JP2023532923A

JP2023532923A - 骨格筋線維の修復を改善するためのリコンビナントヒト酸性スフィンゴミエリナーゼの使用

Info

Publication number: JP2023532923A
Application number: JP2022581354A
Authority: JP
Inventors: ジョティケージャイスワル; アウレリアドフール; ダニエルビッテル; ゴータムチャンドラ; シュリータマセンチャンドラ
Original assignee: Childrens National Medical Center Inc
Current assignee: Childrens National Medical Center Inc
Priority date: 2020-06-30
Filing date: 2021-06-29
Publication date: 2023-08-01
Also published as: CN116209477A; US20230226221A1; KR20230031329A; EP4171660A1; WO2022006058A1

Abstract

筋ジストロフィーの治療のための組成物および方法が提供される。

Description

本出願は、２０２０年６月３０日に出願された米国仮特許出願第６３／０４６２０２号に対する３５Ｕ．Ｓ．Ｃ． §１１９（ｅ）に基づく優先権を主張する。前記の出願は、参照により本明細書に援用される。

本発明は、米国国立関節炎・筋骨格・皮膚疾患研究所（ＮＩＡＭＳ）より交付された助成番号５Ｒ０１ＡＲ０５５６８６の政府支援を受けて行われたものである。米国政府は、本発明においてある種の権利を有する。
［技術分野］

本発明は、筋繊維の修復に関するものであり、特に、ジスフェリン異常症（ｄｙｓｆｅｒｌｉｎｏｐａｔｈｙ）を治療、抑制、及び／又は予防するための組成物及び方法が提供される。

ジスフェリン異常症は、その筋肉への関与による肢帯型筋ジストロフィー２Ｂ型（ＬＧＭＤ２Ｂ）や三好型筋ジストロフィー１型などの進行性の筋消耗性疾患である（Ｂａｓｈｉｒ，ｅｔａｌ，（１９９８）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，２０：３７－４２；Ｌｉｕ，ｅｔａｌ．，（１９９８）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．、２０：３１－３６）。ジスフェリンの欠損は、小胞の形成と輸送の変化、傷ついた細胞膜の修復不良、および筋肉の炎症の増加を引き起こす（Ｃｅｎａｃｃｈｉ，ｅｔａｌ．，（２００５）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．，５８：１９０－１９５；Ｄｅｍｏｎｂｒｅｕｎ，ｅｔａｌ．，（２０１１）Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，２０：７７９－７８９；Ｂａｎｓａｌ，ｅｔａｌ．，（２００３）Ｎａｔｕｒｅ４２３：１６８－１７２；Ｈｏ，ＥＴＡＬ．，（２００４）Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，１３：１９９９－２０１０；Ｇａｌｌａｒｄｏ，ｅｔａｌ．，（２００１）Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ５７：２１３６－２１３８；Ｂｏｎｎｅｍａｎｎ，ｅｔａｌ．，（１９９６）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｅｄｉａｔｒ．，８：５６９－５８２）。

ジスフェリン異常症における疾患の重症度は、筋肉の脂肪置換と相関している。実際、ジスフェリン欠損患者では、脂肪の蓄積が病態と直接的に関連しており、ジスフェリン異常症に特有の性質である。また、線維／脂肪形成前駆体（ＦＡＰ）の蓄積は、ＦＡＰがジスフェリン異常症の筋肉の脂肪生成損失を引き起こすため、疾患の重症度と相関する（Ｈｏｇａｒｔｈ，ｅｔａｌ．，（２０１９）Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１０：２４３０）。注目すべきは、アネキシンＡ２の欠損が、ジスフェリン異常症の筋肉の脂肪生成損失を防ぐことである（Ｄｅｆｏｕｒ，ｅｔａｌ，（２０１７）Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．、２６（１１）：１９７９－１９９１）。細胞外アネキシンＡ２は、マクロファージと相互作用することで、ジスフェリン異常症の筋肉の脂肪生成転換を促進させる。ＦＡＰ活性化の低下は、アネキシンＡ２欠損のジスフェリン異常症の筋肉における脂肪生成の低下の基礎となっている可能性がある。実際、ＦＡＰの脂肪生成をブロックすることで、ジスフェリン異常症の筋肉の脂肪生成損失が抑制される。

ジスフェリンは、シナプトタグミンなどのＣａ²⁺依存性膜融合タンパク質に見られるＣ２ドメインを含んでいる（Ｌｅｋ，ｅｔａｌ．，（２０１２）Ｔｒａｆｆｉｃ１３：１８５－１９４）。このように、ジスフェリンは小胞の輸送や融合を制御することで筋肉の機能を調節している可能性がある（Ｐｏｓｅｙ，ｅｔａｌ．，（２０１１）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．９６：２０３－２３０；Ｌｅｎｎｏｎ，ｅｔａｌ．，（２００３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７８：５０４６６－５０４７３；Ｋｅｓａｒｉ，ｅｔａｌ．，（２００８）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，１７３：１４７６－１４８７；Ｎａｇａｒａｊｕ，ｅｔａｌ．，（２００８）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，１７２：７７４－７８５）。また、ジスフェリン欠損は、ジスフェリン異常症の筋芽細胞の融合能力に関する相反する報告にも関与している（Ｄｅｍｏｎｂｒｅｕｎ，ｅｔａｌ．，（２０１１）Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，２０：７７９－７８９；ｄｅＬｕｎａ，ｅｔａｌ．，（２００６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８１：１７０９２－１７０９８；Ｈｕｍｐｈｒｅｙ，ｅｔａｌ．，（２０１２）Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅｓ．，３１８：１２７－１３５；Ｐｈｉｌｉｐｐｉ，ｅｔａｌ．，（２０１２）ＰＬｏＳＣｕｒｒ．，４：ＲＲＮ１２９８）。

このようにジスフェリンの役割は多様であり、ジスフェリン欠損が筋病理に至るメカニズムは未解明である。骨格筋に特異的なジスフェリンの再発現がすべてのジスフェリン症の病態を救うことから、筋線維の修復がジスフェリン症の筋病理を支える統一的な欠損であることが示唆されている（Ｍｉｌｌａｙ，ｅｔａｌ．，（２００９）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，１７５：１８１７－１８２３；Ｌｏｓｔａｌ，ｅｔａｌ．，（２０１０）Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，１９：１８９７－１９０７；Ｈａｎ，Ｒ．（２０１１）Ｓｋｅｌｅｔ．Ｍｕｓｃｌｅ１：１０）。傷ついた細胞膜の修復には、細胞内コンパートメントが必要であり、哺乳類細胞では、リソソーム、ラージソーム（ｅｎｌａｒｇｅｏｓｏｍｅｓ）、カベオラ、ジスフェリン含有小胞、およびミトコンドリアが含まれる（Ｌｅｎｎｏｎ，ｅｔａｌ．，（２００３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７８：５０４６６－５０４７３；Ｂａｎｓａｌ，ｅｔａｌ．，（２００３）Ｎａｔｕｒｅ４２３：１６８－１７２；Ｂｏｒｇｏｎｏｖｏ，ｅｔａｌ．，（２００２）Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，４：９５５－９６２；Ｃｏｒｒｏｔｔｅ，ｅｔａｌ．，（２０１３）Ｅｌｉｆｅ２：ｅ００９２６；Ｓｈａｒｍａ，ｅｔａｌ．，（２０１２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８７：３０４５５－３０４６７）。

ジスフェリン発現が正常な筋ジストロフィー患者の細胞は、正常なリソソームとラージソーム（ｅｎｌａｒｇｅｏｓｏｍｅ）のエキソサイトーシスを示す（Ｊａｉｓｗａｌ，ｅｔａｌ．，（２００７）Ｔｒａｆｆｉｃ８：７７－８８）。しかし、ジスフェリン異常症の筋細胞は、ＬＡＭＰ２陽性リソソームの拡大、初期エンドソームの融合の減少、後期エンドソーム／リソソーム融合を制御するタンパク質の発現変化、およびＬＡＭＰ１の損傷トリガー細胞表面レベルの減少を示す（Ｄｅｍｏｎｂｒｅｕｎ，ｅｔａｌ．，（２０１１）Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，２０：７７９－７８９；Ｌｅｎｎｏｎ，ｅｔａｌ．，（２００３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７８：５０４６６－５０４７３；Ｋｅｓａｒｉ，ｅｔａｌ．，（２００８）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，１７３：１４７６－１４８７）。非筋肉細胞において、ジスフェリンの欠如はリソソームのエキソサイトーシスを減少させる（Ｈａｎ，ｅｔａｌ，（２０１２）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．、１２５：１２２５－１２３４）。これらの知見は、リソソームがジスフェリンを介した筋細胞膜修復に関与していることを示唆している（Ｃｏｒｒｏｔｔｅ，ｅｔａｌ．，（２０１３）Ｅｌｉｆｅ２：ｅ００９２６；ＭｃＤａｄｅ，ｅｔａｌ．，（２０１３）Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．、２３：１６７７－１６８６）。

しかしながら、効果的な治療法が求められている。

本発明の一態様によれば、対象における筋ジストロフィーを治療、抑制、及び／又は予防する方法が提供される。酸性スフィンゴミエリナーゼ対象に投与することを含む方法である。特定の実施形態では、方法は、酸性スフィンゴミエリナーゼをコードする核酸を対象に投与することを含み、特に、核酸が肝臓または肝細胞で発現されることを特徴とする。特定の実施形態では、酸性スフィンゴミエリナーゼをコードする核酸は、肝臓特異的または肝細胞特異的プロモーターの制御下にあるか、またはそれに連結されている。一般に、筋ジストロフィーはジスフェリン異常症であるか、またはジスフェリン欠損症である。ジスフェリン異常症の例としては、肢帯型筋ジストロフィー２Ｂ型（ＬＧＭＤ２Ｂ）や三好型筋ジストロフィー１型がある。特定の実施形態では、酸性スフィンゴミエリナーゼは、ヒト酸性スフィンゴミエリナーゼである。特定の実施形態では、酸性スフィンゴミエリナーゼをコードする核酸は、アデノ随伴ウイルスベクターのようなウイルスベクター内に含まれる。

本発明の別の態様によれば、上記方法を実施するための組成物およびベクター（例えば、ＡＡＶベクター）も提供される。

精製ｈＡＳＭタンパク質の投与量を増やして処置したＬＧＭＤ２Ｂ患者の筋芽細胞の画像である。ＦＭ色素標識を示す、局所レーザー傷害前と後の筋芽細胞の共焦点画像（白矢印で示した部位）を提供する。スケールバー＝１０μｍ。膜傷害後の筋芽細胞へのＦＭ色素の進入の動態を示すプロットである（ｎ＝５０細胞／条件）。データは平均値±ＳＥＭで示す。＊ｐ＜０．０５（ｖｓ．未処置および３Ｕ／Ｌ），＃（ｖｓ．５Ｕ／Ｌ）混合モデルＡＮＯＶＡによる、処置条件と時間との間の交互作用の分析。レーザーで傷害された細胞のうち、修復に失敗した細胞の割合を定量化したグラフである（ｎ＞４５細胞／条件）。データは、平均±標準誤差として表す。１－ｗａｙＡＮＯＶＡ、テューキーＨＳＤポストホックテスト、αはｐ＜０．０５に設定（ｎ＝３実験繰り返し、各条件につき１５－１８細胞を使用）。

ｍＲＦＰタグ付きカベオリン－１（ｃａｖｅｏｌｉｎ－１）を発現するマウス筋芽細胞を未処置（上）または６Ｕ／Ｌ精製ｈＡＳＭで処置（下）した底面（細胞－カバースリップ界面）の共焦点画像である。グレースケール画像は、撮像開始時の細胞全体（タイムポイント０）を示す。細胞上の線は、カベオリン－１（ｃａｖｅｏｌｉｎ－１）の移動性を示すグレースケールのキモグラフに示されるピクセルを示し、１秒につき１フレームで３分間取得した画像として示されている（キモグラフのＹ軸＝総取得時間１８０秒）。画素の軌跡が途切れているのは、細胞膜に存在するカベオラが移動していることを表す。ｈＡＳＭ処置したキモグラフの矢印は、６０秒の時点でｈＡＳＭを添加した時間を示している。各条件におけるカベオリン－１（ｃａｖｅｏｌｉｎ－１）の点（ｐｕｎｃｔａｅ）の定量化を示すプロットである（１０細胞からｎ＝５０点）。生細胞をＦＩＴＣ－コレステロールで標識して撮像した、細胞膜の剥離の画像である。グレースケール画像は、撮像開始時（タイムポイント０）のカバースリップ表面の細胞膜の共焦点画像を示し、白いボックスは、細胞から排出されるコレステロール標識小胞をモニターするために使用された細胞に隣接するカバースリップ上の細胞外空間を示す。この領域の拡大図を右のパネルに示す。ここでは、撮像開始時に存在する小胞（ベースライン）と、模擬処置（未処置）または６Ｕ／ＬｈＡＳＭ処置（ｈＡＳＭ処置）後２分後に存在する小胞を示した。６Ｕ／ＬｈＡＳＭで処置した細胞または処置していない細胞が排出したＦＩＴＣ－コレステロール富化粒子の定量を示すグラフである（各条件につきｎ＝１０細胞）。図２Ｃおよび２Ｄで撮像した細胞による細胞関連ＦＩＴＣ－コレステロール蛍光の消失率を定量化したグラフを提供する（条件ごとにｎ＝１０細胞）。ＣＬＩＣ／ＧＥＥＣレポーターＧＰＩ－ＧＦＰを発現するマウス筋芽細胞の、６Ｕ／ＬｈＡＳＭでの処置前および処置４分後の中央部を通る光学断面を示す画像を提供する。Ｃ２Ｃ１２－筋芽細胞（図２Ｇ、２Ｈ）におけるＧＰＩ－ＧＦＰの動態（図２Ｇ、２Ｉ）および内在化率（図２Ｈ、２Ｊ）および健常者と患者の筋芽細胞（図２Ｉ、２Ｊ）を示すプロットである。データは平均値±ＳＥＭを表す。＊ｐ＜０．０５（ｖｓ．未処置細胞）独立標本ｔ検定による（図２Ｂ，２Ｄ，２Ｅ）。動態と速度の解析は混合モデルＡＮＯＶＡで行い、αはｐ＜０．０５とした（図２Ｇ－２Ｊ）。スケールバー＝１０μｍ（細胞全体）、５μｍ（拡大画像）。

