JPH10510163A

JPH10510163A - 欠失レトロウイルスベクタのトランス補完用のパッケージング細胞及び発現ベクタ

Info

Publication number: JPH10510163A
Application number: JP8518347A
Authority: JP
Inventors: − アゲノーエ、オディルコエン
Original assignee: − アゲノーエ、オディルコエン
Priority date: 1994-11-30
Filing date: 1995-11-30
Publication date: 1998-10-06
Also published as: DE69535024D1; FR2727429B1; WO1996017071A1; EP0796338A1; ATE328100T1; US6432709B1; AU4306996A; IL116216A0; FR2727429A1; EP0796338B1; CA2206574A1; IL116216A

Abstract

(57)【要約】本発明は、標的細胞のゲノム内への、選択したヌクレオチド配列（導入遺伝子と呼ぶ）のトランスファー、及び／または組み込みを提供するレトロウイルスベクタのトランス補完用発現ベクタであって、以下を具備するものに関する：a)スプーマウイルスファミリーのレトロウイルスのエンベロープに由来するポリペプチド（ENVポリペプチド）をコードしている、envと呼ばれるヌクレオチド配列であって、該ポリペプチドENVはレトロウイルスRNAのカプシド化を提供する；b)配列envの発現を調節する転写制御シグナル。本発明は更に、上に開示したベクタとの組み換え体である、選択したヌクレオチド配列（導入遺伝子）の、標的細胞内へのトランスファー及び／または組み込みを提供する、組み換えレトロウイルスRNAのトランス補完によるカプシド化用の真核細胞にも関する。

Description

【発明の詳細な説明】欠失レトロウイルスベクタのトランス補完用のパッケ−ジング細胞及び発現ベクタ本発明の目的は新規の細胞株であって、ある場合に治療的に興味のある遺伝子（導入遺伝子）に由来するヌクレオチド配列を有する組み換えのレトロウイルスＲＮＡのパッケ−ジングを可能にする、いわゆるトランス補完細胞株であり、上記の導入遺伝子を真核性の標的細胞へトランスファ−して発現することを目標にしている。治療目的のための遺伝子のトランスファ−、または体細胞「遺伝子治療」は、内在性の遺伝子の機能障害を補うため、または治療目的用の新規の機能を加えるために、制定した生物体の体細胞中に「修復」遺伝子（導入遺伝子）を挿入することからなる、得られる遺伝的変化は操作した細胞の娘細胞へと伝えられるはずであるが、遺伝はしない。よって、変化したＤＮＡ配列の正常な対応物は、医薬中へとトランスフォ−ムされる。標的細胞中へ治療目的で遺伝子、より一般的にはヌクレオチド配列を導入するために、種々の方法が現在、探索されている。これらの標的細胞は、治療的介入から利益を受ける直接的な細胞であるかもしれないし、または治療される細胞と、導入遺伝子を有するベクタとの間の細胞中間体であるかもしれない。遺伝子のトランスファ−に現在使用されているベクタは、レトロウイルスやアデノウイルスのような不活化ウイルス、または高分子接合体の何れかに由来する。レトロウイルスは通常、生体外で操作可能な体細胞プ−ルを含む、標的組織に差し向けられるが、一方、標的組織が、分化しきった細胞からなるか、または、例えば肺のように、構築上の制限が主要な機能性の結果を有する器官内に該標的組織が埋められている場合には、遺伝子トランスファ−は生体内で、例えば組み換えアデノウイルスにより行なわれなくてはならない。遺伝子治療には、ダンチェンズ（Dunchenne's）筋疾患、リソソ−ム病、嚢胞性線維症、またはAIDS、癌、・・・・病のような後天性疾患、または退行性神経疾患及び遺伝的血液病のような単一の遺伝子に起因する遺伝的疾患にわたって適用できる。通常のツ−ルよりもより有効なレトロウイルスベクタを開発することが、主要な目的を構成している。事実、レトロウイルスベクタは、安定に、そして永久に遺伝子を導入するのに有効であることが証明されているが、その際には古典的にトランスファ−の標的である細胞が有糸分裂して、理想的には幹細胞の代表が含まれている。現在の制限はウイルスの不十分な感染性、及び／または穏和すぎる転写のレベルによるものである。更に可能性のある制限は、現在でもいまだ不十分であるトランスファ−の安全性に関するものである。これは複製適格な（replication co mpetent）ウイルスの産性と、パッケ−ジング細胞株により作られ、欠失組み換えウイルスゲノムとともにパッケ−ジングされる内在性配列の、付随した伝達との両方に関連する。現在入手可能なものよりも効果的で安全なベクタ系を開発することは、非常に重要な問題である。発現させる導入遺伝子がレトロウイルスベクタで運ばれる時は常に、導入遺伝子を有するレトロウイルスベクタ粒子のストックを、標的細胞への感染に先だって製造することが、必須の工程である。これを成し逐げるのに、導入遺伝子を有する欠失レトロウイルスベクタのトランス補完を行うべきであり、その対応するコ−ド配列をまず取り除いて導入遺伝子で置換する。このトランス補完工程は、パッケ−ジング細胞での継代で行える。これらの細胞は、遺伝的に改変された細胞であって、ウイルスの複製を許容するウイルス成分、特にはENVエンベロ−プタンパク質、GAG核タンパク質、及びPOL 逆転写酵素の合成に必要な遺伝物質を具備している。このgag、pol、及びenv遺伝子は、ウイルスのパッケ−ジングを行うのに必須のプサイ配列を欠失しているトランス補完ベクタにより、上記遺伝子を有する核酸配列でパッケ−ジング細胞を形質転換して、形質転換される。。パッケ−ジング細胞内でのgag，pol，env遺伝子の発現により、プサイパッケ −ジング配列を有するレトロウイルスベクタが保持している導入遺伝子と組み換えを起こしている、レトロウイルス性の組み換えＲＮＡ配列の更なるパッケ−ジングが可能になる。パッケ−ジングは、gag,pol,及びenv配列によりコ−ドされるウイルスタンパク質によるトランス補完後に起こることが可能である。現在入手可能なパッケ−ジング細胞株は、マウス起源の細胞に由来し、以下の欠点を有している：１.内在性のレトロウイルス配列（MCP，VL30，及びある場合にはレトロトランスポゾンでさえも）が、欠失構築物とともに共パッケ−ジングする。共パッケ− ジングされる配列はまた、遺伝子トランスファ−の標的細胞の感染後に宿主ゲノムに組み込まれる；２.これらのパッケ−ジング細胞株内では、補完性のタンパク質の発現はレトロウイルスＬＴＲから行なわれる、第三世代の細胞株は、複数の変異または欠失部位を有する補完性のレトロウイルス構築物を利用するが、ＬＴＲ配列を維持することは、潜在的に不利益であるかもしれない。これらの配列は、補完される欠失構築物との遺伝的組み換えを誘導することが可能である。このことは、ウイルス産生適格性の組み合わせの可能性を低減するために、GA G及びPOLタンパク質をコ−ドする配列がエンベロ−プをコ−ドする配列とは別に形質転換されるいわゆる第三世代の細胞株からすでに観察されている。欠失レトロウイルスを補完して哺乳類細胞、特には霊長類及びヒト起源のものへの遺伝子トランスファ−に、現在使用されている、エンベロ−プをコ−ドしている配列は、両種向性のエンベロ−プである。これらの遺伝子治療目的で感染させる細胞タイプが、両種向性ウイルスの受容体に対する十分な受容体を有するかどうかはいまだ不確かである。これら全ての要素は、レトロウイルス仲介性の遺伝子トランスファ−の安全性における改善への努力を正当化する。本発明の目的は、少なくとも上記した問題の一部を解決する、新規のパッケ− ジング細胞株を作る方法を提供することである。本発明の細胞株は、現在までに同定されている内在性レトロウイルスの配列を有していない動物種に起源を有する細胞株より開発され、また好ましい態様においては、必要とあらば感染性ウイルス上清が調製されるときには必ず、非ウイルス性のプロモ−タ、特には誘導性プロモ−タであって欠失ベクタ補完性タンパク質、特にはエンベロ−プの条件的合成用のものを利用してウイルス補完性タンパク質の少なくとも一部の発現を行っているので、遺伝子トランスファ−の安全性の改良を可能にする。更に、GAG、及びPOL タンパク質補完は、ベクタを構築するのに使用したフレンドレトロウイルスの核酸配列により仲介される。発明の実施のため、gag、及びpol配列はパッケ−ジング用の細胞株へ、エンベロ−プコ−ド配列とは別個でトランスファ−される。これら細胞株、特にはヒト起源のものはまた、遺伝子治療用のヒト細胞標的の表面にある、両種向性ウイルスに対する受容体の、潜在的に不十分な発現を回避するために、エンベロ−プ配列の使用により、トランスファ−効率の改良を促す：特に、造血幹細胞が標的を代表する可能性のある場合にはそうである。第一態様によると、本発明の目的は、レトロウイルスベクタのトランス補完用発現ベクタであり、これは選択したヌクレオチド配列（「トランスジェニック配列」とよばれる）の、標的細胞ゲノム内へのトランスファ−及び／または組み込みを許容し、以下を具備することを特徴としている： a)スプ−マウイルスファミリのレトロウイルスの、env と呼ばれるヌクレオチド配列でエンベロ−プ（ENV ポリペプチド）由来のポリペプチドをコ−ドし、該 ENVポリペプチドはレトロウイルスＲＮＡのパッケ−ジングを許容する；そして、 b)env 配列の発現を調節する転写制御配列であって、該発現ベクタがパッケ− ジングシグナル配列を有していない。スプ−マウイルス（フォ−ミ−ウイルス）ファミリのレトロウイルスは、動物、またはヒトの細胞培養より単離できるレトロウイルスである。 HSRV と名付けられている、スプ−マウイルスファミリに属するレトロウイルスは、鼻咽頭癌の患者から、１９７１年に単離された（Hachong et al.，J．Nat l.Cancer Inst，46，299-307）。このレトロウイルスHSRVはクロ−ニングされて配列が決定されていて、その配列がフリュ−ゲル（Flugel）らにより報告されていろ(EMBO J．vol6 No7 PP2077-2084，1987)。この発行物は、特にHSRV レトロウイルスエンベロ−プ配列を記載している。有益には、本願で使用するHSRV レトロウイルスのエンベロ−プ配列は、ヒト細胞上の多くの表面受容体により認識されうる糖タンパク質をコ−ドし、特にはヒト起源の細胞のポピュレ−ションのなかでは両種向性エンベロ−プ糖タンパク質と比較してより多くの受容体を利用することが可能な糖タンパク質をコ−ドしている、本発明の別の利点によれば、使用するエンベロ−プ配列は、ヒトまたは霊長類での遺伝子治療における、ヒトまたは霊長類に対しての向性を有している。特には、HSRV−env 配列は興味深いことに、ヒトの造血前駆細胞に対しての向性を有している。造血幹細胞に加えて、線維芽細胞、またはリンパ球のようなヒト初代細胞も、うまく標的にすることができる(溶菌性感染)。欠失ウイルスによる慢性感染がヒトにおいて、腺性の上皮または筋性の組織内で証明されている。上皮またはリンパ球起源の細胞のような、ヒト起源の細胞株は、HeLa細胞と同様にまた、適当な標的である。