CN1711281A - Edg2受体在心力衰竭动物模型中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及可用作为心力衰竭动物模型的瞬时转化的哺乳动物。

Description

EDG2受体在心力衰竭动物模型中的用途

发明领域

本发明涉及可用于作为心力衰竭动物模型的瞬时转化的哺乳动物。

背景技术

G蛋白偶联受体(GPCRs)在多种生理过程中扮演着中心角色。据推测，在人类基因组中，约有1000个基因编码该受体家族。目前约有60％的可经处方获得的药物作为GPCR兴奋剂或拮抗剂起作用。这强调了该受体种类对于药物研究工业的重要性。由于该蛋白质家族的大小及重要性，考虑到许多GPCRs(孤儿GPCRs)的生理配体依然未知，可以想到，未来该受体种类将成为新药物质研究中适宜靶蛋白的最重要的贮藏库之一。

GPCRs是定位于细胞表面的膜内在蛋白家族。它们接受来自细胞外信号物质(例如激素、神经递质、肽、脂类)的信号，并通过鸟嘌呤核苷酸结合蛋白(即“G蛋白”)家族将信号传递进入细胞内部。依赖受体特异性、激活的G蛋白、以及细胞类型，这些受体诱导多种信号传导途径。

所有GPCR多肽链折叠成为七个跨越细胞膜磷脂双层的α-螺旋。这七次跨膜导致细胞外和细胞内环的形成，这些环允许细胞外配体结合以及胞内G蛋白的偶联。因此，GPCRs也表示为七跨膜区受体。

所有G蛋白偶联受体按照共同的基础模式起作用：细胞外配体的结合导致受体蛋白构象改变，从而使受体蛋白能够与G蛋白接触。G蛋白介导的细胞内信号转导级联最终引起该细胞的生物反应。

G蛋白是由α、β、和γ亚基组成的异源三聚体蛋白质。它们通过脂锚(lipid anchors)定位于细胞膜内侧。活化的GPCRs与G蛋白的偶联诱导Gα亚基处GDP/GTP交换以及异源三聚体G蛋白解离为α和βγ亚基。活化的α亚基和βγ复合体都可以与细胞内效应器蛋白质相互作用。

例如，由Gαs型G蛋白活化的膜结合腺苷酸环化酶(AC)引起细胞内cAMP水平的升高，或者，在由Gαi型G蛋白活化的情况下，引起细胞内cAMP水平的降低。Gq型G蛋白活化磷脂酶C(PLC)，该酶催化1，4，5-三磷酸肌醇(IP3)以及二酰甘油(DAG)的形成。这些分子引起Ca²⁺从细胞内贮存细胞器的释放，或者引起蛋白激酶C(PKC)的活化。

人EDG2(Endothelial Difierentiation Gene 2，内皮分化基因2)的多核苷酸序列和氨基酸序列已为公众可获得。该序列可以从例如NCBI(Accession：NM-001401)获得。该蛋白质序列可以从Swiss Prot(Accession：Q 92633)获得。来自人肺cDNA文库的该受体的克隆发表于“An等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.24，231(1997)”中。

全长序列编码359个氨基酸的蛋白质，该蛋白质属于鸟嘌呤核苷酸结合蛋白偶联受体(GPCR)超家族。人EDG2 mRNA广泛分布于人类组织中，在脑中丰度最高。在血清效应元件报告基因试验中，表达人EDG2蛋白质的HEK293细胞表现出对溶血磷脂酸(LPA)反应的增高，该反应是LPA浓度依赖性的并且特异于LPA。

EDG2蛋白质的小鼠等价物也被确定为LPA的受体。

溶血磷脂酸(LPA)和鞘氨醇1-磷酸酯(S1P)是具有多种生物活性的有效的磷脂介质。它们的出现及功能特性提示其在发育、创伤愈合和组织再生当中的可能角色。LPA及S1P的生长刺激和其他复杂的生物活性，部分归结于多种G蛋白介导的细胞内信号通路的激活。在对LPA和S1P的细胞反应中，一些异源三聚体G蛋白以及Ras和Rho依赖的通路扮演着中心角色。

在本发明范围内和使用的所有案例中，毫无例外，哺乳动物不应包括人类(Homosapiens)或者人类个体或人体部分。

发明内容

本发明涉及哺乳动物心肌细胞，该细胞含有用于同时表达G蛋白偶联受体EDG2和GFP(绿色荧光蛋白)的腺病毒载体序列。

该腺病毒载体序列优选由E1/E3缺陷的重组腺病毒组成，该病毒在两个独立启动子的控制之下表达G蛋白偶联受体EDG2和GFP。这类启动子可以是两个CMV启动子。

含有前述腺病毒载体序列的哺乳动物心肌细胞，表达G蛋白偶联受体EDG2和GFP，并因此含有G蛋白偶联受体EDG2蛋白质和GFP蛋白质。

含有腺病毒载体序列的心肌细胞优选兔、小鼠或大鼠细胞。

本发明也涉及含有腺病毒载体序列的心肌细胞的产生，所述腺病毒载体序列用于G蛋白偶联受体EDG2和GFP的同时表达，其中

a]通过现有技术兽医手术技术摘除哺乳动物心脏，

b]使用胶原酶灌注和消化心脏，

c]使用由E1/E3缺陷的重组腺病毒组成的腺病毒载体感染分离的心肌细胞，该重组病毒允许在两个独立启动子的控制下表达G蛋白偶联受体EDG2和GFP。这类启动子优选两个CMV启动子。

另外，本发明涉及其心肌含有用于同时表达G蛋白偶联受体EDG2和GFP的腺病毒载体的哺乳动物。该哺乳动物的腺病毒载体序列优选由E1/E3缺陷的重组腺病毒组成，该病毒允许在两个独立启动子的控制下表达G蛋白偶联受体EDG2和GFP。这样的两个独立启动子优选两个CMV启动子。

本发明还涉及，其心肌含有G蛋白偶联受体EDG2蛋白质和GFP蛋白质的哺乳动物。这类具有含同时表达G蛋白偶联受体EDG2和GFP的腺病毒载体的心肌和/或具有含G蛋白偶联受体EDG2蛋白质和GFP蛋白质的心肌的哺乳动物，优选兔、小鼠或大鼠。另外，本发明涉及哺乳动物的产生，所述哺乳动物具有含同时表达G蛋白偶联受体EDG2和GFP的腺病毒载体的心肌、和/或具有含G蛋白偶联受体EDG2蛋白质和GFP蛋白质的心肌，其中

a]提供用于同时表达G蛋白偶联受体EDG2和GFP的腺病毒载体序列，

b]提供哺乳动物，

c]使用导管将来自a]的腺病毒载体系统转移进入来自b]的哺乳动物的心肌。

本发明也涉及哺乳动物在制备心肌细胞中的用途，其中，所述哺乳动物具有含用于同时表达G蛋白偶联受体EDG2和GFP的腺病毒载体的心肌、和/或具有含G蛋白偶联受体EDG2蛋白质和GFP蛋白质的心肌，所述心肌细胞可以用于鉴定修饰G蛋白偶联受体EDG2活性的化合物的方法。

本发明涉及鉴定修饰G蛋白偶联受体EDG2活性的化合物的方法，其中

a]提供来自心肌的转化细胞，该细胞表达受体EDG2或包含受体EDG2的融合蛋白，

b]可能地，使用异丙基肾上腺素和/或溶血磷脂酸处理来自a]的细胞，

c]提供化学化合物，

d]将来自a]或b]的细胞与来自c]的化学化合物接触，

e]测定来自d]的细胞的收缩性，并且将其与和来自a]的细胞具有相同特征、但未与来自c]的化学化合物接触的细胞的收缩性比较；其中对于依照d]与化学化合物接触的细胞，由该化合物导致的收缩性的相对增加或减少，说明该化合物能够修饰受体EDG2活性。

本发明另外涉及鉴定修饰受体EDG2活性的化合物的方法，其中

a]提供来自心肌的转化细胞，该细胞表达受体EDG2或包含受体EDG2的融合蛋白，

b]可能地，使用proterenol和/或溶血磷脂酸处理来自a]的细胞，

c]提供化学化合物，

d]将来自a]或b]的细胞与来自c]的化学化合物接触，

e]测定来自d]的细胞的收缩性，并且将其与和依照a]的细胞具有相同的细胞类型，但是不表达受体EDG2或包含受体EDG2的融合蛋白的细胞的收缩性比较；其中对于表达受体EDG2或包含受体EDG2的融合蛋白的细胞，由化合物导致的收缩性的相对增加或减少，说明该化合物能够修饰受体EDG2活性。

本发明另外涉及由下组的一个多核苷酸组成的腺病毒载体：

a]具有SEQ ID NO.5所示序列的多核苷酸，

b]与SEQ ID NO.5的多核苷酸95％一致的多核苷酸，

c]长度至少与SEQ ID NO.5的多核苷酸的长度一致、并且在施以高严紧性杂交条件时与SEQ ID NO.5的多核苷酸杂交的多核苷酸。

腺病毒载体序列优选包括编码SEQ ID NO.2蛋白质的多核苷酸序列。

杂交指具有互补序列的两个多核苷酸单链组装为双链。杂交可以发生在两条DNA链、一条DNA和一条RNA链及两条RNA链之间。杂交多核苷酸链的形成可以从含有双链多核苷酸分子的溶液中开始，通过加热此溶液，将双链分离为单链多核苷酸。加热步骤可以由在水浴中煮沸10至20分钟组成。当该溶液在加热后缓慢冷却至室温时，将发生形成双链分子的杂交。在实验条件下，通常使用已通过印迹或电泳将多核苷酸固定于其上的杂交滤膜(hybridization filters)进行杂交。杂交可以使用携带放射性或荧光标记的互补多核苷酸分子来显像。严紧性描述在一定条件下的一致程度。在高严紧性条件下，对一致性的要求较高。在核酸杂交环境下，依据参与的核酸以及用途和目的调节严紧性条件。用于高严紧性杂交的条件，是仅使匹配得非常好的互补分子可以杂交的条件。匹配得非常好的互补多核苷酸与互补配偶体分子表现出例如90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％的一致性。在低严紧性下，杂交也发生在仅在分子某些区段之内互补的多核苷酸分子之间，或者具有大段的错配部分或不成对碱基对的多核苷酸分子之间。

高严紧性杂交条件可以是这样的杂交，在其中，存在标记探针的杂交步骤将在2×SSC水溶液中于68℃进行至少2小时；随后的洗涤步骤组成为：第一次洗涤于室温在2×SSC/0.1％SDS中进行5分钟，第二次洗涤于68℃在1×SSC/0.1％SDS中进行1小时，第三次洗涤于68℃在0.2×SSC/0.1％SDS中再进行1小时。

2×SSC、1×SSC、或0.2×SSC溶液由20×SSC溶液稀释获得。20×SSC溶液由3mol/L氯化钠及0.3mol/L柠檬酸钠组成。技术人员熟知其他用于在严紧条件下杂交多核苷酸的标准方法。教科书如“CurrentProtocols in Molecular Biology(Wiley Interscience；ISBN：0-471-50338-X；编辑：F.M.Ansubel，R.Brant，R.R.Kingston，D.J.Moore，J.G.Seidmann，K.Struhl)”特别对其给以建议。

