RU2823437C2 - Лечение и/или профилактика заболевания или синдрома, связанного с вирусной инфекцией - Google Patents

Лечение и/или профилактика заболевания или синдрома, связанного с вирусной инфекцией Download PDF

Info

Publication number
RU2823437C2
RU2823437C2 RU2021118640A RU2021118640A RU2823437C2 RU 2823437 C2 RU2823437 C2 RU 2823437C2 RU 2021118640 A RU2021118640 A RU 2021118640A RU 2021118640 A RU2021118640 A RU 2021118640A RU 2823437 C2 RU2823437 C2 RU 2823437C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
infection
aat
cov
sars
protein
Prior art date
Application number
RU2021118640A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2021118640A (ru
Inventor
Николай ЖУКОВСКИЙ
Original Assignee
Ажероникс Са
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ажероникс Са filed Critical Ажероникс Са
Publication of RU2021118640A publication Critical patent/RU2021118640A/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2823437C2 publication Critical patent/RU2823437C2/ru

Links

Abstract

Изобретение относится к области фармацевтики и медицины, а именно к применению композиции для лечения и/или профилактики заболевания или синдрома, связанного с вирусной инфекцией, у нуждающегося в этом субъекта, где вирусная инфекция вызывает острое воспаление, прямо или косвенно индуцирующее заболевание или синдром, и где вирусная инфекция представляет собой коронавирусную инфекцию MERS-CoV, где композиция включает терапевтически эффективное количество белка альфа-1-антитрипсина (ААТ). Технический результат заключается в ингибировании проникновения MERS-CoV в клетки. 7 з.п. ф-лы, 26 ил., 11 табл., 25 пр.

