CN105385676B

CN105385676B - 一种提取dna的方法和解离染色质的方法以及高氯酸盐的用途

Info

Publication number: CN105385676B
Application number: CN201510751602.5A
Authority: CN
Inventors: 陆聪儿; 董伟仁; 杜雯林; 项春生; 戴玲华
Original assignee: Hebei Yiwensai Biotechnology Co Ltd; HANGZHOU S-EVANS BIOSCIENCES Co Ltd
Current assignee: Hebei Yiwensai Biotechnology Co Ltd; HANGZHOU S-EVANS BIOSCIENCES Co Ltd
Priority date: 2015-11-05
Filing date: 2015-11-05
Publication date: 2018-10-02
Anticipated expiration: 2035-11-05
Also published as: CN105385676A

Abstract

本发明提供了一种解离染色质的方法，该方法包括：将含有染色质的样品与解离剂混合；其中，所述解离剂含有高氯酸锂。本发明还提供了一种提取DNA的方法，其中，该方法包括如下步骤：(1)将含有染色质的样品与解离剂混合均匀，得到解离后的物料；(2)将所述解离后的物料与蛋白抽提液混合均匀，分离得到蛋白抽提后的上清液；(3)将所述蛋白抽提后的上清液与DNA沉淀剂混合，得到DNA沉淀；其中，所述解离剂含有高氯酸锂。本发明还提供了一种高氯酸盐在提取DNA中的用途，其中，所述高氯酸盐为高氯酸锂。本发明的方法具有重复性好，稳定性高的优点，同时避免了蛋白酶K法需要较高温度加热及长时间消化的劣势。

Description

一种提取DNA的方法和解离染色质的方法以及高氯酸盐的用途

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及一种解离染色质的方法、一种提取DNA的方法和高氯酸盐的用途。

背景技术

染色质是遗传物质的载体。染色质是指间期细胞核内由DNA、组蛋白、非组蛋白及少量RNA组成的线性复合结构，是间期细胞遗传物质存在的形式。核小体是组成染色质的基本组成单位，由基因组DNA和5种组蛋白H1、H2A、H2B、H3和H4共同组成。2分子的H2A、H2B、H3和H4共同构成八聚体的核心组蛋白，DNA双螺旋缠绕在这一核心上形成核小体的核心颗粒。核心颗粒间由DNA和组蛋白H1构成的连接区而连接成串珠样结构。在哺乳动物基因组DNA的提取环节中，无论是经典提取方法(酚抽提法、异丙醇沉淀法和甲酰胺裂解法)还是后期改良的方法，通常都是利用表面活性剂，如十二烷基硫酸钠(SDS)来裂解细胞，利用蛋白酶K来降解核小体中的组蛋白，从而实现基因组DNA的分离。然而，由于利用蛋白酶K对组蛋白进行酶解消化，经典方法不仅需要加热设备(如水浴锅)，而且增加了操作步骤，环节繁琐，实验用时长。

盐酸胍、硫氰酸胍、碘化钠和高氯酸钠作为离液剂可以用于DNA的提取。如CN1187196A公开了一种用于提取DNA的方法和装置，涉及了盐酸胍、硫氰酸胍、碘化钠和高氯酸钠的使用，但是，上述离液剂在用于提取基因组DNA时，存在得率低的缺陷。

发明内容

本发明的目的是克服现有用于DNA的提取方法的得率低的缺陷，提供一种具有得率高等优势的DNA提取方法。

为了实现上述目的，一方面，本发明提供了一种解离染色质的方法，该方法包括：将含有染色质的样品与解离剂混合；其中，所述解离剂含有高氯酸锂。

另一方面，本发明还提供了一种提取DNA的方法，所述DNA在提取前存在于染色质中；其中，该方法包括如下步骤：(1)将含有染色质的样品与解离剂混合均匀，得到解离后的物料；(2)将所述解离后的物料与蛋白抽提液混合均匀，分离得到蛋白抽提后的上清液；(3)将所述蛋白抽提后的上清液与DNA沉淀剂混合，得到DNA沉淀；其中，所述解离剂含有高氯酸锂。

