WO2014061819A1 - 相補的ｄｎａの合成方法 - Google Patents

相補的ｄｎａの合成方法 Download PDF

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WO2014061819A1
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重孝 三森
亮大郎 三股
健太郎 坂井
大介 黒澤
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デンカ生研株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay

Definitions

  • the present invention relates to a method for synthesizing complementary DNA, and more particularly to a method for synthesizing complementary DNA in which complementary DNA is efficiently synthesized from double-stranded RNA.
  • Viruses classified into the Reoviridae family such as ARV (avian Orthooreovirus) have a unique structure of double-stranded RNA (dsRNA) in their genomic genes.
  • dsRNA double-stranded RNA
  • the primer cannot efficiently bind to the target site of the genome because hydrogen bonds are formed between the template RNAs.
  • the synthesis efficiency of is low. Therefore, when genetic testing (genome detection) of double-stranded RNA virus is applied to surveillance (survey of epidemic status) and testing, it may lead to a decrease in detection sensitivity and oversight (false negative) due to a decrease in synthesis efficiency. There is.
  • primer binding is promoted by a treatment (denaturation treatment) different from the case of single-stranded RNA, or virus or extraction
  • a treatment denaturation treatment
  • virus or extraction By concentrating the virus genome, it is necessary to increase the concentration of the genome serving as a template to compensate for the decrease in complementary DNA synthesis efficiency.
  • Non-Patent Document 1 dimethyl sulfoxide (DMSO) is added to a virus genome solution to reduce the hydrogen bond binding force of the virus genome, and then heat treatment and rapid cooling at 97 ° C. The method is described.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • DMSO may affect the activities of reverse transcriptase and DNA polymerase in the complementary DNA synthesis reaction and the subsequent PCR reaction. Moreover, since DMSO may have cytotoxicity, it is preferable to refrain from using it.
  • Non-Patent Document 2 describes a technique in which Forward primer is added to the extracted viral genome solution, heat-treated at 99 ° C., and then rapidly cooled, but this technique improves the efficiency of synthesis of complementary DNA strands. Was desired.
  • complementary DNA synthesis reverse transcription
  • amplification of a reverse transcription product using a double-stranded RNA such as a reovirus genome as a template can be efficiently performed without adding DMSO or concentrating the virus genome solution.
  • the inventors of the present invention contrary to the expectation that high temperature and long time are more effective for denaturing the template double-stranded RNA by heating, Surprisingly, by using a denaturing condition that a mixture of double-stranded RNA and primer is heated at a temperature of 95 ° C. or higher and then rapidly cooled, then heated again at a lower temperature of less than 90 ° C. and then rapidly cooled, It has been found that the binding of a primer to RNA is promoted and the synthesis efficiency of complementary DNA can be improved.
  • the present invention relates to the following (i) to (vi).
  • (I) A method for synthesizing complementary DNA using double-stranded RNA as a template, wherein a mixed solution of double-stranded RNA and a primer extracted from a sample is heated at a temperature of 95 ° C. or higher and then rapidly cooled.
  • a method of synthesizing complementary DNA comprising sequentially performing a step, (2) a step of heating at a temperature of less than 90 ° C. followed by a rapid cooling, followed by synthesis of single-stranded DNA using reverse transcriptase.
  • (Ii) The method according to (i), wherein the heating temperature in the step (1) is 95 ° C. or higher and lower than 110 ° C.
  • the efficiency of synthesis of complementary DNA is increased by promoting primer binding by denaturation treatment of double-stranded RNA only by heating and quenching treatment without adding DMSO or the like and concentrating. Can be improved. Furthermore, since only the heating and quenching processes are performed, there is no risk of loss of the viral genome.
  • the RNA used as a template is a double-stranded RNA, such as the genome of a virus classified as a reoviridae having a double-stranded RNA in the genome.
  • viruses belonging to the family Reoviridae include viruses of the genus Reovirus, the genus Rotavirus, the genus Orbivirus, the genus Cortivirus, and the genus Orthoreovirus.
  • the sample used in the present invention is not particularly limited as long as it contains double-stranded RNA.
  • samples include biological samples (blood, lymph, urine, cells, tissues, etc.), biological samples, environmental samples, environmental samples, excrement samples, excrement samples, and the like.
  • the method for extracting the double-stranded RNA from the sample is not particularly limited, and for example, a denaturing agent such as phenol or chloroform is added to the sample, and extraction is performed by centrifugation or the like.
