KR20190020745A - Abc4a를 발현시키기 위한 이중 중첩 아데노-관련 바이러스 벡터 시스템 - Google Patents

Abstract

본 발명은 표적 세포에서 인간 ABCA4 단백질을 발현시키기 위한 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터 시스템을 제공하고, 상기 AAV 벡터 시스템은 제1 핵산 서열을 포함하는 제1 AAV 벡터 및 제2 핵산 서열을 포함하는 제2 AAV 벡터를 포함하고; 이 때 제1 핵산 서열은 ABCA4 코딩 서열(CDS)의 5' 말단 부분을 포함하고 제2 핵산 서열은 ABCA4 CDS의 3' 말단 부분을 포함하고, 5' 말단 부분 및 3' 말단 부분은 함께 전체 ABCA4 CDS를 포함하고; 제1 핵산 서열은 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 105 내지 3597에 상응하는 연속 뉴클레오티드의 서열을 포함하고; 제2 핵산 서열은 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 3806 내지 6926에 상응하는 연속 뉴클레오티드의 서열을 포함하고; 제1 핵산 서열 및 제2 핵산 서열은 각각 다른 서열과 중첩되는 서열의 영역을 포함하고; 서열 중첩 영역은 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 3598 내지 3805에 상응하는 핵산 서열의 적어도 약 20개의 연속 뉴클레오티드를 포함한다. 또한 질병의 예방 또는 치료에서의 AAV 벡터 시스템의 용도가 제공된다.

Description

ABC4A를 발현시키기 위한 이중 중첩 아데노-관련 바이러스 벡터 시스템

발명의 분야

본 발명은 표적 세포에서 인간 ABCA4 단백질을 발현시키기 위한 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터 시스템 및 AAV 벡터에 관한 것이다. 본 발명의 AAV 벡터 시스템 및 AAV 벡터는 스타가르트병과 같은 망막 세포의 분해와 관련된 질병의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다.

발명의 배경

스타가르트병은 눈에서 광-감지 광수용체 세포가 파괴되어 실명으로 이어질 수 있는 망막의 유전 질환이다. 이 질환은 소아기에 흔히 나타나서 젊은 시절에 실명으로 이어진다.

스타카르트병의 가장 흔한 형태는 단백질 ATP 결합 카세트, 서브-패밀리 A, 구성원 4(ABCA4)를 인코딩하는 유전자의 돌연변이와 관련된 열성 장애이다. ABCA4는 망막 세포에서 광-민감성 색소의 재생에 중요한 역할을 담당하는 큰 막관통 단백질이다. 스타카르트병에서, ABCA4 유전자의 돌연변이는 망막 세포에서 기능성 ABCA4 단백질의 결핍을 초래한다. 이것은 차례로 비스레티노이드 부산물의 형성 및 축적을 초래하여, 망막 색소 상피(RPE) 세포에서 리포푸신의 독성 과립을 생성한다. 이것은 RPE 세포의 분해 및 궁극적인 파괴를 초래하여, 점진적 시력 상실 및 최종 실명을 초래하는 광수용체 세포의 손실로 이어진다.

유전자 요법은 스타가르트병에 대한 치료제로서의 가능성을 지니고 있다. 그 목적은 영향을 받은 광수용체 세포에 기능성 ABCA4 유전자를 도입하는 벡터를 사용하여, ABCA4 기능을 회복시킴에 의해 질병의 근본적인 결핍을 바로 잡는 것이다.

아데노-관련 바이러스(AAV)에서 유래된 벡터는 현재 망막 유전자 요법에 대한 연구가 진행 중이다. AAV는 면역원성이 매우 낮고 알려진 임의의 인간 질병과 관련이 없는 작은 바이러스이다. 관련 염증 반응이 없다는 것은 AAV가 눈에 주입되었을 때 망막 손상을 일으키지 않는다는 것을 의미한다.

그러나, AAV 캡시드의 크기는 그 안에 패키징될 수 있는 DNA의 양에 제한을 둔다. AAV 유전체의 크기는 약 4.7 킬로베이스(kb)이고, AAV에서 DNA 패키징을 위해 상응하는 크기 상한은 약 5 kb인 것으로 여겨진다(Wu et al., Molecular Therapy, vol. 18, No. 1, Jan 2010). ABCA4 유전자의 코딩 서열은 약 6.8 kb의 크기이고(유전자 발현에 필요한 추가 유전적 요소를 지님), 이것은 표준 AAV 벡터에 혼입되기에 너무 크다.

이러한 크기 상한을 극복하고 AAV 벡터로부터 ABCA4와 같은 큰 유전자를 발현시키기 위한 많은 접근법이 시도되었다. 이러한 접근법은 "오버사이즈(oversize)" 벡터 접근법 및 "이중" 벡터 접근법을 포함한다.

"오버사이즈" 벡터

천연 4.7 kb 유전체보다 훨씬 큰 유전자를 AAV 벡터로 강제하기 위한 많은 시도가 있었고, 표적 세포를 형질도입하는데 약간의 약간의 성공이 있었다. 예로서, Allocca 등(J. Clin. Invest. vol.118, No. 5, May 2008)은 뮤린 ABCA4 및 인간 MYO7A 유전자를 패키징하는 오버사이즈 AAV 벡터를 제조하고, 마우스 망막 세포의 형질도입 후 단백질 발현을 입증하였다. 그러나, 특정 AAV 캡시드가 최대 8.9 kb를 수용할 수 있다고 Allocca 등에 의해 제안되었으나, 후속 연구는 "오버사이즈" 접근법이 사실상 패키징 크기 상한을 극복하지 못하고, 오히려 무작위 방식으로 트랜스진의 트렁케이션(truncation)을 발생시켜, 각각이 트랜스진의 단편을 포함하는 AAV 벡터의 이종 집단을 제공한다는 것을 발견하였다(Dong et al., Molecular Therapy, vol. 18, No. 1, Jan 2010). 주어진 집단의 오버사이즈 벡터의 일부는 단편 사이에 중첩 영역이 존재하도록 오버사이즈 트랜스진의 충분히 큰 단편을 패키징하여, 표적 세포의 형질도입 후 전장 유전자로 재-어셈블링된다고 여겨진다. 그러나, 이 방법은 예측 불가능하고 비효율적이며, 패키징 제어의 결여 및 그에 따른 재조합 실패는 일관되고 검출 가능한 성공으로의 중요한 장벽을 제공한다.

"이중" 벡터

대안적인 접근법은 이중 벡터 시스템을 제조하는 것이었고, 여기서 약 5 kb 한계보다 큰 트랜스진은 정의된 서열의 2개의 분리된 백터로 약 절반으로 분할된다: "상류" 벡터는 트랜스진의 5' 부분을 함유하고, "하류" 벡터는 트랜스진의 3' 부분을 함유한다. 상류 및 하류 벡터 둘 모두에 의한 표적 세포의 형질도입은 전장 트랜스진이 2개의 단편으로부터 다양한 세포내 메커니즘을 사용하여 재어셈블링되게 한다.

소위 "트랜스-스플라이싱(trans-splicing)" 이중 벡터 접근법에서, 스플라이스-도너 신호는 상류 트랜스진 단편의 3' 말단에 위치하고 스플라이스-억셉터 신호는 하류 트랜스진 단편의 5' 말단에 위치한다. 이중 벡터에 의한 표적 세포의 형질도입시, AAV 유전체에 존재하는 역방위 말단 반복(ITR) 서열은 트랜스진 단편의 머리-에서-꼬리 콘카테머화(concatermerisation)를 매개하고 전사체의 트랜스-스플라이싱은 전장 mRNA 서열을 생성시켜, 전장 단백질의 발현을 가능하게 한다.

대안적인 이중 벡터 시스템은 "중첩" 접근법을 사용한다. 중첩 이중 벡터 시스템에서, 상류 코딩 서열 부분의 3' 말단에 있는 코딩 서열의 일부는 하류 코딩 서열 부분의 5'에 있는 상동성 서열과 중첩된다. 상류 및 하류 벡터에 의한 표적 세포의 형질도입시, 코딩 서열의 상류 및 하류 부분 사이의 상동성 재조합은 전장 트랜스진의 재현을 허용하고, 이로부터 상응하는 mRNA가 전사되고 전장 단백질이 발현될 수 있다.

WO 2014/170480호는 인간 ABCA4 단백질을 인코딩하는 이중 AAV 벡터 시스템의 생성을 기재하고 있다.

이에 따라, 유전자 요법에 사용하기에 적합한 ABCA4 단백질을 인코딩하는 대안적 및/또는 개선된 AAV 벡터 시스템이 당 분야에 필요하다.

발명의 개요

본 발명은 청구 범위에 기재된 바와 같은 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터 시스템을 제공함에 의해 상기 종래 기술의 문제점을 해결한다.

유리하게는, 본 발명의 AAV 벡터 시스템은 ABCA4의 원하지 않는 트렁케이션된 단편의 제한된 생산으로, 놀랍게도 형질도입된 세포에서 전장 ABCA4 단백질의 높은 수준의 발현을 제공한다.

한 양태에서, 본 발명은 표적 세포에서 인간 ABCA4 단백질을 발현시키기 위한 AAV 벡터 시스템을 제공하고, 상기 AAV 벡터 시스템은 제1 핵산 서열을 포함하는 제1 AAV 벡터 및 제2 핵산 서열을 포함하는 제2 AAV 벡터를 포함하고; 이 때 제1 핵산 서열은 ABCA4 코딩 서열(CDS)의 5' 말단 부분을 포함하고 제2 핵산 서열은 ABCA4 CDS의 3' 말단 부분을 포함하고, 5' 말단 부분 및 3' 말단 부분은 함께 전체 ABCA4 CDS를 포함하고; 제1 핵산 서열은 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 105 내지 3597에 상응하는 연속 뉴클레오티드의 서열을 포함하고; 제2 핵산 서열은 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 3806 내지 6926에 상응하는 연속 뉴클레오티드의 서열을 포함하고; 제1 핵산 서열 및 제2 핵산 서열은 각각 다른 서열과 중첩되는 서열의 영역을 포함하고; 서열 중첩 영역은 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 3598 내지 3805에 상응하는 핵산 서열의 적어도 약 20개의 연속 뉴클레오티드를 포함한다.

서열 중첩 영역은 20 내지 550개 뉴클레오티드의 길이; 바람직하게는 50 내지 250개 뉴클레오티드의 길이; 더욱 바람직하게는 175 내지 225개 뉴클레오티드의 길이; 및 가장 바람직하게는 195 내지 215개 뉴클레오티드의 길이일 수 있다.

서열 중첩 영역은 또한 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 3598 내지 3805에 상응하는 핵산 서열의 적어도 약 50개의 연속 뉴클레오티드; 바람직하게는 적어도 약 75개의 연속 뉴클레오티드; 더욱 바람직하게는 적어도 약 100개의 연속 뉴클레오티드; 심지어 더욱 바람직하게는 적어도 약 150개의 연속 뉴클레오티드; 및 가장 바람직하게는 적어도 약 200개의 연속 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.

한 구체예에서, 제1 핵산 서열은 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 105 내지 3597로 구성된 연속 뉴클레오티드의 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 제2 핵산 서열은 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 3806 내지 6926으로 구성된 연속 뉴클레오티드의 서열을 포함한다.

한 구체예에서, 제1 핵산 서열은 SEQ ID NO: 2의 뉴클레오티드 105 내지 3597로 구성된 연속 뉴클레오티드의 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 제2 핵산 서열은 SEQ ID NO: 2의 뉴클레오티드 3806 내지 6926으로 구성된 연속 뉴클레오티드의 서열을 포함한다.

한 구체예에서, 서열 중첩 영역은 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 3598 내지 3805로 구성된 핵산 서열의 적어도 약 20개의 연속 뉴클레오티드를 포함한다. 한 구체예에서, 서열 중첩 영역은 SEQ ID NO: 2의 뉴클레오티드 3598 내지 3805로 구성된 핵산 서열의 적어도 약 20개의 연속 뉴클레오티드를 포함한다.

한 구체예에서, 서열 중첩 영역은 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 3598 내지 3805로 구성된 핵산 서열의 적어도 약 50개의 연속 뉴클레오티드; 바람직하게는 적어도 약 75개의 연속 뉴클레오티드; 더욱 바람직하게는 적어도 약 100개의 연속 뉴클레오티드; 심지어 더욱 바람직하게는 적어도 약 150개의 연속 뉴클레오티드; 및 가장 바람직하게는 적어도 약 200개의 연속 뉴클레오티드를 포함한다. 한 구체예에서, 서열 중첩 영역은 SEQ ID NO: 2의 뉴클레오티드 3598 내지 3805로 구성된 핵산 서열의 적어도 약 50개의 연속 뉴클레오티드; 바람직하게는 적어도 약 75개의 연속 뉴클레오티드; 더욱 바람직하게는 적어도 약 100개의 연속 뉴클레오티드; 심지어 더욱 바람직하게는 적어도 약 150개의 연속 뉴클레오티드; 및 가장 바람직하게는 적어도 약 200개의 연속 뉴클레오티드를 포함한다.

한 구체예에서, 제1 핵산 서열은 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 105 내지 3805에 상응하는 연속 뉴클레오티드의 서열을 포함하고; 제2 핵산 서열은 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 3598 내지 6926에 상응하는 연속 뉴클레오티드의 서열을 포함한다.

한 구체예에서, 제1 핵산 서열은 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 105 내지 3805로 구성된 연속 뉴클레오티드의 서열을 포함하고; 제2 핵산 서열은 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 3598 내지 6926으로 구성된 연속 뉴클레오티드의 서열을 포함한다.

한 구체예에서, 제1 핵산 서열은 SEQ ID NO: 2의 뉴클레오티드 105 내지 3805로 구성된 연속 뉴클레오티드의 서열을 포함하고; 제2 핵산 서열은 SEQ ID NO: 2의 뉴클레오티드 3598 내지 6926으로 구성된 연속 뉴클레오티드의 서열을 포함한다.

제1 AAV 벡터는 ABCA4 코딩 서열(CDS)의 5' 말단 부분에 작동 가능하게 결합된 GRK1 프로모터를 포함할 수 있다.

제1 핵산 서열은 ABCA4 코딩 서열(CDS)의 5' 말단 부분의 상류에 위치한 비번역 영역(UTR)을 포함할 수 있다.

제2 핵산 서열은 전사 후 반응 요소(PRE); 바람직하게는 우드척(Woodchuck) 간염 바이러스 전사 후 반응 요소(WPRE)를 포함할 수 있다.

제2 핵산 서열은 소 성장 호르몬(bGH) 폴리-아데닐화 서열을 포함할 수 있다.

다른 양태에서, 본 발명은 표적 세포에서 인간 ABCA4 단백질을 발현시키는 방법을 제공하고, 상기 방법은 표적 세포를 상기 정의된 바와 같은 제1 AAV 벡터 및 제2 AAV 벡터로 형질도입시켜, 기능성 ABCA4 단백질이 표적 세포에서 발현되도록 하는 단계를 포함한다.

추가 양태에서, 본 발명은 ABCA4 CDS의 5' 말단 부분을 포함하는 핵산 서열을 포함하는 AAV 벡터를 제공하고, 이 때 ABCA4 CDS의 5' 말단 부분은 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 105 내지 3805 에 상응하는 연속 뉴클레오티드의 서열로 구성된다. 한 구체예에서, 이 AAV 벡터는 SEQ ID NO: 9의 핵산 서열을 포함한다. 한 구체예에서, ABCA4 CDS의 5' 말단 부분은 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 105 내지 3805로 구성된다. 한 구체예에서, ABCA4 CDS의 5' 말단 부분은 SEQ ID NO: 2의 뉴클레오티드 105 내지 3805로 구성된다.

추가 양태에서, 본 발명은 ABCA4 CDS의 3' 말단 부분을 포함하는 핵산 서열을 포함하는 AAV 벡터를 제공하고, 이 때 ABCA4 CDS의 3' 말단 부분은 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 3598 내지 6926에 상응하는 연속 뉴클레오티드의 서열로 구성된다. 한 구체예에서, 이 AAV 벡터는 SEQ ID NO: 10의 핵산 서열을 포함한다. 한 구체예에서, ABCA4 CDS의 3' 말단 부분은 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 3598 내지 6926으로 구성된다. 한 구체예에서, ABCA4 CDS의 3' 말단 부분은 SEQ ID NO: 2의 뉴클레오티드 3598 내지 6926으로 구성된다.

다른 양태에서, 본 발명은 상기 정의된 바와 같은 제1 핵산 서열을 포함하는 핵산을 제공한다.

다른 양태에서, 본 발명은 상기 정의된 바와 같은 제2 핵산 서열을 포함하는 핵산을 제공한다.

또한 SEQ ID NO: 9의 핵산 서열을 포함하는 핵산, 및 SEQ ID NO: 10의 핵산 서열을 포함하는 핵산이 본 발명에 의해 제공된다.

추가 양태에서, 본 발명은 상기 정의된 바와 같은 AAV 벡터 시스템, 또는 상기 정의된 바와 같은 상류 AAV 벡터 및 하류 AAV 벡터를 포함하는 키트를 제공한다.

본 발명은 또한 상기 정의된 바와 같이, 제1 핵산 서열을 포함하는 핵산 및 제2 핵산 서열을 포함하는 핵산, 또는 상기 정의된 바와 같이, SEQ ID NO: 9의 핵산 서열을 포함하는 핵산 및 SEQ ID NO: 10의 핵산 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 키트를 제공한다.

또한 추가 양태에서, 본 발명은 상기 정의된 바와 같은 AAV 벡터 시스템 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.

또한 추가 양태에서, 본 발명은 망막 세포의 분해를 특징으로 하는 질병의 예방 또는 치료에 사용하기 위한; 바람직하게는 스타가르트병의 예방 또는 치료에 사용하기 위한, 상기 정의된 바와 같은 AAV 벡터 시스템, 상기 정의된 바와 같은 키트, 또는 상기 정의된 바와 같은 약학적 조성물을 제공한다.

다른 양태에서, 본 발명은 유효량의 상기 정의된 바와 같은 AAV 벡터 시스템, 상기 정의된 바와 같은 키트, 또는 상기 정의된 바와 같은 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 망막 세포의 분해를 특징으로 하는 질병, 예를 들어, 스타가르트병을 예방 또는 치료하기 위한 방법을 제공한다.

다른 양태에서, 본 발명은 표적 세포에서 인간 ABCA4 단백질을 발현시키기 위한 AAV 벡터 시스템을 제공하고, 상기 AAV 벡터 시스템은 제1 핵산 서열을 포함하는 제1 AAV 벡터 및 제2 핵산 서열을 포함하는 제2 AAV 벡터를 포함하고; 이 때 제1 핵산 서열은 ABCA4 코딩 서열(CDS)의 5' 말단 부분을 포함하고 제2 핵산 서열은 ABCA4 CDS의 3' 말단 부분을 포함하고, 5' 말단 부분 및 3' 말단 부분은 함께 전체 ABCA4 CDS를 포함하고; 제1 핵산 서열은 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 105 내지 3597과 적어도 90%(예를 들어, 적어도 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99.1, 99.2, 99.3, 99.4, 99.5, 99.6, 99.7, 99.8, 99.9 또는 100%) 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고; 제2 핵산 서열은 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 3806 내지 6926과 적어도 90%(예를 들어, 적어도 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99.1, 99.2, 99.3, 99.4, 99.5, 99.6, 99.7, 99.8, 99.9 또는 100%) 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고; 제1 핵산 서열 및 제2 핵산 서열은 각각 다른 서열과 중첩되는 서열의 영역을 포함하고; 서열 중첩 영역은 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 3598 내지 3805와 적어도 90%(예를 들어, 적어도 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99.1, 99.2, 99.3, 99.4, 99.5, 99.6, 99.7, 99.8, 99.9 또는 100%) 서열 동일성을 갖는 핵산 서열의 적어도 약 20개의 연속 뉴클레오티드를 포함한다.

