CN116144843A - Hpv16和/或hpv18基因型的实时荧光恒温扩增检测试剂盒及其专用引物和探针 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种HPV16和/或HPV18基因型的实时荧光恒温扩增检测试剂盒及其专用引物和探针，属于生物医学检测技术领域。本发明提供的试剂盒包括核酸提取液、检测液和SAT酶液，通过优化设计更适合于HPV16和/或HPV18基因型的E6/E7mRNA检测的引物和探针，并在检测过程中分步添加各组分进行分步反应可以实现对HPV16和/或HPV18基因型核酸的快速、准确和分型检测，并且灵敏度高，扩增产物RNA易降解不会引起样本交叉污染和环境污染。
Description
技术领域
本发明属于生物医学检测技术领域，具体涉及一种HPV16和/或HPV18基因型的实时荧光恒温扩增检测试剂盒及其专用引物和探针，特别涉及特异性靶标捕获技术和实时荧光核酸恒温扩增检测技术(Simultaneous Amplification and Test，SAT)结合的人乳头瘤病毒16和18基因型分型的实时荧光核酸恒温扩增检测中使用的引物、探针及相关试剂盒。
背景技术
人乳头瘤病毒(Human Papillomavirus，HPV)属乳头瘤病毒科，是一种嗜上皮性病毒。它对表皮和粘膜鳞状上皮具有特殊嗜性，为无包膜的双链环状DNA病毒，具有高度的特异性，且在人和动物中分布广泛。HPV基因组共由3个功能区组成，包括早期转录区(E区)、晚期转录区(L区)和非转录区(长控制区，LCR)，其中最重要的是E区，它编码E1-E8的8个早期蛋白，参与病毒DNA的复制、转录、编码病毒蛋白、维持细胞内病毒的高拷贝数的基因，其中E6和E7是HPV的主要致癌基因，与病毒细胞转化功能及致癌性有关。L区主要有编码衣壳蛋白的L1和编码次要衣壳蛋白的L2。其中L1高度保守，特异性强；L2编码的衣壳蛋白较小，但变异多。LCR含有HPV基因组DNA的复制起点和调控HPV病毒的转录与复制表达所必需的元件。
至今为止，已经鉴定出的HPV约有100多种，不同基因型的HPV致病能力差异较大，其中HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68、73等基因型被认定为高危型，而其中又以HPV16、18基因型最为常见，与约70％的宫颈癌和癌前病变有关。因此检测宫颈细胞样本中HPV的存在与具体基因型(尤其是HPV16、18基因型)已经成为宫颈癌预防的一种普遍早期诊断方法。
目前临床上对HPV进行检测的常用方法主要包括HPV DNA检测(例如专利文献CN107557492A公开的DNA环介导等温扩增检测方法，以下称文献1)、以HPV E6/E7基因的cDNA为靶标的RT-PCR检测(例如专利文献CN108359742A，以下称文献2)和以HPV E6/E7mRNA为靶标的HPV RNA检测(例如专利文献CN106834547A，以下称文献3)。其中文献1公开的方法基于LAMP技术，对HPV16的检测灵敏度达到1×101拷贝/μl，对HPV18的检测灵敏度达到1×102拷贝/μl，能够实现高灵敏度快速检测，但LAMP技术需要使用至少4条引物来识别靶DNA的6个不同区域，一方面引物条数设计多，增加了成本，另一方面针对变异大的病毒核酸分子在设计上非常困难。文献2公开的方法基于实时荧光RT-PCR技术，对HPV16的检测灵敏度达到1×101拷贝/μl，对HPV18的检测灵敏度达到1×102拷贝/μl，也能够实现高灵敏度检测，但实时荧光RT-PCR技术需要有反转录步骤和在变性、退火及延伸等三个温度点进行几十次升降温循环，每个温度点和时间也需精确设定，整个反应需耗时2-2.5小时以上，因此耗时较长，并且产物为DNA，不易降解易造成环境污染，对设备的要求也高。文献3公开的是一种基于核酸序列依赖性扩增(NASBA)技术结合分子信标建立的实时NASBA等温扩增技术，能够直接以mRNA为靶标，在AMV反转录酶、RNA酶H、T7RNA聚合酶等三种酶的共同协作下，在41-42℃恒温条件下快速(60-90分钟)完成检测，但该文献3公开的方法对HPV16和HPV18的检测灵敏度均只能达到1×102拷贝/μl，不能满足更高灵敏度检测需要。
发明内容
针对现有技术中存在的一个或多个问题，本发明一个方面提供一种检测HPV16或HPV18基因型的实时荧光恒温扩增检测试剂盒，其包括：
(T1)核酸提取液：其包含含有特异性捕获探针的固相支持物、第一引物和/或第三引物，其中所述特异性捕获探针用于捕获HPV16和/或HPV18的检测序列，所述第一引物用于与HPV16的靶标序列特异性结合，所述第三引物用于与HPV18的靶标序列特异性结合；
(T2)检测液1.1：其包含第二引物，所述第二引物与所述第一引物配合，用于扩增HPV16的靶标序列；
(T3)检测液1.2：其包含第一引物和第一靶标检测探针，其中所述第一靶标检测探针与所述HPV16的靶标序列的扩增产物RNA拷贝特异性结合；
(T4)检测液2.1：其包含第四引物，所述第四引物与所述第三引物配合，用于扩增HPV18的靶标序列；
(T5)检测液2.2：其包含第三引物和第二靶标检测探针，其中所述第二靶标检测探针与所述HPV18的靶标序列的扩增产物RNA拷贝特异性结合；和
(T6)SAT酶液：其包含至少一种RNA聚合酶和M-MLV反转录酶；
其中所述特异性捕获探针包含如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；所述第一引物包含如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列，所述第二引物包含如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列，所述第一靶标检测探针包含如SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列；所述第三引物包含如SEQ IDNO:7所示的核苷酸序列，所述第四引物包含如SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列，所述第二靶标检测探针包含如SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列，且所述第一靶标检测探针与第二靶标检测探针的5’端携带有相同或不同的荧光报告基团。
本发明另一方面提供一种同时检测HPV16和HPV18基因型的实时荧光恒温扩增检测试剂盒，其包括：
(S1)核酸提取液：其包含含有特异性捕获探针的固相支持物、第一引物和第三引物，其中所述特异性捕获探针用于捕获HPV16和/或HPV18的检测序列，所述第一引物用于与HPV16的靶标序列特异性结合，所述第三引物用于与HPV18的靶标序列特异性结合；
(S2)检测液1：其包含第二引物和第四引物；所述第二引物与所述第一引物配合，用于扩增HPV16的靶标序列；所述第四引物与所述第三引物配合，用于扩增HPV18的靶标序列；
(S3)检测液2：其包含第一引物、第三引物、第一靶标检测探针和第二靶标检测探针；其中所述第一靶标检测探针与所述HPV16的靶标序列的扩增产物RNA拷贝特异性结合，所述第二靶标检测探针与所述HPV18的靶标序列的扩增产物RNA拷贝特异性结合；和