  • a denaturing agent such as phenol or chloroform
  • commercially available RNA extraction / purification kits for example, RNA extraction kits such as RNid method (BIO1010, Inc. Funakoshi Co., Ltd.) and Isogen LS method (Nippon Gene Co., Ltd.) can be used.
  • the double-stranded RNA extracted as described above and a primer are mixed to form a mixed solution, and (1) a step of rapid cooling after heating at a temperature of 95 ° C. or higher, (2) heating at a temperature of less than 90 ° C. Thereafter, a rapid cooling step is sequentially performed, and then single-stranded DNA is synthesized using reverse transcriptase.
  • the primer mixed with the double-stranded RNA is designed to anneal to the RNA of interest, and preferably designed so that it can be amplified using complementary DNA as a template. Is.
  • Step (1) The heat treatment in this step is performed at a temperature of 95 ° C. or higher in the presence of a primer.
  • the heating temperature is preferably 97 ° C or higher, and the temperature range is preferably 95 ° C or higher and lower than 110 ° C, more preferably 97 to 100 ° C.
  • the treatment time can be, for example, about 1 to 60 minutes, preferably 3 to 30 minutes, and more preferably 5 to 10 minutes.
  • the heat-treated mixture is quenched.
  • "rapid cooling” means to remove heat and quickly lower to a predetermined temperature, and any method may be used.
  • a solvent or metal block cooled to a target temperature This can be done by bringing the reaction vessel into direct contact.
  • the cooling temperature is preferably a non-freezing temperature of 10 ° C. or lower, more preferably a temperature of 4 ° C. or lower, and a temperature range of preferably 10 to 0 ° C., more preferably 4 to 1 ° C.
  • the treatment time can be, for example, about 1 to 60 minutes, preferably 3 to 30 minutes, and more preferably 5 to 15 minutes.
  • the double-stranded RNA can be dissociated by the heat treatment in this step (1), and the primer can be efficiently bound to the part dissociated by the rapid cooling treatment.
  • Step (2) Step The heat treatment in this step is performed at a temperature of less than 90 ° C.
  • the heating temperature is preferably 70 ° C. or lower, and the temperature range is preferably 50 ° C. or higher and lower than 90 ° C., more preferably 60 to 70 ° C.
  • the treatment time can be, for example, about 1 to 60 minutes, preferably 3 to 30 minutes, and more preferably 5 to 15 minutes.
  • the cooling temperature is preferably 10 ° C. or lower, more preferably 4 ° C. or lower, and the temperature range is preferably 10 to 0 ° C., more preferably 4 to 1 ° C.
  • the treatment time can be, for example, about 1 to 60 minutes, preferably 3 to 30 minutes, and more preferably 5 to 15 minutes.
  • ⁇ Efficient reverse transcription reaction can be achieved by the denaturation of the higher order structure of RNA under mild conditions by the heating and rapid cooling treatment in this step (2).
  • the complementary DNA synthesis reaction is not particularly limited.
  • a reverse transcription reaction solution such as pH buffer, salts, deoxyribonucleotides, and reverse transcriptase is added to the treated RNA, and the reaction is performed at about 37 ° C.
  • the synthesis can be performed by incubating in a hot water bath for 30 to 90 minutes.
  • the reverse transcriptase include reverse transcriptases derived from retroviruses such as Moloney Murine Leukemia Virus (M-MVL), Avian Myeloblastosis Virus (AMV), and Rous associated virus (RAV).
  • M-MVL Moloney Murine Leukemia Virus
  • AMV Avian Myeloblastosis Virus
  • RAV Rous associated virus
  • DNA obtained using the obtained complementary DNA as a template is amplified by PCR (RT-PCR) or the like.
  • RT-PCR PCR
  • complementary DNA synthesis and DNA amplification may be performed in separate reaction systems or in the same reaction system.
  • the PCR reaction solution can contain, for example, a pH buffer solution, salts, primers, deoxyribonucleotides, and heat-resistant DNA polymerase.
  • the thermostable DNA polymerase used for PCR is a polymerase with excellent thermostability that synthesizes DNA using a primer as a base, and examples thereof include Taq DNA polymerase derived from Thermus aquaticus.
  • combination of complementary DNA can be used, In that case, in order to prevent depletion of a primer, it can add to PCR reaction solution.