ウサギでは、試験する初代細胞の起源が如何なるものでも、それは何れも感染に感受性を示した。よって、感染のスペクトルは非常に広い。トランス補完用発現ベクタに含まれているenv配列の発現は、レトロウイルス転写制御シグナルから起ころ特に、これらの制御シグナルは、フレンドレトロウイルスのような、レトロウイルスのLTR配列に由来させることができる。本発明によれば、使用するフレンドウイルス株は特に病原性が高いと同定されたものである。同種指向性フレンドマウス白血病ウイルスの単離体I-5は、赤血球増加症を誘導するフレンドウイルス複合体（FV-P，Mathieu-Mahul et al.，19 82）で感染した骨髄の長期培養より得られた。単離体I-5に由来する、F-MuLVのF B29株（Sitbon et al.，Cell，47:851-859，1986）は、赤血球細胞に対して、細胞溶解性、及び白血病誘発性効果の原因であり、誕生時に接種させた感受性マウスでは、後に赤血白血病になる、重度の早期溶血性貧血へと導く。赤血白血病に原因の領域は、ウイルス性LTRのU3領域に位置している(Sitbon et al.，1986;Si tbon et al.，PNAS USA，88:5932-5936，1991)。溶血性貧血の腫瘍決定基は、FB 29株の特異的エンベロ−プ配列に依存するようであり、その重症度は３つの別個の領域により影響されていて、これにはエンベロ−プの構造的分節、U3領域に位置する転写のエンハンサ配列、そして最後にU5-gag-pol領域の配列が含まれている(Sitbon et al.，J.virol.，64:2135-2140，1990)。更に、ウイルス粒子の電子顕微鏡的な分析により、顕著に高いパッケ−ジング効率（１.５から２log）が確認された。よって、スプ−マウイルスタイプのレトロウイルスのenv配列は、LTR配列の制御下、またはフレンドウイルスFB29株由来のLTR配列の一部でenvヌクレオチド配列の転写を行うのに十分なものの下に置くことが可能である。本発明の別の態様において、トランス補完用の発現ベクタは、env 配列の転写制御シグナルが、非ウイルス性プロモ−タを具備していることを特徴としている。場合によっては、このプロモ−タの後には、SV40ウイルスのポリアデニレ−ションシグナル、または別のポリアデニレ−ションシグナルが続く。非ウイルス性のプロモ−タを使用することは、そのように改変されたトランス補完用ベクタの安全性の特徴を改善する。更に、env 配列の発現は、使用するプロモ−タは誘導型である場合には、必要であれば誘導することができる；すなわちこのプロモ−タは、特には薬学的化合物のような、選択した分子により活性化させることが可能である。別個にトランスファ−されるgagとpol配列はまた、誘導性のプロモ−タ制御下に置くことも可能である。あるいは、envの発現、及びgagとpol配列の発現を調節する転写シグナルは、発現が一定の細胞タイプのみに限定されている条件的プロモ−タに関与してもよい。本発明の実施に適する一つの誘導性型のプロモ−タは例えば、レチノイン酸β 受容体のプロモ−タ（RAR βプロモ−タ）である。このプロモ−タはデテ（De The）らにより記載されいる（Nature，49,6254,pp 177-180）。好ましいトランス補完用発現ベクタは、デテらの記載した上記のものであって、スプ−マウイルスファミリのレトロウイルスのenv配列が、レチノイン酸β受容体のHind III−BamHI断片の制御下に置かれているものである。本発明の別の態様によれば、エンベロ−プに関して、トランス補完用の発現ベクタは以下を具備することを特徴としている： a)エンベロ−プ、例えば両種向性エンベロ−プ、例えばモロニ−白血病ウイルス(Mo-MuLV)のエンベロ−プ4070Aに由来するポリペプチドをコ−ドしている、en v と呼ばれるヌクレオチド配列、及び、 b)env 配列の発現を調節している非ウイルス性の転写制御シグナルで、例えば誘導性または条件的プロモ−タ、例えばRAR βプロモ−タを含んでいるもの。本発明の特別な態様によれば、トランス補完用の発現ベクタは、エンベロ−プポリペプチドをコ−ドしているトランス補完用発現ベクタのヌクレオチド配列が、例えば特定の細胞のタイプにより特異的に認識されるポリペプチド若しくは糖タンパク質をコ−ドしているヌクレオチドを配列することによるヌクレオチドの置換、またはそのような配列を付加することにより、特徴付けられる。別の態様によれば、本発明は更に、レトロウイルスベクタである、トランス補完用の発現ベクタを提供し、選択したヌクレオチド配列（「導入遺伝子」と呼ぶ）の、標的細胞のゲノム内へのトランスファ−、及び／または組み込みを許容し、これには、 a)フレンドレトロウイルスタイプのレトロウイルスの、核タンパク質（GAG ポリペプチド）に由来するポリペプチドをコ−ドしている、gag と呼ばれるヌクレオチド配列、 b)フレンドレトロウイルスタイプのレトロウイルスの、逆転写酵素とインテグラ−ゼ（POLポリペプチド）を含む誘導ポリペプチドをコ−ドしている、polと呼ばれるヌクレオチド配列、 c)gag とpol配列の発現を調節している非ウイルス性転写制御シグナルであって、例えば誘導性または条件的プロモ−タ、例えばRAR βプロモ−タと、上記した、カプシド形成シグナルを欠失している発現ベクタとを含んでいるもの、が含まれる。本発明によれば、トランス補完用の発現ベクタは、自発的であろうとも選択によるものであろうとも、組み込み型のもの、あるいは対照的にエピソ−ム性ベクタであることも可能である。。本願の目的はまた、選択したヌクレオチド配列（トランスジェニック配列）の、標的細胞ゲノム内へのトランスファ−及び組み込みを許容する、レトロウイルスベクタ上に存在する組み換えレトロウイルスＲＮＡの、トランス補完によるカプシド形成用の真核細胞であって、以下の性質を示すことを特徴とするもの具備する：・内在性レトロウイルスを欠いている動物種の細胞より選択される；・長期間安定な均一な形態を有する；・腫瘍起源ではない；・形質転換を前もって行わずに、CO₂を欠く最小培地内で選択される能力を有する；そして、・複製の速度が速い。本発明によれば、「前もった形質転換」という表現は、細胞が、選択に先だって、腫瘍性配列の付加による利益を受けないことである。細胞の形態は、６ケ月またはそれ以上の期間に渡り、顕著に変化しない限り、長期間均一で安定である。、本発明の魅力的な態様によれば、選択したヌクレオチド配列（トランスジェニック配列）の、標的細胞ゲノム内へのトランスファ−及び組み込みを許容する、レトロウイルスベクタ上に存在する組み換えレトロウイルスＲＮＡの、トランス補完によるカプシド形成用の真核細胞であって、内在性レトロウイルスを欠く動物種の細胞より選択されたもの、好ましくは胎児または肺細胞、特にはイヌ、またはウサギのものは、以下の方法にそって得ることが可能である： a)選択した真核細胞を、１０％ウシ胎児血清と１０％ウマ血清とを更に含む、イスコ−ブ・リッチ培地（GIBCO）で培養する； b)２０％ウシ胎児血清を含むDMEM培地内で、培養細胞を継代して、CO₂なしの培地で１ケ月細胞を培養する； c)複製速度の速い（加速したキネティクス）細胞を選択する； d)選択した細胞を、１０％ウシ胎児血清を含むDMEM培地で継代する； e)ステップd)で回収した細胞を、10%のウシ新生児血清（Hyclone）を含有する DMEM培地で継代する； f)ステップe)の最後で選択した細胞を回収する。よって、真核細胞は、１９９４年１１月３０日にCNCMに、番号I-1496のもとに寄託された、DOGOM1 と命名されているイヌ胎児細胞であってもよい。このようにして得られたイヌ胎児細胞は、実験のセクションに記載してある、以下の選択基準を満たしている：内在性レトロウイルスを欠く；細胞の付着性が充分である；速い増殖速度を有する；その形態が均一で安定である；このイヌ胎児細胞はまた、容易に形質転換でき、広い範囲での継代に感受性である（集中的な人工継代での試験）； LTC-IC（長期間培養開始細胞）試験を支持できる。上記の選択した細胞から、遺伝的に改変された細胞でレトロウイルスＲＮＡのカプシド形成を許容するものは、例えば上記の細胞における形質転換、またはトランス補完用のポリペプチドまたは糖タンパク質をコ−ドするヌクレオチド配列での感染により調製できるが、該配列は少なくとも二つのベクタ、または少なくとも３つのベクタでさえによっても供給される。例えば、一方でスプ−マウイルスファミリのレトロウイルスのエンベロ−プ由来のポリペプチドをコ−ドしているenv配列を発現することが可能な、プラスミドベクタまたはレトロウイルスベクタの何れかを備えているトランス補完ベクタを使用することが可能であり、またもう一方では、ベクタ、例えばフレンドウイルスタイプのレトロウイルスの、 gag 及びpol ヌクレオチド配列のトランス補完用のプラスミドベクタ、または発現ベクタを使用することが可能である。本発明の別の態様によると、トランス補完用の細胞は、異種間、同種異系間、または自己の細胞であって、感染性欠失ベクタの生体内での患者内への導入を許容すると思われるものである。後者の場合、トランス補完用の細胞は、レトロウイルスベクタでの感染用の細胞標的を代表している。例えば内皮、筋、またはストロ−マ細胞を使用することができる。本願は、トランス補完により、組み換えレトロウイルスＲＮＡのカプシド形成を許容する組み換え細胞（トランス補完性組み換え細胞）に関し、上記の定義に応じる細胞であって、例えば以下のものによる形質転換または感染により、遺伝的に改変されていることを特徴とする：一方で以下のトランス補完配列を具備する、選択したヌクレオチド配列（「トランスジェニック配列」と呼ばれる）の、標的細胞ゲノム内へのトランスファ− 及び／または組み込みを許容する、レトロウイルスベクタのトランス補完用の第一発現ベクタ： a)フレンドレトロウイルスタイプのレトロウイルスの核タンパク質（GAG ポリペプチド）に由来するポリペプチドをコ−ドしている、gag 配列と呼ばれるヌクレオチド配列； b)フレンドレトロウイルスタイプのレトロウイルスの逆転写酵素とインテグラ −ゼ（POLポリペプチド）を含んでいるポリペプチドをコ−ドする、pol配列と呼ばれるヌクレオチド配列； c)gag とpol 配列の発現を調節する転写制御シグナル；ここで上記のトランス補完ベクタは、パッケ−ジングシグナルと以下のものとを欠いている：もう一方で、env タンパク質に関して補完するための第二の発現ベクタであって、エンベロ−プポリペプチドと、この配列の発現の制御用の配列とをコ−ドしているヌクレオチド配列を具備しているもの。本発明によれば、フレンドウイルスタイプのウイルスとは、そのgag、pol、及びenv コ−ド配列が、本願で記載されたレトロウイルスＲＮＡのパッケ−ジングを行うための整列を行った後に、フレンドウイルスのものとの相同性を有するものである。本発明の第一の態様によれば、一つ以上のエンベロ−プポリペプチドをコ−ドするヌクレオチド配列は、スプ−マウイルスファミリのレトロウイルスに由来する。例えばHSRV由来の配列が関わるかもしれない。本発明の別の態様によれば、エンベロ−プ糖タンパク質をコ−ドしているヌクレオチド配列は、Mo-MuLVの4070A配列に由来する。