未処置およびｈＡＳＭ処置細胞におけるベースライン時およびエンドサイトーシス３分後のＷＧＡで標識したマウス筋芽細胞の共焦点画像を示す。スケールバー＝１０μｍ。マウス筋芽細胞におけるバルク膜エンドサイトーシスに対するｈＡＳＭの異なる用量の効果を示すプロットを提供する。ベースライン（左パネル）とエンドサイトーシス３分後（右パネル）の蛍光ＷＧＡ標識健常筋芽細胞と患者筋芽細胞を示す共焦点画像である。スケールバー＝１０μｍ。健常細胞およびＬＧＭＤ２Ｂ患者筋細胞によるバルクエンドサイトーシスの定量化、および患者細胞および健常細胞のエンドサイトーシスに対するｈＡＳＭの効果を示すプロットを示す（条件ごとにｎ＞２の実験繰り返し）。すべてのデータは、平均値±ＳＥＭで示す。図３Ｂ，３Ｄ。＊ｐ＜０．０５（ｖｓ．未処置細胞），１－ｗａｙＡＮＯＶＡ，テューキーＨＳＤポストホックテストで評価した。

肝臓特異的プロモーター下でコントロール－ＡＡＶまたはｈＡＳＭ－ＡＡＶのいずれかで形質導入したＨｅｐＧ２細胞からの溶解物におけるｈＡＳＭのウェスタンブロットの画像を提供する（ｎ＝３の独立した複製）。肝臓特異的プロモーター下でコントロール－ＡＡＶまたはｈＡＳＭ－ＡＡＶのいずれかで形質導入したＨｅｐＧ２細胞からの溶解物におけるｈＡＳＭ活性の定量化のグラフを提供する（ｎ＝３の独立した複製）。コントロール－ＡＡＶおよびｈＡＳＭ－ＡＡＶ感染ＨｅｐＧ２細胞からの培養上清におけるｈＡＳＭ活性の定量化のグラフを提供する。（ｎ＝３の独立した複製）。健常者とＬＧＭＤ２Ｂ患者の筋芽細胞について、局所レーザー傷害前と後の共焦点画像（矢印で示した部位）で、ＦＭ色素標識を示したものである。ＬＧＭＤ２Ｂ患者の筋芽細胞に、コントロールおよびｈＡＳＭ－ＡＡＶ感染ＨｅｐＧ２細胞の培養上清をＣＩＭ中で処置した。スケールバー＝１０μｍ。健常者と患者の筋芽細胞におけるＦＭ色素の進入の平均的な動態を示すプロットである（各条件につきｎ＞１５細胞）。データは平均値±ＳＥＭで示す。独立標本ｔ－検定による＊ｐ＜０．００１（ｖｓ．コントロール－ＡＡＶ処置細胞）（図４Ｂ，４Ｃ）．図４Ｅについては、処置条件と時間との間の相互作用の分析を含む混合モデルＡＮＯＶＡを使用した（＊ｐ＜０．００１，ｖｓ．コントロール－ＡＡＶ処置細胞上清）。

ｈＡＳＭ－ＡＡＶおよびコントロール－ＡＡＶ注入マウスから単離した肝臓におけるｈＡＳＭ活性を示すプロットを提供する（各条件につきｎ＝５マウス）。注入後１２週間のｈＡＳＭ－ＡＡＶおよびコントロール－ＡＡＶの血清中のｈＡＳＭ活性を示すプロットを提供する（Ｕ／Ｌで表した）。注入から１２週間後のコントロールおよびｈＡＳＭ－ＡＡＶ処置マウスにおける肝臓損傷の程度を評価するための血清アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）濃度を示すプロットを提供する。ＩｇＭで標識された筋原繊維の定量化を示すグラフである。ＩｇＭ（矢じり）で標識した筋繊維の画像（上段；スケールバー＝１０００μｍ）；白矢印で示した部位での局所レーザー傷害後の、新鮮な単離上腕二頭筋の筋繊維によるＦＭ色素取り込み画像（マウスあたりｎ＝２０筋線維）（中段２列目。スケールバー＝５０μｍ）；および１０％伸張性収縮を繰り返し、筋鞘に損傷を与え、プロシオンオレンジ色素（矢頭）で標識したコントロールＡＡＶおよびｈＡＳＭ－ＡＡＶ処置マウスからの単離ＥＤＬ筋の画像（下段；スケールバー＝１００μｍ）。白矢印で示した部位で局所レーザー傷害を受けた、単離したばかりの上腕二頭筋の筋繊維によるＦＭ色素の取り込みの動態を示すグラフである（マウスあたりｎ＝２０筋線維）。レーザー損傷から修復に成功した筋繊維を示すプロットである（ｎ＞１５）。筋肉あたりのプロシオンオレンジ標識繊維の数の定量化を示すグラフである（各群１匹のマウスでＥＤＬ筋の調製時に過剰な損傷を受けたため、各群ｎ＝４筋）。１０回の伸張性収縮を繰り返したときの筋収縮力の変化を示すグラフである（各群ｎ＝５マウス）。データは平均値±ＳＥＭで示す。＊ｐ＜０．０５ｖｓ．コントロールＡＡＶ、独立標本ｔ検定または混合モデルＡＮＯＶＡ、処理条件と時間との間の相互作用の分析。５μｇの筋肉タンパク質（大腿四頭筋）における組換えヒトＡＳＭ活性を示すグラフを提供する（各サンプルは３連で解析－コントロールＡＡＶ，ｈＡＳＭ－ＡＡＶ，ｎ＝ＡＡＶグループあたりｎ＝５マウス、野生型あたりｎ＝３マウス）。データは、平均ｈＡＳＭ活性±ＳＥＭで示す。＊ｐ＝０．０１１（ｖｓ．コントロールＡＡＶ）独立標本ｔ－検定による。

１段目は、ＬＧＭＤ２Ｂモデルの大腿四頭筋断面のＨ＆Ｅ染色画像で、コントロールＡＡＶまたはｈＡＳＭ－ＡＶを単回静脈注射して１２週間後である（矢印は炎症巣を示す）（スケールバー＝１００μｍ）。２段目は、ラミニンとＤＡＰＩで標識した筋肉断面の画像で、それぞれ基底膜と筋核を可視化している（スケールバー＝１００μｍ）。３段目は、筋肉断面におけるマッソントリクローム染色（各群ｎ＝５）の画像である（スケールバー＝１００ μｍ）。４段目は大腿四頭筋の断面におけるペリリピン標識領域の画像である（Ｓｃａｌｅｂａｒ＝１００ μｍ）。炎症性病巣の定量化を示すプロットである（各群ｎ＝５マウスの大腿四頭筋断面全体からランダムに選択した１０個の領域）。大腿四頭筋断面全体にわたる、中心核の存在によって示される再生筋繊維の定量化を示し、総繊維の％として表したグラフである。筋繊維断面積の分布を示すグラフを提供する（１群あたりｎ＝３０００繊維）。筋肉断面におけるマッソントリクローム染色の定量化を示すグラフである（各群ｎ＝５）。大腿四頭筋断面におけるペリリピン標識面積の定量化のグラフを提供する。示したように処置したマウスの前肢および後肢の握力の定量化のグラフを提供し、収縮力は体重で正規化した（ｎ＝５マウス／群、マウスあたり５回の繰り返し測定の平均；前肢：ｐ＞０．０５）。データは、平均±標準誤差として表す。後肢：＊ｐ＜０．０５ｖｓ．コントロール－ＡＡＶ。

ＡＡＶ投与マウスの、ＡＡＶ単回投与前と１２週後の体重の対の変化を示すプロットである。ベースライン（０週目）、および注射後１、４、および１２週目における、ｈＡＳＭ－ＡＡＶおよびコントロール－ＡＡＶ注射マウスの血清中のｈＡＳＭ活性を示すプロットを提供する（Ｕ／Ｌで表される）。２２週齢の野生型ＢＬ６マウス２匹について、正常レベルとの比較として血清ＡＳＭ活性を評価した（平均＝点線、灰色陰影＝最小／最大）。＊ｐ＝０．０１１（ｖｓ．コントロール－ＡＡＶ）。ｈＡＳＭの細胞毒性と濃度の関係を示すプロットである。ヒト筋芽細胞を、滴定濃度のｈＡＳＭタンパク質（コントロール／ＰＢＳ、８、８０、８００Ｕ／Ｌ）を添加した成長培地で２４時間培養した（６Ｕ／Ｌは最小治療量、破線で示す）。細胞を回収し、トリパンブルーアッセイで細胞生存率／死滅率を評価した。データは、全細胞数に対する死滅した細胞の平均割合（％）で示す。＊ｐ＜．００１（ｖｓ．８００Ｕ／ＬｈＡＳＭ）独立１－ｗａｙＡＮＯＶＡによる。病理組織学的等級付けを可能にする適切／高品質の組織学的画像を有する各処置群からのマウスについての組織学的スコアのプロットを提供する（スケール：１～１０、スコアが高いほど病理学的に悪いことを示す；３＝局所変性／壊死、４＝局所・広範囲炎症／変性／または壊死、５＝大規模壊死／肝細胞消失；ＰＢＳ注入ＢＬＡ／Ｊマウススコア３：局所変性・壊死）。肝臓の健康および／または肝臓傷害に対する肝臓標的化ＡＡＶの効果を評価するために、１２週間の研究期間にわたる血清ＡＬＴレベルを示すプロットを提供する（正常範囲５ヶ月齢ＢＬ６マウス：～２２～４０Ｕ／Ｌ）（Ｏｔｔｏ，ｅｔａｌ，（２０１６）Ｊ．Ａｍ．Ａｓｓｏｃ．Ｌａｂ．ＡｎｉｍＳｃｉ．、５５（４）：３７５－８６）。データは、平均±標準誤差として表す。

発明の詳細な説明

本願明細書では、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを用いて、組換えヒト酸性スフィンゴミエリナーゼ遺伝子（ｒｈＡＳＭ）をマウスの肝臓に特異的に導入することに成功した。このｒｈＡＳＭ－ＡＡＶは肝細胞のゲノムに挿入され、肝臓がｒｈＡＳＭタンパク質の産生をアップレギュレートするように誘導すると考えられる。骨格筋のジスフェリンタンパク質の欠損を特徴とする肢帯型筋ジストロフィー２Ｂ型（ＬＧＭＤ２Ｂ）などの筋ジストロフィーは、損傷した筋線維の修復が不十分であることが問題である。筋繊維は、日常の活動や筋収縮の際に頻繁に損傷を受け、特に筋繊維膜で損傷を受ける。このような膜損傷は、ジスフェリンを介した修復酵素ＡＳＭの放出もあり、通常数分以内に効率よく修復される。損傷した筋細胞から放出されたＡＳＭにより、酵素は損傷した細胞膜に作用し、脂質スフィンゴミエリンを加水分解して膜を安定化させ、損傷の修復を促進する（Ｄｅｆｏｕｒｅｔａｌ．，（２０１４）ＣｅｌｌＤｅａｔｈＤｉｓｅａｓｅ５：ｅ１３０６）。しかし、ＡＳＭの不足や酵素作用の阻害により、筋繊維が効果的に修復されず、筋繊維の死や筋変性が助長される。この欠損は、ＬＧＭＤ２Ｂやその他の筋疾患で見られる筋肉の健康状態の悪化の根本的なメカニズムである。

ジスフェリン欠損の治療法として、ジスフェリンをコードするＡＡＶを筋肉に直接繰り返し投与する遺伝子治療法がある。この方法は、ＡＡＶベクターに対する免疫反応や炎症反応が妨げになる。さらに、ジスフェリン遺伝子のサイズが大きいため、１つのＡＡＶベクターにパッケージングすることが困難であり、治療効果が低くなる。

これに対し、本発明では、ジスフェリン遺伝子を筋肉に繰り返し導入する必要がない。実際、ジスフェリン欠損の下流、すなわちジスフェリン欠損筋繊維の修復不良につながるＡＳＭ分泌の減少に対処し、ｒｈＡＳＭ－ＡＡＶを肝臓に標的化することにより、本発明は、ジスフェリン異常症の筋繊維の修復能力および／またはジスフェリンの回復に予想外に優れた長期間の改善を提供するものである。したがって、本発明は、ジスフェリン欠損型筋ジストロフィー、特にＬＧＭＤ２Ｂなどのジスフェリン異常症における筋繊維修復能力の低さを治療するための安定した治療法を提供するものである。本方法は、ベクターの反復投与の必要性や、ＡＡＶベクターの筋肉への効率的な導入に伴う困難さを回避することができる。

したがって、本発明は、ＡＳＭ、特にｒｈＡＳＭの外因性供給により、ジスフェリン欠損を治療するアプローチを提供する。本発明のＡＡＶを用いた遺伝子治療では、ＡＳＭ（例えば、ｒｈＡＳＭ）酵素を産生・分泌して循環させることにより、ジスフェリン欠損の骨格筋におけるＡＳＭ（例えば、ｒｈＡＳＭ）酵素のレベルを高め、疾患筋の効率的な修復を補助することが可能である。ＡＡＶ２／８ベースのベクターを用いて、ｒｈＡＳＭ遺伝子をジスフェリン欠損マウス（ＢＬ６／ＡＪ）ＬＧＭＤ２Ｂに尾静脈注射で導入し、疾患マウスの筋の障害を軽減する効果を検証した。その結果、他の方法で報告されているよりも、筋肉の健康状態（収縮力、病理組織学、修復能）を多面的に改善することができたことは大きな成果である。

本発明によれば、それを必要とする対象における筋ジストロフィーを治療、抑制、及び／又は予防する方法が提供される。特定の実施形態において、筋ジストロフィーは、ジスフェリン欠損によって特徴付けられる。特定の実施形態において、筋ジストロフィーは、ジスフェリン異常症である。ジスフェリン異常症の例としては、限定されないが、肢帯型筋ジストロフィー２Ｂ型（ＬＧＭＤ２Ｂ）および三好ミオパチー（ＭＭ）または三好型筋ジストロフィー１型が含まれる。

本発明の別の態様によれば、特にそれを必要とする対象において、筋繊維、特に骨格筋繊維の修復を改善又は増加させる方法が提供される。特定の実施形態では、筋繊維は、ジスフェリン欠損によって特徴付けられる。特定の実施形態において、対象は、筋ジストロフィーを有する。特定の実施形態では、対象は、ジスフェリン異常症を有する。特定の実施形態において、対象は、ニーマンピック病（例えば、Ａ型又はＢ型）を有する。

