CN115175924A - 基于pd-1的针对冠状病毒感染的疫苗 - Google Patents

Abstract

公开了可溶性PD‑1(sPD‑1)蛋白和核酸，以及包含sPD‑1蛋白和核酸的治疗组合物，其用于增强受试者对冠状病毒感染的免疫力。公开了包含可溶性PD‑1蛋白片段和抗原性蛋白片段的可溶性PD‑1融合蛋白，优选地，所述抗原性蛋白片段包含冠状病毒蛋白片段。在某些形式中，冠状病毒蛋白片段衍生自冠状病毒受体结合域(RBD)或冠状病毒核蛋白(N)。在一些形式中，sPD‑1蛋白、核酸和组合物被配制成疫苗组合物。还公开了用于治疗处于冠状病毒感染风险或患有冠状病毒感染的受试者的方法。

Description

基于PD-1的针对冠状病毒感染的疫苗

本国际专利申请要求2020年2月26日提交的美国临时专利申请号：62/982,015的申请日的权益，其全部内容通过引用并入本文以用于所有目的。

发明领域

本发明总体上涉及针对冠状病毒感染的疫苗领域，尤其涉及针对冠状病毒感染的基于PD1的疫苗领域。

发明背景

2019年12月出现一种新型冠状病毒，被世界卫生组织(WHO)命名为2019新型冠状病毒(COVID-19；2019nCoV)。迄今为止，已有超过3万例实验室确诊感染，其中约2％的病例是致命的。2019nCoV已由来自受影响地区的人类传播。随后的流行有两种可能：(1)2019nCoV在当前施加巨大的干预措施后将从人类中消失；(2)2019nCoV可能成为普通感冒病毒，并像其他人类冠状病毒一样继续在人类中传播。自2002/2003年SARS冠状病毒以来，三种冠状病毒已跨越物种障碍并感染人类。有理由相信，未来可能会出现其他来自动物来源的冠状病毒并感染人类。针对当前正在进行的nCoV和未来新出现的冠状病毒需要快速反应和有效的疫苗。此外，人类对nCoV没有预先存在的免疫力，人们担心这种病毒可能会引起大流行，从而导致全球范围内显著的流动性和死亡率。迫切需要用于预防这种nCoV感染的疫苗。

主要在T细胞上表达的程序性死亡1(PD-1或PD1)是B7-H1分子(也称为程序性死亡配体1(PD-L1))和B7-DC分子(也称为程序性死亡配体2(PD-L2))的受体。PD-L1在许多不同的细胞类型上表达，而PD-L2仅在抗原呈递细胞如B细胞、树突状细胞和巨噬细胞上表达。

将阴性信号传递给免疫细胞的PD-1/PD-L通路在感染期间的免疫应答调节中发挥关键作用。PD-1与PD-L1/L2的相互作用在感染期间抑制T细胞功能。在慢性感染期间抗PD-1抗体对PD-1的阻断可导致增强的B细胞应答以及病毒特异性多功能CD8 T细胞的快速增殖和恢复。PD-1/PD-L通路的阻断还有助于在病毒感染期间体液和细胞介导的免疫应答的恢复。

有必要制定新的策略，以开发具有广泛交叉保护活性的针对2019新型冠状病毒(nCoV)的有效疫苗。

本发明的一个目的是提供针对冠状病毒感染的疫苗。

本发明的另一个目的是提供产生针对冠状病毒感染的疫苗的方法。

本发明的另一个目的是提供在哺乳动物中引发针对冠状病毒的免疫应答的方法。

对本说明书中包括的文件、行为、材料、装置、物品等的任何讨论不应被视为承认任何或所有这些事项由于在本申请的每个权利要求的优先权日之前存在而构成现有技术基础的一部分或者是与本公开相关领域的公知常识。

发明概述

公开了可溶性PD-1(sPD-1)蛋白和核酸，以及包含sPD-1蛋白和核酸的治疗组合物，其用于增强受试者对冠状病毒感染的免疫力。在一些形式中，sPD-1蛋白、核酸和组合物被配制成疫苗组合物。

在某些形式中，sPD-1蛋白是sPD-1蛋白变体。在一些形式中，sPD-1蛋白变体是mspd1-14del，其具有包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列。在一些形式中，sPD-1蛋白变体是mspd1-322mu，其具有包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列。在某些形式中，sPD-1蛋白变体是hspd1-14del，其存在于健康中国人中。hspd1-14del变体具有包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列。

还公开了编码sPD-1蛋白的核酸分子。在一些形式中，核酸分子编码mspd1-14del，并具有包含SEQ ID NO：4的序列。在一些形式中，核酸分子编码mspd1-322mu，并具有包含SEQ ID NO：6的序列。在一些形式中，核酸分子编码hspd1-14del，并具有包含SEQ ID NO：10的序列。

还公开了sPD-1融合蛋白。在一些形式中，sPD-1融合蛋白包含选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：9的氨基酸序列，和选自SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12的氨基酸序列。还公开了sPD-1融合核酸分子，其编码sPD-1融合蛋白。在一些形式中，sPD-1融合核酸包含选自SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：10的核酸序列和编码选自SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12的氨基酸序列的核酸序列。

还公开了用于治疗处于冠状病毒感染风险或患有冠状病毒感染的受试者的方法。总体作用是在受试者中诱导抗原特异性保护性免疫。有利地，所公开的方法增强宿主体液和细胞介导的免疫。该方法通常包括向需要这种治疗的受试者施用有效量的如所公开的融合蛋白或融合核酸分子。在某些形式中，该方法可用于治疗冠状病毒感染。在某些形式中，该方法可用于降低冠状病毒感染的风险。在某些形式中，该方法可用于治疗活动性冠状病毒感染。在某些形式中，冠状病毒感染可以是COVID-19、SARS或MERS。此外，这些方法可用于预防和/或治疗肿瘤或癌症。

还公开了治疗或药物组合物。在一些形式中，组合物包含治疗有效量的如所公开的PD-1融合蛋白和/或sPD-1融合核酸分子，以及任选的药学上可接受的载体。在一些形式中，治疗组合物是疫苗组合物。

公开了包含可溶性PD-1蛋白片段和抗原性蛋白片段的可溶性PD-1融合蛋白。在一些形式中，可溶性PD-1蛋白片段包含选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：3、SEQ IDNO：5和SEQ ID NO：9的氨基酸序列。在一些形式中，抗原性蛋白片段包含冠状病毒蛋白片段。

在某些形式中，冠状病毒蛋白片段衍生自冠状病毒受体结合域(RBD)或冠状病毒核蛋白(N)。在某些形式中，冠状病毒蛋白片段衍生自COVID-19、SARS或MERS。在某些形式中，冠状病毒蛋白片段衍生自COVID-19受体结合域(RBD)或COVID-19核蛋白(N)。

在一些形式中，PD-1融合蛋白可以进一步包含Fc结构域。

在一些形式中，PD-1融合蛋白可以进一步包含接头序列。在一些形式中，接头序列连接可溶性PD-1蛋白片段和抗原性蛋白片段。

在一些形式中，PD-1融合蛋白包含选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：9的氨基酸序列和选自SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12的氨基酸序列。

还公开了编码所公开的PD-1融合蛋白的sPD-1融合核酸分子。在一些形式中，sPD-1融合核酸分子包含选自SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:10的核酸序列和编码选自SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12的氨基酸序列的核酸序列。

还公开了包含所公开的sPD-1融合核酸分子的疫苗组合物。还公开了包含所公开的PD-1融合蛋白的疫苗组合物。

还公开了用于治疗处于冠状病毒感染风险或患有冠状病毒感染的受试者的方法。在一些形式中，该方法包括向受试者施用有效量的所公开的sPD-1融合核酸或所公开的疫苗组合物。在一些形式中，该方法包括向受试者施用有效量的所公开的PD-1融合蛋白或所公开的疫苗组合物。

在某些形式中，冠状病毒感染是COVID-19、SARS或MERS。在一些形式中，sPD-1融合核酸包含编码冠状病毒蛋白片段的核酸片段，其中冠状病毒蛋白片段衍生自COVID-19受体结合域(RBD)或COVID-19核蛋白(N)，并且其中冠状病毒感染是COVID-19。

在一些形式中，sPD-1融合核酸包含选自SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：10的核酸序列和编码选自SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12的氨基酸序列的核酸序列。

在一些形式中，sPD-1融合核酸通过注射施用。在一些形式中，sPD-1融合核酸通过电穿孔施用。

还公开了用于治疗处于冠状病毒感染风险或患有冠状病毒感染的受试者的方法，其包括向受试者施用有效量的所公开的PD-1融合蛋白。在某些形式中，冠状病毒感染是COVID-19、SARS或MERS。在某些形式中，冠状病毒蛋白片段衍生自COVID-19受体结合域(RBD)或COVID-19核蛋白(N)。

在某些形式中，受试者处于感染冠状病毒的风险中。在某些形式中，受试者患有冠状病毒感染。

还公开了制备所公开的PD-1融合蛋白、sPD-1融合核酸和疫苗组合物的方法。示例性的冠状病毒抗原性蛋白片段包括受体结合域(RBD)和核蛋白(N)。

还公开了药物组合物。药物组合物可以包含所公开的PD-1融合蛋白或sPD-1融合核酸。药物组合物通常包含有效量的疫苗，以在施用于有需要的受试者时在受试者中诱导免疫应答。药物组合物可以包含另外的试剂，例如增强免疫应答的佐剂。在一些形式中，药物组合物不包含佐剂。在一些形式中，组合物可以包含有效量的sPD-1融合核酸分子，该融合核酸分子包含选自SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:10的核酸序列，以及编码选自SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12的氨基酸序列的核酸序列。在一些形式中，组合物可以包含有效量的PD-1融合蛋白，该融合蛋白包含选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：9的氨基酸序列以及选自SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12的氨基酸序列。

还提供了通过将药物组合物施用于有需要的受试者来治疗受试者的方法。这些方法可以是疫苗方案。因此，在一些形式中，向受试者施用组合物以提供针对冠状病毒例如COVID-19的预防性或治疗性保护。所公开的PD-1融合蛋白和sPD-1融合核酸分子可以通过皮下(sc)、皮内(id)、肌肉内(im)、静脉内(iv)、经口或鼻内施用或通过注射或吸入施用于有需要的哺乳动物。在某些形式中，疫苗可以肌肉内施用。含有PD-1融合蛋白或sPD-1融合核酸分子的组合物施用于需要针对冠状病毒感染的保护性免疫的哺乳动物。

附图说明

图1是PD-1-nCoV-RBD DNA疫苗示意图。该疫苗编码在pVAX质粒骨架中的CMV启动子/增强子元件控制下的重组抗原，该重组抗原由与2019-nCoV RBD的N末端融合的可溶性人PD-1结构域组成。

图2是PD-1-nCoV-N DNA疫苗示意图。该疫苗编码在pVAX质粒骨架中的CMV启动子/增强子元件控制下的重组抗原，该重组抗原由与2019-nCoV N抗原的N末端融合的可溶性人PD-1结构域组成。

序列概述

SEQ ID NO：1是野生型小鼠PD-1的可溶性胞外结构域的氨基酸序列(小鼠spd1)。

SEQ ID NO：2是野生型小鼠spd1DNA的核酸序列。

SEQ ID NO：3是mspd1-14del的氨基酸序列。

SEQ ID NO：4是mspd1-14del DNA的核酸序列。

SEQ ID NO：5是mspd1-322mu的氨基酸序列。

SEQ ID NO：6是mspd1-322mu DNA的核酸序列。

SEQ ID NO：7是野生型人PD-1的可溶性胞外结构域的氨基酸序列(人spd1)。

SEQ ID NO：8是野生型人spd1DNA的核酸序列。

SEQ ID NO：9是hspd1-14del的氨基酸序列。

SEQ ID NO：10是hspd1-14del DNA的核酸序列。

SEQ ID NO：11是COVID-19RBD蛋白的氨基酸序列。

SEQ ID NO：12是COVID-19N蛋白的氨基酸序列。

SEQ ID NO：13是对本发明有用的兔Fc结构域的氨基酸序列。

SEQ ID NO：14是对本发明有用的兔Fc DNA的核酸序列。

SEQ ID NO：15是根据本发明有用的接头序列的氨基酸序列。

SEQ ID NO：16是根据本发明有用的接头序列的氨基酸序列。

SEQ ID NO：17是根据本发明有用的接头序列的氨基酸序列。

SEQ ID NO：18是根据本发明有用的接头序列的氨基酸序列。

SEQ ID NO：19是根据本发明有用的接头序列的氨基酸序列。

SEQ ID NO：20是根据本发明有用的接头序列的氨基酸序列。

SEQ ID NO：21是根据本发明有用的接头序列的氨基酸序列。

SEQ ID NO：22是根据本发明有用的接头序列的氨基酸序列。

SEQ ID NO：23是根据本发明有用的接头序列的氨基酸序列。

SEQ ID NO：24是根据本发明有用的接头序列的氨基酸序列。

SEQ ID NO：25是根据本发明有用的氨基酸序列。

SEQ ID NO：26是根据本发明有用的氨基酸序列。

发明详述

当前爆发的新型冠状病毒(CoV)，2019-nCoV，已成为重大的健康问题，需要立即进行生物医学干预。快速生成安全有效的疫苗以诱导针对病毒的强大保护性免疫是阻止感染传播的重要关键措施之一。本文公开了两种基于靶向树突状细胞的程序性死亡-1(PD-1)的DNA疫苗，其分别表达2019-nCoV受体结合域(RBD)和核蛋白(N)，即PD-1-nCoV-RBD和PD-1-nCoV-N，旨在在预防和治疗环境中在人类中诱导对2019-nCoV感染的免疫保护。