(S4)SAT酶液：其包含至少一种RNA聚合酶和M-MLV反转录酶；
其中所述特异性捕获探针包含如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；所述第一引物包含如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列，所述第二引物包含如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列，所述第一靶标检测探针包含如SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列；所述第三引物包含如SEQ IDNO:7所示的核苷酸序列，所述第四引物包含如SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列，所述第二靶标检测探针包含如SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列，且所述第一靶标检测探针和第二靶标检测探针的核苷酸序列的5’端携带有不同的荧光报告基团。
在一些实施方式中，所述试剂盒还包括：
(M1)洗涤液：其含有NaCl和SDS，可选地，所述洗涤液包含：5-50mM HEPES、50-500mM NaCl、0.5-1.5％ SDS、1-10mM EDTA；和/或
(M2)矿物油；和/或
(M3)阳性对照：含有HPV16和HPV18基因型的E6/E7体外转录RNA的体系；和/或
(M4)阴性对照：不含有人乳头瘤病毒靶标核酸的体系。
在一些实施方式中，所述核酸提取液的组分包括：250-800mM HEPES，4-10％ LLS(十二烷基硫酸锂)，1-50μΜ特异性捕获探针，50-500mg/L磁珠，25-150pmol/mL的所述第一引物和/或第三引物。
在一些实施方式中，所述检测液1.1的组分包括：10-50mM Tris，5-40mM KCl，10-40mM MgCl2，1-20mM NTP，0.1-10mM dNTPs，1-10％PVP40，250-750pmol/mL的所述第二引物。
在一些实施方式中，所述检测液1.2的组分包括：10-50mM Tris，5-40mM KCl，10-40mM MgCl2，1-20mM NTP，0.1-10mM dNTPs，1-10％PVP40，143-857pmol/mL的所述第一引物，143-857pmol/mL的所述第一靶标检测探针。
在一些实施方式中，所述检测液2.1的组分包括：10-50mM Tris，5-40mM KCl，10-40mM MgCl2，1-20mM NTP，0.1-10mM dNTPs，1-10％PVP40，250-750pmol/mL的所述第四引物。
在一些实施方式中，所述检测液2.2的组分包括：10-50mM Tris，5-40mM KCl，10-40mM MgCl2，1-20mM NTP，0.1-10mM dNTPs，1-10％PVP40，143-857pmol/mL的所述第三引物，143-857pmol/mL的所述第二靶标检测探针。
在一些实施方式中，所述SAT酶液的组分为：16000-160000U/mL的M-MLV反转录酶、8000-80000U/mL的RNA聚合酶、2-10mM HEPES pH7.5、10-100mM N-乙酰基-L-半胱氨酸、0.04-0.4mM乙酸锌、10-100mM海藻糖、40-200mM Tris-HCl pH 8.0、40-200mM KCl、0.01-0.5mM EDTA、0.1-1％(v/v)Triton X-100和20-50％(v/v)甘油。
在一些实施方式中，所述核酸提取液的组分包括：250-800mM HEPES，4-10％ LLS(十二烷基硫酸锂)，1-50μΜ特异性捕获探针，50-500mg/L磁珠，25-150pmol/mL的所述第一引物和第三引物。
在一些实施方式中，所述检测液1的组分包括：10-50mM Tris，5-40mM KCl，10-40mM MgCl2，1-20mM NTP，0.1-10mM dNTPs，1-10％PVP40，250-750pmol/mL的所述第二引物和第四引物。
在一些实施方式中，所述检测液2的组分包括：10-50mM Tris，5-40mM KCl，10-40mM MgCl2，1-20mM NTP，0.1-10mM dNTPs，1-10％PVP40，143-857pmol/mL的所述第一引物和第三引物，143-857pmol/mL的所述第一靶标检测探针和第二靶标检测探针。
在一些实施方式中，所述SAT酶液的组分为：16000-160000U/mL的M-MLV反转录酶、8000-80000U/mL的RNA聚合酶、2-10mM HEPES pH7.5、10-100mM N-乙酰基-L-半胱氨酸、0.04-0.4mM乙酸锌、10-100mM海藻糖、40-200mM Tris-HCl pH 8.0、40-200mM KCl、0.01-0.5mM EDTA、0.1-1％(v/v)Triton X-100和20-50％(v/v)甘油。
本发明又一方面提供一种检测HPV16和HPV18基因型的引物和探针组合，其用于实时荧光核酸恒温扩增检测体系，包括：
通用于捕获HPV16和HPV18的检测序列的特异性捕获探针，其包含如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；
用于检测HPV16基因型的引物和探针，其包括：包含如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列的第一引物、包含如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列的第二引物和包含如SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列的第一靶标检测探针；和
用于检测HPV18基因型的引物和探针，其包括：包含如SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列的第三引物、包含如SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列的第四引物和包含如SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列的第二靶标检测探针；
所述第一靶标检测探针和第二靶标检测探针的核苷酸序列两端分别携带有荧光报告基团和淬灭基团。
本发明再一方面提供一种检测HPV16或HPV18基因型核酸的非疾病诊断方法，其包括以下步骤：
1)向试样中加入核酸提取液进行核酸提取，获得分析检测样品；
2)向所述分析检测样品中加入检测液1.1或检测液2.1进行第一步反应，获得第一步反应液；
3)向所述第一步反应液中加入SAT酶液进行第二步反应，获得第二步反应液；
4)向所述第二步反应液中加入检测液1.2或检测液2.2进行第三步反应，并进行实时荧光检测，获得实时荧光检测的dt值；
5)根据步骤4)获得的实时荧光检测的dt值进行结果判定；
若dt≤35，则试样中含有人乳头瘤状病毒HPV16或HPV18基因型核酸；
