JP2012508567A - 生物学的試料中の低量ｒｎａ種の特異的検出方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、生物学的試料中の低量ＲＮＡ種の検出のための方法およびキット、ならびに生物学的試料中のマイコプラズマ汚染の検出のための方法およびキットに関する。
Description
発明の分野
本発明は、生物学的試料中の低量ＲＮＡ種の検出のための方法およびキット、ならびに生物学的試料中のマイコプラズマ汚染の検出のための方法およびキットに関する。
本発明は、生物学的試料中の低量ＲＮＡ種の検出のための方法およびキット、ならびに生物学的試料中のマイコプラズマ汚染の検出のための方法およびキットに関する。
発明の背景
数あるなかでも、最も広く行きわたり、成功したＲＮＡ分子検出および分析方法は、いわゆるＲＴ／ＰＣＲ（逆転写／ポリメラーゼ連鎖反応）である。該方法において、ＲＮＡ分子は、逆転写酵素（ＲＴ）によってｃＤＮＡ分子に転写され、次いで、ＰＣＲに基づく方法によって検出および／または分析される。
数あるなかでも、最も広く行きわたり、成功したＲＮＡ分子検出および分析方法は、いわゆるＲＴ／ＰＣＲ（逆転写／ポリメラーゼ連鎖反応）である。該方法において、ＲＮＡ分子は、逆転写酵素（ＲＴ）によってｃＤＮＡ分子に転写され、次いで、ＰＣＲに基づく方法によって検出および／または分析される。
当該分野における初期の研究者らは、トリの骨髄芽球症ウイルスＲＴまたはモロニー（Moloney）ネズミ白血病ウイルスＲＴを逆転写に用いた。しかしながら、ｃＤＮＡ合成の鋳型としてＲＮＡを用いることにおける重要な問題は、これらの中等温度好性のウイルス性ＲＴが安定なＲＮＡ二次構造によってｃＤＮＡを合成することができないことであった。該問題を迂回するために、逆転写は、二次的ＲＮＡ構造を解くことができ、さらに、プライマー伸長の特異性を増加させることのできる高い反応温度で実施することができる。これは、７０℃の最適温度で活性があるサーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｔｈ ｐｏｌ）のような、逆転写のための熱安定性酵素の使用を必要とする。
しかしながら、熱安定性逆転写酵素の使用は、新たな問題も引き起こす。特に、生物学的試料中の低量のＲＮＡ種を検出および／または分析しようとする場合、熱安定性逆転写酵素は、次のＲＴ／ＰＣＲ工程の間に、非特異的反応産物の生成を触媒することができる。これは、特に、全ＲＮＡの大きいバックグラウンドを有する試料中の場合であり、例えば生物医薬品の品質管理において、必要なレベルより遙かに高いレベルへの、標的ＲＮＡの検出限界の実質的な増加をもたらす。該問題を回避するために、全ての取扱および逆転写後のＲＴ／ＰＣＲ工程を高温にて、ホットスタート条件下で実施しなければならない。しかしながら、このことは、しばしば、特に工業規模で作業する場合、非現実的であり、かつ、不利益である。
しばしば全ＲＮＡの大きいバックグラウンドにおいて、低量のＲＮＡ種の高感度検出が特に適当である応用は、生物学的試料中のマイコプラズマ汚染の検出である。
マイコプラズマは、自己複製することができる最も小さい既知ゲノムのうちの一つを有する細菌である。ほとんどのマイコプラズマは、天然には無害の共生生物であるが、そのいくつかは天然宿主に感染することができ、様々な重篤度の疾患の原因となる。マイコプラズマ、特にマイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）およびアコレプラズマ（Ａｃｈｏｌｅｐｌａｓｍａ）属の種は、また、初代および連続細胞系統の汚染の原因となることが多く、細胞由来の生物学的および医薬的生産物の開発および生産に関与する研究および工業的研究室にとって深刻な問題の典型を示す。かくして、細胞系統繁殖および取扱の工程において通常使用される全ての予防的手段にも拘わらず、マイコプラズマ汚染は引き続き、頻繁に起こる問題である。
細胞系統および細胞由来の生物学的生産物のマイコプラズマ試験のために推奨される分析プロトコールは、ブロス／寒天培養の使用および指標細胞系統試験を包含する。ブロス／寒天培養方法は、培養可能なマイコプラズマ物質の検出を目的とするが、指標細胞系統は、培養条件が面倒で培養できないマイコプラズマ種を検出するために使用される。これら２つの方法の組合せは、有効なマイコプラズマ検出を可能にするが、試験手法全体は高価であり、冗長で、かつ時間がかかる（最短で２８日）。さらに、該アプローチに反応しない多くの培養できないマイコプラズマ種が存在する。
核酸、特にマイコプラズ由来のマリボソームＲＮＡの核酸の増幅に基づく新規なマイコプラズマ試験法が近年開発されている。これらの方法は、コスト、分析感度、簡便性および時間に関し、ある種の利益を有する。しかしながら、現在利用可能な方法の検出限界は、特に全ＲＮＡまたは他の巨大分子の大きいバックグラウンドを有する試料で作業する場合、まだ生物医薬品の品質管理に必要なレベルよりも上回る。
したがって、当該分野において、生物学的試料中の低量のＲＮＡ種の検出限界の改善を可能にするように現行のＲＴ／ＰＣＲ法を改善する必要性が存在する。
上記の問題の解決は、本願の特許請求の範囲において特徴付けられた具体例によって達成される。
