KR20230031329A - 골격 근섬유 복구를 개선하기 위한 재조합 인간 산성 스핑고미엘리나제의 용도 - Google Patents

Abstract

근이영양증을 치료하기 위한 조성물 및 방법이 제공된다.

Description

골격 근섬유 복구를 개선하기 위한 재조합 인간 산성 스핑고미엘리나제의 용도

본 출원은 2020년 6월 30일에 제출된 미국 가출원 제63/046,202호에 대해 35 U.S.C.§119(e) 하에 우선권을 주장한다. 전술한 출원은 본원에 참조로 포함되어 있다.

본 발명은 국립 관절염 및 근골격계 및 피부 질환 연구소(NIAMS)에 의해 수여된 수여 번호 5R01AR055686 하에 정부 지원으로 이루어졌다. 미국 정부는 본 발명에서 특정 권리를 갖는다.

본 발명의 분야

본 발명은 근섬유 복구에 관한 것이며, 특히 다이스페린병증을 치료, 억제 및/또는 예방하기 위한 조성물 및 방법이 제공된다.

다이스페린병증(dysferlinopathy)은 근육 관여에 기초한 사지연결 근이영양증 2B형(limb-girdle muscular dystrophy type 2B, LGMD2B) 또는 미요시(Miyoshi) 근이영양증 1과 같은 진행성 근육 소모 질환이다(Bashir, et al. (1998) Nat. Genet., 20:37-42; Liu, et al. (1998) Nat. Genet., 20:31-36). 다이스페린 결핍은 소포 형성 및 이동(trafficking)의 변화, 손상된 세포막의 부실한 복구, 및 근육 염증 증가로 이어진다(Cenacchi, et al. (2005) J. Clin. Pathol., 58:190-195; Demonbreun, et al. (2011) Hum. Mol. Genet., 20:779-789; Bansal, et al. (2003) Nature 423:168-172; Ho, ET AL. (2004) Hum. Mol. Genet., 13:1999-2010; Gallardo, et al. (2001) Neurology 57:2136-2138; Bonnemann, et al. (1996) Curr. Opin. Pediatr., 8:569-582).

다이스페린병증의 질환 중증도는 근육의 지방 대체와 상관관계가 있다. 실제로, 지방의 축적은 다이스페린 결핍 환자에서의 발병기전과 직접적으로 상관관계가 있으며, 이는 다이스페린병증 특유의 특성이다. 섬유/지방생성 전구체(FAP) 축적 역시 질환 중증도와 상관관계가 있는데, FAP가 다이스페린병증 근육의 지방생성 손실을 유발하기 때문이다(Hogarth, et al. (2019) Nat. Commun., 10:2430). 특히, 아넥신 A2의 결핍은 다이스페린병증 근육의 지방생성 손실을 방지한다(Defour, et al. (2017) Hum. Mol. Genet., 26(11):1979-1991). 세포외 아넥신 A2는 대식세포와 상호작용함으로써 다이스페린병증 근육의 지방생성 전환을 촉진한다. 감소된 FAP 활성화는 아넥신 A2 결핍 다이스페린병증 근육에서의 지방생성 감소에 대한 근거일 수 있다. 실제로, FAP 지방생성의 차단은 다이스페린병증 근육의 지방생성 손실을 제한한다.

다이스페린은 시냅토타그민(synaptotagmin)과 같은 Ca²⁺ 의존성 막 융합 단백질에서 발견되는 C2 도메인을 함유한다(Lek, et al. (2012) Traffic 13:185-194). 따라서, 다이스페린은 소포 이동과 융합을 조절함으로써 근육 기능을 조절할 수 있다(Posey, et al. (2011) Curr. Top. Dev. Biol. 96:203-230; Lennon, et al. (2003) J. Biol. Chem., 278:50466-50473; Kesari, et al. (2008) Am. J. Pathol., 173:1476-1487; Nagaraju, et al. (2008) Am. J. Pathol., 172:774-785). 다이스페린 결핍은 또한 다이스페린병증 근모세포의 융합 능력에 관한 상충되는 보고와 관련되어 왔다(Demonbreun, et al. (2011) Hum. Mol. Genet., 20:779-789; de Luna, et al. (2006) J. Biol. Chem., 281:17092-17098; Humphrey, et al. (2012) Exp. Cell. Res., 318:127-135; Philippi, et al. (2012) PLoS Curr., 4:RRN1298).

이러한 다이스페린의 다양한 역할에도, 다이스페린 결핍이 근육 병리를 초래하는 메커니즘은 밝혀지지 않았다. 다이스페린의 골격근 특이적 재발현이 모든 다이스페린병증 병리를 구제하므로, 근섬유 복구는 다이페린병증에서 근육 병리의 근본이 되는 통합적인 결핍인 것으로 제안되었다(Millay, et al. (2009) Am. J. Pathol., 175: 1817-1823; Lostal, et al. (2010) Hum. Mol. Genet., 19:1897-1907; Han, R. (2011) Skelet. Muscle 1:10). 손상된 세포막의 복구는 포유류 세포에서 리소좀, 인라지오좀(enlargeosome), 카베올라(caveolae), 다이스페린 함유 소포, 및 미토콘드리아를 포함하는 세포하 구획(subcellular compartment)을 필요로 한다(Lennon, et al. (2003) J. Biol. Chem., 278:50466-50473; Bansal, et al. (2003) Nature 423:168-172; Borgonovo, et al. (2002) Nat. Cell. Biol., 4:955-962; Corrotte, et al. (2013) Elife 2:e00926; Sharma, et al. (2012) J. Biol. Chem. 287:30455-30467).

정상적인 다이스페린 발현을 갖는 근이영양증 환자의 세포는 정상적인 리소좀 및 인라지오좀 세포외유출(exocytosis)을 나타낸다(Jaiswal, et al. (2007) Traffic 8:77-88). 그러나, 다이스페린병증 근육 세포는 LAMP2 양성 리소좀의 확대, 초기 엔도솜(endosome)의 융합 감소, 후기 엔도솜/리소좀 융합을 조절하는 단백질의 발현 변화, 및 LAMP1의 손상 촉발된 세포 표면 수준 감소를 나타낸다(Demonbreun, et al. (2011) Hum. Mol. Genet., 20:779-789; Lennon, et al. (2003) J. Biol. Chem., 278:50466-50473; Kesari, et al. (2008) Am. J. Pathol., 173:1476-1487). 비근육 세포에서, 다이스페린의 결핍은 리소좀 세포외유출을 감소시킨다(Han, et al. (2012) J. Cell. Sci., 125:1225-1234). 이러한 발견은 리소좀을 다이스페린 매개 근육 세포막 복구에 연루시킨다(Corrotte, et al. (2013) Elife 2:e00926; McDade, et al. (2013) Hum. Mol. Genet., 23:1677-1686).

전술한 내용에도 불구하고, 효과적인 치료법이 여전히 필요하다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 대상체에서 근이영양증을 치료, 억제 및/또는 예방하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 산성 스핑고미엘리나제를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 산성 스핑고미엘리나제를 코딩하는 핵산을 대상체에 투여하는 단계를 포함하며, 특히 핵산은 간 또는 간세포에서 발현된다. 특정 구현예에서, 산성 스핑고미엘리나제를 코딩하는 핵산은 간 특이적 또는 간세포 특이적 프로모터의 제어 하에 있거나 이에 연결되어 있다. 전형적으로, 근이영양증은 다이스페린병증이거나 다이스페린 결핍이다. 다이스페린병증의 예는 사지연결 근이영양증 2B형(LGMD2B) 또는 미요시 근이영양증 1을 포함한다. 특정 구현예에서, 산성 스핑고미엘리나제는 인간 산성 스핑고미엘리나제이다. 특정 구현예에서, 산성 스핑고미엘리나제를 코딩하는 핵산은 아데노 관련 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터 내에 함유된다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 상기 방법을 실행하기 위한 조성물 및 벡터(예컨대, AAV 벡터)가 또한 제공된다.

도 1a는 정제된 hASM 단백질의 증가하는 용량으로 처리된 LGMD2B 환자 근모세포의 이미지를 제공한다. FM 염료 라벨링을 보여주는 초점 레이저 손상(흰색 화살표로 표시된 부위) 전후의 근모세포의 공초점 이미지(흰색 화살표로 표시된 부위)가 제공된다. 스케일 바 = 10 μm. 도 1b는 막 손상 후 근모세포 내로의 FM 염료 유입의 동역학을 보여주는 플롯을 제공한다(조건당 n = 50개 세포). 데이터는 평균 ± SEM으로 제시된다. 처리 조건 및 시간 간의 상호작용 효과에 대한 분석을 갖는 혼합 모델 ANOVA에 의한 *p<0.05(미처리 및 3 U/L 대비), #(5 U/L 대비). 도 1c는 복구에 실패한 레이저 손상 세포의 비율의 정량화를 보여주는 그래프를 제공한다(조건당 n > 45개 세포). 데이터는 평균 ± SEM으로 제시된다. p < 0.05로 설정된 알파를 갖는, Tukey HSD 사후 검정을 사용한 일원 ANOVA(n = 조건당 반복당 15-18개 세포를 사용한 n=3 실험 반복).
도 2a는 처리되지 않거나(상단) 또는 6 U/L 정제된 hASM으로 처리된(하단) mRFP 태그된 카베올린-1을 발현하는 마우스 근모세포의 바닥 표면(세포-커버슬립 인터페이스)의 공초점 이미지를 제공한다. 그레이스케일 이미지는 이미징 시작시(시점 0) 전체 세포를 보여준다. 세포 상의 선은 3분 동안 초당 1프레임으로 획득한 이미지로 제시된 카베올린-1 이동성을 입증하는 그레이스케일 카이모그래프에 나타낸 픽셀을 표시한다(카이모그래프 y 축 = 180초의 총 획득 시간). 픽셀의 깨진 트랙은 세포막에 존재하는 카베올라의 움직임을 나타낸다. hASM 처리된 카이모그래프에서의 화살표는 60초 표시에서의 hASM 첨가의 시간을 나타낸다. 도 2b는 각 조건에서 카베올린-1 점(punctae)의 정량화를 보여주는 플롯을 제공한다(10개의 세포로부터 n = 50개의 점). 도 2c는 살아있는 세포가 이미징 전에 FITC-콜레스테롤로 라벨링된 세포막 탈락(shedding) 이미지를 제공한다. 그레이스케일 이미지는 이미징 시작시(시점 0) 커버슬립 표면에서 세포막의 공초점 이미지를 나타내며, 흰색 상자는 세포에 의해 탈락된 콜레스테롤 라벨링된 소포를 모니터링하는 데 사용된 세포에 인접한 커버슬립 상의 세포외 공간을 표시한다. 이 영역의 줌이 오른쪽 패널에 나타나 있으며, 여기서 이미징 시작시(기저선) 존재하는 소포와 모의(미처리) 처리 또는 6 U/L hASM(hASM 처리)으로 처리 후 2분 후에 존재하는 소포가 표시되어 있다. 도 2d는 6 U/L hASM으로 처리되거나 처리되지 않은 세포(조건당 n = 10개 세포)에 의해 탈락된 FITC-콜레스테롤이 풍부한 입자의 정량화를 보여주는 그래프를 제공한다. 도 2e는 도 2c 및 2d에서 이미지화된 세포(조건당 n = 10개 세포)에 의한 세포 관련 FITC-콜레스테롤 형광의 손실률의 정량화 그래프를 제공한다. 도 2f는 6 U/L hASM으로 처리하기 전과 처리 4분 후에 CLIC/GEEC 리포터 GPI-GFP를 발현하는 마우스 근모세포의 중앙을 통한 광학 절편을 보여주는 이미지를 제공한다. 도 2g-2j는 C2C12-근모세포(도 2g, 2h) 및 건강한 근모세포 및 환자 근모세포(도 2i, 2j)에서 GPI-GFP의 동역학(도 2g, 2i) 및 내재화 속도(도 2h, 2j)를 보여주는 플롯을 제공한다. 데이터는 평균 ± SEM을 나타낸다. 독립적인 샘플 t-검정(도 2b, 2d, 2e)를 통한 *p < 0.05(미처리 세포 대비). 동역학 및 속도 분석은 p < 0.05로 설정된 혼합 모델 ANOVA, 알파를 통해 수행되었다(도 2g-2j). 스케일 바 = 전체 세포의 경우 10 μm 및 확대된 이미지의 경우 5 μm.
도 3a는 미처리된 세포 및 hASM 처리된 세포에서 기저선에서 그리고 세포내이입(endocytosis) 3분 후 WGA로 라벨링된 마우스 근모세포의 공초점 이미지를 제공한다. 스케일 바 = 10 μm. 도 3b는 상이한 용량의 hASM이 마우스 근모세포에서 벌크 막 세포내이입에 미치는 영향을 보여주는 플롯을 제공한다. 도 3c는 기저선(좌측 패널)에서 그리고 세포내이입 3분 후(우측 패널) 형광 WGA 라벨링된 건강한 근모세포와 환자 근모세포를 보여주는 공초점 이미지를 제공한다. 스케일 바 = 10 μm. 도 3d는 건강한 근육 세포와 LGMD2B 환자 근육 세포에 의한 벌크 세포내이입의 정량화 및 hASM이 환자 및 건강한 세포 세포내이입에 미치는 영향을 보여주는 플롯을 제공한다(조건당 n > 2개의 실험 반복). 모든 데이터는 평균 ± SEM으로 제시된다. 도 3b, 3d: 1원 ANOVA 및 Tukey HSD 사후 검정을 통해 평가된, *p < 0.05 (미처리 세포 대비).
도 4a는 간 특이적 프로모터 하에서 대조군-AAV 또는 hASM-AAV로 형질도입된 HepG2 세포의 용해물에서의 hASM에 대한 웨스턴 블롯의 이미지를 제공한다(n = 3개의 독립적인 복제물). 도 4b는 간 특이적 프로모터 하에서 대조군-AAV 또는 hASM-AAV로 형질도입된 HepG2 세포의 용해물에서의 hASM 활성의 정량화 그래프를 제공한다(n = 3개의 독립적인 복제물). 도 4c는 대조군-AAV 및 hASM-AAV 감염된 HepG2 세포의 배양 상층액에서의 hASM 활성의 정량화 그래프를 제공한다(n = 3개의 독립적인 복제물). 도 4d는 FM 염료 라벨링를 보여주는 초점 레이저 손상(화살표로 표시된 부위) 전후의 건강한 근모세포 및 LGMD2B 환자 근모세포의 공초점 이미지를 제공한다. LGMD2B 환자 근모세포는 CIM에서 대조군 및 hASM-AAV 감염된 HepG2 세포로부터의 배양 상층액으로 처리되었다. 스케일 바 = 10 μm. 도 4e는 건강한 근모세포 및 환자 근모세포(조건당 n > 15개 세포)에서 FM 염료 진입의 평균 동역학을 보여주는 플롯을 제공한다. 데이터는 평균 ± SEM으로 제시된다. 독립 샘플 t-검정에 의한 *p < 0.001(대조군 AAV 처리 세포 대비). 도 4e의 경우, 처리 조건과 시간 간의 상호작용 효과에 대한 분석을 갖는 혼합 모델 ANOVA가 사용되었다(대조군 AAV 처리 세포 상층액 대비 *p < 0.001).
도 5a는 hASM-AAV 및 대조군-AAV 주사 마우스로부터 분리된 간에서의 hASM 활성을 보여주는 플롯을 제공한다(조건당 n = 5마리의 마우스). 도 5b는 주사 후 12주에 hASM-AAV 및 대조군-AAV의 혈청에서 hASM 활성(U/L로 표시됨)을 나타내는 플롯을 제공한다. 도 5c는 주사 후 12주에 대조군- 및 hASM-AAV 처리된 마우스에서 간 손상의 정도를 평가하기 위한 혈청 알라닌 트랜스아미나제(ALT) 농도를 보여주는 플롯을 제공한다. 도 5d는 IgM(화살촉)으로 라벨링된 근섬유의 정량화를 보여주는 그래프를 제공한다. 도 5e는 IgM으로 라벨링된 근섬유의 이미지(상부 행, 스케일 바=1000 μm); 흰색 화살표에 의해 표시된 부위에서 초점 레이저 손상 후, 새로 분리된 이두근 내의 근섬유에 의한 FM-염료 흡수의 이미지(마우스당 n=20 근섬유)(중앙 2개의 행; 스케일 바=50 μm); 및 반복적인 10% 편심 수축과 근형질막 손상에 의해 손상되고 프로시온 오렌지 염료(화살촉)으로 라벨링된 대조군-AAV 및 hASM-AAV 처리된 마우스로부터 분리된 EDL 근육의 이미지(하부 행, 스케일 바=100 μm)를 제공한다. 도 5f는 흰색 화살표로 표시된 부위에서 초점 레이저 손상 후, 새로 분리된 이두근 내의 근섬유에 의한 FM-염료 흡수의 동역학 그래프를 제공한다(마우스당 n=20개의 근섬유). 도 5g는 레이저 손상으로부터 성공적으로 복구된 근섬유를 보여주는 플롯을 제공한다(n>15). 도 5h는 근육당 프로시온 오렌지 라벨링된 섬유의 수의 정량화를 나타내는 그래프를 제공한다(각 그룹 내의 한 마리의 마우스에서 EDL 근육의 제조 동안 과도한 손상으로 인한 그룹당 n=4개의 근육). 도 5i는 10번의 반복적인 편심 수축에 따른 근육 수축력의 변화를 보여주는 그래프를 제공한다(n=그룹당 5마리). 데이터는 평균 ± SEM으로 제시된다. 대조군-AAV 대비 *p<0.05, 독립 샘플 t-검정 또는 처리 조건 및 시간 간의 상호작용 효과에 대한 분석을 갖는 혼합 모델 ANOVA. 도 5j는 5 μg의 근육 단백질(사두근)에서의 재조합 인간 ASM 활성을 보여주는 그래프를 제공한다(각 샘플은 삼반복으로 분석됨 - 대조군-AAV, hASM-AAV, n = AAV 그룹당 5마리 마우스, 야생형당 3마리). 데이터는 평균 hASM 활성 ± SEM으로 제시된다. 독립 샘플 t-검정에 의한 *p = 0.011 (대조군-AAV 대비).
도 6a: 1행은 대조군-AAV 또는 hASM-AAV의 단일 IV 주사로 처리 후 12주에, LGMD2B 모델의 사두근 단면의 H&E 염색 이미지를 제공하고(화살촉은 염증 병소를 표시함)(스케일 바 = 100 μm); 2행은 기저막과 근핵을 각각 시각화하기 위해 라미닌과 DAPI를 사용하여 라벨링된 근육 단면을 보여주는 이미지를 제공하며(스케일 바 = 100 μm); 3행은 근육 단면에서의 마손 삼색 염색(Masson Trichrome staining)의 이미지를 제공하고(그룹당 n = 5)(스케일 바 = 100 μm); 4행은 사두근 단면 내의 페릴리핀(perilipin) 라벨링된 면적의 이미지를 제공한다(스케일 바 = 100 μm). 도 6b는 염증 병소의 정량화를 보여주는 플롯을 제공한다(그룹당 n = 5마리의 마우스로부터의 전체 사두근 단면으로부터 무작위로 선택된 10개의 영역). 도 6c는 전체 사두근 단면에 걸쳐 중심 핵의 존재에 의해 표시되고 총 섬유의 %로 표시된 재생된 근섬유의 정량화를 보여주는 그래프를 제공한다. 도 6d는 근섬유 단면적의 분포를 보여주는 그래프를 제공한다(그룹당 n=3000개의 섬유). 도 6e는 근육 단면에서 마손 삼색 염색의 정량화를 보여주는 그래프를 제공한다(그룹당 n = 5). 도 6f는 사두근 단면에서 페릴리핀 라벨링된 면적의 정량화 그래프를 제공한다. 도 6g 및 6h는 표시된 대로 처리된 마우스의 앞다리 및 뒷다리 그립 강도의 정량화 그래프를 제공하며 수축력은 체중에 대해 정규화된다(그룹당 n = 5마리 마우스, 마우스당 평균 5회 반복 측정, 앞다리: p > 0.05). 데이터는 평균 ± SEM으로 제시된다. 뒷다리: 대조군-AAV 대비 *p<0.05.
도 7a는 단일 AAV 주사 전 및 주사 후 12주에 AAV 처리 마우스의 체중의 쌍별 변화를 나타내는 플롯을 제공한다. 도 7b는 기저선(0주) 및 주사 후 1, 4 및 12주에 hASM-AAV 및 대조군-AAV 주사 마우스의 혈청에서의 hASM 활성을 나타내는 플롯을 제공한다(U/L로 표시됨). 2마리의 22주령 야생형 BL6 마우스를 정상 수준(평균 = 점선, 회색 음영 = 최소/최대)과 비교하여 혈청 ASM 활성에 대해 평가하였다. *p = 0.011(대조군-AAV 대비). 도 7c는 hASM 세포 독성과 농도 관계를 보여주는 플롯을 제공한다. 인간 근모세포를 적정 농도의 hASM 단백질(대조군/PBS, 8, 80, 800 U/L)이 보충된 성장 배지에서 24시간 동안 배양하였다(6 U/L은 최소 치료적 용량이며 점선으로 표시됨). 세포를 수집하고 트립판 블루 분석을 통해 세포 생존력/사멸에 대해 평가하였다. 데이터는 총 세포 수 중 죽은 세포의 평균 비율(%)로 표시된다. 독립적인 1원 ANOVA에 의한 *p <.001(800 U/L hASM 대비). 도 7d는 조직병리학적 등급을 제공한 적합한/고급의 조직학 이미지와 함께 각 처리 그룹의 마우스에 대한 조직학 스코어의 플롯을 제공한다(척도: 1-10, 높은 스코어는 점수는 더 나쁜 병리를 나타냄; 3 = 국소 변성/괴사, 4 = 국소/광범위한 염증/퇴행/괴사, 5 = 대규모 괴사/간세포 손실; 3의 PBS 주사 BLA/J 마우스 스코어: 국소 변성 및 괴사). 도 7e는 간 표적화된 AAV가 간 건강 및/또는 간 손상(정상 범위 5개월령 BL6 마우스: ~22-40 U/L)에 미치는 영향을 평가하기 위해 12주 연구 기간 동안의 혈청 ALT 수준을 보여주는 플롯을 제공한다(Otto, et al. (2016) J. Am. Assoc. Lab. Anim Sci., 55(4):375-86). 데이터는 평균 ± SEM으로 제시된다.