本发明进一步包括腺病毒载体的用途，该腺病毒载体由选自如下之一的多核苷酸组成：

a)具有SEQ ID NO.5所示序列的多核苷酸，

b)与SEQ ID NO.5多核苷酸95％一致的多核苷酸，

c)长度至少与SEQ ID NO.5多核苷酸的长度一致、并且在施以高严紧性杂交条件时与SEQ ID NO.5多核苷酸杂交的多核苷酸，

所述用途为构建至少在一个组织中暂时或持久表达G蛋白偶联受体EDG2的转基因哺乳动物。这类组织优选哺乳动物心脏的一部分。组织也可以由哺乳动物的脑、肌肉、脂肪、肝、肾或其他器官的部分组成。

本发明的一般性技术方面将在下面章节中得到进一步解释。

腺病毒可以感染许多细胞类型和组织的分裂和非分裂细胞。这一特点，加上其制备和纯化的相对容易，使其作为基因载体被广泛使用。

该病毒仅能整合约2kb的外源DNA而不对其稳定性或感染性具有显著影响。因此，引入更长的序列需要去除部分或全部病毒基因。有一系列用于构建重组腺病毒的技术。

载体可用于(例如)：(i)癌症治疗，用来递送将导致肿瘤抑制和消除的基因；(ii)基因治疗，即向组织递送基因来弥补缺陷基因；(iii)辅助治疗，用来传递基因，该基因的表达将抗击疾病进程。

在第一代载体中，E1和/或E3基因盒被去除，允许引入多达6.5kb的外源DNA，该外源DNA常常处于异源启动子的控制之下。在E1缺失的情况下，注意确保ITR和包装序列的保留。E1区的去除具有额外的明显优点，即削弱E2基因(该基因为E1依赖的)转录，从而削弱病毒DNA复制以及病毒衣壳蛋白的产生。

E1缺陷的病毒可以通过感染293细胞而繁殖，293细胞反式提供E1基因产物。尽管许多体外初始研究带来了许多希望，很快变得清楚的是，转基因的体内表达仅仅是瞬时的和受到抑制的，因为存在压倒性的免疫反应，该免疫反应主要攻击病毒衣壳抗原和表达的转基因。对此的原因之一是观察到许多细胞具有E1样蛋白质，其允许E2基因起作用，尽管是在降低的水平。而这又利于病毒DNA的复制、晚期结构抗原的合成以及可复制腺病毒(RCA)的产生。同样变得清楚的是，在较高的感染复数(m.o.i)，E2基因转录的E1依赖性可以被消除。

下一个途径是构建载体(使用合适的互补细胞系)，该载体部分或全部去除E2基因，从而去除了复制病毒DNA和产生RCA的能力。也可以通过构建不合有与载体相重叠的腺病毒序列的细胞系来防止RCA的产生。然而，宿主免疫反应仍然是实现持久转基因表达的一个主要障碍，当尝试重复感染时，这一点格外明显。大量研究证实，感染重组病毒本身足以诱导免疫反应，鉴于前面提到的信号级联的早期激活以及衣壳组分的有效抗原性，这一点也许并不令人惊讶。

另外，通过缺失其它病毒基因，已构建了更为成熟的载体(第三代)(Amalfitano等，1988)，最新的载体中去除了所有或几乎所有病毒基因。这些所谓的“无生气”载体(“gutless vectors”)(Hardy等，1997)最初仅保留了ITR和包装序列，并需要辅助病毒和适宜的互补细胞以繁殖，及随后进行仔细的纯化。然而，出现了与这些技术相关的问题，这些问题主要由污染辅助病毒和载体的不稳定性所致。防止辅助病毒包装的进一步发展，包括使用Cre-lox辅助-依赖性系统(cre-lox helper-dependent system)。

用于产生重组腺病毒的AdEasy^TM系统由Qbiogene商业提供。重组腺病毒的构建一般为两步过程，其中，目的表达盒首先装配到转移载体中，随后通过同源重组转移到腺病毒基因组中。通过同源重组的DNA插入是引导基因进入腺病毒载体的最有效的途径，这是由于两个原因：1)腺病毒DNA为大的线性分子，含有几乎所有限制酶的位点，以及2)基因组过于庞大(36kb)不易操作。

对于AdEasy^TM载体系统，以超螺旋质粒形式而非线性DNA使用含有大部分腺病毒基因组的骨架载体。同源重组步骤在大肠杆菌(Escherichiacoli.)中进行。在AdEasy^TM系统中，首先将目的cDNA克隆到转移载体中。然后使用Pme I将得到的质粒线性化，并且与病毒DNA质粒pAdEasy-1共转化到大肠杆菌菌株BJ5183中。pAdEasy-1是E1和E3缺失的；其E1功能可以在293A细胞中得到弥补。使用卡那霉素选择重组，并使用限制酶分析进行筛选。然后使用Pac I剪切重组腺病毒构建体以暴露其ITR(末端反向重复)并转染到QBI-293A细胞中产生病毒颗粒。

同源重组步骤介于线性化转移载体和完整超螺旋腺病毒质粒之间。存在于转移载体中的卡那霉素抗性基因允许重组子的选择。由于剪切的AdEasy^TM转移载体仅产生低背景的卡那霉素抗性菌落，该同源重组系统具有高信噪比。大肠杆菌菌株BJ5183并非recA，但是其他介导细菌内重组的酶缺陷，其因为较高的转化效率和重组能力而被选择。实现并证实一个重组，腺病毒重组DNA可以简单地转移到常规recA、endA菌株(例如DH5α)中以得到更高DNA产量。由于其recA状态，DH5α不能用于通过同源重组产生腺病毒重组子。

来自维多利亚水母(Aequora victoria)的绿色荧光蛋白(GFP)已迅速成为许多生物系统的标准报道分子。GFP因其不需要用于产光的辅因子或底物的存在而在发光蛋白质中独一无二。在维多利亚水母体内，GFP以钙依赖的方式起作用。当Ca⁺²与另一个生物发光蛋白质一水母发光蛋白一结合时，水母发光蛋白将能量间接转移给GFP，触发绿光的释放。这种能量转移可以通过将GFP暴露于标准长波紫外光而加以实验模拟。可以获得GFP同种型，它们发射蓝或红光，并且在升高的温度下稳定。GFP首先用于使用荧光显微镜观察活细胞，以监测蛋白质定位及将动态的细胞事件可视化。可以使用亚克隆技术产生任何克隆的目的基因与GFP之间的融合，并且可以通过瞬时或稳定表达将其引入目的生物。然后，可以使用常规荧光显微镜追踪活细胞内所产生的蛋白质的命运。检测不需要细胞的固定或透化。同样，可以通过同时表达某蛋白质和GFP，在动物组织中追踪该蛋白质。

提供细胞包括其制备、培养和进一步处理。例如，通过从器官或组织制备适宜的细胞材料，或者通过繁殖适宜的细胞系或微生物提供细胞。可以使用多种合适的培养基用于培养。将细胞维持于对该生物最佳的温度。适当时，将防腐剂、抗生素、pH指示剂、血清组分、血清、辅助物或其他物质添加到在各个情况下使用的生长培养基中。在标准教科书中(例：Basic Cell Culture；J.M.Davis编；IRL Press；1994)描述了制备、培养和进一步处理的方法。

重组技术的应用可以以多核苷酸序列的形式提供将在细胞中表达的构建体，该多核苷酸可以由技术人员借助其专业知识通过常规方式制备。分子生物学/生物化学技术人员可以在例如F.M.Ausubel等；《CurrentProtocols in Molecular Biology》John Wiley & Sons；New York中找到针对这些技术的专业知识。通过将编码例如GPCR氨基酸序列的多核苷酸整合到表达载体中制备载体构建体。表达载体是其中的多核苷酸序列能够在宿主细胞内被表达为蛋白质的载体。载体可以得自质粒、病毒或粘粒，并且必须能够自主复制。它们一般含有复制起点、限制性酶切位点和标记基因(例如抗生素抗性基因)。在表达载体中，将被扩增或已从外部引入的多核苷酸序列处于启动子的功能控制之下。启动子是用来控制转录(即从紧邻所述启动子3’端的多核苷酸序列合成mRNA)的不同长度的功能多核苷酸序列。有些启动子仅在原核生物中具有活性，例如lac、tac和trc启动子之类，还有一些启动子仅在真核细胞中具有活性，例如CMV或ADH启动子之类。在一个优选的实施方案中，重组载体构建体包括可以在真核生物和/或原核生物中使用的表达载体。表达载体含有可以功能性连接于多核苷酸序列的启动子，由此可以在生物(例如细菌、真菌或真核细胞系的细胞)中合成由该多核苷酸序列编码的蛋白质。该启动子可以是可诱导的，例如通过色氨酸；或者可以是具有组成性活性的。表达载体的实例为pUC18、pUC19、pBluescript、pcDNA3.1等。

转染是通过载体将外源多核苷酸序列引入宿主细胞、以及随后所述多核苷酸序列扩增产生任意数量的相同拷贝。

通过常规方法使用重组构建体瞬时转染细胞系，技术人员可以在上述《Current Protocols in Molecular Biology》，published by John Wiley &Sons，New York”或在“Sambrook等，《A Laboratory Manual》，Cold SpringHarbor Laboratory，ISBN 0-87969-309-6”中找到这些方法。这些常规方法的实例为电穿孔、磷酸钙共沉淀以及脂质体转染。转染的基因在宿主细胞中的表达可以通过对转染细胞的细胞裂解物的Western印迹分析结合免疫检测方法确定。对于此，技术人员也可以在上述手册中找到所需的实验室程序。适用于本发明方法的免疫检测GPCR受体的特异性抗体可商业获得。

特别可以通过化学合成或从生物材料中分离化学物质来提供化学化合物。

技术人员可以使用化学合成化合物或从细胞分离物质的常规方法。技术人员可以在教科书(例如《Organic Synthesis Workbook》；1995；John Wiley & Sons；ISBN 3-527-30187-9，《The Organic Chemistry of DrugSynthesis》；1998；John Wiley & Sons；ISBN0-471-24510-0或《BioactiveCompounds from Natural Sources》；2001；Taylor & Francis；ISBN0-7484-0890-8)中得到这些方法。

通过合成或分离得到的化合物可以溶解于合适的溶剂。合适的溶剂可以含有水、缓冲物质(例如Tris、HEPES、MOPS等)、一价和/或二价离子(例如K⁺、Na⁺、Mg²⁺、Ca²⁺等)、酸(例如HCl、H₂SO₄、甲酸、乙酸等)、碱(例如NaOH等)、醇(例如甲醇、乙醇、甘油)、去污剂(例如十二烷基硫酸钠等)、有机溶剂(例如甲酰胺、丙酮、二甲亚砜等)以及其他成分，特别是增溶剂和稳定剂。