Description

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящее изобретение относится к композициям и способам лечения и/или профилактики заболевания или синдрома, связанных с вирусной инфекцией. Изобретение также относится к способам определения предрасположенности субъекта к такому лечению, а также к способу определения количества композиции, необходимого для эффективного лечения.
ПРЕДПОСЫЛКИ К СОЗДАНИЮ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Вирусы, такие как, например, коронавирусы, вызывают заболевания у животных и людей во всем мире. Коронавирусы - это РНК-вирусы.
Известно, что коронавирусы человека (HCoV) в основном вызывают инфекции верхних и нижних дыхательных путей. Примеры коронавирусов человека: бета-коронавирус, вызывающий ближневосточный респираторный синдром (названный MERS-CoV), бета-коронавирус, вызывающий тяжелый острый респираторный синдром (названный SARS-CoV или SARS-CoV-1), новый коронавирус, вызывающий коронавирусное заболевание 2019 года или COVID-19 (названный SARS-CoV-2), альфа-коронавирус 299Е, альфа-коронавирус NL63, бета-коронавирус ОС43 и бета-коронавирус HKU1.
Заболевание или синдром, вызванные инфекцией SARS-CoV-2, также называют COVID-19 (Ковид-19). Инфекция SARS-CoV-2 может протекать бессимптомно или приводить к заболеванию или синдрому, связанному с легкими или тяжелыми симптомами. Наиболее частыми симптомами заболевания или синдрома, связанных с инфекцией SARS-CoV-2 (также называемой SARS-CoV-19), являются лихорадка и кашель, усталость, затрудненное дыхание, озноб, боль в суставах или мышцах, отхаркивание, выделение мокроты, одышка, миалгия, артралгия или боль в горле, головная боль, тошнота, рвота, диарея, боль в носовых пазухах, заложенность носа, снижение интенсивности или изменение обоняния или вкуса. Другие симптомы включают отсутствие аппетита, потерю веса, боль в животе, конъюнктивит, кожную сыпь, лимфому, апатию и сонливость.
У пациентов с тяжелыми симптомами может развиться пневмония. Значительному количеству пациентов с пневмонией требуется пассивная кислородная терапия. Неинвазивная вентиляция и назальная оксигенотерапия с высокой скоростью потока могут применяться в легких и умеренных случаях пневмонии без гиперкапнии. Стратегия искусственной вентиляции, сохраняющей легкие, должна применяться у пациентов с тяжелым острым респираторным синдромом или острым респираторным дистресс-синдромом (S ARS/ARDS) и у пациентов с механической вентиляцией легких.
Хотя основным осложнением коронавирусной болезни 2019 (COVID-19) является дыхательная недостаточность, у значительного числа пациентов были зарегистрированы неврологические симптомы, влияющие как на периферическую, так и на центральную нервную систему (Niazkar, Zibaee et al.2020 Neurol Sci 41(7): 1667-1671; Nordvig, Fong et al. 2021, Neurol Clin Pract 11 (2): el35-el46). Гематогенный путь, ретро-/антероградный транспорт по периферическим нервам, а также редкая прямая инвазия рассматриваются как потенциальные механизмы нейроинвазии нейротропного вируса, включая SARS-CoV-2 (Barrantes 2021 Brain Behav Immun Health 14: 100251; Tavcar, Potokar et al.2021, Front Cell Neurosci 15: 662578). В тяжелых случаях SARS-CoV-2 часто наблюдаются непропорциональные и аномальные воспалительные реакции, включая системную активацию цитокинов, хемокинов и провоспалительных сигналов (Najjar, Najjar et al.2020, J Neuroinflampting 17 (1): 231). Такое системное гипервоспаление может нарушить нейрососудистую эндотелиальную функцию, повредить гематоэнцефалический барьер, в конечном итоге активируя иммунную систему ЦНС и способствуя осложнениям со стороны ЦНС (Amruta, Chastain et al., 2021, Cytokine Growth Factor Rev 58: 1-15).
Несмотря на то внимание, которое недавно привлекла пандемия COVID-19, несколько других вирусов связаны с серьезными заболеваниями головного мозга, такими как болезнь Альцгеймера, Паркинсона и рассеянный склероз. Заболевания или синдромы, связанные с вирусными инфекциями, также включают широкий спектр заболеваний или синдромов, таких как воспалительные заболевания, и являются серьезным бременем для общества. Следовательно, существует потребность в улучшении лечения и/или профилактики заболеваний или синдромов, связанных с вирусами.
Вышеупомянутая техническая проблема решается с помощью аспектов, раскрытых в настоящем документе и определенных в формуле изобретения.
РАСКРЫТИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение обеспечивает композицию для применения при лечении и/или профилактике заболевания или синдрома, связанного с вирусной инфекцией, предпочтительно с коронавирусной инфекцией, более предпочтительно с инфекцией SARS-CoV-2 у субъекта, нуждающегося в этом, композиция, содержащая терапевтически эффективное количество белка альфа-1-антитрипсина, его варианта, изоформы и/или фрагмента. Белок альфа1-антитрипсина (ААТ), вариант, изоформа и/или его фрагмент могут быть ААТ, экстрагированным из плазмы, его вариантом, изоформой и/или его фрагментом, в частности ААТ, экстрагированным из плазмы человека, вариант, изоформа и/или его фрагмент; или рекомбинантный белок альфа-1-антитрипсин (rhAAT), его вариант, изоформа и/или фрагмент, предпочтительно белок альфа-1-антитрипсин (ААТ), его вариант, изоформа и/или фрагмент представляет собой рекомбинантный белок альфа-1-антитрипсин (rhAAT), его вариант, изоформу и/или фрагмент. Вирусная инфекция, такая как коронавирусная инфекция, предпочтительно является инфекцией SARS-CoV-2. Субъект, нуждающийся в лечении и/или профилактике заболевания или синдрома, связанного с вирусной инфекцией, предпочтительно с коронавирусной инфекцией, более предпочтительно с инфекцией SARS-CoV-2, может иметь по крайней мере i) более низкий уровень эндогенного альфа-антитрипсина (ААТ), ii) более высокий уровень по крайней мере одной протеазы, примирующей спайковый белок, iii) более высокий уровень рецептора ангиотензинпревращающего фермента 2 (АСЕ2) и/или iv) более высокий уровень гамма-интерферона (IFN-γ) по сравнению, по крайней мере, с одним субъектом, у которого нет симптомов или есть легкие симптомы во время вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно инфекции SARS-CoV-2.
Изобретение также относится к способу определения предрасположенности интересующего субъекта к лечению и/или профилактике заболевания или синдрома, связанного с вирусной инфекцией, предпочтительно с коронавирусной инфекцией, более предпочтительно с инфекцией SARS-CoV-2, с использованием композиции для применения по настоящему изобретению.
В изобретении также предлагается способ определения терапевтически эффективного количества альфа-1-антитрипсина (ААТ) для эффективного лечения и/или предотвращения заболевания или синдрома, связанного с вирусной инфекцией, предпочтительно коронавирусной инфекцией, более предпочтительно SARS-CoV-2 инфекции с использованием композиции по настоящему изобретению.
Также предоставляется способ лечения и/или профилактики заболевания или синдрома, связанного с вирусной инфекцией, предпочтительно с коронавирусной инфекцией, более предпочтительно с инфекцией SARS-CoV-2 у субъекта, нуждающегося в этом, причем способ включает введение терапевтически эффективного количество альфа-1-антитрипсинового белка, его варианта, изоформы и/или его фрагмента. Белок альфа1-антитрипсина (ААТ), его вариант, изоформа и/или фрагмент могут быть ААТ, экстрагированным из плазмы, его вариантом, изоформой и/или фрагментом, в частности ААТ, экстрагированным из плазмы человека, его вариантом, изоформой и/или фрагментом; или рекомбинантный белок альфа-1-антитрипсин (rhAAT), его вариант, изоформа и/или фрагмент, предпочтительно белок альфа-1-антитрипсин (ААТ), его вариант, изоформа и/или фрагмент представляет собой рекомбинантный белок альфа-1-антитрипсин (rhAAT), его вариант, изоформу и/или фрагмент.
Соответственно, изобретение относится, среди прочего, к следующим аспектам:
1. Композиция для применения при лечении и/или профилактике заболевания или синдрома, связанного с вирусной инфекцией, у субъекта, нуждающегося в этом, композиция, содержащая терапевтически эффективное количество белка альфа-1-антитрипсина (ААТ), его вариант, изоформу и/или фрагмент.
2. Композиция для применения в соответствии с аспектом 1, отличающаяся тем, что у субъекта, нуждающегося в этом, есть по меньшей мере один симптом, выбранный из группы, состоящей из следующего:
1. более низкий уровень эндогенного альфа-антитрипсина (ААТ) до вирусной инфекции или во время вирусной инфекции по сравнению, по крайней мере, с одним субъектом во время вирусной инфекции, которая протекает бессимптомно или характеризуется легкими симптомами,
2. более высокий уровень по меньшей мере одной протеазы, примирующей спайковый белок, до вирусной инфекции или во время вирусной инфекции по сравнению с по меньшей мере одним субъектом во время вирусной инфекции, которая протекает бессимптомно или характеризуется легкими симптомами,
3. более высокий уровень ангиотензинпревращающего фермента 2 (рецептор АСЕ2) у субъекта до вирусной инфекции или во время вирусной инфекции по сравнению с по меньшей мере одним субъектом во время вирусной инфекции, которая протекает бессимптомно или характеризуется легкими симптомами, и
4. более высокий уровень гамма-интерферона (IFN-γ) у субъекта до вирусной инфекции или во время вирусной инфекции по сравнению с по меньшей мере одним субъектом во время вирусной инфекции, которая протекает бессимптомно или характеризуется легкими симптомами.
3. Композиция для применения в соответствии с аспектом 2, отличающаяся тем, что более низкий уровень эндогенного ААТ до вирусной инфекции или во время вирусной инфекции вызван недостаточностью ААТ.
4. Композиция для применения в соответствии с аспектом 2 или 3, отличающаяся тем, что протеаза, примирующая спайковый белок, представляет собой по меньшей мере одну, выбранную из группы, состоящей из подтипа 2 трансмембранной протеазы серина (TMPRSS2), подтипа 6 трансмембранной протеазы (TMPRSS6), катепсина L, катепсина В, пропротеинконвертаза 1 (РС1), трипсин, эластаза, эластаза нейтрофилов, матриптаза и фурин, предпочтительно катепсин L и фурин.
5. Композиция для применения в соответствии с любым из аспектов 2-4, отличающаяся тем, что более высокий уровень, по меньшей мере, одной протеазы, примирующей спайковый белок, обусловлен возрастом и/или генетической предрасположенностью.
6. Композиция для применения в соответствии с любым из аспектов 2-5, отличающаяся тем, что более высокий уровень рецептора АСЕ2 вызван по меньшей мере одним, выбранным из группы, включающей инфекцию, воспаление, возраст и/или генетическую предрасположенность.
7. Композиция для применения в соответствии с любым из аспектов 2-6, отличающаяся тем, что более высокий уровень IFN-γ вызван по меньшей мере одним, выбранным из группы, включающей инфекцию, воспаление, возраст и генетическую предрасположенность.
8. Композиция для применения согласно любому из аспектов 2-7, отличающаяся тем, что субъект, нуждающийся в этом, имеет
i) более низкий уровень эндогенного ААТ, и
ii) более высокий уровень, по крайней мере, одной протеазы примирования спайкового белка.
9. Композиция для применения согласно любому из аспектов 2-8, отличающаяся тем, что субъект, нуждающийся в этом, имеет
i) более низкий уровень эндогенных ААТ и
iii) более высокий уровень рецептора АСЕ2.
10. Композиция для применения согласно любому из аспектов 2-9, отличающаяся тем, что субъект, нуждающийся в этом, имеет
i) более низкий уровень эндогенных ААТ и
iv) более высокий уровень IFN-γ.
11. Композиция для применения в соответствии с аспектом 10, отличающаяся тем, что более высокий уровень IFN-γ вызван по меньшей мере одним заболеванием или состоянием, выбранным из группы, состоящей из ААТ-дефицита, заболевания печени, такого как неалкогольная жировая болезнь печени, диабет, ожирение и/или сердечно-сосудистое заболевание.
12. Композиция для применения согласно любому из аспектов 2-11, отличающаяся тем, что субъект, нуждающийся в этом, имеет
более низкий уровень эндогенного ААТ, и
более высокий уровень, по крайней мере, одной протеазы примирования спайкового белка.
iii) более высокий уровень рецептора АСЕ2 и/или iv) более высокий уровень IFN-γ.
13. Композиция для применения в соответствии с любым из предшествующих аспектов, отличающаяся тем, что белок альфа-1-антитрипсин (ААТ), его вариант, изоформа и/или фрагмент экстрагируют из плазмы человека.
14. Композиция для применения в соответствии с любым из аспектов с 1 по 12, отличающаяся тем, что белок альфа1-антитрипсин (ААТ), его вариант, изоформа и/или фрагмент представляет собой рекомбинантный альфа 1-антитрипсин (rhAAT), его вариант, изоформу и/или фрагмент.
15. Композиция для применения в соответствии с аспектом 14, отличающаяся тем, что белок альфа1-антитрипсин имеет значения, указанные в SEQ ID NO (идентификационном номере последовательности): 1.
16. Композиция для применения в соответствии с аспектом 14, отличающаяся тем, что фрагмент альфа1-антитрипсина представляет собой фрагмент С-концевой последовательности или любую их комбинацию.
17. Композиция для применения согласно аспекту 14, отличающаяся тем, что вариант альфа1-антитрипсина выбран из группы, включающей короткие циклические пептиды, полученные из С-концевой последовательности, как указано в SEQ ID NO: 2.
18. Композиция для применения в соответствии с аспектом 17, отличающаяся тем, что короткие циклические пептиды, полученные из С-концевой последовательности альфа1-антитрипсина, выбраны из группы, включающей Цикло-(CPFVFLM)-SH, Цикло-(CPFVFLE)-SH, Цикло-(CPFVFLR)-SH и цикло-(CPEVFLM)-SH, или любая их комбинация.
19. Композиция для применения в соответствии с любым из предыдущих аспектов, отличающаяся тем, что композиция дополнительно включает фармацевтически приемлемый наполнитель или носитель.
20. Композиция для применения в соответствии с любым из предыдущих аспектов, отличающаяся тем, что композиция дополнительно содержит аналог нуклеозида, ингибитор протеазы, иммуносупрессор (например, сарилумаб или тоцилизумаб), антибиотик, антитело, направленное против структурных компонентов вируса, или его фрагмент (например, пассивная иммунотерапия), бета-интерферон (например, бета-1а-интерферон) и/или вакцина.
21. Композиция для применения в соответствии с любым из предшествующих аспектов, отличающаяся тем, что указанная композиция вводится путем внутривенной инъекции, внутривенной инфузии, инфузии с помощью дозирующего насоса, ингаляционного назального спрея, глазных капель, пластырей для кожи, составов с замедленным высвобождением, ex vivo ген терапия или клеточная терапия ex vivo, предпочтительно путем внутривенной инъекции.
22. Способ определения предрасположенности интересующего субъекта к лечению и/или профилактике заболевания или синдрома, связанного с вирусной инфекцией, с использованием композиции, содержащей терапевтически эффективное количество белка альфа-1-антитрипсина (ААТ), его варианта, изоформы и/или фрагмента, как определено в любом из аспектов с 1 по 21, включающий следующие стадии:
a) определение уровня по меньшей мере одного вещества из группы, включающей эндогенный альфа1-антитрипсин, по меньшей мере одну протеазу, примирующую спайковый белок, рецептор АСЕ2 и гамма-интерферон, у интересующего субъекта до вирусной инфекции или во время вирусной инфекции
b) определение уровня по меньшей мере одного вещества из группы, включающей эндогенный альфа-1-антитрипсин, по меньшей мере одну протеазу, примирующую спайковый белок, рецептор АСЕ2 и гамма-интерферон, по меньшей мере, у одного референтного субъекта во время вирусной инфекции, при которой у эталонного субъекта нет симптомов или он имеет легкие симптомы,
c) сравнение уровня интереса, определенного на этапе а), с референсным уровнем, определенным на этапе b),
отличающийся тем, что интересующий субъект более восприимчив к лечению и/или профилактике заболевания или синдрома, связанного с вирусной инфекцией, если у интересующего субъекта есть по крайней мере один признак, выбранный из группы, состоящей из следующего:
1. более низкий уровень интереса эндогенного альфа-антитрипсина (ААТ) по сравнению с референсным уровнем эндогенного ААТ,
2. более высокий уровень интереса, по крайней мере, одной протеазы, примирующей спайковый белок, по сравнению с контрольным уровнем, по крайней мере, одной протеазы, примирующей спайковый белок,
3. более высокий уровень интереса ангиотензинпревращающего фермента 2 (рецептора АСЕ2) по сравнению с контрольным уровнем рецептора АСЕ2, и
4. более высокий уровень интереса интерферона-гамма (IFN-γ) по сравнению с референсным уровнем IFN-γ.
23. Способ определения терапевтически эффективного количества альфа-1-антитрипсина (ААТ и/или rhAAT) для эффективного лечения и/или предотвращения заболевания или синдрома, связанного с вирусной инфекцией, с использованием композиции в соответствии с любым из аспектов 1-21, включающей шаги:
a) определение уровня эндогенного альфа-1-антитрипсина у интересующего субъекта до вирусной инфекции или во время вирусной инфекции,
b) определение количества ААТ в композиции, которое требуется для достижения уровня ААТ у субъекта по меньшей мере 10 мкМ, предпочтительно по меньшей мере 20 мкМ, более предпочтительно по меньшей мере 50 мкМ, еще более предпочтительно по меньшей мере 100 мкМ, и наиболее предпочтительно не менее 200 мкМ.
24. Композиция для применения в соответствии с любым из аспектов с 1 по 21 или способ в соответствии с аспектами 22 и 23, отличающиеся тем, что вирус представляет собой коронавирус.
25. Композиция для применения согласно аспекту 24 или способ согласно аспекту 24, отличающиеся тем, что вирус представляет собой SARS-CoV-2.
26. Композиция для применения согласно любому из аспектов с 1 по 25 или способ согласно аспектам с 22 по 25, отличающиеся тем, что заболевание или синдром представляет собой респираторный синдром или тяжелый острый респираторный синдром.
27. Композиция для применения согласно любому из аспектов с 1 по 25 или способ согласно аспектам с 22 по 25, отличающиеся тем, что заболевание или синдром представляет собой воспалительное заболевание или синдром нервной системы.
28. Композиция для применения согласно любому из аспектов с 1 по 27 или способ согласно аспекту 27, отличающиеся тем, что воспалительное заболевание или синдром нервной системы представляет собой заболевание или синдром, выбранный из группы рассеянного склероза, бокового амиотрофического склероза, Болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона и болезнь Хантингтона.
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Хотя при осуществлении или тестировании настоящего изобретения могут быть использованы способы и материалы, аналогичные или эквивалентные тем, которые описаны в настоящем изобретении, ниже описаны подходящие способы и материалы. Все публикации, патентные заявки, патенты и другие ссылки, упомянутые здесь, включены в качестве ссылки в полном объеме. Публикации, обсуждаемые в настоящем документе, приведены исключительно для их описания до даты подачи настоящей заявки. Ничто в настоящем документе не следует интерпретировать в качестве признания того, что данное изобретение не может датировать данную публикацию более ранним числом в силу более раннего изобретения. Кроме того, материалы, способы и примеры являются только иллюстративными и не предназначены для ограничения.
В случае противоречия настоящее описание, включая определения, будет иметь преимущественную силу. Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, имеют то же значение, которое обычно понимается специалистом в данной области, к которой относится предмет изобретения. Используемые здесь следующие определения приведены для облегчения понимания настоящего изобретения.
Термин «содержать/содержащий» обычно используется в смысле «включать/включающий», то есть допускать наличие одного или нескольких признаков или компонентов.
Используемые в данном описании и формуле изобретения слова в единственном числе означают также и множественное число, если из контекста очевидно не следует иное.
Используемый здесь термин «по меньшей мере один» означает «один или несколько», «два или более», «три или более» и т.д.
Используемые здесь термины «субъект»/«субъект, нуждающийся в этом» или «пациент»/«пациент, нуждающийся в этом» хорошо известны в данной области и используются здесь взаимозаменяемо для обозначения млекопитающего, включая собаку, кошка, крыса, мышь, обезьяна, корова, лошадь, коза, овца, свинья, верблюд и, наиболее предпочтительно, человек. В некоторых случаях субъектом является субъект, нуждающийся в лечении, или субъект с заболеванием или нарушением. Однако в других аспектах субъект может быть обычным субъектом. Термин не обозначает конкретный возраст или пол. Таким образом, предполагается охват взрослых, детей и новорожденных, мужского или женского пола. Предпочтительно, субъектом является человек. Наиболее предпочтительно человек, страдающий заболеванием или синдромом, связанным с вирусной инфекцией, предпочтительно инфекцией коронавируса, более предпочтительно инфекцией SARS-CoV-2.
В данном контексте термины «пептид», «белок», «полипептид», «полипептидный» и «пептидный» используются взаимозаменяемо для обозначения ряда аминокислотных остатков, связанных друг с другом пептидными связями между альфа-аминогруппой и карбоксильной группой соседних остатков.
Термины «нуклеиновая кислота», «полинуклеотид» и «олигонуклеотид» используются взаимозаменяемо и относятся к любому виду дезоксирибонуклеотида (например, ДНК, кДНК, …) или рибонуклеотидному (например, РНК, мРНК, …) полимеру или комбинации дезоксирибонуклеотида и рибонуклеотидный (например, ДНК/РНК) полимер в линейной или кольцевой конформации, а также в одноцепочечной или двухцепочечной форме. Эти термины не следует истолковывать как ограничивающие длину полимера и могут охватывать известные аналоги природных нуклеотидов, а также нуклеотиды, которые модифицированы по основанию, сахару и/или фосфатным фрагментам (например, фосфоротиоатным остовам). В общем, аналог конкретного нуклеотида имеет одинаковую специфичность спаривания оснований; т.е., аналог А будет парой оснований с Т.
Используемый здесь термин «вектор» относится к вирусному вектору или к молекуле нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК), такой как плазмида или другой носитель, который содержит одну или несколько гетерологичных последовательностей нуклеиновых кислот по изобретению и, предпочтительно, предназначен для переноса между разными клетками-хозяевами. Термины «вектор экспрессии», «вектор доставки гена» и «вектор для генной терапии» относятся к любому вектору, который эффективен для включения и экспрессии одной или нескольких нуклеиновых кислот по изобретению в клетке, предпочтительно при регуляции промоутер. Вектор клонирования или экспрессии может содержать дополнительные элементы, например регуляторные и/или посттранскрипционные регуляторные элементы, в дополнение к промотору.
Термин «примерно», особенно в отношении данного количества, предназначен для охвата отклонений в плюс или минус десять (10) процентов, предпочтительно 5 процентов, еще более предпочтительно 2 процента и наиболее предпочтительно 1 процент.
Настоящее изобретение относится к композиции для применения при лечении и/или профилактике заболевания или синдрома, связанного с любой вирусной инфекцией, у субъекта, нуждающегося в этом, композиция, содержащая терапевтически эффективное количество белка альфа-1-антитрипсин, его вариант, изоформу и/или фрагмент.
Белок альфа1-антитрипсина (ААТ), его вариант, изоформа и/или фрагмент могут быть ААТ, экстрагированным из плазмы, его вариантом, изоформой и/или фрагментом, в частности ААТ, экстрагированным из плазмы человека, его вариантом, изоформой и/или фрагментом; или рекомбинантный белок альфа-1-антитрипсин (rhAAT), его вариант, изоформа и/или фрагмент, предпочтительно белок альфа-1-антитрипсин (ААТ), его вариант, изоформа и/или фрагмент представляет собой рекомбинантный белок альфа-1-антитрипсин (rhAAT), его вариант, изоформу и/или фрагмент. Вирусная инфекция может быть вызвана ДНК-вирусом (двухцепочечным или одноцепочечным), РНК-вирусом (одно- или двухцепочечным, положительным или отрицательным), вирусом с обратной транскрипцией или любым появляющимся вирусом, как в оболочке, так и без нее.
В некоторых аспектах изобретения композиция используется для лечения и/или профилактики заболевания или синдрома, связанного с инфекцией респираторного вируса, у субъекта, нуждающегося в этом. В некоторых аспектах описанный здесь респираторный вирус представляет собой вирус, выбранный из группы, состоящей из риновируса, RSV, парагриппа, метапневмовируса, коронавируса, энтеровируса, аденовируса, бокавируса, полиомавируса, вируса простого герпеса и цитомегаловируса.
В некоторых аспектах изобретения композиция используется для лечения и/или профилактики заболевания или синдрома, связанного с инфекцией ДНК-вируса, у субъекта, нуждающегося в этом.
В некоторых аспектах описанный здесь ДНК-вирус выбран из группы, состоящей из аденовируса, риновируса, RSV, вируса гриппа, вируса парагриппа, метапневмовируса, коронавируса, энтеровируса, аденовируса, бокавируса, полиомавируса, вируса простого герпеса, цитомегаловируса, бокавируса, полиомавируса, и цитомегаловируса.
В некоторых аспектах изобретения композиция используется для лечения и/или профилактики заболевания или синдрома, связанного с инфекцией РНК-вируса, у субъекта, нуждающегося в этом. РНК-вирус может быть вирусом с оболочкой или оболочкой или без оболочки или вирусом с открытой РНК. РНК-вирус может быть вирусом с одноцепочечной РНК (оцРНК) или вирусом с двухцепочечной РНК (дцРНК). Одноцепочечный РНК-вирус может быть вирусом оцРНК с положительным смыслом или вирусом оцРНК с отрицательным смыслом.
В некоторых аспектах описанный здесь РНК-вирус выбран из группы, состоящей из риновируса, RSV, вируса гриппа, вируса парагриппа, метапневмовируса, коронавируса, энтеровируса, аденовируса, бокавируса, полиомавируса, вируса простого герпеса и цитомегаловируса.
В некоторых аспектах изобретения композиция используется для лечения и/или профилактики заболевания или синдрома, связанного с инфекцией коронавируса, у субъекта, нуждающегося в этом. В некоторых аспектах описанный здесь коронавирус представляет собой коронавирус из рода, выбранного из группы α-CoV, β-CoV, γ-CoV или δ-CoV. В другом конкретном аспекте описанный здесь коронавирус относится к роду α-CoV или β-CoV. В некоторых аспектах описанный здесь коронавирус выбран из группы, состоящей из коронавируса человека ОС43 (HCoV-OC43), коронавируса человека HKU1 (HCoV-HKU1), коронавируса человека 229Е (HCoV-229E), коронавируса человека NL63 (HCoV-NL63, New Haven coronavirus), коронавирус, связанный с ближневосточным респираторным синдромом (MERS-CoV или «новый коронавирус 2012»), коронавирус тяжелого острого респираторного синдрома (SARS-CoV или «SARS-classic») и коронавирус тяжелого острого респираторного синдрома 2 (SARS-CoV-2 или «новый коронавирус 2019 года»). Предпочтительно вирусная инфекция представляет собой инфекцию РНК-вируса, наиболее предпочтительно инфекцию коронавируса, вызванную коронавирусом, выбранным из неограничивающей группы, включающей MERS-CoV, SARS-CoV и SARS-CoV-2. Наиболее предпочтительно, чтобы вирусная инфекция была инфекцией SARS-CoV-2.
Следует понимать, что изобретение включает все заболевания или синдромы, связанные с вирусной инфекцией, предпочтительно коронавирусной инфекцией, более предпочтительно инфекцией SARS-CoV-2. Заболевание или синдром, связанный с инфекцией SARS-CoV-2, также называют COVID-19 (Ковид-19). В одном аспекте заболевание или синдром, связанный с вирусной инфекцией, представляет собой воспаление, например, кровеносных сосудов по всему телу (например, болезнь Кавасаки), иммунное заболевание (например, болезнь Грейвса) и/или респираторный синдром, в частности тяжелый острый респираторный синдром. Заболевание или синдром могут быть связаны с вирусной инфекцией в том смысле, что вирусная инфекция связана с заболеванием или синдромом, предшествующим заболеванию или синдрому, способствует заболеванию или синдрому и/или вызывает заболевание или синдром. Например, вирусная инфекция может вызывать воспаление, которое прямо или косвенно вызывает заболевание или синдром. Воспаление, связанное с вирусной инфекцией, может быть острым или хроническим. Воспаление, связанное с вирусной инфекцией, впоследствии может сохраняться системно и/или в конкретном органе, например в головном мозге, и/или вызывать длительные повреждения. В некоторых аспектах изобретения композиция используется для лечения и/или профилактики воспалительного заболевания или синдрома нервной системы, связанного с инфекцией вируса, у субъекта, нуждающегося в этом.
Используемый здесь термин «воспалительное заболевание или синдром нервной системы» относится к заболеванию, синдрому и/или состоянию, которое характеризуется усилением воспаления в нервной системе по сравнению со здоровым эталонным субъектом. Описанное здесь заболевание или синдром, включая заболевание или синдром нервной системы, связано с вирусом. Воспаление характеризуется нарушением регуляции маркеров воспаления и/или повышенной инфильтрацией, активацией, пролиферацией и/или дифференцировкой иммунных клеток в крови и/или головном мозге. Маркер воспаления - это маркер, указывающий на воспаление у субъекта. В определенных аспектах воспалительный маркер, описанный в настоящем документе, представляет собой маркер, выбранный из группы СРБ, скорости оседания эритроцитов (СОЭ) и прокальцитонина (ПКТ), интерлейкина (например, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30, IL-31, IL-33, IL-32, IL-33, IL-35 или IL-36) Фактор некроза опухоли (например, TNF альфа, TNF бета), Интерферон (например, интерферон гамма) MIP-I, MCP-I, RANTES, другие хемокины и/или другие цитокины. Воспалительный маркер также может быть обнаружен косвенно, например, путем обнаружения фактора ингибирования воспалительного маркера (например, фактора связывания и/или антагониста). В некоторых аспектах воспалительный маркер измеряется в клетках, вовлеченных в воспаление, в клетках, затронутых клетками, участвующими в воспалении, в спинномозговой жидкости и/или в крови. В некоторых аспектах маркер воспаления указывает на инфильтрацию, активацию, пролиферацию и/или дифференцировку иммунных клеток. Обнаружение маркера воспаления или соотношение двух или более маркеров воспаления обнаруживается за пределами нормального диапазона. Нормальный диапазон маркеров воспаления и должен ли маркер (соотношение) быть ниже или выше порогового значения, чтобы указывать на воспаление, известны специалисту в данной области. В некоторых аспектах определяется уровень экспрессии гена, уровень транскрипта РНК, уровень экспрессии белка, уровень активности белка и/или уровень ферментативной активности по меньшей мере одного маркера воспаления. В некоторых аспектах по меньшей мере один маркер воспаления детектируется количественно и/или качественно для определения воспалительного заболевания или синдрома нервной системы у субъекта, нуждающегося в лечении и/или профилактике.
В некоторых аспектах описанное здесь воспалительное заболевание или синдром нервной системы характеризуется острым воспалением, то есть продолжительность симптомов воспаления обычно составляет от нескольких минут (например, 2, 5, 10, 15, 30, 45 минут) до нескольких дней (например, 2, 3, 5, 7, 10 или 14 дней). Острое воспаление обычно возникает в результате воздействия раздражителя, например вирусной инфекции. В некоторых аспектах воспалительное заболевание или синдром нервной системы характеризуется хроническим воспалением, то есть продолжительность симптомов воспаления обычно составляет не менее нескольких дней (например, 2, 3, 5, 7, 10 или 14 дней) или симптомы воспаления повторяются, по крайней мере, один раз (например, один или несколько раз, два или более раз или три или более раз). В некоторых аспектах воспалительное заболевание или синдром нервной системы характеризуется хроническим воспалением слабой степени. Хроническое воспаление средней степени тяжести может возникать при отсутствии клинических симптомов.
В некоторых аспектах субъект, нуждающийся в лечении и/или профилактике, имеет в анамнезе вирусную инфекцию. Следовательно, субъект, нуждающийся в лечении и/или профилактике, был инфицирован вирусом по крайней мере один раз. В некоторых аспектах субъект, нуждающийся в лечении и/или профилактике, был инфицирован вирусом по меньшей мере один раз. В некоторых аспектах субъект, нуждающийся в лечении и/или профилактике, был инфицирован вирусом по меньшей мере один раз в детстве. В некоторых аспектах субъект, нуждающийся в лечении и/или профилактике, был инфицирован вирусом по меньшей мере один раз. В некоторых аспектах субъект, нуждающийся в лечении и/или профилактике, был инфицирован вирусом по меньшей мере один раз в течение последних 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 или 0,5 года (лет). В определенных аспектах вирусная инфекция активна (например, обнаруживается) в момент диагностики воспалительного заболевания или синдрома нервной системы у субъекта, нуждающегося в лечении и/или профилактике.
Способы обнаружения вирусных инфекций известны специалисту в данной области. В некоторых аспектах изобретение относится к способу обнаружения вируса, выбранного из группы выделения вируса, способам на основе нуклеиновых кислот, методам на основе микроскопии, обнаружению антител хозяина, электронной микроскопии и фенотипу клетки-хозяина.
В некоторых аспектах описанная здесь вирусная инфекция обнаруживается в образце, например в образце, выбранном из группы носоглоточных мазков, крови, ткани (например, кожи), мокроты, полосканий, смывов из бронхов, мочи, спермы, фекалий, спинномозговой жидкости, засохших пятен крови, слизи из носа.
В некоторых аспектах описанная здесь вирусная инфекция получена как информация, полученная из истории болезни пациента.
Примеры выявления (предыдущей) инфекции SARS-CoV-2 включают набор человеческих антител IFN-γSARS-CoV-2 ELISpotPLUS (ALP), полоски (Mabtech, 3420-4AST-P1-1) или определение ответа Т-клеток. (Zuo, J., Dowell, AC, Pearce, H. et al., 2021, Nat Immunol).
В некоторых аспектах описанное здесь воспалительное заболевание или синдром нервной системы представляет собой воспалительное заболевание или синдром симпатической нервной системы. В некоторых аспектах описанное здесь воспалительное заболевание или синдром нервной системы представляет собой воспалительное заболевание или синдром парасимпатической нервной системы. В некоторых аспектах описанное здесь воспалительное заболевание или синдром нервной системы представляет собой воспалительное заболевание или синдром центральной нервной системы. В некоторых аспектах описанное здесь воспалительное заболевание или синдром нервной системы представляет собой воспалительное заболевание или синдром периферической нервной системы.
В некоторых аспектах воспалительное заболевание или синдром нервной системы, относящиеся к вирусу, выбирают из группы рассеянного склероза, бокового амиотрофического склероза, болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона и болезни Хантингтона.
Термин «рассеянный склероз» в контексте настоящего описания относится к заболеванию или расстройству, характеризующемуся воспалением, демиелинизацией, гибелью олигодендроцитов, повреждением мембран и гибелью аксонов. В некоторых аспектах описанный здесь рассеянный склероз относится к рецидивирующему/ремиттирующему рассеянному склерозу или прогрессирующему рассеянному склерозу. В некоторых аспектах рассеянный склероз является, по крайней мере, одной из четырех основных разновидностей рассеянного склероза, как определено в международном обзоре неврологов (Lublin и Reingold, 1996, Neurology 46 (4): 907-11), а именно рецидивирующий/ремиттирующий рассеянный склероз, вторичный прогрессирующий рассеянный склероз, прогрессирующий/рецидивирующий рассеянный склероз или первичный прогрессирующий рассеянный склероз (PPMS).
В некоторых аспектах описанный здесь рассеянный склероз относится к симптомам рассеянного склероза, которые включают проблемы со зрением, головокружение, головокружение, сенсорную дисфункцию, слабость, проблемы с координацией, потерю равновесия, усталость, боль, нейрокогнитивные нарушения, нарушения психического здоровья, дисфункцию мочевого пузыря, дисфункцию кишечника, сексуальную дисфункцию, тепловую чувствительность.
Термин «болезнь Хантингтона» в контексте настоящего описания относится к нейродегенеративному заболеванию, вызванному размножением трехнуклеотидных повторов (например, CAG, который транслируется в тракт поли-глутамина или PolyQ) в гене НТТ, что приводит к продукции патогенного мутантного белка хантингтина (НТТ, или mHTT). В некоторых аспектах мутантный белок хантингтин ускоряет скорость гибели нейрональных клеток в определенных областях мозга. В некоторых аспектах болезнь Хантингтона, описанная в настоящем документе, относится к симптомам болезни Хантингтона, которые включают нарушение моторной функции, когнитивные нарушения, депрессию, беспокойство, двигательные нарушения, хорею, ригидность, мышечные контрактуры (дистония), медленные движения глаз или аномальные движения глаз, нарушение походки, изменение осанки, нарушение равновесия, непреднамеренную потерю веса, нарушения ритма сна, нарушения циркадного ритма и дисфункцию вегетативной нервной системы.
Термин «боковой амиотрофический склероз» в контексте настоящего описания относится к прогрессирующему нейродегенеративному заболеванию, которое поражает верхние двигательные нейроны (двигательные нейроны в головном мозге) и/или нижние двигательные нейроны (двигательные нейроны в спинном мозге) и приводит к гибели двигательных нейронов. В некоторых аспектах боковой амиотрофический склероз включает все классификации бокового амиотрофического склероза, известные в данной области, включая, помимо прочего, классический боковой амиотрофический склероз (обычно поражающий как нижние, так и верхние двигательные нейроны), первичный боковой склероз (PLS, обычно поражающий только верхние двигательные нейроны), прогрессирующий бульбарный паралич (РВР или бульбарная манифестация, разновидность бокового амиотрофического склероза, который обычно начинается с затруднения глотания, жевания и речи), прогрессирующая мышечная атрофия (РМА, обычно поражающая только нижние двигательные нейроны) и семейная боковой амиотрофический склероз (генетическая версия бокового амиотрофического склероза).
В некоторых аспектах термин «боковой амиотрофический склероз» относится к симптомам бокового амиотрофического склероза, которые включают, без ограничения, прогрессирующую слабость, атрофию, фасцикуляцию, гиперрефлексию, дизартрию, дисфагию и/или паралич дыхательной функции.
Термин «болезнь Альцгеймера» (БА) в контексте настоящего описания относится к умственному ухудшению, связанному с конкретным дегенеративным заболеванием головного мозга, которое характеризуется старческими бляшками, нервными клубками и прогрессирующей потерей нейронов, которая клинически проявляется в прогрессирующем дефиците памяти, спутанности сознания, поведенческих проблемах, неспособности заботиться о себе и/или постепенном ухудшении физического состояния.
В некоторых аспектах субъекты, страдающие болезнью Альцгеймера, идентифицируются с использованием критериев NINCDS-ADRDA (Национальный институт неврологических и коммуникативных расстройств и Ассоциация болезни Альцгеймера и связанных с ней расстройств):
1) Рейтинг клинической деменции (CDR) = 1; Краткое обследование психического состояния (MMSE) от 16 до 24 баллов и медиальная височная атрофия (определяется с помощью магнитно-резонансной томографии, МРТ) > 3 балла по шкале Шелтенса. В некоторых аспектах термин болезнь Альцгеймера включает все стадии заболевания, включая следующие стадии, определенные NINCDS-ADRDA Критериями диагностики болезни Альцгеймера в 1984 году.
2) Определенная болезнь Альцгеймера: пациент соответствует критериям вероятной болезни Альцгеймера и имеет гистопатологические доказательства AD через аутопсию или биопсию.
Вероятная или продромальная болезнь Альцгеймера: деменция установлена клиническим и нейропсихологическим обследованием. Когнитивные нарушения также должны быть прогрессирующими и присутствовать в двух или более сферах познания. Начало дефицита приходится на возраст от 40 до 90 лет, и, наконец, должно быть отсутствие других заболеваний, способных вызвать синдром деменции.
3) Возможная или непродромальная болезнь Альцгеймера: имеется синдром деменции с атипичным началом, проявлением; и без известной этиологии; но считается, что причиной этого не являются сопутствующие заболевания, способные вызвать слабоумие. В некоторых аспектах термин болезнь Альцгеймера относится к одной стадии болезни Альцгеймера. В некоторых аспектах термин болезнь Альцгеймера относится к двум стадиям болезни Альцгеймера. В некоторых аспектах термин «болезнь Альцгеймера» относится к симптомам болезни Альцгеймера, которые включают, помимо прочего, потерю памяти, спутанность сознания, трудности с мышлением, изменения языка, изменения в поведении и/или изменения личности.
Термин «болезнь Паркинсона» в контексте настоящего описания относится к неврологическому синдрому, характеризующемуся дефицитом дофамина, возникающим в результате дегенеративных, сосудистых или воспалительных изменений в базальных ганглиях черной субстанции. Симптомы болезни Паркинсона включают, помимо прочего, следующие: тремор покоя, ригидность зубчатого колеса, брадикинезию, нарушение постурального рефлекса, хороший ответ на лечение 1-допа, отсутствие выраженного глазодвигательного паралича, мозжечковые или пирамидные признаки, амиотрофию, диспраксию и/или или дисфазия. В конкретном аспекте настоящее изобретение используется для лечения синдрома, связанного с дофаминергической дисфункцией. В некоторых аспектах болезнь Паркинсона включает любую стадию болезни Паркинсона. В некоторых аспектах термин болезнь Паркинсона включает раннюю стадию болезни Паркинсона, которая в широком смысле относится к первым стадиям болезни Паркинсона, когда у человека, страдающего этим заболеванием, проявляются легкие симптомы, не приводящие к потере трудоспособности, такие как эпизодический тремор единичного конечности (например, руки), и которые затрагивают только одну сторону тела.
В некоторых аспектах термин «болезнь Паркинсона» включает продвинутую стадию болезни Паркинсона, которая относится к более прогрессивной стадии болезни Паркинсона, при которой у человека, страдающего этим заболеванием, проявляются обычно тяжелые симптомы, которые могут привести к некоторой инвалидности (например, тремор, охватывающий обе стороны тела, проблемы с равновесием и т.д.). Симптомы, связанные с болезнью Паркинсона на поздней стадии, могут значительно различаться у разных людей и могут проявиться через несколько лет после первоначального появления болезни.
В некоторых аспектах термин «болезнь Паркинсона» относится к симптомам болезни Паркинсона, которые включают, помимо прочего, тремор (например, тремор, который наиболее выражен во время покоя), тряску (например, дрожание рук, рук, ног, челюсти и лица), мышечную ригидность, отсутствие постуральных рефлексов, замедление произвольных движений, ретропульсию, маскированное выражение лица, сутулость, плохой баланс, плохую координацию, брадикинезию, постуральную нестабильность и/или аномалии походки.
Примеры установленных связей воспалительного заболевания или синдрома нервной системы и вирусных инфекций:
Заболевание или синдром предпочтительно связаны с коронавирусной инфекцией, а более предпочтительно заболевание или синдром связаны с инфекцией SARS-CoV-2. Заболевание или синдром, связанный с заболеванием или синдромом, вызванным SARS-CoV-2, предпочтительно имеет по меньшей мере один признак, выбранный из группы, состоящей из лихорадки, кашля, усталости, затрудненного дыхания, озноба, боли в суставах или мышцах, отхаркивания, выделения мокроты, одышки, миалгии, артралгии или боли в горле, головной боли, тошноты, рвоты, диареи, боли в синусах, заложенности носа, снижения или изменения обоняния или вкуса, отсутствие аппетита, потеря веса, боль в животе, конъюнктивит, кожная сыпь, лимфома, апатия и сонливость, предпочтительно лихорадка, кашель, усталость, затрудненное дыхание, озноб, боль в суставах или мышцах, отхаркивание, выделение мокроты, одышка, миалгия, артралгия или боль в горле, головная боль, тошнота, рвота, диарея, боль в пазухах носа, заложенность носа, снижение или изменение обоняния или вкуса.
Настоящее изобретение относится к композиции для применения при лечении и/или профилактике заболевания или синдрома, связанного с вирусной инфекцией, предпочтительно коронавирусной инфекцией у субъекта, нуждающегося в этом, композиция, содержащая терапевтически эффективное количество белка альфа-1-антитрипсина (ААТ), его вариант, изоформу и/или фрагмент. Коронавирус предпочтительно представляет собой SARS-CoV-2.
Автор(ы) обнаружили, что ААТ и rhAAT ингибируют проникновение нескольких вирусов (см. Фиг. 11, 21, 22) и уменьшают воспаление, в частности, в микроглии нервной системы (Фиг. 19, 20). Кроме того, клетки SH-SY5Y нейронального происхождения часто используются для изучения нейродегенеративных заболеваний, включая болезнь Паркинсона (Xicoy, Н., Wieringa, В. & Martens, GJ. The SH-SY5Y cell line in Parkinson's disease research: a systematic review (Линия клеток SH-SY5Y в исследовании болезни Паркинсона: систематический анализ). Mol Neurodegeneration 12, 10, 2017) демонстрируют действительно высокое количество копий мРНК протеаз, примирующих спайковый белок, а именно трипсина и катепсина В (Фиг. 15е). В сочетании с относительно высоким уровнем экспрессии АСЕ2 в SH-SY5Y (Фиг. 3а) эти нервные ткани (Bielarz V, Willemart K, Avalosse N, et al. Восприимчивость клеточных линий нейробластомы и глиобластомы к инфекции SARS-CoV-2. Brain Res. 1 мая 2021 г.) и клетки аналогичного происхождения становятся восприимчивыми к вирусной инфекции SARS-CoV-2.
Можно использовать различные стратегии для доставки композиции для применения по изобретению в нервную систему, включая мозг, и для преодоления гематоэнцефалического барьера (Salameh, TS, & Banks, WA, 2014, Advances in Pharmaceuticalology, 71, 277-299; Tashima, Т., 2020, Receptor-Mediated Transcytosis (Опосредованный рецепторами трансцитоз). Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 68(4), 316-32; Pardridge, W. M., 2020, Frontiers in aging neuroscience (На переднем крае нейробиологии старения), 11, 373; Upadhyay, R.K., 2014, BioMed research international).
В некоторых аспектах композиция для применения по настоящему изобретению сливается с белком, повышающим гематоэнцефалический барьер. В некоторых аспектах описанный здесь белок, усиливающий гематоэнцефалический барьер, представляет собой по меньшей мере один полный белок, вариант, изоформу и/или фрагмент белка, выбранный из группы, состоящей из трансферрина, инсулина, инсулиноподобного фактора роста, липопротеина низкой плотности.
Также могут использоваться стратегии троянских коней (см., например, Pardridge, W.M., 2017, BioDrugs 31, 503-519). В некоторых аспектах композиция для применения по изобретению связана с антителом или его фрагментом, которое связывается с эндогенным переносчиком рецептора ВВВ, таким как рецептор инсулина или рецептор трансферрина.
Композицию для использования по настоящему изобретению также можно изменить для увеличения липофильности и последующего улучшения свойств пересечения ГЭБ (см., например, Upadhyay, RK, 2014,. BioMed Research International, Идент. статьи 869269, 37 страниц). В некоторых аспектах композиция для применения по изобретению включает модификации, повышающие липофильность. В некоторых аспектах модификации, которые увеличивают липофильность, описанные в настоящем документе, включают добавление по меньшей мере одного гипдрофильного пептида, замену частей последовательности по меньшей мере одним гипдрофильным пептидом, добавление липидных фрагментов и/или замену нелипидных фрагментов липидными фрагментами..
Соответственно, изобретение, по крайней мере частично, основано на широком действии ААТ на заболевания или синдромы, связанные с вирусными инфекциями.
Конкретные субъекты могут быть особенно подходящими для лечения и/или профилактики с помощью белка ААТ и/или rhAAT.
Следовательно, настоящее изобретение также относится к композиции для применения при лечении и/или профилактике заболевания или синдрома, связанного с вирусной инфекцией, предпочтительно коронавирусной инфекцией, более предпочтительно инфекцией SARS-CoV-2 у субъекта, нуждающегося в этом, композиция, содержащая терапевтически эффективное количество белка альфа-1-антитрипсина (ААТ), его варианта, изоформы и/или фрагмента, где субъект, нуждающийся в этом, имеет по меньшей мере один измененный уровень, выбранный из i) эндогенного альфа-антитрипсина (ААТ), по меньшей мере, одну протеазу, примирующую спайковый белок, ангиотензинпревращающий фермент 2 (рецептор АСЕ2) и гамма-интерферон (IFN-γ), по сравнению с по меньшей мере одним контрольным субъектом. Белок альфа1-антитрипсина (ААТ), его вариант, изоформа и/или фрагмент могут быть ААТ, экстрагированным из плазмы, его вариантом, изоформой и/или фрагментом, в частности ААТ, экстрагированным из плазмы человека, его вариантом, изоформой и/или фрагментом; или рекомбинантный белок альфа-1-антитрипсин (rhAAT), его вариант, изоформа и/или фрагмент, предпочтительно белок альфа-1-антитрипсин (ААТ), его вариант, изоформа и/или фрагмент представляет собой рекомбинантный белок альфа-1-антитрипсин (rhAAT), его вариант, изоформу и/или фрагмент.
«Субъект, нуждающийся в этом» также упоминается как объект интереса. Субъект, нуждающийся в этом, может быть субъектом во время или с вирусной инфекцией, предпочтительно с коронавирусной инфекцией, более предпочтительно с инфекцией SARS-CoV-2 (т.е. инфицированный субъект), страдающим заболеванием или синдромом, связанным с вирусной инфекцией, предпочтительно коронавирусная инфекция, более предпочтительно инфекция SARS-CoV-2. Инфицированному субъекту может потребоваться лечение и/или профилактика заболевания или синдрома, связанного с вирусной инфекцией, предпочтительно коронавирусной инфекцией, более предпочтительно инфекцией SARS-CoV-2. Обработка ААТ и/или rhAAT может подавлять или уменьшать проникновение вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно вируса SARS-CoV-2, в клетки путем ингибирования протеазы, активирующей спайковый белок, уменьшать распространение вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно вируса SARS-CoV-2 в организме и/или уменьшение воспаления в ответ на вирусную инфекцию, предпочтительно коронавирусную инфекцию, более предпочтительно инфекцию SARS-CoV-2. Субъект, нуждающийся в лечении и/или профилактике, может иметь респираторный синдром, более предпочтительно острый респираторный синдром, даже более предпочтительно тяжелый острый респираторный синдром. Субъект, нуждающийся в лечении и/или профилактике, может иметь по меньшей мере один симптом, выбранный из группы, состоящей из лихорадки, кашля, усталости, затрудненного дыхания, озноба, боли в суставах или мышцах, отхаркивания, выделения мокроты, одышки, миалгии, артралгии или боли в горле, головной боли, тошноты, рвоты, диареи, боли в пазухах, заложенности носа, снижения или изменения обоняния или вкуса, отсутствия аппетита, потеря веса, боль в животе, конъюнктивиты, кожная сыпь, лимфома, апатия и сонливость, предпочтительно из группы, состоящей из лихорадки, кашля, усталости, затрудненного дыхания, озноба, боли в суставах или мышцах, отхаркивания, выделения мокроты, одышки, миалгии, артралгии или боли в горле, головной боли, тошноты, рвоты, диареи, боли в пазухах, заложенности носа, снижения или изменения обоняния или вкуса. Субъекту, нуждающемуся в лечении и/или профилактике, может потребоваться интенсивная терапия и/или искусственная вентиляция легких. Субъекта, нуждающегося в лечении и/или профилактике, можно определить с помощью одного из приведенных выше определений или любой их комбинации.
Субъект, нуждающийся в этом, также может быть субъектом до вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно инфекции SARS-CoV-2, которая особенно восприимчива к развитию заболевания или синдрома после вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно инфекции SARS-CoV-2. Такому субъекту может потребоваться профилактика заболевания или синдрома, связанного с вирусной инфекцией, предпочтительно коронавирусной инфекцией, более предпочтительно инфекцией SARS-CoV-2 до инфицирования.
По меньшей мере, один эталонный субъект может быть группой эталонных субъектов. Предпочтительно, эталонный(-ые) субъект(-ы) является/являются субъектами с вирусной инфекцией или во время нее, предпочтительно с коронавирусной инфекцией, более предпочтительно с инфекцией SARS-CoV-2 (т.е. инфицированный субъект), которая протекает бессимптомно или имеет/имеют легкие симптомы, более предпочтительно субъект (ы) является/являются субъектами с вирусной инфекцией или во время нее, предпочтительно с коронавирусной инфекцией, более предпочтительно с инфекцией SARS-CoV-2, которая протекает бессимптомно.
Бессимптомное состояние согласно настоящему изобретению означает, что (контрольный) субъект не имеет симптомов, предпочтительно не имеет симптомов, выбранных из группы, состоящей из отсутствия лихорадки, кашля, усталости, затрудненного дыхания, озноба, боли в суставах или мышцах, отхаркивания, выделения мокроты, одышка, миалгия, артралгия или боль в горле, головная боль, тошнота, рвота, диарея, боль в носовых пазухах, заложенный нос, снижение или изменение обоняния или вкуса, отсутствие аппетита, потеря веса, боли в желудке, конъюнктивиты, кожная сыпь, лимфома, апатия и сонливость, более предпочтительно без лихорадки, кашля, утомляемости, затрудненного дыхания, озноба, боли в суставах или мышцах, отхаркивания, выделения мокроты, одышки, миалгии, артралгии или боли в горле, головной боли, тошноты, рвоты, диареи, боли в носовых пазухах, заложенный нос, снижение или изменение обоняния или вкуса. Бессимптомный (эталонный) субъект предпочтительно не имеет респираторного синдрома, более предпочтительно без острого респираторного синдрома, еще более предпочтительно без тяжелого острого респираторного синдрома. Бессимптомный (эталонный) субъект не требует интенсивной терапии и/или искусственной вентиляции легких. Бессимптомный (эталонный) субъект может быть определен одним из приведенных выше определений или любой их комбинацией.
(Эталонный) субъект с легкими симптомами согласно настоящему изобретению предпочтительно не имеет респираторного синдрома, более предпочтительно без острого респираторного синдрома, еще более предпочтительно без тяжелого острого респираторного синдрома. (Эталонный) субъект с легкими симптомами предпочтительно не требует интенсивной терапии и/или искусственной вентиляции легких. У (эталонного) субъекта с легкими симптомами может быть по меньшей мере один симптом, выбранный из группы, состоящей из лихорадки, кашля, усталости, затрудненного дыхания, озноба, боли в суставах или мышцах, отхаркивания, выделения мокроты, одышки, миалгии, артралгии или боли в горле, головная боль, тошнота, рвота, диарея, боль в носовых пазухах, заложенность носа, снижение или изменение обоняния или вкуса, отсутствие аппетита, потеря веса, боль в желудке, конъюнктивиты, кожная сыпь, лимфома, апатия и сонливость, более предпочтительно отсутствие лихорадка, кашель, усталость, затрудненное дыхание, озноб, боль в суставах или мышцах, отхаркивание, выделение мокроты, одышка, миалгия, артралгия или боль в горле, головная боль, тошнота, рвота, диарея, боль в носовых пазухах, заложенность носа, снижение или изменение обоняния или вкус, при этом (контрольный) субъект с легкими симптомами не требует интенсивной терапии и/или искусственной вентиляции легких. (Эталонный) субъект с легкими симптомами может быть определен одним из приведенных выше определений или любой их комбинацией.
Эталонным субъектом может быть ребенок, в частности ребенок в возрасте менее 10 лет, предпочтительно менее 5 лет. Эталонный субъект может иметь возраст от 1 до 10 лет, предпочтительно от 2 до 5 лет.
Субъект (эталонный) во время или с вирусной инфекцией, в частности коронавирусной инфекцией, в частности, инфекцией SARS-CoV-2, является субъектом, который предпочтительно является (эталонным) субъектом, инфицированным вирусом, в частности коронавирусом, в частности SARS-CoV-2. Инфицированный (эталонный) субъект означает, что вирус, в частности коронавирус, в частности вирус SARS-CoV-2, проник в клетки тела (контрольного) субъекта, предпочтительно пролиферируя в клетках тела (эталонного) субъекта.
После заражения вирусом, в частности коронавирусом, в частности SARS-CoV-2, уровни гамма-интерферона у инфицированного субъекта повышаются. Повышенные уровни гамма-интерферона, в свою очередь, приводят к увеличению уровня ангиотензинпревращающего фермента 2 (рецептора АСЕ2). Повышенные уровни ангиотензин-превращающего фермента 2 (рецептора АСЕ2) стимулируют повышенную активность и примирование спайкового белка протеазами. Затем эндогенные уровни ААТ снижаются в ответ на повышенный уровень (уровни) активности по меньшей мере одной протеиназы, примирующей спайковый белок. Впоследствии эндогенный уровень ААТ снижается еще больше, поскольку ААТ связывает (и ингибирует) активные протеазы, инициирующие спайковый белок. Субъекты, у которых есть по крайней мере один симптом, выбранный из группы: i) более низкий уровень эндогенного альфа-антитрипсина (ААТ), ii) более высокий уровень, по крайней мере, одной протеазы, активирующей спайковый белок, iii) более высокий уровень ангиотензинпревращающего фермента 2 (АСЕ2 рецептор) и iv) более высокий уровень гамма-интерферона (IFN-γ) по сравнению с хотя бы одним контрольным субъектом, особенно подвержены развитию заболевания или синдрома в ответ на вирус, особенно коронавирус, в частности SARS-CoV-2 инфекции. Следовательно, эти представляющие интерес субъекты особенно актуальны и подходят для получения лечения и/или профилактики с использованием композиции, содержащей терапевтически эффективное количество белка альфа-1-антитрипсина (ААТ), его варианта, изоформы и/или фрагмента. Белок альфа1-антитрипсина (ААТ), его вариант, изоформа и/или фрагмент могут быть ААТ, экстрагированным из плазмы, его вариантом, изоформой и/или фрагментом, в частности ААТ, экстрагированным из плазмы человека, его вариантом, изоформой и/или фрагментом; или рекомбинантный белок альфа-1-антитрипсин (rhAAT), его вариант, изоформа и/или фрагмент, предпочтительно белок альфа-1-антитрипсин (ААТ), его вариант, изоформа и/или фрагмент представляет собой рекомбинантный белок альфа-1-антитрипсин (rhAAT), его вариант, изоформу и/или фрагмент. Наиболее предпочтительно белок ААТ представляет собой рекомбинантный белок альфа1-антитрипсина (rhAAT), продуцируемый в клетке яичника китайского хомячка (СНО) и/или в клетке эмбриональной почки человека (HEK).
Настоящее изобретение также относится к композиции для применения при лечении и/или профилактике заболевания или синдрома, связанного с вирусной инфекцией, предпочтительно с коронавирусной инфекцией, более предпочтительно с инфекцией SARS-CoV-2 у субъекта, нуждающегося в этом, композиция, содержащая терапевтически эффективное количество белка альфах-антитрипсина (ААТ) и/или рекомбинантного белка альфа1-антитрипсина (rhAAT), его варианта, изоформы и/или фрагмента, при этом субъект, нуждающийся в этом, имеет по меньшей мере одну выбранную из группы, состоящей из:
1. более низкий уровень эндогенного альфа-антитрипсина (ААТ) до вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно инфекции SARS-CoV-2 или во время инфекции SARS-CoV-2, по сравнению с по крайней мере одним субъектом во время вирусной инфекции предпочтительно коронавирусная инфекция, более предпочтительно инфекция SARS-CoV-2, которая протекает бессимптомно или имеет легкие симптомы,
2. более высокий уровень по крайней мере одной протеазы, примирующей спайковый белок, до вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно, инфекции SARS-CoV-2 или во время вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно SARS-CoV-2 инфекция по сравнению с хотя бы одним субъектом во время вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно инфекции SARS-CoV-2, которая протекает бессимптомно или имеет легкие симптомы,
3. более высокий уровень ангиотензинпревращающего фермента 2 (рецептор АСЕ2) у субъекта до вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно инфекции SARS-CoV-2, или во время вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно инфекции SARS-CoV-2, по сравнению с по меньшей мере одним субъектом во время вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно инфекции SARS-CoV-2, который является бессимптомным или имеет легкие симптомы, и
4. более высокий уровень гамма-интерферона (IFN-γ) у субъекта до вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно инфекции- SARS-CoV2 или во время вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно SARS-CoV-2 по сравнению с хотя бы одним субъектом во время вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно инфекции SARS-CoV-2, которая протекает бессимптомно или имеет легкие симптомы.
По меньшей мере, один субъект, инфекция у которого протекает бессимптомно или имеет легкие симптомы, также называется по меньшей мере одним эталонным субъектом. Эталонный объект определяется, как описано в настоящем документе.
«Субъект, нуждающийся в этом» также упоминается как объект интереса. Потребность в лечении и/или профилактике синдрома болезни, связанного с вирусной инфекцией, предпочтительно с коронавирусной инфекцией, более предпочтительно с инфекцией SARS-CoV-2, определяется, как описано в настоящем документе.
Уровни, определенные в пп. I) - iv), могут быть уровнями белка и/или уровнями мРНК, предпочтительно уровнем белка или мРНК. Уровень(-ни) белка измеряется с использованием анализов на основе антител, таких как твердофазный иммуноферментный анализ (твердофазный ИФА) и/или биослойная интерферометрия (БСИ) на основе волоконно-оптических биосенсоров (ForteBio Octet).
Уровень протеазы примирования спайкового белка может быть определен путем измерения активности протеазы спайкового белка с использованием флуорогенных пептидов, полученных из спайкового белка SARS-CoV-2. Метод описан в Jaimes et al. (Javier A. Jaimes, Jean K. Millet, Gary R. Whittaker Протеолитическое расщепление спайкового белка SARS-CoV-2 и роль нового сайта S1/S2 (Proteolytic Cleavage of the SARS-CoV-2 Spike Protein and the Role of the Novel S1/S2 Site), CELL, iScience 23, 101212, 26 июня 2020 г.). Прозрачные методы Пептиды: флуорогенные пептиды, полученные из сайтов спайка SARS-CoV-2 (S) S1/S2, состоящих из последовательностей HTVSLLRSTSQ (ИДЕНТ. НОМЕР ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 11) и TNSPRRARSVA (SEQ ID NO: 12), соответственно, и содержащие пару (7-метоксикумарин-4-ил)ацетил/2,4-динитрофенил (MCA/DNP) FRET, были синтезированы компанией Biomatik (Вилмингтон, штат Делавэр, США). Рекомбинантный фурин можно приобрести в New England Biolabs (Ипсвич, Массачусетс, США). Рекомбинантный трипсин, обработанный L-1-тозиламид-2-фенилэтилхлорметилкетоном (TPCK), можно приобрести у Sigma-Aldrich (Сент-Луис, штат Миссури, США). Рекомбинантный РС1, матриптаза, катепсин В и катепсин L можно приобрести в R&D Systems (Миннеаполис, штат Миннесота, США). Анализ флуорогенного пептида: для каждого флуорогенного пептида реакцию проводят в объеме 100 мкл с буфером, состоящим из 100 мМ Hepes, 0,5% Triton Х-100, 1 мМ CaCl2 и 1 мМ 2-меркаптоэтанола, рН 7,5 для фурина (разбавленного до 10 Ед/мл); 25 мМ MES, 5 мМ CaCl2, 1% (мас./об.) Brij-35, рН 6,0 для РС1 (разбавлен до 2,2 нг/мкл); PBS для трипсина (разбавлен до 8 нМ); 50 мМ Трис, 50 мМ NaCl, 0,01% (об./об.) Tween® 20, рН 9,0 для матриптазы (разбавленный до 2,2 нг/мкл); 25 мМ MES, рН 5,0 для катепсина В (разбавлен до 2,2 нг/мкл); 50 мМ MES, 5 мМ DTT, 1 мМ EDTA, 0,005% (мас./об.) Brij-35, рН 6,0 для катепсина L (разбавлен до 2,2 нг/мкл) и пептид, разбавленный до 50 мкМ. Реакции проводят при 30°С в трех экземплярах, и испускание флуоресценции измеряется каждую минуту в течение 45 минут с использованием флуориметра SpectraMax (Molecular Devices, Саннивейл, штат Калифорния, США) с настройкой длин волн λех 330 нм и λem 390 нм, что позволяет отслеживать флуоресценцию интенсивность во времени и расчет Vmax реакций. Анализы следует проводить в трех экземплярах, результаты представляют собой средние значения Vmax из трех независимых экспериментов.
Уровень белка IFN-γ можно измерить с помощью проточной цитометрии, иммуноанализа на основе частиц. Метод может быть заимствован у Huang et. др. (Huang KJ, Su IJ, Theron M, et al. Цитокиновый шторм, связанный с интерфероном-гамма, у пациентов с ТОРС (An interferon-gamma-related cytokine storm in SARS patients). J Med Virol. 2005; 75 (2): 185-194. doi: 10.1002/jmv.20255) Набор гранул человеческих цитокинов или хемокинов (СВА) BD Th1/Th2. Набор гранул человеческих цитокинов или хемокинов BD Th1/Th2 (BD PharMingen, Сан-Диего, штат Калифорния) для измерения уровней IFN-γ с помощью проточной цитометрии в иммуноанализе на основе частиц. Этот набор позволял одновременно измерять шесть цитокинов в 50 мл образца сыворотки крови пациента. Предел обнаружения этих иммуноанализов составляет 7,1 пг/мл для IFN-γ.