다른 양태에서, 본 발명은 표적 세포에서 인간 ABCA4 단백질을 발현시키기 위한 AAV 벡터 시스템을 제공하고, 상기 AAV 벡터 시스템은 제1 핵산 서열을 포함하는 제1 AAV 벡터 및 제2 핵산 서열을 포함하는 제2 AAV 벡터를 포함하고, 이 때 제1 핵산 서열은 ABCA4 코딩 서열(CDS)의 5' 말단 부분을 포함하고 제2 핵산 서열은 ABCA4 CDS의 3' 말단 부분을 포함하고, 5' 말단 부분 및 3' 말단 부분은 함께 전체 ABCA4 CDS를 포함하고; ABCA4 CDS의 5' 말단 부분은 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 105 내지 3805와 적어도 90%(예를 들어, 적어도 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99.1, 99.2, 99.3, 99.4, 99.5, 99.6, 99.7, 99.8, 99.9 또는 100%) 서열 동일성을 갖는 서열로 구성되고, ABCA4 CDS의 3' 말단 부분은 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 3598 내지 6926과 적어도 90%(예를 들어, 적어도 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99.1, 99.2, 99.3, 99.4, 99.5, 99.6, 99.7, 99.8, 99.9 또는 100%) 서열 동일성을 갖는 서열로 구성된다.

다른 양태에서, 본 발명은 ABCA4 CDS의 5' 말단 부분을 포함하는 핵산 서열을 포함하는 AAV 벡터를 제공하고, 이 때 ABCA4 CDS의 5' 말단 부분은 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 105 내지 3805와 적어도 90%(예를 들어, 적어도 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99.1, 99.2, 99.3, 99.4, 99.5, 99.6, 99.7, 99.8, 99.9 또는 100%) 서열 동일성을 갖는 서열로 구성된다.

다른 양태에서, 본 발명은 ABCA4 CDS의 3' 말단 부분을 포함하는 핵산 서열을 포함하는 AAV 벡터를 제공하고, 이 때 ABCA4 CDS의 3' 말단 부분은 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 3598 내지 6926과 적어도 90%(예를 들어, 적어도 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99.1, 99.2, 99.3, 99.4, 99.5, 99.6, 99.7, 99.8, 99.9 또는 100%) 서열 동일성을 갖는 서열로 구성된다.

다른 양태에서, 본 발명은 표적 세포에서 인간 ABCA4 단백질을 발현시키기 위한 AAV 벡터 시스템을 제공하고, 상기 AAV 벡터 시스템은 제1 핵산 서열을 포함하는 제1 AAV 벡터 및 제2 핵산 서열을 포함하는 제2 AAV 벡터를 포함하고; 이 때 제1 핵산 서열은 ABCA4 코딩 서열(CDS)의 5' 말단 부분을 포함하고 제2 핵산 서열은 ABCA4 CDS의 3' 말단 부분을 포함하고, 5' 말단 부분 및 3' 말단 부분은 함께 전체 ABCA4 CDS를 포함하고; 제1 핵산 서열은 SEQ ID NO: 2의 뉴클레오티드 105 내지 3597과 적어도 90%(예를 들어, 적어도 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99.1, 99.2, 99.3, 99.4, 99.5, 99.6, 99.7, 99.8, 99.9 또는 100%) 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고; 제2 핵산 서열은 SEQ ID NO: 2의 뉴클레오티드 3806 내지 6926과 적어도 90%(예를 들어, 적어도 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99.1, 99.2, 99.3, 99.4, 99.5, 99.6, 99.7, 99.8, 99.9 또는 100%) 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고; 제1 핵산 서열 및 제2 핵산 서열은 각각 다른 서열과 중첩되는 서열의 영역을 포함하고; 서열 중첩 영역은 SEQ ID NO: 2의 뉴클레오티드 3598 내지 3805와 적어도 90%(예를 들어, 적어도 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99.1, 99.2, 99.3, 99.4, 99.5, 99.6, 99.7, 99.8, 99.9 또는 100%) 서열 동일성을 갖는 핵산 서열의 적어도 약 20개의 연속 뉴클레오티드를 포함한다.

다른 양태에서, 본 발명은 표적 세포에서 인간 ABCA4 단백질을 발현시키기 위한 AAV 벡터 시스템을 제공하고, 상기 AAV 벡터 시스템은 제1 핵산 서열을 포함하는 제1 AAV 벡터 및 제2 핵산 서열을 포함하는 제2 AAV 벡터를 포함하고, 이 때 제1 핵산 서열은 ABCA4 코딩 서열(CDS)의 5' 말단 부분을 포함하고 제2 핵산 서열은 ABCA4 CDS의 3' 말단 부분을 포함하고, 5' 말단 부분 및 3' 말단 부분은 함께 전체 ABCA4 CDS를 포함하고; ABCA4 CDS의 5' 말단 부분은 SEQ ID NO: 2의 뉴클레오티드 105 내지 3805와 적어도 90%(예를 들어, 적어도 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99.1, 99.2, 99.3, 99.4, 99.5, 99.6, 99.7, 99.8, 99.9 또는 100%) 서열 동일성을 갖는 서열로 구성되고, ABCA4 CDS의 3' 말단 부분은 SEQ ID NO: 2의 뉴클레오티드 3598 내지 6926과 적어도 90%(예를 들어, 적어도 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99.1, 99.2, 99.3, 99.4, 99.5, 99.6, 99.7, 99.8, 99.9 또는 100%) 서열 동일성을 갖는 서열로 구성된다.

다른 양태에서, 본 발명은 ABCA4 CDS의 5' 말단 부분을 포함하는 핵산 서열을 포함하는 AAV 벡터를 제공하고, 이 때 ABCA4 CDS의 5' 말단 부분은 SEQ ID NO: 2의 뉴클레오티드 105 내지 3805와 적어도 90%(예를 들어, 적어도 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99.1, 99.2, 99.3, 99.4, 99.5, 99.6, 99.7, 99.8, 99.9 또는 100%) 서열 동일성을 갖는 서열로 구성된다.

다른 양태에서, 본 발명은 ABCA4 CDS의 3' 말단 부분을 포함하는 핵산 서열을 포함하는 AAV 벡터를 제공하고, 이 때 ABCA4 CDS의 3' 말단 부분은 SEQ ID NO: 2의 뉴클레오티드 3598 내지 6926과 적어도 90%(예를 들어, 적어도 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99.1, 99.2, 99.3, 99.4, 99.5, 99.6, 99.7, 99.8, 99.9 또는 100%) 서열 동일성을 갖는 서열로 구성된다.

또한 SEQ ID NO: 9와 적어도 90%(예를 들어, 적어도 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99.1, 99.2, 99.3, 99.4, 99.5, 99.6, 99.7, 99.8 또는 99.9%) 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 핵산, 및 SEQ ID NO: 10과 적어도 90%(예를 들어, 적어도 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99.1, 99.2, 99.3, 99.4, 99.5, 99.6, 99.7, 99.8 또는 99.9%) 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 핵산이 본 발명에 의해 제공된다.

도면의 설명
도 1. 완전한 ABCA4 트랜스진을 형성하기 위해 조합되는 상류 및 하류 트랜스진 구조.
도 2. 추가 UTR 서열이 있고(5'C) 없는(C) 이중 벡터 변이체 C를 주입한지 6주 후에 Abca4 ^-/- 망막에서 ABCA4 단백질 검출. 단위는 주입하지 않은 KO 샘플에 상대적인 배수 증가를 나타낸다. 오차 막대는 SEM을 나타낸다. 일원 ANOVA, Tukey 사후검정(post-hoc), p= **0.009.
도 3. 중첩 변이체 A, B, C, D, E, F 및 X를 구성하는 상류 및 하류 트랜스진에 함유된 ABCA4 CDS의 표시. (a) 시험관내 및 (b) 생체내에서 상이한 중첩 영역 벡터 변이체로 형질도입된 후 ABCA4 단백질 검출. 단위는 처리되지 않은 샘플(- = 처리되지 않은 HEK293T 세포; KO = 주입되지 않은 Abca4 ^-/- 망막)에 상대적인 배수 증가를 나타낸다. 오차 막대는 SEM을 나타낸다. 일원 ANOVA, Tukey 사후 분석은 시험관내에서, 이중 벡터 변이체 B 및 C가 모든 다른 샘플보다 유의하게 많은 ABCA4 단백질을 생성하였지만 B와 C 사이에 유의한 차이는 없었음을 나타내었다. 생체내에서, 이중 벡터 변이체 C는 모든 다른 변이체(B 제외)보다 유의하게 많은 ABCA4 단백질을 생성하였다.
도 4. (a) 재조합되지 않은 하류 벡터로 처리된 HEK293T 세포에서 검출 가능한 트렁케이션된 ABCA4 단백질; (b) 이중 벡터 5'B 또는 5'C가 주입된 Abca4 ^-/- 망막 샘플에서 검출된 트렁케이션된 및 전장 ABCA4 단백질; (c) 표는 주입된 망막의 웨스턴 블롯에 의해 검출된 총 ABCA4 단백질 집단에 존재하는 전장 ABCA4 백분율을 나타낸다 (d) 전사체 및 단백질 수준에서 중첩 C 이중 벡터 변이체가 주입된 망막 및 중첩 B 이중 벡터 변이체가 주입된 망막 사이의 ABCA4 발현의 배수 변화의 차이. 오차 막대는 SEM을 나타낸다.
도 5. a) 인-프레임(in-frame) AUG 코돈 이전에 아웃-오브-프레임(out-of-frame) AUG 코돈을 갖는 중첩 C 서열; b) 중첩 영역 C 및 B의 예측된 이차 구조.
도 6. 주입 6주 후에 수확된 Abca4 ^-/- 망막에서 광수용체 세포의 바깥 부분에서 ABCA4(녹색)의 염색. HCN1(적색) 염색은 안쪽 부분을 표시한다. 주입되지 않은 Abca4 ^-/- 망막에서 염색 부재의 증거 뿐만 아니라 WT 망막에서 천연 Abca4 국소화의 염색 예도 포함된다.
도 7. 야생형(WT) 및 Abca4 ^-/- 눈에서 Abca4/ABCA4(녹색) 및 Hcn1(적색) 염색.
도 8. 야생형(WT) 및 Abca4 ^-/- 눈의 광수용체 세포 바깥 부분에서 Abca4/ABCA4(녹색) 및 로돕신(적색) 염색.
도 9. 야생형(WT) 및 Abca4 ^-/- 눈에서 Abca4/ABCA4(녹색) 및 로돕신(적색) 정점 RPE 염색.
도 10. 예시적인 중첩 벡터의 다이어그램.
도 11. 정상 레티노이드 주기가 다이어그램의 왼쪽에 표시된다. Abca4 결핍 마우스 및 인간에서 증가된 정도로 발생하는 비스레티노이드 및 A2E의 생성이 오른쪽에 표시된다. 다이어그램의 오른쪽에 있는 박스에서 강조된 분자는 Abca4 ^-/- 마우스에서 평가되었다. (실시예 6.)
도 12. sham 또는 치료 주입을 받은 13마리의 Abca4 ^-/- 마우스에 대해 쌍을 이룬 눈에서 비스레티노이드 및 A2E 아이소형의 수준. sham 및 치료 눈 사이에 비스레티노이드 및 A2E 수준의 유의한 감소가 관찰되었다(p=0.017, F=5.849). 또한, 모든 비스레티노이드 및 A2E 측정에 대해, 가장 낮은 수준이 이중 벡터 치료된 눈에서 관찰되었다. (실시예 6.)

서열 목록

SEQ ID NO: 1 인간 ABCA4 핵산 서열. SEQ ID NO: 1은 NCBI 참조 서열 NM_000350.2와 동일하다.

SEQ ID NO: 2 인간 ABCA4 핵산 서열 변이체. SEQ ID NO: 2는 하기 돌연변이를 제외하고 SEQ ID NO: 1과 동일하다: 뉴클레오티드 1640 G>T, 뉴클레오티드 5279 G>A, 뉴클레오티드 6173 T>C.

SEQ ID NO: 3 ITR, 프로모터, CDS, ITR을 포함하는 예시적인 상류 벡터 서열.

SEQ ID NO: 4 ITR, CDS, 전사 후 반응 요소, 폴리-아데닐화 서열, ITR을 포함하는 예시적인 하류 벡터 서열.

SEQ ID NO: 5 GRK1 프로모터 서열.

SEQ ID NO: 6 UTR 서열.

SEQ ID NO: 7 우드척 간염 바이러스 전사 후 반응 요소.

SEQ ID NO: 8 소 성장 호르몬 폴리-아데닐화 서열.

SEQ ID NO: 9 프로모터, CDS를 포함하는 예시적인 부분 상류 벡터 서열.

SEQ ID NO: 10 CDS, 전사 후 반응 요소, 폴리-아데닐화 서열을 포함하는 예시적인 부분 하류 벡터 서열.

상세한 설명

바이러스 벡터는 비-천연 핵산 서열(또는 트랜스진)을 바이러스 유전체에 혼입시키기 위해 재조합 핵산 기술을 사용하여 변형된 야생형 바이러스로부터 유래된다. 특이적 세포를 표적화하고 감염시키는 바이러스의 능력을 사용하여 트랜스진을 표적 세포에 전달함으로써, 유전자의 발현 및 인코딩된 유전자 생성물의 생산을 발생시킨다.

본 발명은 아데노-관련 바이러스(AAV)로부터 유래된 벡터에 관한 것이다.

제1 양태에서, 본 발명은 표적 세포에서 인간 ABCA4 단백질을 발현시키기 위한 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터 시스템을 제공하고, 상기 AAV 벡터 시스템은 제1 핵산 서열을 포함하는 제1 AAV 벡터 및 제2 핵산 서열을 포함하는 제2 AAV 벡터를 포함하고; 이 때 제1 핵산 서열은 ABCA4 코딩 서열(CDS)의 5' 말단 부분을 포함하고 제2 핵산 서열은 ABCA4 CDS의 3' 말단 부분을 포함하고, 5' 말단 부분 및 3' 말단 부분은 함께 전체 ABCA4 CDS를 포함하고; 제1 핵산 서열은 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 105 내지 3597에 상응하는 연속 뉴클레오티드의 서열을 포함하고; 제2 핵산 서열은 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 3806 내지 6926에 상응하는 연속 뉴클레오티드의 서열을 포함하고; 제1 핵산 서열 및 제2 핵산 서열은 각각 다른 서열과 중첩되는 서열의 영역을 포함하고; 서열 중첩 영역은 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 3598 내지 3805에 상응하는 핵산 서열의 적어도 약 20개의 연속 뉴클레오티드를 포함한다.

AAV 벡터는 일반적으로 당 분야에 공지되어 있고, 당업자는 기술분야에서 그의 일반적인 지식으로부터 이들의 제조에 적합한 일반적인 기술에 익숙할 것이다. 당업자의 지식은 AAV 벡터의 유전체에 관심 핵산 서열을 도입하기에 적합한 기술을 포함할 것이다.

용어 "AAV 벡터 시스템"은 제1 및 제2 AAV 벡터가 상보적인 방식으로 함께 작동한다는 사실을 포괄하기 위해 사용된다.

본 발명의 AAV 벡터 시스템의 제1 및 제2 AAV 벡터는 함께 전체 ABCA4 트랜스진을 인코딩한다. 따라서, 표적 세포에서 인코딩된 ABCA4 트랜스진의 발현은 표적 세포를 제1(상류) 및 제2(하류) 벡터 둘 모두로 형질도입하는 것을 필요로 한다.

본 발명의 AAV 벡터 시스템의 AAV 벡터는 통상적으로 AAV 입자(비리온으로도 지칭됨)의 형태이다. AAV 입자는 AAV 유전체인 핵산의 코어를 둘러싸고 있는 단백질 외피(캡시드)를 포함한다. 본 발명은 또한 본원에 기재된 AAV 벡터 시스템의 AAV 벡터 유전체를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다.

SEQ ID NO: 1은 NCBI 참조 서열 NM_000350.2에 상응하는 인간 ABCA4 핵산 서열이다. SEQ ID NO: 1은 NCBI 참조 서열 NM_000350.2와 동일하다. ABCA4 코딩 서열은 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 105 내지 6926에 걸쳐 있다.

제1 AAV 벡터는 ABCA4 CDS의 5' 말단 부분을 포함하는 제1 핵산 서열을 포함한다. ABCA4 CDS의 5' 말단 부분은 이의 5' 말단을 포함하는 ABCA4 CDS의 일부이다. 이것이 CDS의 단지 일부이므로, ABCA4 CDS의 5' 말단 부분은 전장 ABCA4 CDS가 아니다(즉, 전체가 아님). 따라서, 제1 핵산 서열(및 이에 따라 제1 AAV 벡터)은 전장 ABCA4 CDS를 포함하지 않는다.

제2 AAV 벡터는 ABCA4 CDS의 3' 말단 부분을 포함하는 제2 핵산 서열을 포함한다. ABCA4 CDS의 3' 말단 부분은 이의 3' 말단을 포함하는 ABCA4 CDS의 일부이다. 이것이 CDS의 단지 일부이므로, ABCA4 CDS의 3' 말단 부분은 전장 ABCA4 CDS가 아니다(즉, 전체가 아님). 따라서, 제2 핵산 서열(및 이에 따라 제2 AAV 벡터)은 전장 ABCA4 CDS를 포함하지 않는다.

5' 말단 부분 및 3' 말단 부분은 함께 전체 ABCA4 CDS를 포함한다(하기에서 논의되는 바와 같이, 서열 중첩 영역을 지님). 따라서, 전장 ABCA4 CDS는 본 발명의 AAV 벡터 시스템에 함유되고, 제1 및 제2 AAV 벡터에 걸쳐 분할되며, 제1 및 제2 AAV 벡터로 표적 세포를 형질도입한 후 표적 세포에서 재어셈블링될 수 있다.

상기 기재된 제1 핵산 서열은 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 105 내지 3597에 상응하는 연속 뉴클레오티드의 서열을 포함한다. ABCA4 CDS는 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 105에서 시작한다.

상기 기재된 제2 핵산 서열은 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 3806 내지 6926에 상응하는 연속 뉴클레오티드의 서열을 포함한다.

전체 ABCA4 CDS를 포함하기 위해, 제1 및 제2 핵산 서열은 각각 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 3598 내지 3805에 상응하는 ABCA4 CDS의 적어도 일부를 추가로 포함하여, 제1 및 제2 핵산 서열이 정렬될 때 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 3598 내지 3805에 상응하는 ABCA4 CDS의 전체가 포함되도록 한다. 따라서, 정렬시, 제1 및 제2 핵산 서열은 함께 전체 ABCA4 CDS를 포함한다.

또한, 제1 및 제2 핵산 서열은 본 발명의 제1 및 제2 AAV 벡터로 형질도입된 표적 세포 내에서 전장 트랜스진의 일부로서 전체 ABCA4 CDS의 재구성을 허용하는 서열 중첩 영역을 포함한다.

제1 및 제2 핵산 서열이 서로 정렬될 때, 제1 핵산 서열의 3' 말단에 있는 영역은 제2 핵산 서열의 5' 말단에 있는 상응하는 영역과 중첩된다. 따라서, 제1 및 제2 핵산 서열 둘 모두는 서열 중첩 영역을 형성하는 ABCA4 CDS의 부분을 포함한다.

본 발명자들은 제1 및 제2 핵산 서열 사이의 중첩 영역이 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 3598 내지 3805에 상응하는 ABCA4 CDS의 부분의 적어도 약 20개의 연속 뉴클레오티드를 포함할 때 특히 유리한 결과가 얻어진다는 것을 발견하였다.

중첩 영역은 상기 20개의 연속 뉴클레오티드의 상류 및/또는 하류까지 연장될 수 있다. 따라서, 중첩 영역의 길이는 20개를 초과하는 뉴클레오티드일 수 있다.

중첩 영역은 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 3598에 상응하는 위치의 상류에 있는 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 대안적으로, 또는 추가로, 중첩 영역은 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 3805에 상응하는 위치의 하류에 있는 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.

대안적으로, 핵산 서열 중첩 영역은 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 3598 내지 3805에 상응하는 ABCA4 CDS의 부분 내에 함유될 수 있다.