PD-1-nCoV-RBD疫苗由pVAX质粒组成，该质粒编码重组抗原，该重组抗原由融合至nCoV RBD的N末端的人可溶性PD-1结构域组成。同样，PD-1-nCoV-N疫苗也在pVAX质粒骨架中，并具有基因表达盒，该基因表达盒编码融合至nCoV N蛋白的N末端的人可溶性PD-1结构域的重组抗原。

一旦用这些疫苗进行免疫，接种者体内就会产生重组PD-1标记的抗原。抗原上的可溶性PD-1结构域将结合至专职抗原呈递细胞(如树突状细胞)上组成型表达的PD-1配体。这将导致树突状细胞更好地摄取和呈递抗原，从而增强对抗体和T细胞免疫应答的诱导。早先已经证明了使用不同抗原的基于PD-1的DNA疫苗的效用(美国专利号9,029,315)。该平台已应用于设计和产生所公开的新型冠状病毒特异性抗原构建体。这些基于PD-1的疫苗用于在宿主体内诱导中和抗体和T细胞应答，以预防和/或控制CoV感染。基础DNA疫苗载体已被证明是安全的，并且不存在针对所用疫苗载体的预先存在的免疫力问题。此外，所公开的疫苗产生的免疫还应具有最小的副作用，包括抗体依赖性感染增强。

目前市场上没有针对2019-nCoV或其他冠状病毒的获批疫苗。

目前，对于2019-nCoV或其他类型的冠状病毒，没有获得批准的预防性或治疗性疫苗。

据媒体报道，国内外多个研究团队和公司正在尝试使用不同类型的载体生产针对2019-nCoV的疫苗，这些载体包括甲型流感病毒载体、腺病毒载体、基于mRNA的疫苗等。然而，没有任何关于这些疫苗的免疫原性或效力的公开。

所公开的材料和方法解决了以下问题：(1)2019-nCoV感染的大规模爆发，(2)缺乏可用于2019-nCoV病毒的保护性疫苗，以及(3)缺乏有效的可用于治疗2019-nCoV感染患者的治疗方法。这些问题通过例如所公开的基于PD-1的2019-nCoV疫苗(PD-1-nCoV-RBD和PD-1-nCoV-N)来解决，其可用作预防措施以在健康宿主中引发保护性免疫和/或可用作治疗措施以帮助控制感染患者中的病毒载量和相关病理学。

可以通过例如以下方式来促进所公开的DNA疫苗的开发和生产：在体外测试疫苗在哺乳动物细胞系中产生重组PD-1融合抗原的能力以及这些抗原结合PD-1配体的能力；在动物模型(包括但不限于小鼠和恒河猴)中测试它们的安全性、免疫原性和保护功效；以及大量生产GMP级疫苗用于临床前评估和临床测试。

公开了可以用于所公开的方法和组合物、可以与所公开的方法和组合物联合使用、可以用于制备所公开的方法和组合物或者是所公开的方法和组合物的产物的材料、组合物和组分。本文公开了这些和其他材料，并且应当理解，当公开了这些材料的组合、子集、相互作用、组等时，虽然可能未明确公开这些化合物的每种不同的单独和集体组合和排列的具体提及，但本文具体考虑和描述了每种。例如，如果公开和讨论了一种抗原，并且讨论了可以对包括该抗原的多种分子或组合物进行的多种修饰，则特别考虑了该抗原和可能的修饰的每种组合和排列，除非明确给出了相反说明。因此，如果公开了一类分子A、B和C以及一类分子D、E和F，并且公开了组合分子A-D的实例，则即使没有单独列举每一个，也单独和组合考虑每一个。因此，在该实例中，具体考虑了组合A-E、A-F、B-D、B-E、B-F、C-D、C-E和C-F中的每一种，并且这些组合应当被认为从A、B和C，D、E和F以及实例组合A-D中所公开。同样，这些的任何子集或组合也被具体考虑和公开。因此，例如，具体考虑了A-E、B-F和C-E的子组，并且这些子组应当被认为从A、B和C，D、E和F以及实例组合A-D中所公开。此外，如上所设想和公开的材料、组合物、组分等中的每一个也可以具体且独立地包括或排除在此类材料的任何组、子组、列表、集合等中。这些概念适用于本申请的所有方面，包括但不限于制备和使用所公开的组合物的方法中的步骤。因此，如果存在可以执行的多个附加步骤，则应当理解，这些附加步骤中的每一个都可以通过所公开方法的任何具体实施方案或实施方案的组合来执行，并且每个这样的组合都被具体考虑并且应当被认为是公开的。

A.定义

如本文所用，术语“佐剂”是指增强免疫应答的化合物或混合物。

如本文所用，“自体”是指源自自身。

术语“儿童”是指年龄在0个月至18岁之间的人或哺乳动物，“幼儿”是指小于5岁的儿童。

如本文所用，术语“有效量”或“治疗有效量”是指足以治疗、抑制或减轻所治疗疾病状态的一种或多种症状或以其他方式提供所需药理作用的剂量。精确剂量将根据多种因素而变化，例如受试者相关变量(例如，年龄、免疫系统健康等)、疾病和受试者的年龄。

如本文所用，术语“基因”是指核酸(例如，DNA或RNA)序列，其包括产生多肽、RNA(例如，包括但不限于，mRNA、tRNA和rRNA)或前体所必需的编码序列。多肽、RNA或前体可由全长编码序列或其任何部分编码。该术语还包括结构基因的编码区和临近编码区5’和3’端任一端约1kb距离的序列，使得基因对应于全长mRNA的长度。术语“基因”包括基因的cDNA和基因组形式，其可以由DNA或RNA构成。基因的基因组形式或克隆可以包含被称为“内含子”或“间插区”或“间插序列”的非编码序列中断的编码区。内含子是转录成核RNA(hnRNA)的基因片段；内含子可含有调节元件，例如增强子。内含子从核或初级转录本中被去除或“剪切”；因此，信使RNA(mRNA)转录本中不存在内含子。mRNA在翻译过程中起作用以指定新生多肽中氨基酸的序列或顺序。

与蛋白质或组合物有关的术语“免疫原性”或“抗原性”是指蛋白质或组合物可以诱导免疫应答并因此具有抗原性。“免疫应答”是指免疫系统的任何反应。这些反应包括生物体免疫系统响应抗原的活性的改变，并且可以涉及例如抗体产生、细胞介导的免疫的诱导、补体激活或免疫耐受的发展。

术语“经鼻施用”是指任何形式的施用，其中活性成分被推进或以其他方式引入受试者的鼻道，从而使其接触鼻腔的呼吸道上皮细胞，从该上皮细胞被吸收到体循环中。经鼻施用还可以涉及接触嗅觉上皮，嗅觉上皮位于中央鼻中隔和每个主鼻道侧壁之间的鼻腔顶部。紧邻嗅觉上皮的鼻腔区域没有气流。因此，通常必须采用专门的方法来实现通过嗅觉上皮的显著吸收。

术语“口服”、“肠”、“肠内”、“经口”、“非肠胃外”、“非肠胃外地”等是指通过沿消化道的途径或模式向个体施用化合物或组合物。组合物的“口服”施用途径的实例包括但不限于从口中吞咽液体或固体形式的疫苗组合物、通过鼻空肠或胃造口管施用疫苗组合物、十二指肠内施用和直肠施用疫苗组合物，例如，使用释放本文所述的活细菌疫苗株的栓剂。

如本文所用的术语“哺乳动物”包括人类和非人类，并且包括但不限于人类、非人灵长类动物、犬科动物、猫科动物、鼠科动物、牛科动物、马科动物和猪科动物。

术语“局部施用”是指将药剂施用于皮肤或黏膜的外表面(包括鼻、肺和口的表面膜)，使得药剂穿过皮肤或黏膜的外表面并进入下层组织。局部施用可导致药剂有限地分布到皮肤和周围组织，或者当药剂通过血流从治疗区域移除时，导致药剂的全身分布。在优选的形式中，药剂通过透皮递送，例如，使用透皮贴剂来递送。透皮递送是指药剂穿过皮肤(角质层和表皮)的扩散，皮肤(角质层和表皮)充当少数药剂能够穿透的屏障。相反，真皮对许多溶质和药物的吸收是可渗透的，因此局部施用更容易通过擦伤的皮肤或以其他方式剥离表皮而暴露真皮的皮肤发生。通过完整皮肤的吸收可以通过在施用于皮肤之前将活性剂与油性载体(例如，乳膏、润肤剂、渗透增强剂等，如例如Remington's PharmaceuticalSciences，当前版本，Gennaro等人编辑中所述)组合来增强(称为涂抹的过程)。

如本文所用，术语“肽”是指由化学结合在一起的氨基酸组成的一类化合物。通常，氨基酸通过酰胺键(CONH)化学结合在一起；然而，氨基酸也可以通过本领域已知的其他化学键结合在一起。例如，氨基酸可以通过胺键结合。如本文所用的肽包括氨基酸的寡聚体以及小肽和大肽，包括多肽。

如本文所用，“重组DNA”是指从不同来源提取并化学结合在一起的DNA分子；例如，包括来自一个来源的基因的DNA可以与来自另一个来源的DNA重组。重组DNA可以是所有异源DNA或同源和异源DNA的组合。重组DNA可以整合到细胞染色体中并表达，或者可以通过染色体外的方式例如质粒进行表达。

如本文所用，“变体”、“突变体”或“突变的”多核苷酸或多肽包含与对应的野生型或亲本多核苷酸或多肽的多核苷酸或多肽序列相比的至少一种多核苷酸或多肽序列改变。突变可以是自然的、故意的或偶然的。突变包括替换、缺失和插入。

B.组合物

公开了可溶性PD-1(sPD-1)蛋白和核酸，以及包含可溶性PD-1蛋白和核酸的治疗组合物，其可用于诱导针对冠状病毒感染的抗原特异性保护性免疫。在一些形式中，主题sPD-1蛋白、核酸和组合物被配制成疫苗组合物。在一些形式中，融合蛋白可以是mspd1-nCoV-RBD、mspd1-14del-nCoV-RBD、mspd1-322mu-nCoV-RBD、hspd1-14del-nCoV-RBD、mspd1-nCoV-N、mspd1-14del-nCoV-N、mspd1-322mu-nCoV-N和hspd1-14del-nCoV-N，以及编码这些融合蛋白的核酸分子。

所公开的组合物和方法利用免疫调节性PD-1/PD-L通路下调病毒特异性CD8⁺ T细胞应答。特别是，使用了不与PD-L1或PD-L2(PD-1的配体)相互作用的PD-1变体。

在一些形式中，所公开的疫苗被设计为通过将可溶性PD-1与冠状病毒的抗原融合来模拟程序性死亡-1(PD-1)与在树突状细胞(DCs)上表达的其配体的结合而用于功能性活化。在一些形式中，所公开的融合DNA疫苗可以引发强大的抗抗原抗体效价，包括IgG1(Th2)和IgG2a(Th1)应答。免疫后可诱导高频率的抗原特异性、广泛反应和多功能的T细胞，尤其是CD8⁺ T细胞。在某些形式中，应答可以是剂量依赖性的和持久的。因此，基于可溶性PD-1的疫苗接种提供了一种简单、可重复且有效的方法来诱导针对冠状病毒的持久和保护性CD8⁺细胞免疫，这对冠状病毒疫苗的开发具有重要意义。

