 상기 두 문헌들은 본원에 인용되어 포함되며; 문헌[Lebkowski 등, Molec. Cell. Biol. 8:3988-3996 [1988]]; 문헌[Carter, Current Opinion in Biotechnology 3:533-539 [1992]]; 문헌[Muzyczka, Current Topics in Microbiol. and Immunol. 158:97-129 [1992]]; 문헌[Kotin, (1994) Human Gene Therapy 5:793-801]; 문헌[Shelling 및 Smith, Gene Therapy 1:165-169 [1994]]; 및 문헌[Zhou 등, J. Exp. Med. 179:1867-1875 [1994]] 참고).
재조합 AAV 비리온은 AAV 헬퍼 플라스미드 및 AAV 벡터 둘 다에 의해 형질감염되었던 적합한 숙주 세포에서 생산될 수 있다. AAV 헬퍼 플라스미드는 일반적으로 AAV rep 및 cap 암호화 영역을 포함하나, AAV ITR가 결핍되어 있다. 따라서, 헬퍼 플라스미드는 그 자체로 복제하거나 패키징할 수 없다. AAV 벡터는 일반적으로 바이러스 복제와 패키징 기능을 제공하는, AAV ITR에 의한 경계를 갖는 선택된 관심 대상 유전자를 포함한다. 헬퍼 플라스미드 및 선택된 유전자를 보유한 AAV 벡터는, 둘 다 순간적인 형질감염에 의해 적합한 숙주 세포에 도입된다. 이후, 형질감염된 세포는 헬퍼 바이러스, 예컨대 아데노바이러스에 의해 형질감염되며, 이는 AAV rep 및 cap 영역의 전사와 번역을 유도하는, 헬퍼 플라스미드 내에 존재하는 AAV 프로모터를 전사활성화한다(transactivate). 선택된 유전자를 포함하는 재조합 AAV 비리온이 형성되고, 제조를 위해 정제될 수 있다. 일단 AAV 벡터가 생산되면, 이들을 사용하여, 고 카피수 숙주 세포를 생산하기 위한 원하는 감염 다중도로 형질감염시킬 수 있다(예를 들어, 본원에 인용되어 포함된 미국 특허 제5,843,742호 참고). 당업계의 숙련자가 이해하는 바와 같이, AAV 벡터는 또한 상기 기재된 바와 같이 다양한 조절 서열(예를 들어, 신호 펩티드 서열, RNA 방출 요소, 및 IRES 서열)을 함유하도록 변형될 수 있다.
일부 바람직한 구현예에서, 벡터는 트랜스포존-기반의 벡터이다. 트랜스포존은 게놈 내의 한 장소에서 다른 장소로 움직이거나, 위치를 바꾸는 이동성 유전 요소이다. 게놈 내의 전위는, 트랜스포존에 의해 암호화되는 전위 효소에 의해 조절된다. 트랜스포존의 많은 예들이 당업계에 알려져 있는데, Tn5(예를 들어, 문헌[de la Cruz 등, J. Bact. 175: 6932-38 [1993]] 참고), Tn7(예를 들어, 문헌[Craig, Curr. Topics Microbiol. Immunol. 204: 27-48 [1996]] 참고), 및 Tn10(예를 들어, 문헌[Morisato 및 Kleckner, Cell 51:101-111 [1987]] 참고)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 트랜스포존이 게놈에 통합되는 능력은, 트랜스포존 벡터를 생성하는데 이용되었다(예를 들어, 미국 특허 제5,719,055호; 제5,968,785호; 제5,958,775호; 및 제6,027,722호를 참고하며; 상기 문헌은 모두 본원에 인용되어 포함된다). 트랜스포존이 감염성을 갖지 않으므로, 트랜스포존 벡터는 당업계에 알려진 방법(예를 들어, 전기천공법, 리포펙션 또는 미세주입)을 통해 숙주 세포에 도입된다. 따라서, 트랜스포존 벡터 대 숙주 세포의 비는 원하는 감염 다중도를 제공하도록 조절되어, 본 발명의 고 카피수 숙주 세포를 생산할 수 있다.
본 발명에 사용하기 적합한 트랜스포존 벡터는, 일반적으로 2개의 트랜스포존 삽입 서열들 사이에 삽입된 관심 대상 단백질을 암호화하는 핵산을 포함한다. 일부 벡터는 또한 전위 효소를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 이들 벡터에서, 상기 삽입 서열들 중 하나는 전위 효소와 관심 대상 단백질을 암호화하는 핵산의 사이에 위치하여, 재조합되는 동안 숙주 세포의 게놈에 혼입되지 않는다. 대안적으로, 전위 효소는 적합한 방법(예를 들어, 리포펙션 또는 미세주입)에 의해 제공될 수 있다. 당업계의 숙련자가 이해하는 바와 같이, 트랜스포존 벡터는 또한 상기 기재된 바와 같은 다양한 조절 서열들(예를 들어, 신호 펩티드 서열, RNA 방출 요소, 및 IRES의 서열)을 함유하도록 변형될 수 있다.
일부 바람직한 구현예에서, 벡터는 선별 마커를 포함한다. 적합한 선별 마커는 글루타민 합성 효소(GS), 디히드로폴레이트 환원효소(DHFR) 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 이들 유전자는 미국 특허 제5,770,359호; 제5,827,739호; 제4,399,216호; 제4,634,665호; 제5,149,636호; 및 제6,455,275호에 기재되어 있고; 상기 문헌은 모두 본원에 인용되어 포함된다. 일부 특히 바람직한 구현예에서, 선별 마커는 GS이고, 서열번호 2의 위치 1789 내지 2910의 서열과 적어도 80%, 90%, 95%, 99% 또는 100%의 동일성을 공유하는 서열을 갖는다. 일부 바람직한 구현예에서, 이용되는 선별 마커는 선별 마커 핵산 서열에 의해 암호화된 효소의 생산이 결핍된 숙주 세포주와 양립가능하다. 적합한 숙주 세포주는 이하에 더욱 상세히 기재되어 있다. 다른 구현예에서, 선별 마커는 항생제 내성 마커, 즉, 항생제에 내성을 갖는 단백질을 발현하는 세포를 제공하는 단백질을 생산하는 유전자이다. 적합한 항생제 내성 마커는 네오마이신(neomycin)(네오마이신 내성 유전자(neo)), 하이그로마이신(hygromycin)(하이그로마이신 B 포스포트랜스퍼라제(phosphotransferase) 유전자), 퓨로마이신(puromycin)(퓨로마이신 N-아세틸-트랜스퍼라제(N-acetyl-transferase)) 등에 내성을 제공하는 유전자를 포함한다.
일부 구현예에서, 선별 마커를 암호화하는 핵산 서열은 프로모터 서열에 작용가능하게 연결된다. 일부 특히 바람직한 구현예에서, 프로모터 서열은 예를 들어 돌연변이에 의해, 프로모터의 비변화된 버전에 비해 프로모터 활성이 감소되었다. 이들 프로모터는 프로모터에 연결된 유전자의 발현이 고 수준이 아니라 저 수준으로 발생한다는 점에서 약한 프로모터로 기재될 수 있다. 강한 프로모터에 의해 조절된 유전자는 더 많은 mRNA를 얻고, 따라서 약한 프로모터에 의해 조절된 유전자보다 더 많은 단백질을 생산한다. 그러므로, 본 발명은 바람직하게는 비교가능한 비변화된 프로모터보다(that) 더 적은 mRNA를 얻도록 변화된, 선별 마커를 위한 프로모터를 이용한다.
일부 바람직한 구현예에서, 선별 마커에 작용가능하게 연결된 프로모터는, 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 유래의 긴 말단 반복부(LTR)이다. 일부 특히 바람직한 구현예에서, 프로모터는 LTR의 U3 영역의 전부 또는 일부를 제거함으로써 변화된 LTR이다. 일부 구현예에서, 선별 마커에 작용가능하게 연결된 프로모터는, 자가-불활성화(SIN) LTR이다. 적합한 SIN LTR은 당업계에 알려져 있다. 일부 바람직한 구현예에서, 본 발명의 SIN LTR는 바람직하게는 서열번호 3과 적어도 80%, 90%, 95%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖고, SIN LTR은 가장 바람직하게는 그 안에서 U3 영역이 결실되어, U3 영역이 결실되지 않은 때의 프로모터 활성에 비해 프로모터 활성이 감소된다.
상기 벡터가 레트로바이러스 벡터일 때, 상기 벡터는, SIN LTR이 레트로바이러스 벡터 서열의 3' LTR인 것으로 제작되었다고 이해될 것이다. U3 결실이 역전사 동안 5' LTR 및 3' LTR에 복사된다는 사실에 기인하여, 통합된 SIN 벡터는 단지 U3가 결실된 LTR만을 함유한다. 본 발명의 예시적인 레트로바이러스 벡터의 지도는, 도 2에 제공되어 있다. 나타난 바와 같이, 벡터는 SIN 3' LTR을 함유한다. 역전사될 때, 벡터 지도에 도시된 hCMV-MOMuSV LTR은 그 벡터 지도에 도시된 SIN 3' LTR로 대체되어, 상기 벡터가 숙주 세포 염색체에 통합될 때, 상기 SIN LTR은 상기 도시된 GS cDNA에 작용가능하게 연결되어, 이의 발현을 유도한다.