따라서, 한 구체예에서, 핵산 서열 중첩 영역은 20 내지 550개 뉴클레오티드의 길이; 바람직하게는 50 내지 250개 뉴클레오티드의 길이; 바람직하게는 175 내지 225개 뉴클레오티드의 길이; 바람직하게는 195 내지 215개 뉴클레오티드의 길이이다.

한 구체예에서, 핵산 서열 중첩 영역은 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 3598 내지 3805에 상응하는 핵산 서열의 적어도 약 50개의 연속 뉴클레오티드; 바람직하게는 적어도 약 75개의 연속 뉴클레오티드; 바람직하게는 적어도 약 100개의 연속 뉴클레오티드; 바람직하게는 적어도 약 150개의 연속 뉴클레오티드; 바람직하게는 적어도 약 200개의 연속 뉴클레오티드; 바람직하게는 모든 208개의 연속 뉴클레오티드를 포함한다.

바람직한 구체예에서, 핵산 서열 중첩 영역은 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 3598에 상응하는 뉴클레오티드에서 시작한다. 용어 "시작"은 핵산 서열 중첩 영역이 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 3598에 상응하는 뉴클레오티드로부터 출발하여 5'에서 3' 방향으로 진행됨을 의미한다. 따라서, 바람직한 구체예에서, 핵산 서열 중첩 영역의 가장 5'측 뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 3598에 상응한다.

추가로 바람직한 구체예에서, 제1 핵산 서열 및 제2 핵산 서열 벡터 사이의 핵산 서열 중첩 영역은 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 3598 내지 3805에 상응한다.

본 발명의 추가 이점은, 상기 기재된 핵산 서열 중첩 영역을 포함하는 이중 AAV 벡터의 작제가 원하지 않는 트렁케이션된 ABCA4 펩티드의 번역의 수준을 유리하게 감소시킬 수 있다는 것이다.

트렁케이션된 ABCA4 펩티드의 번역 문제는 번역이 하류 벡터에서만 유래된 mRNA 전사체로부터 개시되는 경우 이중 AAV 벡터 시스템에서 발생할 수 있다. 이와 관련하여, AAV2 5' ITR과 같은 AAV ITR은 프로모터 활성을 가질 수 있다; 이것은 WPRE 및 bGH 폴리-아데닐화 서열(하기 논의됨)의 하류 벡터에서의 존재와 함께 재조합되지 않은 하류 벡터로부터 안정한 mRNA 전사체의 생성을 유도할 수 있다. 야생형 ABCA4 CDS는 아미노산 서열을 변경하지 않으며 다른 코돈으로 치환될 수 없는 아중 인-프레임 AUG 코돈을 이의 하류 부분에 보유하고 있다. 이는 안정한 전사체로부터 번역이 일어날 가능성을 만들어, 트렁케이션된 ABCA4 펩티드의 존재를 유도한다.

핵산 서열 중첩 영역이 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 3598에 상응하는 뉴클레오티드에서 시작하는 본 발명의 바람직한 구체예에서, 중첩 영역의 시작 서열은 번역 기계가 아웃-오브-프레임 부위로부터 재조합되지 않은 하류-만의 전사체의 번역을 개시하도록 장려하기 위해 보다 약한 환경의 인-프레임 AUG 코돈 이전에 양호한 환경(잠재적인 Kozak 컨센서스 서열에 관해)의 아웃-오브-프레임 AUG(시작) 코돈을 포함한다. 본 발명의 특히 바람직한 구체예에서, 인-프레임 AUG 이전에 다양한 환경의 총 4개의 아웃-오브-프레임 AUG 코돈이 존재한다. 이들 모두는 10개의 아미노산 내에서 정지 코돈으로 번역되어, 원하지 않는 트렁케이션된 ABCA4 펩티드의 번역을 방지할 것이다.

바람직하게는, 제1 핵산 서열은 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 105 내지 3805에 상응하는 연속 뉴클레오티드의 서열을 포함하고, 제2 핵산 서열은 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 3598 내지 6926에 상응하는 연속 뉴클레오티드의 서열을 포함하여, 상기 기재된 특히 바람직한 핵산 서열 중첩 영역을 포함한다.

따라서, 바람직한 구체예에서, ABCA4 CDS의 5' 말단 부분은 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 105 내지 3805에 상응하는 연속 뉴클레오티드의 서열로 구성되고, ABCA4 CDS의 3' 말단 부분은 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 3598 내지 6926에 상응하는 연속 뉴클레오티드의 서열로 구성된다.

추가의 바람직한 구체예에서, ABCA4 CDS의 5' 말단 부분은 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 105 내지 3805로 구성되고, ABCA4 CDS의 3' 말단 부분은 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 3598 내지 6926으로 구성된다.

따라서, 바람직한 구체예에서, 본 발명은 표적 세포에서 인간 ABCA4 단백질을 발현시키기 위한 AAV 벡터 시스템을 제공하고, 상기 AAV 벡터 시스템은 제1 핵산 서열을 포함하는 제1 AAV 벡터 및 제2 핵산 서열을 포함하는 제2 AAV 벡터를 포함하고, 이 때 제1 핵산 서열은 ABCA4 코딩 서열(CDS)의 5' 말단 부분을 포함하고 제2 핵산 서열은 ABCA4 CDS의 3' 말단 부분을 포함하고, 5' 말단 부분 및 3' 말단 부분은 함께 전체 ABCA4 CDS를 포함하고; ABCA4 CDS의 5' 말단 부분은 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 105 내지 3805에 상응하는 연속 뉴클레오티드의 서열로 구성되고, ABCA4 CDS의 3' 말단 부분은 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 3598 내지 6926에 상응하는 연속 뉴클레오티드의 서열로 구성된다.

추가의 바람직한 구체예에서, 본 발명은 표적 세포에서 인간 ABCA4 단백질을 발현시키기 위한 AAV 벡터 시스템을 제공하고, 상기 AAV 벡터 시스템은 제1 핵산 서열을 포함하는 제1 AAV 벡터 및 제2 핵산 서열을 포함하는 제2 AAV 벡터를 포함하고, 이 때 제1 핵산 서열은 ABCA4 코딩 서열(CDS)의 5' 말단 부분을 포함하고 제2 핵산 서열은 ABCA4 CDS의 3' 말단 부분을 포함하고, 5' 말단 부분 및 3' 말단 부분은 함께 전체 ABCA4 CDS를 포함하고; ABCA4 CDS의 5' 말단 부분은 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 105 내지 3805로 구성되고, ABCA4 CDS의 3' 말단 부분은 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 3598 내지 6926으로 구성된다.

용어 "구성된다"에 따르면, ABCA4 CDS의 5' 말단 부분 및 ABCA4 CDS의 3' 말단 부분이 상기 기재된 연속 뉴클레오티드의 특정 서열로 구성되는 구체예에서, 제1 핵산 서열 및 제2 핵산 서열 각각은 임의의 추가적인 ABCA4 CDS를 포함하지 않는다.

통상적으로, 제1 AAV 벡터 및 제2 AAV 벡터 각각은 5' 및 3' 역방위 말단 반복(ITR)을 포함한다.

통상적으로, AAV의 천연 유래 혈청형, 분리물 또는 클레이드의 AAV 유전체는 적어도 하나의 역방위 말단 반복 서열(ITR)을 포함한다. ITR 서열은 기능성 복제 기점을 제공하고, 벡터의 통합 및 세포의 유전체로부터의 절제를 가능하게 하기 위해 시스(cis) 작용한다. AAV ITR은, 예를 들어, 단일-가닥 벡터 DNA를 숙주 세포 DNA 중합효소의 작용에 의해 이중-가닥 DNA로 전환시킨 후, AAV-감염된 세포의 핵에서 콘카테머(concatemer) 형성을 돕는 것으로 여겨진다. 그러한 에피솜 콘카테머의 형성은 숙주 세포의 생애 동안 벡터 작제물을 보호하는 역할을 하여, 생체내에서 트랜스진의 연장된 발현을 가능하게 한다.

따라서, 한 구체예에서, ITR은 AAV ITR이다(즉, AAV 유전체에서 발견된 ITR 서열로부터 유래된 ITR 서열).

본 발명의 AAV 벡터 시스템의 제1 및 제2 AAV 벡터는 함께 둘 모두의 벡터에 의한 형질도입 후 완전 기능성 ABCA4 트랜스진이 표적 세포에서 재어셈블링되는데 필요한 모든 구성요소를 포함한다. 당업자는 바이러스 벡터-형질도입된 세포에서 트랜스진 발현을 보장하기 위해 일반적으로 사용되는 추가적인 유전적 요소를 알 것이다. 이들은 발현 조절 서열로 언급될 수 있다. 따라서, 본 발명의 AAV 바이러스 벡터 시스템의 AAV 벡터는 통상적으로 ABCA4 트랜스진을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 결합된 발현 조절 서열(예를 들어, 프로모터 서열 포함)을 포함한다.

5' 발현 조절 서열 구성요소는 적합하게는 바이러스 벡터 시스템의 제1("상류") AAV 벡터에 위치하는 한편, 3' 발현 조절 서열은 적합하게는 바이러스 벡터 시스템의 제2("하류") AAV 벡터에 위치한다.

따라서, 제1 AAV 벡터는 통상적으로 ABCA4 CDS의 5' 말단 부분에 작동 가능하게 결합된 프로모터를 포함한다. 프로모터는 그 성질상 ABCA4 CDS의 5'측에 위치할 것이 요구되므로, 제1 AAV 벡터에 위치한다.

임의의 적합한 프로모터가 이용될 수 있으며, 그 선택은 당업자에 의해 용이하게 이루어질 수 있다. 프로모터 서열은 항시적으로 활성(즉, 임의의 숙주 세포 배경에서 작동성)일 수 있거나, 대안적으로 특정 숙주 세포 환경에서만 활성일 수 있어, 이에 따라 특정 세포 유형에서의 트랜스진의 표적화된 발현을 가능하게 할 수 있다(예를 들어, 조직-특이적 프로모터). 프로모터는 또 다른 요인, 예를 들어, 숙주 세포 내에 존재하는 요인의 존재에 반응하여 유도성 발현을 나타낼 수 있다. 임의의 사건에서, 벡터가 요법을 위해 투여되는 경우, 프로모터는 표적 세포 배경에서 기능성인 것이 바람직하다.

일부 구체예에서, 트랜스진이 망막 세포 집단에서만 발현되는 것을 가능하게 하기 위해 프로모터가 망막-세포 특이적 발현을 나타내는 것이 바람직하다. 따라서, 프로모터로부터의 발현은, 예를 들어, 감각신경 망막 및 망막 색소 상피의 세포로만 제한된 망막-세포 특이적일 수 있다.

본 발명에 사용하기에 적합한 예시적인 프로모터는 임의로 사이토메갈로바이러스(CMV) 인핸서 요소와 조합된 닭 베타-액틴(CBA) 프로모터이다. 본 발명에서 사용하기 위한 다른 예시적인 프로모터는 하이브리드 CBA/CAG 프로모터, 예를 들어, rAVE 발현 카세트(GeneDetect.com)에서 사용되는 프로모터이다.

망막-특이적 유전자 발현을 유도할 인간 서열에 기반한 프로모터의 예는 막대 및 원뿔에 대한 로돕신 키나제, 원뿔만에 대한 PR2.1, 및 망막 색소 상피에 대한 RPE65를 포함한다.

본 발명자들은 특히 유리한 수준의 유전자 발현이 GRK1 프로모터를 사용하여 달성될 수 있음을 발견하였다. 따라서, 바람직한 구체예에서, 프로모터는 인간 로돕신 키나제(GRK1) 프로모터이다.

본 발명의 GRK1 프로모터 서열은 199개 뉴클레오티드의 길이일 수 있고, GRK1 유전자의 뉴클레오티드 -112 내지 +87을 포함할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 프로모터는 SEQ ID NO: 5의 핵산 서열 또는 적어도 90%(예를 들어, 적어도 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99.1, 99.2, 99.3, 99.4 또는 99.5, 99.6, 99.7, 99.8 또는 99.9%) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함한다.

제1 AAV 벡터는 프로모터 및 상류 ABCA4 핵산 서열 사이에 위치한 번역되지 않은 영역(UTR)을 포함할 수 있다(즉, 5' UTR).

임의의 적합한 UTR 서열이 이용될 수 있으며, 그 선택은 당업자에 의해 용이하게 이루어질 수 있다.

UTR은 하기 요소 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 갈루스 갈루스(Gallus gallus) β-액틴(CBA) 인트론 1 단편, 오릭토라구스 쿠니쿨루스(Oryctolagus cuniculus) β-글로빈(RBG) 인트론 2 단편, 및 오릭토라구스 쿠니쿨루스 β-글로빈 엑손 3 단편.

UTR은 Kozak 컨센서스 서열을 포함할 수 있다. 임의의 적합한 Kozak 컨센서스 서열이 이용될 수 있으며, 그 선택은 당업자에 의해 용이하게 이루어질 수 있다.

바람직한 구체예에서, UTR은 SEQ ID NO: 6에 명시된 핵산 서열 또는 적어도 90%(예를 들어, 적어도 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99.1, 99.2, 99.3, 99.4, 99.5, 99.6, 99.7, 99.8 또는 99.9%) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함한다.

SEQ ID NO: 6의 UTR은 186개 뉴클레오티드의 길이이고, Kozak 컨센서스 서열 직전에 갈루스 갈루스 β-액틴(CBA) 인트론 1 단편(예측된 스플라이스 도너 부위를 지님), 오릭토라구스 쿠니쿨루스 β-글로빈(RBG) 인트론 2 단편(예측된 분지점 및 스플라이스 억셉터 부위를 포함함) 및 오릭토라구스 쿠니쿨루스 β-글로빈 엑손 3 단편을 포함한다.

본 발명자들은 놀랍게도 상기 기재된 UTR, 특히 SEQ ID NO: 6에 명시된 UTR 서열 또는 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체의 존재가 ABCA4 트랜스진으로부터의 번역 수율을 유리하게 증가시킨다는 것을 발견하였다.

본 발명의 AAV 벡터 시스템의 제2("하류") AAV 벡터는 전사 후 반응 요소(전사 후 조절 요소로도 공지됨) 또는 PRE를 포함할 수 있다. 임의의 적합한 PRE가 이용될 수 있으며, 그 선택은 당업자에 의해 용이하게 이루어질 수 있다. 적합한 PRE의 존재는 ABCA4 트랜스진의 발현을 향상시킬 수 있다.

바람직한 구체예에서, PRE는 우드척 간염 바이러스 PRE(WPRE)이다. 특히 바람직한 구체예에서, WPRE는 SEQ ID NO: 7에 명시된 서열 또는 적어도 90%(예를 들어, 적어도 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99.1, 99.2, 99.3, 99.4, 99.5, 99.6, 99.7, 99.8 또는 99.9%) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 갖는다.

제2 AAV 벡터는 하류 ABCA4 핵산 서열의 3'측에 위치한 폴리-아데닐화 서열을 포함할 수 있다. 임의의 적합한 폴리-아데닐화 서열이 이용될 수 있으며, 그 선택은 당업자에 의해 용이하게 이루어질 수 있다.

바람직한 구체예에서, 폴리-아데닐화 서열은 소 성장 호르몬(bGH) 폴리-아데닐화 서열이다. 특히 바람직한 구체예에서, bGH 폴리-아데닐화 서열은 SEQ ID NO: 8에 명시된 서열 또는 적어도 90%(예를 들어, 적어도 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99.1, 99.2, 99.3, 99.4, 99.5, 99.6, 99.7, 99.8 또는 99.9%) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 갖는다.

본 발명의 AAV 벡터 시스템의 바람직한 구체예에서, 제1 AAV 벡터는 SEQ ID NO: 9의 핵산 서열을 포함하고, 제2 AAV 벡터는 SEQ ID NO: 10의 핵산 서열을 포함한다.

본 발명의 AAV 벡터 시스템의 다른 바람직한 구체예에서, 제1 AAV 벡터는 SEQ ID NO: 3의 핵산 서열을 포함하고, 제2 AAV 벡터는 SEQ ID NO: 4의 핵산 서열을 포함한다.

본 발명의 AAV 벡터 시스템은 표적 세포에서 인간 ABCA4 단백질을 발현시키기에 적합하다.

따라서, 한 양태에서, 본 발명은 표적 세포에서 인간 ABCA4 단백질을 발현시키는 방법을 제공하고, 상기 방법은 표적 세포를 상기 기재된 바와 같은 제1 AAV 벡터 및 제2 AAV 벡터로 형질도입시켜, 기능성 ABCA4 단백질이 표적 세포에서 발현되도록 하는 단계를 포함한다.

인간 ABCA4 단백질의 발현은 표적 세포가 제1 AAV 벡터 및 제2 AAV 벡터 둘 모두로 형질도입될 것을 필요로 한다; 그러나, 순서는 중요하지 않다. 따라서, 표적 세포는 제1 AAV 벡터 및 제2 AAV 벡터에 의해 임의의 순서로(제1 AAV 벡터 이후 제2 AAV 벡터, 또는 제2 AAV 벡터 이후 제1 AAV 벡터) 또는 동시에 형질도입될 수 있다.

표적 세포를 AAV 벡터로 형질도입시키는 방법은 당 분야에 공지되어 있고 당업자에게 익숙할 것이다.

표적 세포는 바람직하게는 눈의 세포, 바람직하게는 망막 세포(예를 들어, 신경 광수용체 세포, 막대 세포, 원뿔 세포, 또는 망막 색소 상피 세포)이다.

본 발명은 또한 상기 정의된 바와 같은 제1 AAV 벡터를 제공한다. 상기 정의된 바와 같은 제2 AAV 벡터가 또한 제공된다.

다른 양태에서, 본 발명은 ABCA4 CDS의 5' 말단 부분을 포함하는 핵산 서열을 포함하는 AAV 벡터를 제공하고, 이 때 ABCA4 CDS의 5' 말단 부분은 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 105 내지 3805에 상응하는 연속 뉴클레오티드의 서열로 구성된다. 따라서, 이 AAV 벡터는 상기 연속 뉴클레오티드의 서열을 초과하는 임의의 추가적인 ABCA4 CDS를 포함하지 않는다.

제1 AAV 벡터는 5' 및 3' ITR, 바람직하게는 AAV ITR; 프로모터, 바람직하게는 GRK1 프로모터; 및/또는 UTR을 포함할 수 있고; 상기 요소들은 본 발명의 AAV 벡터 시스템과 관련하여 상기 기재된 바와 같다.

한 구체예에서, 제1 AAV 벡터는 SEQ ID NO: 9의 핵산 서열을 포함한다.

한 구체예에서, 제1 AAV 벡터는 SEQ ID NO: 9의 핵산 서열 또는 적어도 90%(예를 들어, 적어도 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99.1, 99.2, 99.3, 99.4, 99.5, 99.6, 99.7, 99.8 또는 99.9%) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함한다.

한 구체예에서, 제1 AAV 벡터는, SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 1640에 상응하는 위치에 있는 뉴클레오티드가 G인 것을 조건으로 하여, SEQ ID NO: 9의 핵산 서열, 또는 적어도 90%(예를 들어, 적어도 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99.1, 99.2, 99.3, 99.4, 99.5, 99.6, 99.7, 99.8 또는 99.9%) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함한다.

한 구체예에서, 제1 AAV 벡터는 SEQ ID NO: 3의 핵산 서열을 포함한다.

한 구체예에서, 제1 AAV 벡터는 SEQ ID NO: 3의 핵산 서열 또는 적어도 90%(예를 들어, 적어도 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99.1, 99.2, 99.3, 99.4, 99.5, 99.6, 99.7, 99.8 또는 99.9%) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함한다.

한 구체예에서, 제1 AAV 벡터는, SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 1640에 상응하는 위치에 있는 뉴클레오티드가 G인 것을 조건으로 하여, SEQ ID NO: 3의 핵산 서열, 또는 적어도 90%(예를 들어, 적어도 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99.1, 99.2, 99.3, 99.4, 99.5, 99.6, 99.7, 99.8 또는 99.9%) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함한다.