在某些形式中，mspd1-14del蛋白变体是通过缺失野生型mspd1的氨基酸26-39获得的。氨基酸26-39是由野生型小鼠PD-1基因的第二个外显子编码的前14个氨基酸。mspd1的这14个氨基酸与由人类hspd1-14del同源物的第二个外显子编码的前14个氨基酸具有相同的序列。mspd1-322mu蛋白变体是通过将野生型PD-1蛋白的第108位氨基酸残基从Met改变为Val获得的。hspd1-14del变体衍生自人类PD-1的天然同种型，缺失了野生型hspd1的第26-39位氨基酸(由野生型人PD-1基因的第二外显子的第一部分编码)。

mspd1融合蛋白与PD-1配体PD-L1和PD-L2结合，而PD-1与PD-L的结合可被抗PD-L1/L2抗体阻断。推测mspd1融合蛋白的结合抑制了PD-1/PD-L通路，其将阴性信号传递给免疫细胞。相比之下，mspd1-14del、mspd1-322mu和hspd1-14del融合蛋白均不与PD-L1或PD-L2结合。这表明由sPD-1的外显子2中的DNA编码的氨基酸残基26-39和msPD-1的氨基酸残基108Met对于PD-L结合很重要。

有利地，mspd1、mspd1-14del、mspd1-322mu和hspd1-14del融合蛋白或其融合DNA的施用可以增强抗原特异性免疫应答。

C.PD-1变体和融合构建体

所公开的融合蛋白可以使用sPD-1蛋白变体。在一些形式中，sPD-1蛋白变体是通过缺失野生型sPD-1蛋白的氨基酸残基26-39而获得的。野生型sPD-1蛋白优选是哺乳动物来源的(例如野生型小鼠、兔、非人灵长类动物或猪PD-1蛋白)，更优选地，是人来源的。

在一些形式中，sPD-1蛋白变体是mspd1-14del，其具有包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列。在一些形式中，sPD-1蛋白变体是mspd1-322mu，其具有包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列。在一些形式中，sPD-1蛋白变体是hspd1-14del，其具有包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列。

在一些形式中，PD-1蛋白变体可以与mspd1-14del(SEQ ID NO:3)、mspd1-322mu(SEQ ID NO:5)或hspd1-14del(SEQ ID NO:9)同源。在一些形式中，sPD-1蛋白变体具有与SEQ ID NO:3至少约95％、96％、97％、98％、99％或99.5％相同的氨基酸序列。在一些形式中，sPD-1蛋白变体具有与SEQ ID NO:5至少约95％、96％、97％、98％、99％或99.5％相同的氨基酸序列。在一些形式中，sPD-1蛋白变体具有与SEQ ID NO:9至少约95％、96％、97％、98％、99％或99.5％相同的氨基酸序列。

还公开了编码所公开的sPD-1蛋白的核酸分子。核酸分子包括DNA分子(例如基因组DNA和cDNA)和RNA分子。此外，所公开的核酸分子可以是单链或双链的。

在一些形式中，核酸分子编码sPD-1蛋白，该蛋白通过缺失野生型sPD-1蛋白(例如野生型人、小鼠或兔sPD-1蛋白质)的氨基酸残基26-39而获得。在一些形式中，核酸分子编码mspd1-14del，并具有包含SEQ ID NO：4的序列。在一些形式中，主题核酸分子编码mspd1-322mu，并且具有包含SEQ ID NO：6的序列。在一些形式中，主题核酸分子编码hspd1-14del，并且具有包含SEQ ID NO：10的序列。

在一些形式中，核酸分子可以与编码mspd1-14del、mspd1-322mu或hspd1-14del的核酸同源。在一些形式中，核酸分子具有与SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:10至少约95％、96％、97％、98％、99％或99.5％相同的序列。

还公开了PD-1融合蛋白。在一些形式中，PD-1融合蛋白可以包含与抗原性蛋白片段融合的sPD-1蛋白片段，其中抗原性蛋白片段是冠状病毒蛋白片段。在一些形式中，sPD-1融合蛋白包含Fc结构域。在某些形式中，可溶性PD-1蛋白通过接头序列与抗原连接。在一些形式中，PD-1融合蛋白包含任选地经由接头序列与Fc结构域融合的PD-1蛋白。

在一些形式中，sPD-1融合蛋白包含野生型小鼠可溶性PD-1蛋白(mspd)，其具有包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。在一些形式中，sPD-1融合蛋白包含野生型人sPD-1蛋白(hspd1)，其具有包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列。在一些形式中，sPD-1融合蛋白是变体小鼠sPD-1蛋白mspd1-14del，其具有包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列。在一些形式中，sPD-1融合蛋白是变体小鼠sPD-1蛋白mspd1-322mu，其具有包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列。在一些形式中，sPD-1蛋白是变体人sPD-1蛋白(hspd1-14del)，并且具有包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列。

抗原性蛋白片段可以衍生自任何冠状病毒株的任何冠状病毒蛋白。优选地，冠状病毒株是COVID-19、SARS或MERS。优选地，冠状病毒蛋白片段衍生自冠状病毒RBD或N。

在一些形式中，可溶性PD-1、其变体及其融合蛋白用作分子或蛋白质佐剂以增强免疫应答。此外，也可以将编码可溶性PD-1、其变体及其融合蛋白的核酸分子施用于受试者以增强免疫应答。

在一些形式中，抗原性蛋白片段衍生自冠状病毒蛋白结构域的免疫原性片段，包括但不限于RBD和N。在某些形式中，抗原蛋白衍生自COVID-19RBD或COVID-19N。在一些形式中，抗原蛋白包含SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12。在一些形式中，sPD-1融合蛋白还包含Fc结构域。在一些形式中，sPD-1融合蛋白包含用于蛋白质纯化目的的兔Fc结构域。

术语“Fc结构域”涵盖天然人和动物Fc和Fc变体分子和序列的全长和片段，包括例如IgG、IgM、IgD、IgE、IgA和亚型例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。与Fc变体和天然Fc一样，术语“Fc结构域”包括单体或多聚体形式的分子，无论是从整个抗体消化的还是通过其他方式产生的。

术语“Fc变体”是指从天然Fc修饰但仍包含补救受体(salvage receptor)结合位点的分子或序列。Fc结构域包括具有共价、非共价或通过共价和非共价相互作用缔合的两条或更多条多肽链的分子。IgG分子通常形成二聚体；IgM，五聚体；IgD，二聚体；和IgA，单体、二聚体、三聚体或四聚体。多聚体可以通过利用Fc的天然Ig源的序列和所得活性或通过衍生(如下定义)这种天然Fc来形成。

Fc结构域可以是任何同种型的抗体，包括IgG、IgA、IgE、IgD和IgM。IgG同种型抗体可进一步细分为IgG1、IG2、IgG3和IgG4亚型。IgA抗体可进一步细分为IgA1和IgA2亚型。在一些形式中，Fc结构域是IgG1。

在一些形式中，sPD-1融合蛋白包含将可溶性PD-1结构域与抗原连接的接头序列。此外，Fc结构域也可以通过接头序列与融合蛋白连接。接头序列通常是肽链。肽的长度可以是例如6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40、50或更多个氨基酸残基，但通常在5到25个残基之间。

取决于长度和侧链组成，接头可以具有，但不必须具有，比平均柔韧性更大的柔韧性。可以使用本领域已知的算法计算柔韧性。在某些形式中，接头序列是SEQ ID NO:15。可用接头的实例包括但不限于9Gly(SEQ ID NO:16)，9Glu(SEQ ID NO:17)，9Ser(SEQ ID NO:18)，5GlyCys2ProCys(SEQ ID NO:19)，4Gly3Ser(SEQ ID NO:20)，Ser Cys Val Pro LeuMet Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn(SEQ ID NO:21)，Pro Ser Cys Val Pro Leu Met ArgCys Gly Gly Cys Cys Asn(SEQ ID NO:22)，Gly Asp Leu Ile Tyr Arg Asn Gln Lys(SEQID NO:23)，和9GlyProSerCysValProLeuMetArgCysGlyGlyCysCysAsn(SEQ ID NO:24)。

在一些形式中，主题sPD-1融合蛋白包含PD-1-CoV-RBD或PD-1-CoV-N。

还公开了sPD-1融合核酸构建体，其包含编码公开的sPD-1融合蛋白的核酸分子。在一些形式中，sPD-1融合构建体包含与编码冠状病毒抗原的核酸融合的编码sPD-1蛋白的核酸分子。在一些形式中，PD-1融合构建体包含Fc DNA。在某些形式中，可溶性PD-1DNA通过接头序列与抗原DNA连接。任选地，Fc DNA通过接头DNA序列与sPD-1-抗原DNA连接。

本发明公开的抗原性核酸分子编码冠状病毒的免疫原性片段。

在一些形式中，抗原性核酸分子编码冠状病毒抗原。在某些形式中，编码的冠状病毒抗原是COVID-19RBD(SEQ ID NO:11)。在一些形式中，编码的冠状病毒抗原是COVID-19N(SEQ ID NO:12)。

在一些形式中，融合核酸分子包含野生型小鼠PD-1(mspd1)DNA(SEQ ID NO:2)。在一些形式中，融合核酸分子包含野生型人PD-1(hspd1)DNA(SEQ ID NO:8)。在一些形式中，融合核酸分子包含变体小鼠PD-1DNA，其具有SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6的序列。在一些形式中，融合核酸分子包含变体人PD-1DNA，其具有SEQ ID NO：10的序列。

在一些形式中，所公开的PD-1融合蛋白或sPD-1融合核酸通常基本上不含其他组分，例如其他生物分子、蛋白或肽、核酸、脂质和碳水化合物。如本文所用，术语“基本上不含”包括准备的材料，例如所公开的蛋白、化合物和核酸，其具有小于约20％、10％和优选小于5％(按干重计)的污染因子(如生物分子、蛋白或肽、核酸、脂质和碳水化合物以及其他细胞组分)。

如果需要，公开的蛋白质和核酸分子可以通过任何合适的方法进行修饰。有时使用随机诱变进行蛋白质优化策略。在这些情况下，随机挑选位置，或者使用过分简单的规则进行氨基酸变化。例如，所有残基都可以突变为丙氨酸，称为丙氨酸扫描。此外，除特定例举或天然存在于融合蛋白中的那些取代以外的氨基酸的取代也在本发明的范围内。例如，可以用非天然氨基酸取代融合蛋白的氨基酸，只要具有取代的氨基酸的融合蛋白基本上保留与氨基酸没有被取代的融合蛋白相同的功能活性即可。

非天然氨基酸的实例包括但不限于鸟氨酸、瓜氨酸、羟脯氨酸、高丝氨酸、苯基甘氨酸、牛磺酸、碘酪氨酸、2,4-二氨基丁酸、α-氨基异丁酸、4-氨基丁酸、2-氨基丁酸、γ-氨基丁酸、ε-氨基己酸、6-氨基己酸、2-氨基异丁酸、3-氨基丙酸、正亮氨酸、正缬氨酸、肌氨酸、高瓜氨酸、磺基丙氨酸、τ-丁基甘氨酸、τ-丁基丙氨酸、苯基甘氨酸、环己基丙氨酸、β-丙氨酸、氟代氨基酸、设计者氨基酸如β-甲基氨基酸、C-甲基氨基酸、N-甲基氨基酸和通常的氨基酸类似物。非天然氨基酸还包括具有衍生化的侧基的氨基酸。此外，蛋白中的任何氨基酸可以是D(右旋)形式或L(左旋)形式。

所公开的核酸分子可以是编码功能性融合蛋白的核酸分子的变体。变体序列包括其中序列的一个或多个核苷酸已被取代、缺失和/或插入的那些序列。

可取代DNA的天然核苷酸的核苷酸具有碱基部分，该碱基部分可以包括但不限于肌苷、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、次黄嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、5-甲基胞嘧啶和三苯甲基化碱基。序列中核苷酸的糖部分也可以被修饰，包括但不限于阿拉伯糖、木酮糖和己糖。此外，核苷酸的腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶碱基可以用乙酰基、甲基和/或硫代基团修饰。可以使用本领域已知的标准技术制备和测试包含核苷酸取代、缺失和/或插入的序列。