본 발명의 특정 바람직한 구현예에서, 발현 벡터 내의 관심 대상 단백질을 암호화하는 핵산 서열은, 적당한 발현 조절 서열(들)(프로모터)에 작용가능하게 연결되어, mRNA 합성을 유도한다. 본 발명에 유용한 프로모터는, LTR 또는 SV40 프로모터, E. coli의 lac 또는 trp 프로모터, 파지 람다의 PL 및 PR 프로모터, T3 및 T7 프로모터, 그리고 극초기 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, 헤르페스 단순 바이러스(HSV) 티미딘 키나제 프로모터, 및 마우스 메탈로티오네인(metallothionein)-I 프로모터, 및 원핵 또는 진핵 세포 또는 이들의 바이러스의 유전자 발현을 조절한다고 알려진 다른 프로모터를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
상기 언급한 바와 같이, 본 발명의 벡터의 예시적인 지도는, 도 3에 제공되며, 서열번호 2에 해당한다. 일부 바람직한 구현예에서, 벡터는 이하의 요소를 5'에서 3' 순서로 포함한다:
- 5' LTR (hCMV-MoMuSV LTR에 의해 예시됨)
- 레트로바이러스 패키징 영역
- 선별 마커를 암호화하는 핵산(GS cDNA에 의해 예시됨)
- 내부 프로모터(유인원 CMV (sCMV) 프로모터에 의해 예시됨)
- 상기 내부 프로모터에 작용가능하게 연결된 관심 대상 단백질을 암호화하는 핵산 서열("anyway" 서열에 의해 예시됨)
- WPRE 서열
- SIN 3' LTR.
일부 구현예에서, 벡터는 이하의 요소를 5'에서 3'의 순서로 포함하는 플라스미드이다: 1) 5' LTR (예를 들어, SIN LTR); 2) 패키징 영역; 3) 선별 마커 (예를 들어, GS); 4) 내부 프로모터 (예를 들어, CMV 프로모터); 및 5) 상기 내부 프로모터에 작용가능하게 연결된 관심 대상 단백질을 암호화하는 핵산 서열.
일부 구현예에서, 벡터는 관심 대상 단백질을 암호화하는 핵산의 하류에 단일 폴리 A 신호 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 상기 벡터는 이하의 구성요소를 5'에서 3'의 순서로 포함한다: 프로모터(예를 들어, SIN)-선별 마커-정지 코돈-프로모터(예를 들어, CMV)-관심 대상 단백질-정지 코돈-폴리 A.
일부 구현예에서, 본 발명은 숙주 세포와 세포 배양체를 제공하는데, 상기 숙주 세포는 상기 기재된 벡터로부터 관심 대상 단백질을 발현시킨다. 바람직한 구현예에서, 숙주 세포는 포유류 숙주 세포이다. 다수의 포유류 숙주 세포주들이 당업계에 알려져 있다. 일반적으로, 이들 숙주 세포는 적절한 영양분과 성장 인자를 함유하는 배지에서 단층 배양 또는 현탁 배양될 때, 성장과 생존을 할 수 있고, 이는 이하에 더욱 상세히 기재되어 있다. 전형적으로, 상기 세포는 다량의 특정 관심 대상 단백질을 발현시키고, 이를 배양 배지에 분비할 수 있다. 적합한 포유류 숙주 세포의 예는, 중국 햄스터 난소 세포(CHO-K1, ATCC CCl-61); 소의 유선 상피 세포 (ATCC CRL 10274; 소의 유선 상피 세포); SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주(COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아의 신장 세포주(현탁 배양액에서 성장하기 위해 서브클로닝된 293 또는 293 세포; 예를 들어, 문헌[Graham 등, J. Gen Virol., 36:59 [1977]] 참고); 새끼 햄스터 신장 세포(BHK, ATCC CCL 10); 마우스 세르톨리(sertoli) 세포(TM4, 문헌[Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 [1980]]); 원숭이 신장 세포(CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 자궁 경부 암종 세포(HELA, ATCC CCL 2); 개의 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트의 간 세포(BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포 (W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포(Hep G2, HB 8065); 마우스 유선 종양 (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포(Mather 등, Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 [1982]); MRC 5 세포; FS4 세포; 래트의 섬유아세포(208F 세포); MDBK 세포(소의 신장 세포); CAP(CEVEC's Amniocyte Production) 세포; 및 인간 간암 세포주(Hep G2)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
일부 특히 바람직한 구현예에서, 숙주 세포는 변형되어, 이들은 선별제의 존재 하에 세포의 성장 또는 생존에 요구되고 선별 마커에 의해 제공된 효소 활성이 결핍되거나, 자연적으로 결핍된다. 예를 들어, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포는 GS가 결핍되도록 변형되었다. 벡터가 GS 선별 마커를 포함하는 일부 바람직한 구현예에서, 숙주 세포주는 GS가 결핍된다. 일부 특히 바람직한 구현예에서, GS 결핍성 숙주 세포주는 Merck KGaA로부터 이용가능한 CHOZN® GS-/- 세포주이다. 다른 구현예에서, 선별 마커가 예를 들어, DHFR일 때, 세포주는 바람직하게는 DHFR 활성이 결핍될 수 있다(즉, DHFR-). 적합한 DHFR- 세포주는 CHO-DG44 및 이의 파생물을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
벡터는 임의의 적합한 수단에 의해 숙주 세포에 도입될 수 있다. 일부 바람직한 구현예에서, 관심 대상 단백질을 암호화하는 벡터(예를 들어, 레트로바이러스 벡터)가 생산되었고, 이들은 숙주 세포를 형질감염 또는 형질도입시키는데 사용될 수 있다. 바람직하게는, 숙주 세포는 적어도 1개, 바람직하게는 적어도 2개 이상의 레트로바이러스 벡터들을 통합시키는데 충분한 감염 다중도로 통합 벡터에 의해 형질감염 또는 형질도입된다. 일부 구현예에서, 10 내지 1,000,000의 감염 다중도가 이용될 수 있어서, 감염된 숙주 세포의 게놈은 2 내지 1000 카피의 통합된 벡터, 바람직하게는 5 내지 1000 카피의 통합된 벡터, 가장 바람직하게는 20 내지 500 카피의 통합된 벡터를 함유한다. 다른 구현예에서, 10 내지 10,000의 감염 다중도가 이용된다. 비-슈도타입의 레트로바이러스 벡터가 감염에 이용될 때, 숙주 세포는 감염성 벡터의 원하는 역가(즉, 콜로니 형성 단위, CFU)를 함유하는 레트로바이러스 생산자 세포로부터의 배양 배지와 함께 배양된다. 슈도타입의 레트로바이러스 벡터가 이용될 때, 벡터는 초원심분리에 의해 적절한 역가로 농축된 후, 숙주 세포 배양체에 첨가된다. 대안적으로, 농축된 벡터는 세포 타입에 적합한 배양 배지 중에 희석될 수 있다. 추가로, 숙주 세포가 하나 초과의 관심 대상 단백질을 발현시키기를 원하는 경우, 숙주 세포는 각각 상이한 관심 대상 단백질을 암호화하는 핵산을 함유하는 다수의 벡터들에 의해 형질감염될 수 있다.
각 경우에, 숙주 세포는 벡터의 감염 및 추후 통합을 허용하기에 충분한 시기 동안, 감염성 레트로바이러스 벡터를 함유하는 배지에 노출된다. 일반적으로, 세포를 덮는데(overlay) 사용된 배지의 양은, 세포당 최대량의 통합 사건을 조장하도록 가능한한 작은 부피로 유지되어야 한다. 일반적인 지침으로서, 밀리리터당 콜로니 형성 단위(cfu)의 수는, 원하는 통합 사건의 수에 따라서 약 105 내지 107 cfu/ml이어야 한다.
일부 구현예에서, 형질감염 또는 형질 도입 이후, 세포는 증식하고, 그 후 트립신 처리 및 재분주된다. 이후, 개별 콜로니들은 선별되어, 클로닝에 의해 선별된 세포주들을 제공한다. 다른 추가적인 구현예에서, 클로닝에 의해 선별된 세포주는 서던 블로팅 또는 PCR 검정법에 의해 스크리닝되어, 원하는 수의 통합 사건이 발생했는지를 검증하였다. 또한, 클로닝 선별에 의해 우수한 단백질 생산 세포주를 식별할 수 있게 된다는 사실도 고려한다. 다른 구현예에서, 세포는 형질감염 이후 클로닝에 의해 선별되지 않는다.
일부 구현예에서, 숙주 세포는 상이한 관심 대상 단백질들을 암호화하는 벡터들에 의해 형질감염된다. 상이한 관심 대상 단백질들을 암호화하는 벡터들은, 세포를 동시에 형질감염시키는데 사용될 수 있거나(예를 들어, 숙주 세포는 상이한 관심 대상 단백질들을 암호화하는 벡터들을 함유하는 용액에 노출된다), 또는 형질감염은 연속적일 수 있다(예를 들어, 숙주 세포는 먼저 제1 관심 대상 단백질을 암호화하는 벡터에 의해 형질감염되고, 시간이 흐르고, 이후 숙주 세포가 제2 관심 대상 단백질을 암호화하는 벡터에 의해 형질감염된다). 일부 바람직한 구현예에서, 숙주 세포는 제1 관심 대상 단백질을 암호화하는 통합 벡터에 의해 형질감염되고, 다수의 통합된 카피의 통합 벡터를 함유하는 고 발현 세포주가 선별되고(예를 들어, 클로닝에 의해 선별되고), 선별된 세포주는 제2 관심 대상 단백질을 암호화하는 통합 벡터에 의해 형질감염된다. 이 과정은 다수의 관심 대상 단백질들을 도입하기 위해 반복될 수 있다. 일부 구현예에서, 감염의 다중도를 조작하여(예를 들어, 증가 또는 감소시켜), 관심 대상 단백질의 발현을 증가 또는 감소시킬 수 있다. 마찬가지로, 관심 대상 단백질의 발현을 변화시키는데 상이한 프로모터들이 이용될 수 있다. 이들 형질감염 방법은 전체 외인성 대사 경로를 함유하는 숙주 세포주를 제작하거나, 숙주 세포에 단백질을 가공하는 증가된 능력을 제공하는데 사용될 수 있다는 사실이 고려된다(예를 들어, 숙주 세포에 번역-후 변형에 필요한 효소가 제공될 수 있다).