若35<dt<40，则需复测，若复测仍满足dt<40，则试样中含有HPV16或HPV18基因型核酸；
若dt>40，则试样中不含有HPV16或HPV18基因型核酸，或试样中HPV16或HPV18基因型核酸浓度低于检测下限。
本发明再一方面提供一种同时检测HPV16和HPV18基因型核酸的非疾病诊断方法，其包括以下步骤：
(1)向试样中加入核酸提取液进行核酸提取，获得分析检测样品；
(2)向所述分析检测样品中加入检测液1进行第一步反应，获得第一步反应液；
(3)向所述第一步反应液中加入SAT酶液进行第二步反应，获得第二步反应液；
(4)向所述第二步反应液中加入检测液2进行第三步反应，并进行实时荧光检测；其中所述检测液2中含有用于检测HPV16的第一靶标检测探针和用于检测HPV18的第二靶标检测探针，对所述第一靶标检测探针和第二靶标检测探针的核苷酸序列的5’端携带的不同的荧光报告基团所对应通道分别进行检测，获得各自的实时荧光检测的dt值；
(5)根据步骤(4)获得的实时荧光检测的dt值进行结果判定；
针对所述第一靶标检测探针所对应的通道，若dt≤35，则试样中含有HPV16基因型核酸；若35<dt<40，则需复测，若复测仍满足dt<40，则试样中含有HPV16基因型核酸；若dt>40，则试样中不含有HPV16基因型核酸，或试样中HPV16基因型核酸浓度低于检测下限；
针对所述第二靶标检测探针所对应的通道，若dt≤35，则试样中含有HPV18基因型核酸；若35<dt<40，则需复测，若复测仍满足dt<40，则试样中含有HPV18基因型核酸；若dt>40，则试样中不含有HPV18基因型核酸，或试样中HPV18基因型核酸浓度低于检测下限。
在一些实施方式中，所述第一步反应的条件为40℃-45℃保温3-15min。
在一些实施方式中，所述SAT酶液使用前事先预热，预热温度为41-43℃。
在一些实施方式中，所述第二步反应的条件为41℃-43℃反应3-15min。
在一些实施方式中，所述第三步反应的条件为41℃-43℃反应30-50min。
在一些实施方式中，所述试样来源包括食品、血液制品、饮用水、河水、乳制品、物体表面附着物。
基于以上技术方案提供的检测HPV16和/或HPV18基因型的引物和探针是针对HPV16和HPV18基因型的E6/E7mRNA优化设计的，基于该引物和探针提供的检测HPV16和/或HPV18基因型的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒中包括核酸提取液、检测液和SAT酶液等，其中在核酸提取液中可包含用于捕获HPV16和/或HPV18的检测序列的特异性捕获探针和用于与HPV16的靶标序列特异性结合的第一引物和用于与HPV18的靶标序列特异性结合的第三引物，在检测液中可单独含有针对HPV16的第二引物和第一靶标检测探针，或单独含有针对HPV18的第四引物和第二靶标检测探针，或同时含有针对HPV16的第二引物和第一靶标检测探针以及针对HPV18的第四引物和第二靶标检测探针等，SAT酶液则含有反应过程中所需要的RNA聚合酶和反转录酶等，基于SAT恒温扩增检测技术，在使用过程中通过分步添加上述反应液分步反应，可以避免反应过程中不同引物、探针之间的相互干扰，体系反应较为简单，可以实现对HPV16和HPV18基因型的高灵敏度检测，且可对两者进行分型。本发明除用于医学领域的HPV16和/或HPV18基因型检测外，还可以用于对非医学诊断用样本，例如河水、污水、物体表面附着物等环境样本、以及饮用水、食品、血液制品、乳制品等样本中HPV16和/或HPV18基因型的检测，适合大范围推广使用。
与现有的检测方法相比，本发明具有以下优点：
(1)本发明提供的引物和探针是根据HPV16和HPV18基因型的E6/E7mRNA进行优化设计获得，在检测过程中通过分步添加不同的组分进而可以实现更高的灵敏度检测。实施例结果表明，本发明提供的试剂盒和方法对HPV16基因型的检测限为30copies/反应(0.12copies/μL)，对HPV18基因型的检测限为20copies/反应(0.08copies/μL)，相对于上述文献1-3，能够满足更高灵敏度要求的检测环境。
(2)本发明采用实时荧光核酸恒温扩增检测技术对HPV16/HPV18进行分型检测，避免了现有技术(例如上述文献2公开的RT-PCR技术)中提取RNA的加热、离心、体外反转录等操作，其实验步骤和反应体系更加简单，易于实现自动化，且减少了操作人员感染的风险。
(3)本发明将核酸的扩增与检测在同一封闭体系中同步进行，整个过程没有温度的升降及循环，因而所需时间大大缩短，同时相对于上述文献2降低了对所用PCR仪的设计和生产成本。
(4)本发明扩增产物为RNA，RNA在自然界中极易降解，相对PCR或LAMP扩增的DNA而言，污染易控，交叉影响小，不会引起样本交叉污染和环境污染。
附图说明
图1为实施例1中组1(A)和组2(B)引物探针对HPV16阳性对照的梯度浓度样品的扩增曲线；
图2为实施例1中组1(A)和组2(B)引物探针对HPV18阳性对照的梯度浓度样品的扩增曲线；
图3为对10份宫颈脱落细胞样本中的HPV16(A)或HPV18(B)进行检测的扩增曲线。
具体实施方式
针对现有技术中存在的HPV16/18基因型分型检测方法的缺陷，本发明利用核酸恒温同步放大检测的方法以HPV16/18的E6/E7mRNA为靶标对两者进行检测分型，并提供了用于HPV16/18检测的核酸恒温同步放大检测试剂盒及其专用引物和探针以及检测方法。
以下结合具体实施例和附图详细说明本发明的内容。
在下文中，仅简单地描述了某些示例性实施例。正如本领域技术人员可认识到的那样，在不脱离本发明的精神或范围的情况下，可通过各种不同方式修改所描述的实施例。因此，附图和描述被认为本质上是示例性的而非限制性的。
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《分子克隆实验指南》(《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》Sambrook，J.，Russell，DavidW.，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold SpringHarbor)。
实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种试验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。
本发明提及的所有引物、荧光探针和体外转录RNA产物均用已有技术合成。
实施例1：用于实时荧光核酸恒温扩增检测人乳头瘤病毒16和18基因型的专用引物和探针设计
本发明人根据Genbank数据库已公开的HPV16和HPV18核酸序列，从E6/E7基因上一段高度保守且与其他相似病原体有较大差异的序列入手确定检测序列(其中针对HPV16基因型的检测序列如SEQ ID NO:1所示；针对HPV18基因型的检测序列如SEQ ID NO:2所示)，按照引物和探针设计原则进行引物和探针设计，以对HPV16和HPV18基因型进行实时荧光核酸恒温扩增检测。
