RU2524115C2 - Способ специфичной детекции малопредставленных фракций рнк в в биологическом образце - Google Patents

Способ специфичной детекции малопредставленных фракций рнк в в биологическом образце Download PDF

Info

Publication number
RU2524115C2
RU2524115C2 RU2011123897/10A RU2011123897A RU2524115C2 RU 2524115 C2 RU2524115 C2 RU 2524115C2 RU 2011123897/10 A RU2011123897/10 A RU 2011123897/10A RU 2011123897 A RU2011123897 A RU 2011123897A RU 2524115 C2 RU2524115 C2 RU 2524115C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
mycoplasma
rna
pcr
chaotropic agent
cdna
Prior art date
Application number
RU2011123897/10A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2524115C9 (ru
RU2011123897A (ru
Inventor
Томас ХЕММЕРЛЕ
Карстен УРБАН
Франц ГРУБЕР
Original Assignee
Бакстер Интернэшнл Инк.
Бакстер Хелткэр С.А.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Бакстер Интернэшнл Инк., Бакстер Хелткэр С.А. filed Critical Бакстер Интернэшнл Инк.
Publication of RU2011123897A publication Critical patent/RU2011123897A/ru
Publication of RU2524115C2 publication Critical patent/RU2524115C2/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2524115C9 publication Critical patent/RU2524115C9/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6848—Nucleic acid amplification reactions characterised by the means for preventing contamination or increasing the specificity or sensitivity of an amplification reaction
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Изобретение относится к области молекулярной биологии и генной инженерии. Предложены способ и набор для детекции малопредставленных фракций РНК в биологическом образце и для детекции микоплазменного загрязнения, для чего используют операции обратной транскрипции РНК в кДНК с использованием обратной транскриптазы Thermus thermophilus (rTth-pol) в условиях "горячего старта", инактивации ОТ обработкой хаотропным средством, детекции представляющей интерес кДНК посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР). Изобретение может быть использовано для тестирования на наличие микоплазм в медицине. 3 н. и 12 з. п. ф-лы, 3 табл., 3 пр.