Предпочтительно эндогенный уровень ААТ, описанный здесь, представляет собой уровень белка. Уровень по меньшей мере одной описанной здесь протеазы спайкового белка предпочтительно представляет собой уровень мРНК. Уровень рецептора АСЕ2, описанный здесь, предпочтительно представляет собой уровень мРНК. Описанный здесь уровень IFN-γ предпочтительно представляет собой уровень белка. Уровни белка и/или мРНК можно измерить в крови, моче или слюне, предпочтительно в крови, более предпочтительно в плазме крови, наиболее предпочтительно в плазме крови человека.
Некоторые факторы проникновения вирусов, в частности коронавирусов, в частности вируса SARS-CoV-2 в клетки и его распространения в клетках, уже изучены, в то время как другие все еще являются предметом исследования. Проникновение вируса SARS-CoV-2 опосредуется спайковым белком, протеазой(-ами), активирующей спайковый белок, и рецептором АСЕ2. Спайковый белок SARS-CoV-2 также называют спайковым белком S. Протеаза, инициирующая спайковый белок, расщепляет спайковый белок SARS-CoV-2, тем самым подготавливая SARS-CoV-2 для проникновения в клетку. SARS-CoV-2 проникает в клетку путем взаимодействия примированного спайкового белка с рецептором АПФ. Таким образом, если в интересующем субъекте присутствует хотя бы одна или несколько примирующих протеаз, тем легче и быстрее вирус SARS-CoV-2 проникает в клетки. Кроме того, чем больше присутствует рецепторов АСЕ2, тем легче и быстрее SARS-CoV-2 проникает в клетки. Инфекция SARS-CoV-2 приводит к воспалению и, таким образом, к повышению экспрессии IFN-γ. Экспрессия IFN-γ в ответ на инфекцию SARS-CoV-2 может, в свою очередь, привести к повышенной экспрессии рецептора АСЕ2. Во время пролиферации SARS-CoV-2 уровни IFN-γ еще больше увеличиваются, стимулируя усиление взаимодействия АСЕ2 со спайковым белком и, следовательно, примирование спайкового белка, уровни ААТ снижаются, а при проникновении вируса в клетки воспаление усиливается, что приводит к еще более высоким уровням IFN-γ. После заражения SARS-CoV-2, во-первых, повышается уровень IFN-γ, во-вторых, снижается уровень ААТ и повышается уровень катепсина L и/или других протеаз, примирующих спайковый белок (S-примирование). См. Фиг. 1.
Следовательно, изобретение, по крайней мере частично, основано на открытии того факта, что ААТ, а также rhAAT одновременно снижают проникновение вируса (см., например, Фиг. 6, 7, 8, 11, 12, 21, 22) и воспаление, связанное с вирусом (см., например, Фиг. 19, 20), в частности, воспаление, связанное с вирусом, из-за высоких уровней IFN-γ. Этот комбинированный эффект особенно полезен для описанных здесь популяций пациентов.
В определенных аспектах изобретение относится к композиции для применения в соответствии с изобретением, отличающейся тем, что протеаза, примирующая спайковый белок, представляет собой по меньшей мере одну, выбранную из группы, состоящей из подтипа 2 трансмембранной протеазы серина (TMPRSS2), трансмембранной протеазы подтипа 6 (TMPRSS6), катепсина L, катепсин В, пропротеинконвертаза 1 (РС1), трипсин, эластаза, эластаза нейтрофилов, матриптаза и фурин.
В определенных аспектах изобретение относится к композиции для применения в соответствии с изобретением, в которой протеазой, активирующей спайковый белок, является катепсин L и/или фурин.
ААТ эндогенно экспрессируется в организме человека. ААТ также называют ингибитором альфа-1-протеиназы. ААТ способен ингибировать протеазы, в частности протеиназы спайкового белка, такие как трансмембранная протеаза серина подтипа 2 (TMPRSS2), транс мембранная протеаза подтипа 6 (TMPRSS6/матриптаза-2), катепсин L, катепсин В, пропротеинконвертаза 1 (РС1), трипсин, эластаза, эластаза нейтрофилов, матриптаза и фурин. Если уровни четырех участников настоящего изобретения (ААТ, протеаза(ы) примирования спайкового белка, рецептор АСЕ2 и IFN-γ) изменены у инфицированного субъекта по сравнению с контрольным субъектом, то инфицированный субъект может получить особую пользу от лечения и/или профилактики заболевания или синдрома, связанного с инфекцией SARS-CoV-2. Низкие уровни эндогенных ААТ могут привести к более высокой предрасположенности интересующего субъекта к развитию заболевания или синдрома, связанного с SARS-CoV-2, в частности, к развитию COVID-19.
В определенных аспектах изобретение относится к композиции для применения согласно изобретению, отличающейся тем, что более низкий уровень эндогенного ААТ до вирусной инфекции или во время вирусной инфекции вызван недостаточностью ААТ.
Альфа-1-антитрипсин (далее «ААТ») представляет собой белок, который естественным образом встречается в организме человека и вырабатывается в печени, предпочтительно в гепатоцитах. По данным Janciauskiene et. др., (Janciauskiene SM, Bals R, Koczulla R, Vogelmeier C, Welte Т. Открытие α1-антитрипсина и его роль в здоровье и болезнях (The discovery of α1-antitrypsin and its role in health and disease). Respir Med. 2011; 105 (8): 1129-1139. doi: 10.1016/j.rmed.2011.02.002) нормальная концентрация ААТ в плазме колеблется от 0,9 до 1,75 г/л. Учитывая, что молекулярная масса составляет 52000 (Brantly М, Nukiwa Т, Crystal RG. Молекулярные основы дефицита альфа-1-антитрипсина (Molecular basis of alpha-1-antitrypsin deficiency). Am J Med. 1988; 84 (6A): 13-31. doi: 10.1016/0002-9343 (88) 90154-4), это соответствует нормальным концентрациям в плазме крови от 16 до 32 мкМ. Crystal 1990 (Crystal RG. Дефицит альфа-1-антитрипсина, эмфизема и заболевание печени. Генетические основы и стратегии терапии. (Alpha 1-antitrypsin deficiency, emphysema, and liver disease. Genetic basis and strategies for therapy.) J Clin Invest, май 1990; 85(5):1343-52. doi: 10.1172/JCI114578. PMID: 2185272; PMCID: PMC296579) описывает, что 11 мкМ является пороговым уровнем для клинического проявления дефицита ААТ. Для большинства здоровых людей 2 г ежедневной экспрессии ААТ в печени достаточно для достижения этого критического уровня сыворотки 11 мкМ, тогда эндогенный уровень ААТ достаточен для защиты нижних дыхательных путей от разрушения нейтрофильной эластазой (NE) и ингибирования прогрессирующего разрушение альвеол, завершающееся эмфиземой. Crystal 1990 далее отмечает, что нормальные эндогенные уровни ААТ у здоровых людей колеблются в пределах 20-53 мкМ. Эндогенные уровни белка ААТ в плазме крови здоровых людей до вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно, инфекции SARS-CoV-2 находятся в диапазоне от 5 до 60 мкМ, предпочтительно от 10 до 40 мкМ, более предпочтительно в диапазоне от 25 до 30 мкМ, даже более предпочтительно от 16 до 32 мкМ. В качестве альтернативы эндогенные уровни белка ААТ в плазме крови здоровых людей до вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно инфекции SARS-CoV-2, предпочтительно выше 30 мкМ, более предпочтительно выше 40 мкМ, в большинстве случаев предпочтительно выше 50 мкМ. Белок ААТ может быть белком ААТ плазмы или рекомбинантным белком ААТ (rhAAT). В некоторых аспектах белок ААТ плазмы получают из плазмы крови. В некоторых аспектах рекомбинантный белок ААТ продуцируется рекомбинантно, например, в клетках HEK, клетках СНО или клетках Е. coli. Фармацевтические компании по всему миру получают белок ААТ из плазмы крови человека для лечения дефицита ААТ, наследственного заболевания. ААТ, полученный из плазмы, одобрен в США и ЕС Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA) и Европейским агентством по лекарственным средствам (ЕМА), соответственно. Предпочтительно белок ААТ по изобретению имеет аминокислотную последовательность человека, наиболее предпочтительно такую, как указано в SEQ ID NO (Порядковом номере последовательности): 1 (см. Таблицу 1).
Как показано на Фиг. 6а и 6с настоящего изобретения, 10 мкМ ААТ снижает проникновение псевдовирусов на 20-30% в клетки А549, которые сверхэкспрессируют рецептор АСЕ2.
По данным Azouz et al. (Nurit P. Azouz, Andrea M. Klingler and Marc E. Rothenberg, Альфа1-антитрипсин (ААТ) является ингибитором протеазы TMPRSS2 примирования SARS-CoV-2 (Alphal -Antitrypsin (ААТ) is an Inhibitor of the SARS-CoV-2-Priming Protease TMPRSS2), (препринт bioRxiv онлайн, https://doi.org/) 10.1101/2020.05.04.077826, опубликовано 5 мая 2020 г.) в концентрациях 1-100 мкМ ААТ достигается дозозависимое ингибирование протеолитической активности TMPRSS2.
Как показано на Фиг. 7 настоящего изобретения, 100 мкМ ААТ снижает проникновение псевдовирусов на 50-75% в клетки А549, которые сверхэкспрессируют только рецептор АСЕ2.
Как показано на Фиг. 8 настоящего изобретения, 100 мкМ ААТ снижает проникновение псевдовирусов до 45% только в клетках А549, которые сверхэкспрессируют как рецептор АСЕ2, так и протеазу TMPRSS2, примирующую спайковый белок.
Важно отметить, что проникновение вируса наблюдается независимо от TMPRSS2 как на Фиг. 6, так и на Фиг. 7 настоящего изобретения. Демонстрация того, что примирующие протеазы, такие как фурин и/или катепсин L, способны заменить TMPRSS2, вероятно, среди других. В связи с этим ААТ, а также rhAAT снижает активность протеаз катепсина В, катепсина L, трипсина, фурина, РС1, матриптазы, эластазы и эластазы нейтрофилов (Фиг. 16).
Следовательно, ингибирующее действие ААТ, а также rhAAT на проникновение вируса выходит за рамки эффекта других ингибиторов TMPRSS2 (Фиг. 7, 8, 11, 12, 21, 22), поскольку ААТ, а также rhAAT эффективно ингибируют несколько примирующих протеаз (Фиг. 16) (например, протеазы, которые могут заменять функцию TMPRSS2) и последующее проникновение вируса, опосредованное АСЕ2 (Фиг. 7, 8, 11, 12, 21, 22).
Следовательно, ААТ так же, как rhAAT, снижает проникновение вируса за счет снижения активности примирующих протеаз, в частности, за счет широкого и эффективного снижения активности примирующих протеаз.
Соответственно, изобретение, по крайней мере частично, основано на неожиданном открытии того, что композиции, содержащие ААТ и/или rhAAT, их варианты, изоформы и/или фрагменты, особенно эффективны при лечении и/или профилактике заболевания или синдрома, связанного с вирусная инфекция, предпочтительно коронавирусная инфекция, более предпочтительно инфекция SARS-CoV-2, в частности, у субъекта с одним или несколькими предварительными условиями, описанными в настоящем документе.
В настоящем изобретении более низкий уровень эндогенного ААТ согласно i) предпочтительно представляет собой уровень белка в плазме крови человека. Уровень эндогенного белка ААТ в плазме крови человека согласно i) предпочтительно составляет менее 200 мкМ, предпочтительно менее 150 мкМ, 100 мкМ, менее 90 мкМ, менее 80 мкМ, менее 70 мкМ, менее 60 мкМ, менее 50 мкМ, менее 40 мкМ, менее 30 мкМ, менее 25 мкМ, менее 20 мкМ, менее 15 мкМ, менее 11 мкМ или менее 10 мкМ. Более предпочтительно менее 200 мкМ, менее 100 мкМ, менее 25 мкМ, менее 15 мкМ или менее 11 мкМ. Низкий уровень ААТ недостаточен для успешного ингибирования протеазы (протеаз) примирования белка. Поэтому низкий уровень эндогенного ААТ может способствовать пролиферации вируса, в частности пролиферации коронавируса, более конкретно пролиферации SARS-CoV-2 и/или развитию синдрома заболевания, связанного с вирусной инфекцией, предпочтительно коронавирусной инфекцией, более предпочтительно инфекцией SARS-CoV-2. Более низкий уровень эндогенного ААТ до вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно, инфекции SARS-CoV-2 или во время вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно, инфекции SARS-CoV-2 может быть вызван дефицит ААТ, предпочтительно более низкий уровень эндогенного ААТ вызван дефицитом ААТ до вирусной инфекции, предпочтительно инфекции коронавируса, более предпочтительно инфекции SARS-CoV-2. Дефицит ААТ - это состояние, которое наследуется по аутосомно-ко доминантному типу. Кодоминантность означает, что две разные версии гена могут быть активными (экспрессироваться), и обе версии вносят вклад в генетический признак. Наиболее распространенная версия (аллель) гена SERPINA1, называемая М, производит нормальные уровни альфа-1-антитрипсина. Большинство людей в общей популяции имеют две копии аллеля М (ММ) в каждой клетке. Другие версии гена SERPINA1 приводят к снижению уровня альфа-1-антитрипсина. Например, аллель S продуцирует умеренно низкие уровни этого белка, а аллель Z продуцирует очень мало альфа-1 антитрипсина. Люди с двумя копиями аллеля Z (ZZ) в каждой клетке, вероятно, будут иметь дефицит альфа-1 антитрипсина. Люди с комбинацией SZ имеют повышенный риск развития заболеваний легких (таких, как эмфизема), особенно если они курят. По оценкам, во всем мире 161 миллион человек имеют одну копию аллеля S или Z и одну копию аллеля М в каждой клетке (MS или MZ). Люди с комбинацией MS (или SS) обычно производят достаточно альфа-1 антитрипсина для защиты легких. Однако люди с аллелями MZ имеют несколько повышенный риск нарушения функции легких или печени. Субъекты с дефицитом ААТ по настоящему изобретению предпочтительно имеют мутацию ZZ, мутацию SZ, мутацию MS, мутацию MZ или мутацию SS гена SERPINA1, предпочтительно мутацию ZZ. Низкие уровни секреции ААТ в мутации ZZ гена SERPINA1 связаны с неправильной укладкой ААТ и его последующим накоплением в эндоплазматическом ретикулуме (ЭР) гепатоцитов (Crystal 1990), что приводит к прогрессирующему заболеванию печени, поскольку накопление неправильно свернутых ААТ отрицательно влияет на здоровье гепатоцитов, что приводит к их окончательной гибели.
Более низкий уровень эндогенного ААТ во время вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно, инфекции SARS-CoV-2 также может быть вызван вирусной инфекцией, коронавирусной инфекцией или инфекцией SARS-CoV-2 соответственно. То есть уровень эндогенного ААТ у контрольного субъекта может временно увеличиваться во время вирусной инфекции, поскольку здоровые гепатоциты пытаются чрезмерно компенсировать падение эндогенных уровней ААТ, в то время как уровень эндогенного ААТ у субъекта с генетическим дефицитом ААТ ниже из-за к отсутствию или неполному увеличению, вызванному вирусной инфекцией (отсутствие здоровых гепатоцитов).
Более низкий уровень эндогенных ААТ также может быть вызван заболеванием печени, таким как неалкогольная жировая болезнь печени, сахарный диабет 1 или 2 типа (предпочтительно 1 типа), ожирение и сердечно-сосудистые состояния. Накопление отложений жирных кислот в печени приводит к усилению стресса (увеличению IFN-γ), воспалению тканей и последующему повреждению гепатоцитов, вызывая более низкий уровень здоровой секреции ААТ. Как и в случае с другими типами заболеваний печени, важно отметить, что дефицит ААТ со временем приводит к заболеванию печени, поскольку накопление неправильно свернутого ААТ в ER гепатоцитов в конечном итоге вызывает печеночную недостаточность.
В настоящем изобретении протеазой, примирующей спайковый белок, может быть любая протеаза, способная примировать спайковый белок вируса, предпочтительно коронавируса, более предпочтительно SARS-CoV-2. Предпочтительно, чтобы протеиназа примирования спайкового белка была по меньшей мере одной, выбранной из группы, состоящей из транс мембранной протеазы серина подтипа 2 (TMPRSS2), трансмембранной протеазы подтипа 6 (TMPRSS6), катепсина L, катепсина В, пропротеинконвертазы 1 (РС1), трипсина, эластазы, нейтрофильной эластазы, матриптазы и фурина, более предпочтительно TMPRSS2, катепсина L и фурина, еще более предпочтительно катепсина L или фурина. Примирующая протеаза спайкового белка - фурин - также называется ферментом, расщепляющим парные основные аминокислоты (РАСЕ).
Более высокий уровень по меньшей мере одной протеазы, примирующей спайковый белок, предпочтительно катепсина L, описанный здесь, предпочтительно представляет собой уровень мРНК в плазме крови человека или уровень белка в плазме крови человека. Концентрация катепсина L в плазме у здоровых субъектов составляет от 0,2 до 1 нг/мл (т.е. от 10 до 50 пМ при молекулярной массе около 23-24 кДа; (Kirschke 1977 https://febs.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j. 1432-1033.1977.tb11393.x). Более того, известно, что иммунные клетки являются основным источником внеклеточных цистеиновых катепсинов при воспалении, в том числе в головном мозге (Hayashi et al., 2013, von Bernhardi et al., 2015, Wendt et al., 2008, Wendt et al., 2007). Уровень по меньшей мере одного белка протеазы, примирующего спайковый белок, описанного здесь, предпочтительно превышает 0,2, 0,5 или 1 нг/мл в плазме крови человека. Уровень, по меньшей мере, одного описанного здесь протеина, примирующего спайковый белок, предпочтительно выше 10, 20, 30, 40, 50, 75 или 100 пМ, предпочтительно выше 10 или 50 пМ, даже более предпочтительно выше 50 пМ. В этом аспекте, по меньшей мере, одна протеаза(-ы), примирующая спайковый белок, предпочтительно представляет собой катепсин L. В некоторых аспектах, по меньшей мере, одна (несколько) протеаза (протеаз), примирующая(-их) спайковый белок, описанная(-ые) в настоящем документе, представляет(-ют) собой по меньшей мере две, по меньшей мере три, по меньшей мере четыре, по меньшей мере, пять, по меньшей мере, шесть, по меньшей мере, семь, по меньшей мере, восемь, по меньшей мере, девять протеаз, примирующих спайковый белок. В некоторых аспектах, по меньшей мере, одна протеаза(-ы), примирующая(-ие) спайковый белок, описанная в настоящем документе, представляет собой по меньшей мере одну протеазу, выбранную из группы, состоящей из TMPRSS2, катепсина В, катепсина L, трипсина, фурина, РС1, матриптазы, эластазы и эластазы нейтрофилов. В определенных аспектах, по меньшей мере, одна протеаза(-ы), примирующая(-ие) спайковый белок, описанная(-ые) в настоящем документе, представляет(-ют) собой по меньшей мере одну протеазу, выбранную из группы, состоящей из TMPRSS2, катепсина В, катепсина L, трипсина, фурина, PC1 и матриптазы.
В определенных аспектах изобретение относится к композиции для применения согласно изобретению, в которой более высокий уровень по меньшей мере одной протеазы, активирующей спайковый белок, обусловлен возрастом и/или генетической предрасположенностью.
Более высокий уровень, по меньшей мере, одной протеазы примирования спайкового белка может быть вызван возрастом и/или генетической предрасположенностью. В частности, более высокий уровень катепсина В и L, предпочтительно катепсина В, может быть вызван возрастом. В лизосоме могут накапливаться более высокие уровни протеазы спайкового белка, в частности катепсина В и L, более предпочтительно катепсина В. Уровень протеазы примирования спайкового белка выше у интересующих субъектов, с возрастом более 50 лет, предпочтительно более 60 лет, более предпочтительно более 70 лет, даже более предпочтительно более 80 лет и наиболее предпочтительно более 90 лет. Субъекты афроамериканского происхождения могут иметь генетическую предрасположенность к более высоким уровням протеазы, примирующей спайковый белок, в частности фурина. Как показано на Фиг. 2 (а), клетки HeLa различаются по относительной скорости мРНК фурина и катепсина L по сравнению с клетками А549. Клетки HeLa имеют афроамериканское происхождение. Клетки А549 представляют собой эпителиальные клетки дыхательных путей европейского происхождения. Как показано на Фиг. 2(b), клетки HeLa более восприимчивы к проникновению SARS-CoV-2, чем клетки А549 (Фиг. 6), и менее реактивны к лечению ААТ. Генетическая предрасположенность может быть определена путем генетического профилирования отдельных интересующих субъектов.
В определенных аспектах изобретение относится к композиции для применения согласно изобретению, в которой более высокий уровень рецептора АСЕ2 вызван по меньшей мере одним, выбранным из группы инфекции, воспаления, возраста и генетической предрасположенности.
Описанный здесь более высокий уровень рецептора АСЕ 2 предпочтительно представляет собой уровень мРНК в плазме крови человека. Более высокий уровень рецептора АСЕ2 может быть вызван по меньшей мере одним, выбранным из группы, включающей инфекцию, воспаление (например, IFN-γ), возраст и генетическую предрасположенность. Инфекция может представлять собой вирусную инфекцию и/или бактериальную инфекцию, предпочтительно вирусную инфекцию, более предпочтительно коронавирусную инфекцию, еще более предпочтительно инфекцию SARS или SARS-CoV-2. Еще одним примером инфекции является лейшманиоз. Как показано на Фиг. 4 и 5, экспрессия рецептора АСЕ2 повышается в ответ на более высокие уровни IFN-γ, которые, в свою очередь, повышаются в результате иммунного ответа на воспаление. Воспаление может быть вызвано, например, бактериальной и/или вирусной инфекцией, раком, гиперчувствительностью замедленного типа; аутоиммунными заболеваниями (такими, как аутоиммунный энцефаломиелит, ревматоидный артрит, аутоиммунный инсулит (также называемый сахарным диабетом 1 типа), отторжением аллотрансплантата и реакцией трансплантат против хозяина, также это может быть неспецифическое воспаление и выброс цитокинов. Возраст предпочтительно составляет более 50 лет, предпочтительно более 60 лет, более предпочтительно более 70 лет, даже более предпочтительно более 80 лет и наиболее предпочтительно более 90 лет. Примером генетической предрасположенности к высоким уровням IFN-γ является семейная средиземноморская лихорадка. Генетическая предрасположенность может быть определена путем генетического профилирования отдельных интересующих субъектов. Более высокий уровень рецептора АСЕ2, описанный здесь, также может присутствовать в ткани, выбранной из группы, состоящей из легких (Calu3), толстой кишки (СаСо2), печени (HEPG2), почек (HEK-293Т) и головного мозга (SH-SY5Y), что подтверждено кПЦР и показано на Фиг. 3а настоящего изобретения.
В определенных аспектах изобретение относится к композиции для применения согласно изобретению, в которой более высокий уровень IFN-γ вызван по меньшей мере одним, выбранным из группы инфекции, воспаления, возраста и генетической предрасположенности.
Более высокий уровень гамма-интерферона (IFN-γ) согласно iv) предпочтительно представляет собой уровень белка или мРНК в плазме крови человека, более предпочтительно уровень белка в плазме крови человека. У здоровых людей уровень IFN-γ ниже или около предела обнаружения анализов, например, менее 30-50 пг/мл) (Billau 1996; Kimura 2001). IFN-γ продуцируется почти исключительно естественными киллерами (NK), CD4 + и некоторыми CD8+ лимфоцитами. Продукция IFN-γ NK или Т-клетками требует взаимодействия дополнительных клеток, в основном мононуклеарных фагоцитов, которые также должны находиться в некотором состоянии активации (Billiau А. Интерферон-гамма: биология и роль в патогенезе (Interferon-gamma: biology and role in pathogenesis). Adv Immunol. 1996; 62: 61-130. DOI: 10.1016/s0065-2776 (08) 60428-9). Таким образом, воспалительные состояния, приводящие к активации NK-клеток и активации Т-клеток, приводят к увеличению уровней IFN-γ. Ожидается, что состояние воспаления с вовлечением циркулирующих NK или Т-клеток (инфекция, рак) приведет к повышению уровня в плазме.
В следующей таблице представлены значения уровней IFN-γ в плазме при различных состояниях.
Уровень белка IFN-γ в плазме крови человека согласно iv) предпочтительно выше 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 75, 100, 125, 150, 200, 300, 400 или 500 пг/мл. Более высокий уровень IFN-γ предпочтительно вызван по меньшей мере одним, выбранным из группы, состоящей из инфекции, воспаления, возраста и генетической предрасположенности, более предпочтительно воспаления. Инфекция может представлять собой вирусную инфекцию и/или бактериальную инфекцию, предпочтительно вирусную инфекцию, более предпочтительно коронавирусную инфекцию, еще более предпочтительно инфекцию SARS или SARS-CoV-2. Еще одним примером инфекции является лейшманиоз. Воспаление может быть вызвано, например, бактериальной и/или вирусной инфекцией, раком, гиперчувствительностью замедленного типа; аутоиммунными заболеваниями (такими, как аутоиммунный энцефаломиелит, ревматоидный артрит, аутоиммунный инсулит (также называемый сахарным диабетом 1 типа), отторжением аллотрансплантата и реакцией трансплантат против хозяина, также это может быть неспецифическое воспаление и выброс цитокинов. Возраст предпочтительно составляет более 50 лет, предпочтительно более 60 лет, более предпочтительно более 70 лет, даже более предпочтительно более 80 лет и наиболее предпочтительно более 90 лет. Примером генетической предрасположенности к высоким уровням IFN-γ является семейная средиземноморская лихорадка. Генетическая предрасположенность может быть определена путем генетического профилирования отдельных интересующих субъектов.
Соответственно, изобретение, по крайней мере частично, основано на неожиданном открытии того, что композиции, содержащие ААТ, а также rhAAT, его варианты, изоформы и/или фрагменты, уменьшают как пролиферацию вируса, так и воспаление, в частности воспаление, связанное с IFN-γ.
В одном аспекте «субъект, нуждающийся в этом», т.е. интересующий субъект, имеет два симптома, выбранных из следующей группы:
1. более низкий уровень эндогенного альфа-антитрипсина (ААТ) до вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно инфекции SARS-CoV2 или во время вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно SARS-CoV-2 по сравнению с хотя бы одним субъектом во время вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно инфекции SARS-CoV-2, которая протекает бессимптомно или имеет легкие симптомы
2. более высокий уровень по крайней мере одной протеазы, примирующей спайковый белок, до вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно, инфекции SARS-CoV-2 или во время вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно SARS-CoV-2 инфекция по сравнению с хотя бы одним субъектом во время вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно инфекции SARS-CoV-2, которая протекает бессимптомно или имеет легкие симптомы,
3. более высокий уровень ангиотензинпревращающего фермента 2 (рецептор АСЕ2) у субъекта до вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно инфекции SARS-CoV-2, или во время вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно инфекции SARS-CoV-2, по сравнению с по меньшей мере одним субъектом во время вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно инфекции SARS-CoV-2, который является бессимптомным или имеет легкие симптомы, и
4. более высокий уровень гамма-интерферона (IFN-γ) у субъекта до вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно инфекции- SARS-CoV2 или во время вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно SARS-CoV-2 по сравнению с хотя бы одним субъектом во время вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно инфекции SARS-CoV-2, которая протекает бессимптомно или имеет легкие симптомы.
Таким образом, «нуждающийся в этом субъект» может иметь
1. более низкий уровень эндогенного альфа-антитрипсина (ААТ) до вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно инфекции SARS-CoV2 или во время вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно SARS-CoV -2 по сравнению с хотя бы одним субъектом во время вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно инфекции SARS-CoV-2, которая протекает бессимптомно или имеет легкие симптомы
2. более высокий уровень по крайней мере одной протеазы, примирующей спайковый белок, до вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно, инфекции SARS-CoV-2 или во время вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно SARS-CoV-2 инфекция по сравнению с хотя бы одним субъектом во время вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно инфекции SARS-CoV-2, которая протекает бессимптомно или имеет легкие симптомы,
Предпочтительно в этом аспекте уровень белка ААТ в плазме крови человека, описанный в настоящем документе, ниже 52 мкМ, а уровень белка L-катепсина в плазме крови человека выше 10 пМ.
В другом аспекте «нуждающийся в этом субъект» может иметь
1. более низкий уровень эндогенного альфа-антитрипсина (ААТ) до вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно инфекции SARS-CoV-2 или во время инфекции SARS-CoV-2, по сравнению с по крайней мере одним субъектом во время вирусной инфекции предпочтительно коронавирусная инфекция, более предпочтительно инфекция SARS-CoV-2, которая протекает бессимптомно или имеет легкие симптомы, а также
2. более высокий уровень ангиотензинпревращающего фермента 2 (рецептор АСЕ2) у субъекта до вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно инфекции SARS-CoV-2, или во время вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно инфекции SARS-CoV-2, по сравнению с по меньшей мере одним субъектом во время вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно инфекции SARS-CoV-2, который является бессимптомным или имеет легкие симптомы.
В еще одном аспекте «нуждающийся в этом субъект» может иметь
1. более низкий уровень эндогенного альфа-антитрипсина (ААТ) до вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно инфекции SARS-CoV2 или во время вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно SARS-CoV-2 по сравнению с хотя бы одним субъектом во время вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно инфекции SARS-CoV-2, которая протекает бессимптомно или имеет легкие симптомы
2. более высокий уровень гамма-интерферона (IFN-γ) у субъекта до вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно инфекции- SARS-CoV2 или во время вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно SARS-CoV -2 по сравнению с хотя бы одним субъектом во время вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно инфекции SARS-CoV-2, которая протекает бессимптомно или имеет легкие симптомы.
В этих аспектах 1 и 4 могут быть по меньшей мере одним заболеванием или состоянием, выбранным из группы, состоящей из дефицита ААТ, заболевания печени, такого как неалкогольная жировая болезнь печени, диабет, ожирение и сердечно-сосудистое заболевание. В некоторых аспектах изобретение относится к композиции для применения согласно изобретению, отличающейся тем, что более высокий уровень IFN-γ вызван по меньшей мере одним заболеванием или состоянием, выбранным из группы, состоящей из ААТ-дефицита, заболевания печени, такого как неалкогольная жировая болезнь печени, диабет, ожирение и сердечно-сосудистое заболевание. В некоторых аспектах изобретение относится к композиции для применения согласно изобретению, отличающейся тем, что более низкий уровень ААТ вызван по меньшей мере одним заболеванием или состоянием, выбранным из группы, состоящей из дефицита ААТ, заболевания печени, такого как неалкогольный жировая болезнь печени, диабет, ожирение и сердечно-сосудистые заболевания. Диабет может быть сахарным диабетом 1 или 2 типа. Заболеванием печени может быть вызванное ацетаминофеном повреждение печени, тяжелый хронический гепатит, алкогольная болезнь печени (ALD), охватывающая широкий спектр фенотипов, включая простой стеатоз, стеатогепатит, фиброз и цирроз печени или даже НСС (гепатоцеллюлярная карцинома). Сердечно-сосудистое состояние может быть любым состоянием, вызванным внезапным снижением или блокировкой кровотока к сердцу, сердечной недостаточностью, острым коронарным синдромом (ОКС), а также у пациентов с острым инфарктом миокарда, при этом фракция выброса левого желудочка обратно коррелирует с концентрацией ААТ в сыворотке, что позволяет предположить, что систолическая дисфункция связана с воспалительной реакцией.
Предпочтительно в этом аспекте уровень белка ААТ в плазме крови человека, описанный здесь, ниже 52 мкМ, а уровень белка IFN-γ в плазме крови человека, описанный в настоящем документе, выше 0,19 пМ.
В дополнительном аспекте «субъект, нуждающийся в этом», т.е. интересующий субъект, имеет два симптома, выбранных из следующей группы:
1. более высокий уровень по крайней мере одной протеазы, примирующей спайковый белок, до вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно, инфекции SARS-CoV-2 или во время вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно SARS-CoV-2 инфекция по сравнению с хотя бы одним субъектом во время вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно инфекции SARS-CoV-2, которая протекает бессимптомно или имеет легкие симптомы,
2. более высокий уровень ангиотензинпревращающего фермента 2 (рецептор АСЕ2) у субъекта до вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно инфекции SARS-CoV-2, или во время вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно инфекции SARS-CoV-2, по сравнению с по меньшей мере одним субъектом во время вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно инфекции SARS-CoV-2, который является бессимптомным или имеет легкие симптомы, и
3. более высокий уровень гамма-интерферона (IFN-γ) у субъекта до вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно инфекции- SARS-CoV2 или во время вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно SARS-CoV-2 по сравнению с хотя бы одним субъектом во время вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно инфекции SARS-CoV-2, которая протекает бессимптомно или имеет легкие симптомы.
В еще одном аспекте «нуждающийся в этом субъект» может иметь
1. более высокий уровень по крайней мере одной протеазы, примирующей спайковый белок, до вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно, инфекции SARS-CoV-2 или во время вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно SARS-CoV-2 инфекция по сравнению с хотя бы одним субъектом во время вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно инфекции SARS-CoV-2, которая протекает бессимптомно или имеет легкие симптомы, а также
2. более высокий уровень ангиотензинпревращающего фермента 2 (рецептор АСЕ2) у субъекта до вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно инфекции SARS-CoV-2, или во время вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно инфекции SARS-CoV-2, по сравнению с по меньшей мере одним субъектом во время вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно инфекции SARS-CoV-2, который является бессимптомным или имеет легкие симптомы.
В еще одном аспекте «нуждающийся в этом субъект» может иметь
1. более высокий уровень по крайней мере одной протеазы, примирующей спайковый белок, до вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно, инфекции SARS-CoV-2 или во время вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно SARS-CoV-2 инфекция по сравнению с хотя бы одним субъектом во время вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно инфекции SARS-CoV-2, которая протекает бессимптомно или имеет легкие симптомы, а также
2. более высокий уровень гамма-интерферона (IFN-γ) у субъекта до вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно инфекции- SARS-CoV2 или во время вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно SARS-CoV-2 по сравнению с хотя бы одним субъектом во время вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно инфекции SARS-CoV-2, которая протекает бессимптомно или имеет легкие симптомы.
В еще одном аспекте «нуждающийся в этом субъект» может иметь
1. более высокий уровень ангиотензинпревращающего фермента 2 (рецептор АСЕ2) у субъекта до вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно инфекции SARS-CoV-2, или во время вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно инфекции SARS-CoV-2, по сравнению с по меньшей мере одним субъектом во время вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно инфекции SARS-CoV-2, который является бессимптомным или имеет легкие симптомы, и
2. более высокий уровень гамма-интерферона (IFN-γ) у субъекта до вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно инфекции- SARS-CoV2 или во время вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно SARS-CoV -2 по сравнению с хотя бы одним субъектом во время вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно инфекции SARS-CoV-2, которая протекает бессимптомно или имеет легкие симптомы.
В дополнительном аспекте «субъект, нуждающийся в этом», т.е. интересующий субъект, имеет три симптома, выбранных из следующей группы:
1. более низкий уровень эндогенного альфа-антитрипсина (ААТ) до вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно инфекции SARS-CoV2 или во время вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно SARS-CoV -2 по сравнению с хотя бы одним субъектом во время вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно инфекции SARS-CoV-2, которая протекает бессимптомно или имеет легкие симптомы
2. более высокий уровень по крайней мере одной протеазы, примирующей спайковый белок, до вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно, инфекции SARS-CoV-2 или во время вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно SARS-CoV-2 инфекция по сравнению с хотя бы одним субъектом во время вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно инфекции SARS-CoV-2, которая протекает бессимптомно или имеет легкие симптомы,
3. более высокий уровень ангиотензинпревращающего фермента 2 (рецептор АСЕ2) у субъекта до вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно инфекции SARS-CoV-2, или во время вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно инфекции SARS-CoV-2, по сравнению с по меньшей мере одним субъектом во время вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно инфекции SARS-CoV-2, который является бессимптомным или имеет легкие симптомы, и
4. более высокий уровень гамма-интерферона (IFN-γ) у субъекта до вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно инфекции- SARS-CoV2 или во время вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно SARS-CoV-2 по сравнению с хотя бы одним субъектом во время вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно инфекции SARS-CoV-2, которая протекает бессимптомно или имеет легкие симптомы.
Таким образом, «нуждающийся в этом субъект» может иметь
1. более низкий уровень эндогенного альфа-антитрипсина (ААТ) до вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно инфекции SARS-CoV2 или во время вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно SARS-CoV-2 по сравнению с хотя бы одним субъектом во время вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно инфекции SARS-CoV-2, которая протекает бессимптомно или имеет легкие симптомы,
2. более высокий уровень по крайней мере одной протеазы, примирующей спайковый белок, до вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно, инфекции SARS-CoV-2 или во время вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно SARS-CoV-2 инфекция по сравнению с хотя бы одним субъектом во время вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно инфекции SARS-CoV-2, которая протекает бессимптомно или имеет легкие симптомы, а также
3. более высокий уровень ангиотензинпревращающего фермента 2 (рецептор АСЕ2) у субъекта до вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно инфекции SARS-CoV-2, или во время вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно инфекции SARS-CoV-2, по сравнению с по меньшей мере одним субъектом во время вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно инфекции SARS-CoV-2, который является бессимптомным или имеет легкие симптомы.
В другом аспекте «нуждающийся в этом субъект» может иметь
1. более низкий уровень эндогенного альфа-антитрипсина (ААТ) до вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно инфекции SARS-CoV2 или во время вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно SARS-CoV-2 по сравнению с хотя бы одним субъектом во время вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно инфекции SARS-CoV-2, которая протекает бессимптомно или имеет легкие симптомы,
2. более высокий уровень по крайней мере одной протеазы, примирующей спайковый белок, до вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно, инфекции SARS-CoV-2 или во время вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно SARS-CoV-2 инфекция по сравнению с хотя бы одним субъектом во время вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно инфекции SARS-CoV-2, которая протекает бессимптомно или имеет легкие симптомы, а также
3. более высокий уровень гамма-интерферона (IFN-γ) у субъекта до вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно инфекции- SARS-CoV2 или во время вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно SARS-CoV-2 по сравнению с хотя бы одним субъектом во время вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно инфекции SARS-CoV-2, которая протекает бессимптомно или имеет легкие симптомы.
Предпочтительно в этом аспекте уровень белка ААТ в плазме крови человека, описанный в настоящем документе, ниже 36 мкМ, уровень белка L катепсина в плазме крови человека, описанный в настоящем документе, выше 10 пМ, уровень белка IFN-γ в плазме крови человека, описанный в настоящем документе, выше 0,19 мМ.
Более предпочтительно, в этом аспекте уровень белка ААТ в плазме крови человека, описанный в настоящем документе, ниже 52 мкМ, уровень белка L катепсина в плазме крови человека, описанный в настоящем документе, выше 10 пМ, уровень белка IFN-γ в плазме крови человека, описанный в настоящем документе, превышает 0,19 мМ.
В другом аспекте «нуждающийся в этом субъект» может иметь
1. более высокий уровень по крайней мере одной протеазы, примирующей спайковый белок, до вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно, инфекции SARS-CoV-2 или во время вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно SARS-CoV-2 инфекция по сравнению с хотя бы одним субъектом во время вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно инфекции SARS-CoV-2, которая протекает бессимптомно или имеет легкие симптомы,
2. более высокий уровень ангиотензинпревращающего фермента 2 (рецептор АСЕ2) у субъекта до вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно инфекции SARS-CoV-2, или во время вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно инфекции SARS-CoV-2, по сравнению с по меньшей мере одним субъектом во время вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно инфекции SARS-CoV-2, который является бессимптомным или имеет легкие симптомы, и
3. более высокий уровень гамма-интерферона (IFN-γ) у субъекта до вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно инфекции- SARS-CoV2 или во время вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно SARS-CoV -2 по сравнению с хотя бы одним субъектом во время вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно инфекции SARS-CoV-2, которая протекает бессимптомно или имеет легкие симптомы.
В дополнительном аспекте «нуждающийся в этом субъект», т.е. интересующий субъект, имеет
1. более низкий уровень эндогенного альфа-антитрипсина (ААТ) до вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно инфекции SARS-CoV2 или во время вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно SARS-CoV -2 по сравнению с хотя бы одним субъектом во время вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно инфекции SARS-CoV-2, которая протекает бессимптомно или имеет легкие симптомы
2. более высокий уровень по крайней мере одной протеазы, примирующей спайковый белок, до вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно, инфекции SARS-CoV-2 или во время вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно SARS-CoV-2 инфекция по сравнению с хотя бы одним субъектом во время вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно инфекции SARS-CoV-2, которая протекает бессимптомно или имеет легкие симптомы,
3. более высокий уровень ангиотензинпревращающего фермента 2 (рецептор АСЕ2) у субъекта до вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно инфекции SARS-CoV-2, или во время вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно инфекции SARS-CoV-2, по сравнению с по меньшей мере одним субъектом во время вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно инфекции SARS-CoV-2, который является бессимптомным или имеет легкие симптомы, и
4. более высокий уровень гамма-интерферона (IFN-γ) у субъекта до вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно инфекции- SARS-CoV2 или во время вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно SARS-CoV -2 по сравнению с хотя бы одним субъектом во время вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно инфекции SARS-CoV-2, которая протекает бессимптомно или имеет легкие симптомы.
Белок ААТ в композиции для применения по настоящему изобретению может включать белок ААТ плазмы, его вариант, изоформу и/или фрагмент; или рекомбинантный белок ААТ, его вариант, изоформу и/или фрагмент. Предпочтительно белок ААТ, его вариант, изоформа и/или фрагмент представляет собой рекомбинантный белок ААТ, его вариант, изоформу и/или фрагмент. Белок ААТ плазмы предпочтительно получают из белка ААТ плазмы крови, более предпочтительно из плазмы крови человека (также называемого ААТ, экстрагированным из плазмы человека). В определенных аспектах изобретение относится к композиции для применения согласно изобретению, отличающейся тем, что белок альфа1-антитрипсин (ААТ), его вариант, изоформа и/или фрагмент представляет собой рекомбинантный альфа1-антитрипсин (также называемый rhAAT), его вариант, изоформу и/или фрагмент.
Рекомбинантный белок ААТ продуцируется рекомбинантно, например, в клетках СНО, клетках HEK (HEK293 и/или HEK293T) или клетках Е. coli. Фармацевтические компании по всему миру получают белок ААТ из плазмы крови человека для лечения дефицита ААТ, наследственного заболевания. ААТ, полученный из плазмы, одобрен FDA и ЕМА. Предпочтительно белок ААТ по изобретению имеет аминокислотную последовательность человека, наиболее предпочтительно такую, как указано в SEQ ID NO (Порядковом номере последовательности): 1 (см. Таблицу 1). Рекомбинантный белок ААТ, его вариант, изоформа и/или фрагмент предпочтительно не содержат Fc-домена и/или гистидиновой метки (His-метки).
Автор(ы) обнаружили, что рекомбинантный ААТ (rhAAT, продуцируемый в СНО) связывается с ААТ-антителом с другим сродством (Фиг. 17) и имеет более выраженный биологический эффект, чем ААТ, полученный из плазмы. В частности, рекомбинантный ААТ (rhAAT) ингибирует слияние клеток, опосредованное АСЕ2/спайковым белком (Фиг. 14), более эффективно, чем ААТ, полученный из плазмы, и имеет другой профиль ферментативного ингибирования (Фиг. 16).
Соответственно, изобретение, по крайней мере частично, основано на неожиданном открытии того, что рекомбинантный ААТ (rhAAT), продуцируемый в клетках СНО, особенно эффективен для использования при лечении и/или профилактике заболевания или синдрома, связанного с вирусной инфекцией, предпочтительно коронавирусной инфекцией, более предпочтительно инфекцией SARS-CoV-2.
В определенных аспектах изобретение относится к композиции для применения согласно изобретению, отличающейся тем, что белок альфа-1-антитрипсин (ААТ), его вариант, изоформа и/или фрагмент представляет собой рекомбинантный альфа-1-антитрипсин, продуцируемый в клетках человека (например, клетки HEK293 или HEK293T, см. Пример 23).
Автор (ы) обнаружили, что рекомбинантный ААТ, продуцируемый в клетках человека, особенно в HEK293 (rhAAT без His-метки), особенно эффективен в снижении ферментативной активности катепсина L (Фиг. 16b), трипсина (Фиг. 16с), фурина. (Фиг. 16d) и нейтрофильная эластаза (Фиг. 16i) по сравнению с рекомбинантным ААТ (rhAAT), продуцируемым в клетках СНО, а также с ААТ, полученным из плазмы.
Соответственно, изобретение, по крайней мере частично, основано на неожиданном открытии того факта, что рекомбинантный ААТ, продуцируемый в клетках человека, особенно в HEK293, особенно эффективен для использования при лечении и/или профилактике заболевания или синдрома, связанного с вирусной инфекцией, предпочтительно коронавирусной инфекцией, более предпочтительно инфекцией SARS-CoV-2.
В определенных аспектах изобретение относится к композиции для применения согласно изобретению, отличающейся тем, что белок альфа-1-антитрипсин (ААТ), его вариант, изоформа и/или фрагмент представляет собой рекомбинантный альфа-1-антитрипсин (rhAAT, продуцируемый в СНО), имеющий более сильно отличающийся от человеческого гликановый профиль. В некоторых аспектах описанный здесь профиль гликанов, не относящийся к человеческому, представляет собой профиль гликанов, полученных из клеток млекопитающих, и/или профиль гликанов, полученный с модифицированной схемой гликозилирования. Стратегии с модифицированной схемой гликозилирования, например, используемые для уменьшения фукозилирования и/или усиления сиалирования гликопротеинов, известны специалисту в данной области. В некоторых аспектах описанный здесь профиль гликанов, не относящихся к человеку, представляет собой профиль гликанов, полученных из клеток СНО. Клетки СНО экспрессируют другой аппарат гликозилирования, чем клетки человека, что приводит к разному составу гликанов на поверхности рекомбинантных белков (Фиг. 24) (Lalonde, ME, & Durocher, Y., 2017, Journal of biotechnology, 251, 128-140).
В определенных аспектах изобретение относится к композиции для применения согласно изобретению, отличающейся тем, что белок ААТ, его вариант, изоформа и/или фрагмент представляет собой рекомбинантный ААТ, продуцируемый рХС-17.4 (GS System, Lonza), его вариант, изоформу и/или фрагмент.
Автор (ы) обнаружили, что рекомбинантный ААТ, продуцируемый рХС-17.4 (GS System, Lonza) в СНО (Рекомбинантный ААТ 1), вызывает более выраженный ингибирующий эффект на активность эластазы (Фиг. 16h) и нейтрофильной эластазы (Фиг. 16i), чем плазменный ингибитор альфа1-протеиназы (полученный из плазмы ААТ) и рекомбинантный ААТ, продуцируемый PL136/PL137 (pCGS3, Merck) в СНО (рекомбинантный ААТ 2).
Соответственно, изобретение, по крайней мере частично, основано на неожиданном открытии, что определенные формы рекомбинантного ААТ (rhAAT) особенно эффективны для использования при лечении и/или профилактике заболевания или синдрома, связанного с вирусной инфекцией, предпочтительно коронавирусной инфекцией, более предпочтительно инфекцией SARS-CoV-2.
В контексте настоящего описания термин «фрагмент» белка, пептида или полипептида ААТ по изобретению относится к последовательности, содержащей меньшее количество аминокислот по длине, чем белок, пептид или полипептид ААТ по изобретению, в частности, меньше аминокислот, чем последовательность ААТ, как указано в SEQ ID NO: 1. Фрагмент предпочтительно представляет собой функциональный фрагмент, например фрагмент с такой же биологической активностью, что и белок ААТ, как указано в SEQ ID NO: 1. Функциональный фрагмент предпочтительно происходит из белка ААТ, как указано в SEQ ID NO: 1. Можно использовать любой фрагмент ААТ, если он проявляет те же свойства, т.е. является биологически активным, что и нативная последовательность ААТ, из которой он происходит.
Предпочтительно (функциональный) фрагмент имеет около 5 последовательных аминокислот, по меньшей мере около 7 последовательных аминокислот, по меньшей мере около 15 последовательных аминокислот, по меньшей мере около 20 последовательных аминокислот, по меньшей мере около 25 последовательных аминокислот, по меньшей мере, около 20 последовательных аминокислот, по меньшей мере, около 30 последовательных аминокислот, по меньшей мере, около 35 последовательных аминокислот, по меньшей мере, около 40 последовательных аминокислот, по меньшей мере, около 45 последовательных аминокислот, по меньшей мере, около 50 последовательные аминокислоты, по меньшей мере, около 55 последовательных аминокислот, по меньшей мере, около 60 последовательных аминокислот, по меньшей мере, около 100 последовательных аминокислот, по меньшей мере, около 150 последовательных аминокислот, по меньшей мере, около 200 последовательных аминокислот, по меньшей мере около 300 последовательных аминокислот и т.д. или более из нативной аминокислотной последовательности ААТ человека, как указано в SEQ ID NO: 1. В некоторых аспектах описанный здесь (функциональный) фрагмент содержит сигнальный белок с оптимизированной экспрессией (например, пример 24)
Функциональный фрагмент ААТ может содержать или состоять из С-концевого фрагмента ААТ, как указано в SEQ ID NO: 2. С-концевой фрагмент SEQ ID NO: 2 состоит из аминокислот 374-418 SEQ ID NO: 1.
Более предпочтительно, чтобы фрагмент ААТ представлял собой фрагмент, содержащий меньше аминокислот по длине, чем С-концевая последовательность ААТ 374-418 (SEQ ID NO: 2). Альтернативно, фрагмент ААТ по существу состоит из SEQ ID NO: 2.
Термин «вариант» относится к белку, пептиду или полипептиду, имеющему аминокислотную последовательность, которая в некоторой степени отличается от пептида с нативной последовательностью ААТ, то есть аминокислотной последовательности, которая отличается от нативной последовательности ААТ аминокислотными заменами, при этом одна или несколько аминокислот заменены другими с такими же характеристиками и конформационными ролями. Предпочтительно вариант настоящего изобретения по меньшей мере на 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90% или 85% гомологичен аминокислотам SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2. Вариант также может иметь по меньшей мере 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90% или 85% идентичности последовательности с аминокислотами SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2. Варианты аминокислотной последовательности могут иметь замены, делеции и/или вставки в определенных положениях в аминокислотной последовательности нативной аминокислотной последовательности, например, в N- или С-концевой последовательности или в аминокислотной последовательности. Замены также могут быть консервативными, в этом случае консервативные аминокислотные замены здесь определены как замены в одной из следующих пяти групп:
I. Небольшие алифатические, неполярные или слабополярные остатки: Ala, Ser, Thr, Pro, Gly
II. Полярные, положительно заряженные остатки: His, Arg, Lys
III. Полярные отрицательно заряженные остатки и их амиды: Asp, Asn, Glu, Gln
IV. Большие ароматические остатки: Phe, Tyr, Trp
V. Большие алифатические неполярные остатки: Met, Leu, Ile, Val, Cys.
«Гомология» относится к проценту идентичности между двумя полинуклеотидными или двумя полипептидными фрагментами. Две нуклеиновые кислоты или две полипептидные последовательности являются «по существу гомологичными» друг другу, когда последовательности демонстрируют, по меньшей мере, примерно 50% идентичности последовательностей, предпочтительно, по меньшей мере, примерно 75% идентичности последовательностей, более предпочтительно, по меньшей мере, примерно 80% или по меньшей мере примерно 85% Идентичность последовательностей, более предпочтительно, по меньшей мере, примерно 90% идентичности последовательностей и наиболее предпочтительно, по меньшей мере, примерно 95% -98% идентичности последовательностей на определенной длине молекул. В контексте настоящего описания термин «практически гомологичный» также относится к последовательностям, демонстрирующим полную идентичность указанной последовательности.
В общем, «идентичность» относится к точному соответствию нуклеотида с нуклеотидом или от аминокислоты к аминокислоте двух полинуклеотидных или полипептидных последовательностей соответственно. Процент идентичности можно определить путем прямого сравнения информации о последовательностях между двумя молекулами путем выравнивания последовательностей, подсчета точного количества совпадений между двумя выровненными последовательностями, деления на длину более короткой последовательности и умножения результата на 100.
Альтернативно, гомологию можно определить с помощью легкодоступных компьютерных программ или путем гибридизации полинуклеотидов в условиях, которые образуют стабильные дуплексы между гомологичными областями, с последующим расщеплением одноцепочечной специфической нуклеазой (ами) и определением размера расщепленных фрагментов. Последовательности ДНК, которые по существу гомологичны, можно идентифицировать в эксперименте по Саузерн-гибридизации, например, в жестких условиях, как определено для этой конкретной системы. Определение подходящих условий гибридизации находится в компетенции специалиста в данной области.
В некоторых аспектах изобретение относится к композиции для применения согласно изобретению, в которой фрагмент альфа1-антитрипсина представляет собой фрагмент С-концевой последовательности или любую их комбинацию.
Пептидные варианты могут быть линейными пептидами или циклическими пептидами и могут быть выбраны из группы, включающей короткие циклические пептиды, полученные из С-концевой последовательности, как указано в SEQ ID No. 2. Предпочтительно короткие циклические пептиды, полученные из С-концевой последовательности Alphal-антитрипсина, будут выбраны из неограничивающей группы, включающей цикло-(CPFVFLM)-SH, цикло-(CPFVFLE)-SH, цикло-(CPFVFLR)-SH и цикло-(CPEVFLM)-SH или любую их комбинацию.
Используемый здесь термин «изоформа» белка, пептида или полипептида ААТ по изобретению относится к варианту сплайсинга, полученному в результате альтернативного сплайсинга мРНК ААТ.
В некоторых аспектах аминокислотная последовательность ААТ, его варианта, изоформы или фрагмента, как описано в данном документе, по меньшей мере на 80% идентична соответствующей аминокислотной последовательности в SEQ ID NO: 1. В некоторых аспектах аминокислотная последовательность ААТ, его варианта, изоформы или фрагмента составляет 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичны соответствующей аминокислотной последовательности в SEQ ID NO: 1.
Пептид, изоформа, фрагмент или их вариант по настоящему изобретению предпочтительно может быть конъюгирован с агентом, который увеличивает накопление пептида, изоформы, фрагмента или его варианта в клетке-мишени, предпочтительно клетке дыхательных путей. Таким агентом может быть соединение, которое индуцирует опосредованный рецептором эндоцитоз, такой как, например, опосредованный рецептором трансферина эндоцитоз трансферрина, конъюгированного с терапевтическими лекарственными средствами (Qian Z.М. et al., «Направленная доставка лекарственного средства через путь эндоцитоза, опосредованный рецептором трансферрина (Targeted drug delivery via the transferrin receptor-mediated endocytosis pathway)» Pharmacological Reviews, 54, 561, 2002) или проницаемый для клеточной мембраны носитель, который может быть выбран, например, из группы жирных кислот, таких как декановая кислота, миристиновая кислота и стеариновая кислота, которые уже использовались для внутриклеточной доставки пептидных ингибиторов протеинкиназы. С (Ioannides CG et al., «Ингибирование индукции рецептора IL-2 и продукции IL-2 в линии лейкозных клеток человека Jurkat с помощью нового пептидного ингибитора протеинкиназы С (Inhibition of IL-2 receptor induction and IL-2 production in the human leukemic cell line Jurkat by a novel peptide inhibitor of protein kinase C)» Cell Immunol., 131, 242, 1990) и протеинтирозинфосфатазы (Kole H.K. et al., «Пептидный ингибитор протеинтирозинфосфатазы специфически усиливает функцию рецептора инсулина в интактных клетках (A peptide-based protein-tyrosine phosphatase inhibitor specifically enhances insulin receptor function in intact cells)» J. Biol. Chem. 271, 14302, 1996) или среди пептидов. Предпочтительно использовать носители, проницаемые для клеточной мембраны. Более предпочтительно использовать пептид-носитель, проницаемый для клеточной мембраны.
В случае, если носитель, проницаемый для клеточной мембраны, представляет собой пептид, то предпочтительно это будет положительно заряженный пептид, обогащенный аминокислотами.
Предпочтительно такой положительно заряженный пептид, обогащенный аминокислотами, представляет собой пептид, богатый аргинином. Это было показано в Futaki et al. (Futaki S. et al., «Пептиды, богатые аргинином. Обильный источник проницаемых для мембран пептидов, обладающих потенциалом в качестве носителей для доставки внутриклеточного белка (Arginine-rich peptides. An abundant source of membrane-permeable peptides having potential as carriers for intracellular protein delivery)» J. Biol. Chem., 276, 5836, 2001), что количество остатков аргинина в пептиде-носителе, проницаемом через клеточную мембрану, оказывает значительное влияние на метод интернализации и что, по-видимому, существует оптимальное количество остатков аргинина для интернализации, предпочтительно они содержат более 6 аргининов, более предпочтительно они содержат 9 аргининов. Пептид, богатый аргинином, предпочтительно содержит по меньшей мере 6 аргининов, более предпочтительно по меньшей мере 9 аргининов.
Пептид, изоформа, фрагмент или вариант их могут быть конъюгированы с проницаемым для клеточной мембраны носителем с помощью спейсера (например, двух остатков глицина). В этом случае носитель, проницаемый для клеточной мембраны, предпочтительно представляет собой пептид.
Обычно пептиды, богатые аргинином, выбирают из неограничивающей группы, включающей пептид HIV-TAT 48-57 (GRKKRRQRRR; SEQ ID NO. 7), пептид FHV-покрытия 35-49 (RRRRNRTRRNRRRVR; SEQ ID NO. 8), Пептид HTLV-II Rex 4-16 (TRRQRTRRARRNR; SEQ ID NO. 9) и пептид BMV gag 7-25 (SEQ ID NO. 10).
Может быть использован любой проницаемый для клеточной мембраны носитель, как определено специалистом в данной области.
Поскольку неотъемлемой проблемой нативных пептидов (в L-форме) является деградация естественными протеазами, пептид, изоформа, фрагмент или его вариант, а также пептид, проницаемый через клеточную мембрану, по настоящему изобретению могут быть приготовлены с включением D-форм и/или «ретро-инверсо-изомеры» пептида. В этом случае получают ретро-инверсные изомеры фрагментов и вариантов пептида, а также пептида, проницаемого через клеточную мембрану, по настоящему изобретению.
Пептид, изоформа, фрагмент или его вариант по настоящему изобретению, необязательно конъюгированный с агентом, который увеличивает накопление пептида в клетке, может быть получен различными способами и методами, известными в данной области, такими как, например, химический синтез или рекомбинантный методы, описанные в Maniatis et al. 1982, Молекулярное клонирование, лабораторное руководство, лаборатория Колд-Спринг-Харбор.
Пептид, изоформа, фрагмент или его вариант по настоящему изобретению, необязательно конъюгированный с агентом, который увеличивает накопление пептида в клетке, как описано здесь, предпочтительно продуцируются рекомбинантно в системе клеточной экспрессии. Широкое разнообразие одноклеточных клеток-хозяев можно использовать для экспрессии последовательностей ДНК по настоящему изобретению. Эти хозяева могут включать хорошо известных эукариотических и прокариотических хозяев, таких как штаммы Е. coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, грибы, такие как дрожжи, и клетки животных, такие как СНО, YB/20, NSO, SP2/0, Rl. 1, клетки BW и LM, клетки почек африканской зеленой мартышки (например, COS 1, COS 7, BSC1, BSC40 и ВМТ10), клетки насекомых (например, Sf9) и клетки человека и клетки растений в культуре ткани.
Под «терапевтически эффективной дозой или количеством» белка альфа-1-антитрипсина, его варианта, изоформы и/или фрагмента по настоящему изобретению подразумевается количество, которое при введении вызывает положительный терапевтический или профилактический ответ в отношении лечения субъект заболевания или синдрома, связанного с коронавирусной инфекцией.
Термин «коронавирусная инфекция» может относиться к инфекции, вызванной коронавирусом, выбранным из группы, включающей MERS-CoV, SARS-CoV и SARS-CoV-2, а также любой их вариант. В некоторых аспектах вариант SARS-CoV-2, описанный здесь, представляет собой вариант SARS-CoV-2, выбранный из группы Линия В. 1.1.207, Линия В.1.1.7, Кластер 5, вариант 501.V2, Линия Р.1, Линия В. 1.429/CAL.20C, Линия В.1.427, Линия В.1.526, Линия В.1.525, Линия В.1.1.317, Линия В.1.1.318, Линия В. 1.351, Линия В. 1.617 и Линия Р.З. В некоторых аспектах вариант SARS-CoV-2, описанный в данном документе, представляет собой вариант SARS-CoV-2, описанный кладой Nextstrain, выбранной из группы 19А, 20А, 20С, 20G, 20Н, 20В, 20D, 20F, 201 и 20Е. В некоторых аспектах описанный здесь вирус SARS-CoV-2 представляет собой вариант SARS-CoV-2, содержащий по меньшей мере одну мутацию, выбранную из группы D614G, Е484K, N501Y, S477G/N, Р681Н, E484Q, L452R и P614R. В некоторых аспектах вариант SARS-CoV-2, описанный в данном документе, представляет собой вариант SARS-CoV-2, полученный из вариантов, описанных в данном документе. В некоторых аспектах описанный здесь вирус SARS-CoV-2 представляет собой вариант SARS-CoV-2, имеющий не менее 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%. %, 99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8%, 99,9% идентичности последовательности с последовательностью вирусного генома по крайней мере одного варианта S ARS-CoV-2, описанного в настоящем документе.