본원에서, 아데노 관련 바이러스(AAV) 바이러스 벡터가 재조합 인간 산성 스핑고미엘리나제 유전자(rhASM)를 생쥐의 간에 특이적으로 전달하는 데 사용되었다. 이러한 rhASM-AAV는 간세포 게놈 내로 삽입되고 간이 rhASM 단백질의 생산을 상향조절하도록 유도할 수 있다. 골격근에서의 다이스페린 단백질의 부족을 특징으로 하는 사지연결 근이영양증 2B(LGMD2B)와 같은 근이영양증은 손상된 근섬유의 복구 불량을 겪는다. 근섬유는 특히 근섬유막에서 일상 활동 및 근육 수축 동안 자주 손상된다. 이러한 막 손상은 일반적으로 부분적으로 회복 효소 ASM의 다이스페린 매개 방출로 인해 몇 분 내에 효율적으로 복구된다. 손상된 근육 세포에 의해 방출된 ASM은 효소가 손상된 세포막에 작용하여 그 곳에서 지질 스핑고미엘린을 가수분해하고 막을 안정화시켜 손상 복구를 촉진하도록 돕는다(Defour et al. (2014) Cell Death Disease 5:e1306). 그러나, ASM의 부족 또는 그의 효소 작용의 억제는 근섬유가 효과적으로 복구되는 것을 방지하고 근섬유 사멸 및 근육 퇴화에 기여한다. 이러한 결핍은 LGMD2B 및 다른 근육 질환에서 관찰되는 불량한 근육 건강의 근본적인 메커니즘이다.

다이스페린 결핍을 치료하기 위한 한 가지 유전자 요법은 다이스페린을 코딩하는 AAV를 근육에 직접 반복적으로 전달하는 것을 포함한다. 이 방법은 AAV 벡터에 대항하는 면역 반응과 염증 반응에 의해 방해를 받는다. 또한, 다이스페린 유전자의 큰 크기는 단일 AAV 벡터 내로의 그의 패키징을 방해하거나 방지하여 치료 효능을 감소시킨다.

대조적으로, 본 발명은 다이스페린 유전자를 근육 내로 반복적으로 전달할 필요성을 회피한다. 실제로, 다이스페린 결핍의 다운스트림 결과, 즉 다이스페린 결핍 근섬유의 불량한 복구를 초래하는 감소된 ASM 분비를 해결하고 rhASM-AAV를 간에 표적화함으로써, 본 발명은 다이스페린성 근섬유의 복구 능력 및/또는 다이스페린의 회복의 예상치 못하게 우수하고 장기적인 개선을 제공한다. 따라서, 본 발명은 다이스페린 결핍 근이영양증, 특히 LGMD2B 등과 같은 다이스페린병증에서 불량한 근섬유 복구 능력을 치료하기 위한 안정적인 치료적 접근법에 해당한다. 본 방법은 벡터의 반복 투여 요건과 AAV 벡터를 근육 내로 효율적으로 전달하는 것과 관련된 어려움을 피한다.

따라서, 본 발명은 ASM, 특히 rhASM의 외인성 제공에 의해 다이스페린 결핍을 치료하는 접근법을 제공한다. 본 발명의 AAV 기반 유전자 요법은 ASM(예컨대, rhASM) 효소의 순환 내로의 생산 및 분비를 가능하게 하여 다이스페린 결핍을 갖는 골격근에서 ASM(예컨대, rhASM) 효소의 수준을 증가시키고, 이는 다시 병든 근육의 효율적인 복구를 돕는다. AAV2/8 기반 벡터를 사용하여, rhASM 유전자가 꼬리 정맥 주사를 통해 다이스페린 결핍(LGMD2B)에 대한 마우스 모델(BL6/AJ) 내로 전달되었고, 병든 마우스 근육에서 결핍을 감소시키기 위한 이 접근법의 효능을 조사하였다. 유의하게도, 근육 건강의 여러 측면(수축 강도, 조직 병리학, 및 복구 능력)의 개선이 다른 방법에서 보고된 것보다 더 나은 수준까지 달성되었다.

본 발명에 따르면, 이를 필요로 하는 대상체에서 근이영양증을 치료, 억제, 및/또는 예방하는 방법이 제공된다. 특정 구현예에서, 근이영양증은 다이스페린 결핍을 특징으로 한다. 특정 구현예에서, 근이영양증은 다이스페린병증이다. 다이스페린병증의 예는, 비제한적으로 사지연결 근이영양증 2B(LGMD2B) 및 미요시 근병증(MM) 또는 미요시 근이영양증 1을 포함한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 특히 이를 필요로 하는 대상체에서, 근섬유, 특히 골격 근섬유 복구를 개선하거나 증가시키는 방법이 제공된다. 특정 구현예에서, 근섬유는 다이스페린 결핍을 특징으로 한다. 특정 구현예에서, 대상체는 근이영양증을 갖는다. 특정 구현예에서, 대상체는 다이스페린병증을 갖는다. 특정 구현예에서, 대상체는 니만픽병(예컨대, A형 또는 B형)을 갖는다.

본 발명의 방법은 산성 스핑고미엘리나아제(ASM)를 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 방법은 산성 스핑고미엘리나아제(ASM)를 코딩하는 핵산 분자를 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, ASM은 인간 (hASM)이다. 특정 구현예에서, ASM은 올리푸다제 알파(Olipudase alpha)(Sanofi Pharmaceuticals, Bridgewater, NJ)와 같은 재조합 인간 ASM(rhASM)이다. GenBank 유전자 ID: 6609 및 GenBank 등록 번호 NM_000543 및 NP_000534는 아미노산 및 뉴클레오타이드 서열의 예를 제공한다. ASM은 ASM의 임의의 변이체 또는 이소형(예컨대, 이소형 1, 2, 3, 4 또는 5)일 수 있다. 특정 구현예에서, ASM은 이소형 1 또는 변이체 1이다. 특정 구현예에서, ASM은 신호 펩타이드를 포함한다.

신호 펩타이드를 갖는 전구체 인간 ASM 서열의 예는 다음이다:

성숙한 인간 ASM 서열의 예는 다음이다:

인간 ASM 서열을 인코딩하는 핵산 서열의 예는 다음이다:

특정 구현예에서, 인간 ASM 서열을 코딩하는 핵산 서열은 시작 코돈부터 종료 코돈까지의 서열번호: 3의 일부(위에 밑줄로 표시됨)를 포함한다.

본 발명의 ASM은 서열번호: 1 또는 2와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다.

특정 구현예에서, 산성 스핑고미엘리나제를 코딩하는 핵산 분자는 간 특이적 또는 간세포 특이적 프로토머의 제어 하에 있다(Jacobs et al. (2008) Gene Ther., 15(8):594-603; Kramer et al. (2003) Mol. Ther., 7(3):375-385). 간 특이적 또는 간세포 특이적 프로토머는 다른 세포 유형 또는 조직보다 간 세포 또는 간세포에서 연결된 핵산을 우선적으로 발현한다. 간 특이적 또는 간세포 특이적 프로토머는 간 세포 또는 간세포에서 연결된 핵산을 배타적으로 발현할 필요는 없지만 발현할 수 있다. 간 특이적 또는 간세포 특이적 프로토머의 예는 비제한적으로 인간 α-1 항트립신(HaAT) 프로모터, 하이브리드 간 프로모터(HLP; McIntosh, et al. (2013) Blood 121(17):3335-44), 인간 티록신 결합 글로불린(TBG), 인간 혈청 알부민 프로모터(선택적으로 인간 프로트롬빈 인핸서의 하나 이상의 사본에 연결됨), DC190 프로모터(Ziegler, et al. (2004) Mol. Ther., 9:231-240)를 포함한다. 특정 구현예에서, 간 특이적 또는 간세포 특이적 프로토머는 인간 혈청 알부민 프로모터 또는 DC190 프로모터이다.

특정 구현예에서, 산성 스핑고미엘리나제를 코딩하는 핵산 분자는 간에 전달된다(예컨대, 수동적으로(예컨대, 정맥내로) 또는 직접(예컨대, 주사)). 특정 구현예에서, 산성 스핑고미엘리나제를 코딩하는 핵산 분자는 대상체의 근육에 직접(예컨대, 주사에 의해) 전달되지 않는다.