Description

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к способу и набору для детекции малопредставленных фракций РНК в биологическом образце и к способу и набору для определения наличия микоплазменного загрязнения в биологическом образце.
ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К числу наиболее широко распространенных и результативных способов детекции и анализа молекул РНК относится так называемый ОТ/ПЦР (обратная транскрипция/полимеразная цепная реакция). В этом способе, РНК молекулы транскрибируют в молекулы кДНК посредством обратной транскриптазы (ОТ) и затем определяют и/или анализируют способами на основе ПЦР.
В более ранних исследованиях в этой области для обратной транскрипции использовали или ОТ вируса миелобластоза птиц или ОТ вируса лейкоза Молони мышей. Однако значительную проблему при использовании РНК в качестве матрицы для синтеза кДНК представляла неспособность этих мезофильных вирусных ОТ синтезировать кДНК в области стабильных вторичных структур РНК. Для разрешения этой проблемы обратную транскрипцию можно выполнять при повышенных температурах, что позволяет разрушать вторичные структуры РНК и дополнительно увеличивать специфичность при удлинении праймера. Это требует применения термостабильных ферментов для обратной транскрипции, таких как ДНК-полимераза Thermus thermophilus (Tth pol), активность которой является оптимальной при температуре 70°C.
Однако применение термостабильных ферментов для обратной транскрипции также создает ряд новых проблем. В частности, при попытке определить и/или анализировать малопредставленные фракции РНК в биологическом образце, термостабильный фермент для обратной транскрипции во время последовательных стадий ОТ/ПЦР может катализировать образование неспецифичных продуктов реакции. Это особенно относится к образцам, которые содержат большое фоновое количество суммарной РНК, что приводит к последовательному повышению нижнего предела детекции представляющей интерес РНК до уровней, намного выше, чем может быть необходимо, например, при контроле качества биофармацевтических препаратов. Для разрешения этой проблемы, все манипуляции и стадии ОТ/ПЦР, следующие за обратной транскрипцией, надлежит осуществлять при повышенных температурах и в условиях “горячего старта”. Это, однако, часто является практически нецелесообразным и невыгодным, особенно при работе в производственном масштабе.
Применение, где чувствительность детекции малопредставленных фракций РНК, часто при наличии большого фонового количества суммарной РНК, является особенно важной, представляет собой детекцию микоплазменного загрязнения в биологическом образце.
Микоплазмы представляют собой бактериальные микроорганизмы с наименьшими размерами геномов, способных к саморепликации. Хотя большинство микоплазм представляют собой природные безопасные симбионты, некоторые из них способны инфицировать своих природных хозяев и вызывать заболевания различной степени тяжести. Микоплазмы, особенно виды семейства Mycoplasma и Acholeplasma, также представляют собой частую причину загрязнения первичных и стабильных клеточных линий и являются серьезной проблемой для исследовательских и производственных лабораторий, включенных в разработку и получение биологических и фармацевтических препаратов, полученных на основе клеток. Таким образом, несмотря на все профилактические меры, которые, как правило, применяются на всем протяжении культивирования клеточных линий и работы с ними, микоплазменное загрязнение остается часто встречающейся проблемой.
Аналитические протоколы, рекомендованные для тестирования клеточных линий и биологических продуктов, полученных на основе клеток, на наличие микоплазм, включают использование культуры бульон/агар и тестирование индикаторных клеточных линий. Способ на основе культуры бульон/агар предназначен для детекции хорошо культивируемых микоплазменных видов, в то время как индикаторную клеточную линию используют для детекции микоплазменных видов, трудно поддающихся культивированию. Хотя комбинация двух этих способов способствует эффективной детекции наличия микоплазм, в целом способы тестирования являются дорогостоящими, трудоемкими и требуют большого количества времени (минимум 28 суток). Кроме того, существует ряд не поддающихся культивированию видов микоплазм, которые не подлежат детекции данным способом.
Недавно разработаны новые способы тестирования на наличие микоплазм, основанные на амплификации нуклеиновых кислот, в частности рибосомальных РНК микоплазменного происхождения. Эти способы имеют некоторые преимущества в отношении денежных затрат, аналитической чувствительности, простоты исполнения и временных затрат. Однако величина уровня нижнего предела детекции у существующих способов все еще выше, чем это необходимо при контроле качества биофармацевтических препаратов, особенно при работе с образцами, в которых представлено большое фоновое количество суммарной РНК или других макромолекул.
Таким образом, в данной области существует необходимость в усовершенствовании существующих способов ОТ/ПЦР, что позволит расширить пределы детекции малопредставленных фракций РНК в биологических образцах.
Решение проблемы, указанной выше, осуществляют посредством вариантов осуществления, представленных в пунктах формулы изобретения.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Задачей по настоящему изобретению является создание усовершенствованного способа детекции малопредставленных фракций РНК в биологическом образце. В частности, настоящее изобретение относится к указанному способу и набору для детекции малопредставленных фракций РНК в биологическом образце. Дополнительно, другой задачей по настоящему изобретению является создание усовершенствованного способа и набора для определения микоплазменного загрязнения в образце.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В одном аспекте, настоящее изобретение относится к способу детекции малопредставленных представляющих интерес фракций РНК в биологическом образце, где способ включает стадии:
(а) обратная транскрипция РНК в кДНК с использованием обратной транскриптазы (ОТ);
(b) инактивация ОТ и
(с) детекция представляющей интерес кДНК посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Как применяют в настоящем документе, термин “биологический образец” относится к любому образцу, который содержит или предполагают, что он содержит, биологически значимые макромолекулы, такому как, например, образцы, полученные на различных стадиях процесса получения биофармацевтических препаратов, например, вакцин или рекомбинантных белков, образцы супернатантов клеточной культуры, лизатов клеток, экстрактов клеток, проб продуктов питания или окружающей среды, образцы, взятые из организма человека или животного, такие как образцы цельной крови, сыворотки, плазмы, мочи, ликвора или мазки, к любым другим образцам биологического происхождения и любой другой композиции, которая содержит или ожидают, что она содержит РНК.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, биологический образец содержит большое фоновое количество клеточных компонентов.