Коронавирусная инфекция может вызвать инфекцию дыхательных путей, которая приводит к заболеванию или синдрому, который является респираторным синдромом. Респираторный синдром может быть тяжелым острым респираторным синдромом (ТОРС, атипичная пневмония). В некоторых аспектах инфекция SARS-CoV-2 является, по крайней мере, одним из трех клинических течений инфекций, которые можно выделить: (1) легкое заболевание с проявлениями верхних дыхательных путей, (2) не опасная для жизни пневмония и, (3) тяжелое состояние с пневмонией, острым респираторным дистресс-синдромом (ОРДС), тяжелым системным воспалением, органной недостаточностью, сердечно-сосудистыми осложнениями.
Композиция для применения по изобретению может дополнительно содержать один или несколько фармацевтически приемлемых разбавителей или носителей.
«Фармацевтически приемлемый разбавитель или носитель» означает носитель или разбавитель, который полезен при приготовлении фармацевтической композиции, которая обычно является безопасной, нетоксичной и желательной, и включает носители или разбавители, приемлемые для фармацевтического использования человеком.
Такие фармацевтически приемлемые носители могут представлять собой стерильные жидкости, такие как вода и масла, в том числе нефтяного, животного, растительного или синтетического происхождения, такие как арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло, кунжутное масло и т.п. Вода является предпочтительным носителем при внутривенном введении фармацевтической композиции. Физиологические растворы и водные растворы декстрозы и глицерина также могут быть использованы в качестве жидких носителей, в частности, для инъекционных растворов.
Фармацевтически приемлемый разбавитель или носитель включает крахмал, глюкозу, лактозу, сахарозу, стеарат натрия, моностеарат глицерина, тальк, хлорид натрия, сухое обезжиренное молоко, глицерин, пропиленгликоль, воду, этанол и т.п.
Фармацевтические композиции могут дополнительно содержать одну или несколько фармацевтически приемлемых солей, таких как, например, соль минеральной кислоты, такая как гидрохлорид, гидробромид, фосфат, сульфат и т.д.; и соли органических кислот, такие как ацетаты, пропионаты, малонаты, бензоаты и т.д. Кроме того, здесь также могут присутствовать вспомогательные вещества, такие как смачивающие или эмульгирующие агенты, буферные вещества рН, гели или гелеобразующие материалы, ароматизаторы, красители, микросферы, полимеры, суспендирующие агенты и т.д. Кроме того, также могут присутствовать один или несколько других традиционных фармацевтических ингредиентов, таких как консерванты, увлажнители, суспендирующие агенты, поверхностно-активные вещества, антиоксиданты, агенты, предотвращающие слеживание, наполнители, хелатирующие агенты, агенты покрытия, химические стабилизаторы и т.д., особенно если лекарственная форма восстанавливаемая. Подходящие типичные ингредиенты включают макрокристаллическую целлюлозу, натрийкарбоксиметилцеллюлозу, полисорбат 80, фенилэтбиловый спирт, хиоробутанол, сорбат калия, сорбиновую кислоту, диоксид серы, пропилгаллат, парабены, этилванилин, глицерин, фенол, парахлорфенол, желатин, альбумин и их комбинацию. Подробное обсуждение фармацевтически приемлемых вспомогательных веществ доступно в REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Mack Pub. Co., NJ 1991), который включен сюда в качестве ссылки.
Альтернативно, фармацевтические композиции по изобретению дополнительно содержат один или несколько дополнительных терапевтических агентов. Предпочтительно, один или несколько терапевтических агентов включают терапевтически эффективное количество одного или нескольких нуклеозидных аналогов, ингибитора протеазы, иммуносупрессора (например, сарилумаба или тоцилизумаба), хлорохина, антибиотика гидроксихлорохина, антитела, направленного против структурных компонентов вируса, или его фрагмента (например, пассивная иммунотерапия), интерферона бета (например, интерферона бета-1а) и/или вакцины.
В некоторых других аспектах фармацевтические композиции по изобретению и один или несколько дополнительных терапевтических агентов будут вводиться по существу одновременно или одновременно. Например, субъекту может быть дана фармацевтическая композиция для применения по изобретению во время прохождения курса лечения одним или несколькими дополнительными терапевтическими средствами. Кроме того, предполагается, что субъект уже получил или может одновременно получать другие формы противовирусной терапии.
В некоторых аспектах дополнительный терапевтический агент может быть полезен для уменьшения возможных побочных эффектов, связанных с введением антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по изобретению.
В некоторых аспектах дополнительный терапевтический агент может быть полезен для поддержки эффекта, связанного с введением антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по изобретению.
В некоторых аспектах введение дополнительного терапевтического средства и антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по изобретению приводит к синергетическому эффекту в отношении желаемого эффекта и/или побочного эффекта.
В некоторых аспектах описанный здесь дополнительный терапевтический агент представляет собой по меньшей мере один агент, выбранный из группы аналога нуклеозида, ингибитора протеазы и иммуномодуляторов, таких как иммуносупрессоры.
В некоторых аспектах дополнительный терапевтический агент, описанный в настоящем документе, представляет собой по меньшей мере один агент, выбранный из группы, состоящей из нуклеозидного аналога, ингибитора протеазы, иммуносупрессора (например, сарилумаб или тоцилизумаб), хлорохина, антибиотика гидроксихлорохина, антитела, направленного против структурных компонентов вируса, или его фрагмента (например, пассивная иммунотерапия), интерферона бета (например, интерферона бета-1а) и/или вакцины.
Неограничивающие примеры аналога нуклеозида включают рибавирин, ремдесивир, β-d-N4-гидроксицитидин, ВСХ4430, гемцитабина гидрохлорид, 6-азауридин, мизорибин, флексимер ацикловира и комбинацию одного или нескольких из них.
Неограничивающие примеры ингибитора протеазы включают ингибитор протеазы ВИЧ и/или HCV.
В некоторых аспектах описанный здесь иммуномодулятор представляет собой бета-интерферон. В некоторых аспектах описанный здесь иммуномодулятор представляет собой интерферон бета-1а. Неограничивающие примеры иммуносупрессоров включают ингибиторы интерлейкина, такие как, например, IL-6 (например, сарилумаб или тоцилизумаб), IL-1, IL-12, IL-18 и ингибиторы ФНО-альфа.
Дополнительные терапевтические агенты могут улучшать или дополнять терапевтический эффект композиций и способов, описанных в данном документе (см., например, Фиг. 20, 11d).
Соответственно, изобретение, по крайней мере частично, основано на обнаружении того факта, что определенные комбинации (такие, как IFN-бета-1a с ААТ) улучшают действие ААТ на проникновение вируса и воспаление.
Настоящее изобретение также рассматривает вектор для доставки гена и содержащие его фармацевтические композиции. Предпочтительно вектор для доставки гена находится в форме плазмиды или вектора, который содержит одну или несколько нуклеиновых кислот, кодирующих белок ААТ, его вариант, изоформу и/или фрагмент по настоящему изобретению. Примеры векторов доставки генов включают, например, вирусные векторы, невирусные векторы, носители в виде частиц и липосомы. Доставка гена предпочтительно осуществляется in vitro или ex vivo.
Соответственно, изобретение, по крайней мере частично, основано на открытии того, что доставка гена ААТ (генная терапия) снижает эффект воспаления (см., например, Фиг. 19b).
В одном аспекте указанный вирусный вектор представляет собой вектор, подходящий для доставки генов ex vivo и in vivo, предпочтительно для доставки генов ex vivo. Более предпочтительно, вирусный вектор выбран из группы, включающей аденоассоциированный вирус (AAV) и лентивирус, например лентивирус 1-го, 2-го и 3-го поколений, не исключая других вирусных векторов, таких как аденовирусный вектор, векторы вируса герпеса и т.д. Известны другие средства доставки или носители (такие как дрожжевые системы, микровезикулы, генные пушки/средства прикрепления векторов к наночастицам золота), и в некоторых аспектах предусматривается, что один или несколько вирусных или плазмидных векторов могут быть доставлены через липосомы, наночастицы, экзосомы, микровезикулы или генная пушка.
В других аспектах изобретения фармацевтическая композиция (композиции) по изобретению представляет собой композицию с замедленным высвобождением или композицию, которую вводят с использованием устройства с замедленным высвобождением. Такие устройства хорошо известны в данной области и включают, например, трансдермальные пластыри и миниатюрные имплантируемые насосы, которые могут обеспечивать доставку лекарственного средства в течение длительного времени в непрерывном, стабильном режиме в различных дозах для достижения эффекта замедленного высвобождения с фармацевтической композицией с непродолжительным высвобождением.
Фармацевтические композиции по настоящему изобретению можно вводить субъекту различными путями, включая перорально, парентерально, сублингвально, чрескожно, ректально, чрескожно, местно, через ингаляцию, через буккальное введение, внутриплеврально, внутривенно, внутриартериально, внутрибрюшинно, подкожно, внутримышечно, интраназальный интратекальный и внутрисуставной или их комбинации. Для использования человеком композиция может быть введена в виде подходящего приемлемого состава в соответствии с обычной практикой для человека. Квалифицированный специалист легко определит режим дозирования и способ введения, наиболее подходящий для конкретного пациента. Композиции по настоящему изобретению можно вводить с помощью традиционных шприцев, безыгольных инъекционных устройств, «пистолетов с бомбардировкой микрочастицами» или другими физическими методами, такими как электропорация («ЭП»), «гидродинамический метод» или ультразвук. Композицию также можно вводить путем внутривенной инъекции, внутривенной инфузии, инфузии с помощью дозирующего насоса, ингаляционного назального спрея, глазных капель, пластырей для кожи, препаратов с замедленным высвобождением, генной терапии ex vivo или клеточной терапии ex vivo, предпочтительно внутривенной инъекцией.
Фармацевтические композиции по настоящему изобретению также могут быть доставлены пациенту с помощью нескольких технологий, включая инъекцию ДНК нуклеиновой кислоты, кодирующей белок ААТ, его вариант, изоформу и/или фрагмент по настоящему изобретению (также называемую ДНК-вакцинацией) с электропорацией in vivo и без нее, липосомно-опосредованными, облегченными наночастицами рекомбинантными векторами, такими как рекомбинантный лентивирус, рекомбинантный аденовирус и рекомбинантный аденовирус, ассоциированный с вирусом, как описано в настоящем документе.
Композиции можно вводить внутривенно или местно в легкие или дыхательные пути или подвергать электропорации в интересующей ткани.
Настоящее изобретение также относится к способам лечения и/или профилактики заболевания или синдрома, связанного с коронавирусной инфекцией, у субъекта, нуждающегося в этом, причем способ включает введение терапевтически эффективного количества i) белка альфа-1-антитрипсина, его варианта, изоформы и/или фрагмента, как описано здесь, или ii) фармацевтическая композиция для применения по изобретению, как описано здесь.
Кроме того, предусмотрены способы модулирования начала коронавирусной инфекции у субъекта, подвергшегося воздействию коронавируса или подозреваемого в его воздействии, включающие введение субъекту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества i) белка альфа1-антитрипсина, его варианта, изоформы и/или фрагмента, как описано здесь, или ii) фармацевтическая композиция для применения по изобретению, как описано здесь.
Настоящее изобретение также относится к определению восприимчивости интересующего субъекта к лечению и/или профилактике заболевания или синдрома, связанного с вирусной инфекцией, предпочтительно с коронавирусной инфекцией, более предпочтительно с инфекцией SARS-CoV-2, с использованием композиции содержащий терапевтически эффективное количество белка альфа-1-антитрипсина (ААТ), его варианта, изоформы и/или фрагмента, как определено в данном документе, включая стадии:
a) определение уровня по меньшей мере одного из группы, состоящей из эндогенного альфа-1-антитрипсина, по меньшей мере одной протеазы, примирующей спайковый белок, рецептора АСЕ2 и гамма-интерферона у интересующего субъекта до вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно инфекция SARS-CoV-2 или во время вирусной инфекции, предпочтительно инфекция коронавируса, более предпочтительно инфекция SARS-CoV-2,
b) определение уровня по меньшей мере одного из группы, состоящей из эндогенного альфа-1-антитрипсина, по меньшей мере одной протеазы, примирующей спайковый белок, рецептора АСЕ2 и гамма-интерферона по меньшей мере у одного контрольного субъекта во время вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно инфекция SARS-CoV-2, при которой у эталонного субъекта нет симптомов или он имеет легкие симптомы,
c) сравнение уровня интереса, определенного на этапе а), с референсным уровнем, определенным на этапе b),
где интересующий субъект более восприимчив к лечению и/или профилактике заболевания или синдрома, связанного с вирусной инфекцией, предпочтительно коронавирусной инфекцией, более предпочтительно инфекцией SARS-CoV-2, если у интересующего субъекта есть по крайней мере один выбранный из группы, состоящей из:
1. более низкий уровень интереса эндогенного альфа-антитрипсина (ААТ) по сравнению с референсным уровнем эндогенного ААТ,
2. более высокий уровень интереса, по крайней мере, одной протеазы, примирующей спайковый белок, по сравнению с контрольным уровнем, по крайней мере, одной протеазы, примирующей спайковый белок,
3. более высокий уровень интереса ангиотензинпревращающего фермента 2 (рецептора АСЕ2) по сравнению с контрольным уровнем рецептора АСЕ2, и
4. более высокий уровень интереса интерферона-гамма (IFN-γ) по сравнению с референсным уровнем IFN-γ.
Все определения и комбинации, представленные в данном документе, применимы к этому аспекту, если применимо и если не указано иное.
Настоящее изобретение также относится к способу определения терапевтически эффективного количества альфа-1-антитрипсина (ААТ) для эффективного лечения и/или предотвращения заболевания или синдрома, связанного с вирусной инфекцией, предпочтительно коронавирусной инфекцией, более предпочтительно SARS-CoV-2 инфекции с использованием композиции по настоящему изобретению, включающей стадии:
a) определение уровня эндогенного альфа-1-антитрипсина у интересующего субъекта до вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно, инфекции SARS-CoV-2 или во время вирусной инфекции, предпочтительно коронавирусной инфекции, более предпочтительно инфекции SARS-CoV-2,
b) определение количества ААТ в композиции, которое требуется для достижения уровня ААТ у субъекта по меньшей мере 10 мкМ, предпочтительно по меньшей мере 20 мкМ, более предпочтительно по меньшей мере 50 мкМ, еще более предпочтительно по меньшей мере 100 мкМ, и наиболее предпочтительно не менее 200 мкМ.
Все определения и комбинации, представленные в данном документе, применимы к этому аспекту, если применимо и если не указано иное.
В некоторых аспектах изобретение относится к способу согласно изобретению, в котором вирус представляет собой коронавирус. В некоторых аспектах изобретение относится к способу согласно изобретению, в котором вирус представляет собой SARS-CoV-2. В некоторых аспектах изобретение относится к способу согласно изобретению, в котором заболевание или синдром представляет собой респираторный синдром или тяжелый острый респираторный синдром. В некоторых аспектах изобретение относится к способу согласно изобретению, в котором заболевание или синдром представляет собой воспалительное заболевание или синдром нервной системы. В некоторых аспектах изобретение относится к способу согласно изобретению, в котором воспалительное заболевание или синдром нервной системы представляет собой заболевание или синдром, выбранные из группы рассеянного склероза, бокового амиотрофического склероза, болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона и болезни Хантингтона.
Все определения и комбинации, представленные в данном документе, применимы к этим аспектам, если применимо и если не указано иное.
Специалисты в данной области техники поймут, что описанное здесь изобретение допускает изменения и модификации, отличные от конкретно описанных. Следует понимать, что изобретение включает в себя все такие вариации и модификации, не выходящие за рамки его сущности или существенных характеристик. Изобретение также включает все стадии, признаки, композиции и соединения, упомянутые или указанные в данном описании, по отдельности или вместе, и любые и все комбинации или любые две или более из указанных стадий или признаков. Таким образом, настоящее раскрытие следует рассматривать как все проиллюстрированные аспекты, а не как ограничивающие, объем изобретения указывается прилагаемой формулой изобретения, и все изменения, которые входят в значение и диапазон эквивалентности, предназначены для включения в нее. В данном описании цитируются различные ссылки, каждая из которых полностью включена в настоящий документ посредством ссылки. Вышеизложенное описание будет более понятно со ссылкой на следующие примеры.
УСЛОВНЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ К ЧЕРТЕЖАМ
Фиг. 1: Схематическое изображение цикла заражения SARS-CoV-2 и роли ААТ в блокировании проникновения вируса в клетку-хозяина.
Фиг. 2 (а): уровни эндогенной мРНК катепсина L, фурина, АСЕ2 и TMPRSS2 в клетках А549 и HeLa, показывают, что ни клетки HeLa, ни клетки А549 не экспрессируют соответствующие количества мРНК АСЕ2 или TMPRSS2. Обе клеточные линии экспрессируют фурин и катепсин L (примирующая протеаза спайкового белка из SARS-CoV-1 и SARS-CoV-2).
Фиг. 2 (b): Псевдовирусный вариант SARS-CoV-2 Spike D614G демонстрирует повышенную инфекционность. Лентивирусы, экспрессирующие люциферазу и псевдотипированные SARS-CoV-2-Spike дикого типа (D614) или мутант D614G (G614), использовали для трансдукции клеток HeLa, сверхэкспрессирующих или не экспрессирующих либо АСЕ2, либо TMPRSS2. Результаты показывают отсутствие ингибирующего эффекта ААТ, полученного из плазмы, в концентрациях 10 микромолярных (10 мкМ) на проникновение псевдовирусных клеток SARS-CoV-2 в клетки HeLa, сверхэкспрессирующие TMPRSS2, и до 25% в клетках HeLa, экспрессирующих только АСЕ2.
Фиг. 3: а) Экспрессия гена АСЕ2 в различных клеточных линиях. b) Экспрессия гена TMPRSS2 в различных клеточных линиях (тканях).
Фиг. 4: Экспрессия АСЕ2 в А549 в ответ на лечение IFN-γ.
Фиг. 5: Экспрессия АСЕ2 в HeLa в ответ на лечение IFN-γ.
Фиг. 6: Анализ проникновения псевдовируса SARS-CoV-2. а) - b) клетки А549 -псевдовирус WT. а) Клетки А549-АСЕ2 с псевдовирусом WT D614. b) Клетки А549 - АСЕ2 - TMPRSS2 с псевдовирусом WT D614. с - d) Клетки А549 - спайковый мутантный псевдовирус G416. с) Клетки А549 АСЕ2 с мутантным псевдовирусом G416. d) Клетки А549 - АСЕ2 - TMPRSS2 с мутантным псевдовирусом G614. Респикам = Glassia, одобренный FDA ААТ, полученный из плазмы (клинический уровень), Sigma = ААТ, полученный из плазмы, закупленный у Sigma (уровень не GMP).
Фиг. 7. Вход псевдовируса SARS-CoV-2 блокируется на 50-75% в клетках А549 с усилением АСЕ2 при концентрациях ААТ как 100, так и 200 микромоль. (Респикам 100 мкМ в PBS 5х, Sigma 100 мкМ в PBS 5х, Sigma 200 мкМ в PBS 2,5х, Portland 100 мкМ в PBS 5х, Genfaxon в PBS 5х, Camostat 10 мкМ и 100 мкМ в DMSO 0,2%, бромгексин 10 мкМ и 100 мкМ в DMSO 0,2%, бензолсульфонил 10 мкМ и 100 мкМ в ДМСО 0,2%).
Фиг. 8: Вход псевдовируса SARS-CoV-2 блокируется до 45% в клетках А549 с усилением АСЕ2 + TMPRSS2 при концентрациях ААТ как 100, так и 200 микромоль. (Респикам 100 мкМ в PBS 5х, Sigma 100 мкМ в PBS 5х, Sigma 200 мкМ в PBS 2,5х, Portland 100 мкМ в PBS 5х, Genfaxon в PBS 5х, Camostat 10 мкМ и 100 мкМ в DMSO 0,2%, бромгексин 10 мкМ и 100 мкМ в DMSO 0,2%, бензолсульфонил 10 мкМ и 100 мкМ в ДМСО 0,2%).
Фиг. 9 АСЕ-2 - это рецептор клетки-хозяина, ответственный за опосредование инфекции SARS-CoV-2, нового коронавируса, ответственного за коронавирусную болезнь 2019 (COVID-19). Лечение лекарственным соединением (ААТ) нарушает взаимодействие между вирусом и рецептором. (Адаптировано из https://www.rndsystems.com/resources/articles/ace-2-sars-receptor-identified).
Фиг. 10: Протокол анализа проникновения псевдовируса SARS-CoV-2.
Фиг. 11 а) b) Влияние полученного из плазмы и рекомбинантного ААТ на проникновение псевдовируса SARS-CoV-2 в клетки АСЕ2, сверхэкспрессирующие А549, в клетках базального альвеолярного эпителия легких человека. Наиболее выраженный ингибирующий эффект (93,4%) наблюдается при 200 мкМ рекомбинантного ААТ 1, продуцируемого в клетках СНО с использованием вектора рХС17.4 (Lonza Biologies Plc) с) Влияние других ингибиторов сериновых протеаз на проникновение псевдовируса SARS-CoV-2 в клетки альвеолярного базального эпителия легких человека А549, сверхэкспрессирующие АСЕ2. d) ИФН-бета-1а в концентрации 10 нг/мл в комбинации с 25 мкМ ААТ из плазмы крови и рекомбинантным ААТ, полученным в клетках СНО (рекомбинантный ААТ 1, рекомбинантный ААТ 2), демонстрируют аддитивный ингибирующий эффект в тесте на проникновение псевдовируса SARS-CoV-2.
Фиг. 12 а) b) Влияние полученного из плазмы и рекомбинантного ААТ на проникновение псевдовируса SARS-CoV-2 в клетки рака шейки матки человека HeLa со сверхэкспрессией АСЕ2 с) Влияние других ингибиторов сериновой протеазы на проникновение псевдовируса SARS-CoV-2 в человеческий ген HeLa с избыточной экспрессией АСЕ2 клетки рака шейки матки.
Фиг. 13 Схематическое изображение анализа слияния спайков SARS-CoV-2.
Фиг. 14. Анализ слияния спайков SARS-CoV-2 в клетках рака шейки матки человека HeLa, сверхэкспрессирующих либо АСЕ2 и люциферазу small bit, либо спайк SARS-CoV-2 и люциферазу large bit. Рекомбинантный ААТ (rhAAT), продуцируемый в клетках СНО (рекомбинантный ААТ 1 и рекомбинантный ААТ 2), демонстрирует лучший ингибирующий эффект на слияние клеток, опосредованное спайком SARS-CoV-2, по сравнению с ААТ, полученным из плазмы.
Фиг. 15 а) анализ qPCR экспрессии гена протеазы, примирующего спайковый белок в линии клеток легких человека b) анализ qPCR экспрессии гена АСЕ2 в линии клеток легких человека (Calu 3 и А549), показывает отсутствие эндогенной экспрессии АСЕ2 в линии клеток А549 с) Анализ qPCR экспрессии гена TMPRSS2 в линии клеток легких человека (А549) по сравнению с линией колореактных клеток (Сасо2), показывает отсутствие эндогенной экспрессии TMPRSS2 в линии клеток А549 d) е) Относительный количественный анализ qPCR экспрессии гена прайминговых протеаз в различных клеточных линиях (тканях) человека. Очевидно, клетки, происходящие из легких, демонстрируют наибольшее количество копий трипсина и катепсина В в клетках Calu3 и А549 соответственно. Примечательно, что клетки, полученные из нервной ткани (SH-SY5Y), также демонстрируют действительно высокое число копий как для трипсина, так и для катепсина В.
Фиг. 16 а) ААТ и rhAAT ингибируют активность протеазы катепсина В b) ААТ и rhAAT ингибируют активность протеазы катепсина L, причем наиболее выраженный ингибирующий эффект наблюдается для рекомбинантного ААТ, продуцируемого в клетках HEK293 с вектором pcDNA3.1 (+) (Рекомбинантный ААТ 4) с) ААТ и rhAAT ингибируют активность трипсиновой протеазы, причем наиболее выраженный ингибирующий эффект наблюдается для рекомбинантного ААТ, продуцируемого в клетках HEK293 с вектором pcDNA3.1 (+) (Рекомбинантный ААТ 4) d) ААТ и rhAAT ингибируют активность протеазы фурина, причем в наибольшей степени выраженный ингибирующий эффект, наблюдаемый для рекомбинантного ААТ, продуцируемого в клетках HEK293 с вектором pcDNA3.1 (+) (Рекомбинантный ААТ 4) е) ААТ и rhAAT ингибируют активность протеазы PC1 f) ААТ и rhAAT ингибируют активность протеазы матриптазы g) ААТ и rhAAT ингибируют протеазу TMPRSS2 активность h) ААТ и rhAAT ингибируют активность протеазной эластазы, причем наиболее выраженный ингибирующий эффект наблюдается для рекомбинантного ААТ, продуцируемого в клетках СНО с вектором рХС17.4 (Рекомбинантный ААТ 1) i) ААТ и rhAAT ингибирует активность протеазы эластазы нейтрофилов, причем наиболее выраженный ингибирующий эффект наблюдается для рекомбинантного ААТ, продуцируемого в клетках HEK293 с вектором pcDNA3.1 (+) (Рекомбинантный ААТ 4).
Фиг. 17. Стандартная кривая для связывания а) ААТ, полученного из плазмы, и b) рекомбинантного ААТ, измеренная с использованием метода Octet. Различная аффинность связывания наблюдается между ААТ, полученным из плазмы, и рекомбинантным ААТ, продуцируемым в клетках СНО с векторами PL136 и 137.
Фиг. 18 а) Схематическая иллюстрация экспериментальной временной шкалы b) IFNγ-опосредованная активация микроглии (воспаление).
Фиг. 19 а) Схематическая иллюстрация экспериментальной временной шкалы b) ААТ снижает IFNγ-опосредованную активацию микроглии (воспаление). Эффект наблюдается для ААТ, полученного из плазмы, рекомбинантного ААТ (rhAA) и для клеток, трансдуцированных геном, экспрессирующим ААТ (генная терапия).
Фиг.20 а) Схематическая иллюстрация экспериментальной временной шкалы b) IFNβ улучшает противовоспалительный эффект, полученный с ААТ.
Фиг. 21 а) b) Влияние полученного из плазмы и рекомбинантного ААТ на проникновение псевдовируса БВРС-КоВ в клетки колоректальной аденокарциномы человека Сасо2 с) Влияние других ингибиторов сериновой протеазы на проникновение псевдовируса БВРС-КоВ в клетки колоректальной аденокарциномы человека Сасо2.
Фиг. 22 а) b) Влияние плазменного и рекомбинантного ААТ на проникновение псевдовируса SARS-CoV в клетки базального альвеолярного эпителия легких человека А549, сверхэкспрессирующие АСЕ2 с) Влияние других ингибиторов протеазы на проникновение псевдовируса SARS-CoV в клетки базального альвеолярного эпителия легких человека А549, сверхэкспрессирующие АСЕ2.
Фиг. 23. а) влияние ААТ на активацию ADAM17 и выделение белка; b) влияние ААТ на активацию моноцитов/макрофагов иммунными комплексами спайковый белок/IgG.
Фиг. 24 Различия в молекулярной массе ААТ из разных источников.
Фиг. 25 а) Векторная карта для рХС-17.4 (Lonza Biologies) b) Векторная карта для pJ201_AAT_native_SP (Merck) с) Векторная карта для pJ201_AAT_SP5 (Merck) d) Векторная карта для PL136 (Merck) е) Векторная карта для PL137 (Merck) f) Векторная карта для пустого вектора pCGS3 g) Векторная карта для pcDNA3.1 (+) (GenScript).
Фиг. 26. Метод октетов, разработанный для определения аффинности ААТ.
Все рисунки: «Респикам» относится к ААТ, полученному из плазмы (клинического уровня); «Sigma» относится к ААТ, полученному из плазмы; «Рекомбинантный ААТ 1» относится к ААТ, продуцируемым в СНО с помощью рХС-17.4 (GS System, Lonza), «Рекомбинантный ААТ 2» относится к ААТ, продуцируемым в СНО PL136/PL137 (Merck), «Рекомбинантный ААТ 3» относится к ААТ, продуцируемым в HEK293T; «Рекомбинантный ААТ 4» относится к ААТ, продуцируемому в HEK293 с помощью pcDNA3.1 (+) (GenScript).
ПРИМЕРЫ
Материалы и методы
Лечение инфекции SARS-CoV-2 с помощью альфа-1-антитрипсина (ААТ)
Влияние ААТ на инфекцию SARS-CoV-2 показано на двух уровнях:
1. Во-первых, протеазозависимое проникновение SARS-CoV-2 в клетки.
2. Во-вторых, чрезмерное воспаление при тяжелой болезни SARS-CoV-2
Важно отметить, что это представляет три стадии COVID-19 (то есть заболевания, вызванного SARS-CoV-2):
1. Первая стадия COVID-19 (заболевание, вызванное SARS-CoV-2, гриппоподобные симптомы, обычно исчезающие в течение одной недели) не требует лечения.
2. Заболевание второй стадии, обычно характеризующееся вирусной пневмонией, требует госпитализации, и противовирусное лечение (то есть подавление проникновения SARS-CoV-2 в клетки) представляет большой интерес на этой стадии для предотвращения дальнейшего прогрессирования.
3. COVID третьей стадии характеризуется острым респираторным дистресс-синдромом (ОРДС) и тяжелым системным воспалением; эта стадия требует противовоспалительного и противовирусного лечения.
Согласно нашему анализу, ААТ полезен для лечения COVID-19 стадии II и III, тогда как профилактическое введение ААТ предусмотрено для предотвращения развития стадии I в стадию II и III.
Пример 1 - Попадание SARS-CoV-2 в клетки
Проникновение SARS-CoV-2 опосредуется связыванием вирусного спайкового белка с рецептором ангиотензинпревращающего фермента 2 (АСЕ2) клетки-хозяина. Чтобы повторить это биологическое событие in vitro, генерируются лентивекторы, кодирующие репортер (GFP или люциферазу) и экспрессирующие белок-спайк на его поверхности. Проникновение лентивектора в клетки опосредуется механизмом SARS-CoV-2, эффективность которого измеряется экспрессией репортера (GFP или люциферазы) в клетках-мишенях (Ou, X., Liu, Y., Lei, X. et al. Характеристика спайкового гликопротеина SARS-CoV-2 при проникновении вируса и его иммунная перекрестная реактивность с SARS-CoV (Characterization of spike glycoprotein of SARS-CoV-2 on virus entry and its immune cross-reactivity with SARS-CoV). Nat Commun 11, 1620, 2020). ААТ добавляется для количественной оценки ингибирования проникновения вируса путем считывания сигналов GFP и/или люциферазы.
Трансмембранная сериновая протеаза TMPRSS2 имеет решающее значение для инфекции SARS-CoV-2 (Toshio Hirano, Masaaki Murakami COVID-19: новый вирус, но знакомый рецептор ииммунитет к синдрому высвобождения цитокинов (COVID-19: A New Virus, but a Familiar Receptor and Cytokine Release Syndrome Immunity), 22 апреля 2020 г.) и для инфекции гепатита С (Esumi М., Ishibashi М, Yamaguchi Н, Nakajima S, Tai Y, Kikuta S, Sugitani M, Takayama T, Tahara M, Takeda M, Wakita T - Трансмембраннаясериновая протеаза TMPRSS2 активирует инфекцию вируса гепатита С (Transmembrane serine protease TMPRSS2 activates hepatitis С virus infection). Hepatology. фев 2015 г.; 61(2):437-46). Инфекция гепатита С может быть заблокирована с помощью ААТ (предположительно, посредством ингибирования TMPRSS2 - Esumi et al., 2020), SARS-CoV-2 (а также некоторые высокопатогенные формы вируса гриппа) имеет последовательность, которая позволяет расщеплять ее фурин-протеазой. Этот сайт расщепления отсутствует в коронавирусах SARS и MERS, что позволяет предположить, что он важен для патогенности SARS-CoV-2 (В. Coutard, С.Valle, X. de Lamballerie, В. Canard, NG Seidah, E. Decroly, Спайковый гликопротеин нового коронавируса 2019-nCoV содержит фурин-подобный сайт расщепления, отсутствующий в CoV той же клады (The spike glycoprotein of the new coronavirus 2019-nCoV contains a furin-like cleavage site absent in CoV of the same clade), Antiviral Research, Volume 176, 2020). Альфа1-антитрипсин Portland обладает сильной и селективной активностью в отношении фурина (Jean F, Stella K, Thomas L, et al. Альфа1-антитрипсин Portland, биоинженерный серпин, высокоселективный по отношению к фурину: применение в качестве антипатогенного агента (alpha1-antitrypsin Portland, a bioengineered serpin highly selective for furin: application as an antipathogenic agent). Proc Natl Acad Sci US A1998; 95 (13): 7293-7298. DOI: 10.1073/pnas.95.13.7293). Следовательно, предполагается, что ААТ дикого типа (происходящий из плазмы), а также рекомбинантный (продуцируемый в клетках млекопитающих, например, клетках СНО и/или HEK) будут проявлять активность фурина.
Эксперименты
1.1. Влияние ААТ на клеточное расщепление рекомбинантного спайкового белка
Рекомбинантный спайковый белок добавляют к соответствующим типам клеток (любые клетки, экспрессирующие АСЕ2 и известные в данной области), и протеолитическое расщепление оценивают с помощью вестерн-блоттинга. Можно использовать любые линии клеток, экспрессирующие АСЕ2. Множественные линии клеток-мишеней экспрессируют различное количество рецептора АСЕ2, включая, но не ограничиваясь ими; Calu-3, SH-SY5Y, HEK, НТ1080, А549, MRC 5, Huh7, Vero81, VeroE6, Hela, RS и LLCMK2.
1.2. Влияние ААТ на проникновение псевдовирусов
Псевдовирусы (т.е. псевдотипированные вирусные векторы), которые используют спайковый белок SARS-CoV-2 в качестве вирусного белка прикрепления/слияния, правильно отображают механизмы проникновения SARS-CoV-2 в клетки. Этот вход зависит от двух протеолитических стадий, которые ингибируются ингибитором протеазы ААТ. Поэтому исследуется проникновение псевдовирусов в различные клеточные линии, предпочтительно в линии клеток, экспрессирующие АСЕ2.
1.3. Влияние ААТ на клеточную инфекцию активным SARS-CoV-2 (тесты на живые вирусы):
ААТ тестируется на живом вирусе SARS-CoV-2, манипулирующем с уровнем биобезопасности 3 в соответствии с рекомендациями OFSP. Вирус инокулируют in vitro на клетки, обработанные ААТ или любым его фрагментом, вариантом и изоформой, поскольку измеряют множество параметров для оценки эффективности, включая сниженную цитотоксичность и титр вируса. Более конкретно, инфицирование клеток SARS-CoV-2 оценивается с помощью иммунофлуоресценции с вирусными белками, а также количественной оценки гибели клеток. Поскольку SARS-CoV-2 поражает нервную ткань (Helms J, Kremer S, Merdji H, et al. Неврологические особенности при тяжелой инфекции SARS-CoV-2 (Neurologic Features in Severe SARS-CoV-2 mfection) [опубликовано в Интернете перед печатью, 15 апреля 2020 г.]. N Engl J Med. 2020; Pleasure SJ, Green AJ, Josephson SA. Спектр неврологических заболеваний при тяжелом остром респираторном синдроме Пандемическая инфекция, вызванная коронавирусом 2: неврологи выходят на передний план (The Spectrum of Neurologic Disease in the Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 Pandemic Infection: Neurologists Move to the Frontlines). JAMA Neurol. Опубликовано в Интернете 10 апреля 2020 г.), инфекция нервной ткани (например, Minibrain™), а также клеток нейробластомы (SH-SY5Y) будет проводиться в качестве совместного лечения с ААТ и, как ожидается, изменит вирусную цитотоксичность или тропизм.
Пример 2 - Превышение воспаления при тяжелом заболевании SARS-CoV-2, также известном как «цитокиновый шторм». Fu Y, Cheng Y, Wu Y. Понимание воспалительных реакций, опосредованных SARS-CoV-2: от механизмов к потенциальным терапевтическим инструментам (Understanding SARS-CoV-2-Mediated Inflammatory Responses: From Mechanisms to Potential Therapeutic Tools) [опубликовано в Интернете перед печатью, 3 марта 2020 г.]. Virol Sin. 2020; 1-6. DOI: 10.1007/s12250-020-00207-4):
Эксперименты
2.1. SARS-CoV-2 активация ADAM 17 (TACE): активация ADAM 17 часть патологии SARS-CoV-2 (см., например, Vanesa Palau, Marta Riera, Maria Jose Soler, ингибирование ADAM17 может оказывать защитное действие на COVID-19 (ADAM 17 inhibition may exert a protective effect on COVID-19), Nephrology Dialysis Transplantation, gfaa093, https://doi.org/10.1093/ndt/gfaa093; https://clinicalaffairs.umn.edu/umn-research/regulation-sars-cov-2-receptor-ace2-adam17; Haga S, Yamamoto N, Nakai-Murakami C, et al. Модуляция фермента, преобразующего TNF-альфа, с помощью белка-шипа SARS-CoV и АСЕ2 индуцирует продукцию TNF-альфа и способствует проникновению вируса (Modulation of TNF-alpha-converting enzyme by the spike protein of SARS-CoV and ACE2 induces TNF-alpha production and facilitates viral entry). Proc Natl Acad Sci US A. 2008; 105 (22): 7809-7814. DOI: 10.1073/pnas.0711241105). ААТ ингибирует ADAM 17 (см., например, Bergin DA, Reeves EP, Meleady P, et al. Альфа-1-антитрипсин регулирует хемотаксис нейтрофилов человека, индуцированный растворимыми иммунными комплексами и IL-8 (α-1 Antitrypsin regulates human neutrophil chemotaxis induced by soluble immune complexes and IL-8). J Clin Invest. 2010; 120 (12): 4236-4250. doi: 10.1172/JCI41196; Serban KA, Petrusca DN, Mikosz A, et al. Добавка альфа-1-антитрипсина улучшает эффероцитоз и фагоцитоз альвеолярных макрофагов после воздействия сигаретного дыма (Alpha-1 antitrypsin supplementation improves alveolar macrophages efferocytosis and phagocytosis following cigarette smoke exposure). PLoS One. 2017; 12 (4): e0176073. Опубликовано 27 апреля 2017 г. doi: 10.1371/journal.pone.0176073).
Изучить влияние ААТ на активацию ADAM17 и выделение белка (в частности, АСЕ2) после воздействия на клетки (Фиг. 23а):
i) спайковый белок
ii) псевдовирус
iii) SARS-CoV-2 (живой вирус).
Наиболее подходящими для использования клетками являются любые клетки, экспрессирующие АСЕ2 (как указано выше).
2.2. Активация рецепторов Fc иммунными комплексами SARS-CoV-2/IgG (антитело-зависимое усиление, см., например, F. Negro, Swiss Med Wkly. 2020; 150: w20249 "Играет ли антитело-зависимое усиление роль в патогенезе COVID-19? (Is antibody-dependent enhancement playing a role in COVID-19 pathogenesis?)"). Протеолиз с помощью трипсиноподобных протеаз усиливает функции моноцитов, опосредованные FcyRJI, такие как индукция высвобождения TNF (JM Debets, JG Van de Winkel, JL Ceuppens, IE Dieteren, WA Buurman в The Journal of Immunology 15 февраля 1990 г., 144 (4) 1304-1310).
Изучить влияние ААТ на активацию моноцитов/макрофагов иммунными комплексами спайковый белок/IgG (Фиг. 23b).
Пример 3 - Дополнительные эксперименты в поддержку эффективности ААТ в снижении вирусной пролиферации
3. Анализ вирусной полимеразы.
Вирусная полимераза SARS-CoV-2 является ключевым элементом в репликации вирусного генетического материала. Клеточная линия клеточной линии, экспрессирующая мультисубъединичную вирусную полимеразу (состоящую по меньшей мере из 3 ядерных субъединиц NSP7, NSP8 и NSP12), трансфицируется для сверхэкспрессии репортера люциферазы, который может быть активирован только активностью вирусной полимеразы.
Репортерный сигнал люциферазы пропорционален активности вирусной полимеразы. ААТ тестируется для оценки активности ингибирования вирусной полимеразы.
При попадании в клетку-хозяин SARS-CoV-2 будет использовать аппарат клетки-хозяина для усиления собственной репликации. Это вызовет токсический ответ клетки-хозяина, по существу опосредованный вирусным белком NSP1.
Чтобы имитировать это биологическое событие, создается клеточная линия, экспрессирующая вирусный белок NSP1, контролируемый индуцируемым тетрациклином промотором. После обработки клеток тетрациклином будет экспрессироваться токсичный белок NSP1. Предполагается, что добавление ААТ подавляет этот токсический эффект, опосредованный вирусным белком.
Эксперимент 4
Введение
Недавняя пандемия, вызванная недавно появившимся коронавирусом SARS-CoV-2, застала мир врасплох. В отличие от предыдущих вспышек коронавируса, таких как ТОРС и БВРС, новый вирус характеризуется не особенно высоким уровнем летальности, а беспрецедентным эпидемиологическим успехом. И действительно, вирус до сих пор в значительной степени сопротивлялся всем попыткам искоренения, несмотря на строгие меры, принятые во многих странах по всему миру.
SARS-CoV-2 - это РНК-вирус, но коронавирусы отличаются от других РНК-вирусов по нескольким параметрам. У них большой геном и сложный жизненный цикл, который до сих пор плохо изучен. Кроме того, у коронавирусов есть механизм корректуры, который обеспечивает относительно стабильный геном по сравнению с другими типами РНК-вирусов. И действительно, учитывая масштабы пандемии, до сих пор сообщалось об относительно небольшом количестве мутаций, приводящих к аминокислотным изменениям.
Белок коронавируса S, также известный как спайковый, является доминирующим белком оболочки вируса. Он опосредует прикрепление вируса к рецепторам на поверхности клетки-хозяина и последующее слияние между мембранами вируса и клетки-хозяина для облегчения проникновения вируса в клетку-хозяина. Это тримерный слитый белок класса I, который существует в метастабильной конформации до слияния, разделенный на две основные субъединицы, а именно S1 и S2. Чтобы прикрепиться к рецепторам на поверхности клетки-хозяина, рецептор-связывающий домен (RBD), содержащийся в домене S1, претерпевает петлеобразные конформационные изменения, определяя два разных состояния [1]. Это конформационное изменение необходимо для протеолитического процессинга и/или слияния домена S2 с мембраной клетки-хозяина. В настоящее время считается, что множество протеаз, включая семейство протеаз PC, трипсиноподобные протеазы и катепсины, способны расщеплять спайковый белок [2].
Мутация шипового белка D614G привлекла внимание, поскольку потенциально может изменить вирусное прикрепление, слияние и/или иммуногенность. Было высказано предположение, что мутация D614G увеличивает инфекционность (ссылка), [3] транс мисс ив ность и/или уровень летальности [4]. Более поздние исследования прямо демонстрируют, что вариант G614 действительно усиливает проникновение вируса в клетки [5, 6].
SARS-CoV-2 использует механизм репликации/транскрипции, состоящий из нескольких субъединиц [7]. Набор неструктурных белков (nsp), продуцируемых как продукты расщепления вирусных полипротеинов ORFla и ORF1b, собирается для облегчения репликации и транскрипции вируса, что делает этот механизм потенциальной мишенью для терапевтического вмешательства против вирусных инфекций COVID-19 [8]. РНК-зависимая РНК-полимераза (RdRp, также известная как nsp 12) является ключевым игроком в синтезе вирусной РНК. Недавно определенная кристаллическая структура SARS-CoV-2 nsp 12 в комплексе с его кофакторами nsp7 и nsp8 подчеркивает центральную роль этих неструктурных белков в цикле репликации и транскрипции вируса COVID-19 [8, 9]. Мутации P314L в RdRp уделялось меньше внимания, однако было высказано предположение, что эта мутация может изменить считывание вирусных доказательств и тем самым привести к увеличению скорости последующих мутаций [10].
В этой работе мы исследуем появление варианта SARS-CoV-2 с сопутствующими мутациями в S-белке и RdR-полимеразе. Обе мутации находятся в стратегически важных участках соответствующих белков и, следовательно, являются кандидатами на изменение биологии вируса. Вариант G624/L323, но не отдельные мутанты G624 или L323, эпидемиологически очень успешен и за последние месяцы в значительной степени заменил исходный вариант D624/P323.
Методы:
Клеточные линии и культура
Линии клеток человека, использованные в исследовании, представляли собой клетки HEK 293Т/17 (почка человека, АТС C#CRL-11268), А549, HeLa и клетки HMC3-MHCIILuc. Клеточная линия HMC3-MHCIILuc, кодирующая репортер люциферазы под промотором главного комплекса гистосовместимости II (МНСII), была описана как ценный инструмент для изучения активации микроглии человека и была получена от профессора Карла-Хайнца Краузе из Женевского университета. Клетки HMC3-MHCIILuc трансдуцировали лентивирусным вектором для получения ААТ-продуцирующей линии клеток НМС3-MHCIILuc; UbiAAT (см. производство лентивирусов). Клетки поддерживали в среде Игла, модифицированной по Дульбекко (DMEM), дополненной 10% (об./об.) фетальной бычьей сыворотки (FBS), 100 мкг/мл пенициллина и стрептомицина, 2 мМ 1-глутамина, 1 мМ пирувата натрия и 1% незаменимых аминокислот. К клеточным линиям НМС3 не добавляли заменимые аминокислоты. Культуры поддерживали при 37°С в атмосфере с 5% CO2.
Анализ слияния спайков.
Подходящую концентрацию обработок предварительно разводили в питательной среде. Поверх этой смеси была добавлена линия клеток HeLa, стабильно сверхэкспрессирующая человеческий рецептор АСЕ2 и фрагмент расщепленной люциферазы Smallbit, вместе с линией клеток HeLa, стабильно сверхэкспрессирующей спайковый белок SARS-CoV-2 и фрагмент расщепленной люциферазы Largebit, и инкубировали при 27°С в течение 24 часов. Взаимодействие между АСЕ2 и спайковым белком SARS-CoV-2 опосредует слияние обеих клеточных линий, таким образом взаимодействуя между расщепленными фрагментами люциферазы bigbit и smallbit, что приводит к функциональной люциферазе. Световое излучение измеряли с помощью набора Nanoglo (Promega) в соответствии с инструкциями производителя.
Создание клеточных линий, экспрессирующих АСЕ2 и TMPRSS2.
Клетки Hela и А549 высевали с плотностью 2Е05 клеток на лунку в 12-луночный планшет. На следующий день после того, как клетки были котрансдуцированы либо лентивирусами АСЕ2/пуромицин, либо TMPRSS2/бластицидин. Через четыре дня после трансдукции клетки отбирали с бластицидином и пуромицином в концентрации 5 мкг/мл. Клетки поддерживали как поликлональную популяцию.
Плазмиды
ORF кДНК АСЕ2 и TMPRSS2 были приобретены у GenSript и были клонированы в лентивекторы pCDH-CMV-MCS-EF1α-Puro (SEQ ID NO: 13) и pCDH-CMV-MCS-EF1α-Blast (SEQ ID NO: 14) соответственно с использованием стандартных методы клонирования. Плазмида pCGl SCoV2-S (SEQ ID NO: 15), кодирующая белок SARS-CoV-2-Spike, была предоставлена профессором доктором Стефаном Пельманном (Университет Геттингена, Геттинген, Германия). Клетки G614 Spike клонировали с использованием сайт-направленного мутагенеза со следующими праймерами: 5'- GCGTGAACTGTACCGAAGTG-3' (SEQ ID NO: 16) и 5'-CCTGGTACAGCACTGCC-3' (SEQ ID NO: 17). Укороченная версия SARS-CoV-2-Spike из 19 аминокислот на С-конце была создана с помощью ПЦР-амплификации с использованием праймеров 5'-AGCGAATTCGGATCCGCC-3' (SEQ ID NO: 18) и 5'-ACAGTCGACTCTAGATTAGCAGCAGCTGCCACAG-3' (SEQ ID NO: 19) с последующим клонированием в плазмиду pCG1.
Очистка ААТ, произведенная в клетках HEK293T
Отбирали образцы супернатанта клеток HEK293T, сверхэкспрессирующих AAT-His человека, и инкубировали в течение ночи при 4°С при встряхивании со смолой для очистки белка, меченного гистидином Ni Sepharose excel (Cytiva). Объемное соотношение супернатант : смола составляет 200:1. Затем супернатант удаляли, и шарики один раз промывали фосфатно-солевым буфером (PBS). Гранулы один раз промывали PBS с добавлением 10% (об./об.) буфера для элюирования (PBS с добавлением 500 мМ имидазола, рН 7,5) и один раз PBS с добавлением 20% буфера для элюирования. Наконец, очищенный AAT-His-tag был элюирован 100% буфером для элюции. Имидазол удаляли диализом для получения AAT-His в буфере PBS.
Производство лентивирусов
Для получения рекомбинантного лентивируса плазмиды трансфицировали в клетки HEK293T с использованием кальций-фосфатного метода. Вкратце, 4,5×106 клеток высевали в 10-сантиметровую чашку и через 16 часов трансфицировали 15 мкг либо АСЕ2, TMPRSS2, ААТ, либо лентивирусных векторов, экспрессирующих пустые клетки, 10 мкг упаковывающей плазмиды (psPAX2, подарок от Didier Trono [плазмида Addgene 12260]) и 5 мкг оболочки (pMD2G, подарок от Didier Trono [плазмида Addgene 12259]). Среду меняли через 8 часов после трансфекции. Через 48 часов вирусные супернатанты собирали и фильтровали с использованием 45 мкм PVDF-фильтров и хранили при -80°С.
Вспышка коронавируса, псевдотипия производства лентивирусов
Лентивирус с псевдотипом Spike был получен путем котрансфекции клеток 293Т с psPAX2, pCDH-CMV-Gluc-EF1α-GFP и плазмидами, кодирующими либо спайк SARS-CoV-2 D614 полной длины (FL) (SEQ ID NO: 15), спайк G614 полной длины (FL) (SEQ ID NO: 20), спайк D614 DeltaCter (SEQ ID NO: 21), спайк G614 DeltaCter (SEQ ID NO: 22), спайк SARS-CoV (Sino Biological Europe GmbH, номер по каталогу: VG40150-GN), спайк SARS-CoV (Sino Biological Europe GmbH, номер по каталогу: VG40069-GN) или пустой вектор (SEQ ID NO: 23) с использованием метода фосфата кальция, как описано выше.
Псевдотипические анализы на лентивирусную инфекцию со спайком коронавируса
HeLa, стабильно сверхэкспрессирующий человеческий рецептор АСЕ2, клетки А549, стабильно сверхэкспрессирующие человеческий рецептор АСЕ2 или клетки Сасо2, высевали в 96-луночные планшеты. Через 3 часа после нанесения покрытия обработку компаундом проводили или не проводили в зависимости от экспериментальной установки. Через 24 часа клетки трансдуцировали псевдовирусом коронавируса в течение 6 часов. Затем культуральную среду меняли и клетки хранили при 37°С. После трехдневной инкубации активность люциферазы Gaussia измеряли путем добавления 10 мкл клеточного супернатанта к 50 мкл фосфатно-солевого буфера [PBS] с добавлением 4 мкМ коэлентеразина и немедленного измерения люминесценции в люминометре (Glomax; Promega). Параллельно клетки трипсинизировали и ресуспендировали в PBS с добавлением 10% FBS и анализировали проточной цитометрией с использованием проточного цитометра Attune NxT (thermofisher Scientific). Данные анализировали с помощью FlowJo 11 (FlowJo, LLC, Эшланд, штат Орегон).
Бесклеточный анализ (ингибирование протеазы прайминга спайкового белка)
Реакцию проводили в 100 мкл трипсина (Sigma-Aldrich), 75 мкл для катепсина В (R&D Systems) и 50 мкл для PC1 (R&D Systems), матриптазы (R&D Systems), фурина (NEB), катепсина L (R&D Systems) и TMPRSS2 (creative biomart). Буфер состоит из PBS рН 7,4 для трипсина (разбавленного до 6,4 нМ); 25 мМ MES, рН 5 для катепсина В (разбавленный до 1,76 нг/мкл); 25 мМ MES, 5 мМ CaCl2, 1% Brij-35, рН 6 для РС1 (разбавлен до 1,76 нг/мкл); 50 мМ Трис, 50 мМ NaCl, 0,01% Твин 20, рН 9 для матриптазы (разбавленный до 1,76 нг/мкл); 100 мМ HEPES, 1 мМ CaCl2, 0,5% Triton Х100, 1 мМ 2-меркаптоэтанол, рН 7,5 для фурина (разбавленный до 10U/мл); 0,005% Brij-35, 1 мМ EDTA, 5 мМ DTT, 50 мМ MES, рН 6 для катепсина L (разбавленный до 1,76 нг/мкл); 50 мМ TrisHCl, 150 мМ NaCl, 0,01% твин 20, рН 8 для TMPRSS2 (разбавленный до 0,5 мкМ). Если не указано иное, все реагенты были предоставлены Sigma Aldrich. Для анализов трипсина, катепсина В, РС1, матриптазы, фурина, катепсина L использовали пептид SARS-CoV-2, состоящий из последовательности TNSPRRARSVA с модификацией пары FRET MCA/Lys (DNP) (Biomatik). Для анализа TMPRSS2 использовали пептид, состоящий из последовательности Boc-QAR-AMC (R&D Systems). Для эластазы ELA1 из поджелудочной железы свиньи набор для анализа (Е-12056) был приобретен у молекулярных зондов (Sigma-Aldrich), а для эластазы нейтрофилов ELA2 набор для анализа (BML-AK497) был приобретен у Enzo, тесты были выполнены в соответствии с инструкциями производителя. Флуоресценцию или оптическую плотность измеряли каждую минуту в течение 45 минут в планшетном анализаторе. Vmax определяли для каждого условия в единицах флуоресценции в минуту, а ферментативная активность выражалась в процентах от необработанного состояния.
Анализ экспрессии генов
Тотальную РНК выделяли с помощью набора RNeasy Micro Kit (Qiagen) в соответствии с инструкциями производителя. 500 нг общей РНК из каждого образца подвергали обратной транскрипции с помощью набора Primescript от Takara в общем объеме 10 мкл при 37°С в течение 15 минут. Относительные уровни мРНК оценивали с помощью количественной RT-qPCR с использованием набора SYBR Green PCR (Applied Biosystems) методом 2 дельта Ct. GAPDH использовался в качестве внутреннего контроля.
Оценка количества копий гена
Для количества копий линеаризацию каждой конкретной плазмиды проводили с использованием расщепления рестрикционными ферментами. Продукт расщепления очищали с помощью набора для очистки ПЦР (GeneJET) в соответствии с инструкциями производителя. Затем измеряли оптическую плотность и определяли количество копий. Для количественной ПЦР использовали серийное разведение 1/10 расщепленной плазмиды.
Плазмиды для фурина, катепсина L, матриптазы (stl4), трипсина (PRSS1), PCI (PCSK1) были предоставлены GenScript, а плазмида для катепсина В была предоставлена Sino Biological.
Праймеры
Результаты: Влияние мутации S-белка D614G на трансдукцию клеток лентивекторами псевдотипа
Нашей целью было создание клеточных линий, которые последовательно экспрессируют вирусный рецептор АСЕ2, а также соответствующие протеазы, способные расщеплять спайковый белок. Как видно на Фиг. 3А и В, ни клетки Hela, ни клетки А549 не экспрессировали соответствующих количеств мРНК АСЕ2. Точно так же уровни мРНК TMPRSS2 почти не определялись. Оба типа клеток показывают от низкого до среднего уровня экспрессию гена фурина, но относительно высокий уровень экспрессии гена катепсина L (протеазы, способной расщеплять спайковый белок от обоих, SARS-CoV-1 и SARS-CoV-2). Для создания клеточных линий, пермиссивных для лентивекторов с псевдотипом шипового белка, мы поэтому трансдуцировали как клетки Hela, так и клетки А549 либо индивидуально, либо в сочетании с АСЕ2 (SEQ ID NO: 24) и TMPRSS2 (SEQ ID NO: 25).
Как и ожидалось, воздействие на клетки Hela дикого типа (ложно-трансдуцированные) или клетки А549 вышеописанными лентивекторами не приводило к экспрессии GFP или люциферазы (Фиг. 3с-f). Точно так же сверхэкспрессия TMPRSS2 сама по себе не приводила к значительной скорости трансдукции. При использовании лентивектора псевдотипа D614 наблюдалась небольшая, но четко определяемая трансдукция клеток Hela, экспрессирующих АСЕ2 и ACE2/TMPRSS2, но только очень небольшая трансдукция клеток А549. Это заметно изменилось при использовании вектора псевдотипа G614. Обе линии, экспрессирующие АСЕ2, транслировались гораздо сильнее. Однако следует отметить, что трансдукция клеток HeLa, экспрессирующих АСЕ2, была намного сильнее, чем трансдукция клеток А549, экспрессирующих АСЕ2. Напротив, сверхэкспрессия TMRPSS2 в дополнение к АСЕ2 приводит к сильному дополнительному усилению трансдукции, чего не было в случае клеток Hela. Таким образом, наиболее вероятно, что клетки Hela уже сильно экспрессируют протеазу, расщепляющую спайк, и сверхэкспрессия TMRPSS2 не требуется для эффективной трансдукции. Напротив, в клетках А549 протеолитическое расщепление, по-видимому, является лимитирующей стадией, и сверхэкспрессия TMRPSS2, следовательно, усиливает трансдукцию.
Обсуждение (чувствительность линии клеток HeLa к вирусной инфекции в сравнении с клеточной линией А549)
Повышенная чувствительность одной клеточной линии (HeLa, цервикальный, женский, афроамериканского происхождения) к псевдовирусной инфекции SARS-CoV-2 является особенно интересным наблюдением по сравнению с другой клеточной линией (А549, легкие, мужские, кавказского происхождения), поскольку она лежит в основе концепции, согласно которой характеристика популяций пациентов является ключом к определению терапевтической стратегии, направленной на достижение максимального воздействия на пациентов, у которых либо диагностирован COVID-19, либо иным образом в профилактических целях. Хотя раса сама по себе может представлять второстепенную роль для рассмотрения, генетическая предрасположенность либо к низкому эндогенному ААТ, либо к более высоким уровням хронического воспаления (более высокий IFN-γ и/или катепсин L), например, требует более высоких доз и/или более регулярного введения активного терапевтического вещества (ААТ).
Эксперимент 4
Цель состояла в том, чтобы определить эндогенные уровни экспрессии генов АСЕ2 и TMPRSS2 в различных клеточных линиях.
Метод: Тотальную РНК экстрагировали из клеточных линий Calu3, СаСо2, VeroE6, HepG2, А549, SH-SY5Y, HEK293-117Т, HeLa, используя RNeasy Micro Kit (Qiagen). Комплементарную ДНК синтезировали из общей РНК с использованием набора PrimeScript™ RT Reagent (Takara). Измерение кДНК с помощью ПЦР в реальном времени выполняли с использованием PowerUp SYBR™ Green Master Mix (Applied Biosystems) и нормализовали по экспрессии GAPDH в качестве контрольного гена домашнего хозяйства. Праймеры перечислены ниже:
Прямая последователность АСЕ2: cattggagcaagtgttggatctt (SEQ ID NO: 26)
Обратная последователность АСЕ2: gagctaatgcatgccattctca (SEQ ID NO: 27)
Прямая последователность TMPRSS2: cacggactggatttatcgacaa (SEQ ID NO: 28)
Обратная последователность TMPRSS2: cgtcaaggacgaagaccatgt (SEQ ID NO: 29)
Прямая последователность GAPDH: gcacaagaggaagagagagacc (SEQ ID NO: 30)
Обратная последователность GAPDH: aggggagattcagtgtggtg (SEQ ID NO: 31)
Результаты показаны на Фиг. 3.
Эксперимент 5
Цель состояла в том, чтобы определить, индуцирует ли обработка гамма-интерфероном экспрессию АСЕ2 в клеточной линии А549.
Протокол: Клетки А549 высевали в 12-луночный планшет и добавляли гамма-интерферон через 24 часа после расщепления клеток. Обработка длилась 48 часов, и мы выполнили экстракцию РНК, реакцию обратной транскриптазы и кПЦР, как описано ранее (см. раздел о методах Эксперимента 4).
Результаты показаны на Фиг. 4.
Эксперимент 6
Цель состояла в том, чтобы определить, индуцирует ли обработка гамма-интерфероном экспрессию АСЕ2 в клетках HeLa, экспрессирующих слитый белок SARS-CoV-2.
Протокол: Клетки HeLa Spike высевали в 12-луночный планшет и добавляли гамма-интерферон через 24 часа после расщепления клеток. Обработка длилась 48 часов, и мы выполнили экстракцию РНК, реакцию обратной транскриптазы и кПЦР, как описано ранее (см. раздел о методах Эксперимента 4).
Результаты показаны на Фиг. 5.
Эксперимент 7: анализ проникновения вируса SARS-CoV-2
Результаты показаны на Фиг. 7 и Фиг. 8. Выполнено с псевдолентивектором, экспрессирующим шип поверхностного белка SARS-CoV-2, несущий мутацию D614G, кодирующую репортер люциферазы (Фиг. 7 и 8).
Псевдолентивектор добавляется к клеткам А549, избыточно экспрессирующим конститутивно рецептор АСЕ2 (Фиг. 7) или и АСЕ2, и TMPRSS2 (Фиг. 8). Обработка соединения выполняется либо за 24 часа (панели А и В), либо за 1 час (панели С и D) до добавления псевдолентивектора. Дополнительная схематическая информация о протоколе псевдовирусного анализа представлена на рисунках 9 и 10.
Пример 4
Тест ингибирования проникновения вируса с клетками базального альвеолярного эпителия легких человека А549, сверхэкспрессирующими АСЕ2 (Фиг. 11 и 22) или колоректальной аденокарциномой человека Сасо2 (Фиг. 21), обрабатывали в течение 24 часов ААТ из нескольких источников (Фиг. 11а, 11b, 21а, 21b, 22а, 22b) или с соединениями-ингибиторами (Фиг. 11с, 21с, 22с). Затем был добавлен лентивектор, кодирующий репортер люциферазы и экспрессирующий спайковый белок SARS-CoV-2 с мутацией D614G (Фиг. 11), спайковый белок SARS-CoV (Фиг. 22) или спайковый белок MERS-CoV (Фиг. 21). на 6 ч. Наконец, культуральную среду меняли, и клетки инкубировали еще 3 дня перед измерениями. Проникновение вируса измеряли с помощью опосредованного лентивирусом сигнала люциферазы (Фиг. 11, 21, 22, темно-серый) и нормализовали по жизнеспособности клеток WST8, отображаемой светло-серым цветом. Для всех условий концентрации ДМСО/PBS были нормализованы (буфер). Все условия были выполнены в трех экземплярах, «усы» погрешностей представляют собой стандартное отклонение. Пожалуйста, обратитесь к разделу «Материалы и методы» для получения технической информации.
Пример 5
Тест ингибирования проникновения вируса с помощью HeLa. Клетки рака шейки матки человека, сверхэкспрессирующие АСЕ2, обрабатывали в течение 24 часов ААТ из нескольких источников (Фиг. 12а, 12b) или соединениями-ингибиторами (Фиг. 12с). Затем добавляли лентивектор, кодирующий репортер люциферазы и экспрессирующий спайковый белок SARS-CoV-2 с мутацией D614G, на 6 часов. Наконец, культуральную среду меняли, и клетки инкубировали еще 3 дня перед измерениями. Проникновение вируса измеряли с помощью опосредованного лентивирусом сигнала люциферазы (темно-серый) и нормализовали по жизнеспособности клеток WST8, отображаемой светло-серым цветом. Для всех условий концентрации ДМСО/PBS были нормализованы (буфер). Все условия были выполнены в трех экземплярах, «усы» погрешностей представляют собой стандартное отклонение. Пожалуйста, обратитесь к разделу «Материалы и методы» для получения технической информации.
Пример 6
Анализ слияния спайков SARS-CoV-2. Принцип теста изображен на рисунке 13. Клетки рака шейки матки человека HeLa, сверхэкспрессирующие либо АСЕ2 и люциферазу smallbit, либо спайк SARS-CoV-2 и люциферазу largebit, смешивали в равном количестве с подходящей концентрацией для лечения. Через 24 часа слияние клеток измеряли по количеству репортерного сигнала люциферазы. Сигнал люциферазы наблюдается в зависимости от контроля буфера. Сыворотку разводили до конечной концентрации 1/16. Для всех условий концентрации Sera/PBS были нормализованы (буфер). Все условия были выполнены в трех экземплярах, «усы» погрешностей представляют собой стандартное отклонение (Фиг. 14). Пожалуйста, обратитесь к разделу «Материалы и методы» для получения технической информации.
Пример 7
Количественный ПЦР-анализ проводили для определения количества копий гена протеаз в клетке А549. Число копий рассчитывали с использованием линейной плазмиды для каждого гена в качестве контроля (Фиг. 15а). Пожалуйста, обратитесь к разделу «Материалы и методы» для получения технической информации.
Пример 8
Количественный анализ ПЦР проводили для определения относительной экспрессии генов протеаз АСЕ2 (Фиг. 15b) и TMPRSS2 (Фиг. 15с) в клетках А549. Клеточные линии Calu3 и Сасо2 использовали в качестве эталона для экспрессии соответственно АСЕ2 и TMPRSS2. Для нормализации использовали ген Gapdh. "Усы" погрешностей указывают стандартное отклонение. Пожалуйста, обратитесь к разделу «Материалы и методы» для получения технической информации.
Пример 9
Пептид SARS-CoV-2 50 мкМ, рекомбинантный белок катепсина В 1,76 нг/мкл и ААТ при 1 мкМ инкубировали вместе в течение 45 мин. Флуоресценцию измеряли каждую минуту на УФ-спектрофотометре (возбуждение при 330 нм и детектирование излучения при 390 нм) (Фиг. 16а). Значение Vmax определялось по наклону линии тренда. Эксперимент проводился в двух экземплярах. "Усы" погрешностей указывают стандартное отклонение. Пожалуйста, обратитесь к разделу «Материалы и методы» для получения технической информации.
Пример 10
Пептид SARS-CoV-2 50 мкМ, рекомбинантный белок катепсина L 1,76 нг/мкл и ААТ при 10 мкМ инкубировали вместе в течение 45 мин. Флуоресценцию измеряли каждую минуту на УФ-спектрофотометре (возбуждение при 330 нм и детектирование излучения при 390 нм) (Фиг. 16b). Значение Vmax определялось по наклону линии тренда. Эксперимент проводился в двух экземплярах. "Усы" погрешностей указывают стандартное отклонение. Пожалуйста, обратитесь к разделу «Материалы и методы» для получения технической информации.
Пример 11
Пептид SARS-CoV-2 50 мкМ, рекомбинантный белок трипсина 6,4 нМ и две концентрации ААТ (0,1 мкМ и 1 мкМ) инкубировали вместе в течение 45 мин. Флуоресценцию измеряли каждую минуту на УФ-спектрофотометре (возбуждение при 330 нм и детектирование излучения при 390 нм) (Фиг. 16с). Значение Vmax определялось по наклону линии тренда. Эксперимент проводился в двух экземплярах. "Усы" погрешностей указывают стандартное отклонение. Пожалуйста, обратитесь к разделу «Материалы и методы» для получения технической информации.
Пример 12
Пептид SARS-CoV-2 50 мкМ, рекомбинантный белок фурин 10 ед/мл и ААТ при 1 мкМ инкубировали вместе в течение 45 мин. Флуоресценцию измеряли каждую минуту на УФ-спектрофотометре (возбуждение при 330 нм и детектирование излучения при 390 нм) (Фиг. 16d). Значение Vmax определялось по наклону линии тренда. Эксперимент проводился в двух экземплярах. "Усы" погрешностей указывают стандартное отклонение. Пожалуйста, обратитесь к разделу «Материалы и методы» для получения технической информации.
Пример 13
Пептид SARS-CoV-2 50 мкМ, рекомбинантный белок PCI 1,76 нг/мкл и несколько концентраций ААТ (1 мкМ, 10 мкМ, 40 мкМ и 100 мкМ) инкубировали вместе в течение 45 мин. Флуоресценцию измеряли каждую минуту на УФ-спектрофотометре (возбуждение при 330 нм и детектирование излучения при 390 нм) (Фиг. 16е). Значение Vmax определялось по наклону линии тренда. Эксперимент проводился в двух экземплярах. "Усы" погрешностей указывают стандартное отклонение. Пожалуйста, обратитесь к разделу «Материалы и методы» для получения технической информации.
Пример 14
Пептид SARS-CoV-2 50 мкМ, рекомбинантный белок матриптазы 1,76 нг/мкл и несколько концентраций ААТ (1 мкМ, 10 мкМ, 40 мкМ и 100 мкМ) инкубировали вместе в течение 45 мин. Флуоресценцию измеряли каждую минуту на УФ-спектрофотометре (возбуждение при 330 нм и детектирование излучения при 390 нм) (Фиг. 16f). Значение Vmax определялось по наклону линии тренда. Эксперимент проводился в двух экземплярах. "Усы" погрешностей указывают стандартное отклонение. Пожалуйста, обратитесь к разделу «Материалы и методы» для получения технической информации.
Пример 15
ААТ подавляет активность протеазы TMPRSS2. Пептид Boc-QAR-AMC 30 мкМ, рекомбинантный белок TMPRSS2 0,5 мкМ и ААТ в концентрации 5 мкМ инкубировали вместе в течение 45 мин. Флуоресценцию измеряли каждую минуту на УФ-спектрофотометре (возбуждение при 380 нм и детектирование излучения при 460 нм) (Фиг. 16g). Значение Vmax определялось по наклону линии тренда. Эксперимент проводился в двух экземплярах. "Усы" погрешностей указывают стандартное отклонение. Пожалуйста, обратитесь к разделу «Материалы и методы» для получения технической информации.
Пример 16
Субстрат эластина DQ™ 25 мкг/мл, эластаза (ELA1) из поджелудочной железы свиньи 0,25 Ед/мл и несколько концентраций ААТ (10 нМ, 50 нМ и 100 нМ) инкубировали вместе в течение 45 мин. Флуоресценцию измеряли каждую минуту на флюоресцентном анализаторе (возбуждение при 485 нм и детектирование излучения при 530 нм) (Фиг. 16h). Значение Vmax определялось по наклону линии тренда. Это было выполнено в двух экземплярах. «Усы» погрешностей указывают стандартное отклонение. Пожалуйста, обратитесь к разделу «Материалы и методы» для получения технической информации.
Пример 17
Субстрат MeOSuc-AAPV-pNA 100 мкМ, очищенная эластаза нейтрофилов человека (ELA2) 2,2 мкЕ/мкл и несколько концентраций ААТ (1 нМ и 10 нМ) инкубировали вместе в течение 45 мин. Поглощение измеряли каждую минуту на считывающем устройстве для спектрофотометра (А405 нм) (Фиг. 16i). Значение Vmax определялось по наклону линии тренда в течение 20 мин. Это было выполнено в двух экземплярах. "Усы" погрешностей указывают стандартное отклонение. Пожалуйста, обратитесь к разделу «Материалы и методы» для получения технической информации.