다른 구현예에서, 세포주는 동일한 유전자를 암호화하는 벡터에 의해 연속적으로 형질감염된다. 일부 바람직한 구현예에서, 숙주 세포는 관심 대상 단백질을 암호화하는 통합 벡터에 의해 (예를 들어, 약 10 내지 1,000,000, 바람직하게는 100 내지 10,000의 MOI로) 형질감염되고, 단일 또는 다수의 통합된 카피의 통합 벡터를 함유하거나, 높은 수준의 원하는 단백질을 발현하는 세포주가 선별되고(예를 들어, 클로닝에 의해 선별되고), 선별된 세포주는 벡터에 의해 (예를 들어, 약 10 내지 1,000,0000; 바람직하게는 100 내지 10,000의 MOI로) 재형질감염된다. 일부 구현예에서, 적어도 2개의 통합된 카피의 벡터를 포함하는 세포주를 식별하여, 선별한다. 이 공정은 원하는 수준의 단백질 발현이 얻어질 때까지 여러 번 반복될 수 있고, 또한 다수의 관심 대상 단백질을 암호화하는 벡터를 도입하기 위해서도 반복될 수 있다. 예측하지 못하게, 동일한 유전자에 의한 연속 형질감염은, 단지 첨가만 된 것이 아니라, 생성된 세포로부터 단백질 생산을 증가시킨다.
본 발명은 다양한 연속 형질감염 과정을 고려한다. 일부 구현예에서, 레트로바이러스 벡터가 이용될 때, 연속 형질 도입 과정이 제공된다. 바람직한 구현예에서, 연속 형질 도입은 세포의 풀(pool)에서 수행된다. 이들 구현예에서, 숙주 세포의 초기 풀은 바람직하게는 약 0.5 내지 약 1000개 벡터/숙주 세포 범위의 감염 다중도로 레트로바이러스 벡터와 접촉된다. 이후, 세포는 (예를 들어, 선별제를 갖는) 적절한 배지에서 며칠 동안 배양된다. 이후, 세포의 분취액을 취하여 통합된 벡터의 수를 결정하고, 미래의 가능한 사용을 위해 동결한다. 이후, 잔여 세포는 바람직하게는 약 0.5 내지 약 1000개 벡터/숙주 세포의 감염 다중도로 다시 레트로바이러스 벡터와 재접촉된다. 이 공정은 원하는 수의 통합된 벡터를 갖는 세포를 얻을 때까지 반복된다. 예를 들어, 공정은 최대 10 내지 20회, 또는 그 이상의 횟수로 반복될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 원하는 경우 임의의 특정 형질 도입 단계 이후 클로닝에 의해 선별될 수 있으나, 형질 도입이 없는 세포의 풀을 이용하면, 원하는 통합된 벡터 카피수까지의 시간을 감소시켰다.
본 발명의 일부 구현예에서, 적합한 숙주 균주를 형질전환시키고, 배지에서 숙주 균주를 적절한 세포 밀도까지의 성장시킨 후, 관심 대상 단백질은 숙주 세포의 배양 동안 분비된다. 증폭가능한 마커가 이용되는 일부 바람직한 구현예에서, 유전자의 억제제를 포함하는 배지에서 형질도입된 숙주 세포를 배양하는 것이 고려된다. 적합한 억제제는 DHFR의 억제를 위한 메토트렉세이트(methotrexate), 및 GS의 억제를 위한 메티오닌 술폭시민(Msx, methionine sulphoximine) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 이들 억제제의 농도는 세포 배양 시스템에서 증가되므로, 더 높은 카피수의 증폭가능한 마커 (및 따라서 관심 대상 유전자 또는 유전자들)을 갖거나, 더 많은-생산을 하는 삽입체를 함유하는 세포를 선택하는 것을 고려한다.
따라서, 상기 기재된 벡터를 함유하는 숙주 세포는, 당업계에 알려진 방법에 따라 배양하였다. 포유류 세포에 적합한 배양 조건은, 당업계에 잘 알려져 있다(예를 들어, 문헌[J. Immunol. Methods (1983) 56:221-234 [1983], Animal Cell Culture: A Practical Approach 2판, Rickwood, D. 및 Hames, B. D., eds. Oxford University Press, New York [1992]] 참고).
본 발명의 숙주 세포 배양체는, 특정 세포가 배양되기에 적합한 배지에 제조된다. 상업적으로 이용가능한 배지, 예컨대 ActiPro 배지(HyClone), ExCell Advanced 유가 배양(Fed-batch culture)(SAFC), Ham's F10(Sigma, 미주리주 세인트 루인스 소재), 최소 필수 배지(MEM, Sigma), RPMI-1640(Sigma) 및 둘배코(Dulbecco)의 개질 이글 배지(DMEM, Sigma)가, 예시적인 영양 용액이다. 적합한 배지는 또한 미국 특허 제4,767,704호; 제4,657,866호; 제4,927,762호; 제5,122,469호; 제4,560,655호; 및 WO 90/03430 및 WO 87/00195에도 기재되어 있는데; 상기 문헌의 기재 내용은 본원에 인용되어 포함된다. 이들 배지 중 어느 것도 필요한 경우 혈청, 호르몬 및/또는 다른 성장 인자들(예컨대, 인슐린, 트랜스페린, 또는 상피 성장 인자), 염(예컨대, 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘 및 인산염), 완충제(예컨대, HEPES), 뉴클레오시드(예컨대, 아데노신 및 티미딘), 항생제(예컨대, 겐타마이신(gentamicin), 미량 원소(통상 마이크로몰 범위의 최종 농도로 존재하는 무기 화합물로 정의됨), 지질(예컨대, 리놀레산 또는 다른 지방산) 및 이들의 적합한 담체, 및 포도당 또는 동등한 에너지원으로 보충될 수 있다. 선별 마커, 예컨대 GS가 이용되는 일부 바람직한 구현예에서, 예를 들어, 배지는 글루타민이 결핍될 것이다. 임의의 다른 필수 보충제도 또한 당업계의 숙련자들에게 알려진 적절한 농도로 포함될 수 있다.
본 발명은 또한 형질감염된 숙주 세포를 위한 다양한 배양 시스템(예를 들어, 페트리 디쉬, 96 웰 플레이트, 롤러 보틀 및 생물반응기)의 사용을 고려한다. 예를 들어, 형질감염된 숙주 세포는 관류 시스템에서 배양될 수 있다. 관류 배양(Perfusion culture)은, 높은 세포 밀도로 유지된 배양액을 통한 배양 배지의 연속 흐름을 제공하는 것을 지칭한다. 세포는 현탁되며, 성장을 위한 고체 지지체가 요구되지 않는다. 일반적으로, 신선한 영양분이 연속 공급되고, 동시에 독성 대사물질을 제거해야 하고, 이상적으로는 사멸된 세포를 제거해야 한다. 여과, 포획 및 미세-캡슐화 방법은, 모두 충분한 속도로 배양 환경을 재충전(refreshing)하는데 적합하다.
다른 예로서, 일부 구현예에서, 유가 배치(fed-batch)-배양 과정이 이용될 수 있다. 바람직한 유가 배치-배양에서는, 초기에 포유류 숙주, 세포 및 배양 배지가 배양 용기에 공급되고, 추가적인 배양 영양분은 배양을 종결하기 전에 주기적 세포(periodic cell) 및/또는 생성물 수집과 함께 또는 그 부재 하에, 배양 동안 배양액에 연속적으로 또는 개별 증분(discrete increment)으로 공급된다. 유가 배치-배양은 예를 들어, 반-연속 유가 배치-배양을 포함할 수 있는데, 전체 배양액(세포 및 배지 포함)을 주기적으로 제거하고, 신선한 배지로 교체한다. 유가 배치-배양은, 세포 배양을 위한 모든 성분(세포 및 모든 배양 영양분 포함)이 배양 공정의 시작 시 배양 용기에 공급되는 단순 배치-배양과는 구별된다. 유가 배치-배양은 관류 배양과는 더욱 구별되어, 상청액이 공정 동안 배양 용기로부터 제거되지 않는다(관류 배양에서, 세포는 예를 들어, 여과, 캡슐화, 미세 담체에 대한 고정(anchoring) 등에 의해 배양액 내에 있도록 제한되고, 배양 배지는 배양 용기에 연속적으로 또는 간헐적으로 도입되고, 이로부터 제거된다). 일부 특히 바람직한 구현예에서, 배치-배양은 롤러 보틀에서 실시된다.