本発明の方法は、それを必要とする対象に酸性スフィンゴミエリナーゼ（ＡＳＭ）を投与することを含む。特定の実施形態では、本発明の方法は、酸性スフィンゴミエリナーゼ（ＡＳＭ）をコードする核酸分子を、それを必要とする対象に投与することを含む。特定の実施形態では、ＡＳＭはヒト（ｈＡＳＭ）である。特定の実施形態では、ＡＳＭは、オリプダーゼα（ＳａｎｏｆｉＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ、ＮＪ）などの組換えヒトＡＳＭ（ｒｈＡＳＭ）である。ＧｅｎＢａｎｋＧｅｎｅＩＤ：６６０９、ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏｓ．ＮＭ＿０００５４３およびＮＰ＿０００５３４は、アミノ酸およびヌクレオチド配列の例を示す。ＡＳＭは、ＡＳＭの任意のバリアントまたはアイソフォーム（例えば、アイソフォーム１、２、３、４、または５）であることができる。特定の実施形態では、ＡＳＭはアイソフォーム１またはバリアント１である。特定の実施形態では、ＡＳＭは、シグナルペプチドを含んでいる。

シグナルペプチドを有する前駆体ヒトＡＳＭ配列の一例は、以下の通りである。

成熟したヒトのＡＳＭ配列の一例を挙げる。

ヒトＡＳＭ配列をコードする核酸配列の一例は、以下の通りである。

特定の実施形態では、ヒトＡＳＭ配列をコードする核酸配列は、開始コドンから停止コドンまでの配列番号３の部分（上に下線で示す）を含む。

本発明のＡＳＭは、配列番号１または２と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有することができる。

特定の実施形態では、酸性スフィンゴミエリナーゼをコードする核酸分子は、肝臓特異的または肝細胞特異的プロモーターの制御下にある（Ｊａｃｏｂｓｅｔａｌ．，（２００８）ＧｅｎｅＴｈｅｒ．，１５（８）：５９４－６０３；Ｋｒａｍｅｒｅｔａｌ．，（２００３）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，７（３）：３７５－３８５）。肝臓特異的または肝細胞特異的プロモーターは、他の細胞タイプまたは組織よりも、肝細胞または肝細胞において連結された核酸を優先的に発現させる。肝臓特異的または肝細胞特異的プロモーターは、肝細胞または肝細胞において連結した核酸を排他的に発現する必要はないが、そうであってもよい。肝臓特異的または肝細胞特異的プロモーターの例としては、限定されないが、ヒトα－１アンチトリプシン（ｈＡＡＴ）プロモーター、ハイブリッド肝臓プロモーター（ＨＬＰ；ＭｃＩｎｔｏｓｈ，ｅｔａｌ．，（２０１３）Ｂｌｏｏｄ１２１（１７）：３３３５－４４）、ヒトチロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）、ヒト血清アルブミンモーター（場合によりヒトプロトロンビンエンハンサーの一つ以上のコピーに連結される）、ＤＣ１９０プロモーター（Ｚｉｅｇｌｅｒ，ｅｔａｌ．，（２００４）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，９：２３１－２４０）を含む。特定の実施形態では、肝臓特異的または肝細胞特異的プロモーターは、ヒト血清アルブミンプロモーターまたはＤＣ１９０プロモーターである。

特定の実施形態では、酸性スフィンゴミエリナーゼをコードする核酸分子は、肝臓に送達される（例えば、受動的（例えば、静脈内）または直接（例えば、注射））。特定の実施形態では、酸性スフィンゴミエリナーゼをコードする核酸分子は、対象の筋肉に直接送達（例えば、注射によって）されない。

特定の実施形態では、酸性スフィンゴミエリナーゼをコードする核酸分子は、プラスミドまたはベクター（例えば、発現ベクター）、特にウイルスベクター内に含まれる。本発明の核酸分子は、任意に、非ウイルスベクター（例えば、リポソーム、ミセル、ネイキッドｃＤＮＡ、トランスポゾンなど）に含まれるか、またはそれらによってカプセル化されてもよい。本発明で使用することができるウイルスベクターとしては、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター（例えばＡＡＶ－１～ＡＡＶ－１３、特にＡＡＶ－２、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－７、およびＡＡＶ－８、またはハイブリッドＡＡＶベクター）、レンチウイルスベクターおよび偽型レンチウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、およびレトロウイルスベクターなどを挙げることができる。特定の実施形態では、酸性スフィンゴミエリナーゼをコードする核酸分子は、ＡＡＶベクター内に含まれる。特定の実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２／８ベクター又はＡＡＶ８ベクターである。特定の実施形態では、ベクターまたはウイルスベクターは、肝臓または肝細胞に標的化される（例えば、標的化リガンドまたは肝臓もしくは肝細胞特異的受容体リガンドを使用して）。特定の実施形態では、酸性スフィンゴミエリナーゼをコードする核酸分子は、上記で説明したように、肝臓特異的または肝細胞特異的プロモーターの制御下にある。

本発明の酸性スフィンゴミエリナーゼをコードする核酸分子またはそれを含むベクター（またはそれを薬学的に許容される担体とともに含む組成物）は、動物、特に哺乳動物、より詳細にはヒトに投与して、筋ジストロフィーを治療、抑制、または予防することができる。本発明の方法及び組成物は、筋ジストロフィーを治療、抑制、又は予防するための少なくとも１つの他の治療剤（例えば、タンパク質ＡＳＭ）を含んでいてもよい。また、追加の治療剤は、本発明の化合物とは別の組成物で投与することもできる。組成物は、同時に及び／又は異なる時間（例えば、順次）に投与することができる。

本明細書に記載される本発明の化合物は、一般に、医薬製剤として患者または対象に投与されることになる。本明細書で使用される「患者」という語は、ヒトまたは動物対象を指す。本発明の化合物は、医師または他の医療専門家の指導の下で、治療的に用いることができる。

本発明の酸性スフィンゴミエリナーゼをコードする核酸分子またはそれを含むベクターを含む医薬製剤は水、緩衝食塩水、エタノール、ポリオール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、油、界面活性剤、懸濁剤またはそれらの適当な混合物などの許容可能な媒体（例えば、薬学的に許容される担体）と共に投与するために便利に製剤化することができる。溶解度の限界は、当業者であれば容易に求めることができる。

本明細書で使用される「薬学的に許容される媒体」または「担体」は、先の議論において例示されるように、医薬製剤の所望の投与経路に適切であり得る任意のおよび全ての溶媒、分散媒体などを含む。薬学的に活性な物質に対するこのような媒体の使用は、当技術分野で知られている。従来の媒体や薬剤が投与される化合物と不適合である場合を除き、医薬製剤に使用することが企図される。

特定の患者への投与に適した本発明による化合物の用量および投与レジメンは、患者の年齢、性別、体重、一般的な病状、および化合物が投与される特定の状態およびその重症度を考慮して医師が決定することができる。医療従事者は、化合物の投与経路、化合物が含まれる医薬担体、および化合物の生物学的活性も考慮することができる。

適切な医薬製剤の選択は、選択された投与様式（例えば、血流中、静脈内または直接注入）にも依存することになる。例えば、本発明の酸性スフィンゴミエリナーゼをコードする核酸分子またはそれを含むベクターは、注射によって、例えば、肝臓またはその近傍に直接投与することができる。これらの例では、医薬製剤は、注射部位に適合する媒体中に分散された本発明の化合物を含む。

本発明の酸性スフィンゴミエリナーゼをコードする核酸分子またはそれを含むベクターは、鼻腔内、筋肉内、皮下、局所、経口、注射などの任意の方法で投与することができる。注射のための薬学的調製物は、当該分野で公知である。治療を施すための一方法として注射が選択される場合、分子の充分な量がそれらの標的細胞に到達して生物学的作用を発揮することを確実にするために、工程が取られなければならない。

活性成分として本発明の化合物を薬学的担体と密接に混合して含有する医薬組成物は、従来の医薬配合技術に従って調製することができる。担体は、投与に望まれる製剤の形態、例えば、注射剤などに応じて、多種多様な形態をとることができる。注射用懸濁液は、例えば、適切な液体担体、懸濁化剤などを用いて調製することができる。

定義
以下の定義は、本発明の理解を容易にするために提供される：
単数形の「ａ、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上明らかにそうでない場合を除き、複数形の参照語を含む。

「薬学的に許容される」とは、動物、より詳細にはヒトにおける使用のための、連邦もしくは州政府の規制当局による承認、または米国薬局方もしくは他の一般に認められた薬局方に記載された承認を示す。

「担体」とは、例えば、希釈剤、アジュバント、防腐剤（例えば、チメロサール（Ｔｈｉｍｅｒｓｏｌ）、ベンジルアルコール）、酸化防止剤（例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、可溶化剤（例えば、ポリソルベート８０）、乳化剤、緩衝剤（例えば、トリス塩酸塩、酢酸塩、リン酸塩）、抗菌剤、増量物質（例えば、乳糖、マンニトール）、賦形剤、補助剤または本発明の活性薬剤が投与されるビヒクルである。薬学的に許容される担体は、石油、動物、植物または合成起源のものを含む、水および油のような滅菌液であり得る。水または水性生理食塩水溶液および水性デキストロースおよびグリセロール溶液は、特に注射可能な溶液のための担体として使用され得る。好適な医薬担体は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ著「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ」（ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ）、Ｇｅｎｎａｒｏ，Ａ．Ｒ．，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：ＴｈｅＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅｏｆＰｈａｒｍａｃｙ，（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，ＷｉｌｌｉａｍｓａｎｄＷｉｌｋｉｎｓ）；Ｌｉｂｅｒｍａｎ，ｅｔａｌ，Ｅｄｓ．，ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＤｏｓａｇｅＦｏｒｍｓ，ＭａｒｃｅｌＤｅｃｋｅｒ，ＮｅｗＹｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．；およびＫｉｂｂｅ，ｅｔａｌ．，Ｅｄｓ．，ＨａｎｄｂｏｏｋｏｆＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＥｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，ＡｍｅｒｉｃａｎＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎに記載されている。

本明細書で使用される「治療する」という用語は、疾病に罹患した患者に利益を与える任意の種類の治療を指し、患者の状態（例えば、１つ以上の症状）の向上、症状の進行の遅延などを含む。

本明細書で使用される「予防する」という用語は、症状を発症する危険性がある対象の予防的治療を指し、対象が症状を発症する蓋然性を低下させる。

本明細書で使用される「対象」という用語は、動物、特に哺乳動物、特にヒトを指す。

化合物または医薬組成物の「治療的有効量」は、特定の障害または疾患を予防、阻害、または治療するのに効果的な量を指す。本明細書において、疾患または障害の治療とは、疾患または障害、その症状、またはその素因を治癒、緩和、および／または予防することを指す場合がある。

本明細書で使用される場合、用語「治療薬」は、状態、疾患、または障害を治療するため、または状態、疾患、または障害の症状を軽減するために使用することができる、核酸、ペプチド、タンパク質、および抗体を含むがこれらに限定されない化学化合物または生体分子を意味する。

「ベクター」とは、プラスミド、コスミド、バクミド、ファージ、ウイルスなどの遺伝子要素であり、これに別の遺伝子配列または要素（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）を付加させて、付加した配列または要素の複製および／または発現をもたらすことができるものである。ベクターは、ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかであってもよく、一本鎖または二本鎖であってもよい。「発現ベクター」とは、宿主細胞での発現に必要な調節領域（プロモーターなど）を持つ遺伝子や核酸配列を含む特殊なベクターのことである。

「連結された」または「作動可能に連結された」という語は、コード配列の発現に必須の調節配列がコード配列の発現をもたらすように、コード配列に対して適切な位置で核酸分子中に配置されることを意味する。この同一の定義は発現ベクターまたは組換えベクター中のコード配列および転写制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、および終結エレメント）の配置に適用されることがある。

以下の実施例は、本発明を実施する例示的な方法を説明するものであり、いかなる形でも本発明の範囲を限定することを意図するものではない。

骨格筋細胞または筋繊維は身体運動を可能にし、激しい運動、過負荷、伸張性収縮によって頻繁に損傷を受ける（ＭｃＮｅｉｌ，ｅｔａｌ．，（２００３）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．ＣｅｌｌＤｅｖ．Ｂｉｏｌ．，１９：６９７－７３１；Ｈｏｒｎ，ｅｔａｌ．，（２０１８）ＣｅｌｌｕｌａｒＭｏｌｅｃｕｌａｒＬｉｆｅＳｃｉ．，７５（２０）：３７５１－７０）。筋繊維の脆弱性を増加させる変異や修復を妨げる変異は、筋変性や筋ジストロフィーを引き起こす（Ｗａｌｌａｃｅ，ｅｔａｌ，（２００９）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，７１：３７－５７）。三好ミオパチー（ＭＭ）と肢帯型筋ジストロフィー２Ｂ型（ＬＧＭＤ２Ｂ）は、成人期早期に発症し、進行性の骨格筋の衰弱と消耗をもたらすこのような常染色体劣性の筋ジストロフィーである（Ａｏｋｉ，Ｍ．，Ｉｎ：Ａｄａｍｅｔａｌ．，ｅｄｓ．，ＧｅｎｅＲｅｖｉｅｗｓ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ，１９９３）。これらの疾患（集合的にジスフェリン異常症と呼ぶ）は、大きな（２３７ｋＤａ）筋膜タンパク質－ジスフェリンをコードするＤＹＳＦ遺伝子における変異によって引き起こされる（Ｌｉｕ，ｅｔａｌ．，（１９９８）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，２０（１）：３１－６；Ｂａｓｈｉｒ，ｅｔａｌ．，（１９９８）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，２０（１）：３７－４２）。筋変性が顕在化する前でさえ、ジスフェリン異常症患者の筋線維は、膜裂傷、伸展、小胞および液胞の筋鞘下蓄積、基底膜の肥厚などの細胞膜（筋鞘）欠陥を示す（Ｓｅｌｃｅｎ，ｅｔａｌ．，（２００１）Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ５６（１１）：１４７２－８１）。筋鞘損傷の修復不良がこれらの初期異常に関与している（Ｓｅｌｃｅｎ，ｅｔａｌ，（２００１）Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ５６（１１）：１４７２－８１；Ｃｅｎａｃｃｈｉ，ｅｔａｌ，（２００５）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．、５８（２）：１９０－５）。筋繊維の筋鞘の損傷は、損傷をトリガーとする細胞外カルシウムの流入によって活性化される複雑な多段階プロセスによって修復されるが、これはジスフェリン欠損によって損なわれる（Ｂａｎｓａｌ，ｅｔａｌ，（２００３）Ｎａｔｕｒｅ４２３（６９３６）：１６８－７２；Ｄｅｆｏｕｒ，ｅｔａｌ，（２０１４）ＣｅｌｌＤｅａｔｈＤｉｓ．，５：ｅ１３０６）．筋繊維の修復の失敗または欠損は、慢性的な炎症反応を活性化し、筋肉の変性を引き起こすことは、ジスフェリン異常症の骨格筋の顕著な特徴である（Ｎａｇａｒａｊｕ，ｅｔａｌ．，（２００８）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，１７２（３）：７７４－８５；Ｇａｌｌａｒｄｏ，ｅｔａｌ．，（２００１）Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ５７（１１）：２１３６－８；Ｈｏｇａｒｔｈ，ｅｔａｌ．，（２０１９）ＮａｔｕｒｅＣｏｍｍ．，１０（１）：２４３０）。