Пример 18
Измерение титра проводили с использованием метода Octet RED (Sartorius, Octet RED96), биосенсоров на основе протеина A (Sartorius, Ref 18-5010; 18-5012), hAAT антитела мыши Мс IgG2A (abeam, abl 16604), буфера нейтрализации (MBD; 0, Связывание 0,02% Tween 20, 150 мМ, NaCl, 1 мг/мл BSA, PBS1X) и регенерационного буфера (MBD; 10 мМ глицин-HCL (рН2)), как показано на Фиг. 26. Сравнение ААТ, полученного из плазмы (Sigma-Aldrich, SRP6312), и рекомбинантного ААТ, продуцируемого в СНО пулом PL136/PL137 (Фиг. 17).
Пример 19
Клетки микроглии человека НМС3-MHCIILuc высевали в день 0, активировали IFNγ в день 1 до дня 2, а измерение активности люциферазы и жизнеспособности клеток проводили на 4 день (Фиг. 18а). Активацию измеряли по активности люциферазы, управляемой МНСП, и нормализовали по жизнеспособности клеток. Люциферазная активность для всех условий представлена в виде кратности контрольных необработанных клеток (Фиг. 18b). Все условия были выполнены в трех экземплярах, «усы» погрешностей представляют собой стандартное отклонение
Пример 20
Клетки микроглии человека HMC3-MHCIILuc и HMC3-MHCIILuc;UbiAAT высевали в день 0, активировали IFNγ в день 1 до дня 2, а измерение активности люциферазы и жизнеспособности клеток измеряли на 4 день. ААТ, полученный из плазмы, наносили с 0 по 4 день на клетки HMC3-MHCIILuc (Фиг. 19а). Активацию измеряли по активности люциферазы, управляемой MHCII, и нормализовали по жизнеспособности клеток. Люциферазная активность для всех условий представлена как процент от контроля активации IFNγ (Фиг. 19b). Все условия были выполнены в трех экземплярах, «усы» погрешностей представляют собой стандартное отклонение
Пример 21
Клетки микроглии человека НМС3-MHCII Luc высевали в день 0, подвергали воздействию IFNγ и/или IFNβ в дни с 1 по 2 и измерение активности люциферазы и жизнеспособности клеток проводили на 4 день. ААТ, полученный из плазмы, применяли с 0 по 4 день (Фиг. 20а). Активацию измеряли по активности люциферазы, управляемой MHCII, и нормализовали по жизнеспособности клеток. Люциферазная активность для всех условий представлена как процент от контроля активации IFNγ (Фиг. 20b). Полоски для ААТ, полученного из плазмы (1, 10, 25 мкМ), повторяют пример 20 для целей сравнения. Все условия были выполнены в трех экземплярах, «усы» погрешностей представляют собой стандартное отклонение.
Пример 22
Кумасси Условные обозначения к рисунку: SDS-PAGE, окрашенный кумасси ААТ из нескольких источников. Образцы, подвергнутые анализу, были подготовлены для анализа путем смешивания с 4-кратным буфером для образцов LDS NuPage (Life Technologies) и 10-кратным восстанавливающим агентом NuPage (Life Technologies) и инкубированы при 70°С, 10 мин. Для невосстановленных образцов восстановитель и тепловая инкубация не учитывались. На каждую дорожку загружали 5 мкг белка. Образцы подвергали электрофорезу на 4-20% готовых гелях Mini-PROTEAN® (BioRad) с буфером TGS. Затем гели фиксировали в течение 30 минут при комнатной температуре в буфере для фиксации (50% метанол+10% уксусная кислота +40% H2O). Кумасси синий (Sigma Aldrich) добавляли до конечной концентрации 0,25% и инкубировали в течение дополнительных 15 минут. Наконец, гели обесцвечивали в течение ночи многократными промываниями буфера для фиксации и отображали на имидж-сканере G: Box (Syngene) (Фиг. 24).
Пример 23
Экспрессия рекомбинантного человеческого ААТ в клетках HEK 293. На основе SEQ ID NO: 46 для HEK293 или SEQ ID NO: 47 для HEK293T. Для HEK293 клон экспрессии rhAAT, содержащий плазмиду SERPINAl_OHu22141C_pcDNA3.1 (+), был получен из вектора, показанного на Фиг. 25g. Последовательность клона, содержащего плазмиду, проверяли и получали достаточное количество плазмиды для трансфекции клеток HEK 293 (АТСС, Каталожный № CRL-1573). Клетки HEK293 трансфицировали плазмидой, и экспрессия rhAAT и секреция в культуральном бульоне в 3 наборах 6-луночных планшетов подтверждали с использованием коммерчески доступного набора для твердофазного ИФА (Thermo Fischer Scientific, Каталожный № EH411RBX5). Мок-трансфицированные клетки, а также клетки, трансфицированные флуоресцентными маркерами pCMV-Td Tomato и EGFP, использовали в качестве контроля.
ПРОЦЕДУРА
Производство rhAAT в клетках HEK 293 было выполнено в два этапа:
1. Получение клеток, экспрессирующих rhAAT.
2. Производство rhAAT.
Получение клеток, экспрессирующих rhAAT
Приготовление клеток, экспрессирующих rhAAT, включало следующие действия:
- Конструирование и проверка готовой к экспрессии плазмиды
- Трансфекция клеток-хозяев
- Создание пулов, экспрессирующих rhAAT (стабильных)
- Выбор клонов.
Конструирование и проверка готовой к экспрессии плазмиды
На основе последовательности, представленной в SEQ ID NO: 46, Genscript Biotech Corporation (Пискатавэй, штат Нью-Джерси) был получен клон экспрессии rhAAT, содержащий плазмиду SERPINA1_OHu22141C_pcDNA3.1 (+).
Клон, содержащий плазмиду, был отправлен в RTI International (Research Triangle Park, NC) для проверки последовательности и получения достаточного количества плазмиды для трансфекции клеток HEK 293.
Временная трансфекция клеток-хозяев
Клетки HEK293 трансфицировали плазмидой SERPINA1_OHu22141C_pcDNA3.1 (+), и экспрессию и секрецию rhAAT в культуральный бульон в 3 наборах 6-луночных планшетов подтверждали с использованием коммерчески доступного набора для твердофазного ИФА. Мок-трансфицированные клетки, а также клетки, трансфицированные флуоресцентными маркерами pCMV-Td Tomato и EGFP, использовали в качестве контроля.
Создание пулов, экспрессирующих rhAAT (стабильных)
После подтверждения успешной временной трансфекции создание стабильных пулов было выполнено в Т-150 путем отбора антибиотиков. Клетки выдерживали до 2 недель при селекции антибиотиков для удаления клеток без плазмиды. После этого супернатант культуры тестировали на экспрессию белка с помощью твердофазного ИФА.
Объединенные клетки замораживали при 80°С перед переносом для дальнейшего размножения клеток и продукции rhAAT во встряхиваемых колбах.
Выбор клонов
Клетки собирали, разбавляли и переносили в чашки площадью 10 см2 для выделения единичных клонов. 3-6 клонов из 50-96 колоний, в зависимости от поведения трансгена, были идентифицированы для последующего подтверждения экспрессии rhAAT с помощью твердофазного ИФА.
Производство rhAAT
Производство rhAAT включает размножение клеток и продуцирование rhAAT в клеточных стеках, очистку rhAAT с помощью аффинной хроматографии, концентрацию продукта и состав (замена буфера) с использованием пробирок Amicon Ultra 15, 10 кДа.
Экспансия клеток и производство rhAAT в клеточных стеках
Рекомбинантные зависимые от закрепления клетки HEK-293 выращивали в обработанных культурой Т-колбах и бутылях стека клеток в среде Игла, модифицированной по Дульбекко (DMEM, HyClone), с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS, Gibco), пенициллина-стрептомицина (Gibco), и Генетицин-селективный антибиотик G418 сульфат (Gibco). Культуры инкубировали в увлажненном инкубаторе при 37,0°С и 5% СО2 и вращении со скоростью 2,5 об/мин при выращивании в роликовых флаконах и последующем сборе.
Очистка rhAAT с помощью аффинной хроматографии
Осветленный культуральный супернатант тестировали на рН и проводимость и титровали до 7,4±0,1 с использованием 1 М Трис, рН 7,4 и ± 5 мСм/см уравновешивающего буфера с 1 М NaCl, соответственно, при необходимости. После корректировки рН и проводимости осветленный супернатант перед очисткой фильтровали через фильтр 0,2 мкм.
Аффинная хроматография
Колонку для аффинной хроматографии, заполненную смолой rhAAT Select, промывали 3CV очищенной воды и дезинфицировали 3CV 0,5 М NaOH (с выдержкой 30 минут после 2CV), затем еще раз промывали 3CV очищенной воды и уравновешивали 10CV 0f 20 мМ Трис, 150 мМ буфера NaCl рН 7,4. В колонку rhAAT Select загружали максимальный объем осветленного супернатанта, рассчитанный на основе титра rhAAT в конце культивирования во встряхиваемой колбе, объема осветленного супернатанта и максимальной загрузки колонки 10 мг/мл смолы. При необходимости, чтобы избежать перегрузки смолы, осветленный супернатант обрабатывали через колонку rhAAT Select в несколько циклов. Загруженный белок промывали 4CV буфера 20 мМ Трис, 150 мМ NaCl, рН 7,4 и rhAAT, элюируя буфером 4CV 0f 20 мМ Трис, 2 М MgCl, рН 7,4, в ПЭТГ бутыли для сбора. Колонку очищали 4CV буфера PBS, рН 2,0 и, если необходимо, уравновешивали 3CV буфера 20 мМ Tris, 150 мМ NaCl рН 7,4 перед проведением дополнительных циклов.
Пример 24
Конструирование векторов PL136 (pCGS3_AAT_native_SP; Фиг. 25d) (исходный сигнальный пептид в сайтах рестрикции HindIII/XhoI (LC MCS)) и PL137 (pCGS3_ААТ_SP5, Фиг. 25е) (одиночный пептид SEQ ID NO: 1 был оптимизирован заменой аминокислот 1-24 с оптимизированным сигнальным пептидом ATUMSM (Ньюарк, штат Калифорния)).
Кодирующие последовательности были оптимизированы по кодонам для экспрессии в клетках яичника китайского хомячка с использованием запатентованного алгоритма DNA2.0 (GeneGPS® Expression OptimizationTechnology, https://www.dna20.com/services/genegps). Каноническая последовательность кодака (GCCGCCACC) была добавлена перед стартовым кодоном. Сайты рестрикции HindIII и XhoI были добавлены через 5' и 3' синтезированных кодирующих последовательностей.
Полученные фрагменты ДНК клонировали в вектор pJ201. Предоставляются полная карта плазмиды и последовательность клона pJ201_AAT_native_SP (Фиг. 25b) и pJ201_AAT_SP5 (Фиг. 25с).
pCGS3_AAT_native_SP и pCGS3_AAT_SP5 были получены в соответствии со следующей схемой клонирования (пустой вектор pCGS3, Фиг. 25f):
Подготовка фрагментов:
Все расщепленные продукты инкубировали в течение 2 часов при 37°С. Представляющие интерес фрагменты выделяли электрофорезом в агарозном геле (1,2% агарозный гель). Фрагменты ожидаемого размера вырезали, очищали в геле и использовали для следующих лигирований:
Лигирования
Смеси для лигирования (1 мкл) трансформировали клетки Е. coli Stabl2 от Invitrogen. Трансформированные клетки Е. coli культивировали на LB Agar Lennox, Animal Free, содержащем 50 мг/л карбенициллина. Колонии Е. coli переносили в 4 мл LB Broth Lennox, Animal Free, содержащего 50 мг/л ампициллина, и инкубировали в течение ночи при 33°С в шейкере-инкубаторе при 300 об/мин. Плазмидную ДНК выделяли из культур Е. coli с использованием Qiagen BioRobot 9600 и набора плазмид Nucleo Spin Robot-8 от Macherey-Nagel. Затем ДНК секвенировали с использованием праймеров, специфичных для цепочек, покрывающих сайты клонирования.
Было подтверждено, что последовательности следующих клонов идентичны ожидаемым клонам PL136 (pCGS3 ААТ native SP; Фиг. 25d) и PL137 (pCGS3_ААТ_SP5, Фиг. 25е). Объединяли ААТ, полученные из PL136 в СНО и PL137 в СНО.
Пример 25
Синтез генов и конструирование одного гена
Вектор с одним геном rhAAT был сконструирован путем субклонирования гена продукта в вектор рХС-17.4 (Lonza) (Фиг. 25а).
Амплификация ДНК
1 мкл векторной ДНК использовали для трансформации химически компетентных клеток Е. coli One Shot® Stbl3 (Life Technologies, C7373-03) с использованием метода теплового шока в соответствии с инструкциями производителя. Клетки помещали на чашки с агаром LB, содержащим ампициллин (50 мкг/мл) (LB Broth Base, Select APS™ и Bacto-Agar, оба Becton Dickinson, 292438 и 214010 соответственно) и инкубировали в течение ночи при 37°С до появления бактериальных колоний.
Для препаратов Giga использовали отдельные бактериальные культуры для инокуляции заквасочной культуры, которую впоследствии использовали для инокуляции 1,0 л среды Plasmid Plus (Thomson, 446300), содержащей 50 мкг ампициллина, и инкубировали при 37°С в течение ночи при встряхивании. Векторная ДНК была выделена с использованием системы QIAGEN Gigaprep (Qiagen, 12291). Во всех случаях концентрацию ДНК измеряли с помощью спектрофотометра Nanodrop 1000 (Thermo-Scientific) и доводили до 1 мг/мл. Качество ДНК оценивали путем измерения коэффициента поглощения при 260 и 280 нм.
Обычная культура клеток CHOK1SV GS-KO
Клетки CHOK1SV GS-KO культивировали в среде CD-CHO (Life Technologies, 10743-029) с добавлением 6 мМ L-глутамина (Life Technologies, 25030-123). Клетки инкубировали во встряхивателе-инкубаторе при 36,5°С, 5% CO2, влажности 85%, 140 об/мин. Клетки обычно субкультивировали каждые 3-4 дня, высев при 0,2×106 клеток/мл, и размножали, чтобы иметь достаточное количество клеток, доступных для трансфекции. Клетки отбрасывали до 20-го пассажа.
Стабильные рекомбинантные клетки CHOK1SV GS-KO культивировали в среде CD-CHO с добавлением 50 мкМ MSX (L-метионин сульфоксимин, Sigma-Aldrich, М5379) и SP4. Клетки инкубировали во встряхивателе-инкубаторе при 36,5°С, 5% CO2, влажности 85%, 140 об/мин. Клетки обычно субкультивировали каждые 3-4 дня, высев при 0,2×106 клеток/мл, и размножали, чтобы иметь достаточно клеток, доступных для крупномасштабного избыточного роста с подпиткой.
Стабильная объединенная трансфекция клеток CHOKISV GS-KO
Плазмиду ДНК с одним геном вектора готовили для трансфекции линеаризацией с помощью Pvul с последующим осаждением этанолом и ресуспендированием в буфере ЕВ до конечной концентрации 400 мкг/мл. Трансфекцию проводили путем электропорации с использованием Gene Pulse XCell. Для каждой трансфекции жизнеспособные клетки ресуспендировали в предварительно нагретой среде CD-CHO до 1,43×107 клеток/мл. 100 мкл линеаризованной ДНК в концентрации 400 мкг/мл помещали в кювету для электропорации с зазором 0,4 см и добавляли 700 мкл клеточной суспензии. Три кюветы с клетками и ДНК подвергали электропорации при 300 В, 900 мкФ и сразу же восстанавливали до 30 мл предварительно нагретого CD-CHO с добавлением 10 мл/л SP4 (Lonza, BESP1076E) для создания стабильного пула. Трансфектанты инкубировали во встряхивателе-инкубаторе при 36,5°С, 5% CO2, влажности 85%, 140 об/мин.
Всего было создано 3 стабильных пула трансфектантов. Через 24 часа после трансфекции культуры центрифугировали и ресуспендировали в предварительно нагретом CD-CHO с добавлением 50 мкМ MSX и 10 мл/л SP4. После трансфекции периодически проверяли рост и жизнеспособность клеток.
Когда плотность жизнеспособных клеток составляла >0,6×106 клеток/мл, трансфектантные культуры были прзнаны пригодными для развития. Клетки высевали из расчета 0,2×106 клеток/мл в конечном объеме 100 мл в среду CD-CHO с добавлением 50 мкМ MSX/10 мл/л SP4 в колбу Эрленмейера на 500 мл (Fisher Scientific (Corning), 10352742) и инкубировали во встряхивателе-инкубаторе при 36,5°С, 5% CO2, влажности 85%, 140 об/мин. Клеточные культуры контролировались и увеличивались после того, как культуры адаптировались к экспоненциальному росту. Культуры увеличивали до 200 мл культурального объема в колбах Эрленмейера объемом 500 мл при концентрации 0,2×106 клеток/мл в CD-CHO с добавлением 50 мкМ MSX/10 мл/л SP4 и инкубировали в условиях, описанных выше (см. Раздел 0). Затем культуры были увеличены до соответствующего объема производства.
Сокращенное стационарное культивирование с подпиткой с быстрым ростом
Клетки размножали до производственного объема 2 л на продукт, высевая соответствующий объем культуры из расчета 0,2×106 клеток/мл в базовую среду Lonza СМ42 с добавлением 4 мл/л SPE из установленных стабильных пулов. Объемы продукции устанавливали во встряхиваемых колбах объемом 5 л (Generon, 931116) и инкубировали в инкубаторе со встряхиванием при 36,5°С, 5% CO2, влажности 85% и 140 об/мин. Количество клеток и их жизнеспособность контролировали на 4-й день, до начала кормления и периодически до сбора культуры на 11-й день. На 4 и 8 день вводили болюсное питание, состоящее из смеси собственных кормов Lonza.
Заготовка и концентрирование производственной культуры
Культуру собирали центрифугированием при 3000 об/мин в течение 10 мин и фильтровали с использованием мембраны PES 0,22 мкм для получения осветленного супернатанта.
Аффинная хроматография с альфа-1 антитрипсином
Осветленный клеточный супернатант очищали с использованием упакованной 50 мл колонки Alpha-1 с антитрипсином Select собственного производства (GE Healthcare). Колонку уравновешивали до и после нанесения продукта 20 мМ Трис, 150 мМ NaCl, рН 7,4, а элюирование проводили 20 мМ Трис, 2 М MgCl2, рН 7,4. Процедуру проводили на очистителе АКТА со скоростью 10 мл/мин. Фракции, содержащие продукт, из элюата для аффинной хроматографии объединяли и буфер заменяли на 50 мМ Трис, 75 мМ NaCl, рН 8,0 с помощью фильтрации с тангенциальным потоком (TFF) с использованием системы Spectrum KrosFlo TFF с MWCO 10 кДа (D02-E010-05-N).
Анионообменная хроматография
Объединенные фракции и фракции с замененным буфером дополнительно очищали с использованием колонки CaptoQ объемом 25 мл (5 колонок по 5 мл, соединенных тандемом) (GE Healthcare) на очистителе АКТА со скоростью 10 мл/мин. Колонку уравновешивали до и после нанесения продукта с помощью 50 мМ Трис, 75 мМ NaCl, Ph 8,0. Продукт элюировали линейным градиентом 10 CV до 50 мМ Трис, 1 М NaCl, рН 8,0. Содержащие продукт фракции из элюата анионообменной хроматографии объединяли, разбавляли 1 мг/мл и анализировали качество.
Эксклюзионная ВЭЖХ
Повторяющиеся образцы анализировали с помощью эксклюзионной ВЭЖХ в системе ВЭЖХ Agilent серии 1200 с использованием колонки Zorbax GF-250 9,4 мМ ID × 25 см (Agilent). Аликвоты по 80 мкл образцов 1 мг/мл (или исходной концентрации, если образцы <1 мг/мл) вводили и прогоняли в 50 мМ фосфате натрия, 150 мМ хлориде натрия, 500 мМ аргинине, рН 6,0 при 1 мл/мин в течение 15 минут. Уровни растворимых агрегатов анализировали с использованием программного обеспечения Empower. Сигналы, возникающие от составляющих буфера, анализировали путем введения холостого буфера и не включались в анализ данных, если не указано иное.
Концентрация продукта
Очищенный продукт концентрировали до целевого значения 25 мг/мл с использованием центробежных фильтров Vivaspin Turbo-15 с отсечкой молекулярной массы 30 кДа (Sartorius, VS15T02).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Wrapp, D., et al., Крио-ЭМ структура шипа 2019-nCoV в конформации до слияния (Cryo-EM structure of the 2019-nCoV spike in the prefusion conformation). Science, 2020. 367(6483): c. 1260-1263.
2. Jaimes, JA, JK Millet и GR Whittaker, Протеолитическое расщепление спайкового
белка SARS-CoV-2 и роль нового сайта S1/S2 (Proteolytic Cleavage of the SARS-CoV-2 Spike Protein and the Role of the Novel SI/ S2 Site). iScience, 2020. 23(6): c. 101212.
3. Korber, В., et al., «Конвейер мутаций Spike» свидетельствует о появлении более трансмиссивной формы SARS-CoV-2 (Spike mutation pipeline reveals the emergence of a more transmissible form of SARS-CoV-2). bioRxiv, 2020: c. 2020.04.29.069054.
4. Becerra-Flores, M. и Т. Cardozo, Мутация вирусного спайкового белка SARS-CoV-2 G614 демонстрирует более высокий уровень летальности (SARS-CoV-2 viral spike G614 mutation exhibits higher case fatality rate). Int J Clin Pract, 2020.
5. Li, Q., et al., Влияние мутаций в спайковом белке SARS-CoV-2 на вирусную инфекцию и антигенность (The Impact of Mutations in SARS-CoV-2 Spike on Viral Infectivity and Antigenicity). Cell, 2020.
6. Ogawa, J., et al., Мутация D614G в спайковом белке SARS-CoV-2 увеличивает инфекционность зависимым от рецептора АСЕ2 образом (The D614G mutation in the SARS-CoV-2 Spike protein increases infectivity in an ACE2 receptor dependent manner). bioRxiv, 2020.
7. Goodfellow, I. Goodfellow, and S.I. Taube, Репликация калицивирусов и обратная генетика (Calicivirus Replication and Reverse Genetics)
Viral Gastroenteritis: Molecular Epidemiology and Pathogenesis. 2016: c. 355-378.
8. Yin, W., et al., Структурная основа ингибирования РНК-зависимой РНК-полимеразы SARS-CoV-2 ремдесивиром (Structural basis for inhibition of the RNA-dependent RNA polymerase from SARS-CoV-2 by remdesivir). Science, 2020.
9. Gao, Y., et al., Структура РНК-зависимой РНК-полимеразы вируса COVID-19 (Structure of the RNA-dependent RNA polymerase from COVID-19 virus). Science, 2020. 368(6492): c. 779-782.
10. Pachetti, M., et al., Новые горячие точки мутации SARS-CoV-2 включают новый вариант РНК-зависимой РНК-полимеразы (Emerging SARS-CoV-2 mutation hot spots include a novel RNA-dependent-RNA polymerase variant). J Transl Med, 2020. 18(1): c. 179.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> Атлас Байотекнолоджи С.А.
<120> Лечение и/или профилактика заболевания или синдрома, связанного
с вирусной инфекцией
<130> AD2955 PCT BS
<160> 47
<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 418
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Альфа1‐Антитрипсин (AAT)
<400> 1
Met Pro Ser Ser Val Ser Trp Gly Ile Leu Leu Leu Ala Gly Leu Cys
1 5 10 15
Cys Leu Val Pro Val Ser Leu Ala Glu Asp Pro Gln Gly Asp Ala Ala
20 25 30
Gln Lys Thr Asp Thr Ser His His Asp Gln Asp His Pro Thr Phe Asn
35 40 45
Lys Ile Thr Pro Asn Leu Ala Glu Phe Ala Phe Ser Leu Tyr Arg Gln
50 55 60
Leu Ala His Gln Ser Asn Ser Thr Asn Ile Phe Phe Ser Pro Val Ser
65 70 75 80
Ile Ala Thr Ala Phe Ala Met Leu Ser Leu Gly Thr Lys Ala Asp Thr
85 90 95
His Asp Glu Ile Leu Glu Gly Leu Asn Phe Asn Leu Thr Glu Ile Pro
100 105 110
Glu Ala Gln Ile His Glu Gly Phe Gln Glu Leu Leu Arg Thr Leu Asn
115 120 125
Gln Pro Asp Ser Gln Leu Gln Leu Thr Thr Gly Asn Gly Leu Phe Leu
130 135 140
Ser Glu Gly Leu Lys Leu Val Asp Lys Phe Leu Glu Asp Val Lys Lys
145 150 155 160
Leu Tyr His Ser Glu Ala Phe Thr Val Asn Phe Gly Asp Thr Glu Glu
165 170 175
Ala Lys Lys Gln Ile Asn Asp Tyr Val Glu Lys Gly Thr Gln Gly Lys
180 185 190
Ile Val Asp Leu Val Lys Glu Leu Asp Arg Asp Thr Val Phe Ala Leu
195 200 205
Val Asn Tyr Ile Phe Phe Lys Gly Lys Trp Glu Arg Pro Phe Glu Val
210 215 220
Lys Asp Thr Glu Glu Glu Asp Phe His Val Asp Gln Val Thr Thr Val
225 230 235 240
Lys Val Pro Met Met Lys Arg Leu Gly Met Phe Asn Ile Gln His Cys
245 250 255
Lys Lys Leu Ser Ser Trp Val Leu Leu Met Lys Tyr Leu Gly Asn Ala
260 265 270
Thr Ala Ile Phe Phe Leu Pro Asp Glu Gly Lys Leu Gln His Leu Glu
275 280 285
Asn Glu Leu Thr His Asp Ile Ile Thr Lys Phe Leu Glu Asn Glu Asp
290 295 300
Arg Arg Ser Ala Ser Leu His Leu Pro Lys Leu Ser Ile Thr Gly Thr
305 310 315 320
Tyr Asp Leu Lys Ser Val Leu Gly Gln Leu Gly Ile Thr Lys Val Phe
325 330 335
Ser Asn Gly Ala Asp Leu Ser Gly Val Thr Glu Glu Ala Pro Leu Lys
340 345 350
Leu Ser Lys Ala Val His Lys Ala Val Leu Thr Ile Asp Glu Lys Gly
355 360 365
Thr Glu Ala Ala Gly Ala Met Phe Leu Glu Ala Ile Pro Met Ser Ile
370 375 380
Pro Pro Glu Val Lys Phe Asn Lys Pro Phe Val Phe Leu Met Ile Glu
385 390 395 400
Gln Asn Thr Lys Ser Pro Leu Phe Met Gly Lys Val Val Asn Pro Thr
405 410 415
Gln Lys
<210> 2
<211> 44
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность 374‐418 в С‐концевой области ААТ
<400> 2
Met Phe Leu Glu Ala Ile Pro Met Ser Ile Pro Pro Glu Val Lys Phe
1 5 10 15
Asn Lys Pro Phe Val Phe Leu Met Ile Glu Gln Asn Thr Lys Ser Pro
20 25 30
Leu Phe Met Gly Lys Val Val Asn Pro Thr Gln Lys
35 40
<210> 3
<211> 7
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Короткий циклический пептид, полученный из С‐концевой области
альфа‐1‐антитрипсина
<400> 3
Cys Pro Phe Val Phe Leu Met 1 5
<210> 4
<211> 7
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Короткий циклический пептид, полученный из С‐концевой области
альфа‐1‐антитрипсина
<400> 4
Cys Pro Phe Val Phe Leu Glu 1 5
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Короткий циклический пептид, полученный из С‐концевой области
альфа‐1‐антитрипсина
<400> 5
Cys Pro Phe Val Phe Leu Arg 1 5
<210> 6
<211> 7
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Короткий циклический пептид, полученный из С‐концевой области
альфа‐1‐антитрипсина
<400> 6
Cys Pro Glu Val Phe Leu Met 1 5
<210> 7
<211> 10
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> пептид 48‐57 HIV‐TAT
<400> 7
Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 10
<210> 8
<211> 15
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Пептид 35‐49, белка обоблочки вируса FHV
<400> 8
Arg Arg Arg Arg Asn Arg Thr Arg Arg Asn Arg Arg Arg Val Arg 1 5 10 15
<210> 9
<211> 13
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> пептид 4‐16 HTLV‐II Rex
<400> 9
Thr Arg Arg Gln Arg Thr Arg Arg Ala Arg Arg Asn Arg 1 5 10
<210> 10
<211> 19
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> пептид 7‐25 BMV gag
<400> 10
Lys Met Thr Arg Ala Gln Arg Arg Ala Ala Ala Arg Arg Asn Arg Trp 1 5
10 15
Thr Ala Arg
<210> 11
<211> 11
<212> PRT
<213> Вирусы
<220>
<223> Флуорогенные пептиды, полученные из спайк‐белка SARS‐CoV2
<400> 11
His Thr Val Ser Leu Leu Arg Ser Thr Ser Gln 1 5 10
<210> 12
<211> 11
<212> PRT
<213> Вирусы
<220>
<223> Флуорогенные пептиды, полученные из спайк‐белка SARS‐CoV2
<400> 12
Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg Ser Val Ala 1 5 10
<210> 13
<211> 7394
<212> DNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Лентивирусный вектор pCDH‐CMV‐MCS‐EF1α‐Puro
<400> 13
acgcgtgtag tcttatgcaa tactcttgta gtcttgcaac atggtaacga tgagttagca 60
acatgcctta caaggagaga aaaagcaccg tgcatgccga ttggtggaag taaggtggta 120
cgatcgtgcc ttattaggaa ggcaacagac gggtctgaca tggattggac gaaccactga 180
attgccgcat tgcagagata ttgtatttaa gtgcctagct cgatacaata aacgggtctc 240
tctggttaga ccagatctga gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta 300
agcctcaata aagcttgcct tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact 360
ctggtaacta gagatccctc agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agcagtggcg 420
cccgaacagg gacctgaaag cgaaagggaa accagagctc tctcgacgca ggactcggct 480
tgctgaagcg cgcacggcaa gaggcgaggg gcggcgactg gtgagtacgc caaaaatttt 540
gactagcgga ggctagaagg agagagatgg gtgcgagagc gtcagtatta agcgggggag 600
aattagatcg cgatgggaaa aaattcggtt aaggccaggg ggaaagaaaa aatataaatt 660
aaaacatata gtatgggcaa gcagggagct agaacgattc gcagttaatc ctggcctgtt 720
agaaacatca gaaggctgta gacaaatact gggacagcta caaccatccc ttcagacagg 780
atcagaagaa cttagatcat tatataatac agtagcaacc ctctattgtg tgcatcaaag 840
gatagagata aaagacacca aggaagcttt agacaagata gaggaagagc aaaacaaaag 900
taagaccacc gcacagcaag cggccactga tcttcagacc tggaggagga gatatgaggg 960
acaattggag aagtgaatta tataaatata aagtagtaaa aattgaacca ttaggagtag
1020
cacccaccaa ggcaaagaga agagtggtgc agagagaaaa aagagcagtg ggaataggag
1080
ctttgttcct tgggttcttg ggagcagcag gaagcactat gggcgcagcg tcaatgacgc
1140
tgacggtaca ggccagacaa ttattgtctg gtatagtgca gcagcagaac aatttgctga
1200
gggctattga ggcgcaacag catctgttgc aactcacagt ctggggcatc aagcagctcc
1260
aggcaagaat cctggctgtg gaaagatacc taaaggatca acagctcctg gggatttggg
1320
gttgctctgg aaaactcatt tgcaccactg ctgtgccttg gaatgctagt tggagtaata
1380
aatctctgga acagatttgg aatcacacga cctggatgga gtgggacaga gaaattaaca
1440
attacacaag cttaatacac tccttaattg aagaatcgca aaaccagcaa gaaaagaatg
1500
aacaagaatt attggaatta gataaatggg caagtttgtg gaattggttt aacataacaa
1560
attggctgtg gtatataaaa ttattcataa tgatagtagg aggcttggta ggtttaagaa
1620
tagtttttgc tgtactttct atagtgaata gagttaggca gggatattca ccattatcgt
1680
ttcagaccca cctcccaacc ccgaggggac ccgacaggcc cgaaggaata gaagaagaag
1740
gtggagagag agacagagac agatccattc gattagtgaa cggatctcga cggtatcggt
1800
taacttttaa aagaaaaggg gggattgggg ggtacagtgc aggggaaaga atagtagaca
1860
taatagcaac agacatacaa actaaagaat tacaaaaaca aattacaaaa ttcaaaattt
1920
tatcgattac tagtattatg cccagtacat gaccttatgg gactttccta cttggcagta
1980
catctacgta ttagtcatcg ctattaccat ggtgatgcgg ttttggcagt acatcaatgg
2040
gcgtggatag cggtttgact cacggggatt tccaagtctc caccccattg acgtcaatgg
2100
gagtttgttt tggcaccaaa atcaacggga ctttccaaaa tgtcgtaaca actccgcccc
2160
attgacgcaa atgggcggta ggcgtgtacg gtgggaggtt tatataagca gagctcgttt
2220
agtgaaccgt cagatcgcct ggagacgcca tccacgctgt tttgacctcc atagaagatt
2280
ctagagctag cgaattcgaa tttaaatcgg atccgcggcc gcaaggatct gcgatcgctc
2340
cggtgcccgt cagtgggcag agcgcacatc gcccacagtc cccgagaagt tggggggagg
2400
ggtcggcaat tgaacgggtg cctagagaag gtggcgcggg gtaaactggg aaagtgatgt
2460
cgtgtactgg ctccgccttt ttcccgaggg tgggggagaa ccgtatataa gtgcagtagt
2520
cgccgtgaac gttctttttc gcaacgggtt tgccgccaga acacagctga agcttcgagg
2580
ggctcgcatc tctccttcac gcgcccgccg ccctacctga ggccgccatc cacgccggtt
2640
gagtcgcgtt ctgccgcctc ccgcctgtgg tgcctcctga actgcgtccg ccgtctaggt
2700
aagtttaaag ctcaggtcga gaccgggcct ttgtccggcg ctcccttgga gcctacctag
2760
actcagccgg ctctccacgc tttgcctgac cctgcttgct caactctacg tctttgtttc
2820
gttttctgtt ctgcgccgtt acagatccaa gctgtgaccg gcgcctacga tatgaccgag
2880
tacaagccca cggtgcgcct cgccacccgc gacgacgtcc ccagggccgt acgcaccctc
2940
gccgccgcgt tcgccgacta ccccgccacg cgccacaccg tcgatccgga ccgccacatc
3000
gagcgggtca ccgagctgca agaactcttc ctcacgcgcg tcgggctcga catcggcaag
3060
gtgtgggtcg cggacgacgg cgccgcggtg gcggtctgga ccacgccgga gagcgtcgaa
3120
gcgggggcgg tgttcgccga gatcggcccg cgcatggccg agttgagcgg ttcccggctg
3180
gccgcgcagc aacagatgga aggcctcctg gcgccgcacc ggcccaagga gcccgcgtgg
3240
ttcctggcca ccgtcggcgt ctcgcccgac caccagggca agggtctggg cagcgccgtc
3300
gtgctccccg gagtggaggc ggccgagcgc gccggggtgc ccgccttcct ggagacctcc
3360
gcgccccgca acctcccctt ctacgagcgg ctcggcttca ccgtcaccgc cgacgtcgag
3420
gtgcccgaag gaccgcgcac ctggtgcatg acccgcaagc ccggtgcctg acaatcaacc
3480
tctggattac aaaatttgtg aaagattgac tggtattctt aactatgttg ctccttttac
3540
gctatgtgga tacgctgctt taatgccttt gtatcatgct attgcttccc gtatggcttt
3600
cattttctcc tccttgtata aatcctggtt gctgtctctt tatgaggagt tgtggcccgt
3660
tgtcaggcaa cgtggcgtgg tgtgcactgt gtttgctgac gcaaccccca ctggttgggg
3720
cattgccacc acctgtcagc tcctttccgg gactttcgct ttccccctcc ctattgccac
3780
ggcggaactc atcgccgcct gccttgcccg ctgctggaca ggggctcggc tgttgggcac
3840
tgacaattcc gtggtgttgt cggggaaatc atcgtccttt ccttggctgc tcgcctgtgt
3900
tgccacctgg attctgcgcg ggacgtcctt ctgctacgtc ccttcggccc tcaatccagc
3960
ggaccttcct tcccgcggcc tgctgccggc tctgcggcct cttccgcgtc ttcgccttcg
4020
ccctcagacg agtcggatct ccctttgggc cgcctccccg cctggtacct ttaagaccaa
4080
tgacttacaa ggcagctgta gatcttagcc actttttaaa agaaaagggg ggactggaag
4140
ggctaattca ctcccaacga agataagatc tgctttttgc ttgtactggg tctctctggt
4200
tagaccagat ctgagcctgg gagctctctg gctaactagg gaacccactg cttaagcctc
4260
aataaagctt gccttgagtg cttcaagtag tgtgtgcccg tctgttgtgt gactctggta
4320
actagagatc cctcagaccc ttttagtcag tgtggaaaat ctctagcagt agtagttcat
4380
gtcatcttat tattcagtat ttataacttg caaagaaatg aatatcagag agtgagagga
4440
acttgtttat tgcagcttat aatggttaca aataaagcaa tagcatcaca aatttcacaa
4500
ataaagcatt tttttcactg cattctagtt gtggtttgtc caaactcatc aatgtatctt
4560
atcatgtctg gctctagcta tcccgcccct aactccgccc atcccgcccc taactccgcc
4620
cagttccgcc cattctccgc cccatggctg actaattttt tttatttatg cagaggccga
4680
ggccgcctcg gcctctgagc tattccagaa gtagtgagga ggcttttttg gaggcctaga
4740
cttttgcaga gaccaaattc gtaatcatgt catagctgtt tcctgtgtga aattgttatc
4800
cgctcacaat tccacacaac atacgagccg gaagcataaa gtgtaaagcc tggggtgcct
4860
aatgagtgag ctaactcaca ttaattgcgt tgcgctcact gcccgctttc cagtcgggaa
4920
acctgtcgtg ccagctgcat taatgaatcg gccaacgcgc ggggagaggc ggtttgcgta
4980
ttgggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc
5040
gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca ggggataacg
5100
caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt
5160
tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa
5220
gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct
5280
ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc
5340
cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg
5400
tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct
5460
tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag
5520
cagccactgg taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga
5580
agtggtggcc taactacggc tacactagaa ggacagtatt tggtatctgc gctctgctga
5640
agccagttac cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg
5700
gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag
5760
aagatccttt gatcttttct acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag
5820
ggattttggt catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat
5880
gaagttttaa atcaatctaa agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt taccaatgct
5940
taatcagtga ggcacctatc tcagcgatct gtctatttcg ttcatccata gttgcctgac
6000
tccccgtcgt gtagataact acgatacggg agggcttacc atctggcccc agtgctgcaa
6060
tgataccgcg agacccacgc tcaccggctc cagatttatc agcaataaac cagccagccg
6120
gaagggccga gcgcagaagt ggtcctgcaa ctttatccgc ctccatccag tctattaatt
6180
gttgccggga agctagagta agtagttcgc cagttaatag tttgcgcaac gttgttgcca
6240
ttgctacagg catcgtggtg tcacgctcgt cgtttggtat ggcttcattc agctccggtt
6300
cccaacgatc aaggcgagtt acatgatccc ccatgttgtg caaaaaagcg gttagctcct
6360
tcggtcctcc gatcgttgtc agaagtaagt tggccgcagt gttatcactc atggttatgg
6420
cagcactgca taattctctt actgtcatgc catccgtaag atgcttttct gtgactggtg
6480
agtactcaac caagtcattc tgagaatagt gtatgcggcg accgagttgc tcttgcccgg
6540
cgtcaatacg ggataatacc gcgccacata gcagaacttt aaaagtgctc atcattggaa
6600
aacgttcttc ggggcgaaaa ctctcaagga tcttaccgct gttgagatcc agttcgatgt
6660
aacccactcg tgcacccaac tgatcttcag catcttttac tttcaccagc gtttctgggt
6720
gagcaaaaac aggaaggcaa aatgccgcaa aaaagggaat aagggcgaca cggaaatgtt
6780
gaatactcat actcttcctt tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt tattgtctca
6840
tgagcggata catatttgaa tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat
6900
ttccccgaaa agtgccacct gacgtctaag aaaccattat tatcatgaca ttaacctata
6960
aaaataggcg tatcacgagg ccctttcgtc tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc
7020
tctgacacat gcagctcccg gagacggtca cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca
7080
gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg
7140
cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat
7200
gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc attcgccatt caggctgcgc aactgttggg
7260
aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg
7320
caaggcgatt aagttgggta acgccagggt tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg
7380
ccagtgccaa gctg 7394
<210> 14
<211> 7193
<212> DNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Лентивирусный вектор pCDH‐CMV‐MCS‐EF1α‐Blast lentivector
<400> 14
acgcgtgtag tcttatgcaa tactcttgta gtcttgcaac atggtaacga tgagttagca 60
acatgcctta caaggagaga aaaagcaccg tgcatgccga ttggtggaag taaggtggta 120
cgatcgtgcc ttattaggaa ggcaacagac gggtctgaca tggattggac gaaccactga 180
attgccgcat tgcagagata ttgtatttaa gtgcctagct cgatacaata aacgggtctc 240
tctggttaga ccagatctga gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta 300
agcctcaata aagcttgcct tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact 360
ctggtaacta gagatccctc agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agcagtggcg 420
cccgaacagg gacctgaaag cgaaagggaa accagagctc tctcgacgca ggactcggct 480
tgctgaagcg cgcacggcaa gaggcgaggg gcggcgactg gtgagtacgc caaaaatttt 540
gactagcgga ggctagaagg agagagatgg gtgcgagagc gtcagtatta agcgggggag 600
aattagatcg cgatgggaaa aaattcggtt aaggccaggg ggaaagaaaa aatataaatt 660
aaaacatata gtatgggcaa gcagggagct agaacgattc gcagttaatc ctggcctgtt 720
agaaacatca gaaggctgta gacaaatact gggacagcta caaccatccc ttcagacagg 780
atcagaagaa cttagatcat tatataatac agtagcaacc ctctattgtg tgcatcaaag 840
gatagagata aaagacacca aggaagcttt agacaagata gaggaagagc aaaacaaaag 900
taagaccacc gcacagcaag cggccactga tcttcagacc tggaggagga gatatgaggg 960
acaattggag aagtgaatta tataaatata aagtagtaaa aattgaacca ttaggagtag
1020
cacccaccaa ggcaaagaga agagtggtgc agagagaaaa aagagcagtg ggaataggag
1080
ctttgttcct tgggttcttg ggagcagcag gaagcactat gggcgcagcg tcaatgacgc
1140
tgacggtaca ggccagacaa ttattgtctg gtatagtgca gcagcagaac aatttgctga
1200
gggctattga ggcgcaacag catctgttgc aactcacagt ctggggcatc aagcagctcc
1260
aggcaagaat cctggctgtg gaaagatacc taaaggatca acagctcctg gggatttggg
1320
gttgctctgg aaaactcatt tgcaccactg ctgtgccttg gaatgctagt tggagtaata
1380
aatctctgga acagatttgg aatcacacga cctggatgga gtgggacaga gaaattaaca
1440
attacacaag cttaatacac tccttaattg aagaatcgca aaaccagcaa gaaaagaatg
1500
aacaagaatt attggaatta gataaatggg caagtttgtg gaattggttt aacataacaa
1560
attggctgtg gtatataaaa ttattcataa tgatagtagg aggcttggta ggtttaagaa
1620
tagtttttgc tgtactttct atagtgaata gagttaggca gggatattca ccattatcgt
1680
ttcagaccca cctcccaacc ccgaggggac ccgacaggcc cgaaggaata gaagaagaag
1740
gtggagagag agacagagac agatccattc gattagtgaa cggatctcga cggtatcggt
1800
taacttttaa aagaaaaggg gggattgggg ggtacagtgc aggggaaaga atagtagaca
1860
taatagcaac agacatacaa actaaagaat tacaaaaaca aattacaaaa ttcaaaattt
1920
tatcgattac tagtattatg cccagtacat gaccttatgg gactttccta cttggcagta
1980
catctacgta ttagtcatcg ctattaccat ggtgatgcgg ttttggcagt acatcaatgg
2040
gcgtggatag cggtttgact cacggggatt tccaagtctc caccccattg acgtcaatgg
2100
gagtttgttt tggcaccaaa atcaacggga ctttccaaaa tgtcgtaaca actccgcccc
2160
attgacgcaa atgggcggta ggcgtgtacg gtgggaggtt tatataagca gagctcgttt
2220
agtgaaccgt cagatcgcct ggagacgcca tccacgctgt tttgacctcc atagaagatt
2280
ctagagctag cgaattcgaa tttaaatcgg atccgcggcc gcaaggatct gcgatcgctc
2340
cggtgcccgt cagtgggcag agcgcacatc gcccacagtc cccgagaagt tggggggagg
2400
ggtcggcaat tgaacgggtg cctagagaag gtggcgcggg gtaaactggg aaagtgatgt
2460
cgtgtactgg ctccgccttt ttcccgaggg tgggggagaa ccgtatataa gtgcagtagt
2520
cgccgtgaac gttctttttc gcaacgggtt tgccgccaga acacagctga agcttcgagg
2580
ggctcgcatc tctccttcac gcgcccgccg ccctacctga ggccgccatc cacgccggtt
2640
gagtcgcgtt ctgccgcctc ccgcctgtgg tgcctcctga actgcgtccg ccgtctaggt
2700
aagtttaaag ctcaggtcga gaccgggcct ttgtccggcg ctcccttgga gcctacctag
2760
actcagccgg ctctccacgc tttgcctgac cctgcttgct caactctacg tctttgtttc
2820
gttttctgtt ctgcgccgtt acagatccaa gctgtgaccg gcgcctacga tatggccaag
2880
cctttgtctc aagaagaatc caccctcatt gaaagagcaa cggctacaat caacagcatc
2940
cccatctctg aagactacag cgtcgccagc gcagctctct ctagcgacgg ccgcatcttc
3000
actggtgtca atgtatatca ttttactggg ggaccttgtg cagaactcgt ggtgctgggc
3060
actgctgctg ctgcggcagc tggcaacctg acttgtatcg tcgcgatcgg aaatgagaac
3120
aggggcatct tgagcccctg cggacggtgc cgacaggtgc ttctcgatct gcatcctggg
3180
atcaaagcca tagtgaagga cagtgatgga cagccgacgg cagttgggat tcgtgaattg
3240
ctgccctctg gttatgtgtg ggagggctaa caatcaacct ctggattaca aaatttgtga
3300
aagattgact ggtattctta actatgttgc tccttttacg ctatgtggat acgctgcttt
3360
aatgcctttg tatcatgcta ttgcttcccg tatggctttc attttctcct ccttgtataa
3420
atcctggttg ctgtctcttt atgaggagtt gtggcccgtt gtcaggcaac gtggcgtggt
3480
gtgcactgtg tttgctgacg caacccccac tggttggggc attgccacca cctgtcagct
3540
cctttccggg actttcgctt tccccctccc tattgccacg gcggaactca tcgccgcctg
3600
ccttgcccgc tgctggacag gggctcggct gttgggcact gacaattccg tggtgttgtc
3660
ggggaaatca tcgtcctttc cttggctgct cgcctgtgtt gccacctgga ttctgcgcgg
3720
gacgtccttc tgctacgtcc cttcggccct caatccagcg gaccttcctt cccgcggcct
3780
gctgccggct ctgcggcctc ttccgcgtct tcgccttcgc cctcagacga gtcggatctc
3840
cctttgggcc gcctccccgc ctggtacctt taagaccaat gacttacaag gcagctgtag
3900
atcttagcca ctttttaaaa gaaaaggggg gactggaagg gctaattcac tcccaacgaa
3960
gataagatct gctttttgct tgtactgggt ctctctggtt agaccagatc tgagcctggg
4020
agctctctgg ctaactaggg aacccactgc ttaagcctca ataaagcttg ccttgagtgc
4080
ttcaagtagt gtgtgcccgt ctgttgtgtg actctggtaa ctagagatcc ctcagaccct
4140
tttagtcagt gtggaaaatc tctagcagta gtagttcatg tcatcttatt attcagtatt
4200
tataacttgc aaagaaatga atatcagaga gtgagaggaa cttgtttatt gcagcttata
4260
atggttacaa ataaagcaat agcatcacaa atttcacaaa taaagcattt ttttcactgc
4320
attctagttg tggtttgtcc aaactcatca atgtatctta tcatgtctgg ctctagctat
4380
cccgccccta actccgccca tcccgcccct aactccgccc agttccgccc attctccgcc
4440
ccatggctga ctaatttttt ttatttatgc agaggccgag gccgcctcgg cctctgagct
4500
attccagaag tagtgaggag gcttttttgg aggcctagac ttttgcagag accaaattcg
4560
taatcatgtc atagctgttt cctgtgtgaa attgttatcc gctcacaatt ccacacaaca
4620
tacgagccgg aagcataaag tgtaaagcct ggggtgccta atgagtgagc taactcacat
4680
taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa cctgtcgtgc cagctgcatt
4740
aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat tgggcgctct tccgcttcct
4800
cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa
4860
aggcggtaat acggttatcc acagaatcag gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa
4920
aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc
4980
tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga
5040
caggactata aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc
5100
cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt
5160
ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct
5220
gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg
5280
agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt aacaggatta
5340
gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct aactacggct
5400
acactagaag gacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa
5460
gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt
5520
gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg atcttttcta
5580
cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc atgagattat
5640
caaaaaggat cttcacctag atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa
5700
gtatatatga gtaaacttgg tctgacagtt accaatgctt aatcagtgag gcacctatct
5760
cagcgatctg tctatttcgt tcatccatag ttgcctgact ccccgtcgtg tagataacta
5820
cgatacggga gggcttacca tctggcccca gtgctgcaat gataccgcga gacccacgct
5880
caccggctcc agatttatca gcaataaacc agccagccgg aagggccgag cgcagaagtg
5940
gtcctgcaac tttatccgcc tccatccagt ctattaattg ttgccgggaa gctagagtaa
6000
gtagttcgcc agttaatagt ttgcgcaacg ttgttgccat tgctacaggc atcgtggtgt
6060
cacgctcgtc gtttggtatg gcttcattca gctccggttc ccaacgatca aggcgagtta
6120
catgatcccc catgttgtgc aaaaaagcgg ttagctcctt cggtcctccg atcgttgtca
6180
gaagtaagtt ggccgcagtg ttatcactca tggttatggc agcactgcat aattctctta
6240
ctgtcatgcc atccgtaaga tgcttttctg tgactggtga gtactcaacc aagtcattct
6300
gagaatagtg tatgcggcga ccgagttgct cttgcccggc gtcaatacgg gataataccg
6360
cgccacatag cagaacttta aaagtgctca tcattggaaa acgttcttcg gggcgaaaac
6420
tctcaaggat cttaccgctg ttgagatcca gttcgatgta acccactcgt gcacccaact
6480
gatcttcagc atcttttact ttcaccagcg tttctgggtg agcaaaaaca ggaaggcaaa
6540
atgccgcaaa aaagggaata agggcgacac ggaaatgttg aatactcata ctcttccttt
6600
ttcaatatta ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcat gagcggatac atatttgaat
6660
gtatttagaa aaataaacaa ataggggttc cgcgcacatt tccccgaaaa gtgccacctg
6720
acgtctaaga aaccattatt atcatgacat taacctataa aaataggcgt atcacgaggc
6780
cctttcgtct cgcgcgtttc ggtgatgacg gtgaaaacct ctgacacatg cagctcccgg
6840
agacggtcac agcttgtctg taagcggatg ccgggagcag acaagcccgt cagggcgcgt
6900
cagcgggtgt tggcgggtgt cggggctggc ttaactatgc ggcatcagag cagattgtac
6960
tgagagtgca ccatatgcgg tgtgaaatac cgcacagatg cgtaaggaga aaataccgca
7020
tcaggcgcca ttcgccattc aggctgcgca actgttggga agggcgatcg gtgcgggcct
7080
cttcgctatt acgccagctg gcgaaagggg gatgtgctgc aaggcgatta agttgggtaa
7140
cgccagggtt ttcccagtca cgacgttgta aaacgacggc cagtgccaag ctg 7193
<210> 15
<211> 8159
<212> DNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> pCG1_SCoV2‐S плазмид
<400> 15
gaattcgagc tcgccccgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca 60
acgacccccg cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga 120
ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc 180
aagtgtatca tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct 240
ggcattatgc ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat 300
tagtcatcgc tattaccatg gtgatgcggt tttggcagta catcaatggg cgtggatagc 360
ggtttgactc acggggattt ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg agtttgtttt 420
ggcaccaaaa tcaacgggac tttccaaaat gtcgtaacaa ctccgcccca ttgacgcaaa 480
tgggcggtag gcgtgtacgg tgggaggtct atataagcag agctcgttta gtgaaccgtc 540
agatcgcctg gagacgccat ccacgctgtt ttgacctcca tagaagacac cgggaccgat 600
ccagcctccg ggggatcgat cccccgatcc tgagaacttc agggtgagtt tggggaccct 660
tgattgttct ttctttttcg ctattgtaaa attcatgtta tatggagggg gcaaagtttt 720
cagggtgttg tttagaatgg gaagatgtcc cttgtatcac catggaccct catgataatt 780
ttgtttcttt cactttctac tctgttgaca accattgtct cctcttattt tcttttcatt 840
ttctgtaact ttttcgttaa actttagctt gcatttgtaa cgaattttta aattcacttt 900
tgtttatttg tcagattgta agtactttct ctaatcactt ttttttcaag gcaatcaggg 960
tatattatat tgtacttcag cacagtttta gagaacaatt gttataatta aatgataagg
1020
tagaatattt ctgcatataa attctggctg gcgtggaaat attcttattg gtagaaacaa
1080
ctacatcctg gtcatcatcc tgcctttctc tttatggtta caatgatata cactgtttga
1140
gatgaggata aaatactctg agtccaaacc gggcccctct gctaaccatg ttcatgcctt
1200
cttctttttc ctacagctcc tgggcaacgt gctggttatt gtgctgtctc atcattttgg
1260
caaagaattg taatacgact cactataggg cgaattcgga tccgccacca tgttcgtgtt
1320
tctggtgctg ctgcctctgg tgtccagcca gtgtgtgaac ctgaccacaa gaacccagct
1380
gcctccagcc tacaccaaca gctttaccag aggcgtgtac taccccgaca aggtgttcag
1440
atccagcgtg ctgcactcta cccaggacct gttcctgcct ttcttcagca acgtgacctg
1500
gttccacgcc atccacgtgt ccggcaccaa tggcaccaag agattcgaca accccgtgct
1560
gcccttcaac gacggggtgt actttgccag caccgagaag tccaacatca tcagaggctg
1620
gatcttcggc accacactgg acagcaagac ccagagcctg ctgatcgtga acaacgccac
1680
caacgtggtc atcaaagtgt gcgagttcca gttctgcaac gaccccttcc tgggcgtcta
1740
ctatcacaag aacaacaaga gctggatgga aagcgagttc cgggtgtaca gcagcgccaa
1800
caactgcacc ttcgagtacg tgtcccagcc tttcctgatg gacctggaag gcaagcaggg
1860
caacttcaag aacctgcgcg agttcgtgtt caagaacatc gacggctact tcaagatcta
1920
cagcaagcac acccctatca acctcgtgcg ggatctgcct cagggcttct ctgctctgga
1980
acccctggtg gatctgccca tcggcatcaa catcacccgg tttcagacac tgctggccct
2040
gcacagaagc tacctgacac ctggcgatag cagcagcgga tggacagctg gtgccgccgc
2100
ttactatgtg ggctacctgc agcctagaac cttcctgctg aagtacaacg agaacggcac
2160
catcaccgac gccgtggatt gtgcccttga tcctctgagc gagacaaagt gcaccctgaa
2220
gtccttcacc gtggaaaagg gcatctacca gaccagcaac ttccgggtgc agcccaccga
2280
atccatcgtg cggttcccca atatcaccaa tctgtgcccc ttcggcgagg tgttcaatgc
2340
caccagattc gcctctgtgt acgcctggaa ccggaagcgg atcagcaatt gcgtggccga
2400
ctactccgtg ctgtacaact ccgccagctt cagcaccttc aagtgctacg gcgtgtcccc
2460
taccaagctg aacgacctgt gcttcacaaa cgtgtacgcc gacagcttcg tgatccgggg
2520
agatgaagtg cggcagattg cccctggaca gacaggcaag atcgccgact acaactacaa
2580
gctgcccgac gacttcaccg gctgtgtgat tgcctggaac agcaacaacc tggactccaa
2640
agtcggcggc aactacaatt acctgtaccg gctgttccgg aagtccaatc tgaagccctt
2700
cgagcgggac atctccaccg agatctatca ggccggcagc accccttgta acggcgtgga
2760
aggcttcaac tgctacttcc cactgcagtc ctacggcttt cagcccacaa atggcgtggg
2820
ctatcagccc tacagagtgg tggtgctgag cttcgaactg ctgcatgccc ctgccacagt
2880
gtgcggccct aagaaaagca ccaatctcgt gaagaacaaa tgcgtgaact tcaacttcaa
2940
cggcctgacc ggcaccggcg tgctgacaga gagcaacaag aagttcctgc cattccagca
3000
gtttggccgg gatatcgccg ataccacaga cgccgttaga gatccccaga cactggaaat
3060
cctggacatc accccttgca gcttcggcgg agtgtctgtg atcacccctg gcaccaacac
3120
cagcaatcag gtggcagtgc tgtaccagga cgtgaactgt accgaagtgc ccgtggccat
3180
tcacgccgat cagctgacac ctacatggcg ggtgtactcc accggcagca atgtgtttca
3240
gaccagagcc ggctgtctga tcggagccga gcacgtgaac aatagctacg agtgcgacat
3300
ccccatcggc gctggcatct gtgccagcta ccagacacag acaaacagcc ccagacgggc
3360
cagatctgtg gccagccaga gcatcattgc ctacacaatg tctctgggcg ccgagaacag
3420
cgtggcctac tccaacaact ctatcgctat ccccaccaac ttcaccatca gcgtgaccac
3480
agagatcctg cctgtgtcca tgaccaagac cagcgtggac tgcaccatgt acatctgcgg
3540
cgattccacc gagtgctcca acctgctgct gcagtacggc agcttctgca cccagctgaa
3600
tagagccctg acagggatcg ccgtggaaca ggacaagaac acccaagagg tgttcgccca
3660
agtgaagcag atctacaaga cccctcctat caaggacttc ggcggcttca atttcagcca
3720
gattctgccc gatcctagca agcccagcaa gcggagcttc atcgaggacc tgctgttcaa
3780
caaagtgaca ctggccgacg ccggcttcat caagcagtat ggcgattgtc tgggcgacat
3840
tgccgccagg gatctgattt gcgcccagaa gtttaacgga ctgacagtgc tgccaccact
3900
gctgaccgat gagatgatcg cccagtacac atctgccctg ctggccggca caatcacaag
3960
cggctggaca tttggagctg gcgccgctct gcagatcccc tttgctatgc agatggccta
4020
ccggttcaac ggcatcggag tgacccagaa tgtgctgtac gagaaccaga agctgatcgc
4080
caaccagttc aacagcgcca tcggcaagat ccaggacagc ctgagcagca cagcaagcgc
4140
cctgggaaag ctgcaggacg tggtcaacca gaatgcccag gcactgaaca ccctggtcaa
4200
gcagctgtcc tccaacttcg gcgccatcag ctctgtgctg aacgatatcc tgagcagact
4260
ggacaaggtg gaagccgagg tgcagatcga cagactgatc accggaaggc tgcagtccct
4320
gcagacctac gttacccagc agctgatcag agccgccgag attagagcct ctgccaatct
4380
ggccgccacc aagatgtctg agtgtgtgct gggccagagc aagagagtgg acttttgcgg
4440
caagggctac cacctgatga gcttccctca gtctgcccct cacggcgtgg tgtttctgca
4500
cgtgacatac gtgcccgctc aagagaagaa tttcaccacc gctccagcca tctgccacga
4560
cggcaaagcc cactttccta gagaaggcgt gttcgtgtcc aacggcaccc attggttcgt
4620
gacccagcgg aacttctacg agccccagat catcaccacc gacaacacct tcgtgtctgg
4680
caactgcgac gtcgtgatcg gcattgtgaa caataccgtg tacgaccctc tgcagcccga
4740
gctggacagc ttcaaagagg aactggataa gtactttaag aaccacacaa gccccgacgt
4800
ggacctgggc gatatcagcg gaatcaatgc cagcgtcgtg aacatccaga aagagatcga
4860
ccggctgaac gaggtggcca agaatctgaa cgagagcctg atcgacctgc aagaactggg
4920
gaagtacgag cagtacatca agtggccctg gtacatctgg ctgggcttta tcgccggact
4980
gattgccatc gtgatggtca caatcatgct gtgttgcatg accagctgct gtagctgcct
5040
gaagggctgt tgtagctgtg gcagctgctg caagttcgac gaggacgatt ctgagcccgt
5100
gctgaagggc gtgaaactgc actacaccta atctagagtc gactgtttaa acctgcaggc
5160
atgcaagctg atctttttcc ctctgccaaa aattatgggg acatcatgaa gccccttgag
5220
catctgactt ctggctaata aaggaaattt attttcattg caatagtgtg ttggaatttt
5280
ttgtgtctct cactcggaag gacatatggg agggcaaatc atttaaaaca tcagaatgag
5340
tatttggttt agagtttggc aacatatgcc atatgctggc tgccatgaac aaaggtggct
5400
ataaagaggt catcagtata tgaaacagcc ccctgctgtc cattccttat tccatagaaa
5460
agccttgact tgaggttaga ttttttttat attttgtttt gtgttatttt tttctttaac
5520
atccctaaaa ttttccttac atgttttact agccagattt ttcctcctct cctgactact
5580
cccagtcata gctgtccctc ttctcttatg aactcgagga gctttttgca aaagcctagg
5640
cctccaaaaa agcctcctca ctacttctgg aatagctcag aggccgaggc ggcctcggcc
5700
tctgcataaa taaaaaaaat tagtcagcca tggggcggag aatgggcgga actgggcgga
5760
gttaggggcg ggatgggcgg agttaggggc gggactatgg ttgctgacta attgagactg
5820
cattaatgaa tcggccaacg cgcggggaga ggcggtttgc gtattgggcg ctcttccgct
5880
tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac
5940
tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga
6000
gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat
6060
aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac
6120
ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct
6180
gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg
6240
ctttctcaat gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg
6300
ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt
6360
cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg
6420
attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg gcctaactac
6480
ggctacacta gaaggacagt atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga
6540
aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt
6600
gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt
6660
tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaga
6720
ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt ttaaattaaa aatgaagttt taaatcaatc
6780
taaagtatat atgagtaaac ttggtctgac agttaccaat gcttaatcag tgaggcacct
6840
atctcagcga tctgtctatt tcgttcatcc atagttgcct gactccccgt cgtgtagata
6900
actacgatac gggagggctt accatctggc cccagtgctg caatgatacc gcgagaccca
6960
cgctcaccgg ctccagattt atcagcaata aaccagccag ccggaagggc cgagcgcaga
7020
agtggtcctg caactttatc cgcctccatc cagtctatta attgttgccg ggaagctaga
7080
gtaagtagtt cgccagttaa tagtttgcgc aacgttgttg ccattgctac aggcatcgtg
7140
gtgtcacgct cgtcgtttgg tatggcttca ttcagctccg gttcccaacg atcaaggcga
7200
gttacatgat cccccatgtt gtgcaaaaaa gcggttagct ccttcggtcc tccgatcgtt
7260
gtcagaagta agttggccgc agtgttatca ctcatggtta tggcagcact gcataattct
7320
cttactgtca tgccatccgt aagatgcttt tctgtgactg gtgagtactc aaccaagtca
7380
ttctgagaat agtgtatgcg gcgaccgagt tgctcttgcc cggcgtcaat acgggataat
7440
accgcgccac atagcagaac tttaaaagtg ctcatcattg gaaaacgttc ttcggggcga
7500
aaactctcaa ggatcttacc gctgttgaga tccagttcga tgtaacccac tcgtgcaccc
7560
aactgatctt cagcatcttt tactttcacc agcgtttctg ggtgagcaaa aacaggaagg
7620
caaaatgccg caaaaaaggg aataagggcg acacggaaat gttgaatact catactcttc
7680
ctttttcaat attattgaag catttatcag ggttattgtc tcatgagcgg atacatattt
7740
gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg gttccgcgca catttccccg aaaacgtctt
7800
caagctgcct cgcgcgtttc ggtgatgacg gtgaaaacct ctgacacatg cagctcccgg
7860
agacggtcac agcttgtctg taagcggatg ccgggagcag acaagcccgt cagggcgcgt
7920
cagcgggtgt tggcgggtgt cggggcgcag ccatgaccca gtcacgtagc gatagcggag
7980
ttggcttaac tatgcggcat cagagcagat tgtactgaga gtgcaccata tcgacgctct
8040
cccttatgcg actcctgcat taggaagcag cccagtagta ggttgaggcc gttgagcacc
8100
gccgccgcaa ggaatggtgc tggcttatcg aaattaatcg actcactata gggagaccc 8159
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер 1 спайк‐белка G614
<400> 16
gcgtgaactg taccgaagtg 20
<210> 17
<211> 17
<212> DNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер 2 спайк‐белка G614
<400> 17
cctggtacag cactgcc 17
<210> 18
<211> 18
<212> DNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер 1 укороченного спайк‐белка вируса SARS‐CoV2
<400> 18
agcgaattcg gatccgcc
<210> 19
<211> 34
<212> DNA 18
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер 2 укороченного спайк‐белка вируса
SARS‐CoV2
<400> 19
acagtcgact ctagattagc agcagctgcc acag
34
<210> 20
<211> 8159
<212> DNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> плазмиды, кодирующие полноразмерный Spike
G614
<400> 20
gaattcgagc tcgccccgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca 60
acgacccccg cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga 120
ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc 180
aagtgtatca tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct 240
ggcattatgc ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat 300
tagtcatcgc tattaccatg gtgatgcggt tttggcagta catcaatggg cgtggatagc 360
ggtttgactc acggggattt ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg agtttgtttt 420
ggcaccaaaa tcaacgggac tttccaaaat gtcgtaacaa ctccgcccca ttgacgcaaa 480
tgggcggtag gcgtgtacgg tgggaggtct atataagcag agctcgttta gtgaaccgtc 540
agatcgcctg gagacgccat ccacgctgtt ttgacctcca tagaagacac cgggaccgat 600
ccagcctccg ggggatcgat cccccgatcc tgagaacttc agggtgagtt tggggaccct 660
tgattgttct ttctttttcg ctattgtaaa attcatgtta tatggagggg gcaaagtttt 720
cagggtgttg tttagaatgg gaagatgtcc cttgtatcac catggaccct catgataatt 780
ttgtttcttt cactttctac tctgttgaca accattgtct cctcttattt tcttttcatt 840
ttctgtaact ttttcgttaa actttagctt gcatttgtaa cgaattttta aattcacttt 900
tgtttatttg tcagattgta agtactttct ctaatcactt ttttttcaag gcaatcaggg 960
tatattatat tgtacttcag cacagtttta gagaacaatt gttataatta aatgataagg
1020
tagaatattt ctgcatataa attctggctg gcgtggaaat attcttattg gtagaaacaa
1080
ctacatcctg gtcatcatcc tgcctttctc tttatggtta caatgatata cactgtttga
1140
gatgaggata aaatactctg agtccaaacc gggcccctct gctaaccatg ttcatgcctt
1200
cttctttttc ctacagctcc tgggcaacgt gctggttatt gtgctgtctc atcattttgg
1260
caaagaattg taatacgact cactataggg cgaattcgga tccgccacca tgttcgtgtt
1320
tctggtgctg ctgcctctgg tgtccagcca gtgtgtgaac ctgaccacaa gaacccagct
1380
gcctccagcc tacaccaaca gctttaccag aggcgtgtac taccccgaca aggtgttcag
1440
atccagcgtg ctgcactcta cccaggacct gttcctgcct ttcttcagca acgtgacctg
1500
gttccacgcc atccacgtgt ccggcaccaa tggcaccaag agattcgaca accccgtgct
1560
gcccttcaac gacggggtgt actttgccag caccgagaag tccaacatca tcagaggctg
1620
gatcttcggc accacactgg acagcaagac ccagagcctg ctgatcgtga acaacgccac
1680
caacgtggtc atcaaagtgt gcgagttcca gttctgcaac gaccccttcc tgggcgtcta
1740
ctatcacaag aacaacaaga gctggatgga aagcgagttc cgggtgtaca gcagcgccaa
1800
caactgcacc ttcgagtacg tgtcccagcc tttcctgatg gacctggaag gcaagcaggg
1860
caacttcaag aacctgcgcg agttcgtgtt caagaacatc gacggctact tcaagatcta
1920
cagcaagcac acccctatca acctcgtgcg ggatctgcct cagggcttct ctgctctgga
1980
acccctggtg gatctgccca tcggcatcaa catcacccgg tttcagacac tgctggccct
2040
gcacagaagc tacctgacac ctggcgatag cagcagcgga tggacagctg gtgccgccgc
2100
ttactatgtg ggctacctgc agcctagaac cttcctgctg aagtacaacg agaacggcac
2160
catcaccgac gccgtggatt gtgcccttga tcctctgagc gagacaaagt gcaccctgaa
2220
gtccttcacc gtggaaaagg gcatctacca gaccagcaac ttccgggtgc agcccaccga
2280
atccatcgtg cggttcccca atatcaccaa tctgtgcccc ttcggcgagg tgttcaatgc
2340
caccagattc gcctctgtgt acgcctggaa ccggaagcgg atcagcaatt gcgtggccga
2400
ctactccgtg ctgtacaact ccgccagctt cagcaccttc aagtgctacg gcgtgtcccc
2460
taccaagctg aacgacctgt gcttcacaaa cgtgtacgcc gacagcttcg tgatccgggg
2520
agatgaagtg cggcagattg cccctggaca gacaggcaag atcgccgact acaactacaa
2580
gctgcccgac gacttcaccg gctgtgtgat tgcctggaac agcaacaacc tggactccaa
2640
agtcggcggc aactacaatt acctgtaccg gctgttccgg aagtccaatc tgaagccctt
2700
cgagcgggac atctccaccg agatctatca ggccggcagc accccttgta acggcgtgga
2760
aggcttcaac tgctacttcc cactgcagtc ctacggcttt cagcccacaa atggcgtggg
2820
ctatcagccc tacagagtgg tggtgctgag cttcgaactg ctgcatgccc ctgccacagt
2880
gtgcggccct aagaaaagca ccaatctcgt gaagaacaaa tgcgtgaact tcaacttcaa
2940
cggcctgacc ggcaccggcg tgctgacaga gagcaacaag aagttcctgc cattccagca
3000
gtttggccgg gatatcgccg ataccacaga cgccgttaga gatccccaga cactggaaat
3060
cctggacatc accccttgca gcttcggcgg agtgtctgtg atcacccctg gcaccaacac
3120
cagcaatcag gtggcagtgc tgtaccaggg cgtgaactgt accgaagtgc ccgtggccat
3180
tcacgccgat cagctgacac ctacatggcg ggtgtactcc accggcagca atgtgtttca
3240
gaccagagcc ggctgtctga tcggagccga gcacgtgaac aatagctacg agtgcgacat
3300
ccccatcggc gctggcatct gtgccagcta ccagacacag acaaacagcc ccagacgggc
3360
cagatctgtg gccagccaga gcatcattgc ctacacaatg tctctgggcg ccgagaacag
3420
cgtggcctac tccaacaact ctatcgctat ccccaccaac ttcaccatca gcgtgaccac
3480
agagatcctg cctgtgtcca tgaccaagac cagcgtggac tgcaccatgt acatctgcgg
3540
cgattccacc gagtgctcca acctgctgct gcagtacggc agcttctgca cccagctgaa
3600
tagagccctg acagggatcg ccgtggaaca ggacaagaac acccaagagg tgttcgccca
3660
agtgaagcag atctacaaga cccctcctat caaggacttc ggcggcttca atttcagcca
3720
gattctgccc gatcctagca agcccagcaa gcggagcttc atcgaggacc tgctgttcaa
3780
caaagtgaca ctggccgacg ccggcttcat caagcagtat ggcgattgtc tgggcgacat
3840
tgccgccagg gatctgattt gcgcccagaa gtttaacgga ctgacagtgc tgccaccact
3900
gctgaccgat gagatgatcg cccagtacac atctgccctg ctggccggca caatcacaag
3960
cggctggaca tttggagctg gcgccgctct gcagatcccc tttgctatgc agatggccta
4020
ccggttcaac ggcatcggag tgacccagaa tgtgctgtac gagaaccaga agctgatcgc
4080
caaccagttc aacagcgcca tcggcaagat ccaggacagc ctgagcagca cagcaagcgc
4140
cctgggaaag ctgcaggacg tggtcaacca gaatgcccag gcactgaaca ccctggtcaa
4200
gcagctgtcc tccaacttcg gcgccatcag ctctgtgctg aacgatatcc tgagcagact
4260
ggacaaggtg gaagccgagg tgcagatcga cagactgatc accggaaggc tgcagtccct
4320
gcagacctac gttacccagc agctgatcag agccgccgag attagagcct ctgccaatct
4380
ggccgccacc aagatgtctg agtgtgtgct gggccagagc aagagagtgg acttttgcgg
4440
caagggctac cacctgatga gcttccctca gtctgcccct cacggcgtgg tgtttctgca
4500
cgtgacatac gtgcccgctc aagagaagaa tttcaccacc gctccagcca tctgccacga
4560
cggcaaagcc cactttccta gagaaggcgt gttcgtgtcc aacggcaccc attggttcgt
4620
gacccagcgg aacttctacg agccccagat catcaccacc gacaacacct tcgtgtctgg
4680
caactgcgac gtcgtgatcg gcattgtgaa caataccgtg tacgaccctc tgcagcccga
4740
gctggacagc ttcaaagagg aactggataa gtactttaag aaccacacaa gccccgacgt
4800
ggacctgggc gatatcagcg gaatcaatgc cagcgtcgtg aacatccaga aagagatcga
4860
ccggctgaac gaggtggcca agaatctgaa cgagagcctg atcgacctgc aagaactggg
4920
gaagtacgag cagtacatca agtggccctg gtacatctgg ctgggcttta tcgccggact
4980
gattgccatc gtgatggtca caatcatgct gtgttgcatg accagctgct gtagctgcct
5040
gaagggctgt tgtagctgtg gcagctgctg caagttcgac gaggacgatt ctgagcccgt
5100
gctgaagggc gtgaaactgc actacaccta atctagagtc gactgtttaa acctgcaggc
5160
atgcaagctg atctttttcc ctctgccaaa aattatgggg acatcatgaa gccccttgag
5220
catctgactt ctggctaata aaggaaattt attttcattg caatagtgtg ttggaatttt
5280
ttgtgtctct cactcggaag gacatatggg agggcaaatc atttaaaaca tcagaatgag
5340
tatttggttt agagtttggc aacatatgcc atatgctggc tgccatgaac aaaggtggct
5400
ataaagaggt catcagtata tgaaacagcc ccctgctgtc cattccttat tccatagaaa
5460
agccttgact tgaggttaga ttttttttat attttgtttt gtgttatttt tttctttaac
5520
atccctaaaa ttttccttac atgttttact agccagattt ttcctcctct cctgactact
5580
cccagtcata gctgtccctc ttctcttatg aactcgagga gctttttgca aaagcctagg
5640
cctccaaaaa agcctcctca ctacttctgg aatagctcag aggccgaggc ggcctcggcc
5700
tctgcataaa taaaaaaaat tagtcagcca tggggcggag aatgggcgga actgggcgga
5760
gttaggggcg ggatgggcgg agttaggggc gggactatgg ttgctgacta attgagactg
5820
cattaatgaa tcggccaacg cgcggggaga ggcggtttgc gtattgggcg ctcttccgct
5880
tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac
5940
tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga
6000
gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat
6060
aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac
6120
ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct
6180
gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg
6240
ctttctcaat gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg
6300
ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt
6360
cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg
6420
attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg gcctaactac
6480
ggctacacta gaaggacagt atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga
6540
aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt
6600
gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt
6660
tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaga
6720
ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt ttaaattaaa aatgaagttt taaatcaatc
6780
taaagtatat atgagtaaac ttggtctgac agttaccaat gcttaatcag tgaggcacct
6840
atctcagcga tctgtctatt tcgttcatcc atagttgcct gactccccgt cgtgtagata
6900
actacgatac gggagggctt accatctggc cccagtgctg caatgatacc gcgagaccca
6960
cgctcaccgg ctccagattt atcagcaata aaccagccag ccggaagggc cgagcgcaga
7020
agtggtcctg caactttatc cgcctccatc cagtctatta attgttgccg ggaagctaga
7080
gtaagtagtt cgccagttaa tagtttgcgc aacgttgttg ccattgctac aggcatcgtg
7140
gtgtcacgct cgtcgtttgg tatggcttca ttcagctccg gttcccaacg atcaaggcga
7200
gttacatgat cccccatgtt gtgcaaaaaa gcggttagct ccttcggtcc tccgatcgtt
7260
gtcagaagta agttggccgc agtgttatca ctcatggtta tggcagcact gcataattct
7320
cttactgtca tgccatccgt aagatgcttt tctgtgactg gtgagtactc aaccaagtca
7380
ttctgagaat agtgtatgcg gcgaccgagt tgctcttgcc cggcgtcaat acgggataat
7440
accgcgccac atagcagaac tttaaaagtg ctcatcattg gaaaacgttc ttcggggcga
7500
aaactctcaa ggatcttacc gctgttgaga tccagttcga tgtaacccac tcgtgcaccc
7560
aactgatctt cagcatcttt tactttcacc agcgtttctg ggtgagcaaa aacaggaagg
7620
caaaatgccg caaaaaaggg aataagggcg acacggaaat gttgaatact catactcttc
7680
ctttttcaat attattgaag catttatcag ggttattgtc tcatgagcgg atacatattt
7740
gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg gttccgcgca catttccccg aaaacgtctt
7800
caagctgcct cgcgcgtttc ggtgatgacg gtgaaaacct ctgacacatg cagctcccgg
7860
agacggtcac agcttgtctg taagcggatg ccgggagcag acaagcccgt cagggcgcgt
7920
cagcgggtgt tggcgggtgt cggggcgcag ccatgaccca gtcacgtagc gatagcggag
7980
ttggcttaac tatgcggcat cagagcagat tgtactgaga gtgcaccata tcgacgctct
8040
cccttatgcg actcctgcat taggaagcag cccagtagta ggttgaggcc gttgagcacc
8100
gccgccgcaa ggaatggtgc tggcttatcg aaattaatcg actcactata gggagaccc 8159
<210> 21
<211> 8102
<212> DNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Плазмиды, кодирующие Spike D614 DeltaCter
<400> 21
gaattcgagc tcgccccgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca 60
acgacccccg cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga 120
ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc 180
aagtgtatca tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct 240
ggcattatgc ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat 300
tagtcatcgc tattaccatg gtgatgcggt tttggcagta catcaatggg cgtggatagc 360
ggtttgactc acggggattt ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg agtttgtttt 420
ggcaccaaaa tcaacgggac tttccaaaat gtcgtaacaa ctccgcccca ttgacgcaaa 480
tgggcggtag gcgtgtacgg tgggaggtct atataagcag agctcgttta gtgaaccgtc 540
agatcgcctg gagacgccat ccacgctgtt ttgacctcca tagaagacac cgggaccgat 600
ccagcctccg ggggatcgat cccccgatcc tgagaacttc agggtgagtt tggggaccct 660
tgattgttct ttctttttcg ctattgtaaa attcatgtta tatggagggg gcaaagtttt 720
cagggtgttg tttagaatgg gaagatgtcc cttgtatcac catggaccct catgataatt 780
ttgtttcttt cactttctac tctgttgaca accattgtct cctcttattt tcttttcatt 840
ttctgtaact ttttcgttaa actttagctt gcatttgtaa cgaattttta aattcacttt 900
tgtttatttg tcagattgta agtactttct ctaatcactt ttttttcaag gcaatcaggg 960
tatattatat tgtacttcag cacagtttta gagaacaatt gttataatta aatgataagg
1020
tagaatattt ctgcatataa attctggctg gcgtggaaat attcttattg gtagaaacaa
1080
ctacatcctg gtcatcatcc tgcctttctc tttatggtta caatgatata cactgtttga
1140
gatgaggata aaatactctg agtccaaacc gggcccctct gctaaccatg ttcatgcctt
1200
cttctttttc ctacagctcc tgggcaacgt gctggttatt gtgctgtctc atcattttgg
1260
caaagaattg taatacgact cactataggg cgaattcgga tccgccacca tgttcgtgtt
1320
tctggtgctg ctgcctctgg tgtccagcca gtgtgtgaac ctgaccacaa gaacccagct
1380
gcctccagcc tacaccaaca gctttaccag aggcgtgtac taccccgaca aggtgttcag
1440
atccagcgtg ctgcactcta cccaggacct gttcctgcct ttcttcagca acgtgacctg
1500
gttccacgcc atccacgtgt ccggcaccaa tggcaccaag agattcgaca accccgtgct
1560
gcccttcaac gacggggtgt actttgccag caccgagaag tccaacatca tcagaggctg
1620
gatcttcggc accacactgg acagcaagac ccagagcctg ctgatcgtga acaacgccac
1680
caacgtggtc atcaaagtgt gcgagttcca gttctgcaac gaccccttcc tgggcgtcta
1740
ctatcacaag aacaacaaga gctggatgga aagcgagttc cgggtgtaca gcagcgccaa
1800
caactgcacc ttcgagtacg tgtcccagcc tttcctgatg gacctggaag gcaagcaggg
