JP2023520488A - Ｕｓｈ１ｂの処置のための安全性が改善されたデュアルａａｖ－ｍｙｏ７ａベクター - Google Patents

Ｕｓｈ１ｂの処置のための安全性が改善されたデュアルａａｖ－ｍｙｏ７ａベクター Download PDF

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Abstract

哺乳動物の眼の疾患、特に、アッシャー症候群１Ｂ（ＵＳＨ１Ｂ）と関連する網膜の合併症を処置するための組成物および方法が開示される。哺乳動物の内耳の疾患、特に、アッシャー症候群１Ｂ（ＵＳＨ１Ｂ）と関連する内耳細胞の合併症を処置するための組成物および方法がさらに開示される。本開示は、そのコード配列が、個々のＡＡＶベクターのポリヌクレオチドパッケージング容量のものを超える全長タンパク質の発現を容易にする改善されたＡＡＶベースのデュアルベクターシステムを提供する。末端切断型ＭＹＯ７Ａタンパク質の生成を排除するために、分割点を変更することによって（例えば、エクソン２３と２４の間からエクソン２１と２２の間へ）、ＭＹＯ７Ａテールドメインコード配列をフロントハーフベクターからバックハーフベクターへシフトする改変ハイブリッドデュアルベクターシステムが本明細書において記載される。非コード配列中の推定停止コドンおよび残存する配列が除去されている、改善されたコドン改変ハイブリッドおよびオーバーラップベクターシステムが、本明細書においてさらに記載される。

Description

関連出願
本出願は、その全開示内容が参照により組み込まれる２０２０年４月１日に出願された米国特許仮出願第６３／００３，７７４号の出願日の利益を主張する。
本発明は、失明と闘う財団（Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｆｉｇｈｔｉｎｇ Ｂｌｉｎｄｎｅｓｓ）から受領した助成金番号ＴＡ－ＧＴ－０４１９－０７７４－ＵＦＬ－ＧＨに基づく、およびＡｔｓｅｎａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、Ｉｎｃ．から受領した契約番号 ＡＧＲ０００１８２１１に基づく基金から全体的または部分的に行われた。
組換えＡＡＶは、網膜疾患を処置するための有用な遺伝子送達媒体として現れた。しかし、ＡＡＶの１つの制限として、その比較的に小さいＤＮＡパッケージング容量－４．７キロベース（ＫＢ）がある。したがって、標準ＡＡＶベクターシステムは、大きな遺伝子が突然変異されているか、そうでなければ機能障害性である疾患、例えば、アッシャー症候群に取り組むには不適である。ＡＡＶベクターシステム中に大きな遺伝子をパッケージングし、患者に遺伝子療法処置を安全に送達するために、解決法が必要である。
本開示は、概して、分子生物学およびウイルス学の分野、特に、遺伝子送達媒体の開発に関する。種々の遺伝子療法レジメンにおいて使用するための、改善されたｒＡＡＶデュアルベクターおよびポリヌクレオチドベクターシステムならびに選択された宿主細胞への、治療用タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイムコンストラクトをコードするものを含むさまざまな核酸セグメントの送達において有用な組成物が開示される。組換えウイルス粒子、単離された宿主細胞ならびにこれらのｒＡＡＶデュアルベクターおよびポリヌクレオチドベクターシステムのいずれかを含む医薬組成物がさらに開示される。特に、制限するものではないが、ヒトアッシャー症候群ＩＢ型の処置を含む、ミオシンＶＩＩ欠乏症の症状の処置および／または寛解のために、改善されたｒＡＡＶデュアルベクターシステムを調製し、さまざまなウイルスベースの遺伝子療法においてそれを使用する方法がまた、提供される。ＭＹＯ７Ａタンパク質をコードし、これまでに利用可能なベクターシステムよりも低減された細胞傷害性をもたらすｒＡＡＶデュアルベクターシステムの投与を含む、疾患または状態の処置または寛解の方法が、本明細書においてさらに提供される。一部の態様では、ベクターシステムを投与し、それによって、末端切断型ＭＹＯ７Ａタンパク質および／または関連する細胞傷害性の量が最小化される方法が提供される。一部の実施形態では、治療用ポリペプチドは、ミオシンポリペプチドではない。
種々の態様では、本明細書において提供される処置の方法および医薬組成物は、対象、例えば、ヒトまたは動物対象の片眼または両眼への投与のために意図される。さらなる種々の態様では、本明細書において提供される処置の方法および医薬組成物は、対象、例えば、ヒトまたは動物対象の片眼または両眼への投与のために意図される。
本開示は、疾患、例えば、アッシャー症候群の遺伝子療法のための材料および方法を提供する。Ｉ（例えば、ＵＳＨ１Ｂ）、ＩＩおよびＩＩＩ型を含むアッシャー症候群は、感覚機能障害、具体的には、視覚系、聴覚系および前庭系におけるものをもたらす状態である。アッシャー症候群に付随する感覚消失は、誕生時にさえ存在する場合があり、年齢とともに徐々に悪化する。
アッシャー症候群の最も一般的な形態であるＵＳＨ１Ｂは、ＭｙｏｓｉｎＶＩＩａ遺伝子における突然変異によって引き起こされる、重症の常染色体劣性の難聴－失明障害である。患者は、ヒトミオシンＶＩＩタンパク質（ＭＹＯ７Ａ）の不十分な発現および／またはタンパク質機能不全を引き起こす遺伝子の突然変異による生まれながらの難聴である。失明は、生後１０年以内に始まる進行性の網膜変性から生じる。ＭＹＯ７Ａタンパク質は、光受容体および網膜色素上皮（ＲＰＥ）で発現され、光受容体繊毛を介したオプシン輸送およびＲＰＥメラノソームの運動に関与している。研究によって、疾患の最初の部位である可能性があること、および光受容体外節の周囲にある接着帯構造における欠陥が、ＵＳＨ１Ｂ患者において見られる網膜変性を引き起こす可能性があることが示された（Sahly, et al., 2012）。しかし。ＭＹＯ７Ａタンパク質のコーディング領域は、６５３４または６６４８ヌクレオチド長（アイソフォームに応じて）であり、このために伝統的なＡＡＶベクターシステムがＵＳＨ１Ｂの遺伝子療法にとって不適となる。
現在、この状態のために利用可能な処置はないが、遺伝子療法は、視覚系、聴覚系および前庭系内の機能を回復／維持するために有望である。これまでに、Allocca et al. (2008)では、ＡＡＶ５血清型ベクターが最大８．９ＫＢのサイズのゲノムをパッケージング可能であったこと、およびこれらのベクターがインビボで送達されると全長タンパク質を発現したことを示唆する結果が公開された。Allocca et al. (2008)では、著者らは、ＣＭＶプロモーターが駆動するｈＭＹＯ７Ａを含有するＡＡＶ５ベクターから全長ＭＹＯ７Ａタンパク質を発現させた。その後の研究によって、これらの「オーバーサイズの」ＡＡＶ５ベクターが全長タンパク質発現を実際に駆動したが、各ベクターカプシドの遺伝子含量は、Allocca et al. (2008)によって元々報告された８．７ＫＢではなく、約５ＫＢのＤＮＡだけに制限されると見出されたと確認された（Lai et al., 2010; Dong et al., 2010; Wu et al., 2010）。これらのベクターカプシドは、末端切断型ベクターゲノム（例えば、遺伝子の５’末端、遺伝子の３’末端または内部配列が欠失している２つの混合物）の「不均一な混合物」を含有すると示された。さらに、これらのオーバーサイズの／不均一なベクターは、標準サイズのマッチするリポーターベクターと比較した場合に、不十分なパッケージング効率（例えば、低いベクター力価をもたらす）および低い形質導入効率を示した（＜５ＫＢ）（Wu et al., 2010）。
Lai et al. (2010)、Dong et al. (2010)およびWu et al. (2010)に記載されるような「不均一な」システムを使用すると、観察された不十分なパッケージング効率にもかかわらず、ＭＹＯ７Ａ導入遺伝子の部分を含有するベクターがパッケージングされ、ＵＳＨ１Ｂのｓｈａｋｅｒ－１マウスモデルにおいて概念実証結果が実証された。不均一なＡＡＶ－ｈＭＹＯ７Ａベクターを用いて達成された治療結果は、レンチウイルスベースのｈＭＹＯ７Ａベクターを使用する以前の遺伝子置き換え結果（Hashimoto et al., 2007）と同等であった。このレンチウイルス－ＭＹＯ７Ａベクターは、ＵＳＨ１Ｂの第Ｉ／ＩＩ相臨床試験のためにＳａｎｏｆｉ－Ａｖｅｎｔｉｓと共同してＯｘｆｏｒｄ ＢｉｏＭｅｄｉｃａによって開発下にあり、ＵｓｈＳｔａｔ（登録商標）ＬｅｎｔｉＶｅｃｔｏｒ（登録商標）の名称の下で販売されている。レンチウイルスは、有糸分裂後（例えば、非分裂）細胞に感染するのに十分に適していないベクタープラットフォームと見なされている。さらに、ベクターはＲＰＥの形質導入に適しているが、多数の研究が、成体光受容体の形質導入では有効ではないと示した。光受容体（ＰＲ）は、疾患の最初の部位である可能性があるので（Sahly, et al., 2012）、ＲＰＥ細胞のＵｓｈＳｔａｔ（登録商標）による排他的な標的化は、完全なまたは有効な療法を引き起こさない可能性があるが、これはヒト臨床試験において依然として見られる。
ＬＣＡ２／ＲＰＥ６５のＡＡＶ遺伝子療法治験における、優れた安全性プロファイルおよび有効性の有望な報告のために、ＵＳＨ１Ｂ患者を処置するためのＡＡＶベースのシステムの作出に継続する関心がある。本発明者らは、同様に本明細書において記載される、ＵＳＨ１Ｂ患者の処置において使用するためのＡＡＶデュアルベクタープラットフォームをこれまでに特性決定した。本発明者らによって設計された元のデュアルベクターシステム（例えば、「第１世代」デュアルベクターシステム）は、このシステムから生じたｍＲＮＡが、フロントおよびバックベクター対の正しい相同組換えによって予測されるものに対して１００％正確であることを成功裏に実証し、これによって、それらは遺伝子療法送達ベクターシステムとして有用となった。これらのベクターは、米国特許公開第２０１９／０１５３０５０号および同２０１４／０２５６８０２号に記載されており、それらの各々は、その全体で参照によって本明細書に組み込まれる。
本開示は、少なくとも幾分かは、以前のデュアルベクタープラットフォームのうちいくつかは、細胞内で末端切断型ＭＹＯ７Ａタンパク質の生成をもたらし、これは、ＭＹＯ７Ａタンパク質の末端切断型断片の生成と相関していたという観察結果に基づいている。具体的には、マウス網膜中への、以前の第１世代デュアルベクターハイブリッドシステムの注射後に、網膜の構造／機能の消失が観察され、これは、テールドメインの部分を含有する末端切断型ＭＹＯ７Ａタンパク質によって発揮される機能の獲得に起因していた可能性がある。ハイブリッドベクターシステムは、ポリヌクレオチドベクターシステムの２つのハーフが細胞中で組み合わさり、全長ポリヌクレオチドを作製することができる２つの経路を可能にする、組換え産物の配列およびスプライセオソーム認識配列を含有する。したがって、ハイブリッドベクターシステムは、シンプルオーバーラップおよびシンプルトランススプライシングデュアルベクターシステムのモジュール式の、多用途の代替物である。末端切断型ＭＹＯ７Ａタンパク質の生成および任意の関連する細胞傷害性（例えば、網膜において観察される機能毒性の獲得）を排除するために分割点を変更すること（例えば、エクソン２３と２４の間からエクソン２１と２２の間へ）によって、フロントハーフベクターからバックハーフベクターへＭＹＯ７Ａテールドメインのコード配列（そのすべて、またはその部分）をシフトする改変デュアルハイブリッドベクターシステムが本明細書において記載される。さらに、２つのベクターのハーフの間でオーバーラップするコード配列を変更することによって、ＭＹＯ７Ａテールドメインのコード配列をフロントハーフベクターからバックハーフベクターへシフトする改変デュアルオーバーラップベクターシステムが本明細書において記載される。
非コード配列中の推定停止コドンが除去されている、コドン改変ハイブリッドおよびオーバーラップベクターシステムが本明細書においてさらに記載される。変更されたおよび／または低減された長さの、２つのベクター間のオーバーラップするコード配列を含有する改変オーバーラップベクターシステムが、本明細書においてさらに記載される。バックハーフベクターの長さの低減を含有する改変ハイブリッドベクターシステムが、本明細書においてさらに記載される。
本開示はまた、網膜において形質導入効率を増大するための、以前の第１世代デュアルベクターオーバーラップシステムの改善に少なくとも幾分かに基づく。一部の実施形態では、開示される改善は、ｒＡＡＶ粒子パッケージング効率を増大するための、システム中の５’（フロント）および／または３’（バック）ＡＡＶベクターの短縮を包含する。
一部の実施形態では、開示されるｒＡＡＶベクターは、ＭＹＯ７Ａタンパク質、例えば、ヒトＭＹＯ７Ａタンパク質をコードする導入遺伝子を含む。一部の実施形態では、開示されるｒＡＡＶベクターは、アッシャー症候群と関連する他のタンパク質をコードする導入遺伝子を含む。一部の実施形態では、開示されるｒＡＡＶベクターは、他の眼のまたは耳の疾患、障害または状態と関連する他のタンパク質をコードする導入遺伝子を含む。
したがって、本開示の態様は、そのコード配列が個々のＡＡＶベクターのポリヌクレオチドパッケージング容量を超える全長タンパク質の発現を可能にする改変デュアルＡＡＶベクターシステムを提供する。
したがって、一部の態様では、ハイブリッドデュアルベクターシステムが本明細書において提供される。ｉ）ポリヌクレオチドの各末端に逆方向末端反復配列、逆方向末端反復配列の間に、プロモーター、続いて、ミオシンポリペプチドのＮ末端部分をコードする部分コード配列、続いて、スプライスドナー（ＳＤ）部位およびイントロンを含む第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチド、ならびにｉｉ）ポリヌクレオチドの各末端に逆方向末端反復配列、逆方向末端反復配列の間に、イントロンおよびイントロンのスプライスアクセプター（ＳＡ）部位を含む第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドベクターシステムであって、第１および第２のＡＡＶベクター中のイントロン配列は、オーバーラップするポリヌクレオチド配列を含み、第１および第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチド配列の間の分割点は、ｈＭＹＯ７Ａ遺伝子のエクソン２１とエクソン２２の間である、ポリヌクレオチドベクターシステムが、本明細書において提供される（図２２Ｄおよび２２Ｅを参照されたい）。ミオシンポリペプチドのＮ末端部分がミオシンポリペプチドのシングル－アルファヘリックス（ＳＡＨ）ドメインを含まない（例えば、第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチドが、ミオシンポリペプチドのＳＡＨドメインをコードしない部分コード配列を含む）ハイブリッドポリヌクレオチドシステムが、本明細書において提供される。一部の実施形態では、オーバーラップするイントロン配列は、アルカリホスファターゼイントロンを含む。第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチドが配列番号３３または３４のヌクレオチド配列を含み、第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドが配列番号３２、３５または４４のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドベクターシステムが、本明細書においてさらに提供される。
他の態様では、オーバーラップデュアルベクターシステムが本明細書において提供される。ｉ）ポリヌクレオチドの各末端に逆方向末端反復配列、逆方向末端反復配列の間に、プロモーター、続いて、ミオシンポリペプチドのＮ末端部分をコードする部分コード配列を含む第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチド、ならびにｉｉ）ポリヌクレオチドの各末端に逆方向末端反復配列、逆方向末端反復配列の間に、ミオシンポリペプチドのＣ末端部分をコードする部分コード配列を含む第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドベクターシステムであって、第１および第２のＡＡＶベクター中のポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチド配列は、オーバーラップするポリヌクレオチド配列を含み、ミオシンポリペプチドのＣ末端部分は、ミオシンポリペプチドのシングル－アルファヘリックス（ＳＡＨ）ドメインを含む、ポリヌクレオチドベクターシステムが、本明細書において提供される。第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチドが、配列番号３６のヌクレオチド配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である核酸配列を含み、第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドが、配列番号３８のヌクレオチド配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である核酸配列を含むポリヌクレオチドベクターシステムが、本明細書においてさらに提供される。
一部の態様では、ｉ）ポリヌクレオチドの各末端に逆方向末端反復配列、逆方向末端反復配列の間に、プロモーター、続いて、ミオシンポリペプチドのＮ末端部分をコードする部分コード配列を含む第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチド、ならびにｉｉ）ポリヌクレオチドの各末端に逆方向末端反復配列、逆方向末端反復配列の間に、ミオシンポリペプチドのＣ末端部分をコードする部分コード配列を含む第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドベクターシステムであって、第１および第２のＡＡＶベクター中のポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチド配列は、オーバーラップするポリヌクレオチド配列を含み、（ｉ）第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチドは、配列番号６３、９０または６６に対して少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である核酸配列を含み、（ｉｉ）第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドは、配列番号７７または８０に対して少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一である核酸配列を含むポリヌクレオチドベクターシステムが、本明細書においてさらに提供される。
ｉ）ポリヌクレオチドの各末端に逆方向末端反復配列、逆方向末端反復配列の間に、プロモーター、続いて、ミオシンポリペプチドのＮ末端部分をコードする部分コード配列を含む第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチド、ならびにｉｉ）ポリヌクレオチドの各末端に逆方向末端反復配列、逆方向末端反復配列の間に、ミオシンポリペプチドのＣ末端部分をコードする部分コード配列を含む第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドベクターシステムであって、第１および第２のＡＡＶベクター中のポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチド配列は、オーバーラップするポリヌクレオチド配列を含み、（ｉ）第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチドは、配列番号６３、９０および６６から選択されるヌクレオチド配列を含み、（ｉｉ）第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドは、配列番号７７および８０から選択されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドベクターシステムが、本明細書においてさらに提供される。
ｉ）ポリヌクレオチドの各末端に逆方向末端反復配列、逆方向末端反復配列の間に、プロモーター、続いて、ミオシンポリペプチドのＮ末端部分をコードする部分コード配列を含む第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチド、ならびにｉｉ）ポリヌクレオチドの各末端に逆方向末端反復配列、逆方向末端反復配列の間に、ミオシンポリペプチドのＣ末端部分をコードする部分コード配列を含む第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドベクターシステムであって、第１および第２のＡＡＶベクター中のポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチド配列は、オーバーラップするポリヌクレオチド配列を含み、（ｉ）第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチドは、配列番号６２、９１または６５のアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であるアミノ酸をコードし、（ｉｉ）第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドは、配列番号７８または８１に対して少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドベクターシステムが、本明細書においてさらに提供される。
ｉ）ポリヌクレオチドの各末端に逆方向末端反復配列、逆方向末端反復配列の間に、プロモーター、続いて、ミオシンポリペプチドのＮ末端部分をコードする部分コード配列を含む第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチド、ならびにｉｉ）ポリヌクレオチドの各末端に逆方向末端反復配列、逆方向末端反復配列の間に、ミオシンポリペプチドのＣ末端部分をコードする部分コード配列を含む第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドベクターシステムであって、第１および第２のＡＡＶベクター中のポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチド配列は、オーバーラップするポリヌクレオチド配列を含み、オーバーラップするポリヌクレオチド配列は、配列番号３９および５２～５９のいずれか１つから選択される配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドベクターシステムが、本明細書においてさらに提供される。
ｉ）ポリヌクレオチドの各末端に逆方向末端反復配列、逆方向末端反復配列の間に、プロモーター、続いて、ミオシンポリペプチドのＮ末端部分をコードする部分コード配列を含む第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチド、ならびにｉｉ）ポリヌクレオチドの各末端に逆方向末端反復配列、逆方向末端反復配列の間に、ミオシンポリペプチドのＣ末端部分をコードする部分コード配列を含む第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドベクターシステムであって、第１および第２のＡＡＶベクター中のポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチド配列は、オーバーラップするポリヌクレオチド配列を含み、オーバーラップするポリヌクレオチド配列は、配列番号７９および８２～８９のいずれか１つをコードする配列を含むポリヌクレオチドベクターシステムが、本明細書においてさらに提供される。
ｉ）ポリヌクレオチドの各末端に逆方向末端反復配列、逆方向末端反復配列の間に、プロモーター、続いて、ミオシンポリペプチドのＮ末端部分をコードする部分コード配列を含む第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチド、ならびにｉｉ）ポリヌクレオチドの各末端に逆方向末端反復配列、逆方向末端反復配列の間に、第２のイントロンおよび第１のイントロンのスプライスアクセプター部位を含む第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドベクターシステムであって、第１および第２のイントロンのヌクレオチド配列（まとめて本明細書において「イントロン配列」と呼ばれる）は、オーバーラップするポリヌクレオチド配列を含み、第１および／または第２のイントロン配列は、配列番号６９または配列番号７０に対して少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である核酸配列を含むポリヌクレオチドベクターシステムが、本明細書においてさらに提供される。
ｉ）ポリヌクレオチドの各末端に逆方向末端反復配列、逆方向末端反復配列の間に、プロモーター、続いて、ミオシンポリペプチドのＮ末端部分をコードする部分コード配列、続いて、スプライスドナー部位および第１のイントロンを含む第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチド、ならびにｉｉ）ポリヌクレオチドの各末端に逆方向末端反復配列、逆方向末端反復配列の間に、第２のイントロンおよび第１のイントロンのスプライスアクセプター部位を含む第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドベクターシステムであって、第１および第２のイントロンのヌクレオチド配列は、オーバーラップするポリヌクレオチド配列を含み、第１および第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチド配列の間の分割点は、治療用タンパク質をコードする遺伝子の２つのエクソンの間であるポリヌクレオチドベクターシステムが、本明細書においてさらに提供される。
ｉ）ポリヌクレオチドの各末端に逆方向末端反復配列、逆方向末端反復配列の間に、プロモーター、続いて、ミオシンポリペプチドのＮ末端部分をコードする部分コード配列、続いて、スプライスドナー部位および第１のイントロンを含む第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチド、ならびにｉｉ）ポリヌクレオチドの各末端に逆方向末端反復配列、逆方向末端反復配列の間に、第２のイントロンおよび第１のイントロンのスプライスアクセプター部位を含む第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドベクターシステムであって、第１および第２のイントロンのヌクレオチド配列は、オーバーラップするポリヌクレオチド配列を含み、（ｉ）第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチドは、配列番号３１、３３、３４および４６に対して少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である核酸配列を含み、（ｉｉ）第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドは、配列番号３２、３５、４４および４７～４９に対して少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である核酸配列を含むポリヌクレオチドベクターシステムが、本明細書においてさらに提供される。
ｉ）ポリヌクレオチドの各末端に逆方向末端反復配列、逆方向末端反復配列の間に、プロモーター、続いて、ミオシンポリペプチドのＮ末端部分をコードする部分コード配列、続いて、スプライスドナー部位および第１のイントロンを含む第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチド、ならびにｉｉ）ポリヌクレオチドの各末端に逆方向末端反復配列、逆方向末端反復配列の間に、第２のイントロンおよび第１のイントロンのスプライスアクセプター部位を含む第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドベクターシステムであって、第１および第２のイントロンのヌクレオチド配列は、オーバーラップするポリヌクレオチド配列を含み、（ｉ）第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチドは、配列番号３３のヌクレオチド配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である核酸配列を含み、（ｉｉ）第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドは、配列番号３２のヌクレオチド配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である核酸配列を含むポリヌクレオチドベクターシステムが、本明細書においてさらに提供される。
ｉ）ポリヌクレオチドの各末端に逆方向末端反復配列、逆方向末端反復配列の間に、プロモーター、続いて、ミオシンポリペプチドのＮ末端部分をコードする部分コード配列、続いて、スプライスドナー部位および第１のイントロンを含む第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチド、ならびにｉｉ）ポリヌクレオチドの各末端に逆方向末端反復配列、逆方向末端反復配列の間に、第２のイントロンおよび第１のイントロンのスプライスアクセプター部位を含む第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドベクターシステムであって、第１および第２のイントロンのヌクレオチド配列は、オーバーラップするポリヌクレオチド配列を含み、（ｉ）第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチドは、配列番号３４のヌクレオチド配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である核酸配列を含み、（ｉｉ）第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドは、配列番号３５のヌクレオチド配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である核酸配列を含むポリヌクレオチドベクターシステムが、本明細書においてさらに提供される。
ｉ）ポリヌクレオチドの各末端に逆方向末端反復配列、逆方向末端反復配列の間に、プロモーター、続いて、ミオシンポリペプチドのＮ末端部分をコードする部分コード配列、続いて、スプライスドナー部位および第１のイントロンを含む第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチド、ならびにｉｉ）ポリヌクレオチドの各末端に逆方向末端反復配列、逆方向末端反復配列の間に、第２のイントロンおよび第１のイントロンのスプライスアクセプター部位を含む第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドベクターシステムであって、第１および第２のイントロンのヌクレオチド配列は、オーバーラップするポリヌクレオチド配列を含み、（ｉ）第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチドは、配列番号３４のヌクレオチド配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である核酸配列を含み、（ｉｉ）第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドは、配列番号４４のヌクレオチド配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である核酸配列を含むポリヌクレオチドベクターシステムが、本明細書においてさらに提供される。
本開示の原理の理解を促進するために、図面において例示される実施形態または実施例がここで参照され、それを説明するために特定の言語が使用される。それにもかかわらず、それによる本開示の範囲の制限は意図されないということは理解されるであろう。記載された実施形態の任意の変更およびさらなる改変ならびに本明細書において記載されるような本開示の原理の任意のさらなる適用は、本開示が関する技術分野の当業者に通常想起されるように企図される。
図１は、相同組換えによるデュアルＡＡＶベクターからの完全遺伝子カセットの形成を示す。 図２は、本開示の１つの態様に従うオーバーラップデュアルベクターシステムを作り上げる２つのベクター構成成分の模式図を示す。 図３は、天然イントロンを含有する例示的ハイブリッドデュアルベクターシステムを構成する２つのベクター構成成分の模式図を示す。明るい陰影で示される天然ｈＭＹＯ７Ａイントロン２３；スプライスドナーおよびスプライスアクセプター配列は、より暗い陰影で示されており、（・）とともに示されている。 図４は、合成イントロンを含有する例示的ハイブリッドデュアルベクターシステムを構成する２つのベクター構成成分の模式図を示す。これは、例示的な標準トランススプライシングデュアルベクターシステムであり、「イントロン」は、合成アルカリホスファターゼスプライスドナーおよびアクセプター部位を指す。合成アルカリホスファターゼ（ＡＰ）イントロンは、明るい陰影で示されており、ＡＰスプライスドナーおよびスプライスアクセプター配列は、より暗い陰影で示されており、（・）とともに示されている。 図５は、感染したまたはトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞におけるＭＹＯ７Ａの存在を検出するための免疫ブロットを示す。不均一なベクターが、３つすべてのデュアルベクターシステムに対して比較される。デュアルベクターは、ＡＡＶ２またはＡＡＶ２（三重突然変異体）カプシド中のいずれかにパッケージングされた。三重突然変異体は、カプシド表面上に３つのチロシンのフェニルアラニンへの突然変異を含有する。３つすべてのデュアルベクターシステムについて、感染は、ａ）フロントハーフ（Ｎ末端）およびバックハーフ（Ｃ末端）ベクターまたはｂ）フロントハーフベクター単独（プロモーター含有Ｎ末端ベクターから発現された末端切断型タンパク質生成物の有無を確認するため）のいずれかを用いて実施した。 図６Ａおよび図６Ｂは、例示的オーバーラップデュアルベクターシステムを用いて感染させたＨＥＫ２９３細胞におけるＭＹＯ７Ａの存在を検出するための免疫ブロットを示す。結果は、感染後３～７日の経時的推移（レーン３～７）として示されており、ＭＹＯ７Ａプラスミド（レーン１）および未感染対照（レーン２）を用いてトランスフェクトされた細胞と比較される。図６Ａ中の目的の領域は、図６Ｂにおいて拡大され、より高いコントラストで示されている。感染後３日で出発して、全長ヒトＭＹＯ７Ａタンパク質は見ることができ、ピーク発現は、５日目あたりで生じた。 図７Ａおよび図７Ｂは、未処置マウスおよび例示的オーバーラップデュアルベクターシステムを用いて網膜下で処置されたマウスに由来する網膜を示す。免疫組織化学（ＩＨＣ）は、ＭＹＯ７Ａに対して向けられた抗体を使用して実施した。ＭＹＯ７Ａ染色および核（ＤＡＰＩ）染色が示されている。 図８Ａ～８Ｄは、野生型対ｓｈａｋｅｒ－１マウスにおけるＲＰＥメラノソーム局在性の相違を示す。野生型マウスでは、ＲＰＥメラノソームは、光受容体外節へ向けて先端に移動する（図８Ａ）のに対し、（図８Ｂ）において見られるようにＭＹＯ７Ａを欠くマウス（ｓｈａｋｅｒ－１）ではこの現象は生じない。右は、野生型（図８Ｃ）またはｓｈａｋｅｒ－１（図８Ｄ）マウスのいずれかに由来する単一ＲＰＥ細胞の高拡大画像であり、この現象を間近に示す。 図９Ａ～９Ｃは、ＲＰＥメラノソームの先端移動が、例示的オーバーラップデュアルベクターシステムを注射されたｓｈａｋｅｒ－１マウスにおいて回復されることを示す。電子顕微鏡観察によって、未処置ｓｈａｋｅｒ－１マウスのメラノソームは、先端に移動しないことが示されている（図９Ａ）。例示的オーバーラップベクター（ＡＡＶ２中にパッケージングされた）を用いて注射されたｓｈａｋｅｒ－１マウスでは、ＲＰＥメラノソームは光受容体に向けて先端に移動し、これは、ここで低および高拡大画像の両方で見ることができる（図９Ｂおよび９Ｃ）。 図１０Ａ～１０Ｆは、培養細胞におけるシングルＡＡＶ２およびＡＡＶ５ベクターからのＭＹＯ７Ａの発現を例示する。図１０Ａは、ヒトＭＹＯ７Ａ ｃＤＮＡをコードするウイルスベクターの図である。図１０Ｂは、ＷＴ眼杯（レーン１）、ＭＹＯ７Ａ－ヌルマウスおよびＡＡＶ２－ＭＹＯ７Ａ（レーン２）またはＡＡＶ５－ＭＹＯ７Ａ（レーン３）に感染したものまたは感染していないもの（レーン４）に由来する一次ＲＰＥ培養物ならびにＭＹＯ７Ａ＋／－マウス（レーン５）に由来する一次ＲＰＥ培養物のウエスタンブロットである。すべてのレーンは、アクチン（相対タンパク質ローディングのローディング指標として）およびＭＹＯ７Ａに対する抗体を用いて免疫標識された。図１０Ｃ～１０Ｆは、一次ＲＰＥ細胞培養物の免疫蛍光画像である。感染していなかったＭＹＯ７Ａ－ヌルマウスに由来する（図１０Ｃ）、ＭＹＯ７Ａ＋／－マウスに由来する（図１０Ｄ）または１×ＡＡＶ２－ＭＹＯ７Ａ（図１０Ｅ）もしくは１×ＡＡＶ５－ＭＹＯ７Ａ（図１０Ｆ）のいずれかに感染したＭＹＯ７Ａ－ヌルマウスに由来する細胞。スケール＝１０μｍ。 同上。 図１１Ａ～１１Ｍは、インビボでＡＡＶ２およびＡＡＶ５デュアルベクターからのＭＹＯ７Ａの発現を示す。図１１Ａ～１１Ｅは、ＭＹＯ７Ａ－ヌル網膜における杆体光受容体からの結合繊毛および繊毛周囲のＭＹＯ７Ａイムノゴールド標識のＥＭ画像を示す。図１１Ａは、未処置ＭＹＯ７Ａ－ヌル網膜（バックグラウンド標識のみ）からの縦横切片である。図１１Ｂおよび図１１Ｃは、ＡＡＶ２－ＭＹＯ７Ａ（図１１Ｂ）またはＡＡＶ５－ＭＹＯ７Ａ（図１１Ｃ）で処置されたＭＹＯ７Ａ－ヌル網膜からの縦横切片である。スケール＝５０ｎｍ。図１１Ｄおよび図１１Ｅは、ＡＡＶ２－ＭＹＯ７Ａ（図１１Ｄ）またはＡＡＶ５－ＭＹＯ７Ａ（図１１Ｅ）で処置されたＭＹＯ７Ａ－ヌル網膜における杆体光受容体からの結合繊毛の横断切片である。スケール＝５０ｎｍ。図１１Ｆおよび図１１Ｇは、ＡＡＶ２－ＭＹＯ７Ａ（図１１Ｆ）またはＡＡＶ５－ＭＹＯ７Ａ（図１１Ｇ）で処置されたＭＹＯ７Ａ－ヌル網膜から得たＲＰＥ細胞のＥＭ画像を示す。スケール＝５００ｎｍ。矩形によって示される面積が、図１１Ｆ－１および図１１Ｇ－１においてＭＹＯ７Ａイムノゴールド標識（円形によって示される）を示すために拡大されている。スケール＝５０ｎｍ、図１１Ｈおよび図１１Ｉは、ＡＡＶ２－ＭＹＯ７Ａで処置されたＭＹＯ７Ａ－ヌル網膜における杆体（図１１Ｈ）および錐体（図１１Ｉ）光受容体からの結合繊毛および繊毛周囲の縦横切片のＥＭ画像を示す。切片は、ＭＹＯ７Ａ（１２－ｎｍゴールド）および杆体オプシン（１５－ｎｍゴールド）抗体で二重標識された。杆体外節は、オプシン抗体で標識され、錐体はその外節における杆体オプシン標識化の欠如によって同定された。切片は、外節の基部をちょうど示す。結合繊毛における、さらに杆体においても、ほぼすべての標識はＭＹＯ７Ａである。スケール＝５０ｎｍ。図１１Ｊ～１１Ｍは、種々の濃度のＡＡＶ２－ＭＹＯ７Ａ（図１１Ｊおよび図１１Ｋ）またはＡＡＶ５－ＭＹＯ７Ａ（図１１Ｌおよび図１１Ｍ）を用いる処置後の、杆体光受容体繊毛および繊毛周囲における（図１１Ｊおよび図１１Ｌ）、ならびにＲＰＥにおける（図１１Ｋおよび図１１Ｍ）ＭＹＯ７Ａイムノゴールド粒子密度を示す棒グラフである。状態あたりｎ＝３個体の動物。バーは、ＳＥＭを示す。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 図１２Ａ～１２Ｆは、ＡＡＶ２－ＭＹＯ７ＡまたはＡＡＶ５－ＭＹＯ７Ａを用いる網膜下注射後のメラノソーム局在性の修正を示す。ＷＴ網膜（図１２Ａ）およびＡＡＶ２－ＭＹＯ７Ａ（図１２Ｂ）またはＡＡＶ５－ＭＹＯ７Ａ（図１２Ｃ）を用いて注射された網膜におけるＲＰＥの先端突起におけるメラノソームの存在を示す光学マイクロ写真。注射部位（図１２Ｄ）からさらに離れて、メラノソームは、一部のＲＰＥ細胞の先端突起中に存在するが、他では存在しない（矢印は、先端メラノソームを示す；白色の線は、先端突起からメラノソームが存在しない領域を示す）。図１２Ｅは、注射部位から遠位の領域を例示し、すべてのＲＰＥ細胞は、その先端突起においてメラノソームを欠いていた。左側の括弧は、ＲＰＥ先端突起を示す。スケール＝２５μｍ。図１２Ｆは、図１２Ａ～１２Ｅに示される画像の相対位置を示す眼杯の図である。ＯＮＨは視神経乳頭を示す。 同上。 図１３は、ＡＡＶ２－ＭＹＯ７ＡまたはＡＡＶ５－ＭＹＯ７Ａを用いる網膜下注射後の杆体光受容体の結合繊毛および繊毛周囲におけるオプシンの異常レベルの修正を示す。棒グラフは、結合繊毛の長さに沿ったオプシンイムノゴールド金粒子密度を示す。ＭＹＯ７Ａ－ヌルおよびＷＴマウスから得た網膜の極薄切片は、杆体オプシン抗体を用いて染色された。ＭＹＯ７Ａ－ヌル網膜は、未処置であるか、または１×もしくは１：１００ ＡＡＶ２－ＭＹＯ７ＡもしくはＡＡＶ５－ＭＹＯ７Ａのいずれかを用いて処置されていた。状態あたりｎ＝３個体の動物。バーはＳＥＭを示す。 図１４Ａ～１４Ｇは、オーバーラップするＡＡＶ２－ＭＹＯ７ＡデュアルベクターからのＭＹＯ７Ａの発現を示す。図１４Ａ－１および図１４Ａ－２は、オーバーラップするＡＡＶ２－ＭＹＯ７Ａデュアルベクターの図を例示する。オーバーラップする領域は、１３６５塩基を含有する。図１４Ｂは、感染していない（レーン１）またはＡＡＶ２－ＭＹＯ７Ａ（オーバーラップデュアル）に感染した（レーン２）のいずれかであったＭＹＯ７Ａ－ヌルマウスに由来する一次ＲＰＥ培養物；ＭＹＯ７Ａ＋／－マウスに由来する一次ＲＰＥ培養物（レーン３）；ＷＴ眼杯（レーン４）；ｐＴＲ－ｓｍＣＢＡ－ＭＹＯ７ＡでトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞（レーン５）に由来するタンパク質のウエスタンブロットである。すべてのレーンは、抗ＭＹＯ７Ａおよび抗アクチンを用いて免疫標識された。図１４Ｃ～１４Ｆは、ＡＡＶ２－ＭＹＯ７Ａ（オーバーラップデュアル）を用いて形質導入された培養ＲＰＥ細胞の免疫蛍光を示す。図１４Ｃ～１４Ｅは、ＭＹＯ７Ａ－ヌルマウスに由来する一次ＲＰＥ培養物およびＡＲＰＥ１９（図１４Ｆ）細胞を示す。スケール＝１０μｍ。図１４Ｇは、ＡＡＶ２－ＭＹＯ７Ａ（デュアル）を用いて注射されたＭＹＯ７Ａ－ヌルマウスの網膜から得たＲＰＥ細胞の間の、ＭＹＯ７Ａイムノゴールド粒子密度の分布を示す棒グラフである。ｎ＝３個体の動物。 同上。 同上。 図１５Ａ～１５Ｇは、ＡＡＶ２－ＭＹＯ７Ａ（オーバーラップデュアル）を用いる網膜下注射後の突然変異体表現型の修正を例示する。図１５Ａは、処置されたＭＹＯ７Ａ－ヌルマウス網膜から得た半薄切片の光学顕微鏡観察を示す。示された領域は、注射部位付近である。矢印は、先端突起におけるメラノソームを示す。白色の線は、ＭＹＯ７Ａ－ヌル表現型を依然として示し、先端突起にメラノソームは存在しない細胞を示す。スケール＝５０μｍ。図１５Ｂは、ＡＡＶ２－ＭＹＯ７Ａ（オーバーラップデュアル）を用いて処置された網膜から得たＲＰＥの低拡大免疫ＥＭ画像である。図１５Ａにおけるように、白色の線は、ＭＹＯ７Ａ－ヌル表現型を依然として示した領域を示した。矩形「ｃ」は、先端領域にメラノソームを含み、これは、修正されたＲＰＥ細胞を示す。スケール＝５００ｎｍ。図１５Ｃ～１５Ｅは、図１５Ｂにおいて示される矩形によって縁どられた領域のより高い拡大画像を示す。ＭＹＯ７Ａイムノゴールド粒子は、円形によって示される。スケール＝５０ｎｍ。図１５Ｆは、ＭＹＯ７Ａ－ヌル網膜、ＷＴ網膜から得た、またはＡＡＶ２－ＭＹＯ７Ａ（オーバーラップデュアル）を用いて処置され、先端メラノソームの位置によって修正されているか、修正されていないと決定されたＭＹＯ７Ａ－ヌル網膜から得たＲＰＥ細胞において測定されたＭＹＯ７Ａイムノゴールド粒子密度を例示する棒グラフである。状態あたりｎ＝３個体の動物。バーはＳＥＭを示す。図１５Ｇは、ＭＹＯ７Ａ（小さい金粒子）に対する、および杆体オプシン（大きな金粒子）に対する抗体を用いて二重標識された杆体光受容体繊毛の免疫ＥＭ画像である。ＭＹＯ７Ａ標識は、結合繊毛および繊毛周囲膜と関連しており、これは、ＭＹＯ７Ａの発現および正しい局在性を示す。この領域は、ディスク膜に限定されるオプシン標識を欠くが、それは、野生型（ＷＴ）表現型と一致し、したがって、突然変異体表現型の修正を示す。スケール＝３００ｎｍ。 同上。 同上。 図１６は、インビボでの全長ＭＹＯ７Ａの送達のためのデュアルＡＡＶベクターの検証を示す。野生型（Ｃ５７ＢＬ／６）マウス（レーン１）、ＡＡＶ８（７３３）ベクター中にパッケージングされた「シンプルオーバーラップ」ＭＹＯ７Ａベクターを用いて注射された、ヘテロ接合性ｓｈａｋｅｒ－１＋／－マウス（レーン２）およびｓｈａｋｅｒ－１－／－マウスの網膜におけるＭＹＯ７Ａの発現を示す免疫ブロット。「シンプルオーバーラップ」システムのＮ末端およびＣ末端ベクターの両方が、３×１０１０ベクターゲノム／μＬの濃度で注射された。デュアルＡＡＶベクターは、ＷＴおよびｓｈａｋｅｒ－１＋／－マウスにおいて見出されたものとサイズが同一であったＭＹＯ７Ａの発現を媒介した。各ウェルに等量のタンパク質がロードされたことを検証するために、β－アクチン（本明細書において赤で視覚化される）をローディングコントロールとして使用した。 図１７Ａ～１７Ｆは、断片化ベクターおよびシンプルオーバーラップデュアル－ベクターシステムを用いるＡＲＰＥ－１９におけるＡＡＶ媒介性ＭＹＯ７Ａ発現を示す。細胞に断片化ベクター：１×ＡＡＶ２－ＭＹＯ７Ａ（図１７Ａ）、ＡＡＶ５－ＭＹＯ７Ａ（図１７Ｂ）、その１／１００希釈物（図１７Ｃおよび図１７Ｄ）およびシンプルオーバーラップデュアル－ベクターシステム：ＡＡＶ２－ＭＹＯ７Ａ（デュアル）（図１７Ｆ）を用いて形質導入した。非形質導入細胞を、対照（図１７Ｅ）として使用した；明るい色、ＭＹＯ７Ａ；暗い色、ＤＡＰＩ。スケール＝１０μｍ。 同上。 図１８Ａ～１８Ｄは、希釈されたＡＡＶ２－ＭＹＯ７Ａ（図１８Ａおよび図１８Ｂ）またはＡＡＶ５－ＭＹＯ７Ａ（図１８Ｃおよび図１８Ｄ）；（図１８Ａおよび図１８Ｃ）１：１０、（図１８Ｂおよび図１８Ｄ）１：１００を用いて注射されたＭＹＯ７Ａ－ヌル網膜からの杆体光受容体の結合繊毛および繊毛周囲におけるＭＹＯ７Ａ発現を示す。スケール＝２００ｎｍ。 同上。 図１９は、注射されたＭＹＯ７Ａ－ヌル網膜の構造保存を示す。１０×ＡＡＶ５－ＭＹＯ７Ａを用いる注射の３週間後の光受容体層の光学顕微鏡観察。スケール＝１５μｍ。 図２０は、注射されたＭＹＯ７Ａ－ヌル網膜の構造保存を示す。１×ＡＡＶ２－ＭＹＯ７Ａを用いる注射の３週間後の光受容体層の光学顕微鏡観察。スケール＝１０μｍ。 図２１Ａ～２１Ｄは、ＡＡＶ２－ＭＹＯ７ＡまたはＡＡＶ５－ＭＹＯ７Ａを用いる網膜下注射後の杆体光受容体の結合繊毛および繊毛周囲におけるオプシンの異常なレベルの修正を示す。抗杆体オプシンおよび１２－ｎｍ金がコンジュゲートされた二次抗体を用いて標識されたＷＴ網膜（図２１Ａ）、１×ＡＡＶ２－ＭＹＯ７Ａ（図２１Ｂ）または１×ＡＡＶ５－ＭＹＯ７Ａ（図２１Ｃ）を用いて処置されたＭＹＯ７Ａ－ヌル網膜からの、および未処置ＭＹＯ７Ａ－ヌル網膜（図２１Ｄ）からの免疫ＥＭ。スケール＝２００ｎｍ。 同上。 図２２Ａ～２２Ｅは、本研究のために作出されたデュアル－ＡＡＶ－ベクター対の模式図を示す。図２２Ａは、断片化ＡＡＶ（ｆＡＡＶ）ベクターである。図２２Ｂは、シンプルオーバーラップを示す：２つのベクター間で共有される１３６５－ｂｐは、灰色で陰影がつけられている。図２２Ｃは、トランス－スプライシングベクターである。図２２Ｄは、ＡＰハイブリッドベクターを示す：２つのベクター間で共有される２７０－ｂｐのエレメントが斜勾配陰影で印をつけられている（Ｇｈｏｓｈ ｅｔ ａｌ．， ２０１１によって記載されるような１／３ ＡＰヘッド）。図２２Ｅは、ＭＹＯ７Ａイントロン２３の２５０－ｂｐの配列を利用する天然イントロンハイブリッドベクターを示す。３’ＭＹＯ７Ａは、ＭＹＯ７Ａの３’部分であり；５’ＭＹＯ７Ａは、ＭＹＯ７Ａの５’部分であり；ＡＡＶは、アデノ随伴ウイルスであり；ＡＰは、アルカリホスファターゼであり；イントロン＝ＭＹＯ７Ａのイントロン２３；ｐＡ＝ポリアデニル化シグナル；ＳＡ＝スプライス－アクセプター部位；ＳＤ＝スプライス－ドナー部位；およびｓｍＣＢＡは、（末端切断型）キメラサイトメガロウイルス最初期／ニワトリβ－アクチンキメラプロモーターを指す。 図２３Ａ～２３Ｃは、本開示のシンプルオーバーラップベクターによる感染後にヒトＭＹＯ７Ａを発現する細胞を示す。図２３Ａは、ＡＡＶ２中にパッケージングされたシンプルオーバーラップベクター（両ベクターに対して１０，０００のＭＯＩ）（トリプルＹ－Ｆ）による感染後にヒトＭＹＯ７Ａを発現するヒト胎児腎（ＨＥＫ２９３）細胞を示す。等量のタンパク質を、７．５％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）で分離し、ＭＹＯ７Ａについて染色した。図２３Ｂは、１０，０００、２，０００および４００のＭＯＩでＡＡＶ２（トリプルＹ－Ｆ）に感染したＨＥＫ２９３細胞を示す。図２３Ｃは、ＨＥＫ２９３細胞において発現されるＭＹＯ７Ａの時間経過アッセイである。感染後３～７日で細胞を回収した。ＭＯＩ＝多重感染度；Ｔ＝全長ＭＹＯ７Ａプラスミドを用いてトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞；Ｕ＝未処置ＨＥＫ２９３細胞。 図２４は、ＨＥＫ２９３細胞におけるＡＡＶ２およびＡＡＶ２（トリプルＹ－Ｆ突然変異体カプシド）ベースのベクターの比較を示す。各ベクターについて１０，０００のＭＯＩでＡＡＶ２またはＡＡＶ２（トリプルＹ－Ｆ）中にパッケージングされたＡＰハイブリッドおよびシンプルオーバーラップＭＹＯ７Ａデュアルベクタープラットフォームを用いて細胞を感染させた。 図２５Ａ～２５Ｃは、ＨＥＫ２９３細胞において発現されたヒトＭＹＯ７Ａを示す。ＡＡＶ２ベースのベクタープラットフォームを用いて細胞を感染させた。デュアルベクターシステムの各々について、感染のために対応する５’および３’ベクター（または５’ベクター単独）が使用された。ＭＹＯ７Ａプラスミドを用いてトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞を陽性対照として使用された。各ベクターについて１０，０００のＭＯＩでＭＹＯ７Ａデュアルベクター対を用いて細胞を感染させた。タンパク質サンプルは、ＭＹＯ７Ａに対する抗体を用いるウエスタンブロットで分析した（図２５Ａ）。それぞれの３’ベクターの存在下または不在下で５’ベクター媒介性末端切断型タンパク質産物の量を定量化することによって、再構成を促進するための各デュアルベクタープラットフォームの相対能力を比較した（図２５Ｂ）。デュアルベクターによって媒介された全長ＭＹＯ７Ａ発現をトランスフェクション対照に対して定量化した（図２５Ｃ）。 同上。 図２６Ａ～２６Ｃは、コード配列を組み換え、適切に回復させるためのＭＹＯ７Ａデュアルベクターの能力を示す。実験計画は、図２６Ａに示されている。ＨＥＫ２９３細胞をＡＡＶ２ベースのデュアルベクタープラットフォームを用いて感染させ、ＲＮＡを抽出し、ＰＣＲを使用して遺伝子特異的プライマーが配列を増幅させた。ＢｇｌＩＩ（Ｂ）およびＰｐｕＭＩ（Ｐ）を用いた対照消化物は、図２６Ｂ～２６Ｃに示される予測されたバンドパターンを示した。未消化（Ｕ）ＰＣＲ産物が対照として、参照のためにＤＮＡサイズマーカー（Ｍ）が示されている。別々に、産物をＫｐｎＩおよびＡｇｅＩを用いて消化し、次いで、全オーバーラップ領域のシーケンシングのためにｐＵＣ５７中にクローニングした。ベクタープラットフォームあたり１０のクローンを分析した。サブクローンベクターに特異的なＭ１３フォワード－およびリバース－プライマーを使用して、センスおよびアンチセンスリード（各１，０００ｂｐ）を得、その結果、オーバーラップするセンスおよびアンチセンスリードは１４０ｂｐとなった（図２６Ｃ；表）。ＰＣＲ＝ポリメラーゼ連鎖反応。 同上。 同上。 図２７Ａ～２７Ｈは、インビボでデュアルベクターによって媒介されたＭＹＯ７Ａ発現を示す。Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスにＣ末端血球凝集素（ＨＡ）タグを含有するＡＡＶ２ベースのデュアルベクターを用いて網膜下に注射した。注射の４週間後に免疫組織化学およびウエスタンブロットによって網膜タンパク質発現を分析した。１０ミクロンの凍結網膜横断切片を、ＨＡに対する抗体を用いて染色し、１０×で（図２７Ａ、図２７Ｃおよび図２７Ｅ）および６０×で（図２７Ｂ、図２７Ｄおよび図２７Ｆ）画像化した。未処置Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ網膜も、ＨＡに対する抗体を用いて染色した（図２７Ｇ）。等量のタンパク質を４～１５％のポリアクリルアミドゲルで分離し、ＨＡ抗体を用いて染色した（図２７Ｈ）。比較のために、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ網膜由来の内因性ＭＹＯ７ＡをＭＹＯ７Ａに対する抗体を用いてプローブして、ＨＡタグが付いたＭＹＯ７Ａが適当なサイズで移動したことを確認した。ＲＰＥ－網膜色素上皮、ＩＳ－内節、ＯＳ－外節、ＯＮＬ－外顆粒層、ＩＮＬ－内顆粒層、ＧＣＬ－神経節細胞層、ＰＲ－光受容体。核（ＤＡＰＩ）染色は、括弧（｝）を用いて示されている。 同上。 同上。 図２８は、デュアルベクターシステムが全長導入遺伝子を送達し、組み換え、生成する方法の代表的な模式図を示す。ＭＹＯ７Ａ ｃＤＮＡは、２つのパートまたは「ハーフ」に分割され、各ハーフは別々のＡＡＶベクターを介して送達される。同時感染後、遺伝子ハーフは、その共有される／オーバーラップする配列を介して組み換えられて、全長ＭＹＯ７Ａを形成する。次いで、組み換えられた導入遺伝子は転写され、所望のタンパク質産物に翻訳され得る。 図２９Ａ～２９Ｂは、デュアルベクター媒介性ＭＹＯ７Ａ発現Ｍｙｏ７ａ－／－マウスを示す。図２９Ａは、シンプルオーバーラップまたはＡＰハイブリッドデュアルベクター注射後の結果として得られたタンパク質発現を示す。シンプルオーバーラップまたはＡＰハイブリッドデュアルベクターのいずれかの合計５．０×１０８ベクターゲノム（ｖｇ）（各２．５×１０８ｖｇ）を用いてＭｙｏ７ａ－／－マウスに注射した。すべてのベクター発現は、ｓｍＣＢＡプロモーターによって駆動された。注射の６週間後に網膜を集め、分析した。図２９Ｂは、複数の処置群のためにビンキュリン（ＶＣＬ）に対して正規化された全長ＭＹＯ７Ａ発現の定量化を示す。 図３０は、デュアルＡＡＶ－ＭＹＯ７Ａベクターの安全性を評価するための、注射後６週間での処置による暗順応ｂ波応答および平均ＯＮＬ厚を例示する２つの棒グラフを示す。すべての処置は、合計５．０×１０８ｖｇ（各２．５×１０８ｖｇ）で送達された。 図３１Ａ～３１Ｂは、フロントハーフハイブリッドベクターのみが末端切断型タンパク質を産生したことを示す。図３１Ａは、注射の６週間後での平均ＭＹＯ７Ａフロントハーフ転写物発現を示す棒グラフである。図３１Ｂは、ローディングコントロールとしてＶＣＬを使用する、注射の６週間後でのウエスタンブロット結果を示す。すべてのベクターは５．０×１０８ｖｇで送達された。 同上。 図３２は、注射の６週間後でのＣ５７ＢＬ／６ＪおよびＭｙｏ７ａ－／－マウスにおける暗順応ｂ波応答を例示する２つの棒グラフを示す。これらの結果は、フロントハーフハイブリッドベクターのみが網膜機能の消失につながったことを示す。すべてのベクターは、５．０×１０８ｖｇで送達された。 図３３は、注射の６週間後での平均ＭＹＯ７Ａバックハーフ転写物発現およびベクターゲノムを例示する２つの棒グラフを示す。これらの結果は、バックハーフベクターは転写物または末端切断型タンパク質を生成しないことを示す。すべてのベクターは、８．０×１０８ｖｇで送達された。 図３４は、フロントハーフハイブリッドベクターを用いる注射後に観察された機能の消失を防ぐための、エクソン２３と２４の間の元の部位からエクソン２１と２２の間の新規分割部位への分割部位再配置を示す。エクソン２１と２２の間の新規分割部位を有するハイブリッドベクターシステムは、本明細書において以下、「第２世代」ハイブリッドと呼ばれる。 図３５Ａ～３５Ｂは、ＨＥＫ２９３細胞における第１および第２世代ハイブリッドベクターの投与後のインビトロ結果を示す。図３５Ａは、ローディングコントロールとしてＶＣＬを使用する、エクソン２３と２４の間の分割部位を有する元のハイブリッド（「Ｅｘ２３／２４」）およびエクソン２１と２２の間の分割部位を有する第２世代ハイブリッド（「Ｅｘ２１／２２」）のウエスタンブロット結果を示す。図３５Ｂは、正規化された全長ＭＹＯ７Ａ発現を例示する。ＮＩは、「注射されていない」を示す。 図３６Ａ～３６Ｃは、Ｍｙｏ７ａ－／－マウスにおける第２世代デュアルハイブリッドベクターの網膜下注射からのインビボ結果を示す。注射用量は、合計５×１０８ｖｇであった。図３６Ａは、ローディングコントロールとしてＶＣＬを使用する、ウエスタンブロット結果を示す。図３６Ｂは、ハイブリッドベクターシステムにおけるエクソン２１／２２とエクソン２３／２４の間の全長タンパク質発現の比較のｐ値を示す。図３６Ｃは、ＷＴに対して正規化されたＭＹＯ７Ａ発現を示す。ハイブリッドベクターは、ＡＡＶ５およびＡＡＶ８（Ｙ７３３Ｆ）ビリオン中にカプシド形成され、投与され、各血清型と関連するＭＹＯ７Ａ発現が測定され、ＷＴに対して正規化された。 同上。 図３７Ａ～３７Ｂは、本開示の例示的第２世代ＭＹＯ７Ａポリヌクレオチドベクターシステムの模式図を示す。図３７Ａは、エクソン２１と２２の間の分割部位を有する第２世代ハイブリッドベクターシステムを示す。ＡＰ配列は、ポリＡおよび／またはスプライシングシグナルとして作用する。図３７Ｂは、フロントハイブリッドベクタープラスミドにおいて３’末端（ＭＹＯ７ＡＮ末端断片の下流）から潜在的なインフレームの停止コドンが除去されたオーバーラップベクターを示す。 図３８は、インビボでのハイブリッドＡＡＶ－ＭＹＯ７Ａ注射からの結果を示す棒グラフを示す。第２世代Ｅｘ２１／２２ハイブリッドベクターは、第１世代Ｅｘ２３／２４ハイブリッドベクターと比較して同等量の全長ＭＹＯ７Ａを発現するが、第１世代Ｅｘ２３／２４ハイブリッドベクターにおいて観察される末端切断型タンパク質断片の生成を引き起こさない。 図３９Ａ～３９Ｂは、ＨＥＫ２９３細胞における末端切断型ＭＹＯ７Ａタンパク質の発現のインビトロ結果を示す。図３９Ａは、元のハイブリッド（エクソン２３／２４）フロント、第２世代ハイブリッド（エクソン２１／２２）フロントおよびハイブリッドＣＭｖ１（エクソン２１／２２）フロントのウエスタンブロット結果を示す。本明細書において、「ＣＭｖ１」（または「ＣＯｖ２」）は、ヒトコドン改変バージョン１ハイブリッドベクターを指す。図３９Ｂは、ビンキュリンに対して正規化された末端切断型ＭＹＯ７Ａ発現を示す棒グラフである。 図４０は、元のハイブリッドフロントベクター、第２世代ｅｘ２１／２２ハイブリッドフロントベクター、ＣＭｖ１ ｅｘ２１／２２ハイブリッドフロントベクターおよびＣＭｖ２ ｅｘ２１／２２ハイブリッドフロントベクターのウエスタンブロット結果を示す。本明細書で使用される場合、「ＣＭｖ２」（本明細書において「ＣＯｖ２」と呼ばれる場合もある）とは、ヒトコドン改変バージョン２ハイブリッドベクターを指す。 図４１は、マカクザル網膜におけるＡＡＶ媒介性ＭＹＯ７Ａ転写物の発現および網膜下に注射されたマカクザル網膜におけるデュアルＡＡＶ５－ＭＹＯ７Ａベクターの忍容性の非ヒト霊長類データを示す。ベクターは、各４×１０８ｖｇ（合計８×１０８ｖｇ）の力価で送達された。 図４２は、ＣＭｖ１ハイブリッドフロントハーフベクターを作出するための、第２世代ハイブリッドフロントハーフベクター（「Ｍｙｏ７ａ ＮＴ－Ｅｘ２１」）からの停止コドンの除去の手順を示す。第２世代ハイブリッドフロントハーフベクター（配列番号４０として示される配列番号３１の関連断片）は、ＡＰイントロン内に３つの停止コドン（赤で示される潜在的な停止コドン）を含有していた。制限酵素Ｂｓｕ３６ＩおよびＮｈｅＩを使用して、停止コドンを含有する領域を切り出した。次いで、Ｇｉｂｓｏｎプライマーセット（配列番号４２、配列番号４３）を使用して、切り出された配列を置き換えた。新規配列は、３つすべての潜在的なインフレーム停止コドン（アスタリスク（＊）で示されている）が除去されていた（配列番号４１として示される配列番号３３の関連断片）。潜在的な停止コドンを改変することに加えて、得られたクローンのスクリーニングを単純化するために２つの制限部位、ＨｐａｌおよびＭｆｅｌを新規配列に付加した。 図４３は、ＣＭｖ１オーバーラップフロントハーフベクターを作出するために第２世代オーバーラップフロントハーフベクターにおいて行われた変化を示す。 図４４は、ＭＹＯ７Ａ遺伝子療法の送達のためのデュアルＡＡＶベクターアプローチを示す模式図である。ＭＹＯ７Ａ ｃＤＮＡは、２つのハーフに分割され、各ハーフは、別々のＡＡＶベクターを介して送達され、同時に注射される別々のＡＡＶ粒子で送達される。遺伝子ハーフは、各細胞において組み換えられて、全長ＭＹＯ７Ａを形成する。 図４５Ａ～４５Ｃは、全長ＭＹＯ７Ａ発現を駆動する２つの異なるデュアルＡＡＶベクタープラットフォームを示す。図４５Ａは、オーバーラップおよびハイブリッドデュアルＡＡＶベクタープラットフォームを表す模式図を含有する。図４５Ｂおよび４５Ｃは、ＡＡＶ５またはＡＡＶ８（Ｙ７３３Ｆ）ビリオンにおけるカプシド形成後に元のハイブリッドおよびオーバーラップベクターから生成されたＭＹＯ７Ａの量を示す。ＶＣＬマーカーは、対照として使用された。 同上。 図４６は、パッケージング効率の増大を示す改善された（第３世代）オーバーラップデュアルベクターを示す。 図４７は、オーバーラップの長さおよび位置を示す。より短いオーバーラップ長は、フロントとバックハーフベクターの間のより少ない共有される配列をもたらす。 図４８Ａおよび４８Ｂは、キャピラリーベースのウエスタンブロットツールの使用によるＰｒｏｔｅｉｎ Ｓｉｍｐｌｅ Ｊｅｓｓ定量化システムを使用して比較されたオーバーラップベクターを示す。図４８Ａは、種々のオーバーラップベクターからのＭＹＯ７Ａおよび末端切断型ＭＹＯ７Ａの発現を示す。図４８Ｂは、オーバーラップ長およびそれぞれのＩＴＲ－ＩＴＲ長（ｂｐ）を記載する表を示す。 図４９Ａ～４９Ｂは、オーバーラップパネル定量化を示す。６８７または９４５ｂｐのオーバーラップするＭＹＯ７Ａ配列を含有するオーバーラップベクターは、元のハイブリッドベクターと同じかより多い全長ＭＹＯ７Ａを生成する。図４９Ａは、元のハイブリッドベクターに対する、ＶＣＬに対して正規化されたＭＹＯ７Ａ発現を示す。図４９Ｂは、元のハイブリッドベクターに対する、ＶＣＬに対して正規化された末端切断型ＭＹＯ７Ａタンパク質の発現の程度を示す。 図５０Ａ～５０Ｄは、細胞傷害性の低減およびより大きな安全性を提供する改善されたハイブリッドデュアルベクターを示す。図５０Ａは、「分割点」が変更され、その結果、フロントハーフベクターによってネック／テールドメインがコードされないハイブリッド－Ｖ２を示す。図５０Ｂは、ハイブリッドベクターの模式図を示す。ハイブリッド－Ｖ２フロントハーフベクター配列では４つの潜在的なインフレーム停止コドンが改変された。すべてのコドン改変は、ハイブリッド－Ｖ２ ＭＩＮバックグラウンドで行われた。図５０Ｃは、各ベクターに行われた改変およびそれぞれのＩＴＲからＩＴＲ（ＩＴＲ－ＩＴＲ）の長さ（ｂｐで）を記載する表を示す。図５０Ｄは、元のハイブリッドベクターに対する全長ＭＹＯ７Ａおよび末端切断型ＭＹＯ７Ａ断片の生成の比較を示す。 同上。 図５１Ａ～５１Ｅは、安全性について改善されたハイブリッドデュアルベクターを示す。図５１Ａは、ハイブリッド－Ｖ２バックＭＩＮ、ハイブリッド－ＣＭｖ２バックＭＩＮならびにハイブリッド－Ｖ２バックＭＩＮ ＨＡおよびハイブリッド－ＣＭｖ２バックＭＩＮ ＨＡを表す例示的ベクターを示す。ハイブリッドバックＭＩＮベクターでは、ベクターサイズがパッケージング容量を超えないことを確実にするためにバックハーフベクターから「不必要なレガシー」配列が除去された。図５１Ｂは、各ベクターに行われたコドン改変およびそれぞれのＩＴＲ－ＩＴＲ長（ｂｐ）を記載する表を示す。図５１Ｃ～Ｅは、バックハーフベクターのサイズの低減がハイブリッドベクターからの全長ＭＹＯ７Ａの発現の増大につながることを示す。 同上。 同上。
本開示の例示的実施形態は、以下に記載される。本開示は、疾患および条件、例えば、アッシャー症候群１Ｂ（ＵＳＨ１Ｂ）の遺伝子療法のための材料および方法を提供する。本開示の態様は、そのコード配列が個々のＡＡＶベクターのポリヌクレオチドパッケージング容量を超える全長タンパク質の発現を可能にするＡＡＶベースのデュアルベクターシステムに関する。本開示の態様は、対象の眼の網膜または対象の内耳の有毛細胞における発現のためのＡＡＶベースのデュアルベクターシステムを提供する。したがって、本明細書において、ＵＳＨ１Ｂと関連する眼および耳の症状ならびに他の疾患および障害を処置するための方法が提供される。本開示は、オーバーラップベクターシステムの核酸ベクターおよびハイブリッドベクターシステムの核酸ベクターを提供する。
例えば、ヒト患者におけるＵＳＨ１Ｂの処置においてを含む、遺伝子置換療法において使用するために、複数の別個の別々ＡＡＶベースのデュアルベクターシステムが作出されており、本明細書において開示されている。特定の実施形態では、本開示のベクターシステムは、各々最大サイズのＤＮＡ分子（例えば、約４．５～４．８Ｋｂ）をパッケージングする２つの分離したＡＡＶベクターを使用する。２つのベクターは、選択されたレシピエント細胞に同時投与されて、全長の生物学的に活性なＭＹＯ７Ａポリペプチドを再構成する。これらのコンストラクトでは、オーバーラップする核酸配列の一部分は、ベクターゲノムの各々に共通である（図１を参照されたい）。適した細胞に同時に送達されると（図４４）、オーバーラップする配列領域によって、２つの部分遺伝子カセットの適切なコンカテマー化が容易になる。これらの遺伝子カセットは、次いで、相同組換えを受けて、細胞内で全長遺伝子カセットを生成する（図１を参照されたい）。デュアルベクターシステムの例示的実施形態の例示的な共有される構成成分は、ＡＡＶ逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）、キメラＣＭＶ／ニワトリβ－アクチンプロモーター（ｓｍＣＢＡ）の小さい（末端切断型）バージョン、ヒトＭＹＯ７Ａ（ｈＭＹＯ７Ａ）ｃＤＮＡ配列およびＳＶ４０ポリアデニル化（ｐＡ）シグナルの使用を含む。
一部の実施形態では、本明細書において提供されるポリヌクレオチドベクターおよびベクターシステムは、配列番号１～４のヌクレオチド配列を含まない。例示的実施形態では、本開示のオーバーラップベクターは、配列番号１および２のいずれも含まない。例示的実施形態では、本開示のハイブリッドベクターは、配列番号３および４のヌクレオチド配列のいずれも含まない。一部の実施形態では、本開示のベクターは、配列番号６７または７１のヌクレオチド配列を含まない。
オーバーラップベクターシステム
一部の態様では、オーバーラップデュアルＡＡＶベクターシステムが提供される。一部の実施形態では、本開示のオーバーラップベクターシステムは、マウスまたは対象への投与後に末端切断型ＭＹＯ７Ａタンパク質断片を生成しない。
本開示の一態様では、本開示のオーバーラップベクターシステムは、
ｉ）ポリヌクレオチドの各末端（５’および３’末端）に逆方向末端反復配列、逆方向末端反復配列の間に、適したプロモーター、続いて、選択された全長ポリペプチドのＮ末端部分をコードする（例えば、プロモーターの３’）部分コード配列を含む第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチド、ならびに
ｉｉ）ポリヌクレオチドの各末端（例えば、５’および３’末端）に逆方向末端反復配列、逆方向末端反復配列の間に、選択された全長ポリペプチドのＣ末端部分をコードする部分コード配列、適宜、続いて、ポリアデニル化（ｐＡ）配列を含む第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドを含む。第１および第２のベクター中のコード配列は、組み合わされると、選択された全長ポリペプチドまたはその機能的断片または変異体をコードする。第１および第２のＡＡＶベクター中のポリペプチドをコードする配列は、オーバーラップする配列を含む。
提供されたオーバーラップベクターシステムの一部の実施形態では、選択された全長ポリペプチドは、ミオシンポリペプチドである。一部の実施形態では、ミオシンポリペプチドは、ヒトミオシンＶＩＩＡ（ｈＭＹＯ７Ａ）である。一部の実施形態では、ミオシンポリペプチドは、ヒトミオシンＶＩＩ Ｂ（ｈＭＹＯ７Ｂ）である。一部の実施形態では、ミオシンポリペプチドは、ミオシン７（ＶＩＩ）アイソフォームＩＩである。ｈＭＹＯ７ＡのアイソフォームＩＩ（２）（ＮＭ＿００１１２７１８０）は、２１７５アミノ酸タンパク質（２５０．２ｋＤａ）をコードし、アイソフォームＩと比較して、コード領域中にインフレームセグメント（エクソン３５の部分）を欠く（Chen et al., 1996,;Weil et al., 1996を参照されたい）。一部の実施形態では、ミオシンポリペプチドは、別のミオシンアイソフォームまたはその機能的断片である。特定の実施形態では、全長ミオシン７ＡまたはアイソフォームＩＩは、提供されたベクターシステム中にコードされる。アイソフォームＩＩのペプチド配列は配列番号８として示される。
一部の実施形態では、選択される全長ポリペプチドは、ＡＢＣＡ４（シュタルガルト病）、ＣＥＰ２９０（ＬＣＡ１０）、ＥＹＳ（網膜色素変性症）、ＲＰ１（網膜色素変性症）、ＡＬＭＳ１（アルストレーム症候群）、ＣＤＨ２３（アッシャー症候群１Ｄ）、ＰＣＤＨ１５（アッシャー症候群１Ｆ）およびＵＳＨＥＲＩＮ（アッシャー症候群２Ａ）から選択される。一部の実施形態では、選択される全長ポリペプチドは、ＤＭＤ（デュシェンヌ型筋ジストロフィー）、ＣＦＴＲ（嚢胞性線維症）、ＧＤＥ（糖原病ＩＩＩ）、ＤＹＳＦ（ジスフェリン異常症）、ＯＴＯＦ（神経感覚無症候性劣性難聴）およびＦ８（血友病Ａ）から選択される。これらの遺伝子の各々と関連する疾患および障害が、括弧中に提供される。一部の実施形態では、選択される全長ポリペプチドは、約６ｋｂ～約９ｋｂの長さの遺伝子によってコードされる。一部の実施形態では、選択される全長ポリペプチドは、約７ｋｂ～約８ｋｂの長さの遺伝子によってコードされる。
本発明者らは、ｈＭＹＯ７Ａオーバーラップ領域、例えば、配列番号３９および５３～５９は、大きな遺伝子（ＭＹＯ７Ａ以外）を発現するさらなるオーバーラップデュアルベクター中でオーバーラップするポリヌクレオチド配列として使用され得るということを発見した。したがって、一部の実施形態では、ＡＢＣＡ４、ＣＥＰ２９０、ＥＹＳ、ＲＰＩ、ＡＬＭＳ１、ＣＤＨ２３、ＰＣＤＨ１５、ＵＳＨ１Ｃ、ＵＳＨ１Ｇ、ＵＳＨ２Ａ、ＤＮＦＢ３１、ＤＭＤ、ＣＦＴＲ、ＧＤＥ、ＤＹＳＦ、Ｆ８およびＤＦＮＢ２から選択される大きな遺伝子の部分（またはハーフ）を発現するオーバーラップデュアルベクターは、オーバーラップするポリヌクレオチド配列中にｈＭＹＯ７Ａ遺伝子の一部を含むオーバーラップ領域を含有する。これらのオーバーラップベクターは、ＭＹＯ７Ａ以外の、配列番号３９および５２～５９のいずれか１つに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む大きな遺伝子を発現する。このようなオーバーラップベクターは、配列番号３９および５３～５９、例えば、配列番号５６または５７のいずれか１つのヌクレオチド配列を含有するオーバーラップ領域を含み得る。
一部の実施形態では、選択された全長ポリペプチドは、１つまたは複数の光受容体細胞において発現される。一部の実施形態では、選択された全長ポリペプチドは、光受容体細胞を含まない１つまたは複数の細胞において発現される。一部の実施形態では、選択された全長ポリペプチドは、１つまたは複数の有毛細胞、例えば、聴覚系または前庭系の有毛細胞において発現される。
一部の実施形態では、選択された全長ポリペプチド（例えば、ミオシンポリペプチド）のＣ末端部分は、選択された全長ポリペプチドのシングル－アルファヘリックス（ＳＡＨ）ドメインを含む。
一部の実施形態では、第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチドは、配列番号１のヌクレオチド配列またはその機能的断片および／または変異体を含み、第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドは、配列番号２のヌクレオチド配列またはその機能的断片および／または変異体を含む。
一部の実施形態では、第１世代オーバーラップベクター（例えば、配列番号１のヌクレオチド配列もしくはその機能的断片および／もしくは変異体を含むＡＡＶベクターポリヌクレオチドならびに／または配列番号２のヌクレオチド配列もしくはその機能的断片および／もしくは変異体を含む第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチド）は、５’ベクター中のＡＴＧからＭＹＯ７Ａ ｃＤＮＡのヌクレオチド１から３６４４および／または３’ベクター中のヌクレオチド２２７９から６５３４を含有する。一部の実施形態では、断片が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってＰ１およびＰ３を用いて増幅され、それぞれ、ＮｏｔＩおよびＮｈｅＩを介して５’ベクター中に、Ｐ３（ＡｆｌＩＩ）およびＰ４（ＫｐｎＩ）を用いて３’ベクター中にクローニングされる。得られた２つのベクタープラスミドは、１３６５ｂｐのオーバーラップするＭＹＯ７Ａ配列（図２）を共有し、配列間のオーバーラップは、エクソン２３と２４の間の分割点で終了する。
一部の実施形態では、第１世代オーバーラップベクターのコード配列の３’末端に存在するコード配列の一部分は、第１世代オーバーラップベクターのコード配列の５’末端に存在するコード配列の一部分と同一である、または実質的に同一である。特定の実施形態では、第１および第２のＡＡＶ第１世代オーバーラップベクターの間の配列オーバーラップは、約５００から約３，０００ヌクレオチドの間、約１，０００から約２，０００ヌクレオチドの間、約１，２００から約１，８００ヌクレオチドの間または約１，３００から約１，４００ヌクレオチドの間である。
特定の実施形態では、本開示の第１および第２のＡＡＶオーバーラップベクターの間の配列オーバーラップは、１２８４ｂｐ、１０２７ｂｐ、１０２６ｂｐ、９４５ｂｐ、６８７ｂｐ、３６１ｂｐ、２７９ｂｐまたは２０ｂｐの長さである。特定の実施形態では、本開示の第１および第２のＡＡＶオーバーラップベクターの間の配列オーバーラップは、１２８４ｂｐ、１０２７ｂｐ、１０２６ｂｐ、９４５ｂｐ、６８７ｂｐ、３６１ｂｐ、２７９ｂｐまたは２０ｂｐから１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０ヌクレオチド以内になっている長さを有する。一部の実施形態では、配列オーバーラップは、９４５ｂｐ、６８７ｂｐまたは３６１ｂｐである。
特定の実施形態では、第１世代オーバーラップベクターシステムの配列オーバーラップは、約１，３５０ヌクレオチドである。例示的実施形態では、第１世代オーバーラップベクターシステムの配列オーバーラップは、１，３６５ヌクレオチドである。特定の実施形態では、オーバーラップするポリヌクレオチド配列は、配列番号４５を含む。特定の実施形態では、コードされるポリペプチドは、野生型または機能的ヒトミオシンＶＩＩａ（ｈＭＹＯ７Ａ）である。野生型および機能的ｈＭＹＯ７Ａポリペプチドのアミノ酸配列ならびにそれらをコードするポリヌクレオチドは、当技術分野で公知である（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０００２５１およびＵ３９２２６．１を参照されたい）。特定の実施形態では、ｈＭＹＯ７Ａポリペプチドは、配列番号６または配列番号８で示されるアミノ酸配列またはその機能的断片または変異体を含む。特定の実施形態では、ｈＭＹＯ７Ａポリペプチドは、配列番号５または配列番号７において示されるヌクレオチド配列によってコードされる。
コドン改変オーバーラップベクター
開示されるオーバーラップベクターシステムの一部の実施形態では、コドン改変オーバーラップベクターが提供される。一部の実施形態では、第１世代オーバーラップフロントハーフベクター（「ＡＡＶ－ｓｍＣＢＡ－ｈＭＹＯ７Ａ－ＮＴ」）は、短縮される。ＭＹＯ７Ａのテールドメインに対応するすべてのコード配列をフロントハーフベクターから除去し、したがって、オーバーラップ領域のサイズが３６１ｂｐ（配列番号３９）に低減された。（このベクターは、テールまたはＳＡＨ、ドメインを含有する末端切断型ＭＹＯ７Ａ断片を生成しない。ベクターはまた、すべての潜在的な（または推定）停止コドンが除去されるように変更された（図３７Ｂを参照されたい）。得られたベクターは、ＣＭｖ１オーバーラップフロントハーフベクター（「ＡＡＶ－ｓｍＣＢＡ－ｈＭＹＯ７Ａ－ｎｏＤｉｍＮＴ－ＣＭｖ１」）である。したがって、本開示のオーバーラップベクターシステムは、ＣＭｖ１オーバーラップベクターシステムを含む場合がある。
一部の実施形態では、変更された（例えば、短縮された）オーバーラップコード配列を有するオーバーラップベクターが提供される。このような実施形態では、ＭＹＯ７Ａ遺伝子または１３６５ｂｐ未満の長さである別の遺伝子中にオーバーラップ配列を含有するオーバーラップベクターが提供される。これらのシステムでは、オーバーラップ配列の長さは、ある特定の点に低減され、したがって、ベクターゲノムのいずれもＡＡＶカプシドのパッケージング容量（４．７～４．９ｋｂ）を押し広げないことを確実にし、全長ＭＹＯ７Ａの発現の増大につながる。オーバーラップ長が小さすぎる（≦３６１ｂｐ）場合、全長ＭＹＯ７Ａ発現が低減され、末端切断型タンパク質が現れる。６８７または９４５ｂｐのオーバーラップするＭＹＯ７Ａ配列を含有するオーバーラップベクターは、元のハイブリッドベクターと同じかより多い全長ＭＹＯ７Ａを生成する（図４８Ａ、４８Ｂ、４９Ａおよび４９Ｂを参照されたい）。このようなベクターは、本明細書において、「Ｖ３」または第３世代オーバーラップベクターと呼ばれる場合がある。例示的実施形態では、６８７または９４５ｂｐのオーバーラップするＭＹＯ７Ａ配列を含有するオーバーラップベクターが例証される。
したがって、オーバーラップするポリヌクレオチド配列が配列番号３９および５２～５９のいずれか１つから選択されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドベクターシステムが、本明細書において提供される。一部の実施形態では、オーバーラップするポリヌクレオチド配列は、配列番号３９、５６および５７のいずれか１つから選択されるヌクレオチド配列を含む。例示的実施形態では、オーバーラップするポリヌクレオチド配列は、配列番号５６または５７の配列を含む。一部の実施形態では、第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチドの各末端での逆方向末端反復配列の間の長さは、約４６１５ヌクレオチド（ｎｔ）以下である。一部の実施形態では、第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドの各末端での逆方向末端反復配列の間の長さは、約４８００ｎｔ以下である。一部の実施形態では、第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドの各末端での逆方向末端反復配列の間の長さは、約４５６０ｎｔである。
したがって、一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドベクターシステムは、ＣＭｖ１オーバーラップシステムである。一部の実施形態では、ベクターシステムは、オーバーラップＶ２（第２世代）システムである。一部の実施形態では、ベクターシステムは、Ｖ３オーバーラップ（第３世代）システムである。開示されるフロントハーフオーバーラップベクターのいずれも、本開示の組成物中の開示されるバックハーフオーバーラップベクターのいずれかと組み合わせることができる。得られた第３世代オーバーラップフロントハーフベクター（「ＡＡＶ－ｓｍＣＢＡ－ｈＭＹＯ７Ａ－ＮＴｌｏｎｇ－ｖ３」）は、配列番号５０として示されている。得られた第３世代オーバーラップバックハーフベクターは、ＨＡタグを含めて、配列番号５１として示されている。
したがって、一部の態様では、
ｉ）ポリヌクレオチドの各末端に逆方向末端反復配列、逆方向末端反復配列の間に、プロモーター、続いて、ミオシンポリペプチドのＮ末端部分をコードする部分コード配列を含む第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチド、ならびに
ｉｉ）ポリヌクレオチドの各末端に逆方向末端反復配列、逆方向末端反復配列の間に、ミオシンポリペプチドのＣ末端部分をコードする部分コード配列を含む第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドベクターシステムであって、
第１および第２のＡＡＶベクター中のポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチド配列は、オーバーラップするポリヌクレオチド配列を含み、
第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチドは、配列番号３６、３７および５０から選択されるヌクレオチド配列を含み、
第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドは、配列番号３８および５１から選択されるヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチドベクターシステムが、本明細書において提供される。例示的実施形態では、第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチドは、配列番号５０のヌクレオチド配列を含み、第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドは、配列番号５１のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチドは、配列番号５０のヌクレオチド配列を含み、第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドは、配列番号３８のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチドは、配列番号３６のヌクレオチド配列を含み、第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドは、配列番号３８のヌクレオチド配列を含む。
一部の実施形態では、第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチドは、選択された全長ポリペプチドのシングル－アルファヘリックス（ＳＡＨ）ドメインをコードしない部分コード配列を含む。一部の実施形態では、第２世代オーバーラップベクターの第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチドは、配列番号３７のヌクレオチド配列またはその機能的断片および／または変異体を含み、第２世代オーバーラップベクターの第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドは、配列番号３８のヌクレオチド配列またはその機能的断片および／または変異体を含む。
一部の実施形態では、第２世代オーバーラップベクター（例えば、配列番号３７のヌクレオチド配列もしくはその機能的断片および／もしくは変異体を含むＡＡＶベクターポリヌクレオチドならびに／または配列番号３８のヌクレオチド配列もしくはその機能的断片および／もしくは変異体を含む第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチド）は、含有するｓヌクレオチドｓ ５’ベクター中のＡＴＧからＭＹＯ７Ａ ｃＤＮＡのヌクレオチド１から２６４０および／または３’ベクター中のヌクレオチド２２７９から６５３４を含有する。一部の実施形態では、断片が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってＰ１およびＰ３を用いて増幅され、それぞれ、ＮｏｔＩおよびＮｈｅＩを介して５’ベクター中に、Ｐ３（ＡｆｌＩＩ）およびＰ４（ＫｐｎＩ）を用いて３’ベクター中にクローニングされる。得られた２つのベクタープラスミドは、３６１ｂｐのオーバーラップするＭＹＯ７Ａ配列（図３７）を共有し、配列間のオーバーラップは、エクソン２１と２２の間の分割点で終了する。
一部の実施形態では、オーバーラップするポリヌクレオチド配列は、ｈＭＹＯ７Ａ遺伝子のエクソン２３のいずれの部分も含まない。一部の実施形態では、オーバーラップするポリヌクレオチド配列は、エクソン２３全体（例えば、エクソン２３の１００％）を含まない。一部の実施形態では、オーバーラップするポリヌクレオチド配列は、ｈＭＹＯ７Ａ遺伝子のエクソン１７の部分、エクソン１８全体、エクソン１９全体、エクソン２０全体およびエクソン２１の部分を含む。一部の実施形態では、オーバーラップするポリヌクレオチド配列は、ｈＭＹＯ７Ａ遺伝子のエクソン１７の部分、エクソン１８の部分、エクソン１９の部分、エクソン２０の部分および／またはエクソン２１の部分を含む。本明細書で使用される場合、「部分」は、例えば、エクソンおよび／またはイントロン配列の少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％などを含む場合がある。
一部の実施形態では、第２世代オーバーラップベクターの第１のベクターのコード配列の３’末端に存在するコード配列の部分は、第２世代オーバーラップベクターの第２のベクターのコード配列の５’末端に存在するコード配列の部分と同一であるか、または実質的に同一である。特定の実施形態では、第１および第２のＡＡＶベクターの間の配列オーバーラップは、約１から約５００ヌクレオチドの間、約１００から約２００ヌクレオチドの間、約２００から約３００ヌクレオチドの間または約３００から約４００ヌクレオチドの間である。
特定の実施形態では、第２世代オーバーラップベクターシステムの配列オーバーラップは、約３５０ヌクレオチドである。例示的実施形態では、第２世代オーバーラップベクターシステムの配列オーバーラップは、３６１ヌクレオチドである。特定の実施形態では、オーバーラップするポリヌクレオチド配列は、配列番号３９を含む。特定の実施形態では、コードされるポリペプチドは、野生型または機能的ヒトミオシンＶＩＩａ（ｈＭＹＯ７Ａ）である。野生型および機能的ｈＭＹＯ７Ａポリペプチドのアミノ酸配列ならびにそれらをコードするポリヌクレオチドは、当技術分野で公知である（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０００２５１およびＵ３９２２６．１を参照されたい）。特定の実施形態では、ｈＭＹＯ７Ａポリペプチドは、配列番号６または配列番号８で示されるアミノ酸配列またはその機能的断片または変異体を含む。特定の実施形態では、ｈＭＹＯ７Ａポリペプチドは、配列番号５または配列番号７において示されるヌクレオチド配列によってコードされる。
配列番号５は、ヒトミオシンＶＩＩａポリペプチドをコードするヌクレオチド配列である（タンパク質コード配列は、ヌクレオチド２７３～６９２０である）；