技术人员可以使用实验室常规方法将化学化合物与所述细胞系接触。接触可以发生在例如Erlenmeyer vessels、试管、Eppendorf容器中或微量滴定板上。能设定恒定温度(例如30℃或37℃)和固定CO₂或湿度条件的控温培养箱可以用于所述接触。特别还可以在为此提供的实验室自动装置(FLIPR)中进行接触。接触可能是从几秒至几分钟至多达数小时不等的时间。在各个情况中将选用的条件取决于受体、细胞系和化学化合物。

药物的最终形式涉及最终剂型，例如，作为片剂、颗粒剂、喷雾剂、溶液剂、软膏剂、酊剂或其他剂型形式。

最终形式的加工涉及特定剂型的制备。通常，日剂量在每日每公斤体重0.3mg至100mg范围(一般从3mg到50mg)内，例如3-10mg/kg/日。静脉内给药剂量可以在例如0.3mg至1.0mg/kg范围内，并且可能最适宜以每公斤每分钟10ng至100ng输注液给药。对这些目的，适宜的输注溶液可以含有，例如，每毫升0.1ng至10mg、一般1ng至10mg。单剂量可以含有例如1mg至10g活性物质。因此用于注射的安瓿可以含有例如1mg至100mg，对于可以口服给药的单剂量剂型，例如片剂或胶囊之类，可以含有例如1.0到1000mg、一般为10至600mg。

实施例

下述实施例公开本发明，但不将其限制于该实施例范围内。

实验动物说明

本研究所使用的动物为Asamhof，Kissing(Germany)提供的十周龄雌性新西兰白兔。实验开始时动物体重在2.7至3.3kg之间。

实验动物饲养及居住条件

崽兔于30天断奶。为了将断奶应激降至最低，将母兔与仔兔分离，使一窝幼崽最初仍保持在一起。约10至14天后，将仔兔成对放于育肥笼(长×宽×高＝28.5×60×34cm)中，然后约两周后单独笼养。育肥兔依照“全进全出”(“All in-All out”)系统引入和迁出，以方便清洁和消毒。

饲料生产于内部农厂，供兔任意获取，饮用水亦如此。

气候：通风率为夏季10000m³/h、冬季3000m³/h。特别注意避免小股气流。在寒冷天气，温度保持在约15℃；尽可能防止夏季动物房过热。断奶幼崽保持于约19℃。动物房内氨保持在30ppm以下，相对湿度低于70％。育种房(breeding house)以强度约20lux照明16小时。

研究动物居住

将兔在空调车内直接送往公司，允许它们在那里有2至3天的适应期以使其适应新的饮食和环境。

将兔置于常规笼中。笼材料由不锈钢组成，具有PVC插入物；笼基底面积为4040cm²，为凿孔的底板形式。每日清洁便盆，每周对笼子进行清洗和热空气消毒。将其置于室温18至21℃、相对湿度55±5％的恒定条件下。由于动物房有窗户，照明为至少100lux的强度，与自然日夜周期相应。

麻醉及外科准备

在研究第一天，饲料和水供兔随意获取直至麻醉开始。然后指定动物被称重并经受临床检查，特别是心血管系统和呼吸道检查。通过在左右侧耳静脉内的留置导管(Venfion^TM 08.×25mm)，为动物提供双静脉通路，之后经导管使用1％异丙酚(propofol)(Disoprivan，Fresenius AG，BadHomburg)，以7毫克/公斤体重的剂量静脉内给药诱导麻醉。诱导麻醉后立即为角膜施以眼药膏(Vitamin A Dispersa，Ciba Vision^；Grossostheim)。翻正反射消失后，在颈和肘与最后肋骨之间的胸部给兔剃去腹侧兔毛，然后通过将带套的Magill管(内径2.5至3.5mm，Riisch AG，Waiblingen)在吸气过程中推进到气管中，进行插管。

为了在手术过程中保持麻醉，以12至14ml/h剂量经灌流装置(Perfusor^；EDl-300，B.Braun，Melsungen AG)静脉给以动物2％异丙酚(Disoprivan 2％，Zeneca，Italy)。插管后立即以0.01mg/kg剂量静脉对兔给以芬太尼(Fentanyl-Janssen 0.5mg，Janssen-Cilag GmbH，Neuss)作为止痛剂，然后在手术过程中按需(粗略为每30分钟)给予，以维持手术耐受期(surgical tolerance stage)。

使用小动物呼吸机(Anesthesia Workstation，Hallowell EMC，VlkerGmbH，Kaltenkirchen)，以约10mm Hg呼吸压、8至12ml/kg体重的呼吸体积以及每分钟29至32次呼吸的呼吸速率，给兔通以100％氧气，从而在呼出气中给出CO₂分压为约35mm Hg。通过ECG(Medtronic^，9790Programmer，Vitatron Medical B.V.，Dieren，Netherlands)于手术中监测心血管功能。使用脉冲血氧测量法和二氧化碳测定法监测呼吸和循环。主动脉交叉钳夹(Aortic cross-clamping)

右颈总动脉准备。将聚氨基甲酸乙酯导管(Cavafix^；1.1*1.7mm/16G，ref.4173589，B.Braun Melsungen AG，Melsungen，Germany)引入动脉。右颈总动脉插管后，经第三肋间隙打开胸腔。使用Sigscreen^方法将病毒引入心肌，特别要保证灌注的载体保留在此位置。然后使用结扎线(Nylon^，2-0USP)闭合胸腔并缝合(Vicryl^(3-0)及Nylon^(3-0))。止痛：动物术后接受卡洛芬(carprofen)(Rimadyl^，Pfizer，每12小时4mg/kg)和丁丙诺啡(buprenorphine)(Temgesic^，Boehringer，每12小时0.01mg/kg)72小时。

动物安乐死

在研究的最后一天，动物如第四节所述经受全身麻醉。安乐死发生于由0.48g/kg静脉注射戊巴比妥(Narcoren^；Rhone-Merieux GmbH，Laupheim)诱导的深度麻醉中。

死后宏观病理学诊断和取样

死亡后立即在肋骨缘水平两侧分开胸壁并完全断离胸骨，尽快摘取心脏。将心脏与输入和输出血管分离，使用含有5000IU肝素的冷无菌盐水(等渗氯化钠溶液，Delta-Pharm，Boehringer，Ingelheim)洗除血液。经总的病理学检查和称重之后，将心脏完整保存，用于进一步研究。拟用于单细胞分离的心脏暂时于约4℃在一消毒管中于肝素化冷盐水中保存，之后随即进行处理。制备冰冻切片用于GFP荧光检测。拟用于细胞显微术的新鲜摘取心脏，类似地使用无菌盐水清洗，使用纤维素干燥，然后在一试管液氮(-196℃)中超低温冷冻并保存于-80℃直至进一步处理。按照兽医学院指导方案对动物进行尸体解剖，尤其注意评价典型心力衰竭症状的程度：腹水、胸腔积液、心脏重量、心脏形状、肝充血和肝脏重量。

尸体处置

于-20℃收集在超低温柜中之后，尸体由尸体处理单位取走进行处置。

重组腺病毒的构建及纯化：

在人EDG2受体编码序列的基础上，使用基于PCR的策略克隆人EDG2受体。产生用于该受体的带有Flag标签的重组(E1/E3缺陷的)腺病毒(Ad-EDG2-GFP)，在两个独立的CMV启动子的控制下表达该转基因和绿色荧光蛋白(GFP)。使用不含另外的转基因的Ad-GFP作为对照。制备大病毒储液，在非E1表达细胞中，使用噬斑滴定和GFP表达滴定测定腺病毒滴度。

EDG2的克隆

使用正向引物5′-gcggggggtaccaccatggctgccatctctacttccatcc-3′(SEQ IDNO.5)和反向引物

5′-gcggggctcgagtcacttgtcgtcgtcgtccttatagtcaaccacagagtgatcattgct-3′(SEQ ID NO.6)，通过PCR从人脑cDNA扩增EDG2受体的DNA。

使用Expand High Fidelity PCR System(Roche MolecularBiochemicals，Mannheim，Germany)，以58℃退火1分钟，72℃扩增1分钟，经20个循环进行PCR。在PCR反应中，在基因3′末端产生符合阅读框的HA标签(来自人流感病毒A血凝素的9个氨基酸的表位)。

使用Kpnl和Xhol限制位点将PCR片段克隆到pAd-Shuttle(QBiogene，Heidelberg，Germany)中，并通过测序(MediGenomix，Martinsried，Germany)检测所产生的pAd Track-CMV-EDG2序列。

SEQ ID NO.1公开了包括3’末端30个核苷酸以内的HA标签编码区的EDG2多核苷酸序列。

SEQ ID NO.2涉及包括C端9个氨基酸的HA标签的EDG2氨基酸序列。

在SEQ ID NO.8中，公开了具有5′-Hindlll和3′Xhol位点的EDG2多核苷酸序列。该EDG2基因已被克隆到peDNA 3.1(invitrogen)的Hindlll/Xbal位点。这样的载体构建体也适用于扩增EDG2基因。

构建带有Flag标签的重组腺病毒(pAD easy 1-EDG2-HA-GFP)

使用Pmel(New England Biolabs，Beverly，MA)过夜将质粒pADTrackCMV-EDG2 c-HA线性化，之后脱磷酸并纯化(GFX DNA和GelPurification Kit；Amersham Pharmacia Biotech，Uppsala，Sweden)。对于同源重组，使用1μg线性化质粒pADTrack CMV EDG2 c-HA和0.1μg pAdeasyl于2500V、200W和25μFD(E.coli-pulser；Biorad，Heidelberg，Germany)共转化电感受态大肠杆菌BJ5183(Stratagene，La Jolla，California)，涂盘并于37℃孵育过夜。产生的载体(pAdEasyl-edg2-cHA-GFP)含有用于转染的完整重组腺病毒DNA。该完整DNA序列显示于SEQ ID NO.5中。

使用PacI小量制备质粒DNA后，检查菌落，将阳性克隆再转化到大肠杆菌DH5α中。为了转染(Effectene Transfection reagent；Qiagen，Hilden，Germany)293细胞，使用PacI消化质粒DNA。细胞培养7天，刮取收获并离心。沉淀重悬于Dulbecco′s PBS，经过四个反复冰冻(-80℃)和融解(37℃)循环裂解细胞。离心去除细胞碎片，裂解液保存于-80℃。

对于重组病毒的噬斑选择，使用来自转染的裂解液的不同连续稀释物，在Dulbecco′s PBS中，在温和搅拌下于室温将293细胞感染1小时。感染后，使用含有0.5％琼脂糖的生长培养基(添加有20％血清、2×青霉素/链霉素和2×L-谷胺酰胺的2×改良Eagles培养基(Gibco Lifetechnologies#21935)和1％琼脂糖水溶液(Seacam)的1∶1混合物)覆盖细胞。感染后5-14天，检测细胞层的噬斑形成，使用巴氏滴管挑取噬斑，重悬于0.5ml Dulbecco’s PBS中，保存于-80℃。噬斑用于在293细胞上进行另外的扩增循环。