  • a method for detecting the amplified DNA is not particularly limited, and can be performed by a known method using electrophoresis of polyacrylamide or agarose gel, ethidium bromide staining, cyber green staining, etc.
  • electrophoresis has a known molecular weight.
  • the target amplification product can be identified based on the mobility of the marker with respect to the mobility of the marker.
  • the detection method of the present invention can improve the efficiency of synthesizing complementary DNA, and can be widely applied to reovirus nucleic acid detection methods and genotyping.
  • Example 1 Synthesis of complementary DNA (1) From avian reovirus grown on CK cells, a viral genome was extracted using QIAamp MinElute Virus Spin kit (QIAGEN). The extraction method is as follows. First, 0.2 mL of a sample is placed in a sterilized tube (1.5 mL), an equal volume of Lysis Buffer and 25 ⁇ L of QIAGEN Protease are added, and the mixture is stirred for 15 seconds with a vortex mixer, and then placed in a 56 ° C. water bath. Left for 15 minutes. After standing for 15 minutes, add 0.25 mL of 100% ethanol (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and let stand for 5 minutes at room temperature.
  • QIAGEN QIAamp MinElute Virus Spin kit
  • Comparative Example 4 double-stranded RNA was dissociated by heating and cooling treatment after addition of DMSO, and a reverse transcription reaction was performed by adding ForwardRNAPrimer and Reverse ⁇ Primer to the dissociated RNA.
  • Example 1 From the results shown in FIGS. 1 and 2, in Example 1, the band of 626 bp can be most clearly confirmed with respect to Comparative Examples 1 to 5, and particularly in Comparative Example 4 in which DMSO is added and heat treatment at 97 ° C., which is a conventional method. Even when compared, it can be seen that the amount of cDNA synthesis is improved.
  • Example 2 Complementary DNA synthesis of rotavirus genome Virus genome was extracted from human rotavirus (Group A rotavirus, Wa strain) using High Pure Viral RNA Kit.
  • the extraction method was as follows. First, 0.2 mL of a sample was placed in a sterilized tube (1.5 mL), an equal amount of Working solution and 50 ⁇ L of Proteinase K were added, and the mixture was stirred with a vortex mixer and then allowed to stand at 72 ° C. for 10 minutes. . After standing for 10 minutes, the specimen was returned to room temperature, 100 ⁇ L of binding buffer was added, and the mixture was stirred with a vortex mixer. It was added to the spin column and centrifuged at 8,000 ⁇ g for 1 minute.
  • the flow-through was removed and 500 ⁇ L of Inhibitor Removal buffer was added to the spin column and centrifuged at 8,000 ⁇ g for 1 minute.
  • the flow-through was removed, 450 ⁇ L of Washing buffer was added to the spin column, centrifuged at 8,000 ⁇ g for 1 minute, and the same operation was repeated.
  • the flow-through was removed and the column was dried by centrifuging at 13,000 xg for 10 seconds. After adding 50 ⁇ L of Elution buffer and allowing to stand at room temperature for 1 minute, the extract obtained by centrifugation at 8,000 ⁇ g for 1 minute was recovered and used as a virus genome.
  • Random Hexamers (Invitrogen) and 10 mM dNTPs (Invitrogen) are added to the extracted viral genome, and the same heat treatment as in Example 1 and Comparative Examples 1 to 5 is performed (Example 2 and Comparative Examples 6 to 10, respectively). ), followeded by cDNA synthesis reaction. Thereafter, the following amplification reaction in which a solution containing Forward Primer (5′-GGCTTTAAAAGAGAGAATTTCCGTCTGG-3 ′: SEQ ID NO: 3) and Reverse Primer (5′-GGTCACATCATACAATTCTAATCTAAG-3 ′: SEQ ID NO: 4) was added to the obtained reverse transcription reaction solution.
  • a solution containing Forward Primer (5′-GGCTTTAAAAGAGAGAATTTCCGTCTGG-3 ′: SEQ ID NO: 3
  • Reverse Primer 5′-GGTCACATCATACAATTCTAATCTAAG-3 ′: SEQ ID NO: 4
  • the solution was subjected to cDNA amplification reaction using Platinum Taq DNA Polymerase (Invitrogen).
  • the amplification reaction conditions were as follows: treatment at 94 ° C. for 2 minutes, treatment at 94 ° C. for 30 seconds ⁇ 55 ° C. for 60 seconds ⁇ 72 ° C. for 90 seconds, and finally polymerization at 72 ° C. for 7 minutes.