GCTCTGGGCAGGAGAGAGAGTGAGAGACAAGAGACACACACAGAGAGACGGCGAGGAAGGGAAAGACCCAGAGGGACGCCTAGAACGAGACTTGGAGCCAGACAGAGGAAGAGGGGACGTGTGTTTGCAGACTGGCTGGGCCCGTGACCCAGCTTCCTGAGTCCTCCGTGCAGGTGGCAGCTGTACCAGGCTGGCAGGTCACTGAGAGTGGGCAGCTGGGCCCCAGAACTGTGCCTGGCCCAGTGGGCAGCAGGAGCTCCTGACTTGGGACCATGGTGATTCTTCAGCAGGGGGACCATGTGTGGATGGACCTGAGATTGGGGCAGGAGTTCGACGTGCCCATCGGGGCGGTGGTGAAGCTCTGCGACTCTGGGCAGGTCCAGGTGGTGGATGATGAAGACAATGAACACTGGATCTCTCCGCAGAACGCAACGCACATCAAGCCTATGCACCCCACGTCGGTCCACGGCGTGGAGGACATGATCCGCCTGGGGGACCTCAACGAGGCGGGCATCTTGCGCAACCTGCTTATCCGCTACCGGGACCACCTCATCTACACGTATACGGGCTCCATCCTGGTGGCTGTGAACCCCTACCAGCTGCTCTCCATCTACTCGCCAGAGCACATCCGCCAGTATACCAACAAGAAGATTGGGGAGATGCCCCCCCACATCTTTGCCATTGCTGACAACTGCTACTTCAACATGAAACGCAACAGCCGAGACCAGTGCTGCATCATCAGTGGGGAATCTGGGGCCGGGAAGACGGAGAGCACAAAGCTGATCCTGCAGTTCCTGGCAGCCATCAGTGGGCAGCACTCGTGGATTGAGCAGCAGGTCTTGGAGGCCACCCCCATTCTGGAAGCATTTGGGAATGCCAAGACCATCCGCAATGACAACTCAAGCCGTTTCGGAAAGTACATCGACATCCACTTCAACAAGCGGGGCGCCATCGAGGGCGCGAAGATTGAGCAGTACCTGCTGGAAAAGTCACGTGTCTGTCGCCAGGCCCTGGATGAAAGGAACTACCACGTGTTCTACTGCATGCTGGAGGGTATGAGTGAGGATCAGAAGAAGAAGCTGGGCTTGGGCCAGGCCTCTGACTACAACTACTTGGCCATGGGTAACTGCATAACCTGTGAGGGCCGGGTGGACAGCCAGGAGTACGCCAACATCCGCTCCGCCATGAAGGTGCTCATGTTCACTGACACCGAGAACTGGGAGATCTCGAAGCTCCTGGCTGCCATCCTGCACCTGGGCAACCTGCAGTATGAGGCACGCACATTTGAAAACCTGGATGCCTGTGAGGTTCTCTTCTCCCCATCGCTGGCCACAGCTGCATCCCTGCTTGAGGTGAACCCCCCAGACCTGATGAGCTGCCTGACTAGCCGCACCCTCATCACCCGCGGGGAGACGGTGTCCACCCCACTGAGCAGGGAACAGGCACTGGACGTGCGCGACGCCTTCGTAAAGGGGATCTACGGGCGGCTGTTCGTGTGGATTGTGGACAAGATCAACGCAGCAATTTACAAGCCTCCCTCCCAGGATGTGAAGAACTCTCGCAGGTCCATCGGCCTCCTGGACATCTTTGGGTTTGAGAACTTTGCTGTGAACAGCTTTGAGCAGCTCTGCATCAACTTCGCCAATGAGCACCTGCAGCAGTTCTTTGTGCGGCACGTGTTCAAGCTGGAGCAGGAGGAATATGACCTGGAGAGCATTGACTGGCTGCACATCGAGTTCACTGACAACCAGGATGCCCTGGACATGATTGCCAACAAGCCCATGAACATCATCTCCCTCATCGATGAGGAGAGCAAGTTCCCCAAGGGCACAGACACCACCATGTTACACAAGCTGAACTCCCAGCACAAGCTCAACGCCAACTACATCCCCCCCAAGAACAACCATGAGACCCAGTTTGGCATCAACCATTTTGCAGGCATCGTCTACTATGAGACCCAAGGCTTCCTGGAGAAGAACCGAGACACCCTGCATGGGGACATTATCCAGCTGGTCCACTCCTCCAGGAACAAGTTCATCAAGCAGATCTTCCAGGCCGATGTCGCCATGGGCGCCGAGACCAGGAAGCGCTCGCCCACACTTAGCAGCCAGTTCAAGCGGTCACTGGAGCTGCTGATGCGCACGCTGGGTGCCTGCCAGCCCTTCTTTGTGCGATGCATCAAGCCCAATGAGTTCAAGAAGCCCATGCTGTTCGACCGGCACCTGTGCGTGCGCCAGCTGCGGTACTCAGGAATGATGGAGACCATCCGAATCCGCCGAGCTGGCTACCCCATCCGCTACAGCTTCGTAGAGTTTGTGGAGCGGTACCGTGTGCTGCTGCCAGGTGTGAAGCCGGCCTACAAGCAGGGCGACCTCCGCGGGACTTGCCAGCGCATGGCTGAGGCTGTGCTGGGCACCCACGATGACTGGCAGATAGGCAAAACCAAGATCTTTCTGAAGGACCACCATGACATGCTGCTGGAAGTGGAGCGGGACAAAGCCATCACCGACAGAGTCATCCTCCTTCAGAAAGTCATCCGGGGATTCAAAGACAGGTCTAACTTTCTGAAGCTGAAGAACGCTGCCACACTGATCCAGAGGCACTGGCGGGGTCACAACTGTAGGAAGAACTACGGGCTGATGCGTCTGGGCTTCCTGCGGCTGCAGGCCCTGCACCGCTCCCGGAAGCTGCACCAGCAGTACCGCCTGGCCCGCCAGCGCATCATCCAGTTCCAGGCCCGCTGCCGCGCCTATCTGGTGCGCAAGGCCTTCCGCCACCGCCTCTGGGCTGTGCTCACCGTGCAGGCCTATGCCCGGGGCATGATCGCCCGCAGGCTGCACCAACGCCTCAGGGCTGAGTATCTGTGGCGCCTCGAGGCTGAGAAAATGCGGCTGGCGGAGGAAGAGAAGCTTCGGAAGGAGATGAGCGCCAAGAAGGCCAAGGAGGAGGCCGAGCGCAAGCATCAGGAGCGCCTGGCCCAGCTGGCTCGTGAGGACGCTGAGCGGGAGCTGAAGGAGAAGGAGGCCGCTCGGCGGAAGAAGGAGCTCCTGGAGCAGATGGAAAGGGCCCGCCATGAGCCTGTCAATCACTCAGACATGGTGGACAAGATGTTTGGCTTCCTGGGGACTTCAGGTGGCCTGCCAGGCCAGGAGGGCCAGGCACCTAGTGGCTTTGAGGACCTGGAGCGAGGGCGGAGGGAGATGGTGGAGGAGGACCTGGATGCAGCCCTGCCCCTGCCTGACGAGGATGAGGAGGACCTCTCTGAGTATAAATTTGCCAAGTTCGCGGCCACCTACTTCCAGGGGACAACCACGCACTCCTACACCCGGCGGCCACTCAAACAGCCACTGCTCTACCATGACGACGAGGGTGACCAGCTGGCAGCCCTGGCGGTCTGGATCACCATCCTCCGCTTCATGGGGGACCTCCCTGAGCCCAAGTACCACACAGCCATGAGTGATGGCAGTGAGAAGATCCCTGTGATGACCAAGATTTATGAGACCCTGGGCAAGAAGACGTACAAGAGGGAGCTGCAGGCCCTGCAGGGCGAGGGCGAGGCCCAGCTCCCCGAGGGCCAGAAGAAGAGCAGTGTGAGGCACAAGCTGGTGCATTTGACTCTGAAAAAGAAGTCCAAGCTCACAGAGGAGGTGACCAAGAGGCTGCATGACGGGGAGTCCACAGTGCAGGGCAACAGCATGCTGGAGGACCGGCCCACCTCCAACCTGGAGAAGCTGCACTTCATCATCGGCAATGGCATCCTGCGGCCAGCACTCCGGGACGAGATCTACTGCCAGATCAGCAAGCAGCTGACCCACAACCCCTCCAAGAGCAGCTATGCCCGGGGCTGGATTCTCGTGTCTCTCTGCGTGGGCTGTTTCGCCCCCTCCGAGAAGTTTGTCAAGTACCTGCGGAACTTCATCCACGGGGGCCCGCCCGGCTACGCCCCGTACTGTGAGGAGCGCCTGAGAAGGACCTTTGTCAATGGGACACGGACACAGCCGCCCAGCTGGCTGGAGCTGCAGGCCACCAAGTCCAAGAAGCCAATCATGTTGCCCGTGACATTCATGGATGGGACCACCAAGACCCTGCTGACGGACTCGGCAACCACGGCCAAGGAGCTCTGCAACGCGCTGGCCGACAAGATCTCTCTCAAGGACCGGTTCGGGTTCTCCCTCTACATTGCCCTGTTTGACAAGGTGTCCTCCCTGGGCAGCGGCAGTGACCACGTCATGGACGCCATCTCCCAGTGCGAGCAGTACGCCAAGGAGCAGGGCGCCCAGGAGCGCAACGCCCCCTGGAGGCTCTTCTTCCGCAAAGAGGTCTTCACGCCCTGGCACAGCCCCTCCGAGGACAACGTGGCCACCAACCTCATCTACCAGCAGGTGGTGCGAGGAGTCAAGTTTGGGGAGTACAGGTGTGAGAAGGAGGACGACCTGGCTGAGCTGGCCTCCCAGCAGTACTTTGTAGACTATGGCTCTGAGATGATCCTGGAGCGCCTCCTGAACCTCGTGCCCACCTACATCCCCGACCGCGAGATCACGCCCCTGAAGACGCTGGAGAAGTGGGCCCAGCTGGCCATCGCCGCCCACAAGAAGGGGATTTATGCCCAGAGGAGAACTGATGCCCAGAAGGTCAAAGAGGATGTGGTCAGTTATGCCCGCTTCAAGTGGCCCTTGCTCTTCTCCAGGTTTTATGAAGCCTACAAATTCTCAGGCCCCAGTCTCCCCAAGAACGACGTCATCGTGGCCGTCAACTGGACGGGTGTGTACTTTGTGGATGAGCAGGAGCAGGTACTTCTGGAGCTGTCCTTCCCAGAGATCATGGCCGTGTCCAGCAGCAGGGAGTGCCGTGTCTGGCTCTCACTGGGCTGCTCTGATCTTGGCTGTGCTGCGCCTCACTCAGGCTGGGCAGGACTGACCCCGGCGGGGCCCTGTTCTCCGTGTTGGTCCTGCAGGGGAGCGAAAACGACGGCCCCCAGCTTCACGCTGGCCACCATCAAGGGGGACGAATACACCTTCACCTCCAGTAATGCTGAGGACATTCGTGACCTGGTGGTCACCTTCCTAGAGGGGCTCCGGAAGAGATCTAAGTATGTTGTGGCCCTGCAGGATAACCCCAACCCCGCAGGCGAGGAGTCAGGCTTCCTCAGCTTTGCCAAGGGAGACCTCATCATCCTGGACCATGACACGGGCGAGCAGGTCATGAACTCGGGCTGGGCCAACGGCATCAATGAGAGGACCAAGCAGCGTGGGGACTTCCCCACCGACTGTGTGTACGTCATGCCCACTGTCACCATGCCACCGCGGGAGATTGTGGCCCTGGTCACCATGACTCCCGATCAGAGGCAGGACGTTGTCCGGCTCTTGCAGCTGCGAACGGCGGAGCCCGAGGTGCGTGCCAAGCCCTACACGCTGGAGGAGTTTTCCTATGACTACTTCAGGCCCCCACCCAAGCACACGCTGAGCCGTGTCATGGTGTCCAAGGCCCGAGGCAAGGACCGGCTGTGGAGCCACACGCGGGAACCGCTCAAGCAGGCGCTGCTCAAGAAGCTCCTGGGCAGTGAGGAGCTCTCGCAGGAGGCCTGCCTGGCCTTCATTGCTGTGCTCAAGTACATGGGCGACTACCCGTCCAAGAGGACACGCTCCGTCAACGAGCTCACCGACCAGATCTTTGAGGGTCCCCTGAAAGCCGAGCCCCTGAAGGACGAGGCATATGTGCAGATCCTGAAGCAGCTGACCGACAACCACATCAGGTACAGCGAGGAGCGGGGTTGGGAGCTGCTCTGGCTGTGCACGGGCCTTTTCCCACCCAGCAACATCCTCCTGCCCCACGTGCAGCGCTTCCTGCAGTCCCGAAAGCACTGCCCACTCGCCATCGACTGCCTGCAACGGCTCCAGAAAGCCCTGAGAAACGGGTCCCGGAAGTACCCTCCGCACCTGGTGGAGGTGGAGGCCATCCAGCACAAGACCACCCAGATTTTCCACAAGGTCTACTTCCCTGATGACACTGACGAGGCCTTCGAAGTGGAGTCCAGCACCAAGGCCAAGGACTTCTGCCAGAACATCGCCACCAGGCTGCTCCTCAAGTCCTCAGAGGGATTCAGCCTCTTTGTCAAAATTGCAGACAAGGTCATCAGCGTTCCTGAGAATGACTTCTTCTTTGACTTTGTTCGACACTTGACAGACTGGATAAAGAAAGCTCGGCCCATCAAGGACGGAATTGTGCCCTCACTCACCTACCAGGTGTTCTTCATGAAGAAGCTGTGGACCACCACGGTGCCAGGGAAGGATCCCATGGCCGATTCCATCTTCCACTATTACCAGGAGTTGCCCAAGTATCTCCGAGGCTACCACAAGTGCACGCGGGAGGAGGTGCTGCAGCTGGGGGCGCTGATCTACAGGGTCAAGTTCGAGGAGGACAAGTCCTACTTCCCCAGCATCCCCAAGCTGCTGCGGGAGCTGGTGCCCCAGGACCTTATCCGGCAGGTCTCACCTGATGACTGGAAGCGGTCCATCGTCGCCTACTTCAACAAGCACGCAGGGAAGTCCAAGGAGGAGGCCAAGCTGGCCTTCCTGAAGCTCATCTTCAAGTGGCCCACCTTTGGCTCAGCCTTCTTCGAGGTGAAGCAAACTACGGAGCCAAACTTCCCTGAGATCCTCCTAATTGCCATCAACAAGTATGGGGTCAGCCTCATCGATCCCAAAACGAAGGATATCCTCACCACTCATCCCTTCACCAAGATCTCCAACTGGAGCAGCGGCAACACCTACTTCCACATCACCATTGGGAACTTGGTGCGCGGGAGCAAACTGCTCTGCGAGACGTCACTGGGCTACAAGATGGATGACCTCCTGACTTCCTACATTAGCCAGATGCTCACAGCCATGAGCAAACAGCGGGGCTCCAGGAGCGGCAAGTGAACAGTCACGGGGAGGTGCTGGTTCCATGCCTGCTCTCGAGGCAGCAGTGGGTTCAGGCCCATCAGCTACCCCTGCAGCTGGGGAAGACTTATGCCATCCCGGCAGCGAGGCTGGGCTGGCCAGCCACCACTGACTATACCAACTGGGCCTCTGATGTTCTTCCAGTGAGGCATCTCTCTGGGATGCAGAACTTCCCTCCATCCACCCCTCTGGCACCTGGGTTGGTCTAATCCTAGTTTGCTGTGGCCTTCCCGGTTGTGAGAGCCTGTGATCCTTAGATGTGTCTCCTGTTTCAGACCAGCCCCACCATGCAACTTCCTTTGACTTTCTGTGTACCACTGGGATAGAGGAATCAAGAGGACAATCTAGCTCTCCATACTTTGAACAACCAAATGTGCATTGAATACTCTGAAACCGAAGGGACTGGATCTGCAGGTGGGATGAGGGAGACAGACCACTTTTCTATATTGCAGTGTGAATGCTGGGCCCCTGCTCAAGTCTACCCTGATCACCTCAGGGCATAAAGCATGTTTCATTCTCTGAAA
配列番号６は、配列番号５のヌクレオチド２７３～６９２０によってコードされるヒトミオシンＶＩＩａポリペプチドのアミノ酸配列である；
MVILQQGDHVWMDLRLGQEFDVPIGAVVKLCDSGQVQVVDDEDNEHWISPQNATHIKPMHPTSVHGVEDMIRLGDLNEAGILRNLLIRYRDHLIYTYTGSILVAVNPYQLLSIYSPEHIRQYTNKKIGEMPPHIFAIADNCYFNMKRNSRDQCCIISGESGAGKTESTKLILQFLAAISGQHSWIEQQVLEATPILEAFGNAKTIRNDNSSRFGKYIDIHFNKRGAIEGAKIEQYLLEKSRVCRQALDERNYHVFYCMLEGMSEDQKKKLGLGQASDYNYLAMGNCITCEGRVDSQEYANIRSAMKVLMFTDTENWEISKLLAAILHLGNLQYEARTFENLDACEVLFSPSLATAASLLEVNPPDLMSCLTSRTLITRGETVSTPLSREQALDVRDAFVKGIYGRLFVWIVDKINAAIYKPPSQDVKNSRRSIGLLDIFGFENFAVNSFEQLCINFANEHLQQFFVRHVFKLEQEEYDLESIDWLHIEFTDNQDALDMIANKPMNIISLIDEESKFPKGTDTTMLHKLNSQHKLNANYIPPKNNHETQFGINHFAGIVYYETQGFLEKNRDTLHGDIIQLVHSSRNKFIKQIFQADVAMGAETRKRSPTLSSQFKRSLELLMRTLGACQPFFVRCIKPNEFKKPMLFDRHLCVRQLRYSGMMETIRIRRAGYPIRYSFVEFVERYRVLLPGVKPAYKQGDLRGTCQRMAEAVLGTHDDWQIGKTKIFLKDHHDMLLEVERDKAITDRVILLQKVIRGFKDRSNFLKLKNAATLIQRHWRGHNCRKNYGLMRLGFLRLQALHRSRKLHQQYRLARQRIIQFQARCRAYLVRKAFRHRLWAVLTVQAYARGMIARRLHQRLRAEYLWRLEAEKMRLAEEEKLRKEMSAKKAKEEAERKHQERLAQLAREDAERELKEKEAARRKKELLEQMERARHEPVNHSDMVDKMFGFLGTSGGLPGQEGQAPSGFEDLERGRREMVEEDLDAALPLPDEDEEDLSEYKFAKFAATYFQGTTTHSYTRRPLKQPLLYHDDEGDQLAALAVWITILRFMGDLPEPKYHTAMSDGSEKIPVMTKIYETLGKKTYKRELQALQGEGEAQLPEGQKKSSVRHKLVHLTLKKKSKLTEEVTKRLHDGESTVQGNSMLEDRPTSNLEKLHFIIGNGILRPALRDEIYCQISKQLTHNPSKSSYARGWILVSLCVGCFAPSEKFVKYLRNFIHGGPPGYAPYCEERLRRTFVNGTRTQPPSWLELQATKSKKPIMLPVTFMDGTTKTLLTDSATTAKELCNALADKISLKDRFGFSLYIALFDKVSSLGSGSDHVMDAISQCEQYAKEQGAQERNAPWRLFFRKEVFTPWHSPSEDNVATNLIYQQVVRGVKFGEYRCEKEDDLAELASQQYFVDYGSEMILERLLNLVPTYIPDREITPLKTLEKWAQLAIAAHKKGIYAQRRTDAQKVKEDVVSYARFKWPLLFSRFYEAYKFSGPSLPKNDVIVAVNWTGVYFVDEQEQVLLELSFPEIMAVSSSRECRVWLSLGCSDLGCAAPHSGWAGLTPAGPCSPCWSCRGAKTTAPSFTLATIKGDEYTFTSSNAEDIRDLVVTFLEGLRKRSKYVVALQDNPNPAGEESGFLSFAKGDLIILDHDTGEQVMNSGWANGINERTKQRGDFPTDCVYVMPTVTMPPREIVALVTMTPDQRQDVVRLLQLRTAEPEVRAKPYTLEEFSYDYFRPPPKHTLSRVMVSKARGKDRLWSHTREPLKQALLKKLLGSEELSQEACLAFIAVLKYMGDYPSKRTRSVNELTDQIFEGPLKAEPLKDEAYVQILKQLTDNHIRYSEERGWELLWLCTGLFPPSNILLPHVQRFLQSRKHCPLAIDCLQRLQKALRNGSRKYPPHLVEVEAIQHKTTQIFHKVYFPDDTDEAFEVESSTKAKDFCQNIATRLLLKSSEGFSLFVKIADKVISVPENDFFFDFVRHLTDWIKKARPIKDGIVPSLTYQVFFMKKLWTTTVPGKDPMADSIFHYYQELPKYLRGYHKCTREEVLQLGALIYRVKFEEDKSYFPSIPKLLRELVPQDLIRQVSPDDWKRSIVAYFNKHAGKSKEEAKLAFLKLIFKWPTFGSAFFEVKQTTEPNFPEILLIAINKYGVSLIDPKTKDILTTHPFTKISNWSSGNTYFHITIGNLVRGSKLLCETSLGYKMDDLLTSYISQMLTAMSKQRGSRSGK
配列番号７は、ヒトミオシンＶＩＩａポリペプチドをコードするヌクレオチド配列である；
ATGGTGATTCTTCAGCAGGGGGACCATGTGTGGATGGACCTGAGATTGGGGCAGGAGTTCGACGTGCCCATCGGGGCGGTGGTGAAGCTCTGCGACTCTGGGCAGGTCCAGGTGGTGGATGATGAAGACAATGAACACTGGATCTCTCCGCAGAACGCAACGCACATCAAGCCTATGCACCCCACGTCGGTCCACGGCGTGGAGGACATGATCCGCCTGGGGGACCTCAACGAGGCGGGCATCTTGCGCAACCTGCTTATCCGCTACCGGGACCACCTCATCTACACGTATACGGGCTCCATCCTGGTGGCTGTGAACCCCTACCAGCTGCTCTCCATCTACTCGCCAGAGCACATCCGCCAGTATACCAACAAGAAGATTGGGGAGATGCCCCCCCACATCTTTGCCATTGCTGACAACTGCTACTTCAACATGAAACGCAACAGCCGAGACCAGTGCTGCATCATCAGTGGGGAATCTGGGGCCGGGAAGACGGAGAGCACAAAGCTGATCCTGCAGTTCCTGGCAGCCATCAGTGGGCAGCACTCGTGGATTGAGCAGCAGGTCTTGGAGGCCACCCCCATTCTGGAAGCATTTGGGAATGCCAAGACCATCCGCAATGACAACTCAAGCCGTTTCGGAAAGTACATCGACATCCACTTCAACAAGCGGGGCGCCATCGAGGGCGCGAAGATTGAGCAGTACCTGCTGGAAAAGTCACGTGTCTGTCGCCAGGCCCTGGATGAAAGGAACTACCACGTGTTCTACTGCATGCTGGAGGGTATGAGTGAGGATCAGAAGAAGAAGCTGGGCTTGGGCCAGGCCTCTGACTACAACTACTTGGCCATGGGTAACTGCATAACCTGTGAGGGCCGGGTGGACAGCCAGGAGTACGCCAACATCCGCTCCGCCATGAAGGTGCTCATGTTCACTGACACCGAGAACTGGGAGATCTCGAAGCTCCTGGCTGCCATCCTGCACCTGGGCAACCTGCAGTATGAGGCACGCACATTTGAAAACCTGGATGCCTGTGAGGTTCTCTTCTCCCCATCGCTGGCCACAGCTGCATCCCTGCTTGAGGTGAACCCCCCAGACCTGATGAGCTGCCTGACTAGCCGCACCCTCATCACCCGCGGGGAGACGGTGTCCACCCCACTGAGCAGGGAACAGGCACTGGACGTGCGCGACGCCTTCGTAAAGGGGATCTACGGGCGGCTGTTCGTGTGGATTGTGGACAAGATCAACGCAGCAATTTACAAGCCTCCCTCCCAGGATGTGAAGAACTCTCGCAGGTCCATCGGCCTCCTGGACATCTTTGGGTTTGAGAACTTTGCTGTGAACAGCTTTGAGCAGCTCTGCATCAACTTCGCCAATGAGCACCTGCAGCAGTTCTTTGTGCGGCACGTGTTCAAGCTGGAGCAGGAGGAATATGACCTGGAGAGCATTGACTGGCTGCACATCGAGTTCACTGACAACCAGGATGCCCTGGACATGATTGCCAACAAGCCCATGAACATCATCTCCCTCATCGATGAGGAGAGCAAGTTCCCCAAGGGCACAGACACCACCATGTTACACAAGCTGAACTCCCAGCACAAGCTCAACGCCAACTACATCCCCCCCAAGAACAACCATGAGACCCAGTTTGGCATCAACCATTTTGCAGGCATCGTCTACTATGAGACCCAAGGCTTCCTGGAGAAGAACCGAGACACCCTGCATGGGGACATTATCCAGCTGGTCCACTCCTCCAGGAACAAGTTCATCAAGCAGATCTTCCAGGCCGATGTCGCCATGGGCGCCGAGACCAGGAAGCGCTCGCCCACACTTAGCAGCCAGTTCAAGCGGTCACTGGAGCTGCTGATGCGCACGCTGGGTGCCTGCCAGCCCTTCTTTGTGCGATGCATCAAGCCCAATGAGTTCAAGAAGCCCATGCTGTTCGACCGGCACCTGTGCGTGCGCCAGCTGCGGTACTCAGGAATGATGGAGACCATCCGAATCCGCCGAGCTGGCTACCCCATCCGCTACAGCTTCGTAGAGTTTGTGGAGCGGTACCGTGTGCTGCTGCCAGGTGTGAAGCCGGCCTACAAGCAGGGCGACCTCCGCGGGACTTGCCAGCGCATGGCTGAGGCTGTGCTGGGCACCCACGATGACTGGCAGATAGGCAAAACCAAGATCTTTCTGAAGGACCACCATGACATGCTGCTGGAAGTGGAGCGGGACAAAGCCATCACCGACAGAGTCATCCTCCTTCAGAAAGTCATCCGGGGATTCAAAGACAGGTCTAACTTTCTGAAGCTGAAGAACGCTGCCACACTGATCCAGAGGCACTGGCGGGGTCACAACTGTAGGAAGAACTACGGGCTGATGCGTCTGGGCTTCCTGCGGCTGCAGGCCCTGCACCGCTCCCGGAAGCTGCACCAGCAGTACCGCCTGGCCCGCCAGCGCATCATCCAGTTCCAGGCCCGCTGCCGCGCCTATCTGGTGCGCAAGGCCTTCCGCCACCGCCTCTGGGCTGTGCTCACCGTGCAGGCCTATGCCCGGGGCATGATCGCCCGCAGGCTGCACCAACGCCTCAGGGCTGAGTATCTGTGGCGCCTCGAGGCTGAGAAAATGCGGCTGGCGGAGGAAGAGAAGCTTCGGAAGGAGATGAGCGCCAAGAAGGCCAAGGAGGAGGCCGAGCGCAAGCATCAGGAGCGCCTGGCCCAGCTGGCTCGTGAGGACGCTGAGCGGGAGCTGAAGGAGAAGGAGGCCGCTCGGCGGAAGAAGGAGCTCCTGGAGCAGATGGAAAGGGCCCGCCATGAGCCTGTCAATCACTCAGACATGGTGGACAAGATGTTTGGCTTCCTGGGGACTTCAGGTGGCCTGCCAGGCCAGGAGGGCCAGGCACCTAGTGGCTTTGAGGACCTGGAGCGAGGGCGGAGGGAGATGGTGGAGGAGGACCTGGATGCAGCCCTGCCCCTGCCTGACGAGGATGAGGAGGACCTCTCTGAGTATAAATTTGCCAAGTTCGCGGCCACCTACTTCCAGGGGACAACCACGCACTCCTACACCCGGCGGCCACTCAAACAGCCACTGCTCTACCATGACGACGAGGGTGACCAGCTGGCAGCCCTGGCGGTCTGGATCACCATCCTCCGCTTCATGGGGGACCTCCCTGAGCCCAAGTACCACACAGCCATGAGTGATGGCAGTGAGAAGATCCCTGTGATGACCAAGATTTATGAGACCCTGGGCAAGAAGACGTACAAGAGGGAGCTGCAGGCCCTGCAGGGCGAGGGCGAGGCCCAGCTCCCCGAGGGCCAGAAGAAGAGCAGTGTGAGGCACAAGCTGGTGCATTTGACTCTGAAAAAGAAGTCCAAGCTCACAGAGGAGGTGACCAAGAGGCTGCATGACGGGGAGTCCACAGTGCAGGGCAACAGCATGCTGGAGGACCGGCCCACCTCCAACCTGGAGAAGCTGCACTTCATCATCGGCAATGGCATCCTGCGGCCAGCACTCCGGGACGAGATCTACTGCCAGATCAGCAAGCAGCTGACCCACAACCCCTCCAAGAGCAGCTATGCCCGGGGCTGGATTCTCGTGTCTCTCTGCGTGGGCTGTTTCGCCCCCTCCGAGAAGTTTGTCAAGTACCTGCGGAACTTCATCCACGGGGGCCCGCCCGGCTACGCCCCGTACTGTGAGGAGCGCCTGAGAAGGACCTTTGTCAATGGGACACGGACACAGCCGCCCAGCTGGCTGGAGCTGCAGGCCACCAAGTCCAAGAAGCCAATCATGTTGCCCGTGACATTCATGGATGGGACCACCAAGACCCTGCTGACGGACTCGGCAACCACGGCCAAGGAGCTCTGCAACGCGCTGGCCGACAAGATCTCTCTCAAGGACCGGTTCGGGTTCTCCCTCTACATTGCCCTGTTTGACAAGGTGTCCTCCCTGGGCAGCGGCAGTGACCACGTCATGGACGCCATCTCCCAGTGCGAGCAGTACGCCAAGGAGCAGGGCGCCCAGGAGCGCAACGCCCCCTGGAGGCTCTTCTTCCGCAAAGAGGTCTTCACGCCCTGGCACAGCCCCTCCGAGGACAACGTGGCCACCAACCTCATCTACCAGCAGGTGGTGCGAGGAGTCAAGTTTGGGGAGTACAGGTGTGAGAAGGAGGACGACCTGGCTGAGCTGGCCTCCCAGCAGTACTTTGTAGACTATGGCTCTGAGATGATCCTGGAGCGCCTCCTGAACCTCGTGCCCACCTACATCCCCGACCGCGAGATCACGCCCCTGAAGACGCTGGAGAAGTGGGCCCAGCTGGCCATCGCCGCCCACAAGAAGGGGATTTATGCCCAGAGGAGAACTGATGCCCAGAAGGTCAAAGAGGATGTGGTCAGTTATGCCCGCTTCAAGTGGCCCTTGCTCTTCTCCAGGTTTTATGAAGCCTACAAATTCTCAGGCCCCAGTCTCCCCAAGAACGACGTCATCGTGGCCGTCAACTGGACGGGTGTGTACTTTGTGGATGAGCAGGAGCAGGTACTTCTGGAGCTGTCCTTCCCAGAGATCATGGCCGTGTCCAGCAGCAGGGAGTGCCGTGTCTGGCTCTCACTGGGCTGCTCTGATCTTGGCTGTGCTGCGCCTCACTCAGGCTGGGCAGGACTGACCCCGGCGGGGCCCTGTTCTCCGTGTTGGTCCTGCAGGGGAGCGAAAACGACGGCCCCCAGCTTCACGCTGGCCACCATCAAGGGGGACGAATACACCTTCACCTCCAGTAATGCTGAGGACATTCGTGACCTGGTGGTCACCTTCCTAGAGGGGCTCCGGAAGAGATCTAAGTATGTTGTGGCCCTGCAGGATAACCCCAACCCCGCAGGCGAGGAGTCAGGCTTCCTCAGCTTTGCCAAGGGAGACCTCATCATCCTGGACCATGACACGGGCGAGCAGGTCATGAACTCGGGCTGGGCCAACGGCATCAATGAGAGGACCAAGCAGCGTGGGGACTTCCCCACCGACTGTGTGTACGTCATGCCCACTGTCACCATGCCACCGCGGGAGATTGTGGCCCTGGTCACCATGACTCCCGATCAGAGGCAGGACGTTGTCCGGCTCTTGCAGCTGCGAACGGCGGAGCCCGAGGTGCGTGCCAAGCCCTACACGCTGGAGGAGTTTTCCTATGACTACTTCAGGCCCCCACCCAAGCACACGCTGAGCCGTGTCATGGTGTCCAAGGCCCGAGGCAAGGACCGGCTGTGGAGCCACACGCGGGAACCGCTCAAGCAGGCGCTGCTCAAGAAGCTCCTGGGCAGTGAGGAGCTCTCGCAGGAGGCCTGCCTGGCCTTCATTGCTGTGCTCAAGTACATGGGCGACTACCCGTCCAAGAGGACACGCTCCGTCAACGAGCTCACCGACCAGATCTTTGAGGGTCCCCTGAAAGCCGAGCCCCTGAAGGACGAGGCATATGTGCAGATCCTGAAGCAGCTGACCGACAACCACATCAGGTACAGCGAGGAGCGGGGTTGGGAGCTGCTCTGGCTGTGCACGGGCCTTTTCCCACCCAGCAACATCCTCCTGCCCCACGTGCAGCGCTTCCTGCAGTCCCGAAAGCACTGCCCACTCGCCATCGACTGCCTGCAACGGCTCCAGAAAGCCCTGAGAAACGGGTCCCGGAAGTACCCTCCGCACCTGGTGGAGGTGGAGGCCATCCAGCACAAGACCACCCAGATTTTCCACAAGGTCTACTTCCCTGATGACACTGACGAGGCCTTCGAAGTGGAGTCCAGCACCAAGGCCAAGGACTTCTGCCAGAACATCGCCACCAGGCTGCTCCTCAAGTCCTCAGAGGGATTCAGCCTCTTTGTCAAAATTGCAGACAAGGTCATCAGCGTTCCTGAGAATGACTTCTTCTTTGACTTTGTTCGACACTTGACAGACTGGATAAAGAAAGCTCGGCCCATCAAGGACGGAATTGTGCCCTCACTCACCTACCAGGTGTTCTTCATGAAGAAGCTGTGGACCACCACGGTGCCAGGGAAGGATCCCATGGCCGATTCCATCTTCCACTATTACCAGGAGTTGCCCAAGTATCTCCGAGGCTACCACAAGTGCACGCGGGAGGAGGTGCTGCAGCTGGGGGCGCTGATCTACAGGGTCAAGTTCGAGGAGGACAAGTCCTACTTCCCCAGCATCCCCAAGCTGCTGCGGGAGCTGGTGCCCCAGGACCTTATCCGGCAGGTCTCACCTGATGACTGGAAGCGGTCCATCGTCGCCTACTTCAACAAGCACGCAGGGAAGTCCAAGGAGGAGGCCAAGCTGGCCTTCCTGAAGCTCATCTTCAAGTGGCCCACCTTTGGCTCAGCCTTCTTCGAGGTGAAGCAAACTACGGAGCCAAACTTCCCTGAGATCCTCCTAATTGCCATCAACAAGTATGGGGTCAGCCTCATCGATCCCAAAACGAAGGATATCCTCACCACTCATCCCTTCACCAAGATCTCCAACTGGAGCAGCGGCAACACCTACTTCCACATCACCATTGGGAACTTGGTGCGCGGGAGCAAACTGCTCTGCGAGACGTCACTGGGCTACAAGATGGATGACCTCCTGACTTCCTACATTAGCCAGATGCTCACAGCCATGAGCAAACAGCGGGGCTCCAGGAGCGGCAAGTGA
配列番号８は、ヒトミオシンＶＩＩａポリペプチド（アイソフォーム２）のアミノ酸配列である；
MVILQQGDHVWMDLRLGQEFDVPIGAVVKLCDSGQVQVVDDEDNEHWISPQNATHIKPMHPTSVHGVEDMIRLGDLNEAGILRNLLIRYRDHLIYTYTGSILVAVNPYQLLSIYSPEHIRQYTNKKIGEMPPHIFAIADNCYFNMKRNSRDQCCIISGESGAGKTESTKLILQFLAAISGQHSWIEQQVLEATPILEAFGNAKTIRNDNSSRFGKYIDIHFNKRGAIEGAKIEQYLLEKSRVCRQALDERNYHVFYCMLEGMSEDQKKKLGLGQASDYNYLAMGNCITCEGRVDSQEYANIRSAMKVLMFTDTENWEISKLLAAILHLGNLQYEARTFENLDACEVLFSPSLATAASLLEVNPPDLMSCLTSRTLITRGETVSTPLSREQALDVRDAFVKGIYGRLFVWIVDKINAAIYKPPSQDVKNSRRSIGLLDIFGFENFAVNSFEQLCINFANEHLQQFFVRHVFKLEQEEYDLESIDWLHIEFTDNQDALDMIANKPMNIISLIDEESKFPKGTDTTMLHKLNSQHKLNANYIPPKNNHETQFGINHFAGIVYYETQGFLEKNRDTLHGDIIQLVHSSRNKFIKQIFQADVAMGAETRKRSPTLSSQFKRSLELLMRTLGACQPFFVRCIKPNEFKKPMLFDRHLCVRQLRYSGMMETIRIRRAGYPIRYSFVEFVERYRVLLPGVKPAYKQGDLRGTCQRMAEAVLGTHDDWQIGKTKIFLKDHHDMLLEVERDKAITDRVILLQKVIRGFKDRSNFLKLKNAATLIQRHWRGHNCRKNYGLMRLGFLRLQALHRSRKLHQQYRLARQRIIQFQARCRAYLVRKAFRHRLWAVLTVQAYARGMIARRLHQRLRAEYLWRLEAEKMRLAEEEKLRKEMSAKKAKEEAERKHQERLAQLAREDAERELKEKEAARRKKELLEQMERARHEPVNHSDMVDKMFGFLGTSGGLPGQEGQAPSGFEDLERGRREMVEEDLDAALPLPDEDEEDLSEYKFAKFAATYFQGTTTHSYTRRPLKQPLLYHDDEGDQLAALAVWITILRFMGDLPEPKYHTAMSDGSEKIPVMTKIYETLGKKTYKRELQALQGEGEAQLPEGQKKSSVRHKLVHLTLKKKSKLTEEVTKRLHDGESTVQGNSMLEDRPTSNLEKLHFIIGNGILRPALRDEIYCQISKQLTHNPSKSSYARGWILVSLCVGCFAPSEKFVKYLRNFIHGGPPGYAPYCEERLRRTFVNGTRTQPPSWLELQATKSKKPIMLPVTFMDGTTKTLLTDSATTAKELCNALADKISLKDRFGFSLYIALFDKVSSLGSGSDHVMDAISQCEQYAKEQGAQERNAPWRLFFRKEVFTPWHSPSEDNVATNLIYQQVVRGVKFGEYRCEKEDDLAELASQQYFVDYGSEMILERLLNLVPTYIPDREITPLKTLEKWAQLAIAAHKKGIYAQRRTDAQKVKEDVVSYARFKWPLLFSRFYEAYKFSGPSLPKNDVIVAVNWTGVYFVDEQEQVLLELSFPEIMAVSSSRGAKTTAPSFTLATIKGDEYTFTSSNAEDIRDLVVTFLEGLRKRSKYVVALQDNPNPAGEESGFLSFAKGDLIILDHDTGEQVMNSGWANGINERTKQRGDFPTDSVYVMPTVTMPPREIVALVTMTPDQRQDVVRLLQLRTAEPEVRAKPYTLEEFSYDYFRPPPKHTLSRVMVSKARGKDRLWSHTREPLKQALLKKLLGSEELSQEACLAFIAVLKYMGDYPSKRTRSVNELTDQIFEGPLKAEPLKDEAYVQILKQLTDNHIRYSEERGWELLWLCTGLFPPSNILLPHVQRFLQSRKHCPLAIDCLQRLQKALRNGSRKYPPHLVEVEAIQHKTTQIFHKVYFPDDTDEAFEVESSTKAKDFCQNIATRLLLKSSEGFSLFVKIADKVLSVPENDFFFDFVRHLTDWIKKARPIKDGIVPSLTYQVFFMKKLWTTTVPGKDPMADSIFHYYQELPKYLRGYHKCTREEVLQLGALIYRVKFEEDKSYFPSIPKLLRELVPQDLIRQVSPDDWKRSIVAYFNKHAGKSKEEAKLAFLKLIFKWPTFGSAFFEQTTEPNFPEILLIAINKYGVSLIDPKTKDILTTHPFTKISNWSSGNTYFHITIGNLVRGSKLLCETSLGYKMDDLLTSYISQMLTAMSKQRGSRSGK
ＣＭｖｌオーバーラップベクターシステム
一部の実施形態は、ＭＹＯ７Ａ部分コード配列の下流で、３’ＡＡＶ逆方向末端反復配列の前の３’非翻訳領域において１または複数の置換が行われた本明細書において記載されるようなオーバーラップするベクターシステムを企図する。一部の実施形態では、これらの置換は、潜在的な（または推定）インフレーム停止コドンを除去するように意図される。一部の実施形態では、これらの置換は、非コード配列中の１つまたは複数の推定停止コドンを除去する。特定の実施形態では、置換は、ポリペプチドのＣ末端部分をコードする部分コード配列と、第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドの３’ＡＡＶ逆方向末端反復配列の間の３’非翻訳領域（例えば、ＭＹＯ７Ａ Ｎ末端断片の下流）中の１つまたは複数の推定停止コドンを除去する。一部の実施形態では、１つまたは複数の推定停止コドンが除去され、「スタッファー」配列と置き換えられている（図４３を参照されたい）。一部の実施形態では、第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチドは、したがって、選択された全長ポリペプチドのシングル－アルファヘリックス（ＳＡＨ）ドメインをコードしない部分コード配列を含む。
これらの置換の結果として、配列番号３６を含むヌクレオチド配列を有するフロントハーフベクターが作出される。このような実施形態では、本開示のオーバーラップベクターシステムは、
（ｉ）ポリヌクレオチドの各末端に逆方向末端反復配列、逆方向末端反復配列の間に、プロモーター、続いて、選択された全長ポリペプチドのＮ末端部分をコードする部分コード配列を含む第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチド、ならびに
（ｉｉ）ポリヌクレオチドの各末端に逆方向末端反復配列、逆方向末端反復配列の間に、選択された全長ポリペプチドのＣ末端部分をコードする部分コード配列を含む第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチド
を含む場合がある。一部の実施形態では、第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドに、ポリアデニル化（ｐＡ）シグナル配列が続く。第１および第２のベクター中のコード配列は、組み合わされると、選択された全長ポリペプチドまたはその機能的断片または変異体をコードする。第１および第２のＡＡＶベクター中のポリペプチドをコードする配列は、オーバーラップする配列を含む。
一部の実施形態では、選択された全長ポリペプチド（例えば、ミオシンポリペプチド）のＣ末端部分は、選択された全長ポリペプチドのシングル－アルファヘリックス（ＳＡＨ）ドメインを含む。
一部の実施形態では、オーバーラップするポリヌクレオチド配列は、配列番号３９を含む。特定の実施形態では、第１および第２のＡＡＶベクターの間の配列オーバーラップは、約１から約５００ヌクレオチドの間、約１００から約２００ヌクレオチドの間、約２００から約３００ヌクレオチドの間または約３００から約４００ヌクレオチドの間である。特定の実施形態では、第２世代オーバーラップベクターシステムの配列オーバーラップは、約３５０ヌクレオチドである。例示的実施形態では、第２世代オーバーラップベクターシステムの配列オーバーラップは、３６１ヌクレオチドである。
一部の実施形態では、オーバーラップするポリヌクレオチド配列は、ｈＭＹＯ７Ａ遺伝子のエクソン２３のいずれの部分も含まない。一部の実施形態では、オーバーラップするポリヌクレオチド配列は、エクソン２３全体（例えば、エクソン２３の１００％）を含まない。一部の実施形態では、オーバーラップするポリヌクレオチド配列は、ｈＭＹＯ７Ａ遺伝子のエクソン１７の部分、エクソン１８全体、エクソン１９全体、エクソン２０全体およびエクソン２１の部分を含む。一部の実施形態では、オーバーラップするポリヌクレオチド配列は、ｈＭＹＯ７Ａ遺伝子のエクソン１７の部分、エクソン１８の部分、エクソン１９の部分、エクソン２０の部分および／またはエクソン２１の部分を含む。本明細書で使用される場合、「部分」は、例えば、エクソンおよび／またはイントロンの少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％などを含む場合がある。
例示的実施形態では、第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチドは、配列番号３６のヌクレオチド配列またはその機能的断片および／または変異体を含み、第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドは、配列番号３８のヌクレオチド配列またはその機能的断片および／または変異体を含む。
一部の実施形態では、第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチドは、選択された全長（例えば、ミオシン）ポリペプチドのシングル－アルファヘリックス（ＳＡＨ）ドメインをコードしない部分コード配列を含む。一部の実施形態では、第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドに、ポリアデニル化（ｐＡ）シグナル配列が続く。
一部の実施形態では、本開示において記載されるオーバーラップポリヌクレオチドベクターシステムの任意のベクターを、非経口投与、例えば、静脈内、筋肉内、眼球内、鼻腔内などによって投与できる。ベクターは、インビボ、インビトロまたはエキソビボで投与できる。
一部の実施形態では、本明細書において記載されるオーバーラップポリヌクレオチドベクターシステムの任意のベクターを、眼に投与できる。特定の実施形態では、ベクターは、網膜下注射によって対象の眼に投与される。一部の実施形態では、本明細書において記載されるハイブリッドポリヌクレオチドベクターシステムの任意のベクターを、耳に投与できる。一部の実施形態では、本明細書において記載されるハイブリッドポリヌクレオチドベクターシステム、ポリヌクレオチドベクターシステムの任意のベクターは、例えば、正円窓注射によって、または人工内耳手術の際に対象の耳に投与される。
配列番号５は、ヒトミオシンＶＩＩａポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であり（タンパク質コード配列は、ヌクレオチド２７３～６９２０である）、その配列は、本明細書に開示されている；
配列番号６は、配列番号５のヌクレオチド２７３～６９２０によってコードされるヒトミオシンＶＩＩａポリペプチドのアミノ酸配列であり、その配列は、本明細書に開示されている；
配列番号７は、ヒトミオシンＶＩＩａポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であり、その配列は、本明細書に開示されている；
配列番号８は、ヒトミオシンＶＩＩａポリペプチド（アイソフォーム２）のアミノ酸配列であり、その配列は、本明細書に開示されている。
開示されたオーバーラップベクターの一部の態様は、本明細書において記載されるような第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチドまたは第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドを含むウイルスまたは組換えウイルス粒子を企図する。特定の実施形態では、第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチドは、配列番号３６を含み、第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドは、配列番号３８を含む。一部の実施形態では、ウイルスまたは組換えウイルス粒子は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）または感染性ＡＡＶウイルス粒子として特徴づけられる。一部の実施形態では、組換えＡＡＶウイルス粒子は、ウイルスまたはビリオンのカプシドタンパク質中に１つまたは複数のチロシンからフェニルアラニンへの（Ｙ－Ｆ）突然変異を含む。アミノ酸位置７３３でのウイルスまたはビリオンのカプシドタンパク質におけるチロシンからフェニルアラニンへの（Ｙ－Ｆ）突然変異が、本明細書において具体的に企図される（例えば、ＡＡＶ８ Ｙ７３３Ｆ）。
一部の実施形態では、ウイルスまたはビリオンは、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ４４．９、ＡＡＶ４４．９（Ｅ５３１Ｄ）、ＡＡＶ２（４ｐＭｕｔ）、ＡＡＶＡｎｃ８０、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．８Ｒ、ＡＡＶ９－ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ９－ＰＨＰ．ｅＢ、ＡＡＶｒｈ．１０またはＡＡＶｒｈ．７４カプシド中にパッケージングされる。一部の実施形態では、ウイルス粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ７ｍ８、ＡＡＶ－ＤＪ、ＡＡＶ２／２－ＭＡＸ、ＡＡＶＳＨｈ１０、ＡＡＶＳＨｈ１０Ｙ、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶＬＫ０３、ＡＡＶ８ＰＢ２、ＡＡＶ１（Ｅ５３１Ｋ）、ＡＡＶ６（Ｄ５３２Ｎ）、ＡＡＶ６－３ｐｍｕｔ、ＡＡＶ２Ｇ９、ＡＡＶ４４．９、ＡＡＶ４４．９（Ｅ５３１Ｄ）、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．８Ｒ、ＡＡＶ９－ＰＨＰ．Ｂおよび／またはＡＡＶＡｎｃ８０カプシドを含む。例示的実施形態では、ビリオンは、ＡＡＶ４４．９（Ｅ５３１Ｄ）カプシド変異体中にパッケージングされる。
一部の実施形態では、本明細書において記載されるオーバーラップポリヌクレオチドベクターシステムは、組織特異的プロモーターを使用する。一部の実施形態では、このシステムは、眼における発現を媒介するプロモーターを使用する。一部の実施形態では、このシステムは、耳における発現を媒介するプロモーターを使用する。
一部の実施形態では、本明細書において記載されるオーバーラップポリヌクレオチドベクターシステムは、以下のプロモーターのうちいずれか１つを使用する：サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、延長因子－１アルファ（ＥＦ－１アルファ）プロモーター、錐体アレスチンプロモーター、キメラＣＭＶ βアクチンプロモーター（ＣＢＡ）、末端切断型キメラＣＭＶ βアクチン（ｓｍＣＢＡ）、ヒトミオシン７ａ遺伝子由来プロモーター、錐体トランスデューシン（ＴαＣ）遺伝子由来プロモーター、ロドプシンプロモーター、ｃＧＭＰ－ホスホジエステラーゼβ－サブユニットプロモーター、ヒトまたはマウスロドプシンプロモーター、ヒトロドプシンキナーゼ（ｈＧＲＫ１）プロモーター、シナプシンプロモーター、グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーター、杆体特異的ＩＲＢＰプロモーター、ＲＰＥ特異的卵黄様黄斑変性症－２［ＶＭＤ２］プロモーターおよびそれらの組合せ。一部の実施形態では、本明細書において記載されるポリヌクレオチドベクターシステムは、ヒトロドプシンキナーゼ（ｈＧＲＫ１）プロモーターを使用する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドベクターシステムは、錐体アレスチンプロモーターを使用する。
対象の眼（網膜）への送達のための一部の実施形態では、開示されるオーバーラップポリヌクレオチドベクターシステムは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターを使用する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドベクターシステムは、ＥＦ－１アルファプロモーターを使用する。対象の耳（有毛細胞）への送達のための一部の実施形態では、ポリヌクレオチドベクターシステムは、シナプシンまたはＧＦＡＰプロモーターを使用する（Lee et al., Hearing Researchを参照されたい）。
ハイブリッドベクターシステム
一部の態様では、ハイブリッドデュアルＡＡＶベクターシステムが提供される。これらのハイブリッドベクターシステムは、オーバーラップベクターよりも高いレベルの全長ＭＹＯ７Ａを駆動し、フロントハーフベクターから末端切断型タンパク質を生成する。ハイブリッドフロントハーフベクターは、網膜下注射されたマウスにおける網膜機能の低減につながる（図１５Ｂ～Ｅを参照されたい）。種々の実施形態では、本開示のハイブリッドベクターシステムは、マウスまたは対象への投与後に末端切断型ＭＹＯ７Ａタンパク質断片を生成しない。
分割点を変更すること、フロントハーフベクターをコドン改変すること、および／またはバックハーフベクターの長さを最小にすることが、第１世代ハイブリッドベクターを用いた場合に見られたものと同等またはそれを上回るレベルでの全長ＭＹＯ７Ａの生成につながる。本明細書において提供される改善されたベクターは、フロントハーフベクターからかなり少ない望ましくない末端切断型タンパク質側の生成物を生成する。一部の実施形態では、末端切断型タンパク質の生成は部分的にまたは完全に排除される。
本開示の一部の態様では、本開示のハイブリッドベクターシステムは、
（ｉ）ポリヌクレオチドの各末端（例えば、５’末端および３’末端）に逆方向末端反復配列、逆方向末端反復配列の間に、適したプロモーター、続いて、（例えば、プロモーターの３’）選択された全長ポリペプチドのＮ末端部分をコードする部分コード配列、続いて、スプライス供与部位およびイントロンを含む第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチド、ならびに
（ｉｉ）ポリヌクレオチドの各末端（例えば、５’末端および３’末端）に逆方向末端反復配列、逆方向末端反復配列の間に、イントロンおよびイントロンのスプライス受容部位、適宜、続いて、選択された全長ポリペプチドのＣ末端部分をコードする部分コード配列、適宜、続いて、ポリアデニル化（ｐＡ）シグナル配列を含む第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチド
を含む。第１および第２のＡＡＶベクター中のイントロン配列は、オーバーラップする配列を含む。
一部の実施形態では、第１および第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチド配列の間の分割点は、ｈＭＹＯ７Ａ遺伝子のエクソン２１とエクソン２２の間である。
例示的実施形態では、第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチドは、配列番号３１のヌクレオチド配列またはその機能的断片および／または変異体を含み、第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドは、配列番号３２のヌクレオチド配列またはその機能的断片および／または変異体を含む。
第１および第２のベクター中のコード配列は、組み合わされると、選択された全長ポリペプチドまたはその機能的断片または変異体をコードする。一部の実施形態では、選択された全長ポリペプチドはｈＭＹＯ７Ａである。一部の実施形態では、選択された全長ポリペプチドはｈＭＹＯ７Ｂである。一部の実施形態では、選択された全長ポリペプチドは、ｈＭＹＯ７ＡのアイソフォームＩＩである。一部の実施形態では、ＭＹＯ７Ａタンパク質のテールドメインに対応するポリヌクレオチド配列は、第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチドから除去されている。
本開示は、全長ミオシン７Ａポリペプチドまたはミオシン７Ａをコードするヌクレオチドの送達に制限されないということは認められよう。一部の実施形態では、選択された全長ポリペプチドは、ＡＢＣＡ４（シュタルガルト病）、ＣＥＰ２９０（ＬＣＡ１０）、ＥＹＳ（網膜色素変性症）、ＲＰ１（網膜色素変性症）、ＡＬＭＳ１（アルストレーム症候群）、ＣＤＨ２３（アッシャー症候群１Ｄ）、ＰＣＤＨ１５（アッシャー症候群１Ｆ）およびＵＳＨ２Ａ（アッシャー症候群２Ａ）から選択される。一部の実施形態では、選択された全長ポリペプチドは、ＤＭＤ（デュシェンヌ型筋ジストロフィー）、ＣＦＴＲ（嚢胞性線維症）、ＧＤＥ（糖原病ＩＩＩ）、ＤＹＳＦ（ジスフェリン異常症）、ＯＴＯＦ（神経感覚無症候性劣性難聴）およびＦ８（血友病Ａ）から選択される。一部の実施形態では、選択された全長ポリペプチドは、ＯＴＯＦではない。
一部の実施形態では、第１のベクターのコード配列の３’末端に存在するイントロン配列のすべてまたは一部は、第２のベクターのコード配列の５’末端に存在するイントロン配列のすべてまたは一部と同一である、または実質的に同一である。一部の実施形態では、第１および第２のＡＡＶベクター間のイントロン配列オーバーラップは、数百ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、イントロン配列オーバーラップは、約５０～約５００ヌクレオチドほどの長さ；あるいは、約２００から約３００ヌクレオチドほどの長さである。
特定の実施形態では、本開示の任意のベクターシステムにおいて利用されるイントロン配列は、選択されたポリペプチドをコードする遺伝子のゲノム配列中に天然に存在するイントロンの配列である。天然イントロンハイブリッドベクターとして特徴づけられる一部の実施形態では、イントロンは、ｈＭＹＯ７Ａ遺伝子のイントロン２３である。特定の実施形態では、コードされるポリペプチドは、ｈＭＹＯ７Ａまたはその機能的断片であり、イントロンは、ｈＭＹＯ７Ａ遺伝子の全イントロン２３の部分配列である。特定の実施形態では、コードされるポリペプチドは、ｈＭＹＯ７Ａまたはその機能的断片であり、イントロンは、ｈＭＹＯ７Ａ遺伝子の全イントロン２３である。
本明細書において記載されるような天然イントロンハイブリッドベクターの一部の実施形態では、デュアルベクターシステムの組換え産物配列は、ｈＭＹＯ７Ａ遺伝子のエクソン２１、エクソン２２および／またはエクソン２３の部分配列を含む。本明細書において記載されるような天然イントロンハイブリッドベクターの一部の実施形態では、ｈＭＹＯ７Ａ遺伝子のエクソン２１、エクソン２２および／またはエクソン２３の部分配列を含むデュアルベクターシステムは、全天然イントロンの部分配列を利用する。一部の実施形態では、天然イントロンは、ｈＭＹＯ７Ａ遺伝子のイントロン２３である。したがって、一部の実施形態では、イントロン配列は、ｈＭＹＯ７Ａ遺伝子の全イントロン２３の部分配列である。本明細書で使用される場合、「部分配列」は、例えば、エクソンおよび／またはイントロン配列の少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％などを含む場合がある。一部の実施形態では、第１および／または第２のイントロン配列は、ミオシンポリペプチドをコードする遺伝子のゲノム配列中に天然に存在するイントロンの配列を含む。一部の実施形態では、イントロン配列は、ｈＭＹＯ７Ａ遺伝子の全イントロン２３の部分配列である。
ランダムコンカテマー化の問題を克服し、それによって、デュアルベクタープラットフォームの特異性ならびに効率を増大するために、いくつかの戦略が考案されてきた。第１に、高度組換え産物配列、例えば、本明細書においてＡＰハイブリッドベクターにおいて使用されるものの付加は、トランススプライシングシステムと比較して有意に増大したタンパク質発現をもたらした。Ghosh et al. (2011)は、この研究において使用された２７０ｂｐのＡＰ配列ならびに組換えを指示し、トランススプライシングベクターを上回る有意な改善につながるＡＰに由来する他の配列の詳細な分析を提供する。ＡＰハイブリッドベクターはトランススプライシングベクターよりも効率的であるという知見は、ＡＰ配列が、コンカテマー化事象の少なくとも一部を適切な配向に向け、次いで、組換えが、この配列を介して、またはＩＴＲを介して生じることを支持する。ＡＰヘッドドメインは、特に、細胞におけるデュアルベクターの組換え後に、適当なヘッドトゥーテールのコンカテマー化を媒介できる。それにもかかわらず、より多くのコンカテマーが適切にアラインされる場合には、ＡＰハイブリッドシステムは、ＭＹＯ７Ａのより効率的な発現を媒介する（コンカテマー化を方向付けるための別のアプローチは、５’ベクターのバック末端を、３’ベクターのフロント末端に一緒に繋ぐことが可能である一本鎖オリゴヌクレオチドの使用である（Hirsch et al., 2009）、しかし、この戦略は、デュアルベクターとタイミングを合わせた標的細胞の核へのオリゴヌクレオチドの効率的な送達を必要とする）。最後に、ミスマッチのＩＴＲを利用するデュアルベクターを使用して、コンカテマー化をヘッドトゥーテール配向に方向付けることができる（Yan et al., 2005）が、このプロセスは、ＡＡＶパッケージング機構のさらなる最適化を必要とする場合がある。
したがって、一部の実施形態では、本開示のベクターシステムにおいて利用されるイントロン配列は、選択されたポリペプチドをコードする遺伝子のゲノム配列中に天然に存在しないイントロンの配列である。特定の実施形態では、イントロンは、合成アルカリホスファターゼ（ＡＰ）イントロンである。本開示のベクターシステムにおいて利用されるイントロン配列は、スプライスドナーおよびスプライスアクセプター配列を含むことができる。一部の実施形態では、イントロン配列は、組換え産物のイントロン配列である（例えば、Trapani、et al. 2014において示されるような、Ｆ１ファージのＡＫ配列）。これらの実施形態では、本明細書において記載される第２世代ハイブリッドベクターとして特徴づけられるハイブリッドベクターは、全長発現カセットの再構成のために、ＩＴＲ媒介性コンカテマー化およびＡＫ配列によって媒介される相同組換えの両方に依存する。したがって、一部の実施形態では、イントロン配列は、Ｆ１ファージのＡＫ配列である。したがって、開示されるハイブリッドベクターの一部の実施形態では、ベクターは、１つまたは複数のＡＰイントロンスプライセオソーム認識部位、例えば、１つまたは複数のＡＰスプライスアクセプター（ＡＰＳＡ）ドメインまたはＡＰスプライスドナー（ＡＰＳＤ）ドメインを含む。例示的実施形態では、これらのベクターは、ＡＰＳＡおよびＡＰＳＤを含む。一部の実施形態では、フロントハーフベクターは、ＡＰＳＡを含有し、バックハーフベクターは、ＡＰＳＤを含有する。一部の実施形態では、フロントハーフベクターは、ＡＰＳＤを含有し、バックハーフベクターは、ＡＰＳＡを含有する。図３７Ａおよび４５Ａを参照されたい。
したがって、例示的実施形態では、ハイブリッドベクター対は、ＡＰヘッドをコードする配列をＡＰイントロンの一部として含有する。開示されるハイブリッドベクターの一部の実施形態では、ベクターは、配列番号６９または７０のいずれかに対して少なくとも８５％、９０％、９２．５％、９５％、９８％または９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むイントロン配列を含む。開示されるハイブリッドベクターの一部の実施形態では、ベクターは、配列番号６９または７０（ＡＰヘッド配列）のヌクレオチド配列を含む。
開示されたハイブリッドベクターのいずれかを使用する送達のために企図されるｈＭＹＯ７Ａ以外のポリペプチドとして、それだけには限らないが、ハーモニン（ｈａｒｍｏｎｉｎ）（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ９Ｙ６Ｎ９）、カドヘリン２３（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ９Ｈ２５１）、プロトカドヘリン１５（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ９６ＱＵ１）およびウシェリン（ｕｓｈｅｒｉｎ）（ＵＳＨ２Ａ）（Ｕｎｉｐｒｏｔ ０７５４４５）が挙げられる。一部の実施形態では、選択された全長ポリペプチドは、約５Ｋｂ～約１０Ｋｂの長さの遺伝子によってコードされる。一部の実施形態では、選択された全長ポリペプチドは、約６Ｋｂ～約９Ｋｂの長さの遺伝子によってコードされる。一部の実施形態では、選択された全長ポリペプチドは、約７Ｋｂ～約８Ｋｂの長さの遺伝子によってコードされる。一部の実施形態では、大きな遺伝子の一部分（またはハーフ）を発現するハイブリッドデュアルベクターは、それぞれ、第１および第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドの第１のイントロンと第２のイントロンの間の配列ならびにＭＹＯ７Ａ以外の、配列番号３９および５２～５９のいずれか１つに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む大きな遺伝子を含有する。一部の実施形態では、これらのハイブリッドベクター、配列番号３９および５３～５９のいずれか１つ、例えば、配列番号５６または５７のヌクレオチド配列を含有するイントロン配列。大きな遺伝子は、ＡＢＣＡ４、ＣＥＰ２９０、ＥＹＳ、ＲＰ１、ＡＬＭＳ１、ＣＤＨ２３、ＰＣＤＨ１５、ＵＳＨ１Ｃ、ＵＳＨ１Ｇ、ＵＳＨ２Ａ、ＤＮＦＢ３１、ＤＭＤ、ＣＦＴＲ、ＧＤＥ、ＤＹＳＦ、Ｆ８およびＤＦＮＢ２から選択できる。非ＭＹＯ７Ａ（例えば、ＡＢＣＡ４）遺伝子をコードするこれらのハイブリッドベクターは、本明細書において提供された改善されたオーバーラップベクターによって、組換え産物ＡＰヘッド配列／ドメインの代わりに組換え産物配列として同定されたオーバーラップする領域を含有し得る。これらのハイブリッドベクターのオーバーラップする領域は、スプライスアクセプターおよび／またはスプライスドナー配列に隣接し、その結果、オーバーラップする領域は、スプライシングされ、ＭＹＯ７Ａタンパク質を全くコードしない。
一部の実施形態では、第１世代のハイブリッドベクターシステムは、エクソン２３と２４の間の分割点を含有し、ＭＹＯ７Ａタンパク質のテールドメインに対応する配列は、配列番号３によって表されるフロントハーフベクター内に含有される。このエクソン２３／２４ハイブリッドベクターシステムのバックハーフベクターは、配列番号４に示される。一部の実施形態では、第２世代ハイブリッドベクターシステムは、エクソン２１と２２の間に位置する分割点を含有し、ＭＹＯ７Ａタンパク質のテールドメインに対応する配列は、エクソン２３／２４ハイブリッドベクターシステムのフロントハーフベクターから除去され、それによって、第２世代ハイブリッドフロントハーフベクター（配列番号３１）が生じる。
したがって、例証される実施形態では、第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチドは、配列番号３１のヌクレオチド配列またはその機能的断片および／または変異体を含み、第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドは、配列番号３２のヌクレオチド配列またはその機能的断片および／または変異体を含み、イントロン配列は、Ｆ１ファージのＡＫ配列である。
一部の実施形態では、第１および第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチド配列の間の分割点は、ｈＭＹＯ７Ａ遺伝子のエクソン２１とエクソン２２の間である。一部の実施形態では、第１および第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチド配列の間の分割点は、ｈＭＹＯ７Ａ遺伝子のエクソン２２とエクソン２３の間である。
一部の実施形態では、第１および第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチド配列の間の分割点は、ｈＭＹＯ７Ａ遺伝子のエクソン２３とエクソン２４の間ではない。例示的実施形態では、本開示のハイブリッドベクターは、配列番号３および４のヌクレオチド配列のいずれかを含まない。
ＣＭｖ１ハイブリッドベクターシステム
一部の実施形態は、ベクターの非コード配列（例えば、ＭＹＯ７Ａ部分コード配列の下流で、第１および／または第２のベクターポリヌクレオチドの逆方向末端反復配列対の３’ＡＡＶ逆方向末端反復配列の前の３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ））において置換が行われる、本明細書において記載されるようなハイブリッドベクターシステムを企図する。一部の実施形態では、置換は推定停止コドン中に位置付けられ、その結果、これらの潜在的な停止コドンが除去される。一部の実施形態では、１つまたは複数のヌクレオチド置換を、フロントハーフベクター（例えば、配列番号３１を含むフロントハーフベクター）のアルカリホスファターゼ（ＡＰ）イントロンスプライスドナー配列（「ＡＰイントロン」）中に導入することによって、１または複数の潜在的な停止コドンが除去される。一部の実施形態では、３つの潜在的な停止コドンは、フロントハーフベクターのアルカリホスファターゼイントロンスプライスドナー配列内で改変される。ＡＰヘッド配列におけるこれらの推定停止コドンの改変の結果として、配列番号３３を含む改変されたフロントハーフベクターが作出される。図４２を参照されたい。
したがって、一部の実施形態では、本開示のハイブリッドベクターシステムは、
ｉ）ポリヌクレオチドの各末端に逆方向末端反復配列、逆方向末端反復配列の間に、プロモーター、続いて、選択された全長ポリペプチドのＮ末端部分をコードする部分コード配列、続いて、スプライス供与部位およびイントロンを含む第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチド、ならびに
ｉｉ）ポリヌクレオチドの各末端に逆方向末端反復配列、逆方向末端反復配列の間に、イントロンおよびイントロンのスプライス受容部位、適宜、続いて、選択された全長ポリペプチドのＣ末端部分をコードする部分コード配列、続いて、ポリアデニル化（ｐＡ）シグナル配列を含む第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチド
を含む。第１および第２のＡＡＶベクター中のイントロン配列は、オーバーラップする配列を含む。例示的実施形態では、第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチドは、配列番号３３のヌクレオチド配列またはその機能的断片および／または変異体を含み、第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドは、配列番号３２のヌクレオチド配列またはその機能的断片および／または変異体を含む。
ＣＭｖ２ハイブリッドベクターシステム
さらに他の実施形態は、フロントハーフベクター（例えば、配列番号３３を含むフロントハーフベクター）において１つのさらなる推定インフレーム停止コドンが改変された、本明細書において記載されるようなハイブリッドベクターシステムを企図する。一部の実施形態では、改変は、この配列から推定停止コドンを除去する置換をフロントハーフベクターのＡＰヘッド配列中に導入することを含む。この改変およびこの推定停止コドンの除去の結果として、配列番号３４を含むさらに改変されたフロントハーフベクターが作出される。
本明細書において記載されるようなさらなる推定インフレーム停止コドンの改変の際、一部の実施形態は、バックハーフベクター（例えば、配列番号３２を含むバックハーフベクター）において相補的な変更を加えることを考慮し、バックハーフベクターにおいて同一コドンも改変される。したがって、一部の実施形態では、改変は、この配列から推定停止コドンを除去する、バックハーフベクターのＡＰヘッド配列への置換の導入を含む。このさらなる停止コドンの改変の結果として、配列番号３５を含む改変されたバックハーフベクターが作出される。図４２を参照されたい。
そのようなものとして、ＣＭｖ１ベクターでは、ＡＰイントロンにおいて３つの潜在的なインフレーム停止コドンが除去される。ＣＭｖ２ベクターでは、ＡＰイントロンにおいてこれらの同一の３つの潜在的な停止コドンが除去され、ＡＰヘッドコード配列から１つの潜在的な停止コドンが除去された。
したがって、特定の実施形態では、本開示のハイブリッドベクターシステムは、
ｉ）ポリヌクレオチドの各末端に逆方向末端反復配列、逆方向末端反復配列の間に、プロモーター、続いて、選択された全長ポリペプチドのＮ末端部分をコードする部分コード配列、続いて、スプライス供与部位およびイントロンを含む第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチド、ならびに
ｉｉ）ポリヌクレオチドの各末端に逆方向末端反復配列、逆方向末端反復配列の間に、イントロンおよびイントロンのスプライス受容部位、適宜、続いて、選択された全長ポリペプチドのＣ末端部分をコードする部分コード配列、続いて、ポリアデニル化（ｐＡ）シグナル配列を含む第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチド
を含む。第１および第２のＡＡＶベクター中のイントロン配列は、オーバーラップする配列を含む。例示的実施形態では、第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチドは、配列番号３４のヌクレオチド配列またはその機能的断片および／または変異体を含み、第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドは、配列番号３５のヌクレオチド配列またはその機能的断片および／または変異体を含む。
Ｖ２ ＭＩＮおよびＣＭｖ２ ＭＩＮハイブリッドベクターシステム（ＣＭｖ２．１ハイブリッドベクターシステムとしても知られる）
分割点が、第１世代ハイブリッドベクターシステムにおけるようなエクソン２３と２４の間の接合部から、第２世代ハイブリッドベクターシステムにおけるようなエクソン２１と２２の間の接合部に変更される場合には、ＭＹＯ７Ａ配列のさらなる部分は、バックハーフ第２世代ハイブリッドベクターに移動される。このために、一部の実施形態では、第２世代バックハーフハイブリッドベクターは、ＡＡＶパッケージング限界に近いが、それを超えない。したがって、一部の実施形態では、配列番号３５を含む改変されたバックハーフベクターを、さらに改変して、コンストラクトの３’末端から任意の残留物（余分の）、非必須配列、例えば、制限酵素部位およびタグ配列を除去することができる。これらの残留配列は、「シードされていないレガシー」配列と呼ばれることもある。得られた改変バックハーフベクターは、配列番号４９を含む。このベクターシステムは、「Ｖ２ ＭＩＮ」または「Ｖ２－バックＭＩＮ」ハイブリッドシステムとして知られている。一部の実施形態では、このシステムは、ＨＡタグ（「Ｖ２ ＭＩＮ ＨＡ」）を含有する。Ｖ２ ＭＩＮ ＨＡベクターは、配列番号４８として示される。Ｖ２ ＭＩＮバックハーフベクターは、第１世代ハイブリッドバックハーフベクターよりも１２２ｂｐ短い（４９８１ｂｐ対４８６１ｂｐ）。
一部の実施形態では、シードされていないレガシー配列が除去され、非コード配列において１つまたは複数の置換が導入されているベクターが提供される。一部の実施形態では、これらの１つまたは複数の置換が推定停止コドン中に配置される。その結果、これらの潜在的な停止コドンが除去される。一部の実施形態では、フロントハーフベクターのＡＰヘッド配列中に１つまたは複数のヌクレオチド置換を導入することによって、１つまたは複数の潜在的な停止コドンが除去される。一部の実施形態では、１つまたは複数の推定停止コドンが除去され、「スタッファー」配列と置き換えられる（図４３を参照されたい）。
一部の実施形態では、フロントハーフベクターのアルカリホスファターゼイントロン配列内で３つの潜在的な停止コドンが改変される。一部の実施形態では、１つまたは複数の置換をフロントハーフベクターのＡＰヘッド配列中に導入することによって、１つの推定停止コドンが改変（除去）される。ＡＰヘッド配列におけるこれらの推定停止コドンの改変の結果として、配列番号３４の改変されたフロントハーフベクターが生成された。
一部の実施形態では、１つの推定停止コドンは、バックハーフベクターのＡＰヘッド配列において同様に改変される。ＡＰヘッド配列におけるこの推定停止コドンの改変の結果として、配列番号４４の改変されたバックハーフベクターが生成された。
このベクターシステムは、ＣＭｖ２ ＭＩＮシステムとして知られている。一部の実施形態では、このシステムは、ＨＡタグを含有する（「ＣＭｖ２ ＭＩＮ ＨＡ」）。ＣＭｖ２ ＭＩＮ ＨＡベクターは、配列番号４７として示されている。ＣＭｖ２ ＭＩＮバックハーフベクターは、第１世代ハイブリッドバックハーフベクターよりも１２１ｂｐ短い（４９８２ｂｐ対４８６１ｂｐ）。
したがって、一部の実施形態では、本開示のハイブリッドベクターシステムは、
ｉ）ポリヌクレオチドの各末端に逆方向末端反復配列、逆方向末端反復配列の間に、プロモーター、続いて、選択された全長ポリペプチドのＮ末端部分をコードする部分コード配列、続いて、スプライス供与部位およびイントロンを含む第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチド、ならびに
ｉｉ）ポリヌクレオチドの各末端に逆方向末端反復配列、逆方向末端反復配列の間に、イントロンおよびイントロンのスプライス受容部位、適宜、続いて、選択された全長ポリペプチドのＣ末端部分をコードする部分コード配列、続いて、ポリアデニル化（ｐＡ）シグナル配列を含む第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチド
含む。第１および第２のＡＡＶベクター中のイントロン配列は、オーバーラップする配列を含む。例示的実施形態では、第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチドは、配列番号３４のヌクレオチド配列またはその機能的断片および／または変異体を含み、第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドは、配列番号４４のヌクレオチド配列またはその機能的断片および／または変異体を含む。一部の実施形態では、第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチドは、配列番号３４のヌクレオチド配列またはその機能的断片および／または変異体を含み、第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドは、配列番号４７のヌクレオチド配列またはその機能的断片および／または変異体を含む。一部の実施形態では、第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチドは、配列番号３４のヌクレオチド配列またはその機能的断片および／または変異体を含み、第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドは、配列番号４８のヌクレオチド配列またはその機能的断片および／または変異体を含む。
ＣＭｖ３ ＭＩＮハイブリッドベクターシステム
さらに他の実施形態は、フロントハーフベクターにおいて３つのさらなるインフレーム停止コドンが改変された、本明細書において記載されるようなハイブリッドベクターシステムを企図する。一部の実施形態では、１つまたは複数のヌクレオチド置換（例えば、３つの置換）は、ＭＹＯ７Ａコード配列の下流の３’ＵＴＲまたはＩＴＲにおいて行われる。したがって、一部の実施形態では、置換の導入によって、ＡＰヘッド配列中の１つのインフレーム停止コドン、ＡＰイントロン配列中の３つのインフレーム停止コドンおよび３’ＵＴＲ配列中の３つのインフレーム停止コドンが除去されているフロントハーフベクターが提供される。これらの推定停止コドンの改変の結果として、配列番号４６を含むさらに改変されたフロントハーフベクターが作出される（「ＡＡＶ－ｓｍＣＢＡ－ｈＭＹＯ７Ａ－ＮＴ－Ｅｘ２１－ＡＰＳＤ－ＡＰｈｅａｄ－ＣＭｖ３」または単純に「ＣＭｖ３ハイブリッドシステム」）。例示的実施形態では、ＣＭｖ３ハイブリッドシステムは、残留するシードされていないレガシー配列（例えば、制限酵素部位）が除されているＣＭｖ３ ＭＩＮシステムである。一部の実施形態では、ＣＭｖ３システムは、ＨＡタグを有する。
したがって、例示的実施形態では、第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチドは、配列番号４６のヌクレオチド配列またはその機能的断片および／または変異体を含み、第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドは、配列番号３５のヌクレオチド配列またはその機能的断片および／または変異体を含む。
したがって、一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドベクターシステムは、ＣＭｖ３ハイブリッドシステムである。一部の実施形態では、ベクターシステムは、ＣＭｖ３ ＭＩＮシステムである。一部の実施形態では、ベクターシステムは、ＣＭｖ２システムである。一部の実施形態では、ベクターシステムは、ＣＭｖ２ ＭＩＮシステムである。一部の実施形態では、ベクターシステムは、ＣＭｖ１またはＣＭｖ１ ＭＩＮシステムである。本開示の組成物において、開示されるフロントハーフハイブリッドベクターのいずれも、開示されるバックハーフハイブリッドベクターのいずれかと組み合わせることができる。
例示的実施形態では、
ｉ）ポリヌクレオチドの各末端に逆方向末端反復配列、逆方向末端反復配列の間に、プロモーター、続いて、ミオシンポリペプチドのＮ末端部分をコードする部分コード配列、続いて、スプライス供与部位およびイントロンを含む第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチド、ならびに
ｉｉ）ポリヌクレオチドの各末端に逆方向末端反復配列、逆方向末端反復配列の間に、イントロンおよびイントロンのスプライス受容部位を含む第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチド
を含むポリヌクレオチドベクターシステムであって、
第１および第２のＡＡＶベクター中のイントロン配列は、オーバーラップするポリヌクレオチド配列を含み、
第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチドは、配列番号３１、３３、３４および４６から選択されるヌクレオチド配列を含み、
第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドは、配列番号３２、３５、４４および４７～４９から選択されるヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチドベクターシステムが提供される。
本明細書において記載されるハイブリッドベクターシステムの一部の実施形態では、選択された全長ポリペプチドは、ミオシンポリペプチドである。一部の実施形態では、ミオシンポリペプチドは、ヒトミオシンＶＩＩＡ（ｈＭＹＯ７Ａ）である。一部の実施形態では、ミオシンポリペプチドは、ヒトミオシンＶＩＩＢ（ｈＭＹＯ７Ｂ）である。一部の実施形態では、ミオシンポリペプチドは、ミオシン７（ＶＩＩ）アイソフォームＩＩである。一部の実施形態では、ミオシンポリペプチドは、別のミオシンアイソフォームまたはその機能的断片である。特定の実施形態では、全長ミオシン７ＡまたはアイソフォームＩＩは、提供されたベクターシステムにおいてコードされる。
一部の実施形態では、選択された全長ポリペプチド（例えば、ミオシンポリペプチド）のＣ末端部分は、選択された全長ポリペプチドのシングル－アルファヘリックス（ＳＡＨ）ドメインを含む。
第１および第２のベクター中のコード配列は、組み合わされると、選択された全長ポリペプチドまたはその機能的断片または変異体をコードする。したがって、一部の実施形態では、第１のベクターのコード配列の３’末端に存在するイントロン配列のすべてまたは一部は、第２のベクターのコード配列の５’末端に存在するイントロン配列のすべてまたは一部と同一である、または実質的に同一である。
本明細書において記載されるハイブリッドベクターの一部の実施形態は、本明細書において記載される第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチドまたは第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドを含むウイルスまたは組換えウイルス粒子を企図する。特定の実施形態では、第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチドは、配列番号３３を含み、第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドは、配列番号３２を含む。一部の実施形態では、ウイルスまたは組換えウイルス粒子は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）または感染性ＡＡＶウイルス粒子として特徴づけられる。一部の実施形態では、組換えＡＡＶウイルス粒子は、ウイルスまたはビリオンのカプシドタンパク質中に１つまたは複数のチロシンからフェニルアラニンへの（Ｙ－Ｆ）突然変異を含む。アミノ酸位置７３３でのウイルスまたはビリオンのカプシドタンパク質におけるチロシンからフェニルアラニンへの（Ｙ－Ｆ）突然変異が、本明細書において具体的に企図される（例えば、ＡＡＶ８ Ｙ７３３Ｆ）。同様に、アミノ酸位置７３１でのウイルスまたはビリオンのカプシドタンパク質におけるチロシンからフェニルアラニンへの（Ｙ－Ｆ）突然変異が、本明細書において具体的に企図される（例えば、ＡＡＶ４４．９（Ｙ７３１Ｆ））。
一部の実施形態では、ウイルスまたはビリオンは、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ４４．９、ＡＡＶ４４．９（Ｅ５３１Ｄ）、ＡＡＶ２（４ｐＭｕｔ）、ＡＡＶＡｎｃ８０、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．８Ｒ、ＡＡＶ９－ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ９－ＰＨＰ．ｅＢ、ＡＡＶｒｈ．１０またはＡＡＶｒｈ．７４カプシド中にパッケージングされる。一部の実施形態では、ウイルス粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ７ｍ８、ＡＡＶ－ＤＪ、ＡＡＶ２／２－ＭＡＸ、ＡＡＶＳＨｈ１０、ＡＡＶＳＨｈ１０Ｙ、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶＬＫ０３、ＡＡＶ８ＰＢ２、ＡＡＶ１（Ｅ５３１Ｋ）、ＡＡＶ６（Ｄ５３２Ｎ）、ＡＡＶ６－３ｐｍｕｔ、ＡＡＶ２Ｇ９、ＡＡＶ４４．９、ＡＡＶ４４．９（Ｅ５３１Ｄ）、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．８Ｒおよび／またはＡＡＶＡｎｃ８０カプシドを含む。網膜への送達のための例示的実施形態では、ビリオンは、ＡＡＶ４４．９（Ｅ５３１Ｄ）カプシド変異体中にパッケージングされる。耳の有毛細胞への送達のための例示的実施形態では、ビリオンは、ＡＡＶ９－ＰＨＰ．Ｂカプシド変異体中にパッケージングされる。
一部の実施形態では、本明細書において記載されるハイブリッドポリヌクレオチドベクターシステムは、組織特異的プロモーターを使用する。一部の実施形態では、システムは、眼における発現を媒介するプロモーターを使用する。一部の実施形態では、システムは、耳における発現を媒介するプロモーターを使用する。
一部の実施形態では、本明細書において記載されるハイブリッドポリヌクレオチドベクターシステムは、以下のプロモーターのうちいずれか１つを使用する：サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、延長因子－１アルファ（ＥＦ－１アルファ）プロモーター、錐体アレスチンプロモーター、キメラＣＭＶ βアクチン（ｓｍＣＢＡ）プロモーター、ヒトミオシン７ａ遺伝子由来プロモーター、錐体トランスデューシン（ＴαＣ）遺伝子由来プロモーター、ロドプシンプロモーター、ｃＧＭＰ－ホスホジエステラーゼβ－サブユニットプロモーター、ヒトまたはマウスロドプシンプロモーター、ヒトロドプシンキナーゼ（ｈＧＲＫ１）プロモーター、杆体特異的ＩＲＢＰプロモーター、ＲＰＥ特異的卵黄様黄斑変性症－２［ＶＭＤ２］プロモーターおよびそれらの組合せ。一部の実施形態では、本明細書において記載されるポリヌクレオチドベクターシステムは、ヒトロドプシンキナーゼ（ｈＧＲＫ１）プロモーターを使用する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドベクターシステムは、錐体アレスチンプロモーターを使用する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドベクターシステムは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターを使用する。対象の眼（網膜）への送達のための一部の実施形態では、開示されるオーバーラップポリヌクレオチドベクターシステムは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターを使用する。
網膜への送達のための一部の実施形態では、ハイブリッドポリヌクレオチドベクターシステムは、ＥＦ－１アルファプロモーターを使用する。対象の耳（有毛細胞）への送達のための一部の実施形態では、ポリヌクレオチドベクターシステムは、シナプシンまたはＧＦＡＰプロモーターを使用する（Lee et al., Hearing Researchを参照されたい）。
「ハイブリッドベクター」セクションとともに含有され、本明細書において記載されるような各実施形態は、記載される各ハイブリッドベクターシステム、例えば、第１と第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチド配列の間の分割点が、ｈＭＹＯ７Ａ遺伝子のエクソン２１とエクソン２２の間であるベクターシステム；第１と第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチド配列の間の分割点が、ｈＭＹＯ７Ａ遺伝子のエクソン２２とエクソン２３の間であるベクターシステム；配列番号３１のヌクレオチド配列を含むフロントハーフベクターおよび配列番号３２のヌクレオチド配列を含むバックハーフベクターを有するベクターシステム；配列番号３３のヌクレオチド配列を含むフロントハーフベクターおよび配列番号３２のヌクレオチド配列を含むバックハーフベクターを有するベクターシステム；配列番号３４のヌクレオチド配列を含むフロントハーフベクターおよび配列番号３５のヌクレオチド配列を含むバックハーフベクターを有するベクターシステム；ならびに／または配列番号３４のヌクレオチド配列を含むフロントハーフベクターおよび配列番号４４のヌクレオチド配列を含むバックハーフベクターを有するベクターシステムについて具体的に企図される。
一部の実施形態では、本開示において記載されるハイブリッドポリヌクレオチドベクターシステムの任意のベクターを、非経口投与、例えば、静脈内、筋肉内、眼球内、鼻腔内または卵形嚢（内）注射などによって投与できる。ベクターは、インビボ、インビトロまたはエキソビボで投与できる。
一部の実施形態では、本明細書において記載されるハイブリッドポリヌクレオチドベクターシステムの任意のベクターを、眼に投与できる。特定の実施形態では、ベクターは、網膜下注射によって対象の眼に投与される。一部の実施形態では、本明細書において記載されるハイブリッドポリヌクレオチドベクターシステムの任意のベクターを、耳に投与できる。一部の実施形態では、本明細書において記載されるハイブリッドポリヌクレオチドベクターシステム、ポリヌクレオチドベクターシステムの任意のベクターは、例えば、正円窓注射によって、または人工内耳手術の際に対象の耳に投与される。
本開示の方法は、ヒトおよび他の動物を用いて使用できる。本開示の範囲内で企図される動物として、例えば、イヌ、ネコ、ウサギ、フェレット、モルモット、ハムスター、ブタ、サルまたは他の霊長類、マウス、スナネズミ、ウマ、ラバ、ロバ、ブーロ、ウシ、雌ウシ、ブタ、ヒツジおよびワニが挙げられる。本明細書で使用される場合、「患者」および「対象」という用語は、同義的に使用され、ヒトおよび非ヒト細胞を含む、このようなヒトおよび非ヒト種を含むものとする。同様に、本開示のインビトロ方法はまた、ヒトおよび非ヒト細胞を含む、１種または複数のヒトまたは非ヒト、哺乳動物種の細胞で実施できる。
例示的デュアルＡＡＶベクターの構成成分
本開示のデュアルポリヌクレオチドベクターシステムのいずれも、当技術分野で公知のＡＡＶベクターシステムとともに使用できる。一部の疾患の処置において、ｒＡＡＶベクターコンストラクトを単回投与することが好ましい場合があるが、他の疾患または状態の管理または処置では、１または複数の投与期間において患者にベクターコンストラクトの２回またはそれより多い投与を提供することが望ましい場合がある。このような状況では、ＡＡＶベクターベースの治療薬は、処置されている疾患または障害の１つまたは複数の症状の処置または寛解を達成するために必要であり得るように、１または複数の、毎日、毎週、毎月またはより少ない頻度での期間連続して提供される場合がある。一部の実施形態では、ベクターを、処置されている疾患または状態の１つまたは複数の症状を処置または寛解させるのに十分な量および時間での感染性アデノ随伴ウイルス粒子、ｒＡＡＶビリオンまたは複数の感染性ｒＡＡＶ粒子の１回または複数回の投与によって片眼または両眼に提供する場合がある。
特定の実施形態では、本開示は、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９およびＡＡＶ１０からなる群から選択されるものを含むいくつかの異なる血清型に由来しているｒＡＡＶ粒子を提供する。例示的実施形態では、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５およびＡＡＶ８血清型ベクターに由来する粒子が利用される。特定の実施形態では、ＡＡＶ８（Ｙ７３３Ｆ）またはＡＡＶ２（トリプルＹ－Ｆ）カプシドを有する粒子が使用される。したがって、本開示は、例えば、ＡＡＶ８（Ｙ７３３Ｆ）またはＡＡＶ２（トリプルＹ－Ｆ）に由来する、オーバーラップおよびハイブリッドポリヌクレオチドベクターシステムを含む組換えＡＡＶ粒子を提供する。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターの血清型は、ＡＡＶ６またはＡＡＶ２ではない。
さらなる例示的カプシドには、ＡＡＶ２、ＡＡＶ６ならびにＡＡＶ２およびＡＡＶ６に由来するカプシドが含まれる。このようなカプシドには、ＡＡＶ７ｍ８、ＡＡＶ－ＤＪ、ＡＡＶ２／２－ＭＡＸ、ＡＡＶＳＨｈ１０、ＡＡＶＳＨｈ１０Ｙ、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶＬＫ０３、ＡＡＶ８ＰＢ２、ＡＡＶ１（Ｅ５３１Ｋ）、ＡＡＶ６（Ｄ５３２Ｎ）、ＡＡＶ６－３ｐｍｕｔ、ＡＡＶ２Ｇ９、ＡＡＶ４４．９、ＡＡＶ４４．９（Ｅ５３１Ｄ）、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．８Ｒ、ＡＡＶ９－ＰＨＰ．Ｂおよび／またはＡＡＶＡｎｃ８０が含まれる。一部の実施形態では、ウイルスまたはビリオンは、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ４４．９、ＡＡＶ４４．９（Ｅ５３１Ｄ）、ＡＡＶ２（４ｐＭｕｔ）、ＡＡＶＡｎｃ８０、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．８Ｒ、ＡＡＶ９－ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶｒｈ．１０またはＡＡＶｒｈ．７４カプシド中にパッケージングされる。