心力衰竭模型

植入起搏器后，以360搏/分钟快速起搏处理新西兰白兔。在本方案下，经两周可以重复地形成心动过速引起的心力衰竭(HF)。衰竭心脏中平均+dp/dt max值为2200±320mmHg/秒(对比健康对照中的3200±390mmHg/秒；p＜0.05)，LVEDP从3.6±0.4mmHg升高到13±3.4(p＜0.05)。

腺病毒基因转移至兔心肌

快速起搏开始之前，所有兔的心肌接受以导管为基础的腺病毒基因转移(4×10¹⁰pfu)。对于此介入，使用芬太尼和异丙酚对兔进行麻醉。在实验结束后，通过使用荧光显微镜研究冰冻横切片的GFP表达，评价所有心脏的基因转移效率。使用4％多聚甲醛固定后评价形态学改变。基因转移在约50％的心肌细胞中引起可重复的转基因表达。

分离的心肌细胞的缩短测量

使用光电监测系统测量感染的心肌细胞的收缩性，该系统连接有对缩短和舒张的幅度及速率的在线数字化评价。在荧光下通过GFP的共表达鉴定转基因阳性心肌细胞。收缩幅度达到稳定后，在恒定溶血磷脂酸浓度(LPA；10^-5mol/l)下施于递增浓度的异丙肾上腺素；或者将递增浓度的LPA加入恒定浓度的异丙肾上腺素(10^-8mol/l)。

单细胞收缩

为了研究EDG2对心肌细胞收缩性的影响，在离体基因转移后从衰竭心脏中分离心肌单细胞，测量其缩短率(fractional shortening，FS)和缩短速度(velocity of shortening)。在不改变基础收缩性的10^-5mol/l溶血磷脂酸浓度下，递增浓度的异丙肾上腺素对EDG2过表达的心肌细胞具有显著较低的正性收缩能效应(图1)。使用低浓度异丙肾上腺素(10^-8mnl/l)预刺激之后，递增浓度的LPA对EDG2过表达的心肌细胞显示显著的负性收缩能效应，然而在对照GFP组没有观察到作用(图2)。没有异丙肾上腺素预刺激时，LPA对心肌细胞收缩性没有影响。

感染的心肌细胞的蛋白质印迹

腺病毒感染后48小时收获心肌细胞。匀浆细胞，细胞质提取物用于使用抗HA标签的抗体或抗EDG2的抗体的蛋白质印迹。使用辣根过氧化物酶偶联的山羊抗兔抗体(Dianova，Germany)作为第二抗体。

转基因向衰竭心脏的体内腺病毒递送

由于所有转基因与GFP一起表达，在体内基因转移之后，通过研究心脏中GFP的共表达来研究所有转基因的过表达。通过抗GFP抗体染色测定，Ad-EDG 2-GFP感染的兔心脏的宏观切片显示GFP共表达发生在整个左心室中。

使用蛋白质印迹评估转基因表达

使用抗HA标签抗体或抗EDG2特异性抗体，通过蛋白质印迹证明了EDG2在心肌细胞中的表达。

成年心室心肌细胞的制备和培养，以及腺病毒感染

从衰竭的新西兰白兔心脏分离单个的钙耐受心室心肌细胞。简单而言，灌注并使用胶原酶消化心脏。分离的心肌细胞在层粘连蛋白预包被(5-10μg/cm²)的皿中，以1.5×10⁵细胞/cm²的密度培养于改良的M199中(于5％CO²和37℃)。对于收缩实验，接种后5小时使用腺病毒感染细胞(感染复数(moi)1pfu/细胞)。在此滴度，50-60％的感染心肌细胞表达转基因。

使用超声波心动描记法和心室内Tip导管测量心肌收缩性

在快速起搏开始之前、起搏开始后一周后、两周后，使用超声波心动描记法检测左心室收缩性。起搏两周之后进行Tip导管测量。兔被麻醉；连续监测ECG。

对于超声波心动描记法，将7.5MHz探针固定在三角架上。记录能够良好重复的标准断面。对于Tip导管测量，将连接到辨别装置上的Millar 3FTip导管，通过置于颈动脉中的护套，放置于左心室。确定基础收缩性和左心室压之后，注射200μL NaCl(0.9％)作为阴性对照。以递增的剂量静脉输注异丙肾上腺素和溶血磷脂酸(LPA)。在20分钟的平衡期之后，进行Tip导管测量。

在起搏诱导的心力衰竭中左心室功能失常的恶化

图3显示了快速起搏两周之后在严重心力衰竭(NYHA IV)的兔中进行的Tip导管插入术测量。在EDG2表达组中，在基础条件和递增的LPA剂量下，LV压的一阶导数(dp/dt max)显著低于Ad-GFP感染的对照组。对于收缩LV压的增加而言，这一点也属实(图4)。

在EDG2过表达的心脏中，超声波心动描记法显示两周后心肌的明显肥大，这一点也通过心脏收缩和心脏舒张直径的降低得到证实。与GFP对照相比，在EDG2过表达的心脏中，LV隔膜和后壁的平均厚度显著更大。在两周观察期内通过连续超声波心动描记法评定LV缩短率(Fractionalshortening，FS)的时程。在两组中，在快速起博的时期内，FS逐渐降低。

附图描述

图1：

分离自衰竭心脏的单个心肌细胞的收缩幅度。使用Ad-GFP或Ad-EDG2-GFP离体感染心肌细胞。使用10μM LPA预刺激之后，测定响应于递增浓度的异丙肾上腺素的缩短率(FS)。数据表示为平均值±SEM。

图2：

分离自衰竭心脏的单个心肌细胞的收缩幅度。与显示于图1的实验相似，在Ad-GFP或Ad-EDG2-GFP的体外基因转移之后，在心肌细胞内比较FS。使用l0μM异丙肾上腺素预刺激之后，测定响应于递增浓度的LPA的缩短率。数据表示为平均值±SEM。

图3：

通过Tip导管插入法测定的、基线以及响应于递增剂量的LPA的左心室压的最大一阶导数(LV dp/dt max)。在由于快速起搏导致的晚期心力衰竭(terminal heart failure)兔中于基因转移GFP或EDG2之后两周后进行。数据表示为平均值±SEM。所有测量在8只动物中一式三份进行。对照GFP，^*p＜0.05。

图4：

在由于快速起搏导致晚期心力衰竭的兔中、在GFP或EDG2基因转移后两周后，通过Tip导管插入法测定基线以及响应于递增剂量的LPA的左心室收缩压。数据表示为平均值±SEM。所有测量在8个动物中一式三份地进行。对照GFP，^*p＜0.05。

                        序  列  表

<110>安万特医药德国有限公司(Aventis Pharma Deutschland GmbH)

<120>EDG2受体在心力衰竭动物模型中的用途

<130>DEAV2002/0083

<140>

<141>

<160>8

<170>PatentIn Ver.2.1

<210>1

<211>1122

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>1

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<211>373

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<212>DNA

<213>Aequorea victoria

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<210>5

<211>38306

<212>DNA

<213>腺相关病毒2

<220>

<223>Vector

<220>

<223>腺病毒载体

<400>5

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aggcgcagtt gctctgcctc tccacttaac attcagtcgt agccgtccgc cgagtccttt 5460

accgcgtcaa agttaggaat aaattgatcc ggatagtggc cgggaggtcc cgagaagggg 5520

ttaaagtaga ccgatggcac aaactcctca ataaattgca gagttccaat gcctccagag 5580

cgcggctcag aggacgaggt ctgcagagtt aggattgcct gacgaggcgt gaatgaagga 5640

cggccggcgc cgccgatctg aaatgtcccg tccggacgga gaccaagcga ggagctcacc 5700

gactcgtcgt tgagctgaat acctcgccct ctgattgtca ggtgagttat accctgcccg 5760

ggcgaccgca ccctgtgacg aaagccgccc gcaagctgcg cccctgagtt agtcatctga 5820

acttcggcct gggcgtctct gggaagtacc acagtggtgg gagcgggact ttcctggtac 5880

accagggcag cgggccaact acggggatta aggttattac gaggtgtggt ggtaatagcc 5940

gcctgttcca agagaattcg gtttcggtgg gcgcggattc cgttgacccg ggatatcatg 6000

tggggtcccg cgctcatgta gtttattcgg gttgagtagt cttgggcagc tccagccgca 6060

agtcccattt gtggctggta actccacatg tagggcgtgg gaatttcctt gctcataatg 6120

gcgctgacga caggtgctgg cgccgggtgt ggccgctgga gatgacgtag ttttcgcgct 6180

taaatttgag aaagggcgcg aaactagtcc ttaagagtca gcgcgcagta tttactgaag 6240

agagcctccg cgtcttccag cgtgcgccga agctgatctt cgcttttgtg atacaggcag 6300

ctgcgggtga gggatcgcag agacctgttt tttattttca gctcttgttc ttggcccctg 6360

ctctgttgaa atatagcata cagagtggga aaaatcctgt ttctaagctc gcgggtcgat 6420

acgggttcgt tgggcgccag acgcagcgct cctcctcctg ctgctgccgc cgctgtggat 6480

ttcttgggct ttgtcagagt cttgctatcc ggtcgccttt gcttctgtgt ggccgctgct 6540

gttgctgccg ctgccgctgc cgccggtgca gtatgggctg tagagatgac ggtagtaatg 6600

caggatgtta cgggggaagg ccacgccgtg atggtagaga agaaagcggc gggcgaagga 6660

gatgttgccc ccacagtctt gcaagcaagc aactatggcg ttcttgtgcc cgcgccatga 6720

gcggtagcct tggcgctgtt gttgctcttg ggctaacggc ggcggctgct tggacttacc 6780

ggccctggtt ccagtggtgt cccatctacg gttgggtcgg cgaacgggca gtgccggcgg 6840

cgcctgagga gcggaggttg tagccatgct ggaaccggtt gccgatttct ggggcgccgg 6900

cgaggggaat gcgaccgagg gtgacggtgt ttcgtctgac acctcttcga cctcggaagc 6960

ttcctcgtct aggctctccc agtcttccat catgtcctcc tcctcctcgt ccaaaacctc 7020

ctctgcctga ctgtcccagt attcctcctc gtccgtgggt ggcggcggca gctgcagctt 7080

ctttttgggt gccatcctgg gaagcaaggg cccgcggctg ctgctgatag ggctgcggcg 7140

gcggggggat tgggttgagc tcctcgccgg actgggggtc caagtaaacc ccccgtccct 7200

ttcgtagcag aaactcttgg cgggctttgt tgatggcttg caattggcca agaatgtggc 7260

cctgggtaat gacgcaggcg gtaagctccg catttggcgg gcgggattgg tcttcgtaga 7320

acctaatctc gtgggcgtgg tagtcctcag gtacaaattt gcgaaggtaa gccgacgtcc 7380

acagccccgg agtgagtttc aaccccggag ccgcggactt ttcgtcaggc gagggaccct 7440

gcagctcaaa ggtaccgata atttgacttt cgttaagcag ctgcgaattg caaaccaggg 7500

agcggtgcgg ggtgcatagg ttgcagcgac agtgacactc cagtagaccg tcaccgctca 7560

cgtcttccat tatgtcagag tggtaggcaa ggtagttggc tagctgcaga aggtagcagt 7620

ggccccaaag cggcggaggg cattcgcggt acttaatggg cacaaagtcg ctaggaagtg 7680

cacagcaggt ggcgggcaag attcctgagc gctctaggat aaagttccta aagttctgca 7740

acatgctttg actggtgaag tctggcagac cctgttgcag ggttttaagc aggcgttcgg 7800

ggaaaatgat gtccgccagg tgcgcggcca cggagcgctc gttgaaggcc gtccataggt 7860

ccttcaagtt ttgctttagc agtttctgca gctccttgag gttgcactcc tccaagcact 7920

gctgccaaac gcccatggcc gtctgccagg tgtagcatag aaataagtaa acgcagtcgc 7980

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ggttttcgtg caaaattcca aggtaggaga ccaggttgca gagctccacg ttggagatct 8100