Как применяют в настоящем документе, термин “клеточные компоненты” относится к клеточным органеллам, белкам, пептидам, мембранам, липидам, нуклеиновым кислотам, в частности, к фракциям РНК, не являющимся целью исследования по настоящему изобретению, и их комбинациям или фрагментам.
В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, биологический образец содержит большое фоновое количество суммарной РНК.
Как применяют в настоящем документе, термин “большое фоновое количество суммарной РНК” относится к ситуации, когда количество молекул представляющей интерес РНК представлено менее чем одной молекулой в количестве суммарных молекул РНК, равном 104, предпочтительно менее чем одной молекулой в количестве суммарных молекул РНК, равном 106, более предпочтительно менее чем одной молекулой в количестве суммарных молекул РНК, равном 108, и наиболее предпочтительно как менее чем одной молекулой в количестве суммарных молекул РНК равном 1010.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения представляющая интерес РНК представлена в количестве менее чем 10000 копий на мл образца, предпочтительно менее чем 1000 копий на мл образца, более предпочтительно менее чем 100 копий на мл образца, и наиболее предпочтительно менее чем 10 копий на мл образца.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, обратную транскрипцию РНК в кДНК с использованием ОТ осуществляют, согласно способу по настоящему изобретению, в условиях “горячего старта”.
Как применяют в настоящем документе, термин “условия “горячего старта”” относится к любым условиям, при которых реакционную смесь, перед добавлением фермента, осуществляющего удлинение праймера, нагревают до температуры плавления или выше температуры плавления комплекса праймер/нуклеиновая кислота, или если фермент, который осуществляет удлинение праймера, неактивен при температуре окружающей среды и активируется стадией активации при высокой температуре, которую проводят при температуре плавления или выше температуры плавления комплекса праймер/нуклеиновая кислота.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, способ по настоящему изобретению дополнительно содержит, после стадии обратной транскрипции РНК в кДНК с использованием ОТ, стадию амплификации представляющей интерес кДНК с использованием той же ОТ. Эту дополнительную стадию называют “первичная ПЦР” и предпочтительно осуществляют в течение 5-15 циклов в условиях “горячего старта”, более предпочтительно в течение 5-11 циклов в условиях “горячего старта”, и наиболее предпочтительно в течение пяти или в течение десяти циклов в условиях “горячего старта”.
Таким образом, в другом аспекте настоящее изобретение относится к способу детекции малопредставленных фракций РНК в биологическом образце, где способ включает стадии:
(a) обратной транскрипции РНК в кДНК с использованием обратной транскриптазы (ОТ);
(b) амплификации кДНК посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием ОТ из стадии (a);
(c) инактивацию ОТ и
(d) детекции представляющей интерес кДНК посредством ПЦР.
Ферменты, которые обладают активностью как ОТ (т.е. РНК-зависимая ДНК-полимераза), так и ДНК-полимеразы (т.е. ДНК-зависимая ДНК-полимераза), хорошо известны в данной области и включают, например, ДНК-полимеразу Thermus thermophilus (Tth pol). Условия, при которых конкретный фермент демонстрирует конкретную активность, также являются хорошо известными в данной области. В случае Tth pol, его активность в качестве обратной транскриптазы обеспечивается ионами Mn2+, а активность в качестве ДНК-полимеразы обеспечивается ионами Mg2+.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, ОТ, используемая в способе по настоящему изобретению, представляет собой ДНК-полимеразу Thermus thermophilus (Tth pol). В дополнительном предпочтительном варианте осуществления Tth pol получена рекомбинантным способом (rTth-pol).
В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, в способе по настоящему изобретению ОТ инактивируют, предпочтительно способом, выбранным из группы, состоящей из термической обработки, обработки фенолом, обработки протеиназой K и обработки хаотропным средством.
Термическая обработка по настоящему изобретению включает нагревание реакционной смеси, содержащей ОТ, до 80-100°C, предпочтительно до 90-100°C, более предпочтительно до 95°C. Продолжительность термической обработки составляет от 15 до 90 минут, предпочтительно от 30 до 75 минут, более предпочтительно 60 минут. В особенно предпочтительном варианте осуществления, термическая обработка включает нагревание реакционной смеси, содержащей ОТ, до 95°C в течение 60 минут.
По настоящему изобретению обработка протеиназой К включает добавление от 1 до 10 единиц протеиназы К в реакционную смесь, более предпочтительно от 2 до 5 единиц протеиназы K или наиболее предпочтительно 5 единиц протеиназы K. Продолжительность обработки протеиназой К составляет от 30 до 90 минут, предпочтительно от 45 до 75 минут или наиболее предпочтительно 60 минут. В особенно предпочтительном варианте осуществления, обработка протеиназой К включает добавление 5 единиц протеиназы К и продолжительность обработки составляет 60 минут.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, в способе по настоящему изобретению ОТ инактивируют обработкой хаотропным средством. Обработка хаотропным средством по настоящему изобретению включает добавление хаотропного средства в реакционную смесь, содержащую ОТ, в количестве и в течение времени, достаточном для инактивации ОТ. Добавляемое количество и время обработки хорошо известны в данной области для конкретного хаотропного средства. В более предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, хаотропное средство выбирают из группы, состоящей из мочевины, перхлората лития и соли гуанидиния. В наиболее предпочтительном варианте осуществления, хаотропное средство представляет собой соль гуанидиния.
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, способ по настоящему изобретению дополнительно содержит, после инактивации ОТ с использованием хаотропного средства, стадию удаления хаотропного средства из реакционной смеси. Способы удаления хаотропного средства из реакционной смеси хорошо известны в данной области и включают, например, очистку нуклеиновых кислот, содержащихся в реакционной смеси, с использованием связывающих ДНК центрифужных колонок.
Детекция представляющей интерес кДНК посредством ПЦР также называют ““буст” ПЦР”. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, полимеразная цепная реакция (ПЦР) в способе по настоящему изобретению представляет собой ПЦР в реальном времени.
Как применяют в настоящем документе, термин “ПЦР в реальном времени” относится к любому способу, основанному на полимеразной цепной реакции (ПЦР) и который позволяет амплифицировать и одновременно определять количество представляющей интерес ДНК молекулы.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения представляющая интерес РНК получена из микоплазмы. Как применяют в настоящем документе, термин “микоплазма” относится к любому семейству класса молликутов, которое включает вид Mycoplasma, Ureaplasma, Mesoplasma, Entomoplasma, Spiroplasma, Acholeplasma, Asteroleplasma и Thermoplasma. В более предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, микоплазму выбирают из группы, состоящей из Acholeplasma laidlawii, Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma hyorhinis, Mycoplasma hominis, Mycoplasma fermentans, Mycoplasma synoviae и Mycoplasma orale.