ＡＡＶ－ＤＪカプシドは、Grimm et al., J. Virol.、2008、5887-5911およびKatada et al., (2019), Evaluation of AAV-DJ vector for retinal gene therapy, PeerJ 7:e6317に記載され、それらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる。ＡＡＶ－ＤＪと密接に関連するＡＡＶ７ｍ８カプシドは、参照により本明細書に組み込まれる、Dalkara, et al. Sci Transl Med. 2013; 5(189):189ra76に記載されている。ＡＡＶ２／２－ＭＡＸカプシドは、参照により本明細書に組み込まれる、Reid, Ertel & Lipinski, Improvement of Photoreceptor Targeting via Intravitreal Delivery in Mouse and Human Retina Using Combinatory rAAV2 Capsid Mutant Vectors, Invest. Ophthalmol Vis Sci. 2017; 58:6429-6439に記載されている。ＡＡＶ２／２－ＭＡＸカプシドは、５つの点突然変異、Ｙ２７２Ｆ、Ｙ４４４Ｆ、Ｙ５００Ｆ、Ｙ７３０Ｆ、Ｔ４９１Ｖを含む。ＡＡＶ１（Ｅ５３１Ｋ）カプシドは、参照により本明細書に組み込まれる、Boye et al., Impact of Heparin Sulfate Binding on Transduction of Retina by Recombinant Adeno-Associated Virus Vectors, J. Virol. 90:4215-4231 (2016)に記載されている。ＡＡＶＳＨｈ１０およびＡＡＶ６（Ｄ５３２Ｎ）カプシドは、両方ともＡＡＶ６の誘導体であり、参照により本明細書に組み込まれる、Klimczak et al., (2009) A Novel Adeno-Associated Viral Variant for Efficient and Selective Intravitreal Transduction of Rat Muller Cells, PLoS ONE 4(10): e746に記載されている。ＡＡＶ６－３ｐｍｕｔ（ＡＡＶ６（ＴＭ６）およびＡＡＶ６（Ｙ７０５＋Ｙ７３１Ｆ＋Ｔ４９２Ｖ）としても知られる）カプシドは、Rosario et al., Microglia-specific targeting by novel capsid-modified AAV6 vectors, Mol Ther Methods Clin Dev. (2016); 13(3):16026および国際特許公開第２０１６／１２６８５７号に記載されており、それらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる。
開示された方法とともに使用するのに適したさらなるカプシドには、以下が含まれる：野生型ＡＡＶ２カプシドのアミノ酸残基で非天然アミノ酸置換を含むカプシドであって、非天然アミノ酸置換が、Ｙ２７２Ｆ、Ｙ４４４Ｆ、Ｔ４９１Ｖ、Ｙ５００Ｆ、Ｙ７００Ｆ、Ｙ７０４ＦおよびＹ７３０Ｆのうち１つまたは複数を含むカプシド；野生型ＡＡＶ６カプシドのアミノ酸残基で非天然アミノ酸置換を含むカプシドであって、非天然アミノ酸置換が、Ｙ４４５Ｆ、Ｙ７０５Ｆ、Ｙ７３１Ｆ、Ｔ４９２ＶおよびＳ６６３Ｖのうち１つまたは複数を含むカプシド。ある特定の実施形態、カプシドは、ＡＡＶ２の変異体であるＡＡＶ２Ｇ９を含む。
他の実施形態では、カプシドは、野生型ＡＡＶ８カプシドのアミノ酸残基５３３または７３３に非天然アミノ酸置換を含み、非天然アミノ酸置換は、Ｅ５３３Ｋ、Ｙ７３３Ｆまたはそれらの組合せである。ＡＡＶ８（Ｙ７３３Ｆ）カプシドは、Doroudchi et al., Amer. Soc. of Gene & Cell Ther. 19(7): 1220-29 (2011)に記載されている。開示された方法のある特定の実施形態では、カプシドは、ＡＡＶ８の変異体であるＡＡＶ８ＰＢ２を含む。
他の実施形態では、カプシドは、以下の突然変異のうち１つまたは複数を含む野生型ＡＡＶ２カプシドの非天然アミノ酸置換を含む：
（ａ）Ｙ４４４Ｆ、
（ｂ）Ｙ４４４Ｆ＋Ｙ５００Ｆ＋Ｙ７３０Ｆ、
（ｃ）Ｙ２７２Ｆ＋Ｙ４４４Ｆ＋Ｙ５００Ｆ＋Ｙ７３０Ｆ、
（ｄ）Ｙ４４４Ｆ＋Ｙ５００Ｆ＋Ｙ７３０Ｆ＋Ｔ４９１Ｖ、または
（ｅ）Ｙ２７２Ｆ＋Ｙ４４４Ｆ＋Ｙ５００Ｆ＋Ｙ７３０Ｆ＋Ｔ４９１Ｖ。
他の実施形態では、カプシドは、以下の突然変異のうち１つまたは複数を含む野生型ＡＡＶ６カプシドの非天然アミノ酸置換を含む：
（ａ）Ｙ４４５Ｆ、
（ｂ）Ｙ７０５Ｆ＋Ｙ７３１Ｆ、
（ｃ）Ｔ４９２Ｖ、
（ｄ）Ｙ７０５Ｆ＋Ｙ７３１Ｆ＋Ｔ４９２Ｖ、
（ｅ）Ｓ６６３Ｖまたは
（ｆ）Ｓ６６３Ｖ＋Ｔ４９２Ｖ。
開示された方法とともに使用するのに適したさらなるカプシドは、その全体で参照により本明細書に組み込まれる、２０１８年８月３０日に公開された国際特許公開番号ＷＯ２０１８／１５６６５４に記載されている。特定の実施形態では、開示される本発明のｒＡＡＶ粒子は、以下のカプシドのうち１つを含む：ＤＧＥ－ＤＦ（「Ｖ１Ｖ４ ＶＲ－Ｖ」としても知られる）、Ｐ２－Ｖ２、Ｐ２－Ｖ３、Ｐ２－Ｖ１（ＭＥ－Ｂとしても知られる）およびＰ２－Ｖ１（Ｙ－Ｆ＋Ｔ－Ｖ）（ＭＥ－Ｂ（Ｙ－Ｆ＋Ｔ－Ｖ）としても知られる）。さらに他の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ６（３ｐＭｕｔ）またはＡＡＶ２（ｑｕａｄＹＦ＋Ｔ－Ｖ）から選択されるカプシドを含み得る。さらに他の実施形態では、開示される方法のｒＡＡＶ粒子は、国際特許公開番号ＷＯ２０１８／１５６６５４に記載されるカプシド変異体のいずれかを含み得る。
特定の実施形態では、網膜の細胞における前記ｒＡＡＶ粒子の形質導入の増強のためにＤＧＥ－ＤＦカプシド、Ｐ２－Ｖ２カプシド、Ｐ２－Ｖ３カプシド、Ｐ２－Ｖ１カプシド（ＭＥ－Ｂとしても知られる）またはＰ２－Ｖ１（Ｙ－Ｆ＋Ｔ－Ｖ）カプシドを含み得るｒＡＡＶ粒子が本明細書において開示される。他の実施形態では、開示されるｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ２（Ｙ４４４Ｆ）、ＡＡＶ２（Ｙ４４４Ｆ＋Ｙ５００Ｆ＋Ｙ７３０Ｆ）、ＡＡＶ２（Ｙ２７２Ｆ＋Ｙ４４４Ｆ＋Ｙ５００Ｆ＋Ｙ７３０Ｆ）、ＡＡＶ２（Ｙ４４４Ｆ＋Ｙ５００Ｆ＋Ｙ７３０Ｆ＋Ｔ４９１Ｖ）およびＡＡＶ２（Ｙ２７２Ｆ＋Ｙ４４４Ｆ＋Ｙ５００Ｆ＋Ｙ７３０Ｆ＋Ｔ４９１Ｖ）、ＡＡＶ６（Ｙ４４５Ｆ）、ＡＡＶ６（Ｙ７０５Ｆ＋Ｙ７３１Ｆ）、ＡＡＶ６（Ｙ７０５Ｆ＋Ｙ７３１Ｆ＋Ｔ４９２Ｖ）、ＡＡＶ６（Ｓ６６３Ｖ）、ＡＡＶ６（Ｔ４９２Ｖ）またはＡＡＶ６（Ｓ６６３Ｖ＋Ｔ４９２Ｖ）から選択されるカプシドを含み得る。
本開示の任意のＡＡＶベクターシステムにおいて使用される例示的逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）配列は、任意のＡＡＶ ＩＴＲを含み得る。ＡＡＶベクターにおいて使用されるＩＴＲは、同一である場合も、異なっている場合もある。特定の実施形態では、ＩＴＲは、ＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）、ＡＡＶ血清型５（ＡＡＶ５）、ＡＡＶ血清型７（ＡＡＶ７）、ＡＡＶ血清型８（ＡＡＶ８）、ＡＡＶ血清型４４．９（ＡＡＶ４４．９）またはそれらの変異体、例えば、ＡＡＶ血清型４４．９（Ｅ５３１Ｄ）および４４．９（Ｙ７３１Ｆ）から得ることができる（参照により本明細書に組み込まれる、２０２０年１月２３日に出願された、ＰＣＴ出願番号 ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／１４８３８を参照されたい）。本開示のＡＡＶベクターは、異なるＡＡＶ ＩＴＲを含む場合がある。限定されない例では、ベクターは、ＡＡＶ２のＩＴＲおよびＡＡＶ５のＩＴＲを含み得る。ＡＡＶ ＩＴＲ配列は、当技術分野で周知である（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０４３３０３．１、ＮＣ＿００１４０１．２、Ｊ０１９０１．１、ＪＮ８９８９６２．１、Ｋ０１６２４．１およびＫ０１６２５．１を参照されたい）。本明細書において開示されるＡＡＶデュアルベクターシステムは、普通、単一ＡＡＶベクター内にパッケージングできるものよりも大きい治療用遺伝子を効率的に発現させることができる。
したがって、一部の態様では、本開示は、本開示のポリヌクレオチドまたはベクターのいずれかを含むウイルスまたはビリオンを提供する。特定の実施形態では、ウイルスまたはビリオンは、ＡＡＶウイルスである。異種ポリヌクレオチドまたはベクターを含むウイルスおよびビリオンを調製する方法は、当技術分野で公知である。ＡＡＶの場合には、細胞を、アデノウイルスまたはＡＡＶヘルパー機能に適したアデノウイルス遺伝子を含むポリヌクレオチドベクターを用いて同時感染させるか、またはトランスフェクトすることができる。材料および方法の例は、例えば、米国特許第８，１３７，９６２号および同６，９６７，０１８号（それらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
特定の実施形態では、ＡＡＶ血清型は、カプシド表面での１または複数のチロシンからフェニルアラニンへの（Ｙ－Ｆ）突然変異を提供する。特定の実施形態では、ＡＡＶは、７３３位にチロシンからフェニルアラニンへの（Ｙ－Ｆ）突然変異（Ｙ７３３Ｆ）を有するＡＡＶ８血清型である。ＡＡＶ５およびＡＡＶ８（Ｙ７３３Ｆ）ビリオン中にカプシド形成された第２世代ハイブリッドおよびオーバーラップベクターの全長ＭＹＯ７Ａタンパク質を生成する能力が、図３６Ａ～３６Ｃおよび４５Ｂに示されている。ＡＡＶ８（Ｙ７３３Ｆ）ビリオンは、ウエスタンブロットによって測定されたようにＡＡＶ５ビリオンを上回った（図４５Ｂを参照されたい）。
一部の実施形態では、それぞれ、位置Ｙ７３３Ｆ、Ｙ５００ＦおよびＹ７３０ＦにチロシンからフェニルアラニンへのＴｙｒ－Ｐｈｅ突然変異を含有する三重－突然変異体ＡＡＶ８ベクターが使用される（図５を参照されたい）。他の実施形態では、位置Ｙ４４７Ｆ、Ｙ７３３ＦおよびＴ４９４ＶにチロシンからフェニルアラニンへのＴｙｒ－Ｐｈｅ突然変異を含有する三重－突然変異体ＡＡＶ８ベクター（例えば、ＡＡＶ８（Ｙ４４７Ｆ＋Ｙ７３３Ｆ＋Ｔ４９４Ｆ））が使用される。
例示的実施形態では、本開示のｒＡＡＶ粒子は、標準ＡＡＶシステムにおける送達には大きすぎる導入遺伝子または異種核酸を含み得る。例示的導入遺伝子は、制限するものではないが、ロドプシン、メラノプシン、錐体オプシン、チャネルロドプシン、細菌または古細菌関連オプシン、アドレナリン作動性のアゴニスト、抗アポトーシス因子、アポトーシス阻害剤、サイトカイン受容体、サイトカイン、細胞毒、赤血球形成剤、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、糖タンパク質、増殖因子、増殖因子受容体、ホルモン、ホルモン受容体、インターフェロン、インターロイキン、インターロイキン受容体、キナーゼ、キナーゼ阻害剤、神経増殖因子、ネトリン、向神経活性ペプチド、向神経活性ペプチド受容体、神経原性因子、神経原性因子受容体、ニューロピリン（ｎｅｕｒｏｐｈｉｌｉｎ）、神経栄養因子、ニューロトロフィン、ニューロトロフィン受容体、Ｎ－メチル－Ｄ－アスパラギン酸アンタゴニスト、プレキシン、プロテアーゼ、プロテアーゼ阻害剤、タンパク質デカルボキシラーゼ、タンパク質キナーゼ、タンパク質キナーゼ阻害剤、タンパク質分解性タンパク質、タンパク質分解性タンパク質阻害剤、セマフォリン、セマフォリン受容体、セロトニン輸送タンパク質、セロトニン取り込み阻害剤、セロトニン受容体、セルピン、セルピン受容体、腫瘍抑制因子およびそれらの任意の組合せを含む分子マーカー、感光性オプシンからなる群から選択される少なくとも１つの診断用または治療用タンパク質またはポリペプチドをコードする。
一部の実施形態では、導入遺伝子は、ヒトミオシンＶＩＩａポリペプチドをコードするｈＭＹＯ７Ａである。特定の実施形態では、ｈＭＹＯ７Ａポリペプチドは、配列番号６または配列番号８に示されるアミノ酸配列またはその機能的断片または変異体を含む。特定の実施形態では、ｈＭＹＯ７Ａポリペプチドは、配列番号５または配列番号７に示されるヌクレオチド配列によってコードされる。
一部の実施形態では、導入遺伝子は、ＵＳＨ１Ｃ、ＣＤＨ２３、ＰＣＤＨ１５およびＵＳＨ１Ｇであり、そのすべては、アッシャー症候群Ｉ型と関連している。一部の実施形態では、導入遺伝子は、ＵＳＨ２ＡおよびＤＦＮＢ３１であり、両方ともアッシャー症候群ＩＩがと関連している。一部の実施形態では、導入遺伝子は、ＡＢＣＡ４、ＣＥＰ２９０、ＥＹＳ、ＲＰ１、ＡＬＭＳ１、ＣＤＨ２３、ＰＣＤＨ１５、ＤＦＮＢ２またはＵＳＨＥＲＩＮである。
一部の実施形態では、それを必要とする対象の眼への開示されるポリヌクレオチドベクターのいずれかの投与は、視力喪失を部分的にまたは完全に回復させる。導入遺伝子は、ヒトＭＹＯ７Ａを含み得る。これらの投与は、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞におけるメラノソーム先端移動の部分または完全回復を提供し得る。
一部の実施形態では、眼の細胞（例えば、網膜細胞またはＲＰＥ細胞）における開示されるポリヌクレオチドベクターシステムのいずれかの導入遺伝子によってコードされる治療薬の生成は、以下の治療エンドポイントのうち１つまたは複数を提供する：ａ）１つもしくは複数の光受容体細胞または１つもしくは複数のＲＰＥ細胞を保存する、ｂ）１つもしくは複数の杆体－および／または錐体－媒介性機能を回復させる、ｃ）一方もしくは両方の眼において視覚挙動を回復させる、またはｄ）それらの組合せ。特定の実施形態では、開示される方法における治療薬の生成は、１つもしくは複数のＰＲ細胞、例えば、網膜の神経節細胞、双極性細胞、ミュラーグリア細胞またはアストロサイト細胞またはＲＰＥ細胞を保存する。
一部の実施形態では、治療薬の生成は、哺乳動物の片眼または両眼への開示されたｒＡＡＶポリヌクレオチドベクターシステムのいずれかの最初の投与後、実質的に少なくとも３ヶ月、少なくとも６ヶ月、少なくとも９か月または少なくとも１年またはそれより長い期間１つもしくは複数の光受容体細胞または１つもしくは複数のＲＰＥ細胞において持続する。
一部の実施形態では、それを必要とする対象の内耳への開示されたポリヌクレオチドベクターのいずれかの投与は、加齢性難聴を部分的にまたは完全に回復させる。一部の実施形態では、内耳への投与は加齢性難聴を回復させる。導入遺伝子は、ヒトＭＹＯ７Ａを含み得る。これらの投与は、内耳中の前庭機能の部分的または完全回復を提供し得る。一部の実施形態では、開示されるハイブリッドまたはオーバーラップベクターのいずれかを前庭有毛細胞、内耳有毛細胞、外耳有毛細胞またはそれらの組合せに投与できる。
このようにして、本開示のポリヌクレオチドベクターシステムおよびその組成物を使用して、眼および／または内耳においてＵＳＨ１Ｂ（アッシャー症候群１Ｂ型）の症状を処置または寛解させることができる。同様に、本開示のベクターシステムおよび組成物の投与を使用して、常染色体劣性孤立性難聴（ＤＦＮＢ２）、聴覚消失および／または視力喪失の症状を処置または寛解させることができる。例として、本開示のベクターシステムおよび組成物の投与を使用して、ＭＹ０７Ａタンパク質発現の不足と関連する聴覚消失（ＵＳＨｌＢ患者において存在する場合がある）を処置または寛解させることができる。一部の実施形態では、本開示のベクターシステムおよび組成物の投与を使用して、劣性欠損ＭＹ０７Ａ対立遺伝子の保有者（すなわち、ＵＳＨｌＢ保有者）において現れる加齢性難聴またはＭＹ０７Ａ発現の非遺伝性欠乏または不足の結果としての加齢性難聴を処置または寛解できる。
別の例として、本開示のベクターシステムおよび組成物の投与は、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞におけるメラノソーム移動の回復を提供できる。
一部の実施形態では、本開示は、目的のベクターを用いて適宜形質転換された哺乳動物細胞における１つまたは複数の内因性生物学的プロセスの活性を変更する、阻害する、低減する、防ぐ、排除する、または損なう１つもしくは複数の診断薬または治療薬をコードする少なくとも第１の核酸セグメントを含むｒＡＡＶ核酸ベクターを提供する。ある特定の実施形態では、このような診断薬または治療薬は、１または複数の代謝プロセス、機能障害、障害または疾患の影響を選択的に阻害または低減する分子を含み得る。ある特定の実施形態では、欠陥は、処置が望まれる哺乳動物への傷害または外傷によって引き起こされる場合がある。他の実施形態では、欠陥は、内因性生物学的化合物の過剰発現によって引き起こされる場合があるが、他の実施形態ではなお、欠陥は、１つまたは複数の内因性生物学的化合物の発現不足またはさらに欠如によって引き起こされる場合がある。
ｒＡＡＶベクターの調節エレメント
本開示のベクターシステムのいずれも、ベクターが発現される予定である意図される宿主細胞において機能的である調節エレメントを含み得る。当業者ならば、適当な宿主細胞、例えば、哺乳動物またはヒト宿主細胞において使用するための調節エレメントを選択できる。調節エレメントには、例えば、プロモーター、転写終結配列、翻訳終結配列、エンハンサーおよびポリアデニル化エレメントが含まれる。
本開示のベクターシステムのいずれも、所望のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結したプロモーター配列を含み得る。本開示において使用するために企図されるプロモーターとして、それだけには限らないが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ヒトミオシン７ａ遺伝子由来プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、キメラＣＭＶ／ニワトリβ－アクチンプロモーター（ＣＢＡ）およびＣＢＡの末端切断形態（ｓｍＣＢＡ）が挙げられる（例えば、各々、参照により本明細書に組み込まれる、Haire et al. 2006および米国特許第８，２９８，８１８号を参照されたい）。さらなる光受容体特異的、ヒトロドプシンキナーゼ（ｈＧＲＫ１）プロモーター、杆体特異的ＩＲＢＰプロモーター、ＶＭＤ２（卵黄様黄斑変性症／ベスト病）プロモーター、ＲＰＥ特異的卵黄様黄斑変性症－２［ＶＭＤ２］プロモーターおよびＥＦ１－アルファプロモーター配列も、種々の本開示の態様の実行において有用であると企図される。例示的光受容体細胞特異的プロモーターとして、それだけには限らないが、ｈＧＲＫ１、ＩＲＢＰ、杆体オプシン、ＮＲＬ、ＧＮＡＴ２ｅ－ＩＲＢＰ、Ｌ／Ｍオプシンおよび錐体アレスチンプロモーターが挙げられる。
特定の実施形態では、プロモーターは、キメラＣＭＶ－β－アクチンプロモーターである。特定の実施形態では、プロモーターは、１つのまたは１群の組織において選択的活性を示すが、他の組織ではあまり活性ではないか、または活性ではない組織特異的プロモーターである。特定の実施形態では、プロモーターは、光受容体特異的プロモーターである。さらなる実施形態では、プロモーターは、好ましくは、錐体細胞特異的プロモーターまたは杆体細胞特異的プロモーターまたはそれらの任意の組合せである。特定の実施形態では、プロモーターは、ヒトＭＹＯ７Ａ遺伝子のプロモーターである。さらなる実施形態では、プロモーターは、錐体トランスデューシンα（ＴαＣ）遺伝子由来プロモーターを含む。特定の実施形態では、プロモーターは、ヒトＧＮＡＴ２由来プロモーターである。本開示の範囲内で企図される他のプロモーターとして、制限するものではないが、ロドプシンプロモーター（ヒトまたはマウス）、ｃＧＭＰ－ホスホジエステラーゼβ－サブユニットプロモーター、網膜色素変性症特異的プロモーター、ＲＰＥ細胞特異的プロモーター［例えば、卵黄様黄斑変性症－２（ＶＭＤ２）プロモーター（Ｂｅｓｔ１）（Esumi et al., 2004)］またはそれらの任意の組合せが挙げられる。
プロモーターを、分子生物学および／またはウイルス学の分野の当業者に公知の標準技術を使用してベクター中に組み込むことができる。本開示のベクターにおいてプロモーターの複数のコピーおよび／または複数の別個のプロモーターを使用できる。１つのこのような実施形態では、プロモーターを、その天然遺伝子環境における転写開始部位からとほぼ同一の転写開始部位からの距離に、もちろんこの距離において幾分かの変動が許容されるが、プロモーター活性の実質的な低下を伴うことなく位置付けることができる。本開示の実行において、１つまたは複数の転写開始部位が、開示されるベクター内に通常含まれる。
本開示のベクターは、１つもしくは複数の転写終結配列、１つもしくは複数の翻訳終結配列、１つもしくは複数のシグナルペプチド配列、１つもしくは複数の配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）および／または１つもしくは複数のエンハンサーエレメントまたはそれらの任意の組合せをさらに含み得る。転写終結領域は、真核生物のまたはウイルスの遺伝子配列の３’非翻訳領域から通常得ることができる。転写終結配列をコード配列の下流に位置付けて、効率的な終結を提供することができる。
開示されるポリヌクレオチドベクターのいずれも、例えば、それだけには限らないが、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＲＰＥ）、ポリアデニル化シグナル配列またはイントロン／エクソン接合部／スプライシングシグナルまたはそれらの任意の組合せを含む、１つもしくは複数の転写後調節配列または１つもしくは複数のポリアデニル化シグナルをさらに含むことができる。
シグナルペプチド配列とは、例えば、特定のオルガネラコンパートメントを含む１つもしくは複数の翻訳後細胞目的地への、またはタンパク質合成および／もしくは活性の部位への、およびさらには細胞外環境への作動可能に連結されたポリペプチドの局在化に関与する情報をコードするアミノ末端ペプチド性配列である。
エンハンサー－遺伝子転写を増大するシス作動性調節エレメント－を、開示されるＡＡＶベースのベクターシステムのうち１つに含めることができる。さまざまなエンハンサーエレメントが、関連技術分野の当業者に公知であり、これには、制限するものではないが、ＣａＭＶ ３５Ｓエンハンサーエレメント、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期プロモーターエンハンサーエレメント、ＳＶ４０エンハンサーエレメントならびにそれらの組合せおよび／または誘導体が含まれる。目的の構造遺伝子によってコードされるｍＲＮＡのポリアデニル化を指示または調節する１つまたは複数の核酸配列もまた、本開示のベクターのうち１つまたは複数中に適宜含めることができる。
細胞を形質導入するための宿主細胞および方法
本開示は、開示されるポリヌクレオチドベクターシステムのベクターを含む宿主細胞を提供する。一部の実施形態では、オーバーラップポリヌクレオチドベクターシステムを含む単離された宿主細胞が提供される。一部の実施形態では、ハイブリッドポリヌクレオチドベクターシステムを含む単離された宿主細胞が提供される。特定の実施形態では、第２世代ハイブリッドを含む単離された宿主細胞および第２世代オーバーラップベクターを含む単離された宿主細胞が提供される。
開示されるデュアルベクターシステムのいずれかを含む適した宿主細胞の例として、それだけには限らないが、光受容体細胞、錐体細胞、杆体細胞、網膜細胞（例えば、神経節細胞、網膜色素上細胞）またはそれらの組合せが挙げられる。網膜細胞の例として、網膜神経節細胞（ＲＧＣ）、ミュラー細胞、星状細胞および双極性細胞が挙げられる。
適した宿主細胞のさらなる例として、前庭有毛細胞、内耳有毛細胞、外耳有毛細胞またはそれらの任意の組合せがある。
本開示はまた、細胞において選択されたポリペプチドを発現させるまたは形質導入する方法を提供する。特定の実施形態では、方法は、本明細書において開示されるようなＡＡＶベースのデュアルベクターシステムを細胞中に組み込むことであって、ベクターシステムが、選択されたポリペプチドをコードし、目的のポリヌクレオチド配列を含む、組み込むことと、細胞においてポリヌクレオチド配列発現されることとを含む。
ある特定の実施形態では、選択されたポリペプチドは、細胞にとって異種であるポリペプチドであり得る。特定の実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞、好ましくは、ヒト細胞である。特定の実施形態では、細胞は、ヒト光受容体細胞、好ましくは、ヒト光受容体錐体細胞または光受容体杆体細胞である。特定の実施形態では、細胞は、野生型、機能性および／または本明細書において開示されるようなベクターシステム中に存在する核酸セグメントによってコードされる生物学的に活性なｈＭＹＯ７Ａポリペプチドを発現する。特定の実施形態では、ｈＭＹＯ７Ａポリペプチドは、配列番号５または配列番号７において示されるヌクレオチド配列によってコードされる。
特定の実施形態では、細胞は、光受容体細胞である。特定の実施形態では、細胞は、錐体細胞であり、好ましくは、それはヒト錐体細胞またはヒト杆体細胞である。このような細胞は、少なくとも本開示の第１のＡＡＶベースのデュアルベクターシステムにおいて提供される１つまたは複数のヌクレオチド配列を発現し得る。特定の実施形態では、細胞は、野生型、機能性および／または本明細書において開示されるようなＡＡＶベースのベクターシステムのうち１つまたは複数内に含まれる核酸セグメントによってコードされる生物学的に活性なｈＭＹＯ７Ａポリペプチドを発現する。特定の実施形態では、ｈＭＹＯ７Ａポリペプチドは、配列番号５または配列番号７のヌクレオチド配列によってコードされる。
したがって、ある特定の実施形態では、本開示は、哺乳動物（例えば、ヒト）の１つもしくは複数の光受容体細胞または１つもしくは複数のＲＰＥ細胞において、ポリヌクレオチドベクターシステムを形質導入するまたは発現させる方法を提供する。全体的な、一般的な意味で、このような方法は、哺乳動物の片眼または両眼に、ポリヌクレオチドが、少なくとも、治療薬をコードする第１の異種核酸セグメントに作動可能に連結されたＰＲ－またはＲＰＥ－細胞特異的プロモーターを含む少なくとも第１のポリヌクレオチドをさらに含む、本明細書において開示されるｒＡＡＶ粒子のうち１つまたは複数を、哺乳動物の１つもしくは複数のＰＲ細胞またはＲＰＥ細胞において治療薬を生成するのに有効な時間の間、投与すること（例えば、網膜下に直接的に投与すること）を含む。ある特定の実施形態では、治療用ポリヌクレオチドは、光受容体細胞、網膜色素上皮細胞、網膜神経節細胞、双極性細胞、ミュラーグリア細胞またはアストロサイト細胞またはそれらの組合せにおいて安定に発現される。ある特定の実施形態では、治療用ポリペプチドは、前庭有毛細胞、内耳有毛細胞または外耳有毛細胞において安定に発現される。
処置および形質導入の方法
一部の態様では、本開示は、遺伝子療法およびＡＡＶベースのデュアル本開示のベクターシステムを使用してヒトまたは動物において、疾患または状態、例えば、眼の疾患を処置または寛解する方法を提供する。特定の実施形態では、本開示の方法は、疾患または状態の処置または回復を提供するポリペプチドをコードする本開示のベクターシステムを投与することを含む。特定の実施形態では、本開示のベクターは、ＡＡＶウイルスまたはビリオン中で提供される。ベクターシステムは、インビボまたはエキソビボで投与できる。
特定の実施形態では、本開示のベクターシステムは、非経口投与、例えば、硝子体内、網膜下、静脈内、筋肉内、眼球内、卵形嚢または鼻腔内注射によって組換えＡＡＶ粒子中で投与される。一部の実施形態では、ベクターシステムは、参照により本明細書に組み込まれる、Lee et al., Hearing Research Vol. 394 (2020) 107882において記載されるように、例えば、耳の有毛細胞に、重力に対して感受性である２つの嚢様耳石器官のうち１つである卵形嚢中への注射によって投与される。例えば、耳の有毛細胞への投与は、正円窓注射によって、または人工内耳手術の際であり得る。特定の実施形態では、本開示のベクターシステムは、眼球内、硝子体内または網膜下注射によってヒトまたは動物に投与される。
一部の実施形態では、本開示の組換えＡＡＶ粒子は、約１×１０８ｖｇ／ｍｌ、５×１０８ｖｇ／ｍｌ、８×１０８ｖｇ／ｍｌ、１×１０９ｖｇ／ｍｌ、５×１０９ｖｇ／ｍｌ、１×１０１０ｖｇ／ｍｌ、５×１０１０ｖｇ／ｍｌ、１×１０１１ｖｇ／ｍｌ、５×１０１１ｖｇ／ｍｌ、１×１０１２ｖｇ／ｍｌ、２×１０１２ｖｇ／ｍｌ、３×１０１２ｖｇ／ｍｌ、４×１０１２ｖｇ／ｍｌ、約５×１０１２ｖｇ／ｍｌ、約１×１０１３ｖｇ／ｍｌ、または約５×１０１３ｖｇ／ｍｌ、の力価で網膜下注射によって投与される。特定の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、５．０×１０８ｖｇまたは８．０×１０８ｖｇの力価で投与される。
一部の実施形態では、網膜下注射は、約２００μＬ、約１７５μＬ、約１６０μＬ、約１４５μＬ、約１３０μＬ、約１１５μＬ、約１００μＬ、約９０μＬ、約８０μＬ、約７０μＬ、約６０μＬ、約５５μＬ、約５０μＬ、約４５μＬ、約３５μＬ、約２０μＬ、約１０μＬまたは約５μＬの容量で提供される。特定の実施形態では、注射は、約５０μＬの容量で提供される。投与されるべき投与計画および有効量は、通常の熟練した臨床医によって決定できる。投与は、単回用量または複数回用量の形態であり得る。ポリヌクレオチド、発現コンストラクトおよびベクターを使用する遺伝子療法を実施するための一般的な方法は、当技術分野で公知である（例えば、各々、明示的に参照することにより、その全体が本明細書に具体的に組み込まれる、Gene Therapy: Principles and Applications (1999)、および米国特許第６，４６１，６０６号、同６，２０４，２５１号および同６，１０６，８２６号を参照されたい）。
特定の実施形態では、処置されるべき疾患、障害または状態は、アッシャー症候群である。一部の実施形態では、処置されるべき疾患または障害は、常染色体劣性孤立性難聴（ＤＦＮＢ２）である。他の実施形態では、疾患、障害または状態、例えば、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、湿式ＡＭＤ、乾式ＡＭＤまたは地図状萎縮。ある特定の実施形態では、疾患または障害は、網膜色素変性症または緑内障である。
開示されるデュアルベクターシステムを、遺伝子療法および／またはウイルスの技術分野の当業者に公知である方法のうち任意の１つまたは複数を使用して１つまたは複数の選択された哺乳動物細胞中に導入できる。このような方法として、制限するものではないが、トランスフェクション、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、リポフェクション、細胞融合およびリン酸カルシウム沈殿ならびに微粒子銃方法が挙げられる。特定の実施形態では、本開示のベクターを、例えば、リポフェクション（例えば、１つまたは複数のカチオン性脂質から調製されたリポソームを介したＤＮＡトランスフェクション）によってを含めてインビボで導入できる（例えば、Felgner et al., 1987を参照されたい）。合成カチオン性脂質（リポフェクチン（登録商標）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．、米国、カリフォルニア州、ラホーヤ）を使用して、ベクターをカプセル化するリポソームを調製して、１つまたは複数の選択された細胞中へのその導入を容易にすることができる。本開示のベクターシステムを、当業者に公知の方法を使用して「裸の」ＤＮＡとしてインビボで導入できる。
全体的な、一般的な意味で、開示される方法は、少なくとも、本明細書において開示されるｒＡＡＶ粒子のうち１つまたは複数を、それを必要とする哺乳動物の片眼または両眼に、哺乳動物において疾患、障害、機能障害、傷害、異常な状態または外傷の１つまたは複数の症状を処置するまたは寛解させるのに十分な量および時間の間投与する工程を含む。一部の実施形態では、哺乳動物はヒトである。一部の実施形態では、ヒトは、新生児（ｎｅｏｎａｔｅ）、新生児（ｎｅｗｂｏｒｎ）、乳児または若年者である。本開示の実行では、適した患者には、例えば、制限するものではないが、遺伝的に関連がある、または遺伝性である網膜障害、疾患およびジストロフィーを含めて、１つまたは複数の網膜障害、疾患またはジストロフィーを有する、それを有すると疑われる、それを発生するリスクにある、それと診断されているヒトが含まれるであろうということが企図される。
一部の態様では、本開示は、哺乳動物の眼における種々の欠陥、特に、ヒト光受容体もしくはＲＰＥ細胞における１つもしくは複数の欠陥の症状を処置するもしくは寛解させる方法における、または症状を処置するもしくは寛解させる医薬の調製における、本明細書において記載される粒子、ベクター、ウイルス粒子、発現システム、組成物および宿主細胞の使用の方法を提供する。症状の処置または寛解のための眼の例示的疾患および障害（例えば、ＰＲまたはＲＰＥ細胞における１つまたは複数の遺伝子欠陥によって引き起こされる）として、網膜色素変性症、レーバー先天黒内障（例えば、ＬＣＡ１０）、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、湿式ＡＭＤ、乾式ＡＭＤ、ブドウ膜炎、ベスト病、シュタルガルト病、アッシャー症候群、地図状萎縮、糖尿病性網膜症、網膜分離症、色覚異常、脈絡膜欠如症、バルデ・ビードル症候群および糖原病（眼の徴候）が挙げられる。
一部の実施形態では、それを必要とする対象への開示されるベクター、ウイルス粒子または組成物のいずれかの投与は、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞におけるメラノソーム移動の部分または完全回復を提供する。例示的実施形態では、ポリヌクレオチドベクターシステム、ウイルス粒子または組成物のいずれかの投与は、視力喪失の部分または完全回復を提供する。
一部の態様では、本開示は、哺乳動物の耳における種々の欠陥、特に、聴覚の有毛細胞および前庭システムの有毛細胞における１つもしくは複数の欠陥の症状を処置するもしくは寛解させる方法における、または症状を処置するもしくは寛解させる医薬の調製における、本明細書において記載される粒子、ベクター、ウイルス粒子、発現システム、組成物および宿主細胞の使用の方法を提供する。例示的実施形態では、それを必要とする対象は、アッシャー症候群または常染色体劣性孤立性難聴（ＤＦＮＢ２）から選択される疾患または障害を患っている。一部の実施形態では、対象は、アッシャー症候群１Ｂ、１Ｄ、１Ｆまたは２Ａ型を患っている。
一部の実施形態では、対象は、シュタルガルト病、ＬＣＡ１０、網膜色素変性症、アルストレーム症候群、アッシャー症候群１Ｂ、１Ｄ、１Ｆまたは２Ａ型、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、嚢胞性線維症、糖原病ＩＩＩ、非症候性難聴、血友病Ａまたはジスフェリン異常症から選択される眼の疾患もしくは状態および／または耳の疾患もしくは障害を患っている。
このような方法は、それを必要とする対象の片眼または両眼へ、開示される粒子ベクター、ウイルス粒子、宿主細胞または組成物のうち１または複数を、罹患哺乳動物においてこのような欠乏症の症状を処置するまたは寛解させるのに十分な量および時間の間、硝子体内または網膜下投与することを含み得る。方法はまた、このような状態を有すると疑われる動物の予防的処置またはこのような状態を発生するリスクにある動物への、診断後もしくは症状の発生前のいずれかでのこのような組成物の投与を包含し得る。
医薬組成物およびキット
注射または注入に適した医薬投与形は、有効成分を含む無菌水溶液もしくは分散物または無菌散剤を含むことができ、これらは、無菌注射可能または注入可能溶液もしくは分散物の即時調製に適応しており、適宜、リポソーム中に被包されていてもよい。最終投与形は、製造および保存の条件下で無菌、流体および安定でなくてはならない。液体担体または媒体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、植物油、非毒性グリセリルエステルおよびそれらの適した混合物を含む溶媒または液体分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、リポソームの形成によって、分散物の場合には必要な粒子サイズの維持によって、または界面活性剤の使用によって維持できる。適宜、種々の他の抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによって、微生物の作用の防止を引き起こすことができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖、バッファーまたは塩化ナトリウムを含むことが好ましいであろう。吸収を遅延する薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含めることによって、注射可能組成物の長期吸収を引き起こすことができる。
本開示はまた、本開示のベクターシステムを薬学的に許容される担体と組み合わせて含む医薬組成物を提供する。一定量の化合物を含む局所または非経口投与に適応している医薬組成物が本開示の好ましい実施形態を構成する。本開示との関連で患者、特に、ヒトに投与される用量は、致死的毒性を伴わずに、好ましくは、許容されるレベル以下の副作用または罹病率を引き起こしながら、妥当な時間枠にわたって患者において治療応答を達成するのに十分でなくてはならない。当業者ならば、投与量は、対象の状態（健康）、対象の体重、現在の処置の種類、あるとすれば、処置の頻度、治療比ならびに病的状態の重症度およびステージを含むさまざまな因子に応じて変わるということは認識するであろう。
本開示はまた、１つまたは複数の容器中に本開示のベクターシステムを含むキットを提供する。本開示のキットは、適宜、薬学的に許容される担体および／または希釈剤を含む場合もある。特定の実施形態では、本開示のキットは、本明細書において記載されるような、１つまたは複数の他の構成成分、補助剤またはアジュバントを含む。特定の実施形態では、本開示のキットは、キット内に含有されるベクターシステムを選択された哺乳動物レシピエントに投与する方法を説明する使用説明書またはパッケージング材料を含む。
開示されるキットの容器は、任意の適した材料、例えば、ガラス、プラスチック、金属などのものである場合があり、任意の適したサイズ、形状または配置のものである場合がある。特定の実施形態では、キット中に固体として本開示のベクターシステムが提供される。別の実施形態では、キット中に液体または溶液として本開示のベクターシステムが提供される。ある特定の実施形態では、キットは、適した液体または溶液形態で本開示のベクターシステムを含有する、１つまたは複数のアンプルまたはシリンジを含み得る。
開示されるデュアルベクターのいずれか（フロントハーフベクターおよびバックハーフベクター）の予混合物を含有するキットが本明細書においてさらに企図される。これらの予混合物は、単回容器および／または適した液体もしくは溶液形態の単一薬剤製品中であり得る。
本開示はまた、それだけには限らないが、疾患、障害もしくは機能障害の処置、防止および／もしくは予防ならびに／またはこのような疾患、障害もしくは機能障害の１つもしくは複数の症状の寛解を含む、疾患、障害、機能障害、傷害もしくは外傷の症状の処置、防止もしくは寛解のための医薬の製造における、本明細書において開示されるバッファーおよび組成物の使用を提供する。
ＡＡＶ組成物の量およびこのような組成物の投与の時間は、本教示の恩恵を受ける当業者の範囲内にある。開示される組成物の治療上有効量の投与は、単回投与、例えば、このような処置を受けている患者に治療的利益を提供するのに十分な数の感染性粒子の単回注射などによって達成できる。あるいは、一部の状況では、このような組成物の投与を監督する医師によって決定できるように、ＡＡＶベクター組成物の複数回のまたは逐次の投与を、比較的短い期間にわたって、または比較的長期の期間にわたってのいずれかで提供することが望ましい場合がある。
例えば、哺乳動物に投与される感染性粒子の数は、処置されている特定の疾患または障害の療法を達成するために必要であり得るような単回用量として（または２つまたはそれより多い投与などに分割された）いずれかで与えられる、およそ１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３個またはさらに高い感染性粒子／ｍＬ、であり得る。実際、ある特定の実施形態では、特定のレジメンまたは療法の所望の効果を達成するために、２種またはそれより多い異なるｒＡＡＶ粒子ベースまたはベクターベースの組成物を、単独または１つもしくは複数の他の診断薬、薬物、生理活性物質もしくはそのようなものと組み合わせて投与することが望ましい場合がある。ほとんどのｒＡＡＶベクターによる遺伝子療法ベースのレジメンでは、本発明者らは、ＡＡＶカプシドをＨＡとともに前処置し、同時投与する開示される方法を実施する場合には、低力価の感染性粒子が必要となることを考慮する。
本開示に従う治療薬を発現するために、１つまたは複数のプロモーターの制御下に治療薬をコードする核酸セグメントを含むｒＡＡＶ粒子を調製できる。配列をプロモーター「の制御下に」おくために、転写リーディングフレームの転写開始部位の５’末端を、一般に、選択されたプロモーターの約１から約５０ヌクレオチドの間「下流」に（例えば、３’に）配置する。「上流」プロモーターは、ＤＮＡの転写を刺激し、コードされるポリペプチドの発現を促進する。これが、この文脈における「組換え発現」の意味である。一部の実施形態では、組換えベクターコンストラクトは、１つまたは複数の診断薬および／または治療薬をコードする少なくとも１つの核酸セグメントに作動可能に連結されたＲＰＥ細胞特異的または光受容体細胞特異的プロモーターを含有するカプシド－タンパク質改変ｒＡＡＶベクターを含むものである。
ベクターを用いてトランスフェクトされた特定の細胞への１つまたは複数の外因性タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、リボザイムおよび／またはアンチセンスオリゴヌクレオチドの導入のために、このようなベクターの使用が企図される場合には、本明細書において開示されるｒＡＡＶ粒子を使用して、１つまたは複数の外因性ポリヌクレオチドを、選択された宿主細胞に、例えば、哺乳動物の眼内の１つまたは複数の選択された細胞に送達できる。
一部の実施形態では、対象に投与されるウイルス粒子の数は、およそ１０６～１０１４個粒子／ｍｌ、または１０３～１０１５個粒子／ｍｌ、の範囲またはいずれかの範囲の間の任意の値、例えば、約１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３または１０１４個粒子／ｍｌ、などであり得る。一実施形態では、１０１３個粒子／ｍｌ、より高いウイルス粒子が投与され得る。一部の実施形態では、対象に投与されるウイルス粒子の数は、およそ１０６～１０１４ベクターゲノム（ｖｇｓ）／ｍｌ、または１０３～１０１５ｖｇｓ／ｍｌ、またはいずれかの範囲の間の任意の値、例えば、約１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３または１０１４ｖｇｓ／ｍｌ、などであり得る。一実施形態では、１０１３ｖｇｓ／ｍｌ、より高いウイルス粒子が投与され得る。ウイルス粒子は、処置されている特定の疾患または障害の療法を達成するために必要であり得るような単回用量として、または２つもしくはそれより多い投与などに分割されて投与できる。一部の実施形態では、ｄｏｓｅｓ ｏｆ ０．０００１ｍｌ～１０ｍｌ、例えば、０．００１ｍｌ、０．０１ｍｌ、０．１ｍｌ、１ｍｌ、２ｍｌ、５ｍｌまたは１０ｍｌの用量が対象に送達される。
一部の実施形態では、本開示は、単独または１つもしくは複数の他の療法様式と組み合わせて、細胞または動物に投与するための、特に、ヒト細胞、組織および人間に影響を及ぼす疾患の療法のための、薬学的に許容される溶液中の本明細書において開示される１つまたは複数のウイルスベースの組成物の製剤を提供する。
望まれる場合には、本明細書において記載されるｒＡＡＶ粒子は、同様に他の薬剤、例えば、タンパク質またはポリペプチドまたは種々の薬学的に許容される薬剤などと組み合わせて投与でき、治療用ポリペプチド、その生物学的に活性な断片または変異体の１回または複数回の全身または局所投与を含む。実際、さらなる薬剤は、標的細胞または宿主組織との接触の際に相当な有害効果を引き起こさないと仮定すると、同様に含むことができる他の構成成分の制限は実質的にはない。したがって、ｒＡＡＶ粒子を、特定の例における必要に応じて種々の他の薬剤とともに送達できる。このような組成物は、宿主細胞または他の生物学的供給源から精製できる、あるいは、本明細書において記載されるように化学的に合成できる。
例えば、経口、非経口、眼球内（例えば、網膜下または硝子体内）、静脈内、鼻腔内、関節内、卵形嚢内、蝸牛内および筋肉内投与を含むさまざまな処置レジメンならびに製剤化において、本明細書において記載される特定の組成物を使用するための、適した投薬および処置レジメンの開発と同様に、薬学的に許容されるバッファー、賦形剤および担体溶液の製剤化は当業者に周知である。
通常、これらの製剤は、少なくとも約０．１％の治療薬（例えば、ｒＡＡＶ粒子）またはそれより多くを含有できるが、有効成分（複数可）のパーセンテージは、もちろん変わる場合があり、従来、製剤全体の質量または容量の約１または２％から約７０％または８０％の間またはそれより多くであり得る。当然、各治療上有用な組成物における治療薬（複数可）の量は、適した投与量が化合物の任意の所与の単位用量で得られるような方法で調製できる。溶解度、バイオアベイラビリティ、生物学的半減期、投与経路、製品有効期間ならびに他の薬理学的検討事項などの因子が、このような医薬製剤を調製する当業者によって考慮され、そのようなものとして、さまざまな投与量および処置レジメンが望ましい場合がある。
「賦形剤」という用語は、ともにｒＡＡＶ粒子が投与される希釈剤、アジュバント、担体または媒体を指す。このような医薬賦形剤は、無菌液体、例えば、水ならびに石油オイル、例えば、鉱油、植物油、例えば、ピーナッツ油、ダイズ油およびゴマ油、動物油または合成起源のオイルのものを含むオイルであり得る。生理食塩水溶液および水性デキストロースおよびグリセロール溶液も液体担体として使用できる。例示的賦形剤および媒体として、それだけには限らないが、ＨＡ、ＢＳＳ、人工ＣＳＦ、ＰＢＳ、乳酸リンゲル液、ＴＭＮ２００溶液、ポリソルベート２０およびポロキサマー１００が挙げられる。
ｒＡＡＶ粒子組成物の量およびこのような組成物の投与の時間は、本教示の恩恵を受ける当業者の範囲内にある。しかし、開示される組成物の治療上有効量の投与は、単回投与、例えば、このような処置を受けている患者に治療的利益を提供するのに十分な数のウイルス粒子の単回注射などによって達成できる可能性が高い。あるいは、一部の状況では、このような組成物の投与を監督する医師によって決定できるように、組成物の複数回のまたは逐次の投与を、比較的短い期間にわたって、または比較的長期の期間にわたってのいずれかで提供することが望ましい場合がある。
例示的組成物は、ｒＡＡＶ粒子または核酸ベクターを、単独または天然もしくは組換え供給源から得ることができる、または化学的に合成できる、１つもしくは複数のさらなる有効成分と組み合わせて含み得る。
ｒＡＡＶ粒子を製造する方法
組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターは、多種多様な治療用遺伝子の長期発現のためのヒト疾患の多数の前臨床動物モデルにおいてインビボ遺伝子導入のために成功裏に使用されてきた（Daya and Berns, 2008; Niemeyer et al., 2009; Owen et al., 2002; Keen-Rhinehart et al., 2005; Scallan et al., 2003; Song et al., 2004）。ＡＡＶベクターはまた、免疫特権のある部位に標的化される場合、例えば、レーバー先天黒内障のための眼の送達の場合にヒトにおいて長期臨床利益をもたらした（Bainbridge et al., 2008; Maguire et al., 2008; Cideciyan et al., 2008）。このベクターの主要な利点は、その比較的低い免疫プロファイルであり、制限された炎症反応のみを誘発し、一部の場合には、免疫寛容をを導入遺伝子産物にさえ向ける（LoDuca et al., 2009）。それにもかかわらず、治療効率は、免疫免疫特権のない臓器に標的化された場合に、ヒトではウイルスカプシドに対する抗体およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答のために制限されたが、動物モデルでは、導入遺伝子産物に対する適応応答も報告されている（Manno et al., 2006; Mingozzi et al., 2007; Muruve et al., 2008; Vandenberghe and Wilson, 2007; Mingozzi and High, 2007）。これらの結果は、免疫応答が依然としてＡＡＶベクター媒介性遺伝子導入の懸念のままであることを示唆した。
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、その効率、持続性および低い免疫原性のために眼の遺伝子療法のための最適ベクターと考えられる（Daya and Berns, 2008）。硝子体を介してＰＲを形質導入可能なベクターを同定することは、歴史的に、局所送達後にどの血清型がこの細胞種に対して天然指向性を有するかを同定することに依存してきた。いくつかの血清型を使用して、網膜下注射（例えば、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５およびＡＡＶ８を含む）後に導入遺伝子をＰＲに成功裏に標的化した。３つすべてが複数の哺乳動物種（例えば、マウス、ラット、イヌ、ブタおよび非ヒト霊長類）にわたって実施した実験における有効性を実証した（Ali et al., 1996; Auricchio et al., 2001; Weber et al., 2003; Yang et al., 2002; Acland et al., 2001; Vandenberghe et al., 2011; Bennett et al., 1999; Allocca et al., 2007; Petersen-Jones et al., 2009; Lotery et al., 2003; Boye et al., 2012; Stieger et al., 2008; Mussolino et al., 2011; Vandenberghe et al., 2011）。
げっ歯類における網膜下送達後のその相対効率を比較する研究によって、ＡＡＶ５およびＡＡＶ８の両方とも、ＡＡＶ２よりも効率的にＰＲを形質導入し、ＡＡＶ８は最も効率的であることが示されている（Yang et al., 2002; Allocca et al., 2007; Rabinowitz et al., 2002; Boye et al., 2011; Pang et al., 2011）。表面に露出したチロシン残基の点突然変異（チロシンからフェニルアラニン、への、Ｙ－Ｆ）を含有するＡＡＶ２およびＡＡＶ８ベクターは、網膜下および硝子体内注射の両方の後に、未改変ベクターと比較してさまざまな網膜細胞種において導入遺伝子発現の増大を示すことがこれまでに示された（Petrs-Silva et al., 2009; Petrs-Silva et al., 2011）。それらの著者によって最初に試験されたベクターのうち、ＡＡＶ２三重突然変異体（「トリプルＹ－Ｆ」と名付けられた）は、硝子体内注射後に最高の形質導入効率を示したが、ＡＡＶ２四重突然変異体（「クワッドＹ－Ｆ」）は、外網膜の形質導入の増強という新規特性を示した（Petrs-Silva et al., 2011）。
形質導入効率のさらなる改善は、表面に露出したトレオニン（Ｔ）またはセリン（Ｓ）残基の、それらのアミノ酸のうち１つまたは複数での非天然アミノ酸への方向付けられた突然変異誘発を介して達成された。Ｙ－ＦおよびＴ－Ｖ／Ｔ－Ａ突然変異の両方とも、カプシドのリン酸化およびその後のプロテオソーム分解経路の一部としてのユビキチン化を減少させることによって効率を増大すると示されている（Zhong et al., 2008; Aslanidi et al., In Press; Gabriel et al., 2013）。硝子体内に送達されたＡＡＶの形質導入プロファイルは、注射手順自体に大きく依存することが見出されている。マウスの眼の小さいサイズのために、経強膜、硝子体内注射が網膜に損傷をもたらすことは珍しくなく、これは、幾分かのベクターの網膜下腔への直接的な送達を可能にする可能性がある。
本開示に従う有用な例示的ｒＡＡＶ核酸ベクターには、一本鎖（ｓｓ）または自己相補的（ｓｃ）ＡＡＶ核酸ベクター、例えば、一本鎖または自己相補的組換えウイルスゲノムが含まれる。
ｒＡＡＶ粒子および核酸ベクターを生成する方法はまた、当技術分野で公知であり、市販されている（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Zolotukhin et al., Production and purification of serotype 1, 2, and 5 recombinant adeno-associated viral vectors, Methods 28 (2002) 158-167;および米国特許公開番号ＵＳ２００７／００１５２３８およびＵＳ２０１２／０３２２８６１を参照されたい；またＡＴＣＣおよびＣｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ．から入手可能であるプラスミドおよびキット）。例えば、核酸ベクター配列を含有するプラスミドを、１つまたは複数の、例えば、ｒｅｐ遺伝子（例えば、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０をコードする）およびｃａｐ遺伝子（ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３をコードし、本明細書において記載されるような改変ＶＰ３領域を含む）を含有するヘルパープラスミドと組み合わせ、プロデューサー細胞株中にトランスフェクトすることができ、その結果、ｒＡＡＶ粒子をパッケージングし、その後、精製できる。
一部の実施形態では、１つまたは複数のヘルパープラスミドは、ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子を含む第１のヘルパープラスミドならびにＥ１ａ遺伝子、Ｅ１ｂ遺伝子、Ｅ４遺伝子、Ｅ２ａ遺伝子およびＶＡ遺伝子を含む第２のヘルパープラスミドを含む。一部の実施形態では、ｒｅｐ遺伝子は、ＡＡＶ２に由来するｒｅｐ遺伝子であり、ｃａｐ遺伝子はＡＡＶ２に由来し、本明細書において記載される改変カプシドタンパク質を生成するための遺伝子への改変を含む。ヘルパープラスミドおよびこのようなプラスミドを作製する方法は、当技術分野で公知であり、市販されている（例えば、ＰｌａｓｍｉｄＦａｃｔｏｒｙ、ドイツ、ビーレフェルト製のｐＤＭ、ｐＤＧ、ｐＤＰ１ｒｓ、ｐＤＰ２ｒｓ、ｐＤＰ３ｒｓ、ｐＤＰ４ｒｓ、ｐＤＰ５ｒｓ、ｐＤＰ６ｒｓ、ｐＤＧ（Ｒ４８４Ｅ／Ｒ５８５Ｅ）、ｐＤＰ８．ａｐｅプラスミド；Ｖｅｃｔｏｒ Ｂｉｏｌａｂｓ、ペンシルベニア州、フィラデルフィア；Ｃｅｌｌｂｉｏｌａｂｓ、カリフォルニア州、サンディエゴ；Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア州、サンタクララ；およびＡｄｄｇｅｎｅ、マサチューセッツ州、ケンブリッジから入手可能な他の製品およびサービス；ｐｘｘ６；Grimm et al. (1998), Novel Tools for Production and Purification of Recombinant Adenoassociated Virus Vectors, Human Gene Therapy, Vol. 9, 2745-2760; Kern, A. et al. (2003), Identification of a Heparin-Binding Motif on Adeno-Associated Virus Type 2 Capsids, Journal of Virology, Vol. 77, 11072-11081; Grimm et al. (2003), Helper Virus-Free, Optically Controllable, and Two-Plasmid-Based Production of Adeno-associated Virus Vectors of Serotypes 1 to 6, Molecular Therapy, Vol. 7, 839-850; Kronenberg et al. (2005), A Conformational Change in the Adeno-Associated Virus Type 2 Capsid Leads to the Exposure of Hidden VP1 N Termini, Journal of Virology, Vol. 79, 5296-5303;およびMoullier, P. and Snyder, R.O. (2008), International efforts for recombinant adeno-associated viral vector reference standards, Molecular Therapy, Vol. 16, 1185-1188を参照されたい)。
例示的な限定されないｒＡＡＶ粒子生成方法が次に記載される。所望のＡＡＶ血清型のｒｅｐおよびｃａｐ ＯＲＦおよびアデノウイルスＶＡ、Ｅ２Ａ（ＤＢＰ）およびＥ４遺伝子をその天然プロモーターの転写制御下に含む１つまたは複数のヘルパープラスミドが生成され、得られる。ｃａｐ ＯＲＦはまた、本明細書において記載されるような改変カプシドタンパク質を生成するための１つまたは複数の改変を含み得る。ＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）から入手可能）は、ヘルパープラスミド（複数可）および本明細書において記載される核酸ベクターを含有するプラスミドを用いて、ＣａＰＯ４媒介性トランスフェクション、脂質またはポリマー分子、例えば、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を介してトランスフェクトされる。ＨＥＫ２９３細胞は次いで、少なくとも６０時間インキュベートされて、ｒＡＡＶ粒子生成が可能となる。あるいは、別の例では、Ｓｆ９ベースのプロデューサー安定細胞株が、核酸ベクターを含有する一重組換えバキュロウイルスに感染する。さらなる代替法として、別の例では、ＨＥＫ２９３またはＢＨＫ細胞株が、核酸ベクター含有するＨＳＶならびに適宜、本明細書において記載されるようなｒｅｐおよびｃａｐ ＯＲＦおよびアデノウイルスＶＡ、Ｅ２Ａ（ＤＢＰ）およびＥ４遺伝子をその天然プロモーターの転写制御下に含有する１つまたは複数のヘルパーＨＳＶに感染する。ＨＥＫ２９３、ＢＨＫまたはＳｆ９細胞は、次いで、少なくとも６０時間インキュベートされて、ｒＡＡＶ粒子生成が可能となる。次いで、ｒＡＡＶ粒子は、当技術分野で公知の、または本明細書において記載される任意の方法を使用して、例えば、イオジキサノール段階勾配、ＣｓＣｌ勾配、クロマトグラフィーまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈殿によって精製できる。
例示的定義
本開示に従って、ポリヌクレオチド、核酸セグメント、核酸配列などには、それだけには限らないが、ＤＮＡ（それだけには限らないが、ゲノムＤＮＡおよび／またはゲノム外ＤＮＡを含む）、遺伝子、ペプチド核酸（ＰＮＡ）ＲＮＡ（それだけには限らないが、ｒＲＮＡ、ｍＲＮＡおよび／またはｔＲＮＡを含む）、ヌクレオシドならびに天然供給源から得られた、化学合成された、遺伝子改変された、またはそうではなく人の手によって全体にもしくは部分的に調製もしくは合成された１つまたは複数の核酸セグメントが含まれる。
別に定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書において記載されるものと同様または同等の任意の方法および組成物を、本開示の実行または試験において使用できるが、好ましい方法および組成物は、本明細書において記載されている。本開示の目的のために、以下の用語は、以下に定義される：
本明細書において、「核酸」および「ポリヌクレオチド配列」という用語は、一本鎖または二本鎖形態のいずれかのデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを指し、別に制限されない限り、天然に存在するヌクレオチドと同様の方法で機能できる天然ヌクレオチドの既知類似体を包含する。ポリヌクレオチド配列は、全長配列ならびに全長配列に由来するより短い配列の両方を含む。特定のポリヌクレオチド配列は、天然配列の縮重コドンまたは指定の宿主細胞においてコドン優先度を提供するために導入される場合がある配列を含むことは理解される。本開示の範囲内に入るポリヌクレオチド配列は、本開示のペプチドをコードする配列と特異的にハイブリダイズする配列をさらに含む。ポリヌクレオチドは、個々の鎖として、または二重鎖でセンスおよびアンチセンス鎖の両方を含む。
本開示のポリヌクレオチドの断片および変異体は、本明細書において記載されるように生成し、当技術分野で公知の標準技術を使用して機能の存在について試験できる。したがって、当業者ならば、本開示のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの断片および変異体を容易に調製し、試験し、断片または変異体が、全長または非変異体ポリヌクレオチドまたはポリペプチド、例えば、ミオシンＶＩＩａポリヌクレオチドまたはポリペプチドに対して同一または同様である機能活性を保持するか否かを決定できる。
本開示の範囲内にまた、これらの変異体ポリヌクレオチドが、本明細書において例示的なポリヌクレオチドと実質的に同一の関連機能活性を保持する限り、ポリヌクレオチドの配列内の１つまたは複数のヌクレオチド置換、付加または欠失の存在を除いて、同一または実質的に同一の、本明細書において例示的なポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドがある（例えば、それらは本明細書において具体的に例示的なポリヌクレオチドのうち１つと同一のアミノ酸配列または同一の機能活性を有するタンパク質をコードする）。したがって、本明細書において開示されるポリヌクレオチドはまた、その変異体および断片を含むと理解されなければならない。
分子生物学の技術分野の当業者ならば容易に理解できるように、実験室環境において当業者によって人工的に調製または合成できる変異体に加えて、天然に見出される遺伝子またはポリヌクレオチドのいくつかの変異体配列がある場合がある。本開示のポリヌクレオチドは、本明細書において具体的に例示的なものならびにその任意の天然変異体ならびにそれらの変異体が所望の生物活性を保持する限り人工的に作出できる任意の変異体を包含する。
本開示の範囲内にまた、これらの変異体ポリヌクレオチドが、本明細書において具体的に例示的なポリヌクレオチドと実質的に同一の関連生物活性を保持する限り、ポリヌクレオチドの配列内のヌクレオチドの置換、付加または欠失を除いて、同一の本明細書において例示的なポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドがある。したがって、本明細書において開示されるポリヌクレオチドは、具体的に例示的な配列の上記で論じられるような変異体および断片を含むと理解されなければならない。
本明細書において記載されるポリヌクレオチドはまた、本明細書における例示的なものとより特定の同一性および／または類似性の範囲の点で定義され得る。配列同一性は、通常６０％より大きい、好ましくは、７５％より大きく、より好ましくは、８０％より大きく、さらにより好ましくは、９０％より大きく、９５％より大きい場合がある。配列の同一性および／または類似性は、本明細書において例示的な配列と比較される場合に、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％またはそれより大きい場合がある。
特に断りのない限り、本明細書で使用される場合、２つの配列の配列同一性および／または類似性パーセントは、Karlin and Altschul (1993)におけるように改変されたKarlin and Altschul (1990)のアルゴリズムを使用して決定できる。このようなアルゴリズムは、Altschul et al. (1990)のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム中に組み込まれている。ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２を用いてＢＬＡＳＴ検索を実施して、所望の配列同一性パーセントを有する配列を得ることができる。比較目的でギャップ付きアラインメントを得るためには、記載のように(Altschul et al., 1997)ギャップ付きＢＬＡＳＴを利用することができる。ＢＬＡＳＴおよびギャップ付きＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、公開された方法に従って、それぞれのプログラム（ＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータを使用することができる。
本開示はまた、本開示のポリヌクレオチド配列と十分に相同であり、標準のストリンジェントな条件および標準方法下でその配列とのハイブリダイゼーションを可能にする配列を有するポリヌクレオチド分子を企図する(Maniatis et al., 1982)。本明細書で使用される場合、ハイブリダイゼーションのための「ストリンジェントな」条件とは、ハイブリダイゼーションが通常、０．１ｍｇ／ｍｌの適した非特異的変性ＤＮＡを含有する、６×ＳＳＰＥ、５×デンハート液および０．１％ ＳＤＳ中で、ＤＮＡハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）未満の２０～２５摂氏度で一晩実施される条件を指す。
「有効量」という用語は、本明細書で使用される場合、疾患もしくは状態を処置もしくは寛解可能である、またはそうでなければ意図される治療効果をもたらすことが可能である量を指す。
「作動可能に連結された」という用語は、本明細書で使用される場合、通常連続している、または実質的に連続している、必要に応じて、２つのタンパク質コード領域を接続するために、連続しており、リーディングフレームにある連結されている核酸配列を指す。しかし、エンハンサーは、一般に、プロモーターから数キロベース分離された場合に機能し、イントロン配列は、可変性の長さのものである場合があるので、一部のポリヌクレオチドエレメントは、作動可能に連結されるが、連続していない場合がある。
「プロモーター」という用語は、本明細書で使用される場合、転写を調節する核酸配列の領域（単数または複数）を指す。本明細書において提供される例示的プロモーターとして、それだけには限らないが、ＣＭＶプロモーター、ＥＦ－１アルファプロモーター、錐体アレスチンプロモーター、キメラＣＭＶ βアクチンプロモーター（ＣＢＡ）、末端切断型キメラＣＭＶ βアクチン（ｓｍＣＢＡ）プロモーター、ヒトミオシン７ａ遺伝子由来プロモーター、ＴαＣ遺伝子由来プロモーター、ロドプシンプロモーター、ｃＧＭＰ－ホスホジエステラーゼβ－サブユニットプロモーター、ヒトまたはマウスロドプシンプロモーター、ｈＧＲＫ１プロモーター、シナプシンプロモーター、グリア繊維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーター、杆体特異的ＩＲＢＰプロモーター、ＶＭＤ２プロモーターが挙げられる。
「調節エレメント」という用語は、本明細書で使用される場合、転写を調節する核酸配列の領域（単数または複数）を指す。例示的調節エレメントとして、それだけには限らないが、エンハンサー、転写後エレメント、転写制御配列などが挙げられる。
「実質的に対応する」、「実質的に相同な」または「実質的同一性」という用語は、本明細書で使用される場合、選択された参照核酸またはアミノ酸配列と比較された場合に、選択された核酸またはアミノ酸配列が、少なくとも約７０または約７５パーセントの配列同一性を有する、核酸またはアミノ酸配列の特徴を表す。より通常は、選択された配列および参照配列は、少なくとも約７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４またはさらには８５パーセントの配列同一性を、より好ましくは、少なくとも約８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４または９５パーセントの配列同一性を有する。より好ましくは、いっそう高度に相同な配列は、選択された配列と、比較された参照配列の間で、少なくとも約９６、９７、９８または９９パーセントより高い配列同一性を共有することが多い。
配列同一性のパーセンテージは、比較される予定の配列の全長にわたって算出される場合もあり、選択された参照配列の合計約２５パーセント未満ほどとなる小さい欠失もしくは付加を排除することによって算出される場合もある。参照配列は、より長い配列のサブセット、例えば、遺伝子または隣接する配列の一部分または染色体の反復部分であり得る。しかし、２つまたはそれより多いポリヌクレオチド配列の配列相同性の場合には、参照配列は、通常、少なくとも約１８～２５ヌクレオチド、より通常は、少なくとも約２６～３５ヌクレオチド、いっそうより通常は、少なくとも約４０、５０、６０、７０、８０、９０またはさらには１００ほどのヌクレオチドを含む。
高度に相同な断片が望まれる場合には、２つの配列の間の同一性パーセントの程度は、当業者に周知の配列比較アルゴリズムのうち１つまたは複数、例えば、Pearson and Lipman (1988)によって記載されたＦＡＳＴＡプログラム分析によって容易に決定されるような、少なくとも約８０％、好ましくは、少なくとも約８５％、より好ましくは、約９０％または９５％またはより高くなる。
「対象」という用語は、本明細書で使用される場合、本開示に従う組成物を用いる処置を提供できる哺乳動物、例えば、霊長類を含む生物を記載する。開示される処置の方法から恩恵を受けることができる哺乳動物種として、それだけには限らないが、ヒト、非ヒト霊長類、例えば、類人猿、チンパンジー、サルおよびオランウータン、イヌおよびネコを含む飼育動物ならびにウマ、ウシ、ブタ、ヒツジおよびヤギなどの家畜または制限するものではないが、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ハムスターなどを含む他の哺乳動物種が挙げられる。
「処置」という用語および任意文法的差異（例えば、処置する、処置することおよび処置など）は、本明細書で使用される場合、それだけには限らないが、疾患もしくは状態の症状を軽減すること、ならびに／または疾患もしくは状態の進行、重症度および／もしくは範囲を低減する、抑制する、阻害する、和らげる、寛解させるまたは影響を及ぼすことを含む。
「ベクター」という用語は、本明細書で使用される場合、適した宿主細胞において複製可能である核酸分子（通常、ＤＮＡを含有するもの）または別の核酸セグメントが作動可能に連結されて、作動可能に連結された核酸セグメントの複製を容易にすることができるものを指す。例示的ベクターとして、制限するものではないが、プラスミド、コスミド、ウイルスなどが挙げられる。
本明細書で使用される場合、「変異体」という用語は、天然に生じることから逸脱する特徴を有する分子（例えば、ポリヌクレオチド）を指す、例えば、「変異体」は、野生型ポリヌクレオチドに対して少なくとも約８０％同一である、少なくとも約９０％同一である、少なくとも約９５％同一である、少なくとも約９６％同一である、少なくとも約９７％同一である、少なくとも約９８％同一である、少なくとも約９９％同一である、少なくとも約９９．５％同一である、または少なくとも約９９．９％同一である。タンパク質分子、例えば、カプシドの変異体は、カプシドタンパク質をコードする核酸配列中に導入された点突然変異から生じる、野生型タンパク質配列に対するアミノ酸配列の改変を含有し得る（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１０～１５または１５～２０のアミノ酸置換を有する）。これらの改変には、化学的改変ならびに末端切断が含まれる。
核酸分子、例えば、ポリヌクレオチドベクターシステムの変異体は、野生型核酸配列に対する配列の改変を含有し得る（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１０～１５または１５～２０のヌクレオチド置換を有する）。これらの改変は、５’末端または３’末端での末端切断を含み得る。
本開示の好ましい実施形態を実証するために以下の実施例が含まれる。以下の実施例において開示される技術は、本開示の実行において十分に機能することが本発明者によって発見された技術を表し、したがって、その実行のための好ましい様式を構成すると考えることができるということは当業者によって理解されなければならない。しかし、当業者は、本開示を踏まえて、開示される特定の実施形態に多数の変更を加え、本開示の趣旨および範囲から逸脱することなく同様または類似の結果を依然として得ることができることを理解しなければならない。
［実施例１］
実施例１は、ｈＭＹＯ７Ａコーディングオーバーラップを有する例示的オーバーラップデュアルベクターシステムを示す。例示的オーバーラップシステムでは（図２）、ベクターＡおよびベクターＢの両方によって共有されるオーバーラップするＤＮＡ配列は、ヒトＭＹＯ７Ａ遺伝子の１３５０ｂｐのコーディング領域からなる。これは、本開示の最もシンプルなシステムであり、全長遺伝子再構成およびＭＹＯ７Ａ発現の点で高度に効率的であると思われる。有利なことに、各ベクターは、標準ＡＡＶパッケージングサイズのものであり、そのようなものとして、各々は、ＤＮＡを高度な効率でパッケージングし、従来のＧＭＰ基準に容易に適応可能である。このようなベクターはまた、ヒトにおける使用の前に必要な規制当局による承認を可能にすると容易に特徴付けられる。
［実施例２］
実施例２は、ｈＭＹＯ７Ａイントロン２３スプライシングを利用する例示的ハイブリッドデュアル－ＡＡＶベクターシステムを示す。例示的システムでは（図３）、オーバーラップするＤＮＡ配列は、ヒトＭＹＯ７Ａの天然イントロン２３から構成される。ベクターＡは、イントロン２３に対するｈＭＹＯ７Ａ ｃＤＮＡのアミノ末端部分に対応するコード配列（ｈＭＹＯ７ＡＮＴ）および天然スプライスドナー部位、続いて、ｈＭＹＯ７Ａのイントロン２３の２５０ｂｐの断片（天然アクセプター部位を差し引いた）を含有する。ベクターＢは、イントロン２３に対するｈＭＹＯ７Ａ ｃＤＮＡのカルボキシル末端部分（ｈＭＹＯ７ＡＣＴ）およびＭＹＯ７Ａのイントロン２３の２５０ｂｐの断片（天然スプライスドナー部位を差し引いた）、続いて、天然スプライスアクセプター部位を含有する。適した哺乳動物宿主細胞への同時送達の際、ベクターＡおよびＢのＤＮＡが組み換えられて、再構成された全長遺伝子カセットを形成する。得られたＲＮＡ転写物は、次いで、天然イントロンを「スプライスアウト」する。あるいは、遺伝子カセットの組換えおよび形成は、ＡＡＶ ＴＲを介して起こる場合がある。この場合には、ＲＮＡ転写物は、天然イントロン２３－ＴＲ－イントロン２３モチーフを「スプライスアウト」する。しかし、両方の場合において、得られるｍＲＮＡは、再構成された全長ｈＭＹＯ７Ａ遺伝子配列のものである。
［実施例３］
実施例３は、ｈＭＹＯ７Ａコーディングオーバーラップを含有する例示的オーバーラップベクターシステムのインビトロ性能を示す。ＨＥＫ２９３細胞に、オーバーラップデュアルベクターシステムのベクターＡおよびベクターＢを各ベクターについて１００００：１ｖｇ／細胞の比で同時に感染させた（図２）。ＡＡＶベクターは、カプシドタンパク質中に３つのＹ－Ｆ突然変異を含有するＡＡＶ２ウイルス粒子中にパッケージングした（例えば、Zhong et al., 2008を参照されたい）。陽性対照として、細胞を全長ｈＭＹＯ７ＡをｓｍＣＢＡの制御下に含有するプラスミドを用いてトランスフェクトした。感染の３、４、５、６および７日後にタンパク質を細胞から回収し、ＭＹＯ７Ａに対する抗体を使用して、免疫ブロット法によって感染細胞におけるその存在についてアッセイした。結果は、図６Ａおよび図６Ｂに示されている。図６Ａ内の目的の範囲が拡大され、図６Ｂにおいてより高いコントラストで示されている。感染後３日で開始して、全長ヒトＭＹＯ７Ａタンパク質を視認でき、このタンパク質のピーク発現は５日目あたりで生じた。
［実施例４］
実施例４は、ｈＭＹＯ７Ａコーディングオーバーラップを含有する例示的オーバーラップベクターシステムのインビボ性能を示す。６週齢のｓｈａｋｅｒ－１（ＭＹＯ７Ａヌル）マウスに、上記のインビトロ研究において使用されたベクターＡおよびベクターＢの同一調製物１μＬを網膜下に同時注射した。両ベクターは約１×１０１２ｖｇ／ｍｌで送達された。注射の４週間後、処置されたおよび未処置の眼から網膜を採取し、ＭＹＯ７Ａに対する抗体を使用して免疫組織化学（ＩＨＣ）を実施した（図７Ａおよび図７Ｂを参照されたい）。より明るい範囲は、ＭＹＯ７Ａ特異的染色を示し、より暗い範囲は、核特異的ＤＡＰＩ染色に対応していた。処置された眼では、ＭＹＯ７Ａ発現は、明確に視認でき、光受容体に、より正確には、光受容体内節と外節の接合部に限定されているようであった。
［実施例５］
実施例５は、ＡＡＶデュアルベクターがオーバーサイズの遺伝子を効率的に送達することを示す。
材料および方法
動物。４６２６ＳＢ対立遺伝子、有効なヌル突然変異（Liu et al., 1999; Hasson et al., 1997）を保持するＳｈａｋｅｒ－１マウスを、Ｃ５７ＢＬ６遺伝的背景で使用し、維持し、記載されたように遺伝子型を同定した（Liu et al., 1999; Gibbs et al., 2003a）。それらは１２時間明／１２時間暗周期で維持し、明相の間、１０～５０ルクスの蛍光照明に対して曝露し、連邦および施設の動物管理ガイドラインに従って処置した。ホモ接合性突然変異体をその活動亢進、頭部を繰り返し上げる動作（ｈｅａｄ－ｔｏｓｓｉｎｇ）および回転挙動によって（Gibson et al., 1995)、および／またはＰＣＲ／制限消化アッセイによってヘテロ接合性対照と区別した。
ＡＡＶベクターの構築。シングルベクタープラットフォーム：ＥａｇＩおよびＳａｌＩ消化によってｐＥＧＦＰ－Ｃ２から全ＭＹＯ７Ａ ｃＤＮＡを取り出し、次いで、ＧＦＰを除去するためにＮｏｔＩおよびＳａｌＩを用いて消化されているｐＴＲ－ｓｍＣＢＡ－ＧＦＰ中にライゲートすることによって、末端切断型キメラＣＭＶ／ニワトリβ－アクチンプロモーター（ｓｍＣＢＡ）（Haire et al., 2006）およびＭＹＯ７Ａ ｃＤＮＡを含有するＡＡＶベクタープラスミドをコンストラクトした。ＭＹＯ７Ａ ｃＤＮＡ（約６．７ｋｂ）は、ヒトＭＹＯ７Ａのアイソフォーム２に相当し、Hashimoto et al. (2007)によって以前に記載されたものと同一であり、Chen et al. (1996)によって公開された配列に基づいていた（配列番号８を参照されたい）。ＭＹＯ７Ａアイソフォーム２は、アイソフォーム１よりも１１４ｋｂ短い（Chen et al., 1996; Weil et al., 1996）。ＭＹＯ７Ａ ｃＤＮＡおよび得られた接合部の両方とも、パッケージングの前に十分にシーケンシングした。インビトロ分析のために意図されるすべてのベクターを野生型ＡＡＶ２中、またはあるいはＡＡＶ２（トリプルＹ－Ｆ）カプシド突然変異体ベクター（Petrs-Silva et al., 2011）中に別個にパッケージングした。
上記のように、ＡＡＶ２ベースのベクターを、他の血清型と比較してその形質導入効率の増大のためにインビトロ実験のために選択した（Ryals et al., 2011）。すべてのベクターを、以前に記載されたような標準法を使用してパッケージングし、精製し、力価測定した（Zolotukhin et al., 2002; Jacobson et al., 2006)。ヒト胎児腎（ＨＥＫ２９３）細胞を、変異体２の全長ＭＹＯ７Ａコード配列を保持するベクタープラスミド（断片化ＡＡＶをパッケージングするために使用されたプラスミド）を用いてリン酸カルシウム法によってトランスフェクトした。次いで、これらのトランスフェクトされた細胞を、免疫ブロット分析全体で、適当なサイズの全長ＭＹＯ７Ａタンパク質を示す陽性対照として使用した。ＨＥＫ２９３細胞において、力価の対応するＡＡＶベクターを用いてベクター感染を実施した。手短には、細胞を６０～７０％のコンフルエンシーに増殖させた。すべてのベクターを平衡化塩溶液で希釈して、所望の多重感染度（ＭＯＩ）を達成した。具体的に記載されない場合には、１０，０００ゲノムを含有する粒子／各ベクターの細胞で細胞に感染させ、その結果、各ベクター対について合計２０，０００のＭＯＩとなった。細胞を１０％血清を含有する培地中、７％ ＣＯ２下、３７℃で感染後３日間インキュベートし、次いで、免疫ブロットによって分析した。ＡＡＶ２－ＭＹＯ７ＡおよびＡＡＶ５－ＭＹＯ７Ａの種々のロットについて１０１２～１０１３個粒子／ｍＬの力価が得られた。
オリゴヌクレオチド配列。インビボ研究のために、唯一のＢａｍＨＩ部位（Ｐ１９）を利用し、タグのついていない３’末端を、ＨＡタグつき（Ｐ２０）版と置き換えることによって、ヒトインフルエンザ血球凝集素（ＨＡ）タグを、全長のシンプルオーバーラップ、トランススプライシング、ハイブリッド３’ベクターの３’末端に付加した。すべてのコンストラクトをＳａｎｇｅｒシーケンシングによって配列確認した。
ＡＡＶベクタープラスミド設計およびクローニング。ＭＹＯ７Ａ（ヒトアイソフォーム２； ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１１２７１８０）の全長コード配列を、強力な、遍在性のＣＭＶ／ニワトリβ－アクチン（ｓｍＣＢＡ）プロモーター（Haire et al., 2006）、ポリアデニル化シグナルおよびＡＡＶ２ ＩＴＲを含有するベクタープラスミド中にクローニングした。
このプラスミドのパッケージングによって、ｆＡＡＶベクターが生成した（図２２Ａ）。すべてのシステムにおいて、５’ベクターは、ｓｍＣＢＡプロモーターおよびＭＹＯ７Ａの５’部分を共有していたが、３’ベクターは、ＭＹＯ７Ａの３’部分およびウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化シグナルを含有していた。ベクター構築のために使用されたオリゴヌクレオチドは、表１に列挙されている。シンプルオーバーラップは、５’ベクター中のＡＴＧからＭＹＯ７Ａ ｃＤＮＡのヌクレオチド１から３６４４および３’ベクター中のヌクレオチド２２７９から６５３４を含有していた。断片をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってオリゴヌクレオチドＰ１およびＰ３を用いて増幅し、それぞれ、ＮｏｔＩおよびＮｈｅＩを介して５’ベクター中に、Ｐ３（ＡｆｌＩＩ）およびＰ４（ＫｐｎＩ）を用いて３’ベクター中にクローニングした。
得られた２つのベクタープラスミドは、１３６５ｂｐのオーバーラップするＭＹＯ７Ａ配列を共有する（図２２Ｂ）。トランススプライシングおよびハイブリッドベクターは、ＡＰコード配列に由来する理想的なスプライスドナーおよびアクセプター部位またはエクソン２３と２４に由来する天然ＭＹＯ７Ａスプライス接合部のいずれかから構成されるスプライス接合部を利用する（Yan et al., 2002）。５’トランススプライシングベクターを作出するために、オリゴヌクレオチドＰ５およびＰ６（ＮｈｅＩ）を使用してスプライスアクセプター部位を増幅し、次いで、アンプリコンを、オリゴヌクレオチドＰ７（ＮｓｉＩ）を用いる第２の反応において使用し、クローニングのためにＭＹＯ７Ａコード配列の一部を付加した。
第１のＰＣＲにおいてオリゴヌクレオチドＰ８（ＡｆｌＩＩ）およびＰ９を用いてスプライスアクセプター部位を増幅することおよび第２のＰＣＲにおいてオリゴヌクレオチドＰ１０（ＡｇｅＩ）を用いて３’ＭＹＯ７Ａコード配列の一部を付加することによって、対応する３’ベクターを同様に作出した（図２２Ｃを参照されたい）。２７０ｂｐのＡＰオーバーラップ配列を、それぞれのトランススプライシングベクターに付加することによってＡＰハイブリッドベクターを作出した（Ghosh et al., 2011）。ＰＣＲによって配列を増幅し、その際、適当な制限エンドヌクレアーゼ部位を付加した。５’ベクターオリゴヌクレオチドのために、Ｐ１１（ＮｈｅＩ）およびＰ１２（ＳａｌＩ）を使用し、３’ベクターのためにオリゴヌクレオチドＰ１３（ＮｏｔＩ）およびＰ１４（ＡｆｌＩＩ）を使用した（図２２Ｄ）。
第４のベクター対、「天然イントロンハイブリッド」ベクターも作出して、組換え遺伝子座として、ＭＹＯ７Ａのイントロン２３中およびその周囲の自然配列、ならびにその後のスプライシングシグナルも活用した。５’部分は、イントロン２３を、オリゴヌクレオチドＰ１５およびＰ１６（ＮｈｅＩ）を用いてまず増幅すること、次いで、クローニングを容易にするために、得られたアンプリコンをオリゴヌクレオチドＰ７（ＮｓｉＩ）とともに第２の反応において使用することによって作出した。対応する３’ベクターは、イントロン２３をオリゴヌクレオチドＰ１７およびＰ１８（ＡｆｌＩＩ）を用いて増幅すること、および得られたアンプリコンを第２の反応においてオリゴヌクレオチドＰ１０（ＡｇｅＩ）を用いて増幅することによって構築した（図２２Ｅを参照されたい）。
Figure 2023520488000002
Figure 2023520488000003
オリゴヌクレオチドを使用して、デュアルベクタープラットフォーム（Ｐ１～Ｐ２０）の５’および３’ベクターを作製した。オリゴヌクレオチドを使用して、シンプルオーバーラップ、トランススプライシングおよびＡＰハイブリッドベクタープラットフォーム（Ｐ２１～Ｐ２２）中のオーバーラップの忠実度を特徴付けた。クローニングのために使用された制限部位には下線が引かれ、導入された血球凝集素（ＨＡ）タグは、イタリック体で記されている（Ｐ１９）。
デュアルベクタープラットフォーム。２つの別々のベクタープラスミドを構築した：ベクターＡは、強力な、遍在性の「ｓｍＣＢＡ」プロモーターおよびＮ末端部分をコードするＭＹＯ７Ａ ｃＤＮＡを含有する。ベクターＢは、Ｃ末端部分をコードするＭＹＯ７Ａ ｃＤＮＡおよびポリＡシグナル配列を含有する。各ベクタープラスミドは、両方とも逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）を含有していた。全長ＭＹＯ７Ａ ｃＤＮＡを鋳型として用いるＰＣＲを使用して、ＭＹＯ７Ａ ｃＤＮＡをハーフに大まかに分割し、アンプリコンは、ＡＴＧ開始位置１に対して、ヌクレオチド位置１から３６４４（ベクターＡ）および２２７９から６６４７（ベクターＢ）を包含していた。得られた２つのベクタープラスミドは、１３６５ｂｐのオーバーラップするＭＹＯ７Ａ配列を共有しており、それぞれ、５．０ｋｂおよび４．９Ｋｂの長さであった。これは、十分に標準ＡＡＶベクターのサイズ制限内であった。両ベクタープラスミドを配列確認し、標準ＡＡＶ生成方法によって別々にパッケージングした（Zolotukhin et al., 2002; Jacobson et al., 2006)。第１のロットの力価は、各ベクターの２．５×１０１２個粒子／ｍＬを含有しており、第２のロットは、各ベクターの４×１０１２個粒子／ｍＬを含有していた。
オーバーラップ領域の逆転写および特徴付け。デュアルベクターを用いてＨＥＫ２９３細胞を感染させ、ＲＮｅａｓｙ（登録商標）キット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を製造業者の推奨されるプロトコールに従って用いて全ＲＮＡを抽出した。次いで、２マイクログラムのＲＮＡを３７℃で３０分間、ＤＮアーゼＩ（ＮＥＢ）消化に付し、その後、３７℃で３０分間、熱不活性化し、続いて、７５℃で１０分間熱不活性化した。ｃＤＮＡの逆転写はＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩＩ（登録商標）キット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、米国、ニューヨーク州、グランドアイスランド）をオリゴｄＴプライマーを利用する標準プロトコールに従って用いて達成した。２マイクロリットルのｃＤＮＡを、オリゴヌクレオチドプライマーＰ２１およびＰ２２（表１を参照されたい）を使用するＰＣＲ（９５℃で３分の最初の変性、９５℃で４５秒、５５℃で４５秒、７２℃で１２分の３５サイクルおよび最後の７２℃で１５分）における鋳型として使用した。これらのプライマーのアニーリング部位は、シンプルオーバーラップおよびハイブリッドベクター対中のｃＤＮＡオーバーラップの範囲のそれぞれ５’および３’（言い換えれば、オーバーラップの領域の外側）に位置している。３’プライマーは、ｂＧＨポリＡに相補的であった配列にアニーリングされた。得られた生成物を、ＰｐｕＭＩまたはＢｇｌＩＩのいずれかで消化し、１．５％アガロースゲルで分離し、その後、ＵＶスクリーニングで分析した。別々に、生成物をＫｐｎＩおよびＡｇｅＩを用いて消化し、その後、全オーバーラップ領域のシーケンシングのためにｐＵＣベクター中にクローニングした。ベクターに特異的であったＭ１３フォワードおよびリバースプライマーを使用して、センスおよびアンチセンスリードを得、センスおよびアンチセンスリードの１４０ｂｐのオーバーラップをもたらした。これらの方法によって異常な配列を検出可能である（例えば、品質管理のため）ことを実証するために、人工的挿入（２６３５位でのＨｉｎｄＩＩＩフィルイン）または２３８１位での点突然変異（Ｔ→Ｃ）のいずれかを使用してＭＹＯ７Ａ配列を生成し、分析を繰り返した。
インビトロでのウイルス送達。１０％ ＦＢＳおよび１×ＮＥＡＡおよびＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を有するＤＭＥＭで増殖させたＨＥＫ２９３Ａ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、６ウェルプレートにプレーティングした。翌日、細胞を、４０μＭのカルパイン阻害剤（Ｒｏｃｈｅ、米国、カリフォルニア州、プレザントン）も含有する５００μＬの完全培地中でＡＡＶ２－およびＡＡＶ５－ＭＹＯ７Ａとともに１０，０００ウイルス粒子／細胞のＭＯＩで３７℃および５％ ＣＯ２でインキュベートした。２時間後、完全培地を添加した。翌日、培地を変更し、細胞をさらに４８時間インキュベートした。あるいは、一部の細胞を１μｇのベクターｐＴＲ－ｓｍＣＢＡ－ＭＹＯ７Ａを用いてトランスフェクトし、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（１：３の比）を製造業者の使用説明書（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従って用いて複合体形成した。
一次マウスＲＰＥ細胞は、Ｐ１４－Ｐ１６ ＭＹＯ７Ａ－ヌル動物に由来し、記載されるように２４ウェルディッシュで培養した（Gibbs et al., 2003a; Gibbs and Williams、2003b）。培養で４８時間後、細胞にウイルスを用いて形質導入した。細胞を、４０μＭのカルパイン阻害剤および完全強度ＡＡＶストックからの１０，０００ウイルス粒子／細胞を含有する１００μＬの完全培地中でインキュベートした。２時間後、各ウェルに４００μＬの完全培地を添加し、一晩インキュベートした。翌日、培地を交換し、細胞をさらに４８時間インキュベートした。
ＡＲＰＥ１９細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、米国、バージニア州、マナサス）を１０％ ＦＢＳを有するＤＭＥＭ／Ｆ－１２で培養し、ガラスカバーガラスを備えた２４ウェルプレート中に分割した。細胞をコンフルエンシーに増殖させ、次いで、一次ＲＰＥ細胞と同様に、同じ方法で形質導入した。
ウエスタンブロットおよび免疫蛍光によるＭＹＯ７Ａ発現分析。ＡＡＶ－ＭＹＯ７Ａを用いて形質導入したＨＥＫ２９３Ａおよび一次マウスＲＰＥ細胞を、形質導入の３日後に回収した。ウエスタンブロット分析のために、細胞を回収し、２０ｍＭ ＴＲＩＳ、ｐＨ７．４、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴおよび１×プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、米国、ミズーリ州、セントルイス）中で溶解した。同等量の総タンパク質を７．５％のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルで分離した。トランスファー後、ブロットを５％無脂肪乳を用いてブロッキングし、ヒトＭＹＯ７Ａの残基９２７～１２０３に対して作製されたマウス抗ＭＹＯ７Ａ抗体（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｂａｎｋ、米国、アイオワ州、アイオワシティ）（Soni et al., 2005）およびローディングコントロールとしてマウス抗アクチン抗体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いてプローブした。
感染の３日後、ＡＲＰＥ１９およびマウスＲＰＥ一次細胞を用いて免疫蛍光を実施した。細胞を４％ホルムアルデヒドで固定し、ブロッキング溶液（ＰＢＳ中の０．５％ ＢＳＡ／０．０５％サポニン）を用いてブロッキングし、マウス抗ＭＹＯ７Ａ、続いてヤギ抗マウスＡｌｅｘａ－５６８（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、米国、カリフォルニア州、カールスバッド）とともにインキュベートした。ＤＡＰＩ（Ｆｌｕｏｒｏｇｅｌ ＩＩ、Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国、ペンシルベニア州、ハットフィールド）を含有するマウンティング培地とともにカバーガラスを乗せ、共焦点システムで視覚化した。