除非另有规定，否则如本文所使用的两个序列的百分比序列同一性和/或相似性可以使用如Karlin和Altschul(1993)中修改的Karlin和Altschul(1990)的算法来确定。这样的算法并入Altschul等人(1990)的NBLAST和XBLAST程序中。可以用NBLAST程序、评分＝100、字长＝12进行BLAST搜索，以获得具有期望百分比序列同一性的序列。为了获得用于比较目的的有缺口的比对，可以如Altschul等人(1997)中所述使用Gapped BLAST。当利用BLAST和Gapped BLAST程序时，可以使用各自程序(NBLAST和XBLAST)的默认参数。参见NCBI/NIH网站。

公开的核酸分子可以具有与公开的核酸序列足够同源，从而允许在标准严格条件和标准方法下与该序列杂交的序列(Maniatis等人，1982)。如本文所用，杂交的“严格”条件是指其中通常在6x SSPE,5x Denhardt溶液,0.1％SDS,0.1mg/ml变性DNA中在低于DNA杂合体熔解温度(Tm)的20-25℃下过夜进行杂交的条件。下式(Beltz等人，1983)描述了熔解温度Tm：Tm＝81.5C+16.6Log[Na+]+0.41(％G+C)-0.61(％甲酰胺)-600/双链体的碱基对长度。

洗涤通常如下进行：

(1)在室温下在1x SSPE,0.1％SDS中两次15分钟(低严格洗涤)。

(2)在Tm-20℃下在0.2x SSPE,0.1％SDS中一次15分钟(中等严格洗涤)。

还公开了包含PD-1核酸分子或其融合构建体的表达构建体。所公开的表达构建体通常包含在该表达构建体待表达的预期宿主细胞中有功能的调控元件。调节元件包括启动子、转录终止序列、翻译终止序列、增强子和多腺苷酸化元件。

表达构建体可以包含可操作地连接至编码肽的核酸序列的启动子序列，所述肽例如为可溶性PD-1融合蛋白。启动子的多个拷贝或多个启动子可用于表达构建体中。在某些形式中，启动子与转录起始位点的距离可以与其在其天然遗传环境中与转录起始位点的距离大致相同。在启动子活性没有显著下降的情况下，该距离的一些变化是允许的。表达构建体中通常包括转录起始位点。

对于在动物细胞中的表达，表达构建体可以包含可驱动多核苷酸序列转录的合适启动子。对于哺乳动物细胞，合适的启动子包括例如Pcmv、肌动蛋白启动子、金属硫蛋白启动子、NF-κB启动子、EGR启动子、SRE启动子、IL-2启动子、NFAT启动子、骨钙蛋白启动子、SV40早期启动子和SV40晚期启动子、Lck启动子、BMP5启动子和TRP-1启动子。

1.佐剂

所公开的组合物和疫苗可以与其他免疫调节剂，包括佐剂联合施用。可用的佐剂包括但不限于以下列出的一种或多种：

含矿物质的佐剂组合物包括矿物盐，例如铝盐和钙盐。示例性矿物盐包括氢氧化物(例如羟基氧化物)、磷酸盐(例如羟基磷酸盐、正磷酸盐)、硫酸盐等或不同矿物化合物的混合物(例如磷酸盐和氢氧化物佐剂的混合物，任选地具有过量的磷酸盐)，其中化合物采用任何合适的形式(例如，凝胶、结晶、无定形等)，并且优选吸附到盐上。含矿物质的组合物也可以配制成金属盐颗粒(WO/0023105)。铝盐可以包含在组合物中，使得Al³⁺的剂量在0.2-1.0mg/剂之间。

适合用作佐剂的油乳液佐剂可以包括角鲨烯-水乳剂，例如MF59(5％角鲨烯、0.5％吐温80和0.5％司盘85，使用微流化器配制成亚微米颗粒)。参见例如WO90/14837和Podda，Vaccine 19：2673-2680，2001。用于组合物中的其他佐剂是亚微米水包油乳液。用于本文的亚微米水包油乳液的实例包括任选含有不同量MTP-PE的角鲨烯/水乳液，例如含有4-5％w/v角鲨烯、0.25-1.0％w/v吐温80(聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯)和/或0.25-1.0％司盘85(脱水山梨糖醇三油酸酯)的亚微米水包油乳液，和，任选地，N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺酰-L-丙氨酸-2-(1'-2'-二棕榈酰-s-n-甘油-3-羟基磷酰基氧基)-乙胺(MTP-PE)，例如称为“MF59”的亚微米水包油乳液(国际公开号WO90/14837；美国专利号6,299,884和6,451,325，其通过引用整体并入本文。MF59可包含4-5％w/v角鲨烯(例如，4.3％)、0.25-0.5％w/v吐温80和0.5％w/v司盘85并任选地包含各种量的MTP-PE，使用微流化器如Model 110Y微流化器(Microfluidics,Newton,MAss)配制成亚微米颗粒。例如，MTP-PE可以以约0-500μg/剂，或0-250μg/剂，或0-100μg/剂的量存在。在国际公开号WO90/14837和美国专利号6,299,884和6,451,325中详细描述了亚微米水包油乳液、其制备方法和用于组合物的免疫刺激剂，例如胞壁酰肽。

完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)也可用作佐剂。

皂苷佐剂制剂也可用作佐剂。皂苷是甾醇糖苷和三萜糖苷的异源组合，存在于多种植物的树皮、叶、茎、根甚至花中。来自皂树树皮的皂苷已被作为佐剂广泛研究。皂苷也可通过商业途径获自丽花菝葜(墨西哥菝葜)、满天星(婚纱花)和肥皂草(皂根)。皂苷佐剂制剂可以包括纯化的制剂，例如QS21，以及脂质制剂，例如免疫刺激复合物(ISCOM；见下文)。皂苷组合物已使用高效薄层色谱(HPLC)和反相高效液相色谱(RP-HPLC)纯化。已经鉴定了使用这些技术的特定纯化级分，包括QS7、QS17、QS18、QS21、QH-A、QH-B和QH-C。QS21的生产方法公开于美国专利号5,057,540中。皂苷制剂还可以包含甾醇，例如胆固醇(参见WO96/33739)。皂苷和胆固醇的组合可用于形成称为ISCOM的独特颗粒。ISCOM通常还包括磷脂，例如磷脂酰乙醇胺或磷脂酰胆碱。任何已知的皂苷都可用于ISCOM。例如，ISCOM可以包括QuilA、QHA和QHC中的一种或多种。ISCOM描述于EP0109942、WO96/11711和WO96/33739中。可选地，ISCOMS可以不添加额外的洗涤剂。参见WO00/07621。开发基于皂苷的佐剂的描述可见于Barr等人，“ISCOMs and Other Saponin Based Adjuvants”，Advanced Drug DeliveryReviews 32:247-27，1998。还参见Sjolander等人，“Uptake and adjuvant activity oforally delivered saponin and ISCOM vaccines”，Advanced Drug Delivery Reviews32：321-338,1998。

病毒体和病毒样颗粒(VLP)也可用作佐剂。这些结构通常包含一种或多种来自病毒的蛋白质，其任选地与磷脂组合或一起配制。它们通常是非致病性的、非复制性的，并且通常不包含任何天然病毒基因组。病毒蛋白可以重组产生或从完整病毒中分离。这些适用于病毒体或VLP的病毒蛋白包括衍生自流感病毒(如HA或NA)、乙型肝炎病毒(如核或衣壳蛋白)、戊型肝炎病毒、麻疹病毒、辛德毕斯病毒、轮状病毒、口蹄疫病毒、逆转录病毒、诺沃克病毒、人乳头瘤病毒、HIV、RNA-噬菌体、QB-噬菌体(如外壳蛋白)、GA-噬菌体、fr-噬菌体、AP205噬菌体和Ty(如反转录转座子Ty蛋白质pl)的蛋白。

可用作佐剂的细菌或微生物衍生物包括：(i)肠杆菌脂多糖(LPS)的无毒衍生物；(ii)脂质衍生物，(iii)免疫刺激性寡核苷酸和ADP-核糖基化毒素及其解毒衍生物，(iv)ADP-核糖基化毒素及其解毒衍生物。LPS的无毒衍生物的实例为单磷酰脂质A(MPL)和3-O-脱酰化MPL(3DMPL)。3dMPL是具有4、5或6个酰化链的3De-O-酰化单磷酰脂质A的混合物。EP0 689454中公开了3De-O-酰化单磷酰基脂质A的“小颗粒”形式的实例。这种3dMPL的“小颗粒”足够小以通过0.22微米的膜进行无菌过滤(参见EP 0689 454)。其他无毒LPS衍生物包括单磷酰基脂质A模拟物，例如氨基烷基氨基葡萄糖苷磷酸衍生物，例如RC-529(Johnson等人，Bioorg Med Chem Lett，9：2273-2278，1999)。脂质A衍生物的实例可以包括来自大肠杆菌的脂质A衍生物，例如OM-174。OM-174描述于例如Meraldi等人,Vaccine 21:2485-2491,2003；和Pajak等人,Vaccine 21:836-842,2003中。免疫刺激性寡核苷酸的实例包括含有CpG基序的核苷酸序列(含有未甲基化的胞嘧啶，随后是鸟苷并通过磷酸键连接的序列)。细菌双链RNA或含有回文或poly(dG)序列的寡核苷酸也已被证明具有免疫刺激性。

CpG可以包括核苷酸修饰/类似物，例如硫代磷酸酯修饰，并且可以是双链或单链的。任选地，鸟苷可以用类似物例如2'-脱氧-7-脱氮鸟苷替换。参见Kandimalla等人，“Divergent synthetic nucleotide motif recognition pattern:design anddevelopment of potent immunomodulatory oligodeoxyribonucleotide agents withdistinct cytokine induction profiles”，Nucleic Acids Research 31：2393-2400，2003；WO02/26757和WO99/62923中描述了类似物取代的实例。CpG寡核苷酸的佐剂作用进一步讨论于Krieg,Nature Medicine(2003)9(7):831-835；McCluskie等人，FEMS Immunologyand Medical Microbiology(2002)32:179-185；WO98/40100；美国专利号6,207,646；美国专利号6,239,116和美国专利号6,429,199中。CpG序列可以针对Toll样受体(TLR9)，例如基序GTCGTT或TTCGTT。参见Kandimalla等人，“Toll-like receptor 9:modulation ofrecognition and cytokine induction by novel synthetic CpG DNAs”，BiochemistrySociety Transactions(2003)31(part 3):654-658。CpG序列可以特异性地诱导Th1免疫应答，例如CpG-A ODN，或者它可以更特异性地诱导B细胞应答，例如CpG-B ODN。CpG-A和CpG-BODN讨论于Blackwell等人，J.Immunol.170：4061-4068，2003；Krieg，TRENDS inImmunology 23：64-65，2002和WO01/95935中。在一些方面，可以构建CpG寡核苷酸，使得5'端可用于受体识别。任选地，两个CpG寡核苷酸序列可以在其3'末端连接以形成“免疫聚体(immunomer)”。参见，例如Kandimalla等人，BBRC 306：948-95，2003；Kandimalla等人，Biochemistry Society Transactions 31：664-658，2003；Bhagat等人,"BBRC300:853-861,2003和WO03/035836。细菌ADP-核糖基化毒素及其解毒衍生物可用作佐剂。例如，毒素可来源于大肠杆菌(即，大肠杆菌不耐热肠毒素(LT))、霍乱(CT)或百日咳(PTX)。在WO95/17211中描述了使用解毒的ADP-核糖基化毒素作为黏膜佐剂的用途，在WO98/42375中描述了作为肠胃外佐剂的用途。在一些方面，佐剂可以是解毒的LT突变体，例如LT-K63、LT-R72和LTR192G。ADP-核糖基化毒素及其解毒衍生物，特别是LT-K63和LT-R72作为佐剂的用途可见于以下参考文献，每一篇都通过引用整体并入本文：Beignon等人，Infection andImmunity 70：3012-3019，2002；Pizza等人，Vaccine 19：2534-2541，2001；Pizza等人,Int.J.Med.Microbiol 290:455-461,2003；Scharton-Kersten等人,Infection andImmunity 68:5306-5313,2000；Ryan等人,Infection and Immunity 67:6270-6280,2003；Partidos等人，Immunol.Lett.67：09-216，1999；Peppoloni等人，Vaccines 2：285-293，2003；和Pine等人，J.Control Release 85:263-270,2002。

生物粘附剂和黏膜粘附剂也可以用作佐剂。合适的生物粘附剂可包括酯化的透明质酸微球(Singh等人，J.Cont.Rel.70:267-276，2001)或黏膜粘附剂诸如聚(丙烯酸)、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、多糖和羧甲基纤维素的交联衍生物。例如在WO99/27960中公开的壳聚糖及其衍生物也可用作佐剂。