  • Electrophoresis was performed in the same manner as in Example 1.
  • Example 2 From the results of FIG. 3, in Example 2, the band of 1062 bp can be most clearly confirmed with respect to Comparative Examples 6 to 10, and the cDNA synthesis efficiency is improved particularly compared with Comparative Example 9 which is a conventional method. I understand that.

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Abstract

　二本鎖ＲＮＡウイルスを効率よく逆転写及び逆転写産物の増幅が可能な方法を提供する。　二本鎖ＲＮＡを鋳型として相補的ＤＮＡを合成する方法であって、試料から抽出した二本鎖ＲＮＡとプライマーの混合液を、（１）９５℃以上の温度で加熱した後急冷する工程、（２）９０℃未満の温度で加熱した後急冷する工程、を順次行った後、逆転写酵素を用いて一本鎖ＤＮＡを合成することを特徴とする。

Description

相補的ＤＮＡの合成方法
　本発明は、相補的ＤＮＡの合成方法、より詳細には二本鎖ＲＮＡから効率的に相補的ＤＮＡを合成する相補的ＤＮＡの合成方法に関する。
　ＡＲＶ（avian Orthoreovirus）などレオウイルス科に分類されるウイルスは、そのゲノム遺伝子が二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）という特有の構造を有する。二本鎖ＲＮＡウイルスを鋳型とした相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の合成は、鋳型ＲＮＡ間で水素結合が形成されているためプライマーがゲノムの標的部位に効率よく結合することができず、相補的ＤＮＡの合成効率が低くなる。そのため、サーベイランス（流行状況調査）や検査に、二本鎖ＲＮＡウイルスの遺伝子検査（ゲノム検出）を応用する場合には、合成効率の低下に伴う検出感度の低下や見逃し（偽陰性）に繋がるおそれがある。その問題を解決するためには、二本鎖ＲＮＡウイルスを鋳型とした相補的ＤＮＡの合成において、一本鎖ＲＮＡの場合とは異なる処理（変性処理）によりプライマーの結合を促す、若しくはウイルス又は抽出したウイルスゲノムを濃縮することにより、鋳型となるゲノム濃度を増加させて、相補的ＤＮＡ合成効率の低下を補う必要がある。
　このような変性処理として、非特許文献１には、ウイルスゲノム溶液にジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を添加して、ウイルスゲノムの水素結合の結合力を低下させた後に、９７℃で加熱処理及び急冷する手法が記載されている。
　しかしながら、ＤＭＳＯの添加は、相補的ＤＮＡの合成反応やその後のＰＣＲ反応において、逆転写酵素及びＤＮＡポリメラーゼの活性に対して抑制等の影響を及ぼす可能性がある。また、ＤＭＳＯは細胞毒性等を有する可能性があるため、その使用を控えることが好ましい。
　非特許文献２には、抽出したウイルスゲノム溶液にForward primerを加えて、９９℃にて加熱処理した後に、急冷する手法が記載されているが、当該手法では相補的ＤＮＡ鎖の合成効率の向上が望まれた。
　また、ウイルス又は抽出したウイルスゲノムを濃縮してＤＮＡ合成効率の低下を補うことにより、鋳型となるゲノム濃度を増加させる手法がある。当該手法では、ウイルス又は抽出したウイルスゲノムを濃縮する工程が労力を要するとともに、ウイルスゲノムの濃縮で一般的に用いられる有機溶媒の沈殿ではウイルスゲノムを減損する懸念される。また、検体が低用量である場合には、濃縮効率が低下するおそれがある。
ウイルス下痢症検査マニュアル（第三版） J. Virol Method 177 (2011) 75-79
　本発明は、ＤＭＳＯ添加やウイルスゲノム溶液の濃縮操作を用いることなく、レオウイルスゲノムのような二本鎖ＲＮＡを鋳型とした相補的ＤＮＡ合成（逆転写）及び逆転写産物の増幅が、効率的に行われる相補的ＤＮＡ合成方法を提供することに関する。