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения представляющая интерес РНК представляет собой рибосомальную РНК 16S (рРНК 16S).
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу детекции микоплазменного загрязнения в биологическом образце, где способ включает стадии:
(a) выделение суммарной РНК из образца;
(b) обратная транскрипция РНК в кДНК с использованием обратной транскриптазы (ОТ);
(с) амплификация кДНК, полученной на основе рибосомальной РНК 16S (рРНК 16S) микоплазмы посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием ОТ из стадии (b);
(d) инактивация ОТ посредством добавления хаотропного средства;
(e) удаление хаотропного средства из реакционной смеси и
(f) детекция кДНК, полученной на основе рРНК 16S из микоплазмы посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Способы выделения суммарной РНК из образца хорошо известны в данной области и включают выделение с фенолом/хлороформом и осаждение изопропанолом.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, микоплазменное загрязнение, подлежащее детекции, представляет собой загрязнение, составляющее не более чем приблизительно 10 КОЕ/мл микоплазм в образце.
Хорошо известны в данной области праймеры для обратной транскрипции рРНК 16S из микоплазмы, а также праймеры для амплификации посредством ПЦР кДНК, полученной на основе рРНК 16S из микоплазмы.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, обратную транскрипцию РНК в кДНК с использованием ОТ из способа детекции микоплазменного загрязнения в образце выполняют в условиях “горячего старта”.
В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, ОТ, которую используют в способе детекции микоплазменного загрязнения в образце, представляет собой ДНК-полимеразу Thermus thermophilus (Tth pol). В дополнительном предпочтительном варианте осуществления Tth pol получена рекомбинантным способом (rTth-pol).
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, хаотропное средство, которое используют в способе детекции микоплазменного загрязнения в образце, выбирают из группы, состоящей из мочевины, перхлората лития и соли гуанидиния. В наиболее предпочтительном варианте осуществления, хаотропное средство представляет собой соль гуанидиния.
В одном дополнительном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, ПЦР в способе детекции микоплазменного загрязнения в образце представляет собой ПЦР в реальном времени.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к набору для детекции малопредставленных представляющих интерес фракций РНК в биологическом образце, содержащем, по меньшей мере, ОТ и средства для инактивации ОТ. Средства для инактивации ОТ могут представлять собой протеиназу К или хаотропное средство. Набор может дополнительно содержать, например, праймеры для обратной транскрипции, праймеры для детекции специфических кДНК, РНК-носитель, калибровочную РНК, калибровочную ДНК, подходящие ферменты, буферы, реагенты, емкости для реакции и расходные материалы.
В дополнительном аспекте, настоящее изобретение относится к набору для детекции микоплазменного загрязнения в биологическом образце, содержащем, по меньшей мере, рекомбинантную ДНК-полимеразу Thermus thermophilus (rTth-pol), подходящие праймеры для обратной транскрипции рРНК 16S микоплазмы, подходящие праймеры для амплификации кДНК, полученной из рРНК 16S микоплазмы, хаотропное средство для инактивации rTth-pol, средства для удаления хаотропного средства из реакционной смеси и праймеры для детекции кДНК, полученной на основе рРНК 16S микоплазмы посредством ПЦР, например, ПЦР в реальном времени. Средства для удаления хаотропного средства могут представлять собой связывающие ДНК центрифужные колонки. Набор может дополнительно содержать, например, средства для выделения суммарной РНК из образца, РНК-носитель, калибровочную РНК, калибровочную ДНК, подходящие ферменты, буферы, реагенты, емкости для реакции и/или расходные материалы. Средства для выделения суммарной РНК могут представлять собой фенол, хлороформ и изопропанол или буферы, содержащие т.п.
Настоящее изобретение будет дополнительно проиллюстрировано в следующих примерах, которые не являются ограничивающими.
ПРИМЕРЫ
Общий способ:
Выполнение способа начинают с центрифугирования представляющего интерес биологического образца, с последующим выделением суммарной РНК из осадка в образце. РНК затем подвергают обратной транскрипции в кДНК, используя рекомбинантную ДНК-полимеразу Thermus thermophilus (rTth-pol) в присутствии Mn2+ в условиях “горячего старта”. После хелатирования Mn2+ и добавления Mg2+, rTth-pol осуществляет амплификацию посредством ПЦР в течение 5 циклов или в течение 10 циклов в условиях “горячего старта” (первичная ПЦР). Реакционную смесь ПЦР затем переносят в буфер, содержащей гуанидин, для инактивации rTth-pol. Очистка посредством набора, основанного на использовании центрифужной колонки, дает в результате очищенные ПЦР-продукты первичной ПЦР, которые затем амплифицируют совместно со стандартной ДНК (калибровочная ДНК) в дуплексной ПЦР в реальном времени (“буст” ПЦР). Альтернативно, РНК-стандарт (калибровочную РНК) можно добавлять на начальных стадиях процесса выделения РНК для нормирования и контроля процесса на начальных стадиях.
Экспериментальные способы:
Выделение РНК. Все стадии проводили в реакционных пробирках объемом 2 мл. 2 мл образца центрифугировали при 4°C в течение 10 мин при 1000 об/мин. Осадок ресуспендировали в 1 мл РНК-Bee™ (Tel-Test Inc., TX), добавляли 5 мкл 1 мг/мл дрожжевой тРНК и образец инкубировали в течение 20 мин в центрифуге при 70°C и 1000 об/мин. Затем, добавляли 110 мкл хлороформа и проводили разделение фаз посредством центрифугирования в течение 5 мин при 13000 об/мин. Проводили осаждение РНК посредством добавления 500 мкл изопропанола к полученной в результате верхней фазе и образцы в течение 5 мин оставляли на сухом льду. Осадок РНК собирали посредством центрифугирования в течение 15 мин при 13000 об/мин, промывали 500 мкл 70% EtOH и образец центрифугировали в течение 10 мин при 13000 об/мин, супернатант удаляли и осадок РНК растворяли в 250 мкл дважды дистиллированной H2O (bdH2O).
Обратная транскрипция. 6 мкл смеси для ОТ (1 мкл 10-кратного буфера для обратной транскрипции (Applied Biosystems, Austria), 1 мкл 10 мМ MnCl2, 0,5 мкл 10 мкМ обратного праймера, 0,8 мкл 2,5 мМ dNTP каждого, 2,2 мкл (5,5 Ед) rTth-pol и 0,5 мкл bdH2O) добавляли к 4 мкл выделенной РНК. Обратную транскрипцию проводили в течение 2 мин при 80°C, 5 мин при 62°C, 10 мин при 70°C и 2 мин при 80°C.
Первичная ПЦР. 40 мкл смеси для ПЦР (4 мкл 10-кратного хелатирующего буфера (Applied Biosystems, Austria), 5 мкл 25 мМ MgCl2, 2,5 мкл 10 мкМ прямого праймера, 2 мкл 10 мкМ обратного праймера и 26,5 мкл bdH2O), которую предварительно прогревали до 85°C±5°C, добавляли к реакционной смеси, полученной на этапе обратной транскрипции. ПЦР проводили по следующему протоколу: 2 мин при 80°C, 2 мин при 95°C, 5x(10 с при 95°C, 30 с при 62°C, 30 с при 72°C).
