MXPA06003728A - Vacunas liquidas para multiples serogrupos meningococales - Google Patents

Abstract

Los sacáridos capsulares conjugados de los serogrupos C, W135 y Y meningococales son seguros y inmunógenos en humanos cuando se combinan en una dosis individual. Este efecto se retiene cuando se adiciona un sacárido capsular conjugado del serogrupo a. Estos antígenos conjugados se pueden combinar de forma estable en una dosis acuosa individual sin la necesidad de liofilización. Se puede lograr protección amplia contra infección de serogrupo B al usar un pequeño número de antígenos polipeptídicos definidos. Estos antígenos polipeptídicos se pueden combinar con los antígenos de sacárido sin pérdida de eficiencia protectora de cualquiera de los cinco serogrupos. Se retiene la eficiencia aún si se adiciona un conjugado de Hib. La eficiencia de un conjugado de serogrupo W135 se mejora por adición de antígenos de proteína, derivados de una cepa del serogrupo B. La adición de un conjugado de Hib a conjugados meningococales mejora la actividad total contra el serogrupo W135 meningococal.

Description

VACUNAS LIQUIDAS PARA MÚLTIPLES SERQGRÜPQS MENINGOCQCALES Campo de la Invención Esta invención se refiere a inmunización contra meningitis bacteriana, y en particular a inmunización combinada contra meningitis bacteriana provocada por múltiples patógenos. Antecedentes de la Invención La N. meningitis es un patógeno humano, gra -negativo, no móvil que coloniza la faringe y provoca meningitis (y ocasionalmente, septicemia en la ausencia de meningitis) . Provoca enfermedad tanto endémica como epidémica. Después de la introducción de la vacuna conjugada contra Haemophilus influenzae tipo B (Hib) , la N. meningitis es la causa principal de meningitis bacteriana en los EUA.

Un tercer patógeno responsable de la meningitis bacteriana es Streptococcus pneumoniae, pero ahora está disponible una vacuna efectiva (PrevNarMR [1] ) . Igual que la vacuna de Hib, la vacuna pneumococal se basa- en antigenos conjugados de sacáridos capsulares. En base a los polisacáridos capsulares del organismo, se han identificado varios serogrupos de N. meningi tis, que incluyen (A, B, C, H, I, K, L, 29E, W135, X, Y e Z) . El serogrupo A es el patógeno más frecuentemente implicado en la enfermedad epidérmica en la África sub- REF: 172061 sahariana. Los serogrupos B y C son responsables de la vasta mayoría de casos en los Estados Unidos de América y en la mayoría de los países desarrollados. Los serogrupos 135 e Y son responsables del resto de lo casos en los Estados Unidos de América y países desarrollados. Aunque el polisacárido capsular es un inmunógeno protector efectivo, cada serogrupo requiere un antígeno de sacárido separado, y este planteamiento es inadecuado para inmunizar contra el serogrupo B. De esta manera, el éxito reciente con vacunas de sacáridos cogujados contra el serogrupo C (Menjugate1^ [2] , MeningitecMR y NeisVac-CMR) no ha tenido impacto en la enfermed provocada por los serogrupos A, B, 135 o Y; por el contrario, presenta una presión selectiva hacia la emergencia de estos serogrupos como causas principales de la 5 enfermedad meningococal . Se ha conocido durante muchos años [3, 4] y se ha aprobado para uso humano una vacuna tetravalente inyectable de polisacáridos capsulares de los serogrupos A, C, Y y W135. Los polisacáridos en esta vacuna están sin conjugar y 0 se presentan en una relación en peso de 1:1:1:1 [5], con 50 µg de cada polisacárido conjugado. Aunque efectiva en adolescentes y adultos, induce una respuesta inmunitaria pobre y de corta duración de protección y no se puede usar en infantes [por ejemplo, referencia 6] . Adicionalmente, las [-. vacunas padecen de la desventaja de requerir reconstitución de las formas liofilizadas en el momento de uso. Para el serogrupo B, una vacuna ha probado ser elusiva. Se han probado las vacunas basadas en vesículas de membrana exterior [por ejemplo, referencia 6] , pero la protección se restringe típicamente a la cepa usada para hacer la vacuna. De esta manera, permanece la necesidad de una vacuna que proteja contra los serogrupos A, C, W135 e Y meningococales en niños, y también una que no requiera reconstitución antes de la administración. Adicionalmente, permanece la necesidad de una vacuna que proteja de forma amplia contra el serogrupo B. Descripción de la Invención La invención cumple con todas estas diversas necesidades, y se basa en ocho hallazgos separados. Primero, los inventores han encontrado que los sacáridos capsulares conjugados de los serogrupos C, W135 y Y meningococales son seguros e inmunógenos en humanos cuando se combinan en una dosis individual. Segundo, han encontrado que este efecto se retiene cuando se adiciona un sacárido capsular conjugado del serogrupo A. Tercero, que estos antígenos conjugados se pueden combinar de forma estable en una dosis' acuosa individual sin la necesidad de liofilización. Cuarto, han encontrado que se puede lograr protección amplia contra la „.. infección por serogrupo B al usar un pequeño número de antígenos de polipéptidos definidos. Quinto, han encontrado que estos antígenos de polipéptido se pueden combinar con los antígenos de sacárido sin pérdida de eficiencia protectora para ninguno de los cinco serogrupos. Sexto, han encontrado que la eficiencia se retiene aún si se adiciona un conjugado de Hib. Séptimo, se ha encontrado que la eficiencia de un conjugado del serogrupo 135 se mejora por la adición de antígenos de proteína derivados de una cepa del serogrupo B. finalmente, han encontrado que la adición de un conjugado de Hib a conjugados meningococales mejora la actividad completa contra el serogrupo W135 del meningococo. De esta manera, la invención proporciona una composición inmunogénica acuosa que, después de la administración a un sujeto, es capaz de inducir una respuesta inmunitaria que es bactericida contra los serogrupos B, C, W135 e Y de N. meningi tidis, en donde la composición comprende: (i) un antígeno de sacárido capsular del serogrupo C conjugado; (ii) un antígeno de sacárido capsular del serogrupo W135 conjugado; (iii) un antígeno de sacárido capsular del serogrupo Y conjugado; y (iv) uno o más antígenos de polipéptido del serogrupo B. La composición acuosa también puede inducir una respuesta inmunitaria que es bacteriana contra el serogrupo A de N. meningi tidis, y de esta manera puede comprender además : (v) un antígeno de sacárido capsular del serogrupo A conjugado.