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ctgcggccat cattagtttg cgtcgctcct ccaagtcggc aggctcgcgc gtttgaagcc 8280

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ttgcatccct ctccaggggc tgcgcacggc gcacgatcag ctcactcatg actgtgctca 8400

tgaccttggg gggtaggtta agtgccgggt aggcaaagtg ggtgacctcg atgctgcgtt 8460

ttagtacggc taggcgcgcg ttgtcaccct cgagttccac caacactcca gagtgacttt 8520

cattttcgct gttttcctgt tgcagagcgt ttgccgcgcg cttctcgtcg cgtccaagac 8580

cctcaaagat ttttggcact tcgttgagcg aggcgatatc aggtatgaca gcgccctgcc 8640

gcaaggccag ctgcttgtcc gctcggctgc ggttggcacg gcaggatagg ggtatcttgc 8700

agttttggaa aaagatgtga taggtggcaa gcacctctgg cacggcaaat acggggtaga 8760

agttgaggcg cgggttgggc tcgcatgtgc cgttttcttg gcgtttgggg ggtacgcgcg 8820

gtgagaatag gtggcgttcg taggcaaggc tgacatccgc tatggcgagg ggcacatcgc 8880

tgcgctcttg caacgcgtcg cagataatgg cgcactggcg ctgcagatgc ttcaacagca 8940

cgtcgtctcc cacatctagg tagtcgccat gcctttcgtc cccccgcccg acttgttcct 9000

cgtttgcctc tgcgttgtcc tggtcttgct ttttatcctc tgttggtact gagcggtcct 9060

cgtcgtcttc gcttacaaaa cctgggtcct gctcgataat cacttcctcc tcctcaagcg 9120

ggggtgcctc gacggggaag gtggtaggcg cgttggcggc atcggtggag gcggtggtgg 9180

cgaactcaga gggggcggtt aggctgtcct tcttctcgac tgactccatg atctttttct 9240

gcctatagga gaaggaaatg gccagtcggg aagaggagca gcgcgaaacc acccccgagc 9300

gcggacgcgg tgcggcgcga cgtcccccaa ccatggagga cgtgtcgtcc ccgtccccgt 9360

cgccgccgcc tccccgggcg cccccaaaaa agcggatgag gcggcgtatc gagtccgagg 9420

acgaggaaga ctcatcacaa gacgcgctgg tgccgcgcac acccagcccg cggccatcga 9480

cctcggcggc ggatttggcc attgcgccca agaagaaaaa gaagcgccct tctcccaagc 9540

ccgagcgccc gccatcacca gaggtaatcg tggacagcga ggaagaaaga gaagatgtgg 9600

cgctacaaat ggtgggtttc agcaacccac cggtgctaat caagcatggc aaaggaggta 9660

agcgcacagt gcggcggctg aatgaagacg acccagtggc gcgtggtatg cggacgcaag 9720

aggaagagga agagcccagc gaagcggaaa gtgaaattac ggtgatgaac ccgctgagtg 9780

tgccgatcgt gtctgcgtgg gagaagggca tggaggctgc gcgcgcgctg atggacaagt 9840

accacgtgga taacgatcta aaggcgaact tcaaactact gcctgaccaa gtggaagctc 9900

tggcggccgt atgcaagacc tggctgaacg aggagcaccg cgggttgcag ctgaccttca 9960

ccagcaacaa gacctttgtg acgatgatgg ggcgattcct gcaggcgtac ctgcagtcgt 10020

ttgcagaggt gacctacaag catcacgagc ccacgggctg cgcgttgtgg ctgcaccgct 10080

gcgctgagat cgaaggcgag cttaagtgtc tacacggaag cattatgata aataaggagc 10140

acgtgattga aatggatgtg acgagcgaaa acgggcagcg cgcgctgaag gagcagtcta 10200

gcaaggccaa gatcgtgaag aaccggtggg gccgaaatgt ggtgcagatc tccaacaccg 10260

acgcaaggtg ctgcgtgcac gacgcggcct gtccggccaa tcagttttcc ggcaagtctt 10320

gcggcatgtt cttctctgaa ggcgcaaagg ctcaggtggc ttttaagcag atcaaggctt 10380

ttatgcaggc gctgtatcct aacgcccaga ccgggcacgg tcaccttttg atgccactac 10440

ggtgcgagtg caactcaaag cctgggcacg cgcccttttt gggaaggcag ctaccaaagt 10500

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cgcggatggt tgtgcctgag tttaagtgga gcactaaaca ccagtatcgc aacgtgtccc 10800

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caagggtggg ggtaaataat cacccgagag tgtacaaata aaagcatttg cctttattga 10920

aagtgtctct agtacattat ttttacatgt ttttcaagtg acaaaaagaa gtggcgctcc 10980

taatctgcgc actgtggctg cggaagtagg gcgagtggcg ctccaggaag ctgtagagct 11040

gttcctggtt gcgacgcagg gtgggctgta cctggggact gttgagcatg gagttgggta 11100

ccccggtaat aaggttcatg gtggggttgt gatccatggg agtttggggc cagttggcaa 11160

aggcgtggag aaacatgcag cagaatagtc cacaggcggc cgagttgggc ccctgtacgc 11220

tttgggtgga cttttccagc gttatacagc ggtcggggga agaagcaatg gcgctacggc 11280

gcaggagtga ctcgtactca aactggtaaa cctgcttgag tcgctggtca gaaaagccaa 11340

agggctcaaa gaggtagcat gcgggttcca ggcaaaggcc atccagtgta cgcccccagt 11400

ctcgcgaccg gccgtattga ctatggcgca ggcgagcttg tgtggagaaa caaagcctgg 11460

aaagcgcttg tcataggtgc ccaaaaaata tggcccacaa ccaagatctt tgacaatggc 11520

tttcagttcc tgctcactgg agcccatggc ggcagctgtt gttgatgttg cttgcttctt 11580

tatgttgtgg cgttgccggc cgagaagggc gtgcgcaggt acacggtttc gatgacgccg 11640

cggtgcggcc ggtgcacacg gaccacgtca aagacttcaa acaaaacata aagaagggtg 11700

ggctcgtcca tgggatccac ctcaaaagtc atgtctagcg cgtgggcgga gttggcgtag 11760

agaaggtttt ggcccaggtc tgtgagtgcg cccatggaca taaagttact ggagaatggg 11820

atgcgccaaa gggtgcgatc gcaaagaaac tttttctggg taatgctgtc aactgcggtc 11880

ttgcctataa gcggataggg gaagttagca gggtaggcct gtccttcgcg catggtgggg 11940

gcaaggtagc caacaaatcc agagttgttg tgttggtgta ggatgcccac ctgttggtag 12000

tccttgtatt tagtatcatc caccacctga cggctcatgg gctggaagtt tctaaagaag 12060

gagtacatgc ggtccttgta gctctctggg atatagaagc cctggtagcc aatgttgtag 12120

ttagctagca tttgtaccag gaaccagtct ttggtcatgt tacactgggc aacgttgtaa 12180

ccctccccgt caactgagcg cttaatttca aactcgttgg gggtaagcag gcggtcattg 12240

ccaggccagc tgacagaaga gtcaaaggta atggccacct tcttaaaggt gtggttgagg 12300

taaaaggttc catctaggta gggtatagag ccagagtagg tgtaataagg gtcgtagccc 12360

gagcccagtg atggggtttc cttagtctta aggcgcgtga aggcccagcc gcggaaagcc 12420

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atggcctcaa gcgtggaggc ggtgttgtgg gccatgggga agaaggtggc gtaaaggcaa 12600

atgctatcaa acttaatgct ggctccgtca acccttaggt catttcctag ggagctctgc 12660

agaaccatgt taacatcctt cctgaagttc cactcgtagg tgtatgagcc cggcaggaga 12720

aggaggtttt taatggcaaa gaacttctga ggcacctgga tgtggaaggg cacatagcga 12780

ccattgccca gcaacattga gcggtagcgc aggccagcat tgcggtggtg gttaaatggg 12840

ttgacgttgt ccatatagtc aagggaccag cgtgctccaa ggttaatgta gcagtccact 12900

aacccgggag ccaccactcg cttgttcatg tagtcgtagg tgtttgggtt atcagaaatt 12960

tttacgttgg aaggactgta ctttagcttg tcgggcaaat acagcgctat gttggagtac 13020

aggaaatttc tccacaggtt ggcatttaga ttgatttcca tggcaaaatt atttccaact 13080

cttatttcat ttttatctga aaattctgta gcatcttttt cccatccatt ttcctgacct 13140

gttttaggtt ttaccttggt aagagtctct gtattaatca cacctcccag tggaaagcag 13200

taatttggaa gttcatcttc agttccatga ttttcaataa ttctaacatc tggatcatag 13260

ctgtcaacag cctgattcca catagaaaag tacctggttc tatcaccaat ggaatcaagc 13320

aaaagctggt atgaaagctc tgtgtttctg tcttgcaaat ctacaacagc attcaactgc 13380

gatgcttggc ccgccagaac acccatatta cccgtgctgt tgtaatacat tagaccaata 13440

aaattgtccc taaaagcaat gtaattaggc ctgttgggca tagattgttg gcccattagt 13500

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atatctacat cttcactgta caataccact ttaggagtca agttatcacc attgcctgcg 13620

gtcgcctcag tagttgagaa aaattgcatt tccacttgac tttctagctt tccattttgt 13680

tgctttacaa gaatgccttg ccctccattt tcatttgtgg gttttgcata tgaaccgtaa 13740

catggtttca ttggggtagt ctttttaagg actctcccag ctgcatgatt aatttcagtt 13800

tcgtaccact gagattctcc tatttgaggt tcaggttgaa atgttttatc ggcatattta 13860

ggtgtttgac cttcgacacc tatttgaata ccctcctttg taatatttat accagaataa 13920

ggcgcctgcc caaatacgtg agttttttgc tgctcagctt gctcgtctac ttcgtcttcg 13980

ttgtcatcgt cctcttcttc taggtttatt tcaagagcag tagcagcttc atcccattcg 14040

caaggatttg gggcaccctt gggagccagg gcgttgtagg cagtgccaga gtagggctta 14100

aaagtagggc ccctgtccag cacgccgcgg atgtcaaagt acgtggaagc catgtccagc 14160

acacggttat cacccacagc tagggtgaac cgcgccttgt acgagtacgc agtatcctca 14220

cggtccacag ggatgaaccg cagcgtcaaa cgctgggacc ggtctgtggt cacgtcgtgc 14280

gtaggcgcca ccgtggggtt tctaaacttg ttattcaggc tgaagtacgt ctcggtggcg 14340

cgggcaaact gcaccagccc ggggctcagg tactccgagg cgtcctggcc cgagatgtgc 14400

atgtaagacc actgcggcat catcgaaggg gtagccatct tggaaagcgg gcgcgcggcg 14460

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ctattcagaa gcatcgtcgg cgcttcaggg attgcacccc cagacccacg atgctgttca 14580

gtgtgctttg ccagttgcca ctggctacgg gccgcaacga tcgcggaccg ctggcggcgc 14640

ggcgcaggga cgcgcggcta ggacgggtta caacaacggc ggtcgggcct ggcagcacag 14700

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ccaccacccc gctaatgcca gaggccaggc catctaccac cttttgttgg aaattttgct 15060