佐剂微粒：微粒也可用作佐剂。设想了由可生物降解和/或无毒的材料(例如，聚(α-羟基酸)、聚羟基丁酸、聚原酸酯、聚酐、聚己内酯、聚(丙交酯-共-乙交酯)等)形成的微粒(即，直径为约100nm至约150μm、或直径为200nm至约30μm、或直径为约500nm至约10μm的颗粒)，其任选地经处理以具有带负电荷的表面(例如，用SDS处理)或带正电荷的表面(例如，用阳离子洗涤剂，如CTAB处理)。

适合用作佐剂的脂质体制剂的实例描述于美国专利号6,090,406、美国专利号5,916,588和EP 0 626 169。

另外的佐剂包括聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯。WO99/52549。此类制剂可进一步包括与辛苯聚醇组合的聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯表面活性剂(WO 01/21207)以及与至少一种另外的非离子表面活性剂如辛苯聚醇组合的聚氧乙烯烷基醚或酯表面活性剂(WO 01/21152)。在一些方面，聚氧乙烯醚可包括：聚氧乙烯-9-月桂基醚(laureth 9)、聚氧乙烯-9-硬脂基醚、聚氧乙烯-8-硬脂基醚、聚氧乙烯-4-月桂基醚、聚氧乙烯-35-月桂基醚或聚氧乙烯-23-月桂基醚。

用作佐剂的PCPP制剂描述于例如Andrianov等人，Biomaterials 19:109-115，1998，1998中。适合用作佐剂的胞壁酰肽的实例可包括N-乙酰基-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(Thr-MDP)、N-乙酰基-正胞壁酰-1-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(nor-MDP)和N-乙酰基胞壁酰-1-丙氨酰-D-异谷氨酰胺酰-1-丙氨酸-2-(1’-2’-二棕榈酰-s-n-甘油基-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(MTP-PE)。适合用作佐剂的咪唑并喹诺酮化合物的实例可包括咪喹莫特及其同系物，其进一步描述于Stanley，“Imiquimod and the imidazoquinolones：mechanism ofaction and therapeutic potential”Clin Exp Dermatol 27：571-577,2002和Jones，“Resiquimod 3M”，Curr Opin Investig Drugs 4:21 4-218,2003中。适合用作佐剂的人免疫调节剂可包括细胞因子，例如白细胞介素(例如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12等)、干扰素(例如干扰素-γ)、巨噬细胞集落刺激因子和肿瘤坏死因子。

佐剂组合：佐剂以一些优选的形式作为组合使用。例如，佐剂组合物可以包括：皂苷和水包油乳液(WO99/11241)；皂苷(例如，QS21)+无毒的LPS衍生物(例如，3dMPL)(参见WO94/00153)；皂苷(例如，QS21)+无毒的LPS衍生物(例如，3dMPL)+胆固醇；皂苷(例如，QS21)+3dMPL+IL-12(任选地+甾醇)(WO98/57659)；3dMPL与例如QS21和/或水包油乳液的组合(参见欧洲专利申请0835318、0735898和0761231)；SAF，含有10％角鲨烷、0.4％吐温80、5％普郎尼克嵌段聚合物L121和thr-MDP，微流化成亚微米乳液或涡旋以产生更大粒径的乳液。Ribi佐剂系统(RAS)(Ribi Immunochem)含有2％角鲨烯、0.2％吐温80和一种或多种选自单磷脂A(MPL)、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)和细胞壁骨架(CWS)的细菌细胞壁成分，优选MPL+CWS(Detox)；以及一种或多种矿物盐(如铝盐)+LPS的无毒衍生物(如3dPML)。

铝盐和MF59是用于可注射流感疫苗的佐剂的实例。细菌毒素和生物粘附剂是用于黏膜递送疫苗(例如鼻疫苗)的佐剂的实例。可以使用本领域熟知的技术配制上述所有佐剂和本领域普通技术人员通常已知的其他佐剂用于鼻内施用。

2.制剂和载体

所公开的组合物可以配制成药物组合物。除了一种或多种公开的融合蛋白或核酸分子之外，这些组合物还可包含药学上可接受的赋形剂、载体、缓冲剂、稳定剂或本领域技术人员熟知的其他材料。此类材料通常应该是无毒的并且通常不干扰活性成分的功效。载体或其他材料的确切性质可取决于施用途径，例如口服、静脉内、皮肤或皮下、鼻、肌内或腹膜内途径。

用于口服施用的药物组合物可以是片剂、胶囊、粉末或液体形式。片剂可以包括固体载体，例如明胶或佐剂。液体药物组合物通常包括液体载体，例如水、石油、动物或植物油、矿物油或合成油。可以包括生理盐水溶液、右旋糖或其他糖类溶液或二醇类，例如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。术语“载体”是指与药物组合物(例如，免疫原性或疫苗制剂)一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。盐水溶液以及右旋糖水溶液和甘油溶液也可用作液体载体，特别是用于可注射溶液。合适的赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石粉、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、乙醇等。合适的药物载体的实例描述于E.W.Martin的“Remington's Pharmaceutical Sciences”中。应根据施用方式选择制剂。

对于静脉内、皮肤或皮下注射，或在痛苦部位注射，活性成分将是肠胃外可接受的水溶液形式，该水溶液无热原并具有合适的pH、等渗性和稳定性。本领域相关技术人员能够使用例如等渗媒介物如氯化钠注射液、林格氏注射液或乳酸林格氏注射液制备合适的溶液。根据需要，可以包括防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其他添加剂。

施用优选以“治疗有效量”或“预防有效量”(视情况而定，尽管预防可被视为治疗)，这足以显示对个体的益处。施用的实际量、施用的速率和施用时间进程将取决于所治疗疾病的性质和严重程度。治疗处方，例如剂量决定等，在全科医生和其他医生的责任范围内，通常会考虑待治疗的疾病、个体患者的状况、递送部位、施用方法和从业者已知的其他因素。上述技术和方案的示例可以在最新版的Remington's Pharmaceutical Science,Mack Publishing Company,Easton,Pa.(“Remington's”)中找到。

还公开了治疗或药物组合物。在一些形式中，组合物包含治疗有效量的所公开的蛋白质和/或核酸分子，以及任选的药学上可接受的载体。

在一些形式中，将蛋白质和/或核酸分子配制成疫苗组合物以施用于具有一定冠状病毒感染风险的受试者。疫苗组合物是一种抗原性制剂，其包含一种或多种用于产生对疾病的主动免疫的免疫原性抗原。此外，所公开的组合物可以施用于已存在冠状病毒感染的受试者。这样的治疗可以提供定制的疫苗方案和组合物以预防或最小化疾病的恶化。

还公开了可用于实施本文所述治疗方法的治疗组合物。治疗组合物可以是任何形式的药物形式，包括可注射制剂，例如液体和冻干注射剂。

在一些形式中，所公开的蛋白质和/或核酸分子的治疗有效量通常是使得当以生理上可耐受的组合物施用时足以实现约0.01微克(μg)每毫升(mL)至约200μg/mL的血浆浓度的量。换句话说，剂量可以从约0.1mg/kg至约300mg/kg，优选从约0.2mg/kg至约200mg/kg，最优选从约0.5mg/kg至约20mg/kg之间变化，每天施用一剂或多剂，持续一天或几天。

与药剂一起使用的合适的无毒的药学上可接受的载体对于药物制剂领域的技术人员来说是显而易见的。参见，例如，Remington's Pharmaceutical Sciences，最新版，ed.Alfonso R.Gennaro,Mack Publishing Company,Easton,Pa。合适的载体包括乙醇、二甲基亚砜、甘油、二氧化硅、氧化铝、淀粉、山梨糖醇、肌醇、木糖醇、D-木糖、甘露糖醇、粉状纤维素、微晶纤维素、滑石粉、胶体二氧化硅、碳酸钙、碳酸镁、磷酸钙、硅酸铝钙、氢氧化铝、淀粉磷酸钠、卵磷脂以及等效载体和稀释剂。盐水溶液以及右旋糖水溶液和甘油溶液也可用作液体载体，特别是用于可注射溶液。

合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石粉、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙二醇、水、乙醇等。如果需要，治疗组合物还可包含少量润湿剂或乳化剂，或pH缓冲剂。此外，如果需要，组合物可以包含少量的辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂等，其可增强活性成分的效力。

可与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量将根据病症的类型和待治疗的对象而变化。通常，治疗组合物含有约5％至约95％的活性成分(w/w)。更具体地，治疗组合物包含约20％(w/w)至约80％，或约30％至约70％(w/w)的活性成分。

含有溶解或分散在其中的活性成分的药理学组合物的制备在本领域中是众所周知的，并且不需要基于制剂进行限制。通常，此类组合物被制备为作为液体溶液或悬浮液的注射剂；然而，也可以制备成适合于使用前在液体中形成溶液或悬浮液的固体形式。制剂也可以乳化。

所公开的治疗组合物可以包括其中组分的药学上可接受的盐。药学上可接受的盐包括与无机酸(例如盐酸或磷酸)或有机酸(例如乙酸、酒石酸、扁桃酸等)形成的酸加成盐(与多肽的游离氨基形成)。与游离羧基形成的盐也可以衍生自无机碱，例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁，以及有机碱，例如异丙胺、三甲胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等。

如本文所用，术语“药学上可接受的”、“生理上可耐受的”及其语法变体，当它们涉及组合物、载体、稀释剂和试剂时，可互换使用，并且代表该材料能够施用于哺乳动物或施用于哺乳动物上。

还公开了药物包装或试剂盒，其包含一个或多个容器，所述容器填充有适于施用的一种或多种成分，例如，化合物、载体。

公开的组合物可以施用于通过标准途径治疗的受试者，所述标准途径包括口服、吸入、或肠胃外施用，包括静脉内、皮下、局部、经皮、皮内、经黏膜、腹膜内、肌内、囊内、眼眶内、心内、经气管、皮下、角质层下、关节内、囊下、蛛网膜下、椎管内、硬脑膜外和胸骨内注射、输注、和电穿孔、以及作为待插入(暂时性或永久性)受试者的任何医疗装置或物体的成分而共同施用。

在一些形式中，可以配制含有所公开的蛋白或核酸分子的微粒用于肠胃外施用。鉴于本公开内容，含有一种或多种试剂如本发明的蛋白或核酸分子的水性组合物的制备将对于本领域技术人员是已知的。通常，将这样的组合物制备为注射剂，作为液体溶液或悬浮液；也可以制备适合于在注射之前添加液体后用于制备溶液或悬浮液的固体形式；并且也可以将制剂乳化。

适于注射使用的药物形式包括无菌水溶液或分散液；包括芝麻油、花生油或水性丙二醇的制剂；以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。在所有情况下，药物形式必须是无菌的，而且必须是流体的以达到存在轻易的可注射性的程度。它必须在生产和保存条件下是稳定的，必须在防止微生物如细菌和真菌的污染作用的条件下保藏。

通过将所需量的活性组分并入合适的溶剂中，随后无菌过滤而制备无菌可注射溶液。通常，通过将各种无菌的活性成分并入包含基本分散介质和所需的来自上面所举的其它成分的无菌媒介物中而制备分散剂。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，其由先前无菌过滤的溶液产生活性成分和任何其它所需成分的粉末。

此外，所公开的核酸分子和组合物可以通过本领域中已知的方法体内递送进宿主细胞。在某些形式中，可以经由病毒载体如腺相关病毒(AAV)、单纯疱疹病毒(HSV)、逆转录病毒、乳头瘤病毒、腺病毒、EB病毒(EBV)体内引入本发明的核酸分子和组合物。此外，也可以经由脂质体转染(经由从合成的阳离子脂质制备的脂质体的DNA转染)体内引入本发明的核酸分子和组合物(Felgner等人,1987)。合成的阳离子脂质(LIPOFECTIN,InvitrogenCorp.,La Jolla,CA)可以用于制备脂质体以封装本发明的核酸分子。也可以使用本领域已知的方法如转染、显微注射、电穿孔、磷酸钙沉淀、并且通过微弹轰击法作为裸DNA体内引入本发明的核酸分子。

D.使用方法

还公开了用于降低冠状病毒感染风险或治疗冠状病毒感染的方法。有利地，所公开的方法可以诱导抗原特异性体液和细胞介导的免疫。在一些形式中，该方法包括向需要这种治疗的受试者施用有效量的如所公开的融合蛋白或融合核酸分子。