タンパク質抽出および免疫ブロット法。トランスフェクトされ、感染したＨＥＫ２９３細胞を収集し、ＰＢＳで２回洗浄し、わずかな改変を加えて以前に報告されたように処理した（Boye et al., 2012）。プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ、ドイツ、マンハイム）を含有する、２００μＬのスクロースバッファー（０．２３Ｍスクロース、２ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５）中で３×３０秒の超音波処理のパルスによって細胞を溶解した。１４，０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離によって、溶解していない細胞および細胞片を除去した。上清のタンパク質濃度を、ＢＣＡ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国、イリノイ州、ロックランド）を用いて測定した。次いで、等量のタンパク質を、７．５％のドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動ゲル（ＢｉｏＲａｄ、米国、カリフォルニア州、ハーキュリーズ）にロードし、ＣＡＰＳバッファー（ｐＨ１１）中でＰＶＤＦメンブラン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、マサチューセッツ州、ビレリカ）上にトランスファーした。次いで、ブロットをＭＹＯ７Ａ（ヒトＭＹＯ７Ａのアミノ酸１１～７０に対するモノクローナル抗体；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、米国、テキサス州、ダラス；１：１０００）またはＨＡ（ＭＭＳ－１０１Ｐ；Ｃｏｖａｎｃｅ、米国、メリーランド州、ゲイザーバーグ；１：５００）およびβ－アクチン（ａｂ ３４７３１；Ａｂｃａｍ、米国、マサチューセッツ州、ケンブリッジ；１：５０００）に対する抗体を用いて標識した。Ｏｄｙｓｓｅｙシステム（Ｌｉ－Ｃｏｒ、米国、ネブラスカ州、リンカーン）を用いる視覚化のために、それぞれＣＷ８００およびＩＲ６８０色素（Ｌｉ－Ｃｏｒ）とコンジュゲートされた抗マウスおよび抗ウサギ二次抗体を使用した。Ｏｄｙｓｓｅｙ獲得および分析ソフトウェア（Ｌｉ－Ｃｏｒ）を用いて半定量的濃度測定的測定を実施した。デュアルカラー画像をそのそれぞれのチャネルで分離し、提示目的でグレースケールに変換した。タンパク質サイズの視覚化のために、各ブロットの１つのチャネル中に存在するサイズマーカーを両チャネルに加えた。
インビボでのウイルス送達。マウスに２．０～３．０％イソフラン吸入を用いて麻酔した。１％（重量／容量）硫酸アトロピンおよび２．５％フェニレフリンを用いて動物の瞳孔を拡大した。局所麻酔薬（０．５％プロパラカイン塩酸塩）も投与した。２７－Ｇａニードルを用いて側頭縁（ｔｅｍｐｏｒａｌ ｌｉｍｂｕｓ）における強膜切開術を実施した。マイクロシリンジポンプに取り付けられた３２－Ｇａブラントニードル（ＷＰＩ、米国、フロリダ州、サラソータ）を挿入し、１μＬのウイルス溶液を、Ｐ１４～Ｐ１６動物の腹側網膜下腔中に注射した。網膜剥離を解剖顕微鏡下で視覚化し、陽性の網膜下注射の指標として登録した。以下のＡＡＶ８（Ｙ７３３Ｆ）ベースのベクターのうち１マイクロリットルを、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの片眼に網膜下注射した：等しく（各ベクター＝１×１０１３ｖｇ／ｍｌ）組み合わされた、シングルｆＡＡＶ（１×１０１３ｖｇ／ｍｌ）、フロントおよびバックハーフ「ハイブリッド」ベクターまたは等しく（各ベクター＝１×１０１３ｖｇ／ｍｌ）組み合わされた、フロントおよびバックハーフ「シンプルオーバーラップ」ベクター。網膜下注射は以前に記載されたように実施した（Timmers et al., 2001）。同等の成功した注射を受けた動物でのみ、さらなる分析を実施した（最小の手術合併症しか有さない、＞６０％の網膜剥離）。
網膜の光学顕微鏡および免疫電子顕微鏡。眼杯をＬＲ ＷｈｉｔｅまたはＥｐｏｎのいずれかでの埋め込みのために処理し、半薄および極薄切片を調製した。半薄切片をトルイジンブルーを用いて染色し、Ｌｅｉｃａ共焦点システムで視覚化した。極薄切片を、以前に記載されたように、精製ＭＹＯ７Ａ ｐＡｂ ２．２（Liu et al., 1997）およびモノクローナル抗オプシン（１Ｄ４、Ｒ． Ｍｏｌｄａｙ）、続いて、金がコンジュゲートされた二次抗体（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて標識した（Ｌｏｐｅｓ ｅｔ ａｌ．， ２０１１）。同時に処理された陰性対照切片は、ＭＹＯ７Ａ－ヌル網膜に由来するものを含んでおり、陽性対照としてＷＴ動物を使用した。
ＭＹＯ７Ａイムノゴールド密度は、年齢を対応させたＷＴ、ＭＹＯ７Ａ－ヌル網膜およびＰ１４～１６でＡＡＶ－ＭＹＯ７Ａを注射され、３週間後に解剖されたＭＹＯ７Ａ－ヌル動物の網膜の切片で決定した。免疫標識の定量化のために、各ＲＰＥ細胞の完全切片における金粒子のすべてをカウントした。各細胞プロファイルの面積をＩｍａｇｅ Ｊソフトウェアを使用して決定した。バックグラウンド標識について、未処置ＭＹＯ７Ａ－ヌル動物の切片における標識の濃度を測定した。データは、このバックグラウンド標識を差し引いて表された。
光受容体細胞の結合繊毛におけるＭＹＯ７Ａおよびオプシンイムノゴールド標識の濃度は、結合繊毛の縦方向プロファイルに沿って金粒子をカウントすることおよび各プロファイルの長さを測定することによって決定した。分析および定量化は、３個体の異なる動物から得た最小で３つの異なる網膜において実施した。統計分析は、片側Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定を使用して実施した。
注射の６週間後、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを眼球除去し、わずかな改変を加えて以前に記載されたようにその眼を処理し、免疫染色した（Boye et al., 2011）。網膜を、血球凝集素（ＨＡ）に特異的な抗体（モノクローナルＡｂクローン１２ＣＡ５；Ｒｏｃｈｅ）を用いて免疫染色し、ＤＡＰＩを用いて対比染色し、スピニングディスク共焦点顕微鏡（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＵｌｔｒａｖｉｅｗモジュラーレーザーシステムおよびＨａｍａｍａｔｓｕ Ｏ－ＲＣＡ－Ｒ２カメラを備えたＮｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ ＴＥ２０００顕微鏡）を用いて画像化した。画像は２０×（空気）対物レンズを使用して逐次得た。すべての設定（露出、ゲイン、レーザー出力）は画像全体で同一であった。すべての画像解析は、Ｖｏｌｏｃｉｔｙ ５．５ソフトウェア（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、米国、マサチューセッツ州、ウォルサム）を使用して実施した。
結果
ＡＡＶ－ＭＹＯ７Ａシングルベクター調製。ＡＡＶベクタープラスミドを、末端切断型キメラＣＭＶ／ニワトリβ－アクチンプロモーター、ｓｍＣＢＡ（Haire et al., 2006）およびヒトＭＹＯ７Ａの全長アイソフォーム２をコードする６．７ｋｂのｃＤＮＡ（ＮＣＢＩ番号ＮＭ＿００１１２７１８０）を含有するように操作した（図１０Ａ）。ｓｍＣＢＡプロモーターは、全長ＣＢＡプロモーターのものと同一の指向性および活性をマウス網膜において示す（Haire et al., 2006; Pang et al., 2008）。ＡＡＶ２－ＭＹＯ７ＡおよびＡＡＶ５－ＭＹＯ７Ａの種々のロットについて、１０１２～１０１３個粒子／ｍｌの力価が得られた。１０１２個粒子／ｍｌの濃度を標準濃度（１×）と見なし、それから希釈物を作製した。実験は、３つの別々の調製物から得られたウイルスを用いて実施した。所与の濃度でＡＡＶ２－ＭＹＯ７ＡまたはＡＡＶ５－ＭＹＯ７Ａの種々のロットの間で、以下に記載されるように、発現または表現型修正の相違は観察されなかった。
細胞培養物におけるＭＹＯ７Ａ発現。１×シングルＡＡＶ２－ＭＹＯ７ＡまたはＡＡＶ５－ＭＹＯ７Ａを用いるＭＹＯ７Ａ－ヌルＲＰＥ細胞の一次培養物の形質導入は、ウエスタンブロット分析によって、ＷＴ ＭＹＯ７Ａタンパク質のものと同等であり、ＭＹＯ７Ａ＋／－ＲＰＥ細胞の一次培養物において見出されるものと同様のレベルで存在していた見かけの質量を有していたポリペプチドの発現をもたらした（図１０Ｂ）。同様に、適当なサイズのシングルバンドが、ＨＥＫ２９３Ａ細胞のウエスタンブロットで検出された。一次ＲＰＥ細胞の免疫蛍光によって、ＭＹＯ７Ａ－ヌル細胞の１×シングルＡＡＶ－ＭＹＯ７Ａ処置から得られたＭＹＯ７Ａタンパク質は、対照細胞における内因性ＭＹＯ７Ａのものと同等である細胞内局在性パターンを有しており、これは、適切に標的化されるタンパク質の生成を示すことが示された（図１０Ｃ～１０Ｆ）。ＡＲＰＥ１９細胞をまた、１×または希釈された（１：１００）ＡＡＶ２－ＭＹＯ７ＡまたはＡＡＶ５－ＭＹＯ７Ａに感染させ、未処置細胞と比較した。ＭＹＯ７Ａ免疫蛍光の増大が、処置細胞において検出され、標識の細胞内局在性は、未処置細胞におけるものと同等であった（図１７Ａ～１７Ｆ）。
インビボでのＭＹＯ７Ａの局在性。ほとんどの網膜ＭＹＯ７Ａは、ＲＰＥにおいて見出される（Hasson et al., 1995）が、このタンパク質はまた、光受容体細胞の結合繊毛および繊毛周囲にも存在する（Liu et al., 1997; Williams、2008）。ＭＹＯ７Ａのこの分布および網膜機能を例示する図は、最近の総説に公開されている（Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｌｏｐｅｓ、２０１１）。
ＭＹＯ７Ａ－ヌルマウスの網膜下腔への１×ＡＡＶ２－ＭＹＯ７ＡまたはＡＡＶ５－ＭＹＯ７Ａの注射の３週後、網膜組織を免疫電子顕微鏡によって検査して、ＭＹＯ７Ａ発現について試験した。イムノゴールド標識は、光受容体細胞において明らかであったが、結合繊毛および繊毛周囲に局在しており、ＷＴ網膜におけるものと同等であった（図１１Ａ～Ｅ）。標識はまた、ＷＴ網膜において見出されるように、ＲＰＥ細胞全体、特に、先端細胞体領域にも存在していた（図１１Ｆ、図１１Ｆ－１、図１１Ｇおよび図１１Ｇ－１；対照のために図１８Ａ～１８Ｄを参照されたい）（Ｇｉｂｂｓ ｅｔ al., 2004; Liu et al., 1997)。
ＭＹＯ７Ａは、杆体および錐体光受容体細胞の両方において同様の分布を有する（Liu et al., 1999)。ＡＡＶ－ＭＹＯ７Ａを用いる処置がまた錐体光受容体細胞にも影響を及ぼしたか否かを試験するために、ＭＹＯ７Ａが錐体光受容体の繊毛領域にも存在するか否かを調べた。処置された網膜の杆体オプシンに対して特異的な抗体と一緒にＭＹＯ７Ａ抗体を使用して二重免疫ＥＭを実施した。各極薄切片において整列している結合繊毛が見出される錐体は少数しかないが、ＭＹＯ７Ａイムノゴールド標識は、これらの錐体の結合繊毛および繊毛周囲領域において明らかであり、これは、その外節における杆体オプシン標識の欠如（周囲の杆体外節とは対照的に）によって同定された（図１１Ｈおよび図１１Ｉ）。したがって、ＡＡＶ２－ＭＹＯ７ＡおよびＡＡＶ５－ＭＹＯ７Ａは、錐体ならびに杆体光受容体細胞を形質導入できる。
光受容体およびＲＰＥ細胞における用量依存性ＭＹＯ７Ａ発現。種々の濃度のＡＡＶ２－ＭＹＯ７ＡおよびＡＡＶ５－ＭＹＯ７Ａ（１×、１：１０または１：１００希釈）を用いる処置後のＭＹＯ７Ａ発現のレベルを決定するために、ＭＹＯ７Ａイムノゴールド標識を、注射部位の１．４ｍｍ内でとられたＥＭ画像において定量化した。その分布が結合繊毛および繊毛周囲に限定される、光受容体細胞におけるＭＹＯ７Ａの信頼できる検出には、電子顕微鏡によって提供されるより高い解像度が必要である（Liu et al., 1997）。イムノゴールド粒子密度は、完全縦断面（基底小体から外節の基部まで）で示される光受容体結合繊毛および繊毛周囲の画像において、または先端から基底切片においてＲＰＥ細胞を示す画像において測定した。粒子密度は、光受容体細胞の繊毛の長さあたりの粒子として（各結合繊毛は、約１．２μｍ長である）、およびＲＰＥ細胞の面積あたりの粒子として（先端と基底表面の間の全面積が含まれた）表された。粒子密度は、切片の表面上のエピトープの露出に応じて変わり、そのようなものとして、ここで使用される条件下での抗原密度の相対線形測定を提供する（例えば、グリッドがエッチングされ、同一方法で標識され、標識は、立体障害によって影響を受けるはずであるほど密ではない）。
１×ＡＡＶ２－ＭＹＯ７ＡまたはＡＡＶ５－ＭＹＯ７Ａを用いる処置は、ＷＴ網膜において見出されるものと比較して、光受容体繊毛において２．５～２．７倍の密度の免疫標識をもたらしたが、１：１０および１：１００希釈は、ＷＴレベルに対してより同等である免疫標識の密度をもたらした（図１１Ｊ、図１１Ｌおよび図１９）。ＲＰＥにおけるイムノゴールド標識の定量化は、ＡＡＶ２－ＭＹＯ７Ａの注射がＷＴよりも２．７倍多い標識をもたらし、１：１０および１：１００希釈を用いた場合に有意差を示さないことを示した（図１１Ｋ）。対照的に、ＡＡＶ５－ＭＹＯ７Ａを注射された網膜のＲＰＥにおけるＭＹＯ７Ａ免疫標識のレベルは、ウイルス力価との関連で変わり、全用量ウイルスは、ＷＴ ＲＰＥにおいて見出されたものよりも２．２倍多いＭＹＯ７Ａを達成し、１：１０希釈は、ＷＴレベルを達成し、１：１００希釈は、平均してＷＴレベルの約６０％をもたらした（図１１Ｍ）。
標識密度のこれらのカウントは、１×ＡＡＶ－ＭＹＯ７Ａが光受容体およびＲＰＥ細胞両方におけるＭＹＯ７Ａ発現の正常レベルの２倍よりも多くをもたらしたことを示す。ＭＹＯ７Ａの分布は、光受容体細胞におけるこの過剰発現によって影響を受けなかった。ＲＰＥ細胞では、ＭＹＯ７Ａの分布全体がＷＴと同等であり、先端細胞体領域においてより高い濃度であった。しかし、１×ＡＡＶ２－ＭＹＯ７Ａまたは１×ＡＡＶ５－ＭＹＯ７Ａを用いた場合には、メラノソームと関連していたＭＹＯ７Ａの割合は、ＷＴ ＲＰＥにおけるもののわずか５５％であった。この相違は、ＭＹＯ７Ａをメラノソーム、ＭＹＲＩＰおよびＲＡＢ２７Ａに連結するタンパク質（Klomp et al., 2007; Lopes et al., 2007）が、ほぼＷＴレベルのままである可能性があり、したがって、メラノソームと会合するであろうＭＹＯ７Ａの絶対量が限定されたためである可能性が高い。
ＭＹＯ７Ａの過剰発現にかかわらず、１×（または１：１０）ＡＡＶ２－ＭＹＯ７Ａの注射の３ヶ月後まで網膜における病理は明らかではなかった。しかし、ＡＡＶ５－ＭＹＯ７Ａ（例えば、１０×）のうち１０１３粒子／ｍｌを注射された６つの網膜のうち２つが、３週間後に網膜全体で光受容体細胞消失の証拠を示した。（ＡＡＶ２－ＭＹＯ７Ａはこの力価では試験されなかった）（図１９）。
ＲＰＥにおけるメラノソーム局在性の修正。ＭＹＯ７Ａ－突然変異体マウスでは、メラノソームは、ＲＰＥ細胞の先端突起には存在しない（Liu et al., 1998）。この突然変異体表現型は、すべての新生児年齢で明らかであり、ミオシン７ａモーターによるメラノソームのアクチンベースの輸送の喪失による（Gibbs et al., 2004）。ＭＹＯ７Ａ－ヌルマウスの網膜下腔への１×ＡＡＶ２－ＭＹＯ７ＡまたはＡＡＶ５－ＭＹＯ７Ａの注射の３週間後、メラノソームが注射部位付近（１．４ｍｍ以内）のすべてのＲＰＥ細胞において正規分布を有すると観察された（ＡＡＶ２－ＭＹＯ７ＡおよびＡＡＶ５－ＭＹＯ７Ａについて各々ｎ＝１０）（図１２Ａ～１２Ｃ）。注射部位から十分に離れると、修正されたおよび未修正のＲＰＥ細胞の混合物が明らかであり、網膜の末梢では、細胞はすべてＭＹＯ７Ａ－突然変異体表現型を示し、この領域における修正の欠如を示した（図１２Ｄ～１２Ｆ）。メラノソームの修正は、注射の３ヶ月後に固定された網膜において依然として明らかであった（図２０）。修正はまた、１：１０希釈ＡＡＶ２－ＭＹＯ７Ａ（ｎ＝６）またはＡＡＶ５－ＭＹＯ７Ａ（ｎ＝６）を注射されたすべての眼において、ならびに１：１００希釈ＡＡＶ２－ＭＹＯ７Ａ（ｎ＝６）またはＡＡＶ５－ＭＹＯ７Ａ（ｎ＝６）を注射されたすべての眼において観察されたが、１：１００希釈を用いた場合、注射部位の付近のＲＰＥ細胞の一部は、修正されなかった。
オプシン分布の修正。ＭＹＯ７Ａ－突然変異体マウスは、光受容体細胞の結合繊毛におけるオプシンの異常な蓄積、オプシン抗体を用いる免疫ＥＭによって明らかである表現型を有する（Liu et al., 1999）。この突然変異体表現型は、ミオシン７ａが、外節へのオプシンのベクターによる送達において機能することを示唆した（Liu et al., 1999）。結合繊毛におけるイムノゴールドオプシン標識の定量化は、この表現型が１×ＡＡＶ２－ＭＹＯ７ＡまたはＡＡＶ５－ＭＹＯ７Ａを用いて修正されることを実証した（図１３および図２１Ａ～２１Ｄ）。この分析はまた、１：１００希釈物を用いた表現型修正を示したが、データは、ＭＹＯ７ＡのＷＴレベルにかかわらず（図１１Ｊおよび図１１Ｌ）、全ＷＴ表現型が達成されなかった（図１３）ことを示し、これは、ＭＹＯ７Ａの一部が十分に機能的ではない可能性があることを示唆した。
ＡＡＶ２－ＭＹＯ７Ａデュアルベクター調製。前述の結果は、シングルＡＡＶベクターがインビボで機能的ＭＹＯ７ＡをＲＰＥおよび光受容体細胞に送達可能であることを実証する。ｓｍＣＢＡ－ＭＹＯ７Ａのサイズが、ＡＡＶの名目上の運搬能よりも約２ｋｂ大きいために（Grieger and Samulski、2005）、この形質導入は、他の大きな遺伝子について示されたように（Dong et al., 2010; Lai et al., 2010; Wu et al., 2010）、ｓｍＣＢＡ－ＭＹＯ７Ａ ｃＤＮＡの定義されない断片化、続いて、細胞への送達後のプラスおよびマイナスｃＤＮＡ鎖の再構築を含む場合がある。ＭＹＯ７Ａ ｃＤＮＡの定義されたオーバーラップする断片（１３６５塩基）を含有する２つのＡＡＶベクターも、全長ＭＹＯ７Ａ発現を媒介可能であったか否かを評価するために、ＡＡＶ２ベースのデュアルベクターシステム（図１４Ａ－１および図１４Ａ－２）を開発した。ＡＡＶ２－ＭＹＯ７Ａ（デュアルベクター）の２つの別々のロットを調製し、各々は、等濃度のＡＡＶ２－ｓｍＣＢＡ－ＭＹＯ７Ａ（５’－ハーフ）およびＡＡＶ２－ＭＹＯ７Ａ（３’－ハーフ）を含有していた。第１のロットの力価は、各ベクターの２．５×１０１２個粒子／ｍＬを含有し、第２のロットは、４×１０１２個粒子／ｍＬを含有していた。
ＡＡＶ２デュアルベクターを用いるＭＹＯ７Ａ発現。いずれかのロットのＡＡＶ２－ＭＹＯ７Ａ（デュアルベクター）に感染したＭＹＯ７Ａ－ヌルＲＰＥ細胞の一次培養物のウエスタンブロット分析によって、細胞が、ＷＴ ＭＹＯ７Ａのものと同等の質量のＭＹＯ７Ａ－免疫標識されたポリペプチドを発現することが示された（図１４Ｂ）。しかし、ＭＹＯ７Ａ－ヌルＲＰＥ細胞におけるＭＹＯ７Ａの発現レベルは、シングルＡＡＶ２またはＡＡＶ５ベクターについて見出されたものとは異なり（図１０Ｂ）、ＭＹＯ７Ａ＋／－ＲＰＥ細胞の一次培養物において見出されるものよりも有意に少なかった（図１４Ｂ中、レーン２および３を参照されたい）。ウエスタンブロットの定量的分析によって、シングルベクター（１×）、ＡＡＶ２－ＭＹＯ７ＡもしくはＡＡＶ５－ＭＹＯ７Ａを用いて、またはＡＡＶ２－ＭＹＯ７Ａ（デュアルベクター）を用いて形質導入されたＭＹＯ７Ａ－ヌルＲＰＥ細胞が、ＭＹＯ７Ａ＋／－ＲＰＥ細胞におけるＭＹＯ７Ａのレベルの、それぞれ、８２％、１１１％および１０％であったレベルでＭＹＯ７Ａを発現したことが示された。
図１６は、ＡＡＶ８血清型においてを除いて上記と同一デュアルベクターシステムを使用するウエスタンブロットである。図１６は、野生型ＭＹＯ７Ａ発現レベルとほぼ等しかったデュアルベクターシステムを使用するＭＹＯ７Ａの発現レベルを示す。矛盾の理由は明確ではないが、幾人かの外部の共同研究者によって得られたものよりもかなり良好な結果が、デュアルベクターシステムを使用して本発明者らによって得られた。デュアル－ＡＡＶ８（Ｙ７３３Ｆ）ベクターを用いる注射後にｓｈａｋｅｒ－１網膜において野生型のようなレベルのＭＹＯ７Ａ発現が観察された。したがって、デュアルＡＡＶプラットフォームを用いてＭＹＯ７Ａの極めて良好な発現が達成された。
ＡＡＶ２－ＭＹＯ７Ａ（デュアルベクター）に感染した一次ＭＹＯ７Ａ－ヌルＲＰＥ細胞の免疫蛍光は、培養物全体に点在する少数の細胞が極めて高いレベルのＭＹＯ７Ａを示すが、すべての他の細胞は、わずかなレベルしか含有していないことを示した（図１４Ｃ～１４Ｅ）。ＭＹＯ７Ａを過剰発現する細胞は、通常、形態学の変更を有しており、これは、高レベルのＭＹＯ７Ａが毒性である可能性があることを示唆した。同様に、ＡＡＶ２－ＭＹＯ７Ａ（デュアルベクター）に感染したＡＲＰＥ１９細胞の免疫蛍光は、ＭＹＯ７Ａ抗体を用いて強く標識された少数の細胞をもたらし、細胞のほとんどは、内因性レベルのＭＹＯ７Ａのみを発現すると思われる（図１４Ｆおよび図１７Ｆ）。
いずれかのロットのＡＡＶ２－ＭＹＯ７Ａ（デュアルベクター）を用いる網膜下注射の３週間後に調製した網膜の免疫標識はまた、明確なＭＹＯ７Ａ発現を有する少数のみのＲＰＥ細胞および光受容体細胞を示したが、このインビボ実験では、大幅な過剰発現は明らかではなかった。極薄切片の画像からのイムノゴールド粒子カウントを使用して、第２のロットのＡＡＶ２－ＭＹＯ７Ａ（デュアルベクター）を用いて処置したＭＹＯ７Ａ－ヌル網膜におけるＭＹＯ７Ａ発現のレベルを定量化した。注射部位の１．４ｍｍ以内の、光受容体細胞の結合繊毛および繊毛周囲のＭＹＯ７Ａ免疫標識は、ＷＴ網膜におけるものの４８％の平均：ＷＴ（ｎ＝３つの網膜）の６．５個粒子／μｍと比較して２．８個粒子／μｍ（ｎ＝３つの網膜）であった。ＲＰＥの先端－基底切片における平均標識密度は、ＷＴ網膜におけるものの３５％：ＷＴの３１個粒子／１００μｍ２と比較して１１個粒子／１００μｍ２であった。しかし、これらのより低い平均が、ＭＹＯ７Ａの正常量付近を発現する一部の細胞と、極めてわずかに発現する大多数によって達成されたことは明らかであり；半分を超える細胞が、１０より少ない粒子／１００μｍ２を有していた（図１４Ｇ）。
ＡＡＶ２デュアルベクターを用いるＭＹＯ７Ａ－突然変異体表現型の修正。注射部位の１．４ｍｍ以内のメラノソーム局在性および繊毛オプシン分布の修正について、眼を分析した。いずれかのロットのＡＡＶ２－ＭＹＯ７Ａ（デュアルベクター）を用いて、一部のＲＰＥ細胞（ロット１処置について２９％［ｎ＝６つの網膜］、ロット２処置について３５％［ｎ＝９つの網膜］）が、正常な先端メラノソーム分布を有すると観察されたが、この領域中の細胞のほとんどは、ＭＹＯ７Ａ－突然変異体表現型を保持し、いずれかのシングルベクターの１：１００希釈物を用いて観察されたものよりもかなり少ない割合の修正された細胞を含有していたモザイク効果をもたらした（図１５Ａ）。ＡＡＶ２－ＭＹＯ７Ａ（デュアルベクター）（第１のロット）の１：１０希釈物を用いて注射された３つの眼において観察された唯一の修正は、網膜の１つにおけるＲＰＥ細胞の１８％においてであった。完全強度のＡＡＶ２－ＭＹＯ７Ａ（デュアルベクター）（第２のロット）を用いた場合、オプシンイムノゴールド密度は、平均３．２±０．４個粒子／μｍの繊毛長であり、未処置網膜（４．２±０．８個粒子／μｍ；ｐ＝０．００３）から低減されているが、依然としてＷＴレベル（１．１±０．２個粒子／μｍ）よりも高く、これは、ほとんどの細胞が修正されていないことを示唆した。
免疫電子顕微鏡を使用して、表現型修正と、ＭＹＯ７Ａの発現レベルの間の相関を同定した（各ＲＰＥ細胞先端－基底切片におけるイムノゴールド粒子の平均濃度によって決定された）（図１５Ｂ～１５Ｅ）。ＡＡＶ２－ＭＹＯ７Ａ（デュアルベクター）（第２のロット）を用いて注射された眼から、修正されたＲＰＥ細胞が、ＭＹＯ７ＡのＷＴレベルの平均１０８％を含有する（最小レベルは８２％であった）ことがわかった。修正されなかったＲＰＥ細胞は、ＭＹＯ７ＡのＷＴレベルの平均２６％を含有していた（最大レベルは９２％であった）。これらのデータは、ＭＹＯ７Ａのより高い発現が表現型修正と相関すること（図１５Ｆ）を示したが、メラノソームが、ＭＹＯ７Ａ－ヌル対立遺伝子についてヘテロ接合性であり、ＭＹＯ７ＡのＷＴレベルの約５０％しか有さないマウスにおいて正常に局在すると仮定すると、標識されたＭＹＯ７Ａタンパク質の一部は機能性ではないことも示した。
シンプルオーバーラップベクターを用いるＭＹＯ７Ａの発現。ＡＡＶ２ベースのシンプルオーバーラップベクターをさまざまなＭＯＩでインビトロで評価して、ベクター対の濃度がＭＹＯ７Ａ発現とどのように関連するかを評価した。ＭＹＯ７Ａのレベルが経時的にどのように変化したかも、感染細胞において評価した。ＡＡＶ２（トリプルＹ－Ｆ）ベクター中にパッケージングされたシンプルオーバーラップベクター対を用いて、ＨＥＫ２９３細胞を感染させた（図２３Ａ）。ＡＡＶ２（トリプルＹ－Ｆ）シンプルオーバーラップベクター（各ベクターについて１０，０００のＭＯＩ）を用いる予備的同時感染によって、ＭＹＯ７Ａが発現されることおよびゲルでのタンパク質の移動が、全長トランスフェクション対照に対して同一であることが示された（図２３Ａ）。各ベクターの４００、２０００および１０，０００のＭＯＩでの同時感染は、シンプルオーバーラップシステムの効率が、使用される５’および３’ベクターの量に比例することを示す（図２３Ｂ）。ＭＹＯ７Ａ発現は、ＨＥＫ２９３細胞において注射後５日まで、インキュベーション時間の関数として増大した（図２３Ｃ）。視認できる発現低下は、後の時間での培養容器中の視認できる細胞の低減のためであった。
デュアル－ＡＡＶ－ＭＹＯ７Ａ発現に対するｆＡＡＶ－ＭＹＯ７Ａの比較およびＡＡＶ血清型効率の評価。これまでに、ＭＹＯ７Ａをコードする断片化されたＡＡＶは、ｓｈａｋｅｒ１マウスの網膜表現型を寛解させることができると示された（Colella et al., 2013; Lopes et al., 2013; Trapani et al., 2013）。比較の基礎を提供するために、デュアル－ＡＡＶ－ベクター発現をインビトロでｆＡＡＶに対して評価した。ＨＥＫ２９３細胞における感染後、すべてのデュアルベクターシステムが、ＭＹＯ７ＡをｆＡＡＶよりも効率的に発現した（図２４）。ＡＰハイブリッドプラットフォームは、最も強力な発現を示し、それに、シンプルオーバーラップシステムが続いた。
他の研究によって、従来のサイズのＤＮＡペイロードとの関連で、ＡＡＶ２（トリプルＹ－Ｆ）ベクターの形質導入効率および動態学は、標準ＡＡＶ２に対してインビトロとインビボの両方で増大していることが示された（Li et al., 2010; Markusic et al., 2010; Ryals et al., 2011）。ＨＥＫ２９３細胞において、ＡＡＶ２対ＡＡＶ２（トリプルＹ－Ｆ）デュアルベクターの効率を直接比較した。驚くべきことに、標準ＡＡＶ２媒介性ＭＹＯ７Ａ発現は、力価が対応しているＡＡＶ２（トリプルＹ－Ｆ）を用いた場合に見られるもよりも高かった（図２４）。同一のベクタープラスミドを用いてパッケージングされた異なるＡＡＶ２およびＡＡＶ２（トリプルＹ－Ｆ）デュアルベクター調製物を比較した場合に、同一の結果が得られた。
全長ＭＹＯ７Ａ発現の相対的効率および特異性の比較。デュアルベクタープラットフォームの相対発現高率を定量的に評価するために、および全長タンパク質の特異性を評価するために、ＨＥＫ２９３細胞を、組み合わされた５’および３’のＡＡＶ２ベースのベクター対または対応する５’ベクター単独のいずれかを用いて感染させた。オーバーラップする配列として働き、適当なスプライシングシグナルを提供した天然ＭＹＯ７Ａイントロン配列（イントロン２３）を組み込んだ、さらなるハイブリッドベクター対が含まれた。すべての５’ベクターが、シンプルオーバーラップベクターを除いて、ウエスタンブロットで検出可能な、少量の定義された、全長より小さいペプチドを生成した（図２５Ａ）。しかし、トランススプライシングおよびＡＰハイブリッドプラットフォームは、サンプルに３’ベクターが付加された場合に、この望まれない生成物の明確な減少を示した（図２５Ａ）。天然イントロンハイブリッドプラットフォームはまた、ウエスタンブロットでこの二次的バンドを示し、５’ベクター単独に起因する末端切断型タンパク質を再び示唆した。試験したすべての他のプラットフォームとは対照的に、このバンド強度は、３’ベクターの付加で増大した。それぞれの３’ベクターの存在下または不在下で、５’ベクター媒介性末端切断型タンパク質生成物の量を定量化することによって、各プラットフォームの、再構成を促進する相対能力を比較した（図２５Ｂ）。次いで、ウエスタンブロットでの全長ＭＹＯ７Ａ発現を、トランスフェクション対照に対して定量化した（図２５Ｃ）。ＡＰハイブリッド媒介性ＭＹＯ７Ａは最強であり、それに、シンプルオーバーラップ、トランススプライシングおよび天然イントロンハイブリッドが続いた（図２５Ｃ）。
発現されたＭＹＯ７Ａのオーバーラップ／スプライス領域の特徴付け。デュアルベクターから生じたｍＲＮＡの忠実度を特徴付けるために、ＨＥＫ２９３細胞をデュアルベクターを用いて感染させ、ＲＮＡを抽出し、オーバーラップ領域の上流およびｂＧＨポリＡシグナル領域中に結合するプライマーを利用して、逆転写し、ＰＣＲに付して、４．５ｋｂのＰＣＲ断片を生成した（図２６Ａ）。逆転写酵素を含有しない同一に処置したサンプルを、染色体ＤＮＡ混入の対照として使用した。全長ＭＹＯ７Ａコード配列を含有するプラスミドを、ＰＣＲの陽性対照として使用した。ＰｐｕＭＩおよびＢｇｌＩＩを用いる制限エンドヌクレアーゼ消化後のアガロースゲルでの断片移動のパターンを分析することによって、ＡＡＶ媒介性ＭＹＯ７Ａ ｍＲＮＡの予備的スクリーニングを実施した（図２６Ａ）。試験した各デュアルベクタープラットフォームから得たアンプリコンの消化後に、予測されたパターン（ＰｐｕＭＩ：１５９１、８７６、５５６、５４８、５４１、２３８、１６８、４２および３６ｂｐ；ＢｇｌＩＩ：１３３５、１０７４、８２７、５８３、３６０、２７２および１４６ｂｐ）と一致する同一のバンドパターンが観察され、これは、ベクター対の相同組換えおよび／またはＲＮＡスプライシングのいずれかの結果として全体的な変化（欠失／挿入）が生じなかったことを示す（図２６Ｂ）。オーバーラップ領域の忠実度をさらに特徴付けるために、完全オーバーラップ領域（１８２９ｂｐ）を含有する断片を制限し、ｐＵＣ５７中にクローニングした（図２６Ａ）。ベクタープラットフォームあたりランダムに選んだ１０クローンのシーケンシング結果は、オーバーラップ領域が、コンセンサス／予測されたＭＹＯ７Ａ配列に対して１００％同一であったことを示した（図２６Ｃ）。これは、シンプルオーバーラッププラットフォームとの関連で、相同組換えが正確であったことを示した。さらに、トランススプライシングベクターとの関連で、正確なスプライシングが生じた。最後に、ＡＰハイブリッドベクターについて、正確な相同組換えおよび／またはスプライシングの組合せが行われた。このプロトコールが再構成されたＭＹＯ７Ａにおいて異常な配列を検出可能であったか否かを決定するために、２６３５位でのＨｉｎｄＩＩＩ認識部位（ＴＡＧＣ）または２３８１位での点突然変異（Ｔ－Ｃ）の挿入のいずれかを含有する配列も生成した。
マウス網膜におけるデュアルベクターによって媒介されるＭＹＯ７Ａ発現。２つのインビボで最良に実施するデュアルベクタープラットフォームからのＭＹＯ７Ａの発現を調べるために、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、ＡＡＶ８（７３３）中にパッケージングされたシンプルオーバーラップおよびＡＰハイブリッドシステムの眼あたり１×１０１０ベクターゲノムを用いて網膜下に注射し、４週間後にウエスタンブロットおよび免疫組織化学によって分析した。ＡＡＶ８（７３３）－ｆＡＡＶ－ＭＹＯ７Ａベクターも注射して、比較の基準を提供した。内因性ＭＹＯ７Ａと、ベクターによって媒介される外因性発現の間を区別するために、ＨＡタグの配列コーディングを、すべてのコンストラクトにおいてＭＹＯ７Ａ ｃＤＮＡのＣプライム末端に付加した。得られた網膜を、ＨＡについて免疫染色し、ｆＡＡＶベクターが両デュアルベクタープラットフォームとともに光受容体およびＲＰＥにおけるＭＹＯ７Ａの発現を媒介したことを明らかにした。最近の報告は、シンプルオーバーラップベクターは、光受容体よりもＲＰＥへの遺伝子導入にとってより効率的であると結論付けた（Trapani et al., 2013）。シンプルオーバーラップ媒介性ＭＹＯ７Ａ発現は、ＲＰＥおよび光受容体の両方において観察された。ＡＡＶ２ベースのシンプルオーバーラップベクターによって媒介される「斑状の」ＭＹＯ７Ａ発現を示す以前の結果（Lopes et al., 2013）とは対照的に、ＡＡＶ８（７３３）中にパッケージングされた場合に、シンプルオーバーラップベクターが、ＲＰＥおよび光受容体細胞の大部分においてＭＹＯ７Ａ発現を媒介したことが見出された。ＡＰハイブリッドベクターシステムを用いて注射された眼では光受容体変性／外顆粒層菲薄化が明らかであった。観察された変性に関わらず、残存するＰＲ細胞体およびＲＰＥにおいてＡＰハイブリッド媒介性ＭＹＯ７Ａは明確に検出され、免疫ブロットによって検出されるのに十分であった。ＨＡ抗体を使用するウエスタンブロット分析によって、シンプルオーバーラップ媒介性ＭＹＯ７Ａは、ちょうど検出可能な量で存在していた。対照的に、ｆＡＡＶ媒介性タンパク質レベルは、このアッセイにおいて検出されるのに不十分であった。ＭＹＯ７Ａに対する抗体を使用して、ＷＴマウス網膜の免疫ブロットは、内因性ＭＹＯ７Ａおよびデュアルベクター媒介性の、ＨＡタグが付けられたＭＹＯ７Ａは両方とも同様に移動することを示した。
考察
この実施例では、定義された遺伝子ペイロードを有するデュアルＡＡＶベクターを使用して、大きな導入遺伝子をインビトロおよびインビボで送達できることがわかった。すべてのデュアルベクタープラットフォームのうち最もシンプルなものを使用する最初の実験によって、ＡＡＶ２ベースのシンプルオーバーラップベクターの効率は、使用される５’および３’ベクターの量に比例することならびにこのシステムによって媒介されるＭＹＯ７Ａ発現が、ＨＥＫ２９３細胞におけるインキュベーション時間の関数として増大することが示された。次いで、インビトロで３つの別個のデュアルベクタープラットフォームを評価し、シングルの、断片化されたｆＡＡＶベクターに対して比較した。分析したすべてのデュアルベクターが、ｆＡＡＶよりも高いレベルのＭＹＯ７Ａ発現を駆動した。試験したすべてのプラットフォームのうち、ＡＰ遺伝子（ＡＰハイブリッド）由来のオーバーラップする組換え産物配列およびスプライスドナー／アクセプター部位を含有するハイブリッドベクターシステムが最も効率的であった。
デュアルベクタープラットフォームが、正しいサイズの遺伝子産物を発現する特異性に関して、免疫ブロットによって検出されたように、より低分子量のさらなるバンドがトランススプライシングおよびハイブリッドデュアルベクタープラットフォームによって生成されたことがインビトロで留意された（使用されたモノクローナル抗体は、アミノ末端ＭＹＯ７Ａに対して作製された）。この末端切断型タンパク質生成物の発現は、５’ベクター単独を用いる感染についてかなりより顕著であった。
宿主細胞への侵入後、ウイルスカプシドが除去され、一本鎖ＤＮＡペイロードが放出される。一本鎖によって保持されるＩＴＲが、ＤＮＡポリメラーゼのプライマーとして働き、二本鎖を生成する。得られた環状中間体は、主に単量体からなり、これは、経時的に、分子間組換えによって多量体コンカテマーに変換する（Duan et al., 1998; Yang et al., 1999）。本開示のデュアルベクターシステムは、この戦略を利用して、全長タンパク質発現を達成する。制限因子は、発現カセットに隣接するより高度の組換え産物ＩＴＲが、天然に同一であり、ランダム組換え、結果的に、互いに対するベクターパートのランダム配向につながるという事実にある。５’から３’配向にある２つのベクターパートを有するコンカテマーのみが、全長タンパク質を発現できるので、このランダム組換えは、効率の低減を必然的にもたらす。この経時的なコンカテマー化は、５’および３’ベクターの両方を組み合わせると、全長タンパク質を好んでシングルベクター生成物の量が低減するという観察結果と一致する。興味深いことに、シンプルオーバーラップシステムは、感染のために５’ベクターのみが使用される場合でさえ末端切断型生成物を生成しない。トランススプライシングおよびハイブリッドベクターとは対照的に、ＭＹＯ７Ａコード配列の末端と右側のＩＴＲの間に介在する配列は実質的にない。
注目すべきことに、本開示において、インビトロで試験されたすべてのデュアルベクターのオーバーラップ領域中の配列は、コンセンサス／予測されたＭＹＯ７Ａ配列に対して１００％同一であったことが見出された。これは、各デュアルベクタープラットフォームにおける相同組換えおよび／またはスプライシングが正確であったことを示す。
インビトロ結果と同様に、最高レベルのＭＹＯ７Ａ発現は、ＡＡＶ８ベースのＡＰハイブリッドベクターを用いて網膜下注射されたマウスの網膜において見出された（ウエスタンブロットでＨＡについてのプロービングによって評価されるように）。注目すべきことに、末端切断型タンパク質は、シンプルオーバーラップまたはＡＰ－ハイブリッドによって媒介されるＭＹＯ７Ａのいずれかを発現する網膜では明らかではなかった。この観察された相違の理由は、依然として解明されるべきであるが、有糸分裂後光受容体／ＲＰＥに対する活発に分裂する細胞における組換えを媒介するＤＮＡ修復機構の相違が関与する可能性がある（Hirsch et al., 2013）。デュアルベクター媒介性ＭＹＯ７Ａ－ＨＡ発現は、ＷＴマウスの、ＭＹＯ７Ａが機能的役割を有すると考えられる位置である光受容体およびＲＰＥにおいて観察された（Williams and Lopes,2011）。ＡＰハイブリッドベクターを用いて注射された眼では、外顆粒層の著しい菲薄化が観察された。ＭＹＯ７Ａのベクター媒介性過剰発現は網膜の毒性につながることが、これまでに示された（Hashimoto et al. 2007）。ＡＰハイブリッドプラットフォームについてインビトロで観察された形質導入の高い効率と総合すると、観察された病理の最も可能性が高い説明は、ＭＹＯ７Ａの過剰な生成である。著しい変性に関わらず、ウエスタンブロットで相当な量のＡＰハイブリッド媒介性の全長ＭＹＯ７Ａ－ＨＡが検出された。これらの実験では高濃度のベクターが使用されたので、細胞傷害性を回避するための単純解は、注射されるベクターゲノムを低減すること、または強力な遍在性のｓｍＣＢＡプロモーターを内因性もしくは相同なプロモーターおよび／もしくは減弱された強度を有するプロモーターと置き換えること、またはインビトロで５’ベクター単独から発現された観察されたタンパク質のような望まれない生成物の発現を低減することである可能性がある。しかし、ＡＰハイブリッド処置された網膜のウエスタンブロットで、完全サイズのＭＹＯ７Ａ－ＨＡのみが明らかであったことは注記された。
ＵＳＨ１ＢのためのＡＡＶベースの処置の開発を目的として、この疾患の動物モデルは、豊富な有用な情報を提供してきた。ｆＡＡＶ－ＭＹＯ７Ａおよびシンプルオーバーラップデュアルベクターは、ｓｈａｋｅｒ１マウスにおいてメラノソーム移動およびオプシン局在性を回復可能であった（Lopes et al., 2013）という以前の観察結果と同様に、独立した実験室による最近の研究によって、動物モデルにおいて超微細構造的網膜表現型を回復可能であったことが報告されたときに、本明細書において開示されるベクターの有用性が確認された。注目すべきことに、ｓｈａｋｅｒ１マウスは、ＵＳＨ１Ｂ患者において見られる重度の機能異常である網膜変性を欠く（Liu et al., 1997）。この事実は、ｓｈａｋｅｒ１網膜における治療成績のインビボ分析を問題になるものにする。この壊滅的な疾患のための処置を評価するための代替動物モデルは、ヒト臨床的使用への本方法の適用において有用であり得る。
ここで提示される結果はまた、デュアル－ＡＡＶ－ベクターシステムを使用してＭＹＯ７Ａを効率的に発現させることができることを実証した。オーバーラップする要素を含有するプラットフォーム、すなわち、シンプルオーバーラップシステムおよびＡＰハイブリッドシステムは両方とも高度に効率的であった。ＡＰハイブリッドベクターは、試験されたすべてのシステムの最強発現を示し、インビトロでは末端切断型タンパク質をほとんど観察可能ではなく、インビボでは観察されなかった。シンプルオーバーラップベクターは、良好な発現を示し、細胞を感染させるために５’のみのベクターが使用された場合でさえ、最も特異的であった（末端切断型タンパク質生成物は観察されなかった）。ＡＡＶは、好ましい臨床ベクターとして現れ、光受容体およびＲＰＥの両方を効率的に形質導入する。ここで、ＭＹＯ７Ａ配列忠実度が、デュアル－ＡＡＶ－ベクタープラットフォームの組換えおよび／またはスプライシング後に保たれることを実証したので、またデュアルベクターを用いて注射されたマウス網膜において全長ＭＹＯ７Ａのみが検出可能であったので、本明細書において提示されるデュアル－ＡＡＶ－ベクター戦略は、大きな遺伝子、例えば、ＵＳＨ１Ｂにおける突然変異と関連する網膜障害の処置のための妥当な選択肢に相当する。
実施例１～５において使用されたベクターのヌクレオチド配列
配列番号１は、オーバーラップシステムの第１世代フロントハーフベクターのヌクレオチド配列である（すなわち、ＡＡＶ－ｓｍＣＢＡ－ｈＭＹＯ７Ａ－ＮＴｌｏｎｇ；「ｈＭｙｏ７ａコーディングオーバーラップベクターＡ」）；
CTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCTCAGATCTGGCGCGCCCAATTCGGTACCCTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGAGTCGCTGCGCGCTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTTGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTGAGGGGCTCCGGGAGCTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTTATTGTGCTGTCTCATCATTTTGGCAAAGAATTCTAGCGGCCGCCACCATGGTGATTCTTCAGCAGGGGGACCATGTGTGGATGGACCTGAGATTGGGGCAGGAGTTCGACGTGCCCATCGGGGCGGTGGTGAAGCTCTGCGACTCTGGGCAGGTCCAGGTGGTGGATGATGAAGACAATGAACACTGGATCTCTCCGCAGAACGCAACGCACATCAAGCCTATGCACCCCACGTCGGTCCACGGCGTGGAGGACATGATCCGCCTGGGGGACCTCAACGAGGCGGGCATCTTGCGCAACCTGCTTATCCGCTACCGGGACCACCTCATCTACACGTATACGGGCTCCATCCTGGTGGCTGTGAACCCCTACCAGCTGCTCTCCATCTACTCGCCAGAGCACATCCGCCAGTATACCAACAAGAAGATTGGGGAGATGCCCCCCCACATCTTTGCCATTGCTGACAACTGCTACTTCAACATGAAACGCAACAGCCGAGACCAGTGCTGCATCATCAGTGGGGAATCTGGGGCCGGGAAGACGGAGAGCACAAAGCTGATCCTGCAGTTCCTGGCAGCCATCAGTGGGCAGCACTCGTGGATTGAGCAGCAGGTCTTGGAGGCCACCCCCATTCTGGAAGCATTTGGGAATGCCAAGACCATCCGCAATGACAACTCAAGCCGTTTCGGAAAGTACATCGACATCCACTTCAACAAGCGGGGCGCCATCGAGGGCGCGAAGATTGAGCAGTACCTGCTGGAAAAGTCACGTGTCTGTCGCCAGGCCCTGGATGAAAGGAACTACCACGTGTTCTACTGCATGCTGGAGGGTATGAGTGAGGATCAGAAGAAGAAGCTGGGCTTGGGCCAGGCCTCTGACTACAACTACTTGGCCATGGGTAACTGCATAACCTGTGAGGGCCGGGTGGACAGCCAGGAGTACGCCAACATCCGCTCCGCCATGAAGGTGCTCATGTTCACTGACACCGAGAACTGGGAGATCTCGAAGCTCCTGGCTGCCATCCTGCACCTGGGCAACCTGCAGTATGAGGCACGCACATTTGAAAACCTGGATGCCTGTGAGGTTCTCTTCTCCCCATCGCTGGCCACAGCTGCATCCCTGCTTGAGGTGAACCCCCCAGACCTGATGAGCTGCCTGACTAGCCGCACCCTCATCACCCGCGGGGAGACGGTGTCCACCCCACTGAGCAGGGAACAGGCACTGGACGTGCGCGACGCCTTCGTAAAGGGGATCTACGGGCGGCTGTTCGTGTGGATTGTGGACAAGATCAACGCAGCAATTTACAAGCCTCCCTCCCAGGATGTGAAGAACTCTCGCAGGTCCATCGGCCTCCTGGACATCTTTGGGTTTGAGAACTTTGCTGTGAACAGCTTTGAGCAGCTCTGCATCAACTTCGCCAATGAGCACCTGCAGCAGTTCTTTGTGCGGCACGTGTTCAAGCTGGAGCAGGAGGAATATGACCTGGAGAGCATTGACTGGCTGCACATCGAGTTCACTGACAACCAGGATGCCCTGGACATGATTGCCAACAAGCCCATGAACATCATCTCCCTCATCGATGAGGAGAGCAAGTTCCCCAAGGGCACAGACACCACCATGTTACACAAGCTGAACTCCCAGCACAAGCTCAACGCCAACTACATCCCCCCCAAGAACAACCATGAGACCCAGTTTGGCATCAACCATTTTGCAGGCATCGTCTACTATGAGACCCAAGGCTTCCTGGAGAAGAACCGAGACACCCTGCATGGGGACATTATCCAGCTGGTCCACTCCTCCAGGAACAAGTTCATCAAGCAGATCTTCCAGGCCGATGTCGCCATGGGCGCCGAGACCAGGAAGCGCTCGCCCACACTTAGCAGCCAGTTCAAGCGGTCACTGGAGCTGCTGATGCGCACGCTGGGTGCCTGCCAGCCCTTCTTTGTGCGATGCATCAAGCCCAATGAGTTCAAGAAGCCCATGCTGTTCGACCGGCACCTGTGCGTGCGCCAGCTGCGGTACTCAGGAATGATGGAGACCATCCGAATCCGCCGAGCTGGCTACCCCATCCGCTACAGCTTCGTAGAGTTTGTGGAGCGGTACCGTGTGCTGCTGCCAGGTGTGAAGCCGGCCTACAAGCAGGGCGACCTCCGCGGGACTTGCCAGCGCATGGCTGAGGCTGTGCTGGGCACCCACGATGACTGGCAGATAGGCAAAACCAAGATCTTTCTGAAGGACCACCATGACATGCTGCTGGAAGTGGAGCGGGACAAAGCCATCACCGACAGAGTCATCCTCCTTCAGAAAGTCATCCGGGGATTCAAAGACAGGTCTAACTTTCTGAAGCTGAAGAACGCTGCCACACTGATCCAGAGGCACTGGCGGGGTCACAACTGTAGGAAGAACTACGGGCTGATGCGTCTGGGCTTCCTGCGGCTGCAGGCCCTGCACCGCTCCCGGAAGCTGCACCAGCAGTACCGCCTGGCCCGCCAGCGCATCATCCAGTTCCAGGCCCGCTGCCGCGCCTATCTGGTGCGCAAGGCCTTCCGCCACCGCCTCTGGGCTGTGCTCACCGTGCAGGCCTATGCCCGGGGCATGATCGCCCGCAGGCTGCACCAACGCCTCAGGGCTGAGTATCTGTGGCGCCTCGAGGCTGAGAAAATGCGGCTGGCGGAGGAAGAGAAGCTTCGGAAGGAGATGAGCGCCAAGAAGGCCAAGGAGGAGGCCGAGCGCAAGCATCAGGAGCGCCTGGCCCAGCTGGCTCGTGAGGACGCTGAGCGGGAGCTGAAGGAGAAGGAGGCCGCTCGGCGGAAGAAGGAGCTCCTGGAGCAGATGGAAAGGGCCCGCCATGAGCCTGTCAATCACTCAGACATGGTGGACAAGATGTTTGGCTTCCTGGGGACTTCAGGTGGCCTGCCAGGCCAGGAGGGCCAGGCACCTAGTGGCTTTGAGGACCTGGAGCGAGGGCGGAGGGAGATGGTGGAGGAGGACCTGGATGCAGCCCTGCCCCTGCCTGACGAGGATGAGGAGGACCTCTCTGAGTATAAATTTGCCAAGTTCGCGGCCACCTACTTCCAGGGGACAACCACGCACTCCTACACCCGGCGGCCACTCAAACAGCCACTGCTCTACCATGACGACGAGGGTGACCAGCTGGCAGCCCTGGCGGTCTGGATCACCATCCTCCGCTTCATGGGGGACCTCCCTGAGCCCAAGTACCACACAGCCATGAGTGATGGCAGTGAGAAGATCCCTGTGATGACCAAGATTTATGAGACCCTGGGCAAGAAGACGTACAAGAGGGAGCTGCAGGCCCTGCAGGGCGAGGGCGAGGCCCAGCTCCCCGAGGGCCAGAAGAAGAGCAGTGTGAGGCACAAGCTGGTGCATTTGACTCTGAAAAAGAAGTCCAAGCTCACAGAGGAGGTGACCAAGAGGCTGCATGACGGGGAGTCCACAGTGCAGGGCAACAGCATGCTGGAGGACCGGCCCACCTCCAACCTGGAGAAGCTGCACTTCATCATCGGCAATGGCATCCTGCGGCCAGCACTCCGGGACGAGATCTACTGCCAGATCAGCAAGCAGCTGACCCACAACCCCTCCAAGAGCAGCTATGCCCGGGGCTGGATTCTCGTGTCTCTCTGCGTGGGCTGTTTCGCCCCCTCCGAGAAGTTTGTCAAGTACCTGCGGAACTTCGCTAGCGGGCACTAGTCCGTCGACTGTTAATTAAGCATGCTGGGGAGAGATCTAGGAAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAG
配列番号２は、オーバーラップシステムの第１世代バックハーフベクターのヌクレオチド配列である（すなわち、ＡＡＶ－ｈＭＹＯ７Ａ－ＣＴｌｏｎｇ．ＨＡ；「ｈＭｙｏ７ａコーディングオーバーラップベクターＢ」）；
CTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCAGATCTGGCGCGCCCAATTGGCTTCGAATTCTAGCGGCCGCTGCTTAAGCAGGTCTAACTTTCTGAAGCTGAAGAACGCTGCCACACTGATCCAGAGGCACTGGCGGGGTCACAACTGTAGGAAGAACTACGGGCTGATGCGTCTGGGCTTCCTGCGGCTGCAGGCCCTGCACCGCTCCCGGAAGCTGCACCAGCAGTACCGCCTGGCCCGCCAGCGCATCATCCAGTTCCAGGCCCGCTGCCGCGCCTATCTGGTGCGCAAGGCCTTCCGCCACCGCCTCTGGGCTGTGCTCACCGTGCAGGCCTATGCCCGGGGCATGATCGCCCGCAGGCTGCACCAACGCCTCAGGGCTGAGTATCTGTGGCGCCTCGAGGCTGAGAAAATGCGGCTGGCGGAGGAAGAGAAGCTTCGGAAGGAGATGAGCGCCAAGAAGGCCAAGGAGGAGGCCGAGCGCAAGCATCAGGAGCGCCTGGCCCAGCTGGCTCGTGAGGACGCTGAGCGGGAGCTGAAGGAGAAGGAGGCCGCTCGGCGGAAGAAGGAGCTCCTGGAGCAGATGGAAAGGGCCCGCCATGAGCCTGTCAATCACTCAGACATGGTGGACAAGATGTTTGGCTTCCTGGGGACTTCAGGTGGCCTGCCAGGCCAGGAGGGCCAGGCACCTAGTGGCTTTGAGGACCTGGAGCGAGGGCGGAGGGAGATGGTGGAGGAGGACCTGGATGCAGCCCTGCCCCTGCCTGACGAGGATGAGGAGGACCTCTCTGAGTATAAATTTGCCAAGTTCGCGGCCACCTACTTCCAGGGGACAACCACGCACTCCTACACCCGGCGGCCACTCAAACAGCCACTGCTCTACCATGACGACGAGGGTGACCAGCTGGCAGCCCTGGCGGTCTGGATCACCATCCTCCGCTTCATGGGGGACCTCCCTGAGCCCAAGTACCACACAGCCATGAGTGATGGCAGTGAGAAGATCCCTGTGATGACCAAGATTTATGAGACCCTGGGCAAGAAGACGTACAAGAGGGAGCTGCAGGCCCTGCAGGGCGAGGGCGAGGCCCAGCTCCCCGAGGGCCAGAAGAAGAGCAGTGTGAGGCACAAGCTGGTGCATTTGACTCTGAAAAAGAAGTCCAAGCTCACAGAGGAGGTGACCAAGAGGCTGCATGACGGGGAGTCCACAGTGCAGGGCAACAGCATGCTGGAGGACCGGCCCACCTCCAACCTGGAGAAGCTGCACTTCATCATCGGCAATGGCATCCTGCGGCCAGCACTCCGGGACGAGATCTACTGCCAGATCAGCAAGCAGCTGACCCACAACCCCTCCAAGAGCAGCTATGCCCGGGGCTGGATTCTCGTGTCTCTCTGCGTGGGCTGTTTCGCCCCCTCCGAGAAGTTTGTCAAGTACCTGCGGAACTTCATCCACGGGGGCCCGCCCGGCTACGCCCCGTACTGTGAGGAGCGCCTGAGAAGGACCTTTGTCAATGGGACACGGACACAGCCGCCCAGCTGGCTGGAGCTGCAGGCCACCAAGTCCAAGAAGCCAATCATGTTGCCCGTGACATTCATGGATGGGACCACCAAGACCCTGCTGACGGACTCGGCAACCACGGCCAAGGAGCTCTGCAACGCGCTGGCCGACAAGATCTCTCTCAAGGACCGGTTCGGGTTCTCCCTCTACATTGCCCTGTTTGACAAGGTGTCCTCCCTGGGCAGCGGCAGTGACCACGTCATGGACGCCATCTCCCAGTGCGAGCAGTACGCCAAGGAGCAGGGCGCCCAGGAGCGCAACGCCCCCTGGAGGCTCTTCTTCCGCAAAGAGGTCTTCACGCCCTGGCACAGCCCCTCCGAGGACAACGTGGCCACCAACCTCATCTACCAGCAGGTGGTGCGAGGAGTCAAGTTTGGGGAGTACAGGTGTGAGAAGGAGGACGACCTGGCTGAGCTGGCCTCCCAGCAGTACTTTGTAGACTATGGCTCTGAGATGATCCTGGAGCGCCTCCTGAACCTCGTGCCCACCTACATCCCCGACCGCGAGATCACGCCCCTGAAGACGCTGGAGAAGTGGGCCCAGCTGGCCATCGCCGCCCACAAGAAGGGGATTTATGCCCAGAGGAGAACTGATGCCCAGAAGGTCAAAGAGGATGTGGTCAGTTATGCCCGCTTCAAGTGGCCCTTGCTCTTCTCCAGGTTTTATGAAGCCTACAAATTCTCAGGCCCCAGTCTCCCCAAGAACGACGTCATCGTGGCCGTCAACTGGACGGGTGTGTACTTTGTGGATGAGCAGGAGCAGGTACTTCTGGAGCTGTCCTTCCCAGAGATCATGGCCGTGTCCAGCAGCAGGGGAGCGAAAACGACGGCCCCCAGCTTCACGCTGGCCACCATCAAGGGGGACGAATACACCTTCACCTCCAGCAATGCTGAGGACATTCGTGACCTGGTGGTCACCTTCCTAGAGGGGCTCCGGAAGAGATCTAAGTATGTTGTGGCCCTGCAGGATAACCCCAACCCCGCAGGCGAGGAGTCAGGCTTCCTCAGCTTTGCCAAGGGAGACCTCATCATCCTGGACCATGACACGGGCGAGCAGGTCATGAACTCGGGCTGGGCCAACGGCATCAATGAGAGGACCAAGCAGCGTGGGGACTTCCCCACCGACAGTGTGTACGTCATGCCCACTGTCACCATGCCACCGCGGGAGATTGTGGCCCTGGTCACCATGACTCCCGATCAGAGGCAGGACGTTGTCCGGCTCTTGCAGCTGCGAACGGCGGAGCCCGAGGTGCGTGCCAAGCCCTACACGCTGGAGGAGTTTTCCTATGACTACTTCAGGCCCCCACCCAAGCACACGCTGAGCCGTGTCATGGTGTCCAAGGCCCGAGGCAAGGACCGGCTGTGGAGCCACACGCGGGAACCGCTCAAGCAGGCGCTGCTCAAGAAGCTCCTGGGCAGTGAGGAGCTCTCGCAGGAGGCCTGCCTGGCCTTCATTGCTGTGCTCAAGTACATGGGCGACTACCCGTCCAAGAGGACACGCTCCGTCAACGAGCTCACCGACCAGATCTTTGAGGGTCCCCTGAAAGCCGAGCCCCTGAAGGACGAGGCATATGTGCAGATCCTGAAGCAGCTGACCGACAACCACATCAGGTACAGCGAGGAGCGGGGTTGGGAGCTGCTCTGGCTGTGCACGGGCCTTTTCCCACCCAGCAACATCCTCCTGCCCCACGTGCAGCGCTTCCTGCAGTCCCGAAAGCACTGCCCACTCGCCATCGACTGCCTGCAACGGCTCCAGAAAGCCCTGAGAAACGGGTCCCGGAAGTACCCTCCGCACCTGGTGGAGGTGGAGGCCATCCAGCACAAGACCACCCAGATTTTCCACAAAGTCTACTTCCCTGATGACACTGACGAGGCCTTCGAAGTGGAGTCCAGCACCAAGGCCAAGGACTTCTGCCAGAACATCGCCACCAGGCTGCTCCTCAAGTCCTCAGAGGGATTCAGCCTCTTTGTCAAAATTGCAGACAAGGTCATCAGCGTTCCTGAGAATGACTTCTTCTTTGACTTTGTTCGACACTTGACAGACTGGATAAAGAAAGCTCGGCCCATCAAGGACGGAATTGTGCCCTCACTCACCTACCAGGTGTTCTTCATGAAGAAGCTGTGGACCACCACGGTGCCAGGGAAGGATCCCATGGCCGATTCCATCTTCCACTATTACCAGGAGTTGCCCAAGTATCTCCGAGGCTACCACAAGTGCACGCGGGAGGAGGTGCTGCAGCTGGGGGCGCTGATCTACAGGGTCAAGTTCGAGGAGGACAAGTCCTACTTCCCCAGCATCCCCAAGCTGCTGCGGGAGCTGGTGCCCCAGGACCTTATCCGGCAGGTCTCACCTGATGACTGGAAGCGGTCCATCGTCGCCTACTTCAACAAGCACGCAGGGAAGTCCAAGGAGGAGGCCAAGCTGGCCTTCCTGAAGCTCATCTTCAAGTGGCCCACCTTTGGCTCAGCCTTCTTCGAGGTGAAGCAAACTACGGAGCCAAACTTCCCTGAGATCCTCCTAATTGCCATCAACAAGTATGGGGTCAGCCTCATCGATCCCAAAACGAAGGATATCCTCACCACTCATCCCTTCACCAAGATCTCCAACTGGAGCAGCGGCAACACCTACTTCCACATCACCATTGGGAACTTGGTGCGCGGGAGCAAACTGCTCTGCGAGACGTCACTGGGCTACAAGATGGATGACCTCCTGACTTCCTACATTAGCCAGATGCTCACAGCCATGAGCAAACAGCGGGGCTCCAGGAGCGGCAAGTACCCTTACGATGTACCGGATTACGCATGAGGTACCAAGGGCGAATTCTGCAGTCGACTAGAGCTCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGAGAGATCTGAGGACTAGTCCGTCGACTGTTAATTAAGCATGCTGGGGAGAGATCTAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAG
配列番号３は、エクソン２３／２４ハイブリッドベクターシステムのフロントハーフベクターのヌクレオチド配列である（すなわち、ＡＡＶ－ｓｍＣＢＡ－ｈＭＹＯ７ＡＮＴ－ＡＰＳＤ－Ａｐヘッド）；
CTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCTCAGATCTGGCGCGCCCAATTCGGTACCCTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGAGTCGCTGCGCGCTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTTGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTGAGGGGCTCCGGGAGCTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTTATTGTGCTGTCTCATCATTTTGGCAAAGAATTCTAGCGGCCGCCACCATGGTGATTCTTCAGCAGGGGGACCATGTGTGGATGGACCTGAGATTGGGGCAGGAGTTCGACGTGCCCATCGGGGCGGTGGTGAAGCTCTGCGACTCTGGGCAGGTCCAGGTGGTGGATGATGAAGACAATGAACACTGGATCTCTCCGCAGAACGCAACGCACATCAAGCCTATGCACCCCACGTCGGTCCACGGCGTGGAGGACATGATCCGCCTGGGGGACCTCAACGAGGCGGGCATCTTGCGCAACCTGCTTATCCGCTACCGGGACCACCTCATCTACACGTATACGGGCTCCATCCTGGTGGCTGTGAACCCCTACCAGCTGCTCTCCATCTACTCGCCAGAGCACATCCGCCAGTATACCAACAAGAAGATTGGGGAGATGCCCCCCCACATCTTTGCCATTGCTGACAACTGCTACTTCAACATGAAACGCAACAGCCGAGACCAGTGCTGCATCATCAGTGGGGAATCTGGGGCCGGGAAGACGGAGAGCACAAAGCTGATCCTGCAGTTCCTGGCAGCCATCAGTGGGCAGCACTCGTGGATTGAGCAGCAGGTCTTGGAGGCCACCCCCATTCTGGAAGCATTTGGGAATGCCAAGACCATCCGCAATGACAACTCAAGCCGTTTCGGAAAGTACATCGACATCCACTTCAACAAGCGGGGCGCCATCGAGGGCGCGAAGATTGAGCAGTACCTGCTGGAAAAGTCACGTGTCTGTCGCCAGGCCCTGGATGAAAGGAACTACCACGTGTTCTACTGCATGCTGGAGGGTATGAGTGAGGATCAGAAGAAGAAGCTGGGCTTGGGCCAGGCCTCTGACTACAACTACTTGGCCATGGGTAACTGCATAACCTGTGAGGGCCGGGTGGACAGCCAGGAGTACGCCAACATCCGCTCCGCCATGAAGGTGCTCATGTTCACTGACACCGAGAACTGGGAGATCTCGAAGCTCCTGGCTGCCATCCTGCACCTGGGCAACCTGCAGTATGAGGCACGCACATTTGAAAACCTGGATGCCTGTGAGGTTCTCTTCTCCCCATCGCTGGCCACAGCTGCATCCCTGCTTGAGGTGAACCCCCCAGACCTGATGAGCTGCCTGACTAGCCGCACCCTCATCACCCGCGGGGAGACGGTGTCCACCCCACTGAGCAGGGAACAGGCACTGGACGTGCGCGACGCCTTCGTAAAGGGGATCTACGGGCGGCTGTTCGTGTGGATTGTGGACAAGATCAACGCAGCAATTTACAAGCCTCCCTCCCAGGATGTGAAGAACTCTCGCAGGTCCATCGGCCTCCTGGACATCTTTGGGTTTGAGAACTTTGCTGTGAACAGCTTTGAGCAGCTCTGCATCAACTTCGCCAATGAGCACCTGCAGCAGTTCTTTGTGCGGCACGTGTTCAAGCTGGAGCAGGAGGAATATGACCTGGAGAGCATTGACTGGCTGCACATCGAGTTCACTGACAACCAGGATGCCCTGGACATGATTGCCAACAAGCCCATGAACATCATCTCCCTCATCGATGAGGAGAGCAAGTTCCCCAAGGGCACAGACACCACCATGTTACACAAGCTGAACTCCCAGCACAAGCTCAACGCCAACTACATCCCCCCCAAGAACAACCATGAGACCCAGTTTGGCATCAACCATTTTGCAGGCATCGTCTACTATGAGACCCAAGGCTTCCTGGAGAAGAACCGAGACACCCTGCATGGGGACATTATCCAGCTGGTCCACTCCTCCAGGAACAAGTTCATCAAGCAGATCTTCCAGGCCGATGTCGCCATGGGCGCCGAGACCAGGAAGCGCTCGCCCACACTTAGCAGCCAGTTCAAGCGGTCACTGGAGCTGCTGATGCGCACGCTGGGTGCCTGCCAGCCCTTCTTTGTGCGATGCATCAAGCCCAATGAGTTCAAGAAGCCCATGCTGTTCGACCGGCACCTGTGCGTGCGCCAGCTGCGGTACTCAGGAATGATGGAGACCATCCGAATCCGCCGAGCTGGCTACCCCATCCGCTACAGCTTCGTAGAGTTTGTGGAGCGGTACCGTGTGCTGCTGCCAGGTGTGAAGCCGGCCTACAAGCAGGGCGACCTCCGCGGGACTTGCCAGCGCATGGCTGAGGCTGTGCTGGGCACCCACGATGACTGGCAGATAGGCAAAACCAAGATCTTTCTGAAGGACCACCATGACATGCTGCTGGAAGTGGAGCGGGACAAAGCCATCACCGACAGAGTCATCCTCCTTCAGAAAGTCATCCGGGGATTCAAAGACAGGTCTAACTTTCTGAAGCTGAAGAACGCTGCCACACTGATCCAGAGGCACTGGCGGGGTCACAACTGTAGGAAGAACTACGGGCTGATGCGTCTGGGCTTCCTGCGGCTGCAGGCCCTGCACCGCTCCCGGAAGCTGCACCAGCAGTACCGCCTGGCCCGCCAGCGCATCATCCAGTTCCAGGCCCGCTGCCGCGCCTATCTGGTGCGCAAGGCCTTCCGCCACCGCCTCTGGGCTGTGCTCACCGTGCAGGCCTATGCCCGGGGCATGATCGCCCGCAGGCTGCACCAACGCCTCAGGGCTGAGTATCTGTGGCGCCTCGAGGCTGAGAAAATGCGGCTGGCGGAGGAAGAGAAGCTTCGGAAGGAGATGAGCGCCAAGAAGGCCAAGGAGGAGGCCGAGCGCAAGCATCAGGAGCGCCTGGCCCAGCTGGCTCGTGAGGACGCTGAGCGGGAGCTGAAGGAGAAGGAGGCCGCTCGGCGGAAGAAGGAGCTCCTGGAGCAGATGGAAAGGGCCCGCCATGAGCCTGTCAATCACTCAGACATGGTGGACAAGATGTTTGGCTTCCTGGGGACTTCAGGTGGCCTGCCAGGCCAGGAGGGCCAGGCACCTAGTGGCTTTGAGGTAAGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCTTGTCGAGACAGAGAAGACTCTTGCGTTTCTGAGCTAGCCCCCGGGTGCGCGGCGTCGGTGGTGCCGGCGGGGGGCGCCAGGTCGCAGGCGGTGTAGGGCTCCAGGCAGGCGGCGAAGGCCATGACGTGCGCTATGAAGGTCTGCTCCTGCACGCCGTGAACCAGGTGCGCCTGCGGGCCGCGCGCGAACACCGCCACGTCCTCGCCTGCGTGGGTCTCTTCGTCCAGGGGCACTGCTGACTGCTGCCGATACTCGGGGCTCCCGCTCTCGCTCTCGGTAACATCCGGCCGGGCGCCGTCCTTGAGCACATAGCCTGGACCGTTTCGTCGACTGTTAATTAAGCATGCTGGGGAGAGATCTAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAG
配列番号６７（配列番号３（ＡＡＶ－ｓｍＣＢＡ－ｈＭＹＯ７ＡＮＴ－ＡＰＳＤ－Ａｐヘッド）のＮ－ミオシン７Ａ部分のみ）
ATGGTGATTCTTCAGCAGGGGGACCATGTGTGGATGGACCTGAGATTGGGGCAGGAGTTCGACGTGCCCATCGGGGCGGTGGTGAAGCTCTGCGACTCTGGGCAGGTCCAGGTGGTGGATGATGAAGACAATGAACACTGGATCTCTCCGCAGAACGCAACGCACATCAAGCCTATGCACCCCACGTCGGTCCACGGCGTGGAGGACATGATCCGCCTGGGGGACCTCAACGAGGCGGGCATCTTGCGCAACCTGCTTATCCGCTACCGGGACCACCTCATCTACACGTATACGGGCTCCATCCTGGTGGCTGTGAACCCCTACCAGCTGCTCTCCATCTACTCGCCAGAGCACATCCGCCAGTATACCAACAAGAAGATTGGGGAGATGCCCCCCCACATCTTTGCCATTGCTGACAACTGCTACTTCAACATGAAACGCAACAGCCGAGACCAGTGCTGCATCATCAGTGGGGAATCTGGGGCCGGGAAGACGGAGAGCACAAAGCTGATCCTGCAGTTCCTGGCAGCCATCAGTGGGCAGCACTCGTGGATTGAGCAGCAGGTCTTGGAGGCCACCCCCATTCTGGAAGCATTTGGGAATGCCAAGACCATCCGCAATGACAACTCAAGCCGTTTCGGAAAGTACATCGACATCCACTTCAACAAGCGGGGCGCCATCGAGGGCGCGAAGATTGAGCAGTACCTGCTGGAAAAGTCACGTGTCTGTCGCCAGGCCCTGGATGAAAGGAACTACCACGTGTTCTACTGCATGCTGGAGGGTATGAGTGAGGATCAGAAGAAGAAGCTGGGCTTGGGCCAGGCCTCTGACTACAACTACTTGGCCATGGGTAACTGCATAACCTGTGAGGGCCGGGTGGACAGCCAGGAGTACGCCAACATCCGCTCCGCCATGAAGGTGCTCATGTTCACTGACACCGAGAACTGGGAGATCTCGAAGCTCCTGGCTGCCATCCTGCACCTGGGCAACCTGCAGTATGAGGCACGCACATTTGAAAACCTGGATGCCTGTGAGGTTCTCTTCTCCCCATCGCTGGCCACAGCTGCATCCCTGCTTGAGGTGAACCCCCCAGACCTGATGAGCTGCCTGACTAGCCGCACCCTCATCACCCGCGGGGAGACGGTGTCCACCCCACTGAGCAGGGAACAGGCACTGGACGTGCGCGACGCCTTCGTAAAGGGGATCTACGGGCGGCTGTTCGTGTGGATTGTGGACAAGATCAACGCAGCAATTTACAAGCCTCCCTCCCAGGATGTGAAGAACTCTCGCAGGTCCATCGGCCTCCTGGACATCTTTGGGTTTGAGAACTTTGCTGTGAACAGCTTTGAGCAGCTCTGCATCAACTTCGCCAATGAGCACCTGCAGCAGTTCTTTGTGCGGCACGTGTTCAAGCTGGAGCAGGAGGAATATGACCTGGAGAGCATTGACTGGCTGCACATCGAGTTCACTGACAACCAGGATGCCCTGGACATGATTGCCAACAAGCCCATGAACATCATCTCCCTCATCGATGAGGAGAGCAAGTTCCCCAAGGGCACAGACACCACCATGTTACACAAGCTGAACTCCCAGCACAAGCTCAACGCCAACTACATCCCCCCCAAGAACAACCATGAGACCCAGTTTGGCATCAACCATTTTGCAGGCATCGTCTACTATGAGACCCAAGGCTTCCTGGAGAAGAACCGAGACACCCTGCATGGGGACATTATCCAGCTGGTCCACTCCTCCAGGAACAAGTTCATCAAGCAGATCTTCCAGGCCGATGTCGCCATGGGCGCCGAGACCAGGAAGCGCTCGCCCACACTTAGCAGCCAGTTCAAGCGGTCACTGGAGCTGCTGATGCGCACGCTGGGTGCCTGCCAGCCCTTCTTTGTGCGATGCATCAAGCCCAATGAGTTCAAGAAGCCCATGCTGTTCGACCGGCACCTGTGCGTGCGCCAGCTGCGGTACTCAGGAATGATGGAGACCATCCGAATCCGCCGAGCTGGCTACCCCATCCGCTACAGCTTCGTAGAGTTTGTGGAGCGGTACCGTGTGCTGCTGCCAGGTGTGAAGCCGGCCTACAAGCAGGGCGACCTCCGCGGGACTTGCCAGCGCATGGCTGAGGCTGTGCTGGGCACCCACGATGACTGGCAGATAGGCAAAACCAAGATCTTTCTGAAGGACCACCATGACATGCTGCTGGAAGTGGAGCGGGACAAAGCCATCACCGACAGAGTCATCCTCCTTCAGAAAGTCATCCGGGGATTCAAAGACAGGTCTAACTTTCTGAAGCTGAAGAACGCTGCCACACTGATCCAGAGGCACTGGCGGGGTCACAACTGTAGGAAGAACTACGGGCTGATGCGTCTGGGCTTCCTGCGGCTGCAGGCCCTGCACCGCTCCCGGAAGCTGCACCAGCAGTACCGCCTGGCCCGCCAGCGCATCATCCAGTTCCAGGCCCGCTGCCGCGCCTATCTGGTGCGCAAGGCCTTCCGCCACCGCCTCTGGGCTGTGCTCACCGTGCAGGCCTATGCCCGGGGCATGATCGCCCGCAGGCTGCACCAACGCCTCAGGGCTGAGTATCTGTGGCGCCTCGAGGCTGAGAAAATGCGGCTGGCGGAGGAAGAGAAGCTTCGGAAGGAGATGAGCGCCAAGAAGGCCAAGGAGGAGGCCGAGCGCAAGCATCAGGAGCGCCTGGCCCAGCTGGCTCGTGAGGACGCTGAGCGGGAGCTGAAGGAGAAGGAGGCCGCTCGGCGGAAGAAGGAGCTCCTGGAGCAGATGGAAAGGGCCCGCCATGAGCCTGTCAATCACTCAGACATGGTGGACAAGATGTTTGGCTTCCTGGGGACTTCAGGTGGCCTGCCAGGCCAGGAGGGCCAGGCACCTAGTGGCTTTGAG
配列番号６８（配列番号３（ＡＡＶ－ｓｍＣＢＡ－ｈＭＹＯ７ＡＮＴ－ＡＰＳＤ－Ａｐヘッド）によってコードされるＮ－ミオシン７Ａ部分のみ）
MVILQQGDHVWMDLRLGQEFDVPIGAVVKLCDSGQVQVVDDEDNEHWISPQNATHIKPMHPTSVHGVEDMIRLGDLNEAGILRNLLIRYRDHLIYTYTGSILVAVNPYQLLSIYSPEHIRQYTNKKIGEMPPHIFAIADNCYFNMKRNSRDQCCIISGESGAGKTESTKLILQFLAAISGQHSWIEQQVLEATPILEAFGNAKTIRNDNSSRFGKYIDIHFNKRGAIEGAKIEQYLLEKSRVCRQALDERNYHVFYCMLEGMSEDQKKKLGLGQASDYNYLAMGNCITCEGRVDSQEYANIRSAMKVLMFTDTENWEISKLLAAILHLGNLQYEARTFENLDACEVLFSPSLATAASLLEVNPPDLMSCLTSRTLITRGETVSTPLSREQALDVRDAFVKGIYGRLFVWIVDKINAAIYKPPSQDVKNSRRSIGLLDIFGFENFAVNSFEQLCINFANEHLQQFFVRHVFKLEQEEYDLESIDWLHIEFTDNQDALDMIANKPMNIISLIDEESKFPKGTDTTMLHKLNSQHKLNANYIPPKNNHETQFGINHFAGIVYYETQGFLEKNRDTLHGDIIQLVHSSRNKFIKQIFQADVAMGAETRKRSPTLSSQFKRSLELLMRTLGACQPFFVRCIKPNEFKKPMLFDRHLCVRQLRYSGMMETIRIRRAGYPIRYSFVEFVERYRVLLPGVKPAYKQGDLRGTCQRMAEAVLGTHDDWQIGKTKIFLKDHHDMLLEVERDKAITDRVILLQKVIRGFKDRSNFLKLKNAATLIQRHWRGHNCRKNYGLMRLGFLRLQALHRSRKLHQQYRLARQRIIQFQARCRAYLVRKAFRHRLWAVLTVQAYARGMIARRLHQRLRAEYLWRLEAEKMRLAEEEKLRKEMSAKKAKEEAERKHQERLAQLAREDAERELKEKEAARRKKELLEQMERARHEPVNHSDMVDKMFGFLGTSGGLPGQEGQAPSGFE
配列番号６９（アルカリホスファターゼヘッド配列（ＡＰヘッド）（例えば、ＡＡＶ－ｓｍＣＢＡ－ｈＭＹＯ７Ａ－ＮＴ－ＡＰＳＤ－ＡＰヘッド、ＡＡＶ－ｓｍＣＢＡ－ｈＭＹＯ７Ａ－ＮＴ－Ｅｘ２１－ＡＰＳＤ－ＡＰヘッド、ＡＡＶ－ｓｍＣＢＡ－ｈＭＹＯ７Ａ－ＮＴ－Ｅｘ２１－ＡＰＳＤ－ＡＰヘッドＣＭｖ１、ＡＡＶ－ＡＰヘッド－ＡＰＳＡ－ｈＭＹＯ７ＡＣＴｅｘ２２．ＨＡ－ＭＩＮ、ＡＡＶ－ＡＰヘッド－ＡＰＳＡ－ｈＭＹＯ７ＡＣＴｅｘ２２－ＭＩＮ））
CCCCGGGTGCGCGGCGTCGGTGGTGCCGGCGGGGGGCGCCAGGTCGCAGGCGGTGTAGGGCTCCAGGCAGGCGGCGAAGGCCATGACGTGCGCTATGAAGGTCTGCTCCTGCACGCCGTGAACCAGGTGCGCCTGCGGGCCGCGCGCGAACACCGCCACGTCCTCGCCTGCGTGGGTCTCTTCGTCCAGGGGCACTGCTGACTGCTGCCGATACTCGGGGCTCCCGCTCTCGCTCTCGGTAACATCCGGCCGGGCGCCGTCCTTGAGCACATAGCCTGGACCGTTTC
配列番号７０アルカリホスファターゼヘッド配列（ＡＰヘッド）（例えば、ＡＡＶ－ｓｍＣＢＡ－ｈＭＹＯ７Ａ－ＮＴ－ｅｘ２１－ＡＰＳＤ－ＡＰヘッド－ＣＭｖ２、ＡＡＶ－ｓｍＣＢＡ－ｈＭＹＯ７Ａ－ＮＴ－ｅｘ２１－ＡＰＳＤ－ＡＰヘッド－ＣＭｖ３、ＡＡＶ－ＡＰｈｅａｄ－ＡＰＳＡ－ｈＭＹＯ７ＡＣＴ－ｅｘ２２－ＡＰＳＤ－ＣＭｖ２．ＨＡ、ＡＡＶ－ＡＰヘッド－ＡＰＳＡ－ｈＭＹＯ７ＡＣＴ－ｅｘ２２－ＡＰＳＤ－ＣＭｖ２．ＨＡ－ＭＩＮ、ＡＡＶ－ＡＰヘッド－ＡＰＳＡ－ｈＭＹＯ７ＡＣＴ－ｅｘ２２－ＡＰＳＤ－ＣＭｖ２－ＭＩＮ）
CCCCGGGTGCGCGGCGTCGGTGGTGCCGGCGGGGGGCGCCAGGTCGCAGGCGGTGTAGGGCTCCAGGCAGGCGGCGAAGGCCATGACGTGCGCTATGAAGGTCTGCTCCTGCACGCCGTGAACCAGGTGCGCCTGCGGGCCGCGCGCGAACACCGCCACGTCCTCGCCTGCGTGGGTCTCTTCGTCCAGGGGCACTGCGCACTGCTGCCGATACTCGGGGCTCCCGCTCTCGCTCTCGGTAACATCCGGCCGGGCGCCGTCCTTGAGCACATAGCCTGGACCGTTTC
配列番号４は、エクソン２３／２４ハイブリッドベクターシステムのバックハーフベクターのヌクレオチド配列である（すなわち、ＡＡＶ－ＡＰヘッド－ＡＰＳＡ－ｈＭＹＯ７ＡＣＴ．ＨＡ）；
CTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCTCAGATCTGGCGCGCCCAATTGGCTTCGAATTCTAGCGGCCGCCCCCGGGTGCGCGGCGTCGGTGGTGCCGGCGGGGGGCGCCAGGTCGCAGGCGGTGTAGGGCTCCAGGCAGGCGGCGAAGGCCATGACGTGCGCTATGAAGGTCTGCTCCTGCACGCCGTGAACCAGGTGCGCCTGCGGGCCGCGCGCGAACACCGCCACGTCCTCGCCTGCGTGGGTCTCTTCGTCCAGGGGCACTGCTGACTGCTGCCGATACTCGGGGCTCCCGCTCTCGCTCTCGGTAACATCCGGCCGGGCGCCGTCCTTGAGCACATAGCCTGGACCGTTTCCTTAAGCGACGCATGCTCGCGATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAGGACCTGGAGCGAGGGCGGAGGGAGATGGTGGAGGAGGACCTGGATGCAGCCCTGCCCCTGCCTGACGAGGATGAGGAGGACCTCTCTGAGTATAAATTTGCCAAGTTCGCGGCCACCTACTTCCAGGGGACAACCACGCACTCCTACACCCGGCGGCCACTCAAACAGCCACTGCTCTACCATGACGACGAGGGTGACCAGCTGGCAGCCCTGGCGGTCTGGATCACCATCCTCCGCTTCATGGGGGACCTCCCTGAGCCCAAGTACCACACAGCCATGAGTGATGGCAGTGAGAAGATCCCTGTGATGACCAAGATTTATGAGACCCTGGGCAAGAAGACGTACAAGAGGGAGCTGCAGGCCCTGCAGGGCGAGGGCGAGGCCCAGCTCCCCGAGGGCCAGAAGAAGAGCAGTGTGAGGCACAAGCTGGTGCATTTGACTCTGAAAAAGAAGTCCAAGCTCACAGAGGAGGTGACCAAGAGGCTGCATGACGGGGAGTCCACAGTGCAGGGCAACAGCATGCTGGAGGACCGGCCCACCTCCAACCTGGAGAAGCTGCACTTCATCATCGGCAATGGCATCCTGCGGCCAGCACTCCGGGACGAGATCTACTGCCAGATCAGCAAGCAGCTGACCCACAACCCCTCCAAGAGCAGCTATGCCCGGGGCTGGATTCTCGTGTCTCTCTGCGTGGGCTGTTTCGCCCCCTCCGAGAAGTTTGTCAAGTACCTGCGGAACTTCATCCACGGGGGCCCGCCCGGCTACGCCCCGTACTGTGAGGAGCGCCTGAGAAGGACCTTTGTCAATGGGACACGGACACAGCCGCCCAGCTGGCTGGAGCTGCAGGCCACCAAGTCCAAGAAGCCAATCATGTTGCCCGTGACATTCATGGATGGGACCACCAAGACCCTGCTGACGGACTCGGCAACCACGGCCAAGGAGCTCTGCAACGCGCTGGCCGACAAGATCTCTCTCAAGGACCGGTTCGGGTTCTCCCTCTACATTGCCCTGTTTGACAAGGTGTCCTCCCTGGGCAGCGGCAGTGACCACGTCATGGACGCCATCTCCCAGTGCGAGCAGTACGCCAAGGAGCAGGGCGCCCAGGAGCGCAACGCCCCCTGGAGGCTCTTCTTCCGCAAAGAGGTCTTCACGCCCTGGCACAGCCCCTCCGAGGACAACGTGGCCACCAACCTCATCTACCAGCAGGTGGTGCGAGGAGTCAAGTTTGGGGAGTACAGGTGTGAGAAGGAGGACGACCTGGCTGAGCTGGCCTCCCAGCAGTACTTTGTAGACTATGGCTCTGAGATGATCCTGGAGCGCCTCCTGAACCTCGTGCCCACCTACATCCCCGACCGCGAGATCACGCCCCTGAAGACGCTGGAGAAGTGGGCCCAGCTGGCCATCGCCGCCCACAAGAAGGGGATTTATGCCCAGAGGAGAACTGATGCCCAGAAGGTCAAAGAGGATGTGGTCAGTTATGCCCGCTTCAAGTGGCCCTTGCTCTTCTCCAGGTTTTATGAAGCCTACAAATTCTCAGGCCCCAGTCTCCCCAAGAACGACGTCATCGTGGCCGTCAACTGGACGGGTGTGTACTTTGTGGATGAGCAGGAGCAGGTACTTCTGGAGCTGTCCTTCCCAGAGATCATGGCCGTGTCCAGCAGCAGGGGAGCGAAAACGACGGCCCCCAGCTTCACGCTGGCCACCATCAAGGGGGACGAATACACCTTCACCTCCAGCAATGCTGAGGACATTCGTGACCTGGTGGTCACCTTCCTAGAGGGGCTCCGGAAGAGATCTAAGTATGTTGTGGCCCTGCAGGATAACCCCAACCCCGCAGGCGAGGAGTCAGGCTTCCTCAGCTTTGCCAAGGGAGACCTCATCATCCTGGACCATGACACGGGCGAGCAGGTCATGAACTCGGGCTGGGCCAACGGCATCAATGAGAGGACCAAGCAGCGTGGGGACTTCCCCACCGACAGTGTGTACGTCATGCCCACTGTCACCATGCCACCGCGGGAGATTGTGGCCCTGGTCACCATGACTCCCGATCAGAGGCAGGACGTTGTCCGGCTCTTGCAGCTGCGAACGGCGGAGCCCGAGGTGCGTGCCAAGCCCTACACGCTGGAGGAGTTTTCCTATGACTACTTCAGGCCCCCACCCAAGCACACGCTGAGCCGTGTCATGGTGTCCAAGGCCCGAGGCAAGGACCGGCTGTGGAGCCACACGCGGGAACCGCTCAAGCAGGCGCTGCTCAAGAAGCTCCTGGGCAGTGAGGAGCTCTCGCAGGAGGCCTGCCTGGCCTTCATTGCTGTGCTCAAGTACATGGGCGACTACCCGTCCAAGAGGACACGCTCCGTCAACGAGCTCACCGACCAGATCTTTGAGGGTCCCCTGAAAGCCGAGCCCCTGAAGGACGAGGCATATGTGCAGATCCTGAAGCAGCTGACCGACAACCACATCAGGTACAGCGAGGAGCGGGGTTGGGAGCTGCTCTGGCTGTGCACGGGCCTTTTCCCACCCAGCAACATCCTCCTGCCCCACGTGCAGCGCTTCCTGCAGTCCCGAAAGCACTGCCCACTCGCCATCGACTGCCTGCAACGGCTCCAGAAAGCCCTGAGAAACGGGTCCCGGAAGTACCCTCCGCACCTGGTGGAGGTGGAGGCCATCCAGCACAAGACCACCCAGATTTTCCACAAAGTCTACTTCCCTGATGACACTGACGAGGCCTTCGAAGTGGAGTCCAGCACCAAGGCCAAGGACTTCTGCCAGAACATCGCCACCAGGCTGCTCCTCAAGTCCTCAGAGGGATTCAGCCTCTTTGTCAAAATTGCAGACAAGGTCATCAGCGTTCCTGAGAATGACTTCTTCTTTGACTTTGTTCGACACTTGACAGACTGGATAAAGAAAGCTCGGCCCATCAAGGACGGAATTGTGCCCTCACTCACCTACCAGGTGTTCTTCATGAAGAAGCTGTGGACCACCACGGTGCCAGGGAAGGATCCCATGGCCGATTCCATCTTCCACTATTACCAGGAGTTGCCCAAGTATCTCCGAGGCTACCACAAGTGCACGCGGGAGGAGGTGCTGCAGCTGGGGGCGCTGATCTACAGGGTCAAGTTCGAGGAGGACAAGTCCTACTTCCCCAGCATCCCCAAGCTGCTGCGGGAGCTGGTGCCCCAGGACCTTATCCGGCAGGTCTCACCTGATGACTGGAAGCGGTCCATCGTCGCCTACTTCAACAAGCACGCAGGGAAGTCCAAGGAGGAGGCCAAGCTGGCCTTCCTGAAGCTCATCTTCAAGTGGCCCACCTTTGGCTCAGCCTTCTTCGAGGTGAAGCAAACTACGGAGCCAAACTTCCCTGAGATCCTCCTAATTGCCATCAACAAGTATGGGGTCAGCCTCATCGATCCCAAAACGAAGGATATCCTCACCACTCATCCCTTCACCAAGATCTCCAACTGGAGCAGCGGCAACACCTACTTCCACATCACCATTGGGAACTTGGTGCGCGGGAGCAAACTGCTCTGCGAGACGTCACTGGGCTACAAGATGGATGACCTCCTGACTTCCTACATTAGCCAGATGCTCACAGCCATGAGCAAACAGCGGGGCTCCAGGAGCGGCAAGTACCCTTACGATGTACCGGATTACGCATGAGGTACCAAGGGCGAATTCTGCAGTCGACTAGAGCTCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGAGAGATCTGAGGACTAGTCCGTCGACTGTTAATTAAGCATGCTGGGGAGAGATCTAGGAAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAG
配列番号７１ミオシン７Ａ（例えば、ＡＡＶ－ＡＰヘッド－ＡＰＳＡ－ｈＭＹＯ７ＡＣＴ．ＨＡ）