発明の概要
本発明の目的は、生物学的試料中の低量のＲＮＡ種の検出のための改善された方法を提供することにある。特に、本発明は、該方法および生物学的試料中の低量のＲＮＡ種の検出のためのキットに関する。さらに、本発明の別の目的は、試料中のマイコプラズマ汚染の検出のための改善された方法およびキットを提供することにある。
本発明の目的は、生物学的試料中の低量のＲＮＡ種の検出のための改善された方法を提供することにある。特に、本発明は、該方法および生物学的試料中の低量のＲＮＡ種の検出のためのキットに関する。さらに、本発明の別の目的は、試料中のマイコプラズマ汚染の検出のための改善された方法およびキットを提供することにある。
発明の詳細な記載
一の態様において、本発明は、生物学的試料中の低量の標的ＲＮＡ種の検出のための方法であって、
（ａ）逆転写酵素（ＲＴ）を用いてＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写する工程、
（ｂ）該ＲＴを不活性化する工程、および
（ｃ）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって標的ｃＤＮＡを検出する工程
を含む方法に関する。
一の態様において、本発明は、生物学的試料中の低量の標的ＲＮＡ種の検出のための方法であって、
（ａ）逆転写酵素（ＲＴ）を用いてＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写する工程、
（ｂ）該ＲＴを不活性化する工程、および
（ｃ）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって標的ｃＤＮＡを検出する工程
を含む方法に関する。
本明細書中で使用される場合、「生物学的試料」なる語は、生物学的に関連する巨大分子を含有する、または含有する疑いのあるいずれかの試料、例えば、生物医薬品、例えば、ワクチンまたは組み換えタンパク質の製造過程の種々の段階に由来する試料、細胞培養上清、細胞ライゼート、細胞抽出物、食物または環境試料、ヒトまたは動物の体に由来する試料、例えば、全血、血清、血漿、尿、分泌液または塗沫、生物学的起源のいずれか他の試料およびＲＮＡを含有するか、または含有する疑いのあるいずれか他の組成物に関する。
本発明の好ましい具体例において、生物学的試料は、細胞成分の大きいバックグラウンドを有する。
本明細書中で使用される場合、「細胞成分」なる語は、細胞小器官、タンパク質、ペプチド、膜、脂質、核酸、特に非標的ＲＮＡ種、およびその組合せまたはフラグメントに関する。
本発明の別の好ましい具体例において、生物学的試料は、全ＲＮＡの大きいバックグラウンドを有する。
本明細書中で使用される場合、「全ＲＮＡの大きいバックグラウンド」なる語は、標的ＲＮＡが１０４全ＲＮＡ分子中において１分子未満、好ましくは１０６全ＲＮＡ分子中において１分子未満、より好ましくは１０８全ＲＮＡ分子中において１分子未満、最も好ましくは１０１０全ＲＮＡ分子中において１分子未満で存在する状況に関する。
本発明の好ましい具体例において、標的ＲＮＡは、試料１ｍｌにつき１００００コピー未満、好ましくは試料１ｍｌにつき１０００コピー未満、より好ましくは試料１ｍｌにつき１００コピー未満、最も好ましくは試料１ｍｌにつき１０コピー未満の量で存在する。
本発明の好ましい具体例によると、本発明の方法にしたがうＲＴを用いるＲＮＡのｃＤＮＡへの逆転写は、ホットスタート条件下で実施される。
本明細書中で使用される場合、「ホットスタート条件」なる語は、プライマー伸長に関与する酵素の添加前に、反応混合物がプライマー／核酸複合体の融点に、または該融点よりも高温に加熱されるいずれかの条件、またはプライマー伸長に関与する酵素が周囲温度で不活性であり、プライマー／核酸複合体の融点にて、または該融点よりも高温にて実施される高温活性化工程によって活性化されるいずれかの条件に関する。
本発明の好ましい具体例において、本発明の方法は、さらに、ＲＴを用いるＲＮＡのｃＤＮＡへの逆転写後に、同じＲＴを用いて標的ｃＤＮＡを増幅する工程を含む。該さらなる工程は、「プライムＰＣＲ」と呼ばれ、好ましくは、ホットスタート条件下で５〜１５サイクル、より好ましくはホットスタート条件下で５〜１１サイクル、最も好ましくはホットスタート条件下で５〜１０サイクル実施される。
したがって、別の態様において、本発明は、生物学的試料中の低量の標的ＲＮＡ種の検出のための方法であって、
（ａ）逆転写酵素（ＲＴ）を用いてＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写する工程、
（ｂ）工程（ａ）のＲＴを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、ｃＤＮＡを増幅する工程
（ｃ）該ＲＴを不活性化する工程、および
（ｄ）ＰＣＲによって標的ｃＤＮＡを検出する工程
を含む方法に関する。
（ａ）逆転写酵素（ＲＴ）を用いてＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写する工程、
（ｂ）工程（ａ）のＲＴを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、ｃＤＮＡを増幅する工程