추가로, 배양액의 세포는 고려된 특정 숙주 세포 및 특정 생산 계획에 적합할 수 있는 임의의 계획 또는 관례에 따라 전파될 수 있다. 따라서, 본 발명은 단일 단계 또는 다수의 단계의 배양 과정을 고려한다. 단일 단계 배양에서는, 숙주 세포가 배양 환경에 접종되고, 본 발명의 공정들은 세포 배양의 단일 생산 상 동안 이용된다. 대안적으로, 다중-상 배양이 구상된다. 다중-상 배양에서, 세포는 다수의 단계 또는 상에서 배양될 수 있다. 예를 들어, 세포는 제1 단계 또는 성장 상 배양에서 성장할 수 있고, 여기에서 저장 상태로부터 제거된 세포는, 가능하게는 성장 및 고 생존능을 촉진하는데 적합한 배지에 접종된다. 세포는 숙주 세포 배양체에 신선한 배지를 첨가함으로써, 적합한 시간 동안 성장 단계로 유지될 수 있다.
유가 배양 또는 연속 세포 배양 조건은, 세포 배양의 성장 상에서 포유류 세포의 성장을 향상시키도록 고안된다. 성장 단계에서, 세포는 성장을 최대화하는 조건 및 시기 동안 성장한다. 배양 조건, 예컨대 온도, pH, 용존 산소(dO2) 등은, 특정 숙주에 대해 사용된 것들이고, 당업계의 통상의 숙련자에게 명백할 것이다. 일반적으로, pH는 산(예를 들어, CO2) 또는 염기(예를 들어, Na2CO3 또는 NaOH)를 사용하여 약 6.5 내지 7.5의 수준으로 조절된다. 포유류 세포, 예컨대 CHO 세포를 배양하는데 적합한 온도 범위는, 약 30℃ 내지 38℃이고, 적합한 dO2는 5-90%의 공기 포화도이다.
폴리펩티드 생산 단계 이후, 관심 대상의 폴리펩티드는 당업계에 잘 확립된 기술을 사용하여 배양 배지로부터 회수된다. 관심 대상 단백질은 바람직하게는 분비된 폴리펩티드로서 배양 배지로부터 회수되나(예를 들어, 관심 대상 단백질의 분비는 신호 펩티드 서열에 의해 주도된다), 이는 또한 숙주 세포의 용해물로부터도 회수될 수 있다. 제1 단계로서, 배양 배지 또는 용해물을 원심 분리하여, 특정 세포 잔여물을 제거한다. 그 이후, 폴리펩티드는 오염물인 용해성 단백질 및 폴리펩티드로부터 정제되며, 이하의 과정은 적합한 정제 과정의 예이다: 면역 친화성 또는 이온-교환 컬럼 상의 분획법; 에탄올 침전; 역상 HPLC; 실리카 또는 양이온-교환 수지, 예컨대 DEAE 상의 크로마토그래피; 크로마토포커싱(chromatofocusing); SDS-PAGE; 황산 암모늄 침전; 예를 들어, 세파덱스 G-75를 사용한 겔 여과; 및 오염물, 예컨대 IgG을 제거하기 위한 단백질 A 세파로스 컬럼. 프로테아제 억제제, 예컨대 페닐 메틸 설포닐 플루오라이드(PMSF)도 또한 정제 동안 단백질 용해성 분해를 억제하는데 유용할 수 있다. 추가로, 관심 대상 단백질은 그 관심 대상 단백질의 정제를 가능하게 하는 마커 서열에 대해 프레임에 맞게 융합될 수 있다. 마커 서열의 비-제한적인 예는, 벡터, 바람직하게는 pQE-9 벡터에 의해 제공될 수 있는 헥사히스티딘 태그, 및 헤마글루티닌(hemagglutinin)(HA) 태그를 포함한다. HA 태그는 인플루엔자 헤마글루티닌 단백질로부터 유래된 에피토프에 상응한다(예를 들어, 문헌[Wilson 등, Cell, 37:767 [1984]] 참고). 당업계의 숙련자는, 관심 대상의 폴리펩티드에 적합한 정제 방법이 재조합 세포 배양체 내의 발현 시 폴리펩티드의 특성 변화를 설명하도록 변화될 필요가 있다는 것을 인지할 것이다.
실험
본 발명은 레트로바이러스의 형질 도입(본원에서 GPEx® 기술이라고 지칭됨)과 글루타민 합성효소(GS) 녹-아웃 CHO 세포주 시스템을 조합한 독특한 방식을 제공하며, 이는 관심 대상 단백질의 높은 역가와 특이적인 생산성을 생성하는 세포의 능력을 예측하지 못하게 개선시킨다. 이 연구에서 사용된 GS 녹-아웃 세포주는, MilliporeSigma로부터 이용가능한 CHOZN 세포주였다. GPEx® 기술은 정상적인 CHO 세포에서 이전에 실시했던 것과 유사한 방식으로 실행되었다. 그러나, 바이러스 발현 벡터에서, GS 녹-아웃 세포주에서 선별을 위해 사용된 GS 유전자는, 본 발명자들이 Catalent에서 사용한 GPEx 발현 벡터의 버전들 중 하나에 존재하는 SIN(자가-불활성화) LTR 유래의 매우 약한 프로모터를 구동시킨다(driven off). 그 벡터, 통상의 GPEx 세포주 생산 공정 및 GS 녹-아웃 CHO 세포주의 조합은, 비변형된 CHO 세포주에서의 전통적인 GPEx 공정보다 최대 7-배 더 큰 생산 수준을 제공한다.
실험 1:
2개의 혼주된 세포주는, 2개의 상이한 바이러스 벡터들로부터 생산되었다. 두 세포주들은 정상적인 GPEx 형질 도입 공정과 GS 녹-아웃 세포주 CHOZN를 사용하여 생산되었다. 두 발현 벡터들은 시험 단백질 "Anyway"를 발현시키도록 고안되었다. Anyway는 Fc 융합 단백질이다. 2개의 발현 벡터들 간의 유일한 차이는, 하나의 벡터는 그 세포주로 삽입된 이후 GS 유전자의 발현을 유도하는 전체 길이의 몰로니 쥣과 백혈병 바이러스(MMLV) LTR을 가질 것이고, 다른 벡터는 GS의 발현을 유도하는 MMLV SIN LTR을 가질 것이라는 점이다. 레트로벡터 입자를 생산하는데 사용된 유전자 작제물은, 도 1 및 2에 제공되어 있다. 유전자 작제물에 대한 서열은, 도 3 및 4에 제공되어 있다.
CHOZN 세포주 개발
레트로벡터 제작: 상기 개략된 발현 작제물(construct)을, MLV gag, pro 및 pol 단백질을 항시적으로 발현하는 HEK 293 세포주에 도입하였다. 발현 플라스미드를 함유하는 외피도, 또한 각각의 유전자 작제물과 함께 공동-형질감염되었다. 공동-형질감염은, 초원심분리에 의해 농축되어, 세포 형질 도입에 사용된 복제 불가능한(replication incompetent) 고 역가 레트로벡터를 생산하였다(1,2). 상기 작제물을 사용하여 생산된 레트로벡터를 사용한 CHO 세포로의 형질 도입으로, 3' LTR 서열이 서열의 5' 말단에서 중복되어, hCMV-MoMuSV 5'LTR을 대체하고, 추후 혼주된 세포주에서 GS 유전자의 발현을 조절한다.
레트로벡터에 의한 CHOZN 세포의 형질 도입: 각각의 상기 작제물로부터의 레트로벡터 삽입체를 함유하는 혼주된 세포주는, CHOZN 중국 햄스터 난소 모 세포주를, Anyway 단백질을 발현시키도록 개발된 유전자 작제물로부터 만들어진 레트로벡터에 의해 형질 도입시킴으로써 만들어졌다. 2개의 작제물 각각을 위한 혼주된 세포주를 생성하기 위해, 단일 사이클의 형질 도입이 실시되었다. 세포 형질 도입의 완료 시, 세포주를 글루타민 불포함 배지 내에 두고, GS 선별을 실시하였다.
2개의 혼주된 집단의 세포로부터의 유가 배양 생산 Anyway: 형질 도입 후, 혼주된 세포주는 유가 배양 연구의 생산성을 위해 2개의 250mL 진탕 플라스크로 스케일-업되었다. 각각의 진탕 플라스크 내의 50mL 작용 부피의 ExCell Advanced 유가 배양 배지(SAFC)에 mL당 300,000개의 생존가능한 세포를 분주하고, 이를 5% CO2 및 37℃의 온도의 습윤(70-80%) 진탕 배양기에서 110 rpm로 배양하였다. 하나의 공급 보충물을 사용하는 생산 동안, 3일차에 시작하여 이틀에 한번 씩 배양액을 공급하였다. 포도당을 매일 모니터링하고, 그 수준이 4 g/L 미만으로 떨어진 경우 보충하였다. 배양은 생존능이 ≤ 50%일 때 종결하였다.
결과
결과는 표 1 및 도 5에 나타나 있다. 이들 결과는 놀라운 것이다. 2개의 풀에 대해 유사한 평균 유전자 카피수에서, 2개의 혼주된 세포주들 간에 주요한 역가 차이가 있었다. 따라서, 심지어 약간 더 높은 평균 유전자 카피수에서도, 야생형 또는 전체 길이의 LTR 유전자 작제물은 유의하게 더 낮은 역가를 제공하는데, 이것은 유전자 삽입체당 유의하게 더 낮은 세포 특이적인 생산성으로 해석된다. 유전자 작제물의 SIN 버전을 함유하는 세포를 많이 발현하기 위한 선별 또는 경쟁적인 장점이 발생하였다.