GACCTGGAGCGAGGGCGGAGGGAGATGGTGGAGGAGGACCTGGATGCAGCCCTGCCCCTGCCTGACGAGGATGAGGAGGACCTCTCTGAGTATAAATTTGCCAAGTTCGCGGCCACCTACTTCCAGGGGACAACCACGCACTCCTACACCCGGCGGCCACTCAAACAGCCACTGCTCTACCATGACGACGAGGGTGACCAGCTGGCAGCCCTGGCGGTCTGGATCACCATCCTCCGCTTCATGGGGGACCTCCCTGAGCCCAAGTACCACACAGCCATGAGTGATGGCAGTGAGAAGATCCCTGTGATGACCAAGATTTATGAGACCCTGGGCAAGAAGACGTACAAGAGGGAGCTGCAGGCCCTGCAGGGCGAGGGCGAGGCCCAGCTCCCCGAGGGCCAGAAGAAGAGCAGTGTGAGGCACAAGCTGGTGCATTTGACTCTGAAAAAGAAGTCCAAGCTCACAGAGGAGGTGACCAAGAGGCTGCATGACGGGGAGTCCACAGTGCAGGGCAACAGCATGCTGGAGGACCGGCCCACCTCCAACCTGGAGAAGCTGCACTTCATCATCGGCAATGGCATCCTGCGGCCAGCACTCCGGGACGAGATCTACTGCCAGATCAGCAAGCAGCTGACCCACAACCCCTCCAAGAGCAGCTATGCCCGGGGCTGGATTCTCGTGTCTCTCTGCGTGGGCTGTTTCGCCCCCTCCGAGAAGTTTGTCAAGTACCTGCGGAACTTCATCCACGGGGGCCCGCCCGGCTACGCCCCGTACTGTGAGGAGCGCCTGAGAAGGACCTTTGTCAATGGGACACGGACACAGCCGCCCAGCTGGCTGGAGCTGCAGGCCACCAAGTCCAAGAAGCCAATCATGTTGCCCGTGACATTCATGGATGGGACCACCAAGACCCTGCTGACGGACTCGGCAACCACGGCCAAGGAGCTCTGCAACGCGCTGGCCGACAAGATCTCTCTCAAGGACCGGTTCGGGTTCTCCCTCTACATTGCCCTGTTTGACAAGGTGTCCTCCCTGGGCAGCGGCAGTGACCACGTCATGGACGCCATCTCCCAGTGCGAGCAGTACGCCAAGGAGCAGGGCGCCCAGGAGCGCAACGCCCCCTGGAGGCTCTTCTTCCGCAAAGAGGTCTTCACGCCCTGGCACAGCCCCTCCGAGGACAACGTGGCCACCAACCTCATCTACCAGCAGGTGGTGCGAGGAGTCAAGTTTGGGGAGTACAGGTGTGAGAAGGAGGACGACCTGGCTGAGCTGGCCTCCCAGCAGTACTTTGTAGACTATGGCTCTGAGATGATCCTGGAGCGCCTCCTGAACCTCGTGCCCACCTACATCCCCGACCGCGAGATCACGCCCCTGAAGACGCTGGAGAAGTGGGCCCAGCTGGCCATCGCCGCCCACAAGAAGGGGATTTATGCCCAGAGGAGAACTGATGCCCAGAAGGTCAAAGAGGATGTGGTCAGTTATGCCCGCTTCAAGTGGCCCTTGCTCTTCTCCAGGTTTTATGAAGCCTACAAATTCTCAGGCCCCAGTCTCCCCAAGAACGACGTCATCGTGGCCGTCAACTGGACGGGTGTGTACTTTGTGGATGAGCAGGAGCAGGTACTTCTGGAGCTGTCCTTCCCAGAGATCATGGCCGTGTCCAGCAGCAGGGGAGCGAAAACGACGGCCCCCAGCTTCACGCTGGCCACCATCAAGGGGGACGAATACACCTTCACCTCCAGCAATGCTGAGGACATTCGTGACCTGGTGGTCACCTTCCTAGAGGGGCTCCGGAAGAGATCTAAGTATGTTGTGGCCCTGCAGGATAACCCCAACCCCGCAGGCGAGGAGTCAGGCTTCCTCAGCTTTGCCAAGGGAGACCTCATCATCCTGGACCATGACACGGGCGAGCAGGTCATGAACTCGGGCTGGGCCAACGGCATCAATGAGAGGACCAAGCAGCGTGGGGACTTCCCCACCGACAGTGTGTACGTCATGCCCACTGTCACCATGCCACCGCGGGAGATTGTGGCCCTGGTCACCATGACTCCCGATCAGAGGCAGGACGTTGTCCGGCTCTTGCAGCTGCGAACGGCGGAGCCCGAGGTGCGTGCCAAGCCCTACACGCTGGAGGAGTTTTCCTATGACTACTTCAGGCCCCCACCCAAGCACACGCTGAGCCGTGTCATGGTGTCCAAGGCCCGAGGCAAGGACCGGCTGTGGAGCCACACGCGGGAACCGCTCAAGCAGGCGCTGCTCAAGAAGCTCCTGGGCAGTGAGGAGCTCTCGCAGGAGGCCTGCCTGGCCTTCATTGCTGTGCTCAAGTACATGGGCGACTACCCGTCCAAGAGGACACGCTCCGTCAACGAGCTCACCGACCAGATCTTTGAGGGTCCCCTGAAAGCCGAGCCCCTGAAGGACGAGGCATATGTGCAGATCCTGAAGCAGCTGACCGACAACCACATCAGGTACAGCGAGGAGCGGGGTTGGGAGCTGCTCTGGCTGTGCACGGGCCTTTTCCCACCCAGCAACATCCTCCTGCCCCACGTGCAGCGCTTCCTGCAGTCCCGAAAGCACTGCCCACTCGCCATCGACTGCCTGCAACGGCTCCAGAAAGCCCTGAGAAACGGGTCCCGGAAGTACCCTCCGCACCTGGTGGAGGTGGAGGCCATCCAGCACAAGACCACCCAGATTTTCCACAAAGTCTACTTCCCTGATGACACTGACGAGGCCTTCGAAGTGGAGTCCAGCACCAAGGCCAAGGACTTCTGCCAGAACATCGCCACCAGGCTGCTCCTCAAGTCCTCAGAGGGATTCAGCCTCTTTGTCAAAATTGCAGACAAGGTCATCAGCGTTCCTGAGAATGACTTCTTCTTTGACTTTGTTCGACACTTGACAGACTGGATAAAGAAAGCTCGGCCCATCAAGGACGGAATTGTGCCCTCACTCACCTACCAGGTGTTCTTCATGAAGAAGCTGTGGACCACCACGGTGCCAGGGAAGGATCCCATGGCCGATTCCATCTTCCACTATTACCAGGAGTTGCCCAAGTATCTCCGAGGCTACCACAAGTGCACGCGGGAGGAGGTGCTGCAGCTGGGGGCGCTGATCTACAGGGTCAAGTTCGAGGAGGACAAGTCCTACTTCCCCAGCATCCCCAAGCTGCTGCGGGAGCTGGTGCCCCAGGACCTTATCCGGCAGGTCTCACCTGATGACTGGAAGCGGTCCATCGTCGCCTACTTCAACAAGCACGCAGGGAAGTCCAAGGAGGAGGCCAAGCTGGCCTTCCTGAAGCTCATCTTCAAGTGGCCCACCTTTGGCTCAGCCTTCTTCGAGGTGAAGCAAACTACGGAGCCAAACTTCCCTGAGATCCTCCTAATTGCCATCAACAAGTATGGGGTCAGCCTCATCGATCCCAAAACGAAGGATATCCTCACCACTCATCCCTTCACCAAGATCTCCAACTGGAGCAGCGGCAACACCTACTTCCACATCACCATTGGGAACTTGGTGCGCGGGAGCAAACTGCTCTGCGAGACGTCACTGGGCTACAAGATGGATGACCTCCTGACTTCCTACATTAGCCAGATGCTCACAGCCATGAGCAAACAGCGGGGCTCCAGGAGCGGCAAG
配列番号７２（血球凝集素（ＨＡ）タグ（ＡＡＶ－ＡＰヘッド－ＡＰＳＡ－ｈＭＹＯ７ＡＣＴ．ＨＡ、ＡＡＶ－ｈＭＹＯ７Ａ－ＣＴｌｏｎｇ．ＨＡ）
TACCCTTACGATGTACCGGATTACGCATGA
［実施例６］
実施例６は、末端切断型ＭＹＯ７Ａタンパク質の発現を最小にする第２世代ハイブリッドベクターを示す。
実施例１～５に記載されるようなハイブリッドおよびシンプルオーバーラップフロントハーフベクターは、ＭＹＯ７Ａタンパク質テールドメインの一部分をコードするＭＹＯ７Ａ ｃＤＮＡ配列を含有していた。ＭＹＯ７Ａのテールドメインは、その能力について、他の細胞性タンパク質を結合すると知られている。本出願の実施例１～５では、元のハイブリッドフロントハーフベクターはＭＹＯ７Ａタンパク質をコード可能であったことが示されている（図２８～３０）（Dyka,et al. 2014）。しかし、マウス網膜への元のハイブリッドフロントハーフベクターの注射後、網膜構造／機能の一部の消失が観察された。網膜構造／機能のこの消失は、部分的なテールドメインを含有する末端切断型ＭＹＯ７Ａタンパク質によって発揮される機能の獲得の結果であると仮定された。末端切断型ＭＹＯ７Ａタンパク質は、フロントハーフベクターのみから生成されると示された（図３１～３２）。対照として、バックハーフベクターによってコードされる任意の末端切断型タンパク質の発現レベルも測定した。これらの結果は、バックハーフベクターが末端切断型生成物を生成せず、網膜構造／機能の消失につながらないことを実証する（図３３）。
末端切断型ＭＹＯ７Ａタンパク質断片と関連するこの機能毒性の獲得を排除するために、フロントハーフベクターからの末端切断型タンパク質の形成を排除する目的で、改善された第２世代ハイブリッドおよびシンプルオーバーラップベクターを開発した。以前に開発したシンプルオーバーラップベクターは、マウスにおけるその注射後に、観察可能な量の末端切断型ＭＹＯ７Ａタンパク質を生成せず、構造／機能の観察可能な消失を示さなかったが、それにもかかわらず、第２世代ハイブリッドベクターとともに第２世代のシンプルオーバーラップベクターを開発した。これは、元のシンプルオーバーラップフロントハーフベクターが、マウスにおける免疫ブロットおよび忍容性研究によって検出できないレベルで末端切断型ＭＹＯ７Ａを発現し得る可能性を回避するための予防措置として行った。
ハイブリッドおよびシンプルオーバーラッププラットフォームの両方において、フロントハーフベクターからのテールドメインに対応する配列をバックハーフベクターに動かした。ＭＹＯ７Ａタンパク質は、アクチンベースの分子モーターであり、Ｎ末端（ヘッド）は、アクチン結合部位およびＡＴＰ結合部位を含有する。５ＩＱ（ネック）は、カルモジュリンによって安定化され、レバーとして作用するシングルａ－ヘリックス（ＳＡＨ）がある。ＭＹＯ７Ａタンパク質のＣ末端（テール）ドメインは、機能特異性を決定する。注目すべきことに、ハイブリッドベクターでは、「分割点」を元におけるエクソン２３／２４から第２世代におけるエクソン２１／２２に動かし（図３４および５０Ａ）、その結果、第２世代ベクターシステムは、シングルアルファヘリックス（ＳＡＨ）の一方の側からもう一方に動かされた分割点を有する。エクソン２１と２２の間のこの新規分割は、５ＩＱ（ネック）とＳＡＨの間に位置している。
シンプルオーバーラップベクターでは、オーバーラップ配列の量が低減され、その結果、フロントベクター中に残るテールドメインに対応する配列はなかった（この新規ベクターコンストラクトは、本明細書において以下、「第２世代オーバーラップ」と呼ばれる。したがって、第２世代オーバーラップベクターは、オーバーラップする配列のより短いセグメントを含有し、その結果、オーバーラップは、エクソン２１と２２の間の分割点で終了した。本明細書において記載される第２世代ハイブリッドおよび第２世代オーバーラップベクターは、ハイブリッドフロント－またはシンプルオーバーラップフロント－ハーフベクターのいずれかによって、テールドメインの部分がコードされないことを確実にする。ベクターシステムをこのように変更して、末端切断型ＭＹＯ７Ａタンパク質の生成を低減した。
エクソン２１／２２分割点を含有する第２世代ハイブリッドベクターが、インビトロでＨＥＫ２９３細胞に投与された場合、ベクター配列中の変更に対応するより小さいサイズの末端切断型ＭＹＯ７Ａタンパク質が観察された（図３５および３９）。エクソン２１／２２分割点を含有する第２世代ハイブリッドベクターが、インビボでＭｙｏ７ａ－／－マウスに網膜下注射によって投与された場合、より小さいサイズのＭＹＯ７Ａタンパク質がまた観察された（図３６および３８）。エクソン２１／２２分割点を含有する第２世代ハイブリッドベクターは、エクソン２３／２４分割点を含有する元のハイブリッドベクターと比較して、同等量の全長ＭＹＯ７Ａを発現する（例えば、図３５および３６を参照されたい）が、元のハイブリッドベクターにおいて観察されたＭＹＯ７Ａテールタンパク質断片を生成しない（図３８）。総じて、フロントハーフベクター中にテールドメイン配列を発現しない第２世代ハイブリッドおよびシンプルオーバーラップベクターは、網膜においてより良好に許容されるＭＹＯ７Ａタンパク質生成物をもたらすことが本明細書において実証される。
フロントハーフＡＡＶ－ＭＹＯ７Ａベクター（ハイブリッドおよびシンプルオーバーラップの両方）は、プロモーターおよび逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）を含有する。ＩＴＲが、プロモーターと一緒に、翻訳のためのメッセンジャーＲＮＡの生成および成熟をもたらすポリアデニル化シグナル提供することが可能である。ハイブリッドベクターとの関連で、ことも可能である。アルカリホスファターゼ（ＡＰ）スプライスドナーおよびＡＰヘッド「イントロン」配列はまた、スプライシングシグナルを提供することによってｍＲＮＡの成熟を促進していることもあり得る。ｍＲＮＡ成熟を促進する正確な機序は明らかではないが、ハイブリッドフロントハーフベクターが末端切断型タンパク質を生成することは観察可能である（図３１～３３）。
第２世代ハイブリッドベクターが、望まれない生成物の生成の減少をもたらすことは本明細書において実証されるが、末端切断型ＭＹＯ７Ａの生成を低減し、それによって、安全性および効率をさらに増大するためにベクターにさらなる改善を行った。上記のように第２世代エクソン２１／２２分割点を含有するハイブリッドベクターでは、フロントハイブリッドベクタープラスミドから、ＭＹＯ７Ａ配列の下流に位置する潜在的なインフレーム停止コドンを除去した（図４２）。これらの潜在的な停止コドンを除去するシングルヌクレオチド置換は、細胞の「ノンストップ」崩壊機序を利用し、それによって、偽ＲＮＡをそれが翻訳され得る前に排除するように設計されている。２つの段階でインフレーム停止コドンを除去した。第１に、ＡＰスプライスドナー配列内の３つの潜在的な停止コドンを第２世代ハイブリッドベクターから除去して、エクソン２１／２２分割点を依然として含有するさらなる改善ベクターを作出した（「ＣＭｖ１ハイブリッド」；配列番号３３および３２；図４２）。
さらなる潜在的なインフレーム停止コドンは、共有される組換え産物のＡＰ領域内に位置していた。したがって、エクソン２１／２２分割点を含有するフロントハーフおよびバックハーフ第２世代ハイブリッドベクター（「ＣＭｖ２ハイブリッド」；配列番号３４および３５）の両方において機能的改善が行われた別々のさらなる改善ベクターを生成した。ＣＭｖ２ハイブリッドフロントハーフベクターは、ＡＰスプライスドナー配列中に位置する３つの潜在的な停止コドンならびにＡＰヘッド組換え産物配列中に位置する１つの潜在的な停止コドンを有する。ＣＭｖ２ハイブリッドバックハーフベクターは、フロントハーフベクターに対応するようにＡＰヘッド組換え産物配列において行われた同一の変更を有する。
本明細書において記載されるようなＣＭｖ２ハイブリッドバックハーフベクターをもたらす改変を行うと、ＣＭｖ２ハイブリッドバックハーフベクターは、ＡＡＶベクターコンストラクトのパッケージング限界を超えそうになるが、実際には超えない。バックハーフベクターが大きすぎる可能性を軽減するために、ＣＭｖ２ハイブリッドバックハーフベクターを、コンストラクト中の要素の間に存在する任意の無関係の配列ならびにＨＡ配列を除去するように改変するコンストラクトを設計した。ひとたび改変されると、得られたバックハーフベクターは、ＣＭｖ２．１ハイブリッドバックハーフベクターと名付けられる（配列番号４４）。
ＣＭｖ１およびＣＭｖ２ハイブリッドベクターを、これらのプラスミドをＨＥＫ２９３細胞中にトランスフェクトすることによってインビトロで試験した。比較のために、第１世代ハイブリッドフロントハーフベクター（「元の」）および第２世代ハイブリッドフロントハーフベクター（「ｅｘ２１／２２」）も使用した（図４０）。ＣＭｖ１ハイブリッドフロントハーフベクターが末端切断型ＭＹＯ７Ａを依然として生成するということが見出された。しかし、ＣＭｖ２ハイブリッドフロントハーフベクターは、末端切断型タンパク質を全く生成しなかった。すべてのサンプルにおいて、ビンキュリン（ＶＣＬ）をローディングコントロールとして使用した。
このベクターによってコードされる末端切断型タンパク質が存在しないにもかかわらず、対応する変更をシンプルオーバーラップベクターにおいて行った（図４３）。ＣＭｖ１およびＣＭｖ２ハイブリッドベクターにおいて除去された推定停止コドンは、シンプルオーバーラップベクターのフロントハーフ中には存在しないので、シンプルオーバーラップベクターにわずかに異なる改変を行った。ＣＭｖ１オーバーラップベクターでは、シンプルオーバーラップベクターは、潜在的なインフレーム停止コドンを除去するように、ＭＹＯ７Ａ部分コード配列と、３’ＡＡＶ ＩＴＲの間の３’非翻訳領域において改変された（「ＣＭｖ１オーバーラップ」；配列番号３６および３８；図４３）。
図４１に示されるように、マカクザル網膜においてＡＡＶ媒介性ＭＹＯ７Ａ転写物が発現され、マカクザル網膜に網膜下注射されたデュアルＡＡＶ５－ＭＹＯ７Ａベクターの忍容性が示されている。マカクザル網膜は、注射の２ヶ月後に評価した。
これらのデータは、ヒト患者への技術の適用についてかなりの有望性を示す。
［実施例７］
実施例７は、第３世代ハイブリッドベクターを提供する。
第３世代オーバーラップベクター
ＭＹＯ７Ａコード配列のオーバーラップする領域を変更することによって、改善された第３世代（Ｖ３）オーバーラップベクター対を作成した。このＶ３オーバーラップ対は、配列番号５０のヌクレオチド配列を含むフロントハーフベクター（「ＡＡＶ－ｓｍＣＢＡ－ｈＭＹＯ７Ａ－ＮＴｌｏｎｇ－ｖ３」）および配列番号５１のヌクレオチド配列を含むバックハーフベクター（「ＡＡＶ－ｓｍＣＢＡ－ｈＭＹＯ７Ａ－ＣＴｌｏｎｇ－ｖ３．ＨＡ」）からなる。このＶ３オーバーラップ対は、配列番号６６を含むＮ末端ミオシン７Ａコード配列および配列番号８０を含むＣ末端ミオシン７Ａコード配列を含有する。これらのベクターは、短縮されたオーバーラップする領域長（図４６および４７を参照されたい）、例えば、９４５ｂｐおよび６８７ｂｐのオーバーラップする領域長を含有する。オーバーラップする領域の長さの低減は、ベクターゲノム全体のサイズを低減する効果を有する。
Ｖ３オーバーラップデュアルベクターシステムは、図４８Ａおよび４９Ａに示されるようにＰｒｏｔｅｉｎ Ｓｉｍｐｌｅ Ｊｅｓｓシステムによって定量化されるように、元のベクターと比較した場合に全長ＭＹＯ７Ａタンパク質のレベルの増大をもたらすと示された。６８７ｂｐおよび９４５ｂｐのオーバーラップするＭＹＯ７Ａ配列を含有するオーバーラップベクターは、最適発現レベルを提供した。
図４９Ｂに示されるように、Ｖ３オーバーラップベクターは、そのオーバーラップする領域長が３６１ｂｐより大きいままである場合も、認識できる量の望ましくない末端切断型ＭＹＯ７Ａ断片を生成しない。したがって、オーバーラップ長をある特定の点に低減すること、ひいては、ベクターゲノムのいずれもＡＡＶカプシドのパッケージング容量（４．７～４．９ｋｂ）を押し広げないことを確実にし、全長ＭＹＯ７Ａの発現の増大につながる。オーバーラップ長が小さすぎる（≦３６１ｂｐ）場合、全長ＭＹＯ７Ａ発現が低減され、末端切断型タンパク質が現れる場合がある。
そのオーバーラップする領域のより短い長さのために、これらの改善された第３世代オーバーラップベクターは、より短いＩＴＲからＩＴＲ（ＩＴＲ－ＩＴＲ）の長さを含有する（図４８Ｂを参照されたい）。特定の実施形態では、第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチドの各末端での逆方向末端反復配列の間の長さは、約４６１５ヌクレオチド（ｎｔ）以下である。改善された第１のベクターポリヌクレオチド中のＩＴＲ－ＩＴＲの長さは、４６１５ｎｔである。特定の実施形態では、第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドの各末端での逆方向末端反復配列の間の長さは、約４８００ｎｔ以下である。改善された第２のベクターポリヌクレオチド中のＩＴＲ－ＩＴＲの長さは、約４５６０ｎｔである。
ｈＭＹＯ７Ａオーバーラップ領域、例えば、配列番号３９および５３～５９は、大きな遺伝子（ＭＹＯ７Ａ以外）を発現するさらなるオーバーラップデュアルベクター中のオーバーラップするポリヌクレオチド配列として使用され得る。特に、ＭＹＯ７Ａ以外の大きな遺伝子を発現し、配列番号３９および５２～５９のいずれか１つに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むオーバーラップデュアルベクターが、本明細書において開示される。特定の実施形態では、これらのオーバーラップデュアルベクターは、配列番号３９および５３～５９、例えば、配列番号５６または５７のいずれか１つのヌクレオチド配列を含み、ＡＢＣＡ４、ＣＥＰ２９０、ＥＹＳ、ＲＰ１、ＡＬＭＳ１、ＣＤＨ２３、ＰＣＤＨ１５、ＵＳＨ１Ｃ、ＵＳＨ１Ｇ、ＵＳＨ２Ａ、ＤＮＦＢ３１、ＤＭＤ、ＣＦＴＲ、ＧＤＥ、ＤＹＳＦ、Ｆ８およびＤＦＮＢ２から選択される大きな遺伝子を発現する。一部の実施形態では、これらのオーバーラップベクターは、本明細書において開示される２つのオーバーラップする配列、例えば、相互排他的配列である配列番号３９および５６または相互排他的配列である配列番号３９および５７を含有する。
６８７ｂｐおよび９４５ｂｐのオーバーラップする領域長を含有するＶ３オーバーラップベクター対を含有するｒＡＡＶウイルス粒子が、パッケージングされ、網膜細胞に投与される。６８７ｂｐおよび９４５ｂｐのオーバーラップする領域長を含有するＶ３オーバーラップベクター対を含有するｒＡＡＶウイルス粒子が、パッケージングされ、聴覚有毛細胞に投与される。
ミオシン７Ａをコードするヌクレオチド配列の以下の対を含有するオーバーラップベクターが、インビトロまたはインビボで全長ＭＹＯ７Ａポリペプチドを生成するその能力で評価される。インビトロ評価は、Ｐｒｏｅｔｅｉｎ Ｓｉｍｐｌｅ Ｊｅｓｓウエスタンブロッティングを使用して実施できる。
・第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチドは、配列番号６３のヌクレオチド配列を含み、第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドは、配列番号８３のヌクレオチド配列を含む、
・第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチドは、配列番号６３のヌクレオチド配列を含み、第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドは、配列番号９０のヌクレオチド配列を含む、
・第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチドは、配列番号１０１のヌクレオチド配列を含み、第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドは、配列番号８３のヌクレオチド配列を含む、
・第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチドは、配列番号１０１のヌクレオチド配列を含み、第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドは、配列番号９０のヌクレオチド配列を含む、
・第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチドは、配列番号６６のヌクレオチド配列を含み、第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドは、配列番号８３のヌクレオチド配列を含む、ならびに
・第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチドは、配列番号６６のヌクレオチド配列を含み、第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドは、配列番号９０のヌクレオチド配列を含む。
したがって、一部の実施形態では、第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチドが、配列番号６３に対して少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列を含み、第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドが、配列番号８３に対して少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドベクターシステムが、本明細書において提供される。一部の実施形態では、第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドは、配列番号９０に対して少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列を含む。
一部の実施形態では、第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチドは、配列番号１０１に対して少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチドは、配列番号６６に対して少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチドが、配列番号６６に対して少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列を含み、第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドが、配列番号９０のヌクレオチド配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドベクターシステムが、本明細書において提供される。
以下のオーバーラップベクターが、インビトロまたはインビボで全長ＭＹＯ７Ａポリペプチドを生成するその能力で評価される。インビトロ評価は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｉｍｐｌｅ Ｊｅｓｓウエスタンブロッティングを使用して実施できる。
・第１のＡＡＶベクターは、配列番号５０のヌクレオチド配列を含み、第２のＡＡＶベクターは、配列番号５１のヌクレオチド配列を含む、
・第１のＡＡＶベクターは、配列番号５０のヌクレオチド配列を含み、第２のＡＡＶベクターは、配列番号３８のヌクレオチド配列を含む、
・第１のＡＡＶベクターは、配列番号１のヌクレオチド配列を含み、第２のＡＡＶベクターは、配列番号３８のヌクレオチド配列を含む、
・第１のＡＡＶベクターは、配列番号５０のヌクレオチド配列を含み、第２のＡＡＶベクターは、配列番号２のヌクレオチド配列を含む、
・第１のＡＡＶベクターは、配列番号１のヌクレオチド配列を含み、第２のＡＡＶベクターは、配列番号５１のヌクレオチド配列を含む、
・第１のＡＡＶベクターは、配列番号３６のヌクレオチド配列を含み、第２のＡＡＶベクターは、配列番号２のヌクレオチド配列を含む、
・第１のＡＡＶベクターは、配列番号３６のヌクレオチド配列を含み、第２のＡＡＶベクターは、配列番号３８のヌクレオチド配列を含む、
・第１のＡＡＶベクターは、配列番号３６のヌクレオチド配列を含み、第２のＡＡＶベクターは、配列番号５１のヌクレオチド配列を含む、
・第１のＡＡＶベクターは、配列番号３７のヌクレオチド配列を含み、第２のＡＡＶベクターは、配列番号３８のヌクレオチド配列を含む、
・第１のＡＡＶベクターは、配列番号３７のヌクレオチド配列を含み、第２のＡＡＶベクターは、配列番号５１のヌクレオチド配列を含む。
したがって、一部の実施形態では、第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチドが、配列番号５０に対して少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列を含み、第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドが、配列番号５１のヌクレオチド配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチドベクターシステムが、本明細書において提供される。一部の実施形態では、第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドは、配列番号３８に対して少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドは、配列番号２に対して少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列を含む。
一部の実施形態では、第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチドは、配列番号１に対して少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチドは、配列番号３６に対して少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチドは、配列番号３７に対して少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチドが、配列番号３７に対して少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列を含み、第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドが、配列番号３８または配列番号５１のヌクレオチド配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドベクターシステムが、本明細書において提供される。
第３世代ハイブリッドベクター
ＣＭｖ２ハイブリッドシステムのフロントハーフベクターの３’非翻訳領域（ＵＴＲ）中の３つの推定停止コドン中に置換を行うことによって、改善された第３世代（ＣＭｖ３）ハイブリッドシステムまたはベクター対を生成した。そのようなものとして、ＣＭｖ３ハイブリッドフロントハーフベクターは、ＡＰヘッド配列中の１つのインフレーム停止コドン、ＡＰイントロン配列中の３つのインフレーム停止コドンおよび３’ＵＴＲ配列中の３つのインフレーム停止コドンに置換（すなわち、それらの除去）を含有する。例示的実施形態では、ＣＭｖ３ハイブリッドシステムは、残存するシードされていないレガシー配列（例えば、制限酵素部位）が除去されているようなＣＭｖ３ ＭＩＮシステムである。
例示的ＣＭｖ３ハイブリッドシステムは、ｉ）配列番号４６のヌクレオチド配列を含むフロントハーフベクター（「ＡＡＶ－ｓｍＣＢＡ－ｈＭＹＯ７Ａ－ＮＴｅｘ２１－ＡＰＳＤ－ＡＰヘッド－ＣＭｖ３」）およびｉｉ）配列番号３５のヌクレオチド配列を含むＣＭｖ２バックハーフベクター（「ＡＡＶ－ＡＰ－ヘッド－ＡＰＳＡ－ｅｘ２２ｈＭＹＯ７Ａ－ＣＴ．ＨＡ－ＣＭｖ２）」）、配列番号４４のヌクレオチド配列を含むＣＭｖ２．１バックハーフベクター（「ＡＡＶ－ＡＰヘッド－ＡＰＳＡ－ｈＭＹＯ７ＡＣＴｅｘ２２－ＣＭｖ２．１」）またはいずれかのベクターの最小化版、例えば、配列番号４９のヌクレオチド配列を含むＣＭｖ２（またはＶ２－）バックＭＩＮからなる。
ハイブリッド－ＣＭｖ３バックＭＩＮおよびハイブリッド－ＣＭｖ２バックＭＩＮベクターを生成するために、ベクターサイズがＡＡＶカプシドのパッケージング容量を超えないことを確実にするために、バックハーフベクターから「不必要なレガシー」配列を除去した。バックからのシードされていないレガシー配列の除去のために、これらの改善された第３世代ハイブリッドベクターは、より短いＩＴＲからＩＴＲ（ＩＴＲ－ＩＴＲ）の長さを含有する（図５０Ｃおよび５１Ｂを参照されたい）。特定の実施形態では、ハイブリッドベクターの第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチドの各末端での逆方向末端反復配列の間の長さは、約４２７９ヌクレオチド（ｎｔ）以下である。これは、バックハーフベクターの長さを最小にする効果を有し、これによってパッケージング効率が改善された。ハイブリッド－Ｖ２バックＭＩＮは、関連する元のベクターよりも１２２ｂｐ小さく（４９８１対４８５９ｂｐ）、ハイブリッド＿ＣＭｖ２バックＭＩＮは、関連する元のベクターよりも１２１ｂｐ小さい（４９８２対４８６１ｂｐ）。ハイブリッド－Ｖ２バックＭＩＮ ＨＡおよびハイブリッド－ＣＭＶ２バックＭＩＮ ＨＡベクターについて、最小化されたバックハーフベクター（ハイブリッド－Ｖ２バックＭＩＮおよびハイブリッド－ＣＭＶ２バックＭＩＮ）に血球凝集素（ＨＡ）タグを付加して、正常サルにおける検出を可能にした。
ＣＭｖ３ハイブリッドベクターシステムは、図５０Ｄに示されるように、ハイブリッドＣＭｖ１およびハイブリッドＣＭｖ２ベクターと比較して、比較的低レベルの末端切断型ＭＹＯ７Ａ断片を生成すると示された。さらに、図５１Ｃおよび５１Ｄに示されるように、対形成 ｔｈｅ ハイブリッド ＣＭｖ３フロントハーフベクターを、ＣＭｖ３ ＭＩＮバックハーフベクターと対形成することによって、元の（第１世代）ハイブリッドベクターを用いた場合に見られたものと等しいまたはそれを上回るレベルの全長ＭＹＯ７Ａが生成された。このベクターの対によって、図５１Ｅに示されるように、比較的低いレベルの末端切断型断片が生成された。
本発明者らはまた、ｈＭＹ０７Ａ配列は、大きな遺伝子（ＭＹＯ７Ａ以外）を発現するハイブリッドデュアルベクター中での投与後に細胞において組換えを媒介するイントロン配列として使用され得るということを発見した。このようなハイブリッドベクターは、本明細書において提供されるＭＹＯ７Ａオーバーラップベクターの改善によって同定される１つまたは複数のオーバーラップする領域を含有するように生成される（このようなベクターは、これらのオーバーラップする領域のうち１つの挿入を可能にする、ＡＰヘッド配列および／またはＡＰイントロン配列を含有しない場合があるまたは含有しない）。特に、配列番号３９および５２～５９のいずれか１つに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、それぞれ、第１および第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドの第１のイントロンと第２のイントロンの間の配列を含有するハイブリッドデュアルベクターが、本明細書において開示される。特定の実施形態では、ハイブリッドデュアルベクターは、配列番号３９および５３～５９、例えば、配列番号５６または５７のいずれか１つのヌクレオチド配列をを含む、それぞれ、第１および第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドの第１のイントロンと第２のイントロンの間の配列を含有する。さらなる大きな遺伝子は、ＡＢＣＡ４、ＣＥＰ２９０、ＥＹＳ、ＲＰＩ、ＡＬＭＳ１、ＣＤＨ２３、ＰＣＤＨ１５、ＵＳＨ１Ｃ、ＵＳＨ１Ｇ、ＵＳＨ２Ａ、ＤＮＦＢ３１、ＤＭＤ、ＣＦＴＲ、ＧＤＥ、ＤＹＳＦ、Ｆ８およびＤＦＮＢ２を含むこれらのハイブリッドベクターを用いて送達できる。一部の実施形態では、これらのハイブリッドデュアルベクターは、本明細書において開示される２つのオーバーラップする配列、例えば、相互排他的配列である配列番号３９および５６または相互排他的配列である配列番号３９および５７を含有する。
配列番号４６フロントハーフベクターおよび配列番号３５バックハーフベクターを含むＣＭｖ３ハイブリッドベクター対を含有するｒＡＡＶウイルス粒子が、パッケージングされ、網膜細胞に投与される。配列番号４６フロントハーフベクターおよび配列番号３５バックハーフベクターを含むＣＭｖ３ ハイブリッドベクター対を含有するｒＡＡＶウイルス粒子が、パッケージングされ、聴覚有毛細胞に投与される。
ミオシン７Ａをコードするヌクレオチド配列の以下の対を含有するハイブリッドベクターが、インビトロまたはインビボで全長ＭＹＯ７Ａポリペプチドを生成するその能力で評価される：
・第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチドは、配列番号７３のヌクレオチド配列を含み、第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドは、配列番号７５のヌクレオチド配列を含む。
したがって、一部の実施形態では、第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチドが、配列番号７３に対して少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列を含み、第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドが、配列番号７５のヌクレオチド配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドベクターシステムが、本明細書において提供される。
ベクター配列の以下の対を含むハイブリッドベクターシステムが、インビトロまたはインビボで全長ＭＹＯ７Ａポリペプチドを生成するその能力で評価される。
・第１のＡＡＶベクターは、配列番号３１のヌクレオチド配列を含み、第２のＡＡＶベクターは、配列番号３２のヌクレオチド配列を含む、
・第１のＡＡＶベクターは、配列番号４６のヌクレオチド配列を含み、第２のＡＡＶベクターは、配列番号３５のヌクレオチド配列を含む、
・第１のＡＡＶベクターは、配列番号４６のヌクレオチド配列を含み、第２のＡＡＶベクターは、配列番号４９のヌクレオチド配列を含む、
・第１のＡＡＶベクターは、配列番号３４のヌクレオチド配列を含み、第２のＡＡＶベクターは、配列番号４７のヌクレオチド配列を含む、
・第１のＡＡＶベクターは、配列番号３１のヌクレオチド配列を含み、第２のＡＡＶベクターは、配列番号４８のヌクレオチド配列を含む、
・第１のＡＡＶベクターは、配列番号３１のヌクレオチド配列を含み、第２のＡＡＶベクターは、配列番号４９のヌクレオチド配列を含む、
・第１のＡＡＶベクターは、配列番号３３のヌクレオチド配列を含み、第２のＡＡＶベクターは、配列番号３２のヌクレオチド配列を含む、
・第１のＡＡＶベクターは、配列番号３４のヌクレオチド配列を含み、第２のＡＡＶベクターは、配列番号３５のヌクレオチド配列を含む、
・第１のＡＡＶベクターは、配列番号３４のヌクレオチド配列を含み、第２のＡＡＶベクターは、配列番号４４のヌクレオチド配列を含む。
したがって、一部の実施形態では、第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチドが、配列番号３１に対して少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列を含み、第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドが、配列番号３２のヌクレオチド配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドベクターシステムが、本明細書において提供される。一部の実施形態では、第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドは、配列番号４８または配列番号４９に対して少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチドは、配列番号３３に対して少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列を含む。
一部の実施形態では、第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチドが、配列番号４６に対して少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列を含み、第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドが、配列番号３５のヌクレオチド配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドベクターシステムが、本明細書において提供される。一部の実施形態では、第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドは、配列番号４９に対して少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチドは、配列番号３４に対して少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列を含む。
一部の実施形態では、第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチドが、配列番号３４に対して少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列を含み、第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドが、配列番号４７のヌクレオチド配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドベクターシステムが、本明細書において提供される。一部の実施形態では、第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドは、配列番号３５または４４に対して少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列を含む。
本開示のポリヌクレオチドベクターシステムは、以下の配列のいずれか（例えば、配列番号３１～３８、４４および４６～５１のいずれか）に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９２．５％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または９９．５％同一であるヌクレオチド配列を含む場合がある。一部の実施形態では、ベクターは、配列番号３１～３８、４４および４６～５１のいずれか１つを含む配列を含む。一部の実施形態では、本開示のベクターシステムは、配列番号３１～３８、４４および４６～５１の配列のうちいずれかと、１、２、３、４、５、５～１０、１０～１５、１５～２０、２０～２５、２５～３０、３０～３５、３５～４０、４０～４５、４５～５０または５０より多いヌクレオチドだけ異なるものを含有するヌクレオチド配列を含む。開示されるベクターは、タグ、例えば、ＨＡタグの存在下または不在下で以下のベクター配列のいずれかにおいて異なる場合がある。開示されるベクターは、配列番号３１～３８、４４および４６～５１のいずれかと共通して、５～１０、１０～１５、１５～２０、２０～２５、２５～３５、３５～４５、４５～６０、６０～７５または７５を超える連続ヌクレオチドのストレッチを含有する。
本明細書において提供されるポリヌクレオチドベクターのいずれかのミオシン７ａをコードする配列は、以下のＮ末端（フロントハーフ、「－ＮＴ」）またはＣ末端（バックハーフ、「－ＣＴ」）ベクター中にｈＭｙｏｓｉｎ７ａをコードする配列のいずれか、例えば、配列番号６３、６６、７３、７５、７７、８０および９０に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９２．５％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または９９．５％同一であるヌクレオチド配列を含む場合がある。開示されるＮ末端およびＣ末端ミオシン７ａをコードする配列は、配列番号６３、６６、７３、７５、７７、８０および９０のいずれかと共通して．５～１０、１０～１５、１５～２０、２０～２５、２５～３５、３５～４５、４５～６０、６０～７５または７５より多くの連続ヌクレオチドのストレッチを含有する場合がある。
本明細書において提供されるポリヌクレオチドベクターおよびミオシン７ａをコードする配列は、以下の配列のいずれか（例えば、配列番号３１～３８、４４および４６～５１のベクターのいずれか；または配列番号６３、６６、７３、７５、７７、８０および９０として示されるＮ末端（フロントハーフ、「－ＮＴ」）またはＣ末端（バックハーフ、「－ＣＴ」）ベクター中の、ｈＭｙｏｓｉｎ７ａをコードする配列のいずれかと、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１０～１５、１５～２０、２０～２５または２５より多いヌクレオチドだけ異なるヌクレオチド配列を含む場合がある。本明細書において提供されるポリヌクレオチドベクターは、以下の配列のいずれかと、ベクターの５’末端で、またはその付近で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１０より多いヌクレオチドだけ異なるヌクレオチド配列を含む場合がある、また、ベクターの３’末端で、またはその付近で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１０より多いヌクレオチドだけ異なる場合がある。本明細書において提供されるベクターは、５’または３’末端で１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０ヌクレオチドだけの末端切断を含む場合がある。
実施例６および７において提供されるベクターのヌクレオチド配列
配列番号３１は、第２世代ハイブリッドフロントハーフベクター（すなわち、ＡＡＶ－ｓｍＣＢＡ－ｈＭＹＯ７Ａ－ＮＴ－Ｅｘ２１－ＡＰＳＤ－ＡＰヘッド）のヌクレオチド配列である：
CTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCTCAGATCTGGCGCGCCCAATTCGGTACCCTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGAGTCGCTGCGCGCTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTTGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTGAGGGGCTCCGGGAGCTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTTATTGTGCTGTCTCATCATTTTGGCAAAGAATTCTAGCGGCCGCCACCATGGTGATTCTTCAGCAGGGGGACCATGTGTGGATGGACCTGAGATTGGGGCAGGAGTTCGACGTGCCCATCGGGGCGGTGGTGAAGCTCTGCGACTCTGGGCAGGTCCAGGTGGTGGATGATGAAGACAATGAACACTGGATCTCTCCGCAGAACGCAACGCACATCAAGCCTATGCACCCCACGTCGGTCCACGGCGTGGAGGACATGATCCGCCTGGGGGACCTCAACGAGGCGGGCATCTTGCGCAACCTGCTTATCCGCTACCGGGACCACCTCATCTACACGTATACGGGCTCCATCCTGGTGGCTGTGAACCCCTACCAGCTGCTCTCCATCTACTCGCCAGAGCACATCCGCCAGTATACCAACAAGAAGATTGGGGAGATGCCCCCCCACATCTTTGCCATTGCTGACAACTGCTACTTCAACATGAAACGCAACAGCCGAGACCAGTGCTGCATCATCAGTGGGGAATCTGGGGCCGGGAAGACGGAGAGCACAAAGCTGATCCTGCAGTTCCTGGCAGCCATCAGTGGGCAGCACTCGTGGATTGAGCAGCAGGTCTTGGAGGCCACCCCCATTCTGGAAGCATTTGGGAATGCCAAGACCATCCGCAATGACAACTCAAGCCGTTTCGGAAAGTACATCGACATCCACTTCAACAAGCGGGGCGCCATCGAGGGCGCGAAGATTGAGCAGTACCTGCTGGAAAAGTCACGTGTCTGTCGCCAGGCCCTGGATGAAAGGAACTACCACGTGTTCTACTGCATGCTGGAGGGTATGAGTGAGGATCAGAAGAAGAAGCTGGGCTTGGGCCAGGCCTCTGACTACAACTACTTGGCCATGGGTAACTGCATAACCTGTGAGGGCCGGGTGGACAGCCAGGAGTACGCCAACATCCGCTCCGCCATGAAGGTGCTCATGTTCACTGACACCGAGAACTGGGAGATCTCGAAGCTCCTGGCTGCCATCCTGCACCTGGGCAACCTGCAGTATGAGGCACGCACATTTGAAAACCTGGATGCCTGTGAGGTTCTCTTCTCCCCATCGCTGGCCACAGCTGCATCCCTGCTTGAGGTGAACCCCCCAGACCTGATGAGCTGCCTGACTAGCCGCACCCTCATCACCCGCGGGGAGACGGTGTCCACCCCACTGAGCAGGGAACAGGCACTGGACGTGCGCGACGCCTTCGTAAAGGGGATCTACGGGCGGCTGTTCGTGTGGATTGTGGACAAGATCAACGCAGCAATTTACAAGCCTCCCTCCCAGGATGTGAAGAACTCTCGCAGGTCCATCGGCCTCCTGGACATCTTTGGGTTTGAGAACTTTGCTGTGAACAGCTTTGAGCAGCTCTGCATCAACTTCGCCAATGAGCACCTGCAGCAGTTCTTTGTGCGGCACGTGTTCAAGCTGGAGCAGGAGGAATATGACCTGGAGAGCATTGACTGGCTGCACATCGAGTTCACTGACAACCAGGATGCCCTGGACATGATTGCCAACAAGCCCATGAACATCATCTCCCTCATCGATGAGGAGAGCAAGTTCCCCAAGGGCACAGACACCACCATGTTACACAAGCTGAACTCCCAGCACAAGCTCAACGCCAACTACATCCCCCCCAAGAACAACCATGAGACCCAGTTTGGCATCAACCATTTTGCAGGCATCGTCTACTATGAGACCCAAGGCTTCCTGGAGAAGAACCGAGACACCCTGCATGGGGACATTATCCAGCTGGTCCACTCCTCCAGGAACAAGTTCATCAAGCAGATCTTCCAGGCCGATGTCGCCATGGGCGCCGAGACCAGGAAGCGCTCGCCCACACTTAGCAGCCAGTTCAAGCGGTCACTGGAGCTGCTGATGCGCACGCTGGGTGCCTGCCAGCCCTTCTTTGTGCGATGCATCAAGCCCAATGAGTTCAAGAAGCCCATGCTGTTCGACCGGCACCTGTGCGTGCGCCAGCTGCGGTACTCAGGAATGATGGAGACCATCCGAATCCGCCGAGCTGGCTACCCCATCCGCTACAGCTTCGTAGAGTTTGTGGAGCGGTACCGTGTGCTGCTGCCAGGTGTGAAGCCGGCCTACAAGCAGGGCGACCTCCGCGGGACTTGCCAGCGCATGGCTGAGGCTGTGCTGGGCACCCACGATGACTGGCAGATAGGCAAAACCAAGATCTTTCTGAAGGACCACCATGACATGCTGCTGGAAGTGGAGCGGGACAAAGCCATCACCGACAGAGTCATCCTCCTTCAGAAAGTCATCCGGGGATTCAAAGACAGGTCTAACTTTCTGAAGCTGAAGAACGCTGCCACACTGATCCAGAGGCACTGGCGGGGTCACAACTGTAGGAAGAACTACGGGCTGATGCGTCTGGGCTTCCTGCGGCTGCAGGCCCTGCACCGCTCCCGGAAGCTGCACCAGCAGTACCGCCTGGCCCGCCAGCGCATCATCCAGTTCCAGGCCCGCTGCCGCGCCTATCTGGTGCGCAAGGCCTTCCGCCACCGCCTCTGGGCTGTGCTCACCGTGCAGGCCTATGCCCGGGGCATGATCGCCCGCAGGCTGCACCAACGCCTCAGGGCTGAGGTAAGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCTTGTCGAGACAGAGAAGACTCTTGCGTTTCTGAGCTAGCCCCCGGGTGCGCGGCGTCGGTGGTGCCGGCGGGGGGCGCCAGGTCGCAGGCGGTGTAGGGCTCCAGGCAGGCGGCGAAGGCCATGACGTGCGCTATGAAGGTCTGCTCCTGCACGCCGTGAACCAGGTGCGCCTGCGGGCCGCGCGCGAACACCGCCACGTCCTCGCCTGCGTGGGTCTCTTCGTCCAGGGGCACTGCTGACTGCTGCCGATACTCGGGGCTCCCGCTCTCGCTCTCGGTAACATCCGGCCGGGCGCCGTCCTTGAGCACATAGCCTGGACCGTTTCGTCGACTGTTAATTAAGCATGCTGGGGAGAGATCTAGGAAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAG
配列番号７３（ｈＭＹＯ７Ａ－ＮＴ（ＡＡＶ－ｓｍＣＢＡ－ｈＭＹＯ７Ａ－ＮＴ－Ｅｘ２１－ＡＰＳＤ－ＡＰヘッド）、（ＡＡＶ－ｓｍＣＢＡ－ｈＭＹＯ７Ａ－ＮＴ－Ｅｘ２１－ＡＰＳＤ－ＡＰヘッドＣＭｖ１）、（ＡＡＶ－ｓｍＣＢＡ－ｈＭＹＯ７Ａ－ＮＴ－Ｅｘ２１－ＡＰＳＤ－ＡＰヘッドＣＭｖ２）、（ＡＡＶ－ｓｍＣＢＡ－ｈＭＹＯ７Ａ－ＮＴｅｘ２１－ＡＰＳＤ－ＡＰヘッド－ＣＭｖ３））
ATGGTGATTCTTCAGCAGGGGGACCATGTGTGGATGGACCTGAGATTGGGGCAGGAGTTCGACGTGCCCATCGGGGCGGTGGTGAAGCTCTGCGACTCTGGGCAGGTCCAGGTGGTGGATGATGAAGACAATGAACACTGGATCTCTCCGCAGAACGCAACGCACATCAAGCCTATGCACCCCACGTCGGTCCACGGCGTGGAGGACATGATCCGCCTGGGGGACCTCAACGAGGCGGGCATCTTGCGCAACCTGCTTATCCGCTACCGGGACCACCTCATCTACACGTATACGGGCTCCATCCTGGTGGCTGTGAACCCCTACCAGCTGCTCTCCATCTACTCGCCAGAGCACATCCGCCAGTATACCAACAAGAAGATTGGGGAGATGCCCCCCCACATCTTTGCCATTGCTGACAACTGCTACTTCAACATGAAACGCAACAGCCGAGACCAGTGCTGCATCATCAGTGGGGAATCTGGGGCCGGGAAGACGGAGAGCACAAAGCTGATCCTGCAGTTCCTGGCAGCCATCAGTGGGCAGCACTCGTGGATTGAGCAGCAGGTCTTGGAGGCCACCCCCATTCTGGAAGCATTTGGGAATGCCAAGACCATCCGCAATGACAACTCAAGCCGTTTCGGAAAGTACATCGACATCCACTTCAACAAGCGGGGCGCCATCGAGGGCGCGAAGATTGAGCAGTACCTGCTGGAAAAGTCACGTGTCTGTCGCCAGGCCCTGGATGAAAGGAACTACCACGTGTTCTACTGCATGCTGGAGGGTATGAGTGAGGATCAGAAGAAGAAGCTGGGCTTGGGCCAGGCCTCTGACTACAACTACTTGGCCATGGGTAACTGCATAACCTGTGAGGGCCGGGTGGACAGCCAGGAGTACGCCAACATCCGCTCCGCCATGAAGGTGCTCATGTTCACTGACACCGAGAACTGGGAGATCTCGAAGCTCCTGGCTGCCATCCTGCACCTGGGCAACCTGCAGTATGAGGCACGCACATTTGAAAACCTGGATGCCTGTGAGGTTCTCTTCTCCCCATCGCTGGCCACAGCTGCATCCCTGCTTGAGGTGAACCCCCCAGACCTGATGAGCTGCCTGACTAGCCGCACCCTCATCACCCGCGGGGAGACGGTGTCCACCCCACTGAGCAGGGAACAGGCACTGGACGTGCGCGACGCCTTCGTAAAGGGGATCTACGGGCGGCTGTTCGTGTGGATTGTGGACAAGATCAACGCAGCAATTTACAAGCCTCCCTCCCAGGATGTGAAGAACTCTCGCAGGTCCATCGGCCTCCTGGACATCTTTGGGTTTGAGAACTTTGCTGTGAACAGCTTTGAGCAGCTCTGCATCAACTTCGCCAATGAGCACCTGCAGCAGTTCTTTGTGCGGCACGTGTTCAAGCTGGAGCAGGAGGAATATGACCTGGAGAGCATTGACTGGCTGCACATCGAGTTCACTGACAACCAGGATGCCCTGGACATGATTGCCAACAAGCCCATGAACATCATCTCCCTCATCGATGAGGAGAGCAAGTTCCCCAAGGGCACAGACACCACCATGTTACACAAGCTGAACTCCCAGCACAAGCTCAACGCCAACTACATCCCCCCCAAGAACAACCATGAGACCCAGTTTGGCATCAACCATTTTGCAGGCATCGTCTACTATGAGACCCAAGGCTTCCTGGAGAAGAACCGAGACACCCTGCATGGGGACATTATCCAGCTGGTCCACTCCTCCAGGAACAAGTTCATCAAGCAGATCTTCCAGGCCGATGTCGCCATGGGCGCCGAGACCAGGAAGCGCTCGCCCACACTTAGCAGCCAGTTCAAGCGGTCACTGGAGCTGCTGATGCGCACGCTGGGTGCCTGCCAGCCCTTCTTTGTGCGATGCATCAAGCCCAATGAGTTCAAGAAGCCCATGCTGTTCGACCGGCACCTGTGCGTGCGCCAGCTGCGGTACTCAGGAATGATGGAGACCATCCGAATCCGCCGAGCTGGCTACCCCATCCGCTACAGCTTCGTAGAGTTTGTGGAGCGGTACCGTGTGCTGCTGCCAGGTGTGAAGCCGGCCTACAAGCAGGGCGACCTCCGCGGGACTTGCCAGCGCATGGCTGAGGCTGTGCTGGGCACCCACGATGACTGGCAGATAGGCAAAACCAAGATCTTTCTGAAGGACCACCATGACATGCTGCTGGAAGTGGAGCGGGACAAAGCCATCACCGACAGAGTCATCCTCCTTCAGAAAGTCATCCGGGGATTCAAAGACAGGTCTAACTTTCTGAAGCTGAAGAACGCTGCCACACTGATCCAGAGGCACTGGCGGGGTCACAACTGTAGGAAGAACTACGGGCTGATGCGTCTGGGCTTCCTGCGGCTGCAGGCCCTGCACCGCTCCCGGAAGCTGCACCAGCAGTACCGCCTGGCCCGCCAGCGCATCATCCAGTTCCAGGCCCGCTGCCGCGCCTATCTGGTGCGCAAGGCCTTCCGCCACCGCCTCTGGGCTGTGCTCACCGTGCAGGCCTATGCCCGGGGCATGATCGCCCGCAGGCTGCACCAACGCCTCAGGGCTGAG
配列番号７４（ｈＭＹＯ７Ａ－ＮＴ（ＡＡＶ－ｓｍＣＢＡ－ｈＭＹＯ７Ａ－ＮＴ－Ｅｘ２１－ＡＰＳＤ－ＡＰヘッド）、（ＡＡＶ－ｓｍＣＢＡ－ｈＭＹＯ７Ａ－ＮＴ－Ｅｘ２１－ＡＰＳＤ－ＡＰヘッドＣＭｖ１）、（ＡＡＶ－ｓｍＣＢＡ－ｈＭＹＯ７Ａ－ＮＴ－Ｅｘ２１－ＡＰＳＤ－ＡＰヘッド－ＣＭｖ３））
MVILQQGDHVWMDLRLGQEFDVPIGAVVKLCDSGQVQVVDDEDNEHWISPQNATHIKPMHPTSVHGVEDMIRLGDLNEAGILRNLLIRYRDHLIYTYTGSILVAVNPYQLLSIYSPEHIRQYTNKKIGEMPPHIFAIADNCYFNMKRNSRDQCCIISGESGAGKTESTKLILQFLAAISGQHSWIEQQVLEATPILEAFGNAKTIRNDNSSRFGKYIDIHFNKRGAIEGAKIEQYLLEKSRVCRQALDERNYHVFYCMLEGMSEDQKKKLGLGQASDYNYLAMGNCITCEGRVDSQEYANIRSAMKVLMFTDTENWEISKLLAAILHLGNLQYEARTFENLDACEVLFSPSLATAASLLEVNPPDLMSCLTSRTLITRGETVSTPLSREQALDVRDAFVKGIYGRLFVWIVDKINAAIYKPPSQDVKNSRRSIGLLDIFGFENFAVNSFEQLCINFANEHLQQFFVRHVFKLEQEEYDLESIDWLHIEFTDNQDALDMIANKPMNIISLIDEESKFPKGTDTTMLHKLNSQHKLNANYIPPKNNHETQFGINHFAGIVYYETQGFLEKNRDTLHGDIIQLVHSSRNKFIKQIFQADVAMGAETRKRSPTLSSQFKRSLELLMRTLGACQPFFVRCIKPNEFKKPMLFDRHLCVRQLRYSGMMETIRIRRAGYPIRYSFVEFVERYRVLLPGVKPAYKQGDLRGTCQRMAEAVLGTHDDWQIGKTKIFLKDHHDMLLEVERDKAITDRVILLQKVIRGFKDRSNFLKLKNAATLIQRHWRGHNCRKNYGLMRLGFLRLQALHRSRKLHQQYRLARQRIIQFQARCRAYLVRKAFRHRLWAVLTVQAYARGMIARRLHQRLRAE
配列番号３２は、第２世代ハイブリッドバックハーフベクター（すなわち、ＡＡＶ－ＡＰヘッド－ＡＰＳＡ－ｅｘ２２ｈＭＹＯ７Ａ－ＣＴ．ＨＡ（血球凝集素（ＨＡ）タグを有する））のヌクレオチド配列である：
CTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCTCAGATCTGGCGCGCCCAATTGGCTTCGAATTCTAGCGGCCGCCCCCGGGTGCGCGGCGTCGGTGGTGCCGGCGGGGGGCGCCAGGTCGCAGGCGGTGTAGGGCTCCAGGCAGGCGGCGAAGGCCATGACGTGCGCTATGAAGGTCTGCTCCTGCACGCCGTGAACCAGGTGCGCCTGCGGGCCGCGCGCGAACACCGCCACGTCCTCGCCTGCGTGGGTCTCTTCGTCCAGGGGCACTGCTGACTGCTGCCGATACTCGGGGCTCCCGCTCTCGCTCTCGGTAACATCCGGCCGGGCGCCGTCCTTGAGCACATAGCCTGGACCGTTTCCTTAAGCGACGCATGCTCGCGATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAGTATCTGTGGCGCCTCGAGGCTGAGAAAATGCGGCTGGCGGAGGAAGAGAAGCTTCGGAAGGAGATGAGCGCCAAGAAGGCCAAGGAGGAGGCCGAGCGCAAGCATCAGGAGCGCCTGGCCCAGCTGGCTCGTGAGGACGCTGAGCGGGAGCTGAAGGAGAAGGAGGCCGCTCGGCGGAAGAAGGAGCTCCTGGAGCAGATGGAAAGGGCCCGCCATGAGCCTGTCAATCACTCAGACATGGTGGACAAGATGTTTGGCTTCCTGGGGACTTCAGGTGGCCTGCCAGGCCAGGAGGGCCAGGCACCTAGTGGCTTTGAGGACCTGGAGCGAGGGCGGAGGGAGATGGTGGAGGAGGACCTGGATGCAGCCCTGCCCCTGCCTGACGAGGATGAGGAGGACCTCTCTGAGTATAAATTTGCCAAGTTCGCGGCCACCTACTTCCAGGGGACAACCACGCACTCCTACACCCGGCGGCCACTCAAACAGCCACTGCTCTACCATGACGACGAGGGTGACCAGCTGGCAGCCCTGGCGGTCTGGATCACCATCCTCCGCTTCATGGGGGACCTCCCTGAGCCCAAGTACCACACAGCCATGAGTGATGGCAGTGAGAAGATCCCTGTGATGACCAAGATTTATGAGACCCTGGGCAAGAAGACGTACAAGAGGGAGCTGCAGGCCCTGCAGGGCGAGGGCGAGGCCCAGCTCCCCGAGGGCCAGAAGAAGAGCAGTGTGAGGCACAAGCTGGTGCATTTGACTCTGAAAAAGAAGTCCAAGCTCACAGAGGAGGTGACCAAGAGGCTGCATGACGGGGAGTCCACAGTGCAGGGCAACAGCATGCTGGAGGACCGGCCCACCTCCAACCTGGAGAAGCTGCACTTCATCATCGGCAATGGCATCCTGCGGCCAGCACTCCGGGACGAGATCTACTGCCAGATCAGCAAGCAGCTGACCCACAACCCCTCCAAGAGCAGCTATGCCCGGGGCTGGATTCTCGTGTCTCTCTGCGTGGGCTGTTTCGCCCCCTCCGAGAAGTTTGTCAAGTACCTGCGGAACTTCATCCACGGGGGCCCGCCCGGCTACGCCCCGTACTGTGAGGAGCGCCTGAGAAGGACCTTTGTCAATGGGACACGGACACAGCCGCCCAGCTGGCTGGAGCTGCAGGCCACCAAGTCCAAGAAGCCAATCATGTTGCCCGTGACATTCATGGATGGGACCACCAAGACCCTGCTGACGGACTCGGCAACCACGGCCAAGGAGCTCTGCAACGCGCTGGCCGACAAGATCTCTCTCAAGGACCGGTTCGGGTTCTCCCTCTACATTGCCCTGTTTGACAAGGTGTCCTCCCTGGGCAGCGGCAGTGACCACGTCATGGACGCCATCTCCCAGTGCGAGCAGTACGCCAAGGAGCAGGGCGCCCAGGAGCGCAACGCCCCCTGGAGGCTCTTCTTCCGCAAAGAGGTCTTCACGCCCTGGCACAGCCCCTCCGAGGACAACGTGGCCACCAACCTCATCTACCAGCAGGTGGTGCGAGGAGTCAAGTTTGGGGAGTACAGGTGTGAGAAGGAGGACGACCTGGCTGAGCTGGCCTCCCAGCAGTACTTTGTAGACTATGGCTCTGAGATGATCCTGGAGCGCCTCCTGAACCTCGTGCCCACCTACATCCCCGACCGCGAGATCACGCCCCTGAAGACGCTGGAGAAGTGGGCCCAGCTGGCCATCGCCGCCCACAAGAAGGGGATTTATGCCCAGAGGAGAACTGATGCCCAGAAGGTCAAAGAGGATGTGGTCAGTTATGCCCGCTTCAAGTGGCCCTTGCTCTTCTCCAGGTTTTATGAAGCCTACAAATTCTCAGGCCCCAGTCTCCCCAAGAACGACGTCATCGTGGCCGTCAACTGGACGGGTGTGTACTTTGTGGATGAGCAGGAGCAGGTACTTCTGGAGCTGTCCTTCCCAGAGATCATGGCCGTGTCCAGCAGCAGGGGAGCGAAAACGACGGCCCCCAGCTTCACGCTGGCCACCATCAAGGGGGACGAATACACCTTCACCTCCAGCAATGCTGAGGACATTCGTGACCTGGTGGTCACCTTCCTAGAGGGGCTCCGGAAGAGATCTAAGTATGTTGTGGCCCTGCAGGATAACCCCAACCCCGCAGGCGAGGAGTCAGGCTTCCTCAGCTTTGCCAAGGGAGACCTCATCATCCTGGACCATGACACGGGCGAGCAGGTCATGAACTCGGGCTGGGCCAACGGCATCAATGAGAGGACCAAGCAGCGTGGGGACTTCCCCACCGACAGTGTGTACGTCATGCCCACTGTCACCATGCCACCGCGGGAGATTGTGGCCCTGGTCACCATGACTCCCGATCAGAGGCAGGACGTTGTCCGGCTCTTGCAGCTGCGAACGGCGGAGCCCGAGGTGCGTGCCAAGCCCTACACGCTGGAGGAGTTTTCCTATGACTACTTCAGGCCCCCACCCAAGCACACGCTGAGCCGTGTCATGGTGTCCAAGGCCCGAGGCAAGGACCGGCTGTGGAGCCACACGCGGGAACCGCTCAAGCAGGCGCTGCTCAAGAAGCTCCTGGGCAGTGAGGAGCTCTCGCAGGAGGCCTGCCTGGCCTTCATTGCTGTGCTCAAGTACATGGGCGACTACCCGTCCAAGAGGACACGCTCCGTCAACGAGCTCACCGACCAGATCTTTGAGGGTCCCCTGAAAGCCGAGCCCCTGAAGGACGAGGCATATGTGCAGATCCTGAAGCAGCTGACCGACAACCACATCAGGTACAGCGAGGAGCGGGGTTGGGAGCTGCTCTGGCTGTGCACGGGCCTTTTCCCACCCAGCAACATCCTCCTGCCCCACGTGCAGCGCTTCCTGCAGTCCCGAAAGCACTGCCCACTCGCCATCGACTGCCTGCAACGGCTCCAGAAAGCCCTGAGAAACGGGTCCCGGAAGTACCCTCCGCACCTGGTGGAGGTGGAGGCCATCCAGCACAAGACCACCCAGATTTTCCACAAAGTCTACTTCCCTGATGACACTGACGAGGCCTTCGAAGTGGAGTCCAGCACCAAGGCCAAGGACTTCTGCCAGAACATCGCCACCAGGCTGCTCCTCAAGTCCTCAGAGGGATTCAGCCTCTTTGTCAAAATTGCAGACAAGGTCATCAGCGTTCCTGAGAATGACTTCTTCTTTGACTTTGTTCGACACTTGACAGACTGGATAAAGAAAGCTCGGCCCATCAAGGACGGAATTGTGCCCTCACTCACCTACCAGGTGTTCTTCATGAAGAAGCTGTGGACCACCACGGTGCCAGGGAAGGATCCCATGGCCGATTCCATCTTCCACTATTACCAGGAGTTGCCCAAGTATCTCCGAGGCTACCACAAGTGCACGCGGGAGGAGGTGCTGCAGCTGGGGGCGCTGATCTACAGGGTCAAGTTCGAGGAGGACAAGTCCTACTTCCCCAGCATCCCCAAGCTGCTGCGGGAGCTGGTGCCCCAGGACCTTATCCGGCAGGTCTCACCTGATGACTGGAAGCGGTCCATCGTCGCCTACTTCAACAAGCACGCAGGGAAGTCCAAGGAGGAGGCCAAGCTGGCCTTCCTGAAGCTCATCTTCAAGTGGCCCACCTTTGGCTCAGCCTTCTTCGAGGTGAAGCAAACTACGGAGCCAAACTTCCCTGAGATCCTCCTAATTGCCATCAACAAGTATGGGGTCAGCCTCATCGATCCCAAAACGAAGGATATCCTCACCACTCATCCCTTCACCAAGATCTCCAACTGGAGCAGCGGCAACACCTACTTCCACATCACCATTGGGAACTTGGTGCGCGGGAGCAAACTGCTCTGCGAGACGTCACTGGGCTACAAGATGGATGACCTCCTGACTTCCTACATTAGCCAGATGCTCACAGCCATGAGCAAACAGCGGGGCTCCAGGAGCGGCAAGTACCCTTACGATGTACCGGATTACGCATGAGGTACCAAGGGCGAATTCTGCAGTCGACTAGAGCTCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGAGAGATCTGGAGGACTAGTCCGTCGACTGTTAATTAAGCATGCTGGGGAGAGATCTAGGAAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAG
配列番号７５、ｅｘ２２ｈＭＹＯ７Ａ（例えば、ＡＡＶ－ＡＰヘッド－ＡＰＳＡ－ｅｘ２２ｈＭＹＯ７Ａ－ＣＴ．ＨＡ、ＡＡＶ－ＡＰヘッド－ＡＰＳＡ－ｅｘ２２ｈＭＹＯ７Ａ－ＣＴ．ＨＡ－ＣＭｖ２、ＡＡＶ－ＡＰヘッド－ＡＰＳＡ－ｈＭＹＯ７ＡＣＴｅｘ２２－ＣＭｖ２．１．ＨＡ、ＡＡＶ－ＡＰヘッド－ＡＰＳＡ－ｈＭＹＯ７ＡＣＴｅｘ２２－ＣＭｖ２、ＡＡＶ－ＡＰヘッド－ＡＰＳＡ－ｈＭＹＯ７ＡＣＴｅｘ ２２．ＨＡ－ＭＩＮ、ＡＡＶ－ＡＰヘッド－ＡＰＳＡ－ｈＭＹＯ７ＡＣＴｅｘ ２２－ＭＩＮ））
TATCTGTGGCGCCTCGAGGCTGAGAAAATGCGGCTGGCGGAGGAAGAGAAGCTTCGGAAGGAGATGAGCGCCAAGAAGGCCAAGGAGGAGGCCGAGCGCAAGCATCAGGAGCGCCTGGCCCAGCTGGCTCGTGAGGACGCTGAGCGGGAGCTGAAGGAGAAGGAGGCCGCTCGGCGGAAGAAGGAGCTCCTGGAGCAGATGGAAAGGGCCCGCCATGAGCCTGTCAATCACTCAGACATGGTGGACAAGATGTTTGGCTTCCTGGGGACTTCAGGTGGCCTGCCAGGCCAGGAGGGCCAGGCACCTAGTGGCTTTGAGGACCTGGAGCGAGGGCGGAGGGAGATGGTGGAGGAGGACCTGGATGCAGCCCTGCCCCTGCCTGACGAGGATGAGGAGGACCTCTCTGAGTATAAATTTGCCAAGTTCGCGGCCACCTACTTCCAGGGGACAACCACGCACTCCTACACCCGGCGGCCACTCAAACAGCCACTGCTCTACCATGACGACGAGGGTGACCAGCTGGCAGCCCTGGCGGTCTGGATCACCATCCTCCGCTTCATGGGGGACCTCCCTGAGCCCAAGTACCACACAGCCATGAGTGATGGCAGTGAGAAGATCCCTGTGATGACCAAGATTTATGAGACCCTGGGCAAGAAGACGTACAAGAGGGAGCTGCAGGCCCTGCAGGGCGAGGGCGAGGCCCAGCTCCCCGAGGGCCAGAAGAAGAGCAGTGTGAGGCACAAGCTGGTGCATTTGACTCTGAAAAAGAAGTCCAAGCTCACAGAGGAGGTGACCAAGAGGCTGCATGACGGGGAGTCCACAGTGCAGGGCAACAGCATGCTGGAGGACCGGCCCACCTCCAACCTGGAGAAGCTGCACTTCATCATCGGCAATGGCATCCTGCGGCCAGCACTCCGGGACGAGATCTACTGCCAGATCAGCAAGCAGCTGACCCACAACCCCTCCAAGAGCAGCTATGCCCGGGGCTGGATTCTCGTGTCTCTCTGCGTGGGCTGTTTCGCCCCCTCCGAGAAGTTTGTCAAGTACCTGCGGAACTTCATCCACGGGGGCCCGCCCGGCTACGCCCCGTACTGTGAGGAGCGCCTGAGAAGGACCTTTGTCAATGGGACACGGACACAGCCGCCCAGCTGGCTGGAGCTGCAGGCCACCAAGTCCAAGAAGCCAATCATGTTGCCCGTGACATTCATGGATGGGACCACCAAGACCCTGCTGACGGACTCGGCAACCACGGCCAAGGAGCTCTGCAACGCGCTGGCCGACAAGATCTCTCTCAAGGACCGGTTCGGGTTCTCCCTCTACATTGCCCTGTTTGACAAGGTGTCCTCCCTGGGCAGCGGCAGTGACCACGTCATGGACGCCATCTCCCAGTGCGAGCAGTACGCCAAGGAGCAGGGCGCCCAGGAGCGCAACGCCCCCTGGAGGCTCTTCTTCCGCAAAGAGGTCTTCACGCCCTGGCACAGCCCCTCCGAGGACAACGTGGCCACCAACCTCATCTACCAGCAGGTGGTGCGAGGAGTCAAGTTTGGGGAGTACAGGTGTGAGAAGGAGGACGACCTGGCTGAGCTGGCCTCCCAGCAGTACTTTGTAGACTATGGCTCTGAGATGATCCTGGAGCGCCTCCTGAACCTCGTGCCCACCTACATCCCCGACCGCGAGATCACGCCCCTGAAGACGCTGGAGAAGTGGGCCCAGCTGGCCATCGCCGCCCACAAGAAGGGGATTTATGCCCAGAGGAGAACTGATGCCCAGAAGGTCAAAGAGGATGTGGTCAGTTATGCCCGCTTCAAGTGGCCCTTGCTCTTCTCCAGGTTTTATGAAGCCTACAAATTCTCAGGCCCCAGTCTCCCCAAGAACGACGTCATCGTGGCCGTCAACTGGACGGGTGTGTACTTTGTGGATGAGCAGGAGCAGGTACTTCTGGAGCTGTCCTTCCCAGAGATCATGGCCGTGTCCAGCAGCAGGGGAGCGAAAACGACGGCCCCCAGCTTCACGCTGGCCACCATCAAGGGGGACGAATACACCTTCACCTCCAGCAATGCTGAGGACATTCGTGACCTGGTGGTCACCTTCCTAGAGGGGCTCCGGAAGAGATCTAAGTATGTTGTGGCCCTGCAGGATAACCCCAACCCCGCAGGCGAGGAGTCAGGCTTCCTCAGCTTTGCCAAGGGAGACCTCATCATCCTGGACCATGACACGGGCGAGCAGGTCATGAACTCGGGCTGGGCCAACGGCATCAATGAGAGGACCAAGCAGCGTGGGGACTTCCCCACCGACAGTGTGTACGTCATGCCCACTGTCACCATGCCACCGCGGGAGATTGTGGCCCTGGTCACCATGACTCCCGATCAGAGGCAGGACGTTGTCCGGCTCTTGCAGCTGCGAACGGCGGAGCCCGAGGTGCGTGCCAAGCCCTACACGCTGGAGGAGTTTTCCTATGACTACTTCAGGCCCCCACCCAAGCACACGCTGAGCCGTGTCATGGTGTCCAAGGCCCGAGGCAAGGACCGGCTGTGGAGCCACACGCGGGAACCGCTCAAGCAGGCGCTGCTCAAGAAGCTCCTGGGCAGTGAGGAGCTCTCGCAGGAGGCCTGCCTGGCCTTCATTGCTGTGCTCAAGTACATGGGCGACTACCCGTCCAAGAGGACACGCTCCGTCAACGAGCTCACCGACCAGATCTTTGAGGGTCCCCTGAAAGCCGAGCCCCTGAAGGACGAGGCATATGTGCAGATCCTGAAGCAGCTGACCGACAACCACATCAGGTACAGCGAGGAGCGGGGTTGGGAGCTGCTCTGGCTGTGCACGGGCCTTTTCCCACCCAGCAACATCCTCCTGCCCCACGTGCAGCGCTTCCTGCAGTCCCGAAAGCACTGCCCACTCGCCATCGACTGCCTGCAACGGCTCCAGAAAGCCCTGAGAAACGGGTCCCGGAAGTACCCTCCGCACCTGGTGGAGGTGGAGGCCATCCAGCACAAGACCACCCAGATTTTCCACAAAGTCTACTTCCCTGATGACACTGACGAGGCCTTCGAAGTGGAGTCCAGCACCAAGGCCAAGGACTTCTGCCAGAACATCGCCACCAGGCTGCTCCTCAAGTCCTCAGAGGGATTCAGCCTCTTTGTCAAAATTGCAGACAAGGTCATCAGCGTTCCTGAGAATGACTTCTTCTTTGACTTTGTTCGACACTTGACAGACTGGATAAAGAAAGCTCGGCCCATCAAGGACGGAATTGTGCCCTCACTCACCTACCAGGTGTTCTTCATGAAGAAGCTGTGGACCACCACGGTGCCAGGGAAGGATCCCATGGCCGATTCCATCTTCCACTATTACCAGGAGTTGCCCAAGTATCTCCGAGGCTACCACAAGTGCACGCGGGAGGAGGTGCTGCAGCTGGGGGCGCTGATCTACAGGGTCAAGTTCGAGGAGGACAAGTCCTACTTCCCCAGCATCCCCAAGCTGCTGCGGGAGCTGGTGCCCCAGGACCTTATCCGGCAGGTCTCACCTGATGACTGGAAGCGGTCCATCGTCGCCTACTTCAACAAGCACGCAGGGAAGTCCAAGGAGGAGGCCAAGCTGGCCTTCCTGAAGCTCATCTTCAAGTGGCCCACCTTTGGCTCAGCCTTCTTCGAGGTGAAGCAAACTACGGAGCCAAACTTCCCTGAGATCCTCCTAATTGCCATCAACAAGTATGGGGTCAGCCTCATCGATCCCAAAACGAAGGATATCCTCACCACTCATCCCTTCACCAAGATCTCCAACTGGAGCAGCGGCAACACCTACTTCCACATCACCATTGGGAACTTGGTGCGCGGGAGCAAACTGCTCTGCGAGACGTCACTGGGCTACAAGATGGATGACCTCCTGACTTCCTACATTAGCCAGATGCTCACAGCCATGAGCAAACAGCGGGGCTCCAGGAGCGGCAAG
配列番号７６、ｅｘ２２ｈＭＹＯ７Ａ（例えば、ＡＡＶ－ＡＰヘッド－ＡＰＳＡ－ｅｘ２２ｈＭＹＯ７Ａ－ＣＴ．ＨＡ、ＡＡＶ－ＡＰヘッド－ＡＰＳＡ－ｅｘ２２ｈＭＹＯ７Ａ－ＣＴ．ＨＡ－ＣＭｖ２、ＡＡＶ－ＡＰヘッド－ＡＰＳＡ－ｈＭＹＯ７ＡＣＴｅｘ２２－ＣＭｖ２．１．ＨＡ））
YLWRLEAEKMRLAEEEKLRKEMSAKKAKEEAERKHQERLAQLAREDAERELKEKEAARRKKELLEQMERARHEPVNHSDMVDKMFGFLGTSGGLPGQEGQAPSGFEDLERGRREMVEEDLDAALPLPDEDEEDLSEYKFAKFAATYFQGTTTHSYTRRPLKQPLLYHDDEGDQLAALAVWITILRFMGDLPEPKYHTAMSDGSEKIPVMTKIYETLGKKTYKRELQALQGEGEAQLPEGQKKSSVRHKLVHLTLKKKSKLTEEVTKRLHDGESTVQGNSMLEDRPTSNLEKLHFIIGNGILRPALRDEIYCQISKQLTHNPSKSSYARGWILVSLCVGCFAPSEKFVKYLRNFIHGGPPGYAPYCEERLRRTFVNGTRTQPPSWLELQATKSKKPIMLPVTFMDGTTKTLLTDSATTAKELCNALADKISLKDRFGFSLYIALFDKVSSLGSGSDHVMDAISQCEQYAKEQGAQERNAPWRLFFRKEVFTPWHSPSEDNVATNLIYQQVVRGVKFGEYRCEKEDDLAELASQQYFVDYGSEMILERLLNLVPTYIPDREITPLKTLEKWAQLAIAAHKKGIYAQRRTDAQKVKEDVVSYARFKWPLLFSRFYEAYKFSGPSLPKNDVIVAVNWTGVYFVDEQEQVLLELSFPEIMAVSSSRGAKTTAPSFTLATIKGDEYTFTSSNAEDIRDLVVTFLEGLRKRSKYVVALQDNPNPAGEESGFLSFAKGDLIILDHDTGEQVMNSGWANGINERTKQRGDFPTDSVYVMPTVTMPPREIVALVTMTPDQRQDVVRLLQLRTAEPEVRAKPYTLEEFSYDYFRPPPKHTLSRVMVSKARGKDRLWSHTREPLKQALLKKLLGSEELSQEACLAFIAVLKYMGDYPSKRTRSVNELTDQIFEGPLKAEPLKDEAYVQILKQLTDNHIRYSEERGWELLWLCTGLFPPSNILLPHVQRFLQSRKHCPLAIDCLQRLQKALRNGSRKYPPHLVEVEAIQHKTTQIFHKVYFPDDTDEAFEVESSTKAKDFCQNIATRLLLKSSEGFSLFVKIADKVISVPENDFFFDFVRHLTDWIKKARPIKDGIVPSLTYQVFFMKKLWTTTVPGKDPMADSIFHYYQELPKYLRGYHKCTREEVLQLGALIYRVKFEEDKSYFPSIPKLLRELVPQDLIRQVSPDDWKRSIVAYFNKHAGKSKEEAKLAFLKLIFKWPTFGSAFFEVKQTTEPNFPEILLIAINKYGVSLIDPKTKDILTTHPFTKISNWSSGNTYFHITIGNLVRGSKLLCETSLGYKMDDLLTSYISQMLTAMSKQRGSRSGK
配列番号３３は、ＣＭｖ１ハイブリッドフロントハーフベクター（すなわち、ＡＡＶ－ｓｍＣＢＡ－ｈＭＹＯ７Ａ－ＮＴ－Ｅｘ２１－ＡＰＳＤ－ＡＰヘッドＣＭｖ１）のヌクレオチド配列である：
CTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCTCAGATCTGGCGCGCCCAATTCGGTACCCTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGAGTCGCTGCGCGCTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTTGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTGAGGGGCTCCGGGAGCTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTTATTGTGCTGTCTCATCATTTTGGCAAAGAATTCTAGCGGCCGCCACCATGGTGATTCTTCAGCAGGGGGACCATGTGTGGATGGACCTGAGATTGGGGCAGGAGTTCGACGTGCCCATCGGGGCGGTGGTGAAGCTCTGCGACTCTGGGCAGGTCCAGGTGGTGGATGATGAAGACAATGAACACTGGATCTCTCCGCAGAACGCAACGCACATCAAGCCTATGCACCCCACGTCGGTCCACGGCGTGGAGGACATGATCCGCCTGGGGGACCTCAACGAGGCGGGCATCTTGCGCAACCTGCTTATCCGCTACCGGGACCACCTCATCTACACGTATACGGGCTCCATCCTGGTGGCTGTGAACCCCTACCAGCTGCTCTCCATCTACTCGCCAGAGCACATCCGCCAGTATACCAACAAGAAGATTGGGGAGATGCCCCCCCACATCTTTGCCATTGCTGACAACTGCTACTTCAACATGAAACGCAACAGCCGAGACCAGTGCTGCATCATCAGTGGGGAATCTGGGGCCGGGAAGACGGAGAGCACAAAGCTGATCCTGCAGTTCCTGGCAGCCATCAGTGGGCAGCACTCGTGGATTGAGCAGCAGGTCTTGGAGGCCACCCCCATTCTGGAAGCATTTGGGAATGCCAAGACCATCCGCAATGACAACTCAAGCCGTTTCGGAAAGTACATCGACATCCACTTCAACAAGCGGGGCGCCATCGAGGGCGCGAAGATTGAGCAGTACCTGCTGGAAAAGTCACGTGTCTGTCGCCAGGCCCTGGATGAAAGGAACTACCACGTGTTCTACTGCATGCTGGAGGGTATGAGTGAGGATCAGAAGAAGAAGCTGGGCTTGGGCCAGGCCTCTGACTACAACTACTTGGCCATGGGTAACTGCATAACCTGTGAGGGCCGGGTGGACAGCCAGGAGTACGCCAACATCCGCTCCGCCATGAAGGTGCTCATGTTCACTGACACCGAGAACTGGGAGATCTCGAAGCTCCTGGCTGCCATCCTGCACCTGGGCAACCTGCAGTATGAGGCACGCACATTTGAAAACCTGGATGCCTGTGAGGTTCTCTTCTCCCCATCGCTGGCCACAGCTGCATCCCTGCTTGAGGTGAACCCCCCAGACCTGATGAGCTGCCTGACTAGCCGCACCCTCATCACCCGCGGGGAGACGGTGTCCACCCCACTGAGCAGGGAACAGGCACTGGACGTGCGCGACGCCTTCGTAAAGGGGATCTACGGGCGGCTGTTCGTGTGGATTGTGGACAAGATCAACGCAGCAATTTACAAGCCTCCCTCCCAGGATGTGAAGAACTCTCGCAGGTCCATCGGCCTCCTGGACATCTTTGGGTTTGAGAACTTTGCTGTGAACAGCTTTGAGCAGCTCTGCATCAACTTCGCCAATGAGCACCTGCAGCAGTTCTTTGTGCGGCACGTGTTCAAGCTGGAGCAGGAGGAATATGACCTGGAGAGCATTGACTGGCTGCACATCGAGTTCACTGACAACCAGGATGCCCTGGACATGATTGCCAACAAGCCCATGAACATCATCTCCCTCATCGATGAGGAGAGCAAGTTCCCCAAGGGCACAGACACCACCATGTTACACAAGCTGAACTCCCAGCACAAGCTCAACGCCAACTACATCCCCCCCAAGAACAACCATGAGACCCAGTTTGGCATCAACCATTTTGCAGGCATCGTCTACTATGAGACCCAAGGCTTCCTGGAGAAGAACCGAGACACCCTGCATGGGGACATTATCCAGCTGGTCCACTCCTCCAGGAACAAGTTCATCAAGCAGATCTTCCAGGCCGATGTCGCCATGGGCGCCGAGACCAGGAAGCGCTCGCCCACACTTAGCAGCCAGTTCAAGCGGTCACTGGAGCTGCTGATGCGCACGCTGGGTGCCTGCCAGCCCTTCTTTGTGCGATGCATCAAGCCCAATGAGTTCAAGAAGCCCATGCTGTTCGACCGGCACCTGTGCGTGCGCCAGCTGCGGTACTCAGGAATGATGGAGACCATCCGAATCCGCCGAGCTGGCTACCCCATCCGCTACAGCTTCGTAGAGTTTGTGGAGCGGTACCGTGTGCTGCTGCCAGGTGTGAAGCCGGCCTACAAGCAGGGCGACCTCCGCGGGACTTGCCAGCGCATGGCTGAGGCTGTGCTGGGCACCCACGATGACTGGCAGATAGGCAAAACCAAGATCTTTCTGAAGGACCACCATGACATGCTGCTGGAAGTGGAGCGGGACAAAGCCATCACCGACAGAGTCATCCTCCTTCAGAAAGTCATCCGGGGATTCAAAGACAGGTCTAACTTTCTGAAGCTGAAGAACGCTGCCACACTGATCCAGAGGCACTGGCGGGGTCACAACTGTAGGAAGAACTACGGGCTGATGCGTCTGGGCTTCCTGCGGCTGCAGGCCCTGCACCGCTCCCGGAAGCTGCACCAGCAGTACCGCCTGGCCCGCCAGCGCATCATCCAGTTCCAGGCCCGCTGCCGCGCCTATCTGGTGCGCAAGGCCTTCCGCCACCGCCTCTGGGCTGTGCTCACCGTGCAGGCCTATGCCCGGGGCATGATCGCCCGCAGGCTGCACCAACGCCTCAGGGCTGAGGTAAGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTAACGGAGACCAATTGAAACTGGGCTTGTCGAGACAGAGAAGACTCTTGCGTTTCAGCGCTAGCCCCCGGGTGCGCGGCGTCGGTGGTGCCGGCGGGGGGCGCCAGGTCGCAGGCGGTGTAGGGCTCCAGGCAGGCGGCGAAGGCCATGACGTGCGCTATGAAGGTCTGCTCCTGCACGCCGTGAACCAGGTGCGCCTGCGGGCCGCGCGCGAACACCGCCACGTCCTCGCCTGCGTGGGTCTCTTCGTCCAGGGGCACTGCTGACTGCTGCCGATACTCGGGGCTCCCGCTCTCGCTCTCGGTAACATCCGGCCGGGCGCCGTCCTTGAGCACATAGCCTGGACCGTTTCGTCGACTGTTAATTAAGCATGCTGGGGAGAGATCTGAGGAAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAG
配列番号３４は、ＣＭｖ２ハイブリッドフロントハーフベクター（すなわち、ＡＡＶ－ｓｍＣＢＡ－ｈＭＹＯ７Ａ－ＮＴ－Ｅｘ２１－ＡＰＳＤ－ＡＰヘッドＣＭｖ２）のヌクレオチド配列である：
CTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCTCAGATCTGGCGCGCCCAATTCGGTACCCTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGAGTCGCTGCGCGCTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTTGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTGAGGGGCTCCGGGAGCTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTTATTGTGCTGTCTCATCATTTTGGCAAAGAATTCTAGCGGCCGCCACCATGGTGATTCTTCAGCAGGGGGACCATGTGTGGATGGACCTGAGATTGGGGCAGGAGTTCGACGTGCCCATCGGGGCGGTGGTGAAGCTCTGCGACTCTGGGCAGGTCCAGGTGGTGGATGATGAAGACAATGAACACTGGATCTCTCCGCAGAACGCAACGCACATCAAGCCTATGCACCCCACGTCGGTCCACGGCGTGGAGGACATGATCCGCCTGGGGGACCTCAACGAGGCGGGCATCTTGCGCAACCTGCTTATCCGCTACCGGGACCACCTCATCTACACGTATACGGGCTCCATCCTGGTGGCTGTGAACCCCTACCAGCTGCTCTCCATCTACTCGCCAGAGCACATCCGCCAGTATACCAACAAGAAGATTGGGGAGATGCCCCCCCACATCTTTGCCATTGCTGACAACTGCTACTTCAACATGAAACGCAACAGCCGAGACCAGTGCTGCATCATCAGTGGGGAATCTGGGGCCGGGAAGACGGAGAGCACAAAGCTGATCCTGCAGTTCCTGGCAGCCATCAGTGGGCAGCACTCGTGGATTGAGCAGCAGGTCTTGGAGGCCACCCCCATTCTGGAAGCATTTGGGAATGCCAAGACCATCCGCAATGACAACTCAAGCCGTTTCGGAAAGTACATCGACATCCACTTCAACAAGCGGGGCGCCATCGAGGGCGCGAAGATTGAGCAGTACCTGCTGGAAAAGTCACGTGTCTGTCGCCAGGCCCTGGATGAAAGGAACTACCACGTGTTCTACTGCATGCTGGAGGGTATGAGTGAGGATCAGAAGAAGAAGCTGGGCTTGGGCCAGGCCTCTGACTACAACTACTTGGCCATGGGTAACTGCATAACCTGTGAGGGCCGGGTGGACAGCCAGGAGTACGCCAACATCCGCTCCGCCATGAAGGTGCTCATGTTCACTGACACCGAGAACTGGGAGATCTCGAAGCTCCTGGCTGCCATCCTGCACCTGGGCAACCTGCAGTATGAGGCACGCACATTTGAAAACCTGGATGCCTGTGAGGTTCTCTTCTCCCCATCGCTGGCCACAGCTGCATCCCTGCTTGAGGTGAACCCCCCAGACCTGATGAGCTGCCTGACTAGCCGCACCCTCATCACCCGCGGGGAGACGGTGTCCACCCCACTGAGCAGGGAACAGGCACTGGACGTGCGCGACGCCTTCGTAAAGGGGATCTACGGGCGGCTGTTCGTGTGGATTGTGGACAAGATCAACGCAGCAATTTACAAGCCTCCCTCCCAGGATGTGAAGAACTCTCGCAGGTCCATCGGCCTCCTGGACATCTTTGGGTTTGAGAACTTTGCTGTGAACAGCTTTGAGCAGCTCTGCATCAACTTCGCCAATGAGCACCTGCAGCAGTTCTTTGTGCGGCACGTGTTCAAGCTGGAGCAGGAGGAATATGACCTGGAGAGCATTGACTGGCTGCACATCGAGTTCACTGACAACCAGGATGCCCTGGACATGATTGCCAACAAGCCCATGAACATCATCTCCCTCATCGATGAGGAGAGCAAGTTCCCCAAGGGCACAGACACCACCATGTTACACAAGCTGAACTCCCAGCACAAGCTCAACGCCAACTACATCCCCCCCAAGAACAACCATGAGACCCAGTTTGGCATCAACCATTTTGCAGGCATCGTCTACTATGAGACCCAAGGCTTCCTGGAGAAGAACCGAGACACCCTGCATGGGGACATTATCCAGCTGGTCCACTCCTCCAGGAACAAGTTCATCAAGCAGATCTTCCAGGCCGATGTCGCCATGGGCGCCGAGACCAGGAAGCGCTCGCCCACACTTAGCAGCCAGTTCAAGCGGTCACTGGAGCTGCTGATGCGCACGCTGGGTGCCTGCCAGCCCTTCTTTGTGCGATGCATCAAGCCCAATGAGTTCAAGAAGCCCATGCTGTTCGACCGGCACCTGTGCGTGCGCCAGCTGCGGTACTCAGGAATGATGGAGACCATCCGAATCCGCCGAGCTGGCTACCCCATCCGCTACAGCTTCGTAGAGTTTGTGGAGCGGTACCGTGTGCTGCTGCCAGGTGTGAAGCCGGCCTACAAGCAGGGCGACCTCCGCGGGACTTGCCAGCGCATGGCTGAGGCTGTGCTGGGCACCCACGATGACTGGCAGATAGGCAAAACCAAGATCTTTCTGAAGGACCACCATGACATGCTGCTGGAAGTGGAGCGGGACAAAGCCATCACCGACAGAGTCATCCTCCTTCAGAAAGTCATCCGGGGATTCAAAGACAGGTCTAACTTTCTGAAGCTGAAGAACGCTGCCACACTGATCCAGAGGCACTGGCGGGGTCACAACTGTAGGAAGAACTACGGGCTGATGCGTCTGGGCTTCCTGCGGCTGCAGGCCCTGCACCGCTCCCGGAAGCTGCACCAGCAGTACCGCCTGGCCCGCCAGCGCATCATCCAGTTCCAGGCCCGCTGCCGCGCCTATCTGGTGCGCAAGGCCTTCCGCCACCGCCTCTGGGCTGTGCTCACCGTGCAGGCCTATGCCCGGGGCATGATCGCCCGCAGGCTGCACCAACGCCTCAGGGCTGAGGTAAGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTAACGGAGACCAATTGAAACTGGGCTTGTCGAGACAGAGAAGACTCTTGCGTTTCAGCGCTAGCCCCCGGGTGCGCGGCGTCGGTGGTGCCGGCGGGGGGCGCCAGGTCGCAGGCGGTGTAGGGCTCCAGGCAGGCGGCGAAGGCCATGACGTGCGCTATGAAGGTCTGCTCCTGCACGCCGTGAACCAGGTGCGCCTGCGGGCCGCGCGCGAACACCGCCACGTCCTCGCCTGCGTGGGTCTCTTCGTCCAGGGGCACTGCGCACTGCTGCCGATACTCGGGGCTCCCGCTCTCGCTCTCGGTAACATCCGGCCGGGCGCCGTCCTTGAGCACATAGCCTGGACCGTTTCGTCGACTGTTAATTAAGCATGCTGGGGAGAGATCTGTAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAG
配列番号３５は、ＣＭｖ２ハイブリッドバックハーフベクター（すなわち、ＡＡＶ－ＡＰ－ヘッド－ＡＰＳＡ－ｅｘ２２ｈＭＹＯ７Ａ－ＣＴ．ＨＡ－ＣＭｖ２）のヌクレオチド配列である：
CTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCAGATCTGGCGCGCCCAATTGGCTTCGAATTCTAGCGGCCGCCCCCGGGTGCGCGGCGTCGGTGGTGCCGGCGGGGGGCGCCAGGTCGCAGGCGGTGTAGGGCTCCAGGCAGGCGGCGAAGGCCATGACGTGCGCTATGAAGGTCTGCTCCTGCACGCCGTGAACCAGGTGCGCCTGCGGGCCGCGCGCGAACACCGCCACGTCCTCGCCTGCGTGGGTCTCTTCGTCCAGGGGCACTGCGCACTGCTGCCGATACTCGGGGCTCCCGCTCTCGCTCTCGGTAACATCCGGCCGGGCGCCGTCCTTGAGCACATAGCCTGGACCGTTTCTCTTAAGCGACGCATGCTCGCGATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAGTATCTGTGGCGCCTCGAGGCTGAGAAAATGCGGCTGGCGGAGGAAGAGAAGCTTCGGAAGGAGATGAGCGCCAAGAAGGCCAAGGAGGAGGCCGAGCGCAAGCATCAGGAGCGCCTGGCCCAGCTGGCTCGTGAGGACGCTGAGCGGGAGCTGAAGGAGAAGGAGGCCGCTCGGCGGAAGAAGGAGCTCCTGGAGCAGATGGAAAGGGCCCGCCATGAGCCTGTCAATCACTCAGACATGGTGGACAAGATGTTTGGCTTCCTGGGGACTTCAGGTGGCCTGCCAGGCCAGGAGGGCCAGGCACCTAGTGGCTTTGAGGACCTGGAGCGAGGGCGGAGGGAGATGGTGGAGGAGGACCTGGATGCAGCCCTGCCCCTGCCTGACGAGGATGAGGAGGACCTCTCTGAGTATAAATTTGCCAAGTTCGCGGCCACCTACTTCCAGGGGACAACCACGCACTCCTACACCCGGCGGCCACTCAAACAGCCACTGCTCTACCATGACGACGAGGGTGACCAGCTGGCAGCCCTGGCGGTCTGGATCACCATCCTCCGCTTCATGGGGGACCTCCCTGAGCCCAAGTACCACACAGCCATGAGTGATGGCAGTGAGAAGATCCCTGTGATGACCAAGATTTATGAGACCCTGGGCAAGAAGACGTACAAGAGGGAGCTGCAGGCCCTGCAGGGCGAGGGCGAGGCCCAGCTCCCCGAGGGCCAGAAGAAGAGCAGTGTGAGGCACAAGCTGGTGCATTTGACTCTGAAAAAGAAGTCCAAGCTCACAGAGGAGGTGACCAAGAGGCTGCATGACGGGGAGTCCACAGTGCAGGGCAACAGCATGCTGGAGGACCGGCCCACCTCCAACCTGGAGAAGCTGCACTTCATCATCGGCAATGGCATCCTGCGGCCAGCACTCCGGGACGAGATCTACTGCCAGATCAGCAAGCAGCTGACCCACAACCCCTCCAAGAGCAGCTATGCCCGGGGCTGGATTCTCGTGTCTCTCTGCGTGGGCTGTTTCGCCCCCTCCGAGAAGTTTGTCAAGTACCTGCGGAACTTCATCCACGGGGGCCCGCCCGGCTACGCCCCGTACTGTGAGGAGCGCCTGAGAAGGACCTTTGTCAATGGGACACGGACACAGCCGCCCAGCTGGCTGGAGCTGCAGGCCACCAAGTCCAAGAAGCCAATCATGTTGCCCGTGACATTCATGGATGGGACCACCAAGACCCTGCTGACGGACTCGGCAACCACGGCCAAGGAGCTCTGCAACGCGCTGGCCGACAAGATCTCTCTCAAGGACCGGTTCGGGTTCTCCCTCTACATTGCCCTGTTTGACAAGGTGTCCTCCCTGGGCAGCGGCAGTGACCACGTCATGGACGCCATCTCCCAGTGCGAGCAGTACGCCAAGGAGCAGGGCGCCCAGGAGCGCAACGCCCCCTGGAGGCTCTTCTTCCGCAAAGAGGTCTTCACGCCCTGGCACAGCCCCTCCGAGGACAACGTGGCCACCAACCTCATCTACCAGCAGGTGGTGCGAGGAGTCAAGTTTGGGGAGTACAGGTGTGAGAAGGAGGACGACCTGGCTGAGCTGGCCTCCCAGCAGTACTTTGTAGACTATGGCTCTGAGATGATCCTGGAGCGCCTCCTGAACCTCGTGCCCACCTACATCCCCGACCGCGAGATCACGCCCCTGAAGACGCTGGAGAAGTGGGCCCAGCTGGCCATCGCCGCCCACAAGAAGGGGATTTATGCCCAGAGGAGAACTGATGCCCAGAAGGTCAAAGAGGATGTGGTCAGTTATGCCCGCTTCAAGTGGCCCTTGCTCTTCTCCAGGTTTTATGAAGCCTACAAATTCTCAGGCCCCAGTCTCCCCAAGAACGACGTCATCGTGGCCGTCAACTGGACGGGTGTGTACTTTGTGGATGAGCAGGAGCAGGTACTTCTGGAGCTGTCCTTCCCAGAGATCATGGCCGTGTCCAGCAGCAGGGGAGCGAAAACGACGGCCCCCAGCTTCACGCTGGCCACCATCAAGGGGGACGAATACACCTTCACCTCCAGCAATGCTGAGGACATTCGTGACCTGGTGGTCACCTTCCTAGAGGGGCTCCGGAAGAGATCTAAGTATGTTGTGGCCCTGCAGGATAACCCCAACCCCGCAGGCGAGGAGTCAGGCTTCCTCAGCTTTGCCAAGGGAGACCTCATCATCCTGGACCATGACACGGGCGAGCAGGTCATGAACTCGGGCTGGGCCAACGGCATCAATGAGAGGACCAAGCAGCGTGGGGACTTCCCCACCGACAGTGTGTACGTCATGCCCACTGTCACCATGCCACCGCGGGAGATTGTGGCCCTGGTCACCATGACTCCCGATCAGAGGCAGGACGTTGTCCGGCTCTTGCAGCTGCGAACGGCGGAGCCCGAGGTGCGTGCCAAGCCCTACACGCTGGAGGAGTTTTCCTATGACTACTTCAGGCCCCCACCCAAGCACACGCTGAGCCGTGTCATGGTGTCCAAGGCCCGAGGCAAGGACCGGCTGTGGAGCCACACGCGGGAACCGCTCAAGCAGGCGCTGCTCAAGAAGCTCCTGGGCAGTGAGGAGCTCTCGCAGGAGGCCTGCCTGGCCTTCATTGCTGTGCTCAAGTACATGGGCGACTACCCGTCCAAGAGGACACGCTCCGTCAACGAGCTCACCGACCAGATCTTTGAGGGTCCCCTGAAAGCCGAGCCCCTGAAGGACGAGGCATATGTGCAGATCCTGAAGCAGCTGACCGACAACCACATCAGGTACAGCGAGGAGCGGGGTTGGGAGCTGCTCTGGCTGTGCACGGGCCTTTTCCCACCCAGCAACATCCTCCTGCCCCACGTGCAGCGCTTCCTGCAGTCCCGAAAGCACTGCCCACTCGCCATCGACTGCCTGCAACGGCTCCAGAAAGCCCTGAGAAACGGGTCCCGGAAGTACCCTCCGCACCTGGTGGAGGTGGAGGCCATCCAGCACAAGACCACCCAGATTTTCCACAAAGTCTACTTCCCTGATGACACTGACGAGGCCTTCGAAGTGGAGTCCAGCACCAAGGCCAAGGACTTCTGCCAGAACATCGCCACCAGGCTGCTCCTCAAGTCCTCAGAGGGATTCAGCCTCTTTGTCAAAATTGCAGACAAGGTCATCAGCGTTCCTGAGAATGACTTCTTCTTTGACTTTGTTCGACACTTGACAGACTGGATAAAGAAAGCTCGGCCCATCAAGGACGGAATTGTGCCCTCACTCACCTACCAGGTGTTCTTCATGAAGAAGCTGTGGACCACCACGGTGCCAGGGAAGGATCCCATGGCCGATTCCATCTTCCACTATTACCAGGAGTTGCCCAAGTATCTCCGAGGCTACCACAAGTGCACGCGGGAGGAGGTGCTGCAGCTGGGGGCGCTGATCTACAGGGTCAAGTTCGAGGAGGACAAGTCCTACTTCCCCAGCATCCCCAAGCTGCTGCGGGAGCTGGTGCCCCAGGACCTTATCCGGCAGGTCTCACCTGATGACTGGAAGCGGTCCATCGTCGCCTACTTCAACAAGCACGCAGGGAAGTCCAAGGAGGAGGCCAAGCTGGCCTTCCTGAAGCTCATCTTCAAGTGGCCCACCTTTGGCTCAGCCTTCTTCGAGGTGAAGCAAACTACGGAGCCAAACTTCCCTGAGATCCTCCTAATTGCCATCAACAAGTATGGGGTCAGCCTCATCGATCCCAAAACGAAGGATATCCTCACCACTCATCCCTTCACCAAGATCTCCAACTGGAGCAGCGGCAACACCTACTTCCACATCACCATTGGGAACTTGGTGCGCGGGAGCAAACTGCTCTGCGAGACGTCACTGGGCTACAAGATGGATGACCTCCTGACTTCCTACATTAGCCAGATGCTCACAGCCATGAGCAAACAGCGGGGCTCCAGGAGCGGCAAGTACCCTTACGATGTACCGGATTACGCATGAGGTACCAAGGGCGAATTCTGCAGTCGACTAGAGCTCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGAGAGATCTGGAGGACTAGTCCGTCGACTGTTAATTAAGCATGCTGGGGAGAGATCTAGGAAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAG
配列番号３６は、ＣＭｖ１オーバーラップフロントハーフベクター（すなわち、ＡＡＶ－ｓｍＣＢＡ－ｈＭＹＯ７Ａ－ｎｏＤｉｍＮＴ－ＣＭｖ１）のヌクレオチド配列である：
CTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCTCAGATCTGGCGCGCCCAATTCGGTACCCTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGAGTCGCTGCGCGCTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTTGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTGAGGGGCTCCGGGAGCTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTTATTGTGCTGTCTCATCATTTTGGCAAAGAATTCTAGCGGCCGCCACCATGGTGATTCTTCAGCAGGGGGACCATGTGTGGATGGACCTGAGATTGGGGCAGGAGTTCGACGTGCCCATCGGGGCGGTGGTGAAGCTCTGCGACTCTGGGCAGGTCCAGGTGGTGGATGATGAAGACAATGAACACTGGATCTCTCCGCAGAACGCAACGCACATCAAGCCTATGCACCCCACGTCGGTCCACGGCGTGGAGGACATGATCCGCCTGGGGGACCTCAACGAGGCGGGCATCTTGCGCAACCTGCTTATCCGCTACCGGGACCACCTCATCTACACGTATACGGGCTCCATCCTGGTGGCTGTGAACCCCTACCAGCTGCTCTCCATCTACTCGCCAGAGCACATCCGCCAGTATACCAACAAGAAGATTGGGGAGATGCCCCCCCACATCTTTGCCATTGCTGACAACTGCTACTTCAACATGAAACGCAACAGCCGAGACCAGTGCTGCATCATCAGTGGGGAATCTGGGGCCGGGAAGACGGAGAGCACAAAGCTGATCCTGCAGTTCCTGGCAGCCATCAGTGGGCAGCACTCGTGGATTGAGCAGCAGGTCTTGGAGGCCACCCCCATTCTGGAAGCATTTGGGAATGCCAAGACCATCCGCAATGACAACTCAAGCCGTTTCGGAAAGTACATCGACATCCACTTCAACAAGCGGGGCGCCATCGAGGGCGCGAAGATTGAGCAGTACCTGCTGGAAAAGTCACGTGTCTGTCGCCAGGCCCTGGATGAAAGGAACTACCACGTGTTCTACTGCATGCTGGAGGGTATGAGTGAGGATCAGAAGAAGAAGCTGGGCTTGGGCCAGGCCTCTGACTACAACTACTTGGCCATGGGTAACTGCATAACCTGTGAGGGCCGGGTGGACAGCCAGGAGTACGCCAACATCCGCTCCGCCATGAAGGTGCTCATGTTCACTGACACCGAGAACTGGGAGATCTCGAAGCTCCTGGCTGCCATCCTGCACCTGGGCAACCTGCAGTATGAGGCACGCACATTTGAAAACCTGGATGCCTGTGAGGTTCTCTTCTCCCCATCGCTGGCCACAGCTGCATCCCTGCTTGAGGTGAACCCCCCAGACCTGATGAGCTGCCTGACTAGCCGCACCCTCATCACCCGCGGGGAGACGGTGTCCACCCCACTGAGCAGGGAACAGGCACTGGACGTGCGCGACGCCTTCGTAAAGGGGATCTACGGGCGGCTGTTCGTGTGGATTGTGGACAAGATCAACGCAGCAATTTACAAGCCTCCCTCCCAGGATGTGAAGAACTCTCGCAGGTCCATCGGCCTCCTGGACATCTTTGGGTTTGAGAACTTTGCTGTGAACAGCTTTGAGCAGCTCTGCATCAACTTCGCCAATGAGCACCTGCAGCAGTTCTTTGTGCGGCACGTGTTCAAGCTGGAGCAGGAGGAATATGACCTGGAGAGCATTGACTGGCTGCACATCGAGTTCACTGACAACCAGGATGCCCTGGACATGATTGCCAACAAGCCCATGAACATCATCTCCCTCATCGATGAGGAGAGCAAGTTCCCCAAGGGCACAGACACCACCATGTTACACAAGCTGAACTCCCAGCACAAGCTCAACGCCAACTACATCCCCCCCAAGAACAACCATGAGACCCAGTTTGGCATCAACCATTTTGCAGGCATCGTCTACTATGAGACCCAAGGCTTCCTGGAGAAGAACCGAGACACCCTGCATGGGGACATTATCCAGCTGGTCCACTCCTCCAGGAACAAGTTCATCAAGCAGATCTTCCAGGCCGATGTCGCCATGGGCGCCGAGACCAGGAAGCGCTCGCCCACACTTAGCAGCCAGTTCAAGCGGTCACTGGAGCTGCTGATGCGCACGCTGGGTGCCTGCCAGCCCTTCTTTGTGCGATGCATCAAGCCCAATGAGTTCAAGAAGCCCATGCTGTTCGACCGGCACCTGTGCGTGCGCCAGCTGCGGTACTCAGGAATGATGGAGACCATCCGAATCCGCCGAGCTGGCTACCCCATCCGCTACAGCTTCGTAGAGTTTGTGGAGCGGTACCGTGTGCTGCTGCCAGGTGTGAAGCCGGCCTACAAGCAGGGCGACCTCCGCGGGACTTGCCAGCGCATGGCTGAGGCTGTGCTGGGCACCCACGATGACTGGCAGATAGGCAAAACCAAGATCTTTCTGAAGGACCACCATGACATGCTGCTGGAAGTGGAGCGGGACAAAGCCATCACCGACAGAGTCATCCTCCTTCAGAAAGTCATCCGGGGATTCAAAGACAGGTCTAACTTTCTGAAGCTGAAGAACGCTGCCACACTGATCCAGAGGCACTGGCGGGGTCACAACTGTAGGAAGAACTACGGGCTGATGCGTCTGGGCTTCCTGCGGCTGCAGGCCCTGCACCGCTCCCGGAAGCTGCACCAGCAGTACCGCCTGGCCCGCCAGCGCATCATCCAGTTCCAGGCCCGCTGCCGCGCCTATCTGGTGCGCAAGGCCTTCCGCCACCGCCTCTGGGCTGTGCTCACCGTGCAGGCCTATGCCCGGGGCATGATCGCCCGCAGGCTGCACCAACGCCTCAGGGCTGAGTATCTGTGGCGCCTCGAGGCTGAGAAAATGCGGCTGGCGGAGGAAGAGAAGCTTAGAGGATCCTCCCGTCGACTGTTTAAGCATGCTGGGGAGAGATCTGAGGAAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAG
配列番号６２（配列番号３６（ＡＡＶ－ｓｍＣＢＡ－ｈＭＹＯ７Ａ－ｎｏＤｉｍＮＴ－ＣＭｖ１）のＮ－ミオシン７Ａ部分によってコードされるペプチド）
MVILQQGDHVWMDLRLGQEFDVPIGAVVKLCDSGQVQVVDDEDNEHWISPQNATHIKPMHPTSVHGVEDMIRLGDLNEAGILRNLLIRYRDHLIYTYTGSILVAVNPYQLLSIYSPEHIRQYTNKKIGEMPPHIFAIADNCYFNMKRNSRDQCCIISGESGAGKTESTKLILQFLAAISGQHSWIEQQVLEATPILEAFGNAKTIRNDNSSRFGKYIDIHFNKRGAIEGAKIEQYLLEKSRVCRQALDERNYHVFYCMLEGMSEDQKKKLGLGQASDYNYLAMGNCITCEGRVDSQEYANIRSAMKVLMFTDTENWEISKLLAAILHLGNLQYEARTFENLDACEVLFSPSLATAASLLEVNPPDLMSCLTSRTLITRGETVSTPLSREQALDVRDAFVKGIYGRLFVWIVDKINAAIYKPPSQDVKNSRRSIGLLDIFGFENFAVNSFEQLCINFANEHLQQFFVRHVFKLEQEEYDLESIDWLHIEFTDNQDALDMIANKPMNIISLIDEESKFPKGTDTTMLHKLNSQHKLNANYIPPKNNHETQFGINHFAGIVYYETQGFLEKNRDTLHGDIIQLVHSSRNKFIKQIFQADVAMGAETRKRSPTLSSQFKRSLELLMRTLGACQPFFVRCIKPNEFKKPMLFDRHLCVRQLRYSGMMETIRIRRAGYPIRYSFVEFVERYRVLLPGVKPAYKQGDLRGTCQRMAEAVLGTHDDWQIGKTKIFLKDHHDMLLEVERDKAITDRVILLQKVIRGFKDRSNFLKLKNAATLIQRHWRGHNCRKNYGLMRLGFLRLQALHRSRKLHQQYRLARQRIIQFQARCRAYLVRKAFRHRLWAVLTVQAYARGMIARRLHQRLRAEYLWRLEAEKMRLAEEEKL
配列番号６３（配列番号３６（ＡＡＶ－ｓｍＣＢＡ－ｈＭＹＯ７Ａ－ｎｏＤｉｍＮＴ－ＣＭｖ１）のＮ－ミオシン７Ａ部分のみ）
ATGGTGATTCTTCAGCAGGGGGACCATGTGTGGATGGACCTGAGATTGGGGCAGGAGTTCGACGTGCCCATCGGGGCGGTGGTGAAGCTCTGCGACTCTGGGCAGGTCCAGGTGGTGGATGATGAAGACAATGAACACTGGATCTCTCCGCAGAACGCAACGCACATCAAGCCTATGCACCCCACGTCGGTCCACGGCGTGGAGGACATGATCCGCCTGGGGGACCTCAACGAGGCGGGCATCTTGCGCAACCTGCTTATCCGCTACCGGGACCACCTCATCTACACGTATACGGGCTCCATCCTGGTGGCTGTGAACCCCTACCAGCTGCTCTCCATCTACTCGCCAGAGCACATCCGCCAGTATACCAACAAGAAGATTGGGGAGATGCCCCCCCACATCTTTGCCATTGCTGACAACTGCTACTTCAACATGAAACGCAACAGCCGAGACCAGTGCTGCATCATCAGTGGGGAATCTGGGGCCGGGAAGACGGAGAGCACAAAGCTGATCCTGCAGTTCCTGGCAGCCATCAGTGGGCAGCACTCGTGGATTGAGCAGCAGGTCTTGGAGGCCACCCCCATTCTGGAAGCATTTGGGAATGCCAAGACCATCCGCAATGACAACTCAAGCCGTTTCGGAAAGTACATCGACATCCACTTCAACAAGCGGGGCGCCATCGAGGGCGCGAAGATTGAGCAGTACCTGCTGGAAAAGTCACGTGTCTGTCGCCAGGCCCTGGATGAAAGGAACTACCACGTGTTCTACTGCATGCTGGAGGGTATGAGTGAGGATCAGAAGAAGAAGCTGGGCTTGGGCCAGGCCTCTGACTACAACTACTTGGCCATGGGTAACTGCATAACCTGTGAGGGCCGGGTGGACAGCCAGGAGTACGCCAACATCCGCTCCGCCATGAAGGTGCTCATGTTCACTGACACCGAGAACTGGGAGATCTCGAAGCTCCTGGCTGCCATCCTGCACCTGGGCAACCTGCAGTATGAGGCACGCACATTTGAAAACCTGGATGCCTGTGAGGTTCTCTTCTCCCCATCGCTGGCCACAGCTGCATCCCTGCTTGAGGTGAACCCCCCAGACCTGATGAGCTGCCTGACTAGCCGCACCCTCATCACCCGCGGGGAGACGGTGTCCACCCCACTGAGCAGGGAACAGGCACTGGACGTGCGCGACGCCTTCGTAAAGGGGATCTACGGGCGGCTGTTCGTGTGGATTGTGGACAAGATCAACGCAGCAATTTACAAGCCTCCCTCCCAGGATGTGAAGAACTCTCGCAGGTCCATCGGCCTCCTGGACATCTTTGGGTTTGAGAACTTTGCTGTGAACAGCTTTGAGCAGCTCTGCATCAACTTCGCCAATGAGCACCTGCAGCAGTTCTTTGTGCGGCACGTGTTCAAGCTGGAGCAGGAGGAATATGACCTGGAGAGCATTGACTGGCTGCACATCGAGTTCACTGACAACCAGGATGCCCTGGACATGATTGCCAACAAGCCCATGAACATCATCTCCCTCATCGATGAGGAGAGCAAGTTCCCCAAGGGCACAGACACCACCATGTTACACAAGCTGAACTCCCAGCACAAGCTCAACGCCAACTACATCCCCCCCAAGAACAACCATGAGACCCAGTTTGGCATCAACCATTTTGCAGGCATCGTCTACTATGAGACCCAAGGCTTCCTGGAGAAGAACCGAGACACCCTGCATGGGGACATTATCCAGCTGGTCCACTCCTCCAGGAACAAGTTCATCAAGCAGATCTTCCAGGCCGATGTCGCCATGGGCGCCGAGACCAGGAAGCGCTCGCCCACACTTAGCAGCCAGTTCAAGCGGTCACTGGAGCTGCTGATGCGCACGCTGGGTGCCTGCCAGCCCTTCTTTGTGCGATGCATCAAGCCCAATGAGTTCAAGAAGCCCATGCTGTTCGACCGGCACCTGTGCGTGCGCCAGCTGCGGTACTCAGGAATGATGGAGACCATCCGAATCCGCCGAGCTGGCTACCCCATCCGCTACAGCTTCGTAGAGTTTGTGGAGCGGTACCGTGTGCTGCTGCCAGGTGTGAAGCCGGCCTACAAGCAGGGCGACCTCCGCGGGACTTGCCAGCGCATGGCTGAGGCTGTGCTGGGCACCCACGATGACTGGCAGATAGGCAAAACCAAGATCTTTCTGAAGGACCACCATGACATGCTGCTGGAAGTGGAGCGGGACAAAGCCATCACCGACAGAGTCATCCTCCTTCAGAAAGTCATCCGGGGATTCAAAGACAGGTCTAACTTTCTGAAGCTGAAGAACGCTGCCACACTGATCCAGAGGCACTGGCGGGGTCACAACTGTAGGAAGAACTACGGGCTGATGCGTCTGGGCTTCCTGCGGCTGCAGGCCCTGCACCGCTCCCGGAAGCTGCACCAGCAGTACCGCCTGGCCCGCCAGCGCATCATCCAGTTCCAGGCCCGCTGCCGCGCCTATCTGGTGCGCAAGGCCTTCCGCCACCGCCTCTGGGCTGTGCTCACCGTGCAGGCCTATGCCCGGGGCATGATCGCCCGCAGGCTGCACCAACGCCTCAGGGCTGAGTATCTGTGGCGCCTCGAGGCTGAGAAAATGCGGCTGGCGGAGGAAGAGAAGCTT
配列番号３７は、第２世代オーバーラップフロントハーフベクター（すなわち、ＡＡＶ－ｓｍＣＢＡ－ｈＭＹＯ７Ａ－ｎｏＤＩＭ－ＮＴｌｏｎｇ）のヌクレオチド配列である：
CTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCTCAGATCTGGCGCGCCCAATTCGGTACCCTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGAGTCGCTGCGCGCTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTTGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTGAGGGGCTCCGGGAGCTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTTATTGTGCTGTCTCATCATTTTGGCAAAGAATTCTAGCGGCCGCCACCATGGTGATTCTTCAGCAGGGGGACCATGTGTGGATGGACCTGAGATTGGGGCAGGAGTTCGACGTGCCCATCGGGGCGGTGGTGAAGCTCTGCGACTCTGGGCAGGTCCAGGTGGTGGATGATGAAGACAATGAACACTGGATCTCTCCGCAGAACGCAACGCACATCAAGCCTATGCACCCCACGTCGGTCCACGGCGTGGAGGACATGATCCGCCTGGGGGACCTCAACGAGGCGGGCATCTTGCGCAACCTGCTTATCCGCTACCGGGACCACCTCATCTACACGTATACGGGCTCCATCCTGGTGGCTGTGAACCCCTACCAGCTGCTCTCCATCTACTCGCCAGAGCACATCCGCCAGTATACCAACAAGAAGATTGGGGAGATGCCCCCCCACATCTTTGCCATTGCTGACAACTGCTACTTCAACATGAAACGCAACAGCCGAGACCAGTGCTGCATCATCAGTGGGGAATCTGGGGCCGGGAAGACGGAGAGCACAAAGCTGATCCTGCAGTTCCTGGCAGCCATCAGTGGGCAGCACTCGTGGATTGAGCAGCAGGTCTTGGAGGCCACCCCCATTCTGGAAGCATTTGGGAATGCCAAGACCATCCGCAATGACAACTCAAGCCGTTTCGGAAAGTACATCGACATCCACTTCAACAAGCGGGGCGCCATCGAGGGCGCGAAGATTGAGCAGTACCTGCTGGAAAAGTCACGTGTCTGTCGCCAGGCCCTGGATGAAAGGAACTACCACGTGTTCTACTGCATGCTGGAGGGTATGAGTGAGGATCAGAAGAAGAAGCTGGGCTTGGGCCAGGCCTCTGACTACAACTACTTGGCCATGGGTAACTGCATAACCTGTGAGGGCCGGGTGGACAGCCAGGAGTACGCCAACATCCGCTCCGCCATGAAGGTGCTCATGTTCACTGACACCGAGAACTGGGAGATCTCGAAGCTCCTGGCTGCCATCCTGCACCTGGGCAACCTGCAGTATGAGGCACGCACATTTGAAAACCTGGATGCCTGTGAGGTTCTCTTCTCCCCATCGCTGGCCACAGCTGCATCCCTGCTTGAGGTGAACCCCCCAGACCTGATGAGCTGCCTGACTAGCCGCACCCTCATCACCCGCGGGGAGACGGTGTCCACCCCACTGAGCAGGGAACAGGCACTGGACGTGCGCGACGCCTTCGTAAAGGGGATCTACGGGCGGCTGTTCGTGTGGATTGTGGACAAGATCAACGCAGCAATTTACAAGCCTCCCTCCCAGGATGTGAAGAACTCTCGCAGGTCCATCGGCCTCCTGGACATCTTTGGGTTTGAGAACTTTGCTGTGAACAGCTTTGAGCAGCTCTGCATCAACTTCGCCAATGAGCACCTGCAGCAGTTCTTTGTGCGGCACGTGTTCAAGCTGGAGCAGGAGGAATATGACCTGGAGAGCATTGACTGGCTGCACATCGAGTTCACTGACAACCAGGATGCCCTGGACATGATTGCCAACAAGCCCATGAACATCATCTCCCTCATCGATGAGGAGAGCAAGTTCCCCAAGGGCACAGACACCACCATGTTACACAAGCTGAACTCCCAGCACAAGCTCAACGCCAACTACATCCCCCCCAAGAACAACCATGAGACCCAGTTTGGCATCAACCATTTTGCAGGCATCGTCTACTATGAGACCCAAGGCTTCCTGGAGAAGAACCGAGACACCCTGCATGGGGACATTATCCAGCTGGTCCACTCCTCCAGGAACAAGTTCATCAAGCAGATCTTCCAGGCCGATGTCGCCATGGGCGCCGAGACCAGGAAGCGCTCGCCCACACTTAGCAGCCAGTTCAAGCGGTCACTGGAGCTGCTGATGCGCACGCTGGGTGCCTGCCAGCCCTTCTTTGTGCGATGCATCAAGCCCAATGAGTTCAAGAAGCCCATGCTGTTCGACCGGCACCTGTGCGTGCGCCAGCTGCGGTACTCAGGAATGATGGAGACCATCCGAATCCGCCGAGCTGGCTACCCCATCCGCTACAGCTTCGTAGAGTTTGTGGAGCGGTACCGTGTGCTGCTGCCAGGTGTGAAGCCGGCCTACAAGCAGGGCGACCTCCGCGGGACTTGCCAGCGCATGGCTGAGGCTGTGCTGGGCACCCACGATGACTGGCAGATAGGCAAAACCAAGATCTTTCTGAAGGACCACCATGACATGCTGCTGGAAGTGGAGCGGGACAAAGCCATCACCGACAGAGTCATCCTCCTTCAGAAAGTCATCCGGGGATTCAAAGACAGGTCTAACTTTCTGAAGCTGAAGAACGCTGCCACACTGATCCAGAGGCACTGGCGGGGTCACAACTGTAGGAAGAACTACGGGCTGATGCGTCTGGGCTTCCTGCGGCTGCAGGCCCTGCACCGCTCCCGGAAGCTGCACCAGCAGTACCGCCTGGCCCGCCAGCGCATCATCCAGTTCCAGGCCCGCTGCCGCGCCTATCTGGTGCGCAAGGCCTTCCGCCACCGCCTCTGGGCTGTGCTCACCGTGCAGGCCTATGCCCGGGGCATGATCGCCCGCAGGCTGCACCAACGCCTCAGGGCTGAGTATCTGTGGCGCCTCGAGGCTGAGAAAATGCGGCTGGCGGAGGAAGAGAAGCTTTGAAAGTGACATTAGGCTCCCGTCGACTGTTAATTAAGCATGCTGGGGAGAGATCTGAGGAAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAG
配列番号９０（配列番号３７（ＡＡＶ－ｓｍＣＢＡ－ｈＭＹＯ７Ａ－ｎｏＤＩＭ－ＮＴｌｏｎｇ）のＮ－ミオシン７Ａ部分のみ）
ATGGTGATTCTTCAGCAGGGGGACCATGTGTGGATGGACCTGAGATTGGGGCAGGAGTTCGACGTGCCCATCGGGGCGGTGGTGAAGCTCTGCGACTCTGGGCAGGTCCAGGTGGTGGATGATGAAGACAATGAACACTGGATCTCTCCGCAGAACGCAACGCACATCAAGCCTATGCACCCCACGTCGGTCCACGGCGTGGAGGACATGATCCGCCTGGGGGACCTCAACGAGGCGGGCATCTTGCGCAACCTGCTTATCCGCTACCGGGACCACCTCATCTACACGTATACGGGCTCCATCCTGGTGGCTGTGAACCCCTACCAGCTGCTCTCCATCTACTCGCCAGAGCACATCCGCCAGTATACCAACAAGAAGATTGGGGAGATGCCCCCCCACATCTTTGCCATTGCTGACAACTGCTACTTCAACATGAAACGCAACAGCCGAGACCAGTGCTGCATCATCAGTGGGGAATCTGGGGCCGGGAAGACGGAGAGCACAAAGCTGATCCTGCAGTTCCTGGCAGCCATCAGTGGGCAGCACTCGTGGATTGAGCAGCAGGTCTTGGAGGCCACCCCCATTCTGGAAGCATTTGGGAATGCCAAGACCATCCGCAATGACAACTCAAGCCGTTTCGGAAAGTACATCGACATCCACTTCAACAAGCGGGGCGCCATCGAGGGCGCGAAGATTGAGCAGTACCTGCTGGAAAAGTCACGTGTCTGTCGCCAGGCCCTGGATGAAAGGAACTACCACGTGTTCTACTGCATGCTGGAGGGTATGAGTGAGGATCAGAAGAAGAAGCTGGGCTTGGGCCAGGCCTCTGACTACAACTACTTGGCCATGGGTAACTGCATAACCTGTGAGGGCCGGGTGGACAGCCAGGAGTACGCCAACATCCGCTCCGCCATGAAGGTGCTCATGTTCACTGACACCGAGAACTGGGAGATCTCGAAGCTCCTGGCTGCCATCCTGCACCTGGGCAACCTGCAGTATGAGGCACGCACATTTGAAAACCTGGATGCCTGTGAGGTTCTCTTCTCCCCATCGCTGGCCACAGCTGCATCCCTGCTTGAGGTGAACCCCCCAGACCTGATGAGCTGCCTGACTAGCCGCACCCTCATCACCCGCGGGGAGACGGTGTCCACCCCACTGAGCAGGGAACAGGCACTGGACGTGCGCGACGCCTTCGTAAAGGGGATCTACGGGCGGCTGTTCGTGTGGATTGTGGACAAGATCAACGCAGCAATTTACAAGCCTCCCTCCCAGGATGTGAAGAACTCTCGCAGGTCCATCGGCCTCCTGGACATCTTTGGGTTTGAGAACTTTGCTGTGAACAGCTTTGAGCAGCTCTGCATCAACTTCGCCAATGAGCACCTGCAGCAGTTCTTTGTGCGGCACGTGTTCAAGCTGGAGCAGGAGGAATATGACCTGGAGAGCATTGACTGGCTGCACATCGAGTTCACTGACAACCAGGATGCCCTGGACATGATTGCCAACAAGCCCATGAACATCATCTCCCTCATCGATGAGGAGAGCAAGTTCCCCAAGGGCACAGACACCACCATGTTACACAAGCTGAACTCCCAGCACAAGCTCAACGCCAACTACATCCCCCCCAAGAACAACCATGAGACCCAGTTTGGCATCAACCATTTTGCAGGCATCGTCTACTATGAGACCCAAGGCTTCCTGGAGAAGAACCGAGACACCCTGCATGGGGACATTATCCAGCTGGTCCACTCCTCCAGGAACAAGTTCATCAAGCAGATCTTCCAGGCCGATGTCGCCATGGGCGCCGAGACCAGGAAGCGCTCGCCCACACTTAGCAGCCAGTTCAAGCGGTCACTGGAGCTGCTGATGCGCACGCTGGGTGCCTGCCAGCCCTTCTTTGTGCGATGCATCAAGCCCAATGAGTTCAAGAAGCCCATGCTGTTCGACCGGCACCTGTGCGTGCGCCAGCTGCGGTACTCAGGAATGATGGAGACCATCCGAATCCGCCGAGCTGGCTACCCCATCCGCTACAGCTTCGTAGAGTTTGTGGAGCGGTACCGTGTGCTGCTGCCAGGTGTGAAGCCGGCCTACAAGCAGGGCGACCTCCGCGGGACTTGCCAGCGCATGGCTGAGGCTGTGCTGGGCACCCACGATGACTGGCAGATAGGCAAAACCAAGATCTTTCTGAAGGACCACCATGACATGCTGCTGGAAGTGGAGCGGGACAAAGCCATCACCGACAGAGTCATCCTCCTTCAGAAAGTCATCCGGGGATTCAAAGACAGGTCTAACTTTCTGAAGCTGAAGAACGCTGCCACACTGATCCAGAGGCACTGGCGGGGTCACAACTGTAGGAAGAACTACGGGCTGATGCGTCTGGGCTTCCTGCGGCTGCAGGCCCTGCACCGCTCCCGGAAGCTGCACCAGCAGTACCGCCTGGCCCGCCAGCGCATCATCCAGTTCCAGGCCCGCTGCCGCGCCTATCTGGTGCGCAAGGCCTTCCGCCACCGCCTCTGGGCTGTGCTCACCGTGCAGGCCTATGCCCGGGGCATGATCGCCCGCAGGCTGCACCAACGCCTCAGGGCTGAGTATCTGTGGCGCCTCGAGGCTGAGAAAATGCGGCTGGCGGAGGAAGAGAAGCTT
配列番号９１（配列番号３７（ＡＡＶ－ｓｍＣＢＡ－ｈＭＹＯ７Ａ－ｎｏＤＩＭ－ＮＴｌｏｎｇ）のＮ－ミオシン７Ａ部分のみ）
MVILQQGDHVWMDLRLGQEFDVPIGAVVKLCDSGQVQVVDDEDNEHWISPQNATHIKPMHPTSVHGVEDMIRLGDLNEAGILRNLLIRYRDHLIYTYTGSILVAVNPYQLLSIYSPEHIRQYTNKKIGEMPPHIFAIADNCYFNMKRNSRDQCCIISGESGAGKTESTKLILQFLAAISGQHSWIEQQVLEATPILEAFGNAKTIRNDNSSRFGKYIDIHFNKRGAIEGAKIEQYLLEKSRVCRQALDERNYHVFYCMLEGMSEDQKKKLGLGQASDYNYLAMGNCITCEGRVDSQEYANIRSAMKVLMFTDTENWEISKLLAAILHLGNLQYEARTFENLDACEVLFSPSLATAASLLEVNPPDLMSCLTSRTLITRGETVSTPLSREQALDVRDAFVKGIYGRLFVWIVDKINAAIYKPPSQDVKNSRRSIGLLDIFGFENFAVNSFEQLCINFANEHLQQFFVRHVFKLEQEEYDLESIDWLHIEFTDNQDALDMIANKPMNIISLIDEESKFPKGTDTTMLHKLNSQHKLNANYIPPKNNHETQFGINHFAGIVYYETQGFLEKNRDTLHGDIIQLVHSSRNKFIKQIFQADVAMGAETRKRSPTLSSQFKRSLELLMRTLGACQPFFVRCIKPNEFKKPMLFDRHLCVRQLRYSGMMETIRIRRAGYPIRYSFVEFVERYRVLLPGVKPAYKQGDLRGTCQRMAEAVLGTHDDWQIGKTKIFLKDHHDMLLEVERDKAITDRVILLQKVIRGFKDRSNFLKLKNAATLIQRHWRGHNCRKNYGLMRLGFLRLQALHRSRKLHQQYRLARQRIIQFQARCRAYLVRKAFRHRLWAVLTVQAYARGMIARRLHQRLRAEYLWRLEAEKMRLAEEEKL
配列番号３８は、第２世代オーバーラップバックハーフベクター（すなわち、ＡＡＶ－ｈＭＹＯ７Ａ－ＣＴｌｏｎｇ－ｖ２．ＨＡ）のヌクレオチド配列である。
CTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCAGATCTGGCGCGCCGGATCCGGGCTGATGCGTCTGGGCTTCCTGCGGCTGCAGGCCCTGCACCGCTCCCGGAAGCTGCACCAGCAGTACCGCCTGGCCCGCCAGCGCATCATCCAGTTCCAGGCCCGCTGCCGCGCCTATCTGGTGCGCAAGGCCTTCCGCCACCGCCTCTGGGCTGTGCTCACCGTGCAGGCCTATGCCCGGGGCATGATCGCCCGCAGGCTGCACCAACGCCTCAGGGCTGAGTATCTGTGGCGCCTCGAGGCTGAGAAAATGCGGCTGGCGGAGGAAGAGAAGCTTCGGAAGGAGATGAGCGCCAAGAAGGCCAAGGAGGAGGCCGAGCGCAAGCATCAGGAGCGCCTGGCCCAGCTGGCTCGTGAGGACGCTGAGCGGGAGCTGAAGGAGAAGGAGGCCGCTCGGCGGAAGAAGGAGCTCCTGGAGCAGATGGAAAGGGCCCGCCATGAGCCTGTCAATCACTCAGACATGGTGGACAAGATGTTTGGCTTCCTGGGGACTTCAGGTGGCCTGCCAGGCCAGGAGGGCCAGGCACCTAGTGGCTTTGAGGACCTGGAGCGAGGGCGGAGGGAGATGGTGGAGGAGGACCTGGATGCAGCCCTGCCCCTGCCTGACGAGGATGAGGAGGACCTCTCTGAGTATAAATTTGCCAAGTTCGCGGCCACCTACTTCCAGGGGACAACCACGCACTCCTACACCCGGCGGCCACTCAAACAGCCACTGCTCTACCATGACGACGAGGGTGACCAGCTGGCAGCCCTGGCGGTCTGGATCACCATCCTCCGCTTCATGGGGGACCTCCCTGAGCCCAAGTACCACACAGCCATGAGTGATGGCAGTGAGAAGATCCCTGTGATGACCAAGATTTATGAGACCCTGGGCAAGAAGACGTACAAGAGGGAGCTGCAGGCCCTGCAGGGCGAGGGCGAGGCCCAGCTCCCCGAGGGCCAGAAGAAGAGCAGTGTGAGGCACAAGCTGGTGCATTTGACTCTGAAAAAGAAGTCCAAGCTCACAGAGGAGGTGACCAAGAGGCTGCATGACGGGGAGTCCACAGTGCAGGGCAACAGCATGCTGGAGGACCGGCCCACCTCCAACCTGGAGAAGCTGCACTTCATCATCGGCAATGGCATCCTGCGGCCAGCACTCCGGGACGAGATCTACTGCCAGATCAGCAAGCAGCTGACCCACAACCCCTCCAAGAGCAGCTATGCCCGGGGCTGGATTCTCGTGTCTCTCTGCGTGGGCTGTTTCGCCCCCTCCGAGAAGTTTGTCAAGTACCTGCGGAACTTCATCCACGGGGGCCCGCCCGGCTACGCCCCGTACTGTGAGGAGCGCCTGAGAAGGACCTTTGTCAATGGGACACGGACACAGCCGCCCAGCTGGCTGGAGCTGCAGGCCACCAAGTCCAAGAAGCCAATCATGTTGCCCGTGACATTCATGGATGGGACCACCAAGACCCTGCTGACGGACTCGGCAACCACGGCCAAGGAGCTCTGCAACGCGCTGGCCGACAAGATCTCTCTCAAGGACCGGTTCGGGTTCTCCCTCTACATTGCCCTGTTTGACAAGGTGTCCTCCCTGGGCAGCGGCAGTGACCACGTCATGGACGCCATCTCCCAGTGCGAGCAGTACGCCAAGGAGCAGGGCGCCCAGGAGCGCAACGCCCCCTGGAGGCTCTTCTTCCGCAAAGAGGTCTTCACGCCCTGGCACAGCCCCTCCGAGGACAACGTGGCCACCAACCTCATCTACCAGCAGGTGGTGCGAGGAGTCAAGTTTGGGGAGTACAGGTGTGAGAAGGAGGACGACCTGGCTGAGCTGGCCTCCCAGCAGTACTTTGTAGACTATGGCTCTGAGATGATCCTGGAGCGCCTCCTGAACCTCGTGCCCACCTACATCCCCGACCGCGAGATCACGCCCCTGAAGACGCTGGAGAAGTGGGCCCAGCTGGCCATCGCCGCCCACAAGAAGGGGATTTATGCCCAGAGGAGAACTGATGCCCAGAAGGTCAAAGAGGATGTGGTCAGTTATGCCCGCTTCAAGTGGCCCTTGCTCTTCTCCAGGTTTTATGAAGCCTACAAATTCTCAGGCCCCAGTCTCCCCAAGAACGACGTCATCGTGGCCGTCAACTGGACGGGTGTGTACTTTGTGGATGAGCAGGAGCAGGTACTTCTGGAGCTGTCCTTCCCAGAGATCATGGCCGTGTCCAGCAGCAGGGGAGCGAAAACGACGGCCCCCAGCTTCACGCTGGCCACCATCAAGGGGGACGAATACACCTTCACCTCCAGCAATGCTGAGGACATTCGTGACCTGGTGGTCACCTTCCTAGAGGGGCTCCGGAAGAGATCTAAGTATGTTGTGGCCCTGCAGGATAACCCCAACCCCGCAGGCGAGGAGTCAGGCTTCCTCAGCTTTGCCAAGGGAGACCTCATCATCCTGGACCATGACACGGGCGAGCAGGTCATGAACTCGGGCTGGGCCAACGGCATCAATGAGAGGACCAAGCAGCGTGGGGACTTCCCCACCGACAGTGTGTACGTCATGCCCACTGTCACCATGCCACCGCGGGAGATTGTGGCCCTGGTCACCATGACTCCCGATCAGAGGCAGGACGTTGTCCGGCTCTTGCAGCTGCGAACGGCGGAGCCCGAGGTGCGTGCCAAGCCCTACACGCTGGAGGAGTTTTCCTATGACTACTTCAGGCCCCCACCCAAGCACACGCTGAGCCGTGTCATGGTGTCCAAGGCCCGAGGCAAGGACCGGCTGTGGAGCCACACGCGGGAACCGCTCAAGCAGGCGCTGCTCAAGAAGCTCCTGGGCAGTGAGGAGCTCTCGCAGGAGGCCTGCCTGGCCTTCATTGCTGTGCTCAAGTACATGGGCGACTACCCGTCCAAGAGGACACGCTCCGTCAACGAGCTCACCGACCAGATCTTTGAGGGTCCCCTGAAAGCCGAGCCCCTGAAGGACGAGGCATATGTGCAGATCCTGAAGCAGCTGACCGACAACCACATCAGGTACAGCGAGGAGCGGGGTTGGGAGCTGCTCTGGCTGTGCACGGGCCTTTTCCCACCCAGCAACATCCTCCTGCCCCACGTGCAGCGCTTCCTGCAGTCCCGAAAGCACTGCCCACTCGCCATCGACTGCCTGCAACGGCTCCAGAAAGCCCTGAGAAACGGGTCCCGGAAGTACCCTCCGCACCTGGTGGAGGTGGAGGCCATCCAGCACAAGACCACCCAGATTTTCCACAAAGTCTACTTCCCTGATGACACTGACGAGGCCTTCGAAGTGGAGTCCAGCACCAAGGCCAAGGACTTCTGCCAGAACATCGCCACCAGGCTGCTCCTCAAGTCCTCAGAGGGATTCAGCCTCTTTGTCAAAATTGCAGACAAGGTCATCAGCGTTCCTGAGAATGACTTCTTCTTTGACTTTGTTCGACACTTGACAGACTGGATAAAGAAAGCTCGGCCCATCAAGGACGGAATTGTGCCCTCACTCACCTACCAGGTGTTCTTCATGAAGAAGCTGTGGACCACCACGGTGCCAGGGAAGGATCCCATGGCCGATTCCATCTTCCACTATTACCAGGAGTTGCCCAAGTATCTCCGAGGCTACCACAAGTGCACGCGGGAGGAGGTGCTGCAGCTGGGGGCGCTGATCTACAGGGTCAAGTTCGAGGAGGACAAGTCCTACTTCCCCAGCATCCCCAAGCTGCTGCGGGAGCTGGTGCCCCAGGACCTTATCCGGCAGGTCTCACCTGATGACTGGAAGCGGTCCATCGTCGCCTACTTCAACAAGCACGCAGGGAAGTCCAAGGAGGAGGCCAAGCTGGCCTTCCTGAAGCTCATCTTCAAGTGGCCCACCTTTGGCTCAGCCTTCTTCGAGGTGAAGCAAACTACGGAGCCAAACTTCCCTGAGATCCTCCTAATTGCCATCAACAAGTATGGGGTCAGCCTCATCGATCCCAAAACGAAGGATATCCTCACCACTCATCCCTTCACCAAGATCTCCAACTGGAGCAGCGGCAACACCTACTTCCACATCACCATTGGGAACTTGGTGCGCGGGAGCAAACTGCTCTGCGAGACGTCACTGGGCTACAAGATGGATGACCTCCTGACTTCCTACATTAGCCAGATGCTCACAGCCATGAGCAAACAGCGGGGCTCCAGGAGCGGCAAGTACCCTTACGATGTACCGGATTACGCATGAGGTACCAAGGGCGAATTCTGCAGTCGACTAGAGCTCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGAGAGATCTGAGGATCCTTAATTAAGCATGCTGGGGAGAGATCTGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAG
配列番号７７（Ｃ末端ミオシン７Ａ（例えば、ＡＡＶ－ｈＭＹＯ７Ａ－ＣＴｌｏｎｇ－ｖ２．ＨＡ））
GGGCTGATGCGTCTGGGCTTCCTGCGGCTGCAGGCCCTGCACCGCTCCCGGAAGCTGCACCAGCAGTACCGCCTGGCCCGCCAGCGCATCATCCAGTTCCAGGCCCGCTGCCGCGCCTATCTGGTGCGCAAGGCCTTCCGCCACCGCCTCTGGGCTGTGCTCACCGTGCAGGCCTATGCCCGGGGCATGATCGCCCGCAGGCTGCACCAACGCCTCAGGGCTGAGTATCTGTGGCGCCTCGAGGCTGAGAAAATGCGGCTGGCGGAGGAAGAGAAGCTTCGGAAGGAGATGAGCGCCAAGAAGGCCAAGGAGGAGGCCGAGCGCAAGCATCAGGAGCGCCTGGCCCAGCTGGCTCGTGAGGACGCTGAGCGGGAGCTGAAGGAGAAGGAGGCCGCTCGGCGGAAGAAGGAGCTCCTGGAGCAGATGGAAAGGGCCCGCCATGAGCCTGTCAATCACTCAGACATGGTGGACAAGATGTTTGGCTTCCTGGGGACTTCAGGTGGCCTGCCAGGCCAGGAGGGCCAGGCACCTAGTGGCTTTGAGGACCTGGAGCGAGGGCGGAGGGAGATGGTGGAGGAGGACCTGGATGCAGCCCTGCCCCTGCCTGACGAGGATGAGGAGGACCTCTCTGAGTATAAATTTGCCAAGTTCGCGGCCACCTACTTCCAGGGGACAACCACGCACTCCTACACCCGGCGGCCACTCAAACAGCCACTGCTCTACCATGACGACGAGGGTGACCAGCTGGCAGCCCTGGCGGTCTGGATCACCATCCTCCGCTTCATGGGGGACCTCCCTGAGCCCAAGTACCACACAGCCATGAGTGATGGCAGTGAGAAGATCCCTGTGATGACCAAGATTTATGAGACCCTGGGCAAGAAGACGTACAAGAGGGAGCTGCAGGCCCTGCAGGGCGAGGGCGAGGCCCAGCTCCCCGAGGGCCAGAAGAAGAGCAGTGTGAGGCACAAGCTGGTGCATTTGACTCTGAAAAAGAAGTCCAAGCTCACAGAGGAGGTGACCAAGAGGCTGCATGACGGGGAGTCCACAGTGCAGGGCAACAGCATGCTGGAGGACCGGCCCACCTCCAACCTGGAGAAGCTGCACTTCATCATCGGCAATGGCATCCTGCGGCCAGCACTCCGGGACGAGATCTACTGCCAGATCAGCAAGCAGCTGACCCACAACCCCTCCAAGAGCAGCTATGCCCGGGGCTGGATTCTCGTGTCTCTCTGCGTGGGCTGTTTCGCCCCCTCCGAGAAGTTTGTCAAGTACCTGCGGAACTTCATCCACGGGGGCCCGCCCGGCTACGCCCCGTACTGTGAGGAGCGCCTGAGAAGGACCTTTGTCAATGGGACACGGACACAGCCGCCCAGCTGGCTGGAGCTGCAGGCCACCAAGTCCAAGAAGCCAATCATGTTGCCCGTGACATTCATGGATGGGACCACCAAGACCCTGCTGACGGACTCGGCAACCACGGCCAAGGAGCTCTGCAACGCGCTGGCCGACAAGATCTCTCTCAAGGACCGGTTCGGGTTCTCCCTCTACATTGCCCTGTTTGACAAGGTGTCCTCCCTGGGCAGCGGCAGTGACCACGTCATGGACGCCATCTCCCAGTGCGAGCAGTACGCCAAGGAGCAGGGCGCCCAGGAGCGCAACGCCCCCTGGAGGCTCTTCTTCCGCAAAGAGGTCTTCACGCCCTGGCACAGCCCCTCCGAGGACAACGTGGCCACCAACCTCATCTACCAGCAGGTGGTGCGAGGAGTCAAGTTTGGGGAGTACAGGTGTGAGAAGGAGGACGACCTGGCTGAGCTGGCCTCCCAGCAGTACTTTGTAGACTATGGCTCTGAGATGATCCTGGAGCGCCTCCTGAACCTCGTGCCCACCTACATCCCCGACCGCGAGATCACGCCCCTGAAGACGCTGGAGAAGTGGGCCCAGCTGGCCATCGCCGCCCACAAGAAGGGGATTTATGCCCAGAGGAGAACTGATGCCCAGAAGGTCAAAGAGGATGTGGTCAGTTATGCCCGCTTCAAGTGGCCCTTGCTCTTCTCCAGGTTTTATGAAGCCTACAAATTCTCAGGCCCCAGTCTCCCCAAGAACGACGTCATCGTGGCCGTCAACTGGACGGGTGTGTACTTTGTGGATGAGCAGGAGCAGGTACTTCTGGAGCTGTCCTTCCCAGAGATCATGGCCGTGTCCAGCAGCAGGGGAGCGAAAACGACGGCCCCCAGCTTCACGCTGGCCACCATCAAGGGGGACGAATACACCTTCACCTCCAGCAATGCTGAGGACATTCGTGACCTGGTGGTCACCTTCCTAGAGGGGCTCCGGAAGAGATCTAAGTATGTTGTGGCCCTGCAGGATAACCCCAACCCCGCAGGCGAGGAGTCAGGCTTCCTCAGCTTTGCCAAGGGAGACCTCATCATCCTGGACCATGACACGGGCGAGCAGGTCATGAACTCGGGCTGGGCCAACGGCATCAATGAGAGGACCAAGCAGCGTGGGGACTTCCCCACCGACAGTGTGTACGTCATGCCCACTGTCACCATGCCACCGCGGGAGATTGTGGCCCTGGTCACCATGACTCCCGATCAGAGGCAGGACGTTGTCCGGCTCTTGCAGCTGCGAACGGCGGAGCCCGAGGTGCGTGCCAAGCCCTACACGCTGGAGGAGTTTTCCTATGACTACTTCAGGCCCCCACCCAAGCACACGCTGAGCCGTGTCATGGTGTCCAAGGCCCGAGGCAAGGACCGGCTGTGGAGCCACACGCGGGAACCGCTCAAGCAGGCGCTGCTCAAGAAGCTCCTGGGCAGTGAGGAGCTCTCGCAGGAGGCCTGCCTGGCCTTCATTGCTGTGCTCAAGTACATGGGCGACTACCCGTCCAAGAGGACACGCTCCGTCAACGAGCTCACCGACCAGATCTTTGAGGGTCCCCTGAAAGCCGAGCCCCTGAAGGACGAGGCATATGTGCAGATCCTGAAGCAGCTGACCGACAACCACATCAGGTACAGCGAGGAGCGGGGTTGGGAGCTGCTCTGGCTGTGCACGGGCCTTTTCCCACCCAGCAACATCCTCCTGCCCCACGTGCAGCGCTTCCTGCAGTCCCGAAAGCACTGCCCACTCGCCATCGACTGCCTGCAACGGCTCCAGAAAGCCCTGAGAAACGGGTCCCGGAAGTACCCTCCGCACCTGGTGGAGGTGGAGGCCATCCAGCACAAGACCACCCAGATTTTCCACAAAGTCTACTTCCCTGATGACACTGACGAGGCCTTCGAAGTGGAGTCCAGCACCAAGGCCAAGGACTTCTGCCAGAACATCGCCACCAGGCTGCTCCTCAAGTCCTCAGAGGGATTCAGCCTCTTTGTCAAAATTGCAGACAAGGTCATCAGCGTTCCTGAGAATGACTTCTTCTTTGACTTTGTTCGACACTTGACAGACTGGATAAAGAAAGCTCGGCCCATCAAGGACGGAATTGTGCCCTCACTCACCTACCAGGTGTTCTTCATGAAGAAGCTGTGGACCACCACGGTGCCAGGGAAGGATCCCATGGCCGATTCCATCTTCCACTATTACCAGGAGTTGCCCAAGTATCTCCGAGGCTACCACAAGTGCACGCGGGAGGAGGTGCTGCAGCTGGGGGCGCTGATCTACAGGGTCAAGTTCGAGGAGGACAAGTCCTACTTCCCCAGCATCCCCAAGCTGCTGCGGGAGCTGGTGCCCCAGGACCTTATCCGGCAGGTCTCACCTGATGACTGGAAGCGGTCCATCGTCGCCTACTTCAACAAGCACGCAGGGAAGTCCAAGGAGGAGGCCAAGCTGGCCTTCCTGAAGCTCATCTTCAAGTGGCCCACCTTTGGCTCAGCCTTCTTCGAGGTGAAGCAAACTACGGAGCCAAACTTCCCTGAGATCCTCCTAATTGCCATCAACAAGTATGGGGTCAGCCTCATCGATCCCAAAACGAAGGATATCCTCACCACTCATCCCTTCACCAAGATCTCCAACTGGAGCAGCGGCAACACCTACTTCCACATCACCATTGGGAACTTGGTGCGCGGGAGCAAACTGCTCTGCGAGACGTCACTGGGCTACAAGATGGATGACCTCCTGACTTCCTACATTAGCCAGATGCTCACAGCCATGAGCAAACAGCGGGGCTCCAGGAGCGGCAAG
配列番号７８（Ｎ末端ミオシン７Ａ（例えば、ＡＡＶ－ｈＭＹＯ７Ａ－ＣＴｌｏｎｇ．ＨＡ）
GLMRLGFLRLQALHRSRKLHQQYRLARQRIIQFQARCRAYLVRKAFRHRLWAVLTVQAYARGMIARRLHQRLRAEYLWRLEAEKMRLAEEEKLRKEMSAKKAKEEAERKHQERLAQLAREDAERELKEKEAARRKKELLEQMERARHEPVNHSDMVDKMFGFLGTSGGLPGQEGQAPSGFEDLERGRREMVEEDLDAALPLPDEDEEDLSEYKFAKFAATYFQGTTTHSYTRRPLKQPLLYHDDEGDQLAALAVWITILRFMGDLPEPKYHTAMSDGSEKIPVMTKIYETLGKKTYKRELQALQGEGEAQLPEGQKKSSVRHKLVHLTLKKKSKLTEEVTKRLHDGESTVQGNSMLEDRPTSNLEKLHFIIGNGILRPALRDEIYCQISKQLTHNPSKSSYARGWILVSLCVGCFAPSEKFVKYLRNFIHGGPPGYAPYCEERLRRTFVNGTRTQPPSWLELQATKSKKPIMLPVTFMDGTTKTLLTDSATTAKELCNALADKISLKDRFGFSLYIALFDKVSSLGSGSDHVMDAISQCEQYAKEQGAQERNAPWRLFFRKEVFTPWHSPSEDNVATNLIYQQVVRGVKFGEYRCEKEDDLAELASQQYFVDYGSEMILERLLNLVPTYIPDREITPLKTLEKWAQLAIAAHKKGIYAQRRTDAQKVKEDVVSYARFKWPLLFSRFYEAYKFSGPSLPKNDVIVAVNWTGVYFVDEQEQVLLELSFPEIMAVSSSRGAKTTAPSFTLATIKGDEYTFTSSNAEDIRDLVVTFLEGLRKRSKYVVALQDNPNPAGEESGFLSFAKGDLIILDHDTGEQVMNSGWANGINERTKQRGDFPTDSVYVMPTVTMPPREIVALVTMTPDQRQDVVRLLQLRTAEPEVRAKPYTLEEFSYDYFRPPPKHTLSRVMVSKARGKDRLWSHTREPLKQALLKKLLGSEELSQEACLAFIAVLKYMGDYPSKRTRSVNELTDQIFEGPLKAEPLKDEAYVQILKQLTDNHIRYSEERGWELLWLCTGLFPPSNILLPHVQRFLQSRKHCPLAIDCLQRLQKALRNGSRKYPPHLVEVEAIQHKTTQIFHKVYFPDDTDEAFEVESSTKAKDFCQNIATRLLLKSSEGFSLFVKIADKVISVPENDFFFDFVRHLTDWIKKARPIKDGIVPSLTYQVFFMKKLWTTTVPGKDPMADSIFHYYQELPKYLRGYHKCTREEVLQLGALIYRVKFEEDKSYFPSIPKLLRELVPQDLIRQVSPDDWKRSIVAYFNKHAGKSKEEAKLAFLKLIFKWPTFGSAFFEVKQTTEPNFPEILLIAINKYGVSLIDPKTKDILTTHPFTKISNWSSGNTYFHITIGNLVRGSKLLCETSLGYKMDDLLTSYISQMLTAMSKQRGSRSGK
一部の実施形態では、本明細書において提供されるベクターは、末端切断型キメラＣＢＡプロモーターを含む。本明細書において提供されるベクターは、配列番号６４として示されるｓｍＣＢＡプロモーターと、１、２または３ヌクレオチドだけ異なるヌクレオチド配列を有するプロモーターを含む場合がある。一部の実施形態では、本明細書において提供されるベクターは、ｓｍＣＢＡプロモーターではないプロモーターを含む。一部の実施形態では、本明細書において提供されるベクターは、ＣＭＶプロモーター、ＥＦ－１アルファプロモーター、錐体アレスチンプロモーター、ヒトミオシン７ａ遺伝子由来プロモーター、ＴαＣ遺伝子由来プロモーター、ロドプシンプロモーター、ｃＧＭＰ－ホスホジエステラーゼβ－サブユニットプロモーター、ヒトまたはマウスロドプシンプロモーター、ｈＧＲＫ１プロモーター、シナプシンプロモーター、グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーター、杆体特異的ＩＲＢＰプロモーター、ＶＭＤ２プロモーターおよびそれらの組合せからなる群から選択されるプロモーターを含む。一部の実施形態では、プロモーターは、ロドプシンプロモーターである。一部の実施形態では、プロモーターは、ＣＭＶプロモーターである。一部の実施形態では、プロモーターは、ＣＭＶプロモーターではない。
一部の実施形態では、プロモーターは、組織特異的プロモーターである。一部の実施形態では、プロモーターは、眼組織において発現を媒介する。一部の実施形態では、プロモーターは、眼組織において発現を媒介しない。一部の実施形態では、プロモーターは、聴覚系および／または前庭系の有毛細胞において発現を媒介する。
配列番号６４ ｓｍＣＢＡプロモーター
AATTCGGTACCCTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGAGTCGCTGCGCGCTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTTGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTGAGGGGCTCCGGGAGCTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTTATTGTGCTGTCTCATCATTTTGGCAAAG
配列番号３９は、オーバーラップベクターシステムの第２世代のオーバーラップする部分のヌクレオチド配列である：
CAGGTCTAACTTTCTGAAGCTGAAGAACGCTGCCACACTGATCCAGAGGCACTGGCGGGGTCACAACTGTAGGAAGAACTACGGGCTGATGCGTCTGGGCTTCCTGCGGCTGCAGGCCCTGCACCGCTCCCGGAAGCTGCACCAGCAGTACCGCCTGGCCCGCCAGCGCATCATCCAGTTCCAGGCCCGCTGCCGCGCCTATCTGGTGCGCAAGGCCTTCCGCCACCGCCTCTGGGCTGTGCTCACCGTGCAGGCCTATGCCCGGGGCATGATCGCCCGCAGGCTGCACCAACGCCTCAGGGCTGAGTATCTGTGGCGCCTCGAGGCTGAGAAAATGCGGCTGGCGGAGGAAGAGAAGCTT
配列番号７９（配列番号３９由来の関連タンパク質配列）
RSNFLKLKNAATLIQRHWRGHNCRKNYGLMRLGFLRLQALHRSRKLHQQYRLARQRIIQFQARCRAYLVRKAFRHRLWAVLTVQAYARGMIARRLHQRLRAEYLWRLEAEKMRLAEEEKL
配列番号４０は、潜在的なインフレーム停止コドンが第２世代ハイブリッドフロントハーフＡＰスプライスドナー領域中に位置する配列番号３１の関連断片である（例えば、図４２を参照されたい）。
CAACGCCTCAGGGCTGAGGTAAGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCTTGTCGAGACAGAGAAGACTCTTGCGTTTCTGAGCTAGCCCC
配列番号４１は、ＣＭｖ１ハイブリッドフロントハーフＡＰスプライスドナー領域において潜在的なインフレーム停止コドンが除去されている配列番号３３の関連断片である（例えば、図４２を参照されたい）。
CAACGCCTCAGGGCTGAGGTAAGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTAACGGAGACCAATTGAAACTGGGCTTGTCGAGACAGAGAAGACTCTTGCGTTTCAGCGCTAGCCCC
配列番号４２は、Ｇｉｂｓｏｎプライマーセット１のフォワードプライマー配列である（リバースプライマー配列は、フォワードプライマーのリバース相補体である（示されていない））（例えば、図４２を参照されたい）。
CCGCAGGCTGCACCAACGCCTCAGGGCTGAGGTAAGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTAACGGAGACCAATTGAAACT
配列番号４３は、Ｇｉｂｓｏｎプライマーセット２のフォワードプライマー配列である（リバースプライマー配列は、フォワードプライマーのリバース相補体である（示されていない））（例えば、図４２を参照されたい）。
AACGGAGACCAATTGAAACTGGGCTTGTCGAGACAGAGAAGACTCTTGCGTTTCAGCGCTAGCCCCCGGGTGCGCGGCG
配列番号４４は、ＣＭｖ２．１ハイブリッドバックハーフベクター（すなわち、ＡＡＶ－ＡＰヘッド－ＡＰＳＡ－ｈＭＹＯ７ＡＣＴｅｘ２２－ＣＭｖ２．１）のポリヌクレオチド配列である。
CTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCTCAGATCTGGCGCGCCCCCCGGGTGCGCGGCGTCGGTGGTGCCGGCGGGGGGCGCCAGGTCGCAGGCGGTGTAGGGCTCCAGGCAGGCGGCGAAGGCCATGACGTGCGCTATGAAGGTCTGCTCCTGCACGCCGTGAACCAGGTGCGCCTGCGGGCCGCGCGCGAACACCGCCACGTCCTCGCCTGCGTGGGTCTCTTCGTCCAGGGGCACTGCGCACTGCTGCCGATACTCGGGGCTCCCGCTCTCGCTCTCGGTAACATCCGGCCGGGCGCCGTCCTTGAGCACATAGCCTGGACCGTTTCTCTTAAGCGACGCATGCTCGCGATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAGTATCTGTGGCGCCTCGAGGCTGAGAAAATGCGGCTGGCGGAGGAAGAGAAGCTTCGGAAGGAGATGAGCGCCAAGAAGGCCAAGGAGGAGGCCGAGCGCAAGCATCAGGAGCGCCTGGCCCAGCTGGCTCGTGAGGACGCTGAGCGGGAGCTGAAGGAGAAGGAGGCCGCTCGGCGGAAGAAGGAGCTCCTGGAGCAGATGGAAAGGGCCCGCCATGAGCCTGTCAATCACTCAGACATGGTGGACAAGATGTTTGGCTTCCTGGGGACTTCAGGTGGCCTGCCAGGCCAGGAGGGCCAGGCACCTAGTGGCTTTGAGGACCTGGAGCGAGGGCGGAGGGAGATGGTGGAGGAGGACCTGGATGCAGCCCTGCCCCTGCCTGACGAGGATGAGGAGGACCTCTCTGAGTATAAATTTGCCAAGTTCGCGGCCACCTACTTCCAGGGGACAACCACGCACTCCTACACCCGGCGGCCACTCAAACAGCCACTGCTCTACCATGACGACGAGGGTGACCAGCTGGCAGCCCTGGCGGTCTGGATCACCATCCTCCGCTTCATGGGGGACCTCCCTGAGCCCAAGTACCACACAGCCATGAGTGATGGCAGTGAGAAGATCCCTGTGATGACCAAGATTTATGAGACCCTGGGCAAGAAGACGTACAAGAGGGAGCTGCAGGCCCTGCAGGGCGAGGGCGAGGCCCAGCTCCCCGAGGGCCAGAAGAAGAGCAGTGTGAGGCACAAGCTGGTGCATTTGACTCTGAAAAAGAAGTCCAAGCTCACAGAGGAGGTGACCAAGAGGCTGCATGACGGGGAGTCCACAGTGCAGGGCAACAGCATGCTGGAGGACCGGCCCACCTCCAACCTGGAGAAGCTGCACTTCATCATCGGCAATGGCATCCTGCGGCCAGCACTCCGGGACGAGATCTACTGCCAGATCAGCAAGCAGCTGACCCACAACCCCTCCAAGAGCAGCTATGCCCGGGGCTGGATTCTCGTGTCTCTCTGCGTGGGCTGTTTCGCCCCCTCCGAGAAGTTTGTCAAGTACCTGCGGAACTTCATCCACGGGGGCCCGCCCGGCTACGCCCCGTACTGTGAGGAGCGCCTGAGAAGGACCTTTGTCAATGGGACACGGACACAGCCGCCCAGCTGGCTGGAGCTGCAGGCCACCAAGTCCAAGAAGCCAATCATGTTGCCCGTGACATTCATGGATGGGACCACCAAGACCCTGCTGACGGACTCGGCAACCACGGCCAAGGAGCTCTGCAACGCGCTGGCCGACAAGATCTCTCTCAAGGACCGGTTCGGGTTCTCCCTCTACATTGCCCTGTTTGACAAGGTGTCCTCCCTGGGCAGCGGCAGTGACCACGTCATGGACGCCATCTCCCAGTGCGAGCAGTACGCCAAGGAGCAGGGCGCCCAGGAGCGCAACGCCCCCTGGAGGCTCTTCTTCCGCAAAGAGGTCTTCACGCCCTGGCACAGCCCCTCCGAGGACAACGTGGCCACCAACCTCATCTACCAGCAGGTGGTGCGAGGAGTCAAGTTTGGGGAGTACAGGTGTGAGAAGGAGGACGACCTGGCTGAGCTGGCCTCCCAGCAGTACTTTGTAGACTATGGCTCTGAGATGATCCTGGAGCGCCTCCTGAACCTCGTGCCCACCTACATCCCCGACCGCGAGATCACGCCCCTGAAGACGCTGGAGAAGTGGGCCCAGCTGGCCATCGCCGCCCACAAGAAGGGGATTTATGCCCAGAGGAGAACTGATGCCCAGAAGGTCAAAGAGGATGTGGTCAGTTATGCCCGCTTCAAGTGGCCCTTGCTCTTCTCCAGGTTTTATGAAGCCTACAAATTCTCAGGCCCCAGTCTCCCCAAGAACGACGTCATCGTGGCCGTCAACTGGACGGGTGTGTACTTTGTGGATGAGCAGGAGCAGGTACTTCTGGAGCTGTCCTTCCCAGAGATCATGGCCGTGTCCAGCAGCAGGGGAGCGAAAACGACGGCCCCCAGCTTCACGCTGGCCACCATCAAGGGGGACGAATACACCTTCACCTCCAGCAATGCTGAGGACATTCGTGACCTGGTGGTCACCTTCCTAGAGGGGCTCCGGAAGAGATCTAAGTATGTTGTGGCCCTGCAGGATAACCCCAACCCCGCAGGCGAGGAGTCAGGCTTCCTCAGCTTTGCCAAGGGAGACCTCATCATCCTGGACCATGACACGGGCGAGCAGGTCATGAACTCGGGCTGGGCCAACGGCATCAATGAGAGGACCAAGCAGCGTGGGGACTTCCCCACCGACAGTGTGTACGTCATGCCCACTGTCACCATGCCACCGCGGGAGATTGTGGCCCTGGTCACCATGACTCCCGATCAGAGGCAGGACGTTGTCCGGCTCTTGCAGCTGCGAACGGCGGAGCCCGAGGTGCGTGCCAAGCCCTACACGCTGGAGGAGTTTTCCTATGACTACTTCAGGCCCCCACCCAAGCACACGCTGAGCCGTGTCATGGTGTCCAAGGCCCGAGGCAAGGACCGGCTGTGGAGCCACACGCGGGAACCGCTCAAGCAGGCGCTGCTCAAGAAGCTCCTGGGCAGTGAGGAGCTCTCGCAGGAGGCCTGCCTGGCCTTCATTGCTGTGCTCAAGTACATGGGCGACTACCCGTCCAAGAGGACACGCTCCGTCAACGAGCTCACCGACCAGATCTTTGAGGGTCCCCTGAAAGCCGAGCCCCTGAAGGACGAGGCATATGTGCAGATCCTGAAGCAGCTGACCGACAACCACATCAGGTACAGCGAGGAGCGGGGTTGGGAGCTGCTCTGGCTGTGCACGGGCCTTTTCCCACCCAGCAACATCCTCCTGCCCCACGTGCAGCGCTTCCTGCAGTCCCGAAAGCACTGCCCACTCGCCATCGACTGCCTGCAACGGCTCCAGAAAGCCCTGAGAAACGGGTCCCGGAAGTACCCTCCGCACCTGGTGGAGGTGGAGGCCATCCAGCACAAGACCACCCAGATTTTCCACAAAGTCTACTTCCCTGATGACACTGACGAGGCCTTCGAAGTGGAGTCCAGCACCAAGGCCAAGGACTTCTGCCAGAACATCGCCACCAGGCTGCTCCTCAAGTCCTCAGAGGGATTCAGCCTCTTTGTCAAAATTGCAGACAAGGTCATCAGCGTTCCTGAGAATGACTTCTTCTTTGACTTTGTTCGACACTTGACAGACTGGATAAAGAAAGCTCGGCCCATCAAGGACGGAATTGTGCCCTCACTCACCTACCAGGTGTTCTTCATGAAGAAGCTGTGGACCACCACGGTGCCAGGGAAGGATCCCATGGCCGATTCCATCTTCCACTATTACCAGGAGTTGCCCAAGTATCTCCGAGGCTACCACAAGTGCACGCGGGAGGAGGTGCTGCAGCTGGGGGCGCTGATCTACAGGGTCAAGTTCGAGGAGGACAAGTCCTACTTCCCCAGCATCCCCAAGCTGCTGCGGGAGCTGGTGCCCCAGGACCTTATCCGGCAGGTCTCACCTGATGACTGGAAGCGGTCCATCGTCGCCTACTTCAACAAGCACGCAGGGAAGTCCAAGGAGGAGGCCAAGCTGGCCTTCCTGAAGCTCATCTTCAAGTGGCCCACCTTTGGCTCAGCCTTCTTCGAGGTGAAGCAAACTACGGAGCCAAACTTCCCTGAGATCCTCCTAATTGCCATCAACAAGTATGGGGTCAGCCTCATCGATCCCAAAACGAAGGATATCCTCACCACTCATCCCTTCACCAAGATCTCCAACTGGAGCAGCGGCAACACCTACTTCCACATCACCATTGGGAACTTGGTGCGCGGGAGCAAACTGCTCTGCGAGACGTCACTGGGCTACAAGATGGATGACCTCCTGACTTCCTACATTAGCCAGATGCTCACAGCCATGAGCAAACAGCGGGGCTCCAGGAGCGGCAAGAGAGCTCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATTTAATTAAGCATGCTGGGGAGAGATCTGAGGAAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAG
配列番号４５は、元のオーバーラップベクターに由来するオーバーラップする配列の部分である。
CAGGTCTAACTTTCTGAAGCTGAAGAACGCTGCCACACTGATCCAGAGGCACTGGCGGGGTCACAACTGTAGGAAGAACTACGGGCTGATGCGTCTGGGCTTCCTGCGGCTGCAGGCCCTGCACCGCTCCCGGAAGCTGCACCAGCAGTACCGCCTGGCCCGCCAGCGCATCATCCAGTTCCAGGCCCGCTGCCGCGCCTATCTGGTGCGCAAGGCCTTCCGCCACCGCCTCTGGGCTGTGCTCACCGTGCAGGCCTATGCCCGGGGCATGATCGCCCGCAGGCTGCACCAACGCCTCAGGGCTGAGTATCTGTGGCGCCTCGAGGCTGAGAAAATGCGGCTGGCGGAGGAAGAGAAGCTTCGGAAGGAGATGAGCGCCAAGAAGGCCAAGGAGGAGGCCGAGCGCAAGCATCAGGAGCGCCTGGCCCAGCTGGCTCGTGAGGACGCTGAGCGGGAGCTGAAGGAGAAGGAGGCCGCTCGGCGGAAGAAGGAGCTCCTGGAGCAGATGGAAAGGGCCCGCCATGAGCCTGTCAATCACTCAGACATGGTGGACAAGATGTTTGGCTTCCTGGGGACTTCAGGTGGCCTGCCAGGCCAGGAGGGCCAGGCACCTAGTGGCTTTGAGGACCTGGAGCGAGGGCGGAGGGAGATGGTGGAGGAGGACCTGGATGCAGCCCTGCCCCTGCCTGACGAGGATGAGGAGGACCTCTCTGAGTATAAATTTGCCAAGTTCGCGGCCACCTACTTCCAGGGGACAACCACGCACTCCTACACCCGGCGGCCACTCAAACAGCCACTGCTCTACCATGACGACGAGGGTGACCAGCTGGCAGCCCTGGCGGTCTGGATCACCATCCTCCGCTTCATGGGGGACCTCCCTGAGCCCAAGTACCACACAGCCATGAGTGATGGCAGTGAGAAGATCCCTGTGATGACCAAGATTTATGAGACCCTGGGCAAGAAGACGTACAAGAGGGAGCTGCAGGCCCTGCAGGGCGAGGGCGAGGCCCAGCTCCCCGAGGGCCAGAAGAAGAGCAGTGTGAGGCACAAGCTGGTGCATTTGACTCTGAAAAAGAAGTCCAAGCTCACAGAGGAGGTGACCAAGAGGCTGCATGACGGGGAGTCCACAGTGCAGGGCAACAGCATGCTGGAGGACCGGCCCACCTCCAACCTGGAGAAGCTGCACTTCATCATCGGCAATGGCATCCTGCGGCCAGCACTCCGGGACGAGATCTACTGCCAGATCAGCAAGCAGCTGACCCACAACCCCTCCAAGAGCAGCTATGCCCGGGGCTGGATTCTCGTGTCTCTCTGCGTGGGCTGTTTCGCCCCCTCCGAGAAGTTTGTCAAGTACCTGCGGAACTTC
配列番号４６は、ＣＭｖ３ハイブリッドフロントハーフベクター（すなわち、ＡＡＶ－ｓｍＣＢＡ－ｈＭＹＯ７Ａ－ＮＴｅｘ２１－ＡＰＳＤ－ＡＰヘッド－ＣＭｖ３）（ＣＭｖ２バックハーフベクターと対形成する）のポリヌクレオチド配列である。
CTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCTCAGATCTGGCGCGCCCAATTCGGTACCCTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGAGTCGCTGCGCGCTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTTGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTGAGGGGCTCCGGGAGCTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTTATTGTGCTGTCTCATCATTTTGGCAAAGAATTCTAGCGGCCGCCACCATGGTGATTCTTCAGCAGGGGGACCATGTGTGGATGGACCTGAGATTGGGGCAGGAGTTCGACGTGCCCATCGGGGCGGTGGTGAAGCTCTGCGACTCTGGGCAGGTCCAGGTGGTGGATGATGAAGACAATGAACACTGGATCTCTCCGCAGAACGCAACGCACATCAAGCCTATGCACCCCACGTCGGTCCACGGCGTGGAGGACATGATCCGCCTGGGGGACCTCAACGAGGCGGGCATCTTGCGCAACCTGCTTATCCGCTACCGGGACCACCTCATCTACACGTATACGGGCTCCATCCTGGTGGCTGTGAACCCCTACCAGCTGCTCTCCATCTACTCGCCAGAGCACATCCGCCAGTATACCAACAAGAAGATTGGGGAGATGCCCCCCCACATCTTTGCCATTGCTGACAACTGCTACTTCAACATGAAACGCAACAGCCGAGACCAGTGCTGCATCATCAGTGGGGAATCTGGGGCCGGGAAGACGGAGAGCACAAAGCTGATCCTGCAGTTCCTGGCAGCCATCAGTGGGCAGCACTCGTGGATTGAGCAGCAGGTCTTGGAGGCCACCCCCATTCTGGAAGCATTTGGGAATGCCAAGACCATCCGCAATGACAACTCAAGCCGTTTCGGAAAGTACATCGACATCCACTTCAACAAGCGGGGCGCCATCGAGGGCGCGAAGATTGAGCAGTACCTGCTGGAAAAGTCACGTGTCTGTCGCCAGGCCCTGGATGAAAGGAACTACCACGTGTTCTACTGCATGCTGGAGGGTATGAGTGAGGATCAGAAGAAGAAGCTGGGCTTGGGCCAGGCCTCTGACTACAACTACTTGGCCATGGGTAACTGCATAACCTGTGAGGGCCGGGTGGACAGCCAGGAGTACGCCAACATCCGCTCCGCCATGAAGGTGCTCATGTTCACTGACACCGAGAACTGGGAGATCTCGAAGCTCCTGGCTGCCATCCTGCACCTGGGCAACCTGCAGTATGAGGCACGCACATTTGAAAACCTGGATGCCTGTGAGGTTCTCTTCTCCCCATCGCTGGCCACAGCTGCATCCCTGCTTGAGGTGAACCCCCCAGACCTGATGAGCTGCCTGACTAGCCGCACCCTCATCACCCGCGGGGAGACGGTGTCCACCCCACTGAGCAGGGAACAGGCACTGGACGTGCGCGACGCCTTCGTAAAGGGGATCTACGGGCGGCTGTTCGTGTGGATTGTGGACAAGATCAACGCAGCAATTTACAAGCCTCCCTCCCAGGATGTGAAGAACTCTCGCAGGTCCATCGGCCTCCTGGACATCTTTGGGTTTGAGAACTTTGCTGTGAACAGCTTTGAGCAGCTCTGCATCAACTTCGCCAATGAGCACCTGCAGCAGTTCTTTGTGCGGCACGTGTTCAAGCTGGAGCAGGAGGAATATGACCTGGAGAGCATTGACTGGCTGCACATCGAGTTCACTGACAACCAGGATGCCCTGGACATGATTGCCAACAAGCCCATGAACATCATCTCCCTCATCGATGAGGAGAGCAAGTTCCCCAAGGGCACAGACACCACCATGTTACACAAGCTGAACTCCCAGCACAAGCTCAACGCCAACTACATCCCCCCCAAGAACAACCATGAGACCCAGTTTGGCATCAACCATTTTGCAGGCATCGTCTACTATGAGACCCAAGGCTTCCTGGAGAAGAACCGAGACACCCTGCATGGGGACATTATCCAGCTGGTCCACTCCTCCAGGAACAAGTTCATCAAGCAGATCTTCCAGGCCGATGTCGCCATGGGCGCCGAGACCAGGAAGCGCTCGCCCACACTTAGCAGCCAGTTCAAGCGGTCACTGGAGCTGCTGATGCGCACGCTGGGTGCCTGCCAGCCCTTCTTTGTGCGATGCATCAAGCCCAATGAGTTCAAGAAGCCCATGCTGTTCGACCGGCACCTGTGCGTGCGCCAGCTGCGGTACTCAGGAATGATGGAGACCATCCGAATCCGCCGAGCTGGCTACCCCATCCGCTACAGCTTCGTAGAGTTTGTGGAGCGGTACCGTGTGCTGCTGCCAGGTGTGAAGCCGGCCTACAAGCAGGGCGACCTCCGCGGGACTTGCCAGCGCATGGCTGAGGCTGTGCTGGGCACCCACGATGACTGGCAGATAGGCAAAACCAAGATCTTTCTGAAGGACCACCATGACATGCTGCTGGAAGTGGAGCGGGACAAAGCCATCACCGACAGAGTCATCCTCCTTCAGAAAGTCATCCGGGGATTCAAAGACAGGTCTAACTTTCTGAAGCTGAAGAACGCTGCCACACTGATCCAGAGGCACTGGCGGGGTCACAACTGTAGGAAGAACTACGGGCTGATGCGTCTGGGCTTCCTGCGGCTGCAGGCCCTGCACCGCTCCCGGAAGCTGCACCAGCAGTACCGCCTGGCCCGCCAGCGCATCATCCAGTTCCAGGCCCGCTGCCGCGCCTATCTGGTGCGCAAGGCCTTCCGCCACCGCCTCTGGGCTGTGCTCACCGTGCAGGCCTATGCCCGGGGCATGATCGCCCGCAGGCTGCACCAACGCCTCAGGGCTGAGGTAAGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTAACGGAGACCAATTGAAACTGGGCTTGTCGAGACAGAGAAGACTCTTGCGTTTCAGCGCTAGCCCCCGGGTGCGCGGCGTCGGTGGTGCCGGCGGGGGGCGCCAGGTCGCAGGCGGTGTAGGGCTCCAGGCAGGCGGCGAAGGCCATGACGTGCGCTATGAAGGTCTGCTCCTGCACGCCGTGAACCAGGTGCGCCTGCGGGCCGCGCGCGAACACCGCCACGTCCTCGCCTGCGTGGGTCTCTTCGTCCAGGGGCACTGCGCACTGCTGCCGATACTCGGGGCTCCCGCTCTCGCTCTCGGTAACATCCGGCCGGGCGCCGTCCTTGAGCACATAGCCTGGACCGTTTCGTCGACGGATCCGCATGCTGGGGAGAGATCTGAGGAAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAG
配列番号４７は、ＨＡタグを含有するＣＭｖ２．１ハイブリッドバックハーフベクター（すなわち、ＡＡＶ－ＡＰヘッド－ＡＰＳＡ－ｈＭＹＯ７ＡＣＴｅｘ２２－ＣＭｖ２．１．ＨＡ）（ＣＭｖ２フロントハーフベクターと対形成する）のポリヌクレオチド配列である。
CTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCTCAGATCTGGCGCGCCCCCCGGGTGCGCGGCGTCGGTGGTGCCGGCGGGGGGCGCCAGGTCGCAGGCGGTGTAGGGCTCCAGGCAGGCGGCGAAGGCCATGACGTGCGCTATGAAGGTCTGCTCCTGCACGCCGTGAACCAGGTGCGCCTGCGGGCCGCGCGCGAACACCGCCACGTCCTCGCCTGCGTGGGTCTCTTCGTCCAGGGGCACTGCGCACTGCTGCCGATACTCGGGGCTCCCGCTCTCGCTCTCGGTAACATCCGGCCGGGCGCCGTCCTTGAGCACATAGCCTGGACCGTTTCTCTTAAGCGACGCATGCTCGCGATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAGTATCTGTGGCGCCTCGAGGCTGAGAAAATGCGGCTGGCGGAGGAAGAGAAGCTTCGGAAGGAGATGAGCGCCAAGAAGGCCAAGGAGGAGGCCGAGCGCAAGCATCAGGAGCGCCTGGCCCAGCTGGCTCGTGAGGACGCTGAGCGGGAGCTGAAGGAGAAGGAGGCCGCTCGGCGGAAGAAGGAGCTCCTGGAGCAGATGGAAAGGGCCCGCCATGAGCCTGTCAATCACTCAGACATGGTGGACAAGATGTTTGGCTTCCTGGGGACTTCAGGTGGCCTGCCAGGCCAGGAGGGCCAGGCACCTAGTGGCTTTGAGGACCTGGAGCGAGGGCGGAGGGAGATGGTGGAGGAGGACCTGGATGCAGCCCTGCCCCTGCCTGACGAGGATGAGGAGGACCTCTCTGAGTATAAATTTGCCAAGTTCGCGGCCACCTACTTCCAGGGGACAACCACGCACTCCTACACCCGGCGGCCACTCAAACAGCCACTGCTCTACCATGACGACGAGGGTGACCAGCTGGCAGCCCTGGCGGTCTGGATCACCATCCTCCGCTTCATGGGGGACCTCCCTGAGCCCAAGTACCACACAGCCATGAGTGATGGCAGTGAGAAGATCCCTGTGATGACCAAGATTTATGAGACCCTGGGCAAGAAGACGTACAAGAGGGAGCTGCAGGCCCTGCAGGGCGAGGGCGAGGCCCAGCTCCCCGAGGGCCAGAAGAAGAGCAGTGTGAGGCACAAGCTGGTGCATTTGACTCTGAAAAAGAAGTCCAAGCTCACAGAGGAGGTGACCAAGAGGCTGCATGACGGGGAGTCCACAGTGCAGGGCAACAGCATGCTGGAGGACCGGCCCACCTCCAACCTGGAGAAGCTGCACTTCATCATCGGCAATGGCATCCTGCGGCCAGCACTCCGGGACGAGATCTACTGCCAGATCAGCAAGCAGCTGACCCACAACCCCTCCAAGAGCAGCTATGCCCGGGGCTGGATTCTCGTGTCTCTCTGCGTGGGCTGTTTCGCCCCCTCCGAGAAGTTTGTCAAGTACCTGCGGAACTTCATCCACGGGGGCCCGCCCGGCTACGCCCCGTACTGTGAGGAGCGCCTGAGAAGGACCTTTGTCAATGGGACACGGACACAGCCGCCCAGCTGGCTGGAGCTGCAGGCCACCAAGTCCAAGAAGCCAATCATGTTGCCCGTGACATTCATGGATGGGACCACCAAGACCCTGCTGACGGACTCGGCAACCACGGCCAAGGAGCTCTGCAACGCGCTGGCCGACAAGATCTCTCTCAAGGACCGGTTCGGGTTCTCCCTCTACATTGCCCTGTTTGACAAGGTGTCCTCCCTGGGCAGCGGCAGTGACCACGTCATGGACGCCATCTCCCAGTGCGAGCAGTACGCCAAGGAGCAGGGCGCCCAGGAGCGCAACGCCCCCTGGAGGCTCTTCTTCCGCAAAGAGGTCTTCACGCCCTGGCACAGCCCCTCCGAGGACAACGTGGCCACCAACCTCATCTACCAGCAGGTGGTGCGAGGAGTCAAGTTTGGGGAGTACAGGTGTGAGAAGGAGGACGACCTGGCTGAGCTGGCCTCCCAGCAGTACTTTGTAGACTATGGCTCTGAGATGATCCTGGAGCGCCTCCTGAACCTCGTGCCCACCTACATCCCCGACCGCGAGATCACGCCCCTGAAGACGCTGGAGAAGTGGGCCCAGCTGGCCATCGCCGCCCACAAGAAGGGGATTTATGCCCAGAGGAGAACTGATGCCCAGAAGGTCAAAGAGGATGTGGTCAGTTATGCCCGCTTCAAGTGGCCCTTGCTCTTCTCCAGGTTTTATGAAGCCTACAAATTCTCAGGCCCCAGTCTCCCCAAGAACGACGTCATCGTGGCCGTCAACTGGACGGGTGTGTACTTTGTGGATGAGCAGGAGCAGGTACTTCTGGAGCTGTCCTTCCCAGAGATCATGGCCGTGTCCAGCAGCAGGGGAGCGAAAACGACGGCCCCCAGCTTCACGCTGGCCACCATCAAGGGGGACGAATACACCTTCACCTCCAGCAATGCTGAGGACATTCGTGACCTGGTGGTCACCTTCCTAGAGGGGCTCCGGAAGAGATCTAAGTATGTTGTGGCCCTGCAGGATAACCCCAACCCCGCAGGCGAGGAGTCAGGCTTCCTCAGCTTTGCCAAGGGAGACCTCATCATCCTGGACCATGACACGGGCGAGCAGGTCATGAACTCGGGCTGGGCCAACGGCATCAATGAGAGGACCAAGCAGCGTGGGGACTTCCCCACCGACAGTGTGTACGTCATGCCCACTGTCACCATGCCACCGCGGGAGATTGTGGCCCTGGTCACCATGACTCCCGATCAGAGGCAGGACGTTGTCCGGCTCTTGCAGCTGCGAACGGCGGAGCCCGAGGTGCGTGCCAAGCCCTACACGCTGGAGGAGTTTTCCTATGACTACTTCAGGCCCCCACCCAAGCACACGCTGAGCCGTGTCATGGTGTCCAAGGCCCGAGGCAAGGACCGGCTGTGGAGCCACACGCGGGAACCGCTCAAGCAGGCGCTGCTCAAGAAGCTCCTGGGCAGTGAGGAGCTCTCGCAGGAGGCCTGCCTGGCCTTCATTGCTGTGCTCAAGTACATGGGCGACTACCCGTCCAAGAGGACACGCTCCGTCAACGAGCTCACCGACCAGATCTTTGAGGGTCCCCTGAAAGCCGAGCCCCTGAAGGACGAGGCATATGTGCAGATCCTGAAGCAGCTGACCGACAACCACATCAGGTACAGCGAGGAGCGGGGTTGGGAGCTGCTCTGGCTGTGCACGGGCCTTTTCCCACCCAGCAACATCCTCCTGCCCCACGTGCAGCGCTTCCTGCAGTCCCGAAAGCACTGCCCACTCGCCATCGACTGCCTGCAACGGCTCCAGAAAGCCCTGAGAAACGGGTCCCGGAAGTACCCTCCGCACCTGGTGGAGGTGGAGGCCATCCAGCACAAGACCACCCAGATTTTCCACAAAGTCTACTTCCCTGATGACACTGACGAGGCCTTCGAAGTGGAGTCCAGCACCAAGGCCAAGGACTTCTGCCAGAACATCGCCACCAGGCTGCTCCTCAAGTCCTCAGAGGGATTCAGCCTCTTTGTCAAAATTGCAGACAAGGTCATCAGCGTTCCTGAGAATGACTTCTTCTTTGACTTTGTTCGACACTTGACAGACTGGATAAAGAAAGCTCGGCCCATCAAGGACGGAATTGTGCCCTCACTCACCTACCAGGTGTTCTTCATGAAGAAGCTGTGGACCACCACGGTGCCAGGGAAGGATCCCATGGCCGATTCCATCTTCCACTATTACCAGGAGTTGCCCAAGTATCTCCGAGGCTACCACAAGTGCACGCGGGAGGAGGTGCTGCAGCTGGGGGCGCTGATCTACAGGGTCAAGTTCGAGGAGGACAAGTCCTACTTCCCCAGCATCCCCAAGCTGCTGCGGGAGCTGGTGCCCCAGGACCTTATCCGGCAGGTCTCACCTGATGACTGGAAGCGGTCCATCGTCGCCTACTTCAACAAGCACGCAGGGAAGTCCAAGGAGGAGGCCAAGCTGGCCTTCCTGAAGCTCATCTTCAAGTGGCCCACCTTTGGCTCAGCCTTCTTCGAGGTGAAGCAAACTACGGAGCCAAACTTCCCTGAGATCCTCCTAATTGCCATCAACAAGTATGGGGTCAGCCTCATCGATCCCAAAACGAAGGATATCCTCACCACTCATCCCTTCACCAAGATCTCCAACTGGAGCAGCGGCAACACCTACTTCCACATCACCATTGGGAACTTGGTGCGCGGGAGCAAACTGCTCTGCGAGACGTCACTGGGCTACAAGATGGATGACCTCCTGACTTCCTACATTAGCCAGATGCTCACAGCCATGAGCAAACAGCGGGGCTCCAGGAGCGGCAAGTACCCTTACGATGTACCGGATTACGCATGAAGAGCTCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATTTAATTAAGCATGCTGGGGAGAGATCTGAGGAAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAG
配列番号４８は、ＨＡタグを含有する、最小化された第２世代ハイブリッドバックハーフベクター（すなわち、ＡＡＶ－ＡＰヘッド－ＡＰＳＡ－ｈＭＹＯ７ＡＣＴｅｘ２２．ＨＡ－ＭＩＮ）（第２世代フロントハーフハイブリッドベクターと対形成する）のポリヌクレオチド配列である。
CTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCTCAGATCTGGCGCGCCCCCCGGGTGCGCGGCGTCGGTGGTGCCGGCGGGGGGCGCCAGGTCGCAGGCGGTGTAGGGCTCCAGGCAGGCGGCGAAGGCCATGACGTGCGCTATGAAGGTCTGCTCCTGCACGCCGTGAACCAGGTGCGCCTGCGGGCCGCGCGCGAACACCGCCACGTCCTCGCCTGCGTGGGTCTCTTCGTCCAGGGGCACTGCTGACTGCTGCCGATACTCGGGGCTCCCGCTCTCGCTCTCGGTAACATCCGGCCGGGCGCCGTCCTTGAGCACATAGCCTGGACCGTTTCCTTAAGCGACGCATGCTCGCGATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAGTATCTGTGGCGCCTCGAGGCTGAGAAAATGCGGCTGGCGGAGGAAGAGAAGCTTCGGAAGGAGATGAGCGCCAAGAAGGCCAAGGAGGAGGCCGAGCGCAAGCATCAGGAGCGCCTGGCCCAGCTGGCTCGTGAGGACGCTGAGCGGGAGCTGAAGGAGAAGGAGGCCGCTCGGCGGAAGAAGGAGCTCCTGGAGCAGATGGAAAGGGCCCGCCATGAGCCTGTCAATCACTCAGACATGGTGGACAAGATGTTTGGCTTCCTGGGGACTTCAGGTGGCCTGCCAGGCCAGGAGGGCCAGGCACCTAGTGGCTTTGAGGACCTGGAGCGAGGGCGGAGGGAGATGGTGGAGGAGGACCTGGATGCAGCCCTGCCCCTGCCTGACGAGGATGAGGAGGACCTCTCTGAGTATAAATTTGCCAAGTTCGCGGCCACCTACTTCCAGGGGACAACCACGCACTCCTACACCCGGCGGCCACTCAAACAGCCACTGCTCTACCATGACGACGAGGGTGACCAGCTGGCAGCCCTGGCGGTCTGGATCACCATCCTCCGCTTCATGGGGGACCTCCCTGAGCCCAAGTACCACACAGCCATGAGTGATGGCAGTGAGAAGATCCCTGTGATGACCAAGATTTATGAGACCCTGGGCAAGAAGACGTACAAGAGGGAGCTGCAGGCCCTGCAGGGCGAGGGCGAGGCCCAGCTCCCCGAGGGCCAGAAGAAGAGCAGTGTGAGGCACAAGCTGGTGCATTTGACTCTGAAAAAGAAGTCCAAGCTCACAGAGGAGGTGACCAAGAGGCTGCATGACGGGGAGTCCACAGTGCAGGGCAACAGCATGCTGGAGGACCGGCCCACCTCCAACCTGGAGAAGCTGCACTTCATCATCGGCAATGGCATCCTGCGGCCAGCACTCCGGGACGAGATCTACTGCCAGATCAGCAAGCAGCTGACCCACAACCCCTCCAAGAGCAGCTATGCCCGGGGCTGGATTCTCGTGTCTCTCTGCGTGGGCTGTTTCGCCCCCTCCGAGAAGTTTGTCAAGTACCTGCGGAACTTCATCCACGGGGGCCCGCCCGGCTACGCCCCGTACTGTGAGGAGCGCCTGAGAAGGACCTTTGTCAATGGGACACGGACACAGCCGCCCAGCTGGCTGGAGCTGCAGGCCACCAAGTCCAAGAAGCCAATCATGTTGCCCGTGACATTCATGGATGGGACCACCAAGACCCTGCTGACGGACTCGGCAACCACGGCCAAGGAGCTCTGCAACGCGCTGGCCGACAAGATCTCTCTCAAGGACCGGTTCGGGTTCTCCCTCTACATTGCCCTGTTTGACAAGGTGTCCTCCCTGGGCAGCGGCAGTGACCACGTCATGGACGCCATCTCCCAGTGCGAGCAGTACGCCAAGGAGCAGGGCGCCCAGGAGCGCAACGCCCCCTGGAGGCTCTTCTTCCGCAAAGAGGTCTTCACGCCCTGGCACAGCCCCTCCGAGGACAACGTGGCCACCAACCTCATCTACCAGCAGGTGGTGCGAGGAGTCAAGTTTGGGGAGTACAGGTGTGAGAAGGAGGACGACCTGGCTGAGCTGGCCTCCCAGCAGTACTTTGTAGACTATGGCTCTGAGATGATCCTGGAGCGCCTCCTGAACCTCGTGCCCACCTACATCCCCGACCGCGAGATCACGCCCCTGAAGACGCTGGAGAAGTGGGCCCAGCTGGCCATCGCCGCCCACAAGAAGGGGATTTATGCCCAGAGGAGAACTGATGCCCAGAAGGTCAAAGAGGATGTGGTCAGTTATGCCCGCTTCAAGTGGCCCTTGCTCTTCTCCAGGTTTTATGAAGCCTACAAATTCTCAGGCCCCAGTCTCCCCAAGAACGACGTCATCGTGGCCGTCAACTGGACGGGTGTGTACTTTGTGGATGAGCAGGAGCAGGTACTTCTGGAGCTGTCCTTCCCAGAGATCATGGCCGTGTCCAGCAGCAGGGGAGCGAAAACGACGGCCCCCAGCTTCACGCTGGCCACCATCAAGGGGGACGAATACACCTTCACCTCCAGCAATGCTGAGGACATTCGTGACCTGGTGGTCACCTTCCTAGAGGGGCTCCGGAAGAGATCTAAGTATGTTGTGGCCCTGCAGGATAACCCCAACCCCGCAGGCGAGGAGTCAGGCTTCCTCAGCTTTGCCAAGGGAGACCTCATCATCCTGGACCATGACACGGGCGAGCAGGTCATGAACTCGGGCTGGGCCAACGGCATCAATGAGAGGACCAAGCAGCGTGGGGACTTCCCCACCGACAGTGTGTACGTCATGCCCACTGTCACCATGCCACCGCGGGAGATTGTGGCCCTGGTCACCATGACTCCCGATCAGAGGCAGGACGTTGTCCGGCTCTTGCAGCTGCGAACGGCGGAGCCCGAGGTGCGTGCCAAGCCCTACACGCTGGAGGAGTTTTCCTATGACTACTTCAGGCCCCCACCCAAGCACACGCTGAGCCGTGTCATGGTGTCCAAGGCCCGAGGCAAGGACCGGCTGTGGAGCCACACGCGGGAACCGCTCAAGCAGGCGCTGCTCAAGAAGCTCCTGGGCAGTGAGGAGCTCTCGCAGGAGGCCTGCCTGGCCTTCATTGCTGTGCTCAAGTACATGGGCGACTACCCGTCCAAGAGGACACGCTCCGTCAACGAGCTCACCGACCAGATCTTTGAGGGTCCCCTGAAAGCCGAGCCCCTGAAGGACGAGGCATATGTGCAGATCCTGAAGCAGCTGACCGACAACCACATCAGGTACAGCGAGGAGCGGGGTTGGGAGCTGCTCTGGCTGTGCACGGGCCTTTTCCCACCCAGCAACATCCTCCTGCCCCACGTGCAGCGCTTCCTGCAGTCCCGAAAGCACTGCCCACTCGCCATCGACTGCCTGCAACGGCTCCAGAAAGCCCTGAGAAACGGGTCCCGGAAGTACCCTCCGCACCTGGTGGAGGTGGAGGCCATCCAGCACAAGACCACCCAGATTTTCCACAAAGTCTACTTCCCTGATGACACTGACGAGGCCTTCGAAGTGGAGTCCAGCACCAAGGCCAAGGACTTCTGCCAGAACATCGCCACCAGGCTGCTCCTCAAGTCCTCAGAGGGATTCAGCCTCTTTGTCAAAATTGCAGACAAGGTCATCAGCGTTCCTGAGAATGACTTCTTCTTTGACTTTGTTCGACACTTGACAGACTGGATAAAGAAAGCTCGGCCCATCAAGGACGGAATTGTGCCCTCACTCACCTACCAGGTGTTCTTCATGAAGAAGCTGTGGACCACCACGGTGCCAGGGAAGGATCCCATGGCCGATTCCATCTTCCACTATTACCAGGAGTTGCCCAAGTATCTCCGAGGCTACCACAAGTGCACGCGGGAGGAGGTGCTGCAGCTGGGGGCGCTGATCTACAGGGTCAAGTTCGAGGAGGACAAGTCCTACTTCCCCAGCATCCCCAAGCTGCTGCGGGAGCTGGTGCCCCAGGACCTTATCCGGCAGGTCTCACCTGATGACTGGAAGCGGTCCATCGTCGCCTACTTCAACAAGCACGCAGGGAAGTCCAAGGAGGAGGCCAAGCTGGCCTTCCTGAAGCTCATCTTCAAGTGGCCCACCTTTGGCTCAGCCTTCTTCGAGGTGAAGCAAACTACGGAGCCAAACTTCCCTGAGATCCTCCTAATTGCCATCAACAAGTATGGGGTCAGCCTCATCGATCCCAAAACGAAGGATATCCTCACCACTCATCCCTTCACCAAGATCTCCAACTGGAGCAGCGGCAACACCTACTTCCACATCACCATTGGGAACTTGGTGCGCGGGAGCAAACTGCTCTGCGAGACGTCACTGGGCTACAAGATGGATGACCTCCTGACTTCCTACATTAGCCAGATGCTCACAGCCATGAGCAAACAGCGGGGCTCCAGGAGCGGCAAGTACCCTTACGATGTACCGGATTACGCATGAAGAGCTCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATTTAATTAAGCATGCTGGGGAGAGATCTGAGGAAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAG
配列番号４９は、ＨＡタグを含有しない、最小化された第２世代ハイブリッドバックハーフベクター（すなわち、ＡＡＶ－ＡＰヘッド－ＡＰＳＡ－ｈＭＹＯ７ＡＣＴｅｘ２２－ＭＩＮ）（第２世代フロントハーフハイブリッドベクターと対形成する）のポリヌクレオチド配列である。
CTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCTCAGATCTGGCGCGCCCCCCGGGTGCGCGGCGTCGGTGGTGCCGGCGGGGGGCGCCAGGTCGCAGGCGGTGTAGGGCTCCAGGCAGGCGGCGAAGGCCATGACGTGCGCTATGAAGGTCTGCTCCTGCACGCCGTGAACCAGGTGCGCCTGCGGGCCGCGCGCGAACACCGCCACGTCCTCGCCTGCGTGGGTCTCTTCGTCCAGGGGCACTGCTGACTGCTGCCGATACTCGGGGCTCCCGCTCTCGCTCTCGGTAACATCCGGCCGGGCGCCGTCCTTGAGCACATAGCCTGGACCGTTTCCTTAAGCGACGCATGCTCGCGATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAGTATCTGTGGCGCCTCGAGGCTGAGAAAATGCGGCTGGCGGAGGAAGAGAAGCTTCGGAAGGAGATGAGCGCCAAGAAGGCCAAGGAGGAGGCCGAGCGCAAGCATCAGGAGCGCCTGGCCCAGCTGGCTCGTGAGGACGCTGAGCGGGAGCTGAAGGAGAAGGAGGCCGCTCGGCGGAAGAAGGAGCTCCTGGAGCAGATGGAAAGGGCCCGCCATGAGCCTGTCAATCACTCAGACATGGTGGACAAGATGTTTGGCTTCCTGGGGACTTCAGGTGGCCTGCCAGGCCAGGAGGGCCAGGCACCTAGTGGCTTTGAGGACCTGGAGCGAGGGCGGAGGGAGATGGTGGAGGAGGACCTGGATGCAGCCCTGCCCCTGCCTGACGAGGATGAGGAGGACCTCTCTGAGTATAAATTTGCCAAGTTCGCGGCCACCTACTTCCAGGGGACAACCACGCACTCCTACACCCGGCGGCCACTCAAACAGCCACTGCTCTACCATGACGACGAGGGTGACCAGCTGGCAGCCCTGGCGGTCTGGATCACCATCCTCCGCTTCATGGGGGACCTCCCTGAGCCCAAGTACCACACAGCCATGAGTGATGGCAGTGAGAAGATCCCTGTGATGACCAAGATTTATGAGACCCTGGGCAAGAAGACGTACAAGAGGGAGCTGCAGGCCCTGCAGGGCGAGGGCGAGGCCCAGCTCCCCGAGGGCCAGAAGAAGAGCAGTGTGAGGCACAAGCTGGTGCATTTGACTCTGAAAAAGAAGTCCAAGCTCACAGAGGAGGTGACCAAGAGGCTGCATGACGGGGAGTCCACAGTGCAGGGCAACAGCATGCTGGAGGACCGGCCCACCTCCAACCTGGAGAAGCTGCACTTCATCATCGGCAATGGCATCCTGCGGCCAGCACTCCGGGACGAGATCTACTGCCAGATCAGCAAGCAGCTGACCCACAACCCCTCCAAGAGCAGCTATGCCCGGGGCTGGATTCTCGTGTCTCTCTGCGTGGGCTGTTTCGCCCCCTCCGAGAAGTTTGTCAAGTACCTGCGGAACTTCATCCACGGGGGCCCGCCCGGCTACGCCCCGTACTGTGAGGAGCGCCTGAGAAGGACCTTTGTCAATGGGACACGGACACAGCCGCCCAGCTGGCTGGAGCTGCAGGCCACCAAGTCCAAGAAGCCAATCATGTTGCCCGTGACATTCATGGATGGGACCACCAAGACCCTGCTGACGGACTCGGCAACCACGGCCAAGGAGCTCTGCAACGCGCTGGCCGACAAGATCTCTCTCAAGGACCGGTTCGGGTTCTCCCTCTACATTGCCCTGTTTGACAAGGTGTCCTCCCTGGGCAGCGGCAGTGACCACGTCATGGACGCCATCTCCCAGTGCGAGCAGTACGCCAAGGAGCAGGGCGCCCAGGAGCGCAACGCCCCCTGGAGGCTCTTCTTCCGCAAAGAGGTCTTCACGCCCTGGCACAGCCCCTCCGAGGACAACGTGGCCACCAACCTCATCTACCAGCAGGTGGTGCGAGGAGTCAAGTTTGGGGAGTACAGGTGTGAGAAGGAGGACGACCTGGCTGAGCTGGCCTCCCAGCAGTACTTTGTAGACTATGGCTCTGAGATGATCCTGGAGCGCCTCCTGAACCTCGTGCCCACCTACATCCCCGACCGCGAGATCACGCCCCTGAAGACGCTGGAGAAGTGGGCCCAGCTGGCCATCGCCGCCCACAAGAAGGGGATTTATGCCCAGAGGAGAACTGATGCCCAGAAGGTCAAAGAGGATGTGGTCAGTTATGCCCGCTTCAAGTGGCCCTTGCTCTTCTCCAGGTTTTATGAAGCCTACAAATTCTCAGGCCCCAGTCTCCCCAAGAACGACGTCATCGTGGCCGTCAACTGGACGGGTGTGTACTTTGTGGATGAGCAGGAGCAGGTACTTCTGGAGCTGTCCTTCCCAGAGATCATGGCCGTGTCCAGCAGCAGGGGAGCGAAAACGACGGCCCCCAGCTTCACGCTGGCCACCATCAAGGGGGACGAATACACCTTCACCTCCAGCAATGCTGAGGACATTCGTGACCTGGTGGTCACCTTCCTAGAGGGGCTCCGGAAGAGATCTAAGTATGTTGTGGCCCTGCAGGATAACCCCAACCCCGCAGGCGAGGAGTCAGGCTTCCTCAGCTTTGCCAAGGGAGACCTCATCATCCTGGACCATGACACGGGCGAGCAGGTCATGAACTCGGGCTGGGCCAACGGCATCAATGAGAGGACCAAGCAGCGTGGGGACTTCCCCACCGACAGTGTGTACGTCATGCCCACTGTCACCATGCCACCGCGGGAGATTGTGGCCCTGGTCACCATGACTCCCGATCAGAGGCAGGACGTTGTCCGGCTCTTGCAGCTGCGAACGGCGGAGCCCGAGGTGCGTGCCAAGCCCTACACGCTGGAGGAGTTTTCCTATGACTACTTCAGGCCCCCACCCAAGCACACGCTGAGCCGTGTCATGGTGTCCAAGGCCCGAGGCAAGGACCGGCTGTGGAGCCACACGCGGGAACCGCTCAAGCAGGCGCTGCTCAAGAAGCTCCTGGGCAGTGAGGAGCTCTCGCAGGAGGCCTGCCTGGCCTTCATTGCTGTGCTCAAGTACATGGGCGACTACCCGTCCAAGAGGACACGCTCCGTCAACGAGCTCACCGACCAGATCTTTGAGGGTCCCCTGAAAGCCGAGCCCCTGAAGGACGAGGCATATGTGCAGATCCTGAAGCAGCTGACCGACAACCACATCAGGTACAGCGAGGAGCGGGGTTGGGAGCTGCTCTGGCTGTGCACGGGCCTTTTCCCACCCAGCAACATCCTCCTGCCCCACGTGCAGCGCTTCCTGCAGTCCCGAAAGCACTGCCCACTCGCCATCGACTGCCTGCAACGGCTCCAGAAAGCCCTGAGAAACGGGTCCCGGAAGTACCCTCCGCACCTGGTGGAGGTGGAGGCCATCCAGCACAAGACCACCCAGATTTTCCACAAAGTCTACTTCCCTGATGACACTGACGAGGCCTTCGAAGTGGAGTCCAGCACCAAGGCCAAGGACTTCTGCCAGAACATCGCCACCAGGCTGCTCCTCAAGTCCTCAGAGGGATTCAGCCTCTTTGTCAAAATTGCAGACAAGGTCATCAGCGTTCCTGAGAATGACTTCTTCTTTGACTTTGTTCGACACTTGACAGACTGGATAAAGAAAGCTCGGCCCATCAAGGACGGAATTGTGCCCTCACTCACCTACCAGGTGTTCTTCATGAAGAAGCTGTGGACCACCACGGTGCCAGGGAAGGATCCCATGGCCGATTCCATCTTCCACTATTACCAGGAGTTGCCCAAGTATCTCCGAGGCTACCACAAGTGCACGCGGGAGGAGGTGCTGCAGCTGGGGGCGCTGATCTACAGGGTCAAGTTCGAGGAGGACAAGTCCTACTTCCCCAGCATCCCCAAGCTGCTGCGGGAGCTGGTGCCCCAGGACCTTATCCGGCAGGTCTCACCTGATGACTGGAAGCGGTCCATCGTCGCCTACTTCAACAAGCACGCAGGGAAGTCCAAGGAGGAGGCCAAGCTGGCCTTCCTGAAGCTCATCTTCAAGTGGCCCACCTTTGGCTCAGCCTTCTTCGAGGTGAAGCAAACTACGGAGCCAAACTTCCCTGAGATCCTCCTAATTGCCATCAACAAGTATGGGGTCAGCCTCATCGATCCCAAAACGAAGGATATCCTCACCACTCATCCCTTCACCAAGATCTCCAACTGGAGCAGCGGCAACACCTACTTCCACATCACCATTGGGAACTTGGTGCGCGGGAGCAAACTGCTCTGCGAGACGTCACTGGGCTACAAGATGGATGACCTCCTGACTTCCTACATTAGCCAGATGCTCACAGCCATGAGCAAACAGCGGGGCTCCAGGAGCGGCAAGAGAGCTCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATTTAATTAAGCATGCTGGGGAGAGATCTAGGAAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAG
配列番号５０は、第３世代オーバーラップフロントハーフベクター（すなわち、ＡＡＶ－ｓｍＣＢＡ－ｈＭＹＯ７Ａ－ＮＴｌｏｎｇ－ｖ３）のポリヌクレオチド配列である。
CTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCAGATCTGGCGCGCCCAATTCGGTACCCTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGAGTCGCTGCGCGCTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTTGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTGAGGGGCTCCGGGAGCTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTTATTGTGCTGTCTCATCATTTTGGCAAAGAATTCTAGCGGCCGCCACCATGGTGATTCTTCAGCAGGGGGACCATGTGTGGATGGACCTGAGATTGGGGCAGGAGTTCGACGTGCCCATCGGGGCGGTGGTGAAGCTCTGCGACTCTGGGCAGGTCCAGGTGGTGGATGATGAAGACAATGAACACTGGATCTCTCCGCAGAACGCAACGCACATCAAGCCTATGCACCCCACGTCGGTCCACGGCGTGGAGGACATGATCCGCCTGGGGGACCTCAACGAGGCGGGCATCTTGCGCAACCTGCTTATCCGCTACCGGGACCACCTCATCTACACGTATACGGGCTCCATCCTGGTGGCTGTGAACCCCTACCAGCTGCTCTCCATCTACTCGCCAGAGCACATCCGCCAGTATACCAACAAGAAGATTGGGGAGATGCCCCCCCACATCTTTGCCATTGCTGACAACTGCTACTTCAACATGAAACGCAACAGCCGAGACCAGTGCTGCATCATCAGTGGGGAATCTGGGGCCGGGAAGACGGAGAGCACAAAGCTGATCCTGCAGTTCCTGGCAGCCATCAGTGGGCAGCACTCGTGGATTGAGCAGCAGGTCTTGGAGGCCACCCCCATTCTGGAAGCATTTGGGAATGCCAAGACCATCCGCAATGACAACTCAAGCCGTTTCGGAAAGTACATCGACATCCACTTCAACAAGCGGGGCGCCATCGAGGGCGCGAAGATTGAGCAGTACCTGCTGGAAAAGTCACGTGTCTGTCGCCAGGCCCTGGATGAAAGGAACTACCACGTGTTCTACTGCATGCTGGAGGGTATGAGTGAGGATCAGAAGAAGAAGCTGGGCTTGGGCCAGGCCTCTGACTACAACTACTTGGCCATGGGTAACTGCATAACCTGTGAGGGCCGGGTGGACAGCCAGGAGTACGCCAACATCCGCTCCGCCATGAAGGTGCTCATGTTCACTGACACCGAGAACTGGGAGATCTCGAAGCTCCTGGCTGCCATCCTGCACCTGGGCAACCTGCAGTATGAGGCACGCACATTTGAAAACCTGGATGCCTGTGAGGTTCTCTTCTCCCCATCGCTGGCCACAGCTGCATCCCTGCTTGAGGTGAACCCCCCAGACCTGATGAGCTGCCTGACTAGCCGCACCCTCATCACCCGCGGGGAGACGGTGTCCACCCCACTGAGCAGGGAACAGGCACTGGACGTGCGCGACGCCTTCGTAAAGGGGATCTACGGGCGGCTGTTCGTGTGGATTGTGGACAAGATCAACGCAGCAATTTACAAGCCTCCCTCCCAGGATGTGAAGAACTCTCGCAGGTCCATCGGCCTCCTGGACATCTTTGGGTTTGAGAACTTTGCTGTGAACAGCTTTGAGCAGCTCTGCATCAACTTCGCCAATGAGCACCTGCAGCAGTTCTTTGTGCGGCACGTGTTCAAGCTGGAGCAGGAGGAATATGACCTGGAGAGCATTGACTGGCTGCACATCGAGTTCACTGACAACCAGGATGCCCTGGACATGATTGCCAACAAGCCCATGAACATCATCTCCCTCATCGATGAGGAGAGCAAGTTCCCCAAGGGCACAGACACCACCATGTTACACAAGCTGAACTCCCAGCACAAGCTCAACGCCAACTACATCCCCCCCAAGAACAACCATGAGACCCAGTTTGGCATCAACCATTTTGCAGGCATCGTCTACTATGAGACCCAAGGCTTCCTGGAGAAGAACCGAGACACCCTGCATGGGGACATTATCCAGCTGGTCCACTCCTCCAGGAACAAGTTCATCAAGCAGATCTTCCAGGCCGATGTCGCCATGGGCGCCGAGACCAGGAAGCGCTCGCCCACACTTAGCAGCCAGTTCAAGCGGTCACTGGAGCTGCTGATGCGCACGCTGGGTGCCTGCCAGCCCTTCTTTGTGCGATGCATCAAGCCCAATGAGTTCAAGAAGCCCATGCTGTTCGACCGGCACCTGTGCGTGCGCCAGCTGCGGTACTCAGGAATGATGGAGACCATCCGAATCCGCCGAGCTGGCTACCCCATCCGCTACAGCTTCGTAGAGTTTGTGGAGCGGTACCGTGTGCTGCTGCCAGGTGTGAAGCCGGCCTACAAGCAGGGCGACCTCCGCGGGACTTGCCAGCGCATGGCTGAGGCTGTGCTGGGCACCCACGATGACTGGCAGATAGGCAAAACCAAGATCTTTCTGAAGGACCACCATGACATGCTGCTGGAAGTGGAGCGGGACAAAGCCATCACCGACAGAGTCATCCTCCTTCAGAAAGTCATCCGGGGATTCAAAGACAGGTCTAACTTTCTGAAGCTGAAGAACGCTGCCACACTGATCCAGAGGCACTGGCGGGGTCACAACTGTAGGAAGAACTACGGGCTGATGCGTCTGGGCTTCCTGCGGCTGCAGGCCCTGCACCGCTCCCGGAAGCTGCACCAGCAGTACCGCCTGGCCCGCCAGCGCATCATCCAGTTCCAGGCCCGCTGCCGCGCCTATCTGGTGCGCAAGGCCTTCCGCCACCGCCTCTGGGCTGTGCTCACCGTGCAGGCCTATGCCCGGGGCATGATCGCCCGCAGGCTGCACCAACGCCTCAGGGCTGAGTATCTGTGGCGCCTCGAGGCTGAGAAAATGCGGCTGGCGGAGGAAGAGAAGCTTCGGAAGGAGATGAGCGCCAAGAAGGCCAAGGAGGAGGCCGAGCGCAAGCATCAGGAGCGCCTGGCCCAGCTGGCTCGTGAGGACGCTGAGCGGGAGCTGAAGGAGAAGGAGGCCGCTCGGCGGAAGAAGGAGCTCCTGGAGCAGATGGAAAGGGCCCGCCATGAGCCTGTCAATCACTCAGACATGGTGGACAAGATGTTTGGCTTCCTGGGGACTTCAGGTGGCCTGCCAGGCCAGGAGGGCCAGGCACCTAGTGGCTTTGAGGACCTGGAGCGAGGGCGGAGGGAGATGGTGGAGGAGGACCTGGATGCAGCCCTGCCCCTGCCTGACGAGGATGAGGAGGACCTCTCTGAGTATAAATTTGCCAAGTTCGCGGCCACCTACTTCCAGGGGACAACCACGCACTCCTACACCCGGCGGCCACTCAAACAGCCACTGCTCTACCATGACGACGAGGGTGACCAGCTGGCAGCCCTGGCGGTCTGGATCACCATCCTCCGCTTCATGGGGGACCTCCCTGAGCCCAAGTACCACACAGCCATGAGTGATGGCAGTGAGAAGATCCCTGTGATGACCAAGATTTATGAGACCCTGGGCAAGAAGACGTACAAGAGGGAGCTGCAGGCCCTGCAGGGCGAGGGCGAGGCCCAGCTCCCCGAGGGCCAGTTAATTAAGCATGCTGGGGAGAGATCTGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAG
配列番号６６（配列番号５０のＮ－ミオシン７Ａ部分のみ）
ATGGTGATTCTTCAGCAGGGGGACCATGTGTGGATGGACCTGAGATTGGGGCAGGAGTTCGACGTGCCCATCGGGGCGGTGGTGAAGCTCTGCGACTCTGGGCAGGTCCAGGTGGTGGATGATGAAGACAATGAACACTGGATCTCTCCGCAGAACGCAACGCACATCAAGCCTATGCACCCCACGTCGGTCCACGGCGTGGAGGACATGATCCGCCTGGGGGACCTCAACGAGGCGGGCATCTTGCGCAACCTGCTTATCCGCTACCGGGACCACCTCATCTACACGTATACGGGCTCCATCCTGGTGGCTGTGAACCCCTACCAGCTGCTCTCCATCTACTCGCCAGAGCACATCCGCCAGTATACCAACAAGAAGATTGGGGAGATGCCCCCCCACATCTTTGCCATTGCTGACAACTGCTACTTCAACATGAAACGCAACAGCCGAGACCAGTGCTGCATCATCAGTGGGGAATCTGGGGCCGGGAAGACGGAGAGCACAAAGCTGATCCTGCAGTTCCTGGCAGCCATCAGTGGGCAGCACTCGTGGATTGAGCAGCAGGTCTTGGAGGCCACCCCCATTCTGGAAGCATTTGGGAATGCCAAGACCATCCGCAATGACAACTCAAGCCGTTTCGGAAAGTACATCGACATCCACTTCAACAAGCGGGGCGCCATCGAGGGCGCGAAGATTGAGCAGTACCTGCTGGAAAAGTCACGTGTCTGTCGCCAGGCCCTGGATGAAAGGAACTACCACGTGTTCTACTGCATGCTGGAGGGTATGAGTGAGGATCAGAAGAAGAAGCTGGGCTTGGGCCAGGCCTCTGACTACAACTACTTGGCCATGGGTAACTGCATAACCTGTGAGGGCCGGGTGGACAGCCAGGAGTACGCCAACATCCGCTCCGCCATGAAGGTGCTCATGTTCACTGACACCGAGAACTGGGAGATCTCGAAGCTCCTGGCTGCCATCCTGCACCTGGGCAACCTGCAGTATGAGGCACGCACATTTGAAAACCTGGATGCCTGTGAGGTTCTCTTCTCCCCATCGCTGGCCACAGCTGCATCCCTGCTTGAGGTGAACCCCCCAGACCTGATGAGCTGCCTGACTAGCCGCACCCTCATCACCCGCGGGGAGACGGTGTCCACCCCACTGAGCAGGGAACAGGCACTGGACGTGCGCGACGCCTTCGTAAAGGGGATCTACGGGCGGCTGTTCGTGTGGATTGTGGACAAGATCAACGCAGCAATTTACAAGCCTCCCTCCCAGGATGTGAAGAACTCTCGCAGGTCCATCGGCCTCCTGGACATCTTTGGGTTTGAGAACTTTGCTGTGAACAGCTTTGAGCAGCTCTGCATCAACTTCGCCAATGAGCACCTGCAGCAGTTCTTTGTGCGGCACGTGTTCAAGCTGGAGCAGGAGGAATATGACCTGGAGAGCATTGACTGGCTGCACATCGAGTTCACTGACAACCAGGATGCCCTGGACATGATTGCCAACAAGCCCATGAACATCATCTCCCTCATCGATGAGGAGAGCAAGTTCCCCAAGGGCACAGACACCACCATGTTACACAAGCTGAACTCCCAGCACAAGCTCAACGCCAACTACATCCCCCCCAAGAACAACCATGAGACCCAGTTTGGCATCAACCATTTTGCAGGCATCGTCTACTATGAGACCCAAGGCTTCCTGGAGAAGAACCGAGACACCCTGCATGGGGACATTATCCAGCTGGTCCACTCCTCCAGGAACAAGTTCATCAAGCAGATCTTCCAGGCCGATGTCGCCATGGGCGCCGAGACCAGGAAGCGCTCGCCCACACTTAGCAGCCAGTTCAAGCGGTCACTGGAGCTGCTGATGCGCACGCTGGGTGCCTGCCAGCCCTTCTTTGTGCGATGCATCAAGCCCAATGAGTTCAAGAAGCCCATGCTGTTCGACCGGCACCTGTGCGTGCGCCAGCTGCGGTACTCAGGAATGATGGAGACCATCCGAATCCGCCGAGCTGGCTACCCCATCCGCTACAGCTTCGTAGAGTTTGTGGAGCGGTACCGTGTGCTGCTGCCAGGTGTGAAGCCGGCCTACAAGCAGGGCGACCTCCGCGGGACTTGCCAGCGCATGGCTGAGGCTGTGCTGGGCACCCACGATGACTGGCAGATAGGCAAAACCAAGATCTTTCTGAAGGACCACCATGACATGCTGCTGGAAGTGGAGCGGGACAAAGCCATCACCGACAGAGTCATCCTCCTTCAGAAAGTCATCCGGGGATTCAAAGACAGGTCTAACTTTCTGAAGCTGAAGAACGCTGCCACACTGATCCAGAGGCACTGGCGGGGTCACAACTGTAGGAAGAACTACGGGCTGATGCGTCTGGGCTTCCTGCGGCTGCAGGCCCTGCACCGCTCCCGGAAGCTGCACCAGCAGTACCGCCTGGCCCGCCAGCGCATCATCCAGTTCCAGGCCCGCTGCCGCGCCTATCTGGTGCGCAAGGCCTTCCGCCACCGCCTCTGGGCTGTGCTCACCGTGCAGGCCTATGCCCGGGGCATGATCGCCCGCAGGCTGCACCAACGCCTCAGGGCTGAGTATCTGTGGCGCCTCGAGGCTGAGAAAATGCGGCTGGCGGAGGAAGAGAAGCTTCGGAAGGAGATGAGCGCCAAGAAGGCCAAGGAGGAGGCCGAGCGCAAGCATCAGGAGCGCCTGGCCCAGCTGGCTCGTGAGGACGCTGAGCGGGAGCTGAAGGAGAAGGAGGCCGCTCGGCGGAAGAAGGAGCTCCTGGAGCAGATGGAAAGGGCCCGCCATGAGCCTGTCAATCACTCAGACATGGTGGACAAGATGTTTGGCTTCCTGGGGACTTCAGGTGGCCTGCCAGGCCAGGAGGGCCAGGCACCTAGTGGCTTTGAGGACCTGGAGCGAGGGCGGAGGGAGATGGTGGAGGAGGACCTGGATGCAGCCCTGCCCCTGCCTGACGAGGATGAGGAGGACCTCTCTGAGTATAAATTTGCCAAGTTCGCGGCCACCTACTTCCAGGGGACAACCACGCACTCCTACACCCGGCGGCCACTCAAACAGCCACTGCTCTACCATGACGACGAGGGTGACCAGCTGGCAGCCCTGGCGGTCTGGATCACCATCCTCCGCTTCATGGGGGACCTCCCTGAGCCCAAGTACCACACAGCCATGAGTGATGGCAGTGAGAAGATCCCTGTGATGACCAAGATTTATGAGACCCTGGGCAAGAAGACGTACAAGAGGGAGCTGCAGGCCCTGCAGGGCGAGGGCGAGGCCCAGCTCCCCGAGGGCCAG
配列番号６５（配列番号５０のＮ－ミオシン７Ａ部分によってコードされるペプチド）
MVILQQGDHVWMDLRLGQEFDVPIGAVVKLCDSGQVQVVDDEDNEHWISPQNATHIKPMHPTSVHGVEDMIRLGDLNEAGILRNLLIRYRDHLIYTYTGSILVAVNPYQLLSIYSPEHIRQYTNKKIGEMPPHIFAIADNCYFNMKRNSRDQCCIISGESGAGKTESTKLILQFLAAISGQHSWIEQQVLEATPILEAFGNAKTIRNDNSSRFGKYIDIHFNKRGAIEGAKIEQYLLEKSRVCRQALDERNYHVFYCMLEGMSEDQKKKLGLGQASDYNYLAMGNCITCEGRVDSQEYANIRSAMKVLMFTDTENWEISKLLAAILHLGNLQYEARTFENLDACEVLFSPSLATAASLLEVNPPDLMSCLTSRTLITRGETVSTPLSREQALDVRDAFVKGIYGRLFVWIVDKINAAIYKPPSQDVKNSRRSIGLLDIFGFENFAVNSFEQLCINFANEHLQQFFVRHVFKLEQEEYDLESIDWLHIEFTDNQDALDMIANKPMNIISLIDEESKFPKGTDTTMLHKLNSQHKLNANYIPPKNNHETQFGINHFAGIVYYETQGFLEKNRDTLHGDIIQLVHSSRNKFIKQIFQADVAMGAETRKRSPTLSSQFKRSLELLMRTLGACQPFFVRCIKPNEFKKPMLFDRHLCVRQLRYSGMMETIRIRRAGYPIRYSFVEFVERYRVLLPGVKPAYKQGDLRGTCQRMAEAVLGTHDDWQIGKTKIFLKDHHDMLLEVERDKAITDRVILLQKVIRGFKDRSNFLKLKNAATLIQRHWRGHNCRKNYGLMRLGFLRLQALHRSRKLHQQYRLARQRIIQFQARCRAYLVRKAFRHRLWAVLTVQAYARGMIARRLHQRLRAEYLWRLEAEKMRLAEEEKLRKEMSAKKAKEEAERKHQERLAQLAREDAERELKEKEAARRKKELLEQMERARHEPVNHSDMVDKMFGFLGTSGGLPGQEGQAPSGFEDLERGRREMVEEDLDAALPLPDEDEEDLSEYKFAKFAATYFQGTTTHSYTRRPLKQPLLYHDDEGDQLAALAVWITILRFMGDLPEPKYHTAMSDGSEKIPVMTKIYETLGKKTYKRELQALQGEGEAQLPEGQ
配列番号５１は、第３世代オーバーラップバックハーフベクター（すなわち、ＡＡＶ－ｈＭＹＯ７Ａ－ＣＴｌｏｎｇ－ｖ３．ＨＡ）のポリヌクレオチド配列である。
CTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCAGATCTGGCGCGCCCTGGCGGAGGAAGAGAAGCTTCGGAAGGAGATGAGCGCCAAGAAGGCCAAGGAGGAGGCCGAGCGCAAGCATCAGGAGCGCCTGGCCCAGCTGGCTCGTGAGGACGCTGAGCGGGAGCTGAAGGAGAAGGAGGCCGCTCGGCGGAAGAAGGAGCTCCTGGAGCAGATGGAAAGGGCCCGCCATGAGCCTGTCAATCACTCAGACATGGTGGACAAGATGTTTGGCTTCCTGGGGACTTCAGGTGGCCTGCCAGGCCAGGAGGGCCAGGCACCTAGTGGCTTTGAGGACCTGGAGCGAGGGCGGAGGGAGATGGTGGAGGAGGACCTGGATGCAGCCCTGCCCCTGCCTGACGAGGATGAGGAGGACCTCTCTGAGTATAAATTTGCCAAGTTCGCGGCCACCTACTTCCAGGGGACAACCACGCACTCCTACACCCGGCGGCCACTCAAACAGCCACTGCTCTACCATGACGACGAGGGTGACCAGCTGGCAGCCCTGGCGGTCTGGATCACCATCCTCCGCTTCATGGGGGACCTCCCTGAGCCCAAGTACCACACAGCCATGAGTGATGGCAGTGAGAAGATCCCTGTGATGACCAAGATTTATGAGACCCTGGGCAAGAAGACGTACAAGAGGGAGCTGCAGGCCCTGCAGGGCGAGGGCGAGGCCCAGCTCCCCGAGGGCCAGAAGAAGAGCAGTGTGAGGCACAAGCTGGTGCATTTGACTCTGAAAAAGAAGTCCAAGCTCACAGAGGAGGTGACCAAGAGGCTGCATGACGGGGAGTCCACAGTGCAGGGCAACAGCATGCTGGAGGACCGGCCCACCTCCAACCTGGAGAAGCTGCACTTCATCATCGGCAATGGCATCCTGCGGCCAGCACTCCGGGACGAGATCTACTGCCAGATCAGCAAGCAGCTGACCCACAACCCCTCCAAGAGCAGCTATGCCCGGGGCTGGATTCTCGTGTCTCTCTGCGTGGGCTGTTTCGCCCCCTCCGAGAAGTTTGTCAAGTACCTGCGGAACTTCATCCACGGGGGCCCGCCCGGCTACGCCCCGTACTGTGAGGAGCGCCTGAGAAGGACCTTTGTCAATGGGACACGGACACAGCCGCCCAGCTGGCTGGAGCTGCAGGCCACCAAGTCCAAGAAGCCAATCATGTTGCCCGTGACATTCATGGATGGGACCACCAAGACCCTGCTGACGGACTCGGCAACCACGGCCAAGGAGCTCTGCAACGCGCTGGCCGACAAGATCTCTCTCAAGGACCGGTTCGGGTTCTCCCTCTACATTGCCCTGTTTGACAAGGTGTCCTCCCTGGGCAGCGGCAGTGACCACGTCATGGACGCCATCTCCCAGTGCGAGCAGTACGCCAAGGAGCAGGGCGCCCAGGAGCGCAACGCCCCCTGGAGGCTCTTCTTCCGCAAAGAGGTCTTCACGCCCTGGCACAGCCCCTCCGAGGACAACGTGGCCACCAACCTCATCTACCAGCAGGTGGTGCGAGGAGTCAAGTTTGGGGAGTACAGGTGTGAGAAGGAGGACGACCTGGCTGAGCTGGCCTCCCAGCAGTACTTTGTAGACTATGGCTCTGAGATGATCCTGGAGCGCCTCCTGAACCTCGTGCCCACCTACATCCCCGACCGCGAGATCACGCCCCTGAAGACGCTGGAGAAGTGGGCCCAGCTGGCCATCGCCGCCCACAAGAAGGGGATTTATGCCCAGAGGAGAACTGATGCCCAGAAGGTCAAAGAGGATGTGGTCAGTTATGCCCGCTTCAAGTGGCCCTTGCTCTTCTCCAGGTTTTATGAAGCCTACAAATTCTCAGGCCCCAGTCTCCCCAAGAACGACGTCATCGTGGCCGTCAACTGGACGGGTGTGTACTTTGTGGATGAGCAGGAGCAGGTACTTCTGGAGCTGTCCTTCCCAGAGATCATGGCCGTGTCCAGCAGCAGGGGAGCGAAAACGACGGCCCCCAGCTTCACGCTGGCCACCATCAAGGGGGACGAATACACCTTCACCTCCAGCAATGCTGAGGACATTCGTGACCTGGTGGTCACCTTCCTAGAGGGGCTCCGGAAGAGATCTAAGTATGTTGTGGCCCTGCAGGATAACCCCAACCCCGCAGGCGAGGAGTCAGGCTTCCTCAGCTTTGCCAAGGGAGACCTCATCATCCTGGACCATGACACGGGCGAGCAGGTCATGAACTCGGGCTGGGCCAACGGCATCAATGAGAGGACCAAGCAGCGTGGGGACTTCCCCACCGACAGTGTGTACGTCATGCCCACTGTCACCATGCCACCGCGGGAGATTGTGGCCCTGGTCACCATGACTCCCGATCAGAGGCAGGACGTTGTCCGGCTCTTGCAGCTGCGAACGGCGGAGCCCGAGGTGCGTGCCAAGCCCTACACGCTGGAGGAGTTTTCCTATGACTACTTCAGGCCCCCACCCAAGCACACGCTGAGCCGTGTCATGGTGTCCAAGGCCCGAGGCAAGGACCGGCTGTGGAGCCACACGCGGGAACCGCTCAAGCAGGCGCTGCTCAAGAAGCTCCTGGGCAGTGAGGAGCTCTCGCAGGAGGCCTGCCTGGCCTTCATTGCTGTGCTCAAGTACATGGGCGACTACCCGTCCAAGAGGACACGCTCCGTCAACGAGCTCACCGACCAGATCTTTGAGGGTCCCCTGAAAGCCGAGCCCCTGAAGGACGAGGCATATGTGCAGATCCTGAAGCAGCTGACCGACAACCACATCAGGTACAGCGAGGAGCGGGGTTGGGAGCTGCTCTGGCTGTGCACGGGCCTTTTCCCACCCAGCAACATCCTCCTGCCCCACGTGCAGCGCTTCCTGCAGTCCCGAAAGCACTGCCCACTCGCCATCGACTGCCTGCAACGGCTCCAGAAAGCCCTGAGAAACGGGTCCCGGAAGTACCCTCCGCACCTGGTGGAGGTGGAGGCCATCCAGCACAAGACCACCCAGATTTTCCACAAAGTCTACTTCCCTGATGACACTGACGAGGCCTTCGAAGTGGAGTCCAGCACCAAGGCCAAGGACTTCTGCCAGAACATCGCCACCAGGCTGCTCCTCAAGTCCTCAGAGGGATTCAGCCTCTTTGTCAAAATTGCAGACAAGGTCATCAGCGTTCCTGAGAATGACTTCTTCTTTGACTTTGTTCGACACTTGACAGACTGGATAAAGAAAGCTCGGCCCATCAAGGACGGAATTGTGCCCTCACTCACCTACCAGGTGTTCTTCATGAAGAAGCTGTGGACCACCACGGTGCCAGGGAAGGATCCCATGGCCGATTCCATCTTCCACTATTACCAGGAGTTGCCCAAGTATCTCCGAGGCTACCACAAGTGCACGCGGGAGGAGGTGCTGCAGCTGGGGGCGCTGATCTACAGGGTCAAGTTCGAGGAGGACAAGTCCTACTTCCCCAGCATCCCCAAGCTGCTGCGGGAGCTGGTGCCCCAGGACCTTATCCGGCAGGTCTCACCTGATGACTGGAAGCGGTCCATCGTCGCCTACTTCAACAAGCACGCAGGGAAGTCCAAGGAGGAGGCCAAGCTGGCCTTCCTGAAGCTCATCTTCAAGTGGCCCACCTTTGGCTCAGCCTTCTTCGAGGTGAAGCAAACTACGGAGCCAAACTTCCCTGAGATCCTCCTAATTGCCATCAACAAGTATGGGGTCAGCCTCATCGATCCCAAAACGAAGGATATCCTCACCACTCATCCCTTCACCAAGATCTCCAACTGGAGCAGCGGCAACACCTACTTCCACATCACCATTGGGAACTTGGTGCGCGGGAGCAAACTGCTCTGCGAGACGTCACTGGGCTACAAGATGGATGACCTCCTGACTTCCTACATTAGCCAGATGCTCACAGCCATGAGCAAACAGCGGGGCTCCAGGAGCGGCAAGTACCCTTACGATGTACCGGATTACGCATGAGGTACCAAGGGCGAATTCTGCAGTCGACTAGAGCTCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGAGAGATCTGAGGACTAGTCCGTCGACTGTTAATTAAGCATGCTGGGGAGAGATCTGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAG
配列番号８０（ｈＭＹＯ７Ａ ｃ末端（例えば、ＡＡＶ－ｈＭＹＯ７Ａ－ＣＴｌｏｎｇ－ｖ３．ＨＡ）
CTGGCGGAGGAAGAGAAGCTTCGGAAGGAGATGAGCGCCAAGAAGGCCAAGGAGGAGGCCGAGCGCAAGCATCAGGAGCGCCTGGCCCAGCTGGCTCGTGAGGACGCTGAGCGGGAGCTGAAGGAGAAGGAGGCCGCTCGGCGGAAGAAGGAGCTCCTGGAGCAGATGGAAAGGGCCCGCCATGAGCCTGTCAATCACTCAGACATGGTGGACAAGATGTTTGGCTTCCTGGGGACTTCAGGTGGCCTGCCAGGCCAGGAGGGCCAGGCACCTAGTGGCTTTGAGGACCTGGAGCGAGGGCGGAGGGAGATGGTGGAGGAGGACCTGGATGCAGCCCTGCCCCTGCCTGACGAGGATGAGGAGGACCTCTCTGAGTATAAATTTGCCAAGTTCGCGGCCACCTACTTCCAGGGGACAACCACGCACTCCTACACCCGGCGGCCACTCAAACAGCCACTGCTCTACCATGACGACGAGGGTGACCAGCTGGCAGCCCTGGCGGTCTGGATCACCATCCTCCGCTTCATGGGGGACCTCCCTGAGCCCAAGTACCACACAGCCATGAGTGATGGCAGTGAGAAGATCCCTGTGATGACCAAGATTTATGAGACCCTGGGCAAGAAGACGTACAAGAGGGAGCTGCAGGCCCTGCAGGGCGAGGGCGAGGCCCAGCTCCCCGAGGGCCAGAAGAAGAGCAGTGTGAGGCACAAGCTGGTGCATTTGACTCTGAAAAAGAAGTCCAAGCTCACAGAGGAGGTGACCAAGAGGCTGCATGACGGGGAGTCCACAGTGCAGGGCAACAGCATGCTGGAGGACCGGCCCACCTCCAACCTGGAGAAGCTGCACTTCATCATCGGCAATGGCATCCTGCGGCCAGCACTCCGGGACGAGATCTACTGCCAGATCAGCAAGCAGCTGACCCACAACCCCTCCAAGAGCAGCTATGCCCGGGGCTGGATTCTCGTGTCTCTCTGCGTGGGCTGTTTCGCCCCCTCCGAGAAGTTTGTCAAGTACCTGCGGAACTTCATCCACGGGGGCCCGCCCGGCTACGCCCCGTACTGTGAGGAGCGCCTGAGAAGGACCTTTGTCAATGGGACACGGACACAGCCGCCCAGCTGGCTGGAGCTGCAGGCCACCAAGTCCAAGAAGCCAATCATGTTGCCCGTGACATTCATGGATGGGACCACCAAGACCCTGCTGACGGACTCGGCAACCACGGCCAAGGAGCTCTGCAACGCGCTGGCCGACAAGATCTCTCTCAAGGACCGGTTCGGGTTCTCCCTCTACATTGCCCTGTTTGACAAGGTGTCCTCCCTGGGCAGCGGCAGTGACCACGTCATGGACGCCATCTCCCAGTGCGAGCAGTACGCCAAGGAGCAGGGCGCCCAGGAGCGCAACGCCCCCTGGAGGCTCTTCTTCCGCAAAGAGGTCTTCACGCCCTGGCACAGCCCCTCCGAGGACAACGTGGCCACCAACCTCATCTACCAGCAGGTGGTGCGAGGAGTCAAGTTTGGGGAGTACAGGTGTGAGAAGGAGGACGACCTGGCTGAGCTGGCCTCCCAGCAGTACTTTGTAGACTATGGCTCTGAGATGATCCTGGAGCGCCTCCTGAACCTCGTGCCCACCTACATCCCCGACCGCGAGATCACGCCCCTGAAGACGCTGGAGAAGTGGGCCCAGCTGGCCATCGCCGCCCACAAGAAGGGGATTTATGCCCAGAGGAGAACTGATGCCCAGAAGGTCAAAGAGGATGTGGTCAGTTATGCCCGCTTCAAGTGGCCCTTGCTCTTCTCCAGGTTTTATGAAGCCTACAAATTCTCAGGCCCCAGTCTCCCCAAGAACGACGTCATCGTGGCCGTCAACTGGACGGGTGTGTACTTTGTGGATGAGCAGGAGCAGGTACTTCTGGAGCTGTCCTTCCCAGAGATCATGGCCGTGTCCAGCAGCAGGGGAGCGAAAACGACGGCCCCCAGCTTCACGCTGGCCACCATCAAGGGGGACGAATACACCTTCACCTCCAGCAATGCTGAGGACATTCGTGACCTGGTGGTCACCTTCCTAGAGGGGCTCCGGAAGAGATCTAAGTATGTTGTGGCCCTGCAGGATAACCCCAACCCCGCAGGCGAGGAGTCAGGCTTCCTCAGCTTTGCCAAGGGAGACCTCATCATCCTGGACCATGACACGGGCGAGCAGGTCATGAACTCGGGCTGGGCCAACGGCATCAATGAGAGGACCAAGCAGCGTGGGGACTTCCCCACCGACAGTGTGTACGTCATGCCCACTGTCACCATGCCACCGCGGGAGATTGTGGCCCTGGTCACCATGACTCCCGATCAGAGGCAGGACGTTGTCCGGCTCTTGCAGCTGCGAACGGCGGAGCCCGAGGTGCGTGCCAAGCCCTACACGCTGGAGGAGTTTTCCTATGACTACTTCAGGCCCCCACCCAAGCACACGCTGAGCCGTGTCATGGTGTCCAAGGCCCGAGGCAAGGACCGGCTGTGGAGCCACACGCGGGAACCGCTCAAGCAGGCGCTGCTCAAGAAGCTCCTGGGCAGTGAGGAGCTCTCGCAGGAGGCCTGCCTGGCCTTCATTGCTGTGCTCAAGTACATGGGCGACTACCCGTCCAAGAGGACACGCTCCGTCAACGAGCTCACCGACCAGATCTTTGAGGGTCCCCTGAAAGCCGAGCCCCTGAAGGACGAGGCATATGTGCAGATCCTGAAGCAGCTGACCGACAACCACATCAGGTACAGCGAGGAGCGGGGTTGGGAGCTGCTCTGGCTGTGCACGGGCCTTTTCCCACCCAGCAACATCCTCCTGCCCCACGTGCAGCGCTTCCTGCAGTCCCGAAAGCACTGCCCACTCGCCATCGACTGCCTGCAACGGCTCCAGAAAGCCCTGAGAAACGGGTCCCGGAAGTACCCTCCGCACCTGGTGGAGGTGGAGGCCATCCAGCACAAGACCACCCAGATTTTCCACAAAGTCTACTTCCCTGATGACACTGACGAGGCCTTCGAAGTGGAGTCCAGCACCAAGGCCAAGGACTTCTGCCAGAACATCGCCACCAGGCTGCTCCTCAAGTCCTCAGAGGGATTCAGCCTCTTTGTCAAAATTGCAGACAAGGTCATCAGCGTTCCTGAGAATGACTTCTTCTTTGACTTTGTTCGACACTTGACAGACTGGATAAAGAAAGCTCGGCCCATCAAGGACGGAATTGTGCCCTCACTCACCTACCAGGTGTTCTTCATGAAGAAGCTGTGGACCACCACGGTGCCAGGGAAGGATCCCATGGCCGATTCCATCTTCCACTATTACCAGGAGTTGCCCAAGTATCTCCGAGGCTACCACAAGTGCACGCGGGAGGAGGTGCTGCAGCTGGGGGCGCTGATCTACAGGGTCAAGTTCGAGGAGGACAAGTCCTACTTCCCCAGCATCCCCAAGCTGCTGCGGGAGCTGGTGCCCCAGGACCTTATCCGGCAGGTCTCACCTGATGACTGGAAGCGGTCCATCGTCGCCTACTTCAACAAGCACGCAGGGAAGTCCAAGGAGGAGGCCAAGCTGGCCTTCCTGAAGCTCATCTTCAAGTGGCCCACCTTTGGCTCAGCCTTCTTCGAGGTGAAGCAAACTACGGAGCCAAACTTCCCTGAGATCCTCCTAATTGCCATCAACAAGTATGGGGTCAGCCTCATCGATCCCAAAACGAAGGATATCCTCACCACTCATCCCTTCACCAAGATCTCCAACTGGAGCAGCGGCAACACCTACTTCCACATCACCATTGGGAACTTGGTGCGCGGGAGCAAACTGCTCTGCGAGACGTCACTGGGCTACAAGATGGATGACCTCCTGACTTCCTACATTAGCCAGATGCTCACAGCCATGAGCAAACAGCGGGGCTCCAGGAGCGGCAAG
配列番号８１（ｈＭＹＯ７Ａ ｃ末端（例えば、ＡＡＶ－ｈＭＹＯ７Ａ－ＣＴｌｏｎｇ－ｖ３．ＨＡ）
LAEEEKLRKEMSAKKAKEEAERKHQERLAQLAREDAERELKEKEAARRKKELLEQMERARHEPVNHSDMVDKMFGFLGTSGGLPGQEGQAPSGFEDLERGRREMVEEDLDAALPLPDEDEEDLSEYKFAKFAATYFQGTTTHSYTRRPLKQPLLYHDDEGDQLAALAVWITILRFMGDLPEPKYHTAMSDGSEKIPVMTKIYETLGKKTYKRELQALQGEGEAQLPEGQKKSSVRHKLVHLTLKKKSKLTEEVTKRLHDGESTVQGNSMLEDRPTSNLEKLHFIIGNGILRPALRDEIYCQISKQLTHNPSKSSYARGWILVSLCVGCFAPSEKFVKYLRNFIHGGPPGYAPYCEERLRRTFVNGTRTQPPSWLELQATKSKKPIMLPVTFMDGTTKTLLTDSATTAKELCNALADKISLKDRFGFSLYIALFDKVSSLGSGSDHVMDAISQCEQYAKEQGAQERNAPWRLFFRKEVFTPWHSPSEDNVATNLIYQQVVRGVKFGEYRCEKEDDLAELASQQYFVDYGSEMILERLLNLVPTYIPDREITPLKTLEKWAQLAIAAHKKGIYAQRRTDAQKVKEDVVSYARFKWPLLFSRFYEAYKFSGPSLPKNDVIVAVNWTGVYFVDEQEQVLLELSFPEIMAVSSSRGAKTTAPSFTLATIKGDEYTFTSSNAEDIRDLVVTFLEGLRKRSKYVVALQDNPNPAGEESGFLSFAKGDLIILDHDTGEQVMNSGWANGINERTKQRGDFPTDSVYVMPTVTMPPREIVALVTMTPDQRQDVVRLLQLRTAEPEVRAKPYTLEEFSYDYFRPPPKHTLSRVMVSKARGKDRLWSHTREPLKQALLKKLLGSEELSQEACLAFIAVLKYMGDYPSKRTRSVNELTDQIFEGPLKAEPLKDEAYVQILKQLTDNHIRYSEERGWELLWLCTGLFPPSNILLPHVQRFLQSRKHCPLAIDCLQRLQKALRNGSRKYPPHLVEVEAIQHKTTQIFHKVYFPDDTDEAFEVESSTKAKDFCQNIATRLLLKSSEGFSLFVKIADKVISVPENDFFFDFVRHLTDWIKKARPIKDGIVPSLTYQVFFMKKLWTTTVPGKDPMADSIFHYYQELPKYLRGYHKCTREEVLQLGALIYRVKFEEDKSYFPSIPKLLRELVPQDLIRQVSPDDWKRSIVAYFNKHAGKSKEEAKLAFLKLIFKWPTFGSAFFEVKQTTEPNFPEILLIAINKYGVSLIDPKTKDILTTHPFTKISNWSSGNTYFHITIGNLVRGSKLLCETSLGYKMDDLLTSYISQMLTAMSKQRGSRSGK
一部の実施形態では、本明細書において提供されるオーバーラップポリヌクレオチドベクターは、本明細書において提供されるオーバーラップ配列のいずれかに対して８０％、８５％、９０％、９２．５％、９５％、９８％または９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むオーバーラップの領域を含む。一部の実施形態では、オーバーラップする領域は、配列番号３９および５２～５９のいずれか１つに対して８０％、８５％、９０％、９２．５％、９５％、９８％または９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、オーバーラップする領域は、配列番号３９および５３～５９のいずれか１つに対して８０％、８５％、９０％、９２．５％、９５％、９８％または９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、オーバーラップする領域（またはオーバーラップするポリヌクレオチド配列）は、配列番号３９、５６または５７に対して８０％、８５％、９０％、９２．５％、９５％、９８％または９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、オーバーラップするポリヌクレオチド配列は、配列番号３９および５２～５９のいずれか１つから選択されるヌクレオチド配列を含む。本明細書において提供されるオーバーラップベクターは、配列番号３９および５２～５９のいずれか１つと、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１０～１５、１５～２０、２０～２５または２５より多いヌクレオチドだけ異なる、オーバーラップするポリヌクレオチド配列を含む場合がある。一部の実施形態では、これらのオーバーラップベクターは、本明細書において開示される２つのオーバーラップする配列、例えば、相互排他的配列である配列番号３９および５６または相互排他的配列である配列番号３９および５７を含有する。
例示的実施形態では、オーバーラップするポリヌクレオチド配列は、配列番号５６を含む。一部の実施形態では、オーバーラップするポリヌクレオチド配列は、配列番号５７を含む。一部の実施形態では、オーバーラップするポリヌクレオチド配列は、配列番号３９を含む。一部の実施形態では、オーバーラップするポリヌクレオチド配列は、配列番号５２を含まない。
一部の実施形態では、本明細書において提供されるオーバーラップポリヌクレオチドベクターは、配列番号７９および８２～８９のいずれかに対して９５％、９８％または９９％またはそれより大きい配列同一性を含むアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするオーバーラップの領域（オーバーラップするポリヌクレオチド配列）を含む。例示的実施形態では、これらのベクターは、配列番号７９および８２～８９のいずれか１つのアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするオーバーラップの領域（オーバーラップするポリヌクレオチド配列）を含む。例示的実施形態では、これらのベクターは、配列番号７９および８３～８９のいずれか１つのアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするオーバーラップの領域（オーバーラップするポリヌクレオチド配列）を含む。一部の実施形態では、オーバーラップするポリヌクレオチド配列は、配列番号８２のアミノ酸配列をコードしない。
種々の実施形態では、本明細書において提供されるオーバーラップポリヌクレオチドベクターは、約１３６５ｂｐ、１２８４ｂｐ、１０２７ｂｐ、１０２６ｂｐ、９４５ｂｐ、６８７ｂｐ、３６１ｂｐ、２７９ｂｐまたは２０ｂｐの長さを有するポリペプチドコード配列中にオーバーラップの領域を含有する。一部の実施形態では、オーバーラップベクターは、１０００ｂｐ未満の長さのオーバーラップの領域を含有する。一部の実施形態では、オーバーラップベクターは、１３６５ｂｐ未満のオーバーラップの領域を含有する。一部の実施形態では、オーバーラップベクターは、７００ｂｐ未満のオーバーラップの領域を含有する。一部の実施形態では、オーバーラップの領域は、約２０～１００ヌクレオチド、約１００～５００ヌクレオチド、約１００～２００ヌクレオチド、約２００～３００ヌクレオチドまたは約３００～４００ヌクレオチドの間の長さを有する。
種々の実施形態では、本明細書において提供されるオーバーラップポリヌクレオチドベクターは、正確に１３６５ｂｐ、１２８４ｂｐ、１０２７ｂｐ、１０２６ｂｐ、９４５ｂｐ、６８７ｂｐ、３６１ｂｐ、２７９ｂｐまたは２０ｂｐの長さを有するオーバーラップの領域を含有する。オーバーラップの領域は、コード配列中で互いに相互排他的である場合があることは理解される。一部の実施形態では、オーバーラップポリヌクレオチドベクターは、１または複数のオーバーラップの領域を含有する、例えば、２つのオーバーラップの領域を含有する。一部の実施形態では、オーバーラップベクターは、３６１ｂｐおよび６８７ｂｐの長さを有する２つのオーバーラップの領域を含有する。
例示的実施形態では、本明細書において提供されるオーバーラップポリヌクレオチドベクターは、６８７または９４５ｂｐの長さを有するオーバーラップの領域を含有する。一部の実施形態では、これらのベクターは、６８７または９４５ｂｐの長さを有するオーバーラップするＭＹＯ７Ａ配列の領域を含有する。一部の実施形態では、オーバーラップベクターは、３６１ｂｐの長さを有するオーバーラップの領域を含有する。
１３６５ｂｐのオーバーラップ（配列番号５２）。
CAGGTCTAACTTTCTGAAGCTGAAGAACGCTGCCACACTGATCCAGAGGCACTGGCGGGGTCACAACTGTAGGAAGAACTACGGGCTGATGCGTCTGGGCTTCCTGCGGCTGCAGGCCCTGCACCGCTCCCGGAAGCTGCACCAGCAGTACCGCCTGGCCCGCCAGCGCATCATCCAGTTCCAGGCCCGCTGCCGCGCCTATCTGGTGCGCAAGGCCTTCCGCCACCGCCTCTGGGCTGTGCTCACCGTGCAGGCCTATGCCCGGGGCATGATCGCCCGCAGGCTGCACCAACGCCTCAGGGCTGAGTATCTGTGGCGCCTCGAGGCTGAGAAAATGCGGCTGGCGGAGGAAGAGAAGCTTCGGAAGGAGATGAGCGCCAAGAAGGCCAAGGAGGAGGCCGAGCGCAAGCATCAGGAGCGCCTGGCCCAGCTGGCTCGTGAGGACGCTGAGCGGGAGCTGAAGGAGAAGGAGGCCGCTCGGCGGAAGAAGGAGCTCCTGGAGCAGATGGAAAGGGCCCGCCATGAGCCTGTCAATCACTCAGACATGGTGGACAAGATGTTTGGCTTCCTGGGGACTTCAGGTGGCCTGCCAGGCCAGGAGGGCCAGGCACCTAGTGGCTTTGAGGACCTGGAGCGAGGGCGGAGGGAGATGGTGGAGGAGGACCTGGATGCAGCCCTGCCCCTGCCTGACGAGGATGAGGAGGACCTCTCTGAGTATAAATTTGCCAAGTTCGCGGCCACCTACTTCCAGGGGACAACCACGCACTCCTACACCCGGCGGCCACTCAAACAGCCACTGCTCTACCATGACGACGAGGGTGACCAGCTGGCAGCCCTGGCGGTCTGGATCACCATCCTCCGCTTCATGGGGGACCTCCCTGAGCCCAAGTACCACACAGCCATGAGTGATGGCAGTGAGAAGATCCCTGTGATGACCAAGATTTATGAGACCCTGGGCAAGAAGACGTACAAGAGGGAGCTGCAGGCCCTGCAGGGCGAGGGCGAGGCCCAGCTCCCCGAGGGCCAGAAGAAGAGCAGTGTGAGGCACAAGCTGGTGCATTTGACTCTGAAAAAGAAGTCCAAGCTCACAGAGGAGGTGACCAAGAGGCTGCATGACGGGGAGTCCACAGTGCAGGGCAACAGCATGCTGGAGGACCGGCCCACCTCCAACCTGGAGAAGCTGCACTTCATCATCGGCAATGGCATCCTGCGGCCAGCACTCCGGGACGAGATCTACTGCCAGATCAGCAAGCAGCTGACCCACAACCCCTCCAAGAGCAGCTATGCCCGGGGCTGGATTCTCGTGTCTCTCTGCGTGGGCTGTTTCGCCCCCTCCGAGAAGTTTGTCAAGTACCTGCGGAACTTC
配列番号８２（配列番号５２に対応するタンパク質配列）
RSNFLKLKNAATLIQRHWRGHNCRKNYGLMRLGFLRLQALHRSRKLHQQYRLARQRIIQFQARCRAYLVRKAFRHRLWAVLTVQAYARGMIARRLHQRLRAEYLWRLEAEKMRLAEEEKLRKEMSAKKAKEEAERKHQERLAQLAREDAERELKEKEAARRKKELLEQMERARHEPVNHSDMVDKMFGFLGTSGGLPGQEGQAPSGFEDLERGRREMVEEDLDAALPLPDEDEEDLSEYKFAKFAATYFQGTTTHSYTRRPLKQPLLYHDDEGDQLAALAVWITILRFMGDLPEPKYHTAMSDGSEKIPVMTKIYETLGKKTYKRELQALQGEGEAQLPEGQKKSSVRHKLVHLTLKKKSKLTEEVTKRLHDGESTVQGNSMLEDRPTSNLEKLHFIIGNGILRPALRDEIYCQISKQLTHNPSKSSYARGWILVSLCVGCFAPSEKFVKYLRNF
１２８４ｂｐのオーバーラップ（配列番号５３）。
GGGCTGATGCGTCTGGGCTTCCTGCGGCTGCAGGCCCTGCACCGCTCCCGGAAGCTGCACCAGCAGTACCGCCTGGCCCGCCAGCGCATCATCCAGTTCCAGGCCCGCTGCCGCGCCTATCTGGTGCGCAAGGCCTTCCGCCACCGCCTCTGGGCTGTGCTCACCGTGCAGGCCTATGCCCGGGGCATGATCGCCCGCAGGCTGCACCAACGCCTCAGGGCTGAGTATCTGTGGCGCCTCGAGGCTGAGAAAATGCGGCTGGCGGAGGAAGAGAAGCTTCGGAAGGAGATGAGCGCCAAGAAGGCCAAGGAGGAGGCCGAGCGCAAGCATCAGGAGCGCCTGGCCCAGCTGGCTCGTGAGGACGCTGAGCGGGAGCTGAAGGAGAAGGAGGCCGCTCGGCGGAAGAAGGAGCTCCTGGAGCAGATGGAAAGGGCCCGCCATGAGCCTGTCAATCACTCAGACATGGTGGACAAGATGTTTGGCTTCCTGGGGACTTCAGGTGGCCTGCCAGGCCAGGAGGGCCAGGCACCTAGTGGCTTTGAGGACCTGGAGCGAGGGCGGAGGGAGATGGTGGAGGAGGACCTGGATGCAGCCCTGCCCCTGCCTGACGAGGATGAGGAGGACCTCTCTGAGTATAAATTTGCCAAGTTCGCGGCCACCTACTTCCAGGGGACAACCACGCACTCCTACACCCGGCGGCCACTCAAACAGCCACTGCTCTACCATGACGACGAGGGTGACCAGCTGGCAGCCCTGGCGGTCTGGATCACCATCCTCCGCTTCATGGGGGACCTCCCTGAGCCCAAGTACCACACAGCCATGAGTGATGGCAGTGAGAAGATCCCTGTGATGACCAAGATTTATGAGACCCTGGGCAAGAAGACGTACAAGAGGGAGCTGCAGGCCCTGCAGGGCGAGGGCGAGGCCCAGCTCCCCGAGGGCCAGAAGAAGAGCAGTGTGAGGCACAAGCTGGTGCATTTGACTCTGAAAAAGAAGTCCAAGCTCACAGAGGAGGTGACCAAGAGGCTGCATGACGGGGAGTCCACAGTGCAGGGCAACAGCATGCTGGAGGACCGGCCCACCTCCAACCTGGAGAAGCTGCACTTCATCATCGGCAATGGCATCCTGCGGCCAGCACTCCGGGACGAGATCTACTGCCAGATCAGCAAGCAGCTGACCCACAACCCCTCCAAGAGCAGCTATGCCCGGGGCTGGATTCTCGTGTCTCTCTGCGTGGGCTGTTTCGCCCCCTCCGAGAAGTTTGTCAAGTACCTGCGGAACTTC
配列番号８３（配列番号５３に対応するタンパク質配列）
GLMRLGFLRLQALHRSRKLHQQYRLARQRIIQFQARCRAYLVRKAFRHRLWAVLTVQAYARGMIARRLHQRLRAEYLWRLEAEKMRLAEEEKLRKEMSAKKAKEEAERKHQERLAQLAREDAERELKEKEAARRKKELLEQMERARHEPVNHSDMVDKMFGFLGTSGGLPGQEGQAPSGFEDLERGRREMVEEDLDAALPLPDEDEEDLSEYKFAKFAATYFQGTTTHSYTRRPLKQPLLYHDDEGDQLAALAVWITILRFMGDLPEPKYHTAMSDGSEKIPVMTKIYETLGKKTYKRELQALQGEGEAQLPEGQKKSSVRHKLVHLTLKKKSKLTEEVTKRLHDGESTVQGNSMLEDRPTSNLEKLHFIIGNGILRPALRDEIYCQISKQLTHNPSKSSYARGWILVSLCVGCFAPSEKFVKYLRNF
１０２７ｂｐのオーバーラップ（配列番号５４）。
CAGGTCTAACTTTCTGAAGCTGAAGAACGCTGCCACACTGATCCAGAGGCACTGGCGGGGTCACAACTGTAGGAAGAACTACGGGCTGATGCGTCTGGGCTTCCTGCGGCTGCAGGCCCTGCACCGCTCCCGGAAGCTGCACCAGCAGTACCGCCTGGCCCGCCAGCGCATCATCCAGTTCCAGGCCCGCTGCCGCGCCTATCTGGTGCGCAAGGCCTTCCGCCACCGCCTCTGGGCTGTGCTCACCGTGCAGGCCTATGCCCGGGGCATGATCGCCCGCAGGCTGCACCAACGCCTCAGGGCTGAGTATCTGTGGCGCCTCGAGGCTGAGAAAATGCGGCTGGCGGAGGAAGAGAAGCTTCGGAAGGAGATGAGCGCCAAGAAGGCCAAGGAGGAGGCCGAGCGCAAGCATCAGGAGCGCCTGGCCCAGCTGGCTCGTGAGGACGCTGAGCGGGAGCTGAAGGAGAAGGAGGCCGCTCGGCGGAAGAAGGAGCTCCTGGAGCAGATGGAAAGGGCCCGCCATGAGCCTGTCAATCACTCAGACATGGTGGACAAGATGTTTGGCTTCCTGGGGACTTCAGGTGGCCTGCCAGGCCAGGAGGGCCAGGCACCTAGTGGCTTTGAGGACCTGGAGCGAGGGCGGAGGGAGATGGTGGAGGAGGACCTGGATGCAGCCCTGCCCCTGCCTGACGAGGATGAGGAGGACCTCTCTGAGTATAAATTTGCCAAGTTCGCGGCCACCTACTTCCAGGGGACAACCACGCACTCCTACACCCGGCGGCCACTCAAACAGCCACTGCTCTACCATGACGACGAGGGTGACCAGCTGGCAGCCCTGGCGGTCTGGATCACCATCCTCCGCTTCATGGGGGACCTCCCTGAGCCCAAGTACCACACAGCCATGAGTGATGGCAGTGAGAAGATCCCTGTGATGACCAAGATTTATGAGACCCTGGGCAAGAAGACGTACAAGAGGGAGCTGCAGGCCCTGCAGGGCGAGGGCGAGGCCCAGCTCCCCGAGGGCCAG
配列番号８４（配列番号５４に対応するタンパク質配列）
RSNFLKLKNAATLIQRHWRGHNCRKNYGLMRLGFLRLQALHRSRKLHQQYRLARQRIIQFQARCRAYLVRKAFRHRLWAVLTVQAYARGMIARRLHQRLRAEYLWRLEAEKMRLAEEEKLRKEMSAKKAKEEAERKHQERLAQLAREDAERELKEKEAARRKKELLEQMERARHEPVNHSDMVDKMFGFLGTSGGLPGQEGQAPSGFEDLERGRREMVEEDLDAALPLPDEDEEDLSEYKFAKFAATYFQGTTTHSYTRRPLKQPLLYHDDEGDQLAALAVWITILRFMGDLPEPKYHTAMSDGSEKIPVMTKIYETLGKKTYKRELQALQGEGEAQLPEGQ
１０２６ｂｐのオーバーラップ（配列番号５５）。