（ｃ）該ＲＴを不活性化する工程、および
（ｄ）ＰＣＲによって標的ｃＤＮＡを検出する工程
を含む方法に関する。
ＲＴ（すなわち、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ）およびＤＮＡポリメラーゼ（すなわち、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ）の両方の活性を有する酵素は、当該分野でよく知られており、例えば、サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｔｈ ｐｏｌ）を包含する。ある特定の酵素がある特定の活性を示す条件もまた、当該分野でよく知られている。Ｔｔｈ ｐｏｌの場合、逆転写活性は、Ｍｎ２＋イオンによって促進され、ＤＮＡポリメラーゼ活性は、Ｍｇ２＋イオンによって促進される。
本発明の好ましい具体例において、本発明の方法において使用されるＲＴは、サーマス・サーモフィルスＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｔｈ ｐｏｌ）である。さらに好ましい具体例において、Ｔｔｈ ｐｏｌは、組み換え生産される（ｒＴｈ ｐｏｌ）。
本発明の別の好ましい具体例において、ＲＴは、本発明の方法において、好ましくは、熱処理、フェノールでの処理、プロテイナーゼＫでの処理、およびカオトロピック剤での処理からなる群から選択される方法によって、不活性化される。
本発明にしたがう熱処理は、ＲＴを含有する反応混合物を８０〜１００℃、好ましくは９０〜１００℃、より好ましくは９５℃に加熱することを含む。熱処理の期間は、１５〜９０分、好ましくは３０〜７５分、より好ましくは６０分である。特に好ましい具体例において、熱処理は、ＲＴを含有する反応混合物を９５℃に６０分間加熱することを含む。
本発明にしたがうプロテイナーゼＫでの処理は、１〜１０単位のプロテイナーゼＫ、より好ましくは２〜５単位のプロテイナーゼＫ、最も好ましくは５単位のプロテイナーゼＫを反応混合物に添加することを含む。プロテイナーゼＫ処理の期間は、３０〜９０分、好ましくは４５〜７５分、最も好ましくは６０分である。特に好ましい具体例において、プロテイナーゼＫでの処理は、５単位のプロテイナーゼＫの６０分間の添加を含む。
本発明の好ましい具体例において、ＲＴは、本発明の方法において、カオトロピック剤での処理によって不活性化される。本発明にしたがうカオトロピック剤での処理は、ＲＴを含有する反応混合物に、ＲＴを不活性化するのに十分な量および時間でカオトロピック剤を添加することを含む。特定のカオトロピック剤の量および時間は、当該分野でよく知られている。本発明のより好ましい具体例において、カオトロピック剤は、尿素、過塩素酸リチウムおよびグアニジニウム塩からなら群から選択される。最も好ましい具体例において、カオトロピック剤は、グアニジニウム塩である。
本発明のさらに好ましい具体例において、本発明の方法は、さらに、カオトロピック剤を用いるＲＴの不活性化後に、該カオトロピック剤を反応混合物から除去する工程を含む。反応混合物からカオトロピック剤を除去するための方法は、当該分野でよく知られており、例えば、ＤＮＡ結合スピンカラムを用いる反応混合物中に含有される核酸の精製を包含する。
ＰＣＲによる標的ｃＤＮＡの検出は、「ブーストＰＣＲ」とも呼ばれる。本発明の好ましい具体例において、本発明の方法におけるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、リアルタイムＰＣＲである。
本明細書中で使用される場合、「リアルタイムＰＣＲ」なる語は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づき、標的のＤＮＡ分子を増幅させ、同時に定量化することが可能ないずれかの方法に関する。
本発明の好ましい具体例において、標的ＲＮＡは、マイコプラズマから由来する。本明細書中で使用される場合、「マイコプラズマ」なる語は、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、ウレアプラズマ（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ）、メソプラズマ（Ｍｅｓｏｐｌａｓｍａ）、エントモプラズマ（Ｅｎｔｏｍｏｐｌａｓｍａ）、スピロプラズマ（Ｓｐｉｒｏｐｌａｓｍａ）、アコレプラズマ（Ａｃｈｏｌｅｐｌａｓｍａ）、アステロプラズマ（Ａｓｔｅｒｏｌｅｐｌａｓｍａ）、およびサーモプラズマ（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ）属を包含するモリクテス（Ｍｏｌｌｉｃｕｔｅｓ）クラスのいずれかのメンバーに関する。本発明のより好ましい具体例において、マイコプラズマは、アコレプラズマ・ライドラウィ（Ａｃｈｏｌｅｐｌａｓｍａ ｌａｉｄｌａｗｉｉ）、マイコプラズマ・ガリセプティカム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）、マイコプラズマ・ヒオリニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｒｈｉｎｉｓ）、マイコプラズマ・ホミニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｏｍｉｎｉｓ）、マイコプラズマ・フェルメンタンス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、マイコプラズマ・シノヴィエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｓｙｎｏｖｉａｅ）およびマイコプラズマ・オラーレ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｏｒａｌｅ）からなる群から選択される。