　本発明者らは二本鎖ＲＮＡの解離及びプライマーの結合条件を検討した結果、加熱による鋳型二本鎖ＲＮＡの変性には高温、長時間の方が、効果が高いと考えられる予想に反し、二本鎖ＲＮＡとプライマーの混合液を、９５℃以上の温度で加熱した後急冷した後、より低温の９０℃未満で再度加熱後急冷するという変性条件を用いることにより、驚くべき事に、当該ＲＮＡへのプライマーの結合が促進され、相補的ＤＮＡの合成効率を向上させることができることを見出した。
　すなわち本発明は、以下の（ｉ）～（ｖｉ）に係るものである。
　（ｉ）二本鎖ＲＮＡを鋳型として相補的ＤＮＡを合成する方法であって、試料から抽出した二本鎖ＲＮＡとプライマーの混合液を、（１）９５℃以上の温度で加熱した後急冷する工程、（２）９０℃未満の温度で加熱した後急冷する工程、を順次行った後、逆転写酵素を用いて一本鎖ＤＮＡを合成することを特徴とする相補的ＤＮＡの合成方法。
　（ｉｉ）前記工程（１）における加熱温度が、９５℃以上１１０℃未満である（ｉ）に記載の方法。
　（ｉｉｉ）前記工程（２）における加熱温度が、５０℃以上９０℃未満である（ｉ）又は（ｉｉ）に記載の方法。
　（ｉｖ）二本鎖ＲＮＡが、レオウイルスゲノムである（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれかに記載の方法。
　（ｖ）下記（１）～（４）の工程を含む試料中の二本鎖ＲＮＡを検出する方法。（１）試料から二本鎖ＲＮＡを抽出する工程、（２）前記工程（１）で得られた二本鎖ＲＮＡとプライマーの混合液を、９５℃以上の温度で加熱した後急冷し、次いで９０℃未満の温度で加熱した後急冷し、次いで逆転写酵素を用いて一本鎖ＤＮＡを合成する工程、（３）前記工程（２）で得られた一本鎖ＤＮＡを増幅する工程、（４）前記工程（３）で得られた増幅産物を検出する工程
　（ｖｉ）二本鎖ＲＮＡが、レオウイルスゲノムである（ｖ）に記載の方法。
　本発明の合成方法では、ＤＭＳＯ等の添加や濃縮操作を行うことなく、加熱及び急冷処理のみで二本鎖ＲＮＡの変性処理によりプライマーの結合を促して、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の合成効率を向上させることができる。更に加熱及び急冷の処理のみを行うため、ウイルスゲノムの減損が生じるおそれがない。
増幅産物原液による電気泳動の結果を示す図である。 増幅産物１０倍希釈溶液による電気泳動の結果を示す図である。 増幅産物による電気泳動の結果を示す図である。
　本発明において、鋳型として用いられるＲＮＡは、二本鎖ＲＮＡであり、例えば二本鎖ＲＮＡをゲノムに持つレオウイルス科に分類されるウイルスの当該ゲノム等が挙げられる。なおレオウイルス科のウイルスとしては、レオウイルス属、ロタウイルス属、オルビウイルス属、コルチウイルス属、オルトレオウイルス属等のウイルスが挙げられる。
　本発明において用いられる試料としては、二本鎖ＲＮＡを含有するものであれば特に限定されない。このような試料として、生体試料（血液、リンパ液、尿、細胞、組織等）、生体由来試料、環境試料、環境由来試料、排泄物試料、排泄物由来試料などが挙げられる。
　試料から二本鎖ＲＮＡを抽出する方法は、特に限定されず、例えばフェノール、クロロホルム等の変性剤を試料に添加し、遠心分離等により抽出することが挙げられる。また、市販のＲＮＡ抽出・精製キット、例えばＲＮａｉｄ法（ＢＩＯ１０１０，Ｉｎｃ．フナコシ株式会社）、ＩｓｏｇｅｎＬＳ法（ニッポンジーン社）等のＲＮＡ抽出キットを用いることができる。
　本発明の方法では、上記により抽出した二本鎖ＲＮＡとプライマーを混合して混合液とし、（１）９５℃以上の温度で加熱した後急冷する工程、（２）９０℃未満の温度で加熱した後急冷する工程、を順次行った後、逆転写酵素を用いて一本鎖ＤＮＡが合成される。
　ここで、二本鎖ＲＮＡと混合するプライマーは、対象となるＲＮＡに対してアニーリングするようにデザインされたものであり、好ましくは更に相補的ＤＮＡを鋳型としてこれを増幅可能なように設計されたものである。
上記（１）工程
　本工程の加熱処理は、プライマーの存在下９５℃以上の温度で行われる。
　加熱温度は好ましくは９７℃以上であり、温度範囲としては好ましくは９５℃以上１１０℃未満、より好ましくは９７～１００℃である。処理時間は、例えば１～６０分程度、好ましくは３～３０分、より更に好ましくは５～１０分とすることができる。