다른 양태에서, 본 발명은 ABCA4 CDS의 3' 말단 부분을 포함하는 핵산 서열을 포함하는 AAV 벡터를 제공하고, 이 때 ABCA4 CDS의 3' 말단 부분은 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 3598 내지 6926에 상응하는 연속 뉴클레오티드의 서열로 구성된다. 따라서, 이 AAV 벡터는 상기 연속 뉴클레오티드의 서열을 초과하는 임의의 추가적인 ABCA4 CDS를 포함하지 않는다.

제2 벡터는 5' 및 3' ITR, 바람직하게는 AAV ITR; PRE, 바람직하게는 WPRE; 및/또는 폴리-아데닐화 서열, 바람직하게는 bGH 폴리-아데닐화 서열을 포함할 수 있고; 상기 요소들은 본 발명의 AAV 벡터 시스템과 관련하여 상기 기재된 바와 같다.

한 구체예에서, 제2 AAV 벡터는 SEQ ID NO: 10의 핵산 서열을 포함한다.

한 구체예에서, 제2 AAV 벡터는 SEQ ID NO: 10의 핵산 서열 또는 적어도 90%(예를 들어, 적어도 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99.1, 99.2, 99.3, 99.4, 99.5, 99.6, 99.7, 99.8 또는 99.9%) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함한다.

한 구체예에서, 제2 AAV 벡터는, SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 5279에 상응하는 위치에 있는 뉴클레오티드가 G이고 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 6173에 상응하는 위치에 있는 뉴클레오티드가 T인 것을 조건으로 하여, SEQ ID NO: 10의 핵산 서열, 또는 적어도 90%(예를 들어, 적어도 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99.1, 99.2, 99.3, 99.4, 99.5, 99.6, 99.7, 99.8 또는 99.9%) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함한다.

한 구체예에서, 제2 AAV 벡터는 SEQ ID NO: 4의 핵산 서열을 포함한다.

한 구체예에서, 제2 AAV 벡터는 SEQ ID NO: 4의 핵산 서열 또는 적어도 90%(예를 들어, 적어도 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99.1, 99.2, 99.3, 99.4, 99.5, 99.6, 99.7, 99.8 또는 99.9%) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함한다.

한 구체예에서, 제2 AAV 벡터는, SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 5279에 상응하는 위치에 있는 뉴클레오티드가 G이고 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 6173에 상응하는 위치에 있는 뉴클레오티드가 T인 것을 조건으로 하여, SEQ ID NO: 4의 핵산 서열, 또는 적어도 90%(예를 들어, 적어도 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99.1, 99.2, 99.3, 99.4, 99.5, 99.6, 99.7, 99.8 또는 99.9%) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함한다.

본 발명은 또한 상기 기재된 핵산 서열을 포함하는 핵산을 제공한다.

본 발명은 또한 상기 기재된 AAV 벡터로부터 유래될 수 있는 AAV 벡터 유전체를 제공한다.

?한 상기 기재된 바와 같은 제1 AAV 벡터 및 제2 AAV 벡터를 포함하는 키트가 제공된다. AAV 벡터는 AAV 입자 형태의 키트로 제공될 수 있다.

상기 기재된 바와 같은 제1 핵산 서열을 포함하는 핵산 및 제2 핵산 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 키트가 추가로 제공된다.

본 발명은 또한 상기 정의된 바와 같은 AAV 벡터 시스템 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 AAV 벡터 시스템, 본 발명의 키트, 및 본 발명의 약학적 조성물은 유전자 요법에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 AAV 벡터 시스템, 본 발명의 키트, 및 본 발명의 약학적 조성물은 질병의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다.

질병을 예방 또는 치료하기 위한 본 발명의 용도는 ABCA4 단백질의 발현을 제공하기 위해, 제1 AAV 벡터 및 제2 AAV 벡터를 표적 세포에 투여하는 것을 필요로 한다.

바람직하게는 예방 또는 치료되는 질병은 망막 세포의 분해를 특징으로 한다. 그러한 질병의 예는 스타가르트병이다. 따라서, 본 발명의 제1 및 제2 AAV 벡터는 환자의 눈, 바람직하게는 눈의 망막 조직에 투여되어, 질병에 존재하는 돌연변이(들)를 보완하기 위해 기능성 ABCA4 단백질이 발현되게 할 수 있다.

본 발명의 AAV 벡터는 약학적 조성물 또는 약제로서 제형화될 수 있다.

본 발명의 예시적인 AAV 벡터 시스템은 제1 AAV 벡터 및 제2 AAV 벡터를 포함하고; 이 때 제1 AAV 벡터는 SEQ ID NO: 9의 핵산 서열을 포함하고; 제2 AAV 벡터는 SEQ ID NO: 10의 핵산 서열을 포함한다.

본 발명의 추가의 예시적인 AAV 벡터 시스템은 제1 AAV 벡터 및 제2 AAV 벡터를 포함하고; 이 때 제1 AAV 벡터는 SEQ ID NO: 9의 핵산 서열 또는 적어도 90%(예를 들어, 적어도 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99.1, 99.2, 99.3, 99.4, 99.5, 99.6, 99.7, 99.8 또는 99.9%) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하고; 제2 AAV 벡터는 SEQ ID NO: 10의 핵산 서열 또는 적어도 90%(예를 들어, 적어도 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99.1, 99.2, 99.3, 99.4, 99.5, 99.6, 99.7, 99.8 또는 99.9%) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함한다.

본 발명은 또한 SEQ ID NO: 2가 SEQ ID NO: 1을 대신하여 참조 서열로서 사용되는 경우에 수행될 수 있다.

이와 관련하여, SEQ ID NO: 2는 하기 돌연변이를 제외하고 SEQ ID NO: 1과 동일하다: 뉴클레오티드 1640 G>T, 뉴클레오티드 5279 G>A, 뉴클레오티드 6173 T>C. 이러한 돌연변이는 인코딩되는 아미노산 서열을 변경시키지 않으므로, SEQ ID NO: 2에 의해 인코딩된 ABCA4 단백질은 SEQ ID NO: 1에 의해 인코딩된 ABCA4 단백질과 동일하다.

따라서, 본 발명의 대안적인 구체예에서, SEQ ID NO: 1에 대한 상기 언급은 SEQ ID NO: 2에 대한 언급으로 대체될 수 있다.

서열 상응성

본원에서 사용되는 바와 같이, 주어진 핵산 서열에서 뉴클레오티드와 관련하여 사용될 때 용어 "~에 상응하는"은 특정 SEQ ID NO에 대한 언급을 통해 뉴클레오티드 위치를 정의한다. 그러나, 그러한 언급이 주어질 때, 본 발명은 지칭된 특정 SEQ ID NO에 제시된 정확한 서열로 한정되지 않으며 이의 변형 서열을 포함하는 것으로 이해될 것이다. SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 위치에 상응하는 뉴클레오티드는, 그 사용이 당 분야에 널리 공지되어 있는 서열 정렬 프로그램을 사용하는 것과 같이, 서열 정렬에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 이와 관련하여, 당업자는 유전 부호의 축퇴성이라 함이 주어진 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열에서의 변이가 인코딩되는 폴리펩티드의 아미노산 서열을 변화시키지 않으며 존재할 수 있다는 것을 의미하는 것임을 용이하게 인지할 것이다. 따라서, 다른 ABCA4 코딩 서열에서 뉴클레오티드 위치의 확인이 고려된다(즉, 당업자가, 예를 들어, SEQ ID NO: 1에서 확인된 위치에 상응할 것으로 고려하는 위치에 있는 뉴클레오티드).

예로서, SEQ ID NO: 2는 상기 기재된 바와 같은 3개의 특이적 돌연변이를 제외하고는 SEQ ID NO: 1과 동일하다(이러한 3개의 돌연변이는 인코딩되는 ABCA4 폴리펩티드의 아미노산 서열을 변경시키지 않는다). 이 경우에, 당업자는 따라서 SEQ ID NO: 2의 주어진 뉴클레오티드 위치가 SEQ ID NO: 1의 동등한 번호의 뉴클레오티드 위치에 상응한다고 고려할 것이다.

AAV 벡터

본 발명의 바이러스 벡터는 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터이다. 본 발명의 AAV 벡터는 성숙한 AAV 입자 또는 비리온, 즉, AAV 단백질 캡시드에 의해 둘러싸인 핵산의 형태일 수 있다.

AAV 벡터는 AAV 유전체 또는 이의 유도체를 포함할 수 있다.

AAV 유전체는 AAV 입자의 생성에 필요한 기능을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이다. 이들 기능은 AAV 유전체의 AAV 입자로의 캡시드화를 포함하는, 숙주 세포에서의 AAV의 복제 및 패키징 주기에서 작용하는 기능을 포함한다. 천연 발생 AAV는 복제-결여되어 있으며, 복제 및 패키징 주기의 완성을 위해 트랜스의 헬퍼 기능의 공급에 의존한다. 따라서, 본 발명의 벡터의 AAV 유전체는 통상적으로 복제-결여되어 있다.

AAV 유전체는 양성 또는 음성-센스의 단일-가닥 형태일 수 있거나, 대안적으로 이중-가닥 형태일 수 있다. 이중-가닥 형태의 이용은 표적 세포에서의 DNA 복제 단계의 우회를 가능하게 하며, 따라서 트랜스진 발현을 가속화시킬 수 있다.

본 발명의 벡터의 AAV 유전체는 통상적으로 단일-가닥 형태이다.

AAV 유전체는 AAV의 임의의 천연 유래 혈청형, 분리물 또는 클레이드로부터 유래될 수 있다. 따라서, AAV 유전체는 천연 발생 AAV의 전체 유전체일 수 있다. 당업자에게 공지된 바와 같이, 천연 발생하는 AAV는 다양한 생물학적 시스템에 따라 분류될 수 있다.

일반적으로, AAV는 이들의 혈청형과 관련하여 언급된다. 혈청형은 캡시드 표면 항원의 발현의 프로파일로 인해 다른 변이체 아종과 구별하기 위해 이용될 수 있는 특이한 반응성을 갖는 AAV의 변이체 아종에 해당한다. 통상적으로, 특정 AAV 혈청형을 갖는 바이러스는 임의의 다른 AAV 혈청형에 특이적인 중화 항체와 유효하게 교차 반응하지 않는다.

AAV 혈청형은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 및 AAV11, 및 또한 최근에 영장류 뇌로부터 확인된 재조합 혈청형, 예를 들어, Rec2 및 Rec3을 포함한다. 이들 AAV 혈청형 중 임의의 혈청형이 본 발명에서 이용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 한 구체예에서, 본 발명의 AAV 벡터는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rec2 또는 Rec3 AAV로부터 유래될 수 있다.

AAV 혈청형의 개관은 문헌[Choi et al. (2005) Curr. Gene Ther. 5: 299-310 and Wu et al. (2006) Molecular Therapy 14: 316-27]에서 발견될 수 있다. ITR 서열, rep 또는 cap 유전자를 포함하는 AAV 유전체의 서열 또는 AAV 유전체의 요소의 서열은 AAV 전체 유전체 서열에 대한 하기 등록 번호로부터 유래될 수 있다: 아데노-관련 바이러스 1 NC_002077, AF063497; 아데노-관련 바이러스 2 NC_001401; 아데노-관련 바이러스 3 NC_001729; 아데노-관련 바이러스 3B NC_001863; 아데노-관련 바이러스 4 NC_001829; 아데노-관련 바이러스 5 Y18065, AF085716; 아데노-관련 바이러스 6 NC_001862; 조류 AAV ATCC VR-865 AY186198, AY629583, NC_004828; 조류 AAV 균주 DA-1 NC_006263, AY629583; 소 AAV NC_005889, AY388617.

AAV는 또한 클레이드 또는 클론과 관련하여 언급될 수 있다. 이는 천연 유래 AAV의 계통발생학적 관계, 및 통상적으로 공통의 조상으로 역 추적될 수 있는 AAV의 계통발생학적 그룹을 나타내며, 이들의 모든 자손을 포함한다. 또한, AAV는 특정 분리물, 즉, 천연에서 발견되는 특정 AAV의 유전적 분리물과 관련하여 언급될 수 있다. 용어 유전적 분리물은 다른 천연 발생 AAV와 제한된 유전적 혼합을 겪음으로써 유전적 수준에서 인지 가능하게 다른 집단을 규정하는 AAV의 집단을 기재한다.

당업자는 이들의 공통의 일반적 지식을 기초로 하여 본 발명에서 사용하기 위한 AAV의 적절한 혈청형, 클레이드, 클론 또는 분리물을 선택할 수 있다. 예를 들어, AAV5 캡시드는 유전적 색각 결함의 성공적인 교정에 의해 입증되는 바와 같이 영장류 원뿔 광수용체를 효과적으로 형질도입시키는 것으로 밝혀졌다(Mancuso et al. (2009) Nature 461: 784-7).

AAV 혈청형은 AAV 바이러스의 감염(또는 향성)의 조직 특이성을 결정한다. 따라서, 본 발명에 따라 환자에게 투여되는 AAV에서 사용하기에 바람직한 AAV 혈청형은 눈 내에서 표적 세포의 높은 감염효율지수 또는 이에 대한 자연 향성을 갖는 혈청형이다. 한 구체예에서, 본 발명에서 사용하기 위한 AAV 혈청형은 감각신경 망막, 망막 색소 상피 및/또는 맥락막의 세포를 감염시키는 혈청형이다.

통상적으로, AAV의 천연 유래 혈청형, 분리물 또는 클레이드의 AAV 유전체는 적어도 하나의 역방위 말단 반복 서열(ITR)을 포함한다. ITR 서열은 기능성 복제 기점을 제공하고, 벡터의 통합 및 세포의 유전체로부터의 절제를 가능하게 하기 위해 시스 작용한다. AAV 유전체는 또한 통상적으로 AAV 입자의 패키징 기능을 인코딩하는 패키징 유전자, 예를 들어, rep 및/또는 cap 유전자를 포함한다. rep 유전자는 단백질 Rep78, Rep68, Rep52 및 Rep40 또는 이들의 변이체 중 하나 이상을 인코딩한다. cap 유전자는 하나 이상의 캡시드 단백질, 예를 들어, VP1, VP2 및 VP3 또는 이들의 변이체를 인코딩한다. 이들 단백질은 AAV 입자의 캡시드를 구성한다. 캡시드 변이체는 하기에 논의된다.

프로모터는 패키징 유전자 각각에 작동 가능하게 결합될 것이다. 그러한 프로모터의 특정 예는 p5, p19 및 p40 프로모터를 포함한다(Laughlin et al. (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 5567-5571). 예를 들어, p5 및 p19 프로모터는 rep 유전자를 발현시키기 위해 일반적으로 사용되는 한편, p40 프로모터는 cap 유전자를 발현시키기 위해 일반적으로 사용된다.

본 발명의 벡터에서 사용되는 AAV 유전체는 따라서 천연 발생 AAV의 전체 유전체일 수 있다. 예를 들어, 전체 AAV 유전체를 포함하는 벡터가 시험관 내에서 AAV 벡터를 제조하기 위해 사용될 수 있다. 그러나, 그러한 벡터는 원칙적으로는 환자에 투여될 수 있으나, 이는 실제로는 드물게 수행될 것이다. 바람직하게는, AAV 유전체는 환자로의 투여 목적을 위해 유도체화될 것이다. 그러한 유도체화는 당 분야에서 표준이며, 본 발명은 AAV 유전체의 임의의 공지된 유도체, 및 당 분야에 공지된 기술을 적용시킴으로써 생성될 수 있는 유도체의 사용을 포함한다. AAV 유전체 및 AAV 캡시드의 유도체화는 상기 참조된 문헌[Coura and Nardi (2007) Virology Journal 4: 99, 및 Choi et al. and Wu et al.]에 개관되어 있다.

AAV 유전체의 유도체화는 생체내에서 본 발명의 벡터로부터 트랜스진의 발현을 가능하게 하는 AAV 유전체의 임의의 트렁케이션되거나 변형된 형태를 포함한다. 통상적으로, 중요하게는 최소의 바이러스 서열을 포함하나 상기 기능을 보유하는 AAV 유전체를 트렁케이션시키는 것이 가능하다. 이는 야생형 바이러스를 갖는 벡터의 재조합의 위험을 감소시키고, 또한 표적 세포 내의 바이러스 유전자 단백질의 존재에 의한 세포 면역 반응을 촉발시키는 것을 피하는 안전성 이유로 바람직하다.

통상적으로, AAV 유전체의 유도체는 적어도 하나의 역방위 말단 반복 서열(ITR), 바람직하게는 하나 초과의 ITR, 예를 들어, 2개의 ITR 또는 그 초과를 포함할 것이다. ITR 중 하나 이상은 다양한 혈청형을 갖는 AAV 유전체로부터 유래될 수 있거나, 이는 키메라 또는 돌연변이체 ITR일 수 있다. 바람직한 돌연변이체 ITR은 trs(말단 분해 부위)의 결실을 갖는 것이다. 이러한 결실은 유전체의 지속된 복제를 가능하게 하여 코딩 및 상보성 서열 둘 모두를 함유하는 단일-가닥 유전체, 즉, 자가-상보성 AAV 유전체를 생성시킨다. 이는 표적 세포에서 DNA 복제의 우회를 가능하게 하고, 따라서 가속화된 트랜스진 발현을 가능하게 한다.

하나 이상의 ITR의 포함은, 예를 들어, 숙주 세포 DNA 중합효소의 작용에 의해 단일-가닥 벡터 DNA의 이중-가닥 DNA로의 전환 후에 숙주 세포의 핵에서 본 발명의 벡터의 콘카타머(concatamer) 형성을 돕는데 바람직하다. 그러한 에피솜 콘카타머의 형성은 숙주 세포의 생애 동안 벡터 작제물을 보호함으로써 생체내에서 트랜스진의 연장된 발현을 가능하게 한다.

바람직한 구체예에서, ITR 요소는 유도체 내에서 천연 AAV 유전체로부터 유지된 유일한 서열일 것이다. 따라서, 유도체는 바람직하게는 천연 유전체의 rep 및/또는 cap 유전자 및 천연 유전체의 임의의 다른 서열을 포함하지 않을 것이다. 이는 상기 기재된 이유로 바람직하며, 또한 숙주 세포 유전체로의 벡터의 통합 가능성을 감소시키는데 바람직하다. 또한, AAV 유전체의 크기를 감소시키는 것은 트랜스진에 더하여 벡터 내에 다른 서열 요소(예를 들어, 조절 요소)를 혼입시키는데 있어서 증가된 유연성을 가능하게 한다.

따라서, 본 발명의 유도체에서 다음과 같은 부분이 제거될 수 있었다: 1개의 역방위 말단 반복(ITR) 서열, 복제(rep) 및 캡시드(cap) 유전자. 그러나, 일부 구체예에서, 유도체는 하나 이상의 rep 및/또는 cap 유전자 또는 AAV 유전체의 다른 바이러스 서열을 추가로 포함할 수 있다. 천연 발생 AAV는 인간 염색체 19 상의 특정 부위에 높은 빈도로 통합되며, 벡터 내에서의 통합 능력의 보유가 치료 환경에서 용인될 수 있도록 아주 약간의 빈도의 무작위 통합을 나타낸다.

유도체가 캡시드 단백질, 즉, VP1, VP2 및/또는 VP3을 포함하는 경우, 유도체는 하나 이상의 천연 발생 AAV의 키메라 유도체, 셔플링된 유도체 또는 캡시드-변형된 유도체일 수 있다. 특히, 본 발명은 동일 벡터(즉, 슈도타이핑된 벡터(pseudotyped vector)) 내의 AAV의 다양한 혈청형, 클레이드, 클론 또는 분리물로부터의 캡시드 단백질 서열의 제공을 포함한다.