在一些形式中，所公开的方法可以诱导针对冠状病毒感染的保护性免疫。在一些形式中，该方法包括施用包含融合核酸分子的组合物，其中该融合核酸分子包含编码冠状病毒抗原的核酸和编码野生型可溶性PD1蛋白的sPD-1核酸、编码spd1-14 del蛋白的核酸，或编码spd1-322 del蛋白的核酸。任选地，可以包括编码Fc结构域的核酸和连接sPD-1核酸和抗原核酸的接头核酸序列。在一些形式中，组合物通过电穿孔(EP)经由肌肉内注射施用。

在一些形式中，该方法包括施用包含融合蛋白的组合物，其中该融合蛋白包含冠状病毒抗原和选自野生型可溶性PD1蛋白、spd1-14del蛋白或spd1-322del蛋白的可溶性PD-1蛋白。任选地，可以包括Fc结构域和连接sPD-1蛋白和抗原蛋白的接头序列。

该方法可用于预防和/或治疗冠状病毒感染。

如本文所用，术语“治疗(treatment)”或其任何语法变体(例如，treat、treating和treatment等)包括但不限于改善或减轻疾病或病症的症状，减少、遏制、抑制、减轻或影响病情的进展、严重程度和/或范围。

如本文所用，术语“预防(prevention)”或其任何语法变体(例如，prevent、preventing和and prevention等)包括但不限于延迟症状的发作、预防疾病复发、减少复发发作的次数或频率、增加症状发作之间的潜伏期或其组合。如本文所用，预防不需要完全抑制或消除症状。

如本文所用，术语“受试者”描述了可以向其提供所公开的组合物治疗的生物体，包括哺乳动物，例如灵长类动物。可受益于所公开的治疗方法的哺乳动物物种包括但不限于猿、黑猩猩、猩猩、人、猴；和其他动物，如狗、猫、马、牛、猪、绵羊、山羊、鸡、小鼠、大鼠、豚鼠和仓鼠。

在一些形式中，在预防冠状病毒感染的情况下，可将基于sPD-1的组合物施用于未患有要预防的冠状病毒感染的受试者或未表现出要预防的冠状病毒感染症状的受试者。

在某些形式中，所公开的方法可用于预防和/或治疗由COVID-19、SARS或MERS引起的感染。

所公开的组合物和疫苗可用于在有需要的受试者中有效增加病毒滴度或引发免疫应答。在一些方面，受试者可以包括老年人(例如，>65岁)、幼儿(例如，<5岁)。使用佐剂化制剂改善儿童免疫应答的方法公开于例如美国公开2017/0202955中。

所公开的组合物和疫苗通常可以直接施用于有需要的哺乳动物以增加哺乳动物中的病毒滴度并引发免疫应答。

通常以有效量施用组合物以诱导针对一种或多种冠状病毒抗原的免疫应答。例如，有效量的组合物通常导致产生杀死或限制冠状病毒增殖或感染的抗体和/或活化的T细胞。

组合物通常可用于引发全身和/或黏膜免疫，例如引发增强的全身和/或黏膜免疫。例如，免疫应答可以通过血清IgG和/或肠IgA免疫应答的诱导来表征。通常，针对流感感染的保护水平可以超过50％，例如60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多。在一方面，保护水平可以是100％。

由所公开的组合物和方法诱导的免疫应答可以是TH1免疫应答和TH2应答中的一种或两种。免疫应答可以是改善的或增强的或改变的免疫应答。免疫应答可以是全身和黏膜免疫应答中的一种或两种。例如，免疫应答可以是增强的全身和/或黏膜应答。增强的全身和/或黏膜免疫反映在增强的TH1和/或TH2免疫应答中。例如，增强的免疫应答可包括IgG1和/或IgG2a和/或IgA产生的增加。在另一方面，黏膜免疫应答可以是TH2免疫应答。例如，黏膜免疫应答可包括IgA产生的增加。

通常，活化的TH2细胞增强抗体产生，因此在响应细胞外感染中具有价值。活化的TH2细胞通常可以分泌IL-4、IL-5、IL-6和IL-10中的一种或多种。TH2免疫应答还可导致产生IgG1、IgE、IgA和/或记忆B细胞以供将来保护。通常，TH2免疫应答可包括与TH2免疫应答相关的一种或多种细胞因子(如IL-4、IL-5、IL-6和IL-10)的增加，或IgG1、IgE、IgA和记忆B细胞产生的增加中的一种或多种。例如，增强的TH2免疫应答可包括IgG1产生的增加。TH1免疫应答可包括CTL增加、与TH1免疫应答相关的一种或多种细胞因子(如IL-2、IFN-γ和TNF-α)增加、活化的巨噬细胞的增加、NK活性增加或IgG2a产生的增加中的一种或多种。例如，增强的TH1免疫应答可包括IgG2a产生的增加。

所公开的融合蛋白和融合核酸分子可以单独使用或与其他试剂组合使用，任选地与能够引发Th1和/或Th2应答的免疫调节剂一起使用。

精确剂量将根据多种因素而变化，例如依赖于受试者的变量(例如，年龄、免疫系统健康等)和接受治疗的受试者的年龄。考虑到受试者的治疗背景、年龄和一般健康状况，本领域技术人员可以确定合适的剂量。选择的剂量取决于所需的治疗效果、施用途径和所需治疗的持续时间。

疫苗组合物可以以单剂量或多剂量形式施用。疫苗可以在施用前数小时或数天用佐剂制备，进行稳定缓冲液和合适的佐剂组合物的鉴定。通常，剂量将是以多剂量局部施用的100μL，而通过皮下、肌肉内、器官内、静脉内或鼻内施用的全身或区域施用可以是例如10至100μL。

E.试剂盒

还提供了包括所公开的融合蛋白和/或融合核酸分子的试剂盒。试剂盒可以包括含有合适的载体、稀释剂或赋形剂的单独容器。另外，试剂盒可包括用于混合或组合成分和/或施用的说明书。

组合物可以是液体形式或可以是冻干的。用于组合物的合适容器包括例如瓶子、小瓶、注射器和试管。容器可以由多种材料制成，包括玻璃或塑料。容器可以具有无菌进入端口(例如，容器可以是静脉注射溶液袋或具有可被皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。

试剂盒还可以包括第二容器，该第二容器包含药学上可接受的缓冲液，例如磷酸盐缓冲液、林格溶液或右旋糖溶液。它还可以包含对最终用户有用的其他材料，包括其他药学上可接受的配制溶液，例如缓冲液、稀释剂、过滤器、针头和注射器或其他递送装置。试剂盒可以进一步包括包含佐剂的第三组分。

试剂盒还可以包括包装插页，所述包装插页含有关于诱导免疫、预防感染或用于治疗感染的方法的书面说明。包装插页可以是未经批准的草稿包装插页，或者可以是由食品和药物管理局(FDA)或其他监管机构批准的包装插页。

还公开了预填充有所公开的组合物的递送装置。

组合物通常被配制成无菌的、基本上等渗的并且完全符合美国食品和药物管理局的所有良好生产规范(GMP)规定。

通过以下编号的段落可以进一步理解所公开的组合物和方法。

1.一种可溶性PD-1融合蛋白，其包含可溶性PD-1蛋白片段和抗原性蛋白片段，其中所述可溶性PD-1蛋白片段包含选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:5和SEQ ID NO:9的氨基酸序列，并且其中所述抗原性蛋白片段包含冠状病毒蛋白片段。

2.根据段落1所述的可溶性PD-1融合蛋白，其中所述冠状病毒蛋白片段衍生自冠状病毒受体结合域(RBD)或冠状病毒核蛋白(N)。

3.根据段落1或2所述的PD-1融合蛋白，其中所述冠状病毒蛋白片段衍生自COVID-19、SARS或MERS。

4.根据段落1-3中任一项所述的PD-1融合蛋白，其中所述冠状病毒蛋白片段衍生自COVID-19受体结合域(RBD)或COVID-19核蛋白(N)。

5.根据段落1-4中任一项所述的PD-1融合蛋白，其还包含Fc结构域。

6.根据段落1-5中任一项所述的PD-1融合蛋白，其还包含接头序列，其中所述接头序列连接所述可溶性PD-1蛋白片段和所述抗原性蛋白片段。

7.根据段落1-6中任一项所述的PD-1融合蛋白，其包含选自SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：7、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：9的氨基酸序列，以及选自SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12的氨基酸序列。

8.一种sPD-1融合核酸分子，其编码段落1-7中任一项所述的PD-1融合蛋白。

9.根据段落8所述的sPD-1融合核酸分子，其中所述核酸分子包含选自SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:10的核酸序列，以及编码选自SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12的氨基酸序列的核酸序列。

10.一种疫苗组合物，其包含段落8或9所述的sPD-1融合核酸分子。

11.一种治疗处于冠状病毒感染风险或患有冠状病毒感染的受试者的方法，其包括向所述受试者施用有效量的段落8或9所述的sPD-1融合核酸或段落10所述的疫苗组合物。

12.根据段落11所述的方法，其中所述冠状病毒感染是COVID-19、SARS或MERS。

13.根据段落11或12所述的方法，其中所述sPD-1融合核酸包含编码所述冠状病毒蛋白片段的核酸片段，其中所述冠状病毒蛋白片段衍生自COVID-19受体结合域(RBD)或COVID-19核蛋白(N)，并且其中所述冠状病毒感染是COVID-19。

14.根据段落11-13中任一项所述的方法，其中所述sPD-1融合核酸包含选自SEQID NO:4、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:10的核酸序列，以及编码选自SEQ ID NO：11或SEQ IDNO：12的氨基酸序列的核酸序列。

15.根据段落11-14中任一项所述的方法，其中所述sPD-1融合核酸通过注射施用。

16.根据段落11-14中任一项所述的方法，其中所述sPD-1融合核酸通过电穿孔施用。

17.一种治疗有冠状病毒感染风险或患有冠状病毒感染的受试者的方法，其包括向所述受试者施用有效量的段落1-7中任一项所述的融合蛋白。

18.根据段落17所述的方法，其中所述冠状病毒感染是COVID-19、SARS或MERS。

19.根据段落17或18所述的方法，其中所述冠状病毒蛋白片段衍生自COVID-19受体结合域(RBD)或COVID-19核蛋白(N)。

20.根据段落11-19中任一项所述的方法，其中所述受试者处于冠状病毒感染的风险中。

21.根据段落11-19中任一项所述的方法，其中所述受试者患有冠状病毒感染。

序列

野生型小鼠sPD-1蛋白(SEQ ID NO:1)

野生型小鼠sPD-1核酸(SEQ ID NO:2)

msPD-1-14del蛋白(SEQ ID NO:3)

msPD-1-14del核酸(SEQ ID NO:4)

msPD-1-322mu蛋白(SEQ ID NO:5)

msPD-1-322mu核酸(SEQ ID NO:6)

人sPD-1蛋白(SEQ ID NO:7)

人sPD-1核酸(SEQ ID NO:8)

hsPD-1-14del(SEQ ID NO:9)

hsPD-1-14del(SEQ ID NO:10)

COVID-19RBD蛋白(SEQ ID NO:11)

COVID-19N蛋白(SEQ ID NO:12)

兔Fc结构域(SEQ ID NO:13)

兔Fc结构域核酸(SEQ ID NO:14)

接头序列(SEQ ID NO:15)

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

接头序列(SEQ ID NO:16)

接头序列(SEQ ID NO:17)

Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu

接头序列(SEQ ID NO:18)

接头序列(SEQ ID NO:19)

Gly Gly Gly Gly Gly Cys Pro Pro Cys

接头序列(SEQ ID NO:20)

接头序列(SEQ ID NO:21)

Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn接头序列(SEQ IDNO:22)

Pro Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn接头序列(SEQID NO:23)

Gly Asp Leu Ile Tyr Arg Asn Gln Lys

接头序列(SEQ ID NO:24)

接头序列(SEQ ID NO:25)

Ala Met Gln Met Leu Lys Asp Thr Ile

接头序列(SEQ ID NO:26)

应当理解，所公开的方法和组合物不限于所描述的特定方法、方案和试剂，因为这些可以变化。还应理解，本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并不旨在限制本发明的范围，本发明的范围将仅由所附权利要求书限制。

必须注意，除非上下文另有明确规定，否则如本文和所附权利要求书中所用，单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数指代。因此，例如，提及“一个抗原”包括多个这样的抗原，提及“该抗原”是指本领域技术人员已知的一种或多种适体及其等同物，等等。