该实施例共设计了多组引物和探针，其中选择以下2组引物和探针(组1和组2)对HPV16和HPV18混合阳性对照(以下详述)和阴性对照(不含人乳头瘤病毒靶标核酸序列或不含有人乳头瘤病毒的体系，例如去离子水或样本保存液(商购))进行实时荧光核酸恒温扩增检测(检测方法在以下实施例5中详述)，从中筛选出能用于同时检测HPV16和HPV18基因型且能够对HPV16和HPV18基因型进行分型的灵敏度较高的引物和探针组。
组1：
HPV16/18通用特异性捕获探针：
CCATCTATTTCATCTTTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA(SEQ ID NO:3)；
针对HPV16基因型的第一引物：
AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGAAATATTGTAATGGGCTCTGT(SEQ ID NO:4)；
针对HPV16基因型的第二引物：
AACTGATCTCTACTGTTATGA(SEQ ID NO:5)；
针对HPV16基因型的第一靶标检测探针：CACCAGAGGAGGAGGAUGAAGGUG(SEQ ID NO:6)；
其中第一靶标检测探针的5’端和3’端分别标记有荧光报告基团(例如FAM、HXE或ROX等)和荧光淬灭基团(例如DABCYL、BHQ-1或BHQ-2等)，下同；
针对HPV18基因型的第三引物：
AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGAACTTACAACACATACACAACAT(SEQ ID NO:7)；
针对HPV18基因型的第四引物：AATTAAGCGACTCAGAGGAA(SEQ ID NO:8)；
针对HPV18基因型的第二靶标检测探针：CACCCAACGAUGAAAUAGAUGGGGUG(SEQ IDNO:9)；
其中第二靶标检测探针的5’端标记有荧光报告基团(例如FAM、HXE或ROX等)，且不同于第一靶标检测探针5’端标记的荧光报告基团；3’端标记有荧光淬灭基团，可以与第一靶标检测探针相同或不同，下同。
组2：
HPV16/18通用特异性捕获探针(SEQ ID NO:3)；
针对HPV16基因型的第一引物-1：
AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGCTGGACCATCTATTTCAT(SEQ ID NO:10)；
针对HPV16基因型的第二引物-1：TGGAGATACACCTACATTGC(SEQ ID NO:11)；
针对HPV16基因型的第一靶标检测探针-1：CACCCAACCAGAGACAACUGGGUG(SEQIDNO:12)；
针对HPV18基因型的第三引物-1：
AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGAGGCTTCACACTTACAACACAT(SEQ ID NO:13)；
针对HPV18基因型的第四引物-1：CAATTAAGCGACTCAGAGGAA(SEQ ID NO:14)；
针对HPV18基因型的第二靶标检测探针-1：CACCCUUAAUCAUCAACAUUUGGGUG(SEQ IDNO:15)；
该实施例中阳性对照的制备方式包括以下步骤：
(1)用化学合成法分别合成HPV16/18的E6/E7保守性片段(SEQ ID NO:1和SEQIDNO:2)，构建到含有T7启动子序列的常用质粒载体上；
(2)用商品化T7启动子体外转录试剂盒(sigma)转录出RNA片段，纯化后，通过紫外计算RNA拷贝数，分别得到HPV16和HPV18的体外转录RNA阳性对照。
利用上述两组引物和探针(组1和组2)分别对HPV16/18混合阳性对照的梯度浓度样品(其中HPV16体外转录RNA的梯度浓度分别为105copies/反应(即400copies/μL)、104copies/反应、103copies/反应、102copies/反应、30copies/反应，HPV18体外转录RNA的梯度浓度分别为105copies/反应、104copies/反应、103copies/反应、102copies/反应、20copies/反应)和阴性对照进行实时荧光核酸恒温扩增检测(双重检测)(具体检测方法如以下实施例5所述)。组1和组2引物探针的扩增检测结果如图1-2所示，为了方便显示和比较，将组1和组2中针对HPV16基因型的扩增曲线分别示于图1的A幅和B幅中，将组1和组2中针对HPV18基因型的扩增曲线分别示于图2的A幅和B幅中。由图1中A幅和B幅所示，可见组1中针对HPV16基因型的引物和探针的检测灵敏度至少可达30copies/反应(即0.12copies/μL)，而组2中针对HPV16基因型的引物和探针的检测灵敏度只达到102copies/反应；由图2中A幅和B幅所示，可见组1中针对HPV18基因型的引物和探针的检测灵敏度至少可达20copies/反应(即0.08copies/μL)，而组2中针对HPV18基因型的引物和探针的检测灵敏度只达到102copies/反应。显然可见，在同时检测HPV16和HPV18基因型并对他们进行分型时，组1的引物和探针的检测灵敏度显著高于组2的引物和探针的检测灵敏度，因此本发明确定组1的引物和探针用于同时对以上两种基因型进行实时荧光核酸恒温扩增检测，并可对两者进行基因分型。
在该实施例中，发明人还使用组1中分别针对HPV16和HPV18基因型的引物和探针组合分别对HPV16和HPV18的体外转录RNA阳性对照的梯度稀释样品进行单独检测(具体检测方法如以下实施例4所述)，结果表明，针对HPV16基因型的引物和探针组合对HPV16基因型的检测灵敏度至少可达30copies/反应(即0.12copies/μL)，针对HPV18基因型的引物和探针组合对HPV18基因型的检测灵敏度至少可达20copies/反应(即0.08copies/μL)。因此可确定组1中分别针对HPV16和HPV18基因型的引物和探针组合也可用于单独对HPV16和HPV18基因型进行实时荧光核酸恒温扩增检测。
实施例2：HPV16和/或HPV18基因型的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒
该实施例提供的试剂盒是基于RNA核酸恒温同步放大检测原理检测HPV16/18的E6/E7mRNA的试剂盒。在该试剂盒中，用于检测HPV16基因型和HPV18基因型的试剂分开使用(例如实施例1的组1中分别针对两种基因型的引物和探针分开使用，进行单重检测)，将该试剂盒命名为检测试剂盒1，其中针对HPV16基因型的第一靶标检测探针的5’端标记的荧光报告基团可以与针对HPV18基因型的第二靶标检测探针的5’端标记的荧光报告基团相同或不同。该检测试剂盒1具体可以包括以下组分：
(T1)核酸提取液：用于提取和纯化样本中的HPV16和/或HPV18核酸，其可以包含含有特异性捕获探针(SEQ ID NO:3)的固相支持物(例如磁珠)、第一引物(SEQ ID NO:4)和/或第三引物(SEQ ID NO:7)(这种情况下，试剂盒中的核酸提取液的存在形式有以下两种：(1)存在一种核酸提取液，其中包含第一引物和第三引物；(2)存在两种核酸提取液，其中一种含有第一引物，而另一种含有第三引物)，其中所述特异性捕获探针用于捕获HPV16和/或HPV1的8检测序列，所述第一引物用于与HPV16的靶标序列特异性结合，所述第三引物用于与HPV18的靶标序列特异性结合；具体地，该核酸提取液可以包含：250-800mM HEPES、4-10％ LLS(十二烷基磺酸锂)、1-50μΜ的特异性捕获探针、50-500mg/L磁珠、25-150pmol/mL的第一引物和/或第三引物；