再一方面，本发明还提供了一种高氯酸盐在提取DNA中的用途，所述DNA在提取前存在于染色质中，其中，所述高氯酸盐为高氯酸锂。

通过上述技术方案，本发明以化学物质高氯酸锂(LiClO₄)替代蛋白酶K来解离组蛋白和基因组DNA，这种方法具有操作简单、重复性好，稳定性高的优点，同时避免了蛋白酶K法需要较高温度(如50-65℃)加热及长时间消化的劣势。与传统蛋白酶K消化法相比，本发明能高效、快速、简便地提取人类基因组DNA，且基因组完整性更好，可用于PCR、芯片分析、分子克隆等分子生物学相关实验。并且，与使用高氯酸钠进行DNA提取的技术方案相比，本发明具有得率高的优势。

本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

附图说明

附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1是高氯酸锂法(LiClO₄法)和蛋白酶K法两种基因组DNA提取方法提取脐带组织和脐带间充质干细胞基因组DNA的电泳检测结果。

图2是高氯酸锂法(LiClO₄法)中利用不同的LiClO₄终浓度所提取的脐带间充质干细胞基因组DNA的电泳检测结果。

图3是高氯酸锂法(LiClO₄法)和高氯酸钠法(NaClO₄法)两种基因组提取方法的电泳检测结果。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

一方面，本发明提供了一种解离染色质的方法，该方法包括：将含有染色质的样品与解离剂混合；其中，所述解离剂含有高氯酸锂。

其中，将含有染色质的样品与解离剂混合后，高氯酸锂的终浓度可以在较大范围内变化，例如可以为0.1-3.9mol/L，优选为0.25-3.5mol/L，更优选为2-3mol/L。

其中，优选地，所述解离剂含有高氯酸锂的水溶液。

其中，优选地，所述高氯酸锂的水溶液中，高氯酸锂的浓度只要高于高氯酸锂的终浓度即可，例如可以为不低于2mol/L且不高于饱和浓度，优选为不低于4mol/L且不高于饱和浓度。

其中，作为本发明的一种优选实施方式，所述含有染色质的样品中含有裂解液；所述裂解液含有表面活性剂。

其中，所述表面活性剂包括但不限于吐温-20、Triton X-100和NP40中的至少一种。所述裂解液中，所述表面活性剂的浓度可以为0.1-10％体积比，优选为0.5-5％体积比。

其中，所述裂解液中还含有平衡盐、离子螯合剂和RNase A。所述平衡盐包括但不限于Tris-HCl和HEPES中的至少一种。所述离子螯合剂包括但不限于EDTA和柠檬酸钠中的至少一种。所述裂解液中，所述平衡盐的浓度为10-100mmol/L，优选为30-70mmol/L；所述离子螯合剂的浓度为5-40mmol/L，优选为10-30mmol/L；RNase A的浓度为5-40μg/mL，优选为10-30μg/mL。所述裂解液的pH值可以为7.5-8.5。

其中，优选地，所述解离剂含有高氯酸锂的水溶液。

其中，作为本发明的一种优选实施方式，该方法还包括：将含有染色质的生物材料与裂解液混合进行裂解，并且将裂解得到的裂解产物作为含有染色质的样本进行步骤(1)的操作；所述裂解液含有表面活性剂

其中，所述表面活性剂包括但不限于吐温-20、Triton X-100和NP40中的至少一种。所述裂解液中，所述表面活性剂的浓度可以为0.1-10％体积比，优选为0.5-5％体积比。其中，所述裂解液中还含有平衡盐、离子螯合剂和RNase A。所述平衡盐包括但不限于Tris-HCl和HEPES中的至少一种。所述离子螯合剂包括但不限于EDTA和柠檬酸钠中的至少一种。所述裂解液中，所述平衡盐的浓度为10-100mmol/L，优选为30-70mmol/L；所述离子螯合剂的浓度为5-40mmol/L，优选为10-30mmol/L；RNase A的浓度为5-40μg/mL，优选为10-30μg/mL。所述裂解液的pH值可以为7.5-8.5。

其中，该方法还可以进一步包括：将原始生物材料进行预处理，以获得适合直接用于裂解的含有染色质的生物材料。所述预处理的操作包括清洗、干燥、剪碎、研磨、冷冻和冻融中的至少一种。可以按照本领域常规的方式进行预处理的操作，例如按照《分子克隆实验指南》中记载的内容进行操作。

其中，所述原始生物材料可以包括组织、器官、个体和共生体中的至少一种。所述含有染色质的生物材料可以包括血液、血细胞和人工培养细胞中的至少一种。

其中，该方法还包括：将所述DNA沉淀进行洗涤和再溶解。其中，进行洗涤所用的洗涤液可以为60-80体积％浓度的乙醇水溶液，进行再溶解所用的溶剂可以为水或TE缓冲液。

