JP2023011821A - ムコ多糖症ｉｉ型を処置するための遺伝子療法 - Google Patents

ムコ多糖症ｉｉ型を処置するための遺伝子療法 Download PDF

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Abstract

【課題】ムコ多糖症ＩＩ型（ＭＰＳ ＩＩ）を処置するための薬学的組成物、キット、及び処置する方法を提供する。【解決手段】（ａ）複製欠損組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）であってＡＡＶ９キャプシドにパッケージされたヒトイズロネート－２－スルファターゼ（ｈＩＤＳ）をコードする異種核酸を含み；（ｂ）生理学的に適合する水性緩衝液、及び任意のサーファクタント及び賦形剤を含み；かつ（ｃ）（ｉ）前記ｒＡＡＶのゲノムコピー（ＧＣ）力価が少なくとも１．０×１０１３ＧＣ／ｍｌ（＋／－２０％）であるか；及び／または（ｉｉ）前記ｒＡＡＶの空粒子／全粒子比が、空のキャプシドを少なくとも約８０％含まないか；及び／または（ｉｉｉ）少なくとも約２．５×１０１０ＧＣ／ｇ脳質量～約３．６×１０１１ＧＣ／ｇ脳質量の前記ｒＡＡＶの懸濁液の用量が力価を有する、薬学的組成物とする。【選択図】なし

Description

連邦政府支援の研究に関する声明
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ（国立衛生研究所）からの助成金番号Ｒ０１ＤＫ５４４８１、Ｐ４０ＯＤ０１０９３９、及びＰ３０ＥＳ０１３５０８の下で政府支援によってなされた。連邦政府はこの発明において、一定の権利を有し得る。
電子資料の参照による組み込み
出願人は、ファイル番号「ＵＰＮ－１６－７７７１ＰＣＴ＿ＳＴ．２５」で本明細書とともに電子的に提出されている配列表を参照として組み込む。
１．序文
本発明は、ハンター症候群としても公知のムコ多糖症ＩＩ型（ＭＰＳ ＩＩ）を処置するための遺伝子治療アプローチに関する。
２．発明の背景
ハンター症候群としても公知のＭＰＳ ＩＩは、主に男性、１０万人に１人から１７万人に１人が罹患する希なＸ連鎖劣性遺伝病である。この進行性でかつ悲惨な疾患は、ＩＤＳ遺伝子の変異によって引き起こされ、ヘパラン硫酸及びデルマタン硫酸のリソソーム異化に必要な酵素であるリソソーム酵素、イズロネート－２－スルファターゼの欠乏に至る。ＧＡＧ（グリコサミノグリカン）と呼ばれるこれらの遍在性多糖類は、ＭＰＳ ＩＩ患者の組織及び器官に蓄積し、特徴的な蓄積病変及び多様な疾患の後遺症を生じる。この患者集団では罹患率及び死亡率が高く－重度の表現型（神経認知機能低下を特徴とする）の患者では、平均年齢１１．７歳で死亡が報告されており；軽度または弱化した表現型の患者では、２１．７歳で死亡が報告されている。
ＭＰＳ ＩＩの患者は出生時には正常であるように見えるが、疾患の徴候及び症状は、典型的には１８ヶ月～４歳の年齢の間に重度の形態で存在し、４～８年の間に弱化した形態で存在する。罹患した全ての患者に共通する徴候及び症状としては、低身長、粗い顔貌、大頭症、巨大舌、難聴、肝腫脹及び脾腫、多発異骨症、関節拘縮、脊髄狭窄及び手根管症候群が挙げられる。頻繁な上気道及び耳の感染症がほとんどの患者で起こり、進行性気道閉塞が一般的に見出され、睡眠時無呼吸及びしばしば死につながる。心臓病はこの集団における主要な死因であり、左右の心室肥大及び心不全をもたらす弁膜機能障害を特徴とする。死亡は、一般に、閉塞性気道疾患または心不全に起因する。
重篤な形態の疾患では、早期発達のマイルストーンが達成される可能性があるが、発達遅延は１８～２４ヶ月で容易に明らかである。一部の患者は初年度にスクリーニング検査の聴取を受けず、サポートされずに座る能力、歩く能力、会話を含む他のマイルストーンが遅れる。発達の進行は約６．５年の間プラトーになり始める。ＭＰＳ ＩＩの小児の半数はトイレ訓練を受けているが、大部分の子どもたちは、全員ではないにしても、病気の進行とともにこの能力を失う。
有意な神経学的関与を有する患者は、過活動、頑固さ及び攻撃を含む重度の行動障害を示し、これは生後２年目から始まり、神経変性がこの行動を減弱させる８～９歳まで続く。
てんかん発作は、１０歳に達した重症患者の半分超で報告され、死亡するまでにＣＮＳの関与するほとんどの患者が重度の精神的な障害を有し、絶えずケアを必要とする。弱化した病気の患者は正常な知的機能を発揮するが、ＭＲＩ画像では、白質病変、拡大した脳室及び脳萎縮を含む、ＭＰＳ ＩＩを有するすべての患者において全体的な脳の異常が明らかになる。
組換えイデュルスルファーゼ（Ｅｌａｐｒａｓｅ（登録商標）、Ｓｈｉｒｅ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ）を用いた酵素補充療法（「ＥＲＴ」）は、ハンター症候群の唯一承認された処置であり、毎週の輸液として投与される。しかし、現在投与されているＥＲＴは、血液脳関門（「ＢＢＢ」）を通過しないため、重篤な疾患の患者、すなわちＣＮＳ／神経認知及び行動関与を伴うＭＰＳ ＩＩの満たされていないニーズに対処し得ない。この問題に対処する現在の労力は、ＢＢＢを横切ることが可能なように酵素を改変することを目的としている。
３．発明の要旨
ハンター症候群としても公知のＭＰＳ ＩＩと診断された患者（ヒト対象）のＣＮＳにヒトイズロネート－２－スルファターゼ（ｈｕｍａｎ ｉｄｕｒｏｎａｔｅ－２－ｓｕｌｆａｔａｓｅ）（「ｈＩＤＳ」）遺伝子を送達するための複製欠損アデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）の使用が、本明細書で提供される。ｈＩＤＳ遺伝子を送達するために使用される組換えＡＡＶ（「ｒＡＡＶ」）ベクター（「ｒＡＡＶ．ｈＩＤＳ」）は、ＣＮＳ（例えば、ＡＡＶ９キャプシドを保有するｒＡＡＶ）に対して指向性を有するべきであり、ｈＩＤＳ導入遺伝子は、特定の発現制御エレメント、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサー及びニワトリベータアクチンプロモーター（ＣＢ７）のハイブリッドによって制御されるべきである。くも膜下腔内／大槽内投与に適した薬学的組成物は、生理学的に適合性の水性緩衝液、サーファクタント及び任意の賦形剤を含む製剤緩衝液中のｒＡＡＶ．ｈＩＤＳベクターの懸濁液を含む。ｒＡＡＶ懸濁液は、さらに以下によって特徴付けられる：
（ｉ）ｒＡＡＶゲノムコピー（ＧＣ）力価が少なくとも１．０×１０１３ＧＣ／ｍｌ（＋／－２０％）である；
（ｉｉ）ｒＡＡＶの空粒子／全粒子比が、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析（実施例５Ｄ参照）で決定して０．０１～０．０５である（９５％～９９％が空のキャプシドなし）か、または他の実施形態では、少なくとも約５０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％が空のキャプシドなし；及び／または（ｉｉｉ）少なくとも約２．５×１０１０ＧＣ／ｇの脳質量～約３．６×１０１１ＧＣ／ｇ脳質量というｒＡＡＶ懸濁液の用量が力価を有する。
本明細書にはまた、それを必要とするヒト対象にくも膜下腔内注射によって投与可能な、本明細書で提供される薬学的組成物が提供される。特定の実施形態では、本明細書に記載のｒＡＡＶ．ｈＩＤＳを含む薬学的組成物の使用は、それを必要とするヒト対象にくも膜下腔内注射によって投与可能な医薬品の調製に使用される。ヒト対象（患者）は、以前にムコ多糖症ＩＩ（ＭＰＳ ＩＩ）または重度のハンター症候群と診断されていてもよい。
力価は、インビトロ細胞培養アッセイ、例えば、本明細書の実施例５Ｇに記載されているインビトロの力価アッセイで測定され得、ここで、ＨＥＫ２９３またはＨｕｈ７細胞は、１細胞あたり既知の多重度のｒＡＡＶＧＣで形質導入され、この上清は４ＭＵ－イズロニド酵素アッセイを使用して形質導入７２時間後にＩＤＳ活性についてアッセイされる。
このようなｒＡＡＶ．ｈＩＤＳベクター調製物を、くも膜下腔内／大槽内注射によって小児または成人のヒト対象に投与して、ＣＮＳにおける治療レベルのｈＩＤＳ発現を達成してもよい。処置の候補となる患者は、ＭＰＳ ＩＩ疾患が重度または弱化した小児及び成人患者である。重症疾患は、連続試験で１標準偏差を超える低下という、平均または記録された歴史的証拠よりも少なくとも１標準偏差低い発達指数（ＤＱ）（ＢＳＩＤ－ＩＩＩ）を有する早期神経認知欠損として定義される。
ハンター症候群患者のｒＡＡＶ．ｈＩＤＳの治療上有効なくも膜下腔内／大槽内用量は、患者の脳質量１ｇあたり１０１０～５×１０１０ＧＣに等しい１．４×１０１３～７．０×１０１３ＧＣ（フラット用量）、または患者の脳質量１ｇあたり１０１０～５×１０１０ＧＣに等しい３．８×１０１２～７．０×１０１３ＧＣ（フラット用量）におよぶ。あるいは、以下の治療上有効なフラット用量を、示された年齢群の患者に投与してもよい：
・新生児：約３．８×１０１２～約１．９×１０１４ＧＣ；
・３～９ヶ月：約６×１０１２～約３×１０１４ＧＣ；
・９～３６ヶ月：約１０１３～約５×１０１４ＧＣ；
・３～１２年：約１．２×１０１３～約６×１０１４ＧＣ；
・１２＋歳：約１．４×１０１３～約７．０×１０１４ＧＣ；
・１８＋歳（成人）：約１．４×１０１３～約７．０×１０１４ＧＣ。
いくつかの実施形態において、１２＋歳の年齢のＭＰＳ ＩＩ患者（１８＋歳の年齢を含む）に投与される用量は、１．４×１０１３のゲノムコピー（ＧＣ）（１．１×１０１０ＧＣ／ｇ脳質量）である。いくつかの実施形態では、１２歳＋のＭＰＳ ＩＩ患者（１８歳＋の年齢を含む）に投与される用量は、７×１０１３ＧＣ（５．６×１０１０ＧＣ／ｇ脳質量）である。なおさらなる実施形態において、ＭＰＳ ＩＩ患者に投与される用量は、少なくとも約４×１０８ＧＣ／ｇ脳質量～約４×１０１１ＧＣ／ｇ脳質量である。特定の実施形態において、ＭＰＳ ＩＩ新生児に投与される用量は、約１．４×１０１１～約１．４×１０１４ＧＣの範囲であり；乳児３～９ヶ月に投与される用量は、約２．４×１０１１～約２．４×１０１４ＧＣの範囲であり；ＭＰＳ ＩＩ小児９～３６ヶ月に投与される用量は：約４×１０１１～約４×１０１４ＧＣの範囲であり；３～１２歳のＭＰＳ
ＩＩ小児に投与される用量は：約４．８×１０１１～約４．８×１０１４ＧＣの範囲であり；小児及び１２＋歳の成人に投与される用量は、約５．６×１０１１～約５．６×１０１４ＧＣの範囲である。
この処置の目的は、疾患を処置するための実行可能なアプローチとして、ｒＡＡＶに基づくＣＮＳ指向性遺伝子治療を介して、患者の欠損イズロネート－２－スルファターゼを機能的に置き換えることである。治療の有効性は、（ａ）ＭＰＳ ＩＩ（ハンター症候群）患者の神経認知低下の予防；及び（ｂ）疾患のバイオマーカー、例えば、ＣＳＦ、血清及び／もしくは尿中、ならびに／または肝臓及び脾臓容積中のＧＡＧレベル及び／または酵素活性（ＩＤＳまたはヘキソサミニダーゼ）の減少を評価することによって測定され得る。乳児の神経認知は、Ｂａｙｌｅｙ Ｓｃａｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｆａｎｔ ａｎｄ Ｔｏｄｄｌｅｒ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、第３版、ＢＳＩＤ－ＩＩＩによって測定され得る。神経認知及び適応行動評価（例えば、それぞれ、Ｂａｙｌｅｙ Ｓｃａｌｅ ｏｆ Ｉｎｆａｎｔ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ及びＶｉｎｅｌａｎｄ Ａｄａｐｔｉｖｅ Ｂｅｈａｖｉｏｒ Ｓｃａｌｅｓを使用して）を行ってもよい。
処置前に、ＭＰＳ ＩＩ患者は、ｈＩＤＳ遺伝子を送達するために使用されるｒＡＡＶベクターのキャプシドに対する中和抗体（Ｎａｂ）について評価してもよい。そのようなＮａｂは、形質導入効率を妨げ、処置力価を低下し得る。ベースラインの血清Ｎａｂ力価≦１：５を有するＭＰＳ ＩＩ患者は、ｒＡＡＶ．ｈＩＤＳ遺伝子療法プロトコールでの
処置のための良好な候補である。血清Ｎａｂ＞１：５の力価を有するＭＰＳ ＩＩ患者の処置は、ｒＡＡＶ．ｈＩＤＳベクター送達での処置の前及び／または処置中に、免疫抑制剤を用いた一過性同時処置などの併用療法を必要とする場合がある。必要に応じて、免疫抑制剤併用療法は、ＡＡＶベクターキャプシド及び／または製剤の他の成分に対する中和抗体を事前に評価することなく、予防措置として使用してもよい。特定の実施形態では、特にＩＤＳ活性のレベルが実質的にない患者において、導入遺伝子産物が「外来」と見なされる可能性のあるｈＩＤＳ導入遺伝子産物に対する潜在的な有害な免疫反応を予防するために、事前の免疫抑制療法が望ましい場合がある。動物で観察されるのと同様の反応は、ヒト対象には生じない場合があるが、ｒＡＡＶ－ｈＩＤＳの全てのレシピエントに予防措置の免疫抑制療法が推奨されている。
ｈＩＤＳの全身送達を伴うＣＮＳへのｒＡＡＶ．ｈＩＤＳの遺伝子治療送達の組み合わせは、本発明の方法に包含される。全身送達は、ＥＲＴ（例えば、Ｅｌａｐｒａｓｅ（登録商標）（イデュルスルファーゼ）を用いる）、または肝臓の指向性を有するｒＡＡＶ．ｈＩＤＳ（例えば、ＡＡＶ８キャプシドを有するｒＡＡＶ．ｈＩＤＳ）を用いるさらなる遺伝子治療を用いて達成してもよい。
特定の実施形態において、患者は、ｈＩＤＳに対して患者を寛容化させるために、肝臓特異的注射によってＡＡＶ．ｈＩＤＳを投与され、この患者は引き続き、乳児、小児及び／または成人である場合にはくも膜下腔内注射によってＡＡＶ．ｈＩＤＳを投与されて、ＣＮＳにおいて治療濃度のｈＩＤＳを発現される。
特定の実施形態は、部分的に、（ｉ）ＭＰＳ ＩＩのマウスモデル（以下の実施例２に記載）において生成された有望なデータ（このデータは、本発明のｒＡＡＶ．ｈＩＤＳベクターによる処置がＩＤＳ発現を正常化し；疾患のバイオマーカーを低下し；行動的な（ＣＮＳ）症状を改善したことを示す）；ならびに、（ｉｉ）以下の実施例３に記載の非ヒト霊長類（ＮＨＰ）における安全性及び生体内分布に基づいている。本発明の特定の実施形態はまた、ｒＡＡＶ．ｈＩＤＳ薬学的組成物（以下の実施例４及び５）の製造及び特徴付けを記載する実施例によって例示される。
本明細書で使用される場合、「くも膜下腔内送達」または「くも膜下腔内投与」という用語は、薬物が脳脊髄液（ＣＳＦ）に到達するような、脊髄管、より具体的にはくも膜下腔内への注射による薬物の投与経路を指す。くも膜下腔内送達には、腰椎穿刺、脳室内、後頭下／大槽内、及び／またはＣ１－２穿刺が含まれ得る。例えば、材料は、腰椎穿刺によってくも膜下腔全体に拡散のために導入されてもよい。別の例では、注射は大槽内であってもよい。
本明細書で使用される「大槽内送達」または「大槽内投与」という用語は、大槽小脳の脳脊髄液中に直接的、より具体的には、後頭下穿刺を介するか、または大槽への直接注射により、または恒久的に配置されたチューブを介した、薬物の投与の経路を指す。
本明細書で使用する「治療上有効な量」とは、ＭＰＳ ＩＩの１つ以上の症状を改善または処置するのに十分な量の酵素を標的細胞に送達して発現する、ＡＡＶ．ｈＩＤＳ組成物の量を指す。「処置」は、ＭＰＳ ＩＩ症候群の１つの症状の悪化、及びおそらくその１つ以上の症状の逆転を予防することを包含し得る。例えば、治療上有効な量のｒＡＡＶ．ｈＩＤＳは、ＭＰＳ ＩＩを有する患者における神経認知機能を改善する量である。このような神経認知機能の改善は、Ｂａｙｌｅｙ Ｓｃａｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｆａｎｔ ａｎｄ Ｔｏｄｄｌｅｒ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔを用いて、対象の神経認知発達指数（ＤＱ）を評価することによって測定され得る。また、神経認知機能の改善は、限定するものではないが、例えば、Ｗｅｃｈｓｌｅｒ Ａｂｂｒｅｖｉａｔｅｄ Ｓｃａｌｅ ｏｆ
Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｃｅ（ＷＡＳＩ）（ＩＱ）、Ｂａｙｌｅｙ’ｓ Ｉｎｆａｎｔｉｌｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｓｃａｌｅ、ｔｈｅ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｖｅｒｂａｌ Ｌｅａｒｎｉｎｇ Ｔｅｓｔ（ｍｅｍｏｒｙ）（ホプキンスの語学学習試験（記憶））、及び／またはＴｅｓｔｓ ｏｆ Ｖａｒｉａｂｌｅｓ ｏｆ Ａｔｔｅｎｔｉｏｎ（注意変数の試験）（ＴＯＶＡ）の使用を含む、当該分野で公知の方法を用いて、対象の知性の商（ＩＱ）を評価することによって、測定され得る。別の実施形態において、治療上有効な量のｒＡＡＶ．ｈＩＤＳは、尿中及び／または脳脊髄液中、及び／または血清及び／または他の組織中における病原性ＧＡＧ、ヘパラン硫酸及び／またはヘキソサミニダーゼ濃度を減少させる量である。さらに他の実施形態では、角膜混濁の是正が観察され得、中枢神経系（ＣＮＳ）における病変の是正が観察されるか、並びに／または血管周囲及び／もしくは髄膜間隙蓄積の逆転が観察される。
「治療上有効な量」は、ヒト患者ではなく、動物モデルに基づいて決定されてもよい。適切なマウスモデルの例を本明細書に記載する。
本明細書中で使用される場合、「機能的ヒトイズロネート－２－スルファターゼ」とは、ＭＰＳ ＩＩまたは関連する症候群のないヒトにおいて通常機能するヒトイズロネート－２－スルファターゼ酵素を指す。逆に、ＭＰＳ ＩＩまたは関連する症候群を引き起こすヒトイズロネート－２－スルファターゼ酵素バリアントは、機能しないと考えられる。一実施形態では、機能的ヒトイズロネート－２－スルファターゼは、Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ
ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７（２１）：８５３１－８５３５（１９９０）に記載の野性型ヒトイズロネート－２－スルファターゼのアミノ酸配列、配列番号２（５５０アミノ酸）に再現されたＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿０００１９３．１を有する；このプレプロタンパク質は、シグナルペプチド（アミノ酸１～２５）、プロペプチド（アミノ酸２６～３３）、並びにアミノ酸３４～４５５（４２ｋＤａ鎖）及びアミノ酸４５６～５５０（１４ｋＤａ鎖）から構成される成熟ペプチドを含む。ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ（Ｐ２２３０４．１）も参照のこと。
本明細書中で使用される場合、「ＮＡｂ力価」という用語は、その標的化エピトープ（例えば、ＡＡＶ）の生理学的効果を中和する中和抗体（例えば、抗ＡＡＶ Ｎａｂ）がどれくらい生成されるかの尺度を指す。抗ＡＡＶ ＮＡｂ力価は、例えば、参照によって本明細書に組み込まれる、Ｃａｌｃｅｄｏ、Ｒ．ｅｔ ａｌ．、Ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ
Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓｅｓ（アデノ随伴ウイルスに対する中和抗体の世界的疫学）．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ、２００９．１９９（３）：ｐ３８１－３９０に記載されているように測定され得る。
本明細書中で使用される場合、「発現カセット」とは、ＩＤＳ遺伝子、プロモーターを含み、そのための他の調節配列を含み得る核酸分子を指し、このカセットは、遺伝子エレメント（例えば、プラスミド）を介してパッケージング宿主細胞に送達されてもよく、ウイルスベクター（例えば、ウイルス粒子）のキャプシドにパッケージングされてもよい。典型的には、ウイルスベクターを生成するためのそのような発現カセットは、ウイルスゲノムのパッケージングシグナル及び本明細書に記載のものなどの他の発現制御配列に隣接する、本明細書に記載のＩＤＳコード配列を含む。
「ｓｃ」という略語は、自己相補的であることを意味する。「自己相補的ＡＡＶ」とは、組換えＡＡＶ核酸配列によって保持されるコード領域が、分子内二本鎖ＤＮＡ鋳型を形成するようにデザインされた構築物を指す。感染後、第２鎖の細胞媒介合成を待つのではなく、ｓｃＡＡＶの２つの相補的な半分が会合して、即座の複製及び転写の準備ができている１本の二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）単位を形成する。例えば、Ｄ Ｍ ＭｃＣａｒｔ
ｙ ｅｔ ａｌ．、「Ｓｅｌｆ－ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ
ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ（ｓｃＡＡＶ）ｖｅｃｔｏｒｓ ｐｒｏｍｏｔｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ ｏｆ ＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（自己相補的組み換えアデノ随伴ウイルス（ｓｃＡＡＶ）ベクターは、ＤＮＡ合成とは独立して効率的な形質導入を促進する）」Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（Ａｕｇｕｓｔ ２００１）、Ｖｏｌ．８、Ｎｕｍｂｅｒ １６、Ｐａｇｅｓ １２４８～１２５４を参照のこと。自己相補的なＡＡＶは、例えば、米国特許第６，５９６，５３５号；同第７，１２５，７１７号；及び同第７，４５６，６８３号に記載されており、その各々は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書中で使用される場合、「作動可能に連結された」という用語は、目的の遺伝子と連続する発現制御配列、及び目的の遺伝子を制御するためにトランスまたは遠隔で作用する発現制御配列の両方を指す。
タンパク質または核酸に関して使用される場合、「異種」という用語は、そのタンパク質または核酸が、性質上お互いに同じ関係では見出されない２つ以上の配列または部分配列を含むことを示す。例えば、典型的には、新しい機能的核酸を作製するように配置された無関係の遺伝子由来の２つ以上の配列を有する核酸は、組換え生産される。例えば、一実施形態では、核酸は、異なる遺伝子に由来するコード配列の発現を指示するように配置された１つの遺伝子由来のプロモーターを有する。従って、コード配列を参照すると、プロモーターは異種である。
「複製欠損ウイルス」または「ウイルスベクター」とは、目的の遺伝子を含む発現カセットがウイルスキャプシドまたはエンベロープにパッケージングされた合成または人工のウイルス粒子を指し、ウイルスキャプシドまたはエンベロープ内にパッケージングもされる任意のウイルスゲノム配列は、複製欠損であり；すなわち、それらは、子孫ビリオンを生成し得ないが、標的細胞を感染させる能力を保持し得る。一実施形態において、ウイルスベクターのゲノムは、複製に必要な酵素をコードする遺伝子を含まない（このゲノムは、人工ゲノムの増幅及びパッケージングに必要なシグナルに隣接する目的の導入遺伝子のみを含む「ガットレス」であるように操作されてもよい）が、これらの遺伝子は生成中に供給されてもよい。従って、複製のために必要なウイルス酵素の存在を除いて、子孫のビリオンによる複製及び感染は生じ得ないので、これは遺伝子治療での使用に安全であるとみなされる。
本明細書中で使用される場合、「組換えＡＡＶ９ウイルス粒子」とは、ＡＡＶ９キャプシドを有するヌクレアーゼ耐性粒子（ＮＲＰ）を指し、キャプシドは、所望の遺伝子産物の発現カセットを含む異種核酸分子を内部にパッケージングしている。そのような発現カセットは、典型的には、遺伝子配列が発現制御配列に作動可能に連結されている遺伝子配列に隣接するＡＡＶ５’及び／または３’の逆方向末端反復配列を含む。発現カセットのこれらの及び他の適切なエレメントは、以下により詳細に記載され、本明細書では、代わりに、導入遺伝子のゲノム配列と呼ばれる場合がある。これは、「完全な」ＡＡＶキャプシドとも呼ばれてもよい。このようなｒＡＡＶウイルス粒子は、発現カセットによって保持される所望の遺伝子産物を発現し得る宿主細胞に導入遺伝子を送達する場合、「薬理学的に活性」と呼ばれる。
多くの場合、ｒＡＡＶ粒子は「ＤＮａｓｅ耐性」と呼ばれる。しかし、このエンドヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）に加えて、他のエンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼも、汚染核酸を除去するために本明細書に記載の精製ステップで使用されてもよい。そのようなヌクレアーゼは、一本鎖ＤＮＡ及び／または二本鎖ＤＮＡ及びＲＮＡを分解するように選択してもよい。そのようなステップは、単一のヌクレアーゼ、または異なる標的に向け
られたヌクレアーゼの混合物を含んでもよく、そしてエンドヌクレアーゼであってもエキソヌクレアーゼであってもよい。
「ヌクレアーゼ耐性」という用語は、ＡＡＶキャプシドが、導入遺伝子を宿主細胞に送達するようにデザインされた発現カセットの周りに完全にアセンブルされ、産生過程から、存在し得る混入核酸を除去するようにデザインされたヌクレアーゼインキュベーションステップ中の分解（消化）から、これらのパッケージゲノム配列を保護することを示す。
本明細書中で使用される場合、「ＡＡＶ９キャプシド」とは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション：ＡＡＳ９９２６４のアミノ酸配列を有するＡＡＶ９を指し、参照によって本明細書に援用され、ＡＡＶｖｐ１キャプシドタンパク質は配列番号１３に再現される。このコードされた配列からのいくつかのバリエーションは、本発明によって包含され、これは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション：ＡＡＳ９９２６４、配列番号１３及びＵＳ７９０６１１１（またＷＯ２００５／０３３３２１）において参照アミノ酸配列と約９９％の同一性を有する配列を含んでもよい（すなわち、参照配列から約１％未満のバリエーション）。そのようなＡＡＶとしては、例えば、天然の単離物（例えば、ｈｕ３１またはｈｕ３２）、またはアミノ酸の置換、欠失もしくは付加を有するＡＡＶ９のバリアント、例えばＡＡＶ９キャプシドと配列された任意の他のＡＡＶキャプシド中の対応する位置から「補充された」代用残基から選択されるアミノ酸置換；例えば、米国特許第９，１０２，９４９号、米国特許第８，９２７，５１４号、米国特許出願公開第２０１５／３４９９１１号、及びＷＯ２０１６／０４９２３０Ａ１に記載の置換などが挙げられる。しかし、他の実施形態では、上記の配列と少なくとも約９５％の同一性を有するＡＡＶ９またはＡＡＶ９キャプシドの他のバリアントを選択してもよい。例えば、米国特許出願公開第２０１５／００７９０３８号を参照のこと。したがって、キャプシドを生成する方法、そのためのコード配列、及びｒＡＡＶウイルスベクターの作製方法が記載されている。例えば、Ｇａｏ ｅｔ
ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、１００（１０）、６０８１－６０８６（２００３）及び米国特許出願公開第２０１３／００４５１８６Ａ１号を参照のこと。
「ＡＡＶ９中間体」または「ＡＡＶ９ベクター中間体」という用語は、そこにパッケージングされた所望のゲノム配列を欠いているアセンブルされたｒＡＡＶキャプシドを指す。これらはまた、「空の」キャプシドと呼ばれてもよい。そのようなキャプシドは、発現カセットの検出可能なゲノム配列を含まない場合もあるし、または遺伝子産物の発現を達成するのに不十分な部分的にパッケージされたゲノム配列のみを含む場合もある。これらの空のキャプシドは目的の遺伝子を宿主細胞に移入させるようには機能しない。
用語「ａ」または「ａｎ」は、１つ以上を指す。したがって、「ａ」（または「ａｎ」）、「１つ以上」、及び「少なくとも１つ」という用語は、本明細書では交換可能に使用される。
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、排他的ではなく包括的に解釈されるべきである。「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ）」、「からなっている（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」及びその変形の用語は、包括的ではなく、排他的に解釈されるべきである。本明細書の様々な実施形態は、「含む」という言葉を使用して提示されるが、他の状況下では、関連する実施形態はまた、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」または「本質的にからなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｃｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という言葉を使用して解釈及び記載されるものとする。
「約」という用語は、他に特定されない限り、±１０％以内の変動を包含する。
本明細書中で他に定義されていない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、当業者によって及び刊行されたテキスト（本出願で用いられる用語の多くに対して当業者を一般的に導く）を参照して一般に理解されるのと同じ意味を有する。
ＡＡＶ９．ＣＢ．ｈＩＤＳベクターゲノムの概略図である。ＩＤＳ発現カセットは、逆方向末端反復（ＩＴＲ）によって隣接され、発現は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサー及びニワトリベータアクチンプロモーター（ＣＢ７）のハイブリッドによって駆動される。導入遺伝子は、ニワトリベータアクチンイントロン及びウサギベータグロビンポリアデニル化（ポリＡ）シグナルを含む。 図２Ａ～２Ｃは、ＩＴベクター処理後のＭＰＳ ＩＩマウスのＣＮＳ及び血清におけるＩＤＳ発現を提供する。ＭＰＳ ＩＩマウスは、以下：３×１０８ＧＣ（低）、３×１０９ＧＣ（中）または３×１０１０ＧＣ（高）の３つの用量のうちの１つでのＡＡＶ９．ＣＢ．ｈＩＤＳのＩＣＶ注射を行って２～３月齢で処置した。注射の３週間後に動物を屠殺した。ＣＳＦ（図２Ａ）全脳ホモジネート（図２Ｂ）及び血清（図２Ｃ）中でＩＤＳ活性を測定した。野生型及び未処置のＭＰＳ ＩＩマウスを対照として使用した。 ＡＡＶ９．ＣＢ．ｈＩＤＳを投与したＭＰＳ ＩＩマウスにおけるベクターＤＮＡの生体内分布を提供する。ＭＰＳ ＩＩマウスを、３×１０１０ＧＣのＡＡＶ９ベクターのＩＣＶ注射で処置した。注射の３週間後、動物を屠殺し、ベクターゲノムをＴａｑｍａｎ ＰＣＲによって組織ＤＮＡ中で定量した。 図４Ａ～図４Ｄは、ＭＰＳ ＩＩマウスにおけるＩＴベクター送達後の末梢ＧＡＧの是正を示す。ＭＰＳ ＩＩマウスを、以下の３つの用量：３×１０８ＧＣ（低）、３×１０９ＧＣ（中）または３×１０１０ＧＣ（高）のうちの１つでのＡＡＶ９．ＣＢ．ｈＩＤＳのＩＣＶ注射により、２～３ヶ月齢で処置した。注射後３ヵ月後に動物を屠殺した。肝臓（図４Ａ）及び心臓（図４Ｂ）においてヘキソサミニダーゼ活性を測定した。蓄積の是正は、肝臓では全ての用量、並びに心臓では、中用量及び高用量で見られた。肝臓（図４Ｃ）及び心臓（図４Ｄ）においてＧＡＧ含量を測定した。野生型及び未処置のＭＰＳ ＩＩマウスを対照として使用した。＊ｐ＜０．０５、一元配置ＡＮＯＶＡ、続いてダネット検定。 図５Ａ～５Ｌは、ＭＰＳ ＩＩマウスにおける脳蓄積病変の用量依存的解決を示す。ＭＰＳ ＩＩマウスを、以下：３×１０８ＧＣ（低）、３×１０９ＧＣ（中）または３×１０１０ＧＣ（高）のうちの３つの用量のうちの１つでのＡＡＶ９．ＣＢ．ｈＩＤＳのＩＣＶ注射により、２～３ヶ月齢で処置した。注射の３ヶ月後に動物を屠殺し、脳を、リソソーム膜タンパク質ＬＩＭＰ２及びガングリオシドＧＭ３について染色した。ＧＭ３（図５Ａ、図５Ｃ、図５Ｅ、図５Ｇ及び図５Ｉ）及びＬＩＭＰ２（図５Ｂ、図５Ｄ、図５Ｆ、図５Ｈ及び図５Ｊ）について陽性に染色された細胞を、各動物の４つの皮質脳切片中において盲検のレビューアによって定量した。代表的な皮質脳切片が示されている（ＧＭ３、図５Ｋ；ＬＩＭＰ２、図５Ｌ）。野生型及び未処置のＭＰＳ ＩＩマウスを対照として使用した。＊ｐ＜０．０５、一元配置ＡＮＯＶＡ、続いてダネット検定。 図６Ａ～６Ｃは、ベクター処理されたＭＰＳ ＩＩマウスにおける物体の識別の改善を示す。未処置のＭＰＳ ＩＩマウス及びＷＴ雄性同腹仔は、４～５月齢で行動試験を受けた。ＭＰＳ ＩＩマウスを、以下：３×１０８ＧＣ（低）、３×１０９ＧＣ（中）または３×１０１０ＧＣ（高）の３つの用量のうちの１つでのＡＡＶ９．ＣＢ．ｈＩＤＳのＩＣＶ注射を行って２～３月齢で処置した。注射２ヵ月後に動物は、行動試験を受けた。図６Ａは、Ｙ迷路の挙動を示し、図６Ｂは、文脈恐怖条件付けを示し、盲検のレビューアにより注射の２ヶ月後に評価した。「Ｐｒｅ」は、信号なしの１．５ｍＡフット・ショックを受けてから２４時間後に囲いに再暴露されたときのフリージング時間を示した。＊ｐ＜０．０５、二元配置ＡＮＯＶＡ、続いてシダックの多重比較検定。図６Ｃは、長期記憶を評価するために使用される、新規物体認識タスクにおける新規物体または慣れた物体の探索に費やされた時間のパーセンテージを示す。野生型及び未処置のＭＰＳ ＩＩマウスを対照として使用した。＊ｐ＜０．０５、多重比較のためのボンフェローニ補正によるｔ検定。 図７Ａ～７Ｂは、ＩＴ ＡＡＶ９で処置したＭＰＳ Ｉマウスにおける酵素発現及び脳蓄積病変の是正の比較を示す。ＭＰＳ Ｉマウスを、以下：３×１０８ＧＣ（低）、３×１０９ＧＣ（中）または３×１０１０ＧＣ（高）の３つの用量のうちの１つでのＡＡＶ９．ＣＢ．ｈＩＤＵＡのＩＣＶ注射を行って２～３月齢で処置した。ベクター注射３週間後に動物の１つのコホートを屠殺し、脳をＩＤＵＡ活性の測定のために採取した。これを図７Ａに示す。図７Ｂは、注射の３ヶ月後に動物の第２コホートを屠殺し、リソソーム膜タンパク質ＬＩＭＰ２について脳を染色したことを示す。ＬＩＭＰ２について陽性に染色された細胞を、４つの皮質脳切片中の盲検レビューアによって定量化した。野生型及び未処置のＭＰＳ ＩＩマウスを対照として使用した。＊ｐ＜０．０５、一元配置ＡＮＯＶＡ、続いてダネット検定。 ＩＣＶ ＡＡＶ９．ＣＢ．ｈＩＤＳで処置したＭＰＳ ＩＩマウスにおけるヒトＩＤＳに対する抗体応答を示す。ＭＰＳ ＩＩマウスを、以下：３×１０８ＧＣ（低）、３×１０９ＧＣ（中）または３×１０１０ＧＣ（高）の３つの用量のうちの１つでのＡＡＶ９．ＣＢ．ｈＩＤＳのＩＣＶ注射を行って２～３月齢で処置した。ベクター投与後２１日目または９０日目に屠殺したマウスから剖検で血清を採取した。ヒトＩＤＳに対する抗体を、間接ＥＬＩＳＡによって評価した。破線は、未処置動物由来のナイーブ血清中の平均力価より２ＳＤ高いことを示す。ほとんどの動物には（ナイーブ血清のバックグラウンドレベルで）検出可能な抗体はなかった。 図９Ａ～９Ｄは、ＭＰＳ ＩＩマウスにおける正常なオープンフィールド活動及びＹ迷路の能力を示す。未処置のＭＰＳ ＩＩマウス及びＷＴ雄性同腹仔は、４～５月齢で行動試験を受けた。オープンフィールド活動は、水平活動（図９Ａ）についてのＸＹ軸ビームブレイク、垂直活動に対するＺ軸ビームブレイク（図９Ｂ）、及びセンター活動に対するセンタービームブレイクのパーセント（図９Ｃ）によって測定した。全アームエントリー（図９Ｄ）は、８分間のＹ迷路試験セッション中に記録した。 図１０Ａ～図１０Ｂは、製造プロセスの流れ図を示す。 同軸挿入方法（２８）のための任意選択の導入針を含む、薬学的組成物の大槽内送達のための装置（１０）の画像であり、これには、１０ｃｃのベクターシリンジ（１２）、１０ｃｃのプレフィルドフラッシュシリンジ（１４）、Ｔコネクタ延長セット（チューブ（２０）、チューブ（２２）及びコネクタ（２４）の端部のクリップを含む）、２２Ｇ×５インチの脊髄針（２６）及び任意の１８Ｇ×３．５インチの導入器針（２８）を備える。また、スイベルオスルアーロック（１６）を備えた４方向ストップコックも示されている。 図１２Ａ～１２Ｉは、ＩＣＶ ＡＡＶ９で処置したイヌにおける脳炎及び導入遺伝子特異的Ｔ細胞応答を示す。１歳齢のＭＰＳ Ｉイヌを、ＧＦＰを発現するＡＡＶ９ベクターの単一のＩＣＶまたはＩＣ注射で処置した。注射の１２日後に死亡したＩ－５６７を除いて、注射の１４日後に全ての動物を屠殺した。脳を冠状切片に分け、ＩＣＶ処置動物の注射部位付近の肉眼的損傷（矢頭）を明らかにした（図１２Ａ～１２Ｆ）。肉眼的病変を取り囲む脳領域からの組織切片を、ヘマトキシリン及びエオシンで染色した（図１２Ｇ及び１２Ｈ）。元の倍率＝４×（左パネル）、及び２０×（右パネル）。剖検時にＩＣＶ処理した１匹のイヌ（Ｉ－５６５）から末梢血単核細胞を採取し、インターフェロン－γＥＬＩＳＰＯＴにより、ＡＡＶ９キャプシド及びヒトＩＤＵＡタンパク質に対するＴ細胞応答を測定した（図１２Ｉ）。ＧＦＰ導入遺伝子産物に対するＴ細胞応答は、完全なＧＦＰ配列をカバーする重複する１５アミノ酸ペプチドの単一プールを用いて測定した。ＡＡＶ９キャプシドタンパク質を含むペプチドを、３つのプールに分けた（プールＡ～Ｃと呼ぶ）。＊＝陽性応答、＞３倍のバックグラウンド（刺激されていない細胞）及び百万細胞あたり５５スポット超と定義される。フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）及びイオノマイシンとホルボール１２－ミリステート１３－アセテート（ＰＭＡ）は、Ｔ細胞活性化の陽性対照として役立った。 ＩＣＶまたはＩＣ ＡＡＶ９で処置したイヌにおけるベクターの生体内分布を示す棒グラフである。注射から１２日後に剖検した動物Ｉ－５６７を除いて、イヌを、ＧＦＰを発現するＡＡＶ９ベクターの単一のＩＣＶまたはＩＣ注射の１４日後に屠殺した。ベクターゲノムは、定量的ＰＣＲによって組織試料中で検出された。値は、１個の二倍体細胞あたりのベクターゲノムコピー（ＧＣ／二倍体ゲノム）として表される。海馬または大脳皮質から採取した脳試料は、ＩＣＶ処置イヌに関して注射半球または未注射半球として示す；ＩＣ処理動物の場合、これらはそれぞれ右半球及び左半球である。動物Ｉ－５６７の注射した大脳半球からのＰＣＲのためには試料を採取しなかった。 図１４Ａ～図１４Ｈは、ＩＣＶまたはＩＣ ＡＡＶ９で処置したイヌの脳及び脊髄におけるＧＦＰ発現を示す。ＧＦＰ発現は、ＧＦＰを発現するＡＡＶ９ベクターのＩＣＶまたはＩＣ注射で処置したイヌから収集した脳及び脊髄試料の直接蛍光顕微鏡検査によって評価した。前頭皮質の試料について、ならびに頚部、胸部、及び腰部レベルで収集された脊髄の前角からの代表的な切片が示されている。もとの倍率は１０×である。 図１５Ａ～１５Ｑは、リソソーム酵素β－グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）を発現するＩＣＶ ＡＡＶ９で処理したＭＰＳ ＶＩＩイヌにおける安定した導入遺伝子発現及び脳炎の非存在を示す。ＧＵＳＢ（ＭＰＳ ＶＩＩのモデル）の遺伝的欠損を有する６週齢のイヌを、ＧＵＳＢを発現するＡＡＶ９ベクターの単一のＩＣＶ注射で処置した。ＧＵＳＢ酵素活性は、注射時及び注射後７日目及び２１日目に採取したＣＳＦ試料で測定した（図１５Ａ）。イヌは、注射の３週間後に屠殺した。注射部位を取り囲む脳領域の肉眼的検査及び顕微鏡的評価を行った（図１５Ｂ～１５Ｄ）。元の倍率＝４×（中央のパネル）、及び１０×（右側のパネル）。ＧＵＳＢ活性は、活性ＧＵＳＢによって切断された場合に赤色産物を産生する基質を用いて脳及び脊髄切片において検出された（図１５Ｅ～１５Ｎ）。頚部、胸部、及び腰部のレベルで収集された大脳皮質、小脳、及び脊髄の前角の試料についての代表的な切片が示されている。元の倍率＝４×（皮質及び小脳）及び１０×（脊髄）。未処置のＭＰＳ ＶＩＩイヌ、正常イヌ、及びＩＣＶ ＡＡＶ９で処置したＭＰＳ ＶＩＩイヌから採取した大脳皮質の切片を、病理学的にＭＰＳ ＶＩＩイヌの脳に蓄積するガングリオシドＧＭ３について染色した（図１５Ｏ～図１５Ｑ）。元の倍率＝４×である。 図１６Ａ～１６Ｂは、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）における腰髄くも膜下腔内注射後の造影剤の分布を示す。成体のカニクイザルは、５ｍＬのＩｏｈｅｘｏｌ １８０で希釈したＡＡＶ９ベクターの腰椎穿刺によるくも膜下腔内注射を受けた。脊髄に沿った造影剤の分布を、蛍光透視法で評価した。胸部及び頸部領域の代表的な画像を示す。造影料（矢頭）は、全ての動物において注射の１０分以内に脊髄の全長に沿って見えた。 くも膜下腔内ＡＡＶ９で処置したＮＨＰにおけるベクターの生体内分布を示す棒グラフである。ＮＨＰを、５ｍＬのイオヘキソール１８０で希釈したＡＡＶ９ベクターの腰椎穿刺によるくも膜下腔内注射の１４日後に屠殺した。２匹の動物を、注射後１０分間、トレンデレンブルグ位に置いた。ベクターゲノムは、定量的ＰＣＲによって組織試料中で検出された。値は、１個の二倍体細胞あたりのベクターゲノムコピー（ＧＣ／二倍体ゲノム）として表される。 図１８Ａ～１８Ｈは、くも膜下腔内ＡＡＶ９で処置したＮＨＰの脳及び脊髄におけるＧＦＰ発現を示す。ＧＦＰ発現は、ＡＡＶ９ベクターのくも膜下腔内注射で処置したＮＨＰから採取した脳及び脊髄試料の直接蛍光顕微鏡検査によって評価した。このベクターは、腰椎穿刺によって投与された。２匹の動物を、注射後１０分間、トレンデレンブルグ位に置いた。前頭皮質の試料について、ならびに頚部、胸部、及び腰部レベルで収集された脊髄の前角からの代表的な切片が示されている。いくつかのＮＨＰ組織に自己蛍光物質が存在するため、赤血球画像を捕捉して、自家蛍光とＧＦＰシグナルとを区別した。自己蛍光画像をマゼンタの上に重ねる。元の倍率＝４×（皮質）、及び１０×（脊髄）である。 図１９Ａ～図１９Ｂは、ＭＰＳＩ中のＣＳＦスペルミンの上昇を示す。ＭＰＳ Ｉイヌ（ｎ＝１５）及び正常対照（ｎ＝１５）由来のＣＳＦ試料について、ハイスループットＬＣ／ＭＳ及びＧＣ／ＭＳ代謝産物スクリーニングを行った。示差的に検出された代謝産物（ＡＮＯＶＡ）のトップ１００のヒートマップが示されている（図１９Ａ）。ＭＰＳ Ｉコホート（２８日齢）の最年少動物は、アスタリスクで示す。スペルミン濃度は、ＭＰＳ Ｉのある６例の乳児及び２例の正常乳児からのＣＳＦ試料における定量的同位体希釈ＬＣ／ＭＳアッセイによって測定した（図１９Ｂ）。 図２０Ａ～２０Ｊは、ＭＰＳ Ｉニューロンにおけるスペルミン依存性の異常な神経突起伸長を示す。Ｅ１８野生型またはＭＰＳ Ｉマウス胚から採取した皮質ニューロンを、プレートした２４時間後にスペルミン（５０ｎｇ／ｍＬ）またはスペルミンシンターゼ阻害剤ＡＰＣＨＡで処理した。プレートした９６時間後に位相差画像を取得した（図２０Ａ～２０Ｄ）。盲検のレビューアにより、処置条件ごとに重複培養物からの４５～６５個のランダムに選択されたニューロンについて、神経突起の数、長さ及び分岐を定量した（図２０Ｅ及び２０Ｈ、２０Ｇ及び２０Ｊ、ならびに２０Ｆ及び２０Ｉ）。＊＊＊ｐ＜０．０００１（ＡＮＯＶＡ、続いてダネット検定）。 図２１Ａ～図２１Ｋは、遺伝子療法後のＭＰＳ ＩイヌにおけるＣＳＦスペルミンレベル及び脳ＧＡＰ４３発現の正常化を示す。１ケ月齢のイヌＩＤＵＡを発現するＡＡＶ９ベクターのくも膜下腔内注射により、５匹のＭＰＳ１イヌを処置した。数匹のＭＰＳ ＩイヌでＩＤＵＡに誘発される抗体応答を防止するために、イヌ（Ｉ－５４９、Ｉ－５５２）のうち２匹を出生後１日で、ＩＤＮＡに対して、肝臓特異的遺伝子治療によって寛容化した。くも膜下腔内ベクター注射から６ヶ月後、ＩＤＵＡ活性を脳組織で測定した（図２１Ａ）。脳蓄積病変を、リソソーム膜タンパク質ＬＩＭＰ２を染色することによって評価した（図２１Ｂ～２１Ｈ）。ＧＡＰ４３は、ウエスタンブロットにより皮質脳試料で測定し（図２１Ｉ）、デンシトメトリーによってβ－アクチンに対して定量した（図２１Ｊ）。同位体希釈ＬＣ／ＭＳによる屠殺時にＣＳＦスペルミンを測定した（図２１Ｋ）。未処置のＭＰＳ１イヌ（ｎ＝３）及び正常イヌ（ｎ＝２）が対照として役立った。＊ｐ＜０．０５（クラスカル・ウォリス検定、続いてダン検定）。 図２２Ａ～図２２Ｂは、ＭＰＳ ＩにおけるＣＮＳ指向性遺伝子治療の評価のためのＣＳＦバイオマーカーとしてのスペルミンの使用を例示する。出生時にヒトＩＤＵＡに寛容化された６匹のＭＰＳ Ｉイヌを、１か月齢で、ヒトＩＤＵＡを発現するくも膜下腔内ＡＡＶ９で処理した（１０１２ＧＣ／ｋｇ、ｎ＝２，１０１１ＧＣ／ｋｇ、ｎ＝２、１０１０ＧＣ／ｋｇ、ｎ＝２）。ＣＳＦスペルミンレベルを、処置の６ヵ月後に測定した（図２２Ａ）。３匹のＭＰＳ Ｉネコを、ネコＩＤＵＡを発現するくも膜下腔内ＡＡＶ９（１０１２ＧＣ／ｋｇ）で処置した。ＣＳＦスペルミンを、処理後６ヶ月定量した（図２２Ｂ）。未処置のＭＰＳ１イヌ（ｎ＝３）及び正常イヌ（ｎ＝２）が対照として役立った。 ランダムフォレスト分析によって同定された代謝産物の平均減少精度を示す。 ＭＰＳ Ｉイヌ脳試料におけるポリアミン合成経路における酵素の発現を示す。 ＭＰＳ ＶＩＩイヌＣＳＦにおけるスペルミン濃度を示す。 図２６Ａ～２６Ｃは、ＷＴニューロン増殖に対するＡＰＣＨＡ処置の影響がないことを示す。 種々の用量（３ｅ８、３×１０８ＧＣ；３ｅ９、３×１０９ＧＣ；３ｅ１０、３×１０１０ＧＣ）を用いてＩＣＶ ＡＡＶ９．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＩＤＳ．ｒＢＧで処理したＭＰＳ ＩＩマウス（ＩＤＳγ／－）における、ＭＰＳ ＩＩ関連の病理所見の用量依存性の減少を示す。累積病理学スコアを評価し、ｙ軸にプロットした。ヘテロ接合性マウス（ＩＤＳγ／＋）を対照として用いた。結果によって、ＩＣＶ ＡＡＶ９．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＩＤＳ．ｒＢＧで処置したＭＰＳ ＩＩマウスにおけるＭＰＳ ＩＩ関連病理所見の用量依存的な減少が示された。 実施例９に記載のアカゲザルにおけるＣＳＦ髄液細胞増加症を示す。様々な日（ｘ軸、０日目、７日目、１４日目、２１日目、３０日目、４５日目、６０日目及び９０日目）に収集したＣＳＦ試料中の白血球（白血球、ｙ軸）をカウントした。ひし形は、ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＩＤＳで処理していないＲＡ ２１９８のデータに相当する。四角、三角形、及びｘは、それぞれ５×１０１３ＧＣのＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＩＤＳで処置した、ＲＡ１３９９、ＲＡ２２０３及びＲＡ２２３１からのデータに相当する。＊、丸及び＋はそれぞれ、１．７×１０１３ＧＣのＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＩＤＳで処置したＲＡ １３５８、ＲＡ １３５６及びＲＡ ２１９７からのデータに相当する。 実施例９に記載のように、６０日目にＮＨＰの血清中に発生した抗ｈＩＤＳ抗体を測定したＥＬＩＳＡ結果を示す。希釈をｘ軸としてプロットし、一方で、光学密度（ＯＤ）をｙ軸としてプロットした。ひし形は、ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＩＤＳでの処置なしのＲＡ２１９８からのデータに相当する。四角は、１．７×１０１３ＧＣのＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＩＤＳで処置されたＲＡ２１９７からのデータに相当し、一方、三角形及びｘは、それぞれ、５×１０１３ＧＣのＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＩＤＳで処置されたＲＡ ２２０３及びＲＡ ２２３１のデータに相当する。