種々の細胞株は、第三世代のパッケ−ジング細胞株の原理にそって、連続する形質転換により遺伝的に改変される。すなわち、GAG、POL、及びENV 補完性タンパク質をコ−ドする配列、及びその関連した制御配列の別個の断片を二つ、または三つがそれ以上で使用することにより改変される。この方法は、複製適格性のウイルス粒子を産生する遺伝的組み換えの可能性を低減する。本発明の一つの態様によれば、本発明のパッケ−ジング細胞株は言い換えると、以下を具備することを特徴としている： a)フレンドレトロウイルスタイプのレトロウイルスの核タンパク質（GAG ポリペプチド）に由来するポリペプチドをコ−ドする、gag 配列と呼ばれるヌクレオチド配列； b)フレンドレトロウイルスタイプのレトロウイルスの逆転写酵素とインテグラ −ゼ（POLポリペプチド）に由来するポリペプチドをコ−ドする、pol配列と呼ばれるヌクレオチド配列； c)gag、pol配列の発現を調節する転写制御シグナル； d)スプ−マウイルスファミリのレトロウイルスのエンベロ−プ（ENV ポリペプチド）に由来するポリペプチドをコ−ドする、env 配列と呼ばれるヌクレオチド配列であって、該ENV ポリペプチドがレトロウイルスＲＮＡのカプシド形成を許容するもの； e)上記のenv配列の発現を調節する転写制御シグナル。上記のパッケ−ジング細胞は更に、選択した所望の導入遺伝子配列であって、ハッケ−ジング細胞の上清で感染すると標的細胞内で発現するはずのものを有するレトロウイルスベクタにより形質転換されるようになっている。別の態様によれば、本発明の目的は、以下を具備することを特徴とするパッケ −ジング細胞である： a)フレンドレトロウイルスタイプのレトロウイルスの核タンパク質（GAG ポリペプチド）に由来するポリペプチドをコ−ドする、gag 配列と呼ばれるヌクレオチド配列； b)フレンドレトロウイルスタイプのレトロウイルスの逆転写酵素とインテグラ −ゼ（POLポリペプチド）に由来するポリペプチドをコードする、pol配列と呼ばれるヌクレオチド配列； c)gag、pol配列の発現を調節する転写制御シグナル； d)両種向性エンベロ−プ、例えばモロニ−白血病ウイルス（Mo-MuLV）のエンベロ−プ4070A に由来するポリペプチドをコ−ドする、env 配列と呼ばれるヌクレオチド配列； e)enb配列の発現を調節する転写制御シグナル。有益には、本発明のパッケ−ジング細胞は、ヘルパ−ウイルスと、内在性のウイルスを欠き、よって安全性の改善された条件を提供する。本願で言及するGAG、POL、ENV ポリペプチドは、ウイルスのヌクレオチド配列 gag、pol、env により発現されるポリペプチド及び／または糖タンパク質全てに対応するが、またはこれらポリペプチド及び／または糖タンパク質の一部に対応するか、またはトランケ−ションにより細胞標的の感染にむけたトランス補完の達成を可能にする場合には特に、このトランケ−ションにより修飾したものに対応する。本発明の特に魅力的な細胞は、一方でフレンドレトロウイルス株 FB29 の LTR 配列内に含まれている転写制御シグナルの制御下にある、フレンドレトロウイルス株PB29のgag、及びpol ヌクレオチド配列と組み換えを起こしていて、もう一方で誘導性プロモ−タ、例えばRAR βプロモ−タの制御下にある、スプ−マレトロウイルスタイプのレトロウイルスのenv ヌクレオチド配列と組み換えを起こしている、CNCMに番号I-1496の下に寄託されたDOGOM1細胞であることを特徴としている。スプ−マウイルスエンベロ−プをコ−ドしている配列の制御を誘導性プロモ− タで行うことで、形質転換細胞でのスプ−マウイルス配列の発現による溶解の可能性を防げるはずである。本発明の別の魅力的な組み換えトランス補完性細胞は、gag、及びpol配列の発現を調節するフレンドFB-29 レトロウイルスのLTR 配列内に含まれている転写制御シグナルが、非ウイルス性プロモ−タとその後に続くSV40ウイルスポリアデニレ−ションシグナルまたはオルタナティブなポリアデニレ−ションシグナルにより置換されていることを特徴としている。よって gag、及びpol 配列は、例えばRAR βのような誘導性プロモ−タ制御下におくことができる。別の態様によれば、本発明の主題は、レトロウイルスＲＮＡのパッケ−ジング用のトランス補完性組み換え細胞であって、上記の gag、及びpol 配列を誘導性ないしは条件性プロモ−タの制御下に具備し、さらに例えば両種向性のenv配列、例えばモロニ−ウイルスのエンベロ−プ配列4070Aに由来するものが、誘導性または条件性プロモ−タの制御下にあるものを具備していることを特徴とする。本発明の特別な態様によれば、トランス補完性細胞は、エンベロ−プポリペプチドをコ−ドしている、トランス補完用の発現ベクタのヌクレオチド配列は、例えば特定の細胞種により特異的に認識されるポリペプチドまたは糖タンパク質をコ−ドしているヌクレオチドを配列することによる置換により修飾されているが、またはそのような配列を加えることにより修飾されていることを特徴とする。よって得られた組み換え細胞は更に、選択したヌクレオチド配列（トランスジェニック配列）の、標的細胞ゲノム内での発現、及びまたはトランスファー及び／または組み込み用の、レトロウイルスベクタで形質転換され、該レトロウイルスベクタは有益にはフレンドレトロウイルスPB29株から構築される。よって、レトロウイルスベクタは、発現させるトランスジェニック配列を LTR 配列の制御のもとに置き、一方で、gag、pol、及びenvをコードする配列は少なくとも一部で欠失させ、またパッケ−ジング配列をベクタ構築物内に含める。上記したトランス補完性細胞の形質転換用に使用される有益なベクタは、図１に示してあり、CNCM に番号 I-1326 の下に 1993 年６月 30 日に寄託したベクタpFOCH29 である。標的細胞内へ発現させるトランスジェニック配列は、複製に必須でない部位で挿入される。他のレトロウイルスベクタも有益である。少なくともLTR配列の真ん中の一部、例えばLTR配列のU3領域が欠失している場合には、特にpFOCH29誘導体が最初に考慮される。別のベクタは、図２に示してあるベクタpFOCH29PL である。本発明によると、上記した補完細胞株で継代した、効果的に偽性タイピング（ pseudotyping）される欠失レトロウイルスベクタは如何なるものでも、導入遺伝子の遺伝子治療目的のために使用することが可能である。導入遺伝子のヌクレオチド配列は、天然にはベクタゲノムではないヌクレオチド配列であり、また特には発現、クロ−ニングまたは遺伝子トランスファ−を調節する配列である。それは天然または合成の配列、特にはハイブリッド配列であってもよい。トランスジェニックヌクレオチド配列のトランスファ−とは、ベクタで形質転換した標的細胞のゲノム内、または該ベクタの衛星内への、該ベクタが有する配列の組み込みを意味する、このようなトランスファ−は、組み換え、特には相同性組み換えにより得られる。よって、レトロウイルスベクタは、標的細胞のゲノムの修飾を通じて、外来性ヌクレオチド配列の恒久的な発現を仲介するが、該外来性配列は、該標的細胞のゲノム内への組み込みを行う能力に応じて選択される。トランスジェニック遺伝子を有する上記の欠損ベクタ、または一方でgagおよびpol配列を有し、もう一方でパッケ−ジングに向けられた補完用にenv配列を有するプラスミド発現ベクタは、好ましくは例えば形質転換、または電気穿孔により、パッケ−ジング細胞株内へ導入される。この形質転換により、標的細胞の形質導入後の組み換えを達成するのに適切なウイルス粒子の形成がおきる。これは、ベクタ内に含まれるトランスジェニック配列のクロ−ニング、トランスファ− 、または発現に向けて行なわれる。治療的に興味のある配列で、本発明のベクタとパッケ−ジング細胞株により標的細胞内へ導入されるものは、例えば特定の疾患の背景事情における非機能性の遺伝子の、正常な相当物に一致する配列であるが、またはそのアンチセンス配列と一致するものか、または特定の遺伝子のドミナントネガティブ変異体と一致するものか、または遺伝子の機能性阻害剤をコ−ドする配列に一致するものか、またはリポ−タ−の標識遺伝子に一致するものか、または特定の遺伝子の制御遺伝子若しくは制御配列に一致するものか、または標的細胞に新規の機能を与える遺伝子に一致するものである。本発明は、遺伝子補正、または腫瘍細胞破壊のための方法の戦略の改善による、癌の遺伝子治療のための適切な方法を提供する。第一の技術によれば、先天的に癌になりやすい素質の背景事情において遺伝している変異を直すこと、または ras 癌遺伝子経路、及び相同性経路のようなシグナル伝達の機能不全を直すことを目的にすることが可能であるが、この機能不全により、癌遺伝子活性化、または腫瘍サプレッサ−遺伝子の阻害と同様に、遺伝的不安定性若しくはＤＮＡ修復が関わるものを好む異常の補正が生じる。第二の戦略によれば、本発明は有益には、ガンシクロビルまたはアシクロビルを細胞毒性薬剤に変換する、ヘルペスウイルスのチミジンキナ−ゼ遺伝子、または 5-フルオロウラシル前駆体を活性薬剤に変換するシトシンデアミナ−ゼ遺伝子を利用するようなプロドラッグを活性化するために、または例えばサイトカイン遺伝子による腫瘍細胞の遺伝的改変によるか、または抗原提示細胞若しくはその前駆体（造血幹細胞）の改変、または免疫エフェクタ−細胞である T 細胞、B 細胞、LAK 細胞、若しくはTIL 細胞の改変により、免疫系を誘導するか若しくは刺激するために行なわれる。貧血の遺伝的疾患を直すことに関しては、本発明は、先天性の代謝異常、サラセミア若しくは鎌形赤血球症のような異常血色素症、うっ血、及び血液凝固疾患、または先天的髄鞘形成若しくは筋障害を直すのに適用することが可能である。本発明はまた有益には、治療またはAIDSのような感染症の予防の何れか、心血管疾患、肺、肝臓、及び消化器、神経筋、中枢神経系、胸膜、及び腹膜などの疾患に対して適用することが可能である。本発明の別の態様によれば、トランスジェニック配列は抗原、または抗原決定基、または抗イディオタイプをコ−ドしている。本発明の別の態様によれば、トランスジェニック配列は、抗体、特には抗原認識に必要な可変配列を含む単一鎖抗体をコ−ドしている。治療のプロトコ−ルの背景事情において、例えば免疫反応を惹起するための場合には、上記のような抗原決定基を含むベクタを、潜在的に使用することが可能である。本発明のツ−ルはまた、病原体に対しての患者のワクチン接種、または有益な薬剤の接種を、恒久的若しくは一過的に行うのに適している。トランスファ−は、細胞、組織、器官、または生物体の形質導入により行える。本発明を実施するための適切な細胞標的には、例えば線維芽細胞、内皮細胞、中皮及び間葉細胞、皮膚細胞（その中ではケラチノサイト）、肝臓の細胞（その中では肝細胞）、筋細胞、中枢神経系の修飾細胞、グリアル細胞、乏突起膠細胞、星状細胞など、上皮（その中では尿路上皮）、腺性上皮（その中では乳腺由来のもの）、肺上皮、消化器上皮と同様に、その起源をとわない細胞株がある。図１：FOCH29ベクタの制限地図。番号は、FB29株の配列による。 