표 1. 두 개의 유전자 작제물들 간의 혼주된 세포주 비교.
실험 2: 이전 실험에 기초하여, 본 발명자들은 GPEx 기술을 전통적으로 실행하고 있는 방식과, 상기 기재된 SIN-GS 벡터를 CHOZN GS 녹-아웃 세포주와 조합하여 사용하는 것을 제외하고는 정확하게 동일한 방식으로 상기 기술을 실행하는 방식을 비교하기 위한 실험을 디자인하였다. 공정은 단지 2개의 주요 차이점만을 갖고 가능한 한 유사하게 유지되었다. 첫 번째 차이는 전통적인 GPEx가 GPEx® 중국 햄스터 난소(GCHO) 모 세포주를 사용하고, 새로운 버전은 CHOZN 세포주를 사용한다는 점이다. 두 번째 차이는 레트로벡터를 만드는데 사용된 유전자 작제물들이 상이하다는 점이다. 전통적인 GPEx에서, 작제물은 GS 유전자를 함유하지 않는데, 새로운 버전에 대하여 이는 GS 유전자를 함유한다. 유전자 작제물의 모든 다른 구성요소들은 유사하였다. 작제물 각각은 다시 Anyway 단백질을 발현한다. 혼주된 세포주가 각각의 방법에 대해 종결된 후, 이들은 유가-배치-배양 분석에서의 생산과 비교되었다.
GCHO 및 CHOZN 세포주 개발:
레트로벡터 제작: 발현 작제물을, MLV gag, pro 및 pol 단백질을 항시적으로 생산하는 HEK 293 세포주에 도입하였다. 발현 플라스미드를 함유하는 외피도, 또한 각각의 유전자 작제물과 함께 공동-형질감염되었다. 공동-형질감염은 초원심분리에 의해 농축되어, 세포 형질 도입에 사용된 복제 불가능한 고 역가 레트로벡터를 생성하였다(1,2).
레트로벡터에 의한 CHOZN 세포의 형질 도입: 각각의 작제물로부터의 레트로벡터 삽입체를 함유하는 혼주된 세포주는, CHOZN 중국 햄스터 난소 모 세포주 또는 GCHO 중국 햄스터 난소 모 세포주를, GS를 함유하는 유전자 작제물 또는 GS가 없는 유전자 작제물로부터 만들어진 레트로벡터에 의해 형질 도입시킴으로써 만들어졌고, 상기 작제물은 둘 다 Anyway 단백질을 발현하도록 개발되었다. 3 사이클의 형질 도입을 실시하여, 상응하는 세포주 내의 2개의 작제물 각각을 위한 혼주된 세포주를 생성하였다. 추가적인 사이클은 전형적으로 세포주 내의 삽입체의 수, 및 추후 유전자 카피수를 증가시켰다. 각 사이클의 형질 도입 완료 시, CHOZN 기반의 세포 풀을, GS 선택을 위해 글루타민 불포함 배지 내에 두었다. 전통적인 GPEx 세포는 정상적인 과정과 마찬가지로 선별을 실시하지 않았다.
결과
기대한 바와 같이, 반복된 사이클의 형질 도입에 의한 두 방법에서 대해, 카피수가 증가하였다. 그러나, 유의하게 더 높은 유전자 카피수는, 표 2에 나타난 전통적인 GPEx에 비해 새로운 각각의 GPEx 세포 풀에서 관찰되었다.
표 2. 2개의 상이한 공정들 간에 비교된 혼주된 세포주 유전자 카피수.
2개의 혼주된 집단의 세포로부터의 유가 배양 생산 Anyway(3 사이클의 형질 도입): 형질 도입 후, 혼주된 세포주는 유가 배양의 생산성을 위해 2개의 250 mL 진탕 플라스크로 스케일-업되었다. 각각의 진탕 플라스크 내의 50 mL의 작용 부피의 ActiPro 배지(HyClone)에 mL당 300,000개의 생존가능한 세포를 분주하고, 이를 5% CO2 및 37℃의 온도의 습윤(70-80%) 진탕 배양기에서 120 rpm으로 배양하였다(6일 차에 시작하여 34℃). 2개의 상이한 공급 보충물을 사용하는 생산 가동 동안, 배양액은 6회 공급되었다. 포도당을 매일 모니터링하고, 그 수준이 4 g/L 미만으로 떨어지면 보충하였다. 생존능이 ≤ 50%일 때, 배양을 종결하였다.
결과는 표 3 및 도 6에 제공되었다. 다시, 매우 예측하지 못한 결과가 관찰되었다. 최적화된 전통적인 GPEx 클론 세포주는 발현된 Anyway 생성물을 최대 1.8 g/L로 생산하였고, 새로운 GPEx 풀은 임의의 클론 선택 전의 그 발현의 2배가 넘었다. 새로운 GPEx 풀은 실험 #1에서 나타난 바와 마찬가지로, 유전자 삽입체당 더 높은 카피수 뿐만 아니라 더 많은 생산을 갖는다. 이들 둘은 함께 세포 특이적인 생산성의 유의한 차이를 생성하며, 새로운 GPEx 풀에 대해서는 3-배 더 높은 pg/세포/일에 근접한다. 전체적인 생존가능 세포의 밀도도 또한 전통적인 풀에 비해 새로운 GPEx 풀에 대해 더 높아서, 또한 실질적인 역가 차이가 관찰되는 것을 돕는다.
표 3. Anyway에 대한 2개의 상이한 공정들 간의 혼주된 세포주 비교
실험 3 및 4:
상기 데이터는 단일 유전자로부터 생산된 Fc-융합체에 관한 것이다. 실험 3 및 4는 GPEx® 기술과 GS 발현을 유도하는 SIN LTR을 사용하는 새로운 공정 둘 다를 사용하여, 2개의 상이한 항체 "Peelaway" 및 "Yourway"를 갖는 별개의 중쇄 및 경쇄 벡터에 의한 형질 도입을 사용한다(둘 다에 대해 2회의 경쇄 형질 도입과 3회의 중쇄 형질 도입).
레트로벡터 제작: 발현 작제물을, MLV gag, pro 및 pol 단백질을 항시적으로 발현시키는 HEK 293 세포주에 도입하였다. 발현 플라스미드를 함유하는 외피도, 또한 각각의 유전자 작제물과 함께 공동-형질감염되었다. 공동-형질감염은, 초원심분리에 의해 농축되어, 세포 형질 도입에 사용된 복제 불가능한 고 역가 레트로벡터를 생산하였다(1,2).
레트로벡터를 갖는 CHOZN 세포의 형질 도입: 각각의 작제물로부터의 레트로벡터 삽입체를 함유하는 혼주된 세포주는, CHOZN 중국 햄스터 난소 모 세포주 또는 GCHO 중국 햄스터 난소 모 세포주 중 하나를, 2개의 상이한 항체를 발현시키도록 개발된, GS를 함유하는 중쇄 및 경쇄 유전자 작제물 또는 GS가 없는 유전자 작제물 중 어느 하나로부터 만들어진 레트로벡터에 의해 형질 도입시킴으로써 만들어졌다. 2회 사이클의 경쇄 형질 도입과 3회 사이클의 중쇄 형질 도입을 실시하여, 상응하는 항원 세포주 각각 내의 4개의 작제물 각각에 대한 혼주된 세포주를 생성하였다. 추가적인 사이클은 전형적으로 세포주 내의 삽입체의 수, 및 이후 유전자 카피수를 증가시킨다. 각 사이클의 형질 도입의 완료 시, GS 선별을 위해 CHOZN 기반의 세포 풀을 글루타민 불포함 배지 내에 두었다. 전통적인 GPEx 세포는 정상적인 과정과 마찬가지로 선별 과정을 실시하지 않았다.
혼주된 집단 세포주로부터의 유가 배양 생산 Peelaway 및 Yourway (2회 경쇄 사이클의 형질 도입 및 3회의 중쇄 사이클의 형질 도입): 형질 도입-후 혼주된 세포주를, 유가 배양 연구에서의 생산성을 위해 2개의 250mL 진탕 플라스크 내로 스케일-업시켰다. 각각의 진탕 플라스크 내의 50mL의 작용 부피의 ActiPro 배지(HyClone)에 mL당 300,000개의 생존가능한 세포를 분주하고, 이를 5% CO2 및 37℃의 온도의 습윤(70-80%) 진탕 배양기에서 120 rpm으로 배양하였다(34℃, 6일 차에 시작). 2개의 상이한 공급 보충물을 사용하여 생산을 가동하는 동안, 배양액을 6회 공급하였다. 포도당을 매일 모니터링하고, 그 수준이 4 g/L 미만으로 떨어질 때 보충하였다. 배양은 생존능이 ≤ 50%일 때 종결되었다.
결과
결과는 표 4 및 5에 제시되었다. 유의한 장점들은, 새로운 벡터 및 공정에 의한 역가에 대해 관찰되었다.