５．発明の詳細な説明
ＭＰＳ ＩＩと診断された患者（ヒト対象）のＣＮＳにｈＩＤＳ遺伝子を送達するための複製欠損ＡＡＶの使用が提供される。ｈＩＤＳ遺伝子を送達するために使用される組換えＡＡＶ（「ｒＡＡＶ」）ベクター（「ｒＡＡＶ．ｈＩＤＳ」）は、ＣＮＳ（例えば、ＡＡＶ９キャプシドを有するｒＡＡＶ）に対する向性を有し、ｈＩＤＳ導入遺伝子は、特定の発現制御エレメント、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサーとニワトリベータアクチンプロモーター（ＣＢ７）とのハイブリッドによって制御される。特定の実施形態では、生理学的に適合する水性緩衝液、サーファクタント及び任意の賦形剤を含む製剤緩衝液中のｒＡＡＶ．ｈＩＤＳベクターの懸濁液を含む、くも膜下腔内投与、大槽内投与及び全身投与に適した薬学的組成物が提供される。ｒＡＡＶ懸濁液は、さらに以下によって特徴付けられる：
（ｉ）ｒＡＡＶゲノムコピー（ＧＣ）力価が少なくとも１．０×１０１３ＧＣ／ｍＬである；
（ｉｉ）ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析により測定した場合、ｒＡＡＶの空粒子／全粒子比は、０．０１～０．０５（空のキャプシドが９５％～９９％含まれない）である（実施例５Ｄを参照のこと）；他の実施形態では、本明細書で提供されるｒＡＡＶ９．ｈＩＤＳは、空のキャプシドを少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％含まないか；及び／または
（ｉｉｉ）ｒＡＡＶ懸濁液の少なくとも約４×１０８ＧＣ／ｇ脳質量～約４×１０１１ＧＣ／ｇ脳質量の用量が力価を有する。
力価は、インビトロ細胞培養アッセイ、例えば、実施例５Ｇに記載のインビトロ力価アッセイで測定してもよく、ここで、ＨＥＫ２９３細胞は、１細胞あたり既知の多重度のｒＡＡＶＧＣで形質導入され、上清は、形質導入７２時間後にＩＤＳ活性についてアッセイされる。例えば、蛍光発生基質４－メチルウンベリフェリルアルファ－Ｌ－イズロニド－２硫酸を切断するｈＩＤＳの能力を測定する４ＭＵ－イズロニド酵素アッセイを使用して、ｈＩＤＳの機能（活性）及び／または力価を適切なインビトロアッセイで測定してもよい。記載された条件下で測定した比活性は、＞７，５００ｐｍｏｌ／分／μｇである。ｗｗｗ．ＲｎＤＳｙｓｔｅｍｓ．ｃｏｍのＡｃｔｉｖｉｔｙ Ａｓｓａｙ Ｐｒｏｔｏｃｏｌを参照のこと。酵素活性を測定する他の適切な方法が記載されている［例えば、Ｋａｋｋｉｓ、Ｅ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．（１９９４）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｕｒｉｆ．５：２２５－２３２；Ｒｏｍｅ、Ｌ．Ｈ．、ｅｔ ａｌ（１９７９）．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７６：２３３１－２３３４を参照のこと］、これには、本明細書に記載の方法も含む。活性はまた、記載された方法、例えば、Ｅ．
Ｏｕｓｓｏｒｅｎ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｍｅｔａｂ．２０１３ Ａｕｇ；１０９（４）：３７７－８１．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｙｍｇｍｅ．２０１３．０５．０１６．Ｅｐｕｂ ２０１３ Ｊｕｎ ４を用いて評価してもよい。処置の候補となる患者は、ＭＰＳ ＩＩ（ハンター症候群）及び／またはＭＰＳ ＩＩに関連する症状を有する小児及び成人患者である。
指定された年齢群のＭＰＳ ＩＩ患者には、以下の治療上有効なｒＡＡＶ９．ｈＩＤＳのフラット用量を投与してもよい：
・新生児：約３．８×１０１２～約１．９×１０１４ＧＣ；
・３～９ヶ月：約６×１０１２～約３×１０１４ＧＣ；
・９～３６ヶ月：約１０１３～約５×１０１４ＧＣ；
・３～１２年：約１．２×１０１３～約６×１０１４ＧＣ；
・１２＋歳：約１．４×１０１３～約７．０×１０１４ＧＣ；
・１８＋歳（成人）：約１．４×１０１３～約７．０×１０１４ＧＣ。
いくつかの実施形態において、１２＋歳の年齢のＭＰＳ ＩＩ患者（１８歳＋を含む）に投与される用量は、１．４×１０１３のゲノムコピー（ＧＣ）（１．１×１０１０ＧＣ／ｇ脳質量）である。いくつかの実施形態では、１２＋歳の年齢のＭＰＳ ＩＩ患者（１８＋歳を含む）に投与される用量は、７×１０１３ＧＣ（５．６×１０１０ＧＣ／ｇ脳質量）である。なおさらなる実施形態において、ＭＰＳ ＩＩ患者に投与される用量は、少なくとも約４×１０８ＧＣ／ｇ脳質量～約４×１０１１ＧＣ／ｇ脳質量である。特定の実施形態において、ＭＰＳ ＩＩ新生児に投与される用量は、約１．４×１０１１～約１．４×１０１４ＧＣの範囲であり；乳児３～９ヶ月に投与される用量は、約２．４×１０１１～約２．４×１０１４ＧＣの範囲であり；ＭＰＳ ＩＩ小児９～３６ヶ月に投与される用量は：約４×１０１１～約４×１０１４ＧＣの範囲であり；３～１２歳のＭＰＳ ＩＩ小児に投与される用量は：約４．８×１０１１～約４．８×１０１４ＧＣの範囲であり；小児及び１２＋歳の成人に投与される用量は、約５．６×１０１１～約５．６×１０１４ＧＣの範囲である。
この処置の目的は、疾患を処置するための実行可能なアプローチとして、ｒＡＡＶに基づくＣＮＳ指向性遺伝子治療を介して、患者の欠損イズロネート－２－スルファターゼを機能的に置き換えることである。本明細書中に記載されるｒＡＡＶベクターから発現される場合、ＣＳＦ、血清、ニューロン、または他の組織において検出される少なくとも約２％の発現レベルは、治療効果を提供し得る。しかし、より高い発現レベルが達成される場合がある。そのような発現レベルは、正常な機能的ヒトＩＤＳレベルの２％～約１００％である場合がある。特定の実施形態では、正常より高い発現レベルが、ＣＳＦ、血清、または他の組織において検出され得る。
治療の有効性は、（ａ）ＭＰＳ ＩＩ（ハンター症候群）患者の神経認知低下の予防；及び（ｂ）疾患のバイオマーカー、例えば、ＣＳＦ、血清及び／もしくは尿中、ならびに／または肝臓及び脾臓容積中のＧＡＧレベル及び／または酵素活性の減少を評価することによって測定され得る。乳児の神経認知は、Ｂａｙｌｅｙ Ｓｃａｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｆａｎｔ ａｎｄ Ｔｏｄｄｌｅｒ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、第３版、ＢＳＩＤ－ＩＩＩによって測定され得る。神経認知及び適応行動評価（例えば、それぞれ、Ｂａｙｌｅｙ Ｓｃａｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｆａｎｔ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ及びＶｉｎｅｌａｎｄ Ａｄａｐｔｉｖｅ Ｂｅｈａｖｉｏｒ Ｓｃａｌｅｓを使用して）を行ってもよい。
ｈＩＤＳの全身送達を伴うＣＮＳへのｒＡＡＶ．ｈＩＤＳの遺伝子治療送達の組み合わせは、特定の実施形態によって包含される。全身送達は、ＥＲＴ（例えば、Ｅｌａｐｒａｓｅ（登録商標）を用いて）、または肝指向性を有するｒＡＡＶ．ｈＩＤＳ（例えば、Ａ
ＡＶ８キャプシドを保有するｒＡＡＶ．ｈＩＤＳ）を用いるさらなる遺伝子治療を用いて達成してもよい。
特定の実施形態はまた、ｒＡＡＶ．ｈＩＤＳ薬学的組成物（下記の実施例４）の製造及び特徴付けも提供する。
５．１．ＡＡＶ．ｈＩＤＳ構築物及び製剤
５．１．１．発現カセット
配列番号１（ＣＣＤＳ１４６８５．１）のヌクレオチド配列を有することを特徴とするｈＩＤＳ遺伝子を含む発現カセットを含むＡＡＶベクターが提供される。この配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ ＮＰ０００１９３．１をコードする公表された遺伝子配列であり、また配列番号２としても本明細書中に含まれる。別の実施形態では、この発現カセットは、配列番号１と少なくとも約７５％同一であるヌクレオチド配列を有することによって特徴付けられるｈＩＤＳ遺伝子を含み、かつ機能的なヒトイズロネート－２－スルファターゼをコードする。別の実施形態では、この発現カセットは、配列番号１と少なくとも約８０％同一であるヌクレオチド配列を有することによって特徴付られるｈＩＤＳ遺伝子を含み、かつ機能性ヒトイズロネート－２－スルファターゼをコードする。別の実施形態において、配列は、配列番号１と少なくとも約８５％同一であるか、または配列番号１と少なくとも約９０％同一であり、かつ機能的ヒトイズロネート－２－スルファターゼをコードする。一実施形態では、配列は、配列番号１と少なくとも約９５％同一であるか、配列番号１と少なくとも約９７％同一であるか、または配列番号１と少なくとも約９９％同一であり、機能的ヒトイズロネート－２－スルファターゼをコードする。一実施形態では、この配列は、配列番号１と少なくとも約７７％同一である。別の実施形態では、発現カセットは、配列番号８のｎｔ１１７７～ｎｔ２８２９のｈＩＤＳコード配列を含み、配列番号１１のｎｔ１９３７～ｎｔ３５８９としても示される。別の実施形態では、発現カセットは、配列番号８のｎｔ１１７７～ｎｔ２８２９（配列番号１１のｎｔ１９３７～ｎｔ３５８９としても示される）と少なくとも約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９７％、約９８％または約９９％同一のｈＩＤＳコード配列を含む。
別の実施形態では、機能的ヒトイズロネート－２－スルファターゼは、合成アミノ酸配列を含んでもよく、ここでは、リーダー（シグナル）ペプチドに対応するプレプロタンパク質、配列番号２の最初の２５アミノ酸の全部または一部が、異種リーダーペプチドで置換されている。このリーダーペプチド、例えば、インターロイキン－２（ＩＬ－２）またはオンコスタチン由来のリーダーペプチドなどは、循環系へのその分泌経路を通じて細胞外への酵素の輸送を改善し得る。適切なリーダーペプチドは、好ましくは、必ずしもヒト由来である必要はない。適切なリーダーペプチドは、本明細書中に参考として援用されるｐｒｏｌｉｎｅ．ｂｉｃ．ｎｕｓ．ｅｄｕ．ｓｇ／ｓｐｄｂ／ｚｈａｎｇ２７０．ｈｔｍから選択されてもよく、または選択されたタンパク質中でリーダー（シグナル）ペプチドを決定するための様々なコンピュータプログラムを用いて、決定されてもよい。限定されないが、このような配列は、長さが約１５～約５０アミノ酸、もしくは長さが約１９～約２８アミノ酸であってもよく、または必要に応じてより大きくても小さくてもよい。さらに、少なくとも１つのインビトロアッセイが、ＩＤＳ酵素の酵素活性を評価するために有用であると記載されている［例えば、Ｄｅａｎ ｅｔ ａｌ．、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００６ Ａｐｒ；５２（４）：６４３－６４９を参照のこと］。プレプロタンパク質の全部または一部（配列番号２のアミノ酸１～２５）の除去に加えて、プロタンパク質の全部または一部（配列番号２のアミノ酸２６～３３）を除去してもよく、必要に応じて異種の成熟ペプチドで置換されていてもよい。
別の実施形態では、配列番号５のｎｔ３４２３～ｎｔ４５４７のヌクレオチド配列を有することを特徴とするＳＵＭＦ１遺伝子をさらに含む発現カセットを含むＡＡＶベクター
（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＢ４４８７３７．１のＣＤＳ）が提供される。この配列は、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿８７７４３７．２をコードする公表された遺伝子配列であり、これもまた配列番号７及び配列番号１０として本明細書中に包含される。いくつかの研究によって、ＩＤＳなどのスルファターゼの発現が、ＩＤＳの翻訳後修飾に必要とされるスルファターゼ改変因子ＳＵＭＦ１の利用可能性によって制限され得ることが示唆された（Ｆｒａｌｄｉ ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊ、２００７：４０３：３０５－３１２）。別の実施形態では、発現カセットは、配列番号５のｎｔ３４２３～ｎｔ４５４７と少なくとも約８０％同一であるヌクレオチド配列を有することを特徴とするＳＵＭＦ１遺伝子を含み、かつ機能的なヒトＳＵＭＦ１をコードする。別の実施形態において、配列は、配列番号５のｎｔ３４２３～ｎｔ４５４７と少なくとも約８５％同一であるか、または配列番号５のｎｔ３４２３～ｎｔ４５４７と少なくとも約９０％同一であり、かつ機能的ヒトＳＵＭＦ１をコードする。一実施形態では、配列は、配列番号５のｎｔ３４２３～ｎｔ４５４７と少なくとも約９５％、約９７％、または約９９％同一であり、かつ機能的なヒトＳＵＭＦ１をコードする。一実施形態では、この配列は、配列番号５のｎｔ３４２３～ｎｔ４５４７と少なくとも約７６．６％同一である。別の実施形態において、発現カセットは、配列番号８のｎｔ３４２３～ｎｔ４５５３のｈＳＵＭＦ１コード配列を含む。別の実施形態において、発現カセットは、配列番号８のｎｔ３４２３～ｎｔ４５５３と少なくとも約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９７％、約９８％または約９９％同一なｈＳＵＭＦ１コード配列を含む。
一実施形態では、ｈＩＤＳコード配列及びｈＳＵＭＦ１コード配列を含む発現カセットを含むＡＡＶベクターが提供される。別の実施形態において、ｈＩＤＳコード配列及びｈＳＵＭＦ１コード配列は、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）によって連結された。さらなる実施形態において、ＩＲＥＳは、配列番号５のｎｔ２８３０～ｎｔ３４２２または配列番号８のｎｔ２８３０～ｎｔ３４２２の配列を有する。別の実施形態において、この発現カセットは、配列番号５のｎｔ１１７７～ｎｔ４５４７、または配列番号８のｎｔ１１７７～ｎｔ４５５３を含み、これは、ｈＩＤＳコード配列、ＩＲＥＳ及びｈＳＵＭＦ１コード配列を含む。
配列に関する同一性または類似性とは、必要に応じて最大パーセントの配列同一性を達成するために配列を整列させギャップを導入した後に、本明細書に提供されるペプチド及びポリペプチド領域と同一である（すなわち、同じ残基）または類似の（すなわち、共通の側鎖特性に基づき同じ群由来のアミノ酸残基である、下を参照のこと）候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして本明細書において定義される。パーセント（％）同一性とは、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列をそれぞれ比較することによって決定される、２つのポリヌクレオチドまたは２つのポリペプチド間の関係の尺度である。一般に、比較される２つの配列は、配列間で最大の相関を与えるように整列される。２つの配列のアライメントを調べ、決定された２つの配列間の正確なアミノ酸またはヌクレオチド対応を与える位置の数を、アライメントの全長で割って１００を掛けて同一性％の数字を得る。この同一性％の数字は、比較される配列の全長にわたって決定され得、これは、同じまたは非常に類似した長さ及び高度に相同的な配列に、またはより短い規定された長さにわたって特に適しており、長さが等しくないか、または相同性のレベルがより低い配列に関してはさらに適している。文献を使用するために利用可能であり、かつ／または、アライメント及びパーセント同一性を実施するために公的にもしくは商業的に利用可能である、多数のアルゴリズム及びそれに基づくコンピュータプログラムがある。アルゴリズムまたはプログラムの選択は、本発明の限定ではない。
例えば、Ｕｎｉｘ上のソフトウェアＣＬＵＳＴＡＬＷを含む適切なアライメントプログラムの例を、次にＢｉｏｅｄｉｔプログラム（Ｈａｌｌ、Ｔ．Ａ．１９９９、ＢｉｏＥｄｉｔ：ａｕｓｅｒ－ｆｒｉｅｎｄｌｙｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓｅｑｕｅｎｃｅａｌｉｇｎ
ｍｅｎｔｅｄｉｔｏｒａｎｄａｎａｌｙｓｉｓｐｒｏｇｒａｍｆｏｒＷｉｎｄｏｗｓ９５／９８／ＮＴ．（Ｗｉｎｄｏｗｓ ９５／９８／ＮＴ．用のユーザフレンドリーな生物学的配列アライメントエディタ及び解析プログラム）、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．４１：９５－９８）；ＥＭＢＬ－ＥＢＩから入手可能なＣｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ（Ｓｉｅｖｅｒｓ、Ｆａｂｉａｎ ｅｔ ａｌ．、「Ｆａｓｔ，ｓｃａｌａｂｌｅ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈ－ｑｕａｌｉｔｙ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ ｕｓｉｎｇ Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ」Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｌｏｇｙ ７．１（２０１１）：５３９ ａｎｄ Ｇｏｕｊｏｎ、Ｍｉｃｋａｅｌ、ｅｔ ａｌ「Ａ ｎｅｗ ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎａｌｙｓｉｓ ｔｏｏｌｓ ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ａｔ ＥＭＢＬ－ＥＢＩ」Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ ３８．ｓｕｐｐｌ ２（２０１０）：Ｗ６９５－Ｗ６９９）；Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ、ｖｅｒｓｉｏｎ ９．１（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ Ｊ．ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１２：３８７－３９５，１９８４、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．，ＵＳＡから入手可能）に組み込んでもよい。プログラムＢＥＳＴＦＩＴ及びＧＡＰは、２つのポリヌクレオチド間の同一性％及び２つのポリペプチド配列間の同一性％を決定するために使用され得る。配列間の同一性及び／または類似性を決定するための他のプログラムとしては、例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢ），Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，ＵＳＡから入手可能で、ＮＣＢＩのホームページ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）からアクセス可能なＢＬＡＳＴファミリーのプログラム、ＧＣＧ配列アライメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）が挙げられる。アミノ酸配列を比較するためにＡＬＩＧＮプログラムを利用する場合、ＰＡＭ１２０重量残基表、ギャップ長ペナルティ１２、及びギャップペナルティ４を用いてもよい；及びＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ Ｗ．Ｒ．及びＬｉｐｍａｎ Ｄ．Ｊ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５：２４４４－２４４８，１９８８、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅの一部として入手可能）を用いてもよい。ＳｅｑＷｅｂ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅへのウェブベースのインターフェース：Ｇａｐプログラム）。
いくつかの実施形態では、カセットは組換えアデノ随伴ウイルスから発現するようにデザインされ、ベクターゲノムはまたＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）も含む。一実施形態では、ｒＡＡＶはシュードタイプであり、すなわち、ＡＡＶキャプシドは、ＩＴＲを提供するＡＡＶとは異なる供給源のＡＡＶ由来である。一実施形態では、ＡＡＶ血清型２のＩＴＲが使用される。しかし、他の適切な供給源からのＩＴＲを選択してもよい。必要に応じて、ＡＡＶは自己相補的ＡＡＶであってもよい。
本明細書に記載の発現カセットは、ＡＡＶ５’逆方向末端反復（ＩＴＲ）及びＡＡＶ３’ＩＴＲを利用した。しかし、これらのエレメントの他の構成も適切である場合がある。ΔＩＴＲと呼ばれる５’ＩＴＲの短縮版が記載されており、ここでは、Ｄ－配列及び末端解離部位（ｔｒｓ）が欠失している。他の実施形態では、全長ＡＡＶ５’及び／または３’ＩＴＲが使用される。シュードタイプＡＡＶが産生される場合、発現中のＩＴＲは、キャプシドのＡＡＶ供給源とは異なる供給源から選択される。例えば、ＡＡＶ２ ＩＴＲは、ＣＮＳまたはＣＮＳ内の組織もしくは細胞を標的とするための特定の効率を有するＡＡＶキャプシドと共に使用するために選択され得る。一実施形態では、ＡＡＶ２由来のＩＴＲ配列またはその欠失バージョン（ΔＩＴＲ）は、便宜のために、及び規制当局の承認を加速するために使用される。しかし、他のＡＡＶ源由来のＩＴＲを選択してもよい。ＩＴＲの供給源がＡＡＶ２に由来し、ＡＡＶキャプシドが別のＡＡＶ供給源に由来する場合、
得られるベクターをシュードタイプと称してもよい。しかし、他のＡＡＶ ＩＴＲの供給源を利用してもよい。
一実施形態では、発現カセットは、脳脊髄液及び脳を含む中枢神経系（ＣＮＳ）における発現及び分泌のためにデザインされる。特に望ましい実施形態では、発現カセットは、ＣＮＳ及び肝臓の両方での発現に有用であり、それによってＭＰＳ ＩＩの全身及びＣＮＳ関連効果の両方の処置が可能になる。例えば、本発明者らは、特定の構成的プロモーター（例えば、ＣＭＶ）が、くも膜下腔内に送達された場合に所望のレベルで発現を駆動せず、それにより準最適なｈＩＤＳ発現レベルを提供することを観察した。しかし、ニワトリベータ－アクチンプロモーターは、くも膜下腔内送達及び全身送達の両方で発現を良好に駆動する。従って、これは特に望ましいプロモーターである。他のプロモーターを選択してもよいが、同じものを含む発現カセットは、ニワトリベータアクチンプロモーターを有するものの利点の全てを有するわけではない。様々なニワトリベータアクチンプロモーターが、単独で、または種々のエンハンサーエレメント（例えば、ＣＢ７は、サイトメガロウイルスエンハンサーエレメントを有するニワトリベータ－アクチンプロモーター、ＣＡＧプロモーターであり、これは、プロモーター、ニワトリベータアクチンの第１エキソン及び第１イントロン、ならびにウサギベータグロビン遺伝子のスプライスアクセプターを含む）、ＣＢｈプロモーターと組み合わせて記載されている［ＳＪ Ｇｒａｙ ｅｔ ａｌ．、Ｈｕ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ、２０１１ Ｓｅｐ；２２（９）：１１４３－１１５３。
組織特異的であるプロモーターの例は、とりわけ、肝臓及び他の組織（ａｌｂｕｍｉｎ，Ｍｉｙａｔａｋｅ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７１：５１２４－３２；Ｂ型肝炎ウイルスコアプロモーター、Ｓａｎｄｉｇ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，３：１００２－９；アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、Ａｒｂｕｔｈｎｏｔ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，７：１５０３－１４）、骨オステオカルシン（Ｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．，２４：１８５－９６）；骨シアロプロテイン（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．，１１：６５４－６４）、リンパ球（ＣＤ２，Ｈａｎｓａｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６１：１０６３－８；免疫グロブリン重鎖；Ｔ細胞受容体鎖）、ニューロン、例えば、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーター（Ａｎｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．，１３：５０３－１５）、ニューロフィラメント軽鎖遺伝子（Ｐｉｃｃｉｏｌｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：５６１１－５）、及びニューロン特異的ｖｇｆ遺伝子（Ｐｉｃｃｉｏｌｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ｎｅｕｒｏｎ，１５：３７３－８４）について周知である。あるいは、調節可能なプロモーターを選択してもよい。例えば、本明細書において参照によって援用される、ＷＯ ２０１１／１２６８０８Ｂ２を参照のこと。
一実施形態では、発現カセットは、１つ以上の発現エンハンサーを含む。一実施形態では、発現カセットは、２つ以上の発現エンハンサーを含む。これらのエンハンサーは同一であっても異なっていてもよい。例えば、エンハンサーは、アルファｍｉｃ／ｂｉｋエンハンサーまたはＣＭＶエンハンサーを含んでもよい。このエンハンサーは、互いに隣接して位置する２つのコピーで存在してもよい。あるいは、エンハンサーの二重コピーは、１つ以上の配列によって分離されてもよい。さらに別の実施形態では、発現カセットはイントロン、例えばニワトリベータ－アクチンイントロン、ヒトβ－グロブリンイントロン、及び／または市販のＰｒｏｍｅｇａ（登録商標）イントロンをさらに含む。他の適切なイントロンとしては、例えば国際公開第２０１１／１２６８０８号パンフレットに記載されているような当該分野で公知のイントロンが挙げられる。
さらに、適切なポリアデニル化シグナルを有する発現カセットが提供される。一実施形態では、ポリＡ配列は、ウサギグロブリンポリＡである。例えば、ＷＯ２０１４／１５１３４１号を参照のこと。あるいは、別のポリＡ、例えばヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリアデニル化配列、ＳＶ４０ポリＡ、ＳＶ５０ポリＡ、または合成ポリＡ。さらに他の従来の調節エレメントは、発現カセットに追加してまたは必要に応じて含まれていてもよい。
例示的なｒＡＡＶ．ｈＩＤＳベクターゲノムは、配列番号３のｎｔ２～ｎｔ３９６７、配列番号５のｎｔ１１～ｎｔ４９６４、配列番号８のｎｔ１１～ｎｔ４９６４、配列番号１１のｎｔ２～ｎｔ３９６７、または配列番号１４のｎｔ２～ｎｔ３９６５に示される。
５．１．２．ｒＡＡＶ．ｈＩＤＳウイルス粒子の産生
一実施形態では、ＡＡＶキャプシドを有し、かつその発現を制御する調節配列の制御下でＡＡＶ逆方向末端反復配列、ヒトイズロネート－２－スルファターゼ（ｈＩＤＳ）遺伝子をその中にパッケージングしている、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子であって、ここで前記ｈＩＤＳ遺伝子が、機能性ヒトイズロネート－２－スルファターゼをコードする、配列番号１（図１）に示される配列またはそれと少なくとも約９５％同一である配列を有する粒子が提供される。一実施形態では、ｈＩＤＳ発現カセットは、ＡＡＶ５’ＩＴＲ及びＡＡＶ３’ＩＴＲに隣接している。別の実施形態では、ＡＡＶは一本鎖ＡＡＶである。
くも膜下腔内及び／または大槽内送達のために、ＡＡＶ９が特に望ましい。必要に応じて、本明細書に記載のｒＡＡＶ９．ｈＩＤＳベクターは、肝臓を特異的に標的とするようにデザインされたベクターと同時投与されてもよい。肝指向性を有する多数のｒＡＡＶベクターのいずれを使用してもよい。ｒＡＡＶのキャプシドの供給源として選択され得るＡＡＶの例としては、例えば、ｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ６４Ｒ１、ＡＡＶｒｈ６４Ｒ２、ｒｈ８が挙げられる［例えば、米国特許出願公開第２００７－００３６７６０－Ａ１号；米国公開特許出願第２００９－０１９７３３８－Ａ１号；欧州特許第１３１０５７１号を参照のこと］。また、ＷＯ２００３／０４２３９７（ＡＡＶ７及び他のシミアンＡＡＶ）、米国特許第７７９０４４９号及び米国特許第７２８２１９９号（ＡＡＶ８）、ＷＯ２００５／０３３３２１及び米国特許第７，９０６，１１１号（ＡＡＶ９）及びＷＯ２００６／１１０６８９］、及びｒｈ１０［ＷＯ２００３／０４２３９７］、ＡＡＶ３Ｂ；ＡＡＶｄｊ［ＵＳ２０１０／００４７１７４］も参照のこと。１つの特に望ましいｒＡＡＶは、ＡＡＶ２／８．ＴＢＧ．ｈＩＤＳ．ｃｏである。
多くの場合、ｒＡＡＶ粒子はＤＮａｓｅ耐性と呼ばれる。しかし、このエンドヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）に加えて、他のエンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼもまた、本明細書に記載の精製ステップにおいて、汚染核酸を除去するために使用されてもよい。そのようなヌクレアーゼは、一本鎖ＤＮＡ及び／または二本鎖ＤＮＡ及びＲＮＡを分解するように選択されてもよい。そのようなステップは、単一のヌクレアーゼ、または異なる標的に向けられたヌクレアーゼの混合物を含んでもよく、そしてエンドヌクレアーゼであってもエキソヌクレアーゼであってもよい。
ＡＡＶに基づくベクターを調製する方法は公知である。例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００７／００３６７６０号（２００７年２月１５日）を参照のこと。ＡＡＶ９のＡＡＶキャプシドの使用は、本明細書に記載の組成物及び方法に特によく適している。ＡＡＶ９の配列及びＡＡＶ９キャプシドに基づくベクターを生成する方法は、米国特許第７，９０６，１１１号；米国特許出願公開第２０１５／０３１５６１２号；ＷＯ２０１２／１１２８３２（これらは参照により本明細書に組み込まれる）に記載される。しかし、他のＡＡＶキャプシドが選択されても、または生成されてもよい
。例えば、ＡＡＶ８の配列及びＡＡＶ８キャプシドに基づくベクターを生成する方法は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，２８２，１９９Ｂ２号、米国特許第７，７９０，４４９号及び米国特許第８，３１８，４８０号に記載されている。多数のそのようなＡＡＶの配列は、上記の米国特許第７，２８２，１９９Ｂ２号、米国特許第７，７９０，４４９号、米国特許第８，３１８，４８０号、及び米国特許第７，９０６，１１１号に示されているか、及び／またはＧｅｎＢａｎｋから入手可能である。任意のＡＡＶキャプシドの配列は、合成的に、または種々の分子生物学及び遺伝子工学技術を用いて容易に生成され得る。適切な製造技術は、当業者に周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ）を参照のこと。あるいは、ペプチド（例えば、ＣＤＲ）をコードするオリゴヌクレオチドまたはペプチド自体は、例えば周知の固相ペプチド合成法（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、（１９６２）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、８５：２１４９；Ｓｔｅｗａｒｔ及びＹｏｕｎｇ、Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｆｒｅｅｍａｎ、Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、１９６９）ｐｐ．２７－６２）によって合成的に生成され得る。これら及び他の適切な製造方法は、当業者の知識の範囲内であり、本発明の限定ではない。
本明細書に記載の組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、公知の技術を用いて作製され得る。例えば、ＷＯ２００３／０４２３９７号；ＷＯ２００５／０３３３２１、ＷＯ２００６／１１０６８９；米国特許第７５８８７７２Ｂ２号を参照のこと。そのような方法は、ＡＡＶキャプシドをコードする核酸配列；機能的ｒｅｐ遺伝子；少なくともＡＡＶ逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）及び導入遺伝子から構成される発現カセット；ＡＡＶキャプシドタンパク質への発現カセットのパッケージングを可能にするのに十分なヘルパー機能を含有する宿主細胞を培養することを包含する。
空の完全な粒子含有量を計算するために、選択された試料（例えば、本明細書の実施例では、ＧＣの数＝粒子の数であるイオジキサノール勾配精製調製物）のＶＰ３バンド容積を、ロードされたＧＣ粒子に対してプロットする。得られた一次方程式（ｙ＝ｍｘ＋ｃ）を用いて、試験品のピークのバンド容積中の粒子の数を計算する。次いで、ロードされた２０μＬあたりの粒子数（ｐｔ）に５０を乗じて粒子（ｐｔ）／ｍＬを得る。Ｐｔ／ｍＬをＧＣ／ｍＬで割って、ゲノムコピーに対する粒子の比（ｐｔ／ＧＣ）を得る。Ｐｔ／ｍＬ－ＧＣ／ｍＬによって、空のｐｔ／ｍＬを得る。空のｐｔ／ｍＬを、ｐｔ／ｍＬで割って×１００し、空の粒子のパーセンテージを得る。
一般に、パッケージされたゲノムを有する空のキャプシド及びＡＡＶベクター粒子についてアッセイするための方法は、当技術分野で公知である。例えば、Ｇｒｉｍｍ ｅｔ ａｌ．、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９９）６：１３２２－１３３０；Ｓｏｍｍｅｒ
ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌｅｃ．Ｔｈｅｒ．（２００３）７：１２２－１２８を参照のこと。変性キャプシドを試験するために、この方法は、処理されたＡＡＶストックを、３つのキャプシドタンパク質を分離し得る任意のゲル、例えば、緩衝液中の３～８％トリス－アセテートを含む勾配ゲルからなるＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供すること、次いで試料材料が分離されるまでゲルを泳動すること、ナイロンまたはニトロセルロース膜、好ましくはナイロン上にゲルをブロットすることを包含する。次いで、抗ＡＡＶキャプシド抗体を、変性キャプシドタンパク質に結合する一次抗体として、好ましくは抗ＡＡＶキャプシドモノクローナル抗体、最も好ましくはＢ１抗ＡＡＶ－２モノクローナル抗体を使用する（Ｗｏｂｕｓ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２０００）７４：９２８１－９２９３）。次いで、二次抗体であって、一次抗体に結合し、かつ一次抗体、より好ましくはそれに共有結合した検出分子を含む抗ＩｇＧ抗体、最も好ましくは西洋ワサビペルオキシダーゼに共有結合したヒツジ抗マウスＩｇＧ抗体との結合を検出するための手段を
含む二次抗体を使用する。結合を検出する方法を使用して、一次抗体と二次抗体との間の結合を半定量的に決定し、これは好ましくは、放射性同位体放射、電磁照射、または比色変化を検出し得る検出方法、最も好ましくは化学発光検出キットである。例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥでは、カラム画分由来の試料を採取し、還元剤（例えばＤＴＴ）を含有するＳＤＳ－ＰＡＧＥローディング緩衝液中で加熱し、キャプシドタンパク質をプレキャスト勾配ポリアクリルアミドゲル（例えばＮｏｖｅｘ）で分離した。銀染色は、ＳｉｌｖｅｒＸｐｒｅｓｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ）を使用して、製造業者の説明書または他の適切な染色方法、すなわちＳＹＰＲＯルビーまたはクーマシー染色により実施してもよい。一実施形態では、カラム画分中のＡＡＶベクターゲノム（ｖｇ）の濃度は、定量的リアルタイムＰＣＲ（Ｑ－ＰＣＲ）によって測定してもよい。試料を希釈し、ＤＮａｓｅ Ｉ（または別の適切なヌクレアーゼ）で消化して、外因性ＤＮＡを除去する。ヌクレアーゼの不活性化の後、プライマー及びプライマー間のＤＮＡ配列に特異的なＴａｑＭａｎ（商標）蛍光発生プローブを使用して、試料をさらに希釈し、増幅する。Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｒｉｓｍ ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ上の各試料について、定義された蛍光レベル（閾値サイクル、Ｃｔ）に達するのに必要なサイクル数を測定する。ＡＡＶベクターに含まれるものと同一の配列を含むプラスミドＤＮＡを使用して、Ｑ－ＰＣＲ反応において標準曲線を生成する。試料から得られたサイクル閾値（Ｃｔ）の値を使用して、それをプラスミド標準曲線のＣｔ値に正常化することによってベクターゲノム力価を決定する。デジタルＰＣＲに基づくエンドポイントアッセイも使用してもよい。
一態様では、広域スペクトルのセリンプロテアーゼ、例えばプロテイナーゼＫ（Ｑｉａｇｅｎから市販されているものなど）を利用する最適化ｑ－ＰＣＲ法が使用される。より具体的には、最適化されたｑＰＣＲゲノム力価アッセイは、ＤＮａｓｅＩ消化後、試料をプロテイナーゼＫ緩衝液で希釈し、プロテイナーゼＫで処理した後熱失活させることを除いて、標準アッセイと同様である。適切には、試料を、試料サイズに等しい量のプロテイナーゼＫ緩衝液で希釈する。プロテイナーゼＫ緩衝液は、２倍以上に濃縮してもよい。典型的には、プロテイナーゼＫ処理は、約０．２ｍｇ／ｍＬであるが、０．１ｍｇ／ｍＬ～約１ｍｇ／ｍＬで変化させてもよい。処理ステップは、一般に、約５５℃で約１５分間行われるが、より長い時間（例えば、約２０分～約３０分）にわたってより低い温度（例えば、約３７℃～約５０℃）、またはより高い温度（例えば、約６０℃まで）でより短い時間（例えば、約５～１０分）行ってもよい。同様に、熱不活性化は、一般に、約９５℃で約１５分間であるが、温度を低下させてもよい（例えば、約７０℃～約９０℃）及び時間を延長してもよい（例えば、約２０分～約３０分間）。次いで、試料を希釈し（例えば、１０００倍）、標準アッセイに記載されるようにＴａｑＭａｎ分析に供する。
加えて、または代替的に、ドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）を使用してもよい。例えば、ｄｄＰＣＲによる一本鎖及び自己相補的ＡＡＶベクターゲノム力価を決定するための方法が記載されている。例えば、Ｍ．Ｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ，Ｈｕ Ｇｅｎｅ
Ｔｈｅｒａｐｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１４ Ａｐｒ；２５（２）：１１５－２５．ｄｏｉ：１０．１０８９／ｈｇｔｂ．２０１３．１３１．Ｅｐｕｂ ２０１４ Ｆｅｂ １４を参照のこと。
要約すると、ゲノム欠損ＡＡＶ９中間体からパッケージングされたゲノム配列を有するｒＡＡＶ９粒子を分離する方法は、組換えＡＡＶ９ウイルス粒子及びＡＡＶ９キャプシド中間体を含む懸濁液を、高速液体クロマトグラフィーに供することを包含し、ここでＡＡＶ９ウイルス粒子及びＡＡＶ９中間体は、１０．２のｐＨで平衡化された強力な陰イオン交換樹脂に結合され、約２６０及び約２８０の紫外線吸光度について溶離液をモニタリングしながら塩勾配に供する。ｒＡＡＶ９の最適性は低いが、ｐＨは約１０．０～１０．４の範囲であり得る。この方法では、Ａ２６０／Ａ２８０の比が変曲点に達したときに溶出
する画分からＡＡＶ９完全キャプシドを回収する。一例では、アフィニティークロマトグラフィーステップについては、ダイアフィルトレーション産物を、ＡＡＶ２／９血清型を効率的に捕捉するＣａｐｔｕｒｅ Ｓｅｌｅｃｔ（商標）Ｐｏｒｏｓ－ＡＡＶ２／９親和性樹脂（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に適用してもよい。これらのイオン条件下では、有意なパーセンテージの残留細胞ＤＮＡ及びタンパク質がカラムを通って流れ、一方でＡＡＶ粒子が効率的に捕捉される。
ｒＡＡＶ．ｈＩＤＳベクターは、図１１に示すフロー図に示すように製造してもよく、これは下記のセクション５．４及び実施例４にさらに詳細に記載されている。
５．１．３．ｒＡＡＶ．ｈＩＤＳの薬学的製剤
ｒＡＡＶ９．ｈＩＤＳ製剤は、生理食塩水、サーファクタント、及び生理学的に適合する塩または塩の混合物を含有する水溶液中に懸濁した有効量のＡＡＶ．ｈＩＤＳベクターを含有する懸濁液である。適切には、製剤は、生理的に許容されるｐＨ、例えばｐＨ６～９、またはｐＨ６．５～７．５、ｐＨ７．０～７．７、またはｐＨ７．２～７．８の範囲に調整される。脳脊髄液のｐＨが、約７．２８～約７．３２であるので、くも膜下腔内送達のためには、この範囲内のｐＨが望ましい場合がある；静脈内送達の場合、６．８～約７．２のｐＨが望ましい場合がある。しかし、最も広い範囲内の他のｐＨ及びこれらの部分的範囲が、他の送達経路のために選択されてもよい。
適切なサーファクタントまたはサーファクタントの組み合わせは、非毒性の非イオン性サーファクタントの中から選択してもよい。一実施形態では、例えば、中性ｐＨを有するＰｏｌｏｘａｍｅｒ １８８としても公知のＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８［ＢＡＳＦ］などの一級ヒドロキシル基で終結する二官能性ブロックコポリマーサーファクタントが選択され、平均分子量は８４００である。他のサーファクタント及び他のＰｏｌｏｘａｍｅｒ（ポロキサマー類）、すなわち、ポリオキシエチレン（ポリ（エチレンオキシド））の２つの親水性鎖に隣接するポリオキシプロピレン（ポリ（プロピレンオキシド））の中央疎水性鎖からなる非イオン性トリブロックコポリマー、ＳＯＬＵＴＯＬ ＨＳ １５（Ｍａｃｒｏｇｏｌ－１５ Ｈｙｄｒｏｘｙｓｔｅａｒａｔｅ）、ＬＡＢＲＡＳＯＬ（ポリオキシカプリル酸グリセリド）、ポリオキシ１０オレイルエーテル、ＴＷＥＥＮ（ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル）、エタノール及びポリエチレングリコールから構成される非イオン性トリブロックコポリマーが選択されてもよい。一実施形態では、製剤はポロキサマーを含む。これらのコポリマーは、一般に、文字「Ｐ」（ポロキサマー用）に続いて３桁の数字で名付けられ：最初の２桁×１００は、ポリオキシプロピレンコアのおよその分子量を示し、最後の数字×１０はポリオキシエチレン含有パーセンテージを示す。一実施形態では、ポロキサマー１８８が選択される。サーファクタントは、懸濁液の約０．０００５％～約０．００１％までの量で存在してもよい。
一実施形態では、この製剤は、例えば、Ｍ．Ｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ．、Ｈｕ Ｇｅｎｅ
Ｔｈｅｒａｐｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ、Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１４ Ａｐｒ；２５（２）：１１５－２５．ｄｏｉ：１０．１０８９／ｈｇｔｂ．２０１３．１３１．Ｅｐｕｂ ２０１４ Ｆｅｂ １４（これは参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、ｏｑＰＣＲまたはデジタル液滴ＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）によって測定して、少なくとも約１×１０９ＧＣ／ｍＬ～３×１０１３ＧＣ／ａｌの濃度を含んでもよい。