細胞膜損傷の修復には、カルシウムをトリガーとするシグナル伝達と小胞の融合・分裂が関与し、シナプトタグミンを含むカルシウム結合タンパク質によって促進される（Ｂａｎｓａｌ，ｅｔａｌ．，（２００３）Ｎａｔｕｒｅ４２３（６９３６）：１６８－７２；Ｓｏｎｄｅｒ，ｅｔａｌ．，（２０１９）Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．，９（１）：６７２６；Ｈｏｒｎ，ｅｔａｌ．，（２０１９）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｅｍｂｒ．，８４：６７－９８；

Ｈｏｒｎ，ｅｔａｌ．，（２０１７）Ｓｃｉ．Ｓｉｇｎａｌ．，１０（４９５）：ｅａａｊ１９７８；Ｓｒｅｅｔａｍａ，ｅｔａｌ．，（２０１６）ＣｅｌｌＤｅａｔｈＤｉｆｆｅｒ．，２３（４）：５９６－６０７；Ｓｃｈｅｆｆｅｒ，ｅｔａｌ．，（２０１４）Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．，５：５６４６；Ｊａｉｓｗａｌ，ｅｔａｌ．，（２０１４）Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．，５：３７９５；Ｂｉｔｔｅｌ，ｅｔａｌ．，（２０１９）Ｆｒｏｎｔ．Ｐｈｙｓ．，１０：８２８；Ｊａｉｓｗａｌ，ｅｔａｌ．，（２００２）Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．，１５９（４）：６２５－３５；Ｊａｉｓｗａｌ，ｅｔａｌ．，（２００４）ＰＬｏＳＢｉｏｌ．，２（８）：ｅ２３３）。シナプトタグミンと同様に、ジスフェリンは、カルシウム依存的に負電荷の膜リン脂質と結合するタンパク質を含むＣ２ドメインタンパク質ファミリーのメンバーである（Ｒｉｚｏ，ｅｔａｌ，（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３（２６）：１５８７９－８２；Ｌｅｋ，ｅｔａｌ．，（２０１２）Ｔｒａｆｆｉｃ１３（２）：１８５－９４）．ジスフェリンは、リソソームを細胞膜に繋ぎ止め、膜損傷直後にリソソームがエキソサイトースするのを促進することで、筋鞘修復を仲介します（Ｄｅｆｏｕｒ，ｅｔａｌ．，（２０１４）ＣｅｌｌＤｅａｔｈＤｉｓ．，５：ｅ１３０６）。迅速なリソソームエキソサイトーシスにより、リソソーム酵素ＡＳＭは筋鞘損傷から数秒以内に分泌され、これは修復に必要なプロセスである（Ｔａｍ，ｅｔａｌ．，（２０１０）Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．，１８９（６）：１０２７－３８；Ｍｉｃｈａｉｌｏｗｓｋｙ，ｅｔａｌ．，（２０１９）Ｓｋｅｌｅｔ．Ｍｕｓｃｌｅ９（１）：１）。ジスフェリンの欠如は、傷害トリガーとなるリソソームのエキソサイトーシスを遅らせ、減少させ、それによって細胞傷害時のＡＳＭ分泌を遅らせ、減少させる（Ｄｅｆｏｕｒ，ｅｔａｌ．，（２０１４）ＣｅｌｌＤｅａｔｈＤｉｓ．，５：ｅ１３０６）．結果として、損傷したＬＧＭＤ２Ｂ細胞におけるＡＳＭ分エキソサイトーシスーマン・ピック病Ａ型（ＮＰＤＡ）細胞におけるＡＳＭ産生の欠如は、筋線維の筋鞘修復を損なう（Ｄｅｆｏｕｒ，ｅｔａｌ．，（２０１４）ＣｅｌｌＤｅａｔｈＤｉｓ．，５：ｅ１３０６；Ｍｉｃｈａｉｌｏｗｓｋｙ，ｅｔａｌ．，（２０１９）Ｓｋｅｌｅｔ．Ｍｕｓｃｌｅ９（１）：１）。これらの欠損は、細胞外ＡＳＭの補充が、ＬＧＭＤ２ＢとＮＰＤＡの両患者の筋線維の修復を改善する潜在的な治療法であることを示唆している。

細胞外媒体に分泌されると、ＡＳＭは細胞膜内のスフィンゴミエリン脂質をセラミドに加水分解し、細胞外小胞（ＥＣＶ）の脱落やエンドサイトーシスにより、細胞膜の損傷部分を除去することが提案されている（Ｔａｍ，ｅｔａｌ．，（２０１０）Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．，１８９（６）：１０２７－３８；Ｂｉａｎｃｏ，ｅｔａｌ．，（２００９）ＥＭＢＯＪ．，２８（８）：１０４３－５４）。孔を形成する毒素によって傷つけられた細胞膜は、ＥＣＶの脱落およびカベオラエンドサイトーシスの両方を受けることが分かっており（Ｋｅｙｅｌ，ｅｔａｌ．，（２０１１）Ｊ．ＣｅｌｌＳｃｉ．，１２４（Ｐｔ１４）：２４１４－２３；Ｃｏｒｒｏｔｔｅ，ｅｔａｌ，（２０１３）Ｅｌｉｆｅ２：ｅ００９２６）、これらの毒素は、クラスリン非依存性担体（ＣＬＩＣ）によって形成されるエンドソームのマーカーであるグリコシルホスホチジルイノシトール（ＧＰＩ）とも共局在化する（Ｉｄｏｎｅ，ｅｔａｌ．，（２００８）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１８０（５）：９０５－１４；Ｍａｙｏｒ，ｅｔａｌ．，（２０１４）ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂ．Ｐｅｒｓｐｅｃｔ．Ｂｉｏｌ．，６（６）：ａ０１６７５８）。しかし、ＡＳＭがどのように細胞膜の生理的（局所的または機械的）損傷の修復に役立っているのか、詳細は不明であった。生理的な膜傷害の修復におけるＡＳＭの役割を理解することは、筋肉や肺など、細胞膜傷害を伴う疾患の治療法を知る上で重要である。

骨格筋ジスフェリン遺伝子の再発現を目指したＬＧＭＤ２Ｂの前臨床遺伝子治療アプローチでは、様々な結果が得られているが、全体的にポジティブな治療見通しとなっている（Ｐｏｔｔｅｒ，ｅｔａｌ．，（２０１８）Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．，２９（７）：７４９－６２；Ｐｒｙａｄｋｉｎａ，ｅｔａｌ．，（２０１５）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．ＭｅｔｈｏｄｓＣｌｉｎ．Ｄｅｖ．，２：１５００９；Ｌｏｓｔａｌ，ｅｔａｌ．，（２０１２）ＰＬｏＳＯｎｅ，７（５）：ｅ３８０３６）。しかし、これらの治療法の臨床への進展には、ジスフェリンのような大きな遺伝子の効率的なパッケージングと筋肉送達に関連する障壁を克服することが必要である（Ｂｕｌａｋｌａｋ，ｅｔａｌ．，（２０１７）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，３４：５６－６３）。薬物療法も選択肢の一つであるが、現在のところ、修復不良や他の疾患の病因となるジスフェリン異常症に対応する薬剤は承認されていない。しかし、前臨床研究では、筋鞘を安定化させる薬剤が筋線維の修復を促進し、ジスフェリン異常症の筋肉機能を改善することが示されている（Ｓｒｅｅｔａｍａ，ｅｔａｌ．，（２０１８）ＭｏｌｅｃｕｌａｒＴｈｅｒａｐｙ，２６（９）：２２３１－４２；Ｇｕｓｈｃｈｉｎａ，ｅｔａｌ．，（２０１７）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２５（１０）：２３６０－７１）。細胞外ＡＳＭはジスフェリン異常症の筋繊維の修復を改善する（Ｄｅｆｏｕｒ，ｅｔａｌ．，（２０１４）ＣｅｌｌＤｅａｔｈＤｉｓ．，５：ｅ１３０６）．ｈＡＳＭの静脈内投与は、ＮＰＤＡを治療するためのｈＡＳＭの有効性（Ｍｉｒａｎｄａ，ｅｔａｌ．，（２０００）ＦＡＳＥＢＪ．，１４（１３）：１９８８－９５；Ｍｕｒｒａｙ，ｅｔａｌ．，（２０１５）Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｍｅｔａｂ．，１１４（２）：２１７－２５；Ｓａｍａｒａｎｃｈ，ｅｔａｌ．，（２０１９）Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．，１１（５０６）：ｅａａｔ３７３８；Ｄｏｄｇｅ，ｅｔａｌ．，（２００５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１０２（４９）：１７８２２－７）、および臨床的安全性を示している（Ｗａｓｓｅｒｓｔｅｉｎ，ｅｔａｌ．，（２０１９）Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｍｅｔａｂ．，１２６（２）：９８－１０５；Ｗａｓｓｅｒｓｔｅｉｎ，ｅｔａｌ．，（２０１８）Ｊ．Ｉｎｈｅｒｉｔ．Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓ．、４１（５）：８２９－３８）。しかし、ＬＧＭＤ２Ｂの治療や、ＮＰＤＡの骨格筋障害の改善に対する有用性は検証されていない。本願では、ＬＧＭＤ２ＢにおけるｈＡＳＭタンパク質と非筋肉標的ＡＡＶベースの遺伝子治療法について、患者の筋肉細胞およびマウスモデルを用いて、筋鞘修復を改善する前臨床試験の効果を検証する。また、ＬＧＭＤ２Ｂマウスモデルを用いて、ｈＡＳＭ－ＡＡＶ遺伝子療法による筋繊維の修復、筋病理学、筋機能の慢性的な改善を検討した。

材料及び方法
動物
Ｂ６．Ａ－Ｄｙｓｆ^prmd／ＧｅｎｅＪ（Ｂ６Ａ／Ｊ）マウスはＪａｃｋｓｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＢａｒＨａｒｂｏｒ，ＭＥ）から購入し、Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＣＲＩ）の動物舎で維持した。マウスを使用するすべての実験は、ＣＲＩ動物愛護使用委員会の承認を得ている。動物は、１２時間の明暗サイクルで制御された無菌施設に収容し、餌と水を自由に摂取できるようにした。動物は実験に使用する前にジェノタイピングを行った。

細胞の培養と処置
不死化コントロール（Ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚｅｄｃｏｎｔｒｏｌ）（健常なドナー）およびＬＧＭＤ２Ｂ患者（ホモ接合性ｃ．４８８２Ｇ変異を有し、あらゆる検出可能なジスフェリンタンパクの喪失をもたらす）の筋芽細胞は、記載通りに用いた（Ｄｅｆｏｕｒ，ｅｔａｌ．，（２０１４）ＣｅｌｌＤｅａｔｈＤｉｓ．，５：ｅ１３０６）。筋芽細胞は、１０％ＦＢＳを添加したヒト筋芽細胞培養培地キット（Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ社製）を用い、０．４％ゼラチンコートしたディッシュで培養し、３７℃、５％ＣＯ₂で維持した。ＨｅｐＧ２およびＣ２Ｃ１２筋芽細胞株は、１０％ＦＢＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシンを添加した高グルコースＤＭＥＭで培養された。レーザー損傷では、細胞をフィブロネクチンでコーティングしたガラスカバースリップにプレーティングした。細胞はそのまま傷つけるか、精製ｈＡＳＭ（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）の濃度を変えながら２０分間細胞イメージング用培地（ＣＩＭ：１０ｍＭＨＥＰＥＳを含むＨＢＳＳ、１ｍＭ塩化カルシウム、ｐＨ７．４）中で、ｈＡＳＭ－ＡＡＶまたはコントロール（ｅＧＦＰ－ＡＡＶ）ウイルス粒子で形質転換したＨｅｐＧ２細胞の培養上清中でプレインキュベーションした。１μｇ／μｌの細胞不透過性色素ＦＭ１－４３（Ｎ－（３－トリエチルアンモニウムプロピル）－４－（４－（ジブチルアミノ）スチリル）ピリジニウムジブロマイド；ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）とインキュベーション時と同じ濃度のｈＡＳＭと細胞上清を含むＣＩＭ中で細胞をレーザー傷害を与えた。傷害とその後の画像処置は、ステージトップ型ＺＩＬＣＳインキュベーター（東海ヒット株式会社、富士宮市、日本）を用いて３７℃で行った。パルスレーザー（Ａｂｌａｔｅ！^TM, ３ｉＩｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔＩｍａｇｉｎｇＩｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｄｅｎｖｅｒ，ＣＯ）で細胞膜の１－５μｍ²の領域を＜１０ｍｓ照射し、４８８ｎｍのダイオードレーザー（Ｃｏｂｏｌｔ，Ｓｗｅｄｅｎ）を備えたＩＸ８１オリンパス製顕微鏡（ＯｌｙｍｐｕｓＡｍｅｒｉｃａ，ＣｅｎｔｅｒＶａｌｌｅｙ，ＰＡ）上の６０Ｘ／１．４５ＮＡオイル対物レンズで細胞を２秒間隔で撮像した。ＦＭ色素強度（Ｆ／Ｆ₀、Ｆ₀は元の強度）を定量化し、修復は、ＦＭ色素蛍光の増加をもたらすＦＭ進入のブロックによって示された（Ｄｅｆｏｕｒ，ｅｔａｌ，（２０１４）Ｊ．Ｖｉｓ．Ｅｘｐ．，２０１４（８５）：ｅ５１１０６）。

エンドサイトーシスアッセイ
バルクエンドサイトーシスのために、筋芽細胞（～７０％コンフルエント）の細胞膜をＡＦ４８８結合小麦胚芽アグルチニン（ＷＧＡ）（３ｕｇ／ｍＬ）で３７℃、２分間標識した。過剰なＷＧＡをＣＩＭで洗浄した後、細胞を未処置のまま、またはｈＡＳＭ（ＣＩＭ中６Ｕ／Ｌ）で処置し、ＩＸ８１オリンパス製顕微鏡（ＯｌｙｍｐｕｓＡｍｅｒｉｃａ，ＣｅｎｔｅｒＶａｌｌｅｙ，ＰＡ）の４０Ｘ／１．４ＮＡまたは６０Ｘ／１．４５ＮＡオイル対物レンズを用いて、広視野モードおよび共焦点モードで同時に撮像した。ＷＧＡのエンドサイトーシスを許可し、異なる時点でブロモフェノールブルー（ＢＰＢ）をイメージングチャンバーに注入し（最終濃度４ｍＭ）、細胞表面でのＷＧＡをクエンチさせた。膜エンドサイトーシスの程度を評価するために、バックグラウンド補正後、各細胞の平均クエンチ後蛍光をクエンチ前の初期蛍光で割り、即時クエンチ後に評価した内在化膜の割合（０－ｍｉｎｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）で正規化した。