Инактивация ОТ. После первичной ПЦР, 50 мкл все еще горячей реакционной смеси добавляли к 253 мкл буфера для инактивации (3 мкл РНК-носителя (1 мкг/мкл дрожжевой тРНК), 250 мкл буфера PBI (Qiaquick PCR Purification Kit; Qiagen, Germany)) и перемешивали. Образцы помещали в центрифужные колонки Qiaquick mini (Qiagen, Germany) в 2 мл пробирку для сбора образцов и центрифугировали в течение 1 мин при 13000 об/мин. Пробирку для сбора образцов удаляли, центрифужную колонку помещали в новую пробирку для сбора образцов, добавляли 750 мкл буфера PE (Qiaquick PCR Purification Kit; Qiagen, Germany) и образец центрифугировали в течение 1 мин при 13000 об/мин. Пробирку для сбора образцов вновь удаляли и центрифужную колонку центрифугировали в новой пробирке для сбора образца в течение 1 мин при 13000 об/мин. Центрифужную колонку затем помещали в новую реакционную пробирку объемом 1,5 мл, 50 мкл 10 мМ Tris (pH 8,0) добавляли и проводили элюцию ДНК посредством центрифугирования в течение 1 мин при 13000 об/мин.
“Буст” ПЦР. 10 мкл элюированной ДНК помещали в оптическую пробирку и добавляли 5 мкл калибровочной ДНК в качестве контроля и 35 мкл смеси TMPCR (1xTaqMan Буфер A (Applied Biosystems, Austria), 5 мМ MgCl2, 200 нМ каждого праймера, 100 нМ каждой пробы, 200 мкМ каждого dNTP, 9% глицерина (масс./об.), 0,05% желатин (масс./об.), 0,01% Tween 20 (масс./об.), 2,5 Ед полимеразы AmpliTaq Gold (Applied Biosystems, Austria)). ПЦР в реальном времени проводили по следующему протоколу: 10 мин при 95°C, 40x(15 с при 95°C, 1 мин при 62°C).
Пример 1: Детекция Mycoplasma synoviae в образцах, полученных в процессе производства вакцины
В образцы, полученные в процессе производства вакцины, вносили различные количества Mycoplasma synoviae и анализировали согласно описанным выше экспериментальным способам. Для того чтобы продемонстрировать положительное воздействие инактивации ОТ (образцы 1-6), включали контрольные образцы, в которых ОТ не инактивировали (образцы 7-12) или в которые совсем не добавляли ОТ (образцы 13-18). После выделения РНК, обратной транскрипции, первичной ПЦР и инактивации ОТ, образцы анализировали на наличие кДНК посредством ПЦР в реальном времени. Перед этой “буст” ПЦР, заданное количество калибровочной ДНК добавляли к реакционной смеси. Данную калибровочную ДНК амплифицировали вместе с представляющими интерес нуклеиновыми кислотами с использованием различных наборов праймеров. Сигналы от калибровочной и представляющей интерес ДНК дифференцировали, используя различные меченые зонды. Праймеры для первичной и “буст” ПЦР являлись специфичными для рРНК 16S микоплазмы. Результаты, просуммированные в таблице 1, демонстрируют значения Ct, полученные при ПЦР в реальном времени, т.е. количество циклов, необходимое для детекции специфического продукта ПЦР. Низкие значения Ct подразумевают более быструю детекцию, в то время как значения Ct, равное 40, показывают, что на протяжении всего времени проведения ПЦР в реальном времени продукта обнаружено не было.
Таблица 1
Детекция Mycoplasma synoviae в образцах,
полученных в процессе производства вакцины
Образец № M.synoviae КОЕ/мл ОТ присут-ствует ОТ инакти-вирована Ct (калибро-вочная) Ct (представ-ляющая интерес)
1 100 + + 29,88 30,82
2 100 + + 29,67 30,71
3 10 + + 29,68 33,16
4 10 + + 29,71 35,42
5 - + + 29,85 40,00
6 - + + 29,95 40,00
7 100 + - 39,30 40,00
8 100 + - 34,41 40,00
9 10 + - 34,64 40,00
10 10 + - 35,12 40,00
11 - + - 34,42 40,00
12 - + - 36,11 40,00
13 100 - - 29,56 40,00
14 100 - - 29,43 40,00
15 10 - - 29,39 40,00
16 10 - - 29,40 40,00
17 - - - 29,31 40,00
18 - - - 29,37 40,00
Результаты, представленные в таблице 1, убедительно показывают, что наличие активной ОТ (образцы 7-12) не позволяет определить даже 100 КОЕ/мл Mycoplasma synoviae, а инактивация ОТ позволяет определить даже всего 10 КОЕ/мл. Увеличение определяемых значений Ct для калибровочной ДНК в образцах, в которых не инактивировали ОТ, показывает, что без инактивации ОТ является способной катализировать реакции, приводящие к образованию неспецифических продуктов реакции, которые препятствуют образованию специфических продуктов калибровочной и представляющей интерес ДНК в течение проведения “буст” ПЦР. Объяснение основано на факте того, что в образцах, к которым совсем не добавили ОТ (образцы 13-18), значения Ct для калибровочной ДНК представлены на том же уровне, что и в образцах, в которых ОТ инактивирована (образцы 1-6).
Пример 2: Детекция Mycoplasma fermentans в образцах, полученных в процессе производства вакцины
В образцы, аналогичные образцам в примере 1, вносили различные количества Mycoplasma fermentans и анализировали согласно описанным выше экспериментальным способам. Для того чтобы показать положительное воздействие инактивации ОТ (образцы 1-6), включали контрольные образцы, в которых не инактивировали ОТ (образцы 7-12). После выделения РНК, обратной транскрипции, первичной ПЦР и инактивации ОТ, образцы анализировали на наличие кДНК посредством ПЦР в реальном времени. Перед “буст” ПЦР, заданное количество калибровочной ДНК добавляли в реакционную смесь. Праймеры для первичной и “буст” ПЦР и в этом примере представляли собой праймеры, специфичные к рРНК 16S микоплазмы. Результаты, просуммированные в таблице 2, демонстрируют значения Ct, полученные в результате ПЦР в реальном времени.
Таблица 2
Детекция Mycoplasma fermentans в образцах, полученных в процессе производства вакцины
Образец № M.synoviae КОЕ/мл ОТ присут-ствует ОТ инакти-вирована Ct (калибро-вочная) Ct (представ-ляющая интерес)
1 100 + + 29,31 29,57
2 100 + + 29,46 30,44
3 10 + + 29,30 33,46
4 10 + + 29,47 34,72
5 - + + 29,67 40,00
6 - + + 29,27 40,00
7 100 + - 40,00 40,00
8 100 + - 40,00 40,00
9 10 + - 40,00 40,00
10 10 + - 40,00 40,00
11 - + - 40,00 40,00
12 - + - 40,00 40,00
Результаты в таблице 2 подтверждают, что в то время как наличие активной ОТ (образцы 7-12) не позволяет определять даже 100 КОЕ/мл Mycoplasma fermentans, инактивация ОТ позволяет определить даже всего 10 КОЕ/мл. Увеличение определяемых значений Ct для калибровочной ДНК в образцах, в которых не инактивировали ОТ, показывает, что без инактивации ОТ является способной катализировать реакции, приводящие к образованию неспецифических продуктов реакции, которые препятствуют образованию специфических продуктов калибровочной и представляющей интерес ДНК в течение проведения “буст” ПЦР.
Пример 3: Детекция Mycoplasma fermentans в образцах, полученных в процессе производства рекомбинантного белка
В образцы, полученные в процессе производства рекомбинантного белка, вносили различное количество Mycoplasma fermentans и анализировали согласно описанным выше экспериментальным способам. Положительное воздействие инактивации ОТ представлено в таблице 3, образцы 1-6. Что касается образцов, полученных при производственном получении вакцины, способ также позволяет детекцию всего 10 КОЕ/мл Mycoplasma fermentans, внесенных в суспензию клеток, используемых для получения рекомбинантного белка.
Таблица 3
Детекция Mycoplasma fermentans в образцах, полученных в процессе производства рекомбинантного белка
Образец № M.synoviae КОЕ/мл ОТ присут-ствует ОТ инакти-вирована Ct (калибро-вочная) Ct (представ-ляющая интерес)
1 100 + + 28,33 27,34
2 100 + + 28,56 27,15
3 10 + + 28,57 30,12
4 10 + + 28,50 30,72
5 - + + 28,66 40,00
6 - + + 28,38 40,00