특정 구현예에서, 산성 스핑고미엘리나제를 코딩하는 핵산 분자는 플라스미드 또는 벡터(예컨대, 발현 벡터), 특히 바이러스 벡터 내에 함유된다. 본 발명의 핵산 분자는 선택적으로 비바이러스 벡터(예컨대, 리포좀, 마이셀, 네이키드 cDNA, 트랜스포존 등)에 함유되거나 이에 의해 캡슐화될 수 있다. 본 발명에서 사용될 수 있는 바이러스 벡터는, 비제한적으로 아데노바이러스 벡터, 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터(예컨대, AAV-1 내지 AAV-13, 특히 AAV-2, AAV-5, AAV-7 및 AAV-8, 또는 하이브리드 AAV 벡터), 렌티바이러스 벡터 및 유사형 렌티바이러스 벡터, 헤르페스 심플렉스 바이러스 벡터, 백시니아 바이러스 벡터, 및 레트로바이러스 벡터를 포함한다. 특정 구현예에서, 산성 스핑고미엘리나제를 코딩하는 핵산 분자는 AAV 벡터 내에 함유된다. 특정 구현예에서, AAV 벡터는 AAV2/8 벡터 또는 AAV8 벡터이다. 특정 구현예에서, 벡터 또는 바이러스 벡터는 간 또는 간세포에 표적화된다(예컨대, 표적화 리간드 또는 간 또는 간세포 특이적 수용체 리간드를 이용하여). 특정 구현예에서, 산성 스핑고미엘리나제를 코딩하는 핵산 분자는 상기 설명된 바와 같이 간 특이적 또는 간세포 특이적 프로토머의 제어 하에 있다.

본 발명의 산성 스핑고미엘리나아제를 코딩하는 핵산 분자 또는 이를 포함하는 벡터(또는 약제학적으로 허용가능한 담체와 함께 이를 포함하는 조성물)는 근이영양증을 치료, 억제, 또는 예방하기 위해 동물, 특히 포유동물, 특히 인간에게 투여될 수 있다. 본 발명의 방법 및 조성물은 또한 근이영양증을 치료, 억제 또는 예방하기 위한 적어도 하나의 다른 치료제(예컨대, 단백질 ASM)를 포함할 수 있다. 추가 치료제는 또한 본 발명의 화합물과는 별도의 조성물로 투여될 수 있다. 조성물은 동시에 및/또는 상이한 시간에(예컨대, 순차적으로) 투여될 수 있다.

본원에 기재된 본 발명의 화합물은 일반적으로 약제학적 제제로서 환자 또는 대상체에게 투여될 것이다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "환자"는 인간 또는 동물 대상체를 지칭한다. 본 발명의 화합물은 의사 또는 다른 의료 전문가의 지도 하에 치료적으로 사용될 수 있다.

본 발명의 산성 스핑고미엘리나제를 코딩하는 핵산 분자 또는 이를 포함하는 벡터를 포함하는 약제학적 제제는 물, 완충 식염수, 에탄올, 폴리올(예컨대, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액상 폴리에틸렌 글리콜 등), 디메틸 설폭사이드(DMSO), 오일, 세제, 현탁제, 또는 이의 적합한 혼합물과 같은 허용가능한 매질과 함께 투여하기 위해 편리하게 제제화될 수 있다. 용해도 한계는 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, "약제학적으로 허용가능한 매질" 또는 "담체"는 이전 논의에서 예시된 바와 같이 약제학적 제제의 원하는 투여 경로에 적절할 수 있는 임의의 모든 용매, 분산 매질 등을 포함한다. 약제학적 활성 물질에 대한 이러한 매질의 용도는 당업계에 알려져 있다. 임의의 기존의 매질 또는 제제가 투여되는 화합물과 호환되지 않는 경우를 제외하고, 약제학적 제제에서의 그의 사용이 고려된다.

특정 환자에게 투여하기에 적합한 본 발명에 따른 화합물의 용량 및 투여 요법은 환자의 연령, 성별, 체중, 일반적인 의학적 상태, 및 화합물이 투여되는 특정 상태 및 이의 중증도를 고려하여 의사에 의해 결정될 수 있다. 의료 제공자는 또한 화합물의 투여 경로, 화합물이 함유된 약제학적 담체, 및 화합물의 생물학적 활성을 고려할 수 있다.

적합한 약제학적 제제의 선택은 또한 선택된 투여 방식(예컨대, 혈류 내, 정맥내 또는 직접 주사)에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, 본 발명의 산성 스핑고미엘리나아제를 코딩하는 핵산 분자 또는 이를 포함하는 벡터는 주사에 의해, 예컨대 간 내로 직접 또는 간 근처에 투여될 수 있다. 이러한 경우, 약제학적 제제는 주사 부위와 호환되는 매질에 분산된 본 발명의 화합물을 포함한다.

본 발명의 산성 스핑고미엘리나아제를 코딩하는 핵산 분자 또는 이를 포함하는 벡터는 비강내, 근육내, 피하, 국소, 경구, 또는 주사와 같은 임의의 방법에 의해 투여될 수 있다. 주사를 위한 약제학적 제제는 당업계에 알려져 있다. 화합물을 투여하는 방법으로서 주사가 선택되는 경우, 충분한 양의 화합물이 이들의 표적 세포에 도달하여 생물학적 효과를 발휘하도록 조치가 취해져야 한다.

약제학적 담체와 친밀하게 혼합된 활성 성분으로서 본 발명의 화합물을 함유하는 약제학적 조성물은 종래의 약제학적 배합 기술에 따라 제조될 수 있다. 담체는 투여를 위해 원하는 제제의 형태, 예컨대 주사에 따라 다양한 형태를 취할 수 있다. 주사가능한 현탁액은, 예를 들어 적절한 액체 담체, 현탁제 등을 사용하여 제조될 수 있다.

정의

본 발명의 이해를 용이하게 하기 위해 하기 정의가 제공된다:

단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 문맥이 명백하게 달리 지시하지 않는 한 복수의 참조를 포함한다.

"약제학적으로 허용가능한"은 연방 또는 주 정부의 규제 기관의 승인을 받았거나 또는 미국 약전 또는 동물, 특히 인간에서 사용하기 위한 다른 일반적으로 인정되는 약전에 열거되어 있음을 나타낸다.

"담체"는 예를 들어 희석제, 보조제, 보존제(예컨대, 티메르솔, 벤질 알코올), 항산화제(예컨대, 아스코르브산, 나트륨 메타바이설페이트), 가용화제(예컨대, 폴리소르베이트 80), 유화제, 완충제(예컨대, Tris HCl, 아세테이트, 포스페이트), 항균제, 벌킹 물질(예컨대, 락토스, 만니톨), 부형제, 보조제, 또는 본 발명의 활성제와 함께 투여되는 비히클을 지칭한다. 약제학적으로 허용가능한 담체는 석유, 동물, 식물 또는 합성 기원의 담체를 포함하는, 물 및 오일과 같은 멸균 액체일 수 있다. 물 또는 수성 식염수 용액 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액이 특히 주사가능한 용액을 위한 담체로서 사용될 수 있다. 적합한 약제학적 담체는 문헌["Remington's Pharmaceutical Sciences" by E.W. Martin (Mack Publishing Co., Easton, PA); Gennaro, A. R., Remington: The Science and Practice of Pharmacy, (Lippincott, Williams and Wilkins); Liberman, et al., Eds., Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Decker, New York, N.Y.; and Kibbe, et al., Eds., Handbook of Pharmaceutical Excipients, American Pharmaceutical Association, Washington]에 기재되어 있다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "치료하다"는 환자의 병태(예컨대, 하나 이상의 증상)의 개선, 병태의 진행의 지연 등을 포함하는, 질환에 걸린 환자에게 혜택을 제공하는 임의의 유형의 치료를 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "예방하다"는 대상체가 병태를 발병할 확률의 감소를 초래하는 병태를 발병할 위험이 있는 대상체의 예방적 치료를 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "대상체"는 동물, 특히 포유류, 특히 인간을 지칭한다.

화합물 또는 약제학적 조성물의 "치료적 유효량"은 특정 장애 또는 질환의 증상을 예방, 억제, 치료 또는 경감시키는 데 효과적인 양을 지칭한다. 본원에서 질환 또는 장애의 치료는 질환 또는 장애, 그의 증상(들), 또는 이에 대한 소인을 치유, 완화, 및/또는 예방하는 것을 지칭할 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "치료제"는 병태, 질환 또는 장애를 치료하거나 병태, 질환 또는 장애의 증상을 감소시키는 데 사용될 수 있는, 비제한적으로 핵산, 펩타이드, 단백질 및 항체를 포함하는 화학적 화합물 또는 생물학적 분자를 지칭한다.

"벡터"는 플라스미드, 코스미드, 백미드, 파아지 또는 바이러스와 같은 유전적 요소로서, 여기에 또 다른 유전적 서열 또는 요소(DNA 또는 RNA)가 부착되어 부착된 서열 또는 요소의 복제 및/또는 발현을 일으킬 수 있다. 벡터는 RNA 또는 DNA일 수 있으며 단일 또는 이중 가닥일 수 있다. "발현 벡터"는 숙주 세포에서의 발현에 요구되는 필요한 조절 영역(예컨대, 프로모터)을 갖는 유전자 또는 핵산 서열을 함유하는 특수 벡터이다.

용어 "연결된" 또는 "작동가능하게 연결된"은 코딩 서열의 발현에 필요한 조절 서열이 코딩 서열의 발현을 달성하기 위해 코딩 서열에 대한 적절한 위치에서 핵산 분자 내에 위치된다는 것을 의미한다. 이러한 동일한 정의는 때때로 발현 벡터 또는 재조합 벡터에서의 코딩 서열 및 전사 제어 요소(예컨대, 프로모터, 인핸서 및 종결 요소)의 배열에 적용된다.

하기 실시예는 본 발명을 실행하는 예시적인 방법을 설명하며, 본 발명의 범위를 어떤 식으로든 제한하고자 하는 것은 아니다.

실시예

골격근 세포 또는 근섬유는 신체 움직임을 가능하게 하며 격렬한 활동, 과부하 및 편심 수축(eccentric contraction)에 의해 자주 손상된다(McNeil, et al. (2003) Annu. Rev. Cell Dev. Biol., 19:697-731; Horn, et al. (2018) Cellular Molecular Life Sci., 75(20):3751-70). 근섬유 취약성을 증가시키거나 복구를 방해하는 돌연변이는 근육 퇴화와 근이영양증을 초래한다(Wallace, et al. (2009) Annu. Rev. Physiol., 71:37-57). 미요시 근병증(MM) 및 사지연결 근이영양증 2B(LGMD2B)는 성인 초기에 나타나며 진행성 골격근 약화 및 소모로 이어지는 이러한 두 가지 상염색체 열성 근이영양증이다(Aoki, M., In: Adam et al., eds., GeneReviews, Seattle, WA, 1993). 이러한 질환(통칭하여 다이페린병증이라고 함)은 큰(237 kDa) 근육막 단백질인 다이스페린을 코딩하는 DYSF 유전자의 돌연변이에 의해 유발된다(Liu, et al. (1998) Nat. Genet., 20(1):31-6; Bashir, et al. (1998) Nat. Genet., 20(1):37-42). 명백한 근육 퇴화 이전에도, 다이스페린병증 환자 근섬유는 막 파열, 돌출, 소포 및 액포의 근형질막하 축적, 및 기저판의 두꺼워짐을 포함하는 원형질막(근형질막) 결함을 나타낸다(Selcen, et al. (2001) Neurology 56(11):1472-81). 근형질막 손상의 불량한 복구는 이러한 초기 이상에 기여한다(Selcen, et al. (2001) Neurology 56(11):1472-81; Cenacchi, et al. (2005) J. Clin. Pathol., 58(2):190-5). 근섬유 근형질막의 손상은 세포외 칼슘의 손상 촉발된 유입(influx)에 의해 활성화되는 복잡한 다단계 과정에 의해 복구되며, 이는 다이스페린 결핍에 의해 손상된다(Bansal, et al. (2003) Nature 423(6936):168-72; Defour, et al. (2014) Cell Death Dis., 5:e1306). 실패하거나 결핍된 근섬유 복구는 만성 염증 반응을 활성화시키고 다이스페린병증 골격근의 두드러진 특징인 근육 퇴화를 유발한다(Nagaraju, et al. (2008) Am. J. Pathol., 172(3):774-85; Gallardo, et al. (2001) Neurology 57(11):2136-8; Hogarth, et al. (2019) Nature Comm., 10(1):2430).

원형질막 손상의 복구는 칼슘 촉발 신호전달 및 소포 융합 및 분열을 포함하며, 이는 시냅토타그민(synaptotagmin)을 포함한 칼슘 결합 단백질에 의해 촉진된다(Bansal, et al. (2003) Nature 423(6936):168-72; Sonder, et al. (2019) Sci. Rep., 9(1):6726; Horn, et al. (2019) Curr. Top. Membr., 84:67-98; Horn, et al. (2017) Sci. Signal., 10(495):eaaj1978; Sreetama, et al. (2016) Cell Death Differ., 23(4):596-607; Scheffer, et al. (2014) Nat. Commun., 5:5646; Jaiswal, et al. (2014) Nat. Commun., 5:3795; Bittel, et al. (2019) Front. Phys.,10:828; Jaiswal, et al. (2002) J. Cell Biol., 159(4):625-35; Jaiswal, et al. (2004) PLoS Biol., 2(8):e233). 시냅토타그민과 유사하게, 다이스페린은 C2 도메인 단백질 계열의 구성원이며, 이는 칼슘 의존적 방식으로 음전하를 띤 막 인지질에 결합하는 단백질을 포함한다(Rizo, et al. (1998) J. Biol. Chem., 273(26):15879-82; Lek, et al. (2012) Traffic 13(2):185-94). 다이스페린은 리소좀을 원형질막에 묶어, 리소좀이 세포막 손상 직후 세포외유출하는 것을 용이하게 함으로써 근형질막 복구를 매개한다(Defour, et al. (2014) Cell Death Dis., 5:e1306). 빠른 리소좀 세포외유출은 근형질막 손상 후 몇 초 이내에 리소좀 효소 ASM을 분비시키며, 이는 복구에 필요한 과정이다(Tam, et al. (2010) J. Cell Biol., 189(6):1027-38; Michailowsky, et al. (2019) Skelet. Muscle 9(1):1). 다이스페린 부족은 손상 촉발된 리소좀 세포외유출을 지연 및 감소시켜, 세포 손상시 ASM 분비를 늦추고 감소시킨다(Defour, et al. (2014) Cell Death Dis., 5:e1306). 결과적으로, 손상된 LGMD2B 세포에서의 감소된 ASM 분비 또는 니만픽병 A형(NPDA) 세포에서의 ASM 생산의 부족은 근섬유 근형질막 복구를 손상시킨다(Defour, et al. (2014) Cell Death Dis., 5:e1306; Michailowsky, et al. (2019) Skelet. Muscle 9(1):1). 이러한 결핍은 LGMD2B 및 NPDA 환자 모두에 대해 근섬유 복구를 개선하기 위한 잠재적인 치료로서 세포외 ASM 보충을 확인시켜 준다.