本発明のさらに好ましい具体例において、標的ＲＮＡは、１６ＳリボソームＲＮＡ（１６Ｓ ｒＲＮＡ）である。
別の態様において、本発明は、生物学的試料中のマイコプラズマ汚染の検出のための方法であって、
（ａ）該試料から全ＲＮＡを抽出する工程、
（ｂ）逆転写酵素（ＲＴ）を用いてＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写する工程、
（ｃ）工程（ｂ）のＲＴを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、マイコプラズマ１６ＳリボソームＲＮＡ（１６Ｓ ｒＲＮＡ）由来のｃＤＮＡを増幅する工程、
（ｄ）カオトロピック剤の添加によって、ＲＴを不活性化する工程、
（ｅ）反応混合物からカオトロピック剤を除去する工程、および
（ｆ）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、マイコプラズマ１６Ｓ ｒＲＮＡ由来のｃＤＮＡを検出する工程
を含む方法に関する。
（ａ）該試料から全ＲＮＡを抽出する工程、
（ｂ）逆転写酵素（ＲＴ）を用いてＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写する工程、
（ｃ）工程（ｂ）のＲＴを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、マイコプラズマ１６ＳリボソームＲＮＡ（１６Ｓ ｒＲＮＡ）由来のｃＤＮＡを増幅する工程、
（ｄ）カオトロピック剤の添加によって、ＲＴを不活性化する工程、
（ｅ）反応混合物からカオトロピック剤を除去する工程、および
（ｆ）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、マイコプラズマ１６Ｓ ｒＲＮＡ由来のｃＤＮＡを検出する工程
を含む方法に関する。
試料から全ＲＮＡを抽出するための手段は、当該分野でよく知られており、フェノール／クロロホルムでの抽出およびイソプロパノールでの沈澱を包含する。
本発明の好ましい具体例において、検出されるべきマイコプラズマ汚染は、試料中における約１０ｃｆｕ／ｍｌ以下のマイコプラズマの汚染である。
マイコプラズマ１６Ｓ ｒＲＮＡの逆転写のためのプライマー、ならびにＰＣＲによるマイコプラズマ１６Ｓ ｒＲＮＡ由来のｃＤＮＡの増幅のためのプライマーは、当該分野でよく知られている。
本発明の好ましい具体例において、試料中におけるマイコプラズマ汚染の検出のための方法のＲＴを用いるＲＮＡのｃＤＮＡへの逆転写は、ホットスタート条件下で実施される。
本発明の別の好ましい具体例において、試料中のマイコプラズマ汚染の検出のための方法において使用されるＲＴは、サーマス・サーモフィルスＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｔｈ ｐｏｌ）である。さらに好ましい具体例において、Ｔｔｈ ｐｏｌは、組み換え生産される（ｒＴｔｈ−ｐｏｌ）。
本発明のさらに好ましい具体例において、試料中のマイコプラズマ汚染の検出のための方法において使用されるカオトロピック剤は、尿素、過塩素酸リチウムおよびグアニジニウム塩からなら群から選択される。最も好ましい具体例において、カオトロピック剤は、グアニジニウム塩である。
本発明の一のさらに好ましい具体例において、試料中のマイコプラズマ汚染の検出のための方法におけるＰＣＲは、リアルタイムＰＣＲである。
別の態様において、本発明は、生物学的試料中の低量の標的ＲＮＡ種の検出のためのキットであって、少なくとも、ＲＴおよび該ＲＴの不活性化のための手段を含むキットに関する。ＲＴの不活性化のための手段は、プロテイナーゼＫまたはカオトロピック剤であってもよい。該キットは、さらに、例えば、逆転写のためのプライマー、特定のｃＤＮＡの検出のためのプライマー、キャリヤーＲＮＡ、カリブレーターＲＮＡ、カリブレーターＤＮＡ、適当な酵素、バッファー、試薬、反応容器および消耗品を含んでいてもよい。