Claims (15)

1. Способ детекции малопредставленных представляющих интерес фракций РНК в биологическом образце, включающий стадии:
(a) обратной транскрипции РНК в кДНК с использованием обратной транскриптазы (ОТ), стадию (a) осуществляют в условиях "горячего старта";
(b) инактивации ОТ обработкой хаотропным средством и
(с) детекции представляющей интерес кДНК посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР),
где биологический образец содержит большое фоновое количество клеточных компонентов и большое фоновое количество суммарной РНК, и где ОТ представляет собой рекомбинантную ДНК-полимеразу Thermus thermophilus (rTth-pol).
2. Способ по п.1, дополнительно включающий, после стадии (а), стадию амплификации представляющей интерес кДНК с использованием ОТ из стадии (а).
3. Способ по п.1, дополнительно включающий, после стадии (b), стадию удаления хаотропного средства из реакционной смеси.
4. Способ по п.1, где хаотропное средство выбрано из группы, состоящей из мочевины, перхлората лития и соли гуанидиния.
5. Способ по п.4, где хаотропное средство представляет собой соль гуанидиния.
6. Способ по п.1, где полимеразная цепная реакция (ПЦР) на стадии (c) представляет собой ПЦР в реальном времени.
7. Способ по п.1, где представляющая интерес РНК происходит из микоплазмы.
8. Способ по п.7, где микоплазму выбирают из группы, состоящей из Acholeplasma laidlawii, Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma hyorhinis, Mycoplasma hominis, Mycoplasma fermentans, Mycoplasma synoviae и Mycoplasma orale.
9. Способ по п.7, где представляющая интерес РНК представляет собой рибосомальную РНК 16S.
10. Способ детектирования микоплазменного загрязнения в биологическом образце, где способ включает стадии:
(a) выделения суммарной РНК из биологического образца;
(b) обратной транскрипции РНК в кДНК с использованием обратной транскриптазы (ОТ), где ОТ представляет собой рекомбинантную ДНК-полимеразу Thermus thermophilus (rTth-pol);
(с) амплификации кДНК, полученной на основе рибосомальной РНК 16S (рРНК 16S) микоплазмы посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием ОТ из стадии (b);
(d) инактивации ОТ посредством добавления хаотропного средства;
(e) удаления хаотропного средства из реакционной смеси; и
(f) детекции кДНК, полученной на основе рРНК 16S микоплазмы посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР).
11. Способ по п.10, где стадию (b) осуществляют в условиях “горячего старта”.
12. Способ по п.10, где хаотропное средство выбрано из группы, состоящей из мочевины, перхлората лития и соли гуанидиния.
13. Способ по п.12, где хаотропное средство представляет собой соль гуанидиния.
14. Способ по п.10, где полимеразная цепная реакция (ПЦР) из стадии (f) представляет собой ПЦР в реальном времени.
15. Набор для детекции микоплазменного загрязнения в биологическом образце, содержащий, по меньшей мере, рекомбинантную ДНК-полимеразу Thermus thermophilus (rTth-pol), подходящие праймеры для обратной транскрипции рРНК 16S микоплазмы, подходящие праймеры для амплификации кДНК, полученной из рибосомальной РНК 16S (рРНК 16S) микоплазмы, хаотропное средство для инактивации rTth-pol, средства для удаления хаотропного средства из реакционной смеси и праймеры для детекции кДНК, полученной из рРНК 16S микоплазмы посредством ПЦР в реальном времени.
RU2011123897/10A 2008-11-14 2009-11-12 Способ специфичной детекции малопредставленных фракций рнк в биологическом образце RU2524115C9 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US11485808P 2008-11-14 2008-11-14
US61/114,858 2008-11-14
PCT/EP2009/008071 WO2010054819A1 (en) 2008-11-14 2009-11-12 Method for the specific detection of low abundance rna species in a biological sample