一実施形態では、凍結形態で、本明細書に記載の緩衝液中に、ｒＡＡＶを含む凍結成分が提供される。必要に応じて、この組成物には、１つ以上のサーファクタント（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８）、安定剤または防腐剤が存在する。適切には、使用のために、組成物を解凍し、適切な希釈剤、例えば滅菌生理食塩水またはは緩衝生理食塩水で所望
の用量に滴定する。
一例では、この製剤は、例えば、塩化ナトリウム、重炭酸ナトリウム、デキストロース、硫酸マグネシウム（例えば、硫酸マグネシウム・７Ｈ２Ｏ）、塩化カリウム、塩化カルシウム（例えば、塩化カルシウム・２Ｈ２Ｏ）、リン酸二塩基性ナトリウム、及びそれからの混合物のうちの１つ以上を水の中に含む緩衝生理食塩水を含んでもよい。適切には、くも膜下腔内送達の場合、浸透圧は、脳脊髄液と適合する範囲内（例えば、約２７５～約２９０）である；例えば、ｈｔｔｐ：／／ｅｍｅｄｉｃｉｎｅ．ｍｅｄｓｃａｐｅ．ｃｏｍ／ａｒｔｉｃｌｅ／２０９３３１６－ｏｖｅｒｖｉｅｗを参照のこと。必要に応じて、くも膜下腔内送達のために、市販の希釈剤を懸濁剤として、また別の懸濁剤及び他の賦形剤と組合わせて、使用してもよい。例えば、Ｅｌｌｉｏｔｔｓ Ｂ（登録商標）溶液［Ｌｕｋａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ］を参照のこと。他の実施形態では、この製剤は、１つ以上透過促進剤を含んでもよい。適切な透過促進剤の例としては、例えば、マンニトール、グリコール酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、サリチル酸ナトリウム、カプリル酸ナトリウム、カプリン酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン－９－ラウリルエーテールまたはＥＤＴＡが挙げられる。
特定の実施形態では、製剤（必要に応じて凍結された）中に懸濁された濃縮ベクター、任意の希釈緩衝液、ならびにくも膜下腔内投与に必要なデバイス及び他の構成要素を備えるキットが提供される。別の実施形態では、キットは、静脈内送達のための成分を追加してもよいし、代替的に含んでもよい。一実施形態では、キットは、注射を可能にするのに十分な緩衝液を提供する。そのような緩衝液は、濃縮ベクターの約１：１～１：５希釈以上を可能にし得る。他の実施形態では、処置する臨床家による用量滴定及び他の調整を可能にするために、より多量または少量の緩衝液または滅菌水を含む。さらに他の実施形態では、デバイスの１つ以上の構成要素がキットに含まれる。
５．２．遺伝子療法プロトコール
５．２．１標的患者集団
本明細書に記載されるｒＡＡＶ．ｈＩＤＳの治療上有効な量を、それを必要とする患者に送達することを包含する、ＩＩ型ムコ多糖症の処置方法が本明細書に提供される。具体的には、本明細書に記載のｒＡＡＶ．ｈＩＤＳの治療上有効な量を、それを必要とする患者に送達することを包含する、ＭＰＳ ＩＩと診断された患者における神経認知低下を予防、処置及び／または改善するための方法が本明細書において提供される。本明細書に記載のｒＡＡＶ．ｈＩＤＳベクターの「治療上有効な量」は、以下の段落のいずれか１つで同定された症状の１つ以上を是正し得る。
処置の候補となる患者は、ＭＰＳ ＩＩ（ハンター症候群）及び／またはＭＰＳ ＩＩに関連する症状を有する小児及び成人の患者である。ＭＰＳ ＩＩは、軽度／弱化表現型または重度の表現型として特徴付けられる。死亡は、重度の表現型（神経認知機能低下を特徴とする）の患者では１１．７歳の平均年齢で、軽度または弱い表現型の患者では２１．７歳で起こる。患者の大多数（３分の２）は、この病気の重症型を有する。ＭＰＳ ＩＩの患者は、出生時に正常に見えるが、典型的には、重症型で１８ヶ月～４歳の年齢と弱化型で４～８歳の年齢との間に、疾患の兆候及び症状が存在する。罹患した全ての患者に共通の徴候及び症状としては、低身長、粗い顔貌、大頭症、巨大舌、難聴、肝腫脹及び脾腫、多発異骨症、関節拘縮、脊髄狭窄及び手根管症候群が挙げられる。頻繁な上気道及び耳の感染症がほとんどの患者で起こり、進行性気道閉塞が一般的に見出され、睡眠時無呼吸及びしばしば死につながる。心臓病はこの集団における主要な死因であり、左右の心室肥大及び心不全をもたらす弁膜機能障害を特徴とする。死亡は、一般に、閉塞性気道疾患または心不全に起因する。
重症型のＭＰＳ ＩＩでは、早期発達のマイルストーンが達成されるかもしれないが、発生の遅延は、１８～２４ヶ月で容易に明らかである。一部の患者は、初年度に聴覚スクリーニング検査を受けられず、サポートされずに座る能力、歩く能力、及び会話を含む他のマイルストーンが遅れる。発達の進行は、３～５歳の間でプラトーになり始め、回帰はほぼ６．５年から始まると報告されている。トイレ訓練を受けたＭＰＳ ＩＩの小児の約５０％のうち、全てではないにしても大部分が病気の進行とともにこの能力を失う。
有意な神経学的関与を有する患者は、生後２年目から始まり、神経変性がこの行動を減弱させる８～９歳まで継続する、多動性、頑固さ及び攻撃性を含む重度の行動障害を示す。
てんかん発作は、１０歳に達した重症患者の半分超で報告され、死亡するまでにＣＮＳの関与するほとんどの患者が重度の精神的な障害を有し、絶えずケアを必要とする。弱化した病気の患者は、正常な知的機能を発揮するが、ＭＲＩ画像によって、白質病変、拡大した脳室及び脳萎縮を含むＭＰＳ ＩＩを有する、全ての患者における肉眼的異常が明らかになる。
本発明の組成物は、軽度から完全なアナフィラキシーまでの範囲であり得る、組換え酵素に対する免疫応答に関連する長期酵素補充療法（ＥＲＴ）の合併症、ならびに生涯にわたる末梢投与の合併症、例えば、局所及び全身の感染を回避する。ＥＲＴとは対照的に、本発明の組成物は、生涯にわたって毎週繰り返される注射を必要としない。理論に拘泥するものではないが、本明細書に記載の処置方法は、ＣＮＳコンパートメントの外に治療的レバレッジ効果をもたらす、連続的な循環ＩＤＳレベルの上昇をもたらすトランスダクション効率が高いベクターによってもたらされる効率的で長期間の遺伝子導入を提供することにより、ＭＰＳ ＩＩ障害に関連する少なくとも中枢神経系の表現型を是正するのに有用であると考えられる。さらに、ＣＮＳへのＡＡＶ媒介性送達の前に、タンパク質形態またはＡＡＶ－ｈＩＤＳの形態での酵素の直接的な全身送達を含む、様々な経路による、能動寛容を提供し、酵素に対する抗体形成を防止するための方法が本明細書において提供される。
いくつかの実施形態において、重度のＭＰＳ ＩＩと診断された患者は、本明細書に記載の方法に従って処置される。いくつかの実施形態において、弱化ＭＰＳ ＩＩと診断された患者は、本明細書に記載の方法に従って処置される。いくつかの実施形態では、早期神経認知障害を有するＭＰＳ ＩＩを有する小児対象は、本明細書に記載の方法に従って処置される。特定の実施形態において、ハンター症候群と診断され、神経認知障害を有するか、または神経認知障害を発症する危険性がある２歳以上の患者を、本明細書に記載の方法に従って処置する。特定の実施形態において、重度のハンター症候群と相関することが公知の主要な再編成または欠失突然変異の存在を伴う２歳以上の患者は、本明細書に記載の方法に従って処置される。
特定の実施形態では、新生児（３カ月齢以下）を、本明細書に記載の方法に従って処置する。特定の実施形態において、３ヶ月齢～９ヶ月齢の新生児が、本明細書に記載の方法に従って処置される。特定の実施形態において、９ヶ月齢～３６ヶ月齢の子供が、本明細書に記載の方法に従って処置される。特定の実施形態では、３歳～１２歳の小児が、本明細書に記載の方法に従って処置される。特定の実施形態において、１２歳～１８歳の小児が、本明細書に記載の方法に従って処置される。特定の実施形態において、１８歳以上の成人が、本明細書に記載の方法に従って処置される。
適切には、処置のために選択される患者は、以下の特徴のうちの１つ以上を有する患者が挙げられる：血清、血漿、線維芽細胞または白血球で測定されるＩＤＳ酵素活性の欠如
または減少により確認されたＭＰＳ ＩＩの確認された診断；他の神経学的または精神医学的因子によって説明し得ない場合には、以下のいずれかとして定義されるＭＰＳ ＩＩに起因する早期神経認知障害の確認された証拠：－平均よりも少なくとも１標準偏差低いかまたは逐次試験で１標準偏差を超える低下の確認された歴史的証拠であるＤＱ（ＢＳＩＤ－ＩＩＩ）。あるいは、尿、血清、ＣＳＦ、または遺伝子検査におけるＧＡＧの増大を使用してもよい。
処置前に、対象、例えば、乳児は、好ましくはＭＰＳ ＩＩ患者、すなわちｈＩＤＳをコードする遺伝子に変異を有する患者を同定するために遺伝子型決定を受ける。処置前に、ＭＰＳ ＩＩ患者は、ｈＩＤＳ遺伝子を送達するために使用されるＡＡＶ血清型に対する中和抗体（Ｎａｂ）について評価してもよい。そのようなＮａｂは、形質導入効率を妨げ、処置力価を低下し得る。ベースラインの血清Ｎａｂ力価≦１：５を有するＭＰＳ ＩＩ患者は、ｒＡＡＶ．ｈＩＤＳ遺伝子療法プロトコールでの処置のための良好な候補である。血清Ｎａｂ＞１：５の力価を有するＭＰＳ ＩＩ患者の処置は、ｒＡＡＶ．ｈＩＤＳベクター送達での処置の前及び／または処置中に、免疫抑制剤を用いた一過性同時処置などの併用療法を必要とする場合がある。必要に応じて、免疫抑制剤併用療法は、ＡＡＶベクターキャプシド及び／または製剤の他の成分に対する中和抗体を事前に評価することなく、予防措置として使用してもよい。以前の免疫抑制療法は、特に導入遺伝子産物が「外来」と見なされ得るＩＤＵＡ活性のレベルが実質的にない患者において、ｈＩＤＳ導入遺伝子産物に対する潜在的な有害な免疫反応を予防するために望ましい場合がある。以下に記載のマウス、イヌ及びＮＨＰでの非臨床的研究の結果は、ｈＩＤＳ及び神経炎症に対する免疫応答の発達と一致する。ヒト対象には同様の反応は起こらないかもしれないが、予防策として、免疫抑制療法がｒＡＡＶ－ｈＩＤＳの全てのレシピエントに対して推奨される。
そのような併用療法のための免疫抑制剤としては、限定するものではないが、グルココルチコイド、ステロイド、代謝拮抗剤、Ｔ細胞阻害剤、マクロライド（例えば、ラパマイシンまたはラパログ）、及び細胞増殖抑制剤、例としては、アルキル化剤、代謝拮抗物質、細胞傷害性抗生物質、抗体、またはイムノフィリンに作用する薬剤が挙げられる。免疫抑制剤としては、ナイトロジェンマスタード、ニトロソウレア、白金化合物、メトトレキセート、アザチオプリン、メルカプトプリン、フルオロウラシル、ダクチノマイシン、アントラサイクリン、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、ミトラマイシン、ＩＬ－２受容体（ＣＤ２５－）またはＣＤ３特異的抗体、抗ＩＬ－２抗体、シクロスポリン、タクロリムス、シロリムス、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、オピオイド、またはＴＮＦ－α（腫瘍壊死因子－α）結合剤が挙げられる。特定の実施形態において、免疫抑制療法は、遺伝子療法投与の０、１、２、７またはそれ以上の日前に開始され得る。そのような処置は、２つ以上の薬物（例えば、プレドニゾン、ミノフェノレートモフェチル（ＭＭＦ）及び／またはシロリムス（すなわち、ラパマイシン））を同日に同時投与することを含んでもよい。これらの薬物のうち１つ以上は、遺伝子治療投与後、同じ用量または調整された用量で継続されてもよい。このような治療は、必要に応じて、約１週間（７日間）、約６０日間、またはそれ以上長くてもよい。特定の実施形態では、タクロリムスを含まないレジメンが選択される。
特定の実施形態では、以下の特徴の１つ以上を有する患者は、その介護医の裁量で処置から除外され得る：
・研究者または医療監視者のいずれかの意見で研究結果の解釈を混乱させる可能性がある、ＭＰＳ ＩＩに起因しない神経認知障害を有する
・治験責任医師の意見で、対象に過度のリスクを与えるか、あるいは治験結果の評価または対象の安全性もしくは治験結果の解釈を妨げるような状態（例えば、病歴、現在の病気の証拠、身体診察時の所見、または臨床検査値の異常など）を有する
・精神神経症状の診断
・蛍光透視撮影に対する禁忌を含む、くも膜下腔内／頭蓋内処置投与に対する禁忌を有する
・ＭＲＩに対する禁忌を有する
・登録時に急性水頭症を有する
・スクリーニングの前４週間以内またはその臨床試験で使用された治験薬の５半減期以内のいずれか長い方で治験薬を使用する他の臨床試験に現在登録されている
・造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）を受けている
・スクリーニング前の６ヶ月以内にくも膜下腔内投与によりイデュルスルファーゼを投与されている
・くも膜下腔内イデュルスルファーゼをいつでも受けており、治験責任医師及び／または医療監視者の意見では、対象に過度のリスクを与える、くも膜下腔内投与に関連して重大な副作用（ＡＥ）が認められた。
他の実施形態では、介護の医師は、これらの身体的特徴（病歴）のうちの１つ以上の存在が、本明細書で提供される処置を排除すべきではないと決定する場合もある。
５．２．２．投薬量及び投与様式
患者への投与に適した薬学的組成物は、生理学的に適合する水性緩衝液、サーファクタント及び任意の賦形剤を含む製剤緩衝液中のｒＡＡＶ．ｈＩＤＳベクターの懸濁液を含む。特定の実施形態において、本明細書に記載の薬学的組成物は、くも膜下腔内に投与される。他の実施形態において、本明細書に記載の薬学的組成物は、大槽内に投与される。他の実施形態では、本明細書に記載の薬学的組成物は、静脈内投与される。特定の実施形態では、この薬学的組成物は、末梢静脈を介して２０分（±５分）にわたる注入によって送達される。しかし、この時間は、必要に応じてまたは所望の場合調整されてもよい。しかし、さらに別の投与経路を選択してもよい。代替的または追加的に、所望であれば、投与経路を組み合わせてもよい。
ｒＡＡＶの単回投与が有効であると予想されるが、投与は繰り返してもよい（例えば、四半期ごと、年に２回、毎年、またはその他の必要な場合、特に新生児の処置において）。必要に応じて、治療上有効な量の最初の用量は、注入／注射を許容する対象の年齢及び能力を考慮して、分割注入／注射期間にわたって送達され得る。しかし、完全な治療用量の毎週の注射を繰り返す必要はなく、患者に快適性及び治療転帰の両方に関して利点がもたらされる。
いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ懸濁液は、少なくとも１．０×１０１３ＧＣ／ｍＬのｒＡＡＶゲノムコピー（ＧＣ）力価を有する。特定の実施形態では、ｒＡＡＶ懸濁液中のｒＡＡＶの空／完全粒子比は０．０１～０．０５（９５％～９９％は空のキャプシドがない）である。いくつかの実施形態において、それを必要とするＭＰＳ ＩＩ患者は、少なくとも約４×１０８ＧＣ／ｇ脳質量～約４×１０１１ＧＣ／ｇ脳質量というｒＡＡＶ懸濁液の用量を投与される。
示された年齢群のＭＰＳ ＩＩ患者には、以下の治療上有効なｒＡＡＶ．ｈＩＤＳのフラット用量が投与され得る：
・新生児：約３．８×１０１２～約１．９×１０１４ＧＣ；
・３～９ヶ月：約６×１０１２～約３×１０１４ＧＣ；
・９～３６ヶ月：約１０１３～約５×１０１４ＧＣ；
・３～１２年：約１．２×１０１３～約６×１０１４ＧＣ；
・１２＋歳：約１．４×１０１３～約７．０×１０１４ＧＣ；
・１８＋歳（成人）：約１．４×１０１３～約７．０×１０１４ＧＣ。
いくつかの実施形態において、１２＋歳の年齢のＭＰＳ ＩＩ患者（１８＋歳の年齢を含む）に投与される用量は、１．４×１０１３のゲノムコピー（ＧＣ）（１．１×１０１０ＧＣ／ｇ脳質量）である。いくつかの実施形態では、１２歳＋のＭＰＳ ＩＩ患者（１８歳＋の年齢を含む）に投与される用量は、７×１０１３ＧＣ（５．６×１０１０ＧＣ／ｇ脳質量）である。なおさらなる実施形態において、ＭＰＳ ＩＩ患者に投与される用量は、少なくとも約４×１０８ＧＣ／ｇ脳質量～約４×１０１１ＧＣ／ｇ脳質量である。特定の実施形態において、ＭＰＳ ＩＩ新生児に投与される用量は、約１．４×１０１１～約１．４×１０１４ＧＣの範囲であり；乳児３～９ヶ月に投与される用量は、約２．４×１０１１～約２．４×１０１４ＧＣの範囲であり；ＭＰＳ ＩＩ小児９～３６ヶ月に投与される用量は：約４×１０１１～約４×１０１４ＧＣの範囲であり；３～１２歳のＭＰＳ
ＩＩ小児に投与される用量は：約４．８×１０１１～約４．８×１０１４ＧＣの範囲であり；小児及び１２＋歳の成人に投与される用量は、約５．６×１０１１～約５．６×１０１４ＧＣの範囲である。
これらの用量及び濃度の送達に適した容積は、当業者によって決定され得る。例えば、約１μＬ～１５０ｍＬの容積を選択してもよく、大容積のものは大人用に選択される。典型的には、新生児の場合、適切な容積は約０．５ｍＬから約１０ｍＬであり、高齢の乳児では約０．５ｍＬから約１５ｍＬが選択されてもよい。幼児に関しては、約０．５ｍＬ～約２０ｍＬの容積を選択してもよい。小児の場合、約３０ｍＬまでの容積を選択してもよい。１０代前半及び１０代では、最大約５０ｍＬまでの容積を選択してもよい。さらに他の実施形態では、患者は、約５ｍＬ～約１５ｍＬの容積、または約７．５ｍＬ～約１０ｍＬの容積を選択されて、くも膜下腔内投与を投与されてもよい。他の適切な容積及び用量を決定してもよい。投与量は、任意の副作用に対する治療効果のバランスを取るように調整され、そのような投与量は、組換えベクターが使用される治療用途に応じて変化し得る。
５．２．３．有効性のモニタリング
本明細書に記載の処置の有効性は、（ａ）ＭＰＳ ＩＩ（ハンター症候群）患者における神経認知低下の予防；及び（ｂ）ＣＳＦ、血清及び／または尿中の、及び／または肝臓及び脾臓容積中のＧＡＧレベル及び／または酵素活性などの疾患のバイオマーカーの減少を評価することによって測定され得る。神経認知は、例えば、Ｂａｙｌｅｙ’ｓ Ｉｎｆａｎｔｉｌｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｓｃａｌｅ ｆｏｒ Ｈｕｒｌｅｒによって測定した場合、またはＷｅｃｈｓｌｅｒ Ａｂｂｒｅｖｉａｔｅｄ Ｓｃａｌｅ ｏｆ Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｃｅ（ＷＡＳＩ）ｆｏｒ Ｈｕｒｌｅｒ－Ｓｃｈｅｉｅ ｓｕｂｊｅｃｔによって測定した場合、知能指数（ＩＱ）を測定することによって決定され得る。他の適切な神経認知発達及び機能の尺度、例えばＢａｙｌｅｙ Ｓｃａｌｅ ｏｆ Ｉｎｆａｎｔ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（ＢＳＩＤ－ＩＩＩ）を用いた発達指数（ＤＱ）の評価、Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｖｅｒｂａｌ Ｌｅａｒｎｉｎｇ Ｔｅｓｔ（言語学習試験）を用いた記憶の評価、及び／またはＴｅｓｔｓ ｏｆ Ｖａｒｉａｂｌｅｓ ｏｆ Ａｔｔｅｎｔｉｏｎ（注意変数の試験）（ＴＯＶＡ）を用いた評価が利用されてもよい。他の神経心理学的機能、例えば、ｖｉｎｅｌａｎｄ適応行動スケール、視覚処理、微細運動、コミュニケーション、社会化、日常生活の技能、ならびに情動及び行動的健康がモニターされる。容量測定、拡散テンソル画像（ＤＴＩ）、及び静止状態データ、超音波検査による正中神経断面積、脊髄圧迫の改善、安全性、肝臓サイズ及び脾臓サイズを獲得するための脳の磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）も施される。
必要に応じて、有効性の他の尺度としては、バイオマーカー（例えば、本明細書に記載のポリアミン）及び臨床転帰の評価が挙げられる。尿は、総ＧＡＧ含有量、クレアチニンに対するＧＡＧの濃度、ならびにＭＰＳ ＩＩ特異的ｐＧＡＧについて評価される。ＩＤ
Ｓ活性、抗ＩＤＳ抗体、ｐＧＡＧ、及びヘパリン補因子ＩＩ－トロンビン複合体の濃度及び炎症のマーカーについて、血清及び／または血漿を評価する。ＣＳＦは、ＩＤＵＡ活性、抗ＩＤＳ抗体、ヘキソサミニダーゼ（ｈｅｘ）活性、及びｐＧＡＧ（ヘパラン硫酸及びデルマタン硫酸など）について評価される。ベクターに対する中和抗体（例えば、ＡＡＶ９）の存在及び抗ＩＤＳ抗体に対する結合抗体の存在は、ＣＳＦ及び血清中で評価され得る。ベクターキャプシド（例えば、ＡＡＶ９）またはｈＩＤＳ導入遺伝子産物に対するＴ細胞応答は、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって評価され得る。ＣＳＦ、血清、及び尿中のＩＤＳ発現の薬物動態、ならびにベクター濃度（ＰＣＲ対ＡＡＶ９ ＤＮＡ）もモニターしてもよい。
ｈＩＤＳの全身送達を伴うＣＮＳへのｒＡＡＶ．ｈＩＤＳの遺伝子治療送達の組み合わせは、本発明の方法に包含される。全身送達は、ＥＲＴ（例えば、Ｅｌａｐｒａｓｅ（登録商標）（イデュルスルファーゼ）を用いる）、または肝臓の指向性を有するｒＡＡＶ．ｈＩＤＳ（例えば、ＡＡＶ８キャプシドを有するｒＡＡＶ．ｈＩＤＳ）を用いるさらなる遺伝子治療を用いて達成してもよい。
全身送達に関連するさらなる臨床的有効性の尺度としては、例えば骨塩密度、骨ミネラル含有量、骨の幾何学的形状及び強度、二重エネルギーＸ線吸収測定法（ＤＸＡ）によって測定される骨密度などの整形外科的測定値；高さ（立っている高さ／横になっている長さのＺスコア）；骨代謝のマーカー：血清オステオカルシン（ＯＣＮ）及び骨特異的アルカリホスファターゼ（ＢＳＡＰ）の測定値、Ｉ型コラーゲンのカルボキシ末端テロペプチド（ＩＣＴＰ）及びＩ型コラーゲンのカルボキシ末端テロペプチドα１鎖（ＣＴＸ）の測定；柔軟性及び筋力：Ｂｉｏｄｅｘ及びＰｈｙｓｉｃａｌ Ｔｈｅｒａｐｙの評価（６分間の歩行研究を含む）（Ｂｉｏｄｅｘ ＩＩＩ等速性強度試験システムは、各参加者の膝及び肘の強度を評価するために使用される）；Ａｃｔｉｖｅ Ｊｏｉｎｔ Ｒａｎｇｅ ｏｆ Ｍｏｔｉｏｎ（ＲＯＭ）；Ｃｈｉｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ Ｑｕｅｓｔｉｏｎｎａｉｒｅ／Ｈｅａｌｔｈ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ Ｑｕｅｓｔｉｏｎｎａｉｒｅ（ＣＨＡＱ／ＨＡＱ）Ｄｉｓａｂｉｌｉｔｙ Ｉｎｄｅｘ Ｓｃｏｒｅ；Ｅｌｅｃｔｒｏｍｙｏｇｒａｐｈｉｃ（ＥＭＧ）及び／またはＯｘｙｇｅｎ Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｔｏ Ｍｏｎｉｔｏｒ ａｎ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ’ｓ ｃａｒｄｉｏｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｆｉｔｎｅｓｓ：運動試験の間の最大酸素摂取（ＶＯ２ピーク）；無呼吸／呼吸低下指数（ＡＨＩ）；Ｆｏｒｃｅｄ Ｖｉｔａｌ Ｃａｐａｃｉｔｙ（ＦＶＣ）；左心室重量（ＬＶＭ）が挙げられる。
特定の実施形態では、患者におけるＭＰＳ ＩＩの診断及び／または処置方法、または処置のモニタリング方法が提供される。この方法は、ＭＰＳ ＩＩを有すると疑われるヒト患者から脳脊髄液または血漿試料を得ること；試料中のスペルミン濃度レベルを検出すること；１ｎｇ／ｍＬを超えるスペルミン濃度を有する患者のＭＰＳ ＩＩから選択されるムコ多糖症を有する患者を診断すること；及び本明細書に提供される診断された患者に有効量のヒトＩＤＳを送達することを包含する。
別の態様では、この方法は、ＭＰＳ ＩＩ療法をモニタリング及び調整することを包含する。
そのような方法は、ＭＰＳ ＩＩの処置を受けているヒト患者から脳脊髄液または血漿試料を得ること；質量スペクトル分析を行うことによって試料中のスペルミン濃度レベルを検出すること；ＭＰＳ ＩＩ治療剤の投与量を調節することを包含する。例えば、「正常な」ヒトスペルミン濃度は、脳脊髄液において約１ｎｇ／ｍＬ～２ｎｇ／ｍＬ以下である。しかし、未処置のＭＰＳ ＩＩを有する患者は、２ｎｇ／ｍＬより大きく最大約１００ｎｇ／ｍＬまでのスペルミン濃度レベルを有し得る。患者のレベルが正常レベルに近づ
いている場合、いずれかの対の一方の投与量を減らしてもよい。逆に、患者が所望のＭＰＳ ＩＩレベルよりも高いレベルを有する場合、より高い用量、または追加の治療、例えばＥＲＴを患者に提供してもよい。
スペルミン濃度は、適切なアッセイを用いて決定され得る。例えば、以下で記載されるアッセイ、Ｊ Ｓａｎｃｈｅｚ－Ｌｏｐｅｚ ｅｔ ａｌ．、「Ｕｎｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｐｏｌｙａｍｉｎｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｓ ｐｌａｎｔ ｓａｍｐｌｅｓ ｂｙ ｉｏｎ ｐａｉｒ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｃｏｕｐｌｅｄ
ｗｉｔｈ ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ ｔａｎｄｅｍ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ」Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４７（２００９）：５９２－５９８、ａｖａｉｌ ｏｎｌｉｎｅ ２８ Ｆｅｂ ２００９；ＭＲ Ｈａｋｋｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ．、「Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｕｎｄｅｒｉｖａｔｉｚｅｄ ｐｏｌｙａｍｉｎｅｓ ｂｙ ｒｅｖｅｒｓｅｄ ｐｈａｓｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｗｉｔｈ ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ ｔａｎｄｅｍ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ」Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｍｅｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ、４４（２００７）：６２５－６３４、定量同位体希釈液体クロマトグラフィー（ＬＣ）／質量分析（ＭＳ）アッセイ。他の適切なアッセイを使用してもよい。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の治療剤の有効性は、早期神経認知障害を有するＭＰＳ ＩＩを有する小児対象において、投与後５２週目の神経認知を評価することによって決定される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の治療剤の有効性は、ＭＰＳ ＩＩ患者におけるＣＳＦグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）と神経認知との関係を評価することによって決定される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の治療剤の有効性は、磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）によって測定されるＭＰＳ ＩＩ患者におけるＣＮＳへの物理的変化に対する治療剤の効果を評価すること、例えば、灰白質物質及びＣＳＦ脳室の容積分析によって決定される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の治療剤の有効性は、ＭＰＳ ＩＩ患者の脳脊髄液（ＣＳＦ）、血清及び尿中のバイオマーカー（例えば、ＧＡＧ、ＨＳ）に対する治療剤の薬力学的効果を評価することによって決定される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の治療剤の有効性は、ＭＰＳ ＩＩ患者のＱＯＬ（Ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ Ｌｉｆｅ）に対する治療剤の影響を評価することによって決定される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の治療剤の有効性は、ＭＰＳ
ＩＩ患者の運動機能に対する治療剤の影響を評価することによって決定される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の治療剤の有効性は、ＭＰＳＩＩ患者の成長及び発達のマイルストーンに対する治療剤の効果を評価することによって決定される。
本明細書に記載のｒＡＡＶベクターから発現される場合、ＣＳＦ、血清または他の組織で検出される少なくとも約２％のｈＩＤＳの発現レベルは、治療効果を提供し得る。しかし、より高い発現レベルが達成される場合がある。そのような発現レベルは、正常な機能的ヒトＩＤＳレベルの２％～約１００％である場合がある。特定の実施形態では、正常より高い発現レベルが、ＣＳＦ、血清、または他の組織において検出され得る。
特定の実施形態では、本明細書に記載のＭＰＳ ＩＩ及び／またはその症状を処置、予防、及び／または改善する方法は、Ｂａｙｌｅｙ Ｓｃａｌｅｓ ｏｆ ＩｎｆａｎｔＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔを用いて評価した、処置患者における神経認知発達指数（ＤＱ）の有意な増大をもたらす。特定の実施形態では、本明細書に記載のＭＰＳ ＩＩ及び／またはその症状を処置、予防、及び／または改善する方法では、ハンター症候群の患者における未処置／自然な病歴管理データに対して処置した患者における１５ポイント以下のＤＱの低下が、生じる。
特定の実施形態では、本明細書に記載のＭＰＳ ＩＩ及び／またはその症状を処置、予
防、及び／または改善する方法は、機能的なヒトＩＤＳレベルの有意な増大をもたらす。特定の実施形態では、本明細書に記載されるＭＰＳ ＩＩ及び／またはその症状を処置、予防、及び／または改善する方法は、患者の血清、尿及び／または脳脊髄液（ＣＳＦ）の試料において測定される、ＧＡＧレベルの有意な低下をもたらす。
５．３．併用療法
ｈＩＤＳの全身送達を伴うＣＮＳへのｒＡＡＶ．ｈＩＤＳの遺伝子治療送達の組み合わせは、本発明の特定の実施形態によって包含される。全身送達は、ＥＲＴ（例えば、Ｅｌａｐｒａｓｅ（登録商標）を用いて）、または肝指向性を有するｒＡＡＶ．ｈＩＤＳ（例えば、ＡＡＶ８キャプシドを保有するｒＡＡＶ．ｈＩＤＳ）を用いるさらなる遺伝子治療を用いて達成してもよい。
特定の実施形態では、ｒＡＡＶ９．ｈＩＤＳのくも膜下腔内投与は、例えば、肝臓に対する第２のＡＡＶ．ｈＩＤＳ注射と同時投与される。そのような場合、ベクターは同じであってもよい。例えば、ベクターは、同じキャプシドを有してもよいし、及び／または同じベクターゲノム配列を有してもよい。あるいは、ベクターは異なっていてもよい。例えば、ベクターストックのそれぞれは、肝臓特異的プロモーター及びＣＮＳ特異的プロモーターなどの異なる調節配列（例えば、それぞれ異なる組織特異的プロモーターを有する）でデザインしてもよい。さらに、または代替的に、ベクターストックのそれぞれは、異なるキャプシドを有してもよい。例えば、肝臓に指向されるベクターストックは、とりわけ、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ６４Ｒ１、ＡＡＶｒｈ６４Ｒ２、ｒｈ８、ｒｈ１０、ＡＡＶ３ＢまたはＡＡＶｄｊから選択されるキャプシドを有し得る。そのようなレジメンでは、各ベクターストックの用量は、くも膜下腔内に送達される全ベクターが、約１×１０８ＧＣ～１×１０１４ＧＣの範囲内になるように調節してもよく；他の実施形態では、両方の経路によって送達される組み合わされたベクターは、１×１０１１ＧＣ～１×１０１６ＧＣの範囲内である。あるいは、各ベクターは、約１０８ＧＣ～約１０１２ＧＣ／ベクターの量で送達されてもよい。そのような用量は、実質的に同時に、または異なる時間、例えば約１日～約１２週間、または約３日～約３０日、または他の適切な時間で送達されてもよい。
いくつかの実施形態では、処置方法は、以下を包含する：（ａ）導入遺伝子特異的寛容を誘導するのに十分な量のｈＩＤＳ酵素または肝臓特異的ｒＡＡＶ－ｈＩＤＵＡを、ＭＰＳ ＩＩ及び／またはハンター症候群症状を有する患者に投与すること；ならびに（ｂ）患者のＣＮＳにｒＡＡＶ．ｈＩＤＳを投与することであって、ｒＡＡＶ．ｈＩＤＳが患者の治療レベルのｈＩＤＳの発現を指示すること。
さらなる実施形態では、ＭＰＳ ＩＩ及び／またはハンター症候群に関連する症状を有するヒト患者を処置する方法が提供され、この方法は、十分な量のｈＩＤＳ酵素または肝指向性ｒＡＡＶ－ｈＩＤＳを用いて、ＭＰＳ ＩＩ及び／またはハンター症候群に関連する症状を有する患者を寛容化して導入遺伝子特異的寛容を誘導し、続いて患者にｈＩＤＳのｒＡＡＶ媒介性送達することを包含する。特定の実施形態では、患者に、ｈＩＤＳへの患者の寛容化のために、例えば、患者が４週齢未満（新生児期）または幼児である場合に、肝指向性注射によって、ｒＡＡＶ．ｈＩＤＳを投与し、引き続いて、その患者が乳児、小児及び／または成人である場合、くも膜下腔内注射によってｒＡＡＶ．ｈＩＤＳを投与してＣＮＳにおいて治療濃度のｈＩＤＳを発現する。
一実施例では、ＭＰＳ ＩＩ患者は、患者に生後２週間以内で、例えば、約０～約１４日、または約１日～１２日、または約３日～約１０日、または約５日～約８日以内で、すなわち患者が新生児である患者にｈＩＤＳを送達することによって寛容化される。他の実施形態では、より年齢が上の乳児を選択してもよい。ｈＩＤＳの寛容化用量は、ｒＡＡＶ
を介して送達され得る。しかし、別の実施形態では、用量は、酵素の直接送達（酵素補充療法）によって送達される。組換えｈＩＤＳを産生する方法は、文献に記載されている。
さらに、Ｅｌａｐｒａｓｅ（登録商標）（イデュルスルファーゼ）として商業的に産生された組換えｈＩＤＳは、全身送達に有用であり得る。現時点ではあまり好ましくはないが、酵素は、「裸の」ＤＮＡ、ＲＮＡ、または別の適切なベクターを介して送達され得る。一実施形態では、酵素は、患者に、静脈内及び／またはくも膜下腔内に送達される。別の実施形態では、別の投与経路（例えば、筋肉内、皮下など）が使用される。一実施形態では、寛容化のために選択されたＭＰＳ ＩＩ患者は、寛容化用量の開始前に検出可能な量のｈＩＤＳは発現し得ない。組換えヒトＩＤＳ酵素が送達される場合、静脈内ｒｈＩＤＳ注射は、約０．５ｍｇ／ｋｇ体重からなる場合がある。あるいは、より高い用量またはより低い用量が選択される。同様に、ベクターから発現される場合、より低い発現タンパク質レベルが送達され得る。一実施形態では、寛容化のために送達されるｈＩＤＳの量は、治療上有効な量よりも低い。しかし、他の用量を選択してもよい。
典型的には、寛容化用量の投与後、治療用量は、例えば、寛容化投与後約３日～約６ヶ月、より好ましくは寛容化投与後約７日～約１ヶ月以内に対象に送達される。しかし、これらの範囲内の他の時点を選択してもよく、より長い待機期間またはより短い待機期間も選択してもよい。
代替として、ベクターに加えて、ベクター投与の前、最中及び／または後に免疫抑制療法を施してもよい。免疫抑制療法は、上記のように、プレドニゾロン、ミコフェノレートモフェチル（ＭＭＦ）及びタクロリムスまたはシロリムスを含んでもよい。以下に記載するタクロリムスを含まないレジメンが好ましい場合がある。
５．４．製造
一実施形態は、本明細書に記載のｒＡＡＶ．ｈＩＤＳ薬学的組成物の製造を提供する（下記の実施例４）。例示的な製造プロセスを、図１０Ａ及び図１０Ｂに示す。ｒＡＡＶ．ｈＩＤＳベクターは、図１０Ａ及び図１０Ｂに示すフロー図に示すように製造してもよい。要するに、細胞は、適切な細胞培養物（例えば、ＨＥＫ ２９３）細胞中で製造される。本明細書に記載の遺伝子治療ベクターを製造する方法としては、遺伝子治療ベクターの製造に使用されるプラスミドＤＮＡの生成、ベクターの生成、及びベクターの精製などの当該分野で周知の方法が挙げられる。いくつかの実施形態では、遺伝子治療ベクターは、ＡＡＶベクターであり、生成されるプラスミドは、ＡＡＶゲノム及び目的の遺伝子をコードするＡＡＶシスプラスミド、ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を含むＡＡＶトランスプラスミド、ならびにアデノウイルスヘルパープラスミドである。ベクター生成プロセスは、細胞培養の開始、細胞の継代、細胞の播種、プラスミドＤＮＡによる細胞のトランスフェクション、無血清培地へのトランスフェクション後の培地交換、ならびにベクター含有細胞及び培養培地の回収などの方法ステップを包含してもよい。収穫されたベクター含有細胞及び培養培地は、本明細書において粗細胞収穫物と呼ばれる。
その後、この粗細胞収穫物は、ベクター収穫物の濃縮、ベクター収穫物のダイアフィルトレーション、ベクター収穫物のマイクロ流動化、ベクター収穫物のヌクレアーゼ消化、マイクロ流動化中間体の濾過、クロマトグラフィーによる粗精製、超遠心分離による粗精製、タンジェンシャルフロー濾過による緩衝液交換、及び／またはバルクベクターを調製するための製剤及び濾過などの方法ステップに供され得る。
高塩濃度での２段階アフィニティークロマトグラフィー精製、続いて陰イオン交換樹脂クロマトグラフィーを用いて、ベクター医薬品を精製し、空のキャプシドを除去する。これらの方法は、２０１６年１２月９日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６
／０６５９７０号及びその優先権書類、２０１６年４月１３日に出願された米国特許出願第６２／３２２，０７１号及び本明細書において参照によって組み込まれる、２０１５年１２月１１日に出願され、「Ｓｃａｌａｂｌｅ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ＡＡＶ９」という題の６２／２２６，３５７号にさらに詳細に記載されている。２０１６年１２月９日に出願されたＡＡＶ８の精製方法の国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６５９７６、及び２０１６年４月１３日出願のその優先権書類、米国特許出願第６２／３２２，０９８号及び２０１５年１２月１１日出願の６２／２６６，３４１号、及びｒｈ１０、２０１６年１２月９日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１６／６６０１３及びその優先権書類、２０１６年４月１３日に出願された米国特許出願第６２／３２２，０５５号、及び「Ｓｃａｌａｂｌｅ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ＡＡＶｒｈ１０」と題された６２／２６６，３４７号（これも２０１５年１２月１１日出願）、並びにＡＡＶ１については、２０１６年１２月９日出願の、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６５９７４号及び２０１６年４月１３日出願の、その優先権書類である米国特許出願第６２／３２２，０８３号、及び２０１５年１２月１１日に出願された「Ｓｃａｌａｂｌｅ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ＡＡＶ１」に関する第６２／２６，３５１号は、参照により全てが本明細書に組み込まれる。
５．５．脳脊髄液への薬学的組成物の送達のための装置及び方法
一態様では、本明細書で提供されるベクターは、このセクションで提供される方法及び／またはデバイスを介してくも膜下腔内投与されてもよく、実施例及び図１１にさらに記載されている。あるいは、他のデバイス及び方法が選択されてもよい。この方法は、脊髄針を患者の大槽内に前進させ、ある長さの可撓性チューブを脊髄針の近位ハブに接続し、バルブの出力ポートをこの可撓性チューブの近位端に接続するステップと、前記前進及び接続ステップの後、ならびにチューブに患者の脳脊髄液を自己プライミングさせた後、一定量の等張溶液を含む第１の容器をバルブのフラッシュ入口ポートに接続し、その後、ある量の薬学的組成物を含む第２の容器をバルブのベクター入口ポートに接続するステップとを包含する。第１及び第２の容器をバルブに接続した後、流体流のための通路がバルブのベクター入口ポートと出口ポートとの間に開かれ、薬学的組成物が脊髄針を通して患者に注射され、その薬学的組成物が注射された後、流体の流路がバルブのフラッシュ入口ポート及び出口ポートを介して開かれ、等張溶液が脊髄針に注射されて薬学的組成物を患者にフラッシュする。
別の態様では、薬学的組成物の槽内送達のためのデバイスが提供される。このデバイスは、ある量の薬学的組成物を含む第１の容器、等張溶液を含む第２の容器、及び患者の大槽内の脳脊髄液中に薬学的組成物をこのデバイスから直接放出し得る脊髄針を備える。このデバイスはさらに、第１の容器に相互接続された第１の入口ポート、第２の容器に相互接続された第２の入口ポート、脊髄針に相互接続された出口ポート、及び脊髄針を通して薬学的組成物及び等張溶液の流れを制御するためのルアーロックを有するバルブ備える。
本明細書で使用される場合、コンピュータ断層撮影（Ｃｏｍｐｕｔｅｄ Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）（ＣＴ）という用語は、身体構造の３次元画像が、軸に沿って作られた一連の平面断面画像からコンピュータによって構築される、ラジオグラフィーを指す。
図１１に示す装置または医療デバイス１０は、バルブ１６を介して相互接続された１つ以上の容器１２及び１４を備える。容器１２及び１４は、薬学的組成物、薬物、ベクターなどの物質の新鮮な供給源、ならびに生理食塩水のような等張溶液の新鮮な供給源をそれぞれ提供する。容器１２及び１４は、患者への流体の注射を可能にする任意の形態の医療デバイスであってもよい。
一例として、各容器１２及び１４は、シリンジ、カニューレなどの形態で提供されてもよい。例えば、図示された実施形態では、容器１２は、ある量の薬学的組成物を含有する別個のシリンジとして提供され、本明細書では「ベクターシリンジ」と呼ばれる。単なる例にすぎないが、容器１２は、約１０ｃｃの薬学的組成物などを含んでもよい。
同様に、容器１４は、ある量の生理食塩水を含む別個のシリンジ、カニューレなどの形態で提供されてもよく、「フラッシュシリンジ」と呼ばれてもよい。単に例として、容器１４は約１０ｃｃの生理食塩水を含んでもよい。
代替的に、容器１２及び１４は、シリンジ以外の形態で提供されてもよく、１つが薬学的組成物用及び１つが生理食塩水用の１対の別個のチャンバを有する一体化された医療用注射デバイスなどの単一のデバイスに統合されてもよい。また、チャンバまたは容器のサイズは、所望の量の流体を含むように必要に応じて提供されてもよい。
図示された実施形態では、バルブ１６は、スイベルオスルアーロック１８を有する４方向ストップコックとして設けられている。バルブ１６は、容器１２及び１４（すなわち、図示の実施形態ではベクターシリンジ及びフラッシュシリンジ）、及び、バルブ１６を通る経路が、それぞれの容器１２及び１４に対して閉鎖または開放されることを可能にするスイベルオスルアーロックを相互接続する。このようにして、バルブ１６を通る経路は、ベクターシリンジ及びフラッシュシリンジの両方に対して閉じられる場合があるし、またはベクターシリンジ及びフラッシュシリンジのうちの選択されたものに対して開放される場合もある。４方向ストップコックの代替として、バルブは３方向ストップコックであっても、または流体制御デバイスであってもよい。
図示された実施形態では、バルブ１６は、流体のための延長管２０または同様の導管のある長さの一端に接続される。チューブ２０は、所望の長さまたは内部容積に基づいて選択されてもよい。単なる例であるが、チューブは約６～７インチの長さであってもよい。
例示の実施形態では、チューブ１２の反対側の端部２２は、Ｔ字型コネクタ延長セット２４に接続され、次に脊髄針２６に接続される。一例として、針２６は、５インチの２２または２５ゲージの脊髄針であってもよい。加えて、オプションとして、脊髄針２６は、３．５インチの１８ゲージ導入針などの導入針２８に接続してもよい。
使用中、脊髄針２６及び／または任意の導入針２８は、大槽に向かって患者の中に前進されてもよい。針の前進の後、針２６及び／または２８ならびに関連軟部組織（例えば、傍脊髄筋、骨、脳幹、及び脊髄）の視覚化を可能にするコンピュータ断層撮影（ＣＴ）画像を得てもよい。正確な針の配置は、針ハブ内の脳脊髄液（ＣＳＦ）の観察及び大槽内の針先の視覚化によって確認される。その後、比較的短い延長管２０を挿入された脊柱針２６に取り付けてもよく、次いで４方向ストップコック１６をチューブ２０の反対側の端部に取り付けてもよい。
上記のアセンブリは、患者のＣＳＦと共に「自己プライミング」になることが可能である。その後、プレフィルド生理食塩水フラッシュシリンジ１４が、４方向ストップコック１６のフラッシュ入口ポートに取り付けられ、次いで薬学的組成物を含むベクターシリンジ１２が４方向ストップコック１６のベクター入口に取り付けられる。その後、ストップコック１６の出力ポートは、ベクターシリンジ１２に対して開放され、ベクターシリンジの内容物は、バルブ１６及びアセンブルされた装置を通じてゆっくりと一定時間にわたって患者に注射される。単なる例であるが、この期間は、約１～２分及び／または任意の他の所望の時間であってもよい。
ベクターシリンジ１２の内容物が注射された後、取り付けられたプレフィルドフラッシュシリンジ１４を用いてストップコック１６及び針アセンブリが所望の量の生理食塩水でフラッシュされ得るように、ストップコック１６のスイベルロック１８が第２の位置に回される。単なる例であるが、１～２ｃｃの生理食塩水を使用してもよい；しかし必要に応じて多い量を使用する場合も、少ない量を使用する場合もある。生理食塩水は、薬学的組成物の全てまたは大部分を、アセンブルされたデバイスを通って患者に強制的に注射して、アセンブルされたデバイス内に薬学的組成物が殆どまたは全く残らないようにする。
アセンブルされた装置が生理食塩水で洗い流された後、針（複数可）、延長管、ストップコック、及びシリンジを含むその全体がアセンブルされたデバイスを、対象からゆっくりと取り除いて、バイオハザードの廃棄物レセプタクルまたは硬い容器（針（複数可）の場合）への廃棄のために外科用トレイに置く。