さらなる態様において、本発明は、生物学的試料中のマイコプラズマ汚染の検出のためキットであって、少なくとも、組み換えサーマス・サーモフィルスＤＮＡポリメラーゼ（ｒＴｔｈ−ｐｏｌ）、マイコプラズマ１６Ｓ ｒＲＮＡの逆転写のための適当なプライマー、マイコプラズマ１６Ｓ ｒＲＮＡ由来のｃＤＮＡの増幅のための適当なプライマー、ｒＴｔｈ−ｐｏｌの不活性化のためのカオトロピック剤、反応混合物から該カオトロピック剤を除去するための手段、およびＰＣＲによる、例えばリアルタイムＰＣＲによるマイコプラズマ１６Ｓ ｒＲＮＡ由来のｃＤＮＡの検出のためのプライマーを含むキットに関する。カオトロピック剤を除去するための手段は、ＤＮＡ結合スピンカラムであってもよい。該キットは、さらに、例えば、試料から全ＲＮＡを抽出するための手段、キャリヤーＲＮＡ、カリブレーターＲＮＡ、カリブレーターＤＮＡ、適当な酵素、バッファー、試薬、反応容器および／または消耗品を含んでいてもよい。全ＲＮＡを抽出するための手段は、フェノール、クロロホルムおよびイソプロパノール、またはそれらを含むバッファーであってもよい。
本発明は、さらに、下記の実施例において説明されるが、それらに限定されるものではない。
本発明は、さらに、下記の実施例において説明されるが、それらに限定されるものではない。
一般的手法：
該方法は、目的の生物学的試料の遠心分離から開始し、次いで、該試料ペレットから全ＲＮＡを抽出する。次いで、Ｍｎ２＋の存在下、ホットスタート条件下で、組み換えサーマス・サーモフィルスＤＮＡポリメラーゼ（ｒＴｔｈ−ｐｏｌ）を用いて、ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写する。Ｍｎ２＋のキレート化およびＭｇ２＋の添加後、ｒＴｔｈ−ｐｏｌがホットスタート条件下でＰＣＲ増幅を５サイクルまたは１０サイクル実施する（プライムＰＣＲ）。次いで、該ＰＣＲ反応物をグアニジン含有バッファーに移して、ｒＴｔｈ−ｐｏｌを不活性化する。スピンカラムに基づくキットを用いる精製により、該プライムＰＣＲの精製されたＰＣＲ産物がもたらされ、次いでそれを、二重リアルタイムＰＣＲにおいてＤＮＡ標準（カリブレーターＤＮＡ）と共に増幅させる（ブーストＰＣＲ）。別法では、ＲＮＡ標準（カリブレーターＲＮＡ）をＲＮＡ抽出の最初に添加して、開始時からその手法を標準化し、調節することができる。
該方法は、目的の生物学的試料の遠心分離から開始し、次いで、該試料ペレットから全ＲＮＡを抽出する。次いで、Ｍｎ２＋の存在下、ホットスタート条件下で、組み換えサーマス・サーモフィルスＤＮＡポリメラーゼ（ｒＴｔｈ−ｐｏｌ）を用いて、ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写する。Ｍｎ２＋のキレート化およびＭｇ２＋の添加後、ｒＴｔｈ−ｐｏｌがホットスタート条件下でＰＣＲ増幅を５サイクルまたは１０サイクル実施する（プライムＰＣＲ）。次いで、該ＰＣＲ反応物をグアニジン含有バッファーに移して、ｒＴｔｈ−ｐｏｌを不活性化する。スピンカラムに基づくキットを用いる精製により、該プライムＰＣＲの精製されたＰＣＲ産物がもたらされ、次いでそれを、二重リアルタイムＰＣＲにおいてＤＮＡ標準（カリブレーターＤＮＡ）と共に増幅させる（ブーストＰＣＲ）。別法では、ＲＮＡ標準（カリブレーターＲＮＡ）をＲＮＡ抽出の最初に添加して、開始時からその手法を標準化し、調節することができる。
実験手法：
ＲＮＡ抽出。全ての工程を２ｍｌの反応チューブ中で行った。２ｍｌの試料を１０００ｒｐｍにて、４℃で１０分間遠心分離した。ペレットを１ｍｌ ＲＮＡ−ＢｅｅＴＭ（登録商標）（Ｔｅｌ−Ｔｅｓｔ Ｉｎｃ．，ＴＸ）中に再懸濁し、５μｌの１ｍｇ／ｍｌ酵母ｔＲＮＡを加え、試料を遠心機中、７０℃および１０００ｒｐｍにて２０分間インキュベートした。その後、１１０μｌのクロロホルムを加え、１３０００ｒｐｍで５分間の遠心分離によって相を分離した。得られた上相に５００μｌのイソプロパノールを添加することによって、ＲＮＡを沈澱させ、試料をドライアイス上で５分間維持した。ＲＮＡペレットを１３０００ｒｐｍにて１５分間の遠心分離によって収集し、５００μｌの７０％ＥｔＯＨで洗浄し、試料を１３０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離した。上清を捨て、ＲＮＡペレットを２５０μｌの二重蒸留水（ｂｉｄｅｓｔ．Ｈ２Ｏ）（ｂｄＨ２Ｏ）中に溶解した。
ＲＮＡ抽出。全ての工程を２ｍｌの反応チューブ中で行った。２ｍｌの試料を１０００ｒｐｍにて、４℃で１０分間遠心分離した。ペレットを１ｍｌ ＲＮＡ−ＢｅｅＴＭ（登録商標）（Ｔｅｌ−Ｔｅｓｔ Ｉｎｃ．，ＴＸ）中に再懸濁し、５μｌの１ｍｇ／ｍｌ酵母ｔＲＮＡを加え、試料を遠心機中、７０℃および１０００ｒｐｍにて２０分間インキュベートした。その後、１１０μｌのクロロホルムを加え、１３０００ｒｐｍで５分間の遠心分離によって相を分離した。得られた上相に５００μｌのイソプロパノールを添加することによって、ＲＮＡを沈澱させ、試料をドライアイス上で５分間維持した。ＲＮＡペレットを１３０００ｒｐｍにて１５分間の遠心分離によって収集し、５００μｌの７０％ＥｔＯＨで洗浄し、試料を１３０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離した。上清を捨て、ＲＮＡペレットを２５０μｌの二重蒸留水（ｂｉｄｅｓｔ．Ｈ２Ｏ）（ｂｄＨ２Ｏ）中に溶解した。
逆転写。６μｌのＲＴミックス（１μｌの１０ｘ逆転写バッファー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ａｕｓｔｒｉａ）、１μｌの１０ｍＭ ＭｎＣｌ２、０．５μｌの１０μＭ逆方向プライマー、０．８μｌの２．５ｍＭの各ｄＮＴＰ、２．２μｌ（５．５Ｕ）のｒＴｔｈ−ｐｏｌおよび０．５μｌのｂｄＨ２Ｏ）を４μｌのＲＮＡ抽出物に加えた。８０℃で２分間、６２℃で５分間、７０℃で１０分間および８０℃で２分間、逆転写を行った。
プライムＰＣＲ。予め８５℃±５℃に加熱した４０μｌのＰＣＲミックス（４μｌの１０ｘキレートバッファー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ａｕｓｔｒｉａ）、５μｌの２５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２．５μｌの１０μＭ順方向プライマー、２μｌの１０μＭ逆方向プライマーおよび２６．５μｌのｂｄＨ２Ｏ）を逆転写から得られた反応混合物に加えた。下記のプロトコールにしたがって、ＰＣＲを実施した。８０℃で２分、９５℃で２分、５ｘ（９５℃で１０秒、６２℃で３０秒、７２℃で３０秒）。
ＲＴの不活性化。プライムＰＣＲ後、５０μｌのまだ熱い反応混合物を２５３μｌの不活性化バッファー（３μｌのキャリヤーＲＮＡ（１μｇ／μｌの酵母ｔＲＮＡ）、２５０μｌのバッファーＰＢＩ（Ｑｉａｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ； Ｑｉａｇｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ））に加え、混合した。該試料を２ｍｌのコレクションチューブ中においてＱｉａｑｕｉｃｋミニスピンカラム（Ｑｉａｇｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）にアプライし、１３０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。該コレクションチューブを廃棄し、新しいコレクションチューブ中に該スピンカラムを置き、７５０μｌのバッファーＰＥ（Ｑｉａｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ； Ｑｉａｇｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を加え、試料を１３０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。該コレクションチューブを再び廃棄し、新しいコレクションチューブ中、１３０００ｒｐｍで１分間、該スピンカラムを遠心分離した。次いで、該スピンカラムを新しい１．５ｍｌの反応チューブ中に置き、５０μｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）を加え、１３０００ｒｐｍで１分間の遠心分離により、ＤＮＡを溶出した。
ブーストＰＣＲ。１０μｌの溶出したＤＮＡをオプティカルチューブ中に置き、対照として５μｌのカリブレーターＤＮＡおよび３５μｌのＴＭＰＣＲミックス（１ｘ ＴａｑＭａｎバッファーＡ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ａｕｓｔｒｉａ）、５ｍＭのＭｇＣｌ２、２００ｎＭの各プライマー、１００ｎＭの各プローブ、２００μＭの各ｄＮＴＰ、９％グリセロール（ｗｔ／ｖｏｌ）、０．０５％のゼラチン（ｗｔ／ｖｏｌ）、０．０１％のＴｗｅｅｎ２０（ｗｔ／ｖｏｌ）、２．５ＵのＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄポリメラーゼ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ａｕｓｔｒｉａ））を加えた。リアルタイムＰＣＲを下記のプロトコールにしたがって実施した。９５℃で１０分、４０ｘ（９５℃で１５秒、６２℃で１分）。
実施例１：ワクチンの製造過程に由来する試料中のマイコプラズマ・シノヴィエの検出
ワクチンの製造過程に由来する試料を種々の量のマイコプラズマ・シノヴィエでスパイクし、上記の実験手法にしたがって処理した。ＲＴ不活性化（試料１〜６）の有利な効果を明らかにするために、ＲＴが不活性化されていない（試料７〜１２）、またはＲＴが全く加えられていない（試料１３〜１８）対照試料を含めた。ＲＮＡ抽出、逆転写、プライムＰＣＲおよびＲＴ不活性化の後、リアルタイムＰＣＲによって、ｃＤＮＡの存在について試料を分析した。該ブーストＰＣＲの前に、所定量のカリブレーターＤＮＡを反応混合物に加えた。異なるプライマーセットを用いて、該カリブレーターＤＮＡを標的核酸と一緒に増幅した。異なる標識プローブを用いることによって、カリブレーターおよび標的ＤＮＡ由来のシグナルを区別した。プライムおよびブーストＰＣＲのためのプライマーは、マイコプラズマ１６Ｓ ｒＲＮＡに特異的であった。表１にまとめた結果は、リアルタイムＰＣＲ由来のＣｔ値、すなわち、特異的ＰＣＲ産物を検出するために必要とされたサイクル数を示す。より低いＣｔ値は、より迅速な検出を意味し、一方、Ｃｔ値４０は、リアルタイムＰＣＲのラン全体にわたって検出可能な生産物がなかったことを示す。