La invención también proporciona una composición inmunogénica acuosa que, después de la administración a un sujeto es capaz de inducir una respuesta inmunitaria que es (a) bactericida contra al menos el serogrupo W135 de N. meningi tidis, y (b) protectora contra enfermedad de JT. influenzae tipo b, en donde la composición comprende: (i) un antígeno de sacárido capsular del serogrupo W135 conjugado; (ii) un antígeno de sacárido capsular de H. influenzae tipo b conjugado. La composición puede incluir además antígenos de sacárido capsular conjugado de los serogrupos C y Y y opcionalmente A. Además puede incluir antígenos de polipéptido del serogrupo B de N. meningitidis . Los antígenos de sacáridos preferidos son oligosacáridos . Serogrupos C, W135 e Y Se han conocido durante muchos años las técnicas para preparar polisacáridos capsulares a partir de meningococos , y comprenden típicamente un proceso que comprende los pasos de precipitación de polisacárido (por ejemplo, usando un detergente catiónico), fraccionamiento por etanol, extracción con fenol frío (para remover la proteína) y ultracentrifugación (para remover LPS) [ver por ejemplo referencia 8] . Un proceso más preferido [9] comprende la precipitación de polisacáridos seguido por solubilización del polisacárido precipitado usando un alcohol inferior. Se puede lograr precipitación usando un detergente catiónico tal como sales de tetrabutilamonio y cetiltrimetilamonio (por ejemplo, las sales de bromuro) , o bromuro de hexadimetrina y sales de miristiltrimetilamonio. Se prefiere de manera particular [10] el bromuro de cetiltrimetilamonio ("CTAB") . La solubilización del material precipitado se puede lograr usando un alcohol inferior tal como metanol, propan-l-ol, propan-2-ol, butan-1-ol, butan-2-ol, 2-metil-propan-l-ol, 2-metil-propan~2-ol, dioles, etc., pero el etanol es particularmente adecuado para solubilizar complejos de CTAB-polisacárido. Se puede adicionar etanol al polisacárido precipitado para dar una concentración final de etanol (en base al contenido total de etanol y agua) de entre 50 % y 95 %. Después de la re-solubilización, el polisacárido se puede tratar adicionalmente para remover contaminantes. Esto es particularmente importante en situaciones donde no es aceptable aún contaminación menor (por ejemplo, para producción de vacunas humanas) . Esto comprenderá típicamente uno o más pasos de filtración, por ejemplo, filtración profunda, filtración a través de carbón activado se puede usar, filtración de tamaño y/o ultrafiltración. Una vez filtrado para remover los contaminantes, el polisacárido se puede precipitar para el tratamiento y/o procesamiento adicional . Esto se puede lograr de manera conveniente al intercambiar cationes (por ejemplo, por la adición de sales de calcio o sodio) . Después de la purificación, los sacáridos capsulares se conjugan a las proteínas portadoras como se describe más adelante . 5 En las referencias 11 y 12 se describen métodos adicionales y alternativos para la purificación y conjugación de sacáridos meningococales . Como una alternativa a la purificación, los sacáridos capsulares de la presente invención se pueden obtener por síntesis total o parcial, por ejemplo, síntesis de Hib se describe en la referencia 13 , y la síntesis de MenA en la referencia 14. El sacárido se puede modificar típicamente, por ejemplo, se puede 0-acilar o des-0-acilar . Cualquier des-0- 15 acetilación o hiper-acetilación puede ser en posiciones específicas en el sacárido. Por ejemplo, la mayoría de las cepas del serogrupo C tienen grupos O-acetilo en la posición C-7 y/o C-8 de los residuos de ácido siálico, pero aproximadamente 15 % de los aislados clínicos carecen de estos grupos O-acetilo [5, 16] . La acetilación no parece afectar la eficiencia protectora (por ejemplo, diferente del producto MenjugateMR, el producto Ne i sVac - CMR usa el sacárido des -O-acetilado , pero ambas vacunas son efectivas) . El sacárido del serogrupo W135 es un _.. polímero de unidades de disacárido de ácido siálico- galactosa. El sacárido del serogrupo Y es similar al sacárido del serogrupo 135, excepto que la unidad de repetición de disacárido incluye glucosa en lugar de galactosa. Igual que los sacáridos del serogrupo C, los sacáridos MenW135 y MenY tienen O-acetilación variable, pero en las posiciones 7 y 9 de ácido siálico [17] . Cualquier medicación química toma lugar de manera preferente antes de la conjugación, pero puede tomar lugar de manera alternativa o adicional durante la conjugación. Los sacáridos de diferentes serogrupos se purifican de manera preferente de forma separada, y entonces se pueden combinar, ya sea antes o después de la conjugación. Serogrupo A Las composiciones de la invención pueden incluir un antígeno de sacárido capsular de serogrupo A conjugado. Los sacáridos se pueden purificar y conjugar de la misma manera como para los serogrupos C, W135 e Y (ver anteriormente) , aunque es estructuralmente diferente, en tanto que las cápsulas de los serogrupos C, 135 e Y se basan alrededor de ácido siálico (ácido N-acetil-neuramínico, NeuAc) , la cápsula del serogrupo A se basa en N- acetil -mannosamina, que es el precursor natural de ácido siálico. El sacárido del serogrupo A es particularmente susceptible de la hidrólisis, y su inestabilidad en medios acuosos significa que (a) la inmunogenicidad de las vacunas líquidas contra el serogrupo A declina durante el tiempo, y (b) es más difícil el control de calidad, debido a la liberación de productos de hidrólisis de sacáridos en la vacuna. El sacárido capsular de MenA nativo es un homopolímero de N-acetil-D-mannosamina-1-fosfato (al?ß) -enlazado, con O-acetilación parcial en C3 y C4. El enlace glicosídico principal es un enlace de 1-6-fosfodiéster que comprende el grupo hemiacetal de Cl y el grupo de alcohol de Cß de la D-mannosamina. La longitud promedio de cadena es 93 monómeros. Tiene la siguiente fórmula: Los inventores han preparado un antígeno de sacárido modificado que retiene la actividad inmunogénica del sacárido nativo del serogrupo A pero que es mucho más estable en agua. Los grupos hidroxilo unidos en los carbonos 3 y 4 de las unidades de monosacárido se reemplazan por un grupo de bloqueo [eferencia 18] . El número de unidades de monosacárido que tienen grupos de bloqueo en lugar de hidroxilos puede variar. Por ejemplo, todas o sustancialmente todas las unidades de monosacárido pueden tener grupos de bloqueo. De manera alternativa, al menos 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o 90 % de las unidades de monosacárido pueden tener grupos de bloqueo. Al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 unidades de monosacárido pueden tener grupos de bloqueo. Igualmente, el número de grupos de bloqueo en una unidad de monosacárido puede variar. Por ejemplo, el número de grupos de bloqueo en cualquier unidad de monosacárido particular puede ser 1 o 2. La unidad de monosacárido Terminal puede tener o no un grupo de bloqueo en lugar de su hidroxilo nativa. Se prefiere retener un grupo hidroxilo anomérico libre en una unidad de monosacárido Terminal a fin de proporcionar un manejo para reacciones adicionales (por ejemplo, conjugación) . Los grupos de hidroxilo anoméricos se pueden convertir a grupos amino (-NH2 o -NH-E, donde E es un grupo protector de nitrógeno por aminación reductiva (usando, por ejemplo, NaBH3CN/NH Cl ) , y entonces se pueden regenerar después de que otros grupos hidroxilo se han convertido a grupos de bloqueo. Los grupos de bloqueo para reemplazar los grupos hidroxilo pueden estar directamente accesibles mediante una •reacción de derivatización del grupo hidroxilo, es decir, al reemplazar el átomo de hidrógeno del grupo hidroxilo con otro grupo . Los derivados adecuados de los grupos hidroxilo que actúan como grupos de bloqueo son, por ejemplo, carbamatos, sulfonatos, carbonatos, esteres, éteres (por ejemplo, silil- éteres o alquil-éteres) y acétales. Algunos ejemplos específicos de estos grupos de bloqueo son alilo, Aloe, bencilo, BOM, t-butilo, tritilo, TBS, TBDPS, TES, TMS, TIPS, PMB, MEM, MOM, MTM, THP, etc. Otros grupos de bloqueo que no están directamente accesibles y que reemplazan completamente el grupo hidroxilo incluyen C1_?2alquilo, C3. ?2alquilo, C5_?2arilo, C5-?2arilo-C1.6alquilo, NRXR2 (R1 y R2 se definen en el siguiente párrafo), H, F, Cl, Br, C02H, C02 (C?_ salquilo) , C?, CF3, CC13, etc. 20 Los grupos de bloqueo preferidos son de la fórmula 0-X-Y o -OR3 en donde: X es C (0) , S (O) o S02; Y es CX- a2alquilo, C?-i2alcoxi, C3_?2cicloalquilo, Cs.12arilo' o C5. ?2aril-C?-6alquilo, cada uno de los cuales puede estar opcionalmente sustituido con 1, 2 o 3 grupos _.. independientemente seleccionados de F, Cl, Br, C02H, C02 (Ci- 6alquilo) , CN, CF3 o CC13; o Y es NRXR2; R1 y R2 se seleccionan independientemente de H, C?_?2alquilo, C3_?cicloalquilo, C5_ i2arilo, C5-?2arilo-C1.6alquilo; o R1 y R2 se pueden unir para formar un grupo heterocíclico saturado de C3_12; R3 es C?_ 12alquilo o C3_12cicloalquilo, cada uno de los cuales puede estar opcionalmente sustituido con 1, 2 o 3 grupos independientemente seleccionados de F, Cl, Br, C02 (C?_ salquilo) , CN, CF3 o CC13; o R3 es C5-?2arilo o C5_12aril-C1_ salquilo, cada uno de los cuales puede estar opcionalmente sustituido con 1, 2, 3, 4 o 5 grupos seleccionados de F, Cl, Br, C02H, C02(CX-ealqilo) , CN, CF3 o CC13. Cuando R3 es C?-?2alquilo o C3_12cicloalquilo, está típicamente sustituido con 1, 2 o 3 grupos como se define anteriormente. Cuando R1 y R2 se unen para formar un grupo heterocíclico saturado de C3_?2, se quiere decir que R1 y R2 junto con el átomo de nitrógeno forman un grupo heterocíclico saturado que contiene cualquier número de átomos de carbono entre 3 y 12 (por ejemplo. C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9, C?0, Cll r C12) . El grupo heterocíclico puede contener uno o dos heteroátomos (tal como N, O o S) diferente del átomo de nitrógeno. Los ejemplos de grupos heterocíclicos saturados C3_?2 son pirrolidinilo, piperidinilo, morfolinilo, piperazinilo, imidazolinilo, azetidinilo, y aziridinilo. Los grupos de bloqueo -0-X-Y y -OR3 se pueden „,- preparar a partir de grupos -OH por procedimientos normales de derivatización, tal como reacción del grupo hidroxilo con un haluro de acilo, haluro de alquilo, haluro de sulfonilo, etc. Por lo tanto, el átomo de oxígeno en -O-X-Y es de manera preferente el átomo de oxígeno del grupo hidroxilo, en tanto que el grupo -X-Y en -O-X-Y reemplaza de manera preferente el átomo de hidrógeno del grupo hidroxilo . De manera alternativa, los grupos de bloqueo pueden ser accesibles vía una reacción de sustitución, tal como una sustitución tipo Mitsonobu. Estos y otros métodos para preparar grupos de bloqueo a partir de grupos hidroxilo son bien conocidos . De manera más preferente, el grupo de bloqueo es -0C(0)CF3 [19], o un grupo carbamato -OC (0)NR1R2, donde R1 y R2 se seleccionan independientemente a partir de C?_salquilo. De manera más preferente, R1 y R2 son ambos metilo, es decir, el grupo de bloqueo es -0C(0)NMe2. Los grupos de bloqueo de carbamato tiene un efecto estabilizante en el enlace glicosídico y se pueden preparar bajo condiciones moderadas. Los sacáridos de MenA modificados preferidos contienen n unidades de monosacárido, donde al menos h % de las unidades de monosacárido no tienen grupos -OH en ambas de las posiciones 3 y 4. El valor de h es 24 o más (por ejemplo 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, 99 o 100) y es preferentemente 50 o más. Los grupos -OH ausentes son de manera preferente grupos de bloqueo como se define anteriormente. Otros sacáridos de MenA modificados preferidos comprenden unidades de monosacárido, en donde al menos s de las unidades de monosacárido, no tienen -OH en la posición 3 y no tienen -OH en la posición 4. El valor de s es al menos 1 (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90). Los grupos -OH ausentes son de manera preferente grupos de bloqueo como se define anteriormente . Los sacáridos de MenA modificados, adecuados para el uso con la invención tienen la fórmula: en donde n es un número entero de 1 a 100 (de manera preferente un número entero de 5 a 25, de manera más preferente 15-25) ; T es de la fórmula (A) o (B) : cada grupo Z se selecciona independientemente de OH o un grupo de bloqueo como se define anteriormente; y cada grupo Q se selecciona independientemente de OH o un grupo de bloqueo como se define anteriormente; Y se selecciona de OH o un grupo de bloqueo como se define anteriormente , E es H o un grupo protector de nitrógeno; y en donde más de aproximadamente 7 % (por ejemplo, 8 %, 9 %, % o más) de los grupos Q don grupos de bloqueo. Cada uno de los n+2 grupos Z puede ser el mismo o diferente entre sí. Igualmente, cada uno de los n+2 grupos Q puede ser los mismos o diferentes entre si. Todos los grupos Z pueden ser OH. De manera alternativa, al menos 10 %, 20 %, %, 40 %, 50 o 60 % de los grupos Z puede ser OAc. De manera preferente, cerca de 70 % de los grupos Z es OAc, con el resto de los grupos Z que es OH o grupos de bloqueo como se define anteriormente. Al menos aproximadamente 7 % de grupos Q son grupos de bloqueo. De manera preferente, al menos 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o aún 100 % de los grupos Q son grupos de bloqueo. Los grupos de bloqueo preferidos son grupos de retiro de electrones. Sin que se desee que se una por teoría, se cree que los enlaces glicosídicos son inestables a hidrólisis debido a la asistencia de un ataque nucleófilo intramolecular de un grupo de hidroxilo de sacárido en el enlace glicosídico (es decir, por formación de un compuesto intermedio cíclico) . Entre mayor sea la nucleofilicidad del grupo hidroxilo, mayor será la tendencia del ataque nucleófilo intramolecular. Un grupo de bloqueo de retiro de electrones tiene el efecto de descolocar el par solo de oxígeno, disminuyendo de este modo la nucleofilicidad de oxígeno y disminuyendo la tendencia del ataque nucleófilo intramolecular . Para protección contra el serogrupo A, por lo tanto, las composiciones acuosas pueden incluir un sacárido modificado de MenA como se define anteriormente. Las composiciones preferidas de la invención se pueden almacenar durante 28 días a 37 °C y después de ese periodo, menos de f % de la cantidad total inicial del sacárido de MenA conjugado estará sin conjugar, donde f es 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5 o memos .

Conjugación covalente Los sacáridos capsulares en composiciones de la invención usualmente se conjugarán a proteínas portadoras. En general, la conjugación mejora la inmunogenicidad de los sacáridos conforme los convierte de antígenos T independientes a antígenos T-dependientes, permitiendo de este modo la cebadura de memoria inmunológica. La conjugación es particularmente útil para vacunas pediátricas y es una técnica bien conocida [por ejemplo 0 revisada en referencias 20 a 29] . Las proteínas portadoras preferidas son toxinas bacterianas o toxoides bacterianos, tal como toxoide de difteria o toxoide de tétanos, o el mutante de toxina de difteria CRM?97 [30-32] . Otras proteínas portadoras adecuadas incluyen la proteína de membrana exterior de N. meningi tidis [33], péptidos sintéticos [34,35], proteínas de choque térmico [36, 37], proteínas de tosferina [38, 39], citocinas [40] , linfocinas [40] , hormones [40] , factores de crecimiento [40] , proteínas artificiales que comprenden múltiples epítopes de células T CD4+ humanas de varios antígenos derivados de patógenos [41] tal como la proteína N19 [42], proteína D de H. influenzae [43, 44], pneumolisina [45] , proteína de superficie pneumococal PspA [46] , proteínas de captación de hierro [47] , toxina A o B de __. C. difficile [48] , toxinas bacterianas mutantes (por ejemplo, toxina de cólera "CT" o toxina térmicamente lábil "LT" de E. coli) , tal como una CT con una sustitución en Glu-29 [49] , etc. Los portadores preferidos son toxoide de difteria, toxoide de tétanos, proteína D de H. influenzae, y particularmente CRMi97. Dentro de una composición de la invención, es posible usar más de una proteína portadora, por ejemplo para reducir el riesgo de supresión del portador. De esta manera, se pueden usar diferentes proteínas portadoras para diferentes serogrupos, por ejemplo, se pueden conjugar sacáridos del serogrupo A a CRM?97 en tanto que los sacáridos del serogrupo C se pueden conjugar a toxoide de tétano. También es posible usar más de una proteína portadora para un antígeno de sacárido particular por ejemplo sacáridos del serogrupo A pueden estar en dos grupos, con algunos conjugados a CRM?97 y otros conjugados a toxoide de tétano. Sin embargo, en general, se prefiere usar la misma proteína portadora para todos los serogrupos, con CRM197 que es la elección preferida. 0 Una proteína portadora individual puede tener más de un antígeno de sacárido [50] . Por ejemplo, una proteína portadora individual puede tener conjugados a la misma, sacáridos de los serogrupos A y C. para lograr este objetivo, se pueden mezclar sacáridos antes de la reacción de »-. conjugación. Sin embargo, en general, se prefiere tener conjugados separados para cada serogrupo. Se prefieren los conjugados con una relación de sacárido:proteína (p/p) de entre 1:5 (es decir, exceso de proteína) y 5:1 (es decir, exceso de sacárido). Se prefieren las relaciones entre 1:2 y 5:1, puesto que son más preferidas las relaciones entre 1:1.25 y 1:2.5. La proteína portadora en exceso se puede preferir para MenA y MenC. Se pueden usar conjugados en unión con proteína portadora libre [51] . Cuando está presente una proteína 0 portadora dada tanto en la forma libre como conjugada en una composición de la invención, la forma no conjugada es de manera preferente no más de 5 % de la cantidad total de la proteína portadora en la composición como una totalidad, y de manera más preferente está presente en al menos 2 % en peso. 5 Se puede usar cualquier reacción de conjugación adecuada, con cualquier ligador adecuado cuando sea necesario. El sacárido se activará o funcionalizará típicamente antes de la conjugación. La activación puede comprender, por ejemplo, reactivos de cianilación tal como CDAP (por ejemplo, tetrafluoroborato de l-ciano-4- dimetilamino-piridinio "52, 53, etc]). Otras técnicas adecuadas son carbodiimidas, hidrazidas, esteres activos, norborano, ácido p-nitrobenzoico, N-hidroxisuccinimida, S- _,- NHS , EDC, TSTU; ver también la introducción a la referencia ¿ 27) . Los enlaces vía un grupo ligador se pueden hacer usando cualquier procedimiento conocido, por ejemplo, los procedimientos descritos en las referencias 54 y 55. Un tipo de enlace comprende afinación reductiva del polisacárido, acoplamiento del grupo amino resultante con un extremo de un grupo ligador de ácido adípico, y entonces acoplamiento de una proteína al otro extremo del grupo ligador de ácido adípico [25, 56, 57] . Otros ligadores incluyen B-propionamido

[58] , nitrofenil-etilamina [59] , haluros de haloacilo [60] , enlaces glicosídicos [61] , ácido 6-aminocaproico [62] , ADH [63], porciones de C4 a Ci2 [64], etc. Como una alternativa usar al un ligador, se puede usar enlace directo. Los enlaces directos a la proteína pueden comprender oxidación del polisacárido seguido por amininación reductiva con la proteína, como se describen por ejemplo las referencias 65 y 66. Un proceso que comprende la introducción de grupos amino en el sacárido (por ejemplo, al reemplazar los grupos =o terminales con -NH2) seguido por derivatización con un diéster adípico (por ejemplo, N-hidroxisuccinimido-diéster de ácido adípico) y reacción con proteína portadora se prefiere. Otra acción preferida usa activación con CDAP con un portador de proteína D, por ejemplo, par MenA o MenC. p,- Después de la conjugación, se pueden separar los sacáridos libres y conjugados. Hay muchos métodos adecuados, que incluyen cromatografía hidrófoba, ultra filtración tangencial, diafiltración, etc. [ver también referencias 67 y 68, etc.] Donde la composición de la invención incluye un oligosacárido conjugado, se prefiere que la preparación del oligosacárido preceda a la conjugación. Después de la conjugación, los métodos de la invención pueden incluir un paso de medir el nivel de proteína portadora no conjugada. Una manera para hacer esta medición comprende electroforesis capilar [69] (por ejemplo en solución libre) , o cromatografía electrocinética micelar [70] . Después de la conjugación los métodos de la invención pueden incluir un paso de medir el nivel del sacárido no conjugado. Una manera para hacer esta medición comprende HPAEC-PAD [67] . Después de la conjugación, los métodos de la invención pueden incluir un paso de separar el sacárido conjugado del sacárido no conjugado. Una manera de separar estos sacáridos es usar un método que precipita de forma selectiva un componente. Se prefiere la precipitación selectiva del sacárido conjugado, para dejar en solución el sacárido no conjugado, por ejemplo, por un tratamiento de desoxicolato [67] .