키메라 유도체, 셔플링된 유도체 또는 캡시드-변형된 유도체는 통상적으로 바이러스 벡터에 대해 하나 이상의 요망되는 기능을 제공하도록 선택될 것이다. 따라서, 이들 유도체는 천연 발생 AAV 유전체를 포함하는 AAV 벡터, 예를 들어, AAV2의 AAV 벡터에 비해 증가된 유전자 전달의 효율, 감소된 면역원성(체액성 또는 세포성), 특정 세포 유형의 변경된 향성 범위 및/또는 개선된 표적화를 나타낼 수 있다. 유전자 전달의 증가된 효율은 세포 표면에서의 개선된 수용체 또는 공동-수용체 결합, 개선된 내재화, 세포 내 및 핵으로의 개선된 트래피킹(trafficking), 바이러스 입자의 개선된 탈외피 및 단일-가닥 유전체의 이중-가닥 형태로의 개선된 전환에 의해 달성될 수 있다. 증가된 효율은 또한 특정 세포 집단의 변경된 향성 범위 또는 표적화에 관한 것일 수 있으며, 벡터 용량은 이것이 필요하지 않은 조직으로의 투여에 의해 희석되지 않는다.

키메라 캡시드 단백질은 천연 발생 AAV 혈청형의 2개 이상의 캡시드 코딩 서열 사이의 재조합에 의해 발생된 것을 포함한다. 이는, 예를 들어, 하나의 혈청형의 비-감염성 캡시드 서열이 상이한 혈청형의 캡시드 서열과 공동-트랜스펙션되는 마커 구제 접근법에 의해 수행될 수 있으며, 요망되는 특성을 갖는 캡시드 서열을 선택하기 위해 직접 선택이 이용된다. 다양한 혈청형의 캡시드 서열은 신규한 키메라 캡시드 단백질을 생성시키기 위해 세포 내에서 상동성 재조합에 의해 변경될 수 있다.

키메라 캡시드 단백질은 또한 2개 이상의 캡시드 단백질 사이, 예를 들어, 상이한 혈청형의 2개 이상의 캡시드 단백질 사이로 특정 캡시드 단백질 도메인, 표면 루프 또는 특정 아미노산 잔기를 전달하도록 캡시드 단백질 서열을 조작함으로써 발생된 것을 포함한다.

셔플링된 캡시드 단백질 또는 키메라 캡시드 단백질은 또한 DNA 셔플링 또는 오류-빈발 PCR에 의해 생성될 수 있다. 하이브리드 AAV 캡시드 유전자는 관련된 AAV 유전자의 서열, 예를 들어, 다수의 상이한 혈청형의 캡시드 단백질을 인코딩하는 서열을 무작위로 단편화시키고, 이후 서열 상동성 영역에서 교차를 또한 야기시킬 수 있는 자가-프라이밍 중합효소 반응에서 상기 단편을 재어셈블링시킴으로써 생성될 수 있다. 여러 혈청형의 캡시드 유전자를 셔플링시킴으로써 상기 방식으로 생성된 하이브리드 AAV 유전자의 라이브러리는 요망되는 기능을 갖는 바이러스 클론을 확인하기 위해 스크리닝될 수 있다. 유사하게, 이후에 요망되는 특성에 대해 선택될 수 있는 다양한 라이브러리의 변이체를 생성시키기 위해 AAV 캡시드 유전자를 무작위로 돌연변이시키기 위해 오류 빈발 PCR이 이용될 수 있다.

캡시드 유전자의 서열은 또한 천연의 야생형 서열과 관련하여 특정 결실, 치환 또는 삽입을 도입시키기 위해 유전학적으로 변형될 수 있다. 특히, 캡시드 유전자는 캡시드 코딩 서열의 열린해독틀 내, 또는 캡시드 코딩 서열의 N-말단 및/또는 C-말단에서 관련되지 않은 단백질 또는 펩티드의 서열의 삽입에 의해 변형될 수 있다.

관련되지 않은 단백질 또는 펩티드는 유리하게는 특정 세포 유형에 대한 리간드로서 작용함으로써 표적 세포에 대한 개선된 결합을 부여하거나, 특정 세포 집단으로의 벡터의 표적화의 특이성을 개선시키는 것일 수 있다. 관련되지 않은 단백질은 또한 생성 과정의 일부로서 바이러스 입자의 정제를 돕는 것, 즉, 에피토프 또는 친화성 태그일 수 있다. 삽입 부위는 통상적으로 바이러스 입자의 다른 기능, 예를 들어, 바이러스 입자의 내재화, 트래피킹을 간섭하지 않도록 선택될 것이다. 당업자는 이들의 공통의 일반적인 지식에 기반하여 삽입에 적합한 부위를 확인할 수 있다. 특정 부위가 상기 참조된 문헌[Choi et al.]에 개시되어 있다.

본 발명은 천연 AAV 유전체의 것과 상이한 순서 및 입체형태의 AAV 유전체의 서열의 제공을 추가로 포함한다. 본 발명은 또한 하나 이상의 AAV 서열 또는 유전자의 또 다른 바이러스로부터의 서열 또는 하나 초과의 바이러스로부터의 서열로 구성된 키메라 유전자에 의한 대체를 포함한다. 그러한 키메라 유전자는 상이한 바이러스 종의 2개 이상의 관련 바이러스 단백질로부터의 서열로 구성될 수 있다.

본 발명의 AAV 벡터는 하나의 혈청형의 ITR을 갖는 AAV 유전체 또는 유도체가 상이한 혈청형의 캡시드에 패키징되는 캡시드전이(transcapsidated) 형태를 포함한다. 본 발명의 AAV 벡터는 또한 2개 이상의 상이한 혈청형으로부터의 변형되지 않은 캡시드 단백질의 혼합물이 바이러스 캡시드를 구성하는 모자이크 형태를 포함한다. AAV 벡터는 또한 캡시드 표면에 흡착된 리간드를 갖는 화학적으로 변형된 형태를 포함할 수 있다. 예를 들어, 그러한 리간드는 특정 세포 표면 수용체를 표적화시키기 위한 항체를 포함할 수 있다.

따라서, 예를 들어, 본 발명의 AAV 벡터는 AAV2 유전체 및 AAV2 캡시드 단백질을 갖는 것(AAV2/2), AAV2 유전체 및 AAV5 캡시드 단백질을 갖는 것(AAV2/5) 및 AAV2 유전체 및 AAV8 캡시드 단백질을 갖는 것(AAV2/8)을 포함한다.

본 발명의 AAV 벡터는 돌연변이체 AAV 캡시드 단백질을 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 본 발명의 AAV 벡터는 돌연변이체 AAV8 캡시드 단백질을 포함한다. 바람직하게는, 돌연변이체 AAV8 캡시드 단백질은 AAV8 Y733F 캡시드 단백질이다.

투여 방법

본 발명의 바이러스 벡터는 망막하, 직접 망막 또는 유리체내 주입에 의해 대상체의 눈에 투여될 수 있다.

당업자는 개별적 망막하, 직접 망막 또는 유리체내 주입에 친숙할 것이며, 이를 잘 수행할 수 있을 것이다.

망막하 주입

망막하 주입은 망막하 공간, 즉, 감각신경 망막 아래로의 주입이다. 망막하 주입 동안, 주입되는 물질은 광수용체 세포와 망막 색소 상피(RPE) 층 사이로 향하며, 이 사이에 공간을 발생시킨다.

주입이 작은 망막절개술을 통해 수행되는 경우, 망막 박리가 발생할 수 있다. 주입된 물질에 의해 발생하는 망막의 박리된 부푼 층은 "수포"로 언급된다.

망막하 주입에 의해 발생된 구멍은 주입된 용액이 투여 후에 유리체강으로 유의하게 역류하지 않도록 충분히 작아야 한다. 그러한 역류는 약물이 주입되는 경우에 특히 문제가 되는데, 그 이유는 약물의 효과가 표적 영역으로부터 떨어져 향하게 되기 때문이다. 바람직하게는, 주입은 감각신경 망막 내에 자가-밀봉 진입점을 발생시키며, 즉, 주입 바늘이 제거된 후, 바늘에 의해 발생된 구멍은 그 구멍을 통해 매우 적은 주입 물질이 방출되거나 실질적으로 주입 물질이 방출되지 않도록 재밀봉된다.

상기 과정을 촉진하기 위해, 전문적인 망막하 주입 바늘이 상업적으로 이용 가능하다(예를 들어, DORC 41G Teflon 망막하 주입 바늘, Dutch Ophthalmic Research Center International BV, Zuidland, The Netherlands). 이들은 망막하 주입을 수행하도록 설계된 바늘이다.

주입 동안 망막에 대한 손상이 발생하지 않고, 충분히 작은 바늘이 사용되는 한, 실질적으로 모든 주입된 물질은 박리된 감각신경 망막과 국소화된 망막 박리 부위의 RPE 사이에 국소화된 채로 남아 있는다(즉, 유리체강으로 역류되지 않는다). 게다가, 단기간에 걸친 수포의 통상적인 지속은 일반적으로 주입된 물질의 유리체로의 적은 누출이 존재하는 것을 나타낸다. 수포는 주입된 물질이 흡수됨에 따라 장기간에 걸쳐 사라질 수 있다.

예를 들어, 광간섭 단층영상을 이용한 눈, 특히 망막의 시각화가 수술전에 이루어질 수 있다.

2-단계 망막하 주입

본 발명의 AAV 벡터는 국소화된 망막 박리가 첫 번째 용액의 망막하 주입에 의해 발생되는 2-단계 방법을 이용하여 증가된 정확성 및 안전성으로 전달될 수 있다. 첫 번째 용액은 벡터를 포함하지 않는다. 이후, 첫 번째 망막하 주입에 의해 발생된 수포의 망막하 유체로 벡터를 포함하는 약물을 전달하기 위해 두 번째 망막하 주입이 이용된다. 약물을 전달하는 주입은 망막을 박리시키는데 사용되지 않으므로, 특정 부피의 용액이 이러한 두 번째 단계로 주입될 수 있다.

본 발명의 AAV 벡터는 하기에 의해 전달될 수 있다:

(a) 망막을 적어도 부분적으로 박리시켜 망막하 수포를 형성시키는데 효과적인 양으로 용액을 망막하 주입에 의해 대상체에 투여하는 단계로서, 용액이 벡터를 포함하지 않는 단계; 및

(b) 단계 (a)에 의해 형성된 수포로 망막하 주입에 의해 약물 조성물을 투여하는 단계로서, 약물이 벡터를 포함하는 단계.

망막을 적어도 부분적으로 박리시키기 위해 단계 (a)에서 주입되는 용액의 부피는, 예를 들어, 약 10-1000 μL, 예를 들어, 약 50-1000, 100-1000, 250-1000, 500-1000, 10-500, 50-500, 100-500, 250-500 μL일 수 있다. 부피는, 예를 들어, 약 10, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 또는 1000 μL일 수 있다.

단계 (b)에서 주입되는 약물 조성물의 부피는, 예를 들어, 약 10-500 μL, 예를 들어, 약 50-500, 100-500, 200-500, 300-500, 400-500, 50-250, 100-250, 200-250 또는 50-150 μL일 수 있다. 부피는, 예를 들어, 약 10, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 또는 500 μL일 수 있다. 바람직하게는, 단계 (b)에서 주입되는 약물 조성물의 부피는 100 μL이다. 더 많은 부피는 망막을 신장시킬 위험을 증가시킬 수 있는 반면, 더 적은 부피는 관찰하기가 어려울 수 있다.

약물을 포함하지 않는 용액(즉, 단계 (a)의 "첫 번째 용액")은 하기에 기재되는 바와 같이 약물을 포함하는 용액과 유사하게 제형화될 수 있다. 약물을 포함하지 않는 바람직한 용액은 평형 염 용액(BSS) 또는 망막하 공간의 pH와 삼투질농도와 일치하는 유사한 완충 용액이다.

수술 동안의 망막 시각화

특정 상황 하에서, 예를 들어, 말기 망막 변성 동안, 망막을 확인하는 것은 어려운데, 그 이유는 망막이 얇고, 투명하며, 이것이 놓인 찢어지고 과하게 색소화된 상피를 관찰하기가 어렵기 때문이다. 청색 생체 염료(예를 들어, Brilliant Peel^®, Geuder; MembraneBlue-Dual^®, Dorc)의 사용은 망막 박리 절차(즉, 본 발명의 2-단계 망막하 주입 방법에서 단계 (a))에서 만들어진 망막 구멍의 확인을 촉진시킬 수 있어, 약물이 유리체강으로 역류될 위험 없이 동일 구멍을 통해 투여될 수 있다.

청색 생체 염료의 사용은 또한 두꺼워진 내경계막 또는 망막앞막이 존재하는 망막의 임의의 영역을 확인하는데, 이는 이들 구조 중 어느 쪽을 통한 주입이 망막하 공간으로의 깔끔한 접근을 방해하기 때문이다. 또한, 수술 직후 기간에서의 이들 구조 중 어느 것에서의 수축은 망막 진입 구멍의 신장을 초래할 수 있으며, 이는 약물의 유리체강으로의 역류를 발생시킬 수 있다.

약학적 조성물 및 주입 용액

본 발명의 AAV 벡터 및 AAV 벡터 시스템은 약학적 조성물로 제형화될 수 있다. 이들 조성물은 약물에 더하여 약학적으로 허용되는 담체, 희석제, 부형제, 완충제, 안정화제 또는 당 분야에 널리 공지된 다른 물질을 포함할 수 있다. 그러한 물질은 비독성이어야 하며, 활성 성분의 효능을 간섭하지 않아야 한다. 담체 또는 다른 물질의 정확한 특성은 투여 경로, 예를 들어, 망막하, 직접 망막 또는 유리체내 주입에 따라 당업자에 의해 결정될 수 있다.

약학적 조성물은 통상적으로 액체 형태이다. 액체 약학적 조성물은 일반적으로 액체 담체, 예를 들어, 물, 석유, 동물 또는 식물 오일, 광유 또는 합성유를 포함한다. 생리학적 식염수, 마그네슘 클로라이드, 덱스트로스 또는 다른 당류 용액, 또는 글리콜, 예를 들어, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜이 포함될 수 있다. 일부 경우에, 계면활성제, 예를 들어, 플루론산(PF68) 0.001%가 이용될 수 있다.

질병 부위에서의 주입을 위해, 활성 성분은 발열원이 없고, 적합한 pH, 등장성 및 안정성을 갖는 수용액의 형태일 수 있다. 당업자는, 예를 들어, 등장성 비히클, 예를 들어, 소듐 클로라이드 주사액, 링거 주사액 또는 락테이트화 링거 주사액을 이용하여 적합한 용액을 잘 제조할 수 있다. 보존제, 안정화제, 완충제, 항산화제 및/또는 다른 첨가물이 필요에 따라 포함될 수 있다.

지연 방출을 위해, 약물은 느린 방출을 위해 제형화되는 약학적 조성물, 예를 들어, 당 분야에 공지된 방법에 따른 생체적합성 중합체로부터 형성된 미세캡슐 또는 리포솜 담체 시스템 내에 포함될 수 있다.

치료 방법

본 발명의 상황에서 예방에 대한 언급은 예방적 치료와 더욱 일반적으로 관련되나, 치료에 대한 본원의 모든 언급은 치료적, 완화적 및 예방적 치료를 포함함이 인지되어야 한다. 치료는 또한 질병의 중증도에서 진행을 억제하는 것을 포함할 수 있다.

포유동물, 특히 인간의 치료가 바람직하다. 그러나, 인간 및 수의학적 치료 둘 모두가 본 발명의 범위 내이다.

변이체, 유도체, 유사체, 동족체 및 단편

본원에 언급된 특정 단백질 및 뉴클레오티드에 더하여, 본 발명은 또한 변이체, 유도체, 유사체, 동족체 및 이들의 단편의 사용을 포함한다. 본 발명의 상황에서, 임의의 제공된 서열의 변이체는 잔기의 특정 서열(아미노산이거나 핵산 잔기이건 간에)이 당해 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드가 이의 기능을 실질적으로 유지하도록 하는 방식으로 변형된 서열이다. 변이체 서열은 천연 발생 단백질에 존재하는 적어도 하나의 잔기의 첨가, 결실, 치환, 변형, 대체 및/또는 변화에 의해 획득될 수 있다.

본 발명의 단백질 또는 폴리펩티드와 관련하여 본원에서 사용되는 용어 "유도체"는, 결과로서 발생된 단백질 또는 폴리펩티드가 이의 내인적 기능 중 적어도 하나를 실질적으로 유지하도록 하는 조건으로, 서열로부터 또는 서열로의 하나(또는 그 초과)의 아미노산 잔기의 임의의 치환, 변화, 변형, 대체, 결실 및/또는 첨가를 포함한다.

폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드와 관련하여 본원에서 사용되는 용어 "유사체"는 임의의 모방체, 즉, 모방하는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 내인적 기능 중 적어도 하나를 갖는 화학적 화합물을 포함한다.

통상적으로, 아미노산 치환은, 예를 들어, 1, 2 또는 3 내지 10 또는 20개의 치환으로 이루어질 수 있으나, 단, 변형된 서열은 필요한 활성 또는 능력을 실질적으로 유지해야 한다. 아미노산 치환은 비-천연 발생 유사체의 사용을 포함할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 단백질은 또한 침묵 변화를 생성시키고, 기능적으로 동등한 단백질을 발생시키는 아미노산 잔기의 결실, 삽입 또는 치환을 가질 수 있다. 계획적 아미노산 치환은 내인적 기능이 유지되는 한 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성 특성에서의 유사성을 기초로 하여 이루어질 수 있다. 예를 들어, 음성으로 하전된 아미노산은 아스파르트산 및 글루탐산을 포함하고; 양성으로 하전된 아미노산은 리신 및 아르기닌을 포함하고; 유사한 친수성 값을 갖는 하전되지 않은 극성 헤드 기를 갖는 아미노산은 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌 및 티로신을 포함한다.

보존적 치환은, 예를 들어, 하기 표에 따라 이루어질 수 있다. 두 번째 컬럼 내의 동일 블록, 바람직하게는 세 번째 컬럼 내의 동일 라인의 아미노산은 서로 치환될 수 있다:

본원에서 사용되는 용어 "동족체"는 야생형 아미노산 서열 및 야생형 뉴클레오티드 서열과 특정 상동성을 갖는 존재물을 의미한다. 용어 "상동성"은 "동일성"과 같을 수 있다.

상동성 서열은 대상 서열과 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% 또는 90% 동일할 수 있고, 바람직하게는 적어도 95% 또는 97% 또는 99% 동일할 수 있는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 통상적으로, 동족체는 대상 아미노산 서열과 동일한 활성 부위 등을 포함할 것이다. 상동성은 또한 유사성(즉, 유사한 화학적 특성/기능을 갖는 아미노산 잔기)과 관련하여 고려될 수 있으나, 본 발명의 상황에서, 서열 동일성과 관련하여 상동성을 표현하는 것이 바람직하다.

상동성 서열은 대상 서열과 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% 또는 90% 동일할 수 있고, 바람직하게는 적어도 95% 또는 97% 또는 99% 동일할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 상동성은 또한 유사성과 관련하여 고려될 수 있으나, 본 발명의 상황에서, 서열 동일성과 관련하여 상동성을 표현하는 것이 바람직하다.

바람직하게는, 본원에 상술된 SEQ ID NO 중 어느 하나에 대한 동일성 퍼센트를 갖는 서열에 대한 언급은 언급된 SEQ ID NO의 전체 길이에 걸쳐 언급된 동일성 퍼센트를 갖는 서열을 나타낸다.

상동성 비교는 육안에 의해, 또는 더욱 일반적으로는 용이하게 이용 가능한 서열 비교 프로그램의 도움으로 수행될 수 있다. 이들 상업적으로 이용 가능한 컴퓨터 프로그램은 2개 이상의 서열 사이의 상동성 또는 동일성 백분율을 계산할 수 있다.

상동성 백분율은 연속 서열에 걸쳐 계산될 수 있으며, 즉, 하나의 서열이 다른 서열과 정렬되고, 한 서열 내의 각각의 아미노산이 한번에 하나의 잔기씩 다른 서열 내의 해당 아미노산과 직접 비교된다. 이는 "갭이 없는" 정렬로 언급된다. 통상적으로, 그러한 갭이 없는 정렬은 비교적 짧은 수의 잔기에 걸쳐서만 수행된다.