표 4. 2개의 상이한 공정들 사이의 Peelaway 항원에 대한 혼주된 세포주 비교
표 5. 2개의 상이한 공정들 간의 Yourway 항원에 대한 혼주된 세포주 비교
추가적인 카피수 분석은, 4개의 Yourway 세포 풀에 대해 실시되었다. 1회의 경쇄 형질 도입 및 2회의 중쇄 형질 도입 사이클 이후에 생성된 세포 풀을, 2회의 경쇄 형질 도입 사이클 및 3회의 중쇄 형질 도입 사이클 이후 생성된 세포 풀과 비교하였다. 이러한 2개의 혼주된 세포주들 각각은, 글루타민 함유 배지에서 연속 성장하도록 세팅되거나, 또는 글루타민이 결핍된 배지 내에 두었다. 유전자의 총 수, 중쇄 유전자의 수 및 경쇄 유전자의 수에 대한 유전자 카피수는, 4개의 혼주된 세포주 각각에 대해 계산되었다.
표 6.
이러한 데이터는, 비록 이들 풀 내의 각각의 세포가 다수의 카피의 GS 유전자를 가져서 SIN LTR을 더 많은 카피수로 구동시키기는 하지만, 상기 테이터에 기초하면, 더 많은 카피수를 갖는 것들, 및 더 높은 수준으로 발현되는 이러한 카피수에 대해 유의한 선택이 발생했다는 것을 나타낸다.
실험 5
이 실험에 대해, Yourway 항원 생성물이 사용되었다. 세포주를 생성하는데 사용된 중쇄 유전자 작제물은, 실험 4와 동일하게 사용되었다. 경쇄 유전자 작제물은 이것이 경쇄 암호화 서열을 함유하고, 이것이 GS 유전자가 결핍된 점을 제외하고는 모든 측면에서 중쇄 유전자 작제물과 동일하였다. 단일 형질 도입은 각각 경쇄를 함유하는 레트로벡터(-GS) 및 중쇄를 함유하는 레트로벡터(+GS)에 대해 실시되어, 혼주된 세포주를 생성하였다.
레트로벡터 제작: 발현 작제물을, MLV gag, pro 및 pol 단백질을 항시적으로 생산하는 HEK 293 세포주에 도입하였다. 발현 플라스미드를 함유하는 외피도, 또한 각각의 유전자 작제물과 함께 공동-형질감염되었다. 공동-형질감염은 초원심분리에 의해 농축되어, 세포 형질 도입에 사용된 복제 불가능한 고 역가 레트로벡터를 생산하였다(1,2).
레트로벡터에 의한 CHOZN 세포의 형질 도입: 각각의 작제물로부터의 레트로벡터 삽입체를 함유하는 혼주된 세포주는, CHOZN 중국 햄스터 난소 모 세포주를, GS가 없는 경쇄 유전자 작제물 및 GS를 함유하는 중쇄 작제물로부터 만들어진 레트로벡터에 의해 형질 도입시킴으로써 만들어졌다. 한 사이클의 경쇄 형질 도입과 한 사이클의 중쇄 형질 도입이 실시되어, 혼주된 세포주를 생성하였다. 형질 도입의 두 사이클이 모두 완료된 때, CHOZN 기반의 세포 풀을 나누어, 반은 글루타민 불포함 배지 내에 두고, 다른 반은 세포 확대 및 추후의 생산성 평가 동안 글루타민을 계속하여 보충해주었다.
혼주된 집단 세포주로부터의 Yourway의 유가 배양 생산(1회의 경쇄 형질 도입 및 1회의 중쇄 형질 도입): 혼주된 세포주를 유가 배양 연구에서의 생산성을 위해 250mL의 진탕 플라스크로 스케일-업하였다. 진탕 플라스크 내의 50mL의 작용 부피의 ActiPro 배지(HyClone)에 mL당 300,000개의 생존가능한 세포를 분주하고, 이를 5% CO2 및 37℃의 온도의 습윤(70-80%) 진탕 배양기에서 120 rpm로 배양하였다(6일 차에 시작하여 34℃). 2개의 상이한 공급 보충물을 사용하여 생산이 가동되는 동안, 배양액을 6회 공급하였다. 포도당을 매일 모니터링하고, 그 수준이 4 g/L미만으로 떨어지는 경우 보충하였다. 글루타민 보충 배양액을 글루타민에 대해 매일 모니터링하고, 그 수준이 2 mM 미만으로 떨어지는 경우 공급하였다. 배양은 생존능이 ≤ 50%일 때 종결하였다.
결과
결과는 표 7에 제시되었다. 글루타민을 제거함에 의한 선별은, 세포 풀의 중쇄 유전자 카피수를 유의하게 증가시켰다. 다소 놀랍게도, 경쇄 카피수도 또한 증가하였으나, 중쇄와 동일한 정도는 아니었다. 총 항원 생산은 또한 표 5에 나타난 것들에 도달하는 수준을 갖는 비선별된 배양체보다 유의하게 더 높았고, 그 실험에 대해 완료된 5회의 형질도입 대신에 단 2회의 형질도입만이 실시되었다.
표 7. 글루타민 선택이 있거나 없는 Yourway 항원에 대한 혼주된 세포주 비교. 혼주된 세포주는 단일 경쇄 형질 도입(-GS) 및 단일 중쇄 형질 도입(+GS)으로부터 생산되었다.
실험 6
유전자 작제물은 그 기술이 레트로벡터 형질 도입에 비해 전통적인 세포 형질감염 방법을 사용하여 유사하게 거동하는지를 시험하도록 디자인되고, 제작되었다. 생성된 전통적인 플라스미드 형질감염 작제물의 한 예는, 도 8(플라스미드 지도) 및 도 9(실제 플라스미드 서열; 서열번호 4)에 나타나 있다.
1. Bleck, G.T. 2005 An alternative method for the rapid generation of stable, high-expressing mammalian cell lines (A Technical Review). Bioprocessing J. Sep/Oct. pp 1-7.
2. Bleck, G.T., 2010. GPEx® A Flexible Method for the Rapid Generation of Stable, High Expressing, Antibody Producing Mammalian Cell Lines Chapter 4 In: Current Trends in Monoclonal Antibody Development and Manufacturing, Biotechnology: Pharmaceutical Aspects, Edited by: S.J. Shire et al. ⓒ 2010 American Association of Pharmaceutical Scientists, DOI 10.1007/978-0-387-76643-0_4.
상기 언급된 모든 간행물과 특허는, 본원에 인용되어 포함된다. 본 발명의 기재된 방법 및 시스템의 다양한 변형 및 변화는, 본 발명의 범주와 사상에서 벗어나지 않고 당업계의 숙련자들에게 명백할 것이다. 본 발명이 특정 바람직한 구현예에 대해 기재되어 있기는 하지만, 청구된 본 발명은 이러한 특정 구현예에 지나치게 제한되지 않아야 한다고 이해해야 할 것이다. 사실, 본 발명의 분야의 숙련자들에게 명백한, 본 발명을 실행하기 위한 기재된 모드의 다양한 변형은, 이하의 청구항의 범주 내에 있는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING
<110> CATALENT PHARMA SOLUTIONS, LLC
<120> VECTORS FOR PROTEIN MANUFACTURE
<130> GALA-37375.601
<150> US 62/775,194
<151> 2018-12-04
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 6217
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 1
gtccggccat tagccatatt attcattggt tatatagcat aaatcaatat tggctattgg 60
ccattgcata cgttgtatcc atatcataat atgtacattt atattggctc atgtccaaca 120
ttaccgccat gttgacattg attattgact agttattaat agtaatcaat tacggggtca 180
ttagttcata gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct 240
ggctgaccgc ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta 300
acgccaatag ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta aactgcccac 360
ttggcagtac atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt 420
aaatggcccg cctggcatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc tacttggcag 480
tacatctacg tattagtcat cgctattacc atggtgatgc ggttttggca gtacatcaat 540
gggcgtggat agcggtttga ctcacgggga tttccaagtc tccaccccat tgacgtcaat 600
gggagtttgt tttggcacca aaatcaacgg gactttccaa aatgtcgtaa caactccgcc 660
ccattgacgc aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg tctatataag cagagctcaa 720
taaaagagcc cacaacccct cactcggcgc gccagtcttc cgatagactg cgtcgcccgg 780
gtacccgtat tcccaataaa gcctcttgct gtttgcatcc gaatcgtggt ctcgctgttc 840
cttgggaggg tctcctctga gtgattgact acccacgacg ggggtctttc atttgggggc 900
tcgtccggga tttggagacc cctgcccagg gaccaccgac ccaccaccgg gaggtaagct 960
ggccagcaac ttatctgtgt ctgtccgatt gtctagtgtc tatgtttgat gttatgcgcc 1020
tgcgtctgta ctagttagct aactagctct gtatctggcg gacccgtggt ggaactgacg 1080
agttctgaac acccggccgc aaccctggga gacgtcccag ggactttggg ggccgttttt 1140
gtggcccgac ctgaggaagg gagtcgatgt ggaatccgac cccgtcagga tatgtggttc 1200
tggtaggaga cgagaaccta aaacagttcc cgcctccgtc tgaatttttg ctttcggttt 1260
ggaaccgaag ccgcgcgtct tgtctgctgc agcgctgcag catcgttctg tgttgtctct 1320
gtctgactgt gtttctgtat ttgtctgaaa attagggcca gactgttacc actcccttaa 1380
gtttgacctt aggtcactgg aaagatgtcg agcggatcgc tcacaaccag tcggtagatg 1440
tcaagaagag acgttgggtt accttctgct ctgcagaatg gccaaccttt aacgtcggat 1500
ggccgcgaga cggcaccttt aaccgagacc tcatcaccca ggttaagatc aaggtctttt 1560
cacctggccc gcatggacac ccagaccagg tcccctacat cgtgacctgg gaagccttgg 1620
cttttgaccc ccctccctgg gtcaagccct ttgtacaccc taagcctccg cctcctcttc 1680
ctccatccgc cccgtctctc ccccttgaac ctcctcgttc gaccccgcct cgatcctccc 1740
tttatccagc cctcactcct tctctaggcg ccggaattgc cttccaccat ggccacctca 1800
gcaagttccc acttgaacaa aaacatcaag caaatgtact tgtgcctgcc ccagggtgag 1860
aaagtccaag ccatgtatat ctgggttgat ggtactggag aaggactgcg ctgcaaaacc 1920
cgcaccctgg actgtgagcc caagtgtgta gaagagttac ctgagtggaa ttttgatggc 1980
tctagtacct ttcagtctga gggctccaac agtgacatgt atctcagccc tgttgccatg 2040
tttcgggacc ccttccgcag agatcccaac aagctggtgt tctgtgaagt tttcaagtac 2100
aaccggaagc ctgcagagac caatttaagg cactcgtgta aacggataat ggacatggtg 2160
agcaaccagc acccctggtt tggaatggaa caggagtata ctctgatggg aacagatggg 2220
cacccttttg gttggccttc caatggcttt cctgggcccc aaggtccgta ttactgtggt 2280