Cla→U3 140(7702-7845) U3→R410(7845-8255) R→CBS145(0-145) PvuII→BamHI208 PvuII→PvuII1098 PvuIIMT→PvuII1669 BsmAI→55/150/765/1766/2531/2684 Ｂ：POCH29ベクタの制限地図であって、図中では部位を、図１ A のPB29 株配列による以下の番号で示してあるとともに、構築に属する番号は（括弧内の番号）で示してある。図２：FOCH29-PL ベクタの制限地図図３：A,B：LTR-FB29del Psi-gag/polPB2 ９を含むプラスミドベクタの制限地図図４：RAR β-SＤ-Del Psi gag/pol FB29 を含むプラスミドベクタの制限地図図５：4070A 両種向性エンベロ−プを含む、プラスミドベクタ、「純粋」LTR の構築図６：スプ−マウイルス由来のエンベロ−プを含むプラスミドベクタ「純粋」 LTR の構築図７：4070A 両種向性エンベロ−プを含むプラスミドベクタ RAR βの構築図８：スプ−マウイルス由来のエンベロ−プを含むプラスミドベクタRAR βの構築例 A)レトロウイルスベクタ pPOCH29 の調製材料と方法１-ウイルスゲノム物質の出所プロウイルスのゲノムＤＮＡを pBR322 にクロ−ニングした（Sitbon et al., 1986）。ウイルス配列の7702にあるClaI 部位をEcoRI 部位で置換した後、ウイルスのLTR 全てを含む、2110塩基対（bp）のEcoRI-PvuII 断片を、pUC19のポリリンカのEcoRI、及びSmaI部位へサブクロ−ニングした。２-レトロウイルスベクタ POH29 の構築 EcoRI-PvuII断片を含むpUC19のポリリンカのHind III 部位を、Hind III で開いて大腸菌（E.coli）のＤＮＡポリメラ−ゼのラ−ジ断片（クレノウ断片）での埋め込み後に、BglII部位で置換し、Hind III 部位を再び作りださないBglII アダプターで連結した；このBglII部位を導入して、フレンドウイルスの天然のLTR の第二コピ−を含む865bp の BamHI-BamHI 断片を受け入れて、下流の LTR（または3’LTR）を構成するようにした。ＤＮＡポリメラ−ゼのクレノウ断片により埋め込んだ後に EcoRI 部位を再び作りださないリンカを使用して、pUC19 の Ec oRI部位をBamHI部位で置換して、このBamHI-BamHI断片を単離したが、下流のBam HI 部位はウイルス配列に内在性のものである。よってこの断片をバックボ−ンのpUC １９と連結させて導入したが、pUC19の、BglIIによる開裂開裂で、粘着末端と、BamHIにより作られた末端との組み合わせが可能になった。得られるプラスミドはpFOCH29 と呼ぶ。３-標識遺伝子の導入レトロトランスポゾン Tn5 に由来するネオマイシン耐性遺伝子（NeoR）の、 BglII-BamHI の cDNA断片（1500bp）は、３つの断片（pUC19-5'LTR BglII、NeoR BglII-BamHI、及び3'LTRBamHI-BamHI）の連結により、二つのウイルス性LTR の間に導入した。得られるプラスミドは、pFOCH29-Neo と呼ぶ。４-パッケ−ジング細胞株psi-CRIP と、線維芽細胞の感染ＤＮＡキャリア−なしの標準的な方法にのっとったリン酸カルシウム沈殿法で、10μｇのプラスミドを、１日前に５Ｘ10⁴の細胞をまいといた、直径35mmの培養皿に析出させて、プラスミドpFOCH29-Neo を、ダノス（Danos、1988）らの記載の両種向性パッケ−ジング細胞株psi-CRIP内に導入した。 psi-CRIP 細胞を、１０％ウシ新生児血清（Hyclone）を補充したダルベッコ改変イ−グル培地（DMEM，GTBCO-BRL）で増殖させた。形質転換後２日に、細胞をトリブシン処理して、1/20に希釈して、培地1ml当たり 1mgの最終濃度のジェネティシン存在下での選択にかけた。12日後に現れたコロニ−を選択して、１ウェル当たり１クロ−ンの濃度で24穴の培養皿に再移植した。集密に達したウェル内の細胞培養上清をとって、0.45μｍフィルタ−に通して浮遊細胞を除去して、8ug/mlの濃度のポリブレンの存在下で、24穴培養皿に等しくまいた、マウスの線維芽細胞NIH3T3 を感染させた。このNIH3T3 を、１０％ウシ胎児血清（PCS）で補充したDMEM中で増殖させた。ウイルスの組み込みは、集密に達したNIH3T3の溶解物でのPCRにより分析した。５-ポリメラ−ゼ鎖反応（PCR） 24穴培養皿で集密のNIH3T3の溶解上清を100μｌ回収し、そのうち10μｌを使用してPCR反応を、以下の緩衝液を使用して行った:25mMのMgCl₂を含有する、10 Ｘ標準PCR緩衝液（Perkin-Elmer/Roche MS）、それぞれのプライマを100ナノグラム（ng）、10mMのdNTPsを２μｌ（開始濃度が10mM で、それぞれのdNTPの等量混合物、すなわちそれぞれが 2.5mM）、クロ−ン化 Taq ポリメラ−ゼ（Perkin- Elmer/Roche MS）を４０サイクル用に２単位、25サイクル用には１単位、最終容量は50μl。二組のプライマを使用した。使用したオリゴヌクレオチド配列は、１）第一組が、２）第二組が、であった。増幅配列のサイズは、第一組の場合、末端gag/NeoR遺伝子の近いほうの３分の２の、900bp であり、第二組の場合、離れたNeoR遺伝子/341LTRの近いほうの半分の、610bp である。 94℃、５分の変性、GeneAmpPCR9600で４０サイクル（９４℃変性30”、55℃アニ−リング15”、72℃伸長30”）と、最後の伸長工程を10分間。試料（50μｌ中15μl）を1.2％アガロ−スゲル（Seakem，FMC）にのせて、80 Ｖ、45分間の水平電気泳動にかけて、臭化エチジウム（BET）蛍光の強度の分析に基づき、シグナルを検出した。６-感染力価の決定 NIH3T3を感染する能力を試験したそれぞれのクロ−ンを増幅して、PCRによる感染効率の分析の前に適宜、凍結させた。 PCR後、標準的な方法でNIH3T3を感染するために二つの本質的なクロ−ンを選択して増幅させた。 16時間の培養上清を、直径が３５mmの皿上の、それぞれの産生クロ−ンより、集密時に1mlとり、0.45μｍのフィルタ−に通して浮遊細胞を除去した。この上清を、同じ直径（35mm）の培養皿にある、50％の集密度にあるNIH3T3細胞と、培地1mlあたり8ugのポリブレンの存在下で接触させるようにした。培地を30分ごとにゆずりながら、細胞を約２時間30分、37℃でインキュベーションした。新鮮な培地を３容量、２時間30分後に加えた。感染性ウイルス力価初代の上清の連続的な希釈物を使用して、NIH3T3細胞を感染させた（未希釈の上清、並びに1/10、1/1000、及び1/100000の希釈）。感染２日後、細胞をトリプシン処理して、約1/20で、直径100mmの培養皿３つでサブ培養し、ジェネティシン（1mg/ml）を上清に加えて選択した。この実験方法は、以下の意味でより厳密な条件にされた：一方で、感染後すぐに薬剤を加えて、もう一方では、細胞のトリプシン処理なしで、直接的に選択にかけて、人工的に得られるクロ−ン数を操作することを避け、感染細胞に由来する娘細胞は、グル−プでとどまり、その場で唯一のコロニ−を形成する。逆に言えば、細胞がトリプシン処理されると、娘細胞が培養受け皿に広がり、人工的に独立したコロニ−が形成し、これが計測されると力価を人工的に操作することになる。サザンブロット未希釈の上清による感染２に日後、NIH3T3をトリプシン処理して、約1/20で、直径100mmの培養皿上でサブ培養して、そのうち一つをジェニティシンによる選択にかけた。集密時に、二つのクロ−ンのそれぞれの感染細胞のゲノムＤＮＡを、（選択後、または選択なしで）抽出して定量した。サザンブロットを行うために、ＤＮＡを二つの制限酵素、PstI 及びKpnI で消化した。消化の質と、それぞれのウェルに等量のＤＮＡを入れることを調節した後に、ナイロンハイボンドＮ膜（Amersham）上でトランスファ−を行った。ハイブリダイゼーションは、100塩基上流と 100塩基下流で挟まれているウイルスのL TR の全てを含んでいるプロ−ブを使用して行った。このプロ−ブはプライマ伸長法（Feinberg and Vogelstein，1983，1984）により、比活性が５Ｘ10⁸cpm/ug のアルファ³²Ｐ標識済みのdCTPで標識した。ハイブリダイゼーションは、50％脱イオン化ホルムアミド、５ＸSSEP、ＩＸデンハルト、5％硫酸デキストラン、及び0.2mg/mlの超音波処理サケＤＮＡからなる溶液中で、20時間42℃で行った。低厳密度の２Ｘ SSEP/0.1%SDSの溶液で５分間室温、10分間65℃で簡単に洗浄し、ついで３日間コダック XAR-5 フィルムに- 80℃で、Li-Plus増強スクリ−ン（Dupont-NEN）ともに露出した。７-ヘルパウイルスの産生のためのサ−チこのサ−チは、３Ｔ3BAG株上での動員試験により行った（Danos et al.,1988; Danos et al.，1991）。 3T3BA Ｇ細胞を最初に、感染したパッケ−ジング細胞の未希釈の上清で感染させた。前もって感染させた３Ｔ 3BAGの上清で、未露出の３Ｔ 3BAGを複数回連続して感染させて、この試験を感作した。結果１-レトロウイルスベクタPOCH29の構築フレンドマウスウイルスのウイルス株PB29 を単離し（Mathieu-Mahul et al., 1982）、組み込まれたプロウイルスのゲノムＤＮＡをpBR322にクロ−ニングした（Sitbon et al.，1986）。このゲノムＤＮＡを完全に配列決定した(Perryman e t al.，1991)。2120bpのClaI-PvuII ゲノム断片をpBR322内にクロ−ニングした。この断片には、ウイルスエンベロ−プのpISEをコ−ドする配列の最後の配列、 LTR全て、及びgag配列の3/5が含まれている。ベクタの構築のマトリックスを構成している。 ClaI 部位のEcoRI 部位による置換後に、EcoRI-PvuII 断片を、pUC19のポリリンカのEcoRI-SmaIにサブクロ−ニグした。このクロ−ンは、一方で、無傷のままでベクタの基本構造を形成していて、これには上流のLTR若しくは5’LTR、ウイルス転写のイニシエ−タの結合部位（プライマ結合部位、若しくは PBS）、パッケ−ジング配列、gag配列、及びpUC19のポリリンカの断片でEcoRI/SmaI 消化を受けていて、興味ある遺伝子の挿入に使用するもの、が含まれている。もう一方では、BamHI-BamHI 断片が、上流でEcoRI 部位をBamHI 部位で置換することによって派生していて、ドナ−スプライシング部位のすぐ下流に位置する、下流のウイルスの内在性BamHI 部位をうまく利用している。この断片を、ポリリンカのHindIII 部位が前もってBglII 部位で置換されていて、BamHI 酵素で作られる粘着末端を生じさせている基本的フレ−ムワ−ク内へ導入した。レトロトランスポゾンTn5 に由来し、ネオマイシンへの耐性を与える（NeoR）標識遺伝子を、二つのLTR の間に導入した。ドミナントネガティブなリコンビナ −ゼ表現型の、ス−パ−コンピテント細菌の形質転換後に、存在している配列の再組み換えの可能性を防ぐために、予想される配置の形質転換体を、構築物全てに関して探索した拡張制限地図に基づき選択した。