(T2)检测液1.1：其可以包含第二引物(SEQ ID NO:5)，所述第二引物与所述第一引物配合，用于扩增HPV16的靶标序列；具体地，该检测液1.1可以包含：10-50mM Tris，5-40mM KCl，10-40mM MgCl2，1-20mM NTP，0.1-10mM dNTPs，1-10％PVP40，250-750pmol/mL的第二引物；
(T3)检测液1.2：其可以包含第一引物(SEQ ID NO:4)和第一靶标检测探针(SEQIDNO:6)，其中第一靶标检测探针与HPV16的靶标序列的扩增产物RNA拷贝特异性结合；具体地，该检测液1.2可以包含：10-50mM Tris，5-40mM KCl，10-40mM MgCl2，1-20mM NTP，0.1-10mM dNTPs，1-10％PVP40，143-857pmol/mL的第一引物，143-857pmol/mL的第一靶标检测探针；
(T4)检测液2.1：其可以包含第四引物(SEQ ID NO:8)，所述第四引物与所述第三引物配合，用于扩增HPV18的靶标序列；具体地，该检测液2.1可以包含：10-50mM Tris，5-40mM KCl，10-40mM MgCl2，1-20mM NTP，0.1-10mM dNTPs，1-10％PVP40，250-750pmol/mL的第四引物；
(T5)检测液2.2：其可以包含第三引物(SEQ ID NO:7)和第二靶标检测探针(SEQIDNO:9)，其中第二靶标检测探针与HPV18的靶标序列的扩增产物RNA拷贝特异性结合；具体地，该检测液2.2可以包含：10-50mM Tris，5-40mM KCl，10-40mM MgCl2，1-20mM NTP，0.1-10mM dNTPs，1-10％PVP40，143-857pmol/mL的第三引物，143-857pmol/mL的第二靶标检测探针；和
(T6)SAT酶液：其可以包含至少一种RNA聚合酶和M-MLV反转录酶；具体地，该SAT酶液包含：16000-160000U/mL的M-MLV反转录酶、8000-80000U/mL的RNA聚合酶、2-10mM HEPESpH7.5、10-100mM N-acetyl-L-cysteine(N-乙酰基-L-半胱氨酸)、0.04-0.4mM zincacetate(乙酸锌)、10-100mM trehalose(海藻糖)、40-200mM Tris-HCl pH 8.0、40-200mMKCl、0.01-0.5mM EDTA、0.1-1％(v/v)Triton X-100和20-50％(v/v)glycerol(甘油)。
为了方便检测，该实施例提供的试剂盒中还可包含以下组分：
(M1)洗涤液：用于磁珠水相清洗，其配方可以为HEPES 5-50mM、NaCl 50-500mM、1％SDS、EDTA 1-10mM；
(M2)矿物油：用于磁珠有机相清洗的矿物油；
(M3)阳性对照；可以为HPV16和HPV18E6/E7体外转录RNA或其稀释物(实施例1中制备)；
(M4)阴性对照：可以为不含人乳头瘤病毒靶标核酸序列或不含有人乳头瘤病毒的体系，例如生理盐水和样本保存液混合液(其含有高浓度去垢剂和生理盐水)。
实施例3：同时检测HPV16和HPV18基因型的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒
该实施例提供的试剂盒是基于RNA核酸恒温同步放大检测原理检测HPV16/18的E6/E7mRNA的试剂盒。在该试剂盒中，用于检测HPV16基因型和HPV18基因型的试剂混合使用(例如实施例1的组1中分别针对两种基因型的引物和探针混合使用，进行双重检测)，将该试剂盒命名为检测试剂盒2，其中针对HPV16基因型的第一靶标检测探针的5’端标记的荧光报告基团与针对HPV18基因型的第二靶标检测探针的5’端标记的荧光报告基团不同。该检测试剂盒2具体可以包括以下组分：
(S1)核酸提取液：用于提取和纯化样本中的HPV16和/或HPV18核酸，其可以包含含有特异性捕获探针(SEQ ID NO:3)的固相支持物(例如磁珠)、第一引物(SEQ ID NO:4)和第三引物(SEQ ID NO:7)，其中所述特异性捕获探针用于捕获HPV16和/或HPV18的检测序列，所述第一引物用于与HPV16的靶标序列特异性结合，所述第三引物用于与HPV18的靶标序列特异性结合；具体地，该核酸提取液可以包含：250-800mM HEPES、4-10％ LLS(十二烷基磺酸锂)、1-50μΜ的特异性捕获探针、50-500mg/L磁珠、25-150pmol/mL的第一引物和第三引物；
(S2)检测液1：其可以包含第二引物(SEQ ID NO:5)和第四引物(SEQ ID NO:8)；所述第二引物与所述第一引物配合，用于扩增HPV16的靶标序列；所述第四引物与所述第三引物配合，用于扩增HPV18的靶标序列；具体地，该检测液1可以包含：10-50mM Tris，5-40mMKCl，10-40mM MgCl2，1-20mM NTP，0.1-10mM dNTPs，1-10％PVP40，250-750pmol/mL的第二引物和第四引物；
(S3)检测液2：其可以包含第一引物(SEQ ID NO:4)、第三引物(SEQ ID NO:7)、第一靶标检测探针(SEQ ID NO:6)和第二靶标检测探针(SEQ ID NO:9)；其中所述第一靶标检测探针与所述HPV16的靶标序列的扩增产物RNA拷贝特异性结合，所述第二靶标检测探针与所述HPV18的靶标序列的扩增产物RNA拷贝特异性结合；具体地，该检测液2可以包含：10-50mM Tris，5-40mM KCl，10-40mM MgCl2，1-20mM NTP，0.1-10mM dNTPs，1-10％PVP40，143-857pmol/mL的第一引物和第三引物，143-857pmol/mL的第一靶标检测探针和第二靶标检测探针；和
(S4)SAT酶液：其可以包含至少一种RNA聚合酶和M-MLV反转录酶；具体地，该SAT酶液可以包含：16000-160000U/mL的M-MLV反转录酶、8000-80000U/mL的RNA聚合酶、2-10mMHEPES pH7.5、10-100mM N-acetyl-L-cysteine、0.04-0.4mM zinc acetate、10-100mMtrehalose、40-200mM Tris-HCl pH 8.0、40-200mM KCl、0.01-0.5mM EDTA、0.1-1％(v/v)Triton X-100和20-50％(v/v)glycerol。
为了方便检测，该实施例提供的试剂盒中还可包含以下组分：
(M1)洗涤液：用于磁珠水相清洗，其配方可以为HEPES 5-50mM、NaCl 50-500mM、1％SDS、EDTA 1-10mM；
(M2)矿物油：用于磁珠有机相清洗的矿物油；