gtgggcgcag acaaagccta tggcagggat atcgtggagg ctcactaccg cgcctgcttg 2340
tatgctgggg tcaagattac aggaacaaat gctgaggtca tgcctgccca gtgggagttc 2400
caaataggac cctgtgaagg aatccgcatg ggagatcatc tctgggtggc ccgtttcatc 2460
ttgcatcgag tatgtgaaga ctttggggta atagcaacct ttgaccccaa gcccattcct 2520
gggaactgga atggtgcagg ctgccatacc aactttagca ccaaggccat gcgggaggag 2580
aatggtctga agcacatcga ggaggccatc gagaaactaa gcaagcggca ccggtaccac 2640
attcgagcct acgatcccaa ggggggcctg gacaatgccc gtcgtctgac tgggttccac 2700
gaaacgtcca acatcaacga cttttctgct ggtgtcgcca atcgcagtgc cagcatccgc 2760
attccccgga ctgtcggcca ggagaagaaa ggttactttg aagaccgccg cccctctgcc 2820
aactgtgacc cctttgcagt gacagaagcc atcgtccgca catgccttct caatgagact 2880
ggcgacgagc ccttccaata caaaaactaa agatccctat ggctattggc caggttcaat 2940
actatgtatt ggccctatgc catatagtat tccatatatg ggttttccta ttgacgtaga 3000
tagcccctcc caatgggcgg tcccatatac catatatggg gcttcctaat accgcccata 3060
gccactcccc cattgacgtc aatggtctct atatatggtc tttcctattg acgtcatatg 3120
ggcggtccta ttgacgtata tggcgcctcc cccattgacg tcaattacgg taaatggccc 3180
gcctggctca atgcccattg acgtcaatag gaccacccac cattgacgtc aatgggatgg 3240
ctcattgccc attcatatcc gttctcacgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc 3300
ccacttggca gtacatcaat atctattaat agtaacttgg caagtacatt actattggaa 3360
gtacgccagg gtacattggc agtactccca ttgacgtcaa tggcggtaaa tggcccgcga 3420
tggctgccaa gtacatcccc attgacgtca atggggaggg gcaatgacgc aaatgggcgt 3480
tccattgacg taaatgggcg gtaggcgtgc ctaatgggag gtctatataa gcaatgctcg 3540
tttagggaac cgccattctg cctggggacg tcggaggagc tcgaaagctt ctagacaatt 3600
gccgccacca tgatgtcctt tgtctctctg ctcctggttg gcatcctatt ccatgccacc 3660
caggccagtg atacaggtag acctttcgta gagatgtaca gtgaaatccc cgaaattata 3720
cacatgactg aaggaaggga gctcgtcatt ccctgccggg ttacgtcacc taacatcact 3780
gttactttaa aaaagtttcc acttgacact ttgatccctg atggaaaacg cataatctgg 3840
gacagtagaa agggcttcat catatcaaat gcaacgtaca aagaaatagg gcttctgacc 3900
tgtgaagcaa cagtcaatgg gcatttgtat aagacaaact atctcacaca tcgacaaacc 3960
aatacaatca tagatgtcgt tctgagtccg tctcatggaa ttgaactatc tgttggagaa 4020
aagcttgtct taaattgtac agcaagaact gaactaaatg tggggattga cttcaactgg 4080
gaataccctt cttcgaagca tcagcataag aaacttgtaa accgagacct aaaaacccag 4140
tctgggagtg agatgaagaa gtttttgagc accttaacta tagatggtgt aacccggagt 4200
gaccaaggat tgtacacctg tgcagcatcc agtgggctga tgaccaagaa aaacagcaca 4260
tttgtcaggg tccatgaaaa agacaaaact cacacatgcc caccgtgccc agcacctgaa 4320
ctcctggggg gaccctcagt cttcctcttc cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc 4380
tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc 4440
aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag gtgcataatg ccaagacaaa gccacgggag 4500
gagcagtaca acagcacata tcgtgtggtc agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg 4560
ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag 4620
aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca 4680
tcccgggatg agctgaccaa gaaccaggtc agcctgacct gcctggtcaa aggcttctat 4740
cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc 4800
acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc ttcttcctct acagcaagct caccgtggac 4860
aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac 4920
aaccactaca cgcagaagag cctctccctg tctcccggga aatgatgaga tctcgagttc 4980
gacatcgata atcaacctct ggattacaaa atttgtgaaa gattgactgg tattcttaac 5040
tatgttgctc cttttacgct atgtggatac gctgctttaa tgcctttgta tcatgctatt 5100
gcttcccgta tggctttcat tttctcctcc ttgtataaat cctggttgct gtctctttat 5160
gaggagttgt ggcccgttgt caggcaacgt ggcgtggtgt gcactgtgtt tgctgacgca 5220
acccccactg gttggggcat tgccaccacc tgtcagctcc tttccgggac tttcgctttc 5280
cccctcccta ttgccacggc ggaactcatc gccgcctgcc ttgcccgctg ctggacaggg 5340
gctcggctgt tgggcactga caattccgtg gtgttgtcgg ggaaatcatc gtcctttcct 5400
tggctgctcg cctgtgttgc cacctggatt ctgcgcggga cgtccttctg ctacgtccct 5460
tcggccctca atccagcgga ccttccttcc cgcggcctgc tgccggctct gcggcctctt 5520
ccgcgtcttc gccttcgccc tcagacgagt cggatctccc tttgggccgc ctccccgcat 5580
cgataaaata aaagatttta tttagtctcc agaaaaaggg gggaatgaaa gaccccacct 5640
gtaggtttgg caagctagct taagtaacgc cattttgcaa ggcatggaaa aatacataac 5700
tgagaataga gaagttcaga tcaaggtcag gaacagatgg aacagctgaa tatgggccaa 5760
acaggatatc tgtggtaagc agttcctgcc ccggctcagg gccaagaaca gatggaacag 5820
ctgaatatgg gccaaacagg atatctgtgg taagcagttc ctgccccggc tcagggccaa 5880
gaacagatgg tccccagatg cggtccagcc ctcagcagtt tctagagaac catcagatgt 5940
ttccagggtg ccccaaggac ctgaaatgac cctgtgcctt atttgaacta accaatcagt 6000
tcgcttctcg cttctgttcg cgcgcttctg ctccccgagc tcaataaaag agcccacaac 6060
ccctcactcg gggcgccagt cctccgattg actgagtcgc ccgggtaccc gtgtatccaa 6120
taaaccctct tgcagttgca tccgacttgt ggtctcgctg ttccttggga gggtctcctc 6180
tgagtgattg actacccgtc agcgggggtc tttcatt 6217
<210> 2
<211> 6065
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 2
gtccggccat tagccatatt attcattggt tatatagcat aaatcaatat tggctattgg 60
ccattgcata cgttgtatcc atatcataat atgtacattt atattggctc atgtccaaca 120
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<212> DNA
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ttcccaacga tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg tgcaaaaaag cggttagctc 7440
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ggcagcactg cataattctc ttactgtcat gccatccgta agatgctttt ctgtgactgg 7560
tgagtactca accaagtcat tctgagaata gtgtatgcgg cgaccgagtt gctcttgccc 7620
ggcgtcaata cgggataata ccgcgccaca tagcagaact ttaaaagtgc tcatcattgg 7680
aaaacgttct tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg ctgttgagat ccagttcgat 7740
gtaacccact cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt actttcacca gcgtttctgg 7800
gtgagcaaaa acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga cacggaaatg 7860
ttgaatactc atactcttcc tttttcaata ttattgaagc atttatcagg gttattgtct 7920
catgagcgga tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg ttccgcgcac 7980
atttccccga aaagtgccac ctgacgtcta agaaaccatt attatcatga cattaaccta 8040
taaaaatagg cgtatcacga ggccctttcg tc 8072
Claims (52)
- 관심 대상 단백질의 발현을 위한 벡터로서, 제1 프로모터 서열의 비-변형된 버전 또는 야생-형 버전에 비해 프로모터 활성이 감소되도록 변형된 제1 프로모터 서열에 작용가능하게 연결된 선별 마커를 암호화하는 핵산 서열, 및 제2 프로모터 서열에 작용가능하게 연결된 관심 대상 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는, 벡터.