カベオラエンドサイトーシスについては、ｍＲＦＰタグ付きカベオリン－１（ｃａｖｅｏｌｉｎ－１）をトランスフェクトした細胞を、記載されたように撮像した（Ｔａｇａｗａ，ｅｔａｌ．，（２００５）Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．，１７０（５）：７６９－７９）。５６０ｎｍの共焦点ダイオードレーザー（Ｃｏｂｏｌｔ，Ｓｗｅｄｅｎ）を装備したＩＸ８１オリンパス製顕微鏡（ＯｌｙｍｐｕｓＡｍｅｒｉｃａ，ＣｅｎｔｅｒＶａｌｌｅｙ，ＰＡ）を用いて、上記のように６０Ｘ／１．４５ＮＡオイル対物レンズで、ＣＩＭで細胞を膜－カバースリップ界面で撮像した。細胞は表示通り１Ｈｚで撮像した。カベオリンの移動性を定量化するために、イメージング開始時に各細胞で５０個の個々のカベオリン点刻（ｐｕｎｃｔａ）／小胞をマークした。その後、各小胞は手動で追跡された。小胞は、横方向に１．５μｍ以上移動するか、軸方向に移動して１０秒以上撮影面に存在しないか、またはその両方を満たす場合に移動したと判断した。２分間の小胞の分数（各細胞の５０個中）を定量した。

ＣＬＩＣ／ＧＥＥＣエンドサイトーシスアッセイのために、細胞をＧＦＰでタグ付けされたグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ－ＧＦＰ）でトランスフェクトした（Ｎｉｃｈｏｌｓ，ｅｔａｌ．，（２００１）Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．，１５３（３）：５２９－４１）。トランスフェクションした細胞を上記と同様に細胞体中央を通るｚ平面で１フレーム／分、２０分間撮像した。必要に応じて、２枚目の画像の後にｈＡＳＭをチャンバーに追加した。ＧＰＩ－ＧＦＰ膜の蛍光は、細胞膜をマーキングしてモニターし、光退色を補正した。エンドサイトーシス速度は、目的のタイムポイントにまたがる膜蛍光カイネティクストレースを曲線フィッティングし、これを用いてその特定のタイムポイントにおける膜蛍光の損失速度を計算することによって得られた。画像はＳｌｉｄｅＢｏｏｋ^TM６．０（ＩｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔＩｍａｇｉｎｇＩｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ，ＤｅｎｖｅｒＣＯ）を用いて定量化した。

膜の脱落アッセイ
Ｃ２Ｃ１２細胞（～５０％コンフルエンス）をＦＩＴＣ－ＰＥＧ－コレステロール（５ μＭ；ＰＥＧ－２０００，ＮａｎｏｃｓＩｎｃ．，ＰＧ２－ＣＳＦＣ－２ｋ）で３０分間、３７℃、ＣＩＭ中で標識した。過剰な標識を洗浄した後、直ちにＣＩＭにおいて、４８８ｎｍのダイオードレーザーを装備したＩＸ８１顕微鏡の６０Ｘ／１．４５ＮＡオイル対物レンズで、共焦点顕微鏡と広視野顕微鏡を同時に用いて撮像した。細胞は０．２Ｈｚ、２分間撮像した。必要に応じて、タイムラプス撮影開始の２０－３０秒前にｈＡＳＭを添加した。細胞－カバースリップ界面に位置するＺ平面で画像を収集し、周囲のカバースリップ領域への小胞の流出をモニターした。小胞はＭｅｔａｍｏｒｐｈ７．０（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ，ＣＡ）を用いて、細胞に隣接するカバースリップ表面の５，０００μｍ²の領域で定量化し（２分間に排出された小胞の合計）、取得開始時に存在した小胞に正規化した。細胞蛍光の損失を評価するため、広視野画像を光退色補正し、ＳｌｉｄｅＢｏｏｋ^TM ６．０ソフトウェアを使用して２分間の蛍光の損失を分析した。

ウェスタンブロッティングおよび免疫染色
ＨｅｐＧ２細胞溶解物を４－１２％勾配ポリアクリルアミドゲルで分離し、ニトロセルロース膜に移し、ＡＳＭ（Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）および β－アクチン（Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）に対する示した抗体でプローブした。一次抗体の後に、適切なＨＲＰ結合二次抗体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）および化学発光ウェスタンブロッティング基質（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）を加え、Ｃｈｅｍｉｄｏｃ^TM ＭＰシステム（ＢｉｏＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＣＡ）で処置した。

ＡＡＶベクターの作製と送達
ＡＡＶ８／ＤＣ１９０－ｈＡＳＭベクター生産のために、ヒトＡＳＭｃＤＮＡを有するプレウイルスプラスミドを構築した（Ｂａｒｂｏｎ，ｅｔａｌ，（２００５）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．、１２（３）：４３１－４０）。簡単に説明すると、ヒト酸性スフィンゴミエリナーゼｃＤＮＡ（ＮＭ＿０００５４３）の発現は、肝臓に制限されたプロモーター／エンハンサーＤＣ１９０から駆動される（Ｚｉｅｇｌｅｒ，ｅｔａｌ．，（２００４）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，９：２３１－２４０；ヒトプロトロンビンエンハンサーの２つのコピーに連結されたヒト血清アルブミンプロモーター）。また、この発現カセットにはハイブリッドイントロンが含まれている。ポリアデニレーションシグナルに続いて、ヒトα１－アンチトリプシンのイントロンの断片があり、最適なパッケージングのために組換えウイルスＤＮＡのサイズは約４．５Ｋｂとなる。プラスミドＤＮＡはＱｉａｇｅｎＥｎｄｏＦｒｅｅ（登録商標）Ｐｌａｓｍｉｄｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｋｉｔ（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＭＤ）を用いて精製した。ＡＡＶ２ベースのプレウイルスプラスミドは、ＡＡＶ血清型８カプシドにパッケージングされた。組換えＡＡＶウイルスは、ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＭａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓＭｅｄｉｃａｌＳｃｈｏｏｌＶｅｃｔｏｒＣｏｒｅＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙＣｅｎｔｅｒ（Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ，ＭＡ）による、プラスミド３回トランスフェクションと塩化セシウム密度勾配精製により作製した。ＡＡＶベクターのゲノムコピー価は、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル配列に特異的なプライマーを用いたリアルタイムＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲアッセイ（ＡＢＩＰｒｉｓｍ７７００；ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，ＣＡ）を用いて測定された。ＡＡＶ９．ＣＭＶ．ＰＩ．ｅＧＦＰ．ＷＰＲＥ．ｂＧＨ（Ｌｏｔ＃ＣＳ０２７３）をコントロールＡＡＶベクターとして使用した（ＶｅｃｔｏｒｃｏｒｅａｔｔｈｅＰｅｒｅｌｍａｎＳｃｈｏｏｌｏｆＭｅｄｉｃｉｎｅ，ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＰｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）。ウイルス粒子は、５％グリセロールバッファーを含む滅菌ＰＢＳに懸濁した状態で－８０℃に保存した。このウイルス粒子懸濁液を解凍し、希釈して、３．４ｘ１０¹¹粒子／マウスまたは１．１ｘ１０¹³ｖｇ／ｋｇのウイルス用量で静脈内投与した。この研究に使用されたマウスは、同じ日に生まれた雄と雌の混合からなる２つのＢＬＡ／Ｊマウスの産仔に由来している。各子マウスは耳標ＩＤで識別され、コード化されたＩＤ番号に基づいて各子マウスから無作為に抽選され、１）両子マウスが各処置群に混合されている、２）各処置群に雌雄両方のマウスが含まれていることを確認した。ｈＡＳＭ－ＡＡＶ群では、５匹のマウスにｈＡＳＭ－ＡＡＶを注射した。同じ数のマウスからなる対照群には、コントロールＡＡＶを注入した。注射後、実験マウスは３ヶ月間ホームケージで飼育され、特定の実験に供された。

ＡＳＭ測定
肝臓と大腿四頭筋は液体窒素で冷却したイソペンタンでスナップ冷凍し（－８０℃で保存）、血清はベースライン、注射後１週間、４週間、１２週間に眼窩後出血で採取し、－８０℃で保存した。アッセイ用に、組織サンプルを粉砕し、氷上でＲＩＰＡバッファ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．ＬｏｕｉｓＭＯ）＋プロテアーゼ阻害剤カクテル（ＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）中のマイクロチューブホモジナイザーで均質化した。溶解物は、ＢＣＡタンパク質アッセイとプレートリーダーを使用して、総タンパク質濃度を評価した。すべてのサンプルで、等量の溶解タンパク質（肝臓は４．１μｇ、大腿四頭筋は２５μｇ）および血清量（５μＬ）を使用した。ＡＳＭタンパク質は翻訳後修飾を受け、酵素活性に影響を与えるため、タンパク質量の代わりにＡｍｐｌｅｘ^TM ＲｅｄＳｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎａｓｅａｓｓａｙｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてｈＡＳＭ活性を測定した。すべてのサンプルは三重で実行された。したがって、活性は肝臓と筋肉組織１ｇあたりの加水分解活性（Ｕ）（肝臓／筋肉ＡＳＭ活性の場合）、および血清１リットルあたりのＵの単位で表された。活性は各処置条件につき５サンプルで平均し、平均＋ＳＥＭで表した。

血清アラニン・トランスアミナーゼ（ＡＬＴ）濃度
ＡＡＶ注入後の上記の各時点の血清（５μＬ）を、製造者の指示に従って、比色アッセイ（ＣａｙｍａｎＣｈｅｍｉｃａｌ，ＡｎｎＡｒｂｏｒ，ＭＩ）を用いて、肝臓障害／疾患のマーカーであるＡＬＴ濃度についてアッセイした。すべてのサンプルは三重で実施し、ＡＬＴ濃度は処置条件ごと、タイムポイントごとに全サンプルの平均をとり、平均±ＳＥＭで示す。

ｈＡＳＭ－ＡＡＶによるｉｎｖｉｔｒｏｈＡＳＭの生産と定量化
９６ウェルディッシュに１ｘ１０⁵細胞／ウェルの密度で入れたＨｅｐＧ２細胞に、抗生物質を含まないＤＭＥＭ中で４．５ｘ１０⁶個のＡｄ５粒子（４５個／細胞の感染多重度（ＭＯＩ））を２時間にわたって感染させた。細胞にＡＡＶ２／８ＤＣ１９０－ｈＡＳＭまたはコントロールベクターを１ｘ１０¹⁰ゲノムコピー／ｍｌ（ＭＯＩ１０⁴）で１００ μｌの容量で１時間感染させた。１時間後、１００ μｌの完全ＤＭＥＭを加えた。５日目に細胞培養液を回収し、すぐにその後の実験に使用するか、－８０℃で保存した。細胞を氷冷したリン酸緩衝生理食塩水で擦過してペレット化し、プロテアーゼ阻害剤カクテル（ＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を含むＲＩＰＡ緩衝液（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で溶解させた。培養上清と細胞溶解液は、Ａｍｐｌｅｘ^TM ＲｅｄＳｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎａｓｅａｓｓａｙｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いたｈＡＳＭ活性測定の蛍光測定法およびウェスタンブロットに使用された。ＡＳＭ動態は、ＥｎＳｐｉｒｅ（登録商標）ＭｕｌｔｉｍｏｄｅＰｌａｔｅＲｅａｄｅｒ（パーキンエルマー社）を用いて、５８５ｎｍの蛍光発光検出で２０分間に渡って解析した。ｈＡＳＭ活性は、上清１Ｌまたは細胞ライセート１ｇあたりの活性の単位で表した。すべてのサンプルは三重で評価し、標準曲線を作成した。ｈＡＳＭのＡＳＭ活性は、細菌スフィンゴミエリナーゼ陽性対照（１０Ｕ／Ｌ）の既知の活性と蛍光発光、およびここに示す生成標準曲線を用いて、蛍光発光値から活性単位に変換した。ｈＡＳＭタンパク質は、タンパク質１ｍｇあたり０．０１単位のＡＳＭ活性換算値を持つ。

ｈＡＳＭのｉｎｖｉｔｒｏにおける細胞毒性
健常なドナーの筋芽細胞は、０．４％ゼラチンコートした５１ｃｍ培養皿で培養し、１０％ＦＢＳを添加したヒト筋芽細胞培養液キット（Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ）で６０％コンフルエンスまで培養し、３７℃、５％ＣＯ₂で維持した。６０％コンフルエントに達した時点で、増殖培地に滴定濃度のｈＡＳＭタンパク質（コントロール／ＰＢＳ，８，８０，８００Ｕ／Ｌ）を２４時間添加した。その後、細胞を回収し、トリパンブルーアッセイで細胞生存率／細胞死を評価し、細胞死は全細胞に対するパーセンテージで表した。細胞死実験は、１つのｈＡＳＭ投与量につき３つの生物学的複製で実施した。

組織学と免疫組織化学
ＣＭ３０５０Ｓｃｒｙｏｓｔａｔ（ＬｅｉｃａＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＢｕｆｆａｌｏＧｒｏｖｅ，ＩＬ）を用いて大腿四頭筋と肝臓の厚さ８μｍの横断凍結切片を作成し、後の染色のために－２０℃で保存した（各群ｎ＝５）。解凍後、筋肉切片はＨ＆Ｅ、ラミニン（１：１００，抗ラミニン－２ α鎖，ラットモノクローナル、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ），ＩｇＭ（１：１００，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ），ペリリピン（１：２５０，Ｓｉｇｍａ），マッソントリクローム（ＴｒｉｃｈｒｏｍｅＳｔａｉｎＫｉｔ，Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）で処置し、肝臓切片はＨ＆Ｅでのみ処置した。画像はＶＳ１２０スライドスキャン顕微鏡（ＯｌｙｍｐｕｓＡｍｅｒｉｃａ，ＭＡ）を用いて４０倍の倍率で撮影し、ＣｅｌｌＳｅｎｓソフトウェアで定量化した。免疫染色のため、筋切片は５％ＢＳＡで１時間（ラミニン染色）、または１％ＢＳＡ、１０％ヤギ血清および０．１％Ｔｗｅｅｎ（ペリリピン用）でブロックされた。ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８または５９４（１：５００）二次抗体を使用し、ＷＧＡおよびＤＡＰＩと共染色した。