スクリーニングプロセスは、治験責任医師によって行われてもよく、これは最終的に大槽内（ＩＣ）処置に至る場合もある。治験責任医師は、対象（または指定された介護者）に十分な情報を提供するために、プロセス、手順、管理手順そのもの、及び全ての潜在的な安全リスクを記述し得る。ＩＣ処置の対象適格性のスクリーニング評価に使用するために、病歴、併用薬、身体検査、バイタルサイン、心電図（ＥＣＧ）、及び検査室検査結果が得られ、実行され、神経放射線科医、神経外科医及び麻酔科医に提供される。
適格性を審査するのに十分な時間を確保するために、最初のスクリーニング訪問と研究訪問の１週間前までとの間に、以下の手順をいつでも実施してもよい。例えば、「０日目」では、ガドリニウムの有無での頭部／頸部磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）（すなわち、ｅＧＦＲ＞３０ｍＬ／分／１．７３ｍ２）を得てもよい。研究者は、頭部／頸部ＭＲＩに加えて、屈曲／伸長試験によって頚部のさらなる評価の必要性を判定し得る。ＭＲＩプロトコールは、Ｔ１、Ｔ２、ＤＴＩ、ＦＬＡＩＲ、及びＣＩＮＥプロトコール画像を含んでもよい。
さらに、頭部／頸部のＭＲＡ／ＭＲＶは、ＣＳＦの適切な評価、及びＣＳＦ空間の間の連絡の可能性のある遮断または欠如の識別を可能にする、施設内プロトコール（すなわち、硬膜内手術／経硬膜手術の履歴を有する対象が除外される場合もあるし、またはさらなる試験（例えば、放射性ヌクレオチドの大槽造影法）を必要とする場合もある）にしたがって得てもよい。
神経放射線科医、神経外科医、及び麻酔科医は最終的に利用可能な全ての情報（スキャン、病歴、身体検査、検査値など）に基づいてＩＣ手順の各対象の適格性について考察し、決定する。麻酔の術前評価は、「第－２８日」から「第１日」まで得られてもよく、ここでは、ＭＰＳ対象の特別な生理的必要性を念頭に置いて、気道、頸部（短縮／肥厚）及び頭部動作範囲（頸部屈曲）の詳細な評価を得る。
ＩＣ手技に先立って、ＣＴ室は以下の機器及び医薬が存在することを確認する：
成人の腰椎穿刺（ＬＰ）キット（施設ごとに提供）；
ＢＤ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）２２または２５ゲージ×３－７インチの脊髄針（Ｑｕｉｎｃｋｅ ｂｅｖｅｌ）；
インターベンション医師の裁量で使用される同軸導入針（脊髄針の導入用）；
スイベル（スピン）オスルアーロック付き４方向小口径ストップコック；
メスルアーロックアダプター付きのＴコネクタ延長セット（チューブ）、およその長さ６．７インチ；
くも膜下腔内投与のためのＯｍｎｉｐａｑｕｅ １８０（イオヘキソール）；
静脈内（ＩＶ）投与のためのヨード化造影剤；
１％リドカイン注射液（成人用ＬＰキットに含まれていない場合）；
プレフィルド１０ｃｃの生理食塩水（無菌）フラッシュシリンジ；
放射線不透過性マーカー（複数可）；
外科用準備器具／シェービング用かみそり；
挿管された対象の適切な位置決めを可能にする枕／支持具；
気管内挿管器具、全身麻酔機及び機械的人工呼吸器；
術中神経生理学的モニタリング（ＩＯＮＭ）装置（及び要員）；ならびに
ベクター含有の１０ｃｃシリンジ；別の薬局マニュアルに従って準備して、ＣＴ／手術室（ＯＲ）室に移送する。
この処置のインフォームドコンセントは、医療記録及び／または研究ファイル内で確認され、文書化される。放射線科医及び麻酔科医による処置に関する別個の同意は、施設の要件に従って得る。対象は、施設ガイドライン（例えば、２つのＩＶアクセスサイト）に従って適切な病院ケアユニット内に静脈内アクセスを行う。静脈内の液体は、麻酔科医の裁量で投与される。麻酔科医及び施設ガイドラインの裁量により、対象は、適切な患者ケアユニット、保持領域または外科／ＣＴ処置室において、全身麻酔の投与によって誘導され、気管内挿管を受けてもよい。
腰椎穿刺を行い、最初に脳脊髄液（ＣＳＦ）を５ｃｃ除去し、その後、くも膜下腔内に造影剤（Ｏｍｎｉｐａｑｕｅ １８０）を注射して大槽の視覚化を助ける。大槽内への造影剤の拡散を容易にするために、適切な対象の位置決め操作を行ってもよい。
術中神経生理学的モニタリング（ＩＯＮＭ）装置を対象に取り付ける。対象は、腹臥位または側臥位でＣＴスキャナテーブル上に置かれる。適切なスタッフが、移送中及び配置中の対象の安全を確保するために存在しなければならない。適切と考えられる場合、対象は、術前評価中に安全と判断された程度まで首の屈曲をもたらし、位置決め後に証明された正常な神経生理学的モニター信号があるような方式で位置決めされ得る。
以下のスタッフがいることが確認され、その場で確認される場合がある：インターベンション医師／神経外科医が以下の手順を実行する；麻酔科医及び呼吸技師（複数可）；看護師及び医師のアシスタント；ＣＴ（またはＯＲ）技術者；神経生理学技術者；及びサイトコーディネーター。「タイムアウト」は、共同委員会／病院のプロトコールごとに完了して、正しい対象、手順、場所、位置決め、及び部屋の全ての必要な機器の存在を確認する場合がある。次いで、現場治験責任者は、スタッフと一緒に、その対象を準備し得ることを確認し得る。
頭蓋骨基部の下の対象の皮膚を適宜剃毛する。ＣＴスカウト画像を実行し、続いて、標的位置を定位させ、血管系を画像化するためにインターベンション医師が必要と考える場合、ＩＶ造影剤を用いた処置前の計画ＣＴが続く。標的部位（大槽）が同定され、針の軌道が計画された後、皮膚は、施設ガイドラインに従って無菌技術を用いて準備して、ドレープする。放射線不透過性マーカーを、インターベンション医師によって指示された標的皮膚位置に配置する。マーカーの下の皮膚を１％リドカインによる浸潤により麻酔する。２２Ｇまたは２５Ｇの脊髄針は、同軸導入針を使用するオプションで、大槽に向かって前進される。
ニードルの前進後、ＣＴ画像は、施設の設備（理想的には≦２．５ｍｍ）を使用して実現可能な最も薄いＣＴスライス厚さを用いて得られる。針及び関連する軟部組織（例えば、傍脊椎筋、骨、脳幹及び脊髄）の適切な視覚化を可能にするできる限り低い放射線線量を使用する連続ＣＴ画像を得る。正確な針の配置は、針ハブ内のＣＳＦの観察及び大槽内の針先の可視化によって確認される。
インターベンション医師は、ベクターシリンジが、滅菌野の近くにあるが、滅菌野の外に位置していることを確認する。ベクターシリンジ内で薬学的組成物を取り扱うか、または投与する前に、手袋、マスク、及び目の保護は、滅菌野内で手技を支援するスタッフによって行われる。
延長チューブは、挿入された脊髄針に取り付けられ、その後、４方向ストップコックに取り付けられる。一旦、この装置が対象のＣＳＦに「自己プライミング」されると、１０ｃｃのプレフィルド生理食塩水フラッシュシリンジが４方向ストップコックのフラッシュ入口ポートに取り付けられる。次いで、ベクターシリンジはインターベンション医師に提供され、４方向ストップコックのベクター入口ポートに取り付けられる。
ストップコックのスイベルロックを第１の位置に配置することにより、ストップコックの出口ポートをベクターシリンジに開放した後、注射中にシリンジのプランジャーに過剰な力を加えないように注意深く、ベクターシリンジの内容物をゆっくりと（約１～２分にわたって）注射する。ベクターシリンジの内容物が注射された後、ストップコックのスイベルロックが第２の位置に回されるので、取り付けられたプレフィルドフラッシュシリンジを用いて、１～２ｃｃの生理食塩水でストップコック及び針アセンブリをフラッシュし得る。
準備ができたら、インターベンション医師は、対象から装置を取り外すことをスタッフに警告する。一回の動きで、針、拡張管、ストップコック、及びシリンジを対象からゆっくりと取り外し、バイオハザード廃棄レセプタクルまたは硬い容器（針用）に廃棄するために外科用トレイに置く。
針挿入部位を出血またはＣＳＦ漏出の徴候について検査し、研究者の指示に従って処置する。サイトは、示されているように、ガーゼ、外科用テープ及び／またはＴｅｇａｄｅｒｍ包帯を使用して手当する。次いで、対象をＣＴスキャナから出させて、ストレッチャー上に仰臥位で置く。適切なスタッフが、移送中及び配置中の対象の安全を確保するために存在する。
麻酔を中止して、対象は麻酔後のケアのための施設のガイドラインに従ってケアする。神経生理学的モニターは対象から除かれる。対象が横たわるストレッチャーの頭部は、回復中にわずかに（約３０度）持ち上げるべきである。対象は、施設ガイドラインに従って適切な麻酔後ケアユニットに移送される。対象は意識を十分に回復し、安定した状態になった後、プロトコールが命じるアセスメントのために適切なフロア／ユニットに収容される。プロトコールに従って神経学的評価が行われ、治験責任者は病院及び研究のスタッフと協力して対象のケアを監督する。
一実施形態では、本明細書で提供される組成物の送達方法は、以下のステップを包含する：患者の大槽内に脊髄針を前進させるステップと；可撓性チューブの長さを脊髄針の近位ハブに接続し、バルブの出力ポートを可撓性チューブの近位端に接続するステップと；この全身及び接続ステップの後、ならびにこのチューブが患者の脳脊髄液を自己プライミングすることを可能にした後、一定量の等張溶液を含む第１の容器をバルブのフラッシュ入口ポートに接続し、その後、一定量の薬学的組成物を含む第２の容器を、バルブのベクター入口ポートへ接続するステップと；上記第１及び第２の容器を上記バルブに接続した後、上記バルブの上記ベクター入口ポートと上記出口ポートとの間の流体流路を開き、上記脊髄針を通して上記薬学的組成物を上記患者に注射するステップと；薬学的組成物を注射した後、バルブのフラッシュ入口ポート及び出口ポートを通る流体流のための通路を開き、そして脊髄針に等張溶液を注射して、薬学的組成物を患者にフラッシュするステップ
。特定の実施形態では、本方法は、チューブ及びバルブを脊椎針のハブに接続する前に、大槽内の脊髄針の遠位先端の適切な配置を確認することをさらに包含する。特定の実施形態では、確認ステップは、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）画像を用いて大槽内の脊髄針の遠位先端を視覚化することを包含する。特定の実施形態では、この確認するステップは、脊髄針のハブ内の患者の脳脊髄液の存在を観察するステップを包含する。
上記の方法において、バルブは、第１の位置に対してスイベルに適合されたスイベルのルアーロックを備えるストップコックであってもよく、ベクター入口ポートから出口ポートへの流れを可能にし、一方で、同時にフラッシュ入口ポートを通る第２の位置への流れを遮断し、フラッシュ入り口ポートから出口ポートへの流れを可能にし、一方で同時にベクター入り口ポートを通る流れをブロックし、ここでスイベルルアーロックが、上記薬学的組成物が患者に注射される時上記第１の位置に配置され、上記薬学的組成物が等張溶液によって上記患者にフラッシュされているとき、上記第２の位置に配置される。特定の実施形態では、等張溶液を脊髄針に注射して薬学的組成物を患者にフラッシュした後、脊髄針を、アセンブリとしてそこに接続されたチューブ、バルブ、ならびに第１及び第２の容器を用いて患者から引き出す。特定の実施形態では、バルブは、スイベルオスルアーロックを備えた４方向ストップコックである。特定の実施形態では、第１及び第２の容器は別々のシリンジである。特定の実施形態では、Ｔコネクタが、脊髄針のハブに位置し、チューブを脊髄針に相互接続する。必要に応じて、脊髄針は、脊髄針の遠位端に導入針を備える。脊髄針は、５インチ、２２または２４ゲージの脊髄針であってもよい。特定の実施形態では、導入針は、３．５インチ、１８ゲージの導入針である。
特定の態様では、この方法は、少なくとも以下から構成されるデバイスを利用する、ある量の薬学的組成物を収容するための第１の容器と；等張溶液を収容するための第２の容器と；薬学的組成物が、患者の大槽内の脳脊髄液中にデバイスから直接放出され得る脊髄針と；第１の容器に相互接続された第１の入口ポート、第２の容器に相互接続された第２の入口ポート、脊髄針に相互接続された出口ポート、及び脊髄を通る薬学的組成物及び等張溶液の流れを制御するためのルアーロック針を有するバルブと。特定の実施形態では、このバルブは、第一の位置に対してスイベルに適合されたスイベルルアーロックを有するストップコックであり、第１の入口ポートから出口ポートへの流れを可能にする一方、同時に第１の入口ポートを通り、第２の位置への流れを阻止し、第２の位置口ポートから出口ポートへの流れを可能にする一方、同時に第１の入口ポートを通る流れを遮断する。必要に応じて、バルブはスイベルのオスルアーロック付きの４方向ストップコックである。特定の実施形態では、第１及び第２の容器は、別々のシリンジである。特定の実施形態において、脊髄針は、ある長さの可撓性チューブを介してバルブに相互接続される。Ｔ字型コネクタは、チューブを脊髄針に相互接続し得る。特定の実施形態では、脊髄針は、５インチ、２２または２４ゲージの脊髄針である。特定の実施形態では、このデバイスは、脊髄針の遠位端に接続された導入針をさらに備える。必要に応じて、導入針は３．５インチ、１８ゲージ導入針である。
以下の実施例は、例示的なものに過ぎず、本明細書に記載の本発明を限定するものではない。
６．実施例
実施例１：ヒト対象の処置のためのプロトコール
この実施例は、ＭＰＳ ＩＩ、すなわちハンター症候群を有する患者のための遺伝子治療処置に関する。この例では、野生型ｈＩＤＳ酵素をコードする改変ｈＩＤＳ遺伝子を発現する複製欠損アデノ随伴ウイルスベクター９（ＡＡＶ９）である遺伝子治療ベクターＡＡＶ９．ＣＢ．ｈＩＤＳを、ＭＰＳ ＩＩ患者の中枢神経系（ＣＮＳ）に投与する。全身
麻酔下で、ＡＡＶベクターの用量をＣＮＳに直接注射する。本明細書に記載されているように、神経認知発達及び／または代用マーカー、例としては、バイオマーカー、例えば、対象のＣＳＦまたは血清中の病原性ＧＡＧ及び／またはヘパリン硫酸（ＨＳ）濃度の低下という臨床尺度を用いて処置の有効性を評価する。
Ａ．遺伝子治療ベクター
遺伝子治療ベクターは、ヒトイズロネート－２－スルファターゼ（ＩＤＳ）を発現する血清型９の非複製組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであり、この実施例ではＡＡＶ９．ＣＢ．ＩＤＳと称する（図１を参照のこと）。ＡＡＶ９血清型は、ＩＣ投与後のＣＮＳにおけるｈＩＤＳ産物の効率的な発現を可能にする。
ＩＤＳ発現カセットは、逆方向末端反復（ＩＴＲ）によって隣接され、発現は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサー及びニワトリベータアクチンプロモーター（ＣＢ７）のハイブリッドによって駆動される。導入遺伝子は、ニワトリベータアクチンイントロン及びウサギベータグロビンポリアデニル化（ポリＡ）シグナルを含む。
ベクターを製剤緩衝液（Ｅｌｌｉｏｔｓ Ｂ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、０．００１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８）に懸濁する。この構築物をＡＡＶ９キャプシドにパッケージし、Ｍ．Ｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ．、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ、２１：１２５９－１２７１（２０１０）に以前に記載されているように精製して、力価測定した。製造プロセスは、以下の実施例４においてより詳細に記載される。
ベクター生成：
一連のベクターを生成した。１つのプラスミドは、コドン最適化ＩＤＳ配列（配列番号１１のｎｔ１１７７～ｎｔ２８２９）を含む。２つの他のものはＣＢ７プロモーター（ＣＢ６）の短いバージョンを使用し、ＳＵＭＦ１と呼ばれる第２のタンパク質を発現した［配列番号７及び配列番号１０］。産生されたベクターゲノムＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＩＤＳｃｏ．ＲＢＧは、配列番号１１のｎｔ２～ｎｔ３９６７の配列を有するが、ＡＡＶ．ＣＢ６．ｈＩＤＳｃｏ．ＩＲＥＳ．ｈＳＵＭＦ１ｃｏは、配列番号８のｎｔ１１～ｎｔ４９６４の配列を有する。ｈＩＤＳ配列をコドン最適化及び合成することによってプラスミドを構築し、次いで得られた構築物を、プラスミドｐＥＮＮ．ＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ＲＢＧまたはｐＥＮＮ．ＡＡＶ．ＣＢ６．ＣＩ．ＲＢＧ、ＣＢ７またはＣＢ６を含むＡＡＶ２ ＩＴＲ隣接発現カセット、ＣＩ及びＲＢＧ発現エレメントにクローニングし、上記ベクターゲノムを得る。
天然のヒトＩＤＳ ｃＤＮＡを含むさらに別のプラスミドを作製した；これらのプラスミドは本明細書では、ｐＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＩＤＳ．ＲＢＧ及びｐＡＡＶ．ＣＢ６．ＣＩ．ｈＩＤＳ．ＩＲＥＳ．ＳＵＭＦ１．ＲＢＧと称される。これらのプラスミドに由来するベクターゲノム［配列番号３のｎｔ２～ｎｔ３９６７及び配列番号５のｎｔ１１～ｎｔ４９６４］は、ｈＩＤＳ発現カセットに隣接するＡＡＶ２由来ＩＴＲを有する一本鎖ＤＮＡゲノムである。導入遺伝子カセットからの発現は、ＣＭＶ早初期エンハンサー（Ｃ４）とニワトリベータアクチンプロモーターとの間のハイブリッドであるＣＢ７またはＣＢ６プロモーターによって駆動されるが、このプロモーターからの転写は、ニワトリベータアクチンイントロン（ＣＩ）の存在によって増強される。発現カセットのポリＡシグナルは、ＲＢＧポリＡである。ｈＩＤＳ配列を合成することによってプラスミドを構築し、次いで、プラスミドｐＥＮＮ．ＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ＲＢＧまたはｐＥＮＮ．ＡＡＶ．ＣＢ６．ＣＩ．ＲＢＧ、ＣＢ７、ＣＩを含むＡＡＶ２ ＩＴＲに隣接する発現カセット及びＲＢＧ発現エレメントにクローニングし、上記ベクターゲノムを得る。
配列エレメントの説明：
逆方向末端反復（ＩＴＲ）：ＡＡＶ ＩＴＲ（ＧｅｎＢａｎｋ＃ＮＣ００１４０１）は、両端で同一であるが反対方向である配列である。ＡＡＶ２ ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ及びアデノウイルスヘルパー機能がトランスで提供される場合、ベクターＤＮＡ複製の起点及びベクターゲノムのパッケージングシグナルの両方として機能する。このように、ＩＴＲ配列は、ベクターゲノム複製及びパッケージングに必要とされる唯一のシス配列に相当する。
ＣＭＶ早初期エンハンサー（３８２ｂｐ、Ｃ４；ＧｅｎＢａｎｋ＃Ｋ０３１０４．１）。このエレメントは、ベクターゲノムプラスミド中に存在する。
ニワトリベータ－アクチンプロモーター（２８２ｂｐ；ＣＢ；ＧｅｎＢａｎｋ＃Ｘ００１８２．１）を用いて高レベルのｈＩＤＳ発現を駆動する。
ニワトリベータ－アクチンイントロン：ニワトリベータアクチン遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ＃Ｘ００１８２．１）の９７３ｂｐのイントロンがベクター発現カセットに存在する。イントロンは転写されるが、スプライシングによって成熟メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）から取り除かれ、その両側に配列がまとめられる。発現カセット中のイントロンの存在は、核から細胞質へのｍＲＮＡの輸送を促進し、これによって翻訳のための安定したレベルのｍＲＮＡの蓄積を促進することが示されている。これは、遺伝子発現のレベルの増大を意図した遺伝子ベクターにおける共通の特徴である。このエレメントは、ベクターゲノム及びプラスミドの両方に存在する。
イズロネート－２－スルファターゼコード配列：ｈＩＤＳ配列を合成した［配列番号１］。コードされたタンパク質は、本明細書のはじめの方に記載されている、５５０アミノ酸である［配列番号２；Ｇｅｎｂａｎｋ ＮＰ＿０００１９３、ＵｎｉｔＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ（Ｐ２２３０４．１）］。配列番号１及び２を参照のこと。コドン最適化ｈＩＤＳコード配列は、配列番号８のｎｔ３４２３～ｎｔ４５５３ならびに配列番号１１のｎｔ１９３７～ｎｔ３５８９に示される。
ポリアデニル化シグナル：１２７ｂｐのウサギベータグロビンポリアデニル化シグナル（ＧｅｎＢａｎｋ＃Ｖ００８８２．１）は、抗体ｍＲＮＡの効率的なポリアデニル化のためのシス配列を提供する。このエレメントは、転写終結、新生転写物の３’末端における特異的切断事象、及び長いポリアデニルテールの付加のためのシグナルとして機能する。このエレメントは、ベクターゲノム及びプラスミドの両方に存在する。
Ｂ．投薬及び投与経路
患者は、患者の２．５×１０１０～３．６×１０１１ＧＣ／ｇ脳質量に等価である１．０×１０１３～５．０×１０１４ＧＣ（フラット用量）の範囲内のｒＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＩＤＳの単一のくも膜下腔内／大槽内投与を受ける。あるいは、以下のフラット用量を、示された年齢群の患者に投与する：
・新生児：約３．８×１０１２～約１．９×１０１４ＧＣ；
・３～９ヶ月：約６×１０１２～約３×１０１４ＧＣ；
・９～３６ヶ月：約１×１０１３～約５×１０１４ＧＣ；
・３～１２年：約１．２×１０１３～約６×１０１４ＧＣ；
・１２＋歳：約１．４×１０１３～約７．０×１０１４ＧＣ；
・１８＋歳（成人）：約１．４×１０１３～約７．０×１０１４ＧＣ。
空のキャプシドが患者に投与されるｒＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＩＤＳの用量から確実に除去されるように、本明細書で考察されるとおり、ベクター精製プロセスの間の、塩化セシウム勾配超遠心分離またはイオン交換クロマトグラフィーによってベクター粒子から空の
キャプシドを分離する。
Ｃ．患者亜集団
適切な患者としては、以下の年齢の男性または女性対象が挙げられる：
・新生児；
・３～９ヶ月齢；
・９～３６ヶ月齢；
・３～１２歳；
・１２＋歳；
・１８＋歳（成人）。
Ｄ．臨床目的の測定
主要な臨床目的としては、ＭＰＳ ＩＩ欠損に関連する神経認知低下を予防及び／または必要に応じて逆転させることが挙げられる。臨床目的は、例えば、Ｂａｙｌｅｙ Ｓｃａｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｆａｎｔ ａｎｄ Ｔｏｄｄｌｅｒ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（乳児及び幼児発達のＢａｙｌｅｙ Ｓｃａｌｅｓ），Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＢＳＩＤ－ＩＩＩによって測定されるような神経認知を測定することによって決定され得る。他の適切な尺度は、例えば、Ｖｉｎａｎｔａｎｄ Ａｄａｐｔｉｖｅ Ｂｅｈａｖｉｏｒ Ｓｃａｌｅｓ（適応行動スケール），Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（ＶＡＢＳ－ＩＩ）によって測定される適応行動アセスメント及び例えばＩｎｆａｎｔ Ｔｏｄｄｌｅｒ Ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｑｕｅｓｔｉｏｎｎａｉｒｅ（商標）（ＩＴＱＯＬ）によって測定されるクオリティーオブライフの尺度である。
二次エンドポイントには、バイオマーカー及び臨床転帰の評価が含まれる。必要に応じて、ヒアリングを第２のエンドポイントとして評価してもよい。尿を、総ＧＡＧ含有量及びヘパラン硫酸について評価する。ＩＤＳ活性、抗ＩＤＳ抗体、ＧＡＧ、及びヘパリン補因子ＩＩ－トロンビン複合体の濃度について血清を評価する。ＣＳＦは、ＧＡＧ、ＩＤＳ活性、抗ＩＤＳ抗体及びヘパリン硫酸について評価する。ＣＳＦ及び血清中のＩＤＳ発現の薬物動態と同様に、抗ＩＤＳ抗体の存在を評価する。灰白質及びＣＳＦ脳室の容積分析もまたＭＲＩによって行う。
実施例２：ムコ多糖症ＩＩ型のマウスモデルでの研究－アデノ随伴ウイルスベクターのＣＳＦへの送達は、ムコ多糖症ＩＩ型マウスにおいて中枢神経系疾患を減弱させる
Ａ．脳脊髄液へのＡＡＶ９送達により中枢神経系疾患が是正される
ムコ多糖症ＩＩ型（ＭＰＳ ＩＩ）は、骨及び関節の変形、心臓及び呼吸器疾患、及び発達遅延を伴う早期小児期に典型的に現れるＸ連鎖リソソーム蓄積障害である。欠損酵素であるイズロネート－２－スルファターゼ（ＩＤＳ）の全身送達は、ＭＰＳ ＩＩの多くの症状を改善するが、その酵素が血液脳関門を通過しないため、現在、中枢神経系（ＣＮＳ）疾患の進行を防止する効果的な方法はない。ＭＰＳ ＩＩのマウスモデルを用いて、ＩＤＳ遺伝子のＡＡＶ血清型９ベクター媒介送達を、ＣＮＳにおける連続的なＩＤＳ発現を達成する手段として評価した。ＩＤＳノックアウトマウスは、３つのベクター用量（低－３×１０８、中－３×１０９または高－３×１０１０ゲノムコピー）のうちの１つの側脳室への単回注射を受け、ベクターの体内分布及びＩＤＳ発現の評価のためにベクター投与の３週間後に屠殺するか（ｎ＝７～８マウス／群）、またはベクター投与後３ヶ月で屠殺して、疾患進行に対する遺伝子移入の影響を評価した（ｎ＝７～８マウス／群）。ＩＤＳ活性は、脳脊髄液中で検出可能であり、低用量コホートで野生型レベルの１５％に達し、最高用量で正常の２６８％に達した。脳酵素活性は、低用量コホートの正常値の２．７％から高用量コホートの３２％までの範囲であった。ガングリオシドＧＭ３の染色による脳蓄積病変の定量化によって、それぞれ低、中、及び高用量コホートにおいて３５％、４６％、及び８６％の減少を伴う、用量依存的な是正が示された。処置されたマウスはまた
、新規の物体認識試験において、改善された認知機能を示した。これらの知見によって、くも膜下腔内ＡＡＶ媒介性遺伝子伝達が、ＣＮＳへの持続的な酵素送達のためのプラットフォームとして機能し、ＭＰＳ ＩＩを有する患者に対するこの重要な満たされていない必要性に対処することが示される。
Ｂ．ＡＡＶ９．ＣＢ．ｈＩＤＳの薬理学的及び神経行動学的効果
ＩＤＳ遺伝子のエキソン４及び５をネオマイシン耐性遺伝子で置換することにより、ＭＰＳ ＩＩのノックアウトマウスモデル（ＩＤＳノックアウト；ＩＤＳｙ／－）を作製した（Ｇａｒｃｉａ ｅｔ ａｌ．、２００７、Ｊ Ｉｎｈｅｒｉｔ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓ、３０：９２４－３４を参照のこと）。このモデルは、検出可能な酵素活性を示さず、ＭＰＳ ＩＩ患者に見られるものと同様の組織学的蓄積病変を発症する。ＩＤＳノックアウトマウスは、骨格異常を含むＭＰＳ ＩＩの多くの臨床的特徴を示す。マウスの神経行動表現型は、広範には評価されていないが、いくつかの研究では異常を示しており（Ｍｕｅｎｚｅｒ ｅｔ ａｌ．、２００１、Ａｃｔａ Ｐａｅｄｉａｔｒ Ｓｕｐｐｌ、９１（４３９）：９９－９）、したがって、ＭＰＳ ＩＩの処置としてＡＡＶ９．ＣＢ．ｈＩＤＳの効果を研究するための関連モデルである。実際、これは、この集団の臨床試験を支援するＭＰＳ ＩＩにおける酵素補充療法の効果を評価するために使用されているのと同じノックアウトマウスモデルである。このＭＰＳ ＩＩマウスモデルで実施された以下の研究は、処置活性ＡＡＶ９．ＣＢ．ｈＩＤＳを確立した。
Ｃ．材料及び方法
ベクター。ヒトＩＤＵＡ及びＩＤＳ ｃＤＮＡを、ニワトリベータアクチンプロモーター、ＣＭＶエンハンサー、イントロン、及びウサギベータグロビンポリアデニル化配列を含む発現構築物にクローニングした。発現構築物は、ＡＡＶ２逆方向末端反復に隣接していた。ＡＡＶ９ベクターは、ＨＥＫ２９３細胞の三重トランスフェクション及び以前に記載されているようなイオジキサノール精製（Ｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ．（２０１０）．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２１：１２５９－７１）によってこれらの構築物から生成した。
動物での処置。全ての動物プロトコールは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ（ペンシルベニア大学）のＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（動物実験及び使用委員会）により承認された。ＩＤＳノックアウトマウスを、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｓｔｏｃｋ ｎｏ：０２４７４４）から入手し、社内で飼育した。コロニー由来の野生型雄性Ｃ５７ＢＬ／６を対照として役立てた。２～３ヶ月齢で、動物をイソフルランで麻酔し、滅菌リン酸緩衝生理食塩水で希釈した５μＬのベクターをＩＣＶ注射した。ＣＳＦは、ポリエチレンチューブに接続された３２ゲージの針を用いて、後頭下穿刺によって剖検時に採取した。末端血清試料を、心臓穿刺によって収集した。動物を、ケタミン／キシラジン麻酔下で放血により安楽死させた。死亡は、頚椎脱臼によって確立した。脳、心臓、肺、肝臓及び脾臓をドライアイス上に集めた。組織学的実験のために、脳をＬＩＭＰ２免疫組織化学のために固定した前方半分と、ＧＭ３免疫組織化学のために固定した後方半分に分けた。２つのコホートのマウスを行動実験に使用した。野生型及びＩＤＳ ＫＯマウスの初期コホートを、一連の手順で試験して、遺伝子欠失が学習及び記憶に影響を与えるか否かを判定した。低、中または高ベクター用量のＡＡＶ９．ＣＢ．ｈＩＤＳ（それぞれ３×１０８、３×１０９または３×１０１０個のゲノムコピー（ＧＣ））で処置した第２のコホートマウスを用いて、行動障害の救済ストラテジーとしてＩＴ送達の実現可能性を調べた。
行動手順：全ての行動手順は、遺伝子型及び処置群に対して盲検されたオペレーターが行った。
オープンフィールド活動：オープンフィールドにおける自発的活動は、Ｐｈｏｔｏｂｅａｍ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｓｙｓｔｅｍ（ＰＡＳ）－Ｏｐｅｎ Ｆｉｅｌｄ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて測定した。マウスを個別に１０分間の試行のためにアリーナに配置した。一般的な移動及び飼育活動を評価するために、水平及び垂直のビームブレイクを収集した。
Ｙ迷路：短期記憶は、標準的なＹ字型迷路（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）で評価した。アームエントリーの配列及び数を、８分間のトライアル中に記録した。自発的交替行動（ＳＡ）は、前にエントリー（進入）したアームに直ちに戻ることなく、迷路の３つのアーム全てに連続エントリーするものとして定義した。運動の活動の尺度として、全アームエントリー（ＡＥ）を収集した。自発的交替行動は、％ＳＡ＝（ＳＡ／（ＡＥ－２）＊１００）として計算した。
文脈恐怖条件付け：条件付け実験は、Ａｂｅｌ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ.１９９７ Ｍ
ａｒ ７；８８（５）：６１５－２６によって記載のとおり行った。訓練の日に、マウスは、３００秒間、固有の条件付けチャンバ（Ｍｅｄ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）を探索することが可能であった。無信号、１．５ｍＡの連続フット・ショックが、２４８～２５０秒の間に送達された。チャンバ内でさらに３０秒後、マウスをそれらのホームケージに戻した。２４時間後、訓練が行われた同じチャンバ内で、空間的状況の想起を５分間連続して評価した。フリージング行動をスコアリングするのに使用されたソフトウェア（Ｆｒｅｅｚｅｓｃａｎ、ＣｌｅｖｅｒＳｙｓｔｅｍｓ）を用いて記憶を評価した。訓練セッションの２．５分の予備刺激期におけるフリージング率を、チャンバへの再暴露時のフリージング率と比較する。フリージングの増大は、学習が発生したことを示す。
新規物体認識：実験装置は、白い床上の灰色の長方形のアリーナ（６０ｃｍ×５０ｃｍ×２６ｃｍ）と、２つの固有の物体：３．８×３．８×１５ｃｍの金属バーと３．２ｃｍ直径×１５ｃｍのＰＶＣパイプから構成された。装置に暴露する前に、マウスを５日間にわたり１日あたり１～２分間取り扱った。５日間の慣らし段階の間、マウスは空のアリーナを５分／日で探索することが可能であった。訓練段階の間、マウスは１５分間同じ物体の２つを探索し、慣れを確立した。２４時間後の想起段階では、マウスは、今では慣れた物体と新規物体とを備えるアリーナに戻された。マウスは新規物体を優先的に探索する。新規性に対する嗜好の低下は、慣れた物体を思い起こさせず、したがって学習不足を示唆する。全てのセッションを記録し、オープンソースの画像解析プログラム（Ｐａｔｅｌ ｅｔ ａｌ．、Ｆｒｏｎｔ Ｂｅｈａｖ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０１４ Ｏｃｔ ８；８：３４９）で対象を探索するのに費やした時間をスコア付けした。
酵素及びＧＡＧアッセイ。ＧＡＧ、Ｈｅｘ及びＩＤＵＡアッセイは、以前に記載されたように行った（Ｈｉｎｄｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ．、２０１５）、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２３：１２９８－３０７）。ＩＤＳ活性は、０．１Ｍ酢酸ナトリウムに溶解した１．２５ｍＭ
４－メチルウンベリフェリルα－Ｌ－イドピラノシイズロン酸２－硫酸塩（Ｓａｎｔａ
Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）の２０μＬ（０．０１Ｍ酢酸鉛含有）（ｐＨ５．０）を１０μＬの試料と共にインキュベートすることによって測定した。３７℃で２時間インキュベートした後、４５μＬのＭｃＩｌｖａｉｎ緩衝液（０．４Ｍリン酸ナトリウム、０．２Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ４．５）及び５μＬの組換えヒトイズロニダーゼ（Ａｌｄｕｒａｚｙｍｅ、０．５８ｍｇ／ｍＬ、Ｇｅｎｚｙｍｅ）を、反応混合物に加え３７℃で一晩インキュベートした。混合物をグリシン緩衝液（ｐＨ １０．９）で希釈し、放出された４－ＭＵを、遊離４－ＭＵの標準希釈と比較した蛍光（励起３６５ｎｍ、発光４５０ｎｍ）によって定量した。
組織学。脳を、ＬＩＭＰ２免疫組織化学のために固定された前方半分と、ＧＭ３免疫組
織化学のために固定された後方半分に分けた。ＬＩＭＰ２及びＧＭ３免疫組織化学を、以前に記載されたように実施した（Ｈｉｎｄｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ．、２０１５）、Ｍｏｌ
Ｔｈｅｒ ２３：１２９８－３０７）。ＬＩＭＰ２及びＧＭ３について陽性に染色された細胞の数を、盲検のレビューアによって各動物の４つの脳切片において定量化した。
ベクターの生体内分布。ベクターの体内分布分析のための組織を迅速に解剖し、ドライアイス上で凍結させた。分析の時点まで試料を－８０℃で保存した。ＱＩＡｍｐ ＤＮＡ
Ｍｉｎｉ Ｋｉｔを用いてＤＮＡを組織から単離し、ベクターゲノムを、記載されているようにＴａｑＭａｎ ＰＣＲによって定量した（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．、２０１１）、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２２：１３８９－１４０１）。
抗ｈＩＤＳ抗体のＥＬＩＳＡ。ポリスチレンＥＬＩＳＡプレートを、ｐＨ５．８に滴定したＰＢＳ中の組換えヒトＩＤＳ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）５μｇ／ｍＬで一晩コーティングした。プレートを洗浄し、中性ＰＢＳ中の２％ウシ血清アルブミン中で１時間ブロックした。次いで、プレートを、ＰＢＳで１：１０００に希釈した血清試料とともにインキュベートした。結合した抗体を、２％ＢＳＡを含むＰＢＳ中で１：１０，０００に希釈したＨＲＰ結合ヤギ抗マウス抗体（Ａｂｃａｍ）で検出した。アッセイは、テトラメチルベンジジン基質を用いて行い、２Ｎ硫酸で停止させた後に、４５０ｎｍでの吸光度を測定した。力価は、１：１０，０００の力価で適宜割り当てられた陽性血清試料の連続希釈により生成された標準曲線から決定した。
統計学。処置された及び未処置のマウスにおける、組織ＧＡＧ含有量、Ｈｅｘ活性及び脳蓄積病変を、一方向ＡＮＯＶＡを用い、続いてダネットの多重比較試験を用いて比較した。オープンフィールド及びＹ迷路の日付を、Ｓｔｕｄｅｎｔｓ ｔ－ｔｅｓｔで分析した。二元配置ＡＮＯＶＡ及びダネットのポストホック分析を、恐怖条件付けデータに適用して、トライアル及び遺伝子型の影響を評価した。新規物体の認識試験では、新規物体対慣れた物体を探索する時間を、各グループのｔ検定を使用して、次に多重比較のためのボンフェローニ補正を使用して比較した。
雄性ＩＤＳノックアウトマウスの４匹の年齢適合群及び野生型同腹仔の１群（１群あたり８匹のマウス（ｎ＝８））は、２～３月齢で以下の処置を受けた：
・１群：未処置
・第２群：脳室内ＡＡＶ９．ＣＢ．ｈＩＤＳ低用量３×１０８ＧＣ（１．８７５×１０９ＧＣ／ｇ脳質量）
・第３群：脳室内ＡＡＶ９．ＣＢ．ｈＩＤＳ中用量３×１０９ＧＣ（１．８７５×１０１０ＧＣ／ｇ脳質量）
・第４群：脳室内ＡＡＶ９．ＣＢ．ｈＩＤＳ高用量３×１０１０ＧＣ（１．８７５×１０１１ＧＣ／ｇ脳質量）
・第５群：未処置の野生型同腹仔。
Ｄ．結果：
２～３月齢の雄性ＩＤＳｙ／－マウスを、サイトメガロウイルスエンハンサー（ＡＡＶ９．ＣＢ．ｈＩＤＳ）を有するニワトリベータアクチンプロモーター由来の、ヒトＩＤＳを発現するＡＡＶ９ベクターの脳室内（ＩＣＶ）注射により処置した。ある最初のコホートでは、３種類のベクター用量［３×１０８、３×１０９または３×１０１０ゲノムコピー（ＧＣ）］のうちの１つでマウスを処置し、ベクターの生体内分布及びＩＤＳ発現の評価のためにベクター投与の３週間後に屠殺した。未処置のＩＤＳｙ／－マウス及び野生型のオスの同腹仔が対照として役立った。生体内分布分析のために組織を収穫した。高用量群におけるベクター生体内分布の分析は、効率的な脳標的化を示し、宿主二倍体ゲノムあたり平均して１つのベクターゲノムを有した（図３）。ＣＳＦへのＡＡＶ送達の以前の研
究と一致して、宿主二倍体ゲノムあたり２つ以上のベクターゲノムを有する、周辺へのベクター逃避及び効率的な肝標的化も存在した（図３）。脳組織、ＣＳＦ、及び血清は全て、高用量群において野生型レベルに近づくか、またはそれを上回った、ＩＤＳ活性の用量依存的増大を示した（図２Ａ～２Ｃ）。中及び高用量コホートでは、ヒトＩＤＳに対する抗体がいくつかの動物の血清で検出されたが、これは循環酵素活性に有意に影響しないようであった（図８）。
ＩＤＳ遺伝子のＩＴ ＡＡＶ９媒介性送達の治療可能性を評価するために、ＩＤＳｙ／－マウスのさらなるコホートを同等のベクター用量で処理し、その後の時点で評価して、疾患進行に対する遺伝子移入の影響を評価した。ベクター投与の２ヶ月後、マウスを行動及び神経認知試験に供した。処置から３ヶ月後、疾患活性の組織学的及び生化学的評価のために、動物を屠殺し、組織を採取した。
高レベルの血清酵素活性と一致して、肝臓ではＧＡＧ蓄積が減少し、心臓におけるＧＡＧ蓄積の正常化に向かう有意な傾向はなかった（図４Ａ～４Ｂ）。さらに、ＧＡＧ蓄積の設定でアップレギュレートされたリソソーム酵素ヘキソサミニダーゼ（Ｈｅｘ）の活性は、両方の組織において正常化された（図４Ｃ～４Ｄ）。これらのデータによって、ＡＡＶ９．ＣＢ．ｈＩＤＳのくも膜下腔内投与後の全身治療の活性の可能性が示される。
未処置のＭＰＳ ＩＩマウスの脳は、リソソーム膜タンパク質ＬＩＭＰ２の蓄積を含むニューロンにおけるリソソーム蓄積、ならびにＧＭ３を含むガングリオシドの二次蓄積の明らかな組織学的証拠を示した（図５Ｌ）。処置したマウスは、ＬＩＭＰ２及びＧＭ３染色の両方によって明らかなニューロン蓄積病変における用量依存性の減少を示した（図５Ａ～５Ｌ）。このデータに基づいて、１．８７５×１０９ＧＣ／ｇという低用量が、マウスがＧＭ３及びＬＩＭＰ２蓄積病変の両方において有意な（約５０％）減少を示した最低用量であったため、マウスにおける最小有効用量（ＭＥＤ）であることが推定された。
行動試験は、マウスがベクター投与の２ヶ月後、４～５ヶ月齢に達したときに実施した。一般的な行動、ならびに短期及び長期の記憶を評価するために、包括的な一連の試験を実施した。ＩＤＳｙ／－マウスは、オープンフィールドアリーナにおいて正常な探索的活動を示した（図９Ａ～９Ｃ）。Ｙ迷路における自発的交替行動（図９Ｄ）を用いて、短時間の作業記憶を評価した。ＩＤＳｙ／－マウスは、野生型同腹仔と同様の数のアームエントリー及び同等の自発的交替行動を有し、インタクトな短期記憶を示した。長期記憶は、古典的文脈恐怖条件付け（ＦＣ）及び新規物体認識（ＮＯＲ）を用いて評価した。ＦＣでは、嫌悪刺激と特定の文脈との関連は、その文脈への再露出時にフリージング行動を引き起こす。全てのマウスは、学習が起こったことを実証する試験の想起段階中のフリージング時間率の増大を示したが、ＩＤＳｙ／－マウスは野生型同腹仔と比較してフリージングの減少を示した（図６Ａ）。処置された動物では、正常と未処置のＩＤＳｙ／－マウスとの間の相違が小さいことに起因して処置効果を評価することは困難であったが、文脈的な恐怖条件付けの明確な改善はなかった（図６Ｂ）。ＮＯＲでは、マウスは一対の同様の物体を探索することが許されている。訓練の２４時間後に、今では慣れた１つの物体を新規物体に置き換える。マウスには、新規物体を探求する先天性がある；そうしなければ、慣れた物体の認識が欠けていることが示され、記憶不足が明らかになる。野生型マウスは、新規物体の選択を示したが、ＩＤＳｙ／－マウスは嗜好を示さなかった。注目すべきことに、くも膜下腔内ＡＡＶ９遺伝子治療は、ＩＤＳｙ／－マウスで観察された長期ＮＯＲ欠損を救済した（図６Ｃ）。全ての群が、慣れた物体と比較して新規物体を探索する時間の割合が大きい傾向を示す、全ての処置されたＩＤＳｙ／－マウスにおいて、物体の識別が改善されるようであった。この研究では、投与群間の行動障害の相対的救済度を比較するのに十分なほどの力はなかったが（図６Ａ～６Ｃ）、新規物体の嗜好は中用量コホートにおいてのみ統計的に有意であった。
マウス疾患モデルにおけるＩＴ ＡＡＶ送達を評価する１つの欠点は、わずかに０．４ｇの脳質量及び４０μＬのＣＳＦ容積を有する極めて小型のマウスＣＮＳが、３，５００倍も大きいヒト脳におけるベクター及び分泌酵素の拡散を正確にモデリングし得ないということである。関連するリソソーム蓄積症ムコ多糖症Ｉ型（ＭＰＳＩ）のこれまでの研究では、この問題に対処するために自然発生大型動物モデルを利用した。［Ｈｉｎｄｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒａｐｙ：ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍ Ｓｏｃ Ｇｅｎ Ｔｈｅｒａｐｙ、２０１４：２２：２０１８－２０２７；Ｈｉｎｄｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍ Ｓｏｃ Ｇｅｎ Ｔｈｅｒａｐｙ、２０１５：２３：１２９８－１３０７］。平均脳質量がそれぞれ３０ｇ及び７２ｇであるＭＰＳ Ｉのネコ及びイヌは、ヒトの脳における広範なベクター及び酵素送達を達成するという課題に対処するためにはるかに現実的なモデルを提供した。これらのモデルで実施された研究は、ＭＰＳ Ｉに対するＩＴ ＡＡＶ９送達の有効性の重要な証拠を提供した［Ｈｉｎｄｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒａｐｙ：ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍ Ｓｏｃ Ｇｅｎ Ｔｈｅｒａｐｙ、２０１４：２２：２０１８－２０２７；Ｈｉｎｄｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍ Ｓｏｃ Ｇｅｎ Ｔｈｅｒａｐｙ、２０１５：２３：１２９８－１３０７］。同様の有効性がＭＰＳ ＩＩにおけるこの同じアプローチを使用して可能であるか否かを決定するために、本発明者らは、ＭＰＳ ＩＩにおける酵素発現及び交差是正の相対的効率を調べるために、ＭＰＳ Ｉマウスにおいて平行用量範囲試験を行った。ＩＤＳの代わりのα－Ｌ－イズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）導入遺伝子を除いて、ＭＰＳ Ｉマウスを、ＩＤＳｙ／－マウスに使用したベクターと同一のベクターで処理した。ＭＰＳ ＩＩ研究と同様に、２～３月齢でＭＰＳ Ｉマウスを３×１０８、３×１０９、または３×１０１０ＧＣ（１群あたりｎ＝８）の用量で処置し、脳酵素活性の測定のために処置後２１日目に屠殺するか、または組織学的分析のために処置３ヶ月後に屠殺した。絶対酵素活性及び野生型発現レベルに対しての両方において、ＩＤＳと比較してＩＤＵＡの発現がいくらかより効率的に現れたが（図７Ａ）、ＩＤＳｙ／－マウスで観察されたものと同様の用量応答の脳酵素発現があった。脳貯蔵病変の是正は、２つの疾患モデル間で類似していたが、最も低いベクター用量でＭＰＳ Ｉマウスにおいて処置が軽度にさらに有効であるように思われた（図７Ａ～７Ｂ）。これらの結果によって、ＭＰＳ ＩＩのＩＴ ＡＡＶ９媒介性遺伝子移入が、ＭＰＳ Ｉにおいて観察されるものとほぼ同じ効率で脳蓄積病変の是正をもたらすこと、及びこのアプローチがマウスからスケールアップされた場合でも有効なままであることが示唆される。しかし、脳における効率の低い酵素発現を克服するために、ＭＰＳ Ｉと比較してＭＰＳ ＩＩではわずかに高いベクター用量が必要な場合がある。