そのうちの一つで、pFOCH29 と命名されたものを、ウイルス粒子産生ヘルパ−株の形質転換用に適切で十分な物質原を得るために、増幅して精製した。２-欠失ウイルス産生クロ−ンの単離 psi-CRTP パッケ−ジング株の形質転換：プラスミド pPOCH29-Neo を、ダノス（Danos、1988）らが記載の両種向性パッケ−ジング株のpsi-CRIP内へ、リン酸カルシウム沈殿法を、キャリア−ＤＮＡなしの標準的な方法により導入した。ジェニティシンによる選択にかけた後に、形成したコロニ−の40を取り、培養上清を使用してマウスの線維芽細胞（NIH3T3）を感染させた。パッケ−ジングされた欠失ウイルス粒子の最も産生的なクロ−ンのシリ−ズの初期的選択方法は、ポリメラ−ゼ鎖反応による遺伝子増幅法を使用することに基づいていた。ウイルスの組み込みは、集密に達したNTH3T3の溶解物でのPCRによって分析される。二つの別個のPCRプライマの組を使用した。１：一組目は、構築物中に含まれるgag配列の末端の断片と、ネオマイシン耐性遺伝子の近傍側の三分の二とを増幅する；２：二組目は、ネオマイシン抵抗性遺伝子の離れた側の三分の一と、下流のLTR（3’）の半分とを増幅する。他の３６クロ−ンよりも強いPCR シグナルに基づいて、４つのクロ−ンを選択した；この方法の繰り返しにより、二つのクロ−ンに対しては、このシグナルががなり強く出ていることを示す初期的デ−タが確認された。これら二つのクロ− ンを増幅して、産生細胞の培養上清を次いで使用して、構築物の効率を定量的に評価する目的で、NIH3T3をラ−ジスケ−ルで感染した。３-産生クロ−ンの評価定量的PCR PCR による半定量的分析は、NeoR遺伝子の離れた側の３分の１に対応する領域から下流のLTR(3')の中央の部分までを増幅する、プライマの組を使用して行った。それぞれのクロ−ンに対して、ネオマイシンでの選択後、または選択なしで、未希釈の上清で感染したNIH3T3細胞より抽出した、１μｇ及び３μｇのゲノムＤＮＡを使用した。それぞれのアッセイは二つ一組で行った。プラスミドpPOCH2 9-Neoの複数の希釈を、ゲノムＤＮＡの１ug等量に対して、0.1、0.5、及び１コピ−となるように計算して、すなわち7164bpのプラスミドに対してそれぞれ0.11 5pg、0.575pg、1.15pgとなるように、パラレルで試験した。 PCRは、24サイクルで行ったが、これはまだ反応の対数期にある。読み取りは、臭化エチジウム蛍光の、コンピュ−タ化したデンシトメ−タ−的分析（Cyhertec h）により行った。第一クロ−ンの場合、選択した感染細胞と選択しなかった感染細胞のそれぞれで得られたシグナルの強度の間で、顕著な差異が見られ、検出系がシグナル強度により飽和してしまう３μｇのものよりも、１μｇの試料において、よりはっきりとしていた（選択したものに関してはシグナルの７０％）。第二クロ−ンの場合、選択した細胞と選択しなかった細胞との間のシグナル強度の差異はなく、１μｇの試料も３μｇの試料も差異がなかった。これは、１００％に近いNIH3T3細胞の割合が、この産生クロ−ンの未希釈の上清により感染したことを示唆している。このクロ−ンの高い感染性の程度はさらに、培養上清で感染した NIH3T3 細胞がネオマイシン選択にがけられるときの細胞死亡率の欠如から疑われた。サザンブロット感染したNIH3T3細胞のＤＮＡを二つの制限酵素、KpnI とPstI で加水分解にかけたウイルス組み換え後のバンドの予想されるサイズは、使用するプロ−ブにより変化する。LTR内と、pL1C19のポリリンカの中で切断する酵素KpnI の場合、 LTRプロ−ブ3610bpの、一つの一定の断片サイズと、組み込み部位に対しての内在性ゲノムのKpnI部位の近さに応じた、サイズの異なる二つの断片とが、明らかになり、離れた側の三分の一のNeoR/近い側のLTR分節のプライマを使用したPCR に由来するプロ−ブでは、同じサイズ（3610bp）の断片が予想されて、二つの他の断片のうちのたった一つのみが、組み込みごとに変わっていた。 gagの中間部で二回、及びpUC19のポリリンカ内で一回切断する酵素PstI の場合、組み込み後に以前の二つのプロ−ブで同定された断片は、そのサイズが可変であるはずであり、第二プライマの組みでの PCR で産生したプロ−ブは、790bp の一定の断片を同定する。 KpnI とPstI により消化したプラスミドpFOCH29 の複数の希釈物をサザンブロットで分析した。これらの希釈は、１０μｇのゲノムＤＮＡに対して、それぞれ 0.1、0.5、1.0コピ−のプラスミドに対応している。更に、ネオマイシンで選択しなかった感染細胞のＤＮＡは、構築物の感染性を定量するために、整然と脇をそろえて置いた。選択された細胞は、感染対照の１００％を構成した。滴定：ウイルス希釈による、感染性ウイルス力価初代の上清の複数の希釈（未希釈の上清、1/10、1/1000、及び1/100000の希釈された上清）を使用して、NIH3T3 を感染した。細胞は、直径35mm のウェル当たり、0.5ml に比例させて、ウイルス上清で感染させた。選択薬剤を感染後、正確に２０時間で、細胞のトリプシン処理なしで培養皿へ加えた。選んだ感染性力価は、コロニ−が生じた最終的な希釈度で観察されたコロニ−の数に、希釈の逆数をかけた数字に対応している。第一クロ−ンの場合、最初の産生細胞の力価は２Ｘ10⁶pfu/ml である。第二クロ−ンの場合には、力価は10⁶pfu/ml である。一方で最初の継代を保存するため、もう一方で数カ月間の連続的培養を維持するために、二つの産生クロ−ンを通常どおりに凍結させた。連続的滴定（ウイルス上清の希釈）により、力価の進行性減退を同定することが可能になった。第一クロ−ンの場合、二カ月間の連続的培養の間に、２Ｘ10⁶以上からわずがに10¹にまで、力価が変化した、この劇的な力価の低下は、同心性の外見と剥離の状態を有する、培養細胞の増殖の変化を伴った。第二クロ−ンの場合、二カ月間の連続する培養中に、力価は10⁶以上から10⁵にまで変化した。この中程度の力価の低下は、培養細胞の形態及び増殖に関しての如何なる変化も伴っていなかった。４-3Ｔ 3BAG上での、ヘルパ−活性のアッセイこの研究は３Ｔ 3BAG株での動員試験により行った（Danos et al.,1988;Danos et al.，1991）。３Ｔ 3BAG細胞を最初に、感染済みパッケ−ジング株の未希釈の上清で感染した。前もって感染した３Ｔ 3BAGの上清での、未露出の3T3BAGの感染を複数回の連続サイクルで行い、アッセイを感作し、陰性であることを証明した。更に、ネオマイシンに抵抗性のある細胞コロニ−は、未露出のNIH3T3を、ネオマイシンで選択した感染済みNIH3T3の上清と接触させるように置いた後では検出されなかった。５）組み込み部位ヒト、およびヒト以外の霊長類細胞を使用して、感染後のウイルスの組み込み部位の数を同定した。マウス細胞は、これらの細胞内に、複数のレトロウイルスまたはレトロウイルス様配列に関わる組み込み顕著なバックグラウンドが存在するかぎり、非常に緩やかな質の兆候を提供する。この目的のため、サルVERO細胞をウイルス上清の複数の希釈物で感染した。10^-2 の希釈物の場合、独立したクロ−ンが得られ、それぞれは、単一的性質のウイルス組み込みから始まったものである。一方でウイルス構築物内で、もう一方で、組み込み部位から種々の長さで離れた、細胞宿主のゲノムＤＮＡ内において、切断する制限酵素を使用することにより、組み込みイベントと同様に、種々のサイズの多くの制限断片を得ることが可能になった。この場合、酵素XbaIまたはSa lIを使用した。６）ウイルス力価の安定性-マスタ−バンクシステム均一な、ウイルス産生細胞ストックを構成して、生体内病原性の可能性を調べるために、以下の方法により、複製適格なウイルスがないように徹底的に制御した：・３Ｔ 3BAG細胞での動員試験；・NIH3T3での増幅；・新生マウスの腹腔内接種。この細胞バンク（マスタ−細胞バンク MCB）より始めて、ワ−キング細胞バンクを構成した。得られたウイルス力価は、数カ月間安定であり、20Ｘ10⁶から３Ｘ 10⁷cfu/ml のオ−ダ−であった。10^-7の希釈を含んでいたアッセイでも、結果が得られた。力価はこの強度レベルでは、数ケ月間、かなり安定であった。 B)付加的なレトロウイルス構築物図２に示してある、POCH29-PL（FOCH29-純粋LTR）と命名した、特に3’LTRから上流を縮小したLTRを有する構築物を作成した。この構築物により、ウイルスＬＴＲから上流のエンベロ−プの104の末端を含む、140bp の切り出しの遺伝的安定性における有益性を調べることが可能になった。この構築物は、パ−トＢ１−１に記載したEcoRI-PvuII断片を含んでいるプラスミドpUC19 より作成された。制限酵素EspI（または IsoCelII）により、部位7 864（すなわちういるす LTRの-23）で酵素的に切断した。5’末端で、EcoRI 切断により産生した末端を、LTR（140塩基、そのうち103がエンベロ−プの塩基である）の２３塩基に相補的な二本鎖合成オリゴヌクレオチドに、人工的に付加した。3’末端では、このオリゴヌクレオチドは粘着性SpeI 末端に対して相補的である。オリゴヌクレオチド配列は以下のとおりである： C)パッケ−ジング細胞株を通す補完用の構築物１）GAG-POL 構築物（元のパッケ−ジング細胞株の仕上げ用）フレンドウイルスＦＢ２９株由来配列を使用する種々の工程を以下に記載した。核タンパク質及び逆転写酵素の補完性gag／pol構築物は、フレンドウイルスの PB ２９株から由来する。基本的構造は、段落中に記載の構築物から組み立てられたが、このなかで LTR はそのままにするかまたはRAR βプロモータで置換した。 gag カプシドタンパク質（＋６１９より開始）をコードする配列の上流に位置するパッケージング配列の大きな欠失を、以下のようにして行った：SpeI（またはIsocelII）（＋２８０のユニークな部位）とPstI（＋５６０−５６１）で切断して２８０塩基対を除去する。合成リンカのSpeI-PstI（５'−CTAGTGCA-3'）を合成して、プラスミドにアニーリングし、再びHindIII で切断する。次いで連結を、gag及びpol配列の大部分を含む第三断片である、PstI-HindIII で行う。あるいは、合成のSpeI-PstI アダプタを単にPstI リンカで置換した。次いで、第二工程（形質転換と陽性組み換え体の選択後に）では、GAG の ATG を含むPstI-PstI（５６１−７３７）を、gag配列の全体性を再確立するために、元の位置にクローニングした。この小さい対称的なPstI-PstI断片のクローニングの配向は、HaeII（７２０位、第二の部位は４２９１に位置しているが配向には影響しない）／AhaIII（１０３１位にある、FB２９配列全体でユニークな部位）、またはEspI（LTRの７８６４位にある、FB ２９配列全体でユニークな部位）での酵素的消化により確立する。