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tcttaacggt ggaaccgaaa tttttaatgc cgctccacag cgagccccag ctgaaggcgc 15180

caccgctcat attgctggtg ccgatatctt gccagtttcc catgaacggg cgcgagccgt 15240

gtcgcggggc cagagacgca aagttgatgt cttccattct acaaaatagt tacaggacca 15300

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gcagcaccag ggtcctgcct ccttcgcgag ccaccctgcg cacggaaatc ggggccagca 15720

cgggctggcg acggcgacgg cggcggcggg ttccagtggt ggttcggcgt cgggtagttg 15780

ctcgtcttct ggggcggtag gtgtagccac gatagccggg ggtaggcgca atggaaggat 15840

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gcttgggtac catcagctgc acggtgggtg ccaagtcacc agactcgcgc tttaggccgc 16260

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catcatacac gcgcttgtag gtgcgggtgg agcgctcacc gggcgtaaag actacggtgg 16500

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cggtagcgtg cagcagttcc acctcgtcgt caagttcatc atcatcatct ttctttttct 16620

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agatctccgg cgcgatgacc tggagcatct cttctttgat tttgcgcttg gacatagctt 16740

cgttgcgcgc cgccgccgct ggatacatac aacagtacga gtctaagtag ttttttcttg 16800

caatctagtt gcgcgggggg cgggtgcgca cgggcacgcg caggccgcta accgagtcgc 16860

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cggcggccgc tcgtcgcctg gacctggggg gcacagtgac aatacccgcg gccagccttc 16980

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ccgcgcgttg ggcggcagtg ccgggtcggc ggcggtggcg acgtgctacg cgcctccgcc 17100

gtctcttcat tttagcatag cgccgggctc cgcgcaccac ggtctgaatg gccgcgtcca 17160

ctgtggacac tggtggcggc gtgggcgtgt agttgcgcgc ctcctccacc accgcgtcga 17220

tggcgtcatc gacggtggtg cgcccagtgc ggccgcgttt gtgcgcgccc cagggcgcgc 17280

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tgcttgctca aaaagtgcgg ctcgatagga cgcgcggcga gactatgccc agggccttgt 17460

aaacgtaggg gcaggtgcgg cgtctggcgt cagtaatggt cactcgctgg actcctccga 17520

tgctgttgcg cagcggtagc gtcccgtgat ctgtgagagc aggaacgttt tcactgacgg 17580

tggtgatggt gggggctggc gggcgcgcca aaatctggtt ctcgggaaag cgattgaaca 17640

cgtgggtcag agaggtaaac tggcggatga gttgggagta gacggcctgg tcgttgtaga 17700

agctcttgga gtgcacgggc aacagctcgg cgcccaccac cggaaagttg ctgatctggc 17760

gcgtggagcg gaaggtcacg gggtcttgca tcatgtctgg caacgaccag tagacctgct 17820

ccgagccgca ggttacgtca ggagtgcaaa gcagggtcca tgagcggatt ccggtctgag 17880

ggtcgccgta gttgtatgca aggtaccagc tgcggtactg ggtgaaggtg ctgtcattgc 17940

ttattaggtt gtaactgcgt ttcttgctgt cctctgtcag gggtttgatc accggtttct 18000

tctgaggctt ctcgacctcg ggttgcgcag cgggggcggc agcttcggcc gctgcttcgg 18060

cctcagcgcg cttctcctca gcccgtgtgg caaaggtgtc gccgcgaatg gcatgatcgt 18120

tcatgtcctc caccggctgc attgccgcgg ctgccgcgtt ggagttctct tccgcgccgc 18180

tgccactgct gttgctgccg cctgcgccac ccccgccctg ttcggtgtca tctttcaagc 18240

tcgcctggta ggcgtccaca tccaacagtg cgggaatgtt accaccctcc agatcatcgt 18300

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cttcgtttgt atatacccca ggcatgacaa gaccagtgac ggggtcaaac cccagtctga 18480

agttgcgggt gtcaaacttt accccgatgt cgctttccag aaccccgttc tgtctgccca 18540

ctttcaagta gtgctccacg atcgcgttgt tcataaggtc tatggtcatg gtctcggagt 18600

agttgccctc gggcagcgtg aactccaccc actcgtattt cagctccacc tgattgtcct 18660

tagtaggcaa gcgcgacacc atcacccgcg ccttaaactt attggtaaac atgaactcgt 18720

tcacatttgg catgttggta tgcaggatgg ttttcaggtc gccgccccag tgcgaccggt 18780

cgtcaagatt gatggtctgt gtgcttgcct cccccgggct gtagtcattg ttttgaatga 18840

ccgtggtcag aaagttgctg tggtcgttct ggtagttcag ggatgccaca tccgttgact 18900

tgttgtccac caggtacaca cgggtggtgt cgaatagggg tgccaactca gagtaacgga 18960

tgctgtttct ccccccggta ggccgcaggt accgcggagg cacaaacggc gggtccaggg 19020

gagcatcgaa gggagaaccc agcgccgccg ccactggcgc cgcgctcacc acactctcgt 19080

aggagggagg aggaccttcc tcatacatcg ccgcgcgccg catactaagg ggaatacaag 19140

aaaaccaacg ctcggtgcca tggccttggt gagtttttta ttttgcatca tgcttttttt 19200

tttttaaaac attctcccca gcctggggcg aaggtgcgca aacgggttgc cactccctcc 19260

caaatccagg acgctgctgt cgtctgccga gtcatcgtcc tcccacacca gaccccgctg 19320

acggtcgtgc ctttgacgac gggtgggcgg gcgcgggcct ggcacgtccc tgtgctcctg 19380

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ctcgcccagc aggcgcgggc gggtggtgcg agtgctggta agagacccta tcaagcttgg 19560

aaatgggcta ctagcatctg accgcggggc cgcagcgcct agatcggaca agctgcttgg 19620

cctgcggaag ctttcctttc gcagcgccgc ctctgcctgc tcgcgctgtt gcaactctag 19680

cagggtctgc ggttgcgggg aaaacacgct gtcgtctatg tcgtcccaga ggaatccatc 19740

gttaccctcg ggcacctcga atcccccggt gtagaaacca gggggcggta gccagtgcgg 19800

gttcaagatg gcattggtga aatactcggg gttcacggcg gccgcgcgat gcaagtagtc 19860

cattaggcgg ttgataaacg gccggtttga ggcatacatg cccggttcca tgttgcgcgc 19920

ggtcatgtcc agcgccacgc tgggcgttac cccgtcgcgc atcaggttaa ggctcacgct 19980

ctgctgcacg tagcgcaaaa tgcgctcctc ctcgctgttt aaactgtgca acgaggggat 20040

cttctgccgc cggttggtca gcaggtagtt tagggttgcc tccaggctgc ccgtgtcctc 20100

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gtttgcgcgc gccgggacca ccgcttccag aattgcggag agccggttgg cctgcggctg 20820

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gtccgttgcg tcttgcatca tctgatcaga aacatcaccg cttagtactc gccgtcctct 21000

ggctcgtact catcgtcctc gtcatattcc tccacgccgc cgacgttgcc agcgcgcgcg 21060

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cctatagcca cctcctcgcg cgccacaagc gtacgcacgt ggttgttaaa gcttttttga 21720

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tcacgcgtat cacgcttcag ctgcaccctt gggtaccgct caggagaggg cgctcctagc 22020

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tcgtaatcac catctgctgc cgcgtcaacc gcggatgtcg cccctcctga cgcggtagga 22140

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ctgacccgtc tatgcgaggt aaacctgcag gagctcccgc ctgacctgac gccgcgggag 24900

ctccagacca tggacagctc ccatctgcgc gatgttgtca tcaagctccg accgccgcgc 24960

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tggtggcggg agatccagtt cttcccgatc ggctcgcatc ctcgcaccga gcgtctcttt 25320

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ccagaaaaaa tggccatagg tcgccagttt aggacctttc gcgaccacct gcaaatgcta 25560

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tttgcgctca cccacacctc gctccggaag gccgcgcagg catacgcgct acccgtagaa 26040

aagggatgct gcgcctacca ggccgtcaac cagttctaca tgctaggctc ttaccgttcg 26100

gaggccgacg ggtttccgat ccaagagtac tggaaagacc gcgaagagtt tgtcctcaac 26160

cgcgagctgt ggaaaaaaaa gggacaggat aagtatgaca tcatcaagga aaccctggac 26220

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ccaaccatat catccaactc acatgccatc ttcaggcaga tagtcttccg agcagagcag 26400