本研究では、ＭＰＳ ＩＩマウスにおけるヒトＩＤＳ遺伝子を保有するＡＡＶ９ベクターのＩＴ送達は、ＣＮＳにおける治療レベルの発現及び脳蓄積病変の解消をもたらした。機能改善は、未処置の対照と比較して、処置したマウスにおけるより大きな新規の対象の識別によって示された。神経認知障害は、ＩＤＳｙ／－マウスにおいて以前はよく特徴づけられていなかった。これらの知見によって、ＩＤＳｙ／－マウスが、野生型同腹仔と比較して、オープンフィールドで正常な探索活動、及びＹ迷路で同様のアームエントリーと同様の活動を有することが示される。これらの移動評価は、通常の探索を必要とする他のタイプの行動を検討する際に重要である。ＩＤＳｙ／－マウスは、対照と比較してＹ迷路における同様の自発的交替行動によって示されたインタクトな短期作業記憶を有することが見出されている。対照的に、Ｈｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．［Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ、２０１２：１０７：１２２－１２８］は、３２週齢のＩＤＳｙ／－マウスにおける自発的交替行動の減少及びアームの増大を報告した。種々のＹ迷路の結果は、試験時の年齢が異なることが原因であり、ＭＰＳ ＩＩの進行性を強調する。本発明者らは、ＩＤＳの欠損が長期記憶の２つの形態に及ぼす影響を評価した。軽度の
欠損が、ＩＤＳｙ／－マウスにおける文脈恐怖条件付けにおいて同定された。ＤＳｙ／－マウスは、嫌悪刺激を受けた状況を想起することが可能であったが、野生型同腹仔と比較して、フリージング応答の有意な低下が示された。ＡＡＶ９のＩＴ送達を受けたＩＤＳｙ／－マウスは、注射していないマウスと同様のフリージング応答を示した。したがって、回復は検出されなかった。長期記憶喪失は、新規物体認識においても見出された。ＮＯＲでは、ＩＤＳｙ／－マウスは、慣れた物体と比較して新規物体を好まないことが示された。ベクター処理したマウスは、未処置のＩＤＳｙ／－マウスに見られるＮＯＲ欠損の回復を示した。物体判別は、中用量コホートにおいてのみ統計的に有意であったが、ただし群あたり８匹であって、この研究は行動エンドポイントの用量応答を評価するにはあまり強くなかった。２つのタイプの長期記憶の回復に示差的に影響するＡＡＶ９のＩＴ送達能力は、各タスクに必要とされる異なる神経基質に起因する可能性がある。文脈恐怖条件付けは、視床周囲皮質を必要とするＮＯＲとは対照的な海馬依存性のタスクである［Ｏｌｉｖｅｉｒａ、ｅｔ ａｌ、Ｐｏｓｔ－ｔｒａｉｎｉｎｇ ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｎｏｖｅｌ ｏｂｊｅｃｔ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｍｅｍｏｒｙ（海馬の訓練後の可逆的不活性化は、新規物体認識記憶を増強する）。Ｌｅａｒｎｉｎｇ＆ｍｅｍｏｒｙ（Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ）２０１０；１７：１５５－１６０；Ａｂｅｌ ｅｔ ａｌ．、Ｃｅｌｌ １９９７；８８：６１５－６２６］。
ＭＰＳ ＩＩ及びＭＰＳ ＩマウスモデルにおけるＩＴ ＡＡＶ９送達の効率の比較によって、ＭＰＳ ＩＩのＩＴ ＡＡＶ送達が、以前はＭＰＳ Ｉの大きな動物モデルで示されていたように、かなり大きな脳の大きさ及びＣＳＦ量の状況では広範な疾患の是正を生じるのに十分に効率的であることを証明する、２つの疾患の間で酵素発現及び組織是正が類似していることが示された［Ｈｉｎｄｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒａｐｙ：ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍ Ｓｏｃ Ｇｅｎ Ｔｈｅｒａｐｙ、２０１４：２２：２０１８－２０２７；Ｈｉｎｄｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍ Ｓｏｃ Ｇｅｎ Ｔｈｅｒａｐｙ、２０１５：２３：１２９８－１３０７］。興味深いことに、欠損酵素の発現は、ＭＰＳ
Ｉと比較してＭＰＳ ＩＩにおいていくらか効率が低かった。これは、単に、これらの特定のベクターの発現効率の産物であったが、発現構築物中の制御エレメントは同一であった。いくつかの研究では、ＩＤＳのようなスルファターゼの発現が、ＩＤＳの翻訳後修飾に必要とされるスルファターゼ改変因子ＳＵＭＦ１の利用可能性によって制限され得ることが示唆された［Ｆｒａｌｄｉ ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊ、２００７：４０３：３０５－３１２。しかし、ＩＤＳ及びＳＵＭＦ１の同時発現を評価するパイロット実験は、より活性なＩＤＳ発現を示さなかった（データは示さず）。それにもかかわらず、蓄積病変の是正は、ＭＰＳ Ｉマウスの場合とほぼ同じくらいＭＰＳ ＩＩマウスで効率的であり、遺伝子移入は、ＭＰＳ Ｉ及びＭＰＳ ＩＩ患者の両方に対して同様に効果があるはずであることが示されたが、後者の場合、適度に高いベクター用量が、最適な転帰には必須である場合がある。
ＣＮＳ遺伝子移入に加えて、処置したＭＰＳ ＩＩマウスにおいて有意な肝形質導入及び末梢酵素発現があり、ＭＰＳ ＩＩにおけるＩＴ ＡＡＶ９送達の可能性のある全身的利益が示されている。これは、様々な他の種におけるＩＴ ＡＡＶ送達の研究と一致している［Ｐａｓｓｉｎｉ ｅｔ ａｌ．、Ｈｕ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、２０１４；２５：６１９－６３０；Ｈｉｎｄｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ－Ｍｅｔｈｏｄｓ＆Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ２０１４；１；；Ｈｉｎｄｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ：ｔｈｅ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０１４；２２：２０１８－２０２７；Ｈｉｎｄｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ：ｔｈｅ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅ
ｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０１５；２３：１２９８－１３０７；Ｇｕｒｄａ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ：ｔｈｅ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０１５；Ｈｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．、上記引用；Ｈａｕｒｉｇｏｔ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ、２０１３：１２３：３２５４－３２７１；Ｇｒａｙ ｅｔ ａｌ．、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、２０１３：２０：４５０－４５９］。特に、ＩＴ ＡＡＶベクター送達後の肝形質導入は種間で実質的に変化するので、ヒトが有意な末梢発現を示すか否かはまだ明らかではない。
この研究は、ＩＴ ＡＡＶ９送達が、脳への効果的なＩＤＳ遺伝子移入を達成し、ＭＰＳ ＩＩのＣＮＳ兆候を解決し、このアプローチの臨床への進歩を支持することを実証する。
これらのデータによって、ＡＡＶ９．ＣＢ．ｈＩＤＳがＭＰＳ ＩＩマウスにおける神経認知障害を改善し得るという予備的証拠が得られる。
実施例３：非ヒト霊長類研究
成体雄性アカゲザルにおけるＡＡＶ９．ＣＢ．ｈＩＤＳの安全性及び効果を評価するために、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）における研究を実施する。この研究の目的は、くも膜下腔内（ＩＴ）ＡＡＶ９．ＣＢ．ｈＩＤＳの局所的、急性及び慢性の毒性を評価すること、ならびにベクターの生体内分布を定義することである。ＡＡＶ９．ＣＢ．ｈＩＤＳ（５．６×１０１１または１．８７５×１０１１ＧＣ／ｇ脳質量）の２つの用量のうちの１つまたはビヒクル対照希釈剤でのＡＡＶ９．ＣＢ．ｈＩＤＳのＩＴ注射で合計２１匹の雄性マカクザルを処置する。低用量は、ＭＰＳ ＩＩマウス（ＭＥＤ＝１．８７５×１０９ＧＣ／ｇ）のＭＥＤよりも約１００倍大きく、ＭＰＳＩＩマウスにおける統計的に有意な組織学的改善及び認知機能を反映すると考えられる神経行動変化を生じる最低用量に対応する。より高い用量（ＭＥＤの約３００倍）は、ベクターが製剤化され得る最大濃度であり、ＣＳＦに安全に投与され得る注射容積（＜１０％ＣＳＦ容積）を維持する要件によって制限される。注射処置の間、動物は全身麻酔下に維持される。後頭下腔に脊髄針を入れる；配置は蛍光透視法を介して確認され、用量は１ｍＬの総容積で投与される。注射後０日、３日、７日、１４日、２１日及び３０日ならびにその後毎月に臨床病理評価のために血清及びＣＳＦを収集する。注射後１４、９０、及び１８０日目に、各用量群の３匹の雄性マカクザル（各時間点につき合計６匹）を病理学及び生体内分布について屠殺する。ビヒクル処置動物は対照として役立つ。全ての動物由来の組織に対して完全な組織病理学を行い、高用量コホートについてベクターの生体内分布の分析を行う。ＤＮＡ抽出及び定量的ＰＣＲによるベクターゲノムの検出は、以前に記載されたように（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．、２０１３、Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ、２４（４）：１５４－１６０を参照のこと）行われる。このアッセイは、１μｇのＤＮＡあたり２０のベクターゲノムコピーを超える感度を有し、スパイク対照は、個々の試料の反応効率を検証するために含まれる。生体内分布、生化学及び免疫原性データを１４日、３ヶ月及び６ヶ月で収集する。
実施例４：ｒＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＩＤＳベクターの作製
ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＩＤＳは、ヒトＨＥＫ２９３ ＭＣＢ細胞の以下のトリプルプラスミドのトランスフェクションで生成する：（ｉ）ｈＩＤＳベクターゲノムプラスミド、（ｉｉ）ＡＡＶ ｒｅｐ２及びｃａｐ ９野生型遺伝子を含むｐＡＡＶ２９と呼ばれるＡＡＶヘルパープラスミドならびに（ｉｉｉ）ｐＡｄΔＦ６（Ｋａｎ）と呼ばれるヘルパーアデノウイルスプラスミド。
プラスミドｐＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＩＤＳ．ＲＧＢのクローニングは、上記の実施
例１に記載のとおりである。このプラスミド由来のベクターゲノムは、ｈＩＤＳ発現カセットに隣接するＡＡＶ２由来のＩＴＲを有する一本鎖ＤＮＡゲノムである。導入遺伝子カセットからの発現は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）早初期エンハンサー（Ｃ４）とニワトリベータアクチンプロモーターとの間のハイブリッドであるＣＢ７プロモーターによって駆動されるが、このプロモーターからの転写は、ニワトリベータアクチンイントロン（ＣＩ）の存在によって増強される。発現カセットのポリＡシグナルは、ウサギベータグロビン（ＲＢＧ）ポリＡである。ｈＩＤＳ配列［配列番号８のｎｔ１１７７～ｎｔ２８２９、及び配列番号１１のｎｔ１９３７～ｎｔ３５８９］をコドン最適化すること及び合成することによってプラスミドを構築し、得られた構築物を、プラスミドｐＥＮＮ．ＣＢＶ、ＣＩ．ＲＢＧ（ｐ１０４４）、ＣＢＶ、ＣＩ及びＲＢＧ発現エレメントを含むＡＡＶ２
ＩＴＲに隣接発現カセットにクローニングしてｐＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＩＤＳ．ＲＢＧを得た。
ｃｉｓプラスミドｐＡＡＶ．ＣＢ７ＣＩｈＩＤＳ．ＲＧＢ．ＫａｎＲのクローニング：ＰａｃＩ制限酵素を用いてこのプラスミドからベクターゲノムを切り出し、カナマイシン耐性遺伝子を含むｐＫＳＳに基づくプラスミド骨格（ｐ２０１７）にクローニングした。最終的なベクターゲノムプラスミドは、ｐＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＩＤＳ．ＲＢＧ．ＫａｎＲである。
ＡＡＶ２／９ヘルパープラスミドｐＡＡＶ２９ＫａｎＲＧＸＲｅｐ２：ＡＡＶ２／９ヘルパープラスミドｐＡＡＶ２９ＫａｎＲＧＸＲｅｐ２は、ＡＡＶ９由来の４つの野生型ＡＡＶ２ ｒｅｐタンパク質及び３つの野生型ＡＡＶ ＶＰキャプシドタンパク質をコードする。キメラパッケージ構築物を作製するために、まず、野生型ＡＡＶ２ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を含むプラスミドｐ５Ｅ１８由来のＡＡＶ２ ｃａｐ遺伝子を除去し、肝臓ＤＮＡから増幅されたＡＡＶ９ ｃａｐ遺伝子のＰＣＲ断片と置換した。得られたプラスミドに識別子ｐＡＡＶ２－９（ｐ０００８）を与えた。通常、ｒｅｐ発現を促進するＡＡＶ
ｐ５プロモーターは、この構築物において、キャップの５’末端からｒｅｐの３’末端に移されることに留意のこと。この配置は、プロモーターとｒｅｐ遺伝子（すなわちプラスミド骨格）との間にスペーサーを導入し、ｒｅｐの発現をダウンンレギュレートし、ベクター産生を支持する能力を増大させるのに役立つ。ｐ５Ｅ１８中のプラスミド骨格は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ由来である。ＡＡＶ２／９ヘルパープラスミドｐＡＡＶ２９ＫａｎＲＧＸＲｅｐ２は、４つの野生型ＡＡＶ２ ｒｅｐタンパク質、ＡＡＶ９由来の３つの野生型ＡＡＶ ＶＰキャプシドタンパク質、及びカナマイシン耐性をコードする。
ｐＡｄＤｅｌｔａＦ６（Ｋａｎ）アデノウイルスヘルパープラスミドは、１５，７７０ｂｐのサイズである。このプラスミドは、ＡＡＶ複製にとって重要なアデノウイルスゲノムの領域、すなわちＥ２Ａ、Ｅ４及びＶＡ ＲＮＡ（２９３細胞によってアデノウイルスＥ１機能が提供される）を含むが、他のアデノウイルス複製または構造遺伝子を含まない。このプラスミドは、アデノウイルス逆方向末端反復のような複製にとって重要なシスエレメントを含まず、したがって、感染性アデノウイルスは生成されないと予想される。それはＡｄ５のＥ１、Ｅ３欠失分子クローン（ｐＢＨＧ１０、ｐＢＲ３２２ベースのプラスミド）に由来した。欠失をＡｄ５ ＤＮＡに導入して、不要なアデノウイルス遺伝子の発現を除去し、アデノウイルスＤＮＡの量を３２ｋｂから１２ｋｂに減少させた。最後に、アンピシリン耐性遺伝子を、カナマイシン耐性遺伝子に置き換えて、ｐＡｄΔＦ６（Ｋａｎ）を得た。ＡＡＶベクター産生に必要なＥ２、Ｅ４及びＶＡＩアデノウイルス遺伝子の機能的エレメントは、このプラスミドに残っている。アデノウイルスＥ１必須遺伝子機能は、ＨＥＫ２９３細胞によって供給される。ＤＮＡプラスミド配列決定を、Ｑｉａｇｅｎ
Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｓｅｒｖｉｃｅｓにより行ったところ、参照配列ｐＡｄＤｅｌｔａＦ６（Ｋａｎ）ｐ１７０７ＦＨ－Ｑの以下の重要な機能的エレメントと１００％相同性が示された：Ｅ４ ＯＲＦ６ ３６９２－２８０８ｂｐ；Ｅ２Ａ ＤＮＡ結合タンパク質１１
７８４－１０１９４ｂｐ；ＶＡ ＲＮＡ領域１２４２６－１３３７８ｂｐ。
製造プロセスを要約した流れ図を、図１０Ａ～図１０Ｂに示す。
細胞播種：適格なヒト胚性腎臓２９３細胞株を、製造プロセスに使用する。Ｃｏｒｎｉｎｇ（コーニング）Ｔフラスコ及びＣＳ－１０を用いて細胞を５×１０９～５×１０１０細胞まで増殖すると、ＢＤＳの１ロットあたりのベクター産生に最大５０のＨＳ－３６を播種するのに十分な細胞集団が生成される。細胞は、１０％ガンマ線照射された米国産牛ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）からなる培地中で培養する。細胞は、足場依存性であり、細胞解離は、動物産物を含まない細胞解離試薬であるＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔを使用して達成される。細胞の播種は、滅菌した使い捨てのバイオプロセスバッグ及びチュービングセットを使用して達成される。細胞を、３７℃（±２℃）、５％（±０．５％）のＣＯ２雰囲気中で維持する。細胞培養培地を、新鮮な無血清ＤＭＥＭ培地と交換し、最適化されたＰＥＩベースのトランスフェクション法を用いて３つの生産プラスミドでトランスフェクトする。製造プロセスで使用される全てのプラスミドは、ｃＧＭＰ製造：トレーサビリティ、文書管理、及び材料の分離の最も顕著な特徴を利用するＣＭＯ品質システム及びインフラストラクチャの状況で生成される。
十分なＤＮＡプラスミドトランスフェクション複合体をＢＳＣ中で調製し、最大５０のＨＳ－３６（ＢＤＳバッチあたり）をトランスフェクトする。最初に、７．５ｍｇのｐＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＩＤＳ．ＲＢＧ．ＫａｎＲベクターゲノムプラスミド、１５０ｍｇのｐＡｄＤｅｌｔａＦ６（Ｋａｎ）、７５ｍｇのｐＡＡＶ２９ＫａｎＲＧＸＲｅｐ２ ＡＡＶヘルパープラスミド及びＧＭＰグレードＰＥＩ（ＰＥＩＰｒｏ、ＰｏｌｙＰｌｕｓ
Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ＳＡ）を含有するＤＮＡ／ＰＥＩ混合物を調製する。このプラスミド比は、小規模最適化研究におけるＡＡＶ産生に最適であると判定された。よく混合した後、溶液を室温で２５分間放置する。次いで無血清培地に添加して反応をクエンチさせ、次いでＨＳ－３６に添加した。トランスフェクション混合物を、ＨＳ－３６の全３６層の間で等しくし、細胞を５％（±０．５％）ＣＯ２雰囲気中で、３７℃（±２℃）で５日間インキュベートする。
細胞培地採取：トランスフェクトされた細胞及び培地を、各ＨＳ－３６から、そのユニットから培地を無菌的に排液することにより、使い捨てのバイオプロセスバッグを用いて採取する。培地の回収後、約８０リットルの容積にＭｇＣｌ２を補充して最終濃度２ｍＭ（ベンゾナーゼについては補因子）にし、ベンゾナーゼヌクレアーゼ（カタログ番号：１．０１６７９７．０００１、Ｍｅｒｃｋ Ｇｒｏｕｐ）を最終濃度が２５単位／ｍｌまで添加する。産物（使い捨てバイオプロセスバッグ中）を、インキュベーター中で、３７℃で２時間インキュベートして、トランスフェクション手順の結果として、収集中に残存する細胞及びプラスミドＤＮＡを酵素消化するのに十分な時間を与える。このステップを行って、最終ベクター中の残存ＤＮＡの量を最小にする。インキュベーション期間の後、ＮａＣｌを５００ｍＭの最終濃度まで添加して、濾過及び下流タンジェンシャルフロー濾過の間の生成物の回収を助ける。
清澄化：蠕動ポンプによって駆動される、滅菌された閉鎖チューブ及びバッグセットとして、直列に接続されたデプスフィルターカプセル（１．２μｍ／０．２２μｍ）を使用して、細胞及び細胞破片を生成物から除去する。清澄化により、下流のフィルター及びクロマトグラフィーカラムが汚れから保護され、バイオバーデン還元濾過が確実に行われ、フィルタートレインの終わりに下流の精製の前に、上流の製造プロセス中に潜在的に導入されるバイオバーデンが除去される。収集物を、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓａｒｔｏｇｕａｒｄ ＰＥＳカプセルフィルター（１．２／０．２２μｍ）（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｔ
ｅｄｉｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．）に通す。
大規模タンジェンシャルフロー濾過：清澄化された生成物の容積減少（１０倍）は、カスタムの無菌閉鎖バイオプロセッシングチューブ、バッグ、及びメンブレンセットを使用したタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）によって達成される。ＴＦＦの原理は、適切な多孔度（１００ｋＤａ）の膜に平行な圧力下で溶液を流すことである。圧力差は、膜を通ってより小さいサイズの分子を駆動し、膜の孔よりも大きな分子を保持しながら廃棄ストリームに効果的に移動させる。溶液を再循環させることにより、平行流が膜表面を掃引し、膜孔の汚れを防止する。適切な膜の孔径及び表面積を選択することによって、液体試料は、所望の分子を保持及び濃縮しながら、容積は急速に減少し得る。ＴＦＦの適用におけるダイアフィルトレーションは、液体が膜を通って廃棄ストリームに通過するのと同じ速度で再循環試料に新しい緩衝液を添加することを包含する。ダイアフィルトレーションの量が増大するにつれて、再循環試料から漸増する量の小分子が除去される。これは、清澄化された生成物の中程度の精製をもたらすが、その後のアフィニティーカラムクロマトグラフィーステップと適合する緩衝液交換も達成する。従って、本発明者らは、濃縮用の１００ｋＤａのＰＥＳ膜を利用し、次いで、以下から構成される４容積の緩衝液でダイアフィルトレーションする：２０ｍＭのトリスｐＨ７．５及び４００ｍＭのＮａＣｌ。ダイアフィルトレーションした生成物を４℃で一晩保存し、次いで１．２μｍ／０．２２μｍのデプスフィルターカプセルでさらに清澄化し、沈殿した物質を除去する。
アフィニティークロマトグラフィー：ダイアフィルトレーションした産物を、ＡＡＶ２／９血清型を効率的に捕捉するＣａｐｔｕｒｅ Ｓｅｌｅｃｔ ＴＭ Ｐｏｒｏｓ－ＡＡＶ２／９アフィニティー樹脂（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に加える。これらのイオン条件下では、有意なパーセンテージの残留細胞ＤＮＡ及びタンパク質がカラムを通って流れ、一方でＡＡＶ粒子が効率的に捕捉される。加えた後、カラムを洗浄して追加の供給不純物を除去した後、低ｐＨステップ溶出（４００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭクエン酸ナトリウム；ｐＨ２．５）を行い、これは１／１０容積の中和緩衝液（Ｂｉｓ Ｔｒｉｓ Ｐｒｏｐａｎｅ、２００ｍＭ、ｐＨ１０．２）への収集によって直ちに中和する。
陰イオン交換クロマトグラフィー：空のＡＡＶ粒子を含む製造過程の不純物のさらなる減少を達成するために、Ｐｏｒｏｓ－ＡＡＶ２／９溶出プールを、５０倍に希釈して（２０ｍＭ Ｂｉｓ Ｔｒｉｓプロパン、０．００１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８；ｐＨ １０．２）イオン強度を低下させ、ＣＩＭｕｌｔｕｓ Ｑモノリスマトリックス（ＢＩＡ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）への結合を可能にする。低塩洗浄後、６０ＣＶのＮａＣｌ直線塩勾配（１０－１８０ｍＭ ＮａＣｌ）を用いてベクター産物を溶出する。この浅い塩勾配は、ベクターゲノムを含む粒子（完全な粒子）からベクターゲノムなしのキャプシド粒子（空の粒子）を効果的に分離し、完全なキャプシドに富む調製物をもたらす。チューブへの非特異的結合及び高ｐＨへの曝露の長さを最小にするために、それぞれ、１／１００倍の容積の０．１％プルロニックＦ６８及び１／２７倍の容積のＢｉｓ Ｔｒｉｓ ｐＨ６．３を含むチューブに画分を集める。適切なピーク画分を収集し、ピーク面積を評価し、以前のデータと比較して、近似のベクター収量を決定する。
ＢＤＳを得るための最終処方及び滅菌濾過：ＴＦＦを用いて、１００ｋＤａの膜を有するプールされたＡＥＸ画分の最終処方を達成する。これは、４倍量の処方緩衝液（エリオットＢ溶液、０．００１％プルロニックＦ６８）によるダイアフィルトレーションによって達成し、濃縮してＢＤＳを得て、それによって陰イオン交換クロマトグラフィーからのピーク面積を以前のデータと比較して、５×１０１３ＧＣ／ｍｌ以上の力価を達成する濃縮係数を推定する。試料を、ＢＤＳ試験のために取り出す（以下のセクションで記載）。濾過された精製バルクを、無菌ポリプロピレンチューブに保存し、最終充填まで放出されるまで隔離場所で、－６０℃以下で凍結する。予備安定性研究によって、本発明者らが提
案した製剤緩衝液中でＤＰが凍結及び解凍後の活性を失わないことが示される。－８０℃での長期保存後の安定性を評価するためのさらなる研究が進行中である。
最後の充填：冷凍ＢＤＳを解凍し、プールし、最終製剤緩衝液を用いて標的力価まで希釈し、０．２２μｍフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）で最終的に濾過し、Ｗｅｓｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌの「Ｒｅａｄｙ－ｔｏ－Ｕｓｅ」（プレフィルド）の２ｍｌガラスバイアル及び１３ｍｍの栓及びシール中に、１バイアルあたり０．６ｍｌ以上２．０ｍｌ以下の充填容積で充填する。個々に標識されたバイアルは、以下の仕様に従って表示される。ラベル付きバイアルは、－６０℃以下で保存する。
ベクター（薬物製品）を、単一の固定濃度でバイアルし、唯一の変数は１バイアルあたりの容積である。より低い用量濃度を達成するために、薬剤製品をＥｌｌｉｏｔｓ Ｂ溶液、０．００１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８で希釈する。高用量ベクターは、希釈せずに直接使用されるが、低ベクターは、投薬時に薬局によって行われる製剤緩衝液中で１：５希釈を必要とする。
実施例５：ベクターの試験
血清型同一性、空の粒子含有量及び導入遺伝子産物の同一性を含む特徴付けアッセイを実施する。アッセイの説明を以下に示す。
Ａ．ベクターゲノムの同一性：ＤＮＡ配列決定
ウイルスベクターゲノムＤＮＡを単離し、プライマーウォーキングを用いて２倍の配列決定カバレッジによって配列を決定する。配列アライメントを行い、予想される配列と比較する。
Ｂ．ベクターキャプシド同一性：ＶＰ３のＡＡＶキャプシド質量分析
ベクターのＡＡＶ２／９血清型の確認は、質量分析（ＭＳ）によるＶＰ３キャプシドタンパク質のペプチドの分析に基づくアッセイによって達成される。この方法は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルから切り出されたＶＰ３タンパク質バンドのマルチ酵素消化（トリプシン、キモトリプシン及びエンドプロテイナーゼＧｌｕ－Ｃ）、続いてキャプシドタンパク質を配列決定するＱ－Ｅｘａｃｔｉｖｅ Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析計上のＵＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳでの特徴付けを包含する。宿主タンパク質産物の差引き及び質量スペクトルからのキャプシドペプチド配列の導出を可能にする、タンデム質量スペクトル（ＭＳ）法が開発された。
Ｃ．ゲノムコピー（ＧＣ）力価
ｏｑＰＣＲベースのゲノムコピー力価を、ある範囲の連続希釈にわたって決定し、同族プラスミド標準（ｐＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＩＤＳ．ＲＢＧ．ＫａｎＲ）と比較する。ｏｑＰＣＲアッセイは、ＤＮａｓｅＩ及びプロテイナーゼＫを用いた連続消化、続いてキャプシド化ベクターゲノムコピーを測定するためのｑＰＣＲ分析を利用する。この同じ領域にハイブリダイズする蛍光標識されたプローブと組み合わせて、ＲＢＧポリＡ領域を標的とする配列特異的プライマーを用いてＤＮＡ検出を達成する。プラスミドＤＮＡ標準曲線との比較によって、ＰＣＲ後の試料操作を必要とせずに、力価決定が可能になる。多数の標準、バリデーション試料及び対照（バックグラウンド及びＤＮＡ混入用）をアッセイに導入した。このアッセイは、感度、検出限界、適格性の範囲ならびに細胞内及び細胞間アッセイの精度を含むアッセイパラメータを確立し、定義することにより、定量される。内部ＡＡＶ９参照ロットを確立し、資格試験を実施するために使用する。以前の経験から、本明細書に記載の最適化されたｑＰＣＲアッセイによって得られた力価は、一般に、前臨床データの生成に使用された本発明者らの標準ｑＰＣＲ技術により達成された力価の２
．５倍であることが示唆される。
Ｄ．空の粒子対全粒子の比
医薬品の総粒子含有量は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析によって決定される。イオジキサノール勾配で精製された参照ベクター調製物を、様々な方法（分析的非遠心分離、電子顕微鏡及び２６０／２８０ｎｍでの吸光度）によって分析して、その調製物が＞９５％のゲノム含有（完全）粒子を含有することを確立する。この参照物質は、既知のゲノムコピー数（したがって、拡張すれば粒子数）まで連続的に希釈され、各希釈物は、同様の希釈系列の薬物生成物とともにＳＤＳ ＰＡＧＥゲル上で流される。参照物質及び医薬品ＶＰ３タンパク質バンドの両方のピーク領域容積をデンシトメトリーによって決定し、参照物質容積を、粒子数に対してプロットする。薬物生成物の全粒子濃度をこの曲線からの外挿により決定し、次いでゲノムコピー（ＧＣ）力価を差し引いて空の粒子力価を得る。空の粒子対全粒子の比は、空の粒子力価対ＧＣ力価の比である。
Ｅ．感染性力価
感染性単位（ＩＵ）アッセイを使用して、ＲＣ３２細胞（ｒｅｐ２発現ＨｅＬａ細胞）におけるベクターの生産的取り込み及び複製を決定する。以前に発表されたものと同様に、９６ウェルエンドポイントフォーマットが採用されている。簡潔には、ＲＣ３２細胞を、ｒＡＡＶ９．ＣＢ．ｈＩＤＳの連続希釈と、ｒＡＡＶの各希釈で１２回の反復でのＡｄ５の均一希釈とによって同時感染させる。感染の７２時間後、細胞を溶解し、ｑＰＣＲを行って入力に対するｒＡＡＶベクターの増幅を検出する。終点希釈ＴＣＩＤ５０計算（Ｓｐｅａｒｍａｎ－Ｋａｒｂｅｒ）を実施して、ＩＵ／ｍｌとして表される複製力価を決定する。「感染性」値は、細胞と接触する粒子、受容体結合、内在化、核への輸送及びゲノム複製に依存するので、アッセイ形状ならびに使用される細胞系における適切な受容体及び結合後の経路の存在によって影響される。受容体及び結合後の経路は、通常、不死化細胞株において維持されないため、感染性アッセイ力価は、存在する「感染性」粒子の数の絶対的な尺度ではない。しかし、キャプシド化されたＧＣと「感染性単位」（ＧＣ／ＩＵ比として記載）との比を、ロット間での製品一貫性の尺度として使用してもよい。
ＧＣ／ＩＵ比は、製品の一貫性の尺度である。ｏｑＰＣＲ力価（ＧＣ／ｍｌ）を感染性単位（ＩＵ／ｍｌ）で割って、算出されたＧＣ／ＩＵ比を得る。
Ｆ．複製コンピテントなＡＡＶ（ｒｃＡＡＶ）アッセイ
ある試料を、生産プロセス中に潜在的に生じ得る複製コンピテントＡＡＶ２／９（ｒｃＡＡＶ）の存在について分析する。細胞ベースの増幅及び継代とそれに続くリアルタイムｑＰＣＲ（キャップ９標的）によるｒｃＡＡＶ ＤＮＡの検出からなる３継代アッセイが開発されている。細胞ベースの構成要素は、試験試料及び野生型ヒトアデノウイルスタイプ５（Ａｄ５）の希釈液を用いてＨＥＫ２９３細胞（Ｐ１）の単層を接種することからなる。１０１０ＧＣのベクター産物は、試験した生成物の最大量である。アデノウイルスの存在により、複製コンピテントＡＡＶは、細胞培養において増幅する。２日後、細胞溶解物を生成して、Ａｄ５を熱不活性化する。次いで、清澄化された溶解物を、第２ラウンドの細胞（Ｐ２）に継代して（再びＡｄ５の存在下で）感受性を高める。２日後、細胞溶解物を生成して、Ａｄ５を熱不活性化する。次いで、清澄化された溶解物を、細胞の第３ラウンド（Ｐ３）に継代して、（再度、Ａｄ５の存在下で）感受性を最大にする。２日後、細胞を溶解してＤＮＡを放出させ、次いでこれをｑＰＣＲに供してＡＡＶ９キャップ配列を検出する。Ａｄ５依存的な様式でのＡＡＶ９キャップ配列の増幅は、ｒｃＡＡＶの存在を示す。ＡＡＶ２ ｒｅｐ及びＡＡＶ９ ｃａｐ遺伝子を含むＡＡＶ２／９代理陽性対照の使用により、アッセイの検出限界（ＬＯＤ）を決定することが可能になり（０．１、１、１０及び１００ＩＵ）、ｒＡＡＶ９．ＣＢ．ｈＩＤＳベクターの連続希釈（１×１０１０、１×１０９、１×１０８、１×１０７ＧＣ）を使用して、試験試料中に存在するｒｃ
ＡＡＶの近似レベルを定量してもよい。
Ｇ．インビトロでの力価
ｑＰＣＲＧＣ力価を遺伝子発現と関連付けるために、１細胞あたり既知の多重度のＧＣを用いてＨＥＫ２９３（ヒト胎児腎臓）細胞を形質導入し、形質導入の７２時間後のＩＤＳ活性について上清をアッセイすることによりインビトロバイオアッセイを実施する。ＩＤＳ活性は、０．１ｍｌの水に希釈した試料を１００ｍｍｏｌ／ｌの４ＭＵ－イズロニド－２－硫酸の０．１ｍｌと３７℃で１～３時間インキュベートすることによって測定する。反応を、２ｍｌのグリシン２９０ｍｍｏｌ／ｌ、１８０ｍｍｏｌ／ｌのクエン酸ナトリウム、ｐＨ１０．９の添加により停止させ、遊離した４ＭＵを、蛍光を４ＭＵの標準希釈液と比較することによって定量する。高度に活性な前臨床及びｔｏｘベクター調製物との比較は、生成物活性の解釈を可能にする。
Ｈ．総タンパク質、キャプシドタンパク質、タンパク質純度決定及びキャプシドタンパク質比
ビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイを用いて、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）タンパク質標準曲線に対する全タンパク質について、ベクター試料を総タンパク質についてまず定量する。決定は、等量の試料をキットに入っているＭｉｃｒｏ－ＢＣＡ試薬と混合することによって行う。同じ手順を、ＢＳＡ標準の希釈に適用する。混合物を６０℃でインキュベートし、吸光度を５６２ｎｍで測定する。標準曲線は、４パラメータ適合を用いて既知の濃度の標準吸光度から生成される。未知試料は、４パラメータ回帰に従って定量する。
ＡＡＶ純度の半定量的測定を得るために、試料をゲノム力価について正常化し、還元条件下でＳＤＳ－ポリアクリルアミド（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）ゲル上で５×１０９ＧＣで分離する。次いで、ゲルを、ＳＹＰＲＯ Ｒｕｂｙ染料で染色する。１レーンあたり２５、５０、及び１００ｎｇのタンパク質の共電気泳動されたＢＳＡ標準と比較することによって、あらゆる不純物バンドを、デンシトメトリーによって定量する。これらの量は、総ＡＡＶタンパク質試料の１％、２％及び４％に相当する。３つのＡＡＶ特異的タンパク質ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３に加えて、現れる染色されたバンドは、タンパク質不純物と考えられる。全ての不純物バンドを参照タンパク質と比較し、不純物質量パーセント及びおよその分子量を報告する。ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルはまた、ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３タンパク質を定量化し、それらの比を決定するためにも使用される。
実施例６：ＭＰＳ ＩＩバイオマーカー
今回の研究では、ＭＰＳ Ｉイヌ由来のＣＳＦ試料の代謝産物プロファイリングを行い、ＣＳＦメタボロームにおける実質的な疾患関連変化が明らかになった。最も顕著な相違は、正常対照と比較してスペルミンレベルの３０倍以上の上昇であった。この知見は、ＭＰＳ Ｉ患者試料ならびにＭＰＳ Ｉのネコモデルにおいて確認され、ＭＰＳ ＩＩにおいても見出されると予想される。スペルミンはＨＳに結合し、スペルミンの細胞取り込みは、この相互作用に依存する［Ｍ．Ｂｅｌｔｉｎｇ、Ｓ．Ｐｅｒｓｓｏｎ、Ｌ．－Ａ．Ｆｒａｎｓｓｏｎ、Ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ ｉｎ ｐｏｌｙａｍｉｎｅ ｕｐｔａｋｅ（プロテオグリカンは、ポリアミン摂取に関与する）。Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ３３８、３１７－３２３（１９９９）；Ｊ．Ｅ．Ｗｅｌｃｈ、Ｐ．Ｂｅｎｇｔｓｏｎ、Ｋ．Ｓｖｅｎｓｓｏｎ、Ａ．Ｗｉｔｔｒｕｐ、Ｇ．Ｊ．Ｊｅｎｎｉｓｋｅｎｓ、Ｇ．Ｂ．Ｔｅｎ Ｄａｍ、Ｔ．Ｈ．Ｖａｎ Ｋｕｐｐｅｖｅｌｔ、Ｍ．Ｂｅｌｔｉｎｇ、Ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ｆｒａｇｍｅｎｔ ａｎｔｉ－ｈｅｐａｒａｎ ｓｕｌｆａｔｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔａｒｇｅｔｓ ｔｈｅ ｐｏｌｙａｍｉｎｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｓｙｓｔｅｍ ａｎｄ ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ ｐｏｌｙａｍｉｎｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ（単鎖フラグメント抗ヘパラン硫酸抗体は、ポリアミン輸送系を標的とし、ポリアミン依存性細胞
増殖を減弱させる）．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｏｎｃｏｌｏｇｙ ３２，７４９－７５６（２００８）；オンライン公開ＥｐｕｂＡｐｒ］。Ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎｓ ｓｕｃｈ ａｓ ｇｌｙｐｉｃａｎ－１ ｃａｎ ｂｉｎｄ ｓｐｅｒｍｉｎｅ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅｉｒ ＨＳ ｍｏｉｅｔｉｅｓ， ａｎｄ ａｆｔｅｒ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｇｌｙｐｉｃａｎ ｐｒｏｔｅｉｎ， ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ
ｔｈｅ ＨＳ ｃｈａｉｎ ｒｅｌｅａｓｅｓ ｂｏｕｎｄ ｓｐｅｒｍｉｎｅ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｃｅｌｌ（グリピカン－１のような細胞表面プロテオグリカンは、そのＨＳ部分を通じてスペルミンに結合し得、グリピカンタンパク質のエンドサイトーシス後、ＨＳ鎖の細胞内切断は、細胞に対して結合したスペルミンを遊離する）（Ｂｅｌｔｉｎｇ
ｅｔ ａｌ．、Ｋ．Ｄｉｎｇ、Ｓ ｅｔ ａｌ．、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７６、４６７７９－４６７９１（２００１）；オンライン公開ＥｐｕｂＤｅｃ １４）。従って、無傷のＨＳリサイクリングは、スペルミン摂取にとって必須である。ＭＰＳ Ｉでは、細胞外スペルミンの蓄積は、非効率的なＨＳリサイクリングに起因するこの取り込み機構の阻害を通じて、またはＭＰＳに蓄積する細胞外ＧＡＧへのスペルミンの単純な結合を通じて起こり得、スペルミン結合平衡をシフトさせて細胞外分布を促進する。今後の研究は、ＭＰＳ Ｉ ＣＳＦにおけるスペルミン蓄積に対するこれらの機構の相対的な貢献に取り組むべきである。
本発明者らは、スペルミン合成の阻害剤がＭＰＳニューロンにおける過剰な神経突起伸長をブロックしたこと、及び患者のＣＳＦに見られるものと同様のスペルミン濃度によってＷＴニューロンにおいて神経突起伸長が誘導され得ることを見出した。ＭＰＳ Ｉのイヌモデルにおける遺伝子治療は、スペルミン蓄積を逆転させ、ＧＡＰ４３の発現を正常化し、同じ経路がインビボで影響を受けることを示唆した。本発明者らは、インビボでのスペルミン合成阻害の影響を直接評価し得なかった。なぜなら、利用可能な阻害剤は血液脳関門を通過せず、誕生から慢性の直接ＣＮＳ投与は動物モデルでは実現不可能であるからである。本発明者らのインビトロでの知見は、ＭＰＳ Ｉにおける異常な神経突起伸長におけるスペルミンの役割を支持しているが、スペルミン合成の阻害は、表現型を完全に逆転させず、正常なニューロンへのスペルミン添加はＭＰＳ Ｉニューロンのレベルに対して神経突起伸長を増大しなかったことに注目することが重要である。スペルミン調節の影響は、比較的短期の処置によって制限された可能性がある。スペルミンの蓄積は、ＭＰＳ
Ｉにおける神経突起伸長に寄与する唯一のメディエーターではない可能性もある。特に、多くの神経栄養因子がＨＳ修飾受容体を通じて結合し、細胞外マトリックス中のＨＳとの相互作用は、神経突起伸長に影響を及ぼし得る［Ｄ．Ｖａｎ Ｖａｃｔｏｒ、Ｄ．Ｐ．Ｗａｌｌ、Ｋ．Ｇ．Ｊｏｈｎｓｏｎ、Ｈｅｐａｒａｎ ｓｕｌｆａｔｅ ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｅｍｅｒｇｅｎｃｅ ｏｆ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｉｔｙ（ヘパラン硫酸プロテオグリカン及びニューロン結合の出現）．Ｃｕｒｒｅｎｔ ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ１６，４０－５１（２００６）；オンライン公開ＥｐｕｂＦｅｂ（１０．１０１６／ｊ．ｃｏｎｂ．２００６．０１．０１１）］。したがって、スペルミン蓄積は、ＭＰＳ Ｉにおける異常な神経突起伸長を促進するいくつかの要因のうちの１つであり得る。
１５匹のＭＰＳ ＩイヌＣＳＦ試料をスクリーニングしたが、１匹だけが正常範囲のスペルミン濃度に収まった。２８日齢で、これは研究に含まれた最も若い動物であった。この知見は、スペルミン蓄積が年齢に依存し得ることを示している。今後の研究では、ＭＰＳ患者においてＣＳＦスペルミンのレベルを長軸方向に評価すべきである。ＭＰＳ患者の年齢とともにスペルミンが増大する場合、発達遅延の発症前に大部分の患者が１～２年という正常な発達を経験するので、認知低下の動態を説明し得る。
ＨＳ代謝の障害がニューロンの成長を変化させる代謝産物の蓄積を誘発する可能性は、
ＭＰＳ Ｉにおける酵素欠損と異常な神経突起伸長表現型との間の新規な関連を指し示す可能性があり、これらの障害に伴う認知機能不全を説明する可能性がある。これらの知見はまた、ＣＳＦスペルミンが、ＭＰＳ Ｉのための新規なＣＮＳ指向性療法の薬力学を評価するための非侵襲的バイオマーカーとして有用であることを示す。
材料及び方法：
実験的デザイン：この研究は、健康な対照由来の試料と比較して、ＭＰＳ Ｉ患者のＣＳＦ試料において有意に異なるレベルで存在する代謝産物を検出するために最初にデザインした。ＭＰＳ ＩＨの小児及び健康な対照からのＣＳＦ試料の利用可能性が限られているため、その後、ヒト試料中の候補バイオマーカーを評価する目的で、より多数が入手可能であったＭＰＳ Ｉイヌ由来のＣＳＦ試料を用いて、最初のスクリーニングを行った。個々の未処置のＭＰＳ Ｉイヌからの合計１５のＣＳＦ試料を分析に利用してもよく、さらに健康な対照から１５の試料を得た。有望な代謝産物スクリーニングにおいてＭＰＳ ＩイヌＣＳＦにおけるスペルミン上昇の同定に続いて、遺伝子治療で処置されたＭＰＳ Ｉイヌ及びネコの以前の研究由来のＣＳＦ試料ならびに患者試料においてスペルミンをレトロスペクティブに測定した。これらの分析のために各群に含まれた対象の数は、試料の入手可能性によって制限され、統計的考察に基づくものではなかった；したがって、ある場合には、統計的比較のための数は不十分であった。インビトロでの神経突起伸長の研究のために、各条件について定量された細胞の数は、１細胞あたりの分岐長、神経突起数または神経突起枝の２０％の差異を検出するために、１条件あたり＞３０個の細胞が必要であることを示したパイロット実験に基づいた。細胞をプレートし、指定された薬物で処理した後、ウェルをコード化し、細胞画像の獲得及び神経突起の長さ及び分岐の手技的な定量化を、盲検のレビューアによって行った。類似の結果を有する異なる基質［チャンバスライド（Ｓｉｇｍａ Ｓ６８１５）ではなくポリ－Ｌ－リジン（Ｓｉｇｍａ）コーティングされた組織培養プレート］を用いて野生型マウスとＭＰＳマウスニューロンの比較を繰り返した。スペルミン添加の有無にかかわらず両方の基質を用いて野生型ニューロンの比較を４回行って同様の結果を得た。
ＣＳＦ代謝産物プロファイリング：ＣＳＦ代謝産物プロファイリングは、Ｍｅｔａｂｏｌｏｎによって実施した。
処理するまで試料を－８０℃で保存した。試料は、ＭｉｃｒｏＬａｂ ＳＴＡＲ（登録商標）システム（Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｃｏｍｐａｎｙ）を用いて調製した。ＱＣ目的のための抽出プロセスの第１段階の前に、回収標準を加えた。タンパク質を、２分間激しく振盪しながらメタノールで沈殿させた後、遠心分離した。得られた抽出物を、以下の５つの画分に分けた：１つは、陽イオンモードエレクトロスプレーイオン化を伴う逆相（ＲＰ）ＵＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析用、１つは、陰イオンモードエレクトロスプレーイオン化を伴うＲＰ／ＵＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析用、１つは、陰イオンモードエレクトロスプレーイオン化を伴う親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）／ＵＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳによる分析用、１つは、ＧＣ－ＭＳによる分析用、そして１つの試料をバックアップのために確保した。試料をＴｕｒｂｏＶａｐ（登録商標）（Ｚｙｍａｒｋ）上に短時間置いて、有機溶媒を除去した。ＬＣについては、分析準備の前に試料を窒素下で一晩保存した。ＧＣについては、分析の準備の前に各試料を一晩真空下で乾燥させた。