Después de la conjugación, los métodos de la invención pueden incluir un paso de medir el tamaño molecular y/o masa molar de un conjugado. En particular, se pueden medir las distribuciones. Una manera de hacer estas mediciones comprende cromatografía de exclusión de tamaño con detección por fotometría de dispersión de luz de multiángulo y refractometría diferencial (SEC-MALS/RI) [71] . Oligosacáridos Los sacáridos capsulares se usarán en general en la 0 forma de oligosacáridos. De manera conveniente se forman por fragmentación del polisacárido capsular purificado (por ejemplo por hidrólisis) , que usualmente se seguirá por purificación de los fragmentos del tamaño deseado. La fragmentación de polisacáridos se realiza de manera preferente para dar un grado promedio final de polimerización (DP) en el oligosacáridos de menos de 30 (por ejemplo, entre 10 y 20, de manera preferente alrededor de 10 para el serogrupo A; entre 15 y 25 para los serogrupos W135 y Y, de manera preferente alrededor de 15-20; entre 12 y 22 para el serogrupo C; etc.) . Se puede medir de manera conveniente DP por cromatografía de intercambio iónico o por ensayos colorimétricos [72] . Si se realiza la hidrólisis, el hidrolizado en general se hará de un tamaño a fin de remover los _.. oligosacáridos de longitud corta [73] . Esto se puede lograr de varias maneras, tal como ultrafiltración seguida por cromatografía de intercambio iónico. Los oligosacáridos con un grado de polimerización de menos de o igual a aproximadamente 6 se remueven de manera preferente para el serogrupo A, y aquellos de menos de aproximadamente 4 se remueven de manera preferente para los serogrupos W135 y Y. La hidrólisis química de los sacáridos comprende en general el tratamiento con ya sea ácido base bajo condiciones que son normales en la técnica. Las condiciones para despolimerización de sacáridos capsulares a sus monosacáridos constituyentes, se conoce en la técnica. Un método de despolimerización comprende el uso de peróxido de hidrógeno [11] . Se adiciona peróxido de hidrógeno a un sacárido (por ejemplo, para dar una concentración final de H202) , y la mezcla entonces se incuba (por ejemplo, alrededor de 55°C) hasta que se ha logrado una reducción deseable de la longitud de cadena. Se puede seguir la reducción durante el tiempo al remover muestras de la mezcla y entonces al medir el tamaño molecular (promedio) del sacárido en la muestra. Entonces se puede detener la despolimerización por enfriamiento rápido una vez que se ha alcanzado una longitud deseada de cadena. Serogrupo B Las vacunas contra patógenos tal como virus de hepatitis B, difteria y tétano contienen típicamente un _.. antígeno de proteína individual (por ejemplo, el antígeno de superficie de HBV, o un toxoide de tétano. En contraste, las vacunas a celulares de tosferina contiene típicamente al menos tres proteínas de B. pertussis y la vacuna pneumococal PrevNar"51, contienen siete antígenos de sacárido, conjugados, separados . Otras vacunas tal como vacunas celulares de tosferina, la vacuna de sarampión, la vacuna de polio inactivada (IPV) y las vacunas de OMV meningococales son por su naturaleza muy compleja, mezclas de un gran número de antígenos . Si se puede producir protección por un antígeno individual, por un pequeño número de antígenos definidos, o por una mezcla compleja de antígenos no definidos, depende por lo tanto el patógeno en cuestión. Como se señala anteriormente, ha probado ser elusiva una vacuna contra el meningococo del serogrupo B. Las vacunas basadas en OMV muestran eficiencia limitada. Además, el gran número de antígenos no definidos presentes en un OMV, combinado con su naturaleza variable, significa que los OMV tienen varios problemas de control de calidad. Los inventores han encontrado que la protección amplia contra infección de serogrupo B se puede lograr, y que esto se puede lograr al usar un pequeño número de antígenos definidos de polipéptido serogrupo B, y de este modo las composiciones de la invención incluyen uno o más antígenos de polipéptido tal que la composición puede inducir una respuesta inmunitaria que es bactericida contra dos o más (es decir 2 o 3) de los linajes hipervirulentos A4 , ET-5 y linaje 3 del serogrupo B de N. meningi tidis . Se han reportado secuencias genómicas para los serogrupos A [74] yt B [75, 76] meningococales, y se pueden seleccionar antígenos adecuados de los polipéptidos codificados [por ejemplo referencias 77-82] . Se han manipulado antígenos candidatos para mejorar la expresión heteróloga [referencias 83 a 85] . Una composición preferida incluye una proteína Tbp una proteína Hsf [86] . Hsf es una proteína autotransportadora [87-89] , también conocida como nhhA [89] , GNA0992 [77] o NMB0992 [75] . Tbp es una proteína de unión a transferrina [90-93] , y abarca tanto TbpA como TbpB y las formas de alto peso molecular y bajo peso molecular de TbpA y TbpB. Tbp abarca proteínas individuales descritas anteriormente y complejos de las proteínas y cualquier otra proteína o complejos de las mismas capaces de la unión a transferrina. Aunque Tbp puede referirse ya sea a las formas de alto o bajo peso molecular de TbpA o TbpB, se prefiere que ambas formas de alto peso molecular y bajo peso molecular de TbpA y/o TbpB estén presentes. De manera preferente, está presente TbpA de alto peso molecular y bajo peso molecular. Otra composición preferida incluye el lipooligosacárido (LOS) del serogrupo B [94] . El LOS se puede _.. usar además del polipéptido (s) del serogrupo B o se puede usar en lugar de este/estos. Otra composición preferida incluye al menos un antígeno seleccionado de cada una de al menos dos categorías diferentes de proteína que tienen diferentes funciones dentro de Neisseria. Los ejemplos de estas categorías de proteína son: adhesinas, proteínas aut©transportadoras, toxinas, proteínas integrales de membrana exterior y proteínas de adquisición de hierro. Estos antígenos se pueden seleccionar como sigue, usando la nomenclatura de la referencia 95: al menos una adhesina Neisserial seleccionada del grupo que consiste de FhaB, NspA PilC, Hsf, Hap, MafA, MafB, 0mp26, NMB0315, NMB0995, NMB1119 y NadA; al menos un autotransportador Neisserial seleccionado del grupo que consiste de Hsf, Hap, IgA proteasa, AspA, y NadA; al menos una toxina Neisserial seleccionada del grupo que consiste de FrpA, FrpC, FrpA/C, VapD, ?M-ADPRT (?MB1343) y cualquiera o ambos de inmunotipo L2 de LPS e inmunotipo L3 de LPS; al menos una proteína de adquisición de hierro ?eisserial seleccionada del grupo que consiste de TbpA, TbpB, LbpA, LbpB, HpuA, HpuB, Lipo28 (G?A2132) , Sibp, ?MB0964, ?MB0293, FbpA, Bcp, BfrA, BfrB y P2086 (XthA) ; al menos una proteína asociada a membrana ?eisserial, de manera preferente proteína de membrana exterior, particularmente proteína integral de membrana exterior, seleccionada del grupo que consiste de PilQ, OMP85, FhaC, ?spA, TbpA, LbpA, TspA, TspB, TdfH, PorB, MItA, HpuB, HimD, HisD, GNA1870 , OstA, HlpA (G?A1946) , ?MB1124, ?MB1162, ?MB1220, ?MB1313, ?MB1953, HtrA, y PLDA (OMPLA) . Estas combinaciones de antígenos ?eisseriales se dice que conducen a una mejora sorprendente de la eficiencia de la vacuna contra infección ?eisserial [95] . Las composiciones particularmente preferidas incluyen uno o más de los siguientes cinco antígenos [96] : (1) una proteína a "?adA" , de manera preferente en forma oligomérica (es decir, en forma trimérica) ; (2) una proteína de "741"; (3) una proteína de "936"; (4) una proteína de "953"; y (5) una proteína de "287". "NadA" (adhesina A ?eisserial) de MenB se describe como la proteína "961" en la referencia 80 (SEQ ID ?O 2943 y 2944) y como "?MB1994" en la referencia 75 (ver también números de acceso del GenBank: 11352904 y 7227256) . Se puede encontrar un estudio detallado de la proteína en la referencia 97. Cuando se usa de acuerdo a la presente invención, ?adA puede tomar varias formas. Las formas preferidas de NadA son variantes de truncamiento o supresión, tal como aquellas descritas en las referencias 83 a 85. En particular, NadA sin su ancla de membrana C-terminal se prefiere (por ejemplo, supresión de residuos 351-405 para la cepa 2996, para dar SEQ ID ?O 1 en la presente) , que algunas veces se distingue en la presente por el uso de un _.. superíndice "C" por ejemplo, ?adA(c) . La expresión de NadA sin su dominio de ancla de membrana en E . Coli da por resultado la secreción de la proteína en el sobrenadante de cultivo con remoción concomitante de su péptido guía 23mer (por ejemplo para dejar un 327mer para la cepa 2996 [SEQ ID NO: 2 en la presente]). Los polipéptidos sin sus polipéptidos guía se distinguen algunas veces en la presente por el uso de un superíndice "NL" por ejemplo, NadA(N ) o NadA(c) (N ) . Los polipéptidos preferidos de NadA tienen una secuencia de aminoácidos que: (a) tiene 50 % o más de identidad (por 0 ejemplo, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % o más) a SEQ ID NO: 2; y/o (b) comprende un fragmento de al menos n aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO 1, en donde n es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más) . Los 5 fragmentos preferidos para (b) carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, , 25 o más) del C-termino y/o el N-término de SEQ ID NO 1 (por ejemplo, NadA(c) , NadA(NL) , NadA(c) ( L) ) . Otros fragmentos preferidos comprenden un epítope de SEQ ID ?O 1, y un 0 fragmento particularmente preferido de SEQ ID ?O 1 es SEQ ID ?O 2. Estas varias secuencias incluyen variantes de ?adA (por ejemplo, variantes alélicas, homólogos, ortólogos, parálogos, mutantes, etc.). En la Figura 9 de la referencia 98 se muestran varias referencias de ?adA. _.. La proteína "741" de MenB se describe en la referencia 80 (SEQ ID NOs 2535 y 2536) y como "NMB1870" en la referencia 75 (ver también número de acceso del GenBank GI-.7227128). La proteína correspondiente en el serogrupo A

[74] tiene el número de acceso del GenBank 7379322. La 741 es naturalmente una lipoproteína. Cuando se usa de acuerdo a la presente invención, la proteína 741 puede tomar varias formas. Las formas preferidas de 741 son variantes por truncamiento o supresión, tal como aquellas descritas en las referencias 83 a 85. En particular, el N-término de 741 se puede suprimir e incluye su secuencia de poli-glicina (es decir, supresión de los residuos 1 a 72 para la cepa MC58 [SEQ ID NO 3 en la presente] ) , que algunas veces se distingue en la presente por el uso de un prefijo "?G". Esta supresión puede mejorar la expresión. La supresión también remueve el sitio de lipidación de la 741. Las secuencias preferidas de 741 tienen una secuencia de aminoácidos que: (a) tiene 50 % o más de identidad (por ejemplo, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % o más) a SEQ ID NO:3; y/o (b) comprende un fragmento de al menos n aminoácidos consecutivos del SEQ ID NO 3, en donde n es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más) . Los fragmentos preferidos para (b) comprenden un epítope de 741. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del C-término y/o N-término de SEQ ID NO 3. Estas secuencias incluyen las variantes de 741 (por ejemplo, variantes alélicas, homólogos, ortólogos, parálogos, mutantes, etc.). Se pueden encontrar varias secuencias de 741 en SEQ ID ?Os 1 a 22 de la referencia 85, en SEQ ID ?Os 1 a 23 de la referencia 99, y en SEQ ID ?Os 1- 299 de la referencia 100. La proteína "936" del serogrupo B se describe en la referencia 80 (SEQ ID ?Os 2883 y 2884) y como "?MB2091" en la referencia 75 (ver también número de acceso del GenBank Gl: 7227353) . El gen correspondiente en el serogrupo A [74] tiene el número de acceso de GenBank 7379093. Cuando se usa de acuerdo a la presente invención, la proteína 936 puede tomar varias formas. Las formas preferidas de 936 son variantes por truncamiento o supresión, tal como aquellas descritas 'en las referencias 83 a 85. En particular, el péptido guía de ?-término de 936 se puede suprimir (por ejemplo, supresión de los residuos 1 a 23 de la cepa MC58, para dar 936(?L) [SEQ ID ?O : 4 en la presente]). Las secuencias preferidas de 936 tienen una secuencia de aminoácidos que: (a) tiene 50 % o más de identidad (por ejemplo, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % o más) a SEQ ID ?0:4; y/o (b) comprende un fragmento de al menos n aminoácidos consecutivos de SEQ ID ?O 4, en donde n es 7 o más (por ejemplo 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, „-. 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más) . Los Z D fragmentos preferidos para (b) comprenden un epítope de 936.

Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del C-término y/o N-término de SEQ ID NO: 4. Estas secuencias incluyen 936 variantes (por ejemplo, variantes alélicas, homólogos, ortólogos, parálogos, mutantes, etc.). La proteína "953" del serogrupo B se describe en la referencia 80 (SEQ ID NOs 29917 y 2918) y como "NMB1030" en la referencia 75 (ver también número de acceso de GenBank Gl: 7226269) . La proteína correspondiente del serogrupo A [74] tiene el número de acceso de GenBank 7380108. Cuando se usa de acuerdo a la presente invención, la proteína 953 puede tomar varias formas . Las formas preferidas de 953 son variantes por truncamiento o supresión, tal como aquellas descritas en las referencias 83 a 85. En particular, el péptido guía del N-térmíno del 953 se puede suprimir (por ejemplo, supresión de residuos 1 a 19 para la cepa MC58, para dar 953(NL) [SEQ ID NO: 5 en la presente]. Las secuencias preferidas de 953 tienen una secuencia de aminoácidos que : (a) tiene 50 % o más de identidad (por ejemplo, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % o más) a SEQ ID NO:5; y/o (b) comprende un fragmento de al menos n aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO 5, en donde n es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, ,.,-. 150, 200, 250 o más) . Los fragmentos preferidos para (b) comprenden un epítope de 953. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ej emplo 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del C-término y/o el N- término de SEQ ID NO 5. Estas secuencias incluyen variantes de 936 (por ejemplo, variantes alélicas, homólogos, ortólogos, parólogos, mutantes, etc.). Las formas alélicas de 953 se pueden ver en la Figura 19 de la referencia 82. La proteína "287" del serogrupo B se describe en la referencia 80 (SEQ ID NOs 3103 y 3104) , como "NMB2132" de la referencia 75, y como "GNA2132" en la referencia 77 (ver también número de acceso del GenBank Gl: 7227388) . La proteína correspondiente en el serogrupo A [74] tiene el número de acceso del GenBank 7379057. Cuando se usa de acuerdo a la presente invención, la proteína 287 puede tomar varias formas. Las formas preferidas de 287 son variantes por truncamiento o supresión, tal como aquellas descritas en las referencias 83 a 85. En particular, el N-término de 287 se puede suprimir e incluye su secuencia de poli-glicina (por ejemplo, supresión de los residuos 1 a 24 para la cepa MC58, para dar ?G287 [SEQ ID ?O:6 en la presente] . Esta supresión puede mejorar la expresión. Las secuencias preferidas de 287 tienen una secuencia de aminoácidos que: (1) tiene 50 % o más de identidad (por ejemplo 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % o más) a SEQ ID ?0:6; y/o (b) comprende un fragmento de al ol- menos n aminoácidos consecutivos de SEQ ID ?O 6, en donde n Z D es 7 o más (por ejemplo, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más) . Los fragmentos preferidos para (b) comprenden un epítope de 287. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del C-término y/o el N-término de SEQ ID NO: 6. Estas secuencias incluyen variantes de 287 (por ejemplo, variantes alélicas, homólogos, ortólogos, parálogos, mutantes, etc.). Las formas alélicas de 287 se pueden ver en las Figuras 5 y 0 15 de la referencia 82, y en el Ejemplo 13 y la Figura 21 de la referencia 80 (SEQ ID NOs 3179 a 3184) . Los antígenos preferidos de MenB comprenden una secuencia de aminoácidos encontrada en una de las cepas son 2996, MC58, 95N477 y 394/98. La proteína 287 es de manera preferente de la cepa 2996 o, de manera más preferente de la cepa 394/98. La proteína 741 es de manera preferente de las cepas MC58, 2996, 394/98 o 95N477, del serogrupo C, o la cepa 90/18311 del serogrupo C. Es más preferida la cepa MC58. Las proteínas 936, 953 y NadA son de manera preferente de la cepa 2996. Donde una composición incluye un antígeno de proteína particular (por ejemplo, 741 o 287) , la composición puede incluir este antígeno en más de una forma variante, por ejemplo, la misma proteína, pero de más de una sepa. Estas proteínas se pueden incluir como proteínas en tándem o _ .. separadas .

En algunas modalidades, sin embargo, la composición de la invención incluye la misma proteína pero de más de una cepa. Este planteamiento se ha encontrado que es efectivo dentro de la proteína 741. Esta proteína es un antígeno extremadamente efectivo para producir respuestas de anticuerpos anti-meningococales, y se expresa a través de todos los serogrupos meningococales. El análisis filogenético muestra que la proteína se divide en dos grupos, y que una de estas divisiones nuevamente da tres variantes en total [101] , y en tanto que el suero formulado contra una variante dada es bactericida dentro del mismo grupo variante, no es activo contra cepas que expresan una de las otras dos variantes, es decir, hay protección cruzada intra-variante, pero no protección cruzada inter-variante [99, 101] . Para máxima eficiencia entre cepas cruzadas, por lo tanto, se prefiere que una composición deba incluir más de una variante de la proteína 741. Una secuencia de ejemplo de cada variante se da en SEQ ID Nos : 10, 11 y 12 en la presente, iniciando con un residuo N-terminal de cisteína al cual se unirá covalentemente el lípido en la forma nativa de la lipoproteína. Por lo tanto se prefiere que la composición debe incluir al menos dos de: (1) una primera proteína, que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos a% de identidad de secuencia a SEQ ID ?O 10 y/o que comprende una secuencia de aminoácidos que consiste de un fragmento de al menos x aminoácidos contiguos de SEQ ID NO 10; (2) una segunda proteína, que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos b% de identidad de secuencia a SEQ ID NO 11 y/o que comprende una secuencia de aminoácidos que consiste de un fragmento de al menos y aminoácidos contiguos de SEQ ID NO 11; y (3) una tercera proteína, que comprende una secuencia de aminoácidos que contiene al menos c % identidad de secuencia a SEQ ID NO 12 y/o que comprende una secuencia de aminoácidos que consiste de un fragmento de al menos z aminoácidos contiguos de SEQ ID NO 12. El valor de a es al menos 85, por ejemplo 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99.5, o más, el valor de b es al menos 85 por ejemplo 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99.5, o más, el valor de c es al menos 85 por ejemplo 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99.5, o más. Los valores de a, b y c no están relacionados intrínsecamente entre sí . El valor de x es al menos 7, por ejemplo, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 225, 250) . El valor de y es al menos 7, por ejemplo, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 225, 250) . El valor de z es al menos 7 por ejemplo 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, X40, 160, 180, 200, 225, 250) . Los valores de x, y e z no están relacionados intrínsecamente entre sí . Se prefiere que cualquier secuencia dada de aminoácidos de 741 no caiga en más de una de las categorías (1) , (2) y (3) . Cualquier secuencia dada de 741 caerá de esta manera en sólo una de las categorías (1) , (2) y (3) . De esta manera se prefiere que: la proteína (1) tenga al menos i% identidad de secuencia a la proteína (2) ; la proteína (1) tenga menos de j% de identidad de secuencia a la proteína (3) ; y la proteína (2) tenga menos de k% identidad de secuencia a la proteína (3) . El valor de i es 60 o más (por ejemplo, 61, 62, 63, 64, 65, 66 , 61 , 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, etc.) y es a lo mucho a. El valor de j es 60 o más (por ejemplo 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, etc.) y es a lo mucho b. El valor de k es 60 o más (por ejemplo 61, 62, 63, 64, 65, 66 , 61 , 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, etc.) y es a lo mucho c. Los valores de i, j y k no están relacionados intrínsecamente entre sí . Las composiciones de la invención incluyen un pequeño número (por ejemplo, menos de t antígenos, en donde t es 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4 o 3) de antígenos purificados del serogrupo B. Se prefiere de manera particular que la composición no deba incluir mezclas complejas o no definidas de antígenos, por ejemplo, se prefiere no incluir vesículas de membrana exterior en la composición. Los antígenos se expresan de manera preferente de manera recombinante en un hospedador heterólogo y entonces se purifican. Para una composición que incluye t antígenos de MenB, puede haber t polipéptidos separados pero, para reducir complejidad aún más, se prefiere que al menos dos de los antígenos se expresen como una cadena individual de polipéptido (una proteína "híbrida" [referencias 83 a 85] ) es decir tal que los t antígenos formen menos de los t polipéptidos. Las proteínas híbridas ofrecen dos ventajas principales: primero, una proteína que puede ser inestable o pobremente expresada por sí misma se puede ayudar al adicionar un compañero híbrido adecuado que supere el problema; segundo, la elaboración comercial se simplifica puesto que sólo se necesita emplear una expresión y purificación a fin de producir dos proteínas útiles separadas . Una proteína híbrida incluida en una composición de la invención puede incluir dos o más (es decir, 2, 3, 4 o 5) de los 'cinto antígenos listados anteriormente. Se prefieren híbridos que contienen dos de los cinco antígenos. Dentro de la combinación de cinco antígenos básicos „-. (NadA, 741, 953, 936 y 287) un antígeno puede estar presente en más de una proteína híbrida y/o como una proteína no híbrida. Sin embargo, se prefiere que, esté presente un antígeno ya sea como un híbrido o como un no híbrido, pero no como ambos, aunque puede ser útil incluir la proteína 741 tanto como un antígeno híbrido como no híbrido (de manera preferente lipoproteína) , particularmente donde se usa más de una variante de 741. Las proteínas híbridas se pueden representar por la fórmula NH2-A- [-X-L-] n-B-COOH, en donde: X es una secuencia de aminoácidos de uno de los cinco antígenos básicos; L es una secuencia de aminoácidos ligadora opcional; A es una secuencia de aminoácidos N-terminal opcional; B es una secuencia de aminoácidos C-terminal opcional; y n es 2, 3, 4 o 5. 15 De manera más preferente, n es 2. Los híbridos de dos antígenos para el uso en la invención comprenden: NadA y 741; ?adA y 936; ?adA y 953; ?adA y 287; 741 y 936; 741 y 953; 741 y 287; 936 y 953; 936 y 287; 953 y 287. Dos proteínas preferidas son: Xx es una 936 y X2 es una 741; Xi es una 287 y X2 es una 953. Si una porción -X- tiene una secuencia peptídica guía en su forma de tipo silvestre, esta se puede incluir u omitir en la proteína híbrida. En algunas modalidades, los péptidos guía se suprimirán excepto para aquella de la „.. porción -X- localiza en el ?-término de la proteína híbrida, es decir, el péptido guía de Xx se retendrá, pero los péptidos guía de X2...Xn se omitirán. Esto es equivalente a suprimir todos los péptidos guía y usar el péptido guía de x como la porción -A- . Para cada n casos de [-X-L-] , la secuencia ligadora de aminoácidos -L- puede estar presente o ausente. Por ejemplo, cuando n = 2, el híbrido puede ser NH2-X1-L1-X2-L2-COOH, NHa-Xx-Xa-COOH, NHa-Xa-Li-Xa-COOH, NE2-Xí-X2-- 2-COO?., etc. Las secuencias ligadoras de aminoácidos -L- serán típicamente cortas (por ejemplo 20 o menos aminoácidos, es decir, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1). Los ejemplos comprenden secuencias peptídicas cortas que facilitan la clonación, ligadores de poli-glicina (es decir, que comprenden Glyn en donde n = 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más) , y marcas de histidina (es decir Hisn, en donde n = 3, 4, 5, 6 , 7, 8, 9, 10 o más) . Otras secuencias de aminoácidos, ligadoras, adecuadas serán evidentes para aquellos expertos en la técnica. Un ligador útil es GSGGGG (SEQ ID 9) , con el di-péptido Gly-Ser que se forma a partir de un sitio de restricción de BamHI, ayudando de este modo a la clonación y manipulación, y el tetrapéptido (Gly) 4 que es un ligador típico de poli-glicina. Si Xn+1 es una proteína ?G y Ln es un ligador de glicina, esto puede ser equivalente a Xn+1 que no sea una proteína ?G y Ln que está ausente. -A- es una secuencia de aminoácidos N-terminal opcional. Esta será típicamente corta (por ejemplo, 40 o menos aminoácidos, es decir, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1). Los compuestos incluyen secuencias guía para dirigir el tráfico proteico, o secuencias peptídicas cortas que facilitan la clonación o purificación (por ejemplo, marcas de histidina, es decir, Hisn en donde n = 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más) . Otras secuencias de aminoácidos N-terminales adecuadas estarán presentes por aquellos expertos en la técnica. Si Xi carece de su propia metionina de N-término, -A- es de manera preferente un oligopéptido (por ejemplo con 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 aminoácidos) que proporciona la metionina de N-término. -B- es una secuencia de aminoácidos C-terminal opcional. Esta será típicamente corta (por ejemplo, 40 o menos aminoácidos es decir 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1). Los ejemplos incluyen secuencias para dirigir el tráfico de proteínas, secuencias peptídicas cortas que facilitan la clonación o purificación (por ejemplo, que comprenden marcas de histidina, es decir, Hisn en donde n = 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más) , o secuencias que mejoran la estabilidad de la proteína. Otras secuencias de aminoácidos C-terminales adecuadas serán evidentes por aquellos expertos en la técnica. Dos proteínas híbridas particularmente preferidas de la invención son como sigue: Estas dos proteínas se pueden usar en combinación con NadA (particularmente con SEQ ID NO: 2) . De esta manera, una combinación preferida de los antígenos de MenB para el uso con la invención incluyen de esta manera un primer polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:2, un segundo polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos : 7 y un tercer polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 8. Éste es un grupo preferido de antígenos de MenB para el uso con la invención. Como se menciona anteriormente, las composiciones de la invención pueden incluir una respuesta de anticuerpos bactericidas en suero que es efectiva contra dos o tres de los linajes hipervirulentos A4, ET-5 y linaje 3 de MenB. Pueden inducir adicionalmente respuestas de anticuerpos bactericidas contra uno o más de los linajes hipervirulentos del subgrupo I, subgrupo III, subgrupos IV-1 o complejo ET- 37, o ' contra otros linajes, por ejemplo linajes hiperinvasivos . Esta respuesta de anticuerpos se mide de manera conveniente en ratones y son un indicador normal de la eficiencia de la vacuna [por ejemplo, ver nota final 14 de la referencia 77] . La actividad bactericida sérica (SBA) mide la aniquilación bacteriana mediada por complemento, y se puede ensayar usando complemento de conejo neonato o humano.