筋炎症の定量化には、９個以上の核からなる筋原線維外核のクラスターを炎症巣として注目し、Ｈ＆Ｅ染色切片の大腿四頭筋全断面からランダムに選んだ１０箇所から定量化し、断面積１ｍｍ²あたりで表した。これらの切片は、中心核を持つ繊維の定量化にも使用され、筋切片ごとにカウントされた全筋繊維の割合として表された。中心核付き筋繊維の数は、ラミニンおよびＤＡＰＩの共染色切片、およびＣｅｌｌＰｒｏｆｉｌｅｒＭｕｓｃｌｅＡｎａｌｙｚｅｒパイプラインを使用して、記載されたように、独立して検証した（Ｌａｕ，ｅｔａｌ，（２０１８）Ｓｋｅｌｅｔ．Ｍｕｓｃｌｅ８（１）：３２）。同じパイプラインを使用して、１群３匹のマウス、合計３０００本の筋繊維の断面積を評価し、μｍ²で測定した。筋線維／コラーゲンの蓄積はマッソントリクローム染色で定量化した。全筋画像から大腿四頭筋断面あたり５枚の代表画像を撮影し、染色したコラーゲン組織（青色に染色）に占められる全筋面積の割合を、ＩｍａｇｅＪを用いて記載通りに評価した（Ｃｏｒｂｉｅｒｅ，ＥＴＡＬ．，（２０１８）Ｊ．Ｆｕｎｃｔ．Ｍｏｒｐｈｏｌ．Ｋｉｎｅｓｉｏｌ．、３（１）：１）。選択された画像は、赤、青、緑の各チャンネルに分割され、その後、青チャンネルの画像を閾値処置して、コラーゲン染色された線維性組織を定量化した。

ｉｎｖｉｖｏでの損傷筋繊維の定量化のために、大腿四頭筋の全断面からランダムに選んだ領域から小麦胚芽アグルチニン（ＷＧＡ）標識繊維の総数を、ＩｇＭに陽性であった繊維のスコアとした。そして、これらを筋肉の断面積１ｍｍ²におけるＩｇＭ陽性線維の数として示した。脂肪生成沈着物の定量化のため、ペリリピン染色した大腿四頭筋切片をＭｅｔａｍｏｒｐｈ（登録商標）ソフトウェアで測定し、ペリリピン陽性面積のパーセントで示す。肝組織病理のスコアリングでは、Ｈ＆Ｅ染色した切片について、肝細胞の壊死、アポトーシス、核分裂、変性、欠損（局所またはびまん性）、空胞化、肥大、線維化、炎症などの特徴を１～５のスケールでスコア化した（スコアが高いほど病理が悪いことを意味する）。各肝サンプルスコアは、各肝切片の代表的な５フィールドのスコアの平均である。

握力測定
前肢および後肢の握力測定（ＧＳＭ）は、握力計（ＣｏｌｕｍｂｕｓＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｃｏｌｕｍｂｕｓ，ＯＨ）を用いて、記載の通り評価した（Ｓｐｕｒｎｅｙ，ｅｔａｌ．，（２００９）ＭｕｓｃｌｅＮｅｒｖｅ３９（５）：５９１－６０２）．動物たちはデータ収集の前に３日間馴化させた。その後、前肢および後肢の握力データを５日間連続で収集し、記載されているように５日間の平均握力／ｋｇ体重で表した（Ｓｒｅｅｔａｍａ，ｅｔａｌ．，（２０１８）ＭｏｌｅｃｕｌａｒＴｈｅｒａｐｙ２６（９）：２２３１－４２）．
Ｅｘｖｉｖｏ筋繊維損傷

収縮誘発性筋鞘傷害については、野生型ＢＬ６またはｈＡＳＭ－ＡＡＶまたはコントロール－ＡＡＶで処置したＢ６Ａ／ＪマウスからＥＤＬ筋を抽出し、リンゲル液（１３７ｍＭＮａＣｌ、２４ｍＭＮａＨＣＯ₃、１１ｍＭグルコース、５ｍＭＫＣｌ、２ｍＭＣａＣｌ₂、１ｍＭＭｇＳＯ₄、１ｍＭＮａＨ₂ＰＯ₄ 、および０．０２５ｍＭ塩化ツボクラリン）を９５％Ｏ₂－５％ＣＯ₂でバブリングし、ｐＨを７．４に維持した。遠位腱は固定底板に，近位腱はサーボモーター（８００Ａｉｎｖｉｔｒｏｍｕｓｃｌｅａｐｐａｒａｔｕｓ，ＡｕｒｏｒａＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のアームに６－０シルク縫合糸でしっかりと固定された。縦に並んだＥＤＬ筋の両脇に、２枚のステンレス板電極を配置した。０．２ｍｍ角の単一シミュレーションパルスを用いて、筋を力発生に最適な筋長に調整した。最適な長さで、２５０Ｈｚまでの周波数で３００ｍｓ継続する等尺性四肢収縮を２分間の休息間隔で行い、最大力を測定した。収縮による筋鞘損傷は、１０％の伸縮を伴う９回の連続的な伸長収縮（ＬＣ）を、１秒間に２本の繊維長の速度で行うことで誘発された。各収縮は１分間の休息間隔で区切られた。ＬＣによる力の損失は、最初の収縮に対するパーセンテージで表した。ＬＣプロトコルの終了後、筋肉を腱から切り離し、ブロットして重量を測定し、室温で３０分間、２％ＰＯ溶液でインキュベートした。過剰な色素を洗浄した後、組織を液体窒素で冷却したイソペンタン中で急速凍結し、切片を作成してＰＯ標識繊維を撮像し、非標識組織はバックグラウンド蛍光の測定に使用した。ＰＯ陽性筋線維の数は、筋断面における全筋線維に対する割合で表し、断面の端にある線維は解析から除外した。局所レーザー傷害アッセイのために、無傷の上腕二頭筋を予め温めたチロデス緩衝液（１１９ｍＭＮａＣＬ，５ｍＭＫＣＬ，２５ｍＭＨｅｐｅｓバッファー，２ｍＭＣａＣｌ₂，２ｍＭＭｇＣｌ₂，グルコース－６ｇ／Ｌ，ｐＨ７．４）、ＦＭ１－４３色素（１－２ｍｇ／ｍＬ）に取り付け、上記の細胞レーザー傷害について述べたように４０Ｘ／１．４ＮＡ、ＩＸ８１オリンパス製顕微鏡を用いて撮像した。修復動態および筋繊維修復の成功は細胞傷害アッセイについて記載されたように決定された（Ｈｏｒｎ，ｅｔａｌ．，（２０１７）ＳｃｉＳｉｇｎａｌ，１０（４９５）：ｅａａｊ１９７８）．

研究の厳密性
本研究のｉｎｖｉｖｏ部分の先験的なサンプルサイズの決定は、膜脂質安定化薬（細菌スフィンゴミエリナーゼ、およびバモロロン）のプロレパレーション効果（ｐｒｏ－ｒｅｐａｒａｔｉｖｅｅｆｆｅｃｔ）を評価して実施した２つの研究（Ｄｅｆｏｕｒｅｔａｌ．，（２０１４）ＣｅｌｌＤｅａｔｈＤｉｓ．，５：ｅ１３０６；Ｓｒｅｅｔａｍａ，ｅｔａｌ．，（２０１８）ＭｏｌｅｃｕｌａｒＴｈｅｒａｐｙ２６（９）：２２３１－４２）から得られたものである。レーザーアブレーションによる損傷修復能の評価については、バモロロン試験からパワー解析を行い、この膜脂質修飾薬による効果量は０．７２５であることが判明した。両側αを０．０５に設定し、検出力を８０％とすると、統計的有意差を得るためには、各処置群につき５匹のマウスが必要であることがわかる。同様に、細菌性スフィンゴミエリナーゼは筋繊維膜修復能力を向上させ、その効果量は０．６であった。修復能力に対する有意な効果を評価するには、両側αを０．０５、検出力を８０％として１群６匹のマウスを使用する必要があった。そこで、ＬＧＭＤ２Ｂ（ＢＬＡ／Ｊマウス）の細胞膜脂質を修飾する化合物や薬剤の効果を検討した研究から、このデータをまとめると、ｈＡＳＭ投与のように、主要なエンドポイント（膜修復能）の測定には１群あたり５匹のマウスが必要であり、試験した追加のエンドポイントで統計的に有意な差を見つけるには１処理群あたり４～７匹のマウスが必要であった。

すべてのｉｎｖｉｖｏ測定（レーザー損傷アッセイ、すべての筋肉と肝臓の組織学的測定、ＡＳＭとＡＬＴ活性、偏心力アッセイ）は、研究チームのメンバーによって盲検で取得された。盲検化は、マウスのイヤータグ番号と治療群が記載されたコードシートを使用することで達成された。修復アッセイは、評価者／データ解析者に分からないようにコード化され、コンディションに合わせた。リコンビナントｈＡＳＭを添加したアッセイは、盲検化されていないチームメンバーが実施したが、評価者はｉｎｖｉｔｒｏＡＳＭ活性アッセイではサンプルの同一性を知らされていなかった。

統計情報
細胞傷害動態、上腕二頭筋線維修復動態（ＦＭ－ｄｙｅ－ｉｎｔｅｎｓｉｔｙｋｉｎｅｔｉｃｓ）、伸張力低下トレース（ｅｃｃｅｎｔｒｉｃｆｏｒｃｅｄｅｃｒｅｍｅｎｔｔｒａｃｅｓ）、ＣＬＩＣ－ＧＥＥＣエンドサイトーシス動態について、生成されたすべての曲線を、治療条件と時間または試験の主効果間の相互作用を分析した混合モデルＡＮＯＶＡによって比較検討した。有意な相互作用が見られた場合、ＦＭ色素蛍光強度／膜蛍光／伸張力の群間差をＨｏｌｍ－Ｓｉｄａｋ検定により時間点ごとに評価し、球形性の違反のためＨｕｙｎｈ－Ｆｅｌｄｔ補正を行った。一元配置分散分析により、損傷後に修復できなかった細胞や筋繊維の数、および一般的な膜エンドサイトーシスの測定値における差異を明らかにした。反復測定ＡＮＯＶＡを用いて、１２週間の治療期間中の体重変化とＣＬＩＣ／ＧＥＥＣエンドサイトーシス率における条件間の差異を評価した。肝ＡＳＭ産生、血清ＡＳＭ活性、血清ＡＬＴ濃度、損傷により修復する繊維の割合、組織学的指標（ＩｇＭ＋割合、繊維化領域、炎症巣、中心核形成、ペリリピン＋の割合、プロシオン－オレンジ＋の割合、筋繊維領域に関するマッソントリクローム染色）、および肢力測定におけるコントロール－ＡＡＶマウスとｈＡＳＭ投与マウス間の比較を独立サンプルｔ検定により算出した。同様に、独立標本ｔ検定を用いて、トランスフェクトＨｅｐＧ２細胞のＡＳＭ活性（細胞上清と溶解物の両方）、およびＣ２Ｃ１２カベオリンエンドサイトーシス移動画分、および膜脱落測定値（未処置ｖｓ．ｈＡＳＭ－処置）の差を算出した。すべての統計解析において、αレベルはｐ＜０．０５とした。
結果
ｈＡＳＭは小胞の脱落やカベオラエンドサイトーシスとは無関係にＬＧＭＤ２Ｂ患者の細胞修復を回復させる

膜修復に対するｈＡＳＭの効果を調べるために、ＬＧＭＤ２Ｂ患者由来の筋芽細胞に精製したヒトＡＳＭ（ｈＡＳＭ）タンパク質を投与した。精製ｈＡＳＭに患者細胞をさらすと、その細胞膜修復は用量依存的に改善された（図１Ａ－１Ｃ）。精製ｈＡＳＭは、３Ｕ／Ｌ、または４Ｕ／Ｌの濃度では、患者の筋芽細胞の修復を改善する効能はなかった（図１Ａ、１Ｂ）。しかし、４Ｕ／Ｌを超える量の精製ｈＡＳＭで患者細胞を処置すると、細胞膜の修復が進み、傷ついた細胞へのＦＭ色素の侵入が抑えられた（図１Ａ，１Ｂ）。患者細胞の膜修復に対するｈＡＳＭの効果は、５Ｕ／ＬのｈＡＳＭの用量で膜修復が改善し、６Ｕ／Ｌ以上のｈＡＳＭ濃度でピークに達するような明確な用量反応が現れた（図１Ｂ、１Ｃ）。その結果、５Ｕ／ＬのｈＡＳＭでは傷害から修復できない細胞の数が減少したが、６Ｕ／Ｌ以上のｈＡＳＭの用量で最大の改善が得られた（図１Ｃ）。

孔形成毒素による膜損傷の修復にカベオラエンドサイトーシスと膜脱落が関与していることから、これらの経路に対するｈＡＳＭの影響を調べた。カベオリン１－ＲＦＰを発現する筋芽細胞において、カベオラエンドサイトーシスをカベオラの動態をライブイメージングでモニターした（図２Ａ）。共焦点顕微鏡で個々の細胞膜関連カベオラを観察すると、２分以内に７５％以上の細胞膜のカベオラがその開始位置から移動し、６Ｕ／Ｌの精製ｈＡＳＭで処置してもこの移動カベオラの割合は変化しなかった（７８％±１．８ｖｓ８０％±１．４；図２Ａ、２Ｂ）。次に、この用量のｈＡＳＭが細胞膜の脱落を誘発するかどうかを検討した。ＥＣＶはコレステロールに富んでいるため（Ｂｉｔｔｅｌ，ｅｔａｌ．，（２０１９）Ｆｒｏｎｔ．Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ１０：８２８）、細胞膜をＦＩＴＣ標識ＰＥＧコレステロールで標識し、小胞の脱落を２分間に渡って定量した（図２Ｃ）。未処置と６Ｕ／ＬｈＡＳＭ処理細胞では、同程度のＥＣＶが排出された。－未処置：１５８±２４ｖｓ．ｈＡＳＭ－処理：１４７±１５（図２Ｄ）。そして、ｈＡＳＭ処置細胞と未処置細胞で同量程度の細胞関連コレステロールの標識が失われた（図２Ｅ）。これらの結果から、患者細胞の膜修復を改善するｈＡＳＭの用量は、カベオラエンドサイトーシスやＥＣＶの脱落を促進しないことが判明し、ｈＡＳＭが細胞膜修復を改善する別の膜輸送機構の存在を示唆した。
ｈＡＳＭ処置によるバルク細胞膜エンドサイトーシスの促進