プラットフォームのＬＣ／ＭＳ部分は、加熱されたエレクトロスプレーイオン化（ＨＥＳＩ－ＩＩ）源及びＯｒｂｉｔｒａｐ 質量分析計とインターフェースされたＷａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ超高速液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）及びＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｑ－Ｅｘａｃｔｉｖｅ高分解能／正確質量分析装置は、３５，０００質量分解能で作動した。試料抽出物を乾燥し、次いでＬＣ／ＭＳ法の各々に適合する溶媒中で再構成した。各再構成溶媒は、注入及びクロマトグラフィーの一貫性を確保するために一定濃度の一連の標準物質を含んでいた。ＲＰクロマトグラフィーでは、酸性陽イオン
最適化条件及び他の塩基性の陰イオン最適化条件を用いて分析した。各方法は、別の専用のカラム（Ｗａｔｅｒｓ ＵＰＬＣ ＢＥＨＣ１８－２．１×１００ｍｍ、１．７μｍ）を利用した。酸性条件で再構成された抽出物は、０．１％ギ酸を含有する水及びメタノールを用いて勾配溶出した。塩基性抽出物は、メタノール及び水を用いて同様に、ただし６．５ｍＭ重炭酸アンモニウムを用いて溶出した。第３のアリコートを、１０ｍＭギ酸アンモニウムを含む水及びアセトニトリルからなる勾配を使用して、ＨＩＬＩＣカラム（Ｗａｔｅｒｓ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ａｍｉｄｅ ２．１×１５０ｍｍ、１．７μｍ）からの溶出後の陰イオン化によって分析した。ＭＳ分析は、動的排除を使用して、ＭＳとデータ依存ＭＳｎスキャンとの間で交互に行った。走査範囲は、方法によってわずかに異なるが、８０－１０００ｍ／ｚをカバーした。
ＧＣ－ＭＳによる分析を目的とした試料を、最低１８時間真空下で乾燥させた後、ビストリメチルシリルトリフルオロアセトアミドを用いて乾燥窒素下で誘導化した。誘導化された試料を、キャリアガスとしてのヘリウム及び６０分～３４０℃の温度上昇を１７．５分の期間で５％ジフェニル／９５％ジメチルポリシロキサン溶融シリカカラム（２０ｍ×０．１８ｍｍ ＩＤ；０．１８ｕｍフィルム厚）で分離した。電子衝撃イオン化（ＥＩ）を使用してＴｈｅｒｍｏ－Ｆｉｎｎｉｇａｎ Ｔｒａｃｅ ＤＳＱ高速走査単一四重極質量分析計で試料を分析し、単位質量分解能で操作した。走査範囲は、５０～７５０ｍ／ｚであった。
数種類の対照を、実験試料と呼応して分析した：少量の各実験試料を採取することによって生成されたプールされたマトリックス試料は、データセット全体にわたって技術的複製物として役立った；抽出された水試料は、プロセスブランクとして役立った；内因性化合物の測定を妨害しないように慎重に選択されたＱＣ標準のカクテルを、分析されたあらゆる試料にスパイクし、機器性能のモニタリングを可能にし、クロマトグラフィーアライメントを補助した。装置の変動性は、質量分析計への注射前に各試料に添加された標準の相対標準偏差（ＲＳＤ）の中央値を算出することによって決定した。プールされたマトリックス試料の１００％に存在する全ての内因性代謝産物（すなわち、非機器標準物質）の中央値ＲＳＤを計算することによって、全体のプロセス変動性を決定した。実験試料は、注射間で均等に間隔を置いて配置されたＱＣ試料を用いて、プラットフォーム施行にまたがって無作為化した。
代謝産物は、保持時間、分子量（ｍ／ｚ）、好ましい付加物、及びインソースフラグメントならびに付随するＭＳスペクトルを含む化学標準品目の参照ライブラリーへの実験試料中のイオン特徴の自動化比較により特定され、及びＭｅｔａｂｏｌｏｎで開発されたソフトウェアを用いた品質管理の目視検査によって監督された。既知の化学物質の同定は、精製された標準のメタボロミクスライブラリーエントリとの比較に基づいた。曲線下面積測定を用いてピークを定量した。各試料中の各代謝産物の生エリア数を正常化して、各実行日の中央値による器具の日中の調整の差異から生じる変動を校正し、それによって、各実行について中央値を１．０に設定した。試料間のこのような保存された変化は、類似したグラフィカルスケールで比較される広範に異なる生ピーク領域の代謝産物を許容した。欠落値は、正常化後に観察された最小値とみなした。
定量的ＭＳアッセイ：ＣＳＦ試料（５０μＬ）をスペルミン－ｄ８内部標準（ＩｓｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）と混合した。試料を、４倍過剰のメタノールと混合し、４℃で１２，０００×ｇで遠心分離することによって脱タンパク化した。上清を窒素の気流下で乾燥させた後、５０μＬの水に再懸濁した。５μＬのアリコートを、ＬＣ－ＭＳ分析に供した。ＬＣ分離は、Ｘｂｒｉｄｇｅ（登録商標）Ｃ１８カラム（３．５μｍ、１５０×２．１ｍｍ）を備えたＷａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣシステム（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐ．、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ、ＵＳＡ）を用いて行った。流速は、０．１５ｍＬ／分であり
、溶媒Ａは０．１％ギ酸であり、溶媒Ｂは０．１％ギ酸を含む９８／２アセトニトリル／Ｈ２Ｏ（ｖ／ｖ）であった。溶出条件は、以下のとおりであった：２％Ｂで０分、２％Ｂで２分、６０％Ｂで５分、８０％Ｂで１０分、９８％Ｂで１１分、９８％Ｂで１６分、２％Ｂで１７分、２％Ｂで２２分であり、カラム温度は３５℃であった。Ｆｉｎｎｉｇａｎ
ＴＳＱ Ｑｕａｎｔｕｍ Ｕｌｔｒａ分光計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を使用して、陽イオンモードで以下のパラメータでＭＳ／ＭＳ分析を行った：４０００Ｖの噴霧電圧、２７０℃のキャピラリー温度、３５任意単位のシースガス圧、２任意単位でのイオン掃引ガス圧力、１０任意単位での補助ガス圧力、２００℃での気化器温度、５０のチューブレンズオフセット、キャピラリーオフセットが３５、及びスキマーオフセットが０であった。以下の遷移をモニターした：２０３．１／１１２．１（スペルミン）；２１１．１／１２０．１（スペルミン－ｄ８）、スキャン幅は０．００２ｍ／ｚ、スキャン時間は０．１５秒であった。
動物手順：全ての動物プロトコールは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ（ペンシルベニア大学）のＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（動物実験及び使用委員会）により承認された。ＣＳＦ代謝産物のスクリーニングのために、試料を３～２６ヶ月齢の正常イヌ及び１～１８ヶ月齢のＭＰＳ Ｉイヌの骨髄後穿刺により収集した。ＭＰＳ Ｉイヌ及びネコにおける遺伝子導入研究は、以前に記載されたように行った（２０、２２）。ＣＳＦ試料は、ベクター投与の６～８ヶ月後に収集した。マウス皮質ニューロン実験のために、初代皮質ニューロン培養物を、Ｅ１８ ＩＤＵＡ－／－またはＩＤＵＡ＋／＋胚から調製した。
患者試料：各対象の親または法的保護者からインフォームドコンセントを得た。プロトコールは、ミネソタ大学のＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄによって承認された。ＣＳＦは、腰椎穿刺により採取した。全てのＭＰＳ Ｉ患者は、ハーラー症候群の診断を有し、試料採取前に酵素補充療法または造血幹細胞移植を受けていなかった。ＭＰＳ Ｉ患者は、６～２６ヶ月齢であった。健常対照群は、３６及び４８ヶ月齢であった。
統計解析：ランダムフォレスト分析及びヒートマップ生成は、ＭｅｔａｂｏＡｎａｌｙｓｔ ３．０［Ｒ．Ｇ．Ｋａｌｂ、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２０、３０６３－３０７１（１９９４）；Ｊ．Ｚｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ６４、５３１－５３９（１９９５）Ｄ．Ｖａｎ Ｖａｃｔｏｒ、Ｄ．Ｐ．Ｗ ｅｔ ａｌ、Ｃｕｒｒｅｎｔ ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １６、４０－５１（２００６）；オンライン公開ＥｐｕｂＦｅｂ（１０．１０１６／ｊ．ｃｏｎｂ．２００６．０１．０１１）を用いて行った。生のピークデータを対数変換し、正常な試料値の平均値に正常化した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６を用いて、他の全ての統計分析を行った。培養神経枝の長さ、神経突起の数、及び分岐を、ＡＮＯＶＡにより、続いてダネット検定により比較した。ＣＳＦスペルミン及び皮質ＧＡＰ４３を、クラスカル・ウォリス検定、続いてダネット検定によって比較した。
ＧＡＰ４３ウエスタン：前頭皮質の試料を、Ｑｉａｇｅｎ Ｔｉｓｓｕｅｌｙｓｅｒを用いて３０Ｈｚで５分間、０．２％トリトンＸ－１００中でホモジナイズした。試料を４℃での遠心分離により清澄化した。タンパク質濃度をＢＣＡアッセイにより上清中で測定した。試料をＤＴＴ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含むＮｕＰＡＧＥ ＬＤＳ緩衝液中、７０℃で１時間インキュベートし、ＭＯＰＳ緩衝液中のＢｉｓ－Ｔｒｉｓ ４～１２％ポリアクリルアミドゲル上で分離した。タンパク質をＰＶＤＦ膜に転写し、５％脱脂粉乳中で１時間ブロックした。この膜を、５％脱脂粉乳中で１μｇ／ｍＬに希釈したウサギポリクローナル抗ＧＡＰ４３抗体（Ａｂｃａｍ）、続いて５％脱脂粉乳中で１：１０，０００に希釈したＨＲＰ結合ポリクローナル抗ウサギ抗体（Ｔｈｅ
ｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてプローブした。ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてバンドを検出した。デンシトメトリーは、Ｉｍａｇｅ Ｌａｂ ５．１（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて行った。
神経突起伸長アッセイ：１８日目の胚性皮質ニューロンを、上記のように採取し、１００，０００細胞／ｍＬの濃度で、Ｂ２７（Ｇｉｂｃｏ）によって補充された無血清Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ 培地（Ｇｉｂｃｏ）中で、チャンバスライド（Ｓｉｇｍａ Ｓ６８１５）またはポリ－Ｌ－リジン（Ｓｉｇｍａ）コーティング組織培養プレート上にプレートした。プレートの２４時間後（１日目）に二重のウェルに処理を施した。定量化のための位相コントラスト画像を、Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｔｉで、２０倍で、６００ｍｓの手動露光及び高コントラストで１．７０倍のゲインを用いて撮影した。個々のブラインドの処理条件は、１ウェルあたり１０～２０枚の画像をキャプチャし、それらをコード化した。画像は、ＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ）で８ビットフォーマットに変換して、ＮｅｕｒｏｎＪ［Ｅ．Ｍｅｉｊｅｒｉｎｇ，Ｍ．Ｊａｃｏｂ，Ｊ．Ｃ．Ｓａｒｒｉａ，Ｐ．Ｓｔｅｉｎｅｒ，Ｈ．Ｈｉｒｌｉｎｇ，Ｍ．Ｕｎｓｅｒ，Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｎｅｕｒｉｔｅ ｔｒａｃｉｎｇ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ｉｍａｇｅｓ．Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ．Ｐａｒｔ Ａ：ｔｈｅ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｙｔｏｌｏｇｙ ５８，１６７－１７６（２００４）；オンライン公開ＥｐｕｂＡｐｒ（１０．１００２／ｃｙｔｏ．ａ．２００２２）］で、盲検によるレビューアがトレースした。Ｓｏｍａ径、神経突起数、分岐点及び分岐長を手技的にトレースした。ＮｅｕｒｏｎＪでトレースされた画像は、画像サイズに基づく換算係数を使用してマイクロメータに変換した：２５６０×１９２０ピクセル画像を、０．１７マイクロメートル／ピクセルの変換係数を用いてマイクロメータに変換した。
組織学：脳組織処理及びＬＩＭＰ２免疫蛍光を、以前に記載されたようにして行った［Ｃ．Ｈｉｎｄｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ：ｔｈｅ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２２，２０１８－２０２７（２０１４）；オンライ公開ＥｐｕｂＤｅｃ（１０．１０３８／ｍｔ．２０１４．１３５）］。
ＲＴ－ＰＣＲ：３匹の正常イヌ及び５匹のＭＰＳイヌからの前頭皮質の試料を、剖検で、ドライアイス上で直ちに凍結させた。ＲＮＡをＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で抽出し、ＤＮＡｓｅ Ｉ（Ｒｏｃｈｅ）で、室温で、２０分間処理し、ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて製造業者の指示に従って精製した。ランダムヘキサマープライマーを用いるＨｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、精製ＲＮＡ（５００ｎｇ）を逆転写した。アルギナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ、スペルミンシンターゼ、スペルミジンシンターゼ、スペルミン－スペルミジンアセチルトランスフェラーゼ及びグリセルアルデヒドホスフェートデヒドロゲナーゼの転写産物を、Ｓｙｂｒ ｇｒｅｅｎ ＰＣＲによって、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７５００を使用して定量した。
リアルタイムＰＣＲシステム。全ての個々の試料からなるプール標準の４倍希釈を用いて、各標的遺伝子について標準曲線を作成した。最高の標準に任意の転写物番号を割り当て、個々の試料のＣｔ値を、標準曲線に基づいて転写物番号に変換した。値は、ＧＡＰＤＨ対照に対して表す。
統計解析：ランダムフォレスト分析及びヒートマップ生成は、ＭｅｔａｂｏＡｎａｌｙｓｔ３．０［Ｊ．Ｘｉａ ｅｔ ａｌ．、ＭｅｔａｂｏＡｎａｌｙｓｔ２．０－メタボロームデータ分析のための包括的なサーバを使用して実施した。Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、（２０１２）；オンライン公開ＥｐｕｂＭａｙ ２，２０１２（１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｓ３７４）；Ｊ．Ｘｉａ、ｅｔ ａｌ．、ＭｅｔａｂｏＡｎａｌｙｓｔ：ａ ｗｅｂ ｓｅｒｖｅｒ ｆｏｒ ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃ ｄａｔａ
ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎ（メタボロームデータ分析及び解釈のためのウェブサーバ）。Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３７、Ｗ６５２－Ｗ６６０（２００９）；オンライン公開ＥｐｕｂＪｕｌｙ １、２００９（１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｐ３５６）。Ｊ．Ｘｉａ ｅｔ ａｌ．、ＭｅｔａｂｏＡｎａｌｙｓｔ ３．０－ｍａｋｉｎｇ ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃｓ ｍｏｒｅ ｍｅａｎｉｎｇｆｕｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、（２０１５）；オンライン公開ＥｐｕｂＡｐｒｉｌ２０，２０１５（１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｖ３８０）］。代謝産物スクリーニングの検出不可能な値は、データセットで観察された最小値とみなした。生のピークデータを正常試料値の平均値に正常化し、対数変換した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６を用いて、他の全ての統計分析を行った。培養神経枝の長さ、神経突起の数、及び分岐を、ＡＮＯＶＡにより、続いてダネット検定により比較した。ＣＳＦスペルミン及び皮質ＧＡＰ４３を、クラスカル・ウォリス検定、続いてダネット検定によって比較した。
結果
１．代謝産物プロファイリングによるＣＳＦスペルミンの上昇の同定
ＣＳＦ代謝産物の最初のスクリーニングは、ＭＰＳ Ｉのイヌモデルを使用して行った。これらの動物は、ＩＤＵＡ遺伝子にスプライス部位突然変異を有し、その結果、酵素発現の完全な消失及びＭＰＳ Ｉ患者のものに類似した臨床的及び組織学的特徴の発達が生じた［Ｋ．Ｐ．Ｍｅｎｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １４、７６３－７６８（１９９２）；Ｒ．Ｓｈｕｌｌ、ｅｔ ａｌ．、Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ １１４、４８７（１９８４）］。ＣＳＦ試料を１５匹の正常イヌ及び１５匹のＭＰＳ Ｉイヌから採取した。ＣＳＦ試料を、ＬＣ及びＧＣ－ＭＳによる代謝産物の相対量について評価した。全部で２８１の代謝産物がＣＳＦ試料において質量分析によって陽性と特定された。これらのうち４７匹（１７％）が対照と比較してＭＰＳ１イヌで有意に上昇し、８８匹（３１％）は対照と比較して減少した。群間で最も異なる５０種類の代謝産物のヒートマップを、図１９Ａに示す。代謝産物プロファイリングによって、ＭＰＳ Ｉと正常イヌとの間のポリアミン、スフィンゴリピド、アセチル化アミノ酸、及びヌクレオチド代謝における顕著な差異が同定された。ランダムフォレストクラスタリング分析によって、ポリアミンスペルミンがＭＰＳ Ｉと正常イヌとの間の代謝産物の相違の最大寄与因子であることが同定された（図２３）。平均して、スペルミンは、試料採取時に１カ月齢未満の１匹のＭＰＳ１イヌを除いて、ＭＰＳ１イヌにおいて３０倍を超えて上昇した。ＣＳＦ中のスペルミンを定量的に測定するために、安定同位体希釈（ＳＩＤ）－ＬＣ－ＭＳ／ＭＳアッセイが開発された。ハーラー症候群（６～２６ヵ月齢）の６人の子供、ならびに２匹の健常対照（３６ヵ月及び４８ヵ月）から試料をスクリーニングした。両方の健常対照は、アッセイの定量限界（１ｎｇ／ｍＬ）未満のＣＳＦスペルミンレベルを有したが、ＭＰＳ Ｉ患者のＣＳＦ試料は、定量限界より平均１０倍高かった（図１９Ｂ）。ＭＰＳ ＩＨ患者におけるスペルミン上昇は、スペルミン結合及び取り込みにおけるＨＳの公知の役割と一致するように見えた［Ｍ．Ｂｅｌｔｉｎｇ ｅｔ
ａｌ．、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７８、４７１８１－４７１８９（２００３）；Ｍ．Ｂｅｌｔｉｎｇ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ ｉｎ ｐｏｌｙａｍｉｎｅ ｕｐｔａｋｅ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ３３８、３１７－３２３（１９９９）；Ｊ．Ｅ．Ｗｅｌｌｃｈ、ｅｔ ａｌ、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
ｏｎｃｏｌｏｇｙ ３２、７４９－７５６（２００８））］；増大した合成は、正常イヌ及びＭＰＳ Ｉイヌ脳試料がポリアミン合成経路において転写調節された酵素について同様のｍＲＮＡ発現レベルを有したので、上昇したＣＳＦスペルミンの原因とは思われなかった（図２４）。スペルミン上昇がヘパラン硫酸蓄積疾患の一般的な特性であるかＭＰＳ Ｉに特異的であるかを決定するために、類似の高さを示すＭＰＳ ＶＩＩのイヌモデル由来のＣＳＦ試料においてスペルミンを測定した（図２５）。
２．ＭＰＳに伴う異常な神経突起伸長におけるスペルミンの役割
軸索損傷後のニューロンは、神経突起伸長を促進するポリアミン合成をアップレギュレートする［Ｄ．Ｃａｉ、ｅｔ ａｌ．、Ｎｅｕｒｏｎ ３５、７１１－７１９（２００２）。オンライン公開ＥｐｕｂＡｕｇ １５；Ｋ．Ｄｅｎｇ、ｅｔ ａｌ、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ：ｔｈｅ ｏｆｆｉｃｉａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ２９、９５４５－９５５２（２００９）；オンライン公開ＥｐｕｂＪｕｌ ２９；Ｙ．Ｇａｏ、ｅｔ ａｌ．、Ｎｅｕｒｏｎ ４４、６０９－６２１（２００４）。オンライン公開ＥｐｕｂＮｏｖ １８；Ｒ．Ｃ．Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ、ｅｔ ａｌ．、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ １２８、７４１－７４９（２００４）］。したがって、本発明者らは、ＭＰＳニューロンに記載されている異常な神経突起過形成表現型におけるスペルミンの役割を評価した［Ｈｏｃｑｕｅｍｉｌｌｅｒ、Ｓ．ｅｔ ａｌ．、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ ８８、２０２－２１３（２０１０）］。ＭＰＳ Ｉマウス由来のＥ１８皮質ニューロンの培養物は、コロニーの野生型マウス由来のニューロンよりも、培養中で４日後により大きい神経突起数、分岐及び総分岐長を示した（図２０Ａ～２０Ｆ）。スペルミン合成の阻害剤であるＡＰＣＨＡによるＭＰＳニューロンの処置は、神経突起の成長及び分岐を有意に減少させた。この効果は、スペルミンを置換することによって可逆的であった（図２０Ａ～２０Ｆ）。同じＡＰＣＨＡ濃度は、正常なニューロンの増殖に影響しなかった（図２６）。インビボで同定されたものと同様の濃度で野生型ニューロン培養物にスペルミンを添加すると、神経突起の成長及び分岐が有意に増大した（図２０Ａ～２０Ｆ）。
３．ＣＳＦスペルミン及びＧＡＰ４３発現に対する遺伝子治療の影響
神経突起伸長の中心的調節因子であるＧＡＰ４３は、インビトロ及びインビボの両方でＭＰＳ ＩＩＩマウスニューロンによって過剰発現され、このことは、ニューロン培養において異常に活性化される同じ神経突起伸長経路がインビボでも活性であることを示唆している。インビボでのＧＡＰ４３発現及びスペルミン蓄積に対するＩＤＵＡ欠損の効果を評価するために、本発明者らは、未処置のＭＰＳ Ｉイヌ及びＣＮＳ指向性遺伝子治療で処置したイヌにおけるＣＳＦスペルミン及び脳ＧＡＰ４３レベルを測定した。本発明者らは、先に、イヌＩＤＵＡ導入遺伝子を保有するアデノ随伴ウイルス血清型９ベクターのくも膜下腔内注射によって処置された５匹のＭＰＳ１イヌについて記載した［Ｃ．Ｈｉｎｄｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ：ｔｈｅ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２３、１２９８－１３０７（２０１５）；オンライン公開Ｅｐｕｂ Ａｕｇ］。ＭＰＳ Ｉイヌは、正常なＩＤＵＡ酵素に対する抗体を産生し得るので、２匹のイヌを、肝臓ＩＤＵＡ遺伝子移入を受けた新生児として前処理してこのタンパク質に対する免疫寛容を誘導した。両方の寛容化イヌとも、ＡＡＶ９処置後、正常よりもはるかに高い脳ＩＤＵＡ活性を示した。３匹の非寛容化イヌは、様々なレベルの発現を示し、１匹の動物が正常よりもレベルに達し、他の２匹が正常に近い発現を示した（図２１Ａ）。ＣＳＦスペルミン減少は、脳ＩＤＵＡ活性に反比例し、ＩＤＵＡ発現が最も低い２匹のイヌにおける未処置動物と比較して３倍低下し、最も高い発現を有する動物において２０倍を超えて低下した（図２１Ａ、図２１Ｂ～２１Ｈ及び２１Ｋまで）。ＭＰＳ１イヌの前頭皮質においてＧＡＰ４３がアップレギュレートされ、発現は全てのベクター処理動物で正常化された（図２
１Ｉ～２１Ｊ）。
本発明者らはさらに、ある範囲のベクター用量で処置したＭＰＳ１イヌにおけるＣＳＦスペルミンレベルとＩＤＵＡ再構成との間の関係を評価した。新生児肝臓遺伝子移入によって以前にヒトＩＤＵＡに寛容化されたＭＰＳ Ｉイヌを、ヒトＩＤＵＡを発現するＡＡＶ９ベクターを３用量（１０１０、１０１１、１０１２ＧＣ／ｋｇ、１用量につきｎ＝２）のうちの１つを用いて、くも膜下腔内注射によって処置した［（Ｃ．Ｈｉｎｄｅｒｅｒ、ｅｔ ａｌ．、Ｎｅｏｎａｔａｌ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｅｎａｂｌｅｓ ａｃｃｕｒａｔｅ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ
ｆｏｒ ＭＰＳ Ｉ ｉｎ ａ ｃａｎｉｎｅ ｍｏｄｅｌ（新生児寛容の誘導は、イヌのモデルでＭＰＳ Ｉに関する遺伝子治療の正確な評価を可能にする）。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ、ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｙｍｇｍｅ．２０１６．０６．００６］．．ＣＳＦスペルミンを、注射６か月後に評価した（図２２Ａ）。ＣＳＦスペルミンの減少は、用量依存性であり、中及び高ベクター用量の動物は、正常範囲に達したが、低用量動物ではＣＳＦスペルミンは部分的にしか減少しなかった。ＩＤＵＡ欠損症とＣＳＦのスペルミンの蓄積との間の関係を独立して確認するために、本発明者らは、ＭＰＳ ＩのネコモデルにおいてＣＳＦスペルミンのレベルを評価した。以前に報告された遺伝子治療の研究由来のＣＳＦ試料を用いて、本発明者らは、未処置のＭＰＳ ＩネコがＣＳＦスペルミンの上昇を示したことを見出した（図２２Ｂ）［Ｃ．Ｈｉｎｄｅｒｅｒ、Ｐ．Ｂｅｌｌ、Ｂ．Ｌ．Ｇｕｒｄａ、Ｑ．Ｗａｎｇ、Ｊ．Ｐ．Ｌｏｕｂｏｕｔｉｎ、Ｙ．Ｚｈｕ、Ｊ．Ｂａｇｅｌ、Ｐ．Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌ、Ｔ．Ｓｉｋｏｒａ、Ｔ．Ｒｕａｎｅ、Ｐ．Ｗａｎｇ、Ｍ．Ｅ．Ｈａｓｋｉｎｓ、Ｊ．Ｍ．Ｗｉｌｓｏｎ、Ｉｎｔｒａｔｈｅｃａｌ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｃｏｒｒｅｃｔｓ ＣＮＳ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ｉｎ ａ ｆｅｌｉｎｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ
ｍｕｃｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｏｓｉｓ Ｉ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ（くも膜下腔内遺伝子治療は、ムコ多糖症ＩのネコモデルにおいてＣＮＳ病理を是正する）：ｔｈｅ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ２２、２０１８－２０２７（２０１４）；オンライン公開ＥｐｕｂＤｅｃ（１０．１０３８／ｍｔ．２０１４．１３５）］。ネコＩＤＵＡ正常化ＣＳＦスペルミンレベルを発現する高用量のＡＡＶ９ベクターのくも膜下腔内投与（図２２Ｂ）。
Ｃ．考察
今回の研究では、本発明者らは、ＭＰＳ ＩイヌからのＣＳＦ試料の代謝産物プロファイリングを実施し、これによって、ＣＳＦメタボロームにおける実質的な疾患関連変化が明らかになった。最も顕著な相違は、正常対照と比較してスペルミンレベルの３０倍以上の上昇であった。この知見は、ＭＰＳ Ｉ患者の試料ならびにＭＰＳ Ｉのネコモデル及びＭＰＳ ＶＩＩのイヌモデルにおいて確認された。スペルミンは、高い親和性でＨＳに直接結合し、スペルミンの細胞取り込みは、この相互作用に依存する［Ｍ．Ｂｅｌｔｉｎｇ、Ｓ．ＰＥＲＳＳＯＮ、Ｌ．－Ａ．Ｆｒａｎｓｓｏｎ、Ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔｉｎｐｏｌｙａｍｉｎｅｕｐｔａｋｅ（プロテオグリカンは、ポリアミン摂取に関与する）。Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ３３８、３１７－３２３（１９９９）；Ｊ．Ｅ．Ｗｅｌｃｈ、ｅｔ ａｌ、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｏｎｃｏｌｏｇｙ ３２、７４９－７５６（２００８）］。グリピカン－１のような細胞表面プロテオグリカンは、そのＨＳ部分を通じてスペルミンに結合し得、グリピカンタンパク質のエンドサイトーシス後、ＨＳ鎖の細胞内切断は、結合したスペルミンを細胞に放出する［上記のＢｅｌｔｉｎｇ ｅｔ ａｌ．；Ｋ．Ｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ．、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７６、４６７７９－４６７９１（２００１）；オンライン公開ＥｐｕｂＤｅｃ １４号］。従って、無傷のＨＳリサイクリングは、スペルミン摂取にとって必須である。Ｉ
ＤＵＡ欠損による非効率的なＨＳ再利用は、このスペルミン取り込み機構を阻害し得、細胞外スペルミン蓄積を引き起こし得る。あるいは、細胞外ＧＡＧは、スペルミンを隔離し、平衡をシフトさせて細胞外分布を促進し得る。この研究におけるＬＣ－ＭＳ試料調製に用いたメタノール脱タンパクステップはまた、可溶性ＨＳを沈殿させ、ＣＳＦ中に検出されたスペルミンは結合していないこと、従ってＧＡＧ結合ではなく取り込み阻害が細胞外スペルミン蓄積の原因であることを示唆する［Ｎ．Ｖｏｌｐｉ、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．Ｂ、Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ
６８５、２７－３４（１９９６）；オンライン公開ＥｐｕｂＯｃｔ １１］。機能的ニューラルネットワークの形成及び維持には、神経突起伸長及びシナプス形成の正確な制御が必要である。発達中、ＣＮＳ環境は、神経突起形成に対してますます阻害的になり、ミエリン関連タンパク質が大人の脳における神経突起伸長を主にブロックする。減少した神経突起伸長へのこの発生的なシフトは、ＧＡＰ４３発現の減少と並行する［Ｓ．Ｍ．Ｄｅ
ｌａ Ｍｏｎｔｅ ｅｔ ａｌ．、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４６，１６１－１６８（１９８９）；オンライン公開Ｅｐｕｂ４／１／］。ＭＰＳニューロンによって示される持続的なＧＡＰ４３発現及び誇張された神経突起伸長は、阻害及び成長促進シグナルのこの正常なバランスを妨げ、異常な接続性及び認知障害をもたらす。ＨＳ蓄積がどのようにしてこの神経成長の増大をもたらすかは確立されていない。多くの研究が、神経突起伸長におけるポリアミンの関与を示唆しており；軸索の損傷後、スペルミン及びその前駆体であるプトレシン及びスペルミジンの合成のための律速酵素が上昇し、ミエリンからの阻害シグナルの存在下でさえ神経突起伸長の増強を可能にする［全て上記で引用される、Ｃｉａ（２００２）、Ｄｅｎｇ（２００９）、Ｇａｏ（２００４）。さらに、プトレシンによるニューロンの処理は、スペルミン合成の阻害剤によってブロックされる効果であって、ＣＳＦに直接注射した場合に神経突起伸長を誘導する（上記で引用される、Ｄｅｎｇ（２００９））。ポリアミンが神経突起の成長に及ぼす機構は未知である。潜在的な標的の１つはＮＭＤＡ受容体であり、その活性化はスペルミン結合によって増強される（Ｊ．Ｌｅｒｍａ、Ｎｅｕｒｏｎ ８，３４３－３５２（１９９２）；オンライン公開Ｅｐｕｂ２／／（ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／０８９６－６２７３（９２）９０３００－３））。ＮＭＤＡシグナル伝達は、神経突起伸長を誘導し、受容体のスペルミン感受性サブユニットは、発生中に高度に発現される［Ｄ．Ｇｅｏｒｇｉｅｖ ｅｔ ａｌ．、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｃｅｌｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ ３１４，２６０３－２６１７（２００８）；オンライン公開ＥｐｕｂＡｕｇ １５（１０．１０１６／ｊ．ｙｅｘｃｒ．２００８．０６．００９）；Ｒ．Ｇ．Ｋａｌｂ、Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｔｏｒ ｎｅｕｒｏｎ ｄｅｎｄｒｉｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｂｙ ＮＭＤＡ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ（ＮＭＤＡ受容体活性化による運動ニューロンの樹状突起成長の調節）．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２０、３０６３－３０７１（１９９４）；Ｊ．Ｚｈｏｎｇ、ｅｔ ａｌ．、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ６４、５３１－５３９（１９９５）。特に、多くの神経栄養因子が、ＨＳ修飾レセプターを介して結合し、細胞外マトリックス中のＨＳとの相互作用は、神経突起の成長に影響を及ぼし得る（Ｄ．Ｖａｎ Ｖａｃｔｏｒ ｅｔ ａｌ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １６，４０－５１（２００６）；オンライン公開ＥｐｕｂＦｅｂ）。したがって、スペルミン蓄積は、ＭＰＳ Ｉにおける異常な神経突起伸長を促進するいくつかの要因のうちの１つであり得る。１５匹のＭＰＳ ＩイヌＣＳＦ試料をスクリーニングしたが、１匹だけが正常範囲のスペルミン濃度に収まった。２８日齢で、これは研究に含まれた最も若い動物であった。この知見によって、スペルミンの蓄積が年齢に依存し得ることが示されるが、この研究では、ハーラー症候群の乳児ではスペルミンがすでに６ヶ月齢までに上昇していることが実証されている。将来の研究では、ＣＳＦスペルミンのレベルをＭＰＳ患者で長軸方向に評価する。スペルミンがＭＰＳ患者では年齢とともに増大するのであれば、ほとんどの患者が発達遅延の発症前に１～２年の正常な発達を経験するので、これによって認知低下の動態が説明される。ＭＰＳにおける酵素欠損と異常な神経突起伸長表現型との間の
新規な関連性にニューロン成長点を変化させる代謝産物の蓄積を誘発することがＨＳ代謝障害の原因となり、これらの障害に関連する認知機能不全を説明し得る。将来の研究は、ＭＰＳ ＩＩのような他のＭＰＳにおけるスペルミン上昇を確認する。これらの知見によってまた、ＣＳＦスペルミンが、ＭＰＳのための新規なＣＮＳ指向性療法の薬力学を評価するための非侵襲的バイオマーカーとして有用であることが示される。ＣＮＳ指向性療法の将来のトライアルは、認知エンドポイントとＣＳＦスペルミンの変化との間の相関を評価する。
実施例７：ＣＴガイドされたＩＣＶ送達デバイス
Ａ．処置前のスクリーニング評価
１．プロトコール訪問１：スクリーニング
治験責任医師は、対象（または指定された介護者）がインフォームドコンセントに署名した際に十分に情報を得るために、大槽内（ＩＣ）手順、投与手順そのもの、及び全ての潜在的な安全リスクに至るスクリーニングプロセスについて説明する。
ＩＣ処置について対象の適格性のスクリーニング評価において、以下のことが実施され、神経放射線科医／神経外科医／麻酔科医に提供される：病歴；併用薬；身体検査；バイタルサイン；心電図（ＥＣＧ）；及び検査室の試験結果。
２．インターバル：研究の第２訪問のスクリーニング
適格性を審査するのに十分な時間を与えるために、以下の手順を、最初のスクリーニング訪問と研究訪問２（０日目）の１週間前までの間、いつでも実施する：
・ガドリニウムの有無における頭部／頸部磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）［注：対象はガドリニウムを受けるのに適した候補でなければならない（すなわち、ｅＧＦＲ＞３０ｍＬ／分／１．７３ｍ２）］
・頭部／頚部ＭＲＩに加えて、研究者は、屈曲／伸長研究による頚部のさらなる評価の必要性を判定する
・ＭＲＩプロトコールには、Ｔ１、Ｔ２、ＤＴＩ、ＦＬＡＩＲ、及びＣＩＮＥプロトコールのイメージを含む
・施設内プロトコールによる頭部／頸部ＭＲＡ／ＭＲＶ（注：内／経頭蓋手術の病歴を有する対象を除外する場合もあるし、またはＣＳＦフローの適切な評価及びＣＳＦ腔の間の連絡の潜在的な遮断または欠如の特定を可能にするさらなる試験（例えば、放射性ヌクレオチドの超音波検査）を必要とする場合もある。
・神経放射線科医／神経外科医の対象手続き評価会議：３つのサイトからの代表者は、利用可能な全ての情報（スキャン、病歴、身体検査、臨床検査など）に基づいてＩＣ手順の各対象の適格性について考察する電話会議（またはウェブ会議）を持つ。ＩＣ手順または対象をスクリーニングできずに進行することでコンセンサスを達成するための全ての試みを行うべきである（すなわち、各メンバーは、決定を受け入れる準備をすべきである）。・－２８日目～１日目までの麻酔の術前評価であって、ＭＰＳ対象の特別な生理的要件を念頭に置いて、気道、頸部（短縮／肥厚）及び頭部動作範囲（頸部屈曲度）の詳細な評価をともなう。
３． １日目：コンピュータトモグラフィー室及び投与のためのベクター調製。ＩＣ手技に先立って、ＣＴ室は以下の機器と薬が存在することを確認する：
・成人の腰椎穿刺（ＬＰ）キット（施設ごとに提供）
・ＢＤ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）２２または２５ゲージ×３－７インチの脊髄針（Ｑｕｉｎｃｋｅ ｂｅｖｅｌ）
・インターベンション医師の裁量で使用される同軸導入針（例えば、１８Ｇ×３．５インチ）（脊髄針の導入用）
・スイベル（スピン）オスルアーロック付き４方向小口径ストップコック
・メスルアーロックアダプター付きのＴコネクタ延長セット（チューブ）、およその長さ
６．７インチ
・くも膜下腔内投与のためのＯｍｎｉｐａｑｕｅ １８０（イオヘキソール）
・静脈内（ＩＶ）投与のためのヨード化造影剤
・１％リドカイン注射液（成人用ＬＰキットに含まれていない場合）
・プレフィルドの１０ｃｃの生理食塩水（無菌）フラッシュシリンジ
・放射線不透過性マーカー（複数可）
・手術用準備器具／シェービング用かみそり
・挿管された対象の適切な位置決めを可能にする枕／サポート
・気管内挿管器具、全身麻酔機及び人工呼吸器
・術中神経生理学的モニタリング（ＩＯＮＭ）装置（及び要員）
・ＡＡＶ９．ｈＩＤＵＡベクターを含む１０ｃｃシリンジ；個別の薬局マニュアルに従って、ＣＴ／手術室（ＯＲ）室を準備してそこに移動する。
４． １日目：対象の準備及び投与
・研究及び手順のインフォームドコンセントは、医療記録及び／または研究ファイル内で確認され、文書化される。放射線科医及び麻酔科医による処置に関する別個の同意は、施設の要件に従って得る。
・研究の対象は、施設ガイドライン（例えば、２つのＩＶアクセス部位）に従って適切な病院ケアユニット内で静脈内アクセスを行う。静脈内の液体は、麻酔科医の裁量で投与される。
・麻酔科医の裁量で、施設ガイドラインに従って、適切な患者ケアユニット、保留エリアまたは外科／ＣＴ処置室で全身麻酔を施行して研究対象を導入し、気管内挿管を行う。
・腰椎穿刺を行い、まず脳脊髄液（ＣＳＦ）５ｃｃを除去し、その後、大槽の視覚化を助けるためにくも膜下腔内造影剤（Ｏｍｎｉｐａｑｕｅ １８０）を注射する。大槽内への造影剤の拡散を容易にするために、適切な対象の位置決め操作を行う。
・まだ行われていない場合、術中神経生理学的モニタリング（ＩＯＮＭ）装置を対象に取り付ける。
・対象は、腹臥位または側臥位でＣＴスキャナテーブル上に置かれる。
適切と考えられる場合、対象は、術前評価中に安全と判断された程度まで首の屈曲をもたらし、位置決め後に証明された正常な神経生理学的モニター信号があるような方式で位置決めされる。
・次の研究スタッフ及び研究者（複数可）が、現場に存在し特定されることが確認されている。
ｏ手技を行うインターベンション医師／神経外科医
ｏ麻酔科医及び呼吸技師（複数可）
ｏ看護師及び医師の助手
ｏＣＴ（またはＯＲ）技術者
ｏ神経生理学技術者
ｏ現場研究コーディネーター
・頭蓋骨の下の対象の皮膚を適切に剃る。
・ＣＴスカウト画像を実行した後、目標位置を特定し、血管系を画像化するために介入主任者が必要と考える場合には、ＩＶ造影剤による処置前計画ＣＴを続ける。
・一旦、標的部位（大槽）が同定され、針の軌道が計画されれば、施設ガイドラインに従って無菌技術を用いて皮膚を準備し、ドレープする。
・放射線不透過性マーカーを、インターベンション医師が指示するように、標的皮膚の位置に配置する。
・マーカーの下の皮膚を、１％リドカインを用いる浸潤によって麻酔する。
・２２Ｇまたは２５Ｇの脊髄針を大槽に向かって前進させ、必要に応じて同軸導入針を使用する。
・針の前進後、ＣＴ画像は、施設機器（理想的には２．５ｍｍ以下）を使用して実現可能な最も薄いＣＴスライス厚を使用して取得する。連続ＣＴ画像は、針及び関連する軟部組
織（例えば、傍脊髄筋、骨、脳幹、及び脊髄）の適切な視覚化を可能にする、可能な最低線量を使用すべきである。
・正確な針の配置は、針ハブ内のＣＳＦの観察及び大槽内の針先の可視化によって確認される。
・インターベンション医師は、ベクターを含むシリンジが滅菌野の近くにあるが、滅菌野の外に位置していることを確認する。ベクターを取り扱うか投与する前に、滅菌野内で処置を手助けするスタッフによって手袋、マスク、及び目の保護具が着用されていることを確認する（滅菌野の外にいる他のスタッフはこれらの処置を受ける必要はない）。
・短い（～６インチ）延長チューブを挿入された脊髄針に取り付け、次に４方向ストップコックに取り付ける。一旦、この装置が対象のＣＳＦで「自己プライミング」されると、１０ｃｃのプレフィルド生理食塩水フラッシュシリンジを４方向ストップコックに取り付ける。
・ベクターを含むシリンジをインターベンション医師に渡し、４方向ストップコックのポートに取り付ける。
・一旦、ベクターを含むシリンジへのストップコックポートを開けたら、注射中にプランジャーに過度の力を加えないよう注意しながら、シリンジの内容物をゆっくりと注射する（約１～２分以上）。
・一旦、ＡＡＶ９．ｈＩＤＵＡを含むシリンジの内容物を注射したら、ストップコックを回して、取り付けられたプレフィルドシリンジを使用して、１～２ｃｃの生理食塩水でストップコックと針のアセンブリをフラッシュしてもよい。
・準備ができたら、インターベンション医師はスタッフに装置を対象から取り外すように警告する。
・一回の動きで、針、延長チューブ、ストップコック、及びシリンジを対象からゆっくりと取り外し、バイオハザード廃棄レセプタクルまたは硬い容器（針用）に廃棄するために外科用トレイに置く。
・針挿入部位を出血またはＣＳＦ漏出の徴候について検査し、研究者の指示に従って処置する。サイトは、示されているように、ガーゼ、外科用テープ及び／またはＴｅｇａｄｅｒｍ包帯を使用して手当する。
・対象をＣＴスキャナから出させて、ストレッチャー上に仰臥位で置く。
・麻酔を中止して、麻酔後のケアのための施設のガイドラインに従って対象をケアする。神経生理学的モニターを、研究対象から外してもよい。
・対象が横たわるストレッチャーの頭部は、回復中にわずかに（約３０度）持ち上げるべきである。
・対象は、施設のガイドラインに従って適切な麻酔後ケアユニットに移送される。
・対象は、意識を十分に回復し、安定した状態になった後、プロトコールに基づくアセスメントのために適切なフロア／ユニットに入室する。・プロトコールに従って神経学的アセスメントを行い、治験責任者は病院及び研究のスタッフと協力して対象のケアを監督する。
実施例８：大型動物におけるくも膜下腔内投与経路の評価
この研究の目的は、脳室内（ＩＣＶ）注射、及び腰椎穿刺による注射を含む、ＣＳＦへのより慣用的な投与方法を評価することであった。要するに、この研究では、ＩＣＶ及びＩＣ ＡＡＶ投与をイヌで比較した。ベクターの投与は、非ヒト霊長類の腰椎穿刺によって評価し、動物の一部は、ベクターの頭蓋内分布を改善することが示唆された操作である、注射後、トレンデレンブルグ位に置いた。イヌの研究では、ＩＣＶ及びＩＣベクター投与は、脳及び脊髄全体にわたって同様に効率的な形質導入をもたらした。しかし、ＩＣＶコホートの動物は、導入遺伝子産物に対する重度のＴ細胞応答に明らかに起因して、脳炎を発症した。ＩＣＶコホートにおいてのみ、この導入遺伝子特異的免疫応答の発生は、導入遺伝子発現部位における注射手順からの局在性炎症の存在に関連すると疑われる。非ヒト霊長類（ＮＨＰ）の研究では、非常に大きな注射量（全ＣＳＦ量の約４０％）を用いる
ことにより、腰部槽へのベクター投与後の形質導入効率が以前の研究と比較して改善された。しかし、このアプローチはやはり、ＩＣ管理ほどは効率的ではなかった。注射後にトレンデレンブルグに動物を配置することは、さらなる利益をもたらさなかった。しかし、大きな注射量はベクターの頭蓋内分布を改善し得ることが判明した。