1860
caacttcaag aacctgcgcg agttcgtgtt caagaacatc gacggctact tcaagatcta
1920
cagcaagcac acccctatca acctcgtgcg ggatctgcct cagggcttct ctgctctgga
1980
acccctggtg gatctgccca tcggcatcaa catcacccgg tttcagacac tgctggccct
2040
gcacagaagc tacctgacac ctggcgatag cagcagcgga tggacagctg gtgccgccgc
2100
ttactatgtg ggctacctgc agcctagaac cttcctgctg aagtacaacg agaacggcac
2160
catcaccgac gccgtggatt gtgcccttga tcctctgagc gagacaaagt gcaccctgaa
2220
gtccttcacc gtggaaaagg gcatctacca gaccagcaac ttccgggtgc agcccaccga
2280
atccatcgtg cggttcccca atatcaccaa tctgtgcccc ttcggcgagg tgttcaatgc
2340
caccagattc gcctctgtgt acgcctggaa ccggaagcgg atcagcaatt gcgtggccga
2400
ctactccgtg ctgtacaact ccgccagctt cagcaccttc aagtgctacg gcgtgtcccc
2460
taccaagctg aacgacctgt gcttcacaaa cgtgtacgcc gacagcttcg tgatccgggg
2520
agatgaagtg cggcagattg cccctggaca gacaggcaag atcgccgact acaactacaa
2580
gctgcccgac gacttcaccg gctgtgtgat tgcctggaac agcaacaacc tggactccaa
2640
agtcggcggc aactacaatt acctgtaccg gctgttccgg aagtccaatc tgaagccctt
2700
cgagcgggac atctccaccg agatctatca ggccggcagc accccttgta acggcgtgga
2760
aggcttcaac tgctacttcc cactgcagtc ctacggcttt cagcccacaa atggcgtggg
2820
ctatcagccc tacagagtgg tggtgctgag cttcgaactg ctgcatgccc ctgccacagt
2880
gtgcggccct aagaaaagca ccaatctcgt gaagaacaaa tgcgtgaact tcaacttcaa
2940
cggcctgacc ggcaccggcg tgctgacaga gagcaacaag aagttcctgc cattccagca
3000
gtttggccgg gatatcgccg ataccacaga cgccgttaga gatccccaga cactggaaat
3060
cctggacatc accccttgca gcttcggcgg agtgtctgtg atcacccctg gcaccaacac
3120
cagcaatcag gtggcagtgc tgtaccagga cgtgaactgt accgaagtgc ccgtggccat
3180
tcacgccgat cagctgacac ctacatggcg ggtgtactcc accggcagca atgtgtttca
3240
gaccagagcc ggctgtctga tcggagccga gcacgtgaac aatagctacg agtgcgacat
3300
ccccatcggc gctggcatct gtgccagcta ccagacacag acaaacagcc ccagacgggc
3360
cagatctgtg gccagccaga gcatcattgc ctacacaatg tctctgggcg ccgagaacag
3420
cgtggcctac tccaacaact ctatcgctat ccccaccaac ttcaccatca gcgtgaccac
3480
agagatcctg cctgtgtcca tgaccaagac cagcgtggac tgcaccatgt acatctgcgg
3540
cgattccacc gagtgctcca acctgctgct gcagtacggc agcttctgca cccagctgaa
3600
tagagccctg acagggatcg ccgtggaaca ggacaagaac acccaagagg tgttcgccca
3660
agtgaagcag atctacaaga cccctcctat caaggacttc ggcggcttca atttcagcca
3720
gattctgccc gatcctagca agcccagcaa gcggagcttc atcgaggacc tgctgttcaa
3780
caaagtgaca ctggccgacg ccggcttcat caagcagtat ggcgattgtc tgggcgacat
3840
tgccgccagg gatctgattt gcgcccagaa gtttaacgga ctgacagtgc tgccaccact
3900
gctgaccgat gagatgatcg cccagtacac atctgccctg ctggccggca caatcacaag
3960
cggctggaca tttggagctg gcgccgctct gcagatcccc tttgctatgc agatggccta
4020
ccggttcaac ggcatcggag tgacccagaa tgtgctgtac gagaaccaga agctgatcgc
4080
caaccagttc aacagcgcca tcggcaagat ccaggacagc ctgagcagca cagcaagcgc
4140
cctgggaaag ctgcaggacg tggtcaacca gaatgcccag gcactgaaca ccctggtcaa
4200
gcagctgtcc tccaacttcg gcgccatcag ctctgtgctg aacgatatcc tgagcagact
4260
ggacaaggtg gaagccgagg tgcagatcga cagactgatc accggaaggc tgcagtccct
4320
gcagacctac gttacccagc agctgatcag agccgccgag attagagcct ctgccaatct
4380
ggccgccacc aagatgtctg agtgtgtgct gggccagagc aagagagtgg acttttgcgg
4440
caagggctac cacctgatga gcttccctca gtctgcccct cacggcgtgg tgtttctgca
4500
cgtgacatac gtgcccgctc aagagaagaa tttcaccacc gctccagcca tctgccacga
4560
cggcaaagcc cactttccta gagaaggcgt gttcgtgtcc aacggcaccc attggttcgt
4620
gacccagcgg aacttctacg agccccagat catcaccacc gacaacacct tcgtgtctgg
4680
caactgcgac gtcgtgatcg gcattgtgaa caataccgtg tacgaccctc tgcagcccga
4740
gctggacagc ttcaaagagg aactggataa gtactttaag aaccacacaa gccccgacgt
4800
ggacctgggc gatatcagcg gaatcaatgc cagcgtcgtg aacatccaga aagagatcga
4860
ccggctgaac gaggtggcca agaatctgaa cgagagcctg atcgacctgc aagaactggg
4920
gaagtacgag cagtacatca agtggccctg gtacatctgg ctgggcttta tcgccggact
4980
gattgccatc gtgatggtca caatcatgct gtgttgcatg accagctgct gtagctgcct
5040
gaagggctgt tgtagctgtg gcagctgctg ctaatctaga gtcgactgtt taaacctgca
5100
ggcatgcaag ctgatctttt tccctctgcc aaaaattatg gggacatcat gaagcccctt
5160
gagcatctga cttctggcta ataaaggaaa tttattttca ttgcaatagt gtgttggaat
5220
tttttgtgtc tctcactcgg aaggacatat gggagggcaa atcatttaaa acatcagaat
5280
gagtatttgg tttagagttt ggcaacatat gccatatgct ggctgccatg aacaaaggtg
5340
gctataaaga ggtcatcagt atatgaaaca gccccctgct gtccattcct tattccatag
5400
aaaagccttg acttgaggtt agattttttt tatattttgt tttgtgttat ttttttcttt
5460
aacatcccta aaattttcct tacatgtttt actagccaga tttttcctcc tctcctgact
5520
actcccagtc atagctgtcc ctcttctctt atgaactcga ggagcttttt gcaaaagcct
5580
aggcctccaa aaaagcctcc tcactacttc tggaatagct cagaggccga ggcggcctcg
5640
gcctctgcat aaataaaaaa aattagtcag ccatggggcg gagaatgggc ggaactgggc
5700
ggagttaggg gcgggatggg cggagttagg ggcgggacta tggttgctga ctaattgaga
5760
ctgcattaat gaatcggcca acgcgcgggg agaggcggtt tgcgtattgg gcgctcttcc
5820
gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct
5880
cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg
5940
tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc
6000
cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga
6060
aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct
6120
cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg
6180
gcgctttctc aatgctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag
6240
ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat
6300
cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac
6360
aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac
6420
tacggctaca ctagaaggac agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc
6480
ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt
6540
tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc
6600
ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg
6660
agattatcaa aaaggatctt cacctagatc cttttaaatt aaaaatgaag ttttaaatca
6720
atctaaagta tatatgagta aacttggtct gacagttacc aatgcttaat cagtgaggca
6780
cctatctcag cgatctgtct atttcgttca tccatagttg cctgactccc cgtcgtgtag
6840
ataactacga tacgggaggg cttaccatct ggccccagtg ctgcaatgat accgcgagac
6900
ccacgctcac cggctccaga tttatcagca ataaaccagc cagccggaag ggccgagcgc
6960
agaagtggtc ctgcaacttt atccgcctcc atccagtcta ttaattgttg ccgggaagct
7020
agagtaagta gttcgccagt taatagtttg cgcaacgttg ttgccattgc tacaggcatc
7080
gtggtgtcac gctcgtcgtt tggtatggct tcattcagct ccggttccca acgatcaagg
7140
cgagttacat gatcccccat gttgtgcaaa aaagcggtta gctccttcgg tcctccgatc
7200
gttgtcagaa gtaagttggc cgcagtgtta tcactcatgg ttatggcagc actgcataat
7260
tctcttactg tcatgccatc cgtaagatgc ttttctgtga ctggtgagta ctcaaccaag
7320
tcattctgag aatagtgtat gcggcgaccg agttgctctt gcccggcgtc aatacgggat
7380
aataccgcgc cacatagcag aactttaaaa gtgctcatca ttggaaaacg ttcttcgggg
7440
cgaaaactct caaggatctt accgctgttg agatccagtt cgatgtaacc cactcgtgca
7500
cccaactgat cttcagcatc ttttactttc accagcgttt ctgggtgagc aaaaacagga
7560
aggcaaaatg ccgcaaaaaa gggaataagg gcgacacgga aatgttgaat actcatactc
7620
ttcctttttc aatattattg aagcatttat cagggttatt gtctcatgag cggatacata
7680
tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaacgt
7740
cttcaagctg cctcgcgcgt ttcggtgatg acggtgaaaa cctctgacac atgcagctcc
7800
cggagacggt cacagcttgt ctgtaagcgg atgccgggag cagacaagcc cgtcagggcg
7860
cgtcagcggg tgttggcggg tgtcggggcg cagccatgac ccagtcacgt agcgatagcg
7920
gagttggctt aactatgcgg catcagagca gattgtactg agagtgcacc atatcgacgc
7980
tctcccttat gcgactcctg cattaggaag cagcccagta gtaggttgag gccgttgagc
8040
accgccgccg caaggaatgg tgctggctta tcgaaattaa tcgactcact atagggagac
8100
cc 8102
<210> 22
<211> 8102
<212> DNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> плазмиды Spike G614 DeltaCter
<400> 22
gaattcgagc tcgccccgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca 60
acgacccccg cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga 120
ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc 180
aagtgtatca tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct 240
ggcattatgc ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat 300
tagtcatcgc tattaccatg gtgatgcggt tttggcagta catcaatggg cgtggatagc 360
ggtttgactc acggggattt ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg agtttgtttt 420
ggcaccaaaa tcaacgggac tttccaaaat gtcgtaacaa ctccgcccca ttgacgcaaa 480
tgggcggtag gcgtgtacgg tgggaggtct atataagcag agctcgttta gtgaaccgtc 540
agatcgcctg gagacgccat ccacgctgtt ttgacctcca tagaagacac cgggaccgat 600
ccagcctccg ggggatcgat cccccgatcc tgagaacttc agggtgagtt tggggaccct 660
tgattgttct ttctttttcg ctattgtaaa attcatgtta tatggagggg gcaaagtttt 720
cagggtgttg tttagaatgg gaagatgtcc cttgtatcac catggaccct catgataatt 780
ttgtttcttt cactttctac tctgttgaca accattgtct cctcttattt tcttttcatt 840
ttctgtaact ttttcgttaa actttagctt gcatttgtaa cgaattttta aattcacttt 900
tgtttatttg tcagattgta agtactttct ctaatcactt ttttttcaag gcaatcaggg 960
tatattatat tgtacttcag cacagtttta gagaacaatt gttataatta aatgataagg
1020
tagaatattt ctgcatataa attctggctg gcgtggaaat attcttattg gtagaaacaa
1080
ctacatcctg gtcatcatcc tgcctttctc tttatggtta caatgatata cactgtttga
1140
gatgaggata aaatactctg agtccaaacc gggcccctct gctaaccatg ttcatgcctt
1200
cttctttttc ctacagctcc tgggcaacgt gctggttatt gtgctgtctc atcattttgg
1260
caaagaattg taatacgact cactataggg cgaattcgga tccgccacca tgttcgtgtt
1320
tctggtgctg ctgcctctgg tgtccagcca gtgtgtgaac ctgaccacaa gaacccagct
1380
gcctccagcc tacaccaaca gctttaccag aggcgtgtac taccccgaca aggtgttcag
1440
atccagcgtg ctgcactcta cccaggacct gttcctgcct ttcttcagca acgtgacctg
1500
gttccacgcc atccacgtgt ccggcaccaa tggcaccaag agattcgaca accccgtgct
1560
gcccttcaac gacggggtgt actttgccag caccgagaag tccaacatca tcagaggctg
1620
gatcttcggc accacactgg acagcaagac ccagagcctg ctgatcgtga acaacgccac
1680
caacgtggtc atcaaagtgt gcgagttcca gttctgcaac gaccccttcc tgggcgtcta
1740
ctatcacaag aacaacaaga gctggatgga aagcgagttc cgggtgtaca gcagcgccaa
1800
caactgcacc ttcgagtacg tgtcccagcc tttcctgatg gacctggaag gcaagcaggg
1860
caacttcaag aacctgcgcg agttcgtgtt caagaacatc gacggctact tcaagatcta
1920
cagcaagcac acccctatca acctcgtgcg ggatctgcct cagggcttct ctgctctgga
1980
acccctggtg gatctgccca tcggcatcaa catcacccgg tttcagacac tgctggccct
2040
gcacagaagc tacctgacac ctggcgatag cagcagcgga tggacagctg gtgccgccgc
2100
ttactatgtg ggctacctgc agcctagaac cttcctgctg aagtacaacg agaacggcac
2160
catcaccgac gccgtggatt gtgcccttga tcctctgagc gagacaaagt gcaccctgaa
2220
gtccttcacc gtggaaaagg gcatctacca gaccagcaac ttccgggtgc agcccaccga
2280
atccatcgtg cggttcccca atatcaccaa tctgtgcccc ttcggcgagg tgttcaatgc
2340
caccagattc gcctctgtgt acgcctggaa ccggaagcgg atcagcaatt gcgtggccga
2400
ctactccgtg ctgtacaact ccgccagctt cagcaccttc aagtgctacg gcgtgtcccc
2460
taccaagctg aacgacctgt gcttcacaaa cgtgtacgcc gacagcttcg tgatccgggg
2520
agatgaagtg cggcagattg cccctggaca gacaggcaag atcgccgact acaactacaa
2580
gctgcccgac gacttcaccg gctgtgtgat tgcctggaac agcaacaacc tggactccaa
2640
agtcggcggc aactacaatt acctgtaccg gctgttccgg aagtccaatc tgaagccctt
2700
cgagcgggac atctccaccg agatctatca ggccggcagc accccttgta acggcgtgga
2760
aggcttcaac tgctacttcc cactgcagtc ctacggcttt cagcccacaa atggcgtggg
2820
ctatcagccc tacagagtgg tggtgctgag cttcgaactg ctgcatgccc ctgccacagt
2880
gtgcggccct aagaaaagca ccaatctcgt gaagaacaaa tgcgtgaact tcaacttcaa
2940
cggcctgacc ggcaccggcg tgctgacaga gagcaacaag aagttcctgc cattccagca
3000
gtttggccgg gatatcgccg ataccacaga cgccgttaga gatccccaga cactggaaat
3060
cctggacatc accccttgca gcttcggcgg agtgtctgtg atcacccctg gcaccaacac
3120
cagcaatcag gtggcagtgc tgtaccaggg cgtgaactgt accgaagtgc ccgtggccat
3180
tcacgccgat cagctgacac ctacatggcg ggtgtactcc accggcagca atgtgtttca
3240
gaccagagcc ggctgtctga tcggagccga gcacgtgaac aatagctacg agtgcgacat
3300
ccccatcggc gctggcatct gtgccagcta ccagacacag acaaacagcc ccagacgggc
3360
cagatctgtg gccagccaga gcatcattgc ctacacaatg tctctgggcg ccgagaacag
3420
cgtggcctac tccaacaact ctatcgctat ccccaccaac ttcaccatca gcgtgaccac
3480
agagatcctg cctgtgtcca tgaccaagac cagcgtggac tgcaccatgt acatctgcgg
3540
cgattccacc gagtgctcca acctgctgct gcagtacggc agcttctgca cccagctgaa
3600
tagagccctg acagggatcg ccgtggaaca ggacaagaac acccaagagg tgttcgccca
3660
agtgaagcag atctacaaga cccctcctat caaggacttc ggcggcttca atttcagcca
3720
gattctgccc gatcctagca agcccagcaa gcggagcttc atcgaggacc tgctgttcaa
3780
caaagtgaca ctggccgacg ccggcttcat caagcagtat ggcgattgtc tgggcgacat
3840
tgccgccagg gatctgattt gcgcccagaa gtttaacgga ctgacagtgc tgccaccact
3900
gctgaccgat gagatgatcg cccagtacac atctgccctg ctggccggca caatcacaag
3960
cggctggaca tttggagctg gcgccgctct gcagatcccc tttgctatgc agatggccta
4020
ccggttcaac ggcatcggag tgacccagaa tgtgctgtac gagaaccaga agctgatcgc
4080
caaccagttc aacagcgcca tcggcaagat ccaggacagc ctgagcagca cagcaagcgc
4140
cctgggaaag ctgcaggacg tggtcaacca gaatgcccag gcactgaaca ccctggtcaa
4200
gcagctgtcc tccaacttcg gcgccatcag ctctgtgctg aacgatatcc tgagcagact
4260
ggacaaggtg gaagccgagg tgcagatcga cagactgatc accggaaggc tgcagtccct
4320
gcagacctac gttacccagc agctgatcag agccgccgag attagagcct ctgccaatct
4380
ggccgccacc aagatgtctg agtgtgtgct gggccagagc aagagagtgg acttttgcgg
4440
caagggctac cacctgatga gcttccctca gtctgcccct cacggcgtgg tgtttctgca
4500
cgtgacatac gtgcccgctc aagagaagaa tttcaccacc gctccagcca tctgccacga
4560
cggcaaagcc cactttccta gagaaggcgt gttcgtgtcc aacggcaccc attggttcgt
4620
gacccagcgg aacttctacg agccccagat catcaccacc gacaacacct tcgtgtctgg
4680
caactgcgac gtcgtgatcg gcattgtgaa caataccgtg tacgaccctc tgcagcccga
4740
gctggacagc ttcaaagagg aactggataa gtactttaag aaccacacaa gccccgacgt
4800
ggacctgggc gatatcagcg gaatcaatgc cagcgtcgtg aacatccaga aagagatcga
4860
ccggctgaac gaggtggcca agaatctgaa cgagagcctg atcgacctgc aagaactggg
4920
gaagtacgag cagtacatca agtggccctg gtacatctgg ctgggcttta tcgccggact
4980
gattgccatc gtgatggtca caatcatgct gtgttgcatg accagctgct gtagctgcct
5040
gaagggctgt tgtagctgtg gcagctgctg ctaatctaga gtcgactgtt taaacctgca
5100
ggcatgcaag ctgatctttt tccctctgcc aaaaattatg gggacatcat gaagcccctt
5160
gagcatctga cttctggcta ataaaggaaa tttattttca ttgcaatagt gtgttggaat
5220
tttttgtgtc tctcactcgg aaggacatat gggagggcaa atcatttaaa acatcagaat
5280
gagtatttgg tttagagttt ggcaacatat gccatatgct ggctgccatg aacaaaggtg
5340
gctataaaga ggtcatcagt atatgaaaca gccccctgct gtccattcct tattccatag
5400
aaaagccttg acttgaggtt agattttttt tatattttgt tttgtgttat ttttttcttt
5460
aacatcccta aaattttcct tacatgtttt actagccaga tttttcctcc tctcctgact
5520
actcccagtc atagctgtcc ctcttctctt atgaactcga ggagcttttt gcaaaagcct
5580
aggcctccaa aaaagcctcc tcactacttc tggaatagct cagaggccga ggcggcctcg
5640
gcctctgcat aaataaaaaa aattagtcag ccatggggcg gagaatgggc ggaactgggc
5700
ggagttaggg gcgggatggg cggagttagg ggcgggacta tggttgctga ctaattgaga
5760
ctgcattaat gaatcggcca acgcgcgggg agaggcggtt tgcgtattgg gcgctcttcc
5820
gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct
5880
cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg
5940
tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc
6000
cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga
6060
aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct
6120
cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg
6180
gcgctttctc aatgctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag
6240
ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat
6300
cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac
6360
aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac
6420
tacggctaca ctagaaggac agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc
6480
ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt
6540
tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc
6600
ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg
6660
agattatcaa aaaggatctt cacctagatc cttttaaatt aaaaatgaag ttttaaatca
6720
atctaaagta tatatgagta aacttggtct gacagttacc aatgcttaat cagtgaggca
6780
cctatctcag cgatctgtct atttcgttca tccatagttg cctgactccc cgtcgtgtag
6840
ataactacga tacgggaggg cttaccatct ggccccagtg ctgcaatgat accgcgagac
6900
ccacgctcac cggctccaga tttatcagca ataaaccagc cagccggaag ggccgagcgc
6960
agaagtggtc ctgcaacttt atccgcctcc atccagtcta ttaattgttg ccgggaagct
7020
agagtaagta gttcgccagt taatagtttg cgcaacgttg ttgccattgc tacaggcatc
7080
gtggtgtcac gctcgtcgtt tggtatggct tcattcagct ccggttccca acgatcaagg
7140
cgagttacat gatcccccat gttgtgcaaa aaagcggtta gctccttcgg tcctccgatc
7200
gttgtcagaa gtaagttggc cgcagtgtta tcactcatgg ttatggcagc actgcataat
7260
tctcttactg tcatgccatc cgtaagatgc ttttctgtga ctggtgagta ctcaaccaag
7320
tcattctgag aatagtgtat gcggcgaccg agttgctctt gcccggcgtc aatacgggat
7380
aataccgcgc cacatagcag aactttaaaa gtgctcatca ttggaaaacg ttcttcgggg
7440
cgaaaactct caaggatctt accgctgttg agatccagtt cgatgtaacc cactcgtgca
7500
cccaactgat cttcagcatc ttttactttc accagcgttt ctgggtgagc aaaaacagga
7560
aggcaaaatg ccgcaaaaaa gggaataagg gcgacacgga aatgttgaat actcatactc
7620
ttcctttttc aatattattg aagcatttat cagggttatt gtctcatgag cggatacata
7680
tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaacgt
7740
cttcaagctg cctcgcgcgt ttcggtgatg acggtgaaaa cctctgacac atgcagctcc
7800
cggagacggt cacagcttgt ctgtaagcgg atgccgggag cagacaagcc cgtcagggcg
7860
cgtcagcggg tgttggcggg tgtcggggcg cagccatgac ccagtcacgt agcgatagcg
7920
gagttggctt aactatgcgg catcagagca gattgtactg agagtgcacc atatcgacgc
7980
tctcccttat gcgactcctg cattaggaag cagcccagta gtaggttgag gccgttgagc
8040
accgccgccg caaggaatgg tgctggctta tcgaaattaa tcgactcact atagggagac
8100
cc 8102
<210> 23
<211> 4337
<212> DNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> плазмиды, кодирующие пустой вектор
<400> 23
gaattcgagc tcgccccgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca 60
acgacccccg cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga 120
ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc 180
aagtgtatca tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct 240
ggcattatgc ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat 300
tagtcatcgc tattaccatg gtgatgcggt tttggcagta catcaatggg cgtggatagc 360
ggtttgactc acggggattt ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg agtttgtttt 420
ggcaccaaaa tcaacgggac tttccaaaat gtcgtaacaa ctccgcccca ttgacgcaaa 480
tgggcggtag gcgtgtacgg tgggaggtct atataagcag agctcgttta gtgaaccgtc 540
agatcgcctg gagacgccat ccacgctgtt ttgacctcca tagaagacac cgggaccgat 600
ccagcctccg ggggatcgat cccccgatcc tgagaacttc agggtgagtt tggggaccct 660
tgattgttct ttctttttcg ctattgtaaa attcatgtta tatggagggg gcaaagtttt 720
cagggtgttg tttagaatgg gaagatgtcc cttgtatcac catggaccct catgataatt 780
ttgtttcttt cactttctac tctgttgaca accattgtct cctcttattt tcttttcatt 840
ttctgtaact ttttcgttaa actttagctt gcatttgtaa cgaattttta aattcacttt 900
tgtttatttg tcagattgta agtactttct ctaatcactt ttttttcaag gcaatcaggg 960
tatattatat tgtacttcag cacagtttta gagaacaatt gttataatta aatgataagg
1020
tagaatattt ctgcatataa attctggctg gcgtggaaat attcttattg gtagaaacaa
1080
ctacatcctg gtcatcatcc tgcctttctc tttatggtta caatgatata cactgtttga
1140
gatgaggata aaatactctg agtccaaacc gggcccctct gctaaccatg ttcatgcctt
1200
cttctttttc ctacagctcc tgggcaacgt gctggttatt gtgctgtctc atcattttgg
1260
caaagaattg taatacgact cactataggg cgaattcgga tccgccacct ctagagtcga
1320
ctgtttaaac ctgcaggcat gcaagctgat ctttttccct ctgccaaaaa ttatggggac
1380
atcatgaagc cccttgagca tctgacttct ggctaataaa ggaaatttat tttcattgca
1440
atagtgtgtt ggaatttttt gtgtctctca ctcggaagga catatgggag ggcaaatcat
1500
ttaaaacatc agaatgagta tttggtttag agtttggcaa catatgccat atgctggctg
1560
ccatgaacaa aggtggctat aaagaggtca tcagtatatg aaacagcccc ctgctgtcca
1620
ttccttattc catagaaaag ccttgacttg aggttagatt ttttttatat tttgttttgt
1680
gttatttttt tctttaacat ccctaaaatt ttccttacat gttttactag ccagattttt
1740
cctcctctcc tgactactcc cagtcatagc tgtccctctt ctcttatgaa ctcgaggagc
1800
tttttgcaaa agcctaggcc tccaaaaaag cctcctcact acttctggaa tagctcagag
1860
gccgaggcgg cctcggcctc tgcataaata aaaaaaatta gtcagccatg gggcggagaa
1920
tgggcggaac tgggcggagt taggggcggg atgggcggag ttaggggcgg gactatggtt
1980
gctgactaat tgagactgca ttaatgaatc ggccaacgcg cggggagagg cggtttgcgt
2040
attgggcgct cttccgcttc ctcgctcact gactcgctgc gctcggtcgt tcggctgcgg
2100
cgagcggtat cagctcactc aaaggcggta atacggttat ccacagaatc aggggataac
2160
gcaggaaaga acatgtgagc aaaaggccag caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg
2220
ttgctggcgt ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca
2280
agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc
2340
tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc
2400
ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcaatgc tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag
2460
gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc
2520
ttatccggta actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac acgacttatc gccactggca
2580
gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg
2640
aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga aggacagtat ttggtatctg cgctctgctg
2700
aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct
2760
ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa
2820
gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa
2880
gggattttgg tcatgagatt atcaaaaagg atcttcacct agatcctttt aaattaaaaa
2940
tgaagtttta aatcaatcta aagtatatat gagtaaactt ggtctgacag ttaccaatgc
3000
ttaatcagtg aggcacctat ctcagcgatc tgtctatttc gttcatccat agttgcctga
3060
ctccccgtcg tgtagataac tacgatacgg gagggcttac catctggccc cagtgctgca
3120
atgataccgc gagacccacg ctcaccggct ccagatttat cagcaataaa ccagccagcc
3180
ggaagggccg agcgcagaag tggtcctgca actttatccg cctccatcca gtctattaat
3240
tgttgccggg aagctagagt aagtagttcg ccagttaata gtttgcgcaa cgttgttgcc
3300
attgctacag gcatcgtggt gtcacgctcg tcgtttggta tggcttcatt cagctccggt
3360
tcccaacgat caaggcgagt tacatgatcc cccatgttgt gcaaaaaagc ggttagctcc
3420
ttcggtcctc cgatcgttgt cagaagtaag ttggccgcag tgttatcact catggttatg
3480
gcagcactgc ataattctct tactgtcatg ccatccgtaa gatgcttttc tgtgactggt
3540
gagtactcaa ccaagtcatt ctgagaatag tgtatgcggc gaccgagttg ctcttgcccg
3600
gcgtcaatac gggataatac cgcgccacat agcagaactt taaaagtgct catcattgga
3660
aaacgttctt cggggcgaaa actctcaagg atcttaccgc tgttgagatc cagttcgatg
3720
taacccactc gtgcacccaa ctgatcttca gcatctttta ctttcaccag cgtttctggg
3780
tgagcaaaaa caggaaggca aaatgccgca aaaaagggaa taagggcgac acggaaatgt
3840
tgaatactca tactcttcct ttttcaatat tattgaagca tttatcaggg ttattgtctc
3900
atgagcggat acatatttga atgtatttag aaaaataaac aaataggggt tccgcgcaca
3960
tttccccgaa aacgtcttca agctgcctcg cgcgtttcgg tgatgacggt gaaaacctct
4020
gacacatgca gctcccggag acggtcacag cttgtctgta agcggatgcc gggagcagac
4080
aagcccgtca gggcgcgtca gcgggtgttg gcgggtgtcg gggcgcagcc atgacccagt
4140
cacgtagcga tagcggagtt ggcttaacta tgcggcatca gagcagattg tactgagagt
4200
gcaccatatc gacgctctcc cttatgcgac tcctgcatta ggaagcagcc cagtagtagg
4260
ttgaggccgt tgagcaccgc cgccgcaagg aatggtgctg gcttatcgaa attaatcgac
4320
tcactatagg gagaccc 4337
<210> 24
<211> 9893
<212> DNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Вектор для трансдукции АПФ2
<400> 24
acgcgtgtag tcttatgcaa tactcttgta gtcttgcaac atggtaacga tgagttagca 60
acatgcctta caaggagaga aaaagcaccg tgcatgccga ttggtggaag taaggtggta 120
cgatcgtgcc ttattaggaa ggcaacagac gggtctgaca tggattggac gaaccactga 180
attgccgcat tgcagagata ttgtatttaa gtgcctagct cgatacaata aacgggtctc 240
tctggttaga ccagatctga gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta 300
agcctcaata aagcttgcct tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact 360
ctggtaacta gagatccctc agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agcagtggcg 420
cccgaacagg gacctgaaag cgaaagggaa accagagctc tctcgacgca ggactcggct 480
tgctgaagcg cgcacggcaa gaggcgaggg gcggcgactg gtgagtacgc caaaaatttt 540
gactagcgga ggctagaagg agagagatgg gtgcgagagc gtcagtatta agcgggggag 600
aattagatcg cgatgggaaa aaattcggtt aaggccaggg ggaaagaaaa aatataaatt 660
aaaacatata gtatgggcaa gcagggagct agaacgattc gcagttaatc ctggcctgtt 720
agaaacatca gaaggctgta gacaaatact gggacagcta caaccatccc ttcagacagg 780
atcagaagaa cttagatcat tatataatac agtagcaacc ctctattgtg tgcatcaaag 840
gatagagata aaagacacca aggaagcttt agacaagata gaggaagagc aaaacaaaag 900
taagaccacc gcacagcaag cggccactga tcttcagacc tggaggagga gatatgaggg 960
acaattggag aagtgaatta tataaatata aagtagtaaa aattgaacca ttaggagtag
1020
cacccaccaa ggcaaagaga agagtggtgc agagagaaaa aagagcagtg ggaataggag
1080
ctttgttcct tgggttcttg ggagcagcag gaagcactat gggcgcagcg tcaatgacgc
1140
tgacggtaca ggccagacaa ttattgtctg gtatagtgca gcagcagaac aatttgctga
1200
gggctattga ggcgcaacag catctgttgc aactcacagt ctggggcatc aagcagctcc
1260
aggcaagaat cctggctgtg gaaagatacc taaaggatca acagctcctg gggatttggg
1320
gttgctctgg aaaactcatt tgcaccactg ctgtgccttg gaatgctagt tggagtaata
1380
aatctctgga acagatttgg aatcacacga cctggatgga gtgggacaga gaaattaaca
1440
attacacaag cttaatacac tccttaattg aagaatcgca aaaccagcaa gaaaagaatg
1500
aacaagaatt attggaatta gataaatggg caagtttgtg gaattggttt aacataacaa
1560
attggctgtg gtatataaaa ttattcataa tgatagtagg aggcttggta ggtttaagaa
1620
tagtttttgc tgtactttct atagtgaata gagttaggca gggatattca ccattatcgt
1680
ttcagaccca cctcccaacc ccgaggggac ccgacaggcc cgaaggaata gaagaagaag
1740
gtggagagag agacagagac agatccattc gattagtgaa cggatctcga cggtatcggt
1800
taacttttaa aagaaaaggg gggattgggg ggtacagtgc aggggaaaga atagtagaca
1860
taatagcaac agacatacaa actaaagaat tacaaaaaca aattacaaaa ttcaaaattt
1920
tatcgattac tagtattatg cccagtacat gaccttatgg gactttccta cttggcagta
1980
catctacgta ttagtcatcg ctattaccat ggtgatgcgg ttttggcagt acatcaatgg
2040
gcgtggatag cggtttgact cacggggatt tccaagtctc caccccattg acgtcaatgg
2100
gagtttgttt tggcaccaaa atcaacggga ctttccaaaa tgtcgtaaca actccgcccc
2160
attgacgcaa atgggcggta ggcgtgtacg gtgggaggtt tatataagca gagctcgttt
2220
agtgaaccgt cagatcgcct ggagacgcca tccacgctgt tttgacctcc atagaagatt
2280
ctagagctag cgtttaaact taagcttggt accgagctcg gatccactag tccagtgtgg
2340
tggaattctg cagatatcca gcacagtggc ggccgctcga gatgtcaagc tcttcctggc
2400
tccttctcag ccttgttgct gtaactgctg ctcagtccac cattgaggaa caggccaaga
2460
catttttgga caagtttaac cacgaagccg aagacctgtt ctatcaaagt tcacttgctt
2520
cttggaatta taacaccaat attactgaag agaatgtcca aaacatgaat aatgctgggg
2580
acaaatggtc tgccttttta aaggaacagt ccacacttgc ccaaatgtat ccactacaag
2640
aaattcagaa tctcacagtc aagcttcagc tgcaggctct tcagcaaaat gggtcttcag
2700
tgctctcaga agacaagagc aaacggttga acacaattct aaatacaatg agcaccatct
2760
acagtactgg aaaagtttgt aacccagata atccacaaga atgcttatta cttgaaccag
2820
gtttgaatga aataatggca aacagtttag actacaatga gaggctctgg gcttgggaaa
2880
gctggagatc tgaggtcggc aagcagctga ggccattata tgaagagtat gtggtcttga
2940
aaaatgagat ggcaagagca aatcattatg aggactatgg ggattattgg agaggagact
3000
atgaagtaaa tggggtagat ggctatgact acagccgcgg ccagttgatt gaagatgtgg
3060
aacatacctt tgaagagatt aaaccattat atgaacatct tcatgcctat gtgagggcaa
3120
agttgatgaa tgcctatcct tcctatatca gtccaattgg atgcctccct gctcatttgc
3180
ttggtgatat gtggggtaga ttttggacaa atctgtactc tttgacagtt ccctttggac
3240
agaaaccaaa catagatgtt actgatgcaa tggtggacca ggcctgggat gcacagagaa
3300
tattcaagga ggccgagaag ttctttgtat ctgttggtct tcctaatatg actcaaggat
3360
tctgggaaaa ttccatgcta acggacccag gaaatgttca gaaagcagtc tgccatccca
3420
cagcttggga cctggggaag ggcgacttca ggatccttat gtgcacaaag gtgacaatgg
3480
acgacttcct gacagctcat catgagatgg ggcatatcca gtatgatatg gcatatgctg
3540
cacaaccttt tctgctaaga aatggagcta atgaaggatt ccatgaagct gttggggaaa
3600
tcatgtcact ttctgcagcc acacctaagc atttaaaatc cattggtctt ctgtcacccg
3660
attttcaaga agacaatgaa acagaaataa acttcctgct caaacaagca ctcacgattg
3720
ttgggactct gccatttact tacatgttag agaagtggag gtggatggtc tttaaagggg
3780
aaattcccaa agaccagtgg atgaaaaagt ggtgggagat gaagcgagag atagttgggg
3840
tggtggaacc tgtgccccat gatgaaacat actgtgaccc cgcatctctg ttccatgttt
3900
ctaatgatta ctcattcatt cgatattaca caaggaccct ttaccaattc cagtttcaag
3960
aagcactttg tcaagcagct aaacatgaag gccctctgca caaatgtgac atctcaaact
4020
ctacagaagc tggacagaaa ctgttcaata tgctgaggct tggaaaatca gaaccctgga
4080
ccctagcatt ggaaaatgtt gtaggagcaa agaacatgaa tgtaaggcca ctgctcaact
4140
actttgagcc cttatttacc tggctgaaag accagaacaa gaattctttt gtgggatgga
4200
gtaccgactg gagtccatat gcagaccaaa gcatcaaagt gaggataagc ctaaaatcag
4260
ctcttggaga taaagcatat gaatggaacg acaatgaaat gtacctgttc cgatcatctg
4320
ttgcatatgc tatgaggcag tactttttaa aagtaaaaaa tcagatgatt ctttttgggg
4380
aggaggatgt gcgagtggct aatttgaaac caagaatctc ctttaatttc tttgtcactg
4440
cacctaaaaa tgtgtctgat atcattccta gaactgaagt tgaaaaggcc atcaggatgt
4500
cccggagccg tatcaatgat gctttccgtc tgaatgacaa cagcctagag tttctgggga
4560
tacagccaac acttggacct cctaaccagc cccctgtttc catatggctg attgtttttg
4620
gagttgtgat gggagtgata gtggttggca ttgtcatcct gatcttcact gggatcagag
4680
atcggaagaa gaaaaataaa gcaagaagtg gagaaaatcc ttatgcctcc atcgatatta
4740
gcaaaggaga aaataatcca ggattccaaa acactgatga tgttcagacc tccttttagc
4800
ccaaatcgga tccgcggccg caaggatctg cgatcgctcc ggtgcccgtc agtgggcaga
4860
gcgcacatcg cccacagtcc ccgagaagtt ggggggaggg gtcggcaatt gaacgggtgc
4920
ctagagaagg tggcgcgggg taaactggga aagtgatgtc gtgtactggc tccgcctttt
4980
tcccgagggt gggggagaac cgtatataag tgcagtagtc gccgtgaacg ttctttttcg
5040
caacgggttt gccgccagaa cacagctgaa gcttcgaggg gctcgcatct ctccttcacg
5100
cgcccgccgc cctacctgag gccgccatcc acgccggttg agtcgcgttc tgccgcctcc
5160
cgcctgtggt gcctcctgaa ctgcgtccgc cgtctaggta agtttaaagc tcaggtcgag
5220
accgggcctt tgtccggcgc tcccttggag cctacctaga ctcagccggc tctccacgct
5280
ttgcctgacc ctgcttgctc aactctacgt ctttgtttcg ttttctgttc tgcgccgtta
5340
cagatccaag ctgtgaccgg cgcctacgat atgaccgagt acaagcccac ggtgcgcctc
5400
gccacccgcg acgacgtccc cagggccgta cgcaccctcg ccgccgcgtt cgccgactac
5460
cccgccacgc gccacaccgt cgatccggac cgccacatcg agcgggtcac cgagctgcaa
5520
gaactcttcc tcacgcgcgt cgggctcgac atcggcaagg tgtgggtcgc ggacgacggc
5580
gccgcggtgg cggtctggac cacgccggag agcgtcgaag cgggggcggt gttcgccgag
5640
atcggcccgc gcatggccga gttgagcggt tcccggctgg ccgcgcagca acagatggaa
5700
ggcctcctgg cgccgcaccg gcccaaggag cccgcgtggt tcctggccac cgtcggcgtc
5760
tcgcccgacc accagggcaa gggtctgggc agcgccgtcg tgctccccgg agtggaggcg
5820
gccgagcgcg ccggggtgcc cgccttcctg gagacctccg cgccccgcaa cctccccttc
5880
tacgagcggc tcggcttcac cgtcaccgcc gacgtcgagg tgcccgaagg accgcgcacc
5940
tggtgcatga cccgcaagcc cggtgcctga caatcaacct ctggattaca aaatttgtga
6000
aagattgact ggtattctta actatgttgc tccttttacg ctatgtggat acgctgcttt
6060
aatgcctttg tatcatgcta ttgcttcccg tatggctttc attttctcct ccttgtataa
6120
atcctggttg ctgtctcttt atgaggagtt gtggcccgtt gtcaggcaac gtggcgtggt
6180
gtgcactgtg tttgctgacg caacccccac tggttggggc attgccacca cctgtcagct
6240
cctttccggg actttcgctt tccccctccc tattgccacg gcggaactca tcgccgcctg
6300
ccttgcccgc tgctggacag gggctcggct gttgggcact gacaattccg tggtgttgtc
6360
ggggaaatca tcgtcctttc cttggctgct cgcctgtgtt gccacctgga ttctgcgcgg
6420
gacgtccttc tgctacgtcc cttcggccct caatccagcg gaccttcctt cccgcggcct
6480
gctgccggct ctgcggcctc ttccgcgtct tcgccttcgc cctcagacga gtcggatctc
6540
cctttgggcc gcctccccgc ctggtacctt taagaccaat gacttacaag gcagctgtag
6600
atcttagcca ctttttaaaa gaaaaggggg gactggaagg gctaattcac tcccaacgaa
6660
gataagatct gctttttgct tgtactgggt ctctctggtt agaccagatc tgagcctggg
6720
agctctctgg ctaactaggg aacccactgc ttaagcctca ataaagcttg ccttgagtgc
6780
ttcaagtagt gtgtgcccgt ctgttgtgtg actctggtaa ctagagatcc ctcagaccct
6840
tttagtcagt gtggaaaatc tctagcagta gtagttcatg tcatcttatt attcagtatt
6900
tataacttgc aaagaaatga atatcagaga gtgagaggaa cttgtttatt gcagcttata
6960
atggttacaa ataaagcaat agcatcacaa atttcacaaa taaagcattt ttttcactgc
7020
attctagttg tggtttgtcc aaactcatca atgtatctta tcatgtctgg ctctagctat
7080
cccgccccta actccgccca tcccgcccct aactccgccc agttccgccc attctccgcc
7140
ccatggctga ctaatttttt ttatttatgc agaggccgag gccgcctcgg cctctgagct
7200
attccagaag tagtgaggag gcttttttgg aggcctagac ttttgcagag accaaattcg
7260
taatcatgtc atagctgttt cctgtgtgaa attgttatcc gctcacaatt ccacacaaca
7320
tacgagccgg aagcataaag tgtaaagcct ggggtgccta atgagtgagc taactcacat
7380
taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa cctgtcgtgc cagctgcatt
7440
aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat tgggcgctct tccgcttcct
7500
cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa
7560
aggcggtaat acggttatcc acagaatcag gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa
7620
aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc
7680
tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga
7740
caggactata aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc
7800
cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt
7860
ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct
7920
gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg
7980
agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt aacaggatta
8040
gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct aactacggct
8100
acactagaag gacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa
8160
gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt
8220
gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg atcttttcta
8280
cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc atgagattat
8340
caaaaaggat cttcacctag atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa
8400
gtatatatga gtaaacttgg tctgacagtt accaatgctt aatcagtgag gcacctatct
8460
cagcgatctg tctatttcgt tcatccatag ttgcctgact ccccgtcgtg tagataacta
8520
cgatacggga gggcttacca tctggcccca gtgctgcaat gataccgcga gacccacgct
8580
caccggctcc agatttatca gcaataaacc agccagccgg aagggccgag cgcagaagtg
8640
gtcctgcaac tttatccgcc tccatccagt ctattaattg ttgccgggaa gctagagtaa
8700
gtagttcgcc agttaatagt ttgcgcaacg ttgttgccat tgctacaggc atcgtggtgt
8760
cacgctcgtc gtttggtatg gcttcattca gctccggttc ccaacgatca aggcgagtta
8820
catgatcccc catgttgtgc aaaaaagcgg ttagctcctt cggtcctccg atcgttgtca
8880
gaagtaagtt ggccgcagtg ttatcactca tggttatggc agcactgcat aattctctta
8940
ctgtcatgcc atccgtaaga tgcttttctg tgactggtga gtactcaacc aagtcattct
9000
gagaatagtg tatgcggcga ccgagttgct cttgcccggc gtcaatacgg gataataccg
9060
cgccacatag cagaacttta aaagtgctca tcattggaaa acgttcttcg gggcgaaaac
9120
tctcaaggat cttaccgctg ttgagatcca gttcgatgta acccactcgt gcacccaact
9180
gatcttcagc atcttttact ttcaccagcg tttctgggtg agcaaaaaca ggaaggcaaa
9240
atgccgcaaa aaagggaata agggcgacac ggaaatgttg aatactcata ctcttccttt
9300
ttcaatatta ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcat gagcggatac atatttgaat
9360
gtatttagaa aaataaacaa ataggggttc cgcgcacatt tccccgaaaa gtgccacctg
9420
acgtctaaga aaccattatt atcatgacat taacctataa aaataggcgt atcacgaggc
9480
cctttcgtct cgcgcgtttc ggtgatgacg gtgaaaacct ctgacacatg cagctcccgg
9540
agacggtcac agcttgtctg taagcggatg ccgggagcag acaagcccgt cagggcgcgt
9600
cagcgggtgt tggcgggtgt cggggctggc ttaactatgc ggcatcagag cagattgtac
9660
tgagagtgca ccatatgcgg tgtgaaatac cgcacagatg cgtaaggaga aaataccgca
9720
tcaggcgcca ttcgccattc aggctgcgca actgttggga agggcgatcg gtgcgggcct
9780
cttcgctatt acgccagctg gcgaaagggg gatgtgctgc aaggcgatta agttgggtaa
9840
cgccagggtt ttcccagtca cgacgttgta aaacgacggc cagtgccaag ctg 9893
<210> 25
<211> 8668
<212> DNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> вектор для трансдукции TMPRSS2
<400> 25
acgcgtgtag tcttatgcaa tactcttgta gtcttgcaac atggtaacga tgagttagca 60
acatgcctta caaggagaga aaaagcaccg tgcatgccga ttggtggaag taaggtggta 120
cgatcgtgcc ttattaggaa ggcaacagac gggtctgaca tggattggac gaaccactga 180
attgccgcat tgcagagata ttgtatttaa gtgcctagct cgatacaata aacgggtctc 240
tctggttaga ccagatctga gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta 300
agcctcaata aagcttgcct tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact 360
ctggtaacta gagatccctc agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agcagtggcg 420
cccgaacagg gacctgaaag cgaaagggaa accagagctc tctcgacgca ggactcggct 480
tgctgaagcg cgcacggcaa gaggcgaggg gcggcgactg gtgagtacgc caaaaatttt 540
gactagcgga ggctagaagg agagagatgg gtgcgagagc gtcagtatta agcgggggag 600
aattagatcg cgatgggaaa aaattcggtt aaggccaggg ggaaagaaaa aatataaatt 660
aaaacatata gtatgggcaa gcagggagct agaacgattc gcagttaatc ctggcctgtt 720
agaaacatca gaaggctgta gacaaatact gggacagcta caaccatccc ttcagacagg 780
atcagaagaa cttagatcat tatataatac agtagcaacc ctctattgtg tgcatcaaag 840
gatagagata aaagacacca aggaagcttt agacaagata gaggaagagc aaaacaaaag 900
taagaccacc gcacagcaag cggccactga tcttcagacc tggaggagga gatatgaggg 960
acaattggag aagtgaatta tataaatata aagtagtaaa aattgaacca ttaggagtag
1020
cacccaccaa ggcaaagaga agagtggtgc agagagaaaa aagagcagtg ggaataggag
1080
ctttgttcct tgggttcttg ggagcagcag gaagcactat gggcgcagcg tcaatgacgc
1140
tgacggtaca ggccagacaa ttattgtctg gtatagtgca gcagcagaac aatttgctga
1200
gggctattga ggcgcaacag catctgttgc aactcacagt ctggggcatc aagcagctcc
1260
aggcaagaat cctggctgtg gaaagatacc taaaggatca acagctcctg gggatttggg
1320
gttgctctgg aaaactcatt tgcaccactg ctgtgccttg gaatgctagt tggagtaata
1380
aatctctgga acagatttgg aatcacacga cctggatgga gtgggacaga gaaattaaca
1440
attacacaag cttaatacac tccttaattg aagaatcgca aaaccagcaa gaaaagaatg
1500
aacaagaatt attggaatta gataaatggg caagtttgtg gaattggttt aacataacaa
1560
attggctgtg gtatataaaa ttattcataa tgatagtagg aggcttggta ggtttaagaa
1620
tagtttttgc tgtactttct atagtgaata gagttaggca gggatattca ccattatcgt
1680
ttcagaccca cctcccaacc ccgaggggac ccgacaggcc cgaaggaata gaagaagaag
1740
gtggagagag agacagagac agatccattc gattagtgaa cggatctcga cggtatcggt
1800
taacttttaa aagaaaaggg gggattgggg ggtacagtgc aggggaaaga atagtagaca
1860
taatagcaac agacatacaa actaaagaat tacaaaaaca aattacaaaa ttcaaaattt
1920
tatcgattac tagtattatg cccagtacat gaccttatgg gactttccta cttggcagta
1980
catctacgta ttagtcatcg ctattaccat ggtgatgcgg ttttggcagt acatcaatgg
2040
gcgtggatag cggtttgact cacggggatt tccaagtctc caccccattg acgtcaatgg
2100
gagtttgttt tggcaccaaa atcaacggga ctttccaaaa tgtcgtaaca actccgcccc
2160
attgacgcaa atgggcggta ggcgtgtacg gtgggaggtt tatataagca gagctcgttt
2220
agtgaaccgt cagatcgcct ggagacgcca tccacgctgt tttgacctcc atagaagatt
2280
ctagagctag cgtttaaact taaggccacc atggctttga actcagggtc accaccagct
2340
attggacctt actatgaaaa ccatggatac caaccggaaa acccctatcc cgcacagccc
2400
actgtggtcc ccactgtcta cgaggtgcat ccggctcagt actacccgtc ccccgtgccc
2460
cagtacgccc cgagggtcct gacgcaggct tccaaccccg tcgtctgcac gcagcccaaa
2520
tccccatccg ggacagtgtg cacctcaaag actaagaaag cactgtgcat caccttgacc
2580
ctggggacct tcctcgtggg agctgcgctg gccgctggcc tactctggaa gttcatgggc
2640
agcaagtgct ccaactctgg gatagagtgc gactcctcag gtacctgcat caacccctct
2700
aactggtgtg atggcgtgtc acactgcccc ggcggggagg acgagaatcg gtgtgttcgc
2760
ctctacggac caaacttcat ccttcaggtg tactcatctc agaggaagtc ctggcaccct
2820
gtgtgccaag acgactggaa cgagaactac gggcgggcgg cctgcaggga catgggctat
2880
aagaataatt tttactctag ccaaggaata gtggatgaca gcggatccac cagctttatg
2940
aaactgaaca caagtgccgg caatgtcgat atctataaaa aactgtacca cagtgatgcc
3000
tgttcttcaa aagcagtggt ttctttacgc tgtatagcct gcggggtcaa cttgaactca
3060
agccgccaga gcaggattgt gggcggcgag agcgcgctcc cgggggcctg gccctggcag
3120
gtcagcctgc acgtccagaa cgtccacgtg tgcggaggct ccatcatcac ccccgagtgg
3180
atcgtgacag ccgcccactg cgtggaaaaa cctcttaaca atccatggca ttggacggca
3240
tttgcgggga ttttgagaca atctttcatg ttctatggag ccggatacca agtagaaaaa
3300
gtgatttctc atccaaatta tgactccaag accaagaaca atgacattgc gctgatgaag
3360
ctgcagaagc ctctgacttt caacgaccta gtgaaaccag tgtgtctgcc caacccaggc
3420
atgatgctgc agccagaaca gctctgctgg atttccgggt ggggggccac cgaggagaaa
3480
gggaagacct cagaagtgct gaacgctgcc aaggtgcttc tcattgagac acagagatgc
3540
aacagcagat atgtctatga caacctgatc acaccagcca tgatctgtgc cggcttcctg
3600
caggggaacg tcgattcttg ccagggtgac agtggagggc ctctggtcac ttcgaagaac
3660
aatatctggt ggctgatagg ggatacaagc tggggttctg gctgtgccaa agcttacaga
3720
ccaggagtgt acgggaatgt gatggtattc acggactgga tttatcgaca aatgagggca
3780
gacggctaag cggccgcaag gatctgcgat cgctccggtg cccgtcagtg ggcagagcgc
3840
acatcgccca cagtccccga gaagttgggg ggaggggtcg gcaattgaac gggtgcctag
3900
agaaggtggc gcggggtaaa ctgggaaagt gatgtcgtgt actggctccg cctttttccc
3960
gagggtgggg gagaaccgta tataagtgca gtagtcgccg tgaacgttct ttttcgcaac
4020
gggtttgccg ccagaacaca gctgaagctt cgaggggctc gcatctctcc ttcacgcgcc
4080
cgccgcccta cctgaggccg ccatccacgc cggttgagtc gcgttctgcc gcctcccgcc
4140
tgtggtgcct cctgaactgc gtccgccgtc taggtaagtt taaagctcag gtcgagaccg
4200
ggcctttgtc cggcgctccc ttggagccta cctagactca gccggctctc cacgctttgc
4260
ctgaccctgc ttgctcaact ctacgtcttt gtttcgtttt ctgttctgcg ccgttacaga
4320
tccaagctgt gaccggcgcc tacgatatgg ccaagccttt gtctcaagaa gaatccaccc
4380
tcattgaaag agcaacggct acaatcaaca gcatccccat ctctgaagac tacagcgtcg
4440
ccagcgcagc tctctctagc gacggccgca tcttcactgg tgtcaatgta tatcatttta
4500
ctgggggacc ttgtgcagaa ctcgtggtgc tgggcactgc tgctgctgcg gcagctggca
4560
acctgacttg tatcgtcgcg atcggaaatg agaacagggg catcttgagc ccctgcggac
4620
ggtgccgaca ggtgcttctc gatctgcatc ctgggatcaa agccatagtg aaggacagtg
4680
atggacagcc gacggcagtt gggattcgtg aattgctgcc ctctggttat gtgtgggagg
4740
gctaacaatc aacctctgga ttacaaaatt tgtgaaagat tgactggtat tcttaactat
4800
gttgctcctt ttacgctatg tggatacgct gctttaatgc ctttgtatca tgctattgct
4860
tcccgtatgg ctttcatttt ctcctccttg tataaatcct ggttgctgtc tctttatgag
4920
gagttgtggc ccgttgtcag gcaacgtggc gtggtgtgca ctgtgtttgc tgacgcaacc
4980
cccactggtt ggggcattgc caccacctgt cagctccttt ccgggacttt cgctttcccc
5040
ctccctattg ccacggcgga actcatcgcc gcctgccttg cccgctgctg gacaggggct
5100
cggctgttgg gcactgacaa ttccgtggtg ttgtcgggga aatcatcgtc ctttccttgg
5160
ctgctcgcct gtgttgccac ctggattctg cgcgggacgt ccttctgcta cgtcccttcg
5220
gccctcaatc cagcggacct tccttcccgc ggcctgctgc cggctctgcg gcctcttccg
5280
cgtcttcgcc ttcgccctca gacgagtcgg atctcccttt gggccgcctc cccgcctggt
5340
acctttaaga ccaatgactt acaaggcagc tgtagatctt agccactttt taaaagaaaa
5400
ggggggactg gaagggctaa ttcactccca acgaagataa gatctgcttt ttgcttgtac
5460
tgggtctctc tggttagacc agatctgagc ctgggagctc tctggctaac tagggaaccc
5520
actgcttaag cctcaataaa gcttgccttg agtgcttcaa gtagtgtgtg cccgtctgtt
5580
gtgtgactct ggtaactaga gatccctcag acccttttag tcagtgtgga aaatctctag
5640
cagtagtagt tcatgtcatc ttattattca gtatttataa cttgcaaaga aatgaatatc
5700
agagagtgag aggaacttgt ttattgcagc ttataatggt tacaaataaa gcaatagcat
5760
cacaaatttc acaaataaag catttttttc actgcattct agttgtggtt tgtccaaact
5820
catcaatgta tcttatcatg tctggctcta gctatcccgc ccctaactcc gcccatcccg
5880
cccctaactc cgcccagttc cgcccattct ccgccccatg gctgactaat tttttttatt
5940
tatgcagagg ccgaggccgc ctcggcctct gagctattcc agaagtagtg aggaggcttt
6000
tttggaggcc tagacttttg cagagaccaa attcgtaatc atgtcatagc tgtttcctgt
6060
gtgaaattgt tatccgctca caattccaca caacatacga gccggaagca taaagtgtaa
6120
agcctggggt gcctaatgag tgagctaact cacattaatt gcgttgcgct cactgcccgc
6180
tttccagtcg ggaaacctgt cgtgccagct gcattaatga atcggccaac gcgcggggag
6240
aggcggtttg cgtattgggc gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt
6300
cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga
6360
atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg
6420
taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa
6480
aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt
6540
tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct
6600
gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct gtaggtatct
6660
cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc
6720
cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt
6780
atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc
6840
tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaaggacag tatttggtat
6900
ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa
6960
acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa
7020
aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga
7080
aaactcacgt taagggattt tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca cctagatcct
7140
tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga
7200
cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc
7260
catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat aactacgata cgggagggct taccatctgg
7320
ccccagtgct gcaatgatac cgcgagaccc acgctcaccg gctccagatt tatcagcaat
7380
aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat ccgcctccat
7440
ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta atagtttgcg
7500
caacgttgtt gccattgcta caggcatcgt ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtatggcttc
7560
attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg agttacatga tcccccatgt tgtgcaaaaa
7620
agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt tgtcagaagt aagttggccg cagtgttatc
7680
actcatggtt atggcagcac tgcataattc tcttactgtc atgccatccg taagatgctt
7740
ttctgtgact ggtgagtact caaccaagtc attctgagaa tagtgtatgc ggcgaccgag
7800
ttgctcttgc ccggcgtcaa tacgggataa taccgcgcca catagcagaa ctttaaaagt
7860
gctcatcatt ggaaaacgtt cttcggggcg aaaactctca aggatcttac cgctgttgag
7920
atccagttcg atgtaaccca ctcgtgcacc caactgatct tcagcatctt ttactttcac
7980
cagcgtttct gggtgagcaa aaacaggaag gcaaaatgcc gcaaaaaagg gaataagggc
8040
gacacggaaa tgttgaatac tcatactctt cctttttcaa tattattgaa gcatttatca
8100
gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt tgaatgtatt tagaaaaata aacaaatagg
8160
ggttccgcgc acatttcccc gaaaagtgcc acctgacgtc taagaaacca ttattatcat
8220
gacattaacc tataaaaata ggcgtatcac gaggcccttt cgtctcgcgc gtttcggtga
8280
tgacggtgaa aacctctgac acatgcagct cccggagacg gtcacagctt gtctgtaagc
8340
ggatgccggg agcagacaag cccgtcaggg cgcgtcagcg ggtgttggcg ggtgtcgggg
8400
ctggcttaac tatgcggcat cagagcagat tgtactgaga gtgcaccata tgcggtgtga
8460
aataccgcac agatgcgtaa ggagaaaata ccgcatcagg cgccattcgc cattcaggct
8520
gcgcaactgt tgggaagggc gatcggtgcg ggcctcttcg ctattacgcc agctggcgaa
8580
agggggatgt gctgcaaggc gattaagttg ggtaacgcca gggttttccc agtcacgacg
8640
ttgtaaaacg acggccagtg ccaagctg 8668
<210> 26
<211> 23
<212> DNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Прямой праймер ACE2
<400> 26
cattggagca agtgttggat ctt 23
<210> 27
<211> 22
<212> DNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Oбратный праймер ACE2
<400> 27
gagctaatgc atgccattct ca 22
<210> 28
<211> 22
<212> DNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Прямой праймер TMPRSS2
<400> 28
cacggactgg atttatcgac aa 22
<210> 29
<211> 21
<212> DNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Oбратный праймер TMPRSS2
<400> 29
cgtcaaggac gaagaccatg t 21
<210> 30
<211> 22
<212> DNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Прямой праймер GAPDH
<400> 30
gcacaagagg aagagagaga cc 22
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Oбратный праймер GAPDH
<400> 31
aggggagatt cagtgtggtg 20
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Фурин, прямой
<400> 32
ggaacatgac agctgcaact 20
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Фурин, обратный
<400> 33
tcgtcacgat ctgcttctca 20
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Катепсин L прямой
<400> 34
tagaggcaca gtggaccaag 20
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Катепсин L обратный
<400> 35
atggccattg tgaagctgtg 20
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Катепсин B прямой
<400> 36
tctctgaccg gatctgcatc 20
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Катепсин B обратный
<400> 37
tcacagggag ggatggagta 20
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> PC1 прямой
<400> 38
gcgtgcctga gaagaaagag 20
<210> 39
<211> 20
<212> DNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> PC1 обратный
<400> 39
atcccgttct ctttcagcca 20
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Прямой праймер для гена трипсина
<400> 40
aagtgtgaag cctcctaccc 20
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Обратный праймер для гена трипсина
<400> 41
ggtgtagact ccaggcttgt 20
<210> 42
<211> 20
<212> DNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Прямой праймер для гена матриптазы
<400> 42
cccaacaacc agcatgtgaa 20
<210> 43
<211> 20
<212> DNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Обратный праймер для гена матриптазы
<400> 43
actggagtcg taggagaggt 20
<210> 44
<211> 20
<212> DNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Прямой праймер для гена матриптазы
<400> 44
agaacgtcct gctcatcaca 20
<210> 45
<211> 20
<212> DNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Обратный праймер для гена матриптазы
<400> 45
tgtgcagtca atgttgggtg 20
<210> 46
<211> 6623
<212> DNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> HEK293 AAT вектор
<400> 46
gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg 60
ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg 120
cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc 180
ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt 240
gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata 300
tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc 360
cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc 420
attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt 480
atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt 540
atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca 600
tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg 660
actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc 720
aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg 780
gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctct ctggctaact agagaaccca 840
ctgcttactg gcttatcgaa attaatacga ctcactatag ggagacccaa gctggctagc 900
gtttaaactt aagcttgcca ccatgccgtc ttctgtctcg tggggcatcc tcctgctggc 960
aggcctgtgc tgcctggtcc ctgtctccct ggctgaggat ccccagggag atgctgccca
1020
gaagacagat acatcccacc atgatcagga tcacccaacc ttcaacaaga tcacccccaa
1080
cctggctgag ttcgccttca gcctataccg ccagctggca caccagtcca acagcaccaa
1140
tatcttcttc tccccagtga gcatcgctac agcctttgca atgctctccc tggggaccaa
1200
ggctgacact cacgatgaaa tcctggaggg cctgaatttc aacctcacgg agattccgga
1260
ggctcagatc catgaaggct tccaggaact cctccgtacc ctcaaccagc cagacagcca
1320
gctccagctg accaccggca atggcctgtt cctcagcgag ggcctgaagc tagtggataa
1380
gtttttggag gatgttaaaa agttgtacca ctcagaagcc ttcactgtca acttcgggga
1440
caccgaagag gccaagaaac agatcaacga ttacgtggag aagggtactc aagggaaaat
1500
tgtggatttg gtcaaggagc ttgacagaga cacagttttt gctctggtga attacatctt
1560
ctttaaaggc aaatgggaga gaccctttga agtcaaggac accgaggaag aggacttcca
1620
cgtggaccag gtgaccaccg tgaaggtgcc tatgatgaag cgtttaggca tgtttaacat
1680
ccagcactgt aagaagctgt ccagctgggt gctgctgatg aaatacctgg gcaatgccac
1740
cgccatcttc ttcctgcctg atgaggggaa actacagcac ctggaaaatg aactcaccca
1800
cgatatcatc accaagttcc tggaaaatga agacagaagg tctgccagct tacatttacc
1860
caaactgtcc attactggaa cctatgatct gaagagcgtc ctgggtcaac tgggcatcac
1920
taaggtcttc agcaatgggg ctgacctctc cggggtcaca gaggaggcac ccctgaagct
1980
ctccaaggcc gtgcataagg ctgtgctgac catcgacgag aaagggactg aagctgctgg
2040
ggccatgttt ttagaggcca tacccatgtc tatccccccc gaggtcaagt tcaacaaacc
2100
ctttgtcttc ttaatgattg aacaaaatac caagtctccc ctcttcatgg gaaaagtggt
2160
gaatcccacc caaaaataac tcgagtctag agggcccgtt taaacccgct gatcagcctc
2220
gactgtgcct tctagttgcc agccatctgt tgtttgcccc tcccccgtgc cttccttgac
2280
cctggaaggt gccactccca ctgtcctttc ctaataaaat gaggaaattg catcgcattg
2340
tctgagtagg tgtcattcta ttctgggggg tggggtgggg caggacagca agggggagga
2400
ttgggaagac aatagcaggc atgctgggga tgcggtgggc tctatggctt ctgaggcgga
2460
aagaaccagc tggggctcta gggggtatcc ccacgcgccc tgtagcggcg cattaagcgc
2520
ggcgggtgtg gtggttacgc gcagcgtgac cgctacactt gccagcgccc tagcgcccgc
2580
tcctttcgct ttcttccctt cctttctcgc cacgttcgcc ggctttcccc gtcaagctct
2640
aaatcggggg ctccctttag ggttccgatt tagtgcttta cggcacctcg accccaaaaa
2700
acttgattag ggtgatggtt cacgtagtgg gccatcgccc tgatagacgg tttttcgccc
2760
tttgacgttg gagtccacgt tctttaatag tggactcttg ttccaaactg gaacaacact
2820
caaccctatc tcggtctatt cttttgattt ataagggatt ttgccgattt cggcctattg
2880
gttaaaaaat gagctgattt aacaaaaatt taacgcgaat taattctgtg gaatgtgtgt
2940
cagttagggt gtggaaagtc cccaggctcc ccagcaggca gaagtatgca aagcatgcat
3000
ctcaattagt cagcaaccag gtgtggaaag tccccaggct ccccagcagg cagaagtatg
3060
caaagcatgc atctcaatta gtcagcaacc atagtcccgc ccctaactcc gcccatcccg
3120
cccctaactc cgcccagttc cgcccattct ccgccccatg gctgactaat tttttttatt
3180
tatgcagagg ccgaggccgc ctctgcctct gagctattcc agaagtagtg aggaggcttt
3240
tttggaggcc taggcttttg caaaaagctc ccgggagctt gtatatccat tttcggatct
3300
gatcaagaga caggatgagg atcgtttcgc atgattgaac aagatggatt gcacgcaggt
3360
tctccggccg cttgggtgga gaggctattc ggctatgact gggcacaaca gacaatcggc
3420
tgctctgatg ccgccgtgtt ccggctgtca gcgcaggggc gcccggttct ttttgtcaag
3480
accgacctgt ccggtgccct gaatgaactg caggacgagg cagcgcggct atcgtggctg
3540
gccacgacgg gcgttccttg cgcagctgtg ctcgacgttg tcactgaagc gggaagggac
3600
tggctgctat tgggcgaagt gccggggcag gatctcctgt catctcacct tgctcctgcc
3660
gagaaagtat ccatcatggc tgatgcaatg cggcggctgc atacgcttga tccggctacc
3720
tgcccattcg accaccaagc gaaacatcgc atcgagcgag cacgtactcg gatggaagcc
3780
ggtcttgtcg atcaggatga tctggacgaa gagcatcagg ggctcgcgcc agccgaactg
3840
ttcgccaggc tcaaggcgcg catgcccgac ggcgaggatc tcgtcgtgac ccatggcgat
3900
gcctgcttgc cgaatatcat ggtggaaaat ggccgctttt ctggattcat cgactgtggc
3960
cggctgggtg tggcggaccg ctatcaggac atagcgttgg ctacccgtga tattgctgaa
4020
gagcttggcg gcgaatgggc tgaccgcttc ctcgtgcttt acggtatcgc cgctcccgat
4080
tcgcagcgca tcgccttcta tcgccttctt gacgagttct tctgagcggg actctggggt
4140
tcgaaatgac cgaccaagcg acgcccaacc tgccatcacg agatttcgat tccaccgccg
4200
ccttctatga aaggttgggc ttcggaatcg ttttccggga cgccggctgg atgatcctcc
4260
agcgcgggga tctcatgctg gagttcttcg cccaccccaa cttgtttatt gcagcttata
4320
atggttacaa ataaagcaat agcatcacaa atttcacaaa taaagcattt ttttcactgc
4380
attctagttg tggtttgtcc aaactcatca atgtatctta tcatgtctgt ataccgtcga
4440
cctctagcta gagcttggcg taatcatggt catagctgtt tcctgtgtga aattgttatc
4500
cgctcacaat tccacacaac atacgagccg gaagcataaa gtgtaaagcc tggggtgcct
4560
aatgagtgag ctaactcaca ttaattgcgt tgcgctcact gcccgctttc cagtcgggaa
4620
acctgtcgtg ccagctgcat taatgaatcg gccaacgcgc ggggagaggc ggtttgcgta
4680
ttgggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc
4740
gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca ggggataacg
4800
caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt
4860
tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa
4920
gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct
4980
ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc
5040
cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg
5100
tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct
5160
tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag
5220
cagccactgg taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga
5280
agtggtggcc taactacggc tacactagaa gaacagtatt tggtatctgc gctctgctga
5340
agccagttac cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg
5400
gtagcggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga tctcaagaag
5460
atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga
5520
ttttggtcat gagattatca aaaaggatct tcacctagat ccttttaaat taaaaatgaa
5580
gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc tgacagttac caatgcttaa
5640
tcagtgaggc acctatctca gcgatctgtc tatttcgttc atccatagtt gcctgactcc
5700
ccgtcgtgta gataactacg atacgggagg gcttaccatc tggccccagt gctgcaatga
5760
taccgcgaga cccacgctca ccggctccag atttatcagc aataaaccag ccagccggaa
5820
gggccgagcg cagaagtggt cctgcaactt tatccgcctc catccagtct attaattgtt
5880
gccgggaagc tagagtaagt agttcgccag ttaatagttt gcgcaacgtt gttgccattg
5940
ctacaggcat cgtggtgtca cgctcgtcgt ttggtatggc ttcattcagc tccggttccc
6000
aacgatcaag gcgagttaca tgatccccca tgttgtgcaa aaaagcggtt agctccttcg
6060
gtcctccgat cgttgtcaga agtaagttgg ccgcagtgtt atcactcatg gttatggcag
6120
cactgcataa ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg cttttctgtg actggtgagt
6180
actcaaccaa gtcattctga gaatagtgta tgcggcgacc gagttgctct tgcccggcgt
6240
caatacggga taataccgcg ccacatagca gaactttaaa agtgctcatc attggaaaac
6300
gttcttcggg gcgaaaactc tcaaggatct taccgctgtt gagatccagt tcgatgtaac
6360
ccactcgtgc acccaactga tcttcagcat cttttacttt caccagcgtt tctgggtgag
6420
caaaaacagg aaggcaaaat gccgcaaaaa agggaataag ggcgacacgg aaatgttgaa
6480
tactcatact cttccttttt caatattatt gaagcattta tcagggttat tgtctcatga
6540
gcggatacat atttgaatgt atttagaaaa ataaacaaat aggggttccg cgcacatttc
6600
cccgaaaagt gccacctgac gtc 6623
<210> 47
<211> 8143
<212> DNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> HEK293T AAT вектор
<400> 47
aaaggcggcc gccaccatgg ggaccctcag cgctccgcct tgtacccaga ggattaagtg 60
gaaagggctg ctgctgacag ccagcctgtt aaacttctgg aacttgccca ccaccgctga 120
ggacccacaa ggcgacgcgg cccagaagac cgatacaagc caccacgacc aagatcatcc 180
taccttcaac aagatcactc ccaacctcgc tgagtttgcc ttctccttgt atcgccagct 240
tgcgcaccaa tccaattcaa ccaatatatt cttcagccca gtaagtatcg ctactgcgtt 300
tgcaatgctt agtttgggaa caaaagcgga cactcacgac gaaatccttg agggcttgaa 360
tttcaacttg accgaaattc cggaggccca gattcacgaa gggttccagg agcttttgag 420
gacactgaac cagccagact cacaattgca acttacaacc ggcaacggac tgtttctttc 480
cgagggcctt aaacttgttg ataaatttct tgaagacgtc aagaagctgt accactcaga 540
agcatttaca gtcaacttcg gcgataccga agaggcaaag aagcaaatca acgactatgt 600
ggagaaggga actcagggga aaatagtaga cctggtaaag gaattggacc gcgacacggt 660
attcgcgttg gttaattaca tctttttcaa gggtaagtgg gaacggccat ttgaagtgaa 720
ggacaccgaa gaagaagact tccacgtaga ccaggtaact actgttaaag tcccaatgat 780
gaaacgattg ggtatgttta acattcagca ttgtaagaag ctctcatcct gggttctttt 840
gatgaaatac ttggggaatg caacggccat attctttctt ccggatgagg gaaagttgca 900
acacctggaa aatgaactca cacacgacat cattacgaaa ttcttggaaa atgaagaccg 960
gaggtccgct tctttgcacc tgccaaaact cagtataacg ggtacatatg acctcaagtc
1020
cgtcctcggt caactgggaa taactaaggt cttttctaac ggagcagatt tgagcggcgt
1080
cacagaagaa gcacctttga aacttagtaa ggctgtccat aaagcggtac tcacaattga
1140
cgagaaaggg accgaagctg cgggggctat gtttctggag gcaatcccaa tgagcatacc
1200
accagaagtt aaatttaaca aacctttcgt tttcctcatg atagagcaaa acacaaaaag
1260
tccgctgttt atgggaaagg tagtgaatcc tacccagaaa gggagcgcta gcgaaaacct
1320
gtacttccaa ggcacttccg cttggtccca tcctcagttt gagaaaggcg gaggtagtgg
1380
cggaggatcc ggtggatctg cttggagcca tccacagttc gaaaagggat cccaccatca
1440
tcaccatcac caccaccatc attaatgact gagtagtcta gaagttgtct cctcctgcac
1500
tgactgactg atacaatcga tttctggatc cgcaggccta atcaacctct ggattacaaa
1560
atttgtgaaa gattgactgg tattcttaac tatgttgctc cttttacgct atgtggatac
1620
gctgctttaa tgcctttgta tcatgctatt gcttcccgta tggctttcat tttctcctcc
1680
ttgtataaat cctggttgct gtctctttat gaggagttgt ggcccgttgt caggcaacgt
1740
ggcgtggtgt gcactgtgtt tgctgacgca acccccactg gttggggcat tgccaccacc
1800
tgtcagctcc tttccgggac tttcgctttc cccctcccta ttgccacggc ggaactcatc
1860
gccgcctgcc ttgcccgctg ctggacaggg gctcggctgt tgggcactga caattccgtg
1920
gtgttgtcgg ggaagctgac gtcctttcca tggctgctcg cctgtgttgc cacctggatt
1980
ctgcgcggga cgtccttctg ctacgtccct tcggccctca atccagcgga ccttccttcc
2040
cgcggcctgc tgccggctct gcggcctctt ccgcgtcttc gccttcgccc tcagacgagt
2100
cggatctccc tttgggccgc ctccccgcct gtctagcttg actgactgag atacagcgta
2160
ccttcagctc acagacatga taagatacat tgatgagttt ggacaaacca caactagaat
2220
gcagtgaaaa aaatgcttta tttgtgaaat ttgtgatgct attgctttat ttgtaaccat
2280
tataagctgc aataaacaag ttaacaacaa caattgcatt cattttatgt ttcaggttca
2340
gggggaggtg tgggaggttt tttaaagcaa gtaaaacctc tacaaatgtg gtattggccc
2400
atctctatcg gtatcgtagc ataacccctt ggggcctcta aacgggtctt gaggggtttt
2460
ttgtgcccct cgggccggat tgctatctac cggcattggc gcagaaaaaa atgcctgatg
2520
cgacgctgcg cgtcttatac tcccacatat gccagattca gcaacggata cggcttcccc
2580
aacttgccca cttccatacg tgtcctcctt accagaaatt tatccttaag gtcgtcagct
2640
atcctgcagg cgatctctcg atttcgatca agacattcct ttaatggtct tttctggaca
2700
ccactagggg tcagaagtag ttcatcaaac tttcttccct ccctaatctc attggttacc
2760
ttgggctatc gaaacttaat taagcgatct gcatctcaat tagtcagcaa ccatagtccc
2820
gcccctaact ccgcccatcc cgcccctaac tccgcccagt tccgcccatt ctccgcccca
2880
tcgctgacta atttttttta tttatgcaga ggccgaggcc gcctcggcct ctgagctatt
2940
ccagaagtag tgaggaggct tttttggagg cctaggcttt tgcaaaggag gtagccaaca
3000
tgattgaaca agatggattg cacgcaggtt ctcccgccgc ttgggtggag aggctattcg
3060
gctatgactg ggcacaacag acaatcggct gctctgatgc cgccgtgttc cggctgtcag
3120
cgcaggggcg cccggttctt tttgtcaaga ccgacctgtc cggtgccctg aatgaactcc
3180
aggacgaggc agcgcggcta tcgtggctgg ccacgacggg cgttccttgc gcagctgtgc
3240
tcgacgttgt cactgaagcg ggaagggact ggctgctatt gggcgaagtg ccggggcagg
3300
atctcctgtc atctcacctt gctcctgccg agaaagtatc catcatggct gatgcaatgc
3360
ggcggctgca tacgcttgat ccggctacct gcccattcga ccaccaagcg aaacatcgca
3420
tcgagcgagc acgtactcgg atggaagccg gtcttgtcga tcaggatgat ctggacgaag
3480
agcatcaggg gctcgcgcca gccgaactgt tcgccaggct caaggcgcgg atgcccgacg
3540
gcgaggatct cgtcgtgacc cacggcgatg cctgcttgcc gaatatcatg gtggaaaatg
3600
gccgcttttc tggattcatc gactgtggcc ggctgggtgt ggcggaccgc tatcaggaca
3660
tagcgttggc tacccgtgat attgctgaag agcttggcgg cgaatgggct gaccgcttcc
3720
tcgtgcttta cggtatcgcc gctcccgatt cgcagcgcat cgccttctat cgccttcttg
3780
acgagttctt ctagtatgta agccctgtgc cttctagttg ccagccatct gttgtttgcc
3840
cctcccccgt gccttccttg accctggaag gtgccactcc cactgtcctt tcctaataaa
3900
atgaggaaat tgcatcgcat tgtctgagta ggtgtcattc tattctgggg ggtggggtgg
3960
ggcaggacag caagggggag gattgggaag acaatagcag gcatgctggg gatgcggtgg
4020
gctctatggt taattaacca gtcaagtcag ctacttggcg agatcgactt gtctgggttt
4080
cgactacgct cagaattgcg tcagtcaagt tcgatctggt ccttgctatt gcacccgttc
4140
tccgattacg agtttcattt aaatcatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg
4200
taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa
4260
aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt
4320
tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct
4380
gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct gtaggtatct
4440
cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc
4500
cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt
4560
atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc
4620
tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaagaacag tatttggtat
4680
ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa
4740
acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa
4800
aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga
4860
aaactcacgt taagggattt tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca cctagatcct
4920
tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga
4980
cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc
5040
catagttgca tttaaatttc cgaactctcc aaggccctcg tcggaaaatc ttcaaacctt
5100
tcgtccgatc catcttgcag gctacctctc gaacgaacta tcgcaagtct cttggccggc
5160
cttgcgcctt ggctattgct tggcagcgcc tatcgccagg tattactcca atcccgaata
5220
tccgagatcg ggatcacccg agagaagttc aacctacatc ctcaatcccg atctatccga
5280
gatccgagga atatcgaaat cggggcgcgc ctggtgtacc gagaacgatc ctctcagtgc
5340
gagtctcgac gatccatatc gttgcttggc agtcagccag tcggaatcca gcttgggacc
5400
caggaagtcc aatcgtcaga tattgtactc aagcctggtc acggcagcgt accgatctgt
5460
ttaaacctag atattgatag tctgatcggt caacgtataa tcgagtccta gcttttgcaa
5520
acatctatca agagacagga tcagcaggag gctttcgcat gagtattcaa catttccgtg
5580
tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt ttttgctcac ccagaaacgc
5640
tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcgcg agtgggttac atcgaactgg
5700
atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga agaacgcttt ccaatgatga
5760
gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg tattgacgcc gggcaagagc
5820
aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga atgacttggt tgagtattca ccagtcacag
5880
aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa gagaattatg cagtgctgcc ataaccatga
5940
gtgataacac tgcggccaac ttacttctga caacgattgg aggaccgaag gagctaaccg
6000
cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga tcgttgggaa ccggagctga
6060
atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc tgtagcaatg gcaacaacct
6120
tgcgtaaact attaactggc gaactactta ctctagcttc ccggcaacag ttgatagact
6180
ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc ggcccttccg gctggctggt
6240
ttattgctga taaatctgga gccggtgagc gtgggtctcg cggtatcatt gcagcactgg
6300
ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac gacggggagt caggcaacta
6360
tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc actgattaag cattggtaac
6420
cgattctagg tgcattggcg cagaaaaaaa tgcctgatgc gacgctgcgc gtcttatact
6480
cccacatatg ccagattcag caacggatac ggcttcccca acttgcccac ttccatacgt
6540
gtcctcctta ccagaaattt atccttaaga tcgtttaaac tcgactctgg ctctatcgaa
6600
tctccgtcgt ttcgagctta cgcgaacagc cgtggcgctc atttgctcgt cgggcatcga
6660
atctcgtcag ctatcgtcag cttacctttt tggcagcgat cgcggctccc gacatcttgg
6720
accattagct ccacaggtat cttcttccct ctagtggtca taacagcagc ttcagctacc
6780
tctcaattca aaaaacccct caagacccgt ttagaggccc caaggggtta tgctatcaat
6840
cgttgcgtta cacacacaaa aaaccaacac acatccatct tcgatggata gcgattttat
6900
tatctaactg ctgatcgagt gtagccagat ctagtaatca attacggggt cattagttca
6960
tagcccatat atggagttcc gcgttacata acttacggta aatggcccgc ctggctgacc
7020
gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat aatgacgtat gttcccatag taacgccaat
7080
agggactttc cattgacgtc aatgggtgga gtatttacgg taaactgccc acttggcagt
7140
acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc
7200
cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt atgggacttt cctacttggc agtacatcta
7260
cgtattagtc atcgctatta ccatgctgat gcggttttgg cagtacatca atgggcgtgg
7320
atagcggttt gactcacggg gatttccaag tctccacccc attgacgtca atgggagttt
7380
gttttggcac caaaatcaac gggactttcc aaaatgtcgt aacaactccg ccccattgac
7440
gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga ggtctatata agcagagctg gtttagtgaa
7500
ccgtcagatc gcctggagac gccatccacg ctgttttgac ctccatagaa gacaccggga
7560
ccgatccagc ctcccctcga agcttacatg tggtaccgag ctcggatcct gagaacttca
7620
gggtgagtct atgggaccct tgatgttttc tttccccttc ttttctatgg ttaagttcat
7680
gtcataggaa ggggagaagt aacagggtac acatattgac caaatcaggg taattttgca
7740
tttgtaattt taaaaaatgc tttcttcttt taatatactt ttttgtttat cttatttcta
7800
atactttccc taatctcttt ctttcagggc aataatgata caatgtatca tgcctctttg
7860
caccattcta aagaataaca gtgataattt ctgggttaag gcaatagcaa tatttctgca
7920
tataaatatt tctgcatata aattgtaact gatgtaagag gtttcatatt gctaatagca
7980
gctacaatcc agctaccatt ctgcttttat tttatggttg ggataaggct ggattattct
8040
gagtccaagc taggcccttt tgctaatcat gttcatacct cttatcttcc tcccacagct
8100
cctgggcaac gtgctggtct gtgtgctggc ccatcacttt ggc 8143
<---