細胞のバルクエンドサイトーシスはクラスリン独立担体（ＣＬＩＣ）によって支えられており、ＣＬＩＣはジスフェリンや孔形成性毒素のエンドサイトーシスを促進する（Ｉｄｏｎｅ，ｅｔａｌ．，（２００８）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１８０（５）：９０５－１４；Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ－Ｄｅｖｉｅｚ，ｅｔａｌ．，（２００８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８３（１０）：６４７６－８８），ＣＬＩＣマーカーＧｌｙｃｏｓｙｌ－Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ（ＧＰＩ）－ａｎｃｈｏｒｅｄＧｒｅｅｎＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔＰｒｏｔｅｉｎ（ＧＰＩ－ＧＦＰ）に対するｈＡＳＭ処置の影響を検討した。Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞を用いると、ＣＬＩＣの細胞膜からの定常的なエンドサイトーシスが観察され、これはｈＡＳＭ（図２Ｆ－２Ｈ）処置によって鋭敏に増強されることがわかった。ＣＬＩＣのエンドサイトーシスは、未処置の健常者とＬＧＭＤ２Ｂ患者の筋芽細胞で同程度の割合で観察された（図２Ｆ，２Ｉ，２Ｊ）。マウスの筋芽細胞におけるＣＬＩＣエンドサイトーシス速度の増加（図２Ｈ）と同様に、患者の筋芽細胞へのｈＡＳＭ処置でもＣＬＩＣエンドサイトーシス速度が増加した（図２Ｉ、２Ｊ）。

バルク膜除去におけるＣＬＩＣの役割を念頭に、レクチン小麦胚芽アグルチニン（ＷＧＡ）を用いて細胞膜を標識し、異なる投与量のｈＡＳＭに応答してそのエンドサイトーシス除去を評価することにより、修復におけるバルク膜エンドサイトーシスの役割を検討した。簡単に説明すると、細胞膜を蛍光性のＷＧＡで標識し、エンドサイトーシス期間の終わりにブロモフェノールブルー（ＢＰＢ）を用いて細胞表面のＷＧＡ蛍光を消光することにより、３分間にわたって膜エンドサイトーシスを監視した。ＢＰＢによってクエンチされない細胞内の穿孔蛍光（Ｐｕｎｃｔａｔｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）は、エンドソームに局在する内在化したＷＧＡを示す。内在化したＷＧＡの蛍光は、クエンチ前のベースライン標識との相対値で表した。未処置のマウス筋芽細胞と３Ｕ／ＬｈＡＳＭで処置した筋芽細胞は、同量の細胞膜に結合したＷＧＡをエンドサイトーシスしたが、６Ｕ／ＬｈＡＳＭで処置するとマウス筋細胞におけるＷＧＡエンドサイトーシス率は著しく上昇した（Ｕｎｔｒｅａｔｅｄ：１６．２％＋１．６、３Ｕ／ＬｈＡＳＭ。１５．５％＋０．９，６Ｕ／ＬｈＡＳＭ：２３％＋１．６、ＷＧＡ内包）（図３Ａ、３Ｂ）。

ＬＧＭＤ２Ｂ患者筋芽細胞によるＡＳＭ分泌の減少という知見（Ｄｅｆｏｕｒ，ｅｔａｌ．，（２０１４）ＣｅｌｌＤｅａｔｈＤｉｓ．，５：ｅ１３０６）に従い、これらの細胞はＷＧＡをエンドサイトーシスする能力が２倍減少（１１％＋１患者ｖｓ．２１％＋１．６健常者）した（図３Ｃ、図３Ｄ）。ＬＧＭＤ２Ｂの細胞修復を改善したｈＡＳＭの用量（６Ｕ／Ｌ）で処置すると、これらの細胞のＷＧＡエンドサイトーシスも促進されたが、低用量（３Ｕ／Ｌ）ではそうならなかった（図３Ｃ、３Ｄ）。健康な筋肉細胞を６Ｕ／ＬｈＡＳＭで処置すると、それらによるＷＧＡエンドサイトーシスも増加し（未処置：２０．９％＋１．６、６Ｕ／ＬｈＡＳＭ：２９．７％＋１．４）（図３Ｄ）であり、細胞毒性（図７）を引き起こすことはなかった。これらの結果から、ｈＡＳＭを介した修復の改善は、安全にバルクの細胞膜エンドサイトーシスを促進することが明らかになった。

ｈＡＳＭ－ＡＡＶはＬＧＭＤ２Ｂの膜修復を回復するための遺伝的アプローチを提供する
上記の研究は、ＬＧＭＤ２Ｂ患者細胞におけるバルクエンドサイトーシスの欠陥に安全に対処するためのｈＡＳＭ治療の有用性を示しているが、その治療的有用性のためには、ｉｎｖｉｖｏで治療レベルを維持するためにタンパク質を頻繁に投与することが必要である。この課題を克服するために、分泌型ｈＡＳＭを遺伝子工学的に発現させ、血清中のこのタンパク質の治療レベルを安定的に維持するという別のアプローチの利用が検討された。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを用いて、肝特異的プロモーターの制御下で分泌型ｈＡＳＭタンパク質を発現させた。ＡＡＶベクターは、肝臓特異的プロモーター下で分泌型ｈＡＳＭを産生するｈＡＳＭ－ＡＡＶをヒト肝細胞株ＨｅｐＧ２に感染させてｉｎｖｉｔｒｏで評価した（Ｂａｒｂｏｎ，ｅｔａｌ．，（２００５）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１２（３）：４３１－４０）。コントロールベクターと比較して、ｈＡＳＭ－ＡＡＶを感染させたＨｅｐＧ２細胞は６．４Ｕ／ＬｈＡＳＭを分泌した（図４Ａ－４Ｃ）。これは膜修復を改善するのに必要な治療量（６Ｕ／Ｌ）を上回っているため、ヒト肝細胞が産生する分泌型ｈＡＳＭが傷ついたＬＧＭＤ２Ｂ患者筋細胞の修復を改善する能力を検証した。コントロールＡＡＶ発現ＨｅｐＧ２細胞の培養上清で処置した患者筋芽細胞に比べて、ｈＡＳＭ発現ＨｅｐＧ２細胞の上清で処置した患者筋芽細胞は、健常ドナーの筋芽細胞と同様の動態で効率的に修復した（図４Ｄ、４Ｅ）。これらの結果から、肝臓を標的としたｈＡＳＭ－ＡＡＶ遺伝子治療は、ＬＧＭＤ２Ｂ患者の筋肉細胞における細胞膜修復を改善するｉｎｖｉｔｒｏの有効性が確立された。
肝臓を標的としたｈＡＳＭ－ＡＡＶにより筋繊維の筋鞘修復が改善される

ＬＧＭＤ２Ｂ筋線維の細胞膜修復を改善するｈＡＳＭのｉｎｖｉｖｏでの効果を検証するために、ＬＧＭＤ２Ｂのモデルマウス（Ｂ６Ａ／Ｊ）を使用した。これらのジスフェリン欠損マウスに、１０週齢で肝臓特異的なｈＡＳＭ－ＡＡＶまたはコントロール－ＡＡＶを尾静脈注射で１回投与した。このｈＡＳＭ－ＡＡＶの単回投与から１２週間後、これらのマウスは２２週齢で評価された。Ｂ６Ａ／Ｊマウスは、１５～２４週齢までに、筋損傷、筋線維修復欠損、運動障害の兆候を示し、これらは徐々に悪化し続ける（Ｄｅｆｏｕｒ，ｅｔａｌ．，（２０１４）ＣｅｌｌＤｅａｔｈＤｉｓ．，５：ｅ１３０６；Ｈｏｇａｒｔｈ，ｅｔａｌ．，（２０１９）ＮａｔｕｒｅＣｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ１０（１）：２４３０；Ｎａｇｙ，ｅｔａｌ．，（２０１７）ＰｈｙｓｉｏｌＲｅｐ．，５（６）：ｅ１３１７３）。ｈＡＳＭ－ＡＡＶで処置したマウスでは、コントロール－ＡＡＶで処置したマウスと比較して、肝臓ｈＡＳＭ活性が４倍、血清ＡＳＭ活性が２倍高かった（６００＋５４．７Ｕ／ｇｒａｍｖ／ｓ１７１．６＋２．４）（図５Ａ）。ｈＡＳＭ－ＡＡＶを投与したＢ６Ａ／Ｊマウスの血清および筋肉中のＡＳＭ活性は、投与後１週間以内に上昇し、１２週間後にも高いレベルが維持された（図５Ｂ，５Ｊ，７）。このｈＡＳＭの増加は、１２週間の投与期間中の動物の成長、肝組織病理学、および血清中のアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）値によって評価すると、動物全体の健康や肝臓に悪影響を与えなかった（図５Ｂ、５Ｃ、７）。ｉｎｖｉｔｒｏでの筋細胞修復においてｈＡＳＭが付与する改善効果が実証されたことから、ｉｎｖｉｖｏでのｈＡＳＭの増加が、ジスフェリン欠損筋線維の筋鞘修復を改善し、筋線維の損傷と変性を軽減するかどうか評価された。筋繊維内のＩｇＭの存在を筋繊維損傷の指標とすると、ｈＡＳＭ－ＡＡＶ処置によって損傷した筋繊維の範囲が３倍減少した（図５Ｄ，５Ｅ）。筋繊維の修復に対するｉｎｖｉｖｏｈＡＳＭ処置の利点を直接評価するために、コントロールとｈＡＳＭ－ＡＡＶで処置したマウスの無傷の上腕二頭筋の筋繊維修復を監視するｅｘｖｉｖｏレーザー損傷アッセイが使用された。この方法を用いると、ｈＡＳＭ－ＡＡＶ処置マウスの筋繊維の修復能力は、コントロール－ＡＡＶ処置マウスのものと比較して向上することが観察された（図５Ｅ、５Ｆ、５Ｇ）。レーザー傷害は制御された局所的な損傷をもたらすので、機械的活動によって傷害を受けた筋繊維の修復能力を調査した。ｈＡＳＭ－ＡＡＶまたはコントロールＡＡＶで処置したＢ６Ａ／Ｊマウスの無傷のＥＤＬ筋と、年齢をマッチさせたＷＴマウスで、このような機械的損傷からの修復を評価した。１０％伸張性収縮を１０回行い、筋繊維を損傷させた後、膜不透過性生体色素プロキオンオレンジ（ＰＯ）を用いて損傷した筋繊維を標識した。機械的損傷により、修復に失敗した損傷筋繊維のＰＯ標識は、ｈＡＳＭ－ＡＡＶ処置マウスでは２倍以上減少した（図５Ｅ，５Ｈ）。このｈＡＳＭ－ＡＡＶ処置マウスの筋繊維修復の改善は、機械的損傷による筋力低下の減衰と相関し、健常者（ＷＴ）の筋肉と同じレベルに達した（図５Ｉ）。これらの知見は、ジスフェリン異常症の筋肉を高濃度のｈＡＳＭにｉｎｖｉｖｏで慢性的に曝すと、ｉｎｖｉｖｏでの自然損傷後や、ｅｘｖｉｖｏでの局所的、あるいは機械的損傷後の筋繊維修復能力が回復することを示す。

ＬＧＭＤ２Ｂに対するｈＡＳＭ－ＡＡＶの前臨床試験での有用性
以上のように、ｈＡＳＭ－ＡＡＶ療法がジスフェリン欠損による筋繊維の修復不良や筋繊維の過剰な壊死に対して有益であることから、次にこの治療法がｉｎｖｉｖｏでの筋病理組織学や機能を改善できるかどうかを検討した。大腿四頭筋は、ジスフェリン欠損症によってしばしば影響を受ける主要な運動筋群である（Ｈｏ，ｅｔａｌ，（２００４）Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．、１３（１８）：１９９９－２０１０）。そこで、これらの筋肉の病理組織を調べたところ、筋肉の炎症が～８０％減少していた（図６Ａ，６Ｂ）。慢性的な骨格筋の炎症はダメージを与え、より大きな再生が必要となることから、ｈＡＳＭ－ＡＡＶ処置した筋肉で炎症が減ると再生も低下するかどうかを検討した。Ｈ＆Ｅ標識した筋切片における中心核（再生の目印）を持つ筋繊維の割合を定量したところ、ｈＡＳＭ－ＡＡＶ処置により筋繊維再生の必要性が２倍減少し（コントロール－ＡＡＶ：４０．５％＋５．５，ｒｈＡＳＭ－ＡＡＶ：１９．３％＋４．７）（図６Ｃ）、これは中心核を持つ筋繊維を自動カウントして確認した（図６Ａ）。さらに、筋繊維３０００本の断面積を測定したところ、ｈＡＳＭ－ＡＡＶ処置条件ではコントロール－ＡＡＶと比較して筋繊維が４５％ほど大きくなっていた（図６Ａ，６Ｄ）。さらに、ｈＡＳＭ－ＡＡＶ処置した筋肉では、筋肉の線維化（マッソントリクローム染色）（図６Ａ、６Ｅ）、筋繊維の脂肪生成損失（ペリリピン－１染色）（図６Ａ、６Ｆ）が３倍近く減少していることも確認された。最後に、ｈＡＳＭ－ＡＡＶ処置によるこれらの病理組織学的な改善が、筋力の改善につながるかどうかを検討した。ジスフェリンの欠損は後肢筋の力損失を大きくし（Ｄｅｆｏｕｒ，ｅｔａｌ．，（２０１７）ＨｕｍａｎＭｏｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ２６（１１）：１９７９－９１）、膜修復の改善によりこの欠損に対処する（Ｓｒｅｅｔａｍａｅｔａｌ．，（２０１８）ＭｏｌｅｃｕｌａｒＴｈｅｒａｐｙ２６（９）：２２３１－４２）。そこで、コントロールマウスとｈＡＳＭ－ＡＡＶ処置マウスの前肢および後肢の筋握力を測定した（Ｓｒｅｅｔａｍａｅｔａｌ，（２０１８）ＭｏｌｅｃｕｌａｒＴｈｅｒａｐｙ２６（９）：２２３１－４２）。その結果、コントロールＡＡＶ投与群に比べ、前肢の握力には顕著な変化は見られなかったが、後肢の握力はｈＡＳＭ－ＡＡＶ投与群で有意に向上していた（図６Ｇ、６Ｈ）。これらの知見から、ｈＡＳＭ－ＡＡＶの単回投与により、ＬＧＭＤ２Ｂの病理組織学的および機能的な筋肉の改善が延長できることが明らかとなった。