- 제1항에 있어서, 상기 제1 프로모터 서열의 비-변형된 버전 또는 야생-형 버전에 비해 프로모터 활성이 감소되도록 변형된 상기 제1 프로모터 서열은, 바이러스 자가-불활성화(SIN) 긴 말단 반복부(LTR) 프로모터 서열인, 벡터.
- 제2항에 있어서, 상기 SIN LTR 프로모터 서열은 서열번호 3과 적어도 95% 동일한, 벡터.
- 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 SIN LTR 프로모터 서열은 서열번호 3인, 벡터.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 선별 마커는 글루타민 합성 효소(GS)인, 벡터.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 선별 마커는 디히드로폴레이트 환원효소(DHFR)인, 벡터.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터는 상기 선별 마커와 상기 관심 대상 단백질을 암호화하는 핵산에 작용가능하게 연결된 단일 폴리 A 신호 서열을 포함하는, 벡터.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터는 상기 선별 마커에 작용가능하게 연결된 제1 폴리 A 신호 서열과, 상기 관심 대상 단백질을 암호화하핵산에 작용가능하게 연결된 제2 폴리 A 신호 서열을 포함하는, 벡터.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 관심 대상 단백질은 Fc-융합 단백질, 효소, 알부민 융합체, 성장 인자, 단백질 수용체, 단쇄 항원(scFv), 단쇄-Fc(scFv-Fc), 디아바디, 및 미니바디(scFv-CH3), Fab, 단쇄 Fab(scFab), 이뮤노글로빈 중쇄, 및 이뮤노글로빈 경쇄로 이루어진 군으로부터 선택되는, 벡터.
- 제9항에 있어서, 상기 관심 대상 단백질은 Fc-융합 단백질인, 벡터.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터는 바이러스 벡터인, 벡터.
- 제11항에 있어서, 상기 벡터는 레트로바이러스 벡터인, 벡터.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터는 플라스미드인, 벡터.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
- 제14항에 있어서, 상기 숙주 세포주는 GS 녹아웃 세포주인, 숙주 세포.
- 제15항에 있어서, 상기 숙주 세포주는 DHFR 녹아웃 세포주인, 숙주 세포.
- 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 숙주 세포주는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포주, HEK 293 세포주 및 CAP 세포주로 이루어진 군으로부터 선택된, 숙주 세포.
- 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 숙주 세포는 약 1 내지 1000 카피의 벡터를 포함하는, 숙주 세포.
- 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 숙주 세포는 약 10 내지 200 카피의 벡터를 포함하는, 숙주 세포.
- 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 숙주 세포는 약 10 내지 100 카피의 벡터를 포함하는, 숙주 세포.
- 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 숙주 세포는 약 20 내지 100 카피의 벡터를 포함하는, 숙주 세포.
- 제14항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 숙주 세포는 제2 관심 대상 단백질을 암호화하고, 이의 발현을 허용하는 적어도 하나의 제2 벡터를 추가로 포함하되, 상기 제2 벡터는 선별 마커를 포함하지 않는, 숙주 세포.
- 제14항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 숙주 세포는 제2 관심 대상 단백질을 암호화하고 이의 발현을 허용하는 적어도 하나의 제2 벡터를 추가로 포함하되, 상기 제2 벡터는 상기 제1 벡터 내의 선별 마커와는 다른 선별 마커를 포함하는, 숙주 세포.
- 제22항 또는 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 벡터 내의 상기 제1 관심 대상 단백질은 이뮤노글로빈 중쇄 또는 경쇄 중 하나이고, 상기 제2 벡터 내의 상기 제2 단백질은 이뮤노글로빈 중쇄 또는 경쇄 중 다른 하나인, 숙주 세포.
- 제24항에 있어서, 상기 제1 관심 대상 단백질은 이뮤노글로빈 중쇄이고, 상기 제2 관심 대상 단백질은 이뮤노글로빈 경쇄인, 숙주 세포.
- 제22항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 숙주 세포는 약 1 내지 1000 카피의 제2 벡터를 포함하는, 숙주 세포.
- 제22항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 숙주 세포는 약 10 내지 200 카피의 제2 벡터를 포함하는, 숙주 세포.
- 제22항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 숙주 세포는 약 10 내지 100 카피의 제2 벡터를 포함하는, 숙주 세포.
- 제22항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 숙주 세포는 약 20 내지 100 카피의 제2 벡터를 포함하는, 숙주 세포.
- 제13항 내지 제29항 중 어느 한 항에 의한 숙주 세포를 포함하는, 숙주 세포 배양체.
- 제30항에 있어서, 상기 배양체는 1 내지 150 피코그램/세포/일의 관심 대상 단백질을 생산하는, 숙주 세포 배양체.
- 제30항에 있어서, 상기 배양체는 2 내지 50 피코그램/세포/일의 관심 대상 단백질을 생산하는, 숙주 세포 배양체.
- 관심 대상 단백질을 생산하는 공정으로서, 제14항 내지 제32항 중 어느 한 항에 의한 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 상기 숙주 세포 배양체로부터 관심 대상 단백질을 정제하는 단계를 포함하는, 공정.
- 감염성 레트로바이러스 입자로서,
1) 5' LTR;
2) 레트로바이러스 패키징 영역;
3) 선별 마커를 암호화하는 핵산;
4) 내부 프로모터;
5) 상기 내부 프로모터에 작용가능하게 연결된 관심 대상 단백질을 암호화하는 핵산 서열;
6) SIN 3' LTR을 5'에서 3'의 순서로 포함하는, 감염성 레트로바이러스 입자. - 제34항에 있어서, 상기 5'LTR은 MoMuLV LTR인, 감염성 레트로바이러스 입자.
- 제34항에 있어서, 상기 5'LTR은 SIN LTR인, 감염성 레트로바이러스 입자.
- 제34항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 3' LTR은 폴리 A 신호 서열을 포함하는, 감염성 레트로바이러스 입자.
- 제34항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 패키징 영역은 복수의 잠재적인 번역 개시 부위들을 포함하는, 감염성 레트로바이러스 입자.
- 제34항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 선별 마커는 GS인, 감염성 레트로바이러스 입자.
- 제34항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 내부 프로모터는 CMV 프로모터인, 감염성 레트로바이러스 입자.
- 제34항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 입자는 상기 관심 대상 단백질을 암호화하는 상기 핵산의 하류에 단일 폴리 A 신호 서열을 포함하는, 감염성 레트로바이러스 입자.
- 플라스미드로서,
1) 5' LTR;
2) 패키징 영역;
3) 선별 마커;
4) 내부 프로모터;
5) 상기 내부 프로모터에 작용가능하게 연결된 관심 대상 단백질을 암호화하는 핵산 서열; 및
6) 폴리 A 신호 서열을 5'에서 3'의 순서로 포함하는, 플라스미드. - 제42항에 있어서, 상기 5' LTR은 SIN LTR인, 플라스미드.
- 제42항에 있어서, 상기 5'LTR은 MoMuLV LTR인, 플라스미드.
- 제42항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 패키징 영역은 복수의 잠재적인 번역 개시 부위들을 포함하는, 플라스미드.
- 제42항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 선별 마커는 GS인, 플라스미드.
- 제42항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 내부 프로모터는 CMV 프로모터인, 플라스미드.
- 제42항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 입자는 상기 관심 대상 단백질을 암호화하는 상기 핵산의 하류에 단일 폴리 A 신호 서열을 포함하는, 플라스미드.
- 시스템으로서,
a) 상기 제1 프로모터 서열의 비-변형된 버전 또는 야생-형 버전에 비해 프로모터 활성이 감소되도록 변화된 제1 프로모터 서열에 작용가능하게 연결된 선별 마커를 암호화하는 핵산 서열, 및 제2 프로모터 서열에 작용가능하게 연결된 제1 관심 대상 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는, 제1 벡터; 및
b) 프로모터 서열에 작용가능하게 연결된 관심 대상 제2 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 제2 벡터로서, 상기 제2 벡터는 선별 마커를 포함하지 않는, 제2 벡터를 포함하는, 시스템. - 제49항에 있어서, 상기 제1 벡터 내의 상기 제1 관심 대상 단백질은, 이뮤노글로빈 중쇄 또는 경쇄 중 하나이고, 제2 벡터 내의 제2 단백질은 이뮤노글로빈 중쇄 또는 경쇄 중 다른 하나인, 시스템.
- 관심 대상 단백질을 생산하는 공정으로서,
숙주 세포 또는 세포들을, 제34항 내지 제41항 중 어느 한 항의 감염성 레트로바이러스 입자, 제42항 내지 제48항 중 어느 한 항의 플라스미드, 또는 제49항 또는 제50항의 벡터 시스템에 의해 형질 도입 또는 형질 감염시키는 단계;
관심 대상 단백질을 발현시키는 숙주 세포주를 개발하는 단계;
상기 숙주 세포주에 의해 상기 관심 대상 단백질이 생산되는 조건 하에서, 상기 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
상기 관심 대상 단백질을 상기 숙주 세포 배양체로부터 정제하는 단계를 포함하는, 공정. - 관심 대상 단백질의 생산을 위한 숙주 세포 또는 세포들을 형질 도입시키는데 사용하기 위한, 제49항 또는 제50항에 의한 벡터 시스템의, 제34항 내지 제41항 중 어느 한 항의 감염성 레트로바이러스 입자, 제42항 내지 제48항 중 어느 한 항의 플라스미드.
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