在本说明书的整个描述和权利要求书中，词语“包括”和该词语的变体，例如“包含”和“含有”意指“包括但不限于”，并且不旨在排除例如其他添加剂、组分、整数或步骤。

“任选的”或“任选地”意指随后描述的事件、情况或材料可以或可以不发生或存在，并且该描述包括事件、情况或材料发生或存在的情况以及其不发生或不存在的情况。

范围在本文中可以表示为从“约”一个特定值和/或到“约”另一个特定值。当表示这样的范围时，还具体考虑和认为公开的是从一个特定值和/或到另一个特定值的范围，除非上下文另有具体说明。类似地，当通过使用先行词“约”将值表示为近似值时，应当理解，该特定值形成另一个具体考虑的实施方案，除非上下文另有具体说明，否则该实施方案应被认为是公开的。将进一步理解，除非上下文另有具体说明，否则每个范围的端点相对于另一个端点和独立于另一个端点都是有意义的。应当理解，包含在明确公开的范围内的所有单个值和值的子范围也被具体考虑并且应当被认为是公开的，除非上下文另有具体说明。最后，应当理解，所有范围都是指所述范围作为范围和作为从第一端点(包括第一端点)到第二端点(包括第二端点)的单个数字的集合。在后一种情况下，应当理解，可以选择任何单独的数字作为范围所指的数量、值或特征的一种形式。以这种方式，范围描述了从第一端点(包括第一端点)到第二端点(包括第二端点)的一组数字或值，从所述一组数字或值可以选择该组的单个成员(即，单个数字)作为该范围所涉及的数量、值或特征。无论在特定情况下是否明确公开了这些实施方案中的一些或全部，前述内容都适用。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与所公开的方法和组合物所属领域的技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管与本文所述的那些类似或等同的任何方法和材料可用于实践或测试本发明的方法和组合物，但特别有用的方法、装置和材料如所述。本文引用的出版物及其引用的材料通过引用具体并入本文。本文中的任何内容都不应被解释为承认由于在先发明，本发明无权先于此类公开内容。不承认任何参考文献构成现有技术。参考文献的讨论陈述了其作者所主张的内容，并且申请人保留质疑所引用文献的准确性和相关性的权利。应当清楚地理解，尽管本文引用了许多出版物，但是这种引用并不构成承认这些文件中的任何一个形成本领域公知常识的一部分。

尽管材料、组合物、部件、步骤、技术等的描述可以包括许多选项和替代方案，但是这不应被解释为并且不是承认这些选项和替代方案彼此等同，或者特别地是明显的替代方案。因此，例如，不同部分的列表不指示所列部分彼此显而易见，也不是等同或明显的承认。

序列表

<110> 港大科桥有限公司

<120> 基于PD-1的针对冠状病毒感染的疫苗

<130> F20W8134

<150> US 62/982,015

<151> 2020-02-26

<160> 26

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 178

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 1

Met Trp Val Arg Gln Val Pro Trp Ser Phe Thr Trp Ala Val Leu Gln

1 5 10 15

Leu Ser Trp Gln Ser Gly Trp Leu Leu Glu Val Pro Asn Gly Pro Trp

20 25 30

Arg Ser Leu Thr Phe Tyr Pro Ala Trp Leu Thr Val Ser Glu Gly Ala

35 40 45

Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Leu Ser Asn Trp Ser Glu Asp Leu Met

50 55 60

Leu Asn Trp Asn Arg Leu Ser Pro Ser Asn Gln Thr Glu Lys Gln Ala

65 70 75 80

Ala Phe Cys Asn Gly Leu Ser Gln Pro Val Gln Asp Ala Arg Phe Gln

85 90 95

Ile Ile Gln Leu Pro Asn Arg His Asp Phe His Met Asn Ile Leu Asp

100 105 110

Thr Arg Arg Asn Asp Ser Gly Ile Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu

115 120 125

His Pro Lys Ala Lys Ile Glu Glu Ser Pro Gly Ala Glu Leu Val Val

130 135 140

Thr Glu Arg Ile Leu Glu Thr Ser Thr Arg Tyr Pro Ser Pro Ser Pro

145 150 155 160

Lys Pro Glu Gly Arg Phe Gln Pro Glu Phe Arg Gly Gly Gly Ser Gly

165 170 175

Gly Gly

<210> 2

<211> 537

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 2

atgtgggtcc ggcaggtacc ctggtcattc acttgggctg tgctgcagtt gagctggcaa 60

tcagggtggc ttctagaggt ccccaatggg ccctggaggt ccctcacctt ctacccagcc 120

tggctcacag tgtcagaggg agcaaatgcc accttcacct gcagcttgtc caactggtcg 180

gaggatctta tgctgaactg gaaccgcctg agtcccagca accagactga aaaacaggcc 240

gccttctgta atggtttgag ccaacccgtc caggatgccc gcttccagat catacagctg 300

cccaacaggc atgacttcca catgaacatc cttgacacac ggcgcaatga cagtggcatc 360

tacctctgtg gggccatctc cctgcacccc aaggcaaaaa tcgaggagag ccctggagca 420

gagctcgtgg taacagagag aatcctggag acctcaacaa gatatcccag cccctcgccc 480

aaaccagaag gccggtttca accggaattc cggggtggtg gtggttcagg aggagga 537

<210> 3

<211> 164

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> msPD-1-14del蛋白

<400> 3

Met Trp Val Arg Gln Val Pro Trp Ser Phe Thr Trp Ala Val Leu Gln

1 5 10 15

Leu Ser Trp Gln Ser Gly Trp Leu Leu Ala Trp Leu Thr Val Ser Glu

20 25 30

Gly Ala Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Leu Ser Asn Trp Ser Glu Asp

35 40 45

Leu Met Leu Asn Trp Asn Arg Leu Ser Pro Ser Asn Gln Thr Glu Lys

50 55 60

Gln Ala Ala Phe Cys Asn Gly Leu Ser Gln Pro Val Gln Asp Ala Arg

65 70 75 80

Phe Gln Ile Ile Gln Leu Pro Asn Arg His Asp Phe His Met Asn Ile

85 90 95

Leu Asp Thr Arg Arg Asn Asp Ser Gly Ile Tyr Leu Cys Gly Ala Ile

100 105 110

Ser Leu His Pro Lys Ala Lys Ile Glu Glu Ser Pro Gly Ala Glu Leu

115 120 125

Val Val Thr Glu Arg Ile Leu Glu Thr Ser Thr Arg Tyr Pro Ser Pro

130 135 140

Ser Pro Lys Pro Glu Gly Arg Phe Gln Pro Glu Phe Arg Gly Gly Gly

145 150 155 160

Ser Gly Gly Gly

<210> 4

<211> 495

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> msPD-1-14del核酸

<400> 4

atgtgggtcc ggcaggtacc ctggtcattc acttgggctg tgctgcagtt gagctggcaa 60

tcagggtggc ttctagcctg gctcacagtg tcagagggag caaatgccac cttcacctgc 120

agcttgtcca actggtcgga ggatcttatg ctgaactgga accgcctgag tcccagcaac 180

cagactgaaa aacaggccgc cttctgtaat ggtttgagcc aacccgtcca ggatgcccgc 240

ttccagatca tacagctgcc caacaggcat gacttccaca tgaacatcct tgacacacgg 300

cgcaatgaca gtggcatcta cctctgtggg gccatctccc tgcaccccaa ggcaaaaatc 360

gaggagagcc ctggagcaga gctcgtggta acagagagaa tcctggagac ctcaacaaga 420

tatcccagcc cctcgcccaa accagaaggc cggtttcaac cggaattccg gggtggtggt 480

ggttcaggag gagga 495

<210> 5

<211> 178

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> msPD-1-322mu蛋白

<400> 5

Met Trp Val Arg Gln Val Pro Trp Ser Phe Thr Trp Ala Val Leu Gln

1 5 10 15

Leu Ser Trp Gln Ser Gly Trp Leu Leu Glu Val Pro Asn Gly Pro Trp

20 25 30

Arg Ser Leu Thr Phe Tyr Pro Ala Trp Leu Thr Val Ser Glu Gly Ala

35 40 45

Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Leu Ser Asn Trp Ser Glu Asp Leu Met

50 55 60

Leu Asn Trp Asn Arg Leu Ser Pro Ser Asn Gln Thr Glu Lys Gln Ala

65 70 75 80

Ala Phe Cys Asn Gly Leu Ser Gln Pro Val Gln Asp Ala Arg Phe Gln

85 90 95

Ile Ile Gln Leu Pro Asn Arg His Asp Phe His Val Asn Ile Leu Asp

100 105 110

Thr Arg Arg Asn Asp Ser Gly Ile Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu

115 120 125

His Pro Lys Ala Lys Ile Glu Glu Ser Pro Gly Ala Glu Leu Val Val

130 135 140

Thr Glu Arg Ile Leu Glu Thr Ser Thr Arg Tyr Pro Ser Pro Ser Pro

145 150 155 160

Lys Pro Glu Gly Arg Phe Gln Pro Glu Phe Arg Gly Gly Gly Ser Gly

165 170 175

Gly Gly

<210> 6

<211> 537

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> msPD-1-322mu核酸

<400> 6

atgtgggtcc ggcaggtacc ctggtcattc acttgggctg tgctgcagtt gagctggcaa 60

tcagggtggc ttctagaggt ccccaatggg ccctggaggt ccctcacctt ctacccagcc 120

tggctcacag tgtcagaggg agcaaatgcc accttcacct gcagcttgtc caactggtcg 180

gaggatctta tgctgaactg gaaccgcctg agtcccagca accagactga aaaacaggcc 240

gccttctgta atggtttgag ccaacccgtc caggatgccc gcttccagat catacagctg 300

cccaacaggc atgacttcca cgtgaacatc cttgacacac ggcgcaatga cagtggcatc 360

tacctctgtg gggccatctc cctgcacccc aaggcaaaaa tcgaggagag ccctggagca 420

gagctcgtgg taacagagag aatcctggag acctcaacaa gatatcccag cccctcgccc 480

aaaccagaag gccggtttca accggaattc cggggtggtg gtggttcagg aggagga 537

<210> 7

<211> 176

<212> PRT

<213> 智人

<400> 7

Met Gln Ile Pro Gln Ala Pro Trp Pro Val Val Trp Ala Val Leu Gln

1 5 10 15

Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp

20 25 30

Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp

35 40 45

Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val

50 55 60

Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala

65 70 75 80

Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg

85 90 95

Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg

100 105 110

Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu

115 120 125

Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val

130 135 140

Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro

145 150 155 160

Arg Pro Ala Gly Gln Pro Glu Phe Arg Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