이는 매우 간단하고 일관된 방법이나, 이는, 예를 들어, 서열의 달리 동일한 쌍에서, 뉴클레오티드 서열 내의 하나의 삽입 또는 결실이 다음 코돈을 정렬에서 빠지게 함으로써, 전체적인 정렬이 수행될 때 잠재적으로 상동성 퍼센트에서의 큰 감소를 발생시킬 수 있다는 것을 고려할 수 없다. 결과적으로, 대부분의 서열 비교 방법은 전체 상동성 스코어에 부당하게 페널티를 주지 않으며 가능한 삽입 및 결실을 고려한 최적 정렬을 발생시키도록 설계된다. 이는 국소 상동성을 최대화시키기 위해 서열 정렬 내에 "갭"을 삽입함으로써 달성된다.

그러나, 이들 더욱 복잡한 방법은 정렬에서 발생하는 각각에 갭에 대해 "갭 패널티"를 부여하여, 같은 수의 동일한 아미노산에 대해, 2개의 비교된 서열 사이에 더 높은 관련성을 반영하는 가능한 한 적은 갭을 갖는 서열 정렬이 많은 갭을 갖는 서열 정렬보다 높은 스코어를 달성하도록 할 것이다. 갭의 존재에 대해 비교적 높은 코스트 및 갭 내의 각각의 이후의 잔기에 대해 더 작은 페널티를 부과하는 "어파인 갭 코스트(Affine gap cost)"가 통상적으로 이용된다. 이는 가장 일반적으로 사용되는 갭 스코어링 시스템이다. 높은 갭 페널티는 물론 더 적은 갭을 갖는 최적화된 정렬을 발생시킬 것이다. 대부분의 정렬 프로그램은 갭 페널티가 변형되는 것을 허용한다. 그러나, 서열 비교를 위해 그러한 소프트웨어를 이용하는 경우 디폴트 값을 이용하는 것이 바람직하다. 예를 들어, GCG Wisconsin Bestfit 패키지를 이용하는 경우, 아미노산 서열에 대한 디폴트 갭 페널티는 갭에 대해 -12 및 각각의 신장에 대해 -4이다.

따라서, 최대 상동성 백분율의 계산은 먼저 갭 페널티를 고려한 최적 정렬의 발생을 필요로 한다. 그러한 정렬을 수행하기 위한 적합한 컴퓨터 프로그램은 GCG Wisconsin Bestfit 패키지(University of Wisconsin, U.S.A.; Devereux et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12: 387)이다. 서열 비교를 수행할 수 있는 다른 소프트웨어의 예는 BLAST 패키지(Ausubel et al. (1999) ibid - Ch. 18 참조), FASTA(Atschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 403-410) 및 GENEWORKS 스위트 비교 툴을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. BLAST 및 FASTA 둘 모두는 오프라인 및 온라인 검색에 이용 가능하다(Ausubel et al. (1999) ibid, pages 7-58 to 7-60 참조). 그러나, 일부 적용에 대해, GCG Bestfit 프로그램을 이용하는 것이 바람직하다. BLAST 2 Sequences로 언급되는 또 다른 툴이 또한 단백질 및 뉴클레오티드 서열을 비교하는데 이용 가능하다(FEMS Microbiol. Lett. (1999) 174: 247-50; FEMS Microbiol. Lett. (1999) 177: 187-8 참조). 최종 상동성 퍼센트는 동일성과 관련하여 측정될 수 있으나, 정렬 과정 자체는 통상적으로 올-오어-낫씽(all-or-nothing) 쌍 비교를 기초로 하지 않는다. 대신, 화학적 유사성 또는 진화적 거리(evolutionary distance)에 기반하여 스코어를 각각의 쌍별 비교에 할당하는 스케일드 유사성 스코어 매트릭스(scaled similarity score matrix)가 일반적으로 이용된다. 일반적으로 사용되는 그러한 매트릭스의 예는 BLAST 스위트 프로그램에 대한 디폴트 매트릭스인 BLOSUM62 매트릭스이다. GCG Wisconsin 프로그램은 일반적으로 공적 디폴트 값 또는 공급된 경우 맞춤 기호 비교 표를 이용한다(추가 세부사항에 대해서는 사용자 메뉴얼 참조). 일부 적용을 위해, GCG 패키지에 대한 공적 디폴트 값, 또는 다른 소프트웨어의 경우에서, 디폴트 매트릭스, 예를 들어, BLOSUM62를 이용하는 것이 바람직하다.

소프트웨어가 최적 정렬를 생성한 후, 상동성 퍼센트, 바람직하게는 서열 동일성 퍼센트를 계산하는 것이 가능하다. 소프트웨어는 통상적으로 서열 비교의 일부로서 이를 수행하며, 수치적 결과를 생성한다.

"단편"은 또한 변이체이며, 상기 용어는 통상적으로 기능적 또는, 예를 들어, 검정에서 중요한 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 선택된 영역을 나타낸다. 따라서, "단편"은 전장 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 일부인 아미노산 또는 핵산 서열을 나타낸다.

그러한 변이체는 표준 재조합 DNA 기술, 예를 들어, 부위-지정 돌연변이유발을 이용하여 제조될 수 있다. 삽입이 이루어져야 하는 경우, 삽입 부위의 어느 한 측면에서 천연-발생 서열에 해당하는 5' 및 3' 측접 영역과 함께 삽입물을 인코딩하는 합성 DNA가 제조될 수 있다. 측접 영역은 천연 발생 서열 내의 부위에 해당하는 편리한 제한 부위를 함유할 것이며, 이에 서열은 적절한 효소(들)로 절단될 수 있고, 합성 DNA가 상기 절단부로 라이게이션될 수 있다. 이후, DNA는 본 발명에 따라 발현되어 인코딩된 단백질을 제조한다. 이들 방법은 단지 DNA 서열의 조작을 위한 당 분야에 공지된 다수의 표준 기술의 예시이며, 다른 공지된 기술이 또한 이용될 수 있다.

코돈 최적화

본 발명은 본원에 기재된 핵산 서열의 코돈 최적화된 변이체를 포함한다.

코돈 최적화는 유전 부호에서의 중복을 이용하여 인코딩된 단백질의 동일한 아미노산 서열을 유지하면서 뉴클레오티드 서열이 변경되는 것을 가능하게 한다.

통상적으로, 코돈 최적화는 인코딩된 단백질의 발현의 증가 또는 감소를 촉진하도록 수행된다. 이는 특정 세포 유형의 코돈 사용으로 뉴클레오티드 서열 내의 코돈 사용을 맞춤화시킴으로써, 세포 유형의 특정 tRNA의 상대적 풍부성에서의 편향에 해당하는 세포 코돈 편향을 이용하여 달성된다. 해당 tRNA의 상대적 풍부성과 일치하도록 맞춤화되도록 뉴클레오티드 서열 내의 코돈을 변경시킴으로써, 발현을 증가시키는 것이 가능하다. 역으로, 해당 rRNA가 특정 세포 유형에서 드문 것으로 공지된 코돈을 선택함으로써 발현을 감소시키는 것이 가능하다.

핵산 서열의 코돈 최적화 방법은 당 분야에 공지되어 있고 당업자에게 친숙할 것이다.

서열

실시예

실시예 1 - 상류 및 하류 AAV 벡터의 제조

주어진 AAV 벡터의 생성을 위해, 3개의 플라스미드가 필요하다: pTransgene, pRepCap 및 pHelper. PTransgene은 하기 설명된 대로 상류 또는 하류의 ABCA4 트랜스진을 함유한다(ITR 완전성 확인됨). PRepCap은 AAV 유전체의 rep 및 cap 유전자를 함유한다. rep 유전자는 AAV2 유전체로부터 유래된 반면 cap 유전자는 혈청형 요건에 따라 달라질 것이다. pHelper는 성공적인 AAV 생성에 필요한 필수 아데노바이러스 유전자를 함유한다. 플라스미드는 HEK293T 세포에 적용되는 삼중 트랜스펙션 믹스를 위해 폴리에틸렌이민(PEI)과 복합체화된다. 트랜스펙션 3일 후에, 세포를 수집하고 용해시킨다. 용해물을 벤조나제로 처리하고 정화시킨 후 15%, 25%, 40% 및 60% 상으로 구성된 이오딕사놀 구배에 적용한다. 구배를 59,000rpm으로 1시간 30분 동안 회전한 다음 40% 분획을 회수한다. 이후 이 AAV 상을 Amicon Ultra 100K 필터 유닛을 사용하여 정제하고 농축시킨다. 이 단계 이후, 100-200μl의 정제된 AAV가 PBS에서 수득된다.

실시예 2 - 예시적인 AAV 벡터의 구조

상류 벡터

이 벡터는 프로모터, 비번역 영역(UTR) 및 ABCA4 CDS의 상류 세그먼트를 함유하고 트랜스진의 각 말단에 AAV2 ITR을 갖는다(도 1). ABCA4는 망막의 광수용체 세포에서 발현되므로 인간 로돕신 키나제(GRK1) 프로모터 요소가 혼입되었다. 상류 벡터에 함유된 특이적 GRK1 프로모터 서열은 GRK1 유전자의 뉴클레오티드 -112 내지 +87을 포함하는 문헌[Khani et al. (Investigative Ophthalmology and Visual Science, 48(9), 3954-3961, 2007)]에 기재된 바와 같고, 광수용체 세포를 표적화하는 유전자 요법을 위해 전임상 연구에 이용되어 왔다.

GRK1 프로모터의 199개 뉴클레오티드 뒤에는 186개 뉴클레오티드 길이의 비번역 영역(UTR)이 따라온다. 이 뉴클레오티드 서열은 REP1 임상 시험 벡터(MacLaren et al., 2014)에 함유된 더 큰 UTR(443개 뉴클레오티드)로부터 선택되었다. 구체적으로, 선택된 서열은 Kozak 컨센서스 직전에 갈루스 갈루스 β-액틴(CBA) 인트론 1 단편(예측된 스플라이스 도너 부위를 지님), 오릭토라구스 쿠니쿨루스 β-글로빈(RBG) 인트론 2 단편(예측된 분지점 및 스플라이스 억셉터 부위를 포함함) 및 오릭토라구스 쿠니쿨루스 β-글로빈 엑손 3 단편을 포함하고, 이는 ABCA4 CDS를 유도한다. 이 UTR 단편은 번역 수율을 증가시키기 위해 원래 GRK1 프로모터 요소에 첨가되었다(Rafiq et al., 1997; Chatterjee et al., 2009). 그 자체로, GRK1 프로모터는 광수용체 세포에서 매우 우수한 유전자 발현 능력을 나타내었는데, 이는 발현을 억제하는 주요 특징이 없음을 시사한다.

이중 벡터 주입된 Abca4 ^-/- 망막의 비교는 GRK1 프로모터 요소 단독에 비해 상류 벡터가 GRK1.5'UTR 요소를 지니고 있는 눈에서 상당히 많은 ABCA4 단백질이 생성되는 것을 나타낸다(도 2).

상류 벡터에서 Kozak 컨센서스 후에 뉴클레오티드 1 내지 3,701의 ABCA4 CDS가 있다(NCBI 참조 파일 NM_000350의 105 내지 3,805). ABCA4 CDS의 최종 208개 뉴클레오티드는 하류 벡터에 함유된 CDS의 처음 208개 뉴클레오티드를 형성하고 이는 중첩 영역으로서 작용한다. 상류 벡터에 함유된 코딩 서열 단편은 뉴클레오티드 1,536(NM_000350 1,640)에서의 염기 변화 G>T를 제외하고는 참조 서열 NM_000350과 일치한다. 이것은 코돈의 세 번째 염기이고, 아미노산 서열 변화를 일으키지 않는다. ABCA4 CDS는 이의 3'ITR 하류를 포함하여 엑손 25 내에서 트렁케이션된다.

하류 벡터

이 벡터는 ABCA4 CDS의 하류 세그먼트, 우드척 간염 바이러스 전사 후 반응 요소(WPRE) 및 소 성장 호르몬 폴리-아데닐화 신호(bGH 폴리A)를 함유하고 트랜스진의 각 말단에 AAV2 ITR을 갖는다(도 1). ABCA4 CDS는 위치 3,494의 5'ITR의 하류에서 시작하고(NM_000350 3,598) 6,822의 정지 코돈까지 계속된다(NM_000350 6,926). ABCA4 CDS의 처음 208개 뉴클레오티드는 상류 벡터에 함유된 마지막 208개 ABCA4 CDS 뉴클레오티드와 같고 이는 트랜스진 사이의 중첩 영역으로서 작용한다. 하류 벡터에 함유된 코딩 서열 단편은 뉴클레오티드 5,175(NM_000350 5,279)에서의 염기 변화 G>A 및 6,069(NM_000350 6,173)에서의 T>C를 제외하고는 참조 서열 NM_000350과 일치한다. 이들 둘 모두의 변화는 코돈의 세 번째 염기에서 일어나며, 아미노산 서열 변화를 일으키지 않는다.

제한 효소 HindIII는 ABCA4 CDS 정지 코돈을 WPRE로부터 분리한다. 이 요소는 593개 뉴클레오티드의 길이이고, REP1 임상 시험 벡터에 함유된 X 항원 불활성화된 WPRE와 일치한다. 이후 SphI에 대한 제한 부위는 WPRE를 bGH 폴리A 신호로부터 분리하는데, 이것은 269개 뉴클레오티드의 길이이고 REP1 임상 시험 벡터에 존재하는 bGH 폴리A 신호와 일치한다. 이후 3'ITR은 폴리A 신호의 하류에 놓인다.

AAV2 5'ITR은 프로모터 활성을 갖는 것으로 공지되어 있고, 하류 트랜스진 내의 WPRE 및 bGH 폴리A 신호에 의해, 안정한 전사체가 재조합되지 않은 하류 벡터로부터 생성될 것이다. 하류 트랜스진에 함유된 야생형 ABCA4 CDS는 아미노산 서열을 변경하지 않으며 다른 코돈으로 치환될 수 없는 다중 인-프레임 AUG 코돈을 지니고 있다. 이것은 안정된 전사체로부터 번역이 일어날 가능성을 만들어, 웨스턴 블롯에 의해 검출 가능한 트렁케이션된 ABCA4 펩티드의 존재를 유도한다(도 4a). 선택된 중첩 영역의 시작 서열은 번역 기계가 아웃-오브-프레임 부위로부터 개시되도록 장려하기 위해 보다 약한 환경의 인-프레임 AUG 코돈 이전에 양호한 환경(잠재적인 Kozak 컨센서스에 관해)의 아웃-오브-프레임 AUG 코돈을 포함하도록 신중하게 선택되었다(도 5a). 인-프레임 AUG 이전에 다양한 환경의 총 4개의 아웃-오브-프레임 AUG 코돈이 존재한다. 이들 모두는 10개 아미노산 내에서 정지 코돈으로 번역될 것이다. 이러한 아웃-오브-프레임 AUG 코돈의 존재는 재조합되지 않은 하류 트랜스진으로부터 트렁케이션된 ABCA4 단백질의 번역을 방지할 것이다.

실시예 3 - 중첩 영역의 평가

최적의 중첩 영역은 6개의 중첩 변이체의 시험관내 및 생체내 평가 후에 결정되었다(각각, 도 3a & 3b). 이들은 A, B, C, D, E 및 F라고 지칭되며, 하기 중첩 영역을 나타낸다(X는 중첩 없음을 나타낸다): A. 1,173개 뉴클레오티드(3259-4430); B. 506개 뉴클레오티드(3300-3805); C. 208개 뉴클레오티드(3598-3805); D. 99개 뉴클레오티드(3707-3805); E. 49개 뉴클레오티드(3757-3805) 및; F. 24개 뉴클레오티드(3782-3805). 중첩 영역 B 내지 X에 대한 하류 트랜스진은 모두 동일한 상류 트랜스진과 쌍을 이룬다. 중첩 변이체 B 및 C는 모든 다른 변이체보다 양호하고 유사한 정도로 수행되었지만 이중 벡터 형태 C가 다양한 이유로 선택되었다. 첫 번째는 이것이 재조합되지 않은 하류 트랜스진으로부터 트렁케이션된 ABCA4를 제한적으로 생산하기 때문이다(도 4a). C, D, E, F 및 X 변이체로부터의 재조합되지 않은 하류 트랜스진은 A 또는 B 형태보다 현저하게 감소된 수준의 트렁케이션된 ABCA4 단백질을 생성한다. 이중 벡터 환경에서, 중첩 C는 전장 ABCA4와 비교하여 최저 비율의 트렁케이션된 ABCA4를 생성한다(도 4b 및 4c). 이것은 중첩 C 트랜스진 설계가 재조합되지 않은 트랜스진으로부터 원하지 않는 발현을 제한할 뿐 아니라 중첩 B보다 더 큰 효율로 재조합되는 것을 시사한다. 이에 대한 추가 증거는 중첩 C 및 B 주입된 Abca4 ^-/- 망막 사이의 전사체 배수 변화 및 단백질 배수 변화 차이를 비교함에 의해 발생한다. ABCA4 CDS의 상류 부분을 표적화하는 프라이머(이에 따라 재조합된 트랜스진으로부터의 전장 ABCA4 전사체에 더하여 재조합되지 않은 상류 트랜스진으로부터의 전사체를 검출함)는 중첩 B 및 C 이중 벡터 주입된 망막 둘 모두에 존재하는 매우 높은 수준의 전사체를 검출하였다. 그러나, 중첩 C는 중첩 B의 전사체 수준의 절반보다 낮은 수준을 생성하였지만, 1.5배 수준의 ABCA4 단백질을 생산하였다(도 4d). 둘 모두가 동일한 상류 벡터를 공유하고 이들의 하류 트랜스진 서열만이 상이하다는 것을 감안할 때, 이것은 중첩 C에 대해 선택된 중첩 영역이 중첩 B보다 큰 효율로 재조합된다는 것을 시사한다.

선택된 중첩 영역은 52%의 GC 함량 및 -19.60 kcal/mol의 자유 에너지 예측을 갖는데, 이는 -55.60 kcal/mol(53% GC 함량)의 중첩 영역 B의 거의 3배 미만이다, 도 5b. 이러한 자유 에너지의 감소는 재조합되지 않은 중첩 C에 의해 형성된 이차 구조가 중첩 B보다 분석하기가 더 쉬울 것임을 시사하고, 본 발명자들은 이것이 상대 트랜스진 상의 중첩 영역과의 상호작용에 더욱 이용 가능할 것이라는 예측을 남긴다.

실시예 4 - 실험 프로토콜

도 2

Abca4 ^-/- 마우스는 눈 당 1E+9 유전체 복사체의 각 벡터를 전달하는, 이중 벡터 믹스(1:1)의 2μl 망막하 주입을 투여받았다. 눈의 적출은 아이컵으로부터 절개된 신경 망막을 주입한지 6주 후에 수행되었고 이를 RIPA 완충액에 용해시켰다. 조직을 균질화시키고, 상등액을 원심분리 후에 추출하였다. 상등액을 변성 로딩 완충액과 혼합하고, 변성 조건 하에 7.5% TGX 겔 상에서 진행시켰다. 단백질을 PVDF 막으로 옮기고, ABCA4를 토끼 폴리클로날 항-ABCA4(Abcam)로 검출하고 Gapdh를 마우스 모노클로날 항-GAPDH(Origene)로 검출하였다. LICOR 영상화 시스템을 사용하여 밴드를 시각화하고 분석하였다. ABCA4 수준은 각 샘플에 대해 Gapdh로 표준화된 다음 주입되지 않은 Abca4 ^-/- 눈에 비해 표시되었다.

도 3a

HEK293T 세포를 사용하여 웰 당 2E5 세포로 6웰 배양 플레이트에 시딩하였다. 24시간 후, 한 웰의 세포를 들어 올려 계수하였다. 이 계수를 사용하여 벡터 당 10,000의 감염 다중도(MOI)을 제공하기 위해 각 웰에 제공되는 벡터의 적절한 양을 결정하였다. 배양 배지를 제거하고, AAV를 우태아 혈청(FBS)을 함유하지 않는 1ml의 배지에서 첨가하였다. 세포를 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후 20% FBS를 함유하는 1ml의 배지를 첨가하였다. 형질도입 48시간 후 배지를 제거하고 10% FBS를 함유하는 신선한 배지를 적용하였다. 세포를 48시간 더 인큐베이션한 후 다른 배지 교환이 일어났다. 24시간 후, 세포를 수확하고, 완만한 원심분리 주기를 사용하여 찬 PBS에서 3회 세척하였다. 최종 PBS 세척액을 제거하고, 세포 펠렛을 동결시켰다. 세포 펠렛을 얼음 위에서 녹인 후 RIPA 완충액에 용해시켰다. 웨스턴 블롯 분석을 위해 상기 기술된 망막 샘플에 따라 용해물을 처리하였다.