세포외 매질 내로 분비시, ASM은 원형질막 내의 스핑고미엘린 지질을 세라마이드로 가수분해하며, 이는 세포외 소포(ECV) 탈락을 통해 그리고 세포내이입에 의해 원형질막의 손상된 부분을 제거하는 것으로 제안된다(Tam, et al. (2010) J. Cell Biol., 189(6):1027-38; Bianco, et al. (2009) EMBO J., 28(8):1043-54). 세공 형성 독소에 의해 손상된 원형질막은 ECV 탈락 및 카베올라 세포내이입 모두를 겪는 것으로 밝혀졌고(Keyel, et al. (2011) J. Cell Sci., 124(Pt 14):2414-23; Corrotte, et al. (2013) Elife 2:e00926), 이들 독소는 또한 클라트린 독립적 캐리어(CLIC)에 의해 형성된 엔도솜의 마커인 글리코실포스포티딜이노시톨(GPI)과 함께 공동위치한다(Idone, et al. (2008) J. Cell. Biol., 180(5):905-14; Mayor, et al. (2014) Cold Spring Harb. Perspect. Biol., 6(6): a016758). 그러나, ASM이 원형질막에 대한 생리적(국소적 또는 기계적) 손상을 복구하는 데 어떻게 도움을 주는지에 관한 세부사항은 아직 밝혀지지 않았다. 생리적 막 손상의 복구에서 ASM의 역할을 이해하는 것은 근육, 폐 및 세포막 손상과 관련된 다른 질병에 대한 치료를 알아내는 데 중요하다.

골격근 다이스페린 유전자의 재발현을 목표로 하는 LGMD2B에 대한 전임상 유전자 요법 접근법은 엇갈리긴 하지만 전반적으로 긍정적인 치료 전망을 초래하였다(Potter, et al. (2018) Hum. Gene Ther., 29(7):749-62; Pryadkina, et al. (2015) Mol. Ther. Methods Clin. Dev., 2:15009; Lostal, et al. (2012) PLoS One, 7(5):e38036). 그러나, 이들 요법의 임상으로의 진행은 다이스페린과 같은 큰 유전자의 효율적인 패키징 및 근육 전달과 관련된 장벽을 극복할 것을 요구한다(Bulaklak, et al. (2017) Curr. Opin. Pharmacol., 34:56-63). 약물 기반 요법이 대안을 제시하지만, 현재 불량한 복구, 또는 다이스페린병증의 다른 질환 원인을 해결하기 위해 승인된 약물은 없다. 그러나, 전임상 연구는 근형질막을 안정화시키는 약물이 근섬유 복구를 향상시키고 다이스페린병증 근육 기능을 개선할 수 있음을 나타낸다(Sreetama, et al. (2018) Molecular Therapy, 26(9):2231-42; Gushchina, et al. (2017) Mol. Ther., 25(10):2360-71). 세포외 ASM은 다이스페린병증 근섬유 복구를 개선한다(Defour, et al. (2014) Cell Death Dis., 5:e1306). hASM의 정맥내 전달은 효능(Miranda, et al. (2000) FASEB J., 14(13):1988-95; Murray, et al. (2015) Mol. Genet. Metab., 114(2):217-25; Samaranch, et al. (2019) Sci. Transl. Med., 11(506):eaat3738; Dodge, et al. (2005) Proc. Natl. Acad. Sci., 102(49):17822-7), 및 NPDA를 치료하기 위한 hASM의 임상적 안전성을 보여주었다(Wasserstein, et al. (2019) Mol. Genet. Metab., 126(2):98-105; Wasserstein, et al. (2018) J. Inherit. Metab. Dis., 41(5):829-38). 그러나, LGMD2B를 치료하거나, 또는 NPDA에서 골격근 결핍을 개선하기 위한 이러한 접근법의 유용성은 시험되지 않았다. 본원에서, 환자 근육 세포 및 마우스 모델을 사용하여 LGMD2B에서 근형질막 복구를 개선하기 위한 hASM 단백질 및 비근육 표적화 AAV 기반 유전자 요법 접근법의 전임상 효능을 조사한다. 또한, LGMD2B 마우스 모델을 사용하여 근섬유 복구, 근육 조직 병리학, 및 근육 기능의 만성 개선을 위한 hASM-AAV 유전자 요법의 용도를 조사하였다.

물질 및 방법

동물

B6.A-Dysf^prmd/GeneJ(B6A/J) 마우스를 잭슨 연구소(Bar Harbor, ME)에서 구입하고 아동 연구소(CRI)의 동물 사육장에서 유지시켰다. 마우스 사용과 관련된 모든 실험은 CRI 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인받았다. 동물을 음식과 물을 자유롭게 이용할 수 있는 제어된 12시간의 명암 주기 하에 무균 시설에서 사육하였다. 실험에 사용하기 전에 동물의 유전자형을 결정하였다.

세포 배양 및 처리

불멸화된 대조군(건강한 공여자) 및 LGMD2B 환자(임의의 검출가능한 다이스페린 단백질의 손실을 초래하는, 동형접합 c.4882G 돌연변이를 가짐) 근모세포를 설명된 바와 같이 사용하였다(Defour, et al. (2014) Cell Death Dis., 5:e1306). 근모세포를 0.4% 젤라틴 코팅된 디쉬 상에서, 10% FBS가 보충된 인간 근모세포 배양 배지 키트(Promocell)에서 배양하고, 37℃ 및 5% CO₂에서 유지시켰다. HepG2 및 C2C12 근모세포주를 10% FBS, 및 1% 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 고글루코스 DMEM에서 배양하였다. 레이저 손상을 위해, 세포를 피브로넥틴 코팅된 유리 커버슬립 상에 플레이팅하였다. 세포를 그 자체로 손상시키거나 또는 다양한 농도의 정제된 hASM(R&D Systems, Minneapolis, MN)과 함께 20분 동안 세포 이미징 배지(CIM: 10 mM HEPES, 1 mM 염화칼슘, pH 7.4를 갖는 HBSS)에서, 또는 hASM-AAV 또는 대조군(eGFP-AAV) 바이러스 입자로 형질도입된 HepG2 세포의 배양 상층액에서 사전 배양하였다. 세포를 1 μg/μl 세포 불투과성 염료 FM1-43(N-(3-트리에틸암모늄프로필)-4-(4-(디부틸아미노)스티릴) 피리디늄 디브로마이드; Life Technologies) 및 인큐베이션 기간에서와 같이 동일한 농도의 hASM 및 세포 상층액을 함유하는 CIM에서 레이저로 손상시켰다. 손상 및 후속 이미징을 스테이지 탑 ZILCS 인큐베이터(Tokai Hit Co., Fujinomiya-shi, Japan)에서 37℃에서 수행하였다. 원형질막 1 내지 5 μm² 면적을 펄스 레이저(Ablate!™, 3i Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO)로 <10 ms 동안 조사하고, 세포를 488 nm 다이오드 레이저(Cobolt, Sweden)가 장착된 IX81 올림푸스 현미경(Olympus America, Center Valley, PA) 상에서 60X/1.45NA 오일 대물렌즈로 2초 간격으로 이미지화하였다. FM 염료 강도(F/F₀, 여기서 F₀는 원래의 강도임)를 정량화하고, 복구를 설명된 바와 같이 FM 염료 형광의 증가를 야기하는 FM 유입의 차단에 의해 나타내었다(Defour, et al. (2014) J. Vis. Exp., 2014(85):e51106).

세포내이입 분석

벌크 세포내이입을 위해, 근모세포의 세포막(~70% 컨플루언트)을 37℃에서 2분 동안 AF488 접합된 밀 배아 응집소(WGA)(3 ug/mL)로 라벨링하였다. 과량의 WGA를 CIM으로 세척한 후, 세포를 처리하지 않은 상태로 두거나 hASM(CIM 중의 6 U/L)으로 처리하고, 동시에 광시야 및 공초점 모드로, IX81 올림푸스 현미경(Olympus America, Center Valley, PA) 상에서 40X/1.4NA 또는 60X/1.45NA 오일 대물렌즈를 사용하여 이미지화하였다. WGA 세포내이입을 허용하고 상이한 시점에 브로모페놀 블루(BPB)를 이미징 챔버에 주입하여(4 mM의 최종 농도) 세포 표면에서 WGA를 ??칭시켰다. 막 세포내이입의 정도를 평가하기 위해, 배경 보정 후, 각 세포의 평균 ??칭 후 형광을 그의 초기 ??칭 전 형광으로 나누고, 즉각적인 ??칭 후 평가된 내재화된 막의 분획에 대해 정규화하였다(0분 세포내이입).

카베올라 세포내이입을 위해, mRFP 태그된 카베올린-1로 형질감염된 세포를 설명된 바와 같이 이미지화하였다(Tagawa, et al. (2005) J. Cell Biol., 170(5):769-79). 세포막-커버슬립 경계면에서, 560 nm의 공초점 다이오드 레이저(Cobolt, Sweden)가 장착된 IX81 올림푸스 현미경(Olympus America, Center Valley, PA)을 사용하여 상기 설명한 바와 같이 60X/1.45NA 오일 대물렌즈로 CIM 중의 세포를 이미지화하였다. 세포를 나타낸 바와 같이 1 Hz에서 이미지화하였다. 카베올린 이동성을 정량화하기 위해, 이미징 시작시 각 세포에서 50개의 개별적인 카베올린 점/소포를 표시하였다. 이후 각 소포를 수동으로 추적하였다. 소포가 >1.5 μm 거리에 대해 측방향으로 이동하는 경우 또는 축방향으로 이동하여 >10초 동안 이미징 면에 부재하는 경우, 또는 둘 모두인 경우, 소포는 이동성인 것으로 간주되었다. 소포의 분획(각 세포당 50개 중)을 2분 동안 정량화하였다.

CLIC/GEEC 세포내이입 분석을 위해, 세포를 GFP로 태그된 글리코실포스파티딜이노시톨(GPI-GFP)로 형질감염시켰다(Nichols, et al. (2001) J. Cell Biol., 153(3):529-41). 형질감염된 세포를 20분 동안 1 프레임/분으로 세포체의 중앙을 통해 Z-면에서 상기와 같이 이미지화하였다. 필요에 따라, 두 번째 이미지 후에 hASM을 챔버에 첨가하였다. GPI-GFP 막 형광을 세포막을 표시함으로써 모니터링하고 광퇴색(photobleaching)에 대해 보정하였다. 관심 시점에 걸쳐 막 형광 동역학 트레이스를 곡선 피팅하고 이를 사용하여 특정 시점에서의 막 형광의 손실률을 계산함으로써 세포내이입 속도를 수득하였다. 이미지를 SlideBook™ 6.0(Intelligent Imaging Innovations, Inc, Denver CO)을 사용하여 정량화하였다.

막 탈락 분석

C2C12 세포(~50% 컨플루언스)를 CIM에서 37℃에서 30분 동안 FITC-PEG-콜레스테롤(5 μM; PEG-2000, Nanocs Inc., PG2-CSFC-2k)로 라벨링하였다. 과잉의 라벨을 세척한 후, 488 nm의 다이오드 레이저가 장착된 IX81 현미경 상에서 60X/1.45NA 오일 대물렌즈를 사용하여 동시 공초점 및 광시야 현미경에 의해 세포를 CIM에서 즉시 이미지화하였다. 세포를 0.2 Hz에서 2분 동안 이미지화하였다. 필요에 따라, 시간 경과 획득의 개시 ~20-30초 전에 hASM을 첨가하였다. 주변 커버슬립 영역 상에 탈락된 소포를 모니터링하기 위해 세포-커버슬립 계면에 위치한 z-면에서 이미지를 수집하였다. 세포에 인접한 커버슬립 표면 상의 5,000 μm² 면적에서 Metamorph 7.0(Molecular Devices, CA)을 사용하여 소포를 정량화하고(2분 기간 동안 탈락된 소포의 합), 획득 개시에 존재하는 소포에 대해 정규화하였다. 세포 형광의 손실을 평가하기 위해, 광시야 이미지를 광퇴색에 대해 보정한 후, SlideBook™ 6.0 소프트웨어를 사용하여 2분 기간 이내의 형광의 손실을 분석하였다.

웨스턴 블로팅 및 면역염색

HepG2 세포 용해물을 4-12% 구배 폴리아크릴아미드 겔에서 분해하고, 니트로셀룰로오스 막으로 옮기고, ASM(Abcam, Cambridge, MA) 및 β-액틴(Abcam, Cambridge, MA)에 대한 표시된 항체로 프로빙하였다. 1차 항체에 이어 적절한 HRP 접합된 2차 항체(Sigma-Aldrich) 및 화학발광 웨스턴 블롯팅 기질(GE Healthcare, Pittsburgh, PA)을 투여하고 Chemidoc™ MP 시스템(BioRad Laboratories, CA) 상에서 처리하였다.

AAV 벡터 생성 및 전달

AAV8/DC190-hASM 벡터 생산을 위해, 인간 ASM cDNA를 갖는 프리바이러스 플라스미드를 제작하였다(Barbon, et al. (2005) Mol. Ther., 12(3):431-40). 간략히, 인간 산성 스핑고미엘리나제 cDNA(NM_000543)의 발현을 간 제한 프로모터/인핸서 DC190에 의해 구동시킨다(Ziegler, et al. (2004) Mol. Ther., 9:231-240; 인간 프로트롬빈 인핸서의 2개의 사본에 연결된 인간 혈청 알부민 프로모터). 발현 카세트는 또한 하이브리드 인트론을 함유한다. 폴리아데닐화 신호 뒤에는 인간 α1-안티트립신 인트론의 단편이 이어져, 재조합 바이러스 DNA의 크기를 최적 패키징을 위한 약 4.5 Kb로 만든다. 플라스미드 DNA를 Qiagen EndoFree® 플라스미드 정제 키트(Germantown, MD)를 사용하여 정제하였다. AAV2 기반 프리바이러스 플라스미드를 AAV 혈청형 8 캡시드에 패키징하였다. 재조합 AAV 바이러스를 삼중 플라스미드 형질감염 후 매사추세츠 대학교 의과대학 벡터 코어 유전자 치료 센터(Worcester, MA)에 의한 염화세슘 밀도 구배 정제에 의해 생산하였다. AAV 벡터의 게놈 카피 역가를 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호 서열에 특이적인 프라이머를 사용한 실시간 TaqMan® PCR 분석(ABI Prism 7700; Applied Biosystems, Foster City, CA)을 사용하여 결정하였다. AAV9.CMV.PI.eGFP.WPRE. bGH(Lot # CS0273)를 대조군 AAV 벡터(펜실베니아 대학교 페렐만 의과대학 벡터 코어)로 사용하였다. 바이러스 입자를 -80℃에서 5% 글리세롤 완충액을 갖는 멸균 PBS에 현탁액으로 보관하였다. 바이러스 입자 현탁액을 해동하고, 희석하고, 마우스당 3.4x10¹¹ 입자 또는 1.1 x 10¹³ vg/kg의 바이러스 용량의 정맥 투여를 통해 전달하였다. 이 연구에 사용된 마우스는 같은 날 태어난 수컷과 암컷 마우스의 혼합으로 구성된 BLA/J 마우스의 두 마리의 개별 한배새끼로부터 유래되었다. 각각의 새끼를 귀-태그 ID로 식별하였고, 각 한배새끼로부터 무작위 추첨은 1) 두 한배새끼로부터의 마우스의 혼합이 각 처리 그룹에 할당되고, 2) 수컷과 암컷 마우스 모두가 각 처리 그룹에서 대표되는 것을 보장하도록 코드된 ID 번호를 기반으로 하였다. hASM-AAV 그룹에서, 5마리의 마우스에게 hASM-AAV를 주사하였다. 동일한 수의 마우스를 가진 대조군에게 대조군 AAV를 주사하였다. 주사 후, 실험 마우스를 홈 케이지에 3개월 동안 유지시키고, 특정 실험을 실시하였다.