以下通过实施例进一步详细说明本发明。

实施例1：

本实施例用于说明从细胞样品中提取DNA的操作。

(1)样品预处理：以脐带间充质干细胞为例，将培养瓶中的脐带间充质干细胞经PBS洗涤一次后，用胰酶消化，收集细胞悬液后，计数，取约为2.5×10⁵个细胞的悬液，1000g离心5min，弃上清，用1mL预冷的PBS重悬细胞并转入1.5mL EP管中，1000g离心5min，弃上清，用50μL TE缓冲液重悬细胞；

(2)分别采用高氯酸锂法以及经典的蛋白酶K法两种方法提取：向步骤(1)的EP管中加入500μL裂解液，充分混匀。其中高氯酸锂法裂解液配方为：Tris-HCl(pH 8.0)(50mmol/L)、EDTA(20mmol/L)、Tween-20(1％(v/v))、RNase A(20μg/mL)；蛋白酶K法的裂解配方为：Tris-HC1(pH 8.0)(10mmol/L)、EDTA(pH8.0)(100mmol/L)、SDS(0.5％(m/V))；

(3)向步骤(2)的EP管中分别加入终浓度为3mol/L的蛋白变性剂LiClO₄以及100μg/mL蛋白酶K，振荡混匀，其中加入蛋白酶K法需要在55℃放置2h，其余步骤相同；

(4)向步骤(3)的EP管中加入等体积苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)，振荡混匀，离心至溶液分层，将上层液体转移至另一洁净的EP管中。可重复本步骤一次，并用氯仿抽提一次上清，将上清转移至另一洁净的EP管中；

(5)向步骤(4)的EP管中加入等体积的异丙醇，-20℃放置20min，离心收集基因组DNA；

(6)向步骤(5)的EP管中加入1mL的70％乙醇洗涤DNA，去上清，敞口晾干基因组；

(7)向步骤(6)的EP管中加入100μL TE缓冲液，溶解基因组DNA沉淀。利用光密度测定法测定基因组DNA的浓度，利用琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA的完整性。

实施例2：

本实施例用于说明从脐带组织中提取DNA的操作。

(1)样品预处理：用生理盐水漂洗脐带组织，除去血液，滤纸拭干，剪取200mg左右的小块，放入用液氮预冷的研钵中，加入液氮，迅速将组织研磨成均一粉末，一分为二，放置于EP管中备用；

(2)分别采用高氯酸锂法以及经典的蛋白酶K法两种方法提取：向步骤(1)的EP管中加入500μL裂解液，充分混匀。其中高氯酸锂法裂解液配方可以为：Tris-HCl(pH 8.0)(50mmol/L)、EDTA(20mmol/L)、Tween-20(1％(v/v))、RNase A(20μg/mL)；蛋白酶K法的裂解配方为：Tris-HC1(pH 8.0)(10mmol/L)、EDTA(pH8.0)(100mmol/L)、SDS(0.5％(m/V))；

(3)向步骤(2)的EP管中分别加入终浓度为3mol/L的蛋白变性剂LiClO₄以及

100μg/mL蛋白酶K，振荡混匀，其中加入蛋白酶K法需要在55℃放置2h，其余步骤相同；

实施例3：

本实施例用于说明梯度高氯酸锂法提取细胞DNA的操作。

(2)向步骤(1)的EP管中加入500μL裂解液，充分混匀。其中裂解液配方为：Tris-HCl(pH 8.0)(50mmol/L)、EDTA(20mmol/L)、Tween-20(1％(v/v))、RNase A(20μg/mL)；

(3)向步骤(2)的EP管中分别加入终浓度为0.25-3.5mol/L的7个梯度的蛋白变性剂LiClO₄，振荡混匀；

(7)向步骤(6)的EP管中加入500μL TE缓冲液，溶解基因组DNA沉淀。利用光密度测定法测定基因组DNA的浓度，利用琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA的完整性。

对比例1

按照实施例1的方法进行提取DNA的操作，不同的是，将高氯酸锂替换为高氯酸钠。

对比例2

按照实施例2的方法进行提取DNA的操作，不同的是，将高氯酸锂替换为高氯酸钠。

测试实施例1

将实施例1-3和对比例1-2提取的人基因组DNA的纯度和浓度进行汇总，结果如表1所示。

表1

根据表1的数据可见，本发明以化学物质高氯酸锂(LiClO₄)替代蛋白酶K来解离组蛋白和基因组DNA，这种方法所提DNA的得率约为蛋白酶K法的3倍，同时避免了蛋白酶K法需要较高温度(如50-65℃)加热及长时间消化的劣势。与传统蛋白酶K消化法相比，本发明能高效、快速、简便地提取人类基因组DNA，可用于PCR、芯片分析、分子克隆等分子生物学相关实验。与使用高氯酸钠进行DNA提取的技术方案相比，本发明具有得率较高的优势，高氯酸锂法所提DNA的得率约为高氯酸钠法的3倍。

将实施例1-3和对比例1-2提取的人基因组DNA进行电泳检测，结果如图1，图2和图3所示。其中：

图1是高氯酸锂法(LiClO₄法)和蛋白酶K法两种基因组DNA提取方法提取脐带组织和脐带间充质干细胞基因组DNA的电泳检测结果。M为DNA marker(分子量自上而下分别为：15000、1000、7500、5000、2500、2000、1000、750、500、250、100，单位为bp)，泳道1为LiClO₄法提取的脐带间充质干细胞基因组DNA，泳道2为蛋白酶K法提取的脐带间充质干细胞基因组DNA。泳道3为LiClO₄法提取的脐带基因组DNA，泳道4为蛋白酶K法提取的脐带基因组DNA。根据图1可见，LiClO₄法提取的基因组浓度比蛋白酶K法所提取的基因组浓度更高，蛋白污染较少。

图2是高氯酸锂法(LiClO₄法)中利用不同的LiClO₄终浓度所提取的脐带间充质干细胞基因组DNA的电泳检测结果。M为DNA marker(分子量自上而下分别为：15000、1000、7500、5000、2500、2000、1000、750、500、250、100，单位为bp)，泳道1-7分别为终浓度为0.25mol/L、1mol/L、1.5mol/L、2mol/L、2.5mol/L、3mol/L和3.5mol/L的LiClO₄所提取的脐带间充质干细胞的基因组DNA。根据图2可见，利用LiClO₄法提取基因组时，LiClO₄的较优终浓度为1.5-3.5mol/L，特别优选的浓度为2-3mol/L。

图3是高氯酸锂法(LiClO₄法)和高氯酸钠法(NaClO₄法)两种基因组提取方法的电泳检测结果。M为DNA marker(分子量自上而下分别为：15000、1000、7500、5000、2500、2000、1000、750、500、250、100，单位为bp)，泳道1为LiClO₄法提取的脐带间充质干细胞基因组DNA，泳道2为NaClO₄法提取的脐带间充质干细胞基因组DNA。泳道3为LiClO₄法提取的脐带基因组DNA，泳道4为NaClO₄法提取的脐带基因组DNA。根据图3可见，LiClO₄法提取的基因组DNA浓度比NaClO₄法提取的基因组DNA浓度更高。

以上结合附图详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims

1.一种解离染色质的方法，该方法包括：将含有染色质的样品与解离剂混合；其特征在于，所述解离剂含有高氯酸锂；将含有染色质的样品与解离剂混合后，高氯酸锂的终浓度为2-3mol/L，所述含有染色质的样品为脐带间充质干细胞或脐带组织。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述含有染色质的样品中含有裂解液；所述裂解液含有表面活性剂。

3.一种提取DNA的方法，所述DNA在提取前存在于染色质中；其中，该方法包括如下步骤：

(1)将含有染色质的样品与解离剂混合均匀，得到解离后的物料；

(2)将所述解离后的物料与蛋白抽提液混合均匀，分离得到蛋白抽提后的上清液；

(3)将所述蛋白抽提后的上清液与DNA沉淀剂混合，得到DNA沉淀；

其特征在于，所述解离剂含有高氯酸锂；将含有染色质的样品与解离剂混合后，高氯酸锂的终浓度为2-3mol/L，所述含有染色质的样品为脐带间充质干细胞或脐带组织。

4.根据权利要求3所述的方法，其中，该方法还包括：将含有染色质的生物材料与裂解液混合进行裂解，并且将裂解得到的裂解产物作为含有染色质的样本进行步骤(1)的操作；所述裂解液含有表面活性剂。

5.根据权利要求3或4所述方法，其中，该方法还包括：将所述DNA沉淀进行洗涤和再溶解。