Publications (3)

Publication Number Publication Date
RU2011123897A RU2011123897A (ru) 2012-12-20
RU2524115C2 true RU2524115C2 (ru) 2014-07-27
RU2524115C9 RU2524115C9 (ru) 2014-12-10

Family

ID=41508316

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2011123897/10A RU2524115C9 (ru) 2008-11-14 2009-11-12 Способ специфичной детекции малопредставленных фракций рнк в биологическом образце

Country Status (13)

Country Link
US (2) US8288101B2 (ru)
EP (1) EP2347013B1 (ru)
JP (1) JP5470400B2 (ru)
CN (1) CN102209794A (ru)
AU (1) AU2009315891B2 (ru)
BR (1) BRPI0921147B1 (ru)
CA (1) CA2743503A1 (ru)
DK (1) DK2347013T3 (ru)
HK (1) HK1159692A1 (ru)
IL (1) IL212644A (ru)
RU (1) RU2524115C9 (ru)
SG (1) SG171735A1 (ru)
WO (1) WO2010054819A1 (ru)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105385676B (zh) * 2015-11-05 2018-10-02 杭州易文赛生物技术有限公司 一种提取dna的方法和解离染色质的方法以及高氯酸盐的用途
WO2019189266A1 (ja) 2018-03-26 2019-10-03 三井化学株式会社 試料細菌のｒｎａを用いた細菌同定方法及びそのためのキット
CN109055479A (zh) * 2018-09-10 2018-12-21 山东省科学院生态研究所 一种地形逆温区域灰霾空气污染程度检测预警方法
CN113999897B (zh) * 2021-12-31 2022-04-01 北京金诺美生物技术有限公司 一种rt-pcr反应体系、rt-pcr方法及应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2274449C1 (ru) * 2004-10-19 2006-04-20 Кировская государственная медицинская академия (КГМА) Способ повышения чувствительности метода пцр диагностики микоплазменной урогенитальной инфекции у больных с выраженным экссудативным воспалением