　加熱処理した混合物を急冷処理する。
　本発明において、「急冷」とは除熱をして所定の温度まで速やかに下げることであり、いずれの方法を用いても良いが、例えば氷上、目的の温度に冷却した溶媒若しくは金属ブロックに、反応容器を直接接触させることで行うことができる。
　冷却温度は好ましくは１０℃以下の凍結しない温度、より好ましくは４℃以下の凍結しない温度であり、温度範囲としては好ましくは１０～０℃、より好ましくは４～１℃である。処理時間は、例えば１～６０分程度、好ましくは３～３０分、より更に好ましくは５～１５分とすることができる。
　本工程（１）の加熱処理により、二本鎖ＲＮＡを解離させ、急冷処理により解離した部分にプライマーを効率的に結合させることができる。
上記（２）工程
　本工程の加熱処理は、９０℃未満の温度で行われる。
　加熱温度は好ましくは７０℃以下であり、温度範囲としては好ましくは５０℃以上９０℃未満、より好ましくは６０～７０℃である。処理時間は、例えば１～６０分程度、好ましくは３～３０分、より更に好ましくは５～１５分とすることができる。
　上記温度にすることにより、９５℃以上の加熱による鋳型ＲＮＡの分解を防ぎ且つ鋳型となるＲＮＡの高次構造を変性して逆転写効率を向上させることができる。
　冷却温度は好ましくは１０℃以下、より好ましは４℃以下であり、温度範囲としては好ましくは１０～０℃、より好ましくは４～１℃である。処理時間は、例えば１～６０分程度、好ましくは３～３０分、より更に好ましくは５～１５分とすることができる。
　上記急冷処理により、変性したＲＮＡの高次構造が元の構造に戻ることなく、変性した状態を維持することができる。
　本工程（２）の加熱・急冷処理により、穏やかな条件でＲＮＡの高次構造の変性を実施することができることで効率的な逆転写反応を達成できる。
　相補的ＤＮＡの合成反応は、特に限定されないが、例えば上記処理したＲＮＡに対して、ｐＨ緩衝液、塩類、デオキシリボヌクレオチド類、及び逆転写酵素等の逆転写反応液を添加して、約３７℃の湯浴等で３０～９０分間インキュベートすることにより合成を行うことができる。
　なお逆転写酵素としては、例えばMoloney Murine Leukemia Virus（Ｍ－ＭＶＬ）、Avian Myeloblastosis Virus（ＡＭＶ）、Rous associated virus（ＲＡＶ）等のレトロウイルス由来の逆転写酵素等を挙げることができる。
　本発明における試料中の二本鎖ＲＮＡの検出方法においては、上述した相補的ＤＮＡの合成に続いて、得られた相補的ＤＮＡを鋳型としたＤＮＡがＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）等により増幅されるが、相補的ＤＮＡの合成及びＤＮＡの増幅は、別々の反応系又は同一の反応系で行ってもよい。
　なおＰＣＲ反応液には、例えばｐＨ緩衝液、塩類、プライマー、デオキシリボヌクレオチド類、及び耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含むことできる。ＰＣＲに使用する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、プライマーを基点としてＤＮＡを合成する耐熱性にすぐれたポリメラーゼであり、例えばThermus aquaticus由来のＴａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ等を挙げることができる。
　また、プライマーは、相補的ＤＮＡの合成に使用したものを用いることができ、その場合には、プライマーの枯渇を防ぐためにＰＣＲ反応溶液中に追添することができる。
　増幅されたＤＮＡの検出方法としては、特に限定されないが、ポリアクリルアミド又はアガロースゲルの電気泳動、エチジウムブロマイド染色やサイバーグリーン染色等を用いた既知の方法で行うことができ、例えば電気泳動では既知分子量のマーカーの移動度に対しての、それの移動度に基づいて、目的の増幅産物を同定することができる。
　本発明の検出方法では、相補的ＤＮＡの合成効率を向上させることができ、レオウイルスの核酸検出法及び遺伝子タイピング等に広く応用可能である。
　以下に実施例により本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。