Claims (8)

1. Применение композиции для лечения и/или профилактики заболевания или синдрома, связанного с вирусной инфекцией, у нуждающегося в этом субъекта, где вирусная инфекция вызывает острое воспаление, прямо или косвенно индуцирующее заболевание или синдром, и где вирусная инфекция представляет собой коронавирусную инфекцию MERS-CoV, где композиция включает терапевтически эффективное количество белка альфа-1-антитрипсина (ААТ).
2. Применение композиции по п.1, где белок альфа-1-антитрипсин (ААТ) экстрагируется из плазмы человека.
3. Применение композиции по п.1, где белок альфа1-антитрипсин (AAT) представляет собой рекомбинантный альфа1-антитрипсин (rhAAT).
4. Применение композиции по любому из предшествующих пунктов, где белок альфа1-антитрипсин имеет значения, указанные в SEQ ID NO:1.
5. Применение композиции по любому из предшествующих пунктов, где композиция дополнительно включает фармацевтически приемлемый наполнитель или носитель.
6. Применение композиции по любому из предшествующих пунктов, где композиция дополнительно содержит аналог нуклеозида, ингибитор протеазы, иммуносупрессор, антибиотик, антитело, направленное против структурных компонентов вируса, или его фрагмент, интерферон бета и/или вакцину.
7. Применение композиции по любому из предшествующих пунктов, где указанная композиция вводится путем внутривенной инъекции, внутривенной инфузии, инфузии с помощью дозирующего насоса, ингаляционного назального спрея, глазных капель, пластырей для кожи, составов с замедленным высвобождением, ex vivo ген терапия или ex vivo клеточная терапия.
8. Применение композиции по любому из предшествующих пунктов, где указанная композиция вводится путем внутривенной инъекции.
RU2021118640A 2020-05-01 2021-05-03 Лечение и/или профилактика заболевания или синдрома, связанного с вирусной инфекцией RU2823437C2 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP20172564.5 2020-05-01
EP20192016.2 2020-08-20