ASM 측정

간과 사두근을 액체 질소 냉각된 이소펜탄에서 급속 냉동(-80℃에서 보관)하는 한편, 기저선, 주사 후 1, 4 및 12주에 후안와 출혈을 통해 수집한 혈청을 -80℃에서 보관하였다. 분석을 위해, 조직 샘플을 분쇄하고 얼음 위에서 RIPA 완충액(Sigma-Aldrich, St Louis MO) + 프로테아제 억제제 칵테일(Fisher Scientific, Waltham, MA)에서 마이크로튜브 균질화기를 사용하여 균질화하였다. 용해물을 BCA 단백질 분석 및 플레이트 리더를 사용하여 총 단백질 농도에 대해 평가하였다. 동일한 양의 총 용해물 단백질(간의 경우 4.1 μg, 사두근의 경우 25 μg), 및 혈청 부피(5 μL)를 모든 샘플에 걸쳐 사용하였다. ASM 단백질은 효소 활성에 영향을 미치는 번역 후 변형을 거치므로, 단백질의 양 대신에 hASM 활성을 Amplex™ 레드 스핑고미엘리나제 분석 키트(Invitrogen)를 사용하여 측정하였다. 모든 샘플을 3반복으로 실행하였다. 이에 따라, 활성을 간 및 근육 조직 g당 가수분해 활성의 단위(U)(간/근육의 경우, ASM 활성) 및 혈청 리터당 U로 표시하였다. 활성은 처리 조건당 5개 샘플에 대해 평균을 내었고 평균 + SEM으로 표시하였다.

혈청 알라닌 트랜스아미나제(ALT) 농도

AAV 주사 후 상기 열거된 각 시점으로부터의 혈청(5 μL)을 제조업체의 지침에 따라 비색 분석(Cayman Chemical, Ann Arbor, MI)을 사용하여 간 손상/질환의 마커인 ALT 농도에 대해 분석하였다. 모든 샘플을 3반복으로 실행하였고, ALT 농도는 시점당 처리 조건당 모든 샘플에 대해 평균을 내고, 평균 ± SEM으로 표시하였다.

hASM-AAV 매개 시험관내 hASM 생산 및 정량화

~1x10⁵ 세포/웰의 밀도로 96 웰 디쉬 내의 HepG2 세포를 Ad5의 4.5x10⁶ 입자(45 pts/세포의 감염 다중도(MOI))로 2시간 동안 무항생제 DMEM에서 감염시켰다. 세포를 1시간 동안 100 μl의 부피에서 1x10¹⁰ 게놈 사본/ml(10⁴의 MOI)에서 AAV2/8 DC190-hASM 또는 대조군 벡터로 감염시켰다. 1시간 후, 100 μl의 완전한 DMEM을 첨가하였다. 5일에, 세포 배양 배지를 수집하고, 후속 실험에 즉시 사용하거나 -80℃에 보관하였다. 세포를 얼음 냉각된 인산염 완충 식염수에서 스크래핑하여 펠렛화하고, 프로테아제 억제제 칵테일(Fisher Scientific, Waltham, MA)을 함유하는 RIPA 완충액(Sigma-Aldrich)으로 용해시켰다. 배양 상층액 및 세포 용해물을 Amplex™ 레드 스핑고미엘리나제 분석 키트(Invitrogen)를 사용한 hASM 활성 측정의 형광 분석 및 웨스턴 블롯에 사용하였다. 585 nm에서 형광 방출 검출을 갖는 EnSpire® 멀티모드 플레이트 리더(PerkinElmer)를 사용하여 20분 동안 ASM 동역학을 분석하였다. 이에 따라, hASM 활성을 상층액 L당 또는 세포 용해물 그램당 활성 단위로 표시하였다. 모든 샘플을 3반복으로 평가하고 표준 곡선을 생성하였다. hASM의 ASM 활성을 박테리아 스핑고미엘리나제 양성 대조군(10 U/L)의 공지된 활성 및 형광 방출 및 여기에 표시된 생성된 표준 곡선을 사용하여 형광 방출 값으로부터 활성 단위로 변환하였다. hASM 단백질은 mg 단백질당 .01 단위의 ASM 활성 단위 변환을 갖는다.

시험관내 hASM 세포 독성

건강한 공여자 근모세포를 0.4% 젤라틴 코팅된 51 cm 배양 디쉬에서 배양하고, 10% FBS가 보충된 인간 근모세포 배양 배지 키트(Promocell)에서 60% 컨플루언스까지 성장시키고, 37°C 및 5% CO₂에서 유지시켰다. 60% 컨플루언스에 도달시, 성장 배지에 적정 농도의 hASM 단백질(대조군/PBS, 8, 80, 800 U/L)을 24시간 동안 보충하였다. 이어서, 세포를 수집하고 트립판 블루 분석을 통해 세포 생존율/사멸을 평가하고, 세포 사멸을 전체 세포의 백분율로 표시하였다. hASM 투여량당 3개의 생물학적 복제물을 사용하여 세포 사멸 실험을 수행하였다.

조직학 및 면역조직화학

CM3050S 저온 유지 장치(Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL)를 사용하여 사두근 근육과 간의 8 μm 두께의 횡단 냉동절편을 준비하고, 이후 염색을 위해 -20℃에서 보관하였다(그룹당 n=5). 해동 후, 근육 절편을 H&E, 라미닌(1:100, 항-라미닌-2 알파-사슬, 쥐 모노클로날, Sigma-Aldrich), IgM(1:100, Invitrogen), 페릴리핀(1:250, Sigma), 마손 삼색(Trichrome Stain Kit, Abcam, Cambridge, MA)을 위해 처리한 반면, 간 절편은 H&E를 위해서만 처리하였다. 이미지를 VS120 슬라이드 스캐닝 현미경(Olympus America, MA)으로 40x 배율로 캡처하고, CellSens 소프트웨어를 사용하여 정량화하였다. 면역 염색을 위해, 근육 절편을 1시간 동안 5% BSA(라미닌-염색) 또는 1% BSA, 10% 염소 혈청 및 0.1% Tween(페릴리핀의 경우)에서 차단하였다. 알렉사 플루오르® 488 또는 594(1:500) 2차 항체를 사용하고 WGA 및 DAPI로 공동 염색하였다.

근육 염증을 정량화하기 위해, >9개 핵으로 구성된 근원섬유외 핵(extramyofibrillar nuclei)의 클러스터를 염증 병소로 표시하고 H&E 염색 절편에서 전체 사두근 단면 중 무작위로 선택한 10개의 면적으로부터 정량화하고, mm2 단면적당 표시하였다. 또한, 이들 절편을 사용하여 중심 핵 섬유를 정량화하고, 근육 절편당 계수된 총 근섬유의 백분율로 표시하였다. 중심 핵 근섬유 수는 라미닌 및 DAPI 공동염색된 절편, 및 설명된 바와 같은 CellProfiler Muscle Analyzer 파이프라인을 사용하여 독립적으로 검증하였다(Lau, et al. (2018) Skelet. Muscle 8(1):32.). 동일한 파이프라인을 사용하여 그룹당 총 3000개의 섬유에 대해 그룹당 3마리의 마우스에 걸쳐 근섬유 단면적을 평가하고, μm²로 측정하였다. 근육 섬유증/콜라겐 축적을 마손 삼색 염색을 사용하여 정량화하였다. 전체 근육 이미지로부터 사두근 단면당 5개의 대표 이미지를 취하고, 설명된 바와 같이 ImageJ를 사용하여, 염색된 콜라겐 조직(파란색으로 염색됨)이 차지하는 총 근육 면적의 백분율에 대해 평가하였다(Corbiere, ET AL. (2018) J. Funct. Morphol. Kinesiol., 3(1):1). 선택된 이미지를 빨간색, 파란색, 및 녹색 채널로 분할하고, 후속적으로 파란색 채널 이미지에 대한 임계처리로 콜라겐 염색된 섬유증 조직을 정량화하였다.

생체 내 손상된 근섬유의 정량화를 위해, 전체 사두근 단면 중 무작위로 선택된 면적으로부터의 밀 배아 응집소(WGA)의 총 수를 IgM에 양성인 섬유에 대해 스코어링하였다. 그 다음, 이들을 근육의 1 mm² 단면적에 걸쳐 IgM 양성 섬유의 수로 표시하였다. 지방생성 침착을 정량화하기 위해, 페릴리핀 염색된 사두근 근육 절편을 Metamorph® 소프트웨어를 사용하여 측정하고 페릴리핀 양성 영역의 백분율로 표시하였다. 간 조직병리학 스코어링을 위해, H&E 염색 절편을 1-5의 척도(높은 스코어는 악화된 병리를 나타냄)로 간세포 괴사, 세포자멸사, 핵융해(karyolysis), 변성, 손실(국소 또는 확산), 액포화(vacuolation), 비대, 섬유증 및 염증과 같은 특징에 대해 스코어링하였다. 각각의 간 샘플 스코어는 간 절편당 5개 대표 필드로부터의 점수의 평균이었다.

그립 강도 측정

앞다리 및 뒷다리 그립 강도 측정(GSM)을 설명된 바와 같이 그립 강도 측정기(Columbus Instruments, Columbus, OH)를 사용하여 평가하였다(Spurney, et al. (2009) Muscle Nerve 39(5):591-602). 동물을 데이터 수집 전에 3일 동안 적응시켰다. 그 다음, 앞다리 및 뒷다리 그립 강도 데이터를 연속 5일 동안 수집하고, 설명된 바와 같이 5일 동안의 평균 그립 강도/kg 체중으로 표시하였다(Sreetama, et al. (2018) Molecular Therapy 26(9):2231-42).

생체외 근섬유 손상

수축 유도된 근형질막 손상을 위해, EDL 근육을 야생형 BL6로부터 또는 hASM-AAV 또는 대조군-AAV로 처리된 B6A/J 마우스로부터 추출하고, pH를 7.4로 유지하기 위해 95% O₂ - 5% CO₂로 버블링된 링거 용액(137 mM NaCl, 24 mM NaHCO₃, 11 mM 포도당, 5 mM KCl, 2 mM CaCl₂, 1 mM MgSO₄, 1 mM NaH₂PO₄ 및 0.025 mM 투보쿠라린 클로라이드)에 두었다. 원위 힘줄을 고정된 바닥판에 단단히 연결하고, 근위 힘줄을 6-0 실크 봉합사를 사용하여 서보모터(800A 시험관내 근육 장치, Aurora Scientific)의 팔에 부착하였다. 수직으로 정렬된 EDL 근육을 2개의 스테인리스 강판 전극에 측접시켰다. 단일 0.2 mm 정사각형 시뮬레이션 펄스를 사용하여, 근육을 힘 생성을 위한 최적의 근육 길이로 조정하였다. 최적의 길이에서, 2분의 휴식 간격에 의해 분리된 최대 250 Hz 주파수의 300 ms 지속시간의 등척성 강직성 수축을 이용하여 최대 힘을 결정하였다. 초당 2개의 섬유 길이의 속도에서 10% 변형(strain)과 함께 9번의 순차적인 신장 수축(lengthening contraction, LC)에 의해 수축 유도된 근형질막 손상을 유도하였다. 각 수축은 1분의 휴식 간격에 의해 분리되었다. LC 유도된 힘 손실을 첫 번째 수축의 백분율로 표시하였다. LC 프로토콜 말기에, 근육으로부터 힘줄을 제거하고, 블롯팅하고, 무게를 측정한 다음, 30분 동안 실온에서 .2% PO 용액에서 인큐베이션하였다. 과잉의 염료를 세척한 후, 조직을 액체 질소 냉각 이소펜탄에서 급속 동결시킨 후, 절편화하고 PO 라벨링된 섬유에 대해 이미징하였고, 라벨링되지 않은 조직을 사용하여 배경 형광을 결정하였다. PO 양성 근섬유의 수를 근육 단면에서의 총 근섬유 대비 백분율로 표시하였고, 절편의 가장자리에 있는 섬유를 분석으로부터 제외시켰다. 초점 레이저 손상 분석을 위해, 온전한 이두근을 FM 1-43 염료(1-2 mg/mL)를 갖는 미리 가온한 타이로드 완충액(119 mM NaCl, 5 mM KCL, 25 mM Hepes 완충액, 2 mM CaCl_2, 2 mM MgCl₂, 글루코스 - 6 g/L, pH 7.4)에 장착하고, 상기 세포 레이저 손상에 대해 설명된 바와 같이 40X/1.4NA IX81 올림푸스 현미경을 사용하여 이미지화하였다. 복구 동역학 및 성공적인 근섬유 복구를 세포 손상 분석에 대해 설명된 바와 같이 결정하였다(Horn, et al. (2017) Sci Signal, 10(495):eaaj1978).

연구 엄격성

이 연구의 생체 내 부분에 대한 선험적 샘플 크기 결정은 막 지질 안정화 약물(박테리아 스핑고미엘리나제 및 바모로론(Vamorolone))의 복구 촉진 효과를 평가하기 위해 수행된 두 가지 연구로부터 도출되었다(Defour et al. (2014) Cell Death Dis., 5:e1306; Sreetama, et al. (2018) Molecular Therapy 26(9):2231-42). 복구 능력의 레이저 절제 손상 평가를 위해, 파워 분석을 바모로론 시험으로부터 수행하였고, 이러한 막 지질 변형 약물에 대해 0.725의 효과 크기를 확인하였다. 0.05로 설정된 양측 알파, 및 80%에서의 파워에서, 이것은 처리 그룹당 5마리의 마우스가 통계적 유의성을 달성하는 데 필요하다는 것을 보여준다. 유사하게, 세균성 스핑고미엘리나제는 0.6의 효과 크기로 근섬유막 복구 능력을 개선하였고, 이는 0.05의 양측 알파 및 80%에서의 파워를 가정했을 때 복구 능력에 대한 유의미한 영향을 평가하기 위해 그룹당 6마리의 마우스의 사용을 필요로 하였다. 따라서, LGMD2B(BLA/J 마우스)에서 세포막 지질을 변형시키는 화합물 또는 약물의 효과를 조사하는 연구들의 이러한 데이터를 취합시, hASM과 마찬가지로, 1차 종점 측정(막 복구 능력)을 위해 그룹당 5마리의 마우스가 필요하였고, 시험된 추가 종점에 대해 통계적으로 유의한 차이를 찾기 위해 처리 그룹당 4-7마리의 마우스가 필요하였다.

모든 생체내 측정(레이저 손상 분석, 모든 근육 및 간 조직학 측정, ASM 및 ALT 활성, 편심력 분석)은 연구팀의 맹검 구성원에 의해 수득되었다. 맹검은 마우스 귀 태그 번호와 처리 그룹을 포함한 비식별 코드 시트의 사용을 통해 달성되었다. 복구 분석을 코드화하여 조건에 대해 평가자/데이터 분석자를 맹검화하였다. 추가된 재조합 hASM과 관련된 분석은 비맹검 팀 구성원에 의해 수행되었지만, 평가자는 시험관내 ASM 활성 분석을 위한 샘플 식별에 맹검이었다.