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995011923A1 (en) * 1993-10-29 1995-05-04 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. A novel tumor marker and novel method of isolating same
US5512462A (en) * 1994-02-25 1996-04-30 Hoffmann-La Roche Inc. Methods and reagents for the polymerase chain reaction amplification of long DNA sequences
WO1998016636A1 (fr) * 1996-10-17 1998-04-23 Mitsubishi Chemical Corporation Molecule permettant d'homologuer un genotype et un phenotype, et utilisation de celle-ci
EP1115885B1 (en) * 1998-09-24 2008-08-20 Innogenetics N.V. Identification of microorganisms causing acute respiratory tract infections (ari)
US6132997A (en) 1999-05-28 2000-10-17 Agilent Technologies Method for linear mRNA amplification
US20030124654A1 (en) * 2002-01-03 2003-07-03 Reliance Life Sciences Private Limited Method and device for the rapid clinical diagnosis of hepatitis C virus (HCV) infection in biological samples
EP1560932A2 (en) * 2002-11-12 2005-08-10 Genolife One step real-time rt pcr kits for the universal detection of organisms in industrial products
US20050250112A1 (en) * 2004-05-07 2005-11-10 Padmabandu Gothami A Nucleic acids, compositions, methods, and kits for detecting mycoplasma and acholeplasma species
JP2009072062A (ja) * 2006-04-07 2009-04-09 Institute Of Physical & Chemical Research 核酸の５’末端を単離するための方法およびその適用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2274449C1 (ru) * 2004-10-19 2006-04-20 Кировская государственная медицинская академия (КГМА) Способ повышения чувствительности метода пцр диагностики микоплазменной урогенитальной инфекции у больных с выраженным экссудативным воспалением

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DARRELL P et al.:Reverse Transcriptase (RT) Inhibition of PCR at Low Concentrations of Template and Its Implications for Quantitative RT-PCR, Appl Environ Microbiol. 1998 February; 64(2): 669-211;67. MAROIS C.et al.:A reverse transcription-PCR assay to detect viable Mycoplasma synoviae in poultry environmental samples,Veterinary Microbiology 89 (2002) 17–28. PODDAR S. K. et al.:Effect of Inhibitors in Clinical Specimens on Taq and Tth Dna Polymerase-Based Pcr Amplification of Influenza A Virus,J Med Microbiol December 1998 vol. 47 no. 12 1131-1135. *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2010054819A1 (en) 2010-05-20
IL212644A0 (en) 2011-07-31
EP2347013B1 (en) 2014-06-18
US8288101B2 (en) 2012-10-16
CA2743503A1 (en) 2010-05-20
AU2009315891A1 (en) 2010-05-20
AU2009315891B2 (en) 2013-03-28
JP5470400B2 (ja) 2014-04-16
BRPI0921147A2 (pt) 2016-02-23
US20100124748A1 (en) 2010-05-20
JP2012508567A (ja) 2012-04-12
US20130004958A1 (en) 2013-01-03
EP2347013A1 (en) 2011-07-27
CN102209794A (zh) 2011-10-05
HK1159692A1 (en) 2012-08-03
BRPI0921147B1 (pt) 2019-12-03
RU2524115C9 (ru) 2014-12-10
SG171735A1 (en) 2011-07-28
RU2011123897A (ru) 2012-12-20
DK2347013T3 (da) 2014-08-11
IL212644A (en) 2015-04-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108410951B (zh) 一种新的核酸提取试剂及其应用
JPWO2007052765A1 (ja) Ｒｎａの抽出方法及びｒｎａの検出方法
US11118206B2 (en) Multiple stage isothermal enzymatic amplification
US6867021B2 (en) Multiplex RT-PCR/PCR for simultaneous detection of bovine coronavirus, bovine rotavirus, Cryptosporidium parvum, and Escherichia coli
US6472187B1 (en) Method for amplification of RNA
Filloux et al. Metagenomics approaches based on virion-associated nucleic acids (VANA): an innovative tool for assessing without a priori viral diversity of plants
JP2017525383A (ja) 阻害剤を除去するために有機溶媒を用いる核酸抽出
RU2524115C2 (ru) Способ специфичной детекции малопредставленных фракций рнк в в биологическом образце
CA2035471A1 (en) Techniques for the amplification of nucleic acid
JP2021104046A (ja) ホルムアルデヒドを含有する液体系細胞診用保存剤中検体から核酸を単離する方法
CN115747353A (zh) 一种用于单核细胞增生李斯特菌检测的引物组、试剂、试剂盒及检测方法
JP7385471B2 (ja) Ｐｈｉ６内部対照組成物、装置、および方法
CN103874766A (zh) 分子检测测定
US20220195541A1 (en) Detecting a target nucleic acid in a biological sample
EP2446061A1 (en) Method for quantitative pcr amplification of deoxyribonucleic acids from a sample containing pcr inhibitors
CN103866045B (zh) Hav检测
CN117947195A (zh) 用于检测沙门氏菌的一步法CRISPR/Cas12b检测试剂盒及方法
CN116004917A (zh) 检测禽流感病毒h3、h4和h5亚型的荧光定量pcr引物探针组及试剂盒
CN117305479A (zh) 一种结核分枝杆菌检测引物探针组合物及一体化微流控芯片试剂盒
CN116144843A (zh) Hpv16和/或hpv18基因型的实时荧光恒温扩增检测试剂盒及其专用引物和探针

Legal Events

Date Code Title Description
TH4A Reissue of patent specification
PC41 Official registration of the transfer of exclusive right

Effective date: 20160531

PC41 Official registration of the transfer of exclusive right

Effective date: 20211028