ＬＧＭＤ２Ｂの治療法として、ジスフェリン欠損の下流にある細胞障害の回復が期待されている。ＬＧＭＤ２Ｂ患者の筋肉における大きなジスフェリンタンパク質の発現を回復させることを目的とした現在進行中の遺伝子治療を補完するために、今回の研究は別のアプローチを提供するものである。ジスフェリンより４倍ほど小さいタンパク質（ＡＳＭ）を肝臓に特異的に発現させることにより、ジスフェリン欠損の下流への影響を解明する。これにより、骨格筋のジスフェリン回復に匹敵する前臨床での効果が得られた。ジスフェリンは、ＡＳＭのタイムリーな分泌に必要な迅速かつ効率的なリソソームエキソサイトーシスを可能にし、損傷した筋肉細胞が頻繁に起こる膜損傷を修復できるようにする（Ｄｅｆｏｕｒ，ｅｔａｌ．，（２０１４）ＣｅｌｌＤｅａｔｈＤｉｓ．，５：ｅ１３０６）。傷ついた細胞による不十分なＡＳＭ放出は、ＬＧＭＤ２ＢとＮＰＤＡの両患者に共通する欠損である（Ｄｅｆｏｕｒ，ｅｔａｌ．，（２０１４）ＣｅｌｌＤｅａｔｈＤｉｓ．，５：ｅ１３０６；Ｍｉｃｈａｉｌｏｗｓｋｙ，ｅｔａｌ，（２０１９）Ｓｋｅｌｅｔ．Ｍｕｓｃｌｅ．９（１）：１）。しかし、ＮＰＤＡと異なり、ジスフェリン欠損筋はＡＳＭの発現を欠くことが判明した（図５Ｊ）。驚くべきことに、細胞外ｈＡＳＭの増加は、理論にとらわれることなく、ＣＬＩＣを介したエンドサイトーシスの促進による細胞膜修復の改善によって、ＬＧＭＤ２Ｂマウスモデルの筋肉の健康を改善する（図２、３）。ＣＬＩＣはジスフェリンのエンドサイトーシスを促進し（Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ－Ｄｅｖｉｅｚ，ｅｔａｌ．，（２００８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８３（１０）：６４７６－８８）、細胞膜に結合した孔形成毒素と局在するため（Ｉｄｏｎｅ，ｅｔａｌ，（２００８）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１８０（５）：９０５－１４），ＣＬＩＣエンドサイトーシスは、細胞膜の修復と複雑に関連し、本名所で実証されたように－ＡＳＭ媒介修復と関連する（Ｃｏｒｒｏｔｔｅ，ｅｔａｌ．，（２０１３）Ｅｌｉｆｅ２：ｅ００９２６）。

ｈＡＳＭの外因性投与はヒトに対して安全であり、ＮＰＤ患者におけるＡＳＭ欠損による症状に対して治療効果を示す（Ｍｕｒｒａｙ，ｅｔａｌ，（２０１５）Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｍｅｔａｂ．，１１４（２）：２１７－２５；Ｄｅｆｏｕｒ，ｅｔａｌ．，（２０１７）ＨｕｍａｎＭｏｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ２６（１１）：１９７９－９１）。しかし、こうした研究では、ｈＡＳＭが膜修復を改善する能力を評価したり、ＡＳＭの産生不足ではなく、その分泌低下によって引き起こされる疾患であるＬＧＭＤ２Ｂに対する有効性を評価したりすることはない。本研究では、ｈＡＳＭの修復性を調べ、ジスフェリン欠損筋細胞（図１）において膜修復能を回復できる有効なｈＡＳＭの細胞外投与量を予想外に同定した。この用量は、孔形成毒素によって傷害を受けたＡＳＭ欠損細胞の修復を促進するために使用された用量よりも低い（Ｔａｍ，ｅｔａｌ，（２０１０）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１８９（６）：１０２７－３８）。細胞膜修復の改善に有効なこのｈＡＳＭの用量は、ヒトに使用するために確立された安全な最大ｈＡＳＭ用量よりはるかに低く、細胞死を誘発する用量（図７）より１００倍低いため、ＬＧＭＤ２Ｂにおける臨床的有用性が期待される（ＭｃＧｏｖｅｒｎ，ｅｔａｌ．，（２０１６）Ｇｅｎｅｔ．Ｍｅｄ．，１８（１）：３４－４０）。しかし、注入したｈＡＳＭタンパク質の循環半減期が２１～２４時間と短いことから、ｈＡＳＭの直接投与に依存する治療では、有効性を維持するために薬剤の頻繁な投与と用量漸増が必要となり、ＬＧＭＤ２Ｂなどの慢性疾患の治療への有用性は低くなってしまうであろう。この限界を克服するために、より臨床的に実現可能なアプローチとして、ＡＡＶを介した肝発現によるｈＡＳＭの遺伝子導入が試された。安全性に優れ、幅広い組織でＡＡＶの導入効率が高いことから、これらの遺伝子導入ベクターを利用した臨床試験がこれまでに２０００件以上行われている（Ｋｕｍａｒ，ｅｔａｌ．，（２０１６）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．ＭｅｔｈｏｄｓＣｌｉｎ．Ｄｅｖ．、３：１６０３４）。このうち、肝臓特異的なＡＡＶベースの治療薬は、静脈内投与によるターゲティングの効果が高く、１回の投与で数年にわたるトランスジーン発現が可能で、血漿タンパク質欠乏症の治療に効率的である。（Ｎａｔｈｗａｎｉ，ｅｔａｌ．，（２０１４）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３７１（２１）：１９９４－２００４；Ｄｏｂｒｚｙｎｓｋｉ，ｅｔａｌ．，（２００４）Ｂｌｏｏｄ１０４（４）：９６９－７７；Ｃａｏ，ｅｔａｌ．，（２００７）Ｂｌｏｏｄ１１０（４）：１１３２－４０；Ｃｏｌｅｌｌａ，ｅｔａｌ．，（２０１８）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．ＭｅｔｈｏｄｓＣｌｉｎ．Ｄｅｖ．，８：８７－１０４）．このアプローチは安全であるにもかかわらず、ＭＴＭ１タンパク質（ＡＴ１３２）のＡＡＶ８用量漸増法を用いたｘ連鎖性ミオチュブラーミオパチー（ＭＴＭ）の最近の第１、２相臨床試験（ＮＣＴ０３１９９４６９）では、高いレベルのウイルス量（１ｘ１０¹⁴ ｖｇ／ｋｇから３ｘ１０¹⁴ ｖｇ／ｋｇまで）で肝に有害な結果が観察さた。今回の研究では、ｈＡＳＭ－ＡＡＶの１．１×１０¹³ ｖｇ／ｋｇ（ヒト等量１．１×１０¹²ｖｇ／ｋｇ）でのマウスでの治療効果が確認された。このように、ヒトに相当する投与量を大幅に減らすことで、安全な使用が可能になる。この安全性を裏付けるように、ｈＡＳＭ－ＡＡＶの１２週間の投与中および投与終了時においても、明らかな肝障害（血清ＡＬＴ値および肝組織学）は観察されなかった。

ｈＡＳＭ－ＡＡＶをｉｎｖｉｔｒｏで使用したところ、ヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２細胞）から治療上有効な濃度に達するレベルで分泌型ｈＡＳＭを生産できること、ジスフェリン欠損患者筋細胞（図４）の修復を回復させることが示された。この有効性は、前臨床のジスフェリン欠損モデルマウスにこのベクターを使用したｉｎｖｉｖｏでも反映されている。ＮＰＤのマウスモデルにおけるベクターの使用は、１２週間の研究において、増加した安定したｈＡＳＭ産生を実証した（Ｂａｒｂｏｎ，ｅｔａｌ，（２００５）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．、１２（３）：４３１－４０）。ｈＡＳＭ－ＡＡＶのｉｎｖｉｖｏでの使用はＬＧＭＤ２Ｂマウスモデルを用いて示され、このベクターの単回投与による１２週間の治療後、肝および血清中の高レベルのｈＡＳＭが検出され、筋線維修復能力の回復に有効であることが示された（図５）。これらの知見は、ＬＧＭＤ２Ｂにとって興味深いものであるが、ＮＰＤＡのマウスモデルの筋線維も仙骨修復不良を示すため、ＮＰＤＡ患者にとっても興味深いものである（Ｍｉｃｈａｉｌｏｗｓｋｙ，ｅｔａｌ，（２０１９）Ｓｋｅｌｅｔ．Ｍｕｓｃｌｅ９（１）：１）。

筋変性の増加には、より大きな筋再生が必要であるが、ｈＡＳＭ－ＡＡＶによるジスフェリン欠損筋線維の修復が改善されると、再生筋線維の数が２倍減少し、再生の必要性が低下することが分かった。また、ｈＡＳＭ－ＡＡＶ処置マウスでは、小さな（新しく再生された）筋繊維の割合が減少した（図６）。ｈＡＳＭ－ＡＡＶによるこれらのｉｎｖｉｖｏ改善は、ジスフェリンＡＡＶを介した遺伝子治療アプローチによって得られるものと同等であり（Ｐｏｔｔｅｒ，ｅｔａｌ．，（２０１８）Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．、２９（７）：７４９－６２）、分泌型ｈＡＳＭベースの遺伝子療法が、筋線維のジスフェリン発現を回復させる遺伝子療法と同様にＬＧＭＤ２Ｂ筋線維修復欠損を救済するのに有効であることを実証している。持続的な筋線維の損傷の追加の結果には、慢性的な筋肉の炎症が含まれる（Ｔｉｄｂａｌｌ，ｅｔａｌ．，（２０１１）Ｃｏｍｐｒ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１（４）：２０２９－６２．）。ジスフェリン欠損マウスのｈＡＳＭ－ＡＡＶ処置も、おそらくジスフェリン欠損筋線維のｉｎｖｉｖｏ修復能力の改善を通じて、これを減衰させた（図６）。

傷害と膜修復不良の連続的な発作はまた、筋肉の線維性脂肪形成置換を促進する。ｈＡＳＭ－ＡＡＶは、ＡＡＶ－ジスフェリン遺伝子療法を用いて達成された減少に匹敵する程度に、ジスフェリン異常症の筋肉の線維性脂肪生成置換を減少させた（Ｐｏｔｔｅｒ，ｅｔａｌ．，（２０１８）Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．，２９（７）：７４９－６２）（図６）。これらの結果から、ｈＡＳＭ－ＡＡＶ療法は、筋肉の修復、筋肉の質と健康全般を改善する能力において、同時に筋肉機能を維持することが示唆された。これらの改善に伴い、ｈＡＳＭ－ＡＡＶ投与後に後肢の握力の向上が観察された。前肢握力（ＬＧＭＤ２Ｂマウスモデル（Ｌｌｏｙｄ，ｅｔａｌ．，（２０１９）ＰＬｏＳＯｎｅ１４（４）：ｅ０２１４９０８）では影響を受けない）は、ｈＡＳＭ－ＡＡＶ処置によって変化しなかった。さらに、後肢の握力の観察された改善は、ジスフェリン異常症の治療効果を提供する他の前臨床アプローチと一致する（Ｆａｒｉｎｉ，ｅｔａｌ，（２０１２）Ｅｘｐ．ＣｅｌｌＲｅｓ．，３１８（１０）：１１６０－７４；Ｈａｎ，ｅｔａｌ．，（２０１０）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１２０（１２）：４３６６－７４；Ｈａｌｅｖｙ，ｅｔａｌ．，（２０１３）Ｈｉｓｔｏｌ．Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ．、２８（２）：２１１－２６．）。

以上のことから、今回報告された結果は、ｈＡＳＭタンパク質がＬＧＭＤ２Ｂ筋細胞の筋鞘修復を用量依存的に改善することを実証している。彼らは、精製ｈＡＳＭタンパク質とＡＡＶを介した肝ｈＡＳＭ遺伝子導入アプローチの両方が、ジスフェリン異常症の筋線維の修復能力を向上させるための実行可能な戦略であることを立証した。遺伝子導入法を用いることで、筋繊維の死や組織病理の軽減、筋機能の改善など、より長期的なｉｎｖｉｖｏでの有用性が確立される。

細胞レベル、組織レベルでの脂質のアンバランスがジスフェリン異常症の筋肉変性を特徴づけている。線維性脂肪細胞の異常な蓄積と脂肪分化が、ジスフェリン異常症における筋力低下を引き起こす。線維性脂肪形成細胞をターゲットにすることで、脂肪生成の変性による筋肉の減少を抑制する治療法を提供する。

分泌型酸性スフィンゴミエリナーゼを遺伝的に増加させると、ジスフェリン異常症の筋肉が保護され、その機能低下が防がれる。

本発明が関係する技術水準を説明するために、本明細書全体を通していくつかの刊行物および特許文献が引用されている。これらの各引用文献の開示全体は、参照により本明細書に組み込まれる。

以上、本発明の好ましい実施の特定について説明し、具体的に例示したが、本発明はかかる実施形態に限定されるものではない。以下の特許請求の範囲に記載されているように、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、様々な修正を行うことができる。

Claims

対象の筋ジストロフィーを治療、抑制、及び／又は予防する方法であって、酸性スフィンゴミエリナーゼをコードする核酸を前記対象に投与することを含む、方法。
前記筋ジストロフィーが、ジスフェリン異常症であるか、またはジスフェリン欠損症である、請求項１に記載の方法。
前記ジスフェリン異常症が、肢帯型筋ジストロフィー２Ｂ型（ＬＧＭＤ２Ｂ）又は三好型筋ジストロフィー１型である、請求項２に記載の方法。
前記酸性スフィンゴミエリナーゼをコードする核酸が、肝臓特異的又は肝細胞特異的プロモーターに連結されている、請求項１に記載の方法。
前記肝臓特異的または肝細胞特異的プロモーターが、ヒトα－１アンチトリプシン（ｈＡＡＴ）プロモーター、ハイブリッド肝臓プロモーター（ＨＬＰ）、ヒトチロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）、ヒト血清アルブミンプロモーターおよびＤＣ１９０プロモーターからなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
前記肝臓特異的または肝細胞特異的プロモーターが、ヒト血清アルブミンプロモーターである、請求項４に記載の方法。
前記肝臓特異的または肝細胞特異的プロモーターが、ＤＣ１９０プロモーターである、請求項４に記載の方法。
前記酸性スフィンゴミエリナーゼをコードする核酸を肝臓に直接または血流に注入する、請求項１に記載の方法。
前記酸性スフィンゴミエリナーゼがヒト酸性スフィンゴミエリナーゼである、請求項１に記載の方法。
前記酸性スフィンゴミエリナーゼをコードする核酸が、ウイルスベクター内に含まれる、請求項１に記載の方法。
前記ウイルスベクターがアデノ随伴ウイルスベクターである、請求項１０に記載の方法。