(M3)阳性对照；可以为HPV16和HPV18E6/E7体外转录RNA或其稀释物(实施例1中制备)；
(M4)阴性对照：可以为不含人乳头瘤病毒靶标核酸序列或不含有人乳头瘤病毒的体系，例如生理盐水和样本保存液混合液(其含有高浓度去垢剂和生理盐水)。
实施例4：实时荧光核酸恒温扩增检测HPV16/18基因型的方法
该实施例的方法基于RNA恒温同步放大检测原理检测HPV16/18基因型(E6/E7基因)，其利用上述实施例2提供的检测试剂盒1对样本中是否含有HPV16/18基因型核酸进行检测，具体操作步骤为：
4.1、样品准备
取2mL保存于豪洛捷公司ThinPrep PreservCyt Solution中的人宫颈脱落细胞样本与2mL样本保存液(上海仁度生物科技股份有限公司)1:1混匀，作为待测样本。
4.2、RNA提取
(1)在样本处理管中加入100-800μL的核酸提取液、250μL待测样本，混匀，60℃保温10分钟，室温静置10分钟；
(2)将样品处理管置于磁珠分离装置上，静置3-5分钟。待磁珠吸附于管壁后，保持样品处理管于磁珠分离装置上，吸弃废液，保留磁珠。加入1mL洗涤液，震荡均匀后静置3-5分钟，然后加入800μL洗涤液和200μL矿物油，震荡均匀后静置3-5分钟，吸弃废液，保留磁珠；
(3)将样本处理管移离磁珠分离装置，管中为磁珠-核酸复合物，备用(此步应清晰可见磁珠)。
4.3、SAT核酸扩增检测
(1)向步骤4.2处理后的样品处理管(管中为磁珠-核酸复合物)中加入40μL针对HPV16的检测液1.1(或针对HPV18的检测液2.1)振荡重悬磁珠；
(2)取震荡混匀的检测液1.1(或检测液2.1)至洁净微量反应管，向微量反应管中加入50μL矿物油，将微量反应管在42℃反应条件下预热5-10min，向微量反应管中加入25μL已预热至42℃的SAT酶液，继续42℃恒温保存5-10min。
(3)向微量反应管中加入35μL已预热至42℃的针对HPV16的检测液1.2(或针对HPV18的检测液2.2)，将微量反应管快速转移至恒温荧光检测仪器，42℃反应40分钟，设定每分钟收集一次荧光信号。荧光素通道选择FAM通道(即检测液1.2中的第一靶标检测探针或检测液2.2中的第二靶标检测探针的5’端均标记有FAM荧光报告基团)。按照以上步骤同步检测阴性对照。
4.4、结果判定
根据SAT扩增结果得到的曲线，由软件自动读取dt值，判定结果。
结果判定标准为：
若FAM通道dt≤35，则样品为阳性，即样品中含有HPV16(或HPV18)基因型核酸；
若FAM通道35<dt≤40，需复测；若复测dt≤40，则样品中含有HPV16(或HPV18)基因型核酸
若FAM通道dt>40，则样品为阴性，即样品中不含有HPV16(或HPV18)基因型核酸，或样品中HPV16(或HPV18)基因型核酸浓度低于检测下限。
利用上述方法分别对10份宫颈脱落细胞样本(其中样本1-6为HPV16阳性样本，样本7-9为HPV18阳性样本，样本10为HPV16和HPV18双阳性样本)进行HPV16/18实时荧光核酸恒温扩增检测，并同步检测阳性对照(实施例1制备的HPV16和HPV18E6/E7体外转录RNA)和阴性对照。结果如图3和下表1所示，其中图3中A幅表示使用针对HPV16基因型的引物和探针(实施例1中组1中所示)对10份宫颈脱落细胞样本的检测结果，图3中B幅表示使用针对HPV18基因型的引物和探针(实施例1中组1中所示)对10份宫颈脱落细胞样本的检测结果。在图3中A和B幅中，曲线1表示阳性对照，曲线2表示阴性对照，其他曲线表示样本1-10。结果可见10份宫颈脱落细胞样本中有6份样本(样本1-6)的HPV16检测结果为阳性，有3份样本(样本7-9)HPV18检测结果为阳性，有1份样本(样本10)的HPV16和HPV18检测结果均为阳性，这与样本的实际情况相吻合，阴阳性对照检测结果正常，证明本方法有效，可用于临床样本检测。
表1：10份宫颈脱落细胞样本的检测结果
| HPV16(dt值) | HPV18(dt值) | |
| 样本1 | 21.8 | ＞40 |
| 样本2 | 20.8 | ＞40 |
| 样本3 | 25.5 | ＞40 |
| 样本4 | 11.2 | ＞40 |
| 样本5 | 12.7 | ＞40 |
| 样本6 | 8.0 | ＞40 |
| 样本7 | ＞40 | 9.6 |
| 样本8 | ＞40 | 14.2 |
| 样本9 | ＞40 | 9.2 |
| 样本10 | 14.7 | 16.5 |
| 阳性对照 | 14.5 | 13.9 |
| 阴性对照 | ＞40 | ＞40 |
参照本实施例，还可以对非临床诊断样本，例如被污染的物体表面附着物、河水等环境样本，以及血液制品、饮用水、食品、乳制品等样本中的HPV16/18核酸进行检测。
实施例5：同时检测HPV16和HPV18基因型的实时荧光核酸恒温扩增检测方法
该实施例方法基于RNA恒温同步放大检测原理检测HPV16/18基因型(E6/E7基因)，其利用上述实施例3提供的检测试剂盒2对样本中是否含有HPV16和/或HPV18基因型核酸进行检测，具体操作步骤为：
5.1、样品准备
取2mL保存于豪洛捷公司ThinPrep PreservCyt Solution中的人宫颈脱落细胞样本与2mL样本保存液(上海仁度生物科技股份有限公司)1:1混匀，作为待测样本。
5.2、RNA提取
(1)在样本处理管中加入100-800μL的核酸提取液、250μL待测样本，混匀，60℃保温10分钟，室温静置10分钟；
(2)将样品处理管置于磁珠分离装置上，静置3-5分钟。待磁珠吸附于管壁后，保持样品处理管于磁珠分离装置上，吸弃废液，保留磁珠。加入1mL洗涤液，震荡均匀后静置3-5分钟，然后加入800μL洗涤液和200μL矿物油，震荡均匀后静置3-5分钟，吸弃废液，保留磁珠；
(3)将样本处理管移离磁珠分离装置，管中为磁珠-核酸复合物，备用(此步应清晰可见磁珠)。
5.3、SAT核酸扩增检测
(1)向步骤5.2处理后的样品处理管(管中为磁珠-核酸复合物)中加入40μL的检测液1振荡重悬磁珠；
(2)取震荡混匀的检测液1至洁净微量反应管，向微量反应管中加入50μL矿物油，将微量反应管在42℃反应条件下预热5-10min，向微量反应管中加入25μL已预热至42℃的SAT酶液，继续42℃恒温保存5-10min。
(3)向微量反应管中加入35μL已预热至42℃的检测液2，将微量反应管快速转移至恒温荧光检测仪器，42℃反应40分钟，设定每分钟收集一次荧光信号。HPV16基因型荧光素通道选择FAM通道，HPV18基因型荧光素通道选择HEX通道(即检测液2中的第一靶标检测探针的5’端标记有FAM荧光报告基团，检测液2中的第二靶标检测探针的5’端标记有HEX荧光报告基团)。按照以上步骤同步检测阴性对照。
5.4、结果判定
根据SAT扩增结果得到的曲线，由软件自动读取dt值，判定结果。
结果判定标准为：
若FAM通道dt≤35，则样品为阳性，即样品中含有HPV16基因型核酸；
若FAM通道35<dt≤40，需复测；若复测dt≤40，则样品中含有HPV16基因型核酸；
若FAM通道dt>40，则样品为阴性，即样品中不含有HPV16基因型核酸，或样品中HPV16基因型核酸浓度低于检测下限；
若HEX通道dt≤35，则样品为阳性，即样品中含有HPV18基因型核酸；