도 3b

도 2와 같음.

도 4a

HEK293T 세포를 사용하여 웰 당 1E6 세포로 6웰 배양 플레이트에 시딩하였다. 24시간 후, 트랜스펙션 시약 LT1(GeneFlow)에 복합체화된 1μg의 플라스미드를 함유하는 트랜스펙션 믹스를 세포에 적용하였다. 시험 플라스미드는 AAV 벡터의 생성에 사용되는 하류 트랜스진을 보유하였다. 트랜스펙션 48시간 후, 세포를 세척하고, 수확하고, 상기 기재된 대로 웨스턴 블롯으로 평가하였다.

도 4b

도 2와 같음.

도 4d

ABCA4 단백질 수준을 도 2에 개시된 대로 웨스턴 블롯 분석으로부터 얻었고, 중첩 변이체 C 및 B 이중 벡터 처리 사이의 배수 변화를 비교하였다. 전사체 수준 비교를 위해, 조직 샘플을 RNAlater(Ambion)에 수집하고, mRNA를 Dynabeads-oligodT mRNA DIRECT(Life Technologies)를 사용하여 추출하였다. cDNA 합성을 oligodT 프라이머 및 SuperScript III(Life Technologies)를 사용하여 500ng mRNA로 수행하였다. 샘플을 PCR 정제 스핀 컬럼(QIAGEN)을 사용하여 세척하고, 50μl DEPC-처리 수에서 용리시켰다. ABCA4 CDS의 상류 부분을 표적화하는 qPCR에 의해 cDNA를 평가하였다. ABCA4의 수준은 액틴 수준으로 표준화되었고, 주입되지 않은 Abca4 ^-/- 샘플에 비해 표시되었다. 이후 중첩 변이체 C 및 B 이중 벡터 처리 사이의 ABCA4 전사체 수준에서의 배수 변화를 비교하였다.

실시예 5 - 중첩 이중 벡터 전략을 사용한 ABCA4의 Abca4 ^-/- 마우스의 광수용체로의 AAV-매개 전달

본 실시예에 제시된 데이터는 본 발명의 중첩 이중 벡터 시스템의 망막하 주입 후 Abca4 ^-/- 마우스 모델의 광수용체 바깥 부분에 특이적으로 국소화되는 ABCA4 단백질의 발현을 입증한다.

트랜스진 설계 및 생산:

중첩 ABCA4 트랜스진을 AAV8 Y733F 캡시드에 패키징하였다. 상류 트랜스진은 AAV2 역방위 말단 반복(ITR) 사이에 인간 로돕신 키나제(GRK1) 프로모터 및 ABCA4 코딩 서열(CDS)의 상류 부분을 함유하였다. 하류 트랜스진은 ABCA4 CDS의 하류 부분, 우드척 간염 바이러스 전사 후 조절 요소(WPRE) 및 폴리A 신호(pA)를 함유하였다. 상류 및 하류 트랜스진 둘 모두는 ABCA4 CDS 중첩 영역을 보유하였다.

주입:

Abca4 ^-/- 마우스는 상류 및 하류 벡터의 1:1 믹스를 함유하는 2μl의 망막하 주입을 4-5주령에 투여받았다(1x10¹³ gc/ml). 면역조직화학(IHC) 평가를 위해 주입한지 6주 후에 눈을 수확하였다.

면역조직화학 염색:

수정체가 제거된 전체 아이컵을 4% 파라포름알데하이드(PFA)에 20분 동안 고정시킨 다음 30% 수크로스에서 밤새 4℃로 인큐베이션하였다. 눈을 봉입제에서 동결시킨 후 섹션화하였다. 조직 슬라이스를 실온에서 밤새 건조시킨 다음 포스페이트 완충된 염수(PBS)로 5분 동안 3회 세정하였다. 샘플을 0.2% Triton-X-100으로 20분 동안 침투시킨 다음 PBS로 3회 세척한 후 10% 당나귀 혈청(DS), 1% 소 혈청 알부민(BSA), 0.1% Triton-X-100과 함께 1시간 동안 인큐베이션하였다. 항체를 1% DS, 0.1% BSA에서 1/200으로 희석하고, 섹션에 적용하고, 실온에서 2시간 동안 정치시켰다. Abca4/ABCA4 검출은 염소 항-ABCA4(AntibodiesOnline)로 달성되었고, 과분극 활성화된 사이클릭 뉴클레오티드 게이팅된 포타슘 채널 1(Hcn1) 검출은 마우스 항-Hcn1(Abcam)으로 달성되었고, 로돕신 검출은 마우스 항-1D4(Abcam)로 달성되었다. 섹션을 0.05% Tween-20으로 3회 세정한 다음 이차 항체를 암실 조건 하에 1시간 동안 적용하였다(1/400으로 희석). 섹션을 0.05% Tween-20으로 2회 세정한 다음 Hoechst 스테인(1/1,000)과 15분 동안 인큐베이션하였다. 섹션을 PBS로 세정한 다음 공기 건조되게 하였다(leg to air dry). 다이아몬드 퇴색-방지(anti-fade) 봉입제를 각 섹션에 적용하고, 슬라이드를 영상화 전에 밤새 정치시켰다.

결과:

광수용체 세포 바깥 부분에 국소화된 ABCA4 발현

도 7은 야생형(WT) 및 Abca4 ^-/- 눈에서 Abca4/ABCA4(녹색) 및 Hcn1(적색) 염색을 도시한다. WT SVEV 129, 주입되지 않은 및 주입된 Abca4 ^-/- 눈을 광수용체 안쪽 부분 마커 Hcn1 및 Abca4/ABCA4에 대해 염색하였다. WT 및 이중 벡터 처리된 Abca4 ^-/- 눈은 광수용체 세포 바깥 부분에서 Abca4/ABCA4의 특이적 국소화를 나타내었다.

로돕신과 ABCA4 공동-국소화.

도 8은 야생형(WT) 및 Abca4 ^-/- 눈의 광수용체 세포 바깥 부분에서 Abca4/ABCA4(녹색) 및 로돕신(적색) 염색을 도시한다. WT 및 이중 벡터 처리된 Abca4 ^-/- 눈은 광수용체 세포 바깥 부분에서 로돕신 및 Abca4/ABCA4의 공동국소화를 나타내었다.

도 9는 야생형(WT) 및 Abca4 ^-/- 눈에서 Abca4/ABCA4(녹색) 및 로돕신(적색) 정점 RPE 염색을 도시한다. WT 및 이중 벡터 처리된 Abca4 ^-/- 눈은 버려진 바깥 부분 디스크에서 유래한다고 가정되는, RPE 세포의 정점 영역에서 로돕신 및 Abca4/ABCA4의 공동-국소화를 나타내었다. 이중 벡터로 처리되지 않은 Abca4 ^-/- 눈은 RPE 세포의 정점 영역에서 로돕신 염색만을 보여주었다. 박스 안의 이미지 A는 형질도입된 RPE 세포로부터 달성된 발현 패턴을 보여주며, 이는 Abca4/ABCA4/rho 염색과 달리 분산된 염색 패턴을 나타낸다. 이미지 B는 GRK1 프로모터로부터 RPE 발현이 없음을 확인시켜 준다.

결론:

최적화된 중첩 이중 벡터 시스템을 사용하여, IHC에 의해 검출 가능한 수준으로 요망되는 바깥 부분 구조로 트래피킹되는 광수용체 세포의 ABCA4 발현을 일으킬 수 있다.

실시예 6 - 이중 벡터 처리된 Abca4 ^-/- 마우스에서 비스레티노이드/A2E 평가

Abca4 ^-/- 마우스 모델은 야생형 마우스와 비교하여 연령에 따라 비스레티노이스 및 A2E의 수준이 증가함을 나타낸다. 그러나, 인간과 달리 비스레티노이드의 증가는 임의의 중요한 망막 변성을 초래하는데 필요한 수준에 미치지 못한다. 이는 다른 보상 메커니즘이 Abca4 결핍 마우스 눈에 존재할 수 있음을 시사한다. 야생형 망막에서, Abca4는 재생을 위해 광수용체 세포 바깥 부분 디스크 막의 밖으로 망막의 이동을 촉진한다. Abca4 ^-/- 마우스 모델에서와 같이, 기능성 Abca4의 부재가 존재할 때, 망막은 다양한 비스레티노이드 형태로의 생화학적 변화를 겪는 바깥 부분 디스크 막에 유지된다(도 11). 광수용체 세포는 끊임없이 새로운 바깥 부분 디스크를 생성하고, 이렇게 함에 있어 오래된 더 원위 디스크는 RPE 세포 쪽으로 이동하며, 후속하여 이들은 포식작용에 의해 디스크를 분해한다. Abca4 결핍 마우스에서 포식작용된 디스크는 상승된 수준의 비스레티노이드를 함유한다. RPE 세포 내에서 이들은 A2E 아이소형으로 추가로 전환되고, 이의 축적은 리포푸신을 발생시킨다. 따라서, Abca4 결핍 마우스에서 비스레티노이드 축적은 망막 변성을 일으키기에 충분하지 않지만, 그럼에도 불구하고, 기준선 이상으로 상승된 결과적인 수준은 정량될 수 있으므로, Abca4 기능의 바이오마커를 제공할 수 있다.

비스레티노이드 및 A2E 화합물은 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해 정확하게 측정될 수 있다. ABCA4 유전자 요법으로 치료된 마우스의 치료 효능의 척도는 따라서 치료되지 않은 눈에 비해 비스레티노이드 및 A2E 수준의 감소를 달성하는 것일 것이다. 그러나, 해결해야 할 두 가지 고려 사항이 있다. 우선 먼저, 임상 적용을 위해 본 발명자들은 인간 ABCA4 코딩 서열 및 인간 광수용체 프로모터를 사용할 필요가 있고 이것은 마우스에서 효과가 있을 것 같지 않다. 또한 HPLC 측정은 망막하 주입에 의해 벡터에 노출된 영역만이 아니라 전체 눈에서 수행된다. 따라서 Abca4 결핍 마우스에서 비스레티노이드의 전반적인 감소는 야생형 수준에 도달하지 않을 것이다. 두 번째 고려 사항은 바깥 부분 디스크의 손상을 일으킬 수 있는 망막하 주입이다. 이러한 구조에는 비스레티노이드가 풍부하기 때문에, ABCA4 유전자 요법의 효과는 유사한 sham 주입과 비교될 필요가 있다. 이상적으로는 이를 위해 동일한 마우스의 반대쪽 눈을 사용하여 눈 크기 및 평생 광 노출을 조절해야 하는데, 이는 또한 비스레티노이드 축적에 영향을 줄 수 있다.

이러한 이유로 본 발명자들은 한쪽 눈에 sham 주입을 받고 반대쪽 눈에 유사한 치료 주입을 받은 Abca4 ^-/- 마우스의 코호트에서 비스레티노이드/A2E 수준을 비교하였다. 각각의 sham 눈은 쌍을 이룬 이중 벡터 치료 눈에서 수용한 것과 동일한 총 AAV 용량으로 상류 벡터를 투여받았다. 따라서, 각 마우스의 양쪽 눈은 2 μl의 망막하 주입을 받았고, AAV 벡터의 2 x 10¹⁰ 유전체 입자를 함유하는 수포를 형성하였다.

총 13마리의 Abca4 녹아웃 마우스에 4-5주령에 주입되었고, 주입한지 3개월 후에 눈을 수확하였다. 조직 수집 전에 마우스를 16시간 동안 어둠에 적응시켰는데, 이는 암실의 희미한 적색광 하에서 수행되었다. 이후 전체 눈을 익명으로 하고, 확립된 HPLC 검정을 사용한 비스레티노이드/A2E 평가를 위해 Jules Stein Eye Institute로 동결된 채로 발송하였다. 각각의 전체 눈을 절개 없이 채취 및 처리하였다. 모든 26개 눈의 HPLC 평가 후, 후속하여 정체를 공개하고, 각 처리된 눈에 대한 비스레티노이드/A2E 수준을 이들의 쌍을 이룬 sham 주입된 눈과 비교하였다. 이원 ANOVA는 쌍을 이룬 sham 주입된 눈과 비교하여 이중 벡터 처리된 눈에서의 감소를 관찰함에 의해 이 처리가 비스레티노이드/A2E의 수준에 유의한 효과를 갖는지를 결정하였다(p=0.0171), 도 12.

상기 명세서에 언급된 모든 간행물은 참조로서 본원에 포함된다. 본 발명의 기재된 생성물, 시스템, 용도, 공정 및 방법의 다양한 변형 및 변화는 본 발명의 범위 및 사상으로부터 벗어남이 없이 당업자에게 명백할 것이다. 본 발명은 특정한 바람직한 구체예와 관련하여 기재되었으나, 청구된 바와 같은 본 발명은 그러한 특정 구체예로 부당하게 제한되지 않아야 함이 이해되어야 한다. 실제로, 생화학 및 생물공학 또는 관련 분야의 당업자에게 명백한 본 발명을 수행하기 위한 기재된 방식의 다양한 변형은 하기 청구항의 범위 내인 것으로 의도된다.