통계

세포 손상 및 이두박근 근섬유 복구 동역학(FM-염료-강도 동역학), 편심력 감소 트레이스, 및 CLIC-GEEC 세포내이입 동역학의 경우, 모든 생성된 곡선을 처리 조건과 시간 또는 시험의 주요 효과 간의 상호작용 효과에 대한 분석을 갖는 혼합 모델 ANOVA를 통해 비교하였다. 유의한 상호작용의 경우, FM 염료 형광 강도/막 형광/편심력에서의 그룹 차이를 홀름-시닥(Holm-Sidak) 시험, 및 구형도(sphericity) 위반으로 인한 후인-펠트(Huynh-Feldt) 보정을 통해 시점당 평가하였다. 일원 ANOVA를 사용하여 손상 후 복구에 실패한 세포 및/또는 근섬유의 수의 차이와 일반적인 막 세포내이입 측정의 차이를 결정하였다. 반복 측정 ANOVA를 사용하여 조건 사이에서 12주 처리 기간 동안의 체중 변화의 차이, 및 CLIC/GEEC 세포내이입 비율의 차이를 평가하였다. 간 ASM 생산, 혈청 ASM 활성, 혈청 ALT 농도, 손상으로 회복되는 섬유의 비율, 조직학 측정(IgM+ 비율, 섬유증 면적에 대한 마손 삼색 염색, 염증 병소, 중심 핵, 페릴리핀+ 비율, 프로시온-오렌지+ 비율, 및 근섬유 면적), 및 사지력 측정에서의 대조군 AAV와 hASM 처리 마우스 사이의 비교를 독립 샘플 t-검정을 사용하여 계산하였다. 유사하게, 독립 샘플 t-검정을 사용하여 형질감염된 HepG2 세포(세포 상층액 및 용해물 모두)의 ASM 활성의 차이, 및 C2C12 카베올린 세포내이입 이동성 분획의 차이, 및 막 탈락 측정(미처리 대 hASM 처리)을 계산하였다. 모든 통계 분석에 대해, 알파 수준을 p < 0.05로 설정하였다.

결과

hASM은 소포 탈락 및 카베올라 세포내이입와 무관하게 LGMD2B 환자 세포 복구를 복원한다.

hASM이 막 복구에 미치는 영향을 시험하기 위해, LGMD2B 환자의 근모세포에 정제된 인간 ASM(hASM) 단백질을 처리하였다. 환자 세포를 정제된 hASM에 노출시키는 것은 원형질막 복구의 용량 의존적 개선을 유발하였다(도 1a-1c). 3 U/L 또는 4 U/L 농도의 정제된 hASM은 환자 근모세포의 복구를 개선하는 데 효과적이지 않았다(도 1a, 1b). 그러나, 4 U/L 초과의 정제된 hASM 용량을 환자 세포에 처리하는 것은 세포막 복구를 개선하여, 손상된 세포에서 FM 염료 유입을 감소시켰다(도 1a, 1b). 환자 세포막 복구에 대한 hASM 효과의 명확한 용량-반응이 나타나 막 복구가 5 U/L hASM 용량에서 개선되었고 6 U/L 이상의 hASM 농도에서 최고조에 달하였다(도 1b, 1c). 결과적으로, 5 U/L의 hASM은 손상으로부터 복구하지 못한 세포의 수를 감소시킨 반면, 6 U/L 이상의 hASM 용량에서 가장 큰 개선이 이루어졌다(도 1c).

세공 형성 독소에 의한 막 손상을 복구하는 데 있어서 카베올라 세포내이입 및 막 탈락의 관여를 이용하여, 이들 경로에 대한 hASM의 효과를 조사하였다. 카베올라 세포내이입을 카베올린1-RFP를 발현하는 근모세포에서 라이브 이미징 카베올라 역학에 의해 모니터링하였다(도 2a). 공초점 현미경에 의한 개별 원형질막 관련 카베올라의 이미징은 2분 이내에 원형질막에 있는 카베올라 중 75% 이상이 이들의 시작 위치로부터 이동하였고 6 U/L의 정제된 hASM의 처리가 이동성 카베올라의 이러한 분획에 영향을 미치지 않는 것을 보여주었다(78% ± 1.8 대 80% ± 1.4, 도 2a, 2b). 다음으로, hASM의 이러한 용량이 원형질막 탈락을 촉발하는지 조사하였다. ECV는 콜레스테롤이 풍부하므로(Bittel, et al. (2019) Front. Physiology 10:828), 세포막을 FITC 라벨링된 PEG 콜레스테롤로 라벨링하고 소포 탈락을 2분 동안 정량화하였다(도 2c). 처리되지 않은 세포와 6 U/L hASM 처리된 세포는 유사한 수의 ECV를 탈락시켰고 - 처리되지 않은 세포: 158 ± 24 대 HSM 처리된 세포: 147±15 (도 2d), hASM 처리된 세포와 처리되지 않은 세포에서 유사한 양의 세포 관련 콜레스테롤 라벨링의 손실로 이어졌다(도 2e). 이러한 결과는 환자 세포에서 막 복구를 개선하는 hASM의 용량이 카베올라 세포내이입 또는 ECV 탈락을 향상시키지 않는다는 것을 결정하였고, 이는 hASM이 세포막 복구를 개선하는 대안적인 막 이동 메커니즘의 존재를 암시한다.

hASM 처리는 벌크 원형질막 세포내이입을 향상시킨다

세포의 벌크 세포내이입은 클라트린 독립적 캐리어(clathrin independent carrier, CLIC)에 의해 지원되며, CLIC는 다이스페린 및 세공 형성 독소의 세포내이입을 촉진하기 때문에(Idone, et al. (2008) J. Cell. Biol., 180(5):905-14; Hernandez-Deviez, et al. (2008) J. Biol. Chem., 283(10):6476-88), CLIC 마커 글리코실-포스파티딜이노시톨(GPI) 고정된 녹색 형광 단백질(GPI-GFP)에 대한 hASM 처리의 효과를 조사하였다. C2C12 근모세포를 사용하여, 원형질막으로부터 CLIC의 꾸준한 세포내이입이 관찰되었으며, 이는 hASM 처리에 의해 급격히 향상되었다(도 2f-2h). 처리되지 않은 건강한 근모세포 및 LGMD2B 환자 근모세포에서 유사한 비율의 CLIC 세포내이입이 관찰되었다(도 2f, 2i, 2j). 마우스 근모세포에서 CLIC 세포내이입 속도의 증가와 유사하게(도 2h), 환자 근모세포의 hASM 처리는 또한 CLIC 세포내이입 속도를 증가시켰다(도 2i, 2j).

벌크 막 제거에서 CLIC에 대해, 복구에서의 벌크 막 세포내이입의 역할을 렉틴 밀 배아 응집소(WGA)를 사용하여 원형질막을 라벨링화하고 다양한 용량의 hASM에 대한 반응으로 그의 세포내이입 제거를 평가함으로써 조사하였다. 간략히, 세포막을 형광 WGA로 라벨링하고 세포내이입 기간의 종료시 브로모페놀-블루(BPB)를 사용하여 세포 표면에서의 WGA 형광을 ??칭함으로써 3분에 걸쳐 막 세포내이입을 모니터링하였다. BPB에 의해 ??칭되지 않는 세포 내의 점 형광은 엔도솜에 국한된 내재화된 WGA를 표시한다. 내재화된 WGA 형광을 ??칭 전 기저선 라벨링에 대비하여 표시하였다. 처리되지 않은 마우스 근모세포와 3 U/L hASM으로 처리된 마우스 근모세포는 비슷한 양의 원형질막 관련 WGA를 세포내이입하였지만, 6 U/L hASM 처리는 마우스 근육 세포에서 WGA 세포내이입 속도를 유의하게 증가시켰다(미처리: 16.2% + 1.6, 3 U/L hASM: 15.5% + .9, 2 U/L hASM: 23% + 1.6, 내재화된 WGA)(도 3a, 3b).

LGMD2B 환자 근모세포에 의한 감소된 ASM 분비의 발견에 따라(Defour, et al. (2014) Cell Death Dis., 5:e1306), 이들 세포는 WGA를 세포내이입하는 능력의 2배 감소를 나타내었다(11% + 1명 환자 대 21% + 1.6 건강)(도 3c, 3d). LGMD2B 세포 복구를 개선한 hASM 용량(6 U/L)으로 처리하는 것은 또한 이들 세포의 WGA 세포내이입을 향상시킨 반면, 저용량(3 U/L)은 그렇지 않았다(도 3c, 3d). 건강한 근육 세포를 6 U/L hASM으로 처리하는 것은 또한 임의의 세포 독성을 유발하지 않으면서(도 7), 이들에 의한 WGA 세포내이입을 증가시켰다(미처리: 20.9% +1.6, 6 U/L hASM: 29.7% + 1.4)(도 3d). 이러한 발견은 hASM 매개 복구 개선이 벌크 원형질막 세포내이입을 안전하게 향상시킨다는 것을 확인시켜 준다.

hASM-AAV는 LGMD2B에서 막 복구를 회복시키기 위한 유전적 접근법을 제공한다

상기 연구는 LGMD2B 환자 세포에서 벌크 세포내이입 결함을 안전하게 해결하기 위한 hASM 처리의 유용성을 입증하지만, 그의 치료적 유용성을 위해서는, 상기 단백질이 생체내에서 치료 수준을 유지하기 위해 빈번한 투여를 필요로 할 것이다. 이 문제를 극복하기 위해, 분비된 hASM을 유전적으로 발현시켜 혈청에서 이 단백질의 안정적인 치료 수준을 유지하기 위한 대안적인 접근법의 사용을 조사하였다. 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터를 사용하여 간 특이적 프로모터의 제어하에 hASM 단백질의 분비된 형태를 발현시켰다. 인간 간 세포주 HepG2를 간 특이적 프로모터 하에서 분비된 hASM을 생산하는 hASM-AAV로 감염시켜 시험관 내에서 AAV 벡터를 평가하였다(Barbon, et al. (2005) Mol. Ther., 12(3):431-40). 대조군 벡터와 비교하여, hASM-AAV로 감염된 HepG2 세포는 6.4 U/L hASM을 분비하였다(도 4a-4c). 이것은 막 복구를 개선하는 데 필요한 치료적 용량(6 U/L)을 초과하므로, 손상된 LGMD2B 환자 근육 세포의 복구를 개선하는 인간 간세포에 의해 생산된 분비된 hASM의 능력을 시험하였다. 대조군-AAV를 발현하는 HepG2 세포의 배양 상층액으로 처리된 환자 근모세포와 비교하여, hASM을 발현하는 HepG2 세포의 상층액으로 처리된 환자 근모세포는 건강한 공여자 근모세포와 유사한 동역학으로 효율적으로 복구되었다(도 4d, 4e). 이러한 발견은 LGMD2B 환자 근육 세포에서의 원형질막 복구를 개선하기 위한 간 표적화된 hASM-AAV 유전자 요법의 시험관내 효능을 확립하였다.

근섬유 근형질막 복구는 간 표적화된 hASM-AAV에 의해 개선된다.

LGMD2B 근섬유에서 원형질막 복구를 개선하는 hASM의 생체내 효능을 시험하기 위해, LGMD2B의 마우스 모델(B6A/J)을 사용하였다. 이들 다이스페린 결핍 마우스를 꼬리정맥 주사에 의해 10주령에 간 특이적 hASM-AAV 또는 대조군-AAV로 1회 처리하였다. 이러한 hASM-AAV의 단일 용량 후 12주에, 이들 마우스를 22주령에 평가하였다. 15-24주령까지, B6A/J 마우스는 근육 손상, 근섬유 복구 결핍, 및 운동 결핍의 징후를 나타내며, 이는 계속해서 점진적으로 악화된다(Defour, et al. (2014) Cell Death Dis., 5:e1306; Hogarth, et al. (2019) Nature Communications 10(1):2430; Nagy, et al. (2017) Physiol Rep., 5(6):e13173). hASM-AAV로 처리된 마우스에서는 대조군 AAV로 처리된 마우스와 비교하여 4배 더 높은 간 hASM 활성과 2배 더 높은 혈청 ASM 활성이 있었다(600 + 54.7 U/gram 대 171.6 + 2.4)(도 5a). 혈청 ASM 활성은 hASM-AAV 주사 후 일주일 내에 증가하였고 hASM-AAV로 처리된 B6A/J 마우스의 혈청 및 근육에서 더 높은 수준의 ASM은 처리 후 12주에도 지속되었다(도 5b, 5j, 7). 이러한 증가된 hASM은 처리 12주 동안의 동물 성장, 간 조직 병리학 및 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT)의 혈청 농도에 의해 평가된 바와 같이, 동물의 전반적인 건강이나 간에 부정적인 영향을 미치지 않았다(도 5b, 5c, 7). 시험관내 근육 세포 복구에서 hASM에 의해 제공된 명백한 개선을 고려할 때, 생체내 hASM 증가가 근형질막 복구를 개선하고 다이스페린 결핍 근섬유에서 감소된 근섬유 손상 및 퇴화를 감소시키는지 여부를 평가하였다. 근섬유 손상의 지표로서 근섬유 내 IgM의 존재를 사용하여, hASM-AAV 처리는 손상된 근섬유의 정도에서 3배 감소를 야기하였다(도 5d, 5e). 생체내 hASM 처리가 근섬유 복구에 미치는 이점을 직접 평가하기 위해, 생체외 레이저 손상 분석을 사용하여 대조군 및 hASM-AAV로 처리된 마우스의 온전한 이두근에서 근섬유 복구를 모니터링하였다. 이 접근법을 사용하여, 대조군 AAV 처리 마우스와 비교하여 hASM-AAV 처리 마우스로부터 근섬유의 개선된 복구 능력이 관찰되었다(도 5e, 5f, 5g). 레이저 손상은 제어된 국소 손상으로 이어지기 때문에, 기계적 활동을 통해 손상된 근섬유의 복구 능력을 조사하였다. 이러한 기계적 손상으로부터의 복구를 hASM-AAV 또는 대조군 AAV로 처리된 B6A/J 마우스뿐만 아니라 연령이 일치하는 WT 마우스로부터의 온전한 EDL 근육에서 평가하였다. 근육을 10회의 10% 편심성 수축에 의해 손상시킨 후, 손상된 근섬유를 막 불투과성 생체 염료인 프로시온 오렌지(PO)를 사용하여 라벨링하였다. 기계적 손상은 복구에 실패한 손상된 근섬유의 PO 라벨링를 초래하였고, 이는 hASM-AAV 처리된 마우스에서 2배 이상 감소하였다(도 5e, 5h). hASM-AAV 처리 마우스의 개선된 근섬유 복구는 약화 기계적 손상 유도된 근력 손실과 상관관계가 있었고, 이는 건강한(WT) 근육과 동일한 수준에 도달하였다(도 5i). 이러한 발견은 다이스페린병증 근육을 상승된 hASM에 만성 생체내 노출시키는 것이 생체내 자발적 손상뿐만 아니라 생체외 국소 또는 기계적 손상 후 근섬유 복구 능력을 회복시킨다는 것을 나타낸다.