くも膜下腔内ＡＡＶ送達の有効性を最大にするためには、ＣＳＦへのベクター投与の最適経路を決定することが重要であろう。本発明者らは以前、後頭下穿刺による大槽（ｃｅｒｅｂｅｌｌｏｍｅｄｕｌｌａｒｙ ｃｉｓｔｅｒｎ）へのベクター注射は、非ヒト霊長類における有効なベクター分布を達成したが、腰椎穿刺による注射は、脊髄の形質導入を実質的に低下させ、脳への事実上の分布を生じず、投与経路の重要性を強調していることを報告した［Ｈｉｎｄｅｒｅｒ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ－Ｍｅｔｈｏｄｓ＆Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．１２／１０／オンライン ２０１４；１］。他の研究者は、一般的な臨床的手順である側脳室へのベクター送達が有効なベクター分布をもたらすことを示唆している［Ｈａｕｒｉｇｏｔ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．，１２３（８）：３２５４－３２７１］。また、腰椎穿刺による送達は、頭蓋内ベクター分布を促進するために、注射後にトレンデレンブルグ位に動物を置くことによって改善され得ることも報告されている［Ｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ：ｔｈｅ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｏｃｔ ３１ ２０１４］。この研究では、イヌにおける緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）レポーター遺伝子を発現するＡＡＶ９ベクターの脳室内投与及び大槽内投与を比較した。脳室内送達は、導入遺伝子特異的免疫応答のさらなるリスクを伴うことがあるが、両方の経路がＣＮＳ全体に有効な分布を達成することを本発明者らは、見出した。本発明者らはまた、ＮＨＰにおける腰椎穿刺によるベクター送達、及び注射後のトレンデレンブルグ位に動物を置くことの影響を評価した。注射後の位置決めの明確な効果はなかったが、本発明者らは、大きな注射量はベクターの頭蓋内分布を改善し得たことを見出した。
Ａ．材料及び方法：
１．ベクター生成：ＧＦＰベクターは、ニワトリベータアクチンプロモーターとともに、サイトメガロウイルス早初期エンハンサー、人工イントロン、増強緑色蛍光タンパク質ｃＤＮＡ、ウッドチャック型肝炎ウイルス転写後調節エレメント、及びウサギベータグロビンポリアデニル化配列を含む発現カセットを保持するＡＡＶ血清型９キャプシドから構成された。ＧＵＳＢベクターは、ニワトリベータアクチンプロモーターとともにサイトメガロウイルス早初期エンハンサー、人工イントロン、イヌＧＵＳＢ ｃＤＮＡ、及びウサギベータグロビンポリアデニル化配列を含む発現カセットを保持するＡＡＶ血清型９キャプシドから構成された。ベクターは、ＨＥＫ２９３細胞の三重トランスフェクションによって産生され、以前に記載されたように［Ｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ．、Ｈｕｍａｎ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｏｃｔ ２０１０；２１（１０）：１２５９－１２７１］］イオジキサノール勾配で精製された。
２．動物実験：全てのイヌは、ペンシルバニア大学のｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｆｅｒｒａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ａｎｉｍａｌ Ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ Ｈｕｍａｎ
Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（獣医学部のヒト遺伝病動物モデルの国立紹介センター）（ＮＩＨ ＯＤ Ｐ４０－０１０９３９）で、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ（国立衛生研究所）及びＵＳＤＡの実験動物の飼育及び使用に関するガイドラインに従って飼育した。
３．ＮＨＰ研究：この研究には、９～１２歳のカニクイザル６匹が含まれていた。動物は注射時に４～８ｋｇであった。ベクター（２×１０１３ＧＣ）を注射前に５ｍＬのＯｍ
ｎｉｐａｑｕｅ（Ｉｏｈｅｘｏｌ）１８０造影剤で希釈した。腰椎穿刺によるベクターの注射は、以前に記載されているように行った［Ｈｉｎｄｅｒｅｒ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ－Ｍｅｔｈｏｄｓ ＆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．１２／１０／オンライン ２０１４；１］。くも膜下腔内空間への正確な注射は、蛍光透視法によって確認した。トレンデレンブルグ群の動物では、注射直後にベッドの頭部を１０分間３０度下げた。安楽死及び組織収集は、以前に記載されているように実施した［Ｈｉｎｄｅｒｅｒ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ－Ｍｅｔｈｏｄｓ ＆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．１２／１０／ｏｎｌｉｎｅ ２０１４；１］。
４．イヌの研究：この研究には、６匹の１歳齢のＭＰＳ Ｉイヌと、２ヵ月齢のＭＰＳ
ＶＩＩイヌを含んだ。注射座標を計画するために、ベースラインＭＲＩを、全てのＩＣＶ処置イヌで行った。大槽内注射は、以前に記載されているように実施した［Ｈｉｎｄｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ：ｔｈｅ ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．Ａｕｇ ２０１５；２３（８）：１２９８－１３０７］。ＩＣＶ注射のために、イヌを静脈内プロポフォールで麻酔し、気管内挿管し、イソフルランで麻酔下に維持し、定位フレームに置いた。皮膚を無菌的に準備し、注射部位に切開を施した。単一の穿頭孔を注射部位に穿孔し、そこを通して２６ゲージの針を所定の深さまで前進させた。配置はＣＳＦの戻りによって確認された。ベクター（１ｍＬ中１．８×１０１３ＧＣ）を１～２分間かけてゆっくりと注入した。安楽死及び組織収集は、以前に記載されているように行った［Ｈｉｎｄｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ：ｔｈｅ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．Ａｕｇ ２０１５；２３（８）：１２９８－１３０７］。
５．組織学：脳は、ＧＦＰ発現の評価について記述されているように処理された［Ｈｉｎｄｅｒｅｒ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ－Ｍｅｔｈｏｄｓ＆Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．１２／１０／オンライン ２０１４；１］。ＧＵＳＢ酵素染色及びＧＭ３染色は、以前に記載されたように実施した［Ｇｕｒｄａ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ：ｔｈｅ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｏｃｔ ８ ２０１５］。
６．ＥＬＩＳＰＯＴ：剖検の時点で、血液を、ベクター処理イヌからヘパリン処理したチューブ中に採取した。末梢血単核細胞を、Ｆｉｃｏｌｌ勾配遠心分離によって単離した。ＡＡＶ９キャプシドペプチド及びＧＦＰペプチドに対するＴ細胞応答を、インターフェロンガンマＥＬＩＳＰＯＴによって評価した。ＡＡＶ９及びＧＦＰペプチドライブラリーは、１０アミノ酸オーバーラップ（Ｍｉｍｏｔｏｐｅｓ）を有する１５マーとして合成した。ＡＡＶ９ペプチドライブラリーを、以下の３つのプールにグループ分けした：ペプチド１～５０のプールＡ、ペプチド５１～１００のプールＢ、ペプチド１０１～１４６のプールＣ。また、ＧＦＰペプチドライブラリーを３つのプールにグループ分けした。ホルボール１２－ミリステート１３－アセテートプラスイオノマイシン塩（ＰＭＡ＋ＩＯＮ）を、陽性対照として用いた。陰性対照としてＤＭＳＯを用いた。細胞をペプチドで刺激し、インターフェロンガンマ分泌が記載のように検出された。百万リンパ球あたり５５スポット形成単位（ＳＦＵ）を超え、かつＤＭＳＯ陰性対照値の少なくとも３倍である場合、応答を陽性とみなした。
７．生体内分布：剖検の時点で、生体内分布のための組織をドライアイス上で直ちに凍結させた。ＤＮＡ単離及びＴａｑＭａｎ ＰＣＲによるベクターゲノムの定量は、記載のとおり行った［Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｈｕｍａｎ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｎｏｖ
２０１１；２２（１１）：１３８９－１４０１］。
８．ＧＵＳＢ酵素アッセイ：ＧＵＳＢ活性を記載のとおり、ＣＳＦで測定した［Ｇｕｒｄａ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ：ｔｈｅ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｏｃｔ ８ ２０１５］。
Ｂ．結果
１．イヌにおける脳室内及び大槽内ベクター送達の比較
リソソーム蓄積症ムコ多糖症Ｉ型（ＭＰＳ Ｉ）のイヌモデルを用いた本発明者らの以前の研究は、大槽内へのＡＡＶ９注射が脳及び脊髄全体を効果的に標的し得ることを実証した［Ｈｉｎｄｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ：ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．Ａｕｇ ２０１５；２３（８）：１２９８－１３０７］。この研究では、成体ＭＰＳ Ｉイヌの大槽または側脳室に投与したＧＦＰレポーター遺伝子を発現するＡＡＶ９ベクターの分布を、本発明者らは、比較した。３匹のイヌを、１ｍＬのベクター（１．８×１０１３ゲノムコピー）を大槽に１回注射して処置した。３匹の追加のイヌが、同じベクターを側脳室に１回だけベクター注射した。ＩＣＶ注射によって処置されたイヌでは、注射のためのより大きな側脳室を選択し、標的座標を規定するためにベースラインＭＲＩを実施した。指定された心室を正確に標的とするために、定位固定フレームを用いて注射を行った。
ＩＣベクター注射で処置した３匹のイヌは、この試験を通して健康に見えた。ベクターの生体内分布及び導入遺伝子発現の評価のために、ベクター注射の２週間後に安楽死させた。肉眼的または顕微鏡的脳病変は、いずれのＩＣ処置イヌにおいても観察されなかった（図１２Ａ～１２Ｆ）。定量的ＰＣＲによるベクターゲノムの測定により、脳及び脊髄の全ての採取領域にわたってベクター沈着が明らかになった（図１３）。ベクターゲノムの分布と一致して、強力な導入遺伝子発現が、大脳皮質の大部分の領域ならびに脊髄全体で検出可能であった（図１４Ａ～１４Ｈ）。脊髄組織学は、胸部及び腰部セグメントに有利な形質導入勾配を有するアルファ運動ニューロンの強力な形質導入に関して顕著であった。
ベクターを注射したＩＣＶで処置した３匹のイヌは、当初、この手順の後、健常に見えた。しかし、１匹の動物（Ｉ－５６７）は注射１２日後に死亡が判明した。他の２匹の動物は指定された１４日の剖検時点まで生存したが、一匹の動物（Ｉ－５６５）は安楽死前に昏睡状態になり、もう一方の動物（Ｉ－５６８）は、顔面筋の衰弱を示し始めた。これらの臨床所見は、重大な肉眼的脳病変と相関していた（図１２Ａ～１２Ｆ）。３匹全ての動物の脳は、針跡を囲む変色を示し、その動物での関連する出血は、死亡したと見なされた。組織学的評価では、注射部位周辺領域の重度のリンパ球性炎症が明らかになった。脈管周囲リンパ球浸潤はまた、各動物の脳全体を通して観察された（図１２Ｇ及び１２Ｈ）。この免疫学的毒性の証拠を考慮して、剖検時にＩＣＶ処置イヌ（Ｉ－５６５）の１つから採取した末梢血試料において、ＡＡＶ９キャプシドタンパク質及びＧＦＰ導入遺伝子の両方に対するＴ細胞応答を評価した。インターフェロンガンマＥＬＩＳＰＯＴは、ＧＦＰに対する強いＴ細胞応答を示し、キャプシドペプチドに対する応答の証拠はなかった（図１２Ｉ）。これは、観察された脳炎が、導入遺伝子産物に対する細胞媒介性免疫応答によって引き起こされたことを示唆している。
ＩＣＶ処置動物におけるベクター分布は、ＩＣ処置群で観察されたものと同様であったが、脊髄形質導入は、ＩＣコホートにおいて幾分大きかった（図１３）。ＩＣＶ処置動物で検査したＣＮＳ領域全体にわたってＧＦＰ発現が観察された（図１４Ａ～１４Ｈ）。
２．ＮＨＰにおける腰椎穿刺によるＡＡＶ９投与後のＣＮＳ形質導入に対するトレンデレンブルグ位の影響
本発明者らは、以前に、ＮＨＰの大槽または腰部槽へのＡＡＶ９注射を比較したところ、腰椎経路は脊髄を標的化するのに効果が１０倍少なく、脳を標的化するためには効果が１００倍少ないことが分かった［Ｃ．Ｈｉｎｄｅｒｅｒ、ｅｔ ａｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ－Ｍｅｔｈｏｄｓ ＆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．１２／１０／オンライン ２０１４；１］。それ以来、他の研究者らは、腰椎穿刺によるＡＡＶ９投与を用いたより良好な形質導入を実証しており、ベクターの脳の分布の改善は、注射後にトレンデレンブルグ位に動物を置くことによって達成した［Ｍｙｅｒ ｅｔ
ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：ｔｈｅ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｏｃｔ ３１ ２０１４］。このアプローチでは、ベクターを、過剰容積の造影剤に希釈して、溶液の密度を高め、トレンデレンブルグで重力駆動分布を促進した。６匹の成体カニクイザルを、Ｌ３－４隙間にＧＦＰを発現するＡＡＶ９（２×１０１３ゲノムコピー）の単回注射で処置した。そのベクターは、Ｉｏｈｅｘｏｌ １８０造影剤で５ｍＬの最終容積まで希釈した。４匹の動物を、注射直後に処置台の頭部を－３０°の角度で１０分間配置した。１０分後、透視画像を捕捉してＣＳＦの造影剤分布を確認した。注目すべきことに、この大きな注射容積（動物の総ＣＳＦ容積の約４０％）［Ｒｅｉｓｅｌｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．１９６２；２６７（２５）：１２７３－１２７８］の造影剤は、トレンデレンブルグ位に配置されていない動物においてさえも、脊髄くも膜下腔全体に沿って、及び基底槽に迅速に分布した（図１６Ａ及び１６Ｂ）。ＰＣＲ（図１７）及びＧＦＰ発現（図１８Ａ～１８Ｈ）によるベクターゲノム分布の分析は、脳及び脊髄全体の形質導入を実証した。注射後の位置が形質導入細胞の数または分布に及ぼす明らかな影響はなかった。以前に報告されたように、くも膜下腔内ＡＡＶ投与後の末梢へのベクターの逃避及び肝臓の形質導入があった［Ｈｉｎｄｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ－Ｍｅｔｈｏｄｓ＆Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．１２／１０／オンライン ２０１４；１；Ｈａｕｒｉｇｏｔ ｅｔ ａｌ．、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ．Ａｕｇ ２０１３；１２３（８）：３２５４－３２７１］。肝臓の形質導入の程度は、ＡＡＶ９に対する既存の中和抗体（ｎＡｂ）の存在に依存していた。６匹の動物のうち４匹は、検出可能なベースラインＡＡＶ９ ｎＡｂ（力価＜１：５）を有しておらず、２匹の動物（４０５１及び０７－１１）は、ＡＡＶ９に対する検出可能な既存抗体を１：４０の力価で有していた。以前の結果と一致して、既存の抗体は、肝臓の形質導入をブロックし、脾臓へのベクター分布の増大をもたらした［Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｈｕｍａｎ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｎｏｖ ２０１１；２２（１１）：１３８９－１４０１，が、ＣＮＳ形質導入への影響はなかった；Ｈａｕｒｉｇｏｔ ｅｔ ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ．Ａｕｇ ２０１３；１２３（８）：３２５４－３２７１］。
Ｃ．考察
後頭下穿刺は、臨床診療において寛容的な手順ではないので、本発明者らは、側脳室及び腰部槽を含む、より一般的なＣＳＦアクセス部位を評価した。ここでは、腰椎領域からのベクター分布を頭側で改善するために、より高密度によるベクター溶解及び注射後のトレンデレンブルグ位を使用する方法を評価した。
イヌの研究では、ＩＣとＩＣＶベクター注射の両方が同様に有効なベクター分布をもたらしたが、脳炎はＩＣＶ群のみで生じた。ＧＦＰ導入遺伝子に対するＴ細胞応答は、ＩＣＶ処置イヌの１匹では検出可能であり、これによって、これらの動物で観察されたリンパ球性脳炎は導入遺伝子特異的免疫応答によるものであることが示唆された。新しい抗原に対するＴ細胞応答の誘導には、ナイーブＴ細胞によるタンパク質からのエピトープの認識
、及びＴ細胞の活性化を促進する炎症性の「危険シグナル」という２つの要素が必要である。ＡＡＶは、導入遺伝子産物に対する免疫を惹起することなく外来導入遺伝子を発現し得ると考えられる。なぜなら、ＡＡＶは、先天性免疫系を活性化することなく、それによって、ナイーブリンパ球が新しく発現した抗原に遭遇した場合に、免疫よりむしろ炎症性シグナルを回避し、寛容を促進するからである。外来の導入遺伝子産物が発現されるのと同じ位置で起こる脳実質を貫通する外傷によって引き起こされる局所的な炎症は、導入遺伝子産物に対する免疫応答を誘導するために必要な危険信号を提供し得る。これは、直接脳注射によって送達されるが、ＩＣ注射によっては送達されないＡＡＶベクターから発現される酵素に対する細胞媒介性免疫応答を発達させる、ＭＰＳ Ｉイヌにおける以前の研究によって裏付けられている［Ｃｉｒｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ．Ａｕｇ ２００６；６０（２）：２０４－２１３；Ｈｉｎｄｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ：ｔｈｅ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．Ａｕｇ ２０１５；２３（８）：１２９８－１３０７］。そのような免疫応答の可能性は、注射によって引き起こされる炎症応答が、自己タンパク質に対する寛容を壊さない可能性がある場合でさえ、内因的にも産生されるタンパク質を発現するベクターを送達することに関して、導入遺伝子産物が、外来性と認識されるか否かに依存する。導入遺伝子産物と内因性タンパク質との類似性は、ＧＦＰに対して観察されたタイプのＴ細胞応答の不在の原因である可能性が高いので、ＭＰＳ ＶＩＩイヌにおけるＩＣＶベクター送達の研究における結果、この概念が支持される。これは、導入遺伝子産物に類似のタンパク質の産生を可能にするミスセンス突然変異を有する劣性疾患の患者にも当てはまり得る。したがって、免疫の危険性は、患者集団及び導入遺伝子産物に応じて変化し得、場合によっては、導入遺伝子に対する破壊的Ｔ細胞応答を予防するために免疫抑制が必要であり得る。今回の知見によって、有害な免疫応答のリスクは、ＩＣＶ投与経路ではなくＩＣを用いることによって緩和される可能性が高いことが示唆される。
ＮＨＰにおける腰椎穿刺によるＡＡＶ９投与の研究は、本発明者らが以前にこの投与経路で観察したよりも、ＣＮＳ全体でより大きな形質導入を示した。この差は、ベクターを過剰量の造影剤に希釈するために必要であった、本研究での注射量が大きいためであると思われる。以前の研究では、このような大量の注射（ＣＳＦ量の約４０％）が、注射された物質を直接マカクの基底槽及び脳室ＣＳＦにさえ送達し得ることが示されている［Ｒｅｉｓｅｌｂａｃｈ、上記引用］。患者に日常的に投与されない極めて大きな注射量（＞６０ｍＬ）が必要であることを考えれば、ヒトに対してこのアプローチを変換する可能性は不明である。さらに、この大量のアプローチであっても、腰椎穿刺による注射は、ＩＣ送達での以前の結果よりも効率が悪かった。この以前の研究では、動物は体重によって投与されたので、１匹の動物にだけは、ここで使用したものと同等のＩＣベクター用量を投与した［Ｈｉｎｄｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ－Ｍｅｔｈｏｄｓ＆Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．１２／１０／オンライン ２０１４；１］。その動物は、脳及び脊髄における平均３倍のベクター分布を有し、これは、腰部槽への非常に大きな容積のベクター送達さえもＩＣ送達よりも効率が低いことを示している。文献の報告とは対照的に、本発明者らは、腰椎のベクター注射後にトレンデレンブルグ位に動物を置くことには、さらなる利点はないことを見出した［Ｍｅｙｅｒ ｅｔ
ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ：ｔｈｅ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ
Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｏｃｔ ３１
２０１４］。
これらの発見をまとめると、このアプローチは腰椎穿刺による投与よりも効率的なベクター分布を達成し、ＩＣＶ投与よりも導入遺伝子産物に対する免疫の危険性がより少ないように見えるので、大槽のレベルでのベクター投与をサポートする。大槽脈へのベクター送達は、前臨床試験で用いられた後頭下穿刺アプローチを用いて臨床的に行うことができ
た。さらに、横方向アプローチ（Ｃ１－２穿刺）を用いた第１及び第２の頚椎間のくも膜下腔への注射は、大槽への注射部位の近接性を考慮すれば、同様のベクター分布を生じる可能性がある。Ｃ１－２アプローチは、後頭下穿刺とは異なり、ＣＳＦアクセス、特にくも膜下腔内造影剤投与のために臨床的に広く使用されるというさらなる利点を有する。
実施例９：アカゲザルでくも膜下腔内注射されたＡＡＶ２／９．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＩＤＳ．ＲＢＧの非臨床薬理学／毒物学研究
ヒト投与に関して最小有効用量（ＭＥＤ）よりも十分な安全マージンを得るために、アカゲザルにおけるヒトＩＤＳをコードするベクターであるＡＡＶ２／９．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＩＤＳ．ＲＢＧの２つの用量のくも膜下腔内投与の安全性を評価するためにデザインされた研究を行う。
対照品は、第１群に無作為化した単一のマカクに後頭下穿刺を介して投与する。試験品は、第２～３群に無作為化した６匹のアカゲザルに後頭下穿刺を介して投与する。２群のマカクは、５×１０１３のゲノムコピー（ＧＣ）（Ｎ＝３）という高用量で試験品を与えられる；３群のマカクは、１．７×１０１３ＧＣ（Ｎ＝３）という低用量で投与された試験品を与えられる。血液及び脳脊髄液は、一般的な安全パネルの一部として収集する。
ベクター投与後９０±３日でこれらの研究の生存段階が完了した後、マカクを剖検して、総合的な組織病理学的検査のために組織を採取する。リンパ球を肝臓、脾臓、及び骨髄から採取し、剖検時にこれらの器官における細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の存在を調べる。
Ｉ．Ｉ．実験デザイン
Ａ．材料
試験品－ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＩＤＳは、ＡＡＶ２／９．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＩＤＳ．ＲＢＧとしても公知であり、ＡＡＶ２／９．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＩＤＳ．ＲＢＧ．ＫａｎＲとも呼ばれる。これらの名称は同義語であり、互換的に使用してもよい。
試験品は、ドロップレット（Ｄｒｏｐｌｅｔ）デジタル（ｄｄ）ＰＣＲを用いることによって測定した５．７２×１０１３ＧＣ／ｍｌの濃度を有する単一ロットとして生成した。ベクターは、製造後、注射の日まで６０℃以下で保存する。注射の日に、ベクターを対照品で希釈する。一旦希釈されると、ベクターは、注射の時間まで、冷蔵庫または湿った氷の中で２～４℃で保存される。ベクターの調製は注射の日に行う。
対照群動物は、対照品Ｅｌｌｉｏｔ’ｓ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（ＥＦＢ）を投与され、及び試験品（ＥＦＢ＋０．００１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８）は投与されない。対照品は、製造後及び注射の日まで室温で貯蔵する。
Ｂ．試験システム
試験系選択の正当化：この研究は、ＣＮＳ疾患の遺伝子治療ベクターのくも膜下腔内（ＩＴ）送達を含む。非ヒト霊長類（ＮＨＰ）におけるＣＮＳの様相は、本発明者らの臨床標的集団の最も代表的なモデルとして機能する。この研究によって、ＩＴ注射後のベクターの用量関連毒性に関するデータが得られる。
Ｃｏｖａｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．（Ａｌｉｃｅ，ＴＸ）によって供給された体重３～１０ｋｇの３～７歳の七（７）匹の雄性Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ（アカゲザル）を使用する。
ＩＩ．一般的なデザイン手順
７匹のアカゲザル（雄性）を研究に使用する。動物を表１に記載した３つの研究グループに分ける。７匹の動物全てに、後頭下穿刺を介してＩＴ注射を与える。
Figure 2023011821000001
動物を麻酔し、大槽内へ後頭下穿刺を介して試験品を投与する。
麻酔したマカクを処置室で準備し、Ｆｌｕｏｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｕｉｔｅ（蛍光透視室）に移し、頭部をＣＳＦ採取及び大槽内への投与のために前方に屈曲させた側臥位でイメージングテーブル上に置く。注射部位を無菌的に準備する。無菌技術を使用して、２１～２７ゲージの１－１．５インチのＱｕｉｎｃｋｅ脊髄針（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を、ＣＳＦの流れが観察されるまで、後頭下空間に前進させる。ベースライン分析のため、及び投与前に、最大１．０ｍＬのＣＳＦを収集する。横断される解剖学的構造には、皮膚、皮下脂肪、硬膜外腔、硬膜及び環椎－後頭部筋膜が含まれる。針は、血液汚染及び潜在的な脳幹損傷を避けるために、大槽のより広い上位ギャップに向けられる。針穿刺の正しい配置を、蛍光灯（ＯＥＣ９８００ Ｃ－Ａｒｍ、ＧＥ）を使用して、脊髄造影法により確認する。蛍光透視装置は、製造業者の推奨に従って操作する。ＣＳＦ収集後、Ｉｏｈｅｘａｌ（商品名：Ｏｍｎｉｐａｑｕｅ １８０ｍｇ／ｍＬ、Ｇｅｎｅｒａｌ Ｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）造影媒体及び試験品または対照品の投与を容易にするために、脊髄針にルアーアクセス延長カテーテルを接続する。一（１）ｍＬのＩｏｈｅｘｏｌをカテーテル及び脊髄針を介して投与する。針の配置を確認した後、試験品を含むシリンジ（１ｍＬにシリンジの容積とリンカーのデッドスペースを加えたものに等しい容積）をフレキシブルリンカーに接続し、２０～６０秒かけてゆっくりと注射する。針を外し、穿刺部位に直接圧力を加える。注射装置内に残っている残留試験品を収集し、－６０℃以下で保存する。
動物が大槽にうまく投与できない場合、Ｃ１－Ｃ２くも膜下腔内空間（環椎関節）への投薬を、投薬の代替部位として使用してもよい。投薬手順は以下のとおりである。動物を側臥位に置き、頭部をＣＳＦ収集のために前方に屈曲させ、Ｃ１－Ｃ２くも膜下腔内空間に投与する。注射部位を無菌的に準備する。無菌技術を用いて、２１～２７ゲージの１～１．５インチのＱｕｉｎｃｋｅ脊髄針（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を、ＣＳＦの流れが観察されるまでくも膜下腔内空間に進める。ベースライン分析のため、及び投与前に、最大１．０ｍＬのＣＳＦを収集する。横断される解剖学的構造としては、皮膚、皮下脂肪、硬膜外腔、硬膜及び筋膜が挙げられる。針は、血液汚染及び頚椎脊髄への潜在的
な損傷を避けるために、Ｃ２椎骨よりも上で椎骨空間内に挿入される。残りの手順は、大槽内投与について前記されたのと同様である。
動物には、ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＩＤＳまたは対照品のいずれかのくも膜下腔内注射を与える。投与頻度は表３に概説されている。高用量のＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＩＤＳは５×１０１３ＧＣ及び低用量１．７×１０１３ＧＣである。マカク１匹あたりに注射される希釈されたＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＩＤＳまたは対照品の総容積は１ｍＬである。
ＩＩＩ．結果
ＣＳＦ髄液細胞増加症は、ＣＳＦ中の白血球数として示した場合、高用量処置群（第２群）では３匹中２匹で、低用量投与群（第３群）では３匹中１匹で観察された（図２８）。このような髄液細胞増加症は、９０日目に高用量処置動物１匹（ＲＡ２２０３）を除く全ての動物において解決された。
さらに、脊髄後索の軸索変性症が存在する（データは示されていない）。
現在の低用量は１．９×１０１１ＧＣ／ｇ脳重量に相当し、これは、提案された臨床的高用量、９．４×１０１０ＧＣ／ｇ脳重量に近い。現在の高用量は、５．６×１０１１ＧＣ／ｇ脳重量に相当し、これは臨床用量の約５倍である。
抗ｈＩＤＳ抗体のＥＬＩＳＡアッセイを、上記の動物から採取した血清試料に対して行った。６０日目に得られた結果を、図２９にプロットし、下の表２に示す。ＣＳＦ試料を、抗ｈＩＤＳ抗体のＥＬＩＳＡアッセイを介して評価のために２０倍に希釈した。結果を表３に示す。低用量処置群（第２群）では、血清及びＣＳＦの両方において、高用量群（第３群）と比較して免疫原性の低下が観察された。ｈＩＤＳに対する免疫原性は、非処置対照では観察されなかった。
Figure 2023011821000002
Figure 2023011821000003
実施例１０：免疫抑制されたアカゲザルでくも膜下腔内注射されたＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＩＤＳの非臨床の薬理学／毒物学研究
アカゲザルにおける、ヒトＩＤＳをコードするベクターであるＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＩＤＳの２用量のくも膜下腔内投与の安全性に対する化学誘発免疫抑制（ＩＳ）の影響を評価するためにデザインした研究を行う。この研究は、実施例２に記載のとおりであり、下
に注記する改変を伴う。
対照品投与動物を、実施例９と同様に繰り返す。試験品は、１～２群にランダム化されたアカゲザル６匹に後頭下穿刺によって投与する。第１群のマカクは、５×１０１３ゲノムコピー（ＧＣ）（Ｎ＝３）という高用量で試験品を与えられる。第２群のマカクは、１．７×１０１３ＧＣ（Ｎ＝３）という低用量で投与された試験品を与えられる。血液及び脳脊髄液は、一般的な安全パネルの一部として収集する。第１群及び第２群のサルは、ミコフェノレートモフェチル（ＭＭＦ）を、ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＩＤＳ投薬の少なくとも２週間前、投薬後６０日まで、及びラパマイシンを投薬の少なくとも２週間前、及び投薬後９０日まで（＋／－３日）与えられる。両方の免疫抑制剤の血漿トラフレベルをモニターし、用量は、ミコフェノラート酸（ＭＰＡ、ＭＭＦの活性代謝産物）及びラパマイシンについては１０－１５μｇ／Ｌについて２～３，５ｍｇ／Ｌの範囲を維持するように調節する。
ベクター投与後９０±３日でこれらの研究の生存段階が完了した後、マカクを剖検して、総合的な組織病理学的検査のために組織を採取する。リンパ球を血液、脾臓、及び骨髄から採取し、剖検時にこれらの組織における細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の存在を調べる。
Ａ．材料
試験品、対照品、その調製は実施例９に記載されている。
Ｂ．試験システム
Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ（アカゲザル）を実施例９に記載したように利用し、維持する。６匹の動物（６匹の雄）のコホートをこの研究に使用する。動物には最低のＩＤから最高のＩＤまでの１－６の番号を割り当てる。番号１～６のランダムなリストを、ｒａｎｄｏｍ．ｏｒｇによって生成し、一旦、無作為化された動物は次のように順番に割り当てる：第１群に３匹の動物を割り当てる。第２群には３匹の動物を割り当てる。
Ｃ．一般的なデザイン手順
試料サイズと群の指定：
アカゲザル６匹を研究に使用する。動物を表４に列挙するように２つの研究群に分ける。６匹の動物全てに、後頭下穿刺によるＩＴ注射を与える。
Figure 2023011821000004
免疫抑制レジメンを、第１群及び２の全ての動物に投与する。動物の各群についての薬物の組合せ、用量及び投与スケジュールを表５に要約する。動物を、全身性抗生物質及び／または抗真菌剤を用いて処置して、免疫抑制が起こった場合、免疫抑制に伴う日和見感染を処置してもよい。
動物には、ミコフェノレートモフェチル（ＭＭＦ）とラパマイシンの併用療法を施す。両方の免疫抑制剤とも、麻酔をかけられたか、または意識下イス拘束のマカクに、経口摂食管または経鼻栄養チューブを通じて投与する。麻酔した動物は、絶食はさせず、チューブからの胃内容物の吸引を可能にする（正しい配置確認）。免疫抑制レジメンは、試験品のくも膜下腔内投与の少なくとも２週間前に開始する。ＩＳ薬物の開始投与量は、他の研究のために以前にＧＴＰで使用された用量で、アカゲザルで以前に記載された有効性に基づいており、血漿トラフレベルのモニタリング時に調整される。
免疫抑制の最初の日の動物の体重を用いて初期用量を計算する。動物は毎朝秤量し、体重変化が＋／－１０％を超えた場合、用量を再計算する。
トラフレベルは、最初は週に２回、そして６０日後には１週間に１回（ラパマイシンのみが投与される場合）モニターする。
Figure 2023011821000005
ｃ．ＩＳ薬物
ラパマイシンは、くも膜下腔内投与の少なくとも１４日前、及び研究の９０日目（それを含む）（＋／－３日目）まで、０．５～４ｍｇ／ｋｇ ＰＯ、ＳＩＤの用量で投与される。開始用量は１ｍｇ／ｋｇである。ラパマイシンの投与量は、試験期間中、可能な限り１０～１５μｇ／Ｌに近い目標トラフレベルを維持するように計算される。目標トラフの薬物レベルが１週間以内に達成されない場合、用量は０．２５～２ｍｇ／ｋｇ用量間隔で滴定される。安定化期間の後、トラフレベルが２回の連続的な採血について低すぎる場合、調整が行われる。トラフレベルが高すぎる場合は、即座に調整を行う。
ＭＭＦは、くも膜下腔内投与の少なくとも１４日前、及び研究の第６０日まで（それを含む）５０ｍｇ／ｋｇ ＰＯ、ＢＩＤの開始用量で投与される。次いで、トラフレベルの結果を用いて、５～２５ｍｇ／ｋｇの用量間隔で滴定される用量を調整する。ＭＰＡのトラフレベルは、できるだけ２～３．５ｍｇ／Ｌに近い値に維持する。安定化期間の後、トラフレベルが２回の連続的な採血について低すぎる場合、調整が行われる。トラフレベルが高すぎる場合は、即座に調整を行う。
ｄ．ＩＳ薬物の処方
ＭＭＦは、２００ｍｇ／ｍＬの濃度で市販の経口溶液を用いて試験系に経口投与される。
ラパマイシンは、以下の市販の製剤の１つ以上を用いて試験系に経口投与される：０．５ｍｇのコーティング錠剤；１ｍｇのコーティング錠剤；２ｍｇのコーティング錠剤。
丸剤製剤を投与する場合、錠剤は以下のように調製される：
各ラパマイシン丸剤は、室温または温水のいずれかの希釈剤（必要に応じて温水を使用して溶解を加速する）に入れて、錠剤の外側コーティングを溶解させる。約１０ｍｌの水を使用する。丸剤は黄色のコーティングの下は白い。外側のコーティングが溶解したら、各丸剤を乳鉢と乳棒を用いて細かい粉末になるまで粉砕し、均一な溶液を作る。錠剤（複数可）を溶解するために使用される希釈剤の全量を研究の記録に記録する。
全混合物を投与シリンジに引き込み、本実施例に前に記載したとおりＯＧまたはＮＧチューブを通じて投与する。
ＭＭＦ及び／またはラパマイシンの投与に続いて、経口胃管または経鼻胃管を飲料水でフラッシュする。フラッシュ量は研究の記録に記録する。
ＭＰＳ ＩＩマウスにおけるＡＡＶ９．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＩＤＳの脳室内（ＩＣＶ）送達の有効性を評価し、最小有効用量を決定するために、以下の研究を行った。有効性は、ベクターに対する薬力学的応答（酵素的に活性なｈＩＤＳタンパク質の生成）の証拠及びＭＰＳ ＩＩ疾患（ＩＤＳ欠損）の行動及び組織学的発現に対する効果に基づく。
実施例１１：ＭＰＳ ＩＩのマウスモデルにおける脳室内ＡＡＶ９．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＩＤＳ．ｒＢＧの有効性
Ｉ．要約
ハンター症候群、ムコ多糖症ＩＩ型（ＭＰＳ ＩＩ）は、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）デルマタン及びヘパラン硫酸のリソソーム異化作用に関与する酵素であるイズロネート－２－スルファターゼ（ＩＤＳ）の欠乏によって引き起こされるＸ連鎖遺伝性障害である。この欠損は、分解されていないＧＡＧの細胞内蓄積をもたらし、最終的に進行性の重度の臨床表現型に至る。遺伝子治療及び体細胞治療を含む、障害の可能性のある治療戦略を特定するために、過去２～３０年で多くの試みがなされてきた。ヒトＩＤＳを発現するＡＡＶ９ベクターであるＡＡＶ９．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＩＤＳ．ｒＢＧの単一の脳室内（ＩＣＶ）投与の短期間（２１日間）の生体内分布、発現及び活性を、ＭＰＳ ＩＩマウスモデルにおいて評価するために研究を行った。ＭＰＳ ＩＩのマウスモデルにおいて、３ヶ月の注射後（ｐｉ）観察期間を有する単回用量として、ＩＣＶ経路を通じて投与されたＡＡＶ９．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＩＤＳ．ｒＢＧの最小有効用量（ＭＥＤ）を決定するために、さらなる研究をデザインして、実施した。この研究にはまた、いくつかの安全性エンドポイント（導入遺伝子及び脳組織病理学に対する体液性免疫応答の評価）も含んでいた。
ＡＡＶ９．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＩＤＳ．ｒＢＧを、０日目に、３×１０８ＧＣまたは３×１０９Ｃまたは３×１０１０ＧＣの用量で、２～３月齢のＣ５７ＢＬ／６ＩＤＳγ／－（ＭＰＳ ＩＩ）マウス（１６匹の雄／群）に脳室内投与した。２１日目に、群３～５（表６）からのマウスを安楽死させ、ＣＮＳ ＩＤＳ活性、生体内分布及び抗ｈＩＤＳ免疫原性の評価のために剖検した。６０～８９日の間に、野生型マウス及び未処置ＭＰＳ ＩＩマウスを、一連の神経行動アッセイ（オープンフィールド、Ｙ迷路、文脈恐怖条件付け及び新規物体認識）で評価し、これらのエンドポイントにおける疾患状態の効果を特徴付けた。これらの初期アッセイの結果に基づいて、長期記憶（文脈恐怖条件付け及び新規物体認識）を評価した２つのアッセイにおいて、残りの処置マウスを評価した。ＡＡＶ９．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＩＤＳ．ｒＢＧのＩＣＶ投薬の約３ヶ月後、残りのマウスを全て安楽死させ、剖検した。血清及びＣＳＦを、ＩＤＳ活性及び抗ＩＤＳ抗体の血清について評価した。肝臓及び心臓を、ＧＡＧ組織含有量について評価した。脳全体のリソソーム蓄積（一次ＧＡＧ蓄積及び二次ガングリオシド蓄積の両方）を、ＬＩＭＰ２及びＧＭ３の免疫組織化学染色によって評価した。組織ヘキソサミニダーゼレベルは、ＭＰＳ ＩＩマウス及びＭＰＳ ＩＩ患者においてより高く、リソソーム恒常性障害のバイオマーカーであることが示されている。組織のヘキソサミニダーゼの酵素活性を、ＡＡＶ９．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＩＤＳ．ｒＢＧ投与に対して二次的なリソソーム機能のバイオマーカーとして測定した。脳の組織病理学を評価して、有効性と安全性の両方を検討した。
Figure 2023011821000006
最大３×１０１０ＧＣ（ｄｄＰＣＲ法による５．２×１０１０ＧＣ）でのＣ５７ＢＬ／６ＩＤＳγ／－（ＭＰＳ ＩＩ）マウスへのＡＡＶ９．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＩＤＳ．ｒＢＧのＩＣＶ投与は、臨床的徴候も死亡もなしで良好に耐容され、ＣＮＳならびに末梢組織、特に肝臓に分布し、これによってＣＳＦから末梢血への注射されたウイルス粒子の部分的再分布が実証された。
ベクターの検出ならびに２１日目及びＣＳＦ３ヶ月ｐｉの脳におけるＩＤＳ活性の用量依存的増大（最高用量（脳組織）では野生型レベルに近い酵素活性を有する）によって証明されたとおり、かつ中及び高用量（ＣＳＦ）では野生型より高いことに匹敵する、脳のＩＤＳ遺伝子発現の証拠があった。３ヶ月ｐｉの全ての用量で、ＣＮＳにおけるＬＩＭＰ２及びＧＭ３染色の減少によって示されるように、リソソーム区画の用量依存性の正常化があった。Ｈ＆Ｅ染色された脳切片では、グリア空胞化の量及び頻度、ならびにＭＰＳ ＩＩ ＣＮＳ表現型の指標である両親媒性物質のニューロン蓄積における用量依存的な減少も観察された。Ｈ＆Ｅ染色切片におけるＣＮＳリソソーム含有量の変化及び疾患関連形態の改善に対応して、長期記憶の１つの尺度（新規物体認識、ＮＯＲ）では改善がみられたが、他の文脈恐怖条件付け（ＣＦＣ）ではみられなかった。ＮＯＲにおける改善において明らかになった明確な用量応答はなかった。
血清ＩＤＳ活性の用量依存的増大はまた３ヶ月ｐｉでも観察され、酵素活性は中用量及び高用量で野生型に匹敵するかまたはそれ以上であった。血清中のＩＤＳ活性の正常化を反映して、処理されたＭＰＳ ＩＩマウスは、肝臓及び心臓におけるヘキソサミニダーゼ活性及びＧＡＧ含有量の用量依存的な減少を有した。肝臓及び心臓におけるヘキサミニダーゼ活性及びＧＡＧ含有量において、肝臓ヘキソサミニダーゼ及びＧＡＧのレベルは、肝臓の全ての用量レベルで、ならびに心臓の中及び高用量で正常化した。高度に形質導入された肝臓（二倍体ゲノムあたり１～１０個のＧＣ）はおそらく、血清中のＩＤＳの分泌及び高用量での心臓の交差是正のための蓄積臓器として機能した。
ＩＣＶ投与手順自体に関連する変化が数匹のマウスで観察されたが、脳内に試験品関連毒性の証拠はなかった。導入遺伝子に対する体液性免疫応答は軽微であり、これらの動物の健康または脳組織病理学に影響を及ぼさずに一部の中及び高用量動物においてのみ観察された。
結論として、ＡＡＶ９．ＣＢ７．ＣＩ．ＩＤＳ．ｒＢＧは、全ての用量レベルでＭＰＳ
ＩＩマウスにおいて十分に耐容され、ＭＰＳ ＩＩのＣＮＳ及び末梢パラメータの両方の改善に関連するＩＤＳレベル（発現及び酵素活性）の用量依存的増大をもたらした。投与された最低用量３×１０８ＧＣ（５．２×１０８ＧＣ ｄｄＰＣＲ法）が、この試験における最小有効用量であった。
ＩＩ．材料及び方法
Ａ．ＡＡＶ９．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＩＤＳ．ｒＢＧとして同定された試験品は、ｑＰＣＲによって測定された１．１８×１０１３ＧＣ／ｍＬ及びｄｄＰＣＲによって測定された２．０５７×１０１３ＧＶ／ｍＬの力価を有する透明で無色の液体である。エンドトキシンは１．０ＥＵ／ｍＬ未満である。純度は、１００％である。試験品は≦６０℃で保存した。
Ｂ．投与量の処方及び分析
１．試験品の調製：
試験品を、滅菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈し、各用量群について適切な濃度にした。希釈したベクターを湿った氷上に保ち、希釈後４時間以内に動物に注射した。
Ｃ．試験システム
Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ ＩＤＳγ／－（ＭＰＳ ＩＩ表現型、Ｎ＝５６雄）及びＣ５７ＢＬ／６Ｊ ＩＤＳγ／＋（野生型表現型、Ｎ＝８雄）を、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ストック番号０２４７４４）からもともと得られたストックからＴｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ＴＲＬ）Ｖｉｖａｒｉｕｍで繁殖させた。動物は０日目（投薬日）に２～３ヶ月
齢であった。
Ｄ．実験デザイン
１．研究Ｗ２３５６
０日目に、３～５群（１６匹の雄／群、Ｗ２３５６及びＷ２３０１の研究を合わせた）の全ての動物に、ＡＡＶ９．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＩＤＳ．ｒＢＧをＩＣＶ投与した。２１日目に、３～５群のマウス／群（８匹の雄／群、Ｗ２３５６研究）を安楽死させ、剖検し、脳、心臓、肺、肝臓、及び脾臓を採取して、脳ＩＤＳ活性及び組織ベクター生体内分布の評価のために、ドライアイス上で急速凍結した。
Figure 2023011821000007
２．研究Ｗ２３０１