FB ２９ゲノム全体に対応するＤＮＡ配列の、pUC19 のHindIII 部位における、このクローニング方法の結果として、pol 配列末端が以下のようにして回収された:まずHindIII（５０６０）とSmaI（=isoBstI1071）（６３３５位のユニークな部位）で切断する；精製後、この断片を再びSmaI（６０７９）で切断して、最小のエンベロープ配列（２４４塩基）を具備した１０１９塩基の断片を産生させる。この断片をpUC18のポリリンカ内のHindIII-HincII へサブクローニングした。SV40のポリアデニレーションシグナルは、構築物から下流に配置した（プラスミドpCRIPgag-2,Danos and Mulligan、１９８８）。５‘末端のNheI、３’末端のEcoRI断片を、SV40-polyA含有プラスミドより削除するが、これには SV40 初期プロモータのポリアデニレーションシグナルのHp aI-EcoRI断片が含まれている。この断片をさらに「XbaI（NheI粘着性、または、 XbaIはフレンドpolのこの末端で制限するのでXbaIの部分消化）で、あるいは、p UC18中へのpol末端のクローニング前の初期的工程として、または平滑末端で、またはpUC18ポリリンカのKpnI部位へのSpeI リンカ(NheI制限に粘着性である)の挿入後にクローニングして」、下流をEcoRI粘着性にする。 POL及びポリＡ配列を、5'-HindIII、3'EcoRI制限により一単位としてpUC18から除去し、連結は、上記の段落に記載のプラスミドpUC19／純粋LTR/del-psi／GA G／２／３POL で行った（図３）。同様の構築物は、ウイルス性LTR を、RAR βのような非ウイルス性プロモータで置換することにより、確立することができる（図4A）。その設定では、RAR-βプロモータのBglII-BamHI断片を、pUC19 のBamHI 部位にクローニングする（BglII-BamHI 断片には二つのBamHI 粘着性末端がある）。正しい配向は、BamHI部位（３'）の上流８５塩基の、RAR βプロモータからの非対称性の二つの断片を生じるEcoRI部位をうまく利用した。このプラスミドを更に、RAR βプロモータを具備したBclIまたはScaI／PstI（3'）断片（それぞれ、１８０３，または１８４１）を第二工程で精製するために、5'のBclIまたはScaI 、及び3'のAflIIIで開裂させた。該断片が最初からAflIII消化（それぞれ、２２００，及び２２５０塩基）で単離できない場合には、PstI切断で生じる断片の分離はできない。精製した断片は更に、LTR-GAG/POLプラスミドから除去されたPst I／ScaI またはBcgI断片と連結される。後者には、ウイルスLTR（７８３８，または７８７５塩基）のないgag／pol配列が含まれている。前の構築物をPstI で開裂してスモール断片を配向的な様式（上記してある）でクローニングすることにより、１７６塩基のPstI-PstTgag断片を回復して構築物を完成させた（図4B）。２）両種向性ENV構築物（図５及び７）モロニー白血病ウイルス(Mo-MuLV)の両種向性株(Chattopadhyay et al.,1981) 由来の両種向性エンベロープ配列の４０７０Aが、Psi-CRIP細胞株で使用されたものと同様に、エンベロープ補完に使用されている。形質転換は、ヒスチジノールまたはハイグロマイシンのような選択を可能にする第二遺伝子とともに共形質転換する。二つのオプションを考慮した： a)下流にSV40由来のポリアデニレーション部位を有する、ウイルスの5'LTRからの転写：BglII-EcoRI断片を、pCRIP Amgag-構築物より切り出し、PB29配列のM scIにおけるBglII リンカを挿入して5'末端での粘着性クローニングを行わせるようにした後に、更に純粋LTR構築物に連結する。そして3'末端のXbaI 平滑（ベクタ）−EcoRI（SV40-ポリＡシグナル）も行う。 b)薬学的処置により誘発される誘導性プロモータ、特には上記したレチノイン酸βプロモータからの転写:ここではエンベロープ配列が構築物内で、gag／pol 配列を置換していて、この構築物はセクションCで記載されている、SV40−ポリA 配列が保持されているものである。実際に、ウイルスLTRは、セクションAに記載されているこの構築物より、レチノイン酸受容体の末端（３'末端のBamHI、 BglII 粘着性）に対して粘着性末端を放出するBglII 制限によって、切り出される。 RAR−β両種向性エンベロープは、以下のようにして仕上げることができる：' LTR-env ampho-SV40 polyA'をうまく利用した実験的省略法により、構築した、以下のようにクローニングした：機能的な利点を有する転写制御配列の全てを含んでいる、レチノイン酸βプロモータの、９０２塩基のBglII(-７４７部位)−Ba mHI（＋１５５）断片を精製して、BglIIリンカがHindIII にクローニングされているpUC19内へクローニングした。上記した構築物と、LTR-env-AMPHO 構築物（これからは、断片含有エンベロープ配列が保持されている）の両方に由来するXm nI（pUC19 内を切断する）−BglII 断片は、連結により結合している。配向には RAR−β断片のEcoRI を使用した；これは両種向性エンベロープ配列が、別個のE coRI部位を有しているために可能であった。３）スプーマウイルスENV−構築物（図６及び８）第二の例において、スプーマウイルスのエンベロープ配列を使用した。スプーマウイルスエンベロープ配列で、上記した構築物内の４０７０Ａ両種向性エンベロープ配列を置換したが、ここではSV40−ポリA配列は保持されている。スプーマウイルスのEcoRI−EcoRIゲノム断片をpUC19のEcoRI部位にサブクローニングする。エンベロープ発現構築物内で使用するこの断片は、BanI消化により得られ、これはスプーマウイルスゲノムのエンベロープ−ATG の上流３０塩基を残し、一方、終結シグナル近くの下流のEcoRI部位は、まだ使用される（Flugel et al.，1987）。両種向性エンベロープと同様に、二つのオプションを選択した： a)SV40由来の下流ポリアデニレーション部位を有する5'−ウイルス性LTRからの転写:LTR−スプーマウイルスエンベロープ構築物を確立するために、スプーマウイルスエンベロープのEcoRI−EcoRI断片を、クレノウ酵素で処置して、pUC18 末端のpol／polyA-SV40内のHindIII／クレノウSmaI部位へクローニングし、それによってpol末端を置換する。スプーマウイルスのエンベロープ配列のBanI−Eco RI断片で、SV40-polyAが後に続くものを更に切り出して、5'LTR−FB29純粋−LTR プラスミドのMscI／HindIII 部位へクローニングする（平滑末端はクレノウで処理）（パッケージング配列と gag 配列とを切り出した）。配向性は、PvuIIでの消化により確立する。 b)薬学的処置で誘発される誘導性プロモータ、特には上記したレチノイン酸β プロモータからの転写：RAR−βプロモータ-スプーマウイルスエンベロープ構築物を確立するために、SV40−polyA が後に続いているスプーマウイルスのエンベロープを含んでいる、上記したBanI−EcoRI断片を、pUC18プラスミドのKpnI−Ec oRI部位へクローニングした。ポリリンカないのBamHI部位を次いで開裂して、その中にRAR−βプロモータをクローニングする（このBglII-BamHI 断片の両末端はBamHI粘着性である）。配向性は再び、RAR−βプロモータ内に非対称的な二つの断片を生じるEcoRI部位をうまく利用して確立する。それぞれの工程で、興味ある構築物に対して細胞クローンを、ウイルス補完性タンパク質の産生強度レベルとその安定性とにより、選択する；マスター細胞バンクをそれぞれの選択細胞株に対して調製する。 D)イヌ胎児細胞「DOG」より、パッケージング細胞株を確立するＤ.1 イヌ胎児細胞の選択胎児イヌ細胞の選択は、以下の方法のようにした： a)１０％ウシ胎児血清と１０％ウマ血清とをさらに含む ISCOVE リッチ培地（ GIBCO）で、選択した真核細胞を培養する； b)２０％ウシ胎児血清を含むDMEM培地で、培養細胞を継代して、選択した細胞を回収し、CO₂なしで該細胞を１ヶ月培養する； c)速い増殖速度を有する細胞を選択する； d)選択した細胞を、１０％ウシ胎児血清を含んでいるDMEM培地で継代する； e)工程ｄで回収された細胞を、１０％の新生児ウシ血清(Hyclone)を含むDMEM 培地で継代する；そして、 f)工程e)の最後に、選択した細胞を回収する。Ｄ.2.パッケージング細胞株の調製 a)gag／pol配列によるDOG細胞株の形質転換（DOGP ２９）形質転換は、標準的な方法により、キャリアＤＮＡなしでリン酸カルシウム沈殿を使用した：１０マイクログラムのプラスミドは、５Ｘ１０⁴の細胞が前日にまいておいた直径３５mmの培養皿に析出させた。細胞は、１０％の新生児ウシ血清（Hyclone）を含むダルベッコ改変イーグル培地（DMEM-GIBCO-BRL）で増殖させた。形質転換の２日後、細胞をトリプシン処理し、１／２０に希釈して、選択培地へまいた。１２日目に出現しているコロニーをピックアップして、ウェルあたり１コロニーの割合で２４穴培養皿にまいた。 DOGP29 は、以下に記載の構築物LTR−SD−欠失psi−GAG／POL（フレオマイシン抵抗性の選択遺伝子との共形質転換）で、以下の基準で最適化したイヌ胎児細胞の形質転換により得られた：１−内在性レトロウイルスがないこと、２−付着性細胞であること、3−増殖が速いこと、４−安定で均一な形態を有すること、５−容易に形質転換できること、６−非常に大きい数の継代を許容すること（アッセイのための、過度な人工的継代）、７−適宜LTC-IC（Hemato）を維持することが可能なこと。マスタ細胞バンク系は、ウイルス補完性タンパク質の産生強度と、逆転写酵素（POL）の発現安定性により選択したイヌ細胞のクローンより作り出した。パッケージング細胞株は、以下の評価アルゴリズムにより評価した：初期評価：効率の証明；二次評価：興味ある遺伝子を有する欠失レトロウイルスベクタの補完用のウイルスタンパク質の発現の、もっとも正確なレベルを有する細胞株の選択。両方の例では、使用する方法は同じであり、二番目の場合に、定量的評価と同様に安定性の問題も、考慮に入れる。組み合わせでの評価戦略：１／要求される配列の存在の分子的証明：後者は、ウイルス補完性タンパク質をコードする配列に特異的なポリメラーゼ鎖反応（PCR）に依存する。使用したプライマは以下のの通りである： gag配列（フレンドウイルスFB29株） pol配列（フレンドウイルスFB29株） env配列（モロニーウイルス由来の4070A両種向性エンベロープ） env配列（スプーマウイルスHFVまたはHSRV）２／GAG/POL タンパク質の発現に向けられた、パッケージングシグナルが欠失した基本的構築物の機能的効率の評価 −gag/pol 構築物を DOGP29細胞内へ形質転換する；選択を許容する遺伝子を有するプラスミドで共形質転換する； −POLの発現：後者を逆転写酵素アッセイで試験する； −GAGの発現：後者を、細胞抽出物で行うウェスターンブロットで試験する；このアッセイで使用する抗体は、GAG−CA p ３０に特異的なヤギポリクローナル血清である（標準的な技術では）。