LGMD2B에 대한 hASM-AAV의 전임상 이점

다이스페린 결핍에 의해 유발된 불량한 근섬유 복구 및 과도한 근섬유 괴사를 치료하기 위한 hASM-AAV 요법의 상기 유익한 효과와 함께, 이러한 처리가 또한 생체내 근육 조직병리 및 기능을 개선할 수 있는지 여부를 조사하였다. 사두근은 다이스페린 결핍에 의해 종종 영향을 받는 주요 운동 근육 그룹이다(Ho, et al. (2004) Hum. Mol. Genet., 13(18):1999-2010). 따라서, 이들 근육의 조직병리학을 조사하였고, 이는 근육 염증의 ~80% 감소를 나타내었다(도 6a, 6b). 만성 골격근 염증이 손상을 일으키고 더 큰 재생 필요성을 야기한다는 점을 고려할 때, hASM-AAV 처리된 근육에서의 감소된 염증이 또한 재생을 낮추었는지 조사하였다. H&E 라벨링된 근육 절편에서 중심 핵(재생을 위한 마커)을 갖는 근섬유의 비율의 정량화는 hASM-AAV 처리가 근섬유 재생의 필요성을 2배 감소시킨다는 것을 보여주었고(대조군-AAV: 40.5% + 5.5, rhASM-AAV: 19.3% + 4.7)(도 6c), 이는 중심 핵 근섬유의 자동 계수에 의해 확인되었다(도 6a). 또한, ~3000개의 근섬유의 단면적의 정량화는 근섬유가 대조군-AAV에 비해 hASM-AAV 처리 조건에서 ~ 45% 더 컸음을 보여주었다(도 6a, 6d). 또한, hASM-AAV 처리된 근육은 또한 근육 섬유증(마손 삼색 염색)(도 6a, 6e) 및 근섬유의 지방생성 손실(페릴리핀-1 염색)(도 6a, 6f)에서 거의 3배 감소를 나타내었다. 마지막으로, hASM-AAV 처리에 의한 이러한 조직병리학적 개선이 근력의 임의의 개선으로 이어졌는지 조사하였다. 다이스페린 결핍은 뒷다리 근육에서 더 큰 힘 손실을 유발하였고(Defour, et al. (2017) Human Mol. Genetics 26(11):1979-91), 개선된 막 복구는 이러한 결함을 해결한다(Sreetama et al. (2018) Molecular Therapy 26(9):2231-42). 따라서, 대조군 및 hASM-AAV 처리된 마우스의 앞다리 및 뒷다리 근육 그립 강도를 측정하였다(Sreetama et al. (2018) Molecular Therapy 26(9):2231-42). 대조군 AAV 처리된 코호트와 비교하여, 앞다리 그립 강도는 눈에 띄게 변경되지 않았지만, 뒷다리 그립 강도는 hASM-AAV 처리된 코호트에서 유의하게 개선된 것으로 나타났다(도 6g, 6h). 이러한 발견에 비추어 볼 때, 단일 용량의 hASM-AAV 처리는 LGMD2B에 대해 연장된 조직병리학적 및 기능적 근육 개선을 허용한다는 것이 명백하다.

다이스페린 결핍의 다운스트림에 있는 세포 결핍의 회복은 LGMD2B에 대한 치료 접근법이다. LGMD2B 환자 근육에서 큰 다이스페린 단백질의 발현을 회복하기 위한 지속적인 유전자 치료 노력을 보완하기 위해, 본 연구는 대안적인 접근법을 제공한다. 다이스페린보다 거의 4배 작은 단백질(ASM)의 간 표적 발현을 사용하여, 다이스페린 결핍의 다운스트림 결과가 해결된다. 이는 골격근 다이스페린 복원과 대등한 전임상 이점을 제공하였다. 다이스페린은 ASM을 적시 분비하는 데 필요한 빠르고 효율적인 리소좀 세포외유출을 가능하게 하여 손상된 근육 세포가 빈번한 막 손상을 복구하도록 도움을 준다(Defour, et al. (2014) Cell Death Dis., 5:e1306). 손상된 세포에 의한 불충분한 ASM 방출은 LGMD2B 및 NPDA 환자 모두에서 공통적인 결핍이다(Defour, et al. (2014) Cell Death Dis., 5:e1306; Michailowsky, et al. (2019) Skelet. Muscle. 9(1):1). 그러나, NPDA와 달리, 다이스페린 결핍 근육은 ASM 발현이 부족하지 않은 것으로 밝혀졌다(도 5j). 놀랍게도, 증가된 세포외 hASM은 이론에 얽매이지 않고 향상된 CLIC 매개 세포내이입을 통해 원형질막 복구를 개선함으로써 LGMD2B 마우스 모델에서 근육 건강을 개선한다(도 2, 3). CLIC는 다이스페린 세포내이입을 촉진하고(Hernandez-Deviez, et al. (2008) J. Biol. Chem., 283(10):6476-88), 원형질막에 결합된 세공 형성 독소와 함께 국소화하기 때문에(Idone, et al. (2008) J. Cell. Biol., 180(5):905-14), CLIC 세포내이입은 원형질막 복구, 및 본원에 입증된 바와 같이, ASM 매개 복구와 복잡하게 관련되어 있다(Corrotte, et al. (2013) Elife 2:e00926).

hASM의 외인성 투여는 인간 사용에 안전하며 NPD 환자의 ASM 결핍에 의해 유발된 증상을 치료하는 데 있어서 치료 효능을 보여준다(Murray, et al. (2015) Mol. Genet. Metab., 114(2):217-25; Defour, et al. (2017) Human Mol. Genetics 26(11):1979-91). 그러나, 이러한 연구들은 막 복구를 개선하거나 ASM 생산 부족이 아닌 그의 분비 감소에 의해 유발되는 질환인 LGMD2B 치료에 있어서 그의 효능을 평가하는 hASM의 능력을 평가하지 않았다. 본 연구는 hASM의 복구 특성을 조사하였고 예기치 않게 다이스페린 결핍 근육 세포에서 막 복구 능력을 회복시킬 수 있는 hASM의 효과적인 세포외 용량을 확인하였다(도 1). 이 용량은 세공 형성 독소에 의해 손상된 ASM 결핍 세포의 회복을 향상시키기 위해 사용된 용량보다 낮다(Tam, et al. (2010) J. Cell. Biol., 189(6):1027-38). 원형질막 복구를 개선하는 데 효과적인 이 hASM 용량은 인간에서의 사용을 위해 확립된 안전한 최대 hASM 용량보다 훨씬 낮고 세포 사멸을 유도하는 용량보다 100배 낮기 때문에 LGMD2B에서 그의 임상 유용성에 있어 고무적이다(도 7)(McGovern, et al. (2016) Genet. Med., 18(1):34-40). 그러나, 주사된 hASM 단백질의 짧은 순환 반감기(21-24시간)를 고려할 때, 직접적인 hASM 전달에 의존하는 요법은 효능을 유지하기 위해 약물의 빈번한 투여와 용량 상승을 요구함으로써 LGMD2B와 같은 만성 질환을 치료하는 이의 유용성을 감소시킨다. 이러한 한계를 극복하기 위해, AAV 매개 전달에 의한 이 단백질의 간 발현을 통한 hASM의 유전자 전달의 보다 임상적으로 실현가능한 접근법을 시험하였다. 우수한 안전성 프로파일과 광범위한 조직에서의 AAV의 높은 형질도입 효율을 이용하여, 지금까지 이러한 유전자 전달 벡터를 활용하는 2000건이 넘는 임상 시험이 있다(Kumar, et al. (2016) Mol. Ther. Methods Clin. Dev., 3:16034). 이 중에서, 간 특이적 표적 AAV 기반 치료제는 정맥 투여에 의해 더 큰 표적화 효능을 제공하고, 단일 투여 후 다년간 이식유전자 발현을 허용하며, 혈장 단백질 결핍을 치료하는 데 효율적이다(Nathwani, et al. (2014) N. Engl. J. Med., 371(21):1994-2004; Dobrzynski, et al. (2004) Blood 104(4):969-77; Cao, et al. (2007) Blood 110(4):1132-40; Colella, et al. (2018) Mol. Ther. Methods Clin. Dev., 8:87-104). 이러한 접근법의 안전성에도 불구하고, MTM1 단백질(AT132)의 AAV8 용량 증가를 이용하는 x-연관 근세관성 근병증(x-linked myotubular myopathy, MTM)에 대한 최근의 1, 2상 임상 시험(NCT03199469)은 높은 수준의 바이러스 부하(1x10¹⁴ vg/kg 내지 3x10¹⁴ vg/kg)가 사용되었을 때 해로운 간 결과를 관찰하였다. 이 연구는 1.1 x 10¹³ vg/kg(1.1 x 10¹² vg/kg의 인간 등가 용량)에서 마우스에서 hASM-AAV의 치료 효능을 보여준다. 이러한 현저히 낮은 인간 등가 용량은 안전한 사용을 가능하게 할 것이다. 이러한 안전성을 뒷받침하기 위해, hASM-AAV로 12주 처리 동안 및 종료시에도 명백한 간 손상(혈청 ALT 수준 및 간 조직병리학) 이 관찰되지 않았다.

시험관 내에서 hASM-AAV의 사용은 치료적으로 유효한 농도에 도달한 수준에서 인간 간 세포(HepG2 세포)에 의한 분비된 hASM의 생산을 허용하고 다이스페린 결핍 환자 근육 세포에서 복구를 회복시킨다는 것을 보여주었다(도 4). 이러한 효능은 또한 다이스페린 결핍의 전임상 마우스 모델에서 이 벡터의 생체내 사용에 의해 반영된다. NPD의 마우스 모델에서 벡터의 사용은 12주간의 연구에서 증가되고 안정적인 hASM 생산을 입증하였다(Barbon, et al. (2005) Mol. Ther., 12(3):431-40). hASM-AAV의 생체내 사용은 LGMD2B 마우스 모델을 사용하여 나타났으며, 이 벡터의 단일 용량으로 12주 처리 후, 근섬유 복구 능력을 회복시키는 데 효과적인 검출가능한 높은 수준의 간 및 혈청 hASM이 있었다(도 5). 이러한 발견은 LGMD2B에 대해 흥미롭지만, NPDA 환자에게도 흥미로운데, NPDA에 대한 마우스 모델의 근섬유가 또한 불량한 근형질막 손상을 나타내기 때문이다(Michailowsky, et al. (2019) Skelet. Muscle 9(1):1).

증가된 근육 퇴화는 더 큰 근육 재생을 필요로 하며, hASM-AAV에 의한 다이스페린 결핍 근섬유의 개선된 회복은 재생의 필요성을 감소시켜, 재생된 근섬유의 수를 2배 감소시키는 것으로 밝혀졌다. 그것은 또한 hASM-AAV 처리된 마우스에서 작은(새로 재생된) 근섬유의 비율을 감소시켰다(도 6). hASM-AAV에 의한 이러한 생체내 개선은 다이스페린-AAV 매개 유전자 요법 접근법에 의해 얻어진 것과 대등하고(Potter, et al. (2018) Hum. Gene Ther., 29(7):749-62), 분비된 hASM 기반 유전자 요법이 근섬유 다이스페린 발현을 회복시킨 유전자 요법만큼 LGMD2B 근섬유 복구 결핍을 구제하는 데 효과적이라는 것을 입증한다. 지속적인 근섬유 손상의 추가 결과는 만성 근육 염증을 포함한다(Potter, et al. (2018) Hum. Gene Ther., 29(7):749-62). 다이스페린 결핍 마우스의 hASM-AAV 처리는 또한 아마 다이스페린 결핍 근섬유의 개선된 생체내 복구 능력을 통해 이를 약화시켰다(도 6).

지속적인 부상과 불량한 막 복구는 또한 근육의 섬유지방생성 대체를 촉진한다. hASM-AAV는 AAV-다이스페린 유전자 요법을 사용하여 달성된 감소에 대등한 정도로 다이스페린병증 근육의 섬유지방생성 대체를 감소시켰다(Potter, et al. (2018) Hum. Gene Ther., 29(7):749-62)(도 6). 이러한 발견은 hASM-AAV 처리가 근육 복구와 전반적인 근육의 질 및 건강을 개선하는 그의 능력 면에서 부수적으로 근육 기능을 보존할 수 있음을 나타내었다. 이러한 개선에 따라, hASM-AAV 처리 후 증가된 뒷다리 그립 강도가 관찰되었다. 앞다리 그립 강도(LGMD2B 마우스 모델에서는 영향을 받지 않음)(Lloyd, et al. (2019) PLoS One 14(4):e0214908))는 hASM-AAV 처리에 의해 변경되지 않았다. 또한, 관찰된 뒷다리 그립 강도의 개선은 다이스페린병증에 대한 치료적 이점을 제공하는 다른 전임상 접근법과 일치한다(Farini, et al. (2012) Exp. Cell Res., 318(10):1160-74; Han, et al. (2010) J. Clin. Invest., 120(12):4366-74; Halevy, et al. (2013) Histol. Histopathol., 28(2):211-26.).

요약하면, 본원에 보고된 결과는 hASM 단백질이 용량 의존적 방식으로 LGMD2B 근육 세포 근형질막 복구를 개선시킨다는 것을 입증한다. 이들은 정제된 hASM 단백질과 AAV 매개 간 hASM 유전자 전달 접근법 모두를 다이스페린병증 근섬유의 복구 능력을 개선하기 위한 실행가능한 전략으로서 확립한다. 유전자 전달 접근법의 사용은 근섬유 사멸 및 조직병리를 감소시킬 뿐만 아니라 근육 기능을 개선하기 위한 장기적인 생체내 이점에 대한 그의 유용성을 확립한다.

세포 및 조직 수준에서의 지질 불균형은 다이스페린병증에서 근육 퇴화를 특징으로 한다. 섬유지방생성 세포의 비정상적인 축적 및 지방생성 분화는 다이스페린병증에서 근육 손실을 유발한다. 섬유지방생성 세포를 표적화하는 것은 지방생성 변성으로 인한 근육 손실을 억제하기 위한 치료적 접근법을 제공한다. 유전적으로 증가하는 분비된 산성 스핑고미엘리나제는 다이스페린병증 근육을 보존하고 기능 저하를 방지한다.

본 발명과 관련된 최신 기술을 설명하기 위해 전술한 명세서 전반에 걸쳐 많은 간행물 및 특허 문헌이 언급되어 있다. 이들 인용 각각의 전체 개시내용은 본원에 참조로 포함되어 있다.

본 발명의 바람직한 구현예 중 일부는 상기에 설명되고 명시적으로 예시되었지만, 본 발명이 이러한 구현예에 제한되는 것으로 의도되지 않는다. 하기 청구범위에 제시된 바와 같이, 본 발명의 범위와 사상을 벗어나지 않고 다양한 변형이 이루어질 수 있다.