若HEX通道35<dt≤40，需复测；若复测dt≤40，则样品中含有HPV18基因型核酸；
若HEX通道dt>40，则样品为阴性，即样品中不含有HPV18基因型核酸，或样品中HPV18基因型核酸浓度低于检测下限。
利用上述方法分别对实施例4中的10份宫颈脱落细胞样本(其中样本1-6为HPV16阳性样本，样本7-9为HPV18阳性样本，样本10为HPV16和HPV18双阳性样本)进行双重实时荧光核酸恒温扩增检测，并同步检测阳性对照(实施例1制备的HPV16和HPV18E6/E7体外转录RNA)和阴性对照。结果如下表2所示，可见10份宫颈脱落细胞样本中有6份样本(样本1-6)HPV16检测结果为阳性，有3份样本(样本7-9)HPV18检测结果为阳性，有1份样本(样本10)HPV16和HPV18检测结果均为阳性，这与样本的实际情况和实施例4的检测结果相吻合，阴阳性对照检测结果正常，证明本方法有效，可用于临床样本检测。
表2：10份宫颈脱落细胞样本的检测结果
| HPV16(dt值) | HPV18(dt值) | |
| 样本1 | 22.0 | ＞40 |
| 样本2 | 21.3 | ＞40 |
| 样本3 | 26.2 | ＞40 |
| 样本4 | 11.5 | ＞40 |
| 样本5 | 13.1 | ＞40 |
| 样本6 | 8.4 | ＞40 |
| 样本7 | ＞40 | 10.1 |
| 样本8 | ＞40 | 14.5 |
| 样本9 | ＞40 | 9.6 |
| 样本10 | 15.0 | 16.8 |
| 阳性对照 | 14.6 | 14.3 |
| 阴性对照 | ＞40 | ＞40 |
参照本实施例，还可以对非临床诊断样本，例如被污染的物体表面附着物、河水等环境样本，以及血液制品、饮用水、食品、乳制品等样本中的HPV16和/或HPV18核酸进行同时检测。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应属于本发明的内容。
Claims (10)
1.一种检测HPV16或HPV18基因型的实时荧光恒温扩增检测试剂盒，其包括：
(T1)核酸提取液：其包含含有特异性捕获探针的固相支持物、第一引物和/或第三引物，其中所述特异性捕获探针用于捕获HPV16和/或HPV18的检测序列，所述第一引物用于与HPV16的靶标序列特异性结合，所述第三引物用于与HPV18的靶标序列特异性结合；
(T2)检测液1.1：其包含第二引物，所述第二引物与所述第一引物配合，用于扩增HPV16的靶标序列；
(T3)检测液1.2：其包含第一引物和第一靶标检测探针，其中所述第一靶标检测探针与所述HPV16的靶标序列的扩增产物RNA拷贝特异性结合；
(T4)检测液2.1：其包含第四引物，所述第四引物与所述第三引物配合，用于扩增HPV18的靶标序列；
(T5)检测液2.2：其包含第三引物和第二靶标检测探针，其中所述第二靶标检测探针与所述HPV18的靶标序列的扩增产物RNA拷贝特异性结合；和
(T6)SAT酶液：其包含至少一种RNA聚合酶和M-MLV反转录酶；
其中所述特异性捕获探针包含如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；所述第一引物包含如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列，所述第二引物包含如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列，所述第一靶标检测探针包含如SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列；所述第三引物包含如SEQID NO:7所示的核苷酸序列，所述第四引物包含如SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列，所述第二靶标检测探针包含如SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列，且所述第一靶标检测探针与第二靶标检测探针的5’端携带有相同或不同的荧光报告基团。
2.一种同时检测HPV16和HPV18基因型的实时荧光恒温扩增检测试剂盒，其包括：
(S1)核酸提取液：其包含含有特异性捕获探针的固相支持物、第一引物和第三引物，其中所述特异性捕获探针用于捕获HPV16和/或HPV18的检测序列，所述第一引物用于与HPV16的靶标序列特异性结合，所述第三引物用于与HPV18的靶标序列特异性结合；
(S2)检测液1：其包含第二引物和第四引物；所述第二引物与所述第一引物配合，用于扩增HPV16的靶标序列；所述第四引物与所述第三引物配合，用于扩增HPV18的靶标序列；
(S3)检测液2：其包含第一引物、第三引物、第一靶标检测探针和第二靶标检测探针；其中所述第一靶标检测探针与所述HPV16的靶标序列的扩增产物RNA拷贝特异性结合，所述第二靶标检测探针与所述HPV18的靶标序列的扩增产物RNA拷贝特异性结合；和
(S4)SAT酶液：其包含至少一种RNA聚合酶和M-MLV反转录酶；
其中所述特异性捕获探针包含如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；所述第一引物包含如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列，所述第二引物包含如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列，所述第一靶标检测探针包含如SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列；所述第三引物包含如SEQID NO:7所示的核苷酸序列，所述第四引物包含如SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列，所述第二靶标检测探针包含如SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列，且所述第一靶标检测探针和第二靶标检测探针的核苷酸序列的5’端携带有不同的荧光报告基团。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其还包括：
(M1)洗涤液：其含有NaCl和SDS，可选地，所述洗涤液包含：5-50mM HEPES、50-500mMNaCl、0.5-1.5％SDS、1-10mM EDTA；和/或
(M2)矿物油；和/或
(M3)阳性对照：含有HPV16和HPV18基因型的E6/E7体外转录RNA的体系；和/或
(M4)阴性对照：不含有人乳头瘤病毒靶标核酸的体系。
4.根据权利要求1或3所述的试剂盒，其中，
所述核酸提取液的组分包括：250-800mM HEPES，4-10％LLS(十二烷基硫酸锂)，1-50μΜ特异性捕获探针，50-500mg/L磁珠，25-150pmol/mL的所述第一引物和第三引物；
所述检测液1.1的组分包括：10-50mM Tris，5-40mM KCl，10-40mM MgCl2，1-20mM NTP，0.1-10mM dNTPs，1-10％PVP40，250-750pmol/mL的所述第二引物；