３／レチノイン酸β受容体プロモータからおこる、配列の発現の誘導性 −細胞を、１０−６Ｍの濃度の、全てがトランスのレチノイン酸（ATRA）で処理する；誘導はATRA付加後２４から４８時間で評価するのがもっともよい。４／マウスのウイルス（特にはモロニーまたはフレンド白血病誘導ウイルス）に由来する欠失レトロウイルスのウイルス粒子と、スプーマウイルスエンベロープとの偽性タイピングパッケージング細胞株での、スプーマウイルスのエンベロープの発現 −HSRVエンベロープに特異的な抗体を使用したウェスターンブロット； −エンベロープ発現細胞での免疫蛍光。標的細胞の感染： −マウスのウイルス（特にはモロニーまたはフレンド白血病誘導ウイルス）に由来する、欠失レトロウイルスベクタが有する遺伝的配列を、HSRV−エンベロープ仲介性ウイルス感染により、天然の細胞へ導入する。もっともよい DOGgag／pol（DOGP29）クローンは、特定条件のみが記載されていて残りの条件は当業者に知られている、以下に記載のプロトコールにより、逆転写酵素の測定により、選択した： DOGP29細胞上清を含む試料を、５０μｌで、９６穴皿に入れる（マルチチャンネンルピペットで）；以下の試料を放射能の対照として使用する：H₂O、VIH⁺、対照細胞またはドナーリンパ球培養上清；１０μｌの緩衝液Aを加える（KCl＝0.5M、DTT＝50mM、TritonX100＝0.5%）；次いで、４０μｌの緩衝液Bを加える（TRIS HCl(pH7.8)0.5M中の１０μｌのEG TA、１μｌの0.5M MgCl₂、３μｌの３ HdTTP（1mCi/ml）、１０μｌの 50D/mlの polyA-オリゴdT、１６μｌの水）；試料は、３７℃で１時間インキュベーションする。次いで、２０μｌの緩衝液 C「60%TCA 中の 120mM Na₄Ｐ₂O₇」。＋４℃で１５分後、オーブンを６０℃にする、真空ポンプ、注入器、およびスカトロン（SKATRON）フィルターのスイッチを入れる。用量をチェックする。アルコールをチャンネル２に設定して、水を１に、脱汚染溶液を３に設定する。スカトロンを次いでマニュアルポジションにして、洗浄する：１．チャンネル３：脱汚染溶液（TFD ４２％）を５秒間で二回２．空気３．アルコール：２０“ ４．空気５．蒸留水：２０から３０秒水キャップをTCAに、アルコールキャップを水に。フィルタをオーブンで６０℃で乾燥させる。フィルタを更に切断し、2ml のシンチレーション溶液の入った専用管内にいれて、攪拌する。すぐさまに管を分析できない場合、＋４℃で保存した。データはコンピュータで読みとり、cpm で表す。クルター(coulter)はまた、平均で４つのウェルを提供する。緩衝液A KCl（塩化カリウム）0.5M ７．４５ｇ DTT（ジチオスレイトール）50mM １．５４ｇ TritonX100 ０．５％１ｍｌ無菌化蒸留水２００ｍｌまで＋４Ｃで保存試験あたり１０μｌ緩衝液B EGTA 5mM 0.5MのTRIS（pH7．8）中１０μｌ MgCl₂0.5M １μｌ 3HdTTP（１mCi／ml）３μｌ polyrA−オリゴdT 50D/ml １０μｌ無菌化蒸留水１６μｌ適切な量で、即時調製する。単一試験あたり４０μｌ緩衝液C （60%のTCA中の120mM Na₄P₂O₇）１０．７ｇのPpNa（＝ピロリン酸ナトリウム＝Na₄P₂O₇・10H₂O）をはかりとる。 120gのTCA（トリクロロ酢酸）を加える。無菌化した蒸留水を２００ｍｌまで加える。＋４℃で保存。スカトロン洗浄緩衝液（５％TCA中の,1.2mMのピロリン酸ナトリウム） 21.4gのNa₄P₂O₇・10H₂O（ピロリン酸ナトリウム）をはかりとる。 200mgの純粋なTCAを加える。無菌化した蒸留水を４リットルまで加える（３８００ｍｌ）。最適化した逆転写酵素活性アッセイマウス白血病誘発ウイルスの逆転写酵素の検出用に最適化されたアッセイは、塩化マグネシウムを含有した緩衝液中でのポリメラーゼ鎖反応ではなく、マンガンの存在下で行った（Maniatis、Molecular Biology,A Laboratory Manual、 Cold Spring Harbour、1990）。プロトコールは以下の通りである：逆転写酵素活性を試験する培養上清の５０ μｌを、以下を含んでいる５０μｌの２Ｘ溶液と混合する:TrispH8.3、0.1M;DTT 、25mM；MnCl₂、1.2mM；NaCl、125mM；NP401/1000；dTTP、0.02mM；dTTP アルファ−32P（SA：3000Ci／mmol）、１０μCi／ml；オリゴ dT−PolY rA、２０μｇ／ml；及び必要な容量のH₂O。試料は、ドットブロット装置を利用して、３７℃ で３時間インキュベーションした。それぞれの反応物を、ドットブロット装置を使用してワットマンのDE81 紙で濾す。ワットマンの3MM紙を二枚、DE81 の下にひく。スロットブロットを使用して、２Ｘ緩衝液による３回の洗浄を複数回繰り返す。次いで、フィルタを2XSSC中で１０分間３回、洗浄する。このフィルタを最後に95%EtOHで１分間２回洗浄して、すぐに乾燥させる。このフィルタを、増幅スクリーンを使用してフィルムに露出する。 b)env配列を有するDOGP29細胞株の形質転換形質転換は、上記のgag／pol構築物に対して記載したものと同じ条件で行う。二つの異なる構築物を確立する： −スプーマウイルスエンベロープが FB29-LTR により発現される第一のもの（ LTRに対してDOGP29L）； −誘導性プロモータ、特にはレチノイン酸β受容体プロモータにより発現されるもう一つのもの（結果的には、エンベロープの発現が不十分であることが証明される場合には、HSV−チミジンキナーゼ遺伝子エンハンサに結合している）。例として、レチノイン酸β受容体プロモータを使用する(プロモータRAR−β) 。レチノイン酸β受容体プロモータの5'-HindIIIと3'-BamHI断片(de The et al. ，1990)を、確立された構築物全体内に挿入する。上記の構築物から、BglII リンカをFB29のMscI部位に挿入し、レチノイン酸β受容体プロモータの5'-HindIII と3'-BamHI断片を、パッケージングシグナルのないgag／pol配列の上流へ置く。 c)スプーマウイルスエンベロープに対してのDOG29gag／pol／envの選択この選択は、抗スプーマウイルスエンベロープ抗体を使用した免疫蛍光アッセイにより行った。第一段階の工程の細胞においては、組織学的切片を調製して、更に蛍光活性化細胞ソーター分析（FACS）にかけた。別の選択様式は、ウェスターンブロットを行うことである。 d)gag／pol／及びenv細胞株の感染性を調べる機能アッセイ感染の性質を確立するアッセイにでは、選択部位を有する欠失レトロウイルスベクタを有する初期の形質転換工程が関わる。このようなベクタは、セクション Aに記載されている。 −N1H3T3繊維芽細胞の感染感染は、セクションA-4に記載されている技術により、集密状態まで増殖した培養細胞の培養上清で行った。 −ポリメラーゼ鎖反応（PCR）セクションAに記載の技術により行った。使用したプライマは次の通りである： −選択遺伝子を含む欠失レトロウイルスベクタによる形質転換後の、ウイルス力価の確立選択した方法は、上記のセクションAのポイント６に記載されているが、以下のようにして行った選択工程のみが例外である：感染後２０時間で、G418を上清に加えて（1mg/ml）、細胞選択を開始した。 −伝搬するコピー数 NIH3T3の標準的なアッセイに加えて、構築物内に選択遺伝子を有さない最適化した欠失レトロウイルスベクタの場合に特に適する別の滴定方法が、提案されている。ついでこの滴定は、分子的方法に基づいている：サザンブロットを利用して、伝搬するレトロウイルスのゲノムコピー数の平均値の定量的測定に特に基づいている。後者は、感染細胞由来し、興味ある細胞株により補完されているレトロウイルス構築物のLTR内を切断する能力に応じて選択した制限酵素により加水分解されたＤＮＡを有している（例えばKpnI）；レトロウイルス構築物を含むプラスミドを適切に希釈したもので考慮しているものを、同じ制限酵素を使用して消化し、同じブロットに置く。サザンブロット未希釈の上清での感染後２日で、NIH3T3をトリプシン処理し、１／２０で、直径100mmの培養皿でサブ培養し、そのうちの一つをジェニティシンによる選択にかける。集密時に、２クローンのそれぞれに対して、感染細胞ゲノムを、選択後、または選択なしで、抽出して、定量する。サザンブロットを行うために、ＤＮＡを二つの制限酵素、PstIおよびKpnI で消化する。消化の質と、それぞれのウェルへの等量のＤＮＡの挿入の調整後に、トランスファーを、ハイボンドＮ膜（アマシャム）上で行った。ハイブリダイゼーションは、100塩基上流及び100塩基下流で挟まれたウイルスLTR全体を含むプローブで行った。プローブはプライマ伸張法（Feinberg and Voglestein，1983，1984）により、アルファ-³²P で標識したdCTP（比活性は、5X10⁸cpm/ug）により標識した。ハイブリダイゼーションは、以下からなる培地で４２℃、２０時間で行った：５０％脱イオン化ホルムアミド；5XSSEP;1XDenhardt's；５％硫酸デキストラン、及び0.2mg/mlの超音波処理済みサケＤＮＡ。以下の低厳密度の溶液で、室温で５分間、及び６５℃で１０分間の軽い洗浄を行った：2XSSEP/0.1%SDS。次いで、−８０℃でコダック−XAR −５フィルムに、LI−プラス増強スクリーン（Dupont−NEN）とともに露出した。ヘルパーウイルスの産生のサーチこのサーチは、上記セクションAのポイント７の記載により行った。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．選択したヌクレオチド配列（導入遺伝子）の、標的細胞のゲノム内へのトランスファー、及び／または組み込みを許容する真核細胞であって、該細胞が以下の特徴を示すことで特徴づけられる、トランス補完による組み換えレトロウイルスRNAのパッケージング用の、上記真核細胞：・内在性のレトロウイルスを欠いている動物種の細胞より選択され、好ましくは胎児、または胚の細胞、特にはイヌまたはウサギのものから選択されるもの；・長期間安定である、均一な形態を有するもの；・腫瘍起源ではないもの；・形質転換を前もって行わずに、ＣＯ₂を欠く最小培地で選択されるうる能力のあるもの；・増殖速度の速いもの。２．トランス補完による組み換えレトロウイルスのパッケージングのための、請求項１に記載の真核細胞であって、標的細胞のゲノム内への、選択したヌクレオチド配列（導入遺伝子）のトランスファー、及び／または組み込みを許容し、内在性のレトロウイルスを欠いている動物種の細胞より選択され、好ましくは胎児、または胚の細胞、特にはイヌまたはウサギのものから選択される該細胞が、以下の方法にそって選択して得られることを特徴とする、上記の細胞： a)１０％ウシ胎児血清と１０％ウマ血清とを更に含んでいる、GIBCO 社のイスコーブのリッチ培地で、選択した真核細胞を培養する； b)２０％ウシ胎児血清を含むDMEM培地で培養細胞を継代して、選択した細胞を回収して、CO₂なしで培地中で１ヶ月培養する； c)増殖速度の速い細胞を選択する； d)１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地で選択した細胞を継代する； e)d)でハイクローン社の１０％ウシ新生児血清を含むDMEMに回収した細胞を継代する； f)e)の最後に選択した細胞を回収する。