ワクチンの製造過程に由来する試料を種々の量のマイコプラズマ・シノヴィエでスパイクし、上記の実験手法にしたがって処理した。ＲＴ不活性化（試料１〜６）の有利な効果を明らかにするために、ＲＴが不活性化されていない（試料７〜１２）、またはＲＴが全く加えられていない（試料１３〜１８）対照試料を含めた。ＲＮＡ抽出、逆転写、プライムＰＣＲおよびＲＴ不活性化の後、リアルタイムＰＣＲによって、ｃＤＮＡの存在について試料を分析した。該ブーストＰＣＲの前に、所定量のカリブレーターＤＮＡを反応混合物に加えた。異なるプライマーセットを用いて、該カリブレーターＤＮＡを標的核酸と一緒に増幅した。異なる標識プローブを用いることによって、カリブレーターおよび標的ＤＮＡ由来のシグナルを区別した。プライムおよびブーストＰＣＲのためのプライマーは、マイコプラズマ１６Ｓ ｒＲＮＡに特異的であった。表１にまとめた結果は、リアルタイムＰＣＲ由来のＣｔ値、すなわち、特異的ＰＣＲ産物を検出するために必要とされたサイクル数を示す。より低いＣｔ値は、より迅速な検出を意味し、一方、Ｃｔ値４０は、リアルタイムＰＣＲのラン全体にわたって検出可能な生産物がなかったことを示す。
表１の結果は、明らかに、活性なＲＴの存在（試料７〜１２）は、１００ｃｆｕ／ｍｌのマイコプラズマ・シノヴィエであっても検出不可能にするが、ＲＴの不活性化は、たった１０ｃｆｕ／ｍｌであっても検出可能にすることを示す。ＲＴ不活性化を伴わない試料におけるカリブレーターＤＮＡについてのＣｔ値増加は、不活性化なしに、ＲＴが、ブーストＰＣＲの間にカリブレーターおよび標的ＤＮＡの特異的産物の生成に干渉する非特異的反応産物を導く反応を触媒することができることを示す。該解釈は、ＲＴが全く加えられなかった試料（試料１３〜１８）中でカリブレーターＤＮＡについてのＣｔ値が、ＲＴが不活性化した試料（試料１〜６）中と再び同じレベルにあるという事実により支持される。
実施例２：ワクチンの製造過程に由来する試料中のマイコプラズマ・フェルメンタンスの検出
実施例１における試料と同じ試料を種々の量のマイコプラズマ・フェルメンタンスでスパイクし、上記の実験手法にしたがって処理した。ＲＴ不活性化（試料１〜６）の有利な効果を明らかにするために、ＲＴが不活性化されていない対照試料（試料７〜１２）を含めた。ＲＮＡ抽出、逆転写、プライムＰＣＲおよびＲＴ不活性化の後、リアルタイムＰＣＲによって、ｃＤＮＡの存在について試料を分析した。該ブーストＰＣＲの前に、所定量のカリブレーターＤＮＡを反応混合物に加えた。プライムおよびブーストＰＣＲのためのプライマーは、また、マイコプラズマ１６Ｓ ｒＲＮＡに特異的であった。表２にまとめた結果は、リアルタイムＰＣＲ由来のＣｔ値を示す。
実施例１における試料と同じ試料を種々の量のマイコプラズマ・フェルメンタンスでスパイクし、上記の実験手法にしたがって処理した。ＲＴ不活性化（試料１〜６）の有利な効果を明らかにするために、ＲＴが不活性化されていない対照試料（試料７〜１２）を含めた。ＲＮＡ抽出、逆転写、プライムＰＣＲおよびＲＴ不活性化の後、リアルタイムＰＣＲによって、ｃＤＮＡの存在について試料を分析した。該ブーストＰＣＲの前に、所定量のカリブレーターＤＮＡを反応混合物に加えた。プライムおよびブーストＰＣＲのためのプライマーは、また、マイコプラズマ１６Ｓ ｒＲＮＡに特異的であった。表２にまとめた結果は、リアルタイムＰＣＲ由来のＣｔ値を示す。
表２の結果は、活性なＲＴの存在（試料７〜１２）は、１００ｃｆｕ／ｍｌのマイコプラズマ・フェルメンタンスであっても検出不可能にするが、ＲＴの不活性化は、たった１０ｃｆｕ／ｍｌであっても検出可能にすることを確認する。さらに、ＲＴ不活性化を伴わない試料におけるカリブレーターＤＮＡについてのＣｔ値増加は、不活性化なしに、ＲＴが、ブーストＰＣＲの間にカリブレーターおよび標的ＤＮＡの特異的産物の生成に干渉する非特異的反応産物を導く反応を触媒することができることを確認する。
実施例３：組み換えタンパク質の製造過程に由来する試料中のマイコプラズマ・フェルメンタンスの検出
組み換えタンパク質の製造過程に由来する試料を種々の量のマイコプラズマ・フェルメンタンスでスパイクし、上記の実験手法にしたがって処理した。ＲＴ不活性化の有利な効果を表３、試料１〜６に示す。ワクチンの製造過程由来の試料に関しては、該手法は、また、組み換えタンパク質を製造するために使用された細胞懸濁中へスパイクされたわずか１０ｃｆｕ／ｍｌのマイコプラズマ・フェルメンタンスの検出をも可能にする。
組み換えタンパク質の製造過程に由来する試料を種々の量のマイコプラズマ・フェルメンタンスでスパイクし、上記の実験手法にしたがって処理した。ＲＴ不活性化の有利な効果を表３、試料１〜６に示す。ワクチンの製造過程由来の試料に関しては、該手法は、また、組み換えタンパク質を製造するために使用された細胞懸濁中へスパイクされたわずか１０ｃｆｕ／ｍｌのマイコプラズマ・フェルメンタンスの検出をも可能にする。
Claims (23)
- 生物学的試料中の低量の標的ＲＮＡ種の検出のための方法であって、
（ａ）逆転写酵素（ＲＴ）を用いてＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写する工程、
（ｂ）該ＲＴを不活性化する工程、および
（ｃ）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって標的ｃＤＮＡを検出する工程
を含む方法。 - 生物学的試料が細胞成分の大きいバックグラウンドを有する、請求項１記載の方法。