所述检测液1.2的组分包括：10-50mM Tris，5-40mM KCl，10-40mM MgCl2，1-20mM NTP，0.1-10mM dNTPs，1-10％PVP40，143-857pmol/mL的所述第一引物，143-857pmol/mL的所述第一靶标检测探针；
所述检测液2.1的组分包括：10-50mM Tris，5-40mM KCl，10-40mM MgCl2，1-20mM NTP，0.1-10mM dNTPs，1-10％PVP40，250-750pmol/mL的所述第四引物；
所述检测液2.2的组分包括：10-50mM Tris，5-40mM KCl，10-40mM MgCl2，1-20mM NTP，0.1-10mM dNTPs，1-10％PVP40，143-857pmol/mL的所述第三引物，143-857pmol/mL的所述第二靶标检测探针；
所述SAT酶液的组分为：16000-160000U/mL的M-MLV反转录酶、8000-80000U/mL的RNA聚合酶、2-10mM HEPES pH7.5、10-100mM N-乙酰基-L-半胱氨酸、0.04-0.4mM乙酸锌、10-100mM海藻糖、40-200mM Tris-HCl pH 8.0、40-200mM KCl、0.01-0.5mM EDTA、0.1-1％(v/v)Triton X-100和20-50％(v/v)甘油。
5.根据权利要求2或3所述的检测试剂盒，其中，
所述核酸提取液的组分包括：250-800mM HEPES，4-10％LLS(十二烷基硫酸锂)，1-50μΜ特异性捕获探针，50-500mg/L磁珠，25-150pmol/mL的所述第一引物和第三引物；
所述检测液1的组分包括：10-50mM Tris，5-40mM KCl，10-40mM MgCl2，1-20mM NTP，0.1-10mM dNTPs，1-10％PVP40，250-750pmol/mL的所述第二引物和第四引物；
所述检测液2的组分包括：10-50mM Tris，5-40mM KCl，10-40mM MgCl2，1-20mM NTP，0.1-10mM dNTPs，1-10％PVP40，143-857pmol/mL的所述第一引物和第三引物，143-857pmol/mL的所述第一靶标检测探针和第二靶标检测探针；
所述SAT酶液的组分为：16000-160000U/mL的M-MLV反转录酶、8000-80000U/mL的RNA聚合酶、2-10mM HEPES pH7.5、10-100mM N-乙酰基-L-半胱氨酸、0.04-0.4mM乙酸锌、10-100mM海藻糖、40-200mM Tris-HCl pH 8.0、40-200mM KCl、0.01-0.5mM EDTA、0.1-1％(v/v)Triton X-100和20-50％(v/v)甘油。
6.一种检测HPV16和HPV18基因型的引物和探针组合，其用于实时荧光核酸恒温扩增检测体系，包括：
通用于捕获HPV16和HPV18的检测序列的特异性捕获探针，其包含如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；
用于检测HPV16基因型的引物和探针，其包括：包含如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列的第一引物、包含如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列的第二引物和包含如SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列的第一靶标检测探针；和
用于检测HPV18基因型的引物和探针，其包括：包含如SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列的第三引物、包含如SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列的第四引物和包含如SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列的第二靶标检测探针；
所述第一靶标检测探针和第二靶标检测探针的核苷酸序列两端分别携带有荧光报告基团和淬灭基团。
7.一种检测HPV16或HPV18基因型核酸的非疾病诊断方法，其包括以下步骤：
1)向试样中加入核酸提取液进行核酸提取，获得分析检测样品；
2)向所述分析检测样品中加入检测液1.1或检测液2.1进行第一步反应，获得第一步反应液；
3)向所述第一步反应液中加入SAT酶液进行第二步反应，获得第二步反应液；
4)向所述第二步反应液中加入检测液1.2或检测液2.2进行第三步反应，并进行实时荧光检测，获得实时荧光检测的dt值；
5)根据步骤4)获得的实时荧光检测的dt值进行结果判定；
若dt≤35，则试样中含有人乳头瘤状病毒HPV16或HPV18基因型核酸；
若35<dt<40，则需复测，若复测仍满足dt<40，则试样中含有HPV16或HPV18基因型核酸；
若dt>40，则试样中不含有HPV16或HPV18基因型核酸，或试样中HPV16或HPV18基因型核酸浓度低于检测下限。
8.一种同时检测HPV16和HPV18基因型核酸的非疾病诊断方法，其包括以下步骤：
(1)向试样中加入核酸提取液进行核酸提取，获得分析检测样品；
(2)向所述分析检测样品中加入检测液1进行第一步反应，获得第一步反应液；
(3)向所述第一步反应液中加入SAT酶液进行第二步反应，获得第二步反应液；
(4)向所述第二步反应液中加入检测液2进行第三步反应，并进行实时荧光检测；其中所述检测液2中含有用于检测HPV16的第一靶标检测探针和用于检测HPV18的第二靶标检测探针，对所述第一靶标检测探针和第二靶标检测探针的核苷酸序列的5’端携带的不同的荧光报告基团所对应通道分别进行检测，获得各自的实时荧光检测的dt值；
(5)根据步骤(4)获得的实时荧光检测的dt值进行结果判定；
针对所述第一靶标检测探针所对应的通道，若dt≤35，则试样中含有HPV16基因型核酸；若35<dt<40，则需复测，若复测仍满足dt<40，则试样中含有HPV16基因型核酸；若dt>40，则试样中不含有HPV16基因型核酸，或试样中HPV16基因型核酸浓度低于检测下限；
针对所述第二靶标检测探针所对应的通道，若dt≤35，则试样中含有HPV18基因型核酸；若35<dt<40，则需复测，若复测仍满足dt<40，则试样中含有HPV18基因型核酸；若dt>40，则试样中不含有HPV18基因型核酸，或试样中HPV18基因型核酸浓度低于检测下限。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其中，
所述第一步反应的条件为40℃-45℃保温3-15min；和/或
所述SAT酶液使用前事先预热，预热温度为41-43℃；和/或
所述第二步反应的条件为41℃-43℃反应3-15min；和/或
所述第三步反应的条件为41℃-43℃反应30-50min。
10.根据权利要求7-9中任一项所述的方法，其中所述试样来源包括食品、血液制品、饮用水、河水、乳制品、物体表面附着物。
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