０日目に、群３～５（１６匹の雄／群）の全ての動物に、ＡＡＶ９．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＩＤＳ．ｒＢＧをＩＣＶ投与した。２～３ヶ月ｐｉ：オープンフィールド活動、Ｙ迷路活動、文脈恐怖条件付け、及び新規物体認識を含む一連の神経行動アッセイで、第１群及び２（８匹のマウス／群）の動物を評価して、これらのエンドポイントに対する疾患状態（ＭＰＳ ＩＩ遺伝子型）の影響があるか否かを決定した。明らかな疾患の効果が観察された場合、３－５群由来の８匹のマウス／群もそのアッセイで評価して、ベクターによる処置が応答に影響するか否かを判定した。
１－５群（神経行動アッセイで評価した同じ動物、８匹のマウス／群）の動物を深く麻酔して（ケタミン－キシラジン）、血清及びＣＳＦ ＩＤＳ活性及び血清抗ｈＩＤＳ抗体の評価のために、ＣＳＦ（大槽穿刺）及び血液（心臓穿刺）を収集した。次いで、マウス
を安楽死させ、剖検し、脳組織病理学のために試料を収集した；脳リソソーム蓄積（免疫組織化学及び画像分析によって評価）；肝臓及び心臓のヘキソサミニダーゼ活性；ならびに肝臓及び心臓のＧＡＧ含有量（組織含有量によって評価）。
Figure 2023011821000008
３．試験品の投与
ＩＣＶ経路は、侵襲が最小であり、（首の皮膚及び筋肉の切開を必要とする大槽の経路と比較して）マウスで外科手術を必要としないので選択した。この研究には、マウスの活動記録を含むいくつかの神経行動終点が含まれていたため、生存手術を伴わない非侵襲的注射が好まれた。マウス及び大型動物の両方において、ＡＡＶ９の脳脊髄液（ＩＣＶまたは大槽）への単回注射は、ＣＮＳ全体の中のニューロンを標的とすることが本発明者ら及び他者によって以前に実証された（Ｄｉｒｒｅｎ ａｔ ａｌ．、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｒａｐｙ ２５、１０９－１２０（２０１４）；Ｓｎｙｄｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２２，１１２９－１１３５（２０１１）、Ｆｅｄｅｒｉｃｉ ｅｔ ａｌ．、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １９、８５２－８５９（２０１２）、Ｈａｕｒｉｇｏｔ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １２３，３２５４－３２７１（２０１３）、Ｂｕｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２１，５２２－５２８（２０１４）、Ｈｉｎｄｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ：２２，２０１８－２０２７（２０１４）及びＭｏｌ Ｔｈｅｒ－Ｍｅｔｈｏｄｓ＆Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ １、１４０５１（２０１４）］。Ｈａｕｒｉｇｏｔ ｅｔ ａｌ．、（２０１３）によって発表されたデータは、別のリソソーム蓄積症の状況におけるＩＣＶ注射と大槽内注射と
の間の比較に特に取り組んでおり、２つの投与経路が導入遺伝子の発現及び生体内分布に関して等価であることを示している。
容積制限（成体マウスにおけるＩＣＶ注射については５μＬ）に起因する最大実現可能用量は、マウス１匹あたり約６×１０１０ＧＣ（ｑＰＣＲ滴定方法）であった。他のＭＰＳの処置のためのＧＴＰで得られた以前の結果に起因して、及びより大きな動物への拡張性に関する懸念に起因して、ベクターを、マウス１匹あたり３×１０１０、３×１０９、または３×１０８ＧＣ（ｑＰＣＲ滴定方法）を注射するように希釈した。ｄｄＰＣＲ法に基づいて、実際の用量はマウス１匹につき５．２×１０１０、５．２×１０９、及び５．２×１０８ＧＣであった。若年成体のＣ５７Ｂｌ６マウスの平均脳質量（０．４ｇ）を考慮すると（Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍｏｕｓｅ ｂｙ ｔｈｅ ｓｔａｆｆ ｏｆ ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ジャクソン研究室のスタッフによる生物実験）、第２改訂版、Ｅａｒｌ Ｌ．Ｇｒｅｅｎ Ｅｄｉｔｏｒ）、これは最高用量では脳質量１グラムあたり１．３１×１０１１ＧＣと等価であり、最低投与量では、脳質量１グラムあたり１．３１×１０９ＧＣに等価である。
ベクターを右側脳室にＩＣＶ投与した。マウスをイソフルランで麻酔した。各麻酔されたマウスは、頭の後ろのたるんだ皮膚によってしっかりと把持され、３ｍｍの深さまで挿入されるように調整された２６ゲージの針をはめたハミルトンシリンジで十字縫合の前方及び外側にフリーハンドで注射された。注射方法は、染料またはサブスタンスＰを右側脳室に注射することによって、マウスにおいて以前に確認された。成功は、青色染料の視覚化、または脳脊髄液への注射後のマウスのかゆみ行動（サブスタンスＰ投与後）として定義された。
Ｆ．手順、観察及び測定
罹患率／死亡率について動物を毎日モニターした。動物は、一般的な外観、毒性の徴候、苦痛及び行動の変化について、毎日のケージ側視覚観察によってモニターした。これらのデータは、この非ＧＬＰ研究では記録しなかった。
６０～９０日目（ベクター投与後２～３ヶ月）に、研究Ｗ２３５６の第１群及び第２群の８匹の動物に行動及び神経認知試験を行い、これらのエンドポイントに対する遺伝子型の効果を判定した。遺伝子型の効果が確認された場合、研究Ｗ２３５６群３－５由来の８匹の動物を用いて追加の試験を行い、処置の効果があるか否かを判定した。全ての行動手順は、遺伝子型及び群に対して盲検であるオペレーターが実施した。
ａ）一般的な移動（オープンフィールド活動）：
オープンフィールドにおける自発的活動は、Ｐｈｏｔｏｂｅａｍ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｓｙｓｔｅｍ（ＰＡＳ）－オープンフィールド（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて測定した。この評価では、マウスを単回の１０分間のトライアルのためにアリーナに個別に配置した。一般的な移動及び飼育活動を評価するために、水平及び垂直のビームブレイクを収集した。
ｂ）短期記憶（Ｙ迷路活動）：
Ｙ Ｍａｚｅ Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ Ａｌｔｅｒｎａｔｉｏｎ（Ｙ迷路自発的交替行動）は、新しい環境を探索するための齧歯類の意欲を測定するための行動試験である。試験は、互いに１２０°の角度をなす３つの白色の不透明なプラスチックアームを備えたＹ字型迷路で行われる。迷路の中心に導入された後、動物は３つのアームを自由に探索することが許される。げっ歯類は、典型的には、以前訪れたアームに戻るのではなく、迷路の新しいアームを調べることを好む。複数のアームのエントリーの経過にわたって、対象は、最近あまり訪れられなかったアームに入る傾向を示すはずである。交替行動のパーセ
ンテージを計算するために、アームエントリーの数及びトライアドの数を記録する。エントリーは、アーム内に存在する四肢全てとして定義する。この試験を使用して、マウスのトランスジェニック系統における認知障害を定量化し、認知に対するそれらの影響について新規化学物質を評価する。海馬、中隔、基底前脳及び前頭皮質を含む脳の多くの部分がこのタスクに関与する。この研究では、標準的なＹ字型迷路（サンディエゴ・インスツルメンツ）を使用し、アームエントリーの順序及び数を８分間のトライアル試験の間に記録した。自発的交替行動（ＳＡ）は、前に進入したアームに直ちに戻ることなく、迷路の３つのアーム全てに連続して入るものとして定義した。全アームエントリー（ＡＥ）は運動活動の尺度として収集された。自発的交替行動率は％ＳＡ＝（ＳＡ／（ＡＥ－２）×１００）として計算した。
ｃ）長期記憶（文脈恐怖条件付け）：
これらのタスクでは、動物は、嫌な無条件刺激（ＵＳ）通常はフット・ショックとの時間的関連のために、ある音調のような新しい環境または感情的に中立な条件付け刺激（ＣＳ）を恐れることを学習する。同じコンテクストまたは同じＣＳに曝露された場合、条件付けされた動物はフリージング行動を示す（Ａｂｅｌ ｅｔ ａｌ．、Ｃｅｌｌ ８８：６１５－６２６，１９９７）。訓練の日に、マウスは、３００秒間、ユニークな条件付けチャンバ（Ｍｅｄ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ Ｉｎｃ）を探索することが可能であった。３００秒の期間のうち２４８～２５０秒の間に、信号なしの１．５ｍＡの連続フット・ショックが送達された。チャンバ内でさらに３０秒後、マウスをそれらのホームケージに戻した。２４時間後、訓練が行われた同じチャンバ内で、空間的状況の想起を５分間連続して評価した。フリージング行動をスコアリングするために使用されたソフトウェア（Ｆｒｅｅｚｅｓｃａｎ、ＣｌｅｖｅｒＳｙｓ Ｉｎｃ）を用いて記憶を評価した。訓練セッションの２．５分の前刺激期（フット・ショックの投与前）におけるフリージング率を、チャンバへの再曝露時のフリージング率と比較する。フリージングの増大は、フット・ショックの想起を示す（すなわち、学習が起こり、動物はチャンバをフット・ショックと関連付ける）。
ｄ）長期記憶（新規物体認識）：
新規物体認識（ＮＯＲ）タスクを使用して、ＣＮＳ障害のげっ歯類モデルにおける認知、特に認知記憶を評価する。この試験は、齧歯動物が慣れた物体よりも新規物体を探索するために多くの時間を費やすという自発的な傾向に基づいている。新しい対象を探究する選択は、学習と認識の記憶の使用を反映している。新規物体認識タスクは、一般に高さ及び容積は一貫しているが、形状及び外観が異なる２つの異なる種類の物体を有するオープンフィールドアリーナにおいて行われる。習慣化の間、動物は、空のアリーナを探索することが許される。慣れてから２４時間後、動物は、同じ距離に置かれた２つの同一の物体のある、慣れたアリーナに曝される。翌日、マウスは、長期認識記憶を試験するために、慣れた物体及び新規物体の存在下でオープンフィールドを探索することを可能された。各物体を探索するのに費やされた時間及び識別指数パーセンテージを記録する。この研究では、実験装置は、白い床の灰色の長方形のアリーナ（６０ｃｍ×５０ｃｍ×２６ｃｍ）で構成され、２つの独特の物体は、３．８×３．８×１５ｃｍの金属バーと３．２ｃｍの直径×１５ｃｍ長のＰＶＣパイプであった。５日間の馴化段階の間に、マウスを１日あたり１～２分間取り扱い、空のアリーナを５分間／日で探索することを可能にした。訓練段階の間に、２つの同一の物体をアリーナに入れ、マウスが１５分間、その物体を探索することを許可した。想起段階では、マウスを、１つの慣れた物体と１つの新規物体を有するアリーナに戻した。正常マウスは、新規物体を優先的に探索する。全てのセッションが記録され、物体を探索するのに費やされた時間は、オープンソースの画像解析プログラム［Ｐａｔｅｌ ｅｔ ａｌ ＦｒｏｎｔＢｅｈａｖ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ８：３４９（２０１４）］によってスコア付けした。
Ｉ．実験室の評価
１．血清及びＣＳＦにおけるＩＤＳ活性
血清及びＣＳＦ ＩＤＳ活性のための血液を、注射後約３ヶ月の剖検で収集した。血清を血液から分離し、血清及びＣＳＦをドライアイスで凍結し、分析するまで－８０℃で保存した。ＩＤＳ活性は、１０μＬの試料を、０．０１Ｍ酢酸鉛を含む、０．１Ｍ酢酸ナトリウムに溶解した１．２５ｍＭの４－メチルウンベリフェリル（ＭＵ）ａ－Ｌ－イドピラノシイズロン酸２－硫酸塩（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）２０μＬ（ｐＨ５．０）と共にインキュベートすることによって測定した。３７℃で２時間インキュベートした後、４５μＬのＭｃＩｌｖａｉｎ緩衝液（０．４Ｍリン酸ナトリウム、０．２Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ４．５）及び５μＬの組換えヒトイズロニダーゼ（Ａｌｄｕｒａｚｙｍｅ、０．５８ｍｇ／ｍＬ、Ｇｅｎｚｙｍｅ）を反応混合物に添加し、３７℃で一晩インキュベートした。混合物をグリシン緩衝液（ｐＨ １０．９）中で希釈し、放出された４－ＭＵを、遊離４－ＭＵの標準希釈と比較して蛍光（励起３６５ｎｍ、発光４５０ｎｍ）によって定量した。
２．血清抗ＩＤＳ抗体
心臓穿刺により、研究Ｗ２３５６（２１日目）及び研究Ｗ２３０１（約３ヶ月）の終末検体終点で、血清抗ｈＩＤＳ抗体の測定のための血液を採取した。血清を分離し、ドライアイスで凍結し、分析するまで－８０℃で保存した。ポリスチレンプレートを、ＰＢＳで５μｇ／ｍＬの組換えヒトＩＤＳ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）で一晩コーティングし、ｐＨ５．８に滴定した。プレートを洗浄し、中性ＰＢＳ中の２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）中で１時間ブロックした。次いで、プレートを、ＰＢＳで１：１０００に希釈した血清試料とともにインキュベートした。結合した抗体を、２％ＢＳＡを含むＰＢＳ中で１：１０，０００に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ヤギ抗マウス抗体（Ａｂｃａｍ）で検出した。アッセイは、テトラメチルベンジジン基質を用いて発色させ、２Ｎ硫酸で停止した後、４５０ｎｍの吸光度を測定した。力価は、１：１０，０００の力価で適宜割り当てられた陽性血清試料の連続希釈により生成された標準曲線から決定した。
ＱＩＡｍｐ ＤＮＡミニキットを用いて高用量群の組織からＤＮＡを単離し、以前に記載されているように（Ｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ．、２００６）ＴａｑＭａｎ ＰＣＲによってベクターゲノムを定量した。全細胞ＤＮＡを、ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡミニキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて組織から抽出した。抽出されたＤＮＡにおけるベクターゲノムの検出及び定量は、ｒＢＧポリＡ配列を標的とするプライマー及びプローブセットを用いて、リアルタイムＰＣＲ（ＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）によって行った。
フォワードプライマー：５Ｖ－ＴＴＣＣＣＴＣＴＧＣＣＡＡＡＡＡＴＴＡＴＧＧ－３Ｖ，配列番号１６；
リバースプライマー：５Ｖ－ＣＣＴＴＴＡＴＴＡＧＣＣＡＧＡＡＧＴＣＡＧＡＴＧＣＴ－３Ｖ，配列番号１７；
プローブ：６ＦＡＭ－ＡＣＡＴＣＡＴＧＡＡＧＣＣＣＣ－ＭＧＢＮＦＱ，配列番号１８。
ＰＣＲ条件は、鋳型として１００ｎｇの総細胞ＤＮＡ、３００ｎＭのプライマー及び２００ｎＭのプローブを各々設定した。サイクルは、９５℃で１０分間、４０サイクルの９５℃で１５秒間、及び６０℃で１分であった。１００ｎｇのＤＮＡあたり１×１０４のゲノムコピーの値を計算し、１細胞あたり１つのゲノムコピーに相当した。
Ｈ＆Ｅ染色は、標準プロトコールに従って、３ヶ月間ｐｉ剖検からのホルマリン固定パ
ラフィン包埋吻側脳切片で行った。脳のＨ＆Ｅ切片を、有資格の獣医病理学者によって毒性の証拠について評価し、ＭＰＳ ＩＩ表現型に関連する所見の範囲を特徴付けた。その後、病理学者は、処置の知識なしにスライドを再検査し、グリア細胞質空胞形成、ニューロンの細胞質腫脹及び両親媒性物質の蓄積を含むＭＰＳ ＩＩ表現型の組織学的発現をスコア付けした。ＬＩＭＰ２及びＧＭ３について陽性に染色された細胞の数を、訓練されたＧＴＰ形態学コア要員によるＷ２３５６研究の各動物由来の２～４の脳切片において定量した。
ＧＭ３（凍結切片）：ＧＭ３免疫染色を、一次抗体としてモノクローナル抗体ＤＨ２（Ｇｌｙｃｏｔｅｃｈ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を用い、続いてビオチン化二次抗マウス抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）を用いて、記載したように３０μｍ厚の浮遊凍結切片に対して行い、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ Ｅｌｉｔｅ ＡＢＣキット（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）で検出した。染色切片をガラススライド上に移し、ＦｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔＧ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｈａｔｆｉｅｌｄ、ＰＡ）でマウントした。
ＬＩＭＰ２（ホルマリン固定切片）：ホルマリン固定パラフィン包埋脳組織からの６μｍ切片に対してＬＩＭＰ２免疫染色を行った。切片をエタノール及びキシレンシリーズで脱パラフィンし、抗原回収のために１０ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で、６分間マイクロ波で煮沸し、ＰＢＳ＋０．２％Ｔｒｉｔｏｎ中の１％ロバ血清で１５分間ブロックした後、ブロッキング緩衝液で希釈した一次抗体（１時間）及び標識二次抗体（４５分）と連続インキュベーションした。一次抗体は、ウサギ抗ＬＩＭＰ２（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、リトルトン、ＣＯ、１：２００）であり、二次抗体は、ＦＩＴＣまたはＴＲＩＴＣ標識ロバ抗ウサギ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）であった。
上記で得られた組織試料（切片ｂ）を、ＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて溶解緩衝液（０．２％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００，０．９％ＮａＣｌ、ｐＨ４．０）中でホモジナイズした。試料を凍結融解し、遠心分離により清澄化した。タンパク質をＢＣＡアッセイによって定量した。ＩＤＳ活性は、蛍光発生基質４－メチルウンベリフェリルα－Ｌ－イドピラノシイズロン酸２－硫酸塩（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて測定した。ヘキソサミニダーゼ活性及びＧＡＧ濃度は、記載されている標準的な手順（Ｈｉｎｄｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１５）を用いて測定した。
ＩＶ．コンピュータ化されたシステム
オープンフィールドについては、データをＥｘｃｅｌに入力し、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍを用いて分析した。Ｙ迷路については、データをＥｘｃｅｌに入力し、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍを用いて分析した。ＣＦＣの場合、Ｆｒｅｅｚｅｓｃａｎ、ＣｌｅｖｅｒＳｙｓ Ｉｎｃを使用した。ＮＯＲの場合、ＭＡＴＬＡＢ実装及びユーザガイド：ｗｗｗ．ｓｅａｓ．ｕｐｅｎｎ．ｅｄｕ／～ｍｏｌｎｅｕｒｏ／ａｕｔｏｔｙｐｉｎｇ．ｈｔｍｌを利用した。
Ｖ．統計分析
処置されたマウス及び未処置のマウスにおける組織ＧＡＧ含有量、Ｈｅｘ活性及び脳蓄積病変を、一方向ＡＮＯＶＡ、続いてダネットの多重比較試験を用いて比較した。オープンフィールド及びＹ迷路データを、スチューデントのｔ検定で分析した。二元配置ＡＮＯＶＡ及びダネットのポストホック分析を、恐怖条件付けデータに適用して、トライアル及び遺伝子型の影響を評価した。新規物体の認識試験では、新規物体対慣れた物体を探索する時間を、各グループのｔ検定を使用して、次に多重比較のためのボンフェローニ補正を
使用して比較した。
ＶＩ．結果
死亡は観察されなかった。ベクターによる処置に関連して考慮された臨床的観察はなかった。
一般的な移動活動を評価するために、オープンフィールド試験を実施した。ＩＤＳγ／－マウスは、野生型同腹仔と比較してオープンフィールドアリーナで正常な探索活動を示した（図９Ａ～９Ｃ）。
オープンフィールドアリーナ（水平運動）における野生型及びＩＤＳγ／－（ＭＰＳ ＩＩ）マウスの能力の比較を行った（図９Ａ）。１０分間のトライアル中の自発的活動は、水平運動を捕捉するＸＹ軸ビームブレイクに基づいて自動的に記録された。ＷＴマウスとＭＰＳ ＩＩマウスとの間に差は見られなかった。
オープンフィールドアリーナ（垂直運動または飼育）における野生型及びＩＤＳγ／－（ＭＰＳ ＩＩ）マウスの能力の比較を行った（図９Ｂ）。１０分のトライアル中の自発的活動は、マウスの後肢の立ち上がりをとらえるＺ軸ビームブレイクに基づいて自動的に記録された。ＷＴマウスとＭＰＳ ＩＩマウスとの間に差は見られなかった。
オープンフィールドアリーナ（センター活動）における野生型及びＩＤＳγ／－（ＭＰＳ ＩＩ）マウスの能力の比較を行った（図９Ｃ）。１０分間のトライアル中の自発的活動は、不安のマーカーとして、オープン領域で費やされた時間をとらえるセンタービームブレイクに基づいて自動的に記録した。ＷＴマウスとＭＰＳ ＩＩマウスとの間には有意差は認められなかった。
短期記憶を評価するために、Ｙ－Ｍａｚｅ（Ｙ迷路）活性を分析した。８分間のＹ迷路試験セッション中の野生型及びＩＤＳのγ／－（ＭＰＳ ＩＩ）マウスの比較。ＷＴマウスとＭＰＳ ＩＩマウスとの間のアームエントリーの総数には差異は見られなかった。ＩＤＳγ／－マウスはまた、野生型同腹仔と比較してＹ迷路において同様の数のアームエントリー及び同等の自発的交替行動を有しており、疾患過程が短期記憶に影響しないことを示した（図９Ｄ）。
長期記憶を評価するために、文脈恐怖条件付け（ＦＣ）を行った。文脈恐怖条件付けを用いた認知に対する処置効果の評価を、野生型、未処置及び処置ＭＰＳ ＩＩマウスで試験した。フリージングパーセントを、ｙ軸上にプロットした（図６Ｂ）。学習前のフリージング行動（Ｐｒｅ）を、各群の条件付け後のフリージング行動（Ｐｒｏｂｅ）と比較する（図６Ｂ）。ＦＣアッセイでは、全てのマウス（ＩＤＳγ／－及び野生型）は、試験の想起段階でのフリージング時間の割合の増大を示し、学習が起こったことを示したが、ＩＤＳγ／－マウスは、野生型同腹仔に対してフリージングの低下を示した（データは示されていない）。ＡＡＶ９．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＩＤＳ．ｒＢＧで処置したマウスでは、正常及び未処置のＩＤＳγ／－マウスの差が小さいせいで、処置関連効果を評価することは困難であったが、文脈恐怖条件付けに応答して明らかな改善はなかった（図６Ｂ）。
長期記憶をさらに評価するために、新規物体認識を行った。新規物体認識を用いた認知に対する処置効果の評価を、野生型、未処置及び処置されたＭＰＳ ＩＩマウスで試験した。野生型、未処置及び処置されたＩＤＳγ／－（ＭＰＳ ＩＩ）マウスについての新規な物体対慣れた物体を探索するのに費やされた時間の比較を行った。新規物体の探索に費やされた時間の増大（慣れた物体の記憶を示す）は、処置された全てのマウス群において見られたが、中用量群のみにおいて統計的に有意であった（図６Ｃ）。野生型マウスは、
期待されるように、新規物体を優先することを示したが、ＩＤＳγ／－は、慣れた物体の記憶の欠如（長期間の記憶障害）を示す傾向は示さなかった。くも膜下腔内ＡＡＶ９遺伝子治療は、ＩＤＳγ／－（ＭＰＳ ＩＩ）マウスで観察されたＮＯＲ欠損の改善をもたらしたが、明確な用量反応はなかった。新規物体に関する優先は、投薬群間の行動障害の相対的救済度を比較するのに研究が十分なほど有効ではなかったが、中用量コホートにおいてのみ統計的に有意であった（図６Ｃ）。
野生型の未処置及び処置ＭＰＳ ＩＩマウスにおける脳ＩＤＳ活性（２１日目）の用量依存的増大が観察された（図２Ｂ）。この初期の時点では、高用量群のみが野生型に類似したレベルを有していたが、その発現がまだ最大に達していないと予想された。
野生型、未処置及び処置ＭＰＳ ＩＩマウスにおけるＩＤＳ活性の用量依存的増大（９０日目）が、３ヶ月ｐｉの剖検で採取したＣＳＦにおいて観察された（図２Ａ）。本質的に、未処置のＩＤＳγ／－（ＭＰＳ ＩＩ）マウスではＩＤＳ活性は検出されなかった。
さらに、野生型、未処置及び処置ＭＰＳ ＩＩマウスにおける血清ＩＤＳ活性（９０日目）の用量依存的増大が、３ヶ月ｐｉの剖検で検出された（図２Ｃ）。本質的に、未処置のＩＤＳγ／－（ＭＰＳ ＩＩ）マウスの血清において活性は検出されなかった。
３ヵ月ｐｉの時点で、野生型、未処置及び処置されたＭＰＳ ＩＩマウスの肝臓（図４Ｃ）及び心臓（図４Ｄ）の両方において、ヘキソサミニダーゼ活性（９０日目）を用量依存的に正常化した。二次的に増大した酵素活性のこの正常化は、リソソームのホメオスタシスの回復を示した。野生型、未処置及び処置ＭＰＳ ＩＩマウスにおける肝臓及び心臓のＧＡＧ蓄積を検討した。３カ月ｐｉで、ＧＡＧの組織含有量は、心臓（図４Ｂ）及び肝臓（図４Ａ）の両方で用量依存的に減少し、中及び高用量レベルでの野生型組織含有量に匹敵した。肝臓は全ての用量で是正され、心臓は中及び高用量で最も部分的改善を示した。
さらに、ＩＣＶ ＡＡＶ９．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＩＤＳ．ｒＢＧで処理したＭＰＳ ＩＩマウスにおいて、ヒトＩＤＳに対する抗体応答で示される体液性免疫原性を評価した。ヒトＩＤＳに対する抗体は、２１日目及び９０日目の両方において、中及び高用量コホートにおいてのみ数匹の動物の血清において検出された（図８）。どちらの時点においても、大部分の動物は体液性免疫応答を検出できなかった（対照と同様）。中用量の動物の約３分の１及び動物群の約２０％は、バックグラウンドより高い抗体レベルを有していた。応答は高用量群ではあまり顕著でなかった。図８は、両方の剖検エンドポイントデータを集計して示す。
脳には処置関連の組織病理学的所見はなかった。この研究に存在する全ての顕微鏡所見は、この種の動物の正常な背景、年齢及び性別、疾患モデルに関連するか、またはベクター投与手順に関連すると考えられた。
細胞質空胞化に基づくスコアリングシステムを確立し、処置または表現型の知識なしに全ての試験動物のその後の再評価に使用した。核の偏心または末梢変位を伴う大きな淡明な空胞を特徴とする、グリアにおける細胞質空胞化は、ＩＤＳγ／－遺伝子型の特徴的な特徴であった。評価された脳領域における空胞化の量には地域的なばらつきがあった。両親媒性物質の神経細胞蓄積は、あまり顕著ではなく、未処置のＩＤＳγ／－マウスにおいてのみ観察された。ＡＡＶ９．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＩＤＳ．ＲＢＧを用いた処置は、検査した全ての脳領域において、グリア細胞の空胞化及び両親媒性物質のニューロン蓄積の量及び頻度を減少させた。累積病理学スコアは、グリア及びニューロン病変における処置関連改善を示す（図２７）。
野生型、未処置及び処置ＭＰＳ ＩＩマウスにおけるＧＭ３及びＬＩＭＰ２の免疫組織化学染色を行った。未処置のＩＤＳγ／－マウスの脳は、リソソーム膜タンパク質ＬＩＭＰ２の蓄積、ならびにＧＭ３を含むガングリオシドの二次蓄積を含む、ニューロンにおけるリソソーム蓄積の明らかな組織学的証拠を示した（図５Ａ～５Ｊ）。画像は、全ての用量でリソソーム蓄積が減少したことを示し、高用量群動物は本質的にＷＴ対照と類似していた（図５Ａ～５Ｊ）。ＧＭ３及びＬＩＭＰ２陽性細胞における用量依存的な減少の定量は、野生型、未処置及び処置ＭＰＳ ＩＩマウスで行った。全ての用量でリソソーム蓄積の有意な減少があり、高用量群動物は本質的にＷＴ対照と類似していた。処理したマウスは、減少したＬＩＭＰ２及びＧＭ３染色によって証明される神経細胞蓄積病変における用量依存的減少を示した（図５Ｋ及び５Ｌ）。
高用量群（２１日目）からのＭＰＳ ＩＩマウスにおけるＡＡＶ９．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＩＤＳ．ｒＢＧの生体内分布を分析した。生体内分布データは、脳組織が、評価された末梢組織、特に肝臓（図３）と同様に、形質導入されたことを示した（二倍体ゲノムあたり１～１０ＧＣ）。肝臓及びＣＮＳにおける濃度は、１～１０個のＧＣ／二倍体ゲノムの間であった；肺での濃度は、０．１～１ＧＣ／二倍体ゲノム間で、ならびに心臓及び脾臓の濃度は、０．１ＧＣ／二倍体ゲノム未満であった。
ＶＩＩＩ．結論
最大３×１０１０ＧＣ（５．２×１０１０ＧＣ ｄｄＰＣＲ）までのＣ５７ＢＬ／６ＩＤＳγ／－（ＭＰＳ ＩＩ）マウスへのＡＡＶ９．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＩＤＳ．ｒＢＧのＩＣＶ投与は、臨床的徴候も死亡もなしで良好な耐容性であり、ＣＮＳならびに末梢組織、特に肝臓への分布を生じ、ＣＳＦから末梢血へ注射されたウイルス粒子の部分的再分布を示している。
脳のＩＤＳ遺伝子発現の証拠は、ベクターの検出、ならびに２１日目及びＣＳＦ３ヶ月ｐｉでの脳におけるＩＤＳ活性の用量依存的増大（高用量（脳領域）で野生型レベルに近い酵素活性を有する）によって証明され、中及び高用量（ＣＳＦ）では野生型より高いことに匹敵する。３ヶ月ｐｉの全ての用量で、ＣＮＳにおけるＬＩＭＰ２及びＧＭ３染色の減少によって示されるように、リソソーム区画の用量依存性の正常化があった。Ｈ＆Ｅ染色された脳切片では、グリア空胞化の量及び頻度、ならびにＭＰＳ ＩＩ ＣＮＳ表現型の指標である両親媒性物質のニューロン蓄積における用量依存的な減少も観察された。Ｈ＆Ｅ染色切片におけるＣＮＳリソソーム含有量の変化及び疾患関連形態の改善に対応して、長期記憶（新規物体認識）の１つの尺度での改善があったが、長期記憶の他の尺度、文脈恐怖条件付けでは改善がなかった。ＮＯＲにおける改善において明らかになった明確な用量応答はなかった。ＭＰＳ ＩＩマウスの他のＣＮＳ機能試験（オープンフィールド試験及びＹ迷路）における能力は、野生型マウスの能力に匹敵し、したがってベクターで処置したマウスはこれらのアッセイでは評価しなかった。
血清ＩＤＳ活性の用量依存的増大はまた、野生型に匹敵する（低用量）か、またはそれより高値（中用量／高用量）レベルで３ヶ月ｐｉでも観察された。血清中のＩＤＳ活性の正常化を反映して、ＭＰＳ ＩＩマウスは、肝臓及び心臓におけるヘキソサミニダーゼ活性及びＧＡＧ含有量の用量依存的な減少を有した；肝臓ヘキソサミニダーゼ及びＧＡＧレベルを全ての用量レベルで正常化し、心臓ヘキソサミニダーゼ及びＧＡＧ活性を、中用量及び高用量でそれぞれ正常化した。高度に形質導入された肝臓（二倍体ゲノムあたり１～１０個のＧＣ）はおそらく、血清中のＩＤＳの分泌及び高用量での心臓の交差是正のための蓄積臓器として機能した。
ＩＣＶ投与手順自体に関連する変化が数匹のマウスで観察されたが、脳内に試験品関連
毒性の証拠はなかった。導入遺伝子に対する体液性免疫応答は軽微であり、これらの動物の健康または脳組織病理学に影響を及ぼさずに一部の中及び高用量動物においてのみ観察された。
結論として、ＡＡＶ９．ＣＢ７．ＣＩ．ＩＤＳ．ｒＢＧは、全ての用量レベルでＭＰＳ
ＩＩマウスにおいて良好な耐容性を示し、ＭＰＳ ＩＩのＣＮＳ及び末梢パラメータの両方の改善に関連するＩＤＳレベルの用量依存的増大をもたらした。
投与された最低用量３×１０８ＧＣ（５．２×１０８ＧＣ ｄｄＰＣＲ）が、この試験における最小有効用量であった。
（配列リストフリーテキスト）
数字の識別子＜２２３＞の下にフリーテキストを含む配列に対して、以下の情報を示す。
Figure 2023011821000009
Figure 2023011821000010
Figure 2023011821000011
Figure 2023011821000012
Figure 2023011821000013
Figure 2023011821000014
本出願に引用される全ての刊行物、特許及び特許出願、ならびに２０１７年１月３１日に出願された米国仮特許出願第６２／４５２，４９４号、２０１６年７月２８日に出願された米国仮特許出願第６２／３６７，７８０号、２０１６年５月１６日に出願された米国特許仮出願第６２／３３７，１６３号、２０１６年５月３日に出願された米国仮出願第６２／３３０，９３８号、及び２０１６年４月１５日に出願された米国仮出願第６２／３２３，１９４号、ならびにこれとともに提出された配列表は、各々の個々の刊行物または特許出願が具体的かつ個別に参照により組み込まれると示されるかのように、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。理解の明瞭化ために図示及び実施例を用いてある程度詳しく前述の発明を記載しているが、本発明の教示に照らして、添付の特許請求の範囲の趣旨及び範囲から逸脱することなく、特定の範囲及び改変をそれに対してなし得ることが、当業者には容易に明らかであろう。

Claims (51)

  1. 製剤緩衝液中の複製欠損組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の懸濁液を含む、ヒト対象におけるくも膜下腔内投与に適した薬学的組成物であって、
    （ａ）前記ｒＡＡＶは、ＡＡＶ９キャプシドにパッケージされたヒトイズロネート－２－スルファターゼ（ｈＩＤＳ）をコードする異種核酸を含み；
    （ｂ）前記製剤緩衝液は、生理学的に適合する水性緩衝液、及び任意のサーファクタント及び賦形剤を含み；かつ
    （ｃ）（ｉ）前記ｒＡＡＶのゲノムコピー（ＧＣ）力価が少なくとも１．０×１０１３ＧＣ／ｍｌ（＋／－２０％）であるか；及び／または
    （ｉｉ）前記ｒＡＡＶの空粒子／全粒子比が、空のキャプシドを少なくとも約８０％含まないか；及び／または
    （ｉｉｉ）少なくとも約２．５×１０１０ＧＣ／ｇ脳質量～約３．６×１０１１ＧＣ／ｇ脳質量の前記ｒＡＡＶの懸濁液の用量が力価を有する、前記薬学的組成物。
  2. 力価がインビトロアッセイによって測定される、請求項１に記載の薬学的組成物。
  3. 前記インビトロアッセイが、１細胞あたりの既知の多重度のｒＡＡＶＧＣ力価を用いてＨＥＫ２９３細胞に形質導入すること、及び４ＭＵ－イズロニド酵素アッセイを用いて形質導入７２時間後のｈＩＤＳ活性について上清をアッセイすることを包含する、請求項２に記載の薬学的組成物。
  4. 前記ｒＡＡＶが、空粒子／全粒子比が０．０１～０．０５（空のキャプシドを９５～９９％含まない）である、請求項１～３のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
  5. 前記コードされたｈＩＤＳが、以下から選択される配列を有する、請求項１～３のいずれか１項に記載の薬学的組成物：
    （ａ）配列番号２のアミノ酸１～約５５０（Ｇｅｎｂａｎｋ ＮＰ＿０００１９３）；及び
    （ｂ）配列番号２の約２１～約５５０のアミノ酸に融合された異種リーダー配列を含む合成ヒト酵素；
    （ｃ）配列番号２の約２１～約４５５のアミノ酸に融合された異種リーダー配列を含む合成ヒト酵素；
    （ｄ）配列番号２の約３４～約５５０のアミノ酸に融合された異種リーダー配列を含む合成ヒト酵素；または
    （ｄ）配列番号２の約３４～約４５５のアミノ酸に融合された異種リーダー配列を含む合成ヒト酵素。
  6. 前記ｒＡＡＶが、５’逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列、ＣＢ７プロモーター、ニワトリベータアクチンイントロン、ウサギベータ－グロビンポリアデニル化（ポリＡ）シグナル、及び／または３’ＩＴＲ配列をさらに含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
  7. 前記ＡＡＶ ＩＴＲがＡＡＶ９に対して異種である、請求項６に記載の薬学的組成物。
  8. 前記ＩＴＲがＡＡＶ２由来である、請求項７に記載の薬学的懸濁液。
  9. 前記懸濁液が６～９のｐＨを有する、請求項１～８のいずれか１項に記載の薬学的懸濁液。
  10. 前記懸濁液が６．８～７．８のｐＨを有する、請求項９に記載の薬学的懸濁液。
  11. 前記懸濁液が、くも膜下腔内注射による送達のために製剤化される、請求項１～１０のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
  12. 前記懸濁液が、新生児患者への送達のために製剤化され、約３．８×１０１２のゲノムコピー（ＧＣ）～約１．９×１０１４ＧＣを含む、請求項１～１１のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
  13. 前記懸濁液が、約３ヶ月～約９ヶ月齢の患者への送達のために製剤化され、約６×１０１２ＧＣ～約３×１０１４ＧＣを含む、請求項１～１１のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
  14. 前記懸濁液が、約９ヶ月～約３６ヶ月齢の患者への送達のために製剤化され、約１×１０１３ＧＣ～約５×１０１４ＧＣを含む、請求項１～１１のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
  15. 前記懸濁液が、約３歳～約１２歳である患者への送達のために製剤化され、かつ約１．２×１０１３ＧＣ～約６×１０１４ＧＣを含む、請求項１～１１のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
  16. 前記懸濁液が、約１２歳以上の患者に送達するように製剤化され、約１．４×１０１３ＧＣ～約７×１０１４ＧＣを含む、請求項１～１１のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
  17. くも膜下腔内注射によってそれを必要とするヒト対象に投与可能な、請求項１～１１のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
  18. くも膜下腔内注射によってそれを必要とするヒト対象に投与可能な医薬を調製する際に使用するための、請求項１～１１のいずれか１項に記載の薬学的組成物の使用。
  19. 前記ヒト対象が、ムコ多糖症ＩＩ（ＭＰＳ ＩＩ）または重度のハンター症候群と診断されている、請求項１８に記載の使用。
  20. 請求項１～１６のいずれか１項に記載の懸濁液の成分及びくも膜下腔内投与に必要な成分を含むキット。
  21. 前記懸濁液を希釈するのに有用な希釈緩衝液をさらに含む、請求項２０に記載のキット。
  22. ５’ＩＴＲ、ニワトリベータアクチンプロモーター、イントロン、ヒトＩＤＳコード配列、ウサギベータグロビンポリＡ、及び３’ＩＴＲを含むゲノムを有する水性懸濁基剤及びｒＡＡＶ９ベクターを含む、６～９の範囲のｐＨを有する水性液体懸濁液。
  23. ムコ多糖症ＩＩ（ＭＰＳ ＩＩ）と診断されたヒト対象を処置する方法であって、それを必要とするヒト対象に、２．５×１０１０ＧＣ／ｇ脳質量～約３．６×１０１１ＧＣ／ｇ脳質量の間の用量で、製剤緩衝液中で、複製欠損組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の懸濁液を、くも膜下腔内注射によって、投与することを包含し、ここで：
    （ａ）前記ｒＡＡＶは、ＡＡＶ９キャプシドにパッケージされたヒトイズロネート－２－スルファターゼ（ｈＩＤＳ）をコードする異種核酸を含み；かつ
    （ｂ）前記製剤緩衝液は、生理学的に適合性の水性緩衝液、サーファクタント及び任意の賦形剤を含み；かつ
    （ｃ）（ｉ）前記ｒＡＡＶのゲノムコピー（ＧＣ）力価が少なくとも１．０×１０１３ＧＣ／ｍｌ（＋／－２０％）であり；（ｉｉ）前記ｒＡＡＶの空粒子／全粒子比が０．０１～０．０５（空のキャプシドを９５～９９％含まない）であるか；及び／または（ｉｉｉ）少なくとも約２．５×１０１０ＧＣ／ｇ脳質量～約３．６×１０１１ＧＣ／ｇ脳質量の前記ｒＡＡＶの懸濁液の用量は力価を有する、前記方法。
  24. 前記ヒト対象が２歳以上であり、重篤なハンター症候群と診断された、請求項２０に記載の方法。
  25. 前記ヒト対象が神経認知障害を有するか、または神経認知障害を発症するリスクがある、請求項２３に記載の方法。
  26. 前記ヒト対象が２歳以上であり、重篤なハンター病と相関することが既知の主要な再編成または欠失突然変異の存在と診断される、請求項２３～２５のいずれか１項に記載の方法。
  27. 前記方法が、Ｂａｙｌｅｙ Ｓｃａｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｆａｎｔ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔを用いて評価したとき、前記対象における神経認知発達指数（ＤＱ）の増大をもたらす、請求項２３～２５のいずれか１項に記載の方法。
  28. 前記方法が、ハンター症候群の患者における未処置／自然の履歴管理データと比較して、前記対象においてＤＱの低下が１５ポイント以下になる、請求項２３～２５のいずれか１項に記載の方法。
  29. 前記方法が、前記患者からの血清試料中で測定した場合、機能的ｈＩＤＳレベルの増大をもたらす、請求項２３～２５のいずれか１項に記載の方法。
  30. 前記方法が、患者の血清、尿及び／または脳脊髄液（ＣＳＦ）の試料中で測定したとき、ＧＡＧレベルの低下をもたらす、請求項２３～２９のいずれか１項に記載の方法。
  31. 肝指向性注射によって前記患者にＡＡＶ．ｈＩＤＳを投与することをさらに包含する、請求項２３～３０のいずれか１項に記載の方法。
  32. 前記肝指向性ＡＡＶ．ｈＩＤＳが、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ６４Ｒ１、ＡＡＶｒｈ６４Ｒ２、ｒｈ８、ｒｈ１０、ＡＡＶ３ＢまたはＡＡＶｄｊから選択されるキャプシドを有する、請求項３１に記載の方法。
  33. 力価がインビトロアッセイによって測定される、請求項２３～３２のいずれか１項に記載の方法。
  34. 前記インビトロアッセイが、１細胞あたり既知の多重度の前記ｒＡＡＶＧＣ力価を用いてＨＥＫ２９３細胞を形質導入すること、及び４ＭＵ－イズロニド－２－硫酸酵素アッセイを用いて形質導入の７２時間後のｈＩＤＳ活性について上清をアッセイすることを包含する、請求項３３に記載の方法。
  35. 前記ヒトｈＩＤＳコード配列が、配列番号１のヌクレオチド配列、または機能的ｈＩＤＳをコードする配列番号１と少なくとも約８０％同一である配列を有する、請求項３３～３５のいずれか１項に記載の方法。
  36. 請求項３３～３５のいずれか１項に記載の方法であって、前記コードされたのが
    （ａ）配列番号２のアミノ酸１～約５５０（Ｇｅｎｂａｎｋ ＮＰ＿０００１９３）；及び
    （ｂ）配列番号２の約２１～約５５０のアミノ酸に融合された異種リーダー配列を含む合成ヒト酵素；
    （ｃ）配列番号２の約２１～約４５５のアミノ酸に融合された異種リーダー配列を含む合成ヒト酵素；
    （ｄ）配列番号２の約３４～約５５０のアミノ酸に融合された異種リーダー配列を含む合成ヒト酵素；または
    （ｄ）配列番号２の約３４～約４５５のアミノ酸に融合された異種リーダー配列を含む合成ヒト酵素である、前記方法。
  37. 前記ｒＡＡＶが、５’逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列、ＣＢ７プロモーター、ニワトリベータアクチンイントロン、ウサギベータ－グロビンポリアデニル化（ポリＡ）シグナル及び／または３’ＩＴＲ配列をさらに含む、請求項３３～３６のいずれか１項に記載の方法。
  38. 前記ＡＡＶ ＩＴＲがＡＡＶ９に対して異種である、請求項３７に記載の方法。
  39. 前記ＩＴＲがＡＡＶ２由来である、請求項３７に記載の方法。
  40. 懸濁液が６～９のｐＨを有する、請求項３３～３６のいずれか１項に記載の方法。
  41. 懸濁液が６．８～７．８のｐＨを有する、請求項４０に記載の方法。
  42. 前記懸濁液が、くも膜下腔内注射による送達のために製剤化される、請求項３３～４１のいずれか１項に記載の方法。
  43. 前記懸濁液が、新生児患者への送達のために製剤化され、約３．８×１０１２ゲノムコピー（ＧＣ）～約１．９×１０１４ＧＣを含む、請求項２３～４１のいずれか１項に記載の方法。
  44. 前記懸濁液が、約３ヶ月～約９ヶ月齢の患者への送達のために製剤化され、約６×１０１２３ＧＣ～約３×１０１４ＧＣを含む、請求項２３～４１のいずれか１項に記載の方法。
  45. 前記懸濁液が、約９ヶ月～約３６ヶ月齢の患者への送達のために製剤化され、約１×１０１３ＧＣ～約５×１０１４ＧＣを含む、請求項２３～４１のいずれか１項に記載の方法。
  46. 前記懸濁液が、約３歳～約１２歳であり、かつ約１．２×１０１３ＧＣ～約６×１０１４ＧＣを含む患者への送達のために製剤化される、請求項２３～４１のいずれか１項に記載の方法。
  47. 前記懸濁液が、約１２歳以上の患者に送達するために製剤化され、約１．４×１０１３ＧＣ～約７×１０１４ＧＣを含む、請求項２３～４１のいずれか１項に記載の方法。
  48. ＭＰＳ ＩＩ及び／またはハンター症候群に関連する症状を有するヒト患者を処置する方法であって、
    （ａ）導入遺伝子特異的寛容を誘導するのに十分な量のｈＩＤＳ酵素を、ＭＰＳ ＩＩ及び／またはハンター症候群に関連する症状を有する患者に投与すること；及び
    （ｂ）前記患者にｒＡＡＶ．ｈＩＤＳを投与し、ｒＡＡＶ．ｈＩＤＳは前記患者において治療レベルのｈＩＤＳの発現を指示すること、を包含する、前記方法。
  49. 前記（ａ）のｈＩＤＳが組換えタンパク質として投与される、請求項４８に記載の方法。
  50. 前記患者が乳児である、請求項４８または４９に記載の方法。
  51. 前記（ｂ）の投与が（ａ）の投薬後約３日～約１４日で実施される、請求項４８のいずれか１項に記載の方法。
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