- 生物学的試料が全ＲＮＡの大きいバックグラウンドを有する、請求項１記載の方法。
- 工程（ａ）がホットスタート条件下で実施される、請求項１記載の方法。
- さらに、工程（ａ）の後、工程（ａ）のＲＴを用いて標的ｃＤＮＡを増幅する工程を含む、請求項１記載の方法。
- ＲＴが組み換えサーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ（ｒＴｔｈ−ｐｏｌ）である、請求項１記載の方法。
- 熱処理、フェノールでの処理、プロテイナーゼＫでの処理、およびカオトロピック剤での処理からなる群から選択される方法によって、工程（ｂ）でＲＴが不活性化される、請求項１記載の方法。
- カオトロピック剤での処理によってＲＴが不活性化される、請求項７記載の方法。
- さらに、工程（ｂ）の後、反応混合物からカオトロピック剤を除去する工程を含む、請求項８記載の方法。
- カオトロピック剤が尿素、過塩素酸リチウムおよびグアニジニウム塩からなら群から選択される、請求項８記載の方法。
- カオトロピック剤がグアニジニウム塩である、請求項１０記載の方法。
- 工程（ｃ）のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）がリアルタイムＰＣＲである、請求項１記載の方法。
- 標的ＲＮＡがマイコプラズマに由来する、請求項１記載の方法。
- マイコプラズマがアコレプラズマ・ライドラウィ（Ａｃｈｏｌｅｐｌａｓｍａ ｌａｉｄｌａｗｉｉ）、マイコプラズマ・ガリセプティカム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）、マイコプラズマ・ヒオリニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｒｈｉｎｉｓ）、マイコプラズマ・ホミニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｏｍｉｎｉｓ）、マイコプラズマ・フェルメンタンス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、マイコプラズマ・シノヴィエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｓｙｎｏｖｉａｅ）およびマイコプラズマ・オラーレ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｏｒａｌｅ）からなる群から選択される、請求項１３記載の方法。
- 標的ＲＮＡが１６ＳリボソームＲＮＡである、請求項１３記載の方法。
- 生物学的試料中のマイコプラズマ汚染の検出のための方法であって、
（ａ）生物学的試料から全ＲＮＡを抽出する工程、
（ｂ）逆転写酵素（ＲＴ）を用いてＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写する工程、
（ｃ）工程（ｂ）のＲＴを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、マイコプラズマ１６ＳリボソームＲＮＡ（１６Ｓ ｒＲＮＡ）由来のｃＤＮＡを増幅する工程、
（ｄ）カオトロピック剤の添加によって、ＲＴを不活性化する工程、
（ｅ）反応混合物からカオトロピック剤を除去する工程、および
（ｆ）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、マイコプラズマ１６Ｓ ｒＲＮＡ由来のｃＤＮＡを検出する工程
を含む方法。 - 工程（ｂ）がホットスタート条件下で実施される、請求項１６記載の方法。
- ＲＴが組み換えサーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ（ｒＴｔｈ−ｐｏｌ）である、請求項１６記載の方法。
- カオトロピック剤が尿素、過塩素酸リチウムおよびグアニジニウム塩からなら群から選択される、請求項１６記載の方法。
- カオトロピック剤がグアニジニウム塩である、請求項１９記載の方法。
- 工程（ｆ）のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）がリアルタイムＰＣＲである、請求項１６記載の方法。
- 少なくとも、逆転写酵素（ＲＴ）およびＲＴの不活性化のための手段を含む、全ＲＮＡの大きいバックグラウンドにおける低量の標的ＲＮＡ種の検出のためのキット。
- 少なくとも、組み換えサーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ（ｒＴｔｈ−ｐｏｌ）、マイコプラズマ１６Ｓ ｒＲＮＡの逆転写に適当なプライマー、マイコプラズマ１６ＳリボソームＲＮＡ（１６Ｓ ｒＲＮＡ）由来のｃＤＮＡの増幅に適当なプライマー、ｒＴｔｈ−ｐｏｌの不活性化のためのカオトロピック剤、反応混合物から該カオトロピック剤を除去するための手段、およびリアルタイムＰＣＲによるマイコプラズマ１６Ｓ ｒＲＮＡ由来のｃＤＮＡの検出のためのプライマーを含む、生物学的試料中のマイコプラズマ汚染の検出のためのキット。
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