Las formas de la WHO requieren que una vacuna induzca al menos un aumento de 4 veces en SBA en más de 90 % de los receptores . La composición no necesita inducir anticuerpos bactericidas contra cada y toda la cepa MenB dentro de estos 0 linajes hipervirulentos; más bien, para cualquier grupo dado de cuatro de más cepas de meningococo del grupo B dentro de un linaje hipervirulento particular, los anticuerpos inducidos por la composición son bactericidas contra al menos 50% (por ejemplo, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o más) del grupo.

Los grupos preferidos de cepas incluirán cepas aisladas en al menos cuatro de los siguientes países: GB, AU, CA, NO, IT, US, NZ , NL, BR y CU. El suero tiene de manera preferente un título bactericida de al menos 1024 (por ejemplo, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 21S, 217, 218 o mayor, de manera preferente al menos 214) , es decir, el suero es capaz de aniquilar al menos 50 % de las bacterias de prueba de una cepa particular cuando se diluye 1/1024, como se describe en la referencia 77. Las composiciones preferidas pueden inducir respuestas bactericidas contra las siguientes cepas del _.. meningococo del serogrupo B: (i) de la agrupación A4, cepas 961-5945 (B:2b:P1.21,16) y/o cepa G2136 (B:-); (ii) del complejo ET-5, cepa MC58 (B :15 :P1.7, 16B) y/o9 cepa 44/76 (B:15:P1.7,16) ; (iii) de el linaje 3, cepa 394/98 (B:4:P1.4) y/o cepa BZ198 (B:NT:-). Las composiciones más preferidas pueden inducir respuestas bactericidas contra las cepas 961-5945, 44/76 y 394/98. Las cepas 961-5945 y G2136 son ambas cepas de referencia de MLST de Neisseria [ids 638 y 1002 en referencia 102] . La cepa MC58 está ampliamente disponible (por ejemplo ATCC BAA-335) y fue la cepa secuenciada en la referencia 75. Se ha usado ampliamente la cepa 44/76 y se caracterizó (por ejemplo referencia 103) y es una de las cepas de referencia de MLST de Neisseria [id 237 en referencia 102; fila 32 de la Tabla 2 en referencia 014] . Originalmente se aisló la cepa 394/98 en Nueva Zelanda en 1998, y ha habido varios estudios publicados que usan esta cepa (por ejemplo, referencias 105 y 106) . La cepa BZ198 es otra cepa de referencia de MLST [id 409 en referencia 102; fila 41 de Tabla 2 en referencia 104] . La cor?posición puede inducir adicionalmente una respuesta bactericida contra la cepa LNP17592 del serogrupo W135 (W135:2a:P1.5,2) , del complejo ET-37. Esta es una cepa de Haji aislada en Francia en 2000. Otros antígenos de polipéptido de MenB que se pueden incluir en las composiciones de la invención incluyen aquellas que comprenden una de las siguientes secuencias de aminoácidos: SEQ ID NO 650 de ref. 78, SEQ ID No: 878 de ref. 78; SEQ ID No: 884 de ref. 78; SEQ ID No: 4 de ref. 79; SEQ ID No : 591 de ref. 80; SEQ ID No : 818 de ref. 80; SEQ ID ?o : 864 de ref. 80; SEQ ID ?o: 866 de ref. 80; SEQ ID ?o : 1196 de ref. 80; SEQ ID ?o : 1272 de ref. 80; SEQ ID ?o : 1274 de ref. 80 SEQ ID No : 1640 de ref. 80; SEQ ID ?o: 1788 de ref. 80; SEQ ID No : 2288 de ref. 80; SEQ ID ?o : 2466 de ref. 80; SEQ ID No : 2554 de ref. 80; SEQ ID ?o : 2576 de ref. 80; SEQ ID ?o: 2606 de ref. 80; SEQ ID ?o : 2608 de ref. 80; SEQ ID ?o: 2616 de ref. 80; SEQ ID ?o : 2668 de ref. 80; SEQ ID ?o : 2780 de ref. 80; SEQ ID ?o : 2932 de ref. 80; SEQ ID ?o : 2958 de ref. 80; SEQ ID ?o: 2970 de ref. 80; SEQ ID ?o: 2988 de ref. 80, o un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que: (a) tiene 50 % o más de identidad (por ejemplo, 60 %, 70 % 80 %, 90 %, 95 %, 99 % o más) a las secuencias; y/o (b) comprende un fragmento de al menos n aminoácidos consecutivos de estas secuencias, en donde n es 7 o más (por ejemplo 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más) . Los fragmentos preferidos para (b) comprenden un epítope de la secuencia pertinente. Más de una (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o más) de estos polipéptidos se pueden incluir. Componentes antigénicos adicionales Los antígenos no meningococales y no de neisserial, de manera preferente que no disminuyen la respuesta inmunitaria contra los componentes meningococales, también se pueden incluir en las composiciones de la invención. La referencia 107 describe por ejemplo combinaciones de oligosacáridos de los serogrupos B y C de N. meningi tidis 5 junto con el sacárido Hib. Los antígenos no meningococales particularmente preferidos incluyen: un antígeno de difteria, tal como un toxoide de difteria [por ejemplo, capítulo 3 de referencia 108] un antígeno de tétano, tal como un toxoide de 10 tétano [por ejemplo, capítulo 4 de referencia 108] halotoxina de tosferina (PT) y hemaglutinina filamentosa (FHA) de B . pertussis, opcionalmente en combinación con pertactina y/o aglutinógenos 2 y 3 [por ejemplo referencias 109 y 110] 15 - antígeno celular de tosferina un antígeno de virus de hepatitis A, tal como virus inactivado [por ejemplo, 111, 112] un antígeno de virus de hepatitis B, tal como los antígenos de superficie y/o núcleo [por ejemplo, 112, 20 113] , con el antígeno de superficie que se adsorbe de manera preferente sobre un fosfato de aluminio [114] antígeno (s) de polio [por ejemplo 115, 116] tal como IPV. La mezcla puede comprender uno o más de estos _.. antígenos adicionales, que se pueden destoxificar en donde es necesario (por ejemplo, destoxificación de toxina de tosferina por medio químico y/o genético. Donde se incluye un antígeno de difteria en la mezcla, se prefiere también incluir antígeno de tétano y antígenos de tosferina. De manera similar, en donde se incluye un antígeno de tétano se prefiere también incluir antígenos de difteria y tosferina. De manera similar, en donde se incluye un antígeno de tosferina se prefiere también incluir antígenos de difteria y tétanos. Los antígenos en la mezcla se presentarán típicamente a una concentración de 1 µg/ml cada uno. En general, la concentración de cualquier antígeno dado será suficiente para producir una respuesta inmunitaria contra ese antígeno. Se prefiere que la eficiencia protectora de los antígenos de sacárido individuales no se remueva al combinarlos, aunque se puede reducir la inmunogenidad real (por ejemplo, títulos de ELISA) . Como una para usar alternativa antígenos de proteína en la mezcla, se puede usar ácido nucleico que codifique para el antígeno. Los componentes proteicos de la mezcla se pueden reemplazar de esta manera por el ácido nucleico (de manera preferente, ADN, por ejemplo en la forma de un plásmido) que codifica para la proteína. De manera similar, las composiciones de la invención pueden comprender proteínas que imitan los antígenos de sacárido, por e emplo, mimotopos [117] o anticuerpos anti-idiotípicos . Éstos pueden reemplazar componentes individuales de sacáridos, o pueden complementarlos. Como un ejemplo, la vacuna puede comprender un imitador peptídico del polisacárido capsular de MenC [118] o MenA [119] en lugar del sacárido mismo. Los dos antígenos no meningococales preferidos para la inclusión de las composiciones de la invención son aquellos que protegen contra H. influenzae tipo B (Hib) y contra Streptococcus pneumoniae. Haemophilus influenzae tipo B (Hib) En donde la composición incluye un antígeno tipo B de H. influenzae, típicamente será un antígeno de sacárido capsular de Hib. Los antígenos de sacárido de H. Influenzae b son bien conocidos. De manera ventajosa, el sacárido de Hib se conjuga de manera covalente a una proteína portadora, a fin de mejorar su inmunogenicidad, especialmente en niños. La preparación de los conjugados de polisacárido en general y del polisacárido capsular de Hib en particular, está bien documentada [por ejemplo, referencias 21-29, etc.]. La invención puede usar cualquier conjugado de Hib adecuado. Las proteínas portadoras adecuadas se describen anteriormente, y los portadores preferidos para los sacáridos de Hib son CRMX97 ("HbOC"), toxoide de tétanos ("PRP-T") y el complejo de membrana exterior de N-meningi tidis ("PRP-OMP") .

La porción de sacárido del conjugado puede ser un polisacárido (por ejemplo, polirribosilrribitol-fosfato (PRP) de longitud completa)-, pero se prefiere hidrolizar los polisacáridos para formar oligosacáridos (por ejemplo PM de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 KDa) . Un conjugado preferido comprende un oligosacárido de Hib enlazado covalentemente CRM?9 vía un ligador de ácido adípico [120, 121] . El toxoide de tétanos también es un portador preferido. 0 La administración del antígeno Hib da por resultado de manera preferente una concentración de anticuerpos anti- PRP de >0.15 µg/ml, de manera más preferente > 1 µg/ml. Donde una composición incluye un antígeno de sacárido de Hib, se prefiere que no incluya un adyuvante de hidróxido de aluminio. Si la composición incluye un adyuvante de fosfato de aluminio entonces el antígeno de Hib se puede adsorber al adyuvante [122] o no se puede adsorber [123] . Se puede lograr la prevención de la adsorción al seleccionar el pH correcto durante el mezclado del antígeno/adyuvante, un adyuvante con un cambio apropiado de punto cero, y un origen apropiado de mezclado para los varios antígenos diferentes en una composición [124] . Las composiciones de la invención pueden comprender más de un antígeno de Hib. Los antígenos de Hib se pueden liofilizar, por ejemplo, para reconstitución por _-- composiciones meningococales de la invención.