３．１９９４年１１月３０日に、CNCMへ番号I-１４９６の下に寄託されたイヌの胎児細胞であるDOGOM1 であることを特徴とする、請求項１または２に記載の細胞。４．トランス補完（トランス補完性組み換え細胞）による組み換えレトロウイルスRNAのパッケージングを許容する組み換え細胞であって、該細胞が、例えばトランス補完のポリペプチドまたは糖蛋白質をコードしているヌクレオチド配列での形質転換または感染により修飾されている、請求項１乃至３の何れか一項に記載の細胞であり、該配列が少なくとも二つのベクタにより供給されることを特徴とする、上記の細胞。５．トランス補完（トランス補完性組み換え細胞）による組み換えレトロウイルスRNAのパッケージングを許容する組み換え細胞であって、例えば以下のものによる形質転換または感染により遺伝的に改変された、請求項１乃至４の何れか一項に記載の細胞：１）レトロウイルスのエンベロープに関しての補完用の第一発現ベクタであって、選択したヌクレオチド配列（標的配列）の、標的細胞のゲノム内へのトランスファー及び／または組み込みを許容し、補完用の該ベクタが、エンベロープポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を具備していることを特徴とする、上記の発現ベクタ；２）レトロウイルスベクタのトランス補完用の第二発現ベクタであって、標的細胞への、以下を具備したヌクレオチド配列のトランスファー及び／または組み込みを許容する、上記のベクタ a)フレンドレトロウイルスタイプのレトロウイルスの核タンパク質（GAG ポリペプチド）に由来するポリペプチドをコードしている、gag 配列と呼ばれるヌクレオチド配列； b)フレンドレトロウイルスタイプのレトロウイルスの逆転写酵素及びインテグラーゼ（POL ポリペプチド）が含まれる、誘導体ポリペプチドをコードしている、pol配列と呼ばれるヌクレオチド配列；および、 c)gag及びpol配列の発現を制御する転写制御配列；ここで上記の第一及び第二発現ベクタはパッケージングシグナルを欠いている。６．請求項１乃至４の何れか一項の細胞であることと、以下を具備することを特徴とする、トランス補完性組み換え細胞： a)フレンドレトロウイルスタイプのレトロウイルスの核タンパク質（GAG ポリペプチド）に由来するポリペプチドをコードしている、gag 配列と呼ばれるヌクレオチド配列； b)フレンドレトロウイルスタイプのレトロウイルスの、逆転写酵素由来、及びインテグラーゼ（POLポリペプチド）由来のポリペプチドをコードしている、pol 配列と呼ばれるヌクレオチド配列； c)gag、及びpol配列の発現を制御する転写制御シグナル； d)スプーマウイルスファミリーのレトロウイルスのエンベロープ（ENV ポリペプチド）由来のポリペプチドをコードする、env 配列と呼ばれるヌクレオチド配列であって、該ENVポリペプチドがレトロウイルスRNAのパッケージングを許容する、上記のヌクレオチド配列； e)上記のenv配列の発現を制御する転写制御シグナル。７．請求項６に記載の、トランス補完性組み換え細胞であって、一方で、フレンドレトロウイルスFB２９のLTR配列内に含まれる転写制御シグナルの制御下にある、フレンドレトロウイルスFB２９株のgag及びpol と組み換えを起こしていて、もう一方で誘導性のプロモータ、例えばRAR βプロモータの制御下にある、スプーマウイルスタイプのレトロウイルスのenvヌクレオチド配列と組み換えを起こしていて、CNCM に番号I-１４９６の下に寄託されていた、DOGOM1 細胞であることを特徴とする、上記のトランス補完用組み換え細胞。８．請求項７に記載のトランス補完用の組み換え細胞であって、一方で非ウイルス性のプロモータ、例えばRAR βプロモータのような誘導性プロモータ、または条件的プロモータの制御下にある、フレンドレトロウイルスFB ２９株の gag 及びpol ヌクレオチド配列と組み換えを起こしていて、CNCMにI-１４９６の下に寄託されているDOGOM1細胞であることを特徴とする、上記のトランス補完性組み換え細胞。９．請求項１乃至４の何れか一項の細胞であることと、以下を具備していることとを特徴とする、トランス補完性組み換え細胞： a)フレンドレトロウイルスタイプレトロウイルスの核タンパク質（GAG ポリペプチド）に由来するポリペプチドをコードしている、gag 配列と呼ばれるヌクレオチド配列； h)フレンドレトロウイルスタイプのレトロウイルスの逆転写酵素、及びインテグラーゼ（POL ポリペプチド）に由来するポリペプチドをコードしている、pol 配列と呼ばれるヌクレオチド配列； c)例えば非ウイルス性シグナルのような、gag 及びpol 遺伝子の発現を調節する転写制御シグナル； d)両種向性エンベロープ、例えばモロニー白血病ウイルス（MuLV）の4070A に由来するポリペプチドをコードしている、env と呼ばれるヌクレオチド配列：及び、 e)例えば、誘導性プロモータ、または例えばRAR βプロモータのような条件プロモータを含んでいる、enb 配列の発現を調節する非ウイルス性の転写制御シグナル。１０．請求項４乃至９の何れか一項に記載の、トランス補完性組み換え細胞であって、トランス補完用の、エンベロープをコードした発現ベクタのヌクレオチド配列が、例えば特定の細胞により認識されるポリペプチド若しくは糖タンパク質の配列をコードしているヌクレオチドの配置によるヌクレオチドの置換によるか、またはそのような配置の付加により、修飾されていることを特徴とする、上記のトランス補完性組み換え細胞。１１．請求項４乃至１０の何れか一項に記載の、トランス補完性組み換え細胞であって、更に選択したヌクレオチド配列の、標的細胞のゲノム内への、発現、及び／またはトランスファー、及び／または組み込み用のレトロウイルスベクタで形質転換されていることを特徴としていて、該レトロウイルスベクタが、図１に示され、CNCMに番号I-１３２６の下に寄託されていて、その中に上記した導入遺伝子配列が、複製に非必須である部位で挿入されているベクタpFOCH２９である、上記のトランス補完用の組み換え細胞。１２．請求項５乃至１０の何れか一項に記載の、トランス補完性組み換え細胞であって、上記のレトロウイルスベクタが、CNCMに番号I-１３２６の下に寄託されているベクタ、pFOC1129に由来すること、特にはLTR配列内での欠失により由来すること（ベクタ、pFOCH29PI）を特徴とする、上記のトランス補完性組み換え細胞。１３．請求項４乃至１０の何れか一項に記載の、トランス補完性組み換え細胞であって、導入遺伝子配列が、治療目的の遺伝子、アンチセンスヌクレオチド配列遺伝子、ある遺伝子若しくはある遺伝子の機能的阻害剤をコードする配列のドミナントネガティブ変異体、標識遺伝子、ある遺伝子を制御する配列、または標的細胞へ新規の機能を付加することの可能な遺伝子に向けられている遺伝子をコードすることを特徴とする、上記のトランス補完性組み換え細胞。１４．レトロウイルスベクタのトランス補完用の発現ベクタであって、選択したヌクレオチド配列（導入遺伝子と呼ばれる）のトランスファー、及び／または標的細胞のゲノム内への組み込みを許容し、以下を具備することを特徴とする、上記の発現ベクタ： a)スプーマウイルスファミリーのレトロウイルスのエンベロープ（ENB ポリペプチド）に由来するポリペプチドをコードする、env と呼ばれるヌクレオチド配列であって、レトロウイルスRNAのパッケージングを許容する、上記のヌクレオチド配列： h)env配列の発現を調節する転写制御シグナル。１５．前記のenv配列がスプーマウイルスHSRVの配列であることを特徴とする、請求項１３に記載のトランス補完用の発現ベクタ。１６．前記の転写制御シグナルが非ウイルス性プロモータを具備していることを特徴とする、請求項１３，または１４に記載のトランス補完用の発現ベクタ。１７．前記のプロモータが誘導性タイプであることを特徴とする、請求項１５に記載のトランス補完用の発現ベクタ。１８．前記のプロモータが条件性タイプであることを特徴とする、請求項１５に記載のトランス補完用の発現ベクタ。１９．前記のプロモータが、レチノイン酸β受容体のRAR βプロモータであることを特徴とする、請求項１５に記載のトランス補完用の発現ベクタ。２０．env 配列を調節している前記の転写制御シグナルが、フレンドレトロウイルスのLTR配列起源であることを特徴とする、請求項１３，または１４の何れかに記載の、トランス補完用の発現ベクタ。２１．以下を具備していることを特徴とする、エンベロープに関してのトランス補完用の発現ベクタ： a)モロニー白血病ウイルス（Mo-MuLV）のエンベロープ４９７９Ａのような、両種向性エンベロープのような、エンベロープに由来するポリペプチドをコードする、env配列と呼ばれるヌクレオチド配列；及び、 b)例えば、RAR βプロモータのような誘導性、若しくは条件プロモータを含んでいて、env配列の発現を調節する非ウイルス性の転写制御シグナル。２２．エンベロープに関して請求項１３乃至２０の何れか一項に記載の、トランスコンプレメンテーション用の発現ベクタであって、トランス補完用の発現ベクタの、エンベロープポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が、例えば決めた細胞種により特異的に認識されるポリペプチド若しくは糖タンパク質をコードするヌクレオチドの配置によるヌクレオチドの置換、またはそのような配置の付加によって、修飾されていることを特徴とする、上記のトランス補完用発現ベクタ。２３．選択したヌクレオチド配列（トランスジェニック配列）の、標的細胞ゲノム内へのトランスファー及び／または組み込みを許容する、レトロウイルスのトランス補完用の発現ベクタであって、 a)フレンドレトロウイルスタイプのウイルスの核タンパク質（GAG ポリペプチド）に由来するポリペプチドをコードした、gag と呼ばれるヌクレオチド配列； b)フレンドレトロウイルスタイプのレトロウイルスの逆転写酵素タンパク質及びインテグラーゼ（POL ポリペプチド）を含む派生ポリペプチドをコードする、 polと呼ばれるヌクレオチド配列； c)gag 及びpol 配列の発現を調節する、非ウイルス性の転写制御シグナルであって、これらのシグナルが例えば、誘導性または条件性プロモータ、例えばRAR- βプロモータと、パッケージングシグナルのない上記の発現ベクタとを有しているもの。２４．組み込み型ベクタであることを特徴とする、請求項１３乃至２２の何れか一項に記載のトランス補完用発現ベクタ。２５．試験管内でのヒトの細胞、特には内皮、筋、またはストローマ細胞の形質転換または感染のための、請求項１３乃至２４の何れか一項に記載のトランス補完用発現ベクタの使用。２６．エピソーム型のベクタであることを特徴とする、請求項１３乃至２２の何れか一項に記載のトランス補完用の発現ベクタ。２７．試験管内でのヒトの細胞、特のは内皮、筋、またはストローマ細胞の形質転換または感染のための薬剤の調製のための、請求項１３乃至２４の何れか一項に記載の、トランス補完用の発現ベクタの使用。