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2024120502A Division RU2024120502A (ru) 2020-05-01 2021-05-03 Лечение и/или профилактика заболевания или синдрома, связанного с вирусной инфекцией

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2021118640A RU2021118640A (ru) 2023-07-20
RU2823437C2 true RU2823437C2 (ru) 2024-07-23

Family

ID=

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010029537A1 (en) * 2008-09-10 2010-03-18 Ben Gurion University Of The Negev Research And Development Authority Antinecrotic activity of alpha 1-antitrypsin
WO2011123830A2 (en) * 2010-04-02 2011-10-06 Amunix Operating Inc. Alpha 1-antitrypsin compositions and methods of making and using same
RU2472524C2 (ru) * 2006-02-09 2013-01-20 Камада Лтд. Альфа-1-антитрипсин для лечения эпизодов обострения болезней легких
WO2013025538A2 (en) * 2011-08-12 2013-02-21 The Regents Of The Unversity Of Colorado, A Body Corporate Compositions, methods and uses of alpha 1-antitrypsin for early intervention in bone marrow transplantation and treatment of graft versus host disease
WO2013106589A1 (en) * 2012-01-10 2013-07-18 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Compositions, methods and uses for alpha-1 antitrypsin fusion molecules

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2472524C2 (ru) * 2006-02-09 2013-01-20 Камада Лтд. Альфа-1-антитрипсин для лечения эпизодов обострения болезней легких
WO2010029537A1 (en) * 2008-09-10 2010-03-18 Ben Gurion University Of The Negev Research And Development Authority Antinecrotic activity of alpha 1-antitrypsin
WO2011123830A2 (en) * 2010-04-02 2011-10-06 Amunix Operating Inc. Alpha 1-antitrypsin compositions and methods of making and using same
WO2013025538A2 (en) * 2011-08-12 2013-02-21 The Regents Of The Unversity Of Colorado, A Body Corporate Compositions, methods and uses of alpha 1-antitrypsin for early intervention in bone marrow transplantation and treatment of graft versus host disease
WO2013106589A1 (en) * 2012-01-10 2013-07-18 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Compositions, methods and uses for alpha-1 antitrypsin fusion molecules

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JANCIAUSKIENE S., WELTE T. Well-known and less well-known functions of alpha-1 antitrypsin. Its role in chronic obstructive pulmonary disease and other disease developments // Annals of the American Thoracic Society. - 2016. - Vol. 13. - Supplement 4. - P. S280-S288. ABBATE A. et al. Effects of prolastin C (plasma-derived alpha-1 antitrypsin) on the acute inflammatory response in patients with ST-segment elevation myocardial infarction (from the VCU-alpha 1-RT pilot study) // The American journal of cardiology. - 2015. - Vol. 115. - No. 1. - P. 8-12. DE CHIARA G. et al. Infectious agents and neurodegeneration // Molecular neurobiology. - 2012. - Vol. 46. - No. 3. - P. 614-638. *
JIA Q. et al. Short cyclic peptides derived from the C-terminal sequence of α1-antitrypsin exhibit significant anti-HIV-1 activity // Bioorganic & medicinal chemistry letters. - 2012. - Vol. 22. - No. 7. - P. 2393-2395. ZHOU X. et al. Alpha-1-antitrypsin interacts with gp41 to block HIV-1 entry into CD4+ T lymphocytes // BMC microbiology. - 2016. - Vol. 16. - Art. 172. HOFFMANN M. et al. SARS-CoV-2 cell entry depends on ACE2 and TMPRSS2 and is blocked by a clinically proven protease inhibitor // Cell. - 2020. - Vol. 181. - No. 2. - P. 271-280. e8. *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11028142B2 (en) Compositions and methods for TCR reprogramming using fusion proteins
CN111295449B (zh) 腺病毒载体及其用途
KR101666228B1 (ko) 생물치료학적 분자를 발현시키기 위한 치료학적 유전자-스위치 작제물 및 생물반응기, 및 이의 용도
US20030119104A1 (en) Chromosome-based platforms
KR102494564B1 (ko) 말라리아 백신
KR20210108423A (ko) 아데노 관련 바이러스 (aav) 생산자 세포주 및 관련 방법
KR20210105382A (ko) 단백질을 코딩하는 rna
KR20220121844A (ko) 유전자의 발현을 동시에 조절하기 위한 조성물 및 방법
JP2024037917A (ja) 組換えｔ細胞受容体遺伝子を用いて細胞ベースの治療薬を製造するための技法
CN111094569A (zh) 光控性病毒蛋白质、其基因及包含该基因的病毒载体
RU2823437C2 (ru) Лечение и/или профилактика заболевания или синдрома, связанного с вирусной инфекцией
US11814412B2 (en) Artificial proteins and compositions and methods thereof
KR20240022571A (ko) Rna-가이드된 이펙터 동원을 위한 시스템, 방법 및 성분
KR20230117327A (ko) 가용성 알칼리성 포스파타제 작제물 및 가용성 알칼리성 포스파타제 작제물을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터
KR20230005965A (ko) 바이러스 감염 관련 질환 또는 증후군의 치료 및/또는 예방
CA2522166C (en) Lambda integrase mutein for use in recombination