CTGGCGGAGGAAGAGAAGCTTCGGAAGGAGATGAGCGCCAAGAAGGCCAAGGAGGAGGCCGAGCGCAAGCATCAGGAGCGCCTGGCCCAGCTGGCTCGTGAGGACGCTGAGCGGGAGCTGAAGGAGAAGGAGGCCGCTCGGCGGAAGAAGGAGCTCCTGGAGCAGATGGAAAGGGCCCGCCATGAGCCTGTCAATCACTCAGACATGGTGGACAAGATGTTTGGCTTCCTGGGGACTTCAGGTGGCCTGCCAGGCCAGGAGGGCCAGGCACCTAGTGGCTTTGAGGACCTGGAGCGAGGGCGGAGGGAGATGGTGGAGGAGGACCTGGATGCAGCCCTGCCCCTGCCTGACGAGGATGAGGAGGACCTCTCTGAGTATAAATTTGCCAAGTTCGCGGCCACCTACTTCCAGGGGACAACCACGCACTCCTACACCCGGCGGCCACTCAAACAGCCACTGCTCTACCATGACGACGAGGGTGACCAGCTGGCAGCCCTGGCGGTCTGGATCACCATCCTCCGCTTCATGGGGGACCTCCCTGAGCCCAAGTACCACACAGCCATGAGTGATGGCAGTGAGAAGATCCCTGTGATGACCAAGATTTATGAGACCCTGGGCAAGAAGACGTACAAGAGGGAGCTGCAGGCCCTGCAGGGCGAGGGCGAGGCCCAGCTCCCCGAGGGCCAGAAGAAGAGCAGTGTGAGGCACAAGCTGGTGCATTTGACTCTGAAAAAGAAGTCCAAGCTCACAGAGGAGGTGACCAAGAGGCTGCATGACGGGGAGTCCACAGTGCAGGGCAACAGCATGCTGGAGGACCGGCCCACCTCCAACCTGGAGAAGCTGCACTTCATCATCGGCAATGGCATCCTGCGGCCAGCACTCCGGGACGAGATCTACTGCCAGATCAGCAAGCAGCTGACCCACAACCCCTCCAAGAGCAGCTATGCCCGGGGCTGGATTCTCGTGTCTCTCTGCGTGGGCTGTTTCGCCCCCTCCGAGAAGTTTGTCAAGTACCTGCGGAACTTC
配列番号８５（配列番号５５に対応するタンパク質配列）
LAEEEKLRKEMSAKKAKEEAERKHQERLAQLAREDAERELKEKEAARRKKELLEQMERARHEPVNHSDMVDKMFGFLGTSGGLPGQEGQAPSGFEDLERGRREMVEEDLDAALPLPDEDEEDLSEYKFAKFAATYFQGTTTHSYTRRPLKQPLLYHDDEGDQLAALAVWITILRFMGDLPEPKYHTAMSDGSEKIPVMTKIYETLGKKTYKRELQALQGEGEAQLPEGQKKSSVRHKLVHLTLKKKSKLTEEVTKRLHDGESTVQGNSMLEDRPTSNLEKLHFIIGNGILRPALRDEIYCQISKQLTHNPSKSSYARGWILVSLCVGCFAPSEKFVKYLRNF
９４５ｂｐのオーバーラップ（配列番号５６）。
GGGCTGATGCGTCTGGGCTTCCTGCGGCTGCAGGCCCTGCACCGCTCCCGGAAGCTGCACCAGCAGTACCGCCTGGCCCGCCAGCGCATCATCCAGTTCCAGGCCCGCTGCCGCGCCTATCTGGTGCGCAAGGCCTTCCGCCACCGCCTCTGGGCTGTGCTCACCGTGCAGGCCTATGCCCGGGGCATGATCGCCCGCAGGCTGCACCAACGCCTCAGGGCTGAGTATCTGTGGCGCCTCGAGGCTGAGAAAATGCGGCTGGCGGAGGAAGAGAAGCTTCGGAAGGAGATGAGCGCCAAGAAGGCCAAGGAGGAGGCCGAGCGCAAGCATCAGGAGCGCCTGGCCCAGCTGGCTCGTGAGGACGCTGAGCGGGAGCTGAAGGAGAAGGAGGCCGCTCGGCGGAAGAAGGAGCTCCTGGAGCAGATGGAAAGGGCCCGCCATGAGCCTGTCAATCACTCAGACATGGTGGACAAGATGTTTGGCTTCCTGGGGACTTCAGGTGGCCTGCCAGGCCAGGAGGGCCAGGCACCTAGTGGCTTTGAGGACCTGGAGCGAGGGCGGAGGGAGATGGTGGAGGAGGACCTGGATGCAGCCCTGCCCCTGCCTGACGAGGATGAGGAGGACCTCTCTGAGTATAAATTTGCCAAGTTCGCGGCCACCTACTTCCAGGGGACAACCACGCACTCCTACACCCGGCGGCCACTCAAACAGCCACTGCTCTACCATGACGACGAGGGTGACCAGCTGGCAGCCCTGGCGGTCTGGATCACCATCCTCCGCTTCATGGGGGACCTCCCTGAGCCCAAGTACCACACAGCCATGAGTGATGGCAGTGAGAAGATCCCTGTGATGACCAAGATTTATGAGACCCTGGGCAAGAAGACGTACAAGAGGGAGCTGCAGGCCCTGCAGGGCGAGGGCGAGGCCCAGCTCCCCGAGGGCCAG
配列番号８６（配列番号５６に対応するタンパク質配列）
GLMRLGFLRLQALHRSRKLHQQYRLARQRIIQFQARCRAYLVRKAFRHRLWAVLTVQAYARGMIARRLHQRLRAEYLWRLEAEKMRLAEEEKLRKEMSAKKAKEEAERKHQERLAQLAREDAERELKEKEAARRKKELLEQMERARHEPVNHSDMVDKMFGFLGTSGGLPGQEGQAPSGFEDLERGRREMVEEDLDAALPLPDEDEEDLSEYKFAKFAATYFQGTTTHSYTRRPLKQPLLYHDDEGDQLAALAVWITILRFMGDLPEPKYHTAMSDGSEKIPVMTKIYETLGKKTYKRELQALQGEGEAQLPEGQ
６８７ｂｐのオーバーラップ（配列番号５７）。
CTGGCGGAGGAAGAGAAGCTTCGGAAGGAGATGAGCGCCAAGAAGGCCAAGGAGGAGGCCGAGCGCAAGCATCAGGAGCGCCTGGCCCAGCTGGCTCGTGAGGACGCTGAGCGGGAGCTGAAGGAGAAGGAGGCCGCTCGGCGGAAGAAGGAGCTCCTGGAGCAGATGGAAAGGGCCCGCCATGAGCCTGTCAATCACTCAGACATGGTGGACAAGATGTTTGGCTTCCTGGGGACTTCAGGTGGCCTGCCAGGCCAGGAGGGCCAGGCACCTAGTGGCTTTGAGGACCTGGAGCGAGGGCGGAGGGAGATGGTGGAGGAGGACCTGGATGCAGCCCTGCCCCTGCCTGACGAGGATGAGGAGGACCTCTCTGAGTATAAATTTGCCAAGTTCGCGGCCACCTACTTCCAGGGGACAACCACGCACTCCTACACCCGGCGGCCACTCAAACAGCCACTGCTCTACCATGACGACGAGGGTGACCAGCTGGCAGCCCTGGCGGTCTGGATCACCATCCTCCGCTTCATGGGGGACCTCCCTGAGCCCAAGTACCACACAGCCATGAGTGATGGCAGTGAGAAGATCCCTGTGATGACCAAGATTTATGAGACCCTGGGCAAGAAGACGTACAAGAGGGAGCTGCAGGCCCTGCAGGGCGAGGGCGAGGCCCAGCTCCCCGAGGGCCAG
配列番号８７（配列番号５７に対応するタンパク質配列）
LAEEEKLRKEMSAKKAKEEAERKHQERLAQLAREDAERELKEKEAARRKKELLEQMERARHEPVNHSDMVDKMFGFLGTSGGLPGQEGQAPSGFEDLERGRREMVEEDLDAALPLPDEDEEDLSEYKFAKFAATYFQGTTTHSYTRRPLKQPLLYHDDEGDQLAALAVWITILRFMGDLPEPKYHTAMSDGSEKIPVMTKIYETLGKKTYKRELQALQGEGEAQLPEGQ
３６１ｂｐのオーバーラップ（配列番号３９と同一）
CAGGTCTAACTTTCTGAAGCTGAAGAACGCTGCCACACTGATCCAGAGGCACTGGCGGGGTCACAACTGTAGGAAGAACTACGGGCTGATGCGTCTGGGCTTCCTGCGGCTGCAGGCCCTGCACCGCTCCCGGAAGCTGCACCAGCAGTACCGCCTGGCCCGCCAGCGCATCATCCAGTTCCAGGCCCGCTGCCGCGCCTATCTGGTGCGCAAGGCCTTCCGCCACCGCCTCTGGGCTGTGCTCACCGTGCAGGCCTATGCCCGGGGCATGATCGCCCGCAGGCTGCACCAACGCCTCAGGGCTGAGTATCTGTGGCGCCTCGAGGCTGAGAAAATGCGGCTGGCGGAGGAAGAGAAGCTT
２７９ｂｐのオーバーラップ（配列番号５８）
GGGCTGATGCGTCTGGGCTTCCTGCGGCTGCAGGCCCTGCACCGCTCCCGGAAGCTGCACCAGCAGTACCGCCTGGCCCGCCAGCGCATCATCCAGTTCCAGGCCCGCTGCCGCGCCTATCTGGTGCGCAAGGCCTTCCGCCACCGCCTCTGGGCTGTGCTCACCGTGCAGGCCTATGCCCGGGGCATGATCGCCCGCAGGCTGCACCAACGCCTCAGGGCTGAGTATCTGTGGCGCCTCGAGGCTGAGAAAATGCGGCTGGCGGAGGAAGAGAAGCTT
配列番号８８（配列番号５８に対応するタンパク質配列）
GLMRLGFLRLQALHRSRKLHQQYRLARQRIIQFQARCRAYLVRKAFRHRLWAVLTVQAYARGMIARRLHQRLRAEYLWRLEAEKMRLAEEEKL
２０ｂｐのオーバーラップ（配列番号５９）：TGGCGGAGGAAGAGAAGCTT
配列番号８９（配列番号５９に対応するタンパク質配列）：AEEEKL
開示されるハイブリッドおよびオーバーラップベクターの一部の実施形態では、開示されるフロントハーフベクター（５’ＡＡＶ）のいずれも、配列番号６０に対して少なくとも９５％または９８％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む左側の逆方向末端反復配列の配列を含む。開示されるハイブリッドおよびオーバーラップベクターの一部の実施形態では、開示されるフロントハーフベクターのいずれも、配列番号６０を含む左側の逆方向末端反復配列の配列を含む。開示されるハイブリッドおよびオーバーラップベクターの一部の実施形態では、開示されるバックハーフベクター（３’ＡＡＶ）のいずれも、配列番号６１を含む右側の逆方向末端反復配列の配列を含む。開示されるハイブリッドおよびオーバーラップベクターの一部の実施形態では、開示されるバックハーフベクターのいずれも、配列番号６１に対して少なくとも９５％または９８％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む右側の逆方向末端反復配列の配列を含む。種々の実施形態では、開示されるデュアルハイブリッドおよびオーバーラップベクター対のいずれも、配列番号６０を含む左側ＩＴＲ配列および配列番号６１を含む右側ＩＴＲ配列を含む。
左側ＩＴＲ配列（配列番号６０）。
CTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTT
右側ＩＴＲ配列（配列番号６１）。
AACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAG
Figure 2023520488000004
Figure 2023520488000005
Figure 2023520488000006
Figure 2023520488000007
参考文献
以下の参考文献は、本明細書に記載されたものを補足する例示的な手続きまたはその他の詳細を提供する範囲において、参照によって本明細書に具体的に組み込まれる：
Figure 2023520488000008
Figure 2023520488000009
Figure 2023520488000010
Figure 2023520488000011
Figure 2023520488000012
Figure 2023520488000013
等価物
本明細書において記載される実施例および実施形態は、単に例示目的であること、ならびにそれに照らして種々の改変または変法が当業者に示唆され、本開示の趣旨および範囲および添付の特許請求の範囲内に含まれるものがあることは理解されなければならない。
本明細書において引用されたすべての参考文献（刊行物、特許出願および特許を含む）は、各参考文献が個別に、具体的に参照により組み込まれ、その全体で本明細書に記載されるかのように同程度に参照により組み込まれる。
本明細書における値の範囲の列挙は、本明細書で別段の指示がない限り、範囲内に入る各々別々の値を個別に参照する簡略な方法として機能することを単に意図しており、各々別々の値は、本明細書において個別に列挙されているかのように明細書に組み込まれる。
本明細書において記載されるすべての方法は、本明細書において特に断りのない限り、または文脈によって明確に矛盾しない限り任意の適した順序で実施できる。
本明細書において提供される任意の例または例示的言葉（例えば、「など」）の使用は、単に本開示をよりよく例示することを意図しており、別段の指示がない限り、本開示の範囲の制限を課すものではない。本明細書の文言は、明示的に述べられていない限り、本開示の実行に任意の要素が不可欠であることを示すものとして解釈されるべきではない。
要素（単数または複数）に関して「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有している（ｈａｖｉｎｇ）」、「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」または「含有している（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」などの用語を使用する本開示の任意の態様または実施形態の本明細書における記載は、別段の指示がない限り、または文脈によって明確に矛盾しない限り、その特定の要素（単数または複数）「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｏｆ）」、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」または「を実質的に含む（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」本開示の類似の態様または実施形態への支持を提供することを意図する（例えば、特定の要素を含むものとして本明細書において記載される組成物は、別段の指示がない限り、または文脈によって明確に矛盾しない限り、その要素からなる組成物も記載すると理解されなければならない）。例えば、特定の要素を含むものとして本明細書において記載されるヌクレオチド配列は、別段の指示がない限り、または文脈によって明確に矛盾しない限り、その要素からなるヌクレオチド配列も記載すると理解されなければならない。
本明細書において開示され、特許請求される組成物および方法のすべては、本開示に照らして過度の実験を行うことなく作成および実行できる。本発明の組成物および方法を好ましい実施形態に関して説明したが、本開示の概念、趣旨および／または範囲から逸脱することなく、本明細書において開示される組成物および／または方法に、および／または本明細書において記載される方法の工程または工程の順序に変化を適用できることは当業者には明らかであろう。より詳しくは、化学的におよび／または生理学的に関連するある特定の薬剤を本明細書において記載される薬剤と置換してもよく、同一または類似の結果が達成されるであろうことは明らかであろう。当業者に明らかなすべてのこのような類似の置換および改変は、添付の特許請求の範囲によって定義されるような本開示の趣旨、範囲および概念内であると考えられる。

Claims (151)

  1. ｉ）ポリヌクレオチドの各末端に逆方向末端反復配列、逆方向末端反復配列の間に、プロモーター、続いて、ミオシンポリペプチドのＮ末端部分をコードする部分コード配列を含む第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチド、ならびに
    ｉｉ）ポリヌクレオチドの各末端に逆方向末端反復配列、逆方向末端反復配列の間に、ミオシンポリペプチドのＣ末端部分をコードする部分コード配列を含む第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチド
    を含むポリヌクレオチドベクターシステムであって、
    第１および第２のＡＡＶベクター中のポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチド配列は、オーバーラップするポリヌクレオチド配列を含み、
    第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチドは、配列番号６３、９０または６６に対して少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である核酸配列を含み、第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドは、配列番号７７または８０に対して少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である核酸配列を含む、ポリヌクレオチドベクターシステム。
  2. ｉ）ポリヌクレオチドの各末端に逆方向末端反復配列、逆方向末端反復配列の間に、プロモーター、続いて、ミオシンポリペプチドのＮ末端部分をコードする部分コード配列を含む第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチド、ならびに
    ｉｉ）ポリヌクレオチドの各末端に逆方向末端反復配列、逆方向末端反復配列の間に、ミオシンポリペプチドのＣ末端部分をコードする部分コード配列を含む第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチド
    を含むポリヌクレオチドベクターシステムであって、
    第１および第２のＡＡＶベクター中のポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチド配列は、オーバーラップするポリヌクレオチド配列を含み、
    第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチドは、配列番号６３、９０および６６から選択されるヌクレオチド配列を含み、第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドは、配列番号７７および８０から選択されるヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチドベクターシステム。
  3. ｉ）ポリヌクレオチドの各末端に逆方向末端反復配列、逆方向末端反復配列の間に、プロモーター、続いて、ミオシンポリペプチドのＮ末端部分をコードする部分コード配列を含む第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチド、ならびに
    ｉｉ）ポリヌクレオチドの各末端に逆方向末端反復配列、逆方向末端反復配列の間に、ミオシンポリペプチドのＣ末端部分をコードする部分コード配列を含む第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチド
    を含むポリヌクレオチドベクターシステムであって、
    第１および第２のＡＡＶベクター中のポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチド配列は、オーバーラップするポリヌクレオチド配列を含み、
    第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチドは、配列番号６２、９１または６５のアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列をコードし、第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドは、配列番号７８または８１のアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列をコードする、ポリヌクレオチドベクターシステム。
  4. 第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチドが配列番号６３のヌクレオチド配列を含み、第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドが配列番号７７のヌクレオチド配列を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドベクターシステム。
  5. 第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチドが配列番号６３のヌクレオチド配列を含み、第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドが配列番号８０のヌクレオチド配列を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドベクターシステム。
  6. 第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチドが配列番号９０のヌクレオチド配列を含み、第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドが配列番号７７のヌクレオチド配列を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドベクターシステム。
  7. 第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチドが配列番号９０のヌクレオチド配列を含み、第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドが配列番号８０のヌクレオチド配列を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドベクターシステム。
  8. 第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチドが配列番号６６のヌクレオチド配列を含み、第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドが配列番号７７のヌクレオチド配列を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドベクターシステム。
  9. 第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチドが配列番号６６のヌクレオチド配列を含み、第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドが配列番号８０のヌクレオチド配列を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドベクターシステム。
  10. 第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチドが、配列番号５０のヌクレオチド配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である核酸配列を含み、第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドが、配列番号５１のヌクレオチド配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である核酸配列を含む、請求項１から９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドベクターシステム。
  11. 第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチドが、配列番号５０のヌクレオチド配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である核酸配列を含み、第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドが、配列番号３８のヌクレオチド配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である核酸配列を含む、請求項１から９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドベクターシステム。
  12. 第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチドが、配列番号１のヌクレオチド配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である核酸配列を含み、第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドが、配列番号３８のヌクレオチド配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である核酸配列を含む、請求項１から９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドベクターシステム。
  13. 第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチドが、配列番号５０のヌクレオチド配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である核酸配列を含み、第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドが、配列番号２のヌクレオチド配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である核酸配列を含む、請求項１から９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドベクターシステム。
  14. 第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチドが、配列番号１のヌクレオチド配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である核酸配列を含み、第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドが、配列番号５１のヌクレオチド配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である核酸配列を含む、請求項１から９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドベクターシステム。
  15. 第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチドが、配列番号３６のヌクレオチド配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である核酸配列を含み、第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドが、配列番号２のヌクレオチド配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である核酸配列を含む、請求項１から９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドベクターシステム。
  16. 第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチドが、配列番号３６のヌクレオチド配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である核酸配列を含み、第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドが、配列番号３８のヌクレオチド配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である核酸配列を含む、請求項１から９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドベクターシステム。
  17. 第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチドが、配列番号３６のヌクレオチド配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である核酸配列を含み、第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドが、配列番号５１のヌクレオチド配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である核酸配列を含む、請求項１から９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドベクターシステム。
  18. 第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチドが、配列番号３７のヌクレオチド配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である核酸配列を含み、第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドが、配列番号３８のヌクレオチド配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である核酸配列を含む、請求項１から９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドベクターシステム。
  19. 第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチドが、配列番号３７のヌクレオチド配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である核酸配列を含み、第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドが、配列番号２のヌクレオチド配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である核酸配列を含む、請求項１から９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドベクターシステム。
  20. 第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチドが、配列番号３７のヌクレオチド配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である核酸配列を含み、第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドが、配列番号５１のヌクレオチド配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である核酸配列を含む、請求項１から９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドベクターシステム。
  21. ｉ）ポリヌクレオチドの各末端に逆方向末端反復配列、逆方向末端反復配列の間に、プロモーター、続いて、治療用ポリペプチドのＮ末端部分をコードする部分コード配列を含む第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチド、ならびに
    ｉｉ）ポリヌクレオチドの各末端に逆方向末端反復配列、逆方向末端反復配列の間に、治療用ポリペプチドのＣ末端部分をコードする部分コード配列を含む第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチド
    を含むポリヌクレオチドベクターシステムであって、
    第１および第２のＡＡＶベクター中のポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチド配列は、オーバーラップするポリヌクレオチド配列を含み、
    オーバーラップするポリヌクレオチド配列は、配列番号３９および５２～５９のいずれか１つから選択される配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチドベクターシステム。
  22. オーバーラップするポリヌクレオチド配列が、約１～５０ヌクレオチド、約１００～５００ヌクレオチド、約１００～２００ヌクレオチド、約２００～３００ヌクレオチド、約３００～４００ヌクレオチド、約４００～５００ヌクレオチド、約５００～６００ヌクレオチド、約６００～７００ヌクレオチド、約７００～８００ヌクレオチド、約８００～９００ヌクレオチド、約９００～１０００ヌクレオチド、約１０００～１１００ヌクレオチド、約１１００～１２００ヌクレオチドまたは約１２００～１３００ヌクレオチドの間である、請求項１から２１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドベクターシステム。
  23. オーバーラップするポリヌクレオチド配列が、配列番号３９および５２～５９のいずれか１つから選択される配列に対して少なくとも約８５、９０、９５または９８％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項１から２２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドベクターシステム。
  24. オーバーラップするポリヌクレオチド配列が、配列番号３９および５２～５９のいずれか１つから選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１から２３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドベクターシステム。
  25. オーバーラップするポリヌクレオチド配列が、配列番号３９を含む、請求項１から２４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドベクターシステム。
  26. オーバーラップするポリヌクレオチド配列が、配列番号５２を含む、請求項１から２４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドベクターシステム。
  27. オーバーラップするポリヌクレオチド配列が、配列番号５３を含む、請求項１から２４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドベクターシステム。
  28. オーバーラップするポリヌクレオチド配列が、配列番号５４を含む、請求項１から２４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドベクターシステム。
  29. オーバーラップするポリヌクレオチド配列が、配列番号５５を含む、請求項１から２４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドベクターシステム。
  30. オーバーラップするポリヌクレオチド配列が、配列番号５６を含む、請求項１から２４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドベクターシステム。
  31. オーバーラップするポリヌクレオチド配列が、配列番号５７を含む、請求項１から２４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドベクターシステム。
  32. オーバーラップするポリヌクレオチド配列が、配列番号５８を含む、請求項１から２４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドベクターシステム。
  33. オーバーラップするポリヌクレオチド配列が、配列番号５９を含む、請求項１から２４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドベクターシステム。
  34. 第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチドの各末端での逆方向末端反復配列の間の長さが、約４６１５ヌクレオチド（ｎｔ）以下である、請求項１から３３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドベクターシステム。
  35. 第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドの各末端での逆方向末端反復配列の間の長さが、約４８００ｎｔ以下である、請求項１から３４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドベクターシステム。
  36. 第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドの各末端での逆方向末端反復配列の間の長さが、約４５６０ｎｔである、請求項１から３５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドベクターシステム。
  37. ｉ）ポリヌクレオチドの各末端に逆方向末端反復配列、逆方向末端反復配列の間に、プロモーター、続いて、治療用ポリペプチドのＮ末端部分をコードする部分コード配列を含む第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチド、ならびに
    ｉｉ）ポリヌクレオチドの各末端に逆方向末端反復配列、逆方向末端反復配列の間に、治療用ポリペプチドのＣ末端部分をコードする部分コード配列を含む第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチド
    を含むポリヌクレオチドベクターシステムであって、
    第１および第２のＡＡＶベクター中のポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチド配列は、オーバーラップするポリヌクレオチド配列を含み、
    オーバーラップするポリヌクレオチド配列は、配列番号７９および８２～８９のいずれか１つをコードする配列を含む、ポリヌクレオチドベクターシステム。
  38. オーバーラップするポリヌクレオチド配列が、約１～５０ヌクレオチド、約１００～５００ヌクレオチド、約１００～２００ヌクレオチド、約２００～３００ヌクレオチド、約３００～４００ヌクレオチド、約４００～５００ヌクレオチド、約５００～６００ヌクレオチド、約６００～７００ヌクレオチド、約７００～８００ヌクレオチド、約８００～９００ヌクレオチド、約９００～１０００ヌクレオチド、約１０００～１１００ヌクレオチド、約１１００～１２００ヌクレオチドまたは約１２００～１３００ヌクレオチドの間である、請求項３７に記載のポリヌクレオチドベクターシステム。
  39. オーバーラップするポリヌクレオチド配列が、配列番号７９をコードする配列を含む、請求項１から３８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドベクターシステム。
  40. オーバーラップするポリヌクレオチド配列が、配列番号８２をコードする配列を含む、請求項１から３８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドベクターシステム。
  41. オーバーラップするポリヌクレオチド配列が、配列番号８３をコードする配列を含む、請求項１から３８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドベクターシステム。
  42. オーバーラップするポリヌクレオチド配列が、配列番号８４をコードする配列を含む、請求項１から３８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドベクターシステム。
  43. オーバーラップするポリヌクレオチド配列が、配列番号８５をコードする配列を含む、請求項１から３８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドベクターシステム。
  44. オーバーラップするポリヌクレオチド配列が、配列番号８６をコードする配列を含む、請求項１から３８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドベクターシステム。
  45. オーバーラップするポリヌクレオチド配列が、配列番号８７をコードする配列を含む、請求項１から３８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドベクターシステム。
  46. オーバーラップするポリヌクレオチド配列が、配列番号８８をコードする配列を含む、請求項１から３８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドベクターシステム。
  47. オーバーラップするポリヌクレオチド配列が、配列番号８９をコードする配列を含む、請求項１から３８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドベクターシステム。
  48. 治療用ポリペプチドがミオシンポリペプチドではない、請求項２１から４７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドベクターシステム。
  49. 治療用ポリペプチドが、
    （ｉ）ミオシンである、
    （ｉｉ）ハーモニン、カドヘリン２３、プロトカドヘリン１５もしくはウシェリンである、
    （ｉｉｉ）約５Ｋｂ～約１０Ｋｂ、約６Ｋｂ～約９Ｋｂもしくは約７Ｋｂ～約８Ｋｂの長さの遺伝子によってコードされる、ならびに／または
    （ｉｖ）ＡＢＣＡ４、ＣＥＰ２９０、ＥＹＳ、ＲＰ１、ＡＬＭＳ１、ＣＤＨ２３、ＰＣＤＨ１５、ＵＳＨ１Ｃ、ＵＳＨ１Ｇ、ＵＳＨ２Ａ（ウシェリン）、ＤＮＦＢ３１、ＤＭＤ、ＣＦＴＲ、ＧＤＥ、ＤＹＳＦ、Ｆ８およびＤＦＮＢ２からなる群から選択される遺伝子によってコードされる、請求項２１から４８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドベクターシステム。
  50. ｉ）ポリヌクレオチドの各末端に逆方向末端反復配列、逆方向末端反復配列の間に、プロモーター、続いて、ミオシンポリペプチドのＮ末端部分をコードする部分コード配列を含む第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチド、ならびに
    ｉｉ）ポリヌクレオチドの各末端に逆方向末端反復配列、逆方向末端反復配列の間に、ミオシンポリペプチドのＣ末端部分をコードする部分コード配列を含む第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチド
    を含むポリヌクレオチドベクターシステムであって、
    第１および第２のＡＡＶベクター中のポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチド配列は、オーバーラップするポリヌクレオチド配列を含み、
    ミオシンポリペプチドのＣ末端部分は、ミオシンポリペプチドのシングル－アルファヘリックス（ＳＡＨ）ドメインを含む、ポリヌクレオチドベクターシステム。
  51. ｉ）ポリヌクレオチドの各末端に逆方向末端反復配列、逆方向末端反復配列の間に、プロモーター、続いて、ミオシンポリペプチドのＮ末端部分をコードする部分コード配列を含む第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチド、ならびに
    ｉｉ）ポリヌクレオチドの各末端に逆方向末端反復配列、逆方向末端反復配列の間に、ミオシンポリペプチドのＣ末端部分をコードする部分コード配列を含む第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチド
    を含むポリヌクレオチドベクターシステムであって、
    第１および第２のＡＡＶベクター中のポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチド配列は、オーバーラップするポリヌクレオチド配列を含み、
    第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチドは、配列番号３６のヌクレオチド配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である核酸配列を含み、第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドは、配列番号３８のヌクレオチド配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である核酸配列を含む、ポリヌクレオチドベクターシステム。
  52. ミオシンポリペプチドが、ヒトミオシンＶＩＩａポリペプチド、ヒトミオシンＶＩｌｂポリペプチド、ミオシンＶＩＩａアイソフォーム２または別のミオシンアイソフォームまたはその機能的断片である、請求項５０または請求項５１に記載のポリヌクレオチドベクターシステム。
  53. ヒトミオシンＶＩＩａポリペプチドが、配列番号６または配列番号８のアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項５２に記載のポリヌクレオチドベクターシステム。
  54. ミオシンポリペプチドが、ヒトミオシンＶＩＩａポリペプチド、ミオシンＶＩＩａアイソフォーム２または別のミオシンアイソフォームまたはその機能的断片である、請求項１から２０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドベクターシステム。
  55. ヒトミオシンＶＩＩａポリペプチドが、配列番号６または配列番号８のアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項５４に記載のポリヌクレオチドベクターシステム。
  56. ｉ）ポリヌクレオチドの各末端に逆方向末端反復配列、逆方向末端反復配列の間に、プロモーター、続いて、ミオシンポリペプチドのＮ末端部分をコードする部分コード配列、続いて、スプライスドナー部位および第１のイントロンを含む第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチド、ならびに
    ｉｉ）ポリヌクレオチドの各末端に逆方向末端反復配列、逆方向末端反復配列の間に、第２のイントロンおよび第１のイントロンのスプライスアクセプター部位を含む第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチド
    を含むポリヌクレオチドベクターシステムであって、
    第１および第２のイントロンのヌクレオチド配列は、オーバーラップするポリヌクレオチド配列を含み、
    第１および／または第２のイントロン配列は、配列番号６９または配列番号７０に対して少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である核酸配列を含む、ポリヌクレオチドベクターシステム。
  57. 第１のイントロン配列が、配列番号６９のヌクレオチド配列を含む、請求項５６に記載のポリヌクレオチドベクターシステム。
  58. 第１のイントロン配列が、配列番号７０のヌクレオチド配列を含む、請求項５６に記載のポリヌクレオチドベクターシステム。
  59. 第２のイントロン配列が、配列番号６９のヌクレオチド配列を含む、請求項５６から５８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドベクターシステム。
  60. 第２のイントロン配列が、配列番号７０のヌクレオチド配列を含む、請求項５６から５８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドベクターシステム。
  61. ｉ）ポリヌクレオチドの各末端に逆方向末端反復配列、逆方向末端反復配列の間に、プロモーター、続いて、治療用ポリペプチドのＮ末端部分をコードする部分コード配列、続いて、スプライスドナー部位および第１のイントロンを含む第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチド、ならびに
    ｉｉ）ポリヌクレオチドの各末端に逆方向末端反復配列、逆方向末端反復配列の間に、第２のイントロンおよび第１のイントロンのスプライスアクセプター部位を含む第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチド
    を含むポリヌクレオチドベクターシステムであって、
    第１および第２のイントロンのヌクレオチド配列は、オーバーラップするポリヌクレオチド配列を含み、
    第１および第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチド配列の間の分割点が、治療用タンパク質をコードする遺伝子の２つのエクソンの間である、ポリヌクレオチドベクターシステム。
  62. 治療用ポリペプチドが、
    （ｉ）ミオシンＶＩＩａ、ミオシンＶＩＩａのアイソフォーム、ミオシンＶＩＩａアイソフォーム２、ミオシンＶＩＩｂおよびミオシンＶｌｌｂのアイソフォーム、ハーモニン、カドヘリン２３、プロトカドヘリン１５もしくはウシェリンである、
    （ｉｉ）約５Ｋｂ～約１０Ｋｂ、約６Ｋｂ～約９Ｋｂまたは約７Ｋｂ～約８Ｋｂの長さの遺伝子によってコードされる、ならびに／または
    （ｉｉｉ）ＡＢＣＡ４、ＣＥＰ２９０、ＥＹＳ、ＲＰＪ、ＡＬＭＳＪ、ＣＤＨ２３、ＰＣＤＨ１５、ＵＳＨＪＣ、ＵＳＨＪＧ、ＵＳＨ２Ａ（ウシェリン）、ＤＮＦＢ３１、ＤＭＤ、ＣＦＴＲ、ＧＤＥ、ＤＹＳＦ、Ｆ８およびＤＦＮＢ２からなる群から選択される遺伝子によってコードされる、請求項に６１に記載のポリヌクレオチドベクターシステム。
  63. 治療用タンパク質をコードする遺伝子が、ヒトＭＹＯ７Ａ（ｈＭＹＯ７Ａ）であり、分割点が、
    （ｉ）ｈＭＹＯ７Ａ遺伝子のエクソン２１およびエクソン２２の間である、
    （ｉｉ）ｈＭＹＯ７Ａ遺伝子のエクソン２２およびエクソン２３の間である、ならびに／または
    （ｉｉｉ）ｈＭＹＯ７Ａ遺伝子のエクソン２３とエクソン２４の間ではない、請求項６１または請求項６２に記載のポリヌクレオチドベクターシステム。
  64. ｉ）ポリヌクレオチドの各末端に逆方向末端反復配列、逆方向末端反復配列の間に、プロモーター、続いて、ミオシンポリペプチドのＮ末端部分をコードする部分コード配列、続いて、スプライスドナー部位および第１のイントロンを含む第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチド、ならびに
    ｉｉ）ポリヌクレオチドの各末端に逆方向末端反復配列、逆方向末端反復配列の間に、第２のイントロンおよび第１のイントロンのスプライスアクセプター部位を含む第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチド
    を含むポリヌクレオチドベクターシステムであって、
    第１および第２のイントロンのヌクレオチド配列は、オーバーラップするポリヌクレオチド配列を含み、
    第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチドは、配列番号７３に対して少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である核酸配列を含み、第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドは、配列番号７５に対して少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である核酸配列を含む、ポリヌクレオチドベクターシステム。
  65. ｉ）ポリヌクレオチドの各末端に逆方向末端反復配列、逆方向末端反復配列の間に、プロモーター、続いて、ミオシンポリペプチドのＮ末端部分をコードする部分コード配列、続いて、スプライスドナー部位および第１のイントロンを含む第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチド、ならびに
    ｉｉ）ポリヌクレオチドの各末端に逆方向末端反復配列、逆方向末端反復配列の間に、第２のイントロンおよび第１のイントロンのスプライスアクセプター部位を含む第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチド
    を含むポリヌクレオチドベクターシステムであって、
    第１および第２のイントロンのヌクレオチド配列は、オーバーラップするポリヌクレオチド配列を含み、
    第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチドは、配列番号７３から選択されるヌクレオチド配列を含み、第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドは、配列番号７５から選択されるヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチドベクターシステム。
  66. ｉ）ポリヌクレオチドの各末端に逆方向末端反復配列、逆方向末端反復配列の間に、プロモーター、続いて、ミオシンポリペプチドのＮ末端部分をコードする部分コード配列、続いて、スプライスドナー部位および第１のイントロンを含む第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチド、ならびに
    ｉｉ）ポリヌクレオチドの各末端に逆方向末端反復配列、逆方向末端反復配列の間に、第２のイントロンおよび第１のイントロンのスプライスアクセプター部位を含む第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチド
    を含むポリヌクレオチドベクターシステムであって、
    第１および第２のイントロンのヌクレオチド配列は、オーバーラップするポリヌクレオチド配列を含み、
    第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチドは、配列番号７４のアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列をコードし、第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドは、配列番号７６のアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列をコードする、ポリヌクレオチドベクターシステム。
  67. 第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチドが、配列番号６３のヌクレオチド配列を含み、第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドが、配列番号７７のヌクレオチド配列を含む、請求項６４から６６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドベクターシステム。
  68. 第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチドが、配列番号６３のヌクレオチド配列を含み、第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドが、配列番号８０のヌクレオチド配列を含む、請求項６４から６６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドベクターシステム。
  69. 第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチドが、配列番号９０のヌクレオチド配列を含み、第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドが、配列番号７７のヌクレオチド配列を含む、請求項６４から６６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドベクターシステム。
  70. 第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチドが、配列番号９０のヌクレオチド配列を含み、第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドが、配列番号８０のヌクレオチド配列を含む、請求項６４から６６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドベクターシステム。
  71. 第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチドが、配列番号６６のヌクレオチド配列を含み、第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドが、配列番号７７のヌクレオチド配列を含む、請求項６４から６６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドベクターシステム。
  72. 第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチドが、配列番号６６のヌクレオチド配列を含み、第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドが、配列番号８０のヌクレオチド配列を含む、請求項６４から６６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドベクターシステム。
  73. ｉ）ポリヌクレオチドの各末端に逆方向末端反復配列、逆方向末端反復配列の間に、プロモーター、続いて、ミオシンポリペプチドのＮ末端部分をコードする部分コード配列、続いて、スプライスドナー部位および第１のイントロンを含む第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチド、ならびに
    ｉｉ）ポリヌクレオチドの各末端に逆方向末端反復配列、逆方向末端反復配列の間に、第２のイントロンおよび第１のイントロンのスプライスアクセプター部位を含む第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチド
    を含むポリヌクレオチドベクターシステムであって、
    第１および第２のイントロンのヌクレオチド配列は、オーバーラップするポリヌクレオチド配列を含み、
    第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチドは、配列番号３１、３３、３４および４６に対して少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である核酸配列を含み、第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドは、配列番号３２、３５、４４および４７～４９に対して少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である核酸配列を含む、ポリヌクレオチドベクターシステム。
  74. 第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチドが、配列番号３１のヌクレオチド配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である核酸配列を含む、請求項６１から７３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドベクターシステム。
  75. 第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチドが、配列番号３３のヌクレオチド配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である核酸配列を含む、請求項６１から７３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドベクターシステム。
  76. 第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチドが、配列番号３４のヌクレオチド配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である核酸配列を含む、請求項６１から７３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドベクターシステム。
  77. 第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチドが、配列番号４６のヌクレオチド配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である核酸配列を含む、請求項６１から７３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドベクターシステム。
  78. 第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドが、配列番号３２のヌクレオチド配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である核酸配列を含む、請求項６１から７７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドベクターシステム。
  79. 第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドが、配列番号３５のヌクレオチド配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である核酸配列を含む、請求項６１から７７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドベクターシステム。
  80. 第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドが、配列番号４４のヌクレオチド配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である核酸配列を含む、請求項６１から７７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドベクターシステム。
  81. 第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドが、配列番号４７のヌクレオチド配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である核酸配列を含む、請求項６１から７７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドベクターシステム。
  82. 第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドが、配列番号４８のヌクレオチド配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である核酸配列を含む、請求項６１から７７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドベクターシステム。
  83. 第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドが、配列番号４９のヌクレオチド配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である核酸配列を含む、請求項６１から７７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドベクターシステム。
  84. 第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチドが、配列番号３１のヌクレオチド配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である核酸配列を含み、第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドが、配列番号３２のヌクレオチド配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である核酸配列を含む、請求項６１から７３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドベクターシステム。
  85. 第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチドが、配列番号４６のヌクレオチド配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である核酸配列を含み、第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドが、配列番号３５のヌクレオチド配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である核酸配列を含む、請求項６１から７３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドベクターシステム。
  86. 第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチドが、配列番号３４のヌクレオチド配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である核酸配列を含み、第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドが、配列番号４７のヌクレオチド配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である核酸配列を含む、請求項６１から７３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドベクターシステム。
  87. 第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチドが、配列番号３１のヌクレオチド配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である核酸配列を含み、第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドが、配列番号４８のヌクレオチド配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である核酸配列を含む、請求項６１から７３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドベクターシステム。
  88. 第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチドが、配列番号３１のヌクレオチド配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である核酸配列を含み、第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドが、配列番号４９のヌクレオチド配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である核酸配列を含む、請求項６１から７３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドベクターシステム。
  89. 第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチドが、配列番号３３のヌクレオチド配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である核酸配列を含み、第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドが、配列番号３２のヌクレオチド配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である核酸配列を含む、請求項６１から７３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドベクターシステム。
  90. 第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチドが、配列番号３４のヌクレオチド配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である核酸配列を含み、第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドが、配列番号３５のヌクレオチド配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である核酸配列を含む、請求項６１から７３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドベクターシステム。
  91. 第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチドが、配列番号３４のヌクレオチド配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である核酸配列を含み、第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドが、配列番号４４のヌクレオチド配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である核酸配列を含む、請求項６１から７３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドベクターシステム。
  92. ｉ）ポリヌクレオチドの各末端に逆方向末端反復配列、逆方向末端反復配列の間に、プロモーター、続いて、ミオシンポリペプチドのＮ末端部分をコードする部分コード配列、続いて、スプライスドナー部位および第１のイントロンを含む第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチド、ならびに
    ｉｉ）ポリヌクレオチドの各末端に逆方向末端反復配列、逆方向末端反復配列の間に、第２のイントロンおよび第１のイントロンのスプライスアクセプター部位を含む第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチド
    を含むポリヌクレオチドベクターシステムであって、
    第１および第２のＡＡＶイントロンのヌクレオチド配列は、オーバーラップするポリヌクレオチド配列を含み、
    第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチドは、核酸配列のヌクレオチド配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である配列番号３３を含み、第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドは、配列番号３２のヌクレオチド配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である核酸配列を含む、ポリヌクレオチドベクターシステム。
  93. ｉ）ポリヌクレオチドの各末端に逆方向末端反復配列、逆方向末端反復配列の間に、プロモーター、続いて、ミオシンポリペプチドのＮ末端部分をコードする部分コード配列、続いて、スプライスドナー部位および第１のイントロンを含む第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチド、ならびに
    ｉｉ）ポリヌクレオチドの各末端に逆方向末端反復配列、逆方向末端反復配列の間に、第２のイントロンおよび第１のイントロンのスプライスアクセプター部位を含む第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチド
    を含むポリヌクレオチドベクターシステムであって、
    第１および第２のイントロンのヌクレオチド配列は、オーバーラップするポリヌクレオチド配列を含み、
    第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチドは、配列番号３４のヌクレオチド配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である核酸配列を含み、第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドは、配列番号３５のヌクレオチド配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である核酸配列を含む、ポリヌクレオチドベクターシステム。
  94. ｉ）ポリヌクレオチドの各末端に逆方向末端反復配列、逆方向末端反復配列の間に、プロモーター、続いて、ミオシンポリペプチドのＮ末端部分をコードする部分コード配列、続いて、スプライスドナー部位および第１のイントロンを含む第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチド、ならびに
    ｉｉ）ポリヌクレオチドの各末端に逆方向末端反復配列、逆方向末端反復配列の間に、第２のイントロンおよび第１のイントロンのスプライスアクセプター部位を含む第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチド
    を含むポリヌクレオチドベクターシステムであって、
    第１および第２のイントロンのヌクレオチド配列は、オーバーラップするポリヌクレオチド配列を含み、
    第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチドは、配列番号３４のヌクレオチド配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である核酸配列を含み、第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドは、配列番号４４のヌクレオチド配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である核酸配列を含む、ポリヌクレオチドベクターシステム。
  95. 第１および第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチド配列の間の分割点が、
    （ｉ）ｈＭＹＯ７Ａ遺伝子のエクソン２１およびエクソン２２の間である、
    （ｉｉ）ｈＭＹＯ７Ａ遺伝子のエクソン２２およびエクソン２３の間である、ならびに／または
    （ｉｉｉ）ｈＭＹＯ７Ａ遺伝子のエクソン２３とエクソン２４の間ではない、請求項７３から９４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドベクターシステム。
  96. オーバーラップするポリヌクレオチド配列が、約５０～約５００ヌクレオチド、または約２００～３００ヌクレオチドの長さである、請求項６１から９５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドベクターシステム。
  97. 第１および／または第２のイントロン配列が、ミオシンポリペプチドをコードする遺伝子のゲノム配列中に天然に存在するイントロンの配列を含む、請求項６１から９６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドベクターシステム。
  98. 第１および／または第２のイントロン配列が、配列番号６９に対して少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である核酸配列を含む、請求項６１から８０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドベクターシステム。
  99. 第１および／または第２のイントロン配列が、配列番号７０に対して少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である核酸配列を含む、請求項６１から８０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドベクターシステム。
  100. 第１および／または第２のイントロン配列が、ｈＭＹＯ７Ａ遺伝子の全イントロン２３の部分配列である、請求項６１から９７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドベクターシステム。
  101. 第１および／または第２のイントロン配列が、Ｆ１ファージのＡＫ配列である、請求項６１から９６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドベクターシステム。
  102. 第１および／または第２のイントロン配列が、合成アルカリホスファターゼ（ＡＰ）イントロンを含む、請求項６１から９６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドベクターシステム。
  103. ＭＹＯ７Ａタンパク質のテールドメインに対応するポリヌクレオチド配列が、第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチドから除去されている、請求項７３から１０２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドベクターシステム。
  104. 第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチドおよび／または第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドの１つまたは複数の非コード領域中に１つまたは複数のヌクレオチド置換をさらに含む、請求項６１から１０３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドベクターシステム。
  105. 第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチドの１つまたは複数の非コード領域中に１つまたは複数のヌクレオチド置換をさらに含む、請求項６１から１０４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドベクターシステム。
  106. １つまたは複数の非コード配列が、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）ヘッド配列を含む、請求項１０４または請求項１０５に記載のポリヌクレオチドベクターシステム。
  107. １つまたは複数の非コード配列が、ＡＰイントロンを含む、請求項１０４から１０６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドベクターシステム。
  108. １つまたは複数の非コード配列が、ＭＹＯ７Ａ部分コード配列、３’ＡＡＶ逆方向末端反復配列の間に３’非翻訳領域（ＵＴＲ）を含む、請求項１０４から１０７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドベクターシステム。
  109. 置換が、１つまたは複数の推定インフレーム停止コドン中に位置する、請求項１０４から１０８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドベクターシステム。
  110. 置換が、ＡＰヘッド配列中の１つまたは複数の推定インフレーム停止コドン中に位置する、請求項１０４から１０９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドベクターシステム。
  111. 置換が、ＡＰイントロン配列中の３つの推定インフレーム停止コドン中に位置する、請求項１０４から１１０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドベクターシステム。
  112. 置換が、ＡＰヘッド配列中の１つのインフレーム停止コドン、ＡＰイントロン配列中の３つのインフレーム停止コドンおよび３’ＵＴＲ配列中の３つのインフレーム停止コドン中に位置する、請求項１０４から１１１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドベクターシステム。
  113. プロモーターが、ＣＭＶプロモーター、ＥＦ－１アルファプロモーター、錐体アレスチンプロモーター、ｓｍＣＢＡプロモーター、ヒトミオシン７ａ遺伝子由来プロモーター、ＴαＣ遺伝子由来プロモーター、ロドプシンプロモーター、ｃＧＭＰ－ホスホジエステラーゼβ－サブユニットプロモーター、ヒトまたはマウスロドプシンプロモーター、ｈＧＲＫｌプロモーター、杆体特異的ＩＲＢＰプロモーター、ＶＭＤ２プロモーター、シナプシンプロモーター、グリア繊維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーターおよびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１から１１２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドベクターシステム。
  114. プロモーターがＣＭＶプロモーターである、請求項１から１１３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドベクターシステム。
  115. プロモーターがｓｍＣＢＡプロモーターである、請求項１から１１３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドベクターシステム。
  116. プロモーターがロドプシンプロモーターである、請求項１から１１３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドベクターシステム。
  117. ポリペプチドのＣ末端部分をコードする部分コード配列と、第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドの３’ＡＡＶ逆方向末端反復配列の間の３’非翻訳領域中の１つまたは複数の推定停止コドンを除去するための１つまたは複数のヌクレオチド置換をさらに含む、請求項１から１１６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドシステム。
  118. １つまたは複数の置換が、１つまたは複数の推定停止コドン中に位置する、請求項１１７に記載のポリヌクレオチドシステム。
  119. 第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドに、ポリアデニル化（ｐＡ）シグナル配列が続く、請求項１から１１８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドベクターシステム。
  120. 第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチドが、ポリペプチドのシングルアルファヘリックス（ＳＡＨ）ドメインをコードしない部分コード配列を含む、請求項１から１１９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドベクターシステム。
  121. 第１のまたは第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドの各末端の逆方向末端反復配列が、５’ＡＡＶ ＩＴＲおよび３’ＡＡＶ ＩＴＲを含み、５’ＡＡＶ ＩＴＲおよび３’ＡＡＶ ＩＴＲが、単一ＡＡＶ血清型由来のＩＴＲである、請求項１から１２０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドベクターシステム。
  122. 第１のまたは第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドの各末端の逆方向末端反復配列が、５’ＡＡＶ ＩＴＲおよび３’ＡＡＶ ＩＴＲを含み、５’ＡＡＶ ＩＴＲおよび３’ＡＡＶ ＩＴＲが、複数のＡＡＶ血清型由来のＩＴＲである、請求項１から１２０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドベクターシステム。
  123. 血清型が、ＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）、ＡＡＶ血清型５（ＡＡＶ５）、ＡＡＶ血清型７（ＡＡＶ７）、ＡＡＶ血清型８（ＡＡＶ８）、ＡＡＶ血清型４４．９（ＡＡＶ４４．９）、ＡＡＶ血清型４４．９（Ｅ５３１Ｄ）、ＡＡＶ血清型９－ＰＨＰ．ＢおよびＡＡＶ血清型４４．９（Ｙ７３３Ｆ）からなる群から選択される１つまたは複数のＡＡＶ血清型を含む、請求項１から１２２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドベクターシステム。
  124. ＡＡＶ血清型が、ＡＡＶ血清型４４．９（Ｅ５３１Ｄ）である、請求項１２３に記載のポリヌクレオチドベクターシステム。
  125. ＡＡＶ血清型がＡＡＶ２である、請求項１２３に記載のポリヌクレオチドベクターシステム。
  126. ＡＡＶ血清型が、ＡＡＶ２およびＡＡＶ５である、請求項１２３に記載のポリヌクレオチドベクターシステム。
  127. 第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチドの各末端の逆方向末端反復配列が、５’ＡＡＶ ＩＴＲおよび３’ＡＡＶ ＩＴＲを含み、５’ＡＡＶ ＩＴＲが、配列番号６０のヌクレオチド配列を含む、請求項１から１２６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドベクターシステム。
  128. ３’ ＡＡＶ ＩＴＲが、配列番号６１のヌクレオチド配列を含む、請求項１２７に記載のポリヌクレオチドベクターシステム。
  129. 第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドの各末端の逆方向末端反復配列が、５’ＡＡＶ ＩＴＲおよび３’ＡＡＶ ＩＴＲを含み、５’ＡＡＶ ＩＴＲが、配列番号６０のヌクレオチド配列を含む、請求項１から１２８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドベクターシステム。
  130. ３’ＡＡＶ ＩＴＲが、配列番号６１のヌクレオチド配列を含む、請求項１２９に記載のポリヌクレオチドベクターシステム。
  131. 請求項１から１３０のいずれか一項に記載の第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチドまたは第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチドを含む組換えウイルス粒子。
  132. ウイルスまたはビリオンのカプシドタンパク質中に１つまたは複数のチロシンからフェニルアラニンへの（Ｙ－Ｆ）突然変異を含む、請求項１３１に記載のウイルス粒子。
  133. ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９および／またはＡＡＶ１０カプシドを含む、請求項１３１または請求項１３２に記載のウイルス粒子。
  134. ＡＡＶ７ｍ８、ＡＡＶ－ＤＪ、ＡＡＶ２／２－ＭＡＸ、ＡＡＶＳＨｈｌＯ、ＡＡＶＳＨｈｌＯＹ、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶＬＫ０３、ＡＡＶ８ＢＰ２、ＡＡＶｌ（Ｅ５３１Ｋ）、ＡＡＶ６（Ｄ５３２Ｎ）、ＡＡＶ６－３ｐｍｕｔ、ＡＡＶ２Ｇ９、ＡＡＶ４４．９、ＡＡＶ４４．９（Ｅ５３１Ｄ）、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．８Ｒ、ＡＡＶ９－ＰＨＰ．Ｂおよび／またはＡＡＶＡｎｃ８０カプシドを含む、請求項１３１から１３３のいずれか１つに記載のウイルス粒子。
  135. ウイルス粒子が、ＡＡＶ４４．９（Ｅ５３１Ｄ）カプシドを含む、請求項１３４に記載のウイルス粒子。
  136. 請求項１から１３５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドベクターシステムを含む単離された宿主細胞。
  137. 光受容体細胞、錐体細胞、杆体細胞、網膜細胞、神経節細胞、網膜色素上皮細胞、前庭有毛細胞、内耳有毛細胞、外耳有毛細胞またはそれらの任意の組合せである、請求項１３６に記載の単離された宿主細胞。
  138. ヒトまたは動物において疾患または状態を処置するまたは寛解させる方法であって、ヒトまたは動物の１つまたは複数の細胞に、請求項１から１３０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドベクターシステムを投与することを含み、ポリペプチドは、疾患もしくは状態の処置もしくは寛解を提供し、１つまたは複数の細胞において発現される、方法。
  139. 疾患または状態が、アッシャー症候群または常染色体劣性孤立性難聴（ＤＦＮＢ２）である、請求項１３８に記載の方法。
  140. 疾患または状態が、シュタルガルト病、ＬＣＡｌＯ、網膜色素変性症、アルストレーム症候群、アッシャー症候群ｌＢ、アッシャー症候群ｌＤ、アッシャー症候群ｌＦ、アッシャー症候群２Ａ、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、嚢胞性線維症、糖原病ＩＩＩ、非症候性難聴、血友病Ａまたはジスフェリン異常症である、請求項１３８に記載の方法。
  141. ポリペプチドが、ミオシンポリペプチドである、請求項１３８から１４０のいずれか一項に記載の方法。
  142. ミオシンポリペプチドが、ヒトミオシンＶＩＩａポリペプチド、ヒトミオシンＶｌｌｂポリペプチド、ミオシンＶＩＩａアイソフォーム２または別のミオシンアイソフォームまたはその機能的断片である、請求項１４１に記載の方法。
  143. ヒトミオシンＶＩＩａポリペプチドが、配列番号６または配列番号８のアミノ酸配列またはその機能的断片を含む、請求項１４２に記載の方法。
  144. ポリヌクレオチドベクターシステムの投与によって生成される末端切断型ＭＹＯ７Ａタンパク質の量が最小化される、請求項１から１３０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドベクターシステムを投与する方法。
  145. ポリヌクレオチドベクターシステムの投与に起因する細胞傷害性が最小化される、請求項１から１３０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドベクターシステムを投与する方法。
  146. ポリヌクレオチドベクターシステムの投与が、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞におけるメラノソーム移動の部分的または完全回復を提供する、請求項１３８から１４５のいずれか一項に記載の方法。
  147. ポリヌクレオチドベクターシステムの投与が、視力喪失の部分または完全回復を提供する、請求項１３８から１４６のいずれか一項に記載の方法。
  148. ポリヌクレオチドベクターシステムの投与が、聴力喪失の部分または完全回復を提供する、請求項１３８から１４７のいずれか一項に記載の方法。
  149. 聴力喪失が加齢性である、請求項１４８に記載の方法。
  150. ポリヌクレオチドベクターシステムの投与が、前庭機能の部分または完全回復を提供する、請求項１３８から１４９のいずれか一項に記載の方法。
  151. ポリヌクレオチドベクターシステムが、非経口投与、静脈内投与、筋肉内投与、眼球内投与、鼻腔内投与、網膜下投与、正円窓注射、正円窓膜注射、卵形嚢注射によって、または人工内耳手術の際に投与される、請求項１３８から１５０のいずれか一項に記載の方法。
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