Streptococcus pneumoniae Donde la composición incluye un antígeno de S. pneumoniae, será típicamente un antígeno de sacárido capsular que se conjuga de manera preferente a una proteína portadora [por ejemplo referencia 125 a 127] . Se prefiere incluir sacáridos de más de un serotipo de S. pneumoniae. Por ejemplo, las mezclas de polisacáridos de 23 serotipos diferentes se usarán de forma amplia, como son vacunas e conjugados con polisacáridos de entra 5 y 11 serotipos diferentes [128] . Por ejemplo, PrevNar™ [1] contiene antígenos de siete serotipos (4, 6B, 9V, 18C, 19F y 23F) con cada sacárido individualmente conjugado a CRM197 por aminación reductiva, con 2 µg de cada sacárido por 0.5 ml de dosis (4 µg del serotipo 6B) , y con conjugados adsorbidos en un adyuvante de fosfato de aluminio. Las composiciones de la invención incluyen de manera preferente al menos los serotipos 6B, 14, 19F y 23F. Los conjugados se pueden adsorber sobre un fosfato de aluminio. Como una alternativa a usar antígenos de sacárido de pneumococos, la composición puede incluir uno o más antígenos polipeptídicos . Las secuencias genómicas para varias cepas de pneumococos están disponibles [129, 130] y se pueden someter a vacunología invertida [131-134] para identificar antígenos polipeptídicos adecuados [135, 136] . Por ejemplo, la composición puede incluir uno o más de los siguientes antígenos: PhtA, PhtD, PhtB, PhtE, SpsA, Lytb, LytC, LytA, Spl25, SplOl, Spl28, Spl30 y Spl30, como se define en la referencia 137. La composición puede incluir más de uno (por ejemplo 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ó 14) de estos antígenos. En algunas modalidades, la composición puede incluir antígenos tanto de sacárido como de polisacárido del pneumococo. Estos se pueden usar en mezcla simple, o el antígeno de sacárido pneumococal se puede conjugar a una proteína pneumococal. Las proteínas portadoras adecuadas para estas modalidades incluyen los antígenos listados en el párrafo anterior [137] . Los antígenos pneumococales se pueden liofilizar, por ejemplo conjuntantamenté con el antígeno de Hib. 15 Composiciones farmacéuticas La composición de la invención comprenderá típicamente, además de los componentes mencionados anteriormente, uno o más "portadores farmacéuticamente aceptables" , que incluyen cualquier portador que no induzca por sí mismo la producción de anticuerpos peligrosos al individuo que recibe la composición. Los portadores adecuados son típicamente macromoléculas grandes, lentamente metabolizadas, tal como proteínas, polisacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, „_. copolímeros de aminoácido, sacarosa [138] trehalosa [139] , lactosa y agregados lipidíeos (tal como gotas de aceite o liposomas) . Estos portadores son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica. La vacuna también puede contener diluyente tal como agua, solución salina, glicerol, etc. Adicionalmente, las sustancias auxiliares, tal como agentes humectantes o emulsionantes, sustancias amortiguadoras de pH, y similares, pueden estar presentes. Solución salina fisiológica, estéril, libre de pirógenos, y amortiguada con fosfato es un portador típico. Un análisis completo de 0 excipientes farmacéuticamente aceptables está disponible en la referencia 140. Las composiciones de la invención están en forma acuosa, es decir soluciones o suspensiones. La formulación líquida de este tipo permite que las composiciones se 5 administren directamente desde su forma envasada, sin la necesidad de reconstitución en un medio acuoso, y de esta manera son ideales para inyección. Las composiciones pueden estar presentes en frascos, o pueden estar presentes en jeringas rellenas listas. Las jeringas se pueden administrar con o sin agujas. Una jeringa incluirá una dosis individual de la composición, en tanto que una dosis puede incluir una dosis individual o múltiples dosis. Las composiciones líquidas de la invención también son adecuadas para reconstitución de otras vacunas de una ».. forma liofilizada, por ejemplo, para reconstituir antígenos de Hig ó DTP liofilizados . Donde se va a usar una composición de la invención para esta reconstitución extemporánea, la invención proporciona un equipo, que puede comprender dos frascos, o puede comprender una jeringa rellena, preparada y un frasco, con los contenidos de la jeringa que se usan para reactivar los contenidos del frasco antes de la inyección. Las composiciones de la invención se pueden envasar en una forma de dosis unitaria o en forma de dosis múltiples. Para formas de dosis múltiples, se prefieren frascos a jeringas pre-rellenas . Los volúmenes de dosis efectivos se pueden establecer por rutina, pero una dosis humana típica de la composición para inyección tiene un volumen de 0.5 ml . El pH de la composición está de manera preferente entre 6 y 8 , de manera preferente cerca de 7. El pH estable se puede mantener para el uso de un amortiguador. Si una composición comprende una sal de hidróxido de aluminio, se prefiere usar un amortiguador de histidina [141] . La composición puede ser estéril y/o estar libre de pirógenos. Las composiciones de la invención pueden ser isotónicas con respecto a los humanos. Las composiciones de la invención son inmunogénicas, y de manera más preferente son composiciones de vacuna. Las composiciones de la invención pueden ser ya sea profilácticas (es decir, para prevenir infección) o „.. . terapéuticas (es decir, para tratar infección), pero típicamente serán profilácticas . Las composiciones inmunogénicas usadas como vacunas comprenden una cantidad inmunológicamente efectiva de los antígenos, así como cualquier otro componente, conforme sea necesario. Por "cantidad inmunológicamente efectiva" , se quiere decir que la administración de esa cantidad a un individuo, ya sea en una forma individual o como parte de una serie, es efectiva para el tratamiento o prevención. Esta cantidad varia dependiendo de la salud y condición física del individuo que se va a 0 tratar, edad, el grupo taxonómico del individuo que se va a tratar (por ejemplo, primate no humano, primate, etc.), la capacidad del sistema inmunitario del individuo para sintetizar anticuerpos, el grado de protección deseado, la formulación de la vacuna, la valoración de la situación médica del doctor que trata, y otros factores pertinentes. Se espera que la cantidad caiga en un intervalo relativamente amplio que se pueda determinar a través de ensayos de rutina. Dentro de cada dosis, la cantidad de un antígeno de sacárido individual estará en general entre 1-50 µg (medido como masa de sacárido) , por ejemplo aproximadamente 1 µg, aproximadamente 2.5 µg, aproximadamente 4 µg, aproximadamente 5 µg o aproximadamente 10 µg. Cada sacárido puede estar presente a sustancialmente la misma cantidad por dosis. Sin embargo, la ,-.. relación (p/p) del sacárido Men : sacárido MenW135 puede ser mayor que 1 (por ejemplo 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 10:1 ó mayor), y/o la relación (p/p) del sacárido MenY : sacárido MenC puede ser menor que 1 (por ejemplo 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, o menor). Las relaciones preferidas (p/p) para sacáridos de los serogrupos (A:C:W135:Y son: 1:1:1:1; 1:1:1:2; 2:1:1:1; 4:2:1:1; 8:4:2:1; 4:2:1:2; 8:4:1:2; 4:2:2:1, 2:2:1:1; 4:4:2:1; 2:2:1:2; 4:4:1:2; y 2:2:2:2:1. Las relaciones preferidas (p/p) para los sacáridos de los serogrupos (C:W135:Y son 1:1:1; 1:1:2; 1:1:1; 2:1:1; 4:2:1; 2:1:2; 4:1:2; 2:2:1; y 2:1:1. Se prefiere el uso de una masa sustancialmente igual de cada sacárido. Las composiciones preferidas de la invención comprenden menos de 50 µg de sacárido meningococal por dosis. Otras composiciones preferidas comprenden <40 µg de sacárido meningococal por dosis. Otras composiciones preferidas comprenden <30 µg de sacárido meningococal por dosis. Otras composiciones preferidas comprenden <25 µg de sacárido meningococal por dosis. Otras composiciones preferidas comprenden <20 µg de sacárido meningococal por dosis. Otras composiciones preferidas comprenden <10 µg de sacárido meningococal por dosis pero, de forma ideal, las composiciones de la invención comprenden al menos 10 µg de sacárido meningococal total por dosis. Las composiciones de la invención pueden incluir un antimicrobiano, particularmente cuando se basan en un formato 5 de múltiples dosis. Las composiciones de la invención pueden comprender detergente, por ejemplo, un Tween (polisorbato), tal como Tween 80. En general los detergentes están presentes a bajos niveles por ejemplo <0.01 %. Las composiciones de la invención pueden incluir sales de sodio (por ejemplo, cloruro de sodio), para dar tonicidad. Es típica una concentración de 10±2 mg/ml de NaCl. Las composiciones de la invención incluirán en general un amortiguador. Es típico un amortiguador de fosfato. Las composiciones de la invención se administrarán en general en unión con otros agentes inmunorreguladores . En particular, las composiciones incluirán usualmente uno o más adyuvantes. Estos adyuvantes incluyen, de manera enunciativa y sin limitación: A. Composiciones que Contienen Minerales Las composiciones que contienen minerales adecuadas para el uso como adyuvantes de la invención incluyen sales minerales, tal como sales de aluminio y sales de calcio. La invención incluye sales minerales tal como hidróxidos (por ejemplo, oxihidróxidos) , fosfatos (por ejemplo hidroxifosfatos, ortofosfatos) , sulfatos, etc. [por ejemplo, ver capítulos 8 y 9 de la referencia 142] , o mezclas de diferentes compuestos minerales, con los compuestos que toman cualquier forma adecuada (por ejemplo, gel, cristalina, amorfa, etc.), y con adsorción que es lo preferido. Las composiciones que contienen minerales también se pueden formular como una partícula de sal metálica [143] . B. Emulsiones de Aceite Las composiciones de emulsión de aceite adecuados para el uso como adyuvantes de la invención incluyen emulsiones de escualeno-agua tal como MF59 [Capítulo 10 de referencia 142; ver también referencia 144] (5 % de Escualeno, 0.5 % de Tween 80, y 0.5 % de Span 85, formulado en partículas de sub-micras usando un microfluidizador) , También se pueden usar el adyuvante completo de Freund (CFA) y el adyuvante incompleto de Freund (IFA) . C. Formulaciones de Saponina [capítulo 22 de referencia 142] También se pueden usar formulaciones de saponina como adyuvantes e la invención. Las saponinas son un grupo heterólogo de esterol-glicósidos y triterpenoide-glicósidos que se encuentran en corteza, hojas, tallos, raíces y aun flores de cualquier variedad de especie de planta. La saponina de la corteza del árbol Molina Quillaia saponaria se ha estudiado ampliamente como adyuvante. La saponina también se ha puede obtener de forma comercial de Smilax ornata (sarsaprilla) , Gypsophilla paniculata (velo de novia) , y Saponaria officianallis (raíz de jabón) . Las formulaciones de adyuvante de saponina incluyen formulaciones purificadas, tal como QS21, así como formulaciones lipídicas, tal como ISCOM.