165 170 175

<210> 8

<211> 531

<212> DNA

<213> 智人

<400> 8

atgcagatcc cacaggcgcc ctggccagtc gtctgggcgg tgctacaact gggctggcgg 60

ccaggatggt tcttagactc cccagacagg ccctggaacc cccccacctt ctccccagcc 120

ctgctcgtgg tgaccgaagg ggacaacgcc accttcacct gcagcttctc caacacatcg 180

gagagcttcg tgctaaactg gtaccgcatg agccccagca accagacgga caagctggcc 240

gccttccccg aggaccgcag ccagcccggc caggactgcc gcttccgtgt cacacaactg 300

cccaacgggc gtgacttcca catgagcgtg gtcagggccc ggcgcaatga cagcggcacc 360

tacctctgtg gggccatctc cctggccccc aagacgcaga tcaaagagag cctgcgggca 420

gagctcaggg tgacagagag aagggcagaa gtgcccacag cccaccccag cccctcaccc 480

aggccagccg gccagccgga attccggggt ggtggtggtt caggaggagg a 531

<210> 9

<211> 162

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hsPD-1-14del

<400> 9

Met Gln Ile Pro Gln Ala Pro Trp Pro Val Val Trp Ala Val Leu Gln

1 5 10 15

Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Ala Leu Leu Val Val Thr Glu

20 25 30

Gly Asp Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser

35 40 45

Phe Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys

50 55 60

Leu Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg

65 70 75 80

Phe Arg Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val

85 90 95

Val Arg Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile

100 105 110

Ser Leu Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu

115 120 125

Arg Val Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro

130 135 140

Ser Pro Arg Pro Ala Gly Gln Pro Glu Phe Arg Gly Gly Gly Ser Gly

145 150 155 160

Gly Gly

<210> 10

<211> 486

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> hsPD-1-14del

<400> 10

atgcagatcc cacaggcgcc ctggccagtc gtctgggcgg tgctacaact gggctggcgg 60

ccaggatggt tcttagccct gctcgtggtg accgaagggg acaacgccac cttcacctgc 120

agcttctcca acacatcgga gagcttcgtg ctaaactggt accgcatgag ccccagcaac 180

cagacggaca agctggccgc cttccccgag gaccgcagcc agcccggcca ggactgccgc 240

ttccgtgtca cacaactgcc caacgggcgt gacttccaca tgagcgtggt cagggcccgg 300

cgcaatgaca gcggcaccta cctctgtggg gccatctccc tggcccccaa gacgcagatc 360

aaagagagcc tgcgggcaga gctcagggtg acagagagaa gggcagaagt gcccacagcc 420

caccccagcc cctcacccag gccagccggc cagccggaat tccggggtgg tggtggttca 480

ggagga 486

<210> 11

<211> 238

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> COVID-19 RBD蛋白

<400> 11

Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val Gln

1 5 10 15

Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro

20 25 30

Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp

35 40 45

Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr

50 55 60

Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr

65 70 75 80

Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val

85 90 95

Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys

100 105 110

Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val

115 120 125

Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr

130 135 140

Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu

145 150 155 160

Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn

165 170 175

Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe

180 185 190

Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu

195 200 205

Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys

210 215 220

Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe

225 230 235

<210> 12

<211> 419

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> COVID-19 N蛋白

<400> 12

Met Ser Asp Asn Gly Pro Gln Asn Gln Arg Asn Ala Pro Arg Ile Thr

1 5 10 15

Phe Gly Gly Pro Ser Asp Ser Thr Gly Ser Asn Gln Asn Gly Glu Arg

20 25 30

Ser Gly Ala Arg Ser Lys Gln Arg Arg Pro Gln Gly Leu Pro Asn Asn

35 40 45

Thr Ala Ser Trp Phe Thr Ala Leu Thr Gln His Gly Lys Glu Asp Leu

50 55 60

Lys Phe Pro Arg Gly Gln Gly Val Pro Ile Asn Thr Asn Ser Ser Pro

65 70 75 80

Asp Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg Arg Ala Thr Arg Arg Ile Arg Gly

85 90 95

Gly Asp Gly Lys Met Lys Asp Leu Ser Pro Arg Trp Tyr Phe Tyr Tyr

100 105 110

Leu Gly Thr Gly Pro Glu Ala Gly Leu Pro Tyr Gly Ala Asn Lys Asp

115 120 125

Gly Ile Ile Trp Val Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro Lys Asp

130 135 140

His Ile Gly Thr Arg Asn Pro Ala Asn Asn Ala Ala Ile Val Leu Gln

145 150 155 160

Leu Pro Gln Gly Thr Thr Leu Pro Lys Gly Phe Tyr Ala Glu Gly Ser

165 170 175

Arg Gly Gly Ser Gln Ala Ser Ser Arg Ser Ser Ser Arg Ser Arg Asn

180 185 190

Ser Ser Arg Asn Ser Thr Pro Gly Ser Ser Arg Gly Thr Ser Pro Ala

195 200 205

Arg Met Ala Gly Asn Gly Gly Asp Ala Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu

210 215 220

Asp Arg Leu Asn Gln Leu Glu Ser Lys Met Ser Gly Lys Gly Gln Gln

225 230 235 240

Gln Gln Gly Gln Thr Val Thr Lys Lys Ser Ala Ala Glu Ala Ser Lys

245 250 255

Lys Pro Arg Gln Lys Arg Thr Ala Thr Lys Ala Tyr Asn Val Thr Gln

260 265 270

Ala Phe Gly Arg Arg Gly Pro Glu Gln Thr Gln Gly Asn Phe Gly Asp

275 280 285

Gln Glu Leu Ile Arg Gln Gly Thr Asp Tyr Lys His Trp Pro Gln Ile

290 295 300

Ala Gln Phe Ala Pro Ser Ala Ser Ala Phe Phe Gly Met Ser Arg Ile

305 310 315 320

Gly Met Glu Val Thr Pro Ser Gly Thr Trp Leu Thr Tyr Thr Gly Ala

325 330 335

Ile Lys Leu Asp Asp Lys Asp Pro Asn Phe Lys Asp Gln Val Ile Leu

340 345 350

Leu Asn Lys His Ile Asp Ala Tyr Lys Thr Phe Pro Pro Thr Glu Pro

355 360 365

Lys Lys Asp Lys Lys Lys Lys Ala Asp Glu Thr Gln Ala Leu Pro Gln

370 375 380

Arg Gln Lys Lys Gln Gln Thr Val Thr Leu Leu Pro Ala Ala Asp Leu

385 390 395 400

Asp Asp Phe Ser Lys Gln Leu Gln Gln Ser Met Ser Ser Ala Asp Ser

405 410 415

Thr Gln Ala

<210> 13

<211> 288

<212> PRT

<213> 兔

<400> 13

Met Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu

1 5 10 15

Lys Lys Leu Gly Gly Ser Asn Asp Ile Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser

20 25 30

Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu Gln Tyr

35 40 45

Leu Glu Ala Thr Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Ala Pro Ser Thr

50 55 60

Cys Ser Lys Pro Met Cys Pro Pro Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser

65 70 75 80

Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

85 90 95

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Asp Asp Pro

100 105 110

Glu Val Gln Phe Thr Trp Tyr Ile Asn Asn Glu Gln Val Arg Thr Ala

115 120 125

Arg Pro Pro Leu Arg Glu Gln Gln Phe Asn Ser Thr Ile Arg Val Val

130 135 140

Ser Thr Leu Pro Ile Ala His Gln Asp Trp Leu Arg Gly Lys Glu Phe

145 150 155 160

Lys Cys Lys Val His Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

165 170 175

Ile Ser Lys Ala Arg Gly Gln Pro Leu Glu Pro Lys Val Tyr Thr Met

180 185 190

Gly Pro Pro Arg Glu Glu Leu Ser Ser Arg Ser Val Ser Leu Thr Cys

195 200 205

Met Ile Asn Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ser Val Glu Trp Glu Lys

210 215 220

Asn Gly Lys Ala Glu Asp Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Thr Val Leu Asp

225 230 235 240

Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Pro Thr Ser

245 250 255

Glu Trp Gln Arg Gly Asp Val Phe Thr Cys Ser Val Met His Glu Ala

260 265 270

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Ile Ser His Ser Pro Gly Lys

275 280 285

<210> 14

<211> 820

<212> DNA

<213> 兔

<400> 14

ctgggaggct caaacgacat attcaacaac ttcacagtgt ccttctggtt gcgggttccc 60

aaggtctctg ctagccacct cgaacaatac ctggaggcca ccaacaccaa agtggacaag 120

accgttgcgc cctcgacatg cagcaagccc atgtgcccac cccctgaact cctgggggga 180

ccgtctgtct tcatcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc acgcaccccc 240

gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc caggatgacc ccgaggtgca gttcacatgg 300

tacataaaca acgagcaggt gcgcaccgcc cggccgccgc tacgggagca gcagttcaac 360

agcacgatcc gcgtggtcag caccctcccc atcgcgcacc aggactggct gaggggcaag 420

gagttcaagt gcaaagtcca caacaaggca ctcccggccc ccatcgagaa aaccatctcc 480

aaagccagag ggcagcccct ggagccgaag gtctacacca tgggccctcc ccgggaggag 540

ctgagcagca ggtcggtcag cctgacctgc atgatcaacg gcttctaccc ttccgacatc 600

tcggtggagt gggagaagaa cgggaaggca gaggacaact acaagaccac gccgaccgtg 660

ctggacagcg acggctccta cttcctctac agcaagctct cagtgcccac gagtgagtgg 720

cagcggggcg acgtcttcac ctgctccgtg atgcacgagg ccttgcacaa ccactacacg 780

cagaagtcca tctcccactc tcctggtaaa taatctagag 820

<210> 15

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 接头序列

<400> 15

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

1 5

<210> 16

<211> 27

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 接头序列

<400> 16

Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Gly

1 5 10 15

Leu Tyr Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr

20 25

<210> 17

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 接头序列

<400> 17

Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu

1 5

<210> 18

<211> 27

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 接头序列

<400> 18

Ser Glu Arg Ser Glu Arg Ser Glu Arg Ser Glu Arg Ser Glu Arg Ser

1 5 10 15

Glu Arg Ser Glu Arg Ser Glu Arg Ser Glu Arg

20 25

<210> 19

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 接头序列

<400> 19

Gly Gly Gly Gly Gly Cys Pro Pro Cys

1 5

<210> 20

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 接头序列

<400> 20

Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Ser Glu Arg Ser

1 5 10 15

Glu Arg Ser Glu Arg

20

<210> 21

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 接头序列

<400> 21

Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn

1 5 10

<210> 22

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 接头序列

<400> 22

Pro Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn

1 5 10

<210> 23

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 接头序列

<400> 23

Gly Asp Leu Ile Tyr Arg Asn Gln Lys

1 5

<210> 24

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 接头序列

<400> 24

Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Pro Ser Cys Val Pro Leu Met

1 5 10 15

Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn

20

<210> 25

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 接头序列

<400> 25

Ala Met Gln Met Leu Lys Asp Thr Ile

1 5

<210> 26

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 接头序列

<400> 26

Thr Ser Asn Pro Pro Ile Pro Val Gly Asp Ile Tyr Lys Arg Trp Ile

1 5 10 15

Ile Leu Gly Leu

20

Claims (21)

1.一种可溶性PD-1融合蛋白，其包含可溶性PD-1蛋白片段和抗原性蛋白片段，其中所述可溶性PD-1蛋白片段包含选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:9的氨基酸序列，并且其中所述抗原性蛋白片段包含冠状病毒蛋白片段。

2.根据权利要求1所述的可溶性PD-1融合蛋白，其中所述冠状病毒蛋白片段衍生自冠状病毒受体结合域(RBD)或冠状病毒核蛋白(N)。

3.根据权利要求1或2所述的PD-1融合蛋白，其中所述冠状病毒蛋白片段衍生自COVID-19、SARS或MERS。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的PD-1融合蛋白，其中所述冠状病毒蛋白片段衍生自COVID-19受体结合域(RBD)或COVID-19核蛋白(N)。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的PD-1融合蛋白，其还包含Fc结构域。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的PD-1融合蛋白，其还包含接头序列，其中所述接头序列连接所述可溶性PD-1蛋白片段和所述抗原性蛋白片段。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的PD-1融合蛋白，其包含选自SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：7、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：9的氨基酸序列，以及选自SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12的氨基酸序列。

8.一种sPD-1融合核酸分子，其编码权利要求1-7中任一项所述的PD-1融合蛋白。

9.根据权利要求8所述的sPD-1融合核酸分子，其中所述核酸分子包含选自SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:10的核酸序列，以及编码选自SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12的氨基酸序列的核酸序列。

10.一种疫苗组合物，其包含权利要求8或9所述的sPD-1融合核酸分子。

11.一种治疗处于冠状病毒感染风险或患有冠状病毒感染的受试者的方法，其包括向所述受试者施用有效量的权利要求8或9所述的sPD-1融合核酸或权利要求10所述的疫苗组合物。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述冠状病毒感染是COVID-19、SARS或MERS。

13.根据权利要求11或12所述的方法，其中所述sPD-1融合核酸包含编码所述冠状病毒蛋白片段的核酸片段，其中所述冠状病毒蛋白片段衍生自COVID-19受体结合域(RBD)或COVID-19核蛋白(N)，并且其中所述冠状病毒感染是COVID-19。

14.根据权利要求11-13中任一项所述的方法，其中所述sPD-1融合核酸包含选自SEQID NO:4、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:10的核酸序列，以及编码选自SEQ ID NO：11或SEQ IDNO：12的氨基酸序列的核酸序列。

15.根据权利要求11-14中任一项所述的方法，其中所述sPD-1融合核酸通过注射施用。

16.根据权利要求11-14中任一项所述的方法，其中所述sPD-1融合核酸通过电穿孔施用。

17.一种治疗处于冠状病毒感染风险或患有冠状病毒感染的受试者的方法，其包括向所述受试者施用有效量的权利要求1-7中任一项所述的融合蛋白。

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述冠状病毒感染是COVID-19、SARS或MERS。

19.根据权利要求17或18所述的方法，其中所述冠状病毒蛋白片段衍生自COVID-19受体结合域(RBD)或COVID-19核蛋白(N)。

20.根据权利要求11-19中任一项所述的方法，其中所述受试者处于冠状病毒感染的风险中。

21.根据权利要求11-19中任一项所述的方法，其中所述受试者患有冠状病毒感染。

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