実施例１：相補的ＤＮＡの合成
（１）ＣＫ細胞にて増殖したトリレオウイルスより、QIAamp MinElute Virus Spin kit（QIAGEN社）を用いてウイルスゲノムを抽出した。
　　抽出方法は、まず滅菌チューブ（１．５ｍＬ）に検体０．２ｍＬを入れ、等量のLysis Buffer及び２５μＬのQIAGEN Proteaseを加えてボルテクスミキサーにて１５秒間攪拌した後、５６℃の湯浴中にて１５分間静置した。１５分間の静置後、更に０．２５ｍＬの１００％エタノール（和光純薬工業社）を加えて、室温で５分間静置して、この全量をスピンカラムに加えて、６，０００×ｇにて１分間遠心分離した。フロースルー溶液を取り除き、５００μＬのBuffer AW1をスピンカラムに加えて、６，０００×ｇにて１分間遠心分離した。フロースルー溶液を取り除き、５００μＬのBuffer AW2をスピンカラムに加えて、６，０００×ｇにて１分間遠心分離した。フロースルー溶液を取り除き、５００μＬの１００％エタノールをスピンカラムに加えて、６，０００×ｇにて１分間遠心分離した。フロースルー溶液を取り除き、１５，０００×ｇにて３分間遠心分離によりメンブレンを乾燥させた。５０μＬのBuffer AVEをスピンカラムに加えて室温にて１分間静置した後、１４，０００ｒｐｍにて１分間遠心分離により得られた抽出液を回収して、これをウイルスゲノムとした。
（２）（１）で抽出したウイルスゲノムに、１０ｍＭ　ｄNTPｓ（Invitrogen社）及びS2 gene領域に結合するForward Primer（5’-ACT TCT TYT CTA CGC CTT TCG-3’：配列番号１）及びReverse Primer（5’-ATY AAW DCW CGC ATC TGC TG-3’：配列番号２）を添加して、９９℃５分間→４℃２分間→６５℃５分間→４℃２分間の処理をした。
（３）（２）で得られた処理溶液に、SuperScript III First-Strand Synthesis System（Invitrogen社）を含む下記逆転写反応液を添加して、ｃＤＮＡ合成反応を行った。逆転写反応の反応条件は５５℃、６０分でまず行い、その後９４℃、２分で逆転写酵素を不活化した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
（４）その後、Platinum Taq DNA Polymerase（Invitrogen社）を含む下記増幅反応液を添加して、ｃＤＮＡの増幅反応を行った。
　なお、反応条件は９４℃２分間処理後、９４℃３０秒→５５℃３０秒→７２℃９０秒の処理を４０サイクル行い、最後に７２℃７分間のポリメライゼーションを行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
（５）ｃＤＮＡ増幅反応後、１．５％アガロースゲルにより約９０分間の電気泳動及びサイバーグリーン(Invitrogen社)染色にて、各条件の増幅産物量を測定した。その結果を図１、２に示す。
　電気泳動は、1.5% Agarose（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社）を使用し、Tris Acetate-EDTA buffer（0.04M Tri-004M Acetic acid -0.001M EDTA, pH8）で１００Ｖ約９０分間電気泳動後，ルミノイメージアナライザーＬＡＳ－３０００（ＧＥヘルスケア社）にてバンドのサイズを確認した。
　また、比較例１～５は、実施例１（２）における９９℃５分間→４℃２分間→６５℃５分間→４℃２分間の条件を、９９℃５分間→４℃２分間（比較例１）、９９℃５分間→４℃２分間→９９℃５分間→４℃２分間（比較例２）、９９℃１０分間→４℃２分間（比較例３）、１０％ＤＭＳＯ添加９７℃５分間→４℃２分間の熱処理（比較例４）、及び非処理（比較例５）に変更し、実施例１と同様にｃＤＮＡ合成反応後増幅し、増幅産物量を測定した。なお比較例４は、ＤＭＳＯ添加後の加熱急冷処理により二本鎖ＲＮＡを解離させて、解離した状態のＲＮＡに、Forward Primer及びReverse Primerを添加して逆転写反応を行った。
　図１、２の結果より、実施例１は、比較例１～５に対して６２６ｂｐのバンドが最も明確に確認でき、特に従来の方法であるＤＭＳＯ添加及び９７℃の加熱処理の比較例４に比べても、ｃＤＮＡ合成量が向上することが判る。