El QS21 se comercializa como Stimulon"11. Las composiciones de saponina se han purificado usando HPLC y RP-HPLC. Se han identificado fracciones purificadas específicas usando estas técnicas, que incluyen QS7, QS17, QS18, QS21, QH-A, QH-B y QH-C. De manera preferente, la saponina es QS21. Un método de producción de QS21 se describe en la referencia 145. Las formulaciones de saponina también pueden incluir un esterol, tal como colesterol [146] . Las combinaciones de saponinas y colesteroles se pueden usar para formar partículas únicas llamadas complejos inmunoestimuladores (ISCOM) [capítulo 23 de referencia 142] . Los ISCOM también incluyen típicamente de fosfolípido tal como fosfatidiletanolamina o fosfatidilcolina. Se puede usar cualquier saponina conocida en ISCOM. De manera preferente, el ISCOM incluye uno o más de QuilA, QHA y QHC. Los ISCOM se describen adicionalmente en las referencias 146-148. Opcionalmente, los ISCOM pueden estar desprovistos de detergente adicional [149] . En la referencia 150 y 151 se puede encontrar una revisión del desarrollo de adyuvantes basados en saponina. D. Virosomas y partículas tipo virus También se pueden usar virosomas y partículas tipo virus (VLP) como adyuvantes en la invención. Estas estructuras contienen en general una o más proteínas de un virus opcionalmente combinado o formulado con un fosfolípido. En general no son patógenas, no son replicantes y en general no contienen nada del genoma viral nativo. Las proteínas virales se pueden producir de forma recombinante o aislar de virus completos . Estas proteínas virales adecuadas para el uso en virosomas y VLP incluyen proteínas derivadas del virus de influenza (tal como HA ó NA) . Virus de hepatitis B (tal como proteínas de núcleo o cápside) , virus de hepatitis E, virus de Sarampión, virus de Sindbis, Rotavirus, virus de Enfermedad de Pies y Boca, Retrovirus, virus de ?orwalk, virus de Papiloma humano, VIH, ARN-fagos , Qß-fago (tal como proteínas de cubierta) , GA-fago, fr-fago, AP205-fago, y Ty (tal como proteína pol de Ty de retrotransposón) . Los VLP se analizan adicionalmente en las referencias 152-157. Los virosomas se analizan adicionalmente por ejemplo en la referencia 158. E. Derivados bacterianos o microbianos Los adyuvantes adecuados para el uso en la invención incluyen derivados bacterianos o microbianos tal como derivados no tóxicos de lipopolisacárido enterobacteriano (LPS) , derivados de Lípido A, oligonucleótidos inmunoestimuladores y toxinas de ADP-ribosilación y derivados destosificados de los mismos. Los derivados no tóxicos de LPS incluyen monofosforil-lípido A (MPL) y MPL-3-0 desacilado (3dMPL) . El 3dMPL es una mezcla de monofosforil-lípido A 3-des-0-acilado con 4, 5 ó 6 cadenas aciladas. Una forma "de partícula pequeña" preferida de monofosforil-lípido A 3-Des-O-acilado se describe en la referencia 159. Estas "partículas pequeñas" de 3dMPL son suficientemente pequeñas para ser filtradas de manera estéril a través de una membrana de 0.22 µm [159] . Otros derivados de LPS no tóxicos incluyen imitadores de monofosforil-lípido A, tal como derivados de fosfato de aminoalquil-glucosaminida, por ejemplo, RC-529 [160, 161] . Los derivados de lípido A incluyen derivados de lípido A de Escherichia coli tal como OM-174. El OM-174 se describe por ejemplo en las referencias 162 y 163. Los oligonucleótidos inmunoestimuladores adecuados para el uso como adyuvantes en la invención incluyen secuencias de nucleótidos que contienen una porción CpG (una secuencia de di-nucleótidos que contiene una citosina no metilada enlazada por un enlace de fosfato a una guanosina) . Los ARN de doble hebra y los oligonucleótidos que contienen secuencias palindrómicas o de poli (dG) también se ha mostrado que son inmunoestimuladores. Los CpG pueden incluir modificaciones/análogos de nucleótidos tal como modificaciones de fosforotioato y pueden ser de doble hebra y de hebra individual . Las referencias 164, 165 y 166 describen posibles substituciones análogas por ejemplo, reemplazo de guanosina con 2'-dosexi-7-desazaguanosina. El efecto adyuvante de los oligonucleótidos de CpG se analiza adicionalmente en la referencia 167-172. La secuencia de CpG se puede dirigir a TLR9, tal como la porción GTCGTT Ó TTCGTT [173] . La secuencia de CpG puede ser específica para inducir una respuesta inmunitaria de Thl, tal como un CpG-A ODN, o puede ser más específica para inducir una respuesta de células B, tal como CpG-B ODN. Los CpG-A y CpG-B ODN se analizan en la referencia 174-176. De manera preferente, el CpG es un CpG-A ODN . De manera preferente, el oligonucleótido de CpG se construye de modo que el extremo 5' es accesible para el reconocimiento del receptor. Opcionalmente, dos secuencias de oligonucleótidos de CpG se pueden unir en sus extremos 3' para formar "inmunómeros" , Ver, por ejemplo, referencias 173 y 177-179. Las toxinas ADP-ribosilantes bacterianas y derivados destoxificados de las mismas se pueden usar como adyuvantes en la invención. De manera preferente, la proteína se deriva de E. coli (enterotoxina térmicamente lábil "LT" de E. coli) , cólera ("CT"), tosferina ("PT"). El uso de toxinas ADP-ribosilantes destosificadas como adyuvantes mucosales se describe en la referencia 180 y como adyuvantes parenterales en la referencia 181. La toxina toxoide está de manera preferente en la forma de una holotoxina, que comprende ambas subunidades A y B. De manera preferente, la sub-unidad A contiene una mutación de destoxificación; de manera preferente la subunidad no está mutada. De manera preferente, el adyuvante es un mutante LT destoxificado tal como LT-K72 y LT-G192. El uso de las toxinas ADP ribosilantes y derivados destoxificados de las mismas, de manera particular LT-K63 y LT-R72 como adyuvantes, se pueden encontrar en la referencia 182-189. La referencia numérica para sustituciones de aminoácido se basa de manera preferente en las alineaciones de las sub-unidades de A y B de las toxinas ADP-ribosilantes expuestas en la referencia 190, específicamente incorporada en la presente como referencia en su totalidad. F. Inmunomoduladores humanos Los inmunomoduladores humanos adecuados para el uso como adyuvantes en la invención incluyen citocinas, tal como interleucinas (por ejemplo IL-1, IL-2, LI-4, LI-5, IL-6, IL7, IL-12 [191], etc) [192], Interferones (por ejemplo, interferon-?) , factor de estimulación de colonia de macrófagos, y factor de necrosis tumoral. G. Bioadhesivos y Mucoadhesivos También se pueden usar bioadhesivos y mucoadhesivos como adyuvantes en la invención. Los bioadhesivos adecuados incluyen microesferas esterificadas de ácido hialurónico [193] o mucoadhesivos tal como derivados reticulados de poli (ácido acrílico), alcohol polivinílico, polivinil-pirrolidona, polisacáridos y carboximetilcelulosa. También se pueden usar quitosan y derivados del mismo como adyuvantes en la invención [194] . H. Micropartículas También se pueden usar micropartículas como adyuvantes en la invención. Se prefieren micropartículas (es decir, una partícula de aproximadamente 100 nm y aproximadamente 150 µm de diámetro, de manera preferente aproximadamente 200 nm a aprox. 30 µm de diámetro, y de manera más preferente aproximadamente 500 nm a aprox 10 µm de diámetro) formadas del diámetro que son biodegradables y no tóxicos (por ejemplo, un poli (ácido OÍ-hidroxi) , un ácido polihidroxibutírico, un poliortoéster, un polianhídrido, una policaprolactona, etc.), con poli (láctido-co-glicólido) , opcionalmente tratadas para tener una superficie negativamente cargada (por ejemplo con SDS) o una superficie positivamente cargada (por ejemplo con un detergente catiónico, tal como CTAB) . I. Liposomas (Capítulos 13 y 14 de referencia 142) Los ejemplos de formulaciones de liposomas adecuadas para el uso como adyuvantes se describen en las referencias 195-197. J. Formulaciones de polioxietile-éter y polioxietilen-éster Los adyuvantes adecuados para el uso en la invención incluyen polioxietilen-éteres y polioxietilen-esteres [198] . Estas formulaciones incluyen además agentes tensioactivos de polioxietilen-sorbitan-éster en combinación con un octoxinol [199] así como agentes tensioactivos de polioxietilen-alquil-éteres o esteres en combinación con al menos un agente tensioactivo no iónico adicional tal como oxtoxinol [200] . Los polioxietilenéteres preferido se seleccionan del siguiente grupo: polioxietilen-9-lauril-éter (laureth 9), polioxietilen-9-esteoril-éter, polioxietilen-8-esteoril-éter, polioxetilen-4-lauril-éter, polioxietilen-35-lauril-éter y polioxietilen-23-lauril-éter . K. Polifosfaceno (PCPP) Se describen formulaciones de PCPP, por ejemplo, las referencias 201 y 202. L. Muramil-péptidos. Los ejemplos de muramil-péptidos adecuados para el uso como adyuvantes en la invención incluyen N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP) , N-acetil -normuramil-L-anil-D-isoglutamina (no-MDP) , y ?-acetilmuranil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2- (1' -2 ' -dipalmiitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi) -etilamina MTP-PE) .

M. Compuestos de Imidazoquinolona Los ejemplos de compuestos de imidazoquinolona adecuados para el uso como adyuvantes en la invención incluyen Imiquamod y sus homólogos (por ejemplo "Resiquimod 3M") , descrito adicionalmente en las referencias 203 y 204. La invención también puede comprender combinaciones de aspectos de uno o más de los adyuvantes identificados anteriormente. Por ejemplo, se pueden usar las siguientes composiciones de adyuvante en la invención: (1) una saponina y una emulsión de aceite en agua [205] : (2) una saponina (por ejemplo, [205] ; (2) un saponina (por ejemplo QS2l{l2) + un derivado de LPS no tóxico (por ejemplo MPL

[206] ; (3) una saponina (por ejemplo QS21) + un derivado de LPS no tóxico (por ejemplo, 3dMPL) + un colesterol (4) una saponina (por ejemplo, QS21) + 3dMPL + IL-12 (opcionalmente + un esterol) [207] ; (5) combinaciones de 3dMDP con, por ejemplo, QS21 y/o emulsiones de aceite en agua [208] (6) SAF, que contiene 10 % de escualeno, 0.4 %de Tween 80^, 5 % de polímero de bloque plurónico L121, y thr-MDA, ya sea microfluidizados en una emulsión de sub-micras o sometidos a vórtice para generar una emulsión de mayor tamaño de partículas. (7) sistema de adyuvantes (Ribi Immunochem) (RAS), que contiene 2 % de escualeno, 0.2 % de Tween 80, y uno o más componentes de la pared de células bacterianas del grupo que consiste de monofosforil-lípido A (MLP) , dimicolato de trehalosa (TMT) , y estructura de pared celular (CWN) , de manera preferente MPL + CWS (Detox"11) ; y (8) una o más sales minerales (tal como una sal de aluminio) + un derivado no tóxico de LPS (tal como 3dMPL) .

En el capítulo 7 de la referencia 142 se describen otras sustancias que actúan como agentes inmunoestimuladores . El uso de adyuvantes de sales de aluminio es particularmente preferido, y los antígenos se adsorben en general a estas sales. Los conjugados Menjugatem y NeisVac"11 MenC usan un adyuvante de hidróxido, en tanto que Meningitec1^ usa un fosfato. Es posible en las composiciones de la invención adsorber algunos antígenos a un hidróxido de aluminio pero tener otros antígenos en asociación con un fosfato de aluminio. En general, sin embargo, se prefiere usar sólo una sal individual, por ejemplo, un hidróxido o un fosfato, pero no ambos. De manera preferente evita hidróxido de aluminio como un adyuvante, de manera particular si la composición incluye un antígeno de Hib. Las composiciones que 5 no contiene hidróxido de aluminio son preferidas de esta manera. Más bien, se pueden usar el fosfatos de aluminio, y un adyuvante típico es hidroxifosfato de aluminio amorfo con una relación molar de P04/Al, entre 0.84 y 0.92, incluido a 0.6 mg de Al3+/ml . La adsorción con una baja dosis de fosfato 0 aluminio, se puede usar, por ejemplo, entre 50 y 100 g de Al3+ por conjugado por dosis. Donde se usa un fosfato de aluminio y no se desea adsorber un antígeno al adyuvante, esto se favorece al incluir iones libres en fosfato en solución (por ejemplo por el uso de un amortiguador de fosfato) . -. No se necesitan absorber todos los conjugados, es decir, algunos o todos pueden estar libres en solución. El fosfato de calcio es otro adyuvante preferido.

Métodos de tratamiento La invención también proporciona un método para formular una respuesta de anticuerpos en un mamífero, que comprende administrar una composición farmacéutica de la invención al mamífero . La invención proporciona un método para formular una respuesta inmunitaria en un mamífero que comprende el paso de administrar una cantidad efectiva en una composición de la invención. La respuesta inmunitaria es de manera preferente protectora y comprende de manera preferente anticuerpos . El método puede formular una respuesta de refuerzo . El mamífero es de manera preferente un humano.

Donde la vacuna es para uso profiláctico, el humano es de manera preferente el humano es de manera preferente un niño (por ejemplo un niño que empieza a andar o un infante) o un adolescente; donde la vacuna es para uso terapéutico, el humano es de manera preferente un adulto. Una vacuna propuesta para niños también se puede administrar a adultos, por ejemplo, para valorar seguridad, dosis, inmunogenicidad, etc . La invención también proporciona una composición para la invención para el uso como un medicamento. El medicamento es capaz de manera preferente de formular una respuesta inmunitaria en un mamífero (es decir, es una composición inmunogénica) y de manera más preferente es una vacuna . La invención también proporciona el uso de (i) antígeno de sacárido capsular del serogrupo C conjugado; (ii) un antígeno de sacárido capsular del serogrupo W135 conjugado; (iii) un antígeno de sacárido capsular de serogrupo Y conjugado; (iv) uno o más antígenos de polipéptido del serogrupo B; y opcionalmente, (v) un antígeno de sacárido capsular del serogrupos A conjugado, en la elaboración de un medicamento para formular una respuesta inmunitaria en un mamífero. Estos usos y métodos son de manera preferente para la prevención y/o tratamiento de una enfermedad provocada por una Neisseria (por ejemplo, meningitis, septicemia, bacteremia, gonorrea, etc.). La prevención y/o tratamiento de meningitis bacteria y/o meningococal se prefiere. Una manera de verificar la eficiencia del tratamiento terapéutico comprende monitorizar la infección Neisserial después de la administración de la composición de la invención. Una manera de verificar la eficiencia del tratamiento profiláctico comprende monitorizar las respuestas inmunitarias contra los cinco antígenos básicos después de la administración de la composición. La inmunogenicidad de las composiciones de la invención se puede determinar al administrarlas a sujetos de prueba (por ejemplo niños de 12-16 mes de edad, o modelos en animales [209)] y entonces determinar los parámetros normales que incluyen anticuerpos bactericidas en suero (SBA) y títulos de ELISA (GMT) de la IgG total y anti-cápsula de alta avidez. Estas respuestas inmunitarias se determinarán en general alrededor de las cuatro semanas después de la administración de la composición, y se compararán valores determinados antes de la administración de la composición. Se prefiere un incremento de SBA de al menos 4 veces a 8 veces . Donde se administre más de una dosis de la composición, se puede hacer más de una determinación post-administración. Las composiciones preferidas de la invención pueden conferir un título de anticuerpos en un paciente que es superior a los criterios para sero-protección para cada componente antigénico para un porcentaje aceptable de sujetos humanos. Los antígenos con un título asociado de anticuerpos por arriba del cual un hospedador se considera que está seroconvertido contra el antígeno son bien conocidos, y estos títulos se publican por organizaciones tal como WHO. De manera preferente, más de 80 % de una muestra estadísticamente significativa de sujeto se seroconvierte, de manera más preferente más de 90 %, de manera más preferente más de 93 % y de manera más preferente 96-100 %.