SEQUENCE LISTING <110> Oxford University Innovation Limited <120> ADENO-ASSOCIATED VIRAL VECTOR SYSTEM <130> P107080PCT <150> GB 1610448.1 <151> 2016-06-15 <150> GB 1707261.2 <151> 2017-05-05 <160> 11 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 7326 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 aggacacagc gtccggagcc agaggcgctc ttaacggcgt ttatgtcctt tgctgtctga 60 ggggcctcag ctctgaccaa tctggtcttc gtgtggtcat tagcatgggc ttcgtgagac 120 agatacagct tttgctctgg aagaactgga ccctgcggaa aaggcaaaag attcgctttg 180 tggtggaact cgtgtggcct ttatctttat ttctggtctt gatctggtta aggaatgcca 240 acccgctcta cagccatcat gaatgccatt tccccaacaa ggcgatgccc tcagcaggaa 300 tgctgccgtg gctccagggg atcttctgca atgtgaacaa tccctgtttt caaagcccca 360 ccccaggaga atctcctgga attgtgtcaa actataacaa ctccatcttg gcaagggtat 420 atcgagattt tcaagaactc ctcatgaatg caccagagag ccagcacctt ggccgtattt 480 ggacagagct acacatcttg tcccaattca tggacaccct ccggactcac ccggagagaa 540 ttgcaggaag aggaatacga ataagggata tcttgaaaga tgaagaaaca ctgacactat 600 ttctcattaa 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gacaggggct cggctgttgg 3900 gcactgacaa ttccgtggtg ttgtcgggga aatcatcgtc ctttccttgg ctgctcgcct 3960 gtgttgccac ctggattctg cgcgggacgt ccttctgcta cgtcccttcg gccctcaatc 4020 cagcggacct tccttcccgc ggcctgctgc cggctctgcg gcctcttccg cgtcttcgcc 4080 ttcgccctca gacgagtcgg atctcccttt gggccgcctc cccgcatgcc gctgatcagc 4140 ctcgactgtg ccttctagtt gccagccatc tgttgtttgc ccctcccccg tgccttcctt 4200 gaccctggaa ggtgccactc ccactgtcct ttcctaataa aatgaggaaa ttgcatcgca 4260 ttgtctgagt aggtgtcatt ctattctggg gggtggggtg gggcaggaca gcaaggggga 4320 ggattgggaa gacaatagca ggcatgctgg ggatgcggtg ggctctatgg cttctgaggc 4380 ggaaagaacc agctggggat ttaaattagg gataacaggg taatggcgcg ggccgcagga 4440 acccctagtg atggagttgg ccactccctc tctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc 4500 ccgggcaaag cccgggcgtc gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc 4560 gcgcagagag ggagtggcca a 4581 <210> 5 <211> 199 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 gggccccaga agcctggtgg ttgtttgtcc ttctcagggg aaaagtgagg cggccccttg 60 gaggaagggg ccgggcagaa tgatctaatc ggattccaag cagctcaggg gattgtcttt 120 ttctagcacc ttcttgccac tcctaagcgt cctccgtgac cccggctggg atttagcctg 180 gtgctgtgtc agccccggg 199 <210> 6 <211> 186 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> untranslated region (UTR) sequence <400> 6 gtgccgcagg gggacggctg ccttcggggg ggacggggca gggcggggtt cggcttctgg 60 cgtgtgaccg gcggctctag agcctctgct aaccatgttc atgccttctt ctttttccta 120 cagctcctgg gcaacgtgct ggttattgtg ctgtctcatc attttggcaa agaattacca 180 ccatgg 186 <210> 7 <211> 593 <212> DNA <213> Woodchuck hepatitis virus <400> 7 atcgataatc aacctctgga ttacaaaatt tgtgaaagat tgactggtat tcttaactat 60 gttgctcctt ttacgctatg tggatacgct gctttaatgc ctttgtatca tgctattgct 120 tcccgtatgg ctttcatttt ctcctccttg tataaatcct ggttgctgtc tctttatgag 180 gagttgtggc ccgttgtcag gcaacgtggc gtggtgtgca ctgtgtttgc tgacgcaacc 240 cccactggtt ggggcattgc caccacctgt cagctccttt ccgggacttt cgctttcccc 300 ctccctattg ccacggcgga actcatcgcc gcctgccttg cccgctgctg gacaggggct 360 cggctgttgg gcactgacaa ttccgtggtg ttgtcgggga aatcatcgtc ctttccttgg 420 ctgctcgcct gtgttgccac ctggattctg cgcgggacgt ccttctgcta cgtcccttcg 480 gccctcaatc cagcggacct tccttcccgc ggcctgctgc cggctctgcg gcctcttccg 540 cgtcttcgcc ttcgccctca gacgagtcgg atctcccttt gggccgcctc ccc 593 <210> 8 <211> 269 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> bovine Growth Hormone poly-adenylation sequence <400> 8 cgctgatcag cctcgactgt gccttctagt tgccagccat ctgttgtttg cccctccccc 60 gtgccttcct tgaccctgga aggtgccact cccactgtcc tttcctaata aaatgaggaa 120 attgcatcgc attgtctgag taggtgtcat tctattctgg ggggtggggt ggggcaggac 180 agcaaggggg aggattggga agacaatagc aggcatgctg gggatgcggt gggctctatg 240 gcttctgagg cggaaagaac cagctgggg 269 <210> 9 <211> 4087 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> example partial upstream vector sequence, comprising promoter, CDS <400> 9 ggtaccgggc cccagaagcc tggtggttgt ttgtccttct caggggaaaa gtgaggcggc 60 cccttggagg aaggggccgg gcagaatgat ctaatcggat tccaagcagc tcaggggatt 120 gtctttttct agcaccttct tgccactcct aagcgtcctc cgtgaccccg gctgggattt 180 agcctggtgc tgtgtcagcc ccgggtgccg cagggggacg gctgccttcg ggggggacgg 240 ggcagggcgg ggttcggctt ctggcgtgtg accggcggct ctagagcctc tgctaaccat 300 gttcatgcct tcttcttttt cctacagctc ctgggcaacg tgctggttat tgtgctgtct 360 catcattttg gcaaagaatt accaccatgg gcttcgtgag acagatacag cttttgctct 420 ggaagaactg gaccctgcgg aaaaggcaaa agattcgctt tgtggtggaa ctcgtgtggc 480 ctttatcttt atttctggtc ttgatctggt taaggaatgc caacccgctc tacagccatc 540 atgaatgcca tttccccaac aaggcgatgc cctcagcagg aatgctgccg tggctccagg 600 ggatcttctg caatgtgaac aatccctgtt ttcaaagccc caccccagga gaatctcctg 660 gaattgtgtc aaactataac aactccatct tggcaagggt atatcgagat tttcaagaac 720 tcctcatgaa tgcaccagag agccagcacc ttggccgtat ttggacagag ctacacatct 780 tgtcccaatt catggacacc ctccggactc acccggagag aattgcagga agaggaatac 840 gaataaggga tatcttgaaa gatgaagaaa cactgacact atttctcatt aaaaacatcg 900 gcctgtctga ctcagtggtc taccttctga tcaactctca agtccgtcca gagcagttcg 960 ctcatggagt cccggacctg gcgctgaagg acatcgcctg cagcgaggcc ctcctggagc 1020 gcttcatcat cttcagccag agacgcgggg caaagacggt gcgctatgcc ctgtgctccc 1080 tctcccaggg caccctacag tggatagaag acactctgta tgccaacgtg gacttcttca 1140 agctcttccg tgtgcttccc acactcctag acagccgttc tcaaggtatc aatctgagat 1200 cttggggagg aatattatct gatatgtcac caagaattca agagtttatc catcggccga 1260 gtatgcagga cttgctgtgg gtgaccaggc ccctcatgca gaatggtggt ccagagacct 1320 ttacaaagct gatgggcatc ctgtctgacc tcctgtgtgg ctaccccgag ggaggtggct 1380 ctcgggtgct ctccttcaac tggtatgaag acaataacta taaggccttt ctggggattg 1440 actccacaag gaaggatcct atctattctt atgacagaag aacaacatcc ttttgtaatg 1500 cattgatcca gagcctggag tcaaatcctt taaccaaaat cgcttggagg gcggcaaagc 1560 ctttgctgat gggaaaaatc ctgtacactc ctgattcacc tgcagcacga aggatactga 1620 agaatgccaa ctcaactttt gaagaactgg aacacgttag gaagttggtc aaagcctggg 1680 aagaagtagg gccccagatc tggtacttct ttgacaacag cacacagatg aacatgatca 1740 gagataccct ggggaaccca acagtaaaag actttttgaa taggcagctt ggtgaagaag 1800 gtattactgc tgaagccatc ctaaacttcc tctacaaggg ccctcgggaa agccaggctg 1860 acgacatggc caacttcgac tggagggaca tatttaacat cactgatcgc accctccgcc 1920 ttgtcaatca atacctggag tgcttggtcc tggataagtt tgaaagctac aatgatgaaa 1980 ctcagctcac ccaacgtgcc ctctctctac tggaggaaaa catgttctgg gccggagtgg 2040 tattccctga catgtatccc tggaccagct ctctaccacc ccacgtgaag tataagatcc 2100 gaatggacat agacgtggtg gagaaaacca ataagattaa agacaggtat tgggattctg 2160 gtcccagagc tgatcccgtg gaagatttcc ggtacatctg gggcgggttt gcctatctgc 2220 aggacatggt tgaacagggg atcacaagga gccaggtgca ggcggaggct ccagttggaa 2280 tctacctcca gcagatgccc tacccctgct tcgtggacga ttctttcatg atcatcctga 2340 accgctgttt ccctatcttc atggtgctgg catggatcta ctctgtctcc atgactgtga 2400 agagcatcgt cttggagaag gagttgcgac tgaaggagac cttgaaaaat cagggtgtct 2460 ccaatgcagt gatttggtgt acctggttcc tggacagctt ctccatcatg tcgatgagca 2520 tcttcctcct gacgatattc atcatgcatg gaagaatcct acattacagc gacccattca 2580 tcctcttcct gttcttgttg gctttctcca ctgccaccat catgctgtgc tttctgctca 2640 gcaccttctt ctccaaggcc agtctggcag cagcctgtag tggtgtcatc tatttcaccc 2700 tctacctgcc acacatcctg tgcttcgcct ggcaggaccg catgaccgct gagctgaaga 2760 aggctgtgag cttactgtct ccggtggcat ttggatttgg cactgagtac ctggttcgct 2820 ttgaagagca aggcctgggg ctgcagtgga gcaacatcgg gaacagtccc acggaagggg 2880 acgaattcag cttcctgctg tccatgcaga tgatgctcct tgatgctgct gtctatggct 2940 tactcgcttg gtaccttgat caggtgtttc caggagacta tggaacccca cttccttggt 3000 actttcttct acaagagtcg tattggcttg gcggtgaagg gtgttcaacc agagaagaaa 3060 gagccctgga aaagaccgag cccctaacag aggaaacgga ggatccagag cacccagaag 3120 gaatacacga ctccttcttt gaacgtgagc atccagggtg ggttcctggg gtatgcgtga 3180 agaatctggt aaagattttt gagccctgtg gccggccagc tgtggaccgt ctgaacatca 3240 ccttctacga gaaccagatc accgcattcc tgggccacaa tggagctggg aaaaccacca 3300 ccttgtccat cctgacgggt ctgttgccac caacctctgg gactgtgctc gttgggggaa 3360 gggacattga aaccagcctg gatgcagtcc ggcagagcct tggcatgtgt ccacagcaca 3420 acatcctgtt ccaccacctc acggtggctg agcacatgct gttctatgcc cagctgaaag 3480 gaaagtccca ggaggaggcc cagctggaga tggaagccat gttggaggac acaggcctcc 3540 accacaagcg gaatgaagag gctcaggacc tatcaggtgg catgcagaga aagctgtcgg 3600 ttgccattgc ctttgtggga gatgccaagg tggtgattct ggacgaaccc acctctgggg 3660 tggaccctta ctcgagacgc tcaatctggg atctgctcct gaagtatcgc tcaggcagaa 3720 ccatcatcat gtccactcac cacatggacg aggccgacct ccttggggac cgcattgcca 3780 tcattgccca gggaaggctc tactgctcag gcaccccact cttcctgaag aactgctttg 3840 gcacaggctt gtacttaacc ttggtgcgca agatgaaaaa catccagagc caaaggaaag 3900 gcagtgaggg gacctgcagc tgctcgtcta agggtttctc caccacgtgt ccagcccacg 3960 tcgatgacct aactccagaa caagtcctgg atggggatgt aaatgagctg atggatgtag 4020 ttctccacca tgttccagag gcaaagctgg tggagtgcat tggtcaagaa cttatcttcc 4080 ttcttcc 4087 <210> 10 <211> 4203 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> example partial downstream vector sequence, comprising CDS, post-transcriptional response element, poly-adenylation sequence <400> 10 acatccagag ccaaaggaaa ggcagtgagg ggacctgcag ctgctcgtct aagggtttct 60 ccaccacgtg tccagcccac gtcgatgacc taactccaga acaagtcctg gatggggatg 120 taaatgagct gatggatgta gttctccacc atgttccaga ggcaaagctg gtggagtgca 180 ttggtcaaga acttatcttc cttcttccaa ataagaactt caagcacaga gcatatgcca 240 gccttttcag agagctggag gagacgctgg ctgaccttgg tctcagcagt tttggaattt 300 ctgacactcc cctggaagag atttttctga aggtcacgga ggattctgat tcaggacctc 360 tgtttgcggg tggcgctcag cagaaaagag aaaacgtcaa cccccgacac ccctgcttgg 420 gtcccagaga gaaggctgga cagacacccc aggactccaa tgtctgctcc ccaggggcgc 480 cggctgctca cccagagggc cagcctcccc cagagccaga gtgcccaggc ccgcagctca 540 acacggggac acagctggtc ctccagcatg tgcaggcgct gctggtcaag agattccaac 600 acaccatccg cagccacaag gacttcctgg cgcagatcgt gctcccggct acctttgtgt 660 ttttggctct gatgctttct attgttatcc ctccttttgg cgaatacccc gctttgaccc 720 ttcacccctg gatatatggg cagcagtaca ccttcttcag catggatgaa ccaggcagtg 780 agcagttcac ggtacttgca gacgtcctcc tgaataagcc aggctttggc aaccgctgcc 840 tgaaggaagg gtggcttccg gagtacccct gtggcaactc aacaccctgg aagactcctt 900 ctgtgtcccc aaacatcacc cagctgttcc agaagcagaa atggacacag gtcaaccctt 960 caccatcctg caggtgcagc accagggaga agctcaccat gctgccagag tgccccgagg 1020 gtgccggggg cctcccgccc ccccagagaa cacagcgcag cacggaaatt ctacaagacc 1080 tgacggacag gaacatctcc gacttcttgg taaaaacgta tcctgctctt ataagaagca 1140 gcttaaagag caaattctgg gtcaatgaac agaggtatgg aggaatttcc attggaggaa 1200 agctcccagt cgtccccatc acgggggaag cacttgttgg gtttttaagc gaccttggcc 1260 ggatcatgaa tgtgagcggg ggccctatca ctagagaggc ctctaaagaa atacctgatt 1320 tccttaaaca tctagaaact gaagacaaca ttaaggtgtg gtttaataac aaaggctggc 1380 atgccctggt cagctttctc aatgtggccc acaacgccat cttacgggcc agcctgccta 1440 aggacaggag ccccgaggag tatggaatca ccgtcattag ccaacccctg aacctgacca 1500 aggagcagct ctcagagatt acagtgctga ccacttcagt ggatgctgtg gttgccatct 1560 gcgtgatttt ctccatgtcc ttcgtcccag ccagctttgt cctttatttg atccaggagc 1620 gggtgaacaa atccaagcac ctccagttta tcagtggagt gagccccacc acctactggg 1680 taaccaactt cctctgggac atcatgaatt attccgtgag tgctgggctg gtggtgggca 1740 tcttcatcgg gtttcagaag aaagcctaca cttctccaga aaaccttcct gcccttgtgg 1800 cactgctcct gctgtatgga tgggcggtca ttcccatgat gtacccagca tccttcctgt 1860 ttgatgtccc cagcacagcc tatgtggctt tatcttgtgc taatctgttc atcggcatca 1920 acagcagtgc tattaccttc atcttggaat tatttgagaa taaccggacg ctgctcaggt 1980 tcaacgccgt gctgaggaag ctgctcattg tcttccccca cttctgcctg ggccggggcc 2040 tcattgacct tgcactgagc caggctgtga cagatgtcta tgcccggttt ggtgaggagc 2100 actctgcaaa tccgttccac tgggacctga ttgggaagaa cctgtttgcc atggtggtgg 2160 aaggggtggt gtacttcctc ctgaccctgc tggtccagcg ccacttcttc ctctcccaat 2220 ggattgccga gcccactaag gagcccattg ttgatgaaga tgatgatgtg gctgaagaaa 2280 gacaaagaat tattactggt ggaaataaaa ctgacatctt aaggctacat gaactaacca 2340 agatttatcc aggcacctcc agcccagcag tggacaggct gtgtgtcgga gttcgccctg 2400 gagagtgctt tggcctcctg ggagtgaatg gtgccggcaa aacaaccaca ttcaagatgc 2460 tcactgggga caccacagtg acctcagggg atgccaccgt agcaggcaag agtattttaa 2520 ccaatatttc tgaagtccat caaaatatgg gctactgtcc tcagtttgat gcaatcgatg 2580 agctgctcac aggacgagaa catctttacc tttatgcccg gcttcgaggt gtaccagcag 2640 aagaaatcga aaaggttgca aactggagta ttaagagcct gggcctgact gtctacgccg 2700 actgcctggc tggcacgtac agtgggggca acaagcggaa actctccaca gccatcgcac 2760 tcattggctg cccaccgctg gtgctgctgg atgagcccac cacagggatg gacccccagg 2820 cacgccgcat gctgtggaac gtcatcgtga gcatcatcag agaagggagg gctgtggtcc 2880 tcacatccca cagcatggaa gaatgtgagg cactgtgtac ccggctggcc atcatggtaa 2940 agggcgcctt tcgatgtatg ggcaccattc agcatctcaa gtccaaattt ggagatggct 3000 atatcgtcac aatgaagatc aaatccccga aggacgacct gcttcctgac ctgaaccctg 3060 tggagcagtt cttccagggg aacttcccag gcagtgtgca gagggagagg cactacaaca 3120 tgctccagtt ccaggtctcc tcctcctccc tggcgaggat cttccagctc ctcctctccc 3180 acaaggacag cctgctcatc gaggagtact cagtcacaca gaccacactg gaccaggtgt 3240 ttgtaaattt tgctaaacag cagactgaaa gtcatgacct ccctctgcac cctcgagctg 3300 ctggagccag tcgacaagcc caggactgaa agcttatcga taatcaacct ctggattaca 3360 aaatttgtga aagattgact ggtattctta actatgttgc tccttttacg ctatgtggat 3420 acgctgcttt aatgcctttg tatcatgcta ttgcttcccg tatggctttc attttctcct 3480 ccttgtataa atcctggttg ctgtctcttt atgaggagtt gtggcccgtt gtcaggcaac 3540 gtggcgtggt gtgcactgtg tttgctgacg caacccccac tggttggggc attgccacca 3600 cctgtcagct cctttccggg actttcgctt tccccctccc tattgccacg gcggaactca 3660 tcgccgcctg ccttgcccgc tgctggacag gggctcggct gttgggcact gacaattccg 3720 tggtgttgtc ggggaaatca tcgtcctttc cttggctgct cgcctgtgtt gccacctgga 3780 ttctgcgcgg gacgtccttc tgctacgtcc cttcggccct caatccagcg gaccttcctt 3840 cccgcggcct gctgccggct ctgcggcctc ttccgcgtct tcgccttcgc cctcagacga 3900 gtcggatctc cctttgggcc gcctccccgc atgccgctga tcagcctcga ctgtgccttc 3960 tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct tccttgaccc tggaaggtgc 4020 cactcccact gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca tcgcattgtc tgagtaggtg 4080 tcattctatt ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag ggggaggatt gggaagacaa 4140 tagcaggcat gctggggatg cggtgggctc tatggcttct gaggcggaaa gaaccagctg 4200 ggg 4203 <210> 11 <211> 208 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> overlap C sequence with out-of-frame AUG codons prior to an in-frame AUG codon <400> 11 acauccagag ccaaaggaaa ggcagugagg ggaccugcag cugcucgucu aaggguuucu 60 ccaccacgug uccagcccac gucgaugacc uaacuccaga acaaguccug gauggggaug 120 uaaaugagcu gauggaugua guucuccacc auguuccaga ggcaaagcug guggagugca 180 uuggucaaga acuuaucuuc cuucuucc 208

Claims (24)

1. 표적 세포에서 인간 ABCA4 단백질을 발현시키기 위한 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터 시스템으로서, 상기 AAV 벡터 시스템이 제1 핵산 서열을 포함하는 제1 AAV 벡터 및 제2 핵산 서열을 포함하는 제2 AAV 벡터를 포함하고;
   이 때 제1 핵산 서열이 ABCA4 코딩 서열(CDS)의 5' 말단 부분을 포함하고 제2 핵산 서열이 ABCA4 CDS의 3' 말단 부분을 포함하고, 5' 말단 부분 및 3' 말단 부분이 함께 전체 ABCA4 CDS를 포함하고;
   제1 핵산 서열이 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 105 내지 3597에 상응하는 연속 뉴클레오티드의 서열을 포함하고;
   제2 핵산 서열이 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 3806 내지 6926에 상응하는 연속 뉴클레오티드의 서열을 포함하고;
   제1 핵산 서열 및 제2 핵산 서열이 각각 다른 서열과 중첩되는 서열의 영역을 포함하고;
   서열 중첩 영역이 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 3598 내지 3805에 상응하는 핵산 서열의 적어도 약 20개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는, AAV 벡터 시스템.
2. 제1항에 있어서, 서열 중첩 영역이 20 내지 550개 뉴클레오티드의 길이; 바람직하게는 50 내지 250개 뉴클레오티드의 길이; 바람직하게는 175 내지 225개 뉴클레오티드의 길이; 바람직하게는 195 내지 215개 뉴클레오티드의 길이인 AAV 벡터 시스템.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 서열 중첩 영역이 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 3598 내지 3805에 상응하는 핵산 서열의 적어도 약 50개의 연속 뉴클레오티드; 바람직하게는 적어도 약 75개의 연속 뉴클레오티드; 바람직하게는 적어도 약 100개의 연속 뉴클레오티드; 바람직하게는 적어도 약 150개의 연속 뉴클레오티드; 바람직하게는 적어도 약 200개의 연속 뉴클레오티드; 바람직하게는 모든 208개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 AAV 벡터 시스템.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 핵산 서열이 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 105 내지 3805에 상응하는 연속 뉴클레오티드의 서열을 포함하고;
   제2 핵산 서열이 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 3598 내지 6926에 상응하는 연속 뉴클레오티드의 서열을 포함하는 AAV 벡터 시스템.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 핵산 서열이 ABCA4 코딩 서열(CDS)의 5' 말단 부분에 작동 가능하게 결합된 GRK1 프로모터를 포함하는 AAV 벡터 시스템.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 핵산 서열이 ABCA4 코딩 서열(CDS)의 5' 말단 부분의 상류에 위치한 비번역 영역(UTR)을 포함하는 AAV 벡터 시스템.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 핵산 서열이 전사 후 반응 요소(PRE); 바람직하게는 우드척(Woodchuck) 간염 바이러스 전사 후 반응 요소(WPRE)를 포함하는 AAV 벡터 시스템.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 핵산 서열이 소 성장 호르몬(bGH) 폴리-아데닐화 서열을 포함하는 AAV 벡터 시스템.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 AAV 벡터가 SEQ ID NO: 9의 핵산 서열을 포함하고; 제2 AAV 벡터가 SEQ ID NO: 10의 핵산 서열을 포함하는 AAV 벡터 시스템.
10. 표적 세포에서 인간 ABCA4 단백질을 발현시키는 방법으로서, 상기 방법이 표적 세포를 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 제1 AAV 벡터 및 제2 AAV 벡터로 형질도입시켜, 기능성 ABCA4 단백질이 표적 세포에서 발현되도록 하는 단계를 포함하는, 방법.
11. ABCA4 CDS의 5' 말단 부분을 포함하는 핵산 서열을 포함하는 AAV 벡터로서, ABCA4 CDS의 5' 말단 부분이 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 105 내지 3805에 상응하는 연속 뉴클레오티드의 서열로 구성되는, AAV 벡터.
12. 제11항에 있어서, AAV 벡터가 SEQ ID NO: 9의 핵산 서열을 포함하는 AAV 벡터.
13. ABCA4 CDS의 3' 말단 부분을 포함하는 핵산 서열을 포함하는 AAV 벡터로서, ABCA4 CDS의 3' 말단 부분이 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 3598 내지 6926에 상응하는 연속 뉴클레오티드의 서열로 구성되는, AAV 벡터.
14. 제13항에 있어서, AAV 벡터가 SEQ ID NO: 10의 핵산 서열을 포함하는 AAV 벡터.
15. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 제1 핵산 서열을 포함하는 핵산.
16. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 제2 핵산 서열을 포함하는 핵산.
17. SEQ ID NO: 9의 핵산 서열을 포함하는 핵산.
18. SEQ ID NO: 10의 핵산 서열을 포함하는 핵산.
19. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 제1 AAV 벡터 및 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 제2 AAV 벡터를 포함하는 키트.
20. 제15항의 핵산 및 제16항의 핵산, 또는 제17항의 핵산 및 제18항의 핵산을 포함하는 키트.
21. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 AAV 벡터 시스템 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학적 조성물.
22. 유전자 요법에 사용하기 위한 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 AAV 벡터 시스템, 제19항 또는 제20항에 따른 키트, 또는 제21항에 따른 약학적 조성물.
23. 망막 세포의 분해를 특징으로 하는 질병을 예방 또는 치료하는데 사용하기 위한; 바람직하게는 스타가르트병(Stargardt disease)을 예방 또는 치료하는데 사용하기 위한 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 AAV 벡터 시스템, 제19항 또는 제20항에 따른 키트, 또는 제21항에 따른 약학적 조성물.
24. 유효량의 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 AAV 벡터 시스템, 제19항 또는 제20항에 따른 키트, 또는 제21항에 따른 약학적 조성물을 망막 세포의 분해를 특징으로 하는 질병, 바람직하게는 스타가르트병을 예방 또는 치료할 필요가 있는 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 망막 세포의 분해를 특징으로 하는 질병, 바람직하게는 스타가르트병을 예방 또는 치료하는 방법.

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