実施例２：ロタウイルスゲノムの相補的DNA合成
　ヒトロタウイルス（A群ロタウイルス、Wa株）より、High Pure Viral RNA Kitを用いてウイルスゲノムを抽出した。
　抽出方法は、まず滅菌チューブ（１．５ｍＬ）に検体０．２ｍＬを入れ、等量のWorking solution及び５０μＬのProteinase Kを加えてボルテクスミキサーにて撹拌した後、７２℃にて１０分間静置した。１０分間の静置後、検体を室温に戻して１００μＬのBinding bufferを加えてボルテクスミキサーにて撹拌した。それをスピンカラムに加えて、８，０００×ｇにて１分間遠心分離した。フロースルーを取り除き、５００μＬのInhibitor Removal bufferをスピンカラムに加えて、８，０００×ｇにて１分間遠心分離した。フロースルーを取り除き、４５０μＬのWashing bufferをスピンカラムに加えて、８，０００×ｇにて１分間遠心分離し、さらに同様の操作を繰り返した。フロースルーを取り除き、１３，０００×ｇにて１０秒間遠心分離することでカラムを乾燥させた。５０μＬのElution bufferを加えて室温にて１分間静置した後、８，０００×ｇにて１分間の遠心分離により得られた抽出液を回収して、これをウイルスゲノムとした。
　抽出したウイルスゲノムに、Random Hexamers（Invitrogen社）と１０ｍＭ　ｄNTPｓ（Invitrogen社）を加えて、上記実施例１及び比較例１～５と同様の熱処理をし（それぞれ実施例２、比較例６～１０）、次いでｃＤＮＡ合成反応を行った。その後、得られた逆転写反応溶液にForward Primer（5’-GGCTTTAAAAGAGAGAATTTCCGTCTGG-3’：配列番号３）及びReverse Primer（5’-GGTCACATCATACAATTCTAATCTAAG -3’：配列番号４）を含む溶液を添加した下記増幅反応液を、Platinum Taq DNA Polymerase（Invitrogen社）にてｃＤＮＡの増幅反応を行った。
　なお、増幅反応条件は、９４℃２分間処理後、９４℃３０秒→５５℃６０秒→７２℃９０秒の処理を４０サイクル行い、最後に７２℃７分間のポリメライゼーションを行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　ｃＤＮＡ増幅反応後、１．２％アガロースゲル電気泳動により約６０分間の電気泳動及びサイバーグリーン（Invitrogen社）染色にて、各条件の増幅産物を比較した。その結果を図３に示す。なお電気泳動は実施例１と同様の方法で行った。
　図３の結果より、実施例２は、比較例６～１０に対して１，０６２ｂｐのバンドが最も明確に確認でき、特に従来の方法である比較例９と比べてもｃＤＮＡ合成効率が向上することが判る。

Claims (6)

  1. 　二本鎖ＲＮＡを鋳型として相補的ＤＮＡを合成する方法であって、
    　試料から抽出した二本鎖ＲＮＡとプライマーの混合液を、（１）９５℃以上の温度で加熱した後急冷する工程、（２）９０℃未満の温度で加熱した後急冷する工程、を順次行った後、逆転写酵素を用いて一本鎖ＤＮＡを合成することを特徴とする相補的ＤＮＡの合成方法。
  2. 　前記工程（１）における加熱温度が、９５℃以上１１０℃未満である請求項１に記載の方法。
  3. 　前記工程（２）における加熱温度が、５０℃以上９０℃未満である請求項１又は２に記載の方法。
  4. 　二本鎖ＲＮＡが、レオウイルスゲノムである請求項１～３のいずれかに記載の方法。
  5. 　下記（１）～（４）の工程を含む試料中の二本鎖ＲＮＡを検出する方法。
    　（１）試料から二本鎖ＲＮＡを抽出する工程
    　（２）前記工程（１）で得られた二本鎖ＲＮＡとプライマーの混合液を、９５℃以上の温度で加熱した後急冷し、次いで９０℃未満の温度で加熱した後急冷し、次いで逆転写酵素を用いて一本鎖ＤＮＡを合成する工程
    　（３）前記工程（２）で得られた一本鎖ＤＮＡを増幅する工程
    　（４）前記工程（３）で得られた増幅産物を検出する工程
  6. 　二本鎖ＲＮＡが、レオウイルスゲノムである請求項５に記載の方法。
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