Las composiciones de la invención se administraron en genera en forma directa a un paciente. La distribución directa se puede lograr por inyección parenteral (por ejemplo, subcutánea, intraperitoneal, intravenosa, intramuscular, o al espacio instersticial de un tejido), o por administración rectal, oral, vaginal, tópica, transdérmica, intranasal, ocular, oral, pulmonar u otra mucosal. La administración intramuscular al muslo o el brazo superior se prefiere. La inyección puede ser vía una aguja (por ejemplo una aguja hipodérmica) , pero se puede usar de manera alternativa inyección libre de aguja. Una dosis intramuscular típica es de 0.5 ml . La invención se puede usar para producir inmunidad sistémica y/o mucósica. El tratamiento de dosis puede ser un programa de dosis individual o un programa de múltiples dosis. Se pueden usar múltiples dosis en un programa de inmunización primaria y/o en un programa de inmunización de refuerzo. Un programa de dosis primaria se puede seguir por un programa de dosis de refuerzo. Se puede determinar por rutina la sincronización adecuada entre las dosis primarias (por ejemplo entre 4-16 semanas) y la cebadura y el refuerzo. Las infecciones Neisseriales afectan varias áreas del cuerpo y de esta modo las composiciones de la invención se pueden preparar de varias formas. Por ejemplo, las composiciones se pueden preparar como productos inyectables, ya sea como soluciones o suspensiones- líquidas. La composición se puede preparar para administración pulmonar, por ejemplo, como un inhalador, usando un polvo fino o un aspersor. La composición se puede preparar como un supositorio o un pesario. La composición se puede preparar para administración nasal, oral u ocular, por ejemplo como aspersión, gotas, gel o polvo [por ejemplo referencia 210 y 211] . Se ha reportado éxito con la administración nasal de sacáridos pneumococales [212, 213], polipéptidos pneumococales [214] , sacáridos de Hib [215] , sacáridos de MenC [216] , y mezclas de conjugados de sacáridos de Hib y MenC [217] . Estabilidad en almacenamiento Las composiciones de la invención ofrecen estabilidad mejorada, particularmente para el componente de sacárido de serogrupo A. La invención proporciona un proceso para preparar una composición de vacuna, que comprende los pasos de: (1) mezclar un antígeno de sacárido capsular del serogrupo C conjugado, (ii) un antígeno de sacárido capsular del serogrupo W135 conjugado, (iii) un antígeno de sacárido capsular del serogrupo Y conjugado, y (iv) uno o más antígenos de polipéptido del serogrupo B; (2) almacenar la composición que resulta del paso (1) durante al menos 1 semana; (3) preparar una jeringa que contiene una composición almacenada del paso (2) , lista para inyección a un paciente; y opcionalmente (4) inyectar la composición en el paciente. El paso (1) también puede comprender mezclar (v) un antígeno de sacárido capsular del serogrupo A conjugado.

Puede comprender también mezclar (vi) un antígeno de Hib conjugado. También puede comprender mezclar (vii) un antígeno pneumococal. El paso (2) comprende de manera preferente al menos 2 semanas, 4 semanas, 6 semanas, 8 semanas, 10 semanas, 12 semanas o más de almacenamiento. El paso (2) de almacenamiento puede estar por abajo de temperatura ambiente o no (por ejemplo a 10+10°C) . La invención también proporciona un proceso para preparar una composición de vacuna, que comprende los pasos de: (1) mezclar (i) un antígeno de sacárido capsular de serogrupo C conjugado, (ii) un antígeno de sacárido capsular del serogrupo W135 conjugado, (iii) un antígeno de sacárido capsular del serogrupo Y conjugado, y (iv) uno o más antígenos de polipéptido del serogrupo B; y (2) extraer un volumen de dosis unitaria de los antígenos mezclados; y (c) envasar la dosis unitaria extraída en un recipiente herméticamente sellado. El paso (1) también puede comprender mezclar (v) un antígeno de sacárido capsular del serogrupo A conjugado. También puede comprender mezclar (vi) un antígeno de Hib _.. conjugado. También puede proporcionar mezclar (vii) un antígeno pneumococal . El recipiente herméticamente sellado puede ser un frasco o una jeringa. La invención proporciona un recipiente herméticamente sellado, que contiene una composición de la invención. Generales El término "que comprende" significa "que incluye" así como "que consiste" por ejemplo una composición "que comprende" X puede consistir exclusivamente de X o puede incluir algo adicional por ejemplo X + Y. El término "aproximadamente" con relación a un valor x numérico significa, por ejemplo, x ± 10%. La palabra "sustancialmente" no excluye "completamente" por ejemplo una composición que está "sustancialmente libre" de Y puede estar completamente libre de Y. Donde es necesario, la palabra "sustancialmente" se puede omitir de la definición de la invención. Las referencias a un porcentaje de identidad de secuencia entre dos secuencias de aminoácidos significa que, cuando se alinean, ese porcentaje de aminoácidos es el mismo al comparar las dos secuencias. Esta alineación y el por ciento de homología o identidad de secuencia se pueden determinar usando programas informáticos conocidos en la técnica, por ejemplo aquellos descritos en la sección 7.7.18 de la referencia 218. Una alineación preferida. Una alineación preferida se determina por el algoritmo de búsqueda de homología de Smith-Waterman que usa una búsqueda de separación a fin con una penalidad de abertura de separación de 12 y una penalidad de extensión de separación de 2, matriz BLOSUM de 62. El algoritmo de búsqueda de homología de Smith-Waterman se enseña en la referencia 219. El término "alquilo" se refiere a grupos alquilo tanto en forma recta como ramificada. El grupo alquilo puede estar interrumpido con 1, 2 o 3 heteroátomos seleccionados a partir de -O-, -NH- o -S-. El grupo alquilo también puede estar interrumpido con 1, 2 o 3 dobles y/o triples enlaces. Sin embargo, el término "alquilo" usualmente se refiere a grupos alquilo que no tienen interrupciones de heteroátomos o interrupciones de dobles o triples enlaces . Cuando se hace referencia a C-?2alquilo, se quiere decir que el grupo alquilo puede contener cualquier número de átomos de carbono entre 1 y 12 (por ejemplo Ci, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9, Cío, Cu, L2) . De manera similar en donde se hace referencia a C?-6alquiilo, se quiere decir el grupo alquilo que puede contener cualguier número de átomos de carbono entre 1 y 6 (por ejemplo Cl t C2, C3, C4, C5, Ce) . El término "cicloalquilo" incluye grupos cicloalquilo, policicloalquilo y cicloalquenilo, así como combinaciones de éstos con grupos alquilo, tal como grupos cicloalquilalquilo. El grupo cicloalquilo puede estar interrumpido con 1, 2 o 3 heteroátomos seleccionados de -0-, -NH- o -S . Sin embargo, el término "cicloalquilo" usualmente se refiere a grupos cicloalquilo que no tienen interrupciones de heteroátomo. Los ejemplos de grupos cicloalquilo incluyen grupos ciclopentilo, ciciohexilo, ciclohexenilo, ciciohexilmetilo y adamantilo. Se hace referencia a C3_ ?2cicloalquilo, que quiere decir que el grupo cicloalquilo puede contener cualquier número de átomos de carbono entre 3 y 12 (por ejemplo C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9, C10, Cu, C?2) . El término "arilo" se refiere a un grupo aromático, tal como fenilo o naftilo. Donde se hace referencia a C5_ ?2arilo, se quiere decir que el grupo arilo puede contener cualquier número de átomos de carbono entre 5 y 12 (por ejemplo Cs, C6, C7, C8, C9, Cío, Cu, C?2) El término "C5-?2aril-C?-6alquilo se refiere a grupos tal como bencilo, feniletilo y naftilmetilo. Los grupos protectores de nitrógeno incluyen grupos sililo (tal como TMS, TES, TBS, TIPS) , derivados de acilo (tal como ftalimidas, trifluoroacetamidas, metoxicarbonilo, etoxicarbonilo, t-butoxicarbonilo (Boc), benciloxicarbonilo (Z o Cbz), 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc), 2- (trimetilsilil) etoxicarbonilo, 2,2,2-tricloroetoxicarbonilo (Troc)), derivados de sulfonilo (tal como ß-trimetilsililetanosulf onilo (SES) ) , derivados de sulfenilo, Cx_ i2alquilo, bencilo, benzhidrilo, tritilo, 9-f enilfluorenilo, etc. Un grupo protector de nitrógeno es Fmoc.

Las secuencias incluidas facilitan la clonación o purificación, por ejemplo, no contribuyen necesariamente a la invención y se pueden omitir o remover. Se apreciará que los anillos de azúcar pueden existir en la forma abierta y cerrada y que, en tanto que las formas abiertas se muestran en las fórmulas estructurales en la presente, también se abarcan por la invención las formas abiertas. Los polipéptidos de la invención se pueden preparar por varios medios (por ejemplo, expresión recombinante, purificación de cultivo celular, síntesis química (al menos en parte, etc.), y en varias formas (por ejemplo, nativo, fusiones, no glicosiladas, lipidadas, etc.). De manera preferente se preparan de forma sustancialmente pura (es decir, sustancialmente libres de otras proteínas de N. meningi tidis o células hospedadoras) . En tanto que la expresión del polipéptido puede tomar lugar en Neisseria, se prefiere un hospedador heterólogo. El hospedador heterólogo puede ser procariótico (por ejemplo, una bacteria) o eucariótico. De manera preferente es E. Coli , pero otros hospedadores adecuados incluyen Bacillus subtilis, Vibrio cholerae, Salmonella typha, Salmonella tryphimurium, Neisseria lactamica, Neisseria cinérea, Mycobacteria. (por ejemplo, . tujerculosis) , levadura, etc. El ácido nucleico de acuerdo con la invención se puede preparar de muchas maneras (por ejemplo, por síntesis química (al menos en parte) , a partir de bibliotecas genómicas o de ADNc, a partir del organismo mismo, etc.) y puede tomar varias formas (por ejemplo, hebra individual, doble hebra, vectores, sondas, etc.). De manera preferente se preparan en forma sustancialmente pura (es decir, sustancialmente libres de otros ácidos nucleicos de N. meningi tidis) o células hospedadoras. El término "ácido nucleico" incluye ADN y ARN, y también sus análogos, tal como aquellos que contienen estructuras modificadas (por ejemplo, fosforotioatos, etc.), y también ácidos nucleicos peptídicos (PNA) etc. La invención incluye ácido nucleico que comprende secuencias complementarias a aquellas descritas anteriormente (por ejemplo, para propósitos de sondeo o anti-sentido) . Después del serogrupo, la clasificación meningococal incluye serotipo, serosubtipo y entonces inmunotipo, y la nomenclatura normal lista serogrupo, serotipo, serosubtipo e inmunotipo, cada uno separado por un colon, por ejemplo, B:4 :P1.15 :L3 , 7, 9. Dentro del serogrupo B, algunos linajes provocan enfermedad frecuentemente (hiperinvasivos) , algunos linajes provocan formas más severas de la enfermedad que otros (hipervirulentos) , y otros raramente provocan enfermedad en lo absoluto. Se reconocen siete linajes hipervirulentos, específicamente los subgrupos I, III y IV-1, complejo ET-5, complejo ET-37, agrupación A4 y linaje 3. Estos se han definido por electroforesis en la _.. enzima de multisitio (MLEE) , pero también se ha usado tipificación de secuencia de multisitio (MLST) para clasificar los meningococos [referencia 104] . Modos para Llevar a Cabo la Invención Proteína híbrida ?G287-953 5 Se digirieron y ligaron la proteína 287 de codificación de ADN de la cepa 394/98 del serogrupo B meningococal y la proteína 953 de la cepa 2996 del serogrupo B meningococal , conjuntamente con una secuencia ligadora corta, para dar un plásmido que codifica para la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO 7 . El plásmido se transf ectó en E. coli y las bacterias se cultivaron para expresar la proteína. Después del crecimiento adecuado, las bacterias se recolectaron y la proteína se purificó. Del cultivo, las bacterias se centrifugaron y el sedimento se homogenizó en la presencia de amortiguador de acetato 50 pM (pH 5) con una relación volumétrica de sedimento: amortiguador de 1 : 8. Se realizó la lisis usando un homogenizador de alta presión (AVESTIN, 4 ciclos a 14000 lb/pulg2) . Después de la lisis, se adicionó urea a una concentración final de 5 M, seguido por agitación durante 1 hora a temperatura ambiente . El pH se reduj o de 6 a 5 usando amortiguador de acetato 200 mM (pH 4) + urea 5 M.

La mezcla se centrifugó a 16800 g durante 60 minutos a 2 - 8 °C .

El sobrenadante se recolectó y se filtró por SARTOBRAN P ( 0 .45- 0 .22 µm SARTORIUS) . La proteína en el sobrenadante filtrado fue estable durante al menos 30 días a -20 °C y Z bl- durante al menos 15 días a 2 -8 °C .

La proteína se purificó adicionalmente en una columna de intercambio catiónico (PSF, Amersham Biosciences) con elusión usando NaCl 350 mM + acetato 50 mM + urea 5 M, pH 5 . 00 . La mayoría de las impurezas estuvieron presentes en el fluj o . Un lavado de pre-elución usando una baj a concentración de NaCl (180 mM) eliminó de forma ventaj osa dos proteínas contaminantes de E. coli . El material eluido se aj ustó a pH 8 usando TRIS 200 mM/CHl + urea 5 M, pH 9) y se purificó adicionalmente en una columna Q Sepharose HP (Amersham) con elusión usando ?aCl 150 mM + TRIS 20 mM/CHl, pH 8.00 en urea 5 M. Nuevamente, fue útil para eliminar impurezas un lavado de pre-elusión con sal reducida (90 mM) . El material eluido filtrado de la columna Q HP se diluyó 1 :2 usando PBS pH 7.00 (?aCl 150 M + fosfato de potasio 10 rrM, pH 7.00) y entonces se dialfil tro contra 10 volúmenes de PBS, pH 7.00 por ultra filtración tangencial . Al final de la dialf iltración, el material se concentró 1.6 veces a aproximadamente 1.2 mg/ml de proteínas totales . Usando una membrana de corte de 30 , 000 Da (Membrana de Celulosa Regenerada 50 cm2 , Millipore PLCTK 30) 0 fue posible dializar el material con un rendimiento de aproximadamente 90% . Proteína híbrida 936- ? G741 Se digirieron y ligaron proteína 936 de codificación de ADN de la cepa 2996 del serogrupo B -. meningococal y la proteína 741 de la cepa MC58 del serogