KR20050086524A - 심부전증의 동물 모델에서 ｅｄｇ2 수용체의 용도 - Google Patents

심부전증의 동물 모델에서 ｅｄｇ2 수용체의 용도 Download PDF

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괴츠 뮌흐
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아벤티스 파마 도이칠란트 게엠베하
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Abstract

본 발명은 심부전용 동물 모델로서 유용한 일시적으로 형질전환된 포유동물에 관한 것이다.

Description

심부전증의 동물 모델에서 ＥＤＧ2 수용체의 용도{Use of EDG2 receptor in an animal model of heart failure}
도 1:
기능상실 심장으로 부터 분리한 단일 심근세포의 수축 진폭. 심근세포를 생체외에서 Ad-GFP 또는 Ad-EDG2-GFP로 감염시켰다. 10μM의 LPA로 예비자극한 후, 이소프로테레놀의 농도를 증가시킴에 따라 분획 단축(FS: fractional shortening)을 측정하였다. 데이터는 평균 ±SEM을 나타낸다.
도 2:
기능상실 심장으로 부터 분리한 단일 심근세포의 수축 진폭. 도 1에 도시된 실험과 유사하게, 시험관내에서 Ad-GFP 또는 Ad-EDG2-GFP로 유전자 전달한 후 심근세포내에서 FS를 비교하였다. 10μM의 이소프로테레놀로 예비자극한 후, LPA의 농도를 증가시킴에 따라 분획 단축을 측정하였다. 데이터는 평균 ±SEM을 나타낸다.
도 3:
급속 조율로 인한 말기 심부전증을 가진 토끼에서, GFP 또는 EDG2의 유전자 전달한지 2주 후, 팁 카테터삽입(tip catheterization)에 의해 측정된, 기저선에서 및 LPA의 용량을 증가시킴에 따른 좌심실 압력 (LV dp/dt max)의 최대 1차 도함수. 데이터는 평균 ±SEM을 나타낸다. 모든 측정은 8마리의 동물에서 삼중으로 수행하였다(*p < 0.05 vs GFP).
도 4:
급속 조율로 인한 말기 심부전증을 가진 토끼에서, GFP 또는 EDG2의 유전자 전달한지 2주 후, 팁 카테터삽입에 의해 측정된, 기저선에서 및 LPA의 용량을 증가시킴에 따른 좌심실 수축 압력. 데이터는 평균 ±SEM을 나타낸다. 모든 측정은 8마리의 동물에서 삼중으로 수행하였다(*p < 0.05 vs GFP).
아래의 실시예는 본 발명을 이들 실시예의 범위로 제한하지 않으면서 본 발명을 기술한다.
실험 동물의 설명
본 연구를 위해 사용된 동물은 10주령의 암컷 뉴질랜드산 백색 토끼[공급처: Asamhof, Kissing (Germany)]이다. 본 연구의 출발 시에, 당해 동물의 체중은 2.7 내지 3.3 kg이였다.
실험 동물의 사육 및 수용 조건
새끼를 30일째에 이유시킨다. 이유 스트레스를 최소화하기 위하여, 한배 새끼들이 처음에는 서로 함께 있도록 하며, 어미로 부터 새끼를 분리한다. 약 10 내지 14일 후에, 새끼를 평탄화 우리(l x b x h = 28.5 x 60 x 34 cm) 속에 짝을 지워 수용한 다음, 약 2 주 후에, 이들을 홀로 수용한다. 평탄화기(flattener)을 도입하여 "올인-올아웃트(All in-All out)" 시스템에 따라 제거하여 청소 및 소독을 용이하게 한다.
사료를 가내 농업 장비로 제조하고, 음료수와 함께 토끼가 마음대로 이용할 수 있도록 한다.
기후: 환기 속도는 여름에는 10,000m3/h이고 겨울에는 3000m3/h 이다. 외풍을 피하기 위하여 특히 주의한다. 추운 날씨에서도, 온도는 약 15℃를 유지하고; 여름에는 동물 하우스의 과열을 가능한 한 방지한다. 어린 새끼는 약 19℃에 둔다. 동물 하우스 내의 암모니아는 30ppm 이하로 유지하고, 상대 습도는 70% 이하로 유지한다. 사육 동물에게 16시간 동안 약 20 lux 광도의 조명을 비춘다.
연구 동물 수용
토끼를 공기-조절된 운송 수단을 이용해 회사로 직접 운반하여, 이들이 새로운 음식과 환경에 순응할 수 있도록 2 내지 3일 간의 적응 기간을 둔다.
토끼를 통상의 우리 속에 보관한다. 우리 재질은 PVC 삽입물이 있는 스테인레스 강으로 이루어지며, 우리 바닥은 면적이 4040 cm2이고, 천공된 바닥판의 형태를 가진다. 변 받이를 매일 청소하고, 우리를 매주 씻어내고 고온-공기-멸균시킨다. 이들을 18 내지 21℃의 실온 및 55±5%의 상대 습도의 일정한 조건하에서 둔다. 동물 하우스에 창이 있기 때문에, 조명은 100 lux 이상의 광도를 가지며 자연의 주-야 사이클에 해당한다.
마취 및 수술 준비
본 연구의 첫 날에, 마취가 시작되기 전까지, 사료 및 물이 토끼에게 마음대로 제공된다. 이어서, 정해진 동물의 체중을 재고, 임상 조사, 특히 심혈관계 및 기도의 조사를 수행한다. 당해 동물에, 좌 우 측면의 귀바퀴 정맥 내의 내재 카테터(VenflonTM 08. x 25mm)를 통해 이중 정맥내 통로를 만들고, 이를 통해 7mg/kg 체중 i.v.의 용량의 1 % 프로포폴(propofol) (Disoprivan, Fresenius AG, Bad Homburg)로 마취를 유도한다. 안 연고 (Vitamin A Dispersa, Ciba VisionR, Grossostheim)를 마취 유도 직후 각막에 적용한다. 직립 반사의 소멸 후, 토끼를 목 및 상부관절과 마지막 늑골 사이의 가슴에서 배쪽으로 면도한 다음에, 들 숨 동안에 기관 속으로 커프를 가진 Magill 튜브 (내경 2.5 내지 3.5 mm, Rusch AG, Waiblingen)를 밀어 넣는 방법으로 삽관시킨다.
수술 동안에 마취를 유지하기 위하여, 동물에게 주입 장치(PerfusorR, ED1-300, B. Braun, Melsungen AG)를 통해 2% 프로포폴 (Disoprivan 2 %, Zeneca, Italy)을 12 내지 14ml/h의 용량으로 정맥내로 제공한다. 삽관 직후, 토끼에게 마취제로서 펜타닐(Fentanyl-Janssen 0.5 mg, Janssen-Cilag GmbH, Neuss)을 0.01 mg/kg의 용량으로 정맥내로 투여한 다음, 수술 동안에 필요한 경우에 대략 30분 마다 투여하여, 수술 관용 상태를 유지한다.
소형 동물 환기 장치(Anesthesia Workstation, Hallowell EMC, Voler GmbH, Kaltenkirchen)를 사용하여, 토끼에게 약 10mmHg의 호흡압, 8 내지 12ml/kg(체중)의 호흡 용적, 및 분당 29 내지 32 호흡의 호흡 속도의 100% 산소를 공급하며, 배출 공기중 약 35 mmHg의 CO2 부분압을 제공한다. 심혈관 기능을 ECG (Medtronie, 9790 Programmer, Vitatron Medical B. V. , Dieren, Netherlands)을 통해 수술중에 모니터한다. 호흡 및 순환을 맥박 산소측정 및 호기말이산화탄소분압측정기(capnometry)로 모니터한다.
대동맥 교차 클램핑
우측 온목동맥을 준비한다. 폴리우레탄 카테터 (CavafixR;, 1.1* 1.7 mm/16G, ref. 4173589, B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany)를 당해 동맥에 도입한다. 우측 온목동맥의 삽관 후, 제3 늑간 공간을 통하여 흉부를 개방시킨다. 당해 바이러스를 SigscreenR 방법을 사용하여 심근 속에 도입하고, 주입된 벡터가 특정 위치에 보유되도록 한다. 이어서, 흉곽을 결찰실(NylonR, 2-0 USP)로 봉하고, 봉합한다(VicrylR (3-0) 및 NylonR (3-0)).
진통: 수술 후 72 시간 동안, 당해 동물에게 카프로펜(RimadylR, Pfizer, 12시간 마다 4 mg/kg) 및 부프레노르핀(TemgesicR, Boehringer, 12 시간 마다 0.01 mg/kg)을 투여한다.
동물의 안락사
본 연구의 최종일에, 당해 동물을 섹션 4에 기술된 바와 같이 전신 마취시킨다. 펜토바르비탈 0.48g/kg i.v.(NarcorenR;, Rhone-Merieux GmbH, Laupheim)에 의해 유도된 깊은 마취 상태에서 안락사를 수행한다.
사후 거시적 병리진단 및 샘플채취
사망 직후, 흉부 벽을 늑골 가장자리 수준에서 양측으로 갈라놓고 흉골을 완전히 탈구시켜, 가능한 한 신속하게 심장을 제거한다. 심장을 구심성 혈관 및 원심성 혈관으로 부터 분리하고, 5000 IU 헤파린을 함유하는 차가운 멸균 염수(등장성 염화나트륨 용액, Delta-Pharm, Boehringer,Ingelheim)로 혈액을 씻어낸다. 전체적인 병리 검사 및 칭량 후, 심장을 추가 조사를 위하여 온전하게 보존한다. 단일-세포 분리를 위한 심장을, 즉각적인 처리 전까지, 헤파린처리된 약 4℃의 냉 염수의 멸균 튜브 속에 잠시 보관한다. GFP 형광의 측정을 위하여, 동결된 절편을 준비한다. 세포 현미경검사할 목적으로 새로이 제거된 심장을 염수로 유사하게 세척하고, 셀룰로스로 건조시킨 다음에, 액체 질소(-196℃)의 시험 튜브 속에서 철저히 동결시키고, 추가 처리까지 -80℃에서 보관한다. 당해 동물을, 전형적인 심부전증 증상(복수, 흉막삼출액, 심장 중량, 심장 모양, 간 울혈 및 간 중량) 정도의 평가에 대해 특별히 주의를 기울이며, 수의학회 지침에 따라 검사한다.
사체의 폐기
-20℃의 완전히-냉동된 캐비넷에 수집한 후, 사체를 사체 폐기반에 넘긴다.
재조합 아데노바이러스의 작제 및 정제
사람 EDG2 수용체를 사람 EDG2 수용체의 암호 서열을 기초로 하여 PCR-이용 기법을 사용하여 클로닝하였다. 이 수용체를 위한 재조합체 (E1/E3-결함) 플래그(flag)-태그된(tagged) 아데노바이러스(Ad-EDG2-GFP)를 제조하였으며, 이는 전이유전자 및 녹색 형광 단백질(GFP)을 두 개의 독립적 CMV 프로모터 하에서 발현한다. 대조군으로서, 추가의 전이유전자가 부존재하는 Ad-GFP를 사용하였다. 거대 바이러스 스톡을 제조하고, 아데노바이러스 역가를 비 E1-발현 세포에서 GFP 발현 역가측정 및 플라크 역가측정을 이용하여 측정하였다.
EDG2의 클로닝
EDG2 수용체의 DNA를, 정방향 프라이머 5'-gcggggggtaccaccatggctgccatctctacttccatcc-3' (서열번호 5) 및 역방향 프라이머 5'-gcggggctcgagtcacttgtcgtcgtcgtccttatagtcaaccacagagtgatcattgct-3' (서열번호 6)을 사용하여 PCR로 사람 뇌 기원의 cDNA로 부터 증폭시켰다.
PCR 반응을, Expand High Fidelity PCR 시스템(Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany)을 사용하여, 20 사이클에 걸쳐 1 분간의 58℃ 어닐링 및 1 분간의 72℃의 증폭 온도에서 수행하였다. PCR 반응에서, 사람 A형 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌으로 부터의 9개 아미노산의 HA-태그 에피토프가 유전자의 3'-말단에 프레임과 일치되게 생성되었다.
PCR 단편을, Kpnl 및 Xhol에 대한 제한 부위를 사용하여, 플라스미드 pAd-Shuttle (Q Biogene, Heidelberg, Germany) 속에 클로닝시키고, 생성된 pAd Track-CMV-EDG2의 서열을 서열분석 (MediGenomix, Martinsried, Germany)으로 확인하였다.
서열번호 1은 3'-말단의 30개 뉴클레오티드 내의 HA-태그의 암호 영역을 포함하는 EDG2의 폴리뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
서열번호 2는 C-말단의 9개 아미노산 HA-태그를 포함하는 EDG2의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열번호 8에서, 5'-Hindlll 및 3'Xhol 부위를 보유하는 EDG2의 폴리뉴클레오티드 서열이 제시된다. 이러한 EDG2 유전자를 pcDNA 3.1 (invitrogen)의 Hindlll/Xbal 부위로 클로닝시켰다. 이러한 벡터 작제물은 EDG2 유전자를 증폭시키는데 적합하다.
재조합체 플래그-태그된 아데노바이러스의 작제(pAD easy 1-EDG2-HA-GFP)
플라스미드 pADTrack CMV-EDG2 c-HA를 Pmel (New England Biolabs, Beverly, MA)으로 밤새 선형화시키고, 탈인산화시키고, 정제하였다(GFX DNA 및 Ge1 정제 키트; Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden). 상동 재조합의 경우에, 전기 적격(electro competent) 이.콜라이 BJ5183 (Stratagene, La Jolla, California)를, 2500V, 200W 및 25μFD(E.coli-pulser; Biorad, Heidelberg, Germany)에서 1㎍의 선형화된 플라스미드 pADTrack CMV EDG2 c-HA 및 0.1㎍의 pAdeasyl로 공동-형질전환시키고, 플레이팅하고, 37℃에서 밤새 항온배양하였다. 생성된 벡터, pAdEasyl-edg2-cHA-GFP는 형질감염용 재조합 아데노바이러스 DNA 전체를 함유하였다. 전체 DNA 서열은 서열번호 5에 제시된다.
Pacl로 플라스미드 DNA를 소량추출(minipreparation)한 후, 클로니를 확인하여, 양성 클론을 이.콜라이 DH5α속에 재형질전환시킨다.
293 세포의 형질감염(Effectene Transfection reagent; Qiagen, Hilden, Germany)의 경우에, 플라스미드 DNA를 Pacl로 분해하였다. 당해 세포를 7일 동안 배양하고, 스크래핑에 의해 수거하고, 원심분리하였다. 펠렛을 Dulbecco PBS에 재현탁시키고, 세포를 동결(-80℃) 및 해동(37℃) 사이클을 4회 반복하여 용해시켰다. 세포 부산물을 원심분리로 제거하고, 용해물을 -80℃에서 보관하였다. 재조합 바이러스의 플라크 선별의 경우에, 293 세포를, 실온의 Dulbecco PBS 중에서 1 시간 동안 부드러운 교반하에, 형질감염으로 부터의 용해물의 상이한 연속 희석물로 감염시켰다. 감염 후, 세포를 0.5 % 아가로스 (물 1% 중에 20 % 혈청, 2x 페니실린/스트렙토마이신, 2x L-글루타민 및 아가로스가 보충된 개질된 Eagles 배지(2x)(Gibco Life technologies #21935)의 1:1 혼합물, Seacam)을 함유하는 성장 배지로 피복하였다. 감염 후 5 내지 14일째에, 세포 층을 플라크 형성에 대해 모니터하여, 플라크를 파스퇴르 피펫으로 집어내어, 0.5 ml Dulbeccos PBS 중에 재현탁시키고, -80℃에서 보관하였다. 당해 플라크를 293 세포에 대한 추가 증폭 단계를 위해 사용하였다.
심부전증의 모델
뉴질랜드산 백색 토끼를, 박동조율기 이식 후, 360 박동/분의 급속 조율로 처리하였다. 이러한 프로토콜하에, 빈맥-유도된 심부전증(HF)이 2주에 걸쳐 반복적으로 나타난다. 기능상실 심장에서의 평균 +dp/dtmax-값은 2200±320 mmHg/sec (vs. 건강한 대조군에서 320±390 mmHg/sec; p < 0.05)이였고, LVEDP는 3.6±0.4 mmHg으로 부터 13±3.4로 증가하였다(p < 0.05).
토끼 심근으로의 아데노바이러스 유전자의 전달
급속 조율 시작 전에, 모든 토끼의 심근에 카테터를 이용하여 아데노바이러스 유전자를 전달한다(4x1010 pfu). 본 발명의 경우에, 토끼를 펜타닐 및 프로포폴로 마취시켰다. 유전자 전달의 효능을, 실험 종료 후 모든 심장에서 형광 현미경으로 횡단 동결-절단 분할부를 GFP의 발현에 대해 조사하여 평가하였다. 4% 파라포름알데히드로 고정시킨 후, 형태 변화를 평가하였다. 유전자 전달은, 심근세포의 약 50%에서 재현가능한 전이유전자 발현을 유도하였다.
분리된 심근세포에서 단축 측정
감염된 심근세포의 수축성을, 단축 및 이완의 진폭 및 속도의 온라인 디지탈화 평가에 연결된 전자광학적 모니터 시스템으로 측정하였다. 전이유전자-양성 심근세포를 형광하에 GFP의 공동-발현으로 확인하였다. 수축 진폭이 안정단계에 도달한 후, 리소포스파티드산의 일정한 농도(LPA; 10-5mol/l)에 이소프로테레놀의 농도 증가시키거나; 이소프로테레놀의 일정한 농도(10-8mol/l)에 LPA의 농도를 증가시켰다.
단일 세포 수축
심근세포 수축성에 대한 EDG2의 효과를 조사하기 위하여, 생체외 유전자 전달 후 기능상실 심장으로 부터 분리된 단일 심근세포의 분획 단축 및 단축 속도를 측정하였다. 기저 수축을 변화시키지 않는 10-5mol/l의 리소포스파티드산(LPA) 농도에서, 이소프로테레놀의 농도 증가는 EDG2-과발현 심근세포에서 현저하게 낮은 포지티브 수축 효과를 가져왔다(도 1). 저 농도의 이소프로테레놀(10-8mol/l)을 사용한 예비자극 후, LPA 농도의 증가는 EDG2-과발현 심근세포에서 현저한 네가티브 수축 효과를 보여준 반면에, 대조군 GFP 그룹에서는 어떠한 효과도 관찰되지 않았다(도 2). 이소프로테레놀을 사용한 예비자극의 부존시에는, LPA는 심근세포의 수축성에 어떠한 효과도 나타내지 않는다.
감염된 심근세포의 웨스턴 블롯
심근세포를, 아데노바이러스 감염 48 시간 후에 수거하였다. 당해 세포를 균질화시키고, 이어서 세포질 추출물을, HA 태그 또는 EDG2에 대한 항체를 이용한 웨스턴 블롯팅에 사용하였다. 서양고추냉이 퍼옥시다제-결합된 염소 항-토끼 항체(공급처: Dianova, Germany)를 제2 항체로서 사용하였다.
기능상실 심장으로의 전이유전자의 생체내 아데노바이러스 전달
모든 전이유전자가 GFP와 함께 발현되기 때문에, 모든 전이유전자의 과발현을, 생체내 유전자 전달 후, 심장에서 GFP의 공동-발현을 연구하는 방법으로 조사하였다. Ad-EDG 2-GFP로 감염된 토끼 심장의 육안상의 절편은, 항-GFP 항체 염색으로 측정하였을 때, 좌심실 전반에서 일어난 GFP 공동발현을 보여주었다.
웨스턴 블롯팅에 의해 평가된 전이유전자 발현
웨스턴 블롯팅은, HA 태그에 대해 유도된 항체 또는 EDG2에 대해 유도된 특정 항체를 이용하여 심근세포에서의 EDG2의 발현을 입증하였다.
성체 심실의 심근세포의 제조 및 배양 및 아데노바이러스 감염
단일 칼슘-관용 심실 심근세포를 백색 뉴질랜드산 토끼의 기능상실 심장으로 부터 분리하였다. 요약하면, 심장을 콜라겐아제로 관류하여 분해시켰다. 분리된 심근세포를, 라미닌-예비피복된 디쉬 상의 개질된 M199 (5-10㎍/cm2) 중에서 cm2당 1.5x105개 세포의 밀도로 배양(5% CO2 및 37℃)하였다. 수축 실험을 위하여, 플레이팅한지 5 시간 후에 당해 세포를 아데노바이러스로 감염시켰다(감염 다중도(moi) 1 pfu/세포). 감염된 심근세포의 50 내지 60%는 이 역가에서 전이유전자를 발현하였다.
심장초음파검사 및 심실내 팁 카테터에 의한 심근 수축성 측정
좌심실 수축성을, 급속 조율 개시 전, 조율 개시 1 주일 후 및 조율 개시 2 주일 후에, 심장초음파검사로 조사하였다. 팁 카테터 측정을 조율 2 주후 수행하였다. 당해 토끼를 마취시켰으며; 계속적으로 ECG로 모니터하였다.
심장초음파검사를 위해, 7.5 MHz 프로브를 삼각대 위해 고정시켰다. 적절히 재현가능한 표준 절편을 기록하였다. 팁 카테터 측정을 위하여, 식별 장치에 연결된 Millar 3F 팁 카테터를, 목동맥에 넣은 집(sheath)을 통해 좌심실에 넣었다. 기저 수축 및 좌심실 압력을 정한 후, 200μL의 NaCl (0.9 %)를 음성 대조군으로서 주사하였다. 이소프로테레놀 및 리소포스파티드산(LPA)를 용량을 증가시키면서 정맥내로 주입하였다. 20 분의 평형 기간 후, 팁 카테터 측정을 수행하였다.
조율-유도된 심부전증에서 LV 기능장애의 악화
도 3은, 심각한 심부전증(NYHA IV)을 앓고 있는 토끼에서 2주의 급속 조율 후의 팁 카테터삽입을 도시한다. EDG2-발현 그룹에서, LV 압력(dp/dt max)의 1차 도함수는, 기저 상태 및 LPA의 용량 증가시에 Ad-GFP-감염된 대조군 그룹에서 보다 현저히 낮았다. 이는 또한 수축 LV 압력에 대해서도 마찬가지다 (도 4).
심장초음파검사는 EDG2-과발현 심장에서 2주 후 심근의 현저한 비대를 보여주는데, 이는 또한 수축 및 확장 직경의 감소에 의해서도 입증된다. LV의 후방벽 및 중격의 평균 두께는 GFP 대조군에 비해 EDG2-과발현 심장에서 현저히 두껍다. LV 분획 단축(FS)의 추이는 2주간의 관찰 기간 동안에 연속적 심장초음파검사에 의해 평가되었다. 두 그룹 모두에서, FS는 급속 조율 기간 동안에 점차로 감소하였다.
본 발명은 심부전증의 동물 모델로서 유용한 일시적으로 형질전환된 포유동물에 관한 것이다.
G 단백질-결합 수용체(GPCR)은 다수의 생리학적 과정에서 중추적인 역할을 한다. 사람 게놈에서 약 1000개의 유전자들이 이 수용체 계열을 암호화하는 것으로 추정된다. 현재 처방되고 있는 약제의 약 60%가 GPCR 효능제 또는 길항제로서 작용한다. 이는 약제 연구 업계에서 상기 수용체 부류의 중요성을 강조하는 것이다. 상기 단백질 계열의 규모 및 중요성 때문에, 그리고, 생리학적 리간드가 다수의 GPCR (고아(orphan) GPCR)에 대해 여전히 알려지지 않은 사실을 고려할 때, 상기 수용체 부류가 장래에 신규한 의약 물질의 연구에서 적합한 표적 단백질을 위한 가장 중요한 보고 중의 하나일 것으로 생각될 수 있다.
GPCR은 세포 표면에 위치하는 통합(integral) 막 단백질 계열이다. 이는 세포외 신호전달 물질(예: 호르몬, 신경전달물질, 펩티드, 지질)로 부터 신호를 수용하고, 이들 신호를 구아닌 뉴클레오티드-결합 단백질, "G-단백질" 계열을 통하여 세포 내부로 전달한다. 수용체 특이성, 활성화된 G 단백질 및 세포 유형에 따라, 이들 수용체는 다양한 신호 전달 경로를 유도한다.
모든 GPCR 폴리펩티드 쇄가 7개의 α-나선으로 접혀서, 세포막의 인지질 이중층을 통해 걸쳐있다. 7회의 막 통과에 의해 세포외 및 세포내 루프가 형성되어, 세포외 리간드 결합 및 G 단백질의 세포내 결합이 가능해진다. 이러한 이유로, GPCR은 또한 7회 통과 막관통 수용체로 표시된다.
모든 G 단백질-결합 수용체는 공통의 기본 패턴에 따라 작용한다: 세포외 리간드의 결합은 당해 수용체의 입체형태 변화를 초래하여, 당해 수용체 단백질이 G 단백질에 접촉할 수 있도록 한다. 세포 내에서 G 단백질-매개된 신호 전달 연쇄증폭은 최종적으로 세포의 생물학적 반응을 초래한다. G 단백질은 아단위 α, β 및 γ로 이루어진 이종삼량체 단백질이다. 이는 지질 앵커를 통해 세포막의 내부에 위치한다. 활성화된 GPCR이 G 단백질에 결합되면, Gα아단위에서 GDP/GTP 변화가 유도되고, 이종삼량체 G 단백질이 α 및 βγ 아단위로 해리된다. 활성화된 α아단위 및 βγ복합체는 둘다 세포내 효과인자 단백질과 상호작용할 수 있다.
막-결합 아데닐레이트 사이클라제(AC)가 Gαs-형 G 단백질에 의해 활성화되는 경우에 세포내 cAMP 수준이 증가되거나, 또는 Gαi-형 G 단백질에 의해 활성화되는 경우에 세포내 cAMP 수준이 감소된다. Gq-형 G 단백질은 포스포리파제 C(PLC)를 활성화시키고, 이는 이노시톨 1,4,5-트리포스페이트(IP3) 및 디아실글리세롤(DAG)의 형성을 촉매화한다. 이들 분자는 세포내 저장 소기관으로 부터 Ca2+의 방출을 유도하거나 또는 단백질키나제 C (PKC)의 활성화를 유도한다.
사람 EDG2 (내피세포 분화 유전자 2)의 폴리뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열은 일반인에게 공개되었다. 당해 서열은 예를 들어 NCBI (수탁번호: NM_001401)로 부터 구할 수 있다. 당해 단백질 서열은 Swiss Prot (수탁번호: Q 92633)로 부터 구할 수 있다. 사람 폐 cDNA 라이브러리로 부터의 수용체의 클로닝은 문헌["An etal., Biochem. Biophys. Res. Commun. 24,231 (1997)"]에 공개되었다.
전체 길이 서열은, 구아닌 뉴클레오티드-결합 단백질-결합 수용체(GPCR)의 상위계열에 속하는 359개 아미노산 단백질을 암호화한다. 사람 EDG2 mRNA는 사람 조직에 광범위하게 분포되어 있으며, 뇌에 가장 풍부하다. 사람 EDG2 단백질을 발현하는 HEK293 세포는 혈장 반응 요소 수용체 유전자 분석에서 리소포스파티드산(LPA)에 대해 증가된 반응을 보여주었는데, 이는 LPA 농도에 의존적이고 LPA에 특이적이다. EDG2 단백질의 마우스 대응부도 또한 LPA에 대한 수용체로서 확인되었다.
리소포스파티드산(LPA) 및 스핀고신 1-포스페이트(S1P)은 다양한 생물학적 활성을 가진 강력한 인지질 매개인자이다. 이의 외형 및 기능 특성은 발육, 상처 치유 및 조직 재생에서 가능한 역할을 제시한다. LPA 및 S1P의 성장-자극 활성 및 기타 복잡한 생물학적 활성은 부분적으로는 다중적인 G 단백질-매개된 세포내 신호전달 경로로 인한 것일 수 있다. 여러 이종삼량체 G 단백질 뿐만 아니라, Ras- 및 Rho-의존 경로가 LPA 및 S1P에 대한 세포 반응에서 중추적인 역할을 한다.
본 발명의 범위 내에서 사용된 모든 경우에서 어떠한 예외도 없이, 포유동물은 사람 종(호모사피엔스) 또는 사람 신체 일부로서의 호모사피엔스 개체를 포함하지 않을 것이다.
본 발명은 G 단백질 결합 수용체 EDG2 및 GFP(녹색 형광성 단백질)의 동시적 발현을 위한 아데노바이러스 벡터 서열을 함유하는 포유동물의 심근세포에 관한 것이다.
바람직하게는, 아데노바이러스 벡터 서열은 G 단백질 결합 수용체 EDG2 및 GFP을 두 개의 독립적 프로모터의 조절하에 발현하는 재조합체 E1/E3 결함 아데노바이러스로 이루어진다. 이러한 프로모터는 2개의 CMV 프로모터일 수 있다.
위에서 언급된 아데노바이러스 벡터 서열을 함유하는 포유동물의 심근세포는 G 단백질 결합 수용체 EDG2 및 GFP을 발현하므로, G 단백질 결합 수용체 EDG2의 단백질 및 GFP의 단백질을 함유한다.
아데노바이러스 벡터 서열을 함유하는 심근세포는 바람직하게는 토끼, 마우스 또는 랫트의 세포이다.
또한, 본 발명은,
a) 포유동물의 심장을 기교적인 수의학 수술 기법에 의해 제거하고,
b) 당해 심장에 콜라겐아제를 관류시켜 분해시키고,
c) 분리된 심근세포에, G 단백질 결합 수용체 EDG2 및 GFP를 두 개의 독립적인 프로모터의 조절하에 발현할 수 있는 재조합체 E1/E3 결함 아데노바이러스로 이루어진 아데노바이러스 벡터를 감염시켜, G 단백질 결합 수용체 EDG2 및 GFP의 동시적 발현을 위한 아데노바이러스 벡터 서열을 함유하는 심근세포의 생산에 관한 것이다. 상기 프로모터는 바람직하게는 두 개의 CMV 프로모터이다.
또한, 본 발명은 G 단백질 결합 수용체 EDG2 및 GFP의 동시적 발현을 위한 아데노바이러스 벡터 서열을 함유하는 심근을 가진 포유동물에 관한 것이다. 포유동물의 이러한 아데노바이러스 벡터 서열은 바람직하게는 G 단백질 결합 수용체 EDG2 및 GFP을 두 개의 독립적 프로모터의 조절하에 발현할 수 있는 재조합체 E1/E3 결함 아데노바이러스로 이루어진다. 이러한 두 개의 독립적 프로모터는 바람직하게는 두 개의 CMV 프로모터이다.
또한, 본 발명은 G 단백질 결합 수용체 EDG2의 단백질 및 GFP의 단백질을 함유하는 심근을 가진 포유동물에 관한 것이다. G 단백질 결합 수용체 EDG2 및 GFP의 동시적 발현을 위한 아데노바이러스 벡터를 함유하는 심근을 가지고/가지거나 G 단백질 결합 수용체 EDG2의 단백질 및 GFP의 단백질을 함유하는 심근을 가진 상기와 같은 포유동물은 바람직하게는 토끼, 마우스 또는 랫트이다. 또한, 본 발명은,
a) G 단백질 결합 수용체 EDG2 및 GFP의 동시적 발현을 위한 아데노바이러스 벡터 서열을 준비하고,
b) 포유동물을 준비하고,
c) a)로 부터의 아데노바이러스 벡터 시스템을 카테터를 사용하여 b)로 부터의 포유동물의 심근 속에 전달시켜, G 단백질 결합 수용체 EDG2 및 GFP의 동시적 발현을 위한 아데노바이러스 벡터를 함유하는 심근을 가지고/가지거나 G 단백질 결합 수용체의 단백질 및 GFP의 단백질을 함유하는 심근을 가진 포유동물의 생산에 관한 것이다.
또한, 본 발명은, G 단백질 결합 수용체 EDG2의 활성을 변경시키는 화합물을 확인하기 위한 방법에서 사용될 수 있는 심근 세포을 생산하기 위한, G 단백질 결합 수용체 EDG2 및 GFP의 동시적 발현을 위한 아데노바이러스 벡터를 함유하는 심근을 가지고/가지거나 G 단백질 결합 수용체 EDG2의 단백질 및 GFP의 단백질을 함유하는 심근을 가진 포유동물의 용도에 관한 것이다.
본 발명은,
a) 수용체 EDG2 또는 수용체 EDG2을 포함하는 융합 단백질을 발현하는 심장 근육 기원의 형질전환된 세포를 준비하고,
b) 경우에 따라 a)로 부터의 세포를 이소프로테레놀 및/또는 리소포스파티드산으로 처리하고,
c) 화학적 화합물을 준비하고,
d) a) 또는 b)로 부터의 세포를 c)로 부터의 화학적 화합물과 접촉시키고,
e) d)로 부터의 세포의 수축성을 측정하고, a)로 부터의 세포와 동일한 특징을 가지나 c)로 부터의 화학적 화합물과 접촉시키지 않은 세포의 수축성과 비교할 때, d)에 따라 화학적 화합물과 접촉시킨 세포의 수축성의 당해 화합물에 의한 상대적 증가 또는 감소가 수용체 EDG2의 활성을 변경시키는 상기 화학적 화합물의 능력을 입증하는 것인, 수용체 EDG2의 활성을 변경시키는 화합물의 확인 방법에 관한 것이다.
본 발명은,
a) 수용체 EDG2 또는 수용체 EDG2을 포함하는 융합 단백질을 발현하는 심장 근육 기원의 형질전환된 세포를 준비하고,
b) 경우에 따라 a)로 부터의 세포를 이소프로테레놀 및/또는 리소포스파티드산으로 처리하고,
c) 화학적 화합물을 준비하고,
d) a) 또는 b)로 부터의 세포를 c)로 부터의 화학적 화합물과 접촉시키고,
e) d)로 부터의 세포의 수축성을 측정하고, a)로 부터의 세포와 동일한 세포 유형이지만 수용체 EDG2 또는 수용체 EDG2을 포함하는 융합 단백질을 발현하지 않는 세포의 수축성과 비교할 때, 수용체 EDG2 또는 수용체 EDG2를 포함하는 융합 단백질을 발현하는 세포의 수축성의 당해 화합물에 의한 상대적 증가 또는 감소가 수용체 EDG2의 활성을 변경시키는 상기 화학적 화합물의 능력을 입증하는 것인, 수용체 EDG2의 활성을 변경시키는 화합물의 확인 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 아래의 그룹의 폴리뉴클레오티드의 하나로 이루어진 아데노바이러스 벡터에 관한 것이다:
a) 서열번호 5에 특정된 서열을 가진 폴리뉴클레오티드,
b) 서열번호 5의 폴리뉴클레오티드와 95% 동일한 폴리뉴클레오티드,
c) 서열번호 5의 폴리뉴클레오티드와 길이가 적어도 동일하고, 고도로 엄격한 하이브리드화 조건에 적용될 때 서열번호 5의 폴리뉴클레오티드에 하이브리드화하는 폴리뉴클레오티드.
당해 아데노바이러스 벡터 서열은 바람직하게는 서열번호 2의 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포괄한다.
하이브리드화는, 이본쇄에 대해 상보적 서열을 갖는 두 개의 단일 폴리뉴클레오티드 쇄의 집합을 의미한다. 하이브리드화는 두 개의 DNA-쇄, 하나의 DNA-쇄, 하나의 RNA-쇄 뿐만 아니라 두 개의 RNA-쇄 사이에서 일어날 수 있다. 하이브리드 폴리뉴클레오티드 쇄의 형성은, 이본쇄 폴리뉴클레오티드 분자를 함유하는 용액을 가열하여 당해 이본쇄를 일본쇄 폴리뉴클레오티드로 분리하는 것으로 부터 시작될 수 있다. 가열 단계는 10 내지 20분 동안 수조에서의 비등으로 이루어질 수 있다. 당해 용액을 가열시킨 후 서서히 실온으로 냉각시키는 경우에, 이본쇄 분자로의 하이브리드화가 일어날 것이다. 실험 조건하에서, 하이브리드화는 통상적으로 블롯팅 또는 전기영동시 폴리뉴클레오티드가 고정되어지는 하이브리드화 필터를 사용하여 수행된다. 하이브리드화는 방사성 또는 형광성 표지를 수반하는 상보적 폴리뉴클레오티드 분자를 이용함으로써 가시화될 수 있다. 엄격도는 특정 조건하에서의 상응성을 말한다. 상응성에 관한 요구는 고도로 엄격한 조건하에서 더 높다. 핵산의 하이브리드화 환경하에서, 엄격도 조건은 관련 핵산, 용도 및 목적에 따라 조정된다. 고도로 엄격한 하이브리드화에 대한 조건은 매우 적절히 일치하는 상보적 분자만이 하이브리드화될 수 있는 조건이다. 매우 적절히 일치하는 상보적 폴리뉴클레오티드는 예를 들면 상보적 파트너 분자에 대해 90, 91, 92, 93, 94, 95 , 96, 97, 98, 99%의 동일성 정도를 나타낸다. 낮은 엄격도하에서, 하이브리드화는, 분자의 특정 단편 내에서만 상보적인 폴리뉴클레오티드 분자 사이, 또는 불일치 또는 쌍을 이루지 못한 염기 쌍을 가진 부분이 많은 폴리뉴클레오티드 분자 사이에서 일어난다.
고도의 엄격도의 하이브리드화 조건은, 표지된 프로브의 존재하에서의 하이브리드화 단계가 2XSSC 수용액 중에서 68℃에서 2 시간 이상 동안 수행될 것이며, 다음의 세척 단계는 실온에서의 5분 동안의 2XSSC/0.1 % SDS 중에서의 제1 세척, 68℃에서의 1 시간 동안의 1XSSC/0.1 % SDS 중에서의 제2 세척, 및 68℃에서의 추가 1 시간 동안의 0.2 %SSC/0.1 % SDS 중에서의 세척으로 이루어진 하이드브리화일 수 있다.
2XSSC-, 1XSSC- 또는 0.2XSSC 용액은 20XSSC 용액을 희석시켜 수득한다. 20XSSC 용액은 3mol/l NaCl 및 0.3mol/l Na-시트레이트로 이루어진다. 당업자는 엄격한 조건하에서 폴리뉴클레오티드를 하이브리드화하는 다른 표준 방법을 익히 알고 있다. 당업자에게는 특히 문헌["Current Protocols in Molecular Biology (Wiley Interscience ; ISBN : 0-471-50338-X; eds.: F.M. Ansubel, R. Brant, R. R. Kingston, D. J. Moore, J. G. Seidmann, K. Stuhl]이 권고된다.
또한, 본 발명은, G 단백질 결합 수용체 EDG2가 일시적으로 또는 영구적으로 하나 이상의 조직에서 발현되는 유전자전이된(transgenic) 포유동물을 제조하기 위한 아래의 그룹의 하나의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 아데노바이러스 벡터의 용도에 관한 것이다:
a) 서열번호 5에 특정된 서열을 가진 폴리뉴클레오티드,
b) 서열번호 5의 폴리뉴클레오티드와 95% 동일한 폴리뉴클레오티드,
c) 서열번호 5의 폴리뉴클레오티드와 길이가 적어도 동일하고, 엄격한 하이브리드화 조건에 적용될 때 서열번호 5의 폴리뉴클레오티드에 하이브리드화하는 폴리뉴클레오티드. 상기 조직은 바람직하게는 포유동물의 심장의 일부이다. 조직은 또한 포유동물의 뇌, 근육, 지방, 간, 신장 또는 기타 기관으로 이루어진다.
본 발명의 일반적 기술적 측면은 아래의 부분에서 추가로 설명될 것이다.
아데노바이러스는 분열 세포 및 비-분열 세포 모두에서 매우 다양한 세포 유형 및 조직을 감염시킬 수 있다. 이러한 특징과 함께 이들의 비교적 용이한 제조 및 정제 때문에, 이들이 유전자 벡터로서 광범위하게 사용되어왔다. 바이러스는 이의 안정성 또는 감염성에 상당한 영향 없이 약 2kb의 외래 DNA을 받아들일 수 있다. 따라서, 보다 긴 서열의 도입은 바이러스 유전자의 일부 또는 전부의 제거를 필요로 한다. 재조합 아데노바이러스를 작제에는 다양한 기법이 있다.
벡터는 특히 (i) 종양 억제 또는 제거를 유도하는 유전자를 전달하는 암 치료; (ii) 결함 유전자를 증대시키기 위하여 조직에 유전자를 전달하는 유전자 치료; (iii) 발현시 질환 과정에 대항하는 유전자를 전달하는 보충적 치료에 활용될 수 있다.
벡터의 1세대에서, E1 및/또는 E3 유전자 카세트가 제거되고, 종종 이종성 프로모터의 조절하에 6.5kb의 외래 DNA가 도입될 수 있었다. E1을 결실시키는 경우에, ITR 및 패키징 서열이 보유되도록 조심해야한다. E1 영역의 제거는 E2 유전자 (이는 E1 독립적이다)의 전사를 손상시키고, 결과적으로 바이러스 DNA의 복제 및 바이러스 캡시드 단백질의 생성을 손상시키는 추가적인 명백한 이점이 있었다.
결함 E1 바이러스는, E1 유전자 산물을 트랜스로 제공하는 293 세포의 감염에 의해 증식될 수 있었다. 비록 다수의 시험관내 초기 연구가 많은 가능성을 제공했지만, 바이러스 캡시드 항원 및 발현된 전이유전자로 인해 주로 증대되는 압도적인 면역 반응 때문에, 생체내 전이유전자(transgene)의 발현은 단지 일시적이며 약화된다는 것이 곧 명백해졌다. 이에 대한 이유 중의 하나가, 감소된 수준에서도 E2 유전자가 기능할 수 있도록 하는 E1-유사 단백질을 다수의 세포가 보유한다는 관찰이였다. 결국, 이는 바이러스 DNA 복제, 후기 구조적 항원의 합성, 및 복제-적격(replication-competent) 아데노바이러스(RCA)의 생성을 용이하게 하였다. 또한, 보다 높은 m.o.i.에서, E2 유전자 전사의 E1 의존성이 제거될 수 있다는 것이 명백해졌다.
다음 연구는 (적당한 보충성 세포주를 사용하여) E2 유전자의 일부 또는 전부를 잘라내어, 바이러스 DNA를 복제하고 RCA를 생성하는 능력이 제거된 벡터를 작제하는 것이였다. RCA의 생성은 또한, 벡터 내의 서열과 중첩하는 아데노바이러스 서열을 함유하지 않는 세포주를 작제함으로써 방지될 수 있었다. 그럼에도 불구하고, 숙주 면역 반응은 지속적인 전이유전자 발현을 성취하는데 있어서 여전히 주요 장애물이였으며, 반복된 감염이 시도되었을 때 특히 명백하였다. 수 많은 연구를 통해, 감염성 재조합 바이러스 그 자체가 면역 반응을 유도하기에 충분하다는 것이 확인되었으며, 이는 위에서 언급된 신호전달 연쇄증폭의 초기 활성화 및 캡시드 성분의 강력한 항원성의 관점에서 놀라운 것은 아니였다.
보다 더욱 복잡해진 다른 벡터 (3 세대)가 다른 바이러스 유전자를 결실시킴으로써 작제되었으며[참조 문헌: Amalfitano et al. 1988], 이들 중 가장 최근의 벡터는 바이러스 유전자 전부 또는 거의 전부가 제거되었다. 이들 소위 '내용 없는(gutless)' 벡터 [참조 문헌: Hardy etal., 1997]은 본래 ITR 및 패키징 서열만을 보유하고, 증식 및 그 이후의 조심스러운 정제를 위하여, 헬퍼 바이러스 및 적당한 보충성 세포를 필요로 하였다. 그럼에도 불구하고, 주로 헬퍼 바이러스의 오염 및 벡터 불안정성으로 인해, 이들 기법에도 문제가 있었다. 헬퍼 바이러스의 패키징을 방지하는 추가적 개발은 Cre-lox 헬퍼-의존형 시스템의 이용을 수반한다.
재조합 아데노바이러스의 제조를 위한 AdEasyTM 시스템은 판매원[Qbiogene]에서 시판되고 있다. 재조합 아데노바이러스의 작제는 통상적으로, 먼저 목적하는 발현 카세트를 전달 벡터 속에 모으고, 이어서 아데노바이러스 게놈을 상동 재조합에 의해 전달하는 2 단계 과정이다. 상동 재조합에 의한 DNA의 삽입이 다음의 두가지 이유 때문에 아데노바이러스 벡터로 유전자를 도입하는 가장 효율적인 방법이다: 1) 아데노바이러스 DNA는 거의 모든 제한 효소의 부위를 함유하는 거대한 선형 분자이며, 2) 게놈이 너무 커서(36kb) 용이하게 조작될 수 없다.
AdEasyTM 벡터 시스템을 사용하는 경우에, 대부분의 아데노바이러스 게놈을 함유하는 주쇄 벡터는 선형 DNA으로 보다는 초나선형으로 사용된다. 상동 재조합 단계는 에스체리키아 콜라이(Escherichia coli)에서 수행한다. AdEasyTM 시스템에서, 목적하는 cDNA를 먼저 전달 벡터에 클로닝시킨다. 이어서, 생성된 플라스미드를 Pme I으로 선형화시키고, 이. 콜라이(E. coli) 균주 BJ5183 속에 바이러스 DNA 벡터인 pAdEasy-1와 함께 공동-형질감염시킨다. pAdEasy-1은 E1 및 E3이 결실되어있으며; 이의 E1 기능은 293A 세포에서 보충될 수 있다. 재조합체는 카나마이신에 의해 선별되며, 제한 효소 분석으로 스크리닝한다. 이어서, 재조합 아데노바이러스 작제물을 Pac I으로 절단하여, 이의 ITR (반전 말단 반복부)를 노출시키고, QBI-293A 세포 속에 형질감염시켜 바이러스 입자를 생성시킨다.
상동 재조합 단계는 선형화된 전달 벡터와 온전한 초나선형 아데노바이러스 플라스미드 사이에서 매개된다. 전달 벡터 내에 존재하는 카나마이신 내성 유전자는 재조합체의 선별을 가능케한다. 절단된 AdEasyTM 전달 벡터는 카나마이신-내성 콜로니를 단지 낮은 배경 수준으로 생성하기 때문에, 상동 재조합 시스템은 높은 신호-대-잡음 비를 갖는다. 이.콜라이 균주 BJ5183은 recA는 아니지만, 세균에서 재조합을 매개하는 다른 효소가 결핍되어 있어서, 형질전환 및 재조합 수행의 높은 효율 때문에 선택되었다. 재조합이 이루어지고 확인되면, 아데노바이러스 DNA가 단순히 정상 recA, DNA 생성의 보다 많은 수율을 위한 DH5α와 같은 endA 종으로 전달될 수 있다. 이의 recA 상태로 인해, DH5α는 상동 재조합에 의해 아데노바이러스 재조합체를 제조하는데 사용될 수 없다.
애쿠오라 빅토리아(Aequora victoria)으로 부터의 녹색 형광성 단백질(GFP)은 다수의 생물학적 시스템에서 신속하게 표준 레포터가 되었다. GFP는, 빛을 생성하는데에 보조인자 또는 기질의 존재를 요구하지 않는다는 점에서 광-방출 단백질 중에서 유일하다. 해파리 애쿠오라 빅토리아(Aequora victoria)에서 GFP는 칼슘-의존형으로 작용한다. Ca+2이 또 다른 생체발광성 단백질인 아에쿠어린(aequorin)에 결합하면, 이는 에너지를 GFP에 전달하여 녹색 광의 방출을 촉진한다. 이러한 에너지 전달은 표준 장파인 자외선에 GFP를 노출시킴으로써 실험적으로 모사될 수 있다. 청색 또는 적색 광을 방출하고 승온에서 안정한 GFP 이소형이 이용될 수 있다. GFP는 먼저 형광 현미경으로 살아있는 세포를 조사하여 단백질 위치를 모니터하고, 역동적인 세포 현상을 가시화하는데 사용되었다 클로닝된 목적하는 임의의 유전자와 GFP 사이의 융합은 서브클로닝 기법에 의해 이루어질 수 있고, 일시적 또는 안정한 발현에 의해 목적하는 생물체 속으로 도입될 수 있다. 이 후, 살아있는 세포 내에서의 생성된 단백질의 운명은 통상의 형광 현미경을 사용하여 추적될 수 있다. 검출은 세포의 고정 또는 영구화(permenbilization)를 요구하지 않는다. 마찬가지로, 단백질은 상기와 같은 단백질 및 GFP를 동시에 발현시킴으로써 동물 조직 내에서 추적될 수 있다.
세포의 제공은 이의 제조, 배양 및 추가적 처리를 포함한다. 세포는 예를 들면 기관 또는 조직으로 부터 적합한 세포 물질을 수득하거나, 또는 적당한 세포주 또는 매생물을 증식하는 방법으로 제공된다. 각종 적당한 배양 배지가 사용될 수 있다. 세포는 생물체를 위한 최적 온도에서 유지된다. 경우에 따라, 보존제, 항생제, pH 지시약, 혈청 성분, 혈청, 보조제 또는 기타 물질이 각 경우에 사용된 성장 배지에 첨가된다. 제조, 배양 및 추가 처리의 방법은 표준 교과서[예를 들면, Basic Cell Culture; Ed. J. M. Davis; IRL Press; 1994]에 기재되어 있다.
재조합 기법을 적용함으로써, 세포 내에서 발현되어질 작제물이, 당업자가 그의 전문적인 지식을 이용하여 통상적인 방법으로 제조할 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열의 형으로 존재할 수 있도록 제공된다. 분자생물학/생화학 분야의 숙련가는 이를 위한 전문적인 지식을 예를 들면 문헌[F. M. Ausubel et al. ; Current Protocols in Molecular Biology ; JohnWiley & Sons; New York]에서 발견할 수 있다. 벡터 작제물은, 예를 들면 GPCR의 아미노산을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 발현 벡터 속에 도입함으로써 제조된다. 발현 벡터는, 함유된 폴리뉴클레오티드 서열이 숙주 세포에서 단백질로 발현될 수 있도록 하는 벡터이다. 벡터는 플라스미드, 바이러스 또는 코스미드로 부터 유도될 수 있으며, 자율 복제할 수 있어야 한다. 이들은 일반적으로 복제 기점, 제한 효소를 위한 절단 부위, 및 예를 들면 항생제 내성 유전자와 같은 마커 유전자를 함유한다. 발현 벡터에서, 증식되거나 외부로 부터 도입되어진 폴리뉴클레오티드 서열은 프로모터의 기능적 조절하에 있다. 프로모터는 다양한 길이의 기능적 폴리뉴클레오티드 서열으로서, 이는 전사, 즉 당해 프로모터의 3'-에 인접한 폴리뉴클레오티드 서열의 mRNA의 합성을 조절하는데 사용된다. 원핵생물에서만 활성인 프로모터, 예를 들면 lac, tac 및 trc 프로모터, 및 진핵생물에서만 활성인 프로모터, 예를 들면 CMV 또는 ADH 프로모터가 있다. 바람직한 태양에서, 재조합 벡터 작제물은 진핵생물 및/또는 원핵생물에서 이용가능한 발현 벡터를 포함한다. 발현 벡터는, 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 단백질이 생물체, 예를 들면 세균, 진균 또는 진균 세포주의 세포 내에서 합성되도록 당해 폴리뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결될 수 있는 프로모터를 함유한다. 당해 프로모터는 예를 들어 트립토판에 의해 유도될 수 있거나, 또는 구성적으로 활성이다. 발현 벡터의 예로는 pUC18, pUC19, pBluescript, pcDNA3.1 등이 있다.
형질감염은 외래 폴리뉴클레오티드 서열을 벡터에 의해 숙주 세포 내로 도입한 다음, 당해 폴리뉴클레오티드 서열을 다수의 동일한 복사체로 증식시키는 것이다.
세포주를, 숙련가가 위에서 언급된 문헌[Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 또는 Current Protocols in Sambrook et al.; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, ISBN 0-87969-309-6]에서 찾아볼 수 있는 통상의 방법을 사용하여 재조합 작제물로 일시적으로 형질감염시킨다. 이러한 통상의 방법의 예로는 전기천공, Ca2+-포스페이트 공동침전 및 리포좀을 이용한 형질감염이 있다. 형질감염된 유전자는, 형질감염된 세포의 세포 용해물의 웨스턴 블로팅과 면역학적 검출 방법을 병행하여 숙주 세포에서 발현시킬 수 있다. 또한 이를 위하여, 숙련가는 필요한 실험실 포로토콜을 위에서 언급된 매뉴얼에서 찾아볼 수 있다. 본 발명의 방법을 수행하는데 적합한, GPCR 수용체의 면역검출을 위한 특이적 항체가 시판되고 있다.
화학적 화합물은 특히 화학적 합성으로, 또는 생물학적 물질로 부터 화학 물질의 분리에 의해 제공된다.
숙련가는 화합물의 화학적 합성 또는 세포로 부터의 물질의 분리를 위한 통상의 방법을 이용할 수 있다. 이러한 방법은 숙련가가 예를 들면 교과서[Organic Synthesis Workbook; 1995; John Wiley & Sons; ISBN 3-527-30187-9, The Organic Chemistry of Drug Synthesis; 1998; John Wiley & Sons; ISBN0-471-24510-0, 또는 Bioactive Compounds from Natural Sources; 2001; Taylor & Francis; ISBN 0-7484-0890-8]에서 찾아볼 수 있다.
합성 또는 분리에 의해 수득된 화합물은 적당한 용매 중에 용해될 수 있다. 적당한 용매는 물, 완충 물질(예: Tris, HEPES, MOPS, 등), 일가 및/또는 이가 이온(예: K+, Na+, Mg2+, Ca2+, 등), 산(예: HCl, H2SO4, 포름산, 아세트산, 등), 염기(예: NaOH, 등), 알코올(예: 메탄올, 에탄올, 글리세롤), 세제(예: Na 도데실 설페이트, 등), 유기 용매(예: 포름아미드, 아세톤, 디메틸 설폭시드, 등) 및 기타 화합물, 특히 가용화제 및 안정화제를 함유할 있다.
숙련가는 화학적 화합물을 통상의 실험실 방법을 사용하여 상기 세포와 접촉시킬 수 있다. 접촉은 예를 들어 Erlenmeyer 용기, 튜브, Eppendorf 용기 내에서, 또는 미세역가 플레이트 상에서 이루어질 수 있다. 예를 들어 30℃ 또는 37℃의 일정한 온도, 고정된 CO2 또는 습도 조건이 설정될 수 있는 온도-제어 항온배양기가 상기 접촉에 이용될 수 있다. 또한, 접촉은 실험실 자동기계 장치에서 수행될 수 있으므로, (FLIPR)를 제공한다. 접촉은 몇 초 내지 몇 분 및 수 시간에 이르기 까지 상이한 기간 동안 가능하다. 각 경우에 선택되는 조건은 수용체, 세포주, 및 화학적 화합물에 따라 결정된다.
약제의 최종 형은 최종 제형, 예를 들면 정제, 과립제, 분무제, 용액제, 연고제, 팅크제 또는 기타 제형 형태에 관한 것이다.
최종 형으로의 가공은 특정 제형의 제조를 의미한다. 일반적으로, 1일 용량은 하루에 체중 kg 당 0.3 mg 내지 100 mg (통상적으로 3 mg 내지 50 mg), 예를 들면 3 내지 10mg/kg/일의 범위이다. 정맥내 투여량은 예를 들면 0.3 mg 내지 1.0 mg/kg이고, 가장 적합하게는 10 ng 내지 100 ng/kg/분으로 주입 투여될 수 있다. 이러한 목적을 위한 적합한 주입 용액은 예를 들면 0.1 ng 내지 10 mg, 통상적으로 1 ng 내지 10 mg/ml을 함유할 수 있다. 1회 투여량은, 예를 들면 1 mg 내지 10 g의 활성 물질을 함유할 수 있다. 따라서, 주사용 앰풀은 예를 들어 1 mg 내지 100 mg을 함유할 수 있고, 경구로 투여될 수 있는 단일-투여 제형의 경우, 예를 들어 정제 또는 캡슐제의 경우, 예를 들어 1.0 내지 1000 mg, 통상적으로 10 내지 600 mg을 함유할 수 있다.
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aagaatccaa ttgtgccaaa agagccgtca acttgtcatc gcgggcggat gaacgggaag 29400 ctgcactgct tgcaagcggg ctcaggaaag caaagtcagt cacaatcccg cgggcggtgg 29460 ctgcagcggc tgaagcggcg gcggaggctg cagtctccaa cggcgttcca gacacggtct 29520 cgtaggtcaa ggtagtagag tttgcgggca ggacggggcg accatcaatg ctggagccca 29580 tcacattctg acgcaccccg gcccatgggg gcatgcgcgt tgtcaaatat gagctcacaa 29640 tgcttccatc aaacgagttg gtgctcatgg cggcggcggc tgctgcaaaa cagatacaaa 29700 actacataag acccccacct tatatattct ttcccaccct tannntaata gtaatcaatt 29760 acggggtcat tagttcatag cccatatatg gagttccgcg ttggtaaatg gcccgcctgg 29820 ctgaccgccc aacgaccccc gcccattgac gtcaataatg acgtatgttc ccatagtaac 29880 gccaataggg actttccatt gacgtcaatg ggtggagtat ttacggtaaa ctgcccactt 29940 ggcagtacat caagtgtatc atatgccaag tacgccccct attgacgtca atgacggtaa 30000 atggcccgcc tggcattatg cccagtacat gaccttatgg gactttccta cttggcagta 30060 catctacgta ttagtcatcg ctattaccat ggtgatgcgg ttttggcagt acatcaatgg 30120 gcgtggatag cggtttgact cacggggatt tccaagtctc caccccattg 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gtggttctct atgctcacat 31020 ctttggctat gttcgccaga ggactatgag aatgtctcgg catagttctg gaccccggcg 31080 gaatcgggat accatgatga gtcttctgaa gactgtggtc attgtgcttg gggcctttat 31140 catctgctgg actcctggat tggttttgtt acttctagac gtgtgctgtc cacagtgcga 31200 cgtgctggcc tatgagaaat tcttccttct ccttgctgaa ttcaactctg ccatgaaccc 31260 catcatttac tcctaccgcg acaaagaaat gagcgccacc tttaggcaga tcctctgctg 31320 ccagcgcagt gagaacccca ccggccccac agaaggctca gaccgctcgg cttcctccct 31380 caaccacacc atcttggctg gagttcacag caatgatcac tctgtggttt atccctatga 31440 cgtccccgac tatgcctgac tcgagcctaa gcttctagat aagatatccg atcnntggag 31500 ttcgtgaccg ccgccgggat cactctcggc atggacgagc tgtacaagtc cggactcaga 31560 tccaccggat ctagataact gatcataatc agccatacca catttgtaga ggttttactt 31620 gctttaaaaa acctcccaca cctccccctg aacctgaaac ataaaatgaa tgcaattgtt 31680 gttgttaact tgtttattgc agcttataat ggttacaaat aaagcaatag catcacaaat 31740 ttcacaaata aagcattttt ttcactgcat tctagttgtg gtttgtccaa actcatcaat 31800 gtatcttaac gcgnnntaat agtaatcaat tacggggtca ttagttcata gcccatatat 31860 ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc ccaacgaccc 31920 ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag ggactttcca 31980 ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta aactgcccac ttggcagtac atcaagtgta 32040 tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg cctggcatta 32100 tgcccagtac atgaccttat gggactttcc tacttggcag tacatctacg tattagtcat 32160 cgctattacc atggtgatgc ggttttggca gtacatcaat gggcgtggat agcggtttga 32220 ctcacgggga tttccaagtc tccaccccat tgacgtcaat gggagtttgt tttggcacca 32280 aaatcaacgg gactttccaa aatgtcgtaa caactccgcc ccattgacgc aaatgggcgg 32340 taggcgtgta cggtgggagg tctatataag cagagctggt ttagtgaacc gtcagatccg 32400 ctagcgctac cggtcgccac catggtgagc aagggcgagg agctgttcac cggggtggtg 32460 cccatcctgg tcgagctgga cggcgacgta aacggccaca agttcagcgt gtccggcgag 32520 ggcgagggcg atgccaccta cggcaagctg accctgaagt tcatctgcac caccggcaag 32580 ctgcccgtgc cctggcccac cctcgtgacc accctgacct acggcgtgca gtgcttcagc 32640 cgctaccccg accacatgaa 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tatcacgggt agccaacgct atgtcctgat agcggtccgc cacacccagc cggccacagt 34380 cgatgaatcc agaaaagcgg ccattttcca ccatgatatt cggcaagcag gcatcgccat 34440 gggtcacgac gagatcctcg ccgtcgggca tgctcgcctt gagcctggcg aacagttcgg 34500 ctggcgcgag cccctgatgc tcttcgtcca gatcatcctg atcgacaaga ccggcttcca 34560 tccgagtacg tgctcgctcg atgcgatgtt tcgcttggtg gtcgaatggg caggtagccg 34620 gatcaagcgt atgcagccgc cgcattgcat cagccatgat ggatactttc tcggcaggag 34680 caaggtgaga tgacaggaga tcctgccccg gcacttcgcc caatagcagc cagtcccttc 34740 ccgcttcagt gacaacgtcg agcacagctg cgcaaggaac gcccgtcgtg gccagccacg 34800 atagccgcgc tgcctcgtct tgcagttcat tcagggcacc ggacaggtcg gtcttgacaa 34860 aaagaaccgg gcgcccctgc gctgacagcc ggaacacggc ggcatcagag cagccgattg 34920 tctgttgtgc ccagtcatag ccgaatagcc tctccaccca agcggccgga gaacctgcgt 34980 gcaatccatc ttgttcaatc atgcgaaacg atcctcatcc tgtctcttga tcagagcttg 35040 atcccctgcg ccatcagatc cttggcggcg agaaagccat ccagtttact ttgcagggct 35100 tcccaacctt accagagggc gccccagctg gcaattccgg ttcgcttgct 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gcgaggtgcc gccggcttcc attcaggtcg aggtggcccg 37680 gctccatgca ccgcgacgca acgcggggag gcagacaagg tatagggcgg cgcctacaat 37740 ccatgccaac ccgttccatg tgctcgccga ggcggcataa atcgccgtga cgatcagcgg 37800 tccagtgatc gaagttaggc tggtaagagc cgcgagcgat ccttgaagct gtccctgatg 37860 gtcgtcatct acctgcctgg acagcatggc ctgcaacgcg ggcatcccga tgccgccgga 37920 agcgagaaga atcataatgg ggaaggccat ccagcctcgc gtcgcgaacg ccagcaagac 37980 gtagcccagc gcgtcggccg ccatgccggc gataatggcc tgcttctcgc cgaaacgttt 38040 ggtggcggga ccagtgacga aggcttgagc gagggcgtgc aagattccga ataccgcaag 38100 cgacaggccg atcatcgtcg cgctccagcg aaagcggtcc tcgccgaaaa tgacccagag 38160 cgctgccggc acctgtccta cgagttgcat gataaagaag acagtcataa gtgcggcgac 38220 gatagtcatg ccccgcgccc accggaagga gctgactggg ttgaaggctc tcaagggcat 38280 cggtcgagga caggnnngga tcctta 38306 <210> 6 <211> 40 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 gcggggggta ccaccatggc tgccatctct acttccatcc 40 <210> 7 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 gcggggctcg agtcacttgt cgtcgtcgtc 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gtcattgtgc ttggggcctt tatcatctgc tggactcctg gattggtttt gttacttcta 840 gacgtgtgct gtccacagtg cgacgtgctg gcctatgaga aattcttcct tctccttgct 900 gaattcaact ctgccatgaa ccccatcatt tactcctacc gcgacaaaga aatgagcgcc 960 acctttaggc agatcctctg ctgccagcgc agtgagaacc ccaccggccc cacagaaggc 1020 tcagaccgct cggcttcctc cctcaaccac accatcttgg ctggagttca cagcaatgac 1080 cactctgtgg tttag 1095

Claims (19)

  1. G 단백질 결합 수용체 EDG2 및 GFP의 동시적 발현을 위한 아데노바이러스 벡터 서열을 함유하는 포유동물 심근 세포.
  2. 제1항에 있어서, 아데노바이러스 벡터 서열이 G 단백질 결합 수용체 EDG2 및 GFP을 두 개의 독립적 프로모터의 조절하에 발현하는 재조합체 E1/E3 결함 아데노바이러스로 이루어진 포유동물 심근 세포.
  3. 제2항에 있어서, 두 개의 독립적 프로모터가 두 개의 CMV 프로모터인 포유동물 심근 세포.
  4. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, G 단백질 결합 수용체 EDG2의 단백질 및 GFP의 단백질을 함유하는 포유동물 심근 세포.
  5. 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서, 포유동물이 토끼, 마우스 또는 랫트인 포유동물 심근 세포.
  6. a) 포유동물의 심장을 수의학 수술 기법에 의해 제거하고,
    b) 당해 심장에 콜라겐아제를 관류시켜 분해시키고,
    c) 분리된 심근세포에, G 단백질 결합 수용체 EDG2 및 GFP를 두 개의 독립적인 프로모터의 조절하에 발현하는 재조합체 E1/E3 결함 아데노바이러스로 이루어진 아데노바이러스 벡터를 감염시켜,
    제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 따른 심근 세포를 생산하는 방법.
  7. G 단백질 결합 수용체 EDG2 및 GFP의 동시적 발현을 위한 아데노바이러스 벡터를 함유하는 심근을 가진 포유동물.
  8. 제7항에 있어서, 아데노바이러스 벡터 서열이 G 단백질 결합 수용체 EDG2 및 GFP을 두 개의 독립적 프로모터의 조절하에 발현하는 재조합체 E1/E3 결함 아데노바이러스로 이루어진 포유동물.
  9. 제8항에 있어서, 두 개의 독립적 프로모터가 두 개의 CMV 프로모터인 포유동물.
  10. 제7항 내지 제9항 중의 어느 한 항에 있어서, 심근이 G 단백질 결합 수용체 EDG2의 단백질 및 GFP의 단백질을 함유하는 포유동물.
  11. 제7항 내지 제10항 중의 어느 한 항에 있어서, 토끼, 마우스 또는 랫트인 포유동물.
  12. a) G 단백질 결합 수용체 EDG2 및 GFP의 동시적 발현을 위한 아데노바이러스 벡터 서열을 준비하고,
    b) 포유동물을 준비하고,
    c) a)로 부터의 아데노바이러스 벡터 서열을 카테터를 사용하여 b)로 부터의 포유동물의 심근 속에 전달시켜,
    제7항 내지 제11항 중의 어느 한 항에 따른 포유동물을 생산하는 방법.
  13. 제14항 또는 제15항을 수행하기 위한 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 따른 심근 세포를 생산하는데 있어서의 포유동물의 용도.
  14. a) 수용체 EDG2 또는 수용체 EDG2을 포함하는 융합 단백질을 발현하는 심장 근육 기원의 형질전환된 세포를 준비하고,
    b) 경우에 따라 a)로 부터의 세포를 이소프로테레놀 및/또는 리소포스파티드산으로 처리하고,
    c) 화학적 화합물을 준비하고,
    d) a) 또는 b)로 부터의 세포를 c)로 부터의 화학적 화합물과 접촉시키고,
    e) d)로 부터의 세포의 수축성을 측정하고, a)로 부터의 세포와 동일한 특징을 가지나 c)로 부터의 화학적 화합물과 접촉시키지 않은 세포의 수축성과 비교할 때, d)에 따라 화학적 화합물과 접촉시킨 세포의 수축성의 당해 화합물에 의한 상대적 증가 또는 감소가 수용체 EDG2의 활성을 변경시키는 상기 화학적 화합물의 능력을 입증하는 것인,
    G 단백질 결합 수용체 EDG2의 활성을 변경시키는 화합물의 확인 방법.
  15. a) 수용체 EDG2 또는 수용체 EDG2을 포함하는 융합 단백질을 발현하는 심장 근육 기원의 형질전환된 세포를 준비하고,
    b) 경우에 따라 a)로 부터의 세포를 이소프로테레놀 및/또는 리소포스파티드산으로 처리하고,
    c) 화학적 화합물을 준비하고,
    d) a) 또는 b)로 부터의 세포를 c)로 부터의 화학적 화합물과 접촉시키고,
    e) d)로 부터의 세포의 수축성을 측정하고, a)로 부터의 세포와 동일한 세포 유형이지만 수용체 EDG2 또는 수용체 EDG2을 포함하는 융합 단백질을 발현하지 않는 세포의 수축성과 비교할 때, 수용체 EDG2 또는 수용체 EDG2를 포함하는 융합 단백질을 발현하는 세포의 수축성의 당해 화합물에 의한 상대적 증가 또는 감소가 수용체 EDG2의 활성을 변경시키는 상기 화학적 화합물의 능력을 입증하는 것인,
    G 단백질 결합 수용체 EDG2의 활성을 변경시키는 화합물의 확인 방법.
  16. a) 서열번호 5에 특정된 서열을 가진 폴리뉴클레오티드,
    b) 서열번호 5의 폴리뉴클레오티드와 95% 동일한 폴리뉴클레오티드, 및
    c) 서열번호 5의 폴리뉴클레오티드와 길이가 적어도 동일하고, 고도로 엄격한 하이브리드화 조건에 적용될 때 서열번호 5의 폴리뉴클레오티드에 하이브리드화하는 폴리뉴클레오티드 그룹의 폴리뉴클레오티드의 하나로 이루어진 재조합 아데노바이러스 벡터.
  17. 제16항에 있어서, 서열번호 2의 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 아데노바이러스 벡터.
  18. G 단백질 결합 수용체 EDG2가 일시적으로 또는 영구적으로 하나 이상의 조직에서 발현되는 유전자전이된(transgenic) 포유동물을 작제하기 위한, 제16항 또는 제17항의 아데노바이러스 벡터의 용도.
  19. 제18항에 있어서, 조직이 심장의 일부인, 아데노바이러스 벡터의 용도.
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