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gtggaccccc tagtggacaa cgaccgctac ccctcccact tagcctcctt cgtgctggcc 27420

tggacgcgag cctttgtctc agagtggtcc gagtttctat acgaggagga ccgcggaaca 27480

ccgctcgagg acaggcctct caagtctgta tacggggaca cggacagcct tttcgtcacc 27540

gagcgtggac accggctcat ggaaaccaga ggtaagaaac gcatcaaaaa gcatggggga 27600

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ctgcagcggc tgaagcggcg gcggaggctg cagtctccaa cggcgttcca gacacggtct 29520

cgtaggtcaa ggtagtagag tttgcgggca ggacggggcg accatcaatg ctggagccca 29580

tcacattctg acgcaccccg gcccatgggg gcatgcgcgt tgtcaaatat gagctcacaa 29640

tgcttccatc aaacgagttg gtgctcatgg cggcggcggc tgctgcaaaa cagatacaaa 29700

actacataag acccccacct tatatattct ttcccaccct tannntaata gtaatcaatt 29760

acggggtcat tagttcatag cccatatatg gagttccgcg ttggtaaatg gcccgcctgg 29820

ctgaccgccc aacgaccccc gcccattgac gtcaataatg acgtatgttc ccatagtaac 29880

gccaataggg actttccatt gacgtcaatg ggtggagtat ttacggtaaa ctgcccactt 29940

ggcagtacat caagtgtatc atatgccaag tacgccccct attgacgtca atgacggtaa 30000

atggcccgcc tggcattatg cccagtacat gaccttatgg gactttccta cttggcagta 30060

catctacgta ttagtcatcg ctattaccat ggtgatgcgg ttttggcagt acatcaatgg 30120

gcgtggatag cggtttgact cacggggatt tccaagtctc caccccattg acgtcaatgg 30180

gagtttgttt tggcaccaaa atcaacggga ctttccaaaa tgtcgtaaca actccgcccc 30240

attgacgcaa atgggcggta ggcgtgtacg gtgggaggtc tatataagca gagctggttt 30300

agtgaaccgt cagatccgct agagatctgg taccaccatg gctgccatct ctacttccat 30360

ccctgtaatt tcacagcccc agttcacagc catgaatgaa ccacagtgct tctacaacga 30420

gtccattgcc ttcttttata accgaagtgg aaagcatctt gccacagaat ggaacacagt 30480

cagcaagctg gtgatgggac ttggaatcac tgtttgtatc ttcatcatgt tggccaacct 30540

attggtcatg gtggcaatct atgtcaaccg ccgcttccat tttcctattt attacctaat 30600

ggctaatctg gctgctgcag acttctttgc tgggttggcc tacttctatc tcatgttcaa 30660

cacaggaccc aatactcgga gactgactgt tagcacatgg ctccttcgtc agggcctcat 30720

tgacaccagc ctgacggcat ctgtggccaa cttactggct attgcaatcg agaggcacat 30780

tacggttttc cgcatgcagc tccacacacg gatgagcaac cggcgggtag tggtggtcat 30840

tgtggtcatc tggactatgg ccatcgttat gggtgctata cccagtgtgg gctggaactg 30900

tatctgtgat attgaaaatt gttccaacat ggcacccctc tacagtgact cttacttagt 30960

cttctgggcc attttcaact tggtgacctt tgtggtaatg gtggttctct atgctcacat 31020

ctttggctat gttcgccaga ggactatgag aatgtctcgg catagttctg gaccccggcg 31080

gaatcgggat accatgatga gtcttctgaa gactgtggtc attgtgcttg gggcctttat 31140

catctgctgg actcctggat tggttttgtt acttctagac gtgtgctgtc cacagtgcga 31200

cgtgctggcc tatgagaaat tcttccttct ccttgctgaa ttcaactctg ccatgaaccc 31260

catcatttac tcctaccgcg acaaagaaat gagcgccacc tttaggcaga tcctctgctg 31320

ccagcgcagt gagaacccca ccggccccac agaaggctca gaccgctcgg cttcctccct 31380

caaccacacc atcttggctg gagttcacag caatgatcac tctgtggttt atccctatga 31440

cgtccccgac tatgcctgac tcgagcctaa gcttctagat aagatatccg atcnntggag 31500

ttcgtgaccg ccgccgggat cactctcggc atggacgagc tgtacaagtc cggactcaga 31560

tccaccggat ctagataact gatcataatc agccatacca catttgtaga ggttttactt 31620

gctttaaaaa acctcccaca cctccccctg aacctgaaac ataaaatgaa tgcaattgtt 31680

gttgttaact tgtttattgc agcttataat ggttacaaat aaagcaatag catcacaaat 31740

ttcacaaata aagcattttt ttcactgcat tctagttgtg gtttgtccaa actcatcaat 31800

gtatcttaac gcgnnntaat agtaatcaat tacggggtca ttagttcata gcccatatat 31860

ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc ccaacgaccc 31920

ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag ggactttcca 31980

ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta aactgcccac ttggcagtac atcaagtgta 32040

tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg cctggcatta 32100

tgcccagtac atgaccttat gggactttcc tacttggcag tacatctacg tattagtcat 32160

cgctattacc atggtgatgc ggttttggca gtacatcaat gggcgtggat agcggtttga 32220

ctcacgggga tttccaagtc tccaccccat tgacgtcaat gggagtttgt tttggcacca 32280

aaatcaacgg gactttccaa aatgtcgtaa caactccgcc ccattgacgc aaatgggcgg 32340

taggcgtgta cggtgggagg tctatataag cagagctggt ttagtgaacc gtcagatccg 32400

ctagcgctac cggtcgccac catggtgagc aagggcgagg agctgttcac cggggtggtg 32460

cccatcctgg tcgagctgga cggcgacgta aacggccaca agttcagcgt gtccggcgag 32520

ggcgagggcg atgccaccta cggcaagctg accctgaagt tcatctgcac caccggcaag 32580

ctgcccgtgc cctggcccac cctcgtgacc accctgacct acggcgtgca gtgcttcagc 32640

cgctaccccg accacatgaa gcagcacgac ttcttcaagt ccgccatgcc cgaaggctac 32700

gtccaggagc gcaccatctt cttcaaggac gacggcaact acaagacccg cgccgaggtg 32760

aagttcgagg gcgacaccct ggtgaaccgc atcgagctga agggcatcga cttcaaggag 32820

gacggcaaca tcctggggca caagctggag tacaactaca acagccacaa cgtctatatc 32880

atggccgaca agcagaagaa cggcatcaag gtgaacttca agatccgcca caacatcgag 32940

gacggcagcg tgcagctcgc cgaccactac cagcagaaca cccccatcgg cgacggcccc 33000

gtgctgctgc ccgacaacca ctacctgagc acccagtccg ccctgagcaa agaccccaac 33060

gagaagcgcg atcacatggt cctgctggag ttcgtgaccg ccgccgggat cactctcggc 33120

atggacgagc tgtacaagtc cggactcaga tccaccggat ctagataact gatcataatc 33180

agccatacca catttgtaga ggttttactt gctttaaaaa acctcccaca cctccccctg 33240

aacctgaaac ataaaatgaa tgcaattgtt gttgttaact tgtttattgc agcttataat 33300

ggttacaaat aaagcaatag catcacaaat ttcacaaata aagcattttt ttcactgcat 33360

tctagttgtg gtttgtccaa actcatcaat gtatcttaac gcgnnnttac gcgctatgag 33420

taacacaaaa ttattcagat ttcacttcct cttattcagt tttcccgcga aaatggccaa 33480

atcttactcg gttacgccca aatttactac aacatccgcc taaaaccgcg cgaaaattgt 33540

cacttcctgt gtacaccggc gcacaccaaa aacgtcactt ttgccacatc cgtcgcttac 33600

atgtgttccg ccacacttgc aacatcacac ttccgccaca ctactacgtc acccgccccg 33660

ttcccacgcc cgcgccacgt cacaaactcc accccctcat tatcatattg gcttcaatcc 33720

aaaaggggca gagagctgga agggannntt aattaannnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 33780

nnnnnnnnnn nnncggcgca ttaagcgcgc gggtgtggtg gttacgcgca gcgtgaccgc 33840

tacacttgcc agcgccctag cgcccgctcc tttcgctttc ttcccttcct ttctcgccac 33900

gttcgccggc tttccccgtc aagctctaaa tcgggggctc cctttagggt tccgatttag 33960

agctttacgg cacctcgacc gcaaaaaact tgatttgggt gatggttcac gtagtgggcc 34020

atcgccctga tagacggttt ttcgcccttt gacgttggag tccacgttct ttaatagtgg 34080

actcttgttc caaactggaa caacactcaa ccctatcgcg gtctattctt ttgatttata 34140

agggatgttg ccgatttcgg cctattggtt aaaaaatgag ctgatttaac aaaaatttta 34200

acaaaattca gaagaactcg tcaagaaggc gatagaaggc gatgcgctgc gaatcgggag 34260

cggcgatacc gtaaagcacg aggaagcggt cagcccattc gccgccaagc tcttcagcaa 34320

tatcacgggt agccaacgct atgtcctgat agcggtccgc cacacccagc cggccacagt 34380

cgatgaatcc agaaaagcgg ccattttcca ccatgatatt cggcaagcag gcatcgccat 34440

gggtcacgac gagatcctcg ccgtcgggca tgctcgcctt gagcctggcg aacagttcgg 34500

ctggcgcgag cccctgatgc tcttcgtcca gatcatcctg atcgacaaga ccggcttcca 34560

tccgagtacg tgctcgctcg atgcgatgtt tcgcttggtg gtcgaatggg caggtagccg 34620

gatcaagcgt atgcagccgc cgcattgcat cagccatgat ggatactttc tcggcaggag 34680

caaggtgaga tgacaggaga tcctgccccg gcacttcgcc caatagcagc cagtcccttc 34740

ccgcttcagt gacaacgtcg agcacagctg cgcaaggaac gcccgtcgtg gccagccacg 34800

atagccgcgc tgcctcgtct tgcagttcat tcagggcacc ggacaggtcg gtcttgacaa 34860

aaagaaccgg gcgcccctgc gctgacagcc ggaacacggc ggcatcagag cagccgattg 34920

tctgttgtgc ccagtcatag ccgaatagcc tctccaccca agcggccgga gaacctgcgt 34980

gcaatccatc ttgttcaatc atgcgaaacg atcctcatcc tgtctcttga tcagagcttg 35040

atcccctgcg ccatcagatc cttggcggcg agaaagccat ccagtttact ttgcagggct 35100

tcccaacctt accagagggc gccccagctg gcaattccgg ttcgcttgct gtccataaaa 35160

ccgcccagtc tagctatcgc catgtaagcc cactgcaagc tacctgcttt ctctttgcgc 35220

ttgcgttttc ccttgtccag atagcccagt agctgacatt catccggggt cagcaccgtt 35280

tctgcggact ggctttctac gtgaaaagga tctaggtgaa gatccttttt nnnnnncaac 35340

aacgttgcgc aaactattaa ctggcgaact acttactcta gcttcccggc aacaattaat 35400

agactggatg gaggcggata aagttgcagg accacttctg cgctcggccc ttccggctgg 35460

ctggtttatt gctgataaat ctggagccgg tgagcgtggg tctcgcggta tcattgcagc 35520

actggggcca gatggtaagc cctcccgtat cgtagttatc tacacgacgg ggagtcaggc 35580

aactatggat gaacgaaata gacagatcgc tgagataggt gcctcactga ttaagcattg 35640

gtaactgtca gaccaagttt actcatatat actttagatt gatttaaaac ttcattttta 35700

atttaaaagg atctaggtga agatcctttt tgataatctc atgaccaaaa tcccttaacg 35760

tgagttttcg ttccactgag cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat cttcttgaga 35820

tccttttttt ctgcgcgtaa tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc taccagcggt 35880

ggtttgtttg ccggatcaag agctaccaac tctttttccg aaggtaactg gcttcagcag 35940

agcgcagata ccaaatactg tccttctagt gtagccgtag ttaggccacc acttcaagaa 36000

ctctgtagca ccgcctacat acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg ctgctgccag 36060

tggcgataag tcgtgtctta ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg ataaggcgca 36120

gcggtcgggc tgaacggggg gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa cgacctacac 36180

cgaactgaga tacctacagc gtgagcattg agaaagcgcc acgcttcccg aagggagaaa 36240

ggcggacagg tatccggtaa gcggcagggt cggaacagga gagcgcacga gggagcttcc 36300

agggggaaac gcctggtatc tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct gacttgagcg 36360

tcgatttttg tgatgctcgt caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca gcaacgcggc 36420

ctttttacgg ttcctggcct tttgctggcc ttttgctcac atgttctttc ctgcgttatc 36480

ccctgattct gtggataacc gtattaccgc ctttgagtga gctgataccg ctcgccgcag 36540

ccgaacgacc gagcgcagcg agtcagtgag cgaggaagcg gaagagcgcc tgatgcggta 36600

ttttctcctt acgcatctgt gcggtatttc acaccgcata tggtgcactc tcagtacaat 36660

ctgctctgat gccgcatagt taagccagta tacactccgc tatcgctacg tgactgggtc 36720

atggctgcgc cccgacaccc gccaacaccc gctgacgcgc cctgacgggc ttgtctgctc 36780

ccggcatccg cttacagaca agctgtgacc gtctccggga gctgcatgtg tcagaggttt 36840

tcaccgtcat caccgaaacg cgcgaggcag ctgcggtaaa gctcatcagc gtggtcgtga 36900

agcgattcac agatgtctgc ctgttcatcc gcgtccagct cgttgagttt ctccagaagc 36960

gttaatgtct ggcttctgat aaagcgggcc atgttaaggg cggttttttc ctgtttggtc 37020

acttgatgcc tccgtgtaag ggggaatttc tgttcatggg ggtaatgata ccgatgaaac 37080

gagagaggat gctcacgata cgggttactg atgatgaaca tgcccggtta ctggaacgtt 37140

gtgagggtaa acaactggcg gtatggatgc ggcgggacca gagaaaaatc actcagggtc 37200

aatgccagcg cttcgttaat acagatgtag gtgttccaca gggtagccag cagcatcctg 37260

cgatgcagat ccggaacata atggtgcagg gcgctgactt ccgcgtttcc agactttacg 37320

aaacacggaa accgaagacc attcatgttg ttgctcaggt cgcagacgtt ttgcagcagc 37380

agtcgcttca cgttcgctcg cgtatcggtg attcattctg ctaaccagta aggcaacccc 37440

gccagcctag ccgggtcctc aacgacagga gcacgatcat gcgcacccgt ggccaggacc 37500

caacgctgcc cgagatgcgc cgcgtgcggc tgctggagat ggcggacgcg atggatatgt 37560

tctgccaagg gttggtttgc gcattcacag ttctccgcaa gaattgattg gctccaattc 37620

ttggagtggt gaatccgtta gcgaggtgcc gccggcttcc attcaggtcg aggtggcccg 37680

gctccatgca ccgcgacgca acgcggggag gcagacaagg tatagggcgg cgcctacaat 37740

ccatgccaac ccgttccatg tgctcgccga ggcggcataa atcgccgtga cgatcagcgg 37800

tccagtgatc gaagttaggc tggtaagagc cgcgagcgat ccttgaagct gtccctgatg 37860

gtcgtcatct acctgcctgg acagcatggc ctgcaacgcg ggcatcccga tgccgccgga 37920

agcgagaaga atcataatgg ggaaggccat ccagcctcgc gtcgcgaacg ccagcaagac 37980

gtagcccagc gcgtcggccg ccatgccggc gataatggcc tgcttctcgc cgaaacgttt 38040

ggtggcggga ccagtgacga aggcttgagc gagggcgtgc aagattccga ataccgcaag 38100

cgacaggccg atcatcgtcg cgctccagcg aaagcggtcc tcgccgaaaa tgacccagag 38160

cgctgccggc acctgtccta cgagttgcat gataaagaag acagtcataa gtgcggcgac 38220

gatagtcatg ccccgcgccc accggaagga gctgactggg ttgaaggctc tcaagggcat 38280

cggtcgagga caggnnngga tcctta                                      38306

<210>6

<211>40

<212>DNA

<213>人

<400>6

gcggggggta ccaccatggc tgccatctct acttccatcc                      40

<210>7

<211>60

<212>DNA

<213>人

<400>7

gcggggctcg agtcacttgt cgtcgtcgtc cttatagtca accacagagt gatcattgct  60

<210>8

<211>1095

<212>DNA

<213>人

<400>8

atggctgcca tctctacttc catccctgta atttcacagc cccagttcac agccatgaat 60

gaaccacagt gcttctacaa cgagtccatt gccttctttt ataaccgaag tggaaagcat 120

cttgccacag aatggaacac agtcagcaag ctggtgatgg gacttggaat cactgtttgt 180

atcttcatca tgttggccaa cctattggtc atggtggcaa tctatgtcaa ccgccgcttc 240

cattttccta tttattacct aatggctaat ctggctgctg cagacttctt tgctgggttg 300

gcctacttct atctcatgtt caacacagga cccaatactc ggagactgac tgtcagcaca 360

tggctccttc gtcagggcct cattgacacc agcctgacgg catctgtggc caacttactg 420

gctattgcaa tcgagaggca cattacggtt ttccgcatgc agctccacac acggatgagc 480

aaccggcggg tagtggtggt cattgtggtc atctggacta tggccatcgt tatgggtgct 540

atacccagtg tgggctggaa ctgtatctgt gatattgaaa attgttccaa catggcaccc 600

ctctacagtg actcttactt agtcttctgg gccattttca acttggtgac ctttgtggta 660

atggtggttc tctatgctca catctttggc tatgttcgcc agaggactat gagaatgtct 720

cggcatagtt ctggaccccg gcggaatcgg gataccatga tgagtcttct gaagactgtg 780

gtcattgtgc ttggggcctt tatcatctgc tggactcctg gattggtttt gttacttcta 840

gacgtgtgct gtccacagtg cgacgtgctg gcctatgaga aattcttcct tctccttgct 900

gaattcaact ctgccatgaa ccccatcatt tactcctacc gcgacaaaga aatgagcgcc 960

acctttaggc agatcctctg ctgccagcgc agtgagaacc ccaccggccc cacagaaggc 1020

tcagaccgct cggcttcctc cctcaaccac accatcttgg ctggagttca cagcaatgac 1080

cactctgtgg tttag                                                  1095

Claims (19)

1.哺乳动物心肌细胞，该细胞含有用于同时表达G蛋白偶联受体EDG2和GFP的腺病毒载体序列。

2.如权利要求1的哺乳动物心肌细胞，其中腺病毒载体序列由E1/E3缺陷的重组腺病毒组成，该重组腺病毒在两个独立启动子的控制下表达G蛋白偶联受体EDG2和GFP。

3.如权利要求2的哺乳动物心肌细胞，其中两个独立的启动子为两个CMV启动子

4.如权利要求1至3中之一的哺乳动物心肌细胞，该细胞含有G蛋白偶联受体EDG2蛋白质和GFP蛋白质。

5.如权利要求1至4中之一的哺乳动物心肌细胞，其中的哺乳动物为兔、小鼠或大鼠。

6.制备如权利要求1至5中之一的心肌细胞的方法，其中

a]通过兽医手术技术摘出哺乳动物心脏，

b]灌注并使用胶原酶消化心脏，

c]使用由重组E1/E3缺陷腺病毒组成的腺病毒载体感染分离的心肌细胞，该重组E1/E3缺陷腺病毒在两个独立启动子的控制下表达G蛋白偶联受体EDG2和GFP。

7.具有含腺病毒载体的心肌的哺乳动物，其中腺病毒载体用于同时表达G蛋白偶联受体EDG2和GFP。

8.如权利要求7的哺乳动物，其中腺病毒载体序列由重组E1/E3缺陷腺病毒组成，该重组E1/E3缺陷腺病毒在两个独立启动子的控制下表达G蛋白偶联受体EDG2和GFP。

9.如权利要求8的哺乳动物，其中两个独立的启动子为两个CMV启动子。

10.如权利要求7至9中之一的哺乳动物，其心肌含有G蛋白偶联受体EDG2蛋白质和GFP蛋白质。

11.如权利要求7至10中之一的哺乳动物，其为兔、小鼠或大鼠。

12.制备如权利要求7至11中之一的哺乳动物的方法，其中

a]提供用于同时表达G蛋白偶联受体EDG2和GFP的腺病毒载体序列，

b]提供哺乳动物，

c]使用导管将来自a]的腺病毒载体序列转移到来自b]的哺乳动物心肌中。

13.权利要求的哺乳动物在制备权利要求1至6之一的心肌细胞中的用途，其中所述心肌细胞用于权利要求14和15的实施。

14.鉴定修饰G蛋白偶联受体EDG2活性的化合物的方法，其中

a]提供来自心肌的、表达受体EDG2或包含受体EDG2的融合蛋白的转化细胞，

b]可能地，使用异丙肾上腺素和/或溶血磷脂酸对来自a]的细胞进行处理，

c]提供化学化合物，

d]将来自a]或b]的细胞与来自c]的化学化合物接触，

e]测定来自d]的细胞的收缩性，并将其与和来自a]的细胞具有相同特征、但是未与来自c]的化学化合物接触的细胞的收缩性进行比较，其中，对于根据d]与化学化合物接触的细胞而言，由此化合物造成的收缩性的相对增加或减少，说明这类化合物修饰受体EDG2活性的能力。

15.鉴定修饰G蛋白偶联受体EDG2活性的化合物的方法，其中

a]提供来自心肌的、表达受体EDG2或包含受体EDG2的融合蛋白的转化细胞，

b]可能地，使用异丙肾上腺素和/或溶血磷脂酸对来自a]的细胞进行处理，

c]提供化学化合物，

d]将来自a]或b]的细胞与来自c]的化学化合物接触，

e]测定来自d]的细胞的收缩性，并将其与和来自a]的细胞为相同细胞类型、但是不表达受体EDG2或包含受体EDG2的融合蛋白的细胞的收缩性进行比较，其中，对于表达受体EDG2或包含受体EDG2的融合蛋白的细胞，由此化合物造成的收缩性的相对增加或减少，说明该化合物修饰受体EDG2活性的能力。

16.重组腺病毒载体，其由选自下组的一种多核苷酸组成：

a]具有SEQ ID NO.5中所示序列的多核苷酸，

b]与SEQ ID NO.5的多核苷酸具有95％一致性的多核苷酸，

c]长度至少与SEQ ID NO.5的多核苷酸的长度相同并可以在施以高严紧性杂交条件时与SEQ ID NO.5的多核苷酸杂交的多核苷酸。

17.如权利要求16的重组腺病毒载体，该载体包含编码SEQ ID NO.2的蛋白质的多核苷酸序列。

18.权利要求16或17的腺病毒载体在构建转基因哺乳动物中的用途，其中，G蛋白偶联受体EDG2在至少一个组织中瞬时或持久表达。

19.权利要求18的腺病毒载体的用途，其中组织为心脏的部分。

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