SEQUENCE LISTING <110> Jaiswal, Jyoti K. Defour, Aurelia Bittel, Daniel Chandra, Goutam Chandra, Sreetama Sen <120> Use of Recombinant Human Acid Sphingomyelinase to Improve Skeletal Myofiber Repair <130> 5410-P06791WO00 <150> 63/046,202 <151> 2020-06-30 <160> 3 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 631 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Pro Arg Tyr Gly Ala Ser Leu Arg Gln Ser Cys Pro Arg Ser Gly 1 5 10 15 Arg Glu Gln Gly Gln Asp Gly Thr Ala Gly Ala Pro Gly Leu Leu Trp 20 25 30 Met Gly Leu Val Leu Ala Leu Ala Leu Ala Leu Ala Leu Ala Leu Ala 35 40 45 Leu Ser Asp Ser Arg Val Leu Trp Ala Pro Ala Glu Ala His Pro Leu 50 55 60 Ser Pro Gln Gly His Pro Ala Arg Leu His Arg Ile Val Pro Arg Leu 65 70 75 80 Arg Asp Val Phe Gly Trp Gly Asn Leu Thr Cys Pro Ile Cys Lys Gly 85 90 95 Leu Phe Thr Ala Ile Asn Leu Gly Leu Lys Lys Glu Pro Asn Val Ala 100 105 110 Arg Val Gly Ser Val Ala Ile Lys Leu Cys Asn Leu Leu Lys Ile Ala 115 120 125 Pro Pro Ala Val Cys Gln Ser Ile Val His Leu Phe Glu Asp Asp Met 130 135 140 Val Glu Val Trp Arg Arg Ser Val Leu Ser Pro Ser Glu Ala Cys Gly 145 150 155 160 Leu Leu Leu Gly Ser Thr Cys Gly His Trp Asp Ile Phe Ser Ser Trp 165 170 175 Asn Ile Ser Leu Pro Thr Val Pro Lys Pro Pro Pro Lys Pro Pro Ser 180 185 190 Pro Pro Ala Pro Gly Ala Pro Val Ser Arg Ile Leu Phe Leu Thr Asp 195 200 205 Leu His Trp Asp His Asp Tyr Leu Glu Gly Thr Asp Pro Asp Cys Ala 210 215 220 Asp Pro Leu Cys Cys Arg Arg Gly Ser Gly Leu Pro Pro Ala Ser Arg 225 230 235 240 Pro Gly Ala Gly Tyr Trp Gly Glu Tyr Ser Lys Cys Asp Leu Pro Leu 245 250 255 Arg Thr Leu Glu Ser Leu Leu Ser Gly Leu Gly Pro Ala Gly Pro Phe 260 265 270 Asp Met Val Tyr Trp Thr Gly Asp Ile Pro Ala His Asp Val Trp His 275 280 285 Gln Thr Arg Gln Asp Gln Leu Arg Ala Leu Thr Thr Val Thr Ala Leu 290 295 300 Val Arg Lys Phe Leu Gly Pro Val Pro Val Tyr Pro Ala Val Gly Asn 305 310 315 320 His Glu Ser Thr Pro Val Asn Ser Phe Pro Pro Pro Phe Ile Glu Gly 325 330 335 Asn His Ser Ser Arg Trp Leu Tyr Glu Ala Met Ala Lys Ala Trp Glu 340 345 350 Pro Trp Leu Pro Ala Glu Ala Leu Arg Thr Leu Arg Ile Gly Gly Phe 355 360 365 Tyr Ala Leu Ser Pro Tyr Pro Gly Leu Arg Leu Ile Ser Leu Asn Met 370 375 380 Asn Phe Cys Ser Arg Glu Asn Phe Trp Leu Leu Ile Asn Ser Thr Asp 385 390 395 400 Pro Ala Gly Gln Leu Gln Trp Leu Val Gly Glu Leu Gln Ala Ala Glu 405 410 415 Asp Arg Gly Asp Lys Val His Ile Ile Gly His Ile Pro Pro Gly His 420 425 430 Cys Leu Lys Ser Trp Ser Trp Asn Tyr Tyr Arg Ile Val Ala Arg Tyr 435 440 445 Glu Asn Thr Leu Ala Ala Gln Phe Phe Gly His Thr His Val Asp Glu 450 455 460 Phe Glu Val Phe Tyr Asp Glu Glu Thr Leu Ser Arg Pro Leu Ala Val 465 470 475 480 Ala Phe Leu Ala Pro Ser Ala Thr Thr Tyr Ile Gly Leu Asn Pro Gly 485 490 495 Tyr Arg Val Tyr Gln Ile Asp Gly Asn Tyr Ser Gly Ser Ser His Val 500 505 510 Val Leu Asp His Glu Thr Tyr Ile Leu Asn Leu Thr Gln Ala Asn Ile 515 520 525 Pro Gly Ala Ile Pro His Trp Gln Leu Leu Tyr Arg Ala Arg Glu Thr 530 535 540 Tyr Gly Leu Pro Asn Thr Leu Pro Thr Ala Trp His Asn Leu Val Tyr 545 550 555 560 Arg Met Arg Gly Asp Met Gln Leu Phe Gln Thr Phe Trp Phe Leu Tyr 565 570 575 His Lys Gly His Pro Pro Ser Glu Pro Cys Gly Thr Pro Cys Arg Leu 580 585 590 Ala Thr Leu Cys Ala Gln Leu Ser Ala Arg Ala Asp Ser Pro Ala Leu 595 600 605 Cys Arg His Leu Met Pro Asp Gly Ser Leu Pro Glu Ala Gln Ser Leu 610 615 620 Trp Pro Arg Pro Leu Phe Cys 625 630 <210> 2 <211> 585 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Leu Ala Leu Ser Asp Ser Arg Val Leu Trp Ala Pro Ala Glu Ala His 1 5 10 15 Pro Leu Ser Pro Gln Gly His Pro Ala Arg Leu His Arg Ile Val Pro 20 25 30 Arg Leu Arg Asp Val Phe Gly Trp Gly Asn Leu Thr Cys Pro Ile Cys 35 40 45 Lys Gly Leu Phe Thr Ala Ile Asn Leu Gly Leu Lys Lys Glu Pro Asn 50 55 60 Val Ala Arg Val Gly Ser Val Ala Ile Lys Leu Cys Asn Leu Leu Lys 65 70 75 80 Ile Ala Pro Pro Ala Val Cys Gln Ser Ile Val His Leu Phe Glu Asp 85 90 95 Asp Met Val Glu Val Trp Arg Arg Ser Val Leu Ser Pro Ser Glu Ala 100 105 110 Cys Gly Leu Leu Leu Gly Ser Thr Cys Gly His Trp Asp Ile Phe Ser 115 120 125 Ser Trp Asn Ile Ser Leu Pro Thr Val Pro Lys Pro Pro Pro Lys Pro 130 135 140 Pro Ser Pro Pro Ala Pro Gly Ala Pro Val Ser Arg Ile Leu Phe Leu 145 150 155 160 Thr Asp Leu His Trp Asp His Asp Tyr Leu Glu Gly Thr Asp Pro Asp 165 170 175 Cys Ala Asp Pro Leu Cys Cys Arg Arg Gly Ser Gly Leu Pro Pro Ala 180 185 190 Ser Arg Pro Gly Ala Gly Tyr Trp Gly Glu Tyr Ser Lys Cys Asp Leu 195 200 205 Pro Leu Arg Thr Leu Glu Ser Leu Leu Ser Gly Leu Gly Pro Ala Gly 210 215 220 Pro Phe Asp Met Val Tyr Trp Thr Gly Asp Ile Pro Ala His Asp Val 225 230 235 240 Trp His Gln Thr Arg Gln Asp Gln Leu Arg Ala Leu Thr Thr Val Thr 245 250 255 Ala Leu Val Arg Lys Phe Leu Gly Pro Val Pro Val Tyr Pro Ala Val 260 265 270 Gly Asn His Glu Ser Thr Pro Val Asn Ser Phe Pro Pro Pro Phe Ile 275 280 285 Glu Gly Asn His Ser Ser Arg Trp Leu Tyr Glu Ala Met Ala Lys Ala 290 295 300 Trp Glu Pro Trp Leu Pro Ala Glu Ala Leu Arg Thr Leu Arg Ile Gly 305 310 315 320 Gly Phe Tyr Ala Leu Ser Pro Tyr Pro Gly Leu Arg Leu Ile Ser Leu 325 330 335 Asn Met Asn Phe Cys Ser Arg Glu Asn Phe Trp Leu Leu Ile Asn Ser 340 345 350 Thr Asp Pro Ala Gly Gln Leu Gln Trp Leu Val Gly Glu Leu Gln Ala 355 360 365 Ala Glu Asp Arg Gly Asp Lys Val His Ile Ile Gly His Ile Pro Pro 370 375 380 Gly His Cys Leu Lys Ser Trp Ser Trp Asn Tyr Tyr Arg Ile Val Ala 385 390 395 400 Arg Tyr Glu Asn Thr Leu Ala Ala Gln Phe Phe Gly His Thr His Val 405 410 415 Asp Glu Phe Glu Val Phe Tyr Asp Glu Glu Thr Leu Ser Arg Pro Leu 420 425 430 Ala Val Ala Phe Leu Ala Pro Ser Ala Thr Thr Tyr Ile Gly Leu Asn 435 440 445 Pro Gly Tyr Arg Val Tyr Gln Ile Asp Gly Asn Tyr Ser Gly Ser Ser 450 455 460 His Val Val Leu Asp His Glu Thr Tyr Ile Leu Asn Leu Thr Gln Ala 465 470 475 480 Asn Ile Pro Gly Ala Ile Pro His Trp Gln Leu Leu Tyr Arg Ala Arg 485 490 495 Glu Thr Tyr Gly Leu Pro Asn Thr Leu Pro Thr Ala Trp His Asn Leu 500 505 510 Val Tyr Arg Met Arg Gly Asp Met Gln Leu Phe Gln Thr Phe Trp Phe 515 520 525 Leu Tyr His Lys Gly His Pro Pro Ser Glu Pro Cys Gly Thr Pro Cys 530 535 540 Arg Leu Ala Thr Leu Cys Ala Gln Leu Ser Ala Arg Ala Asp Ser Pro 545 550 555 560 Ala Leu Cys Arg His Leu Met Pro Asp Gly Ser Leu Pro Glu Ala Gln 565 570 575 Ser Leu Trp Pro Arg Pro Leu Phe Cys 580 585 <210> 3 <211> 2410 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 agtcagccga ctacagagaa gggtaatcgg gtgtccccgg cgccgcccgg ggccctgagg 60 gctggctagg gtccaggccg ggggggacgg gacagacgaa ccagccccgt gtaggaagcg 120 cgacaatgcc ccgctacgga gcgtcactcc gccagagctg ccccaggtcc ggccgggagc 180 agggacaaga cgggaccgcc ggagcccccg gactcctttg gatgggcctg gtgctggcgc 240 tggcgctggc gctggcgctg gcgctggctc tgtctgactc tcgggttctc tgggctccgg 300 cagaggctca ccctctttct ccccaaggcc atcctgccag gttacatcgc atagtgcccc 360 ggctccgaga tgtctttggg tgggggaacc tcacctgccc aatctgcaaa ggtctattca 420 ccgccatcaa cctcgggctg aagaaggaac ccaatgtggc tcgcgtgggc tccgtggcca 480 tcaagctgtg caatctgctg aagatagcac cacctgccgt gtgccaatcc attgtccacc 540 tctttgagga tgacatggtg gaggtgtgga gacgctcagt gctgagccca tctgaggcct 600 gtggcctgct cctgggctcc acctgtgggc actgggacat tttctcatct tggaacatct 660 ctttgcctac tgtgccgaag ccgcccccca aaccccctag ccccccagcc ccaggtgccc 720 ctgtcagccg catcctcttc ctcactgacc tgcactggga tcatgactac ctggagggca 780 cggaccctga ctgtgcagac ccactgtgct gccgccgggg ttctggcctg ccgcccgcat 840 cccggccagg tgccggatac tggggcgaat acagcaagtg tgacctgccc ctgaggaccc 900 tggagagcct gttgagtggg ctgggcccag ccggcccttt tgatatggtg tactggacag 960 gagacatccc cgcacatgat gtctggcacc agactcgtca ggaccaactg cgggccctga 1020 ccaccgtcac agcacttgtg aggaagttcc tggggccagt gccagtgtac cctgctgtgg 1080 gtaaccatga aagcacacct gtcaatagct tccctccccc cttcattgag ggcaaccact 1140 cctcccgctg gctctatgaa gcgatggcca aggcttggga gccctggctg cctgccgaag 1200 ccctgcgcac cctcagaatt ggggggttct atgctctttc cccatacccc ggtctccgcc 1260 tcatctctct caatatgaat ttttgttccc gtgagaactt ctggctcttg atcaactcca 1320 cggatcccgc aggacagctc cagtggctgg tgggggagct tcaggctgct gaggatcgag 1380 gagacaaagt gcatataatt ggccacattc ccccagggca ctgtctgaag agctggagct 1440 ggaattatta ccgaattgta gccaggtatg agaacaccct ggctgctcag ttctttggcc 1500 acactcatgt ggatgaattt gaggtcttct atgatgaaga gactctgagc cggccgctgg 1560 ctgtagcctt cctggcaccc agtgcaacta cctacatcgg ccttaatcct ggttaccgtg 1620 tgtaccaaat agatggaaac tactccggga gctctcacgt ggtcctggac catgagacct 1680 acatcctgaa tctgacccag gcaaacatac cgggagccat accgcactgg cagcttctct 1740 acagggctcg agaaacctat gggctgccca acacactgcc taccgcctgg cacaacctgg 1800 tatatcgcat gcggggcgac atgcaacttt tccagacctt ctggtttctc taccataagg 1860 gccacccacc ctcggagccc tgtggcacgc cctgccgtct ggctactctt tgtgcccagc 1920 tctctgcccg tgctgacagc cctgctctgt gccgccacct gatgccagat gggagcctcc 1980 cagaggccca gagcctgtgg ccaaggccac tgttttgcta gggccccagg gcccacattt 2040 gggaaagttc ttgatgtagg aaagggtgaa aaagcccaaa tgctgctgtg gttcaaccag 2100 gcaagatcat ccggtgaaag aaccagtccc tgggccccaa ggatgccggg gaaacaggac 2160 cttctccttt cctggagctg gtttagctgg atatgggagg gggtttggct gcctgtgccc 2220 aggagctaga ctgccttgag gctgctgtcc tttcacagcc atggagtaga ggcctaagtt 2280 gacactgccc tgggcagaca agacaggagc tgtcgcccca ggcctgtgct gcccagccag 2340 gaaccctgta ctgctgctgc gacctgatgc tgccagtctg ttaaaataaa gataagagac 2400 ttggactcca 2410

Claims (11)

1. 대상체에서 근이영양증을 치료, 억제 및/또는 예방하는 방법으로서, 상기 방법은 산성 스핑고미엘리나제를 코딩하는 핵산을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 것인 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 근이영양증은 다이스페린병증(dysferlinopathy)이거나 다이스페린 결핍인 방법.
3. 제2항에 있어서, 상기 다이스페린병증은 사지연결 근이영양증 2B형(limb-girdle muscular dystrophy type 2B, LGMD2B) 또는 미요시(Miyoshi) 근이영양증 1인 방법.
4. 제1항에 있어서, 상기 산성 스핑고미엘리나제를 코딩하는 핵산은 간 특이적 또는 간세포 특이적 프로모터에 연결되는 것인 방법.
5. 제4항에 있어서, 상기 간 특이적 또는 간세포 특이적 프로모터는 인간 α-1 항트립신(hAAT) 프로모터, 하이브리드 간 프로모터(HLP), 인간 티록신 결합 글로불린(TBG), 인간 혈청 알부민 프로모터, 및 DC190 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
6. 제4항에 있어서, 상기 간 특이적 또는 간세포 특이적 프로모터는 인간 혈청 알부민 프로모터인 방법.
7. 제4항에 있어서, 상기 간 특이적 또는 간세포 특이적 프로모터는 DC190 프로모터인 방법.
8. 제1항에 있어서, 상기 산성 스핑고미엘리나제를 코딩하는 핵산은 간 또는 혈류 내로 직접 주입되는 것인 방법.
9. 제1항에 있어서, 상기 산성 스핑고미엘리나제는 인간 산성 스핑고미엘리나제인 방법.
10. 제1항에 있어서, 상기 산성 스핑고미엘리나제를 코딩하는 핵산은 바이러스 벡터 내에 함유되는 것인 방법.
11. 제10항에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 아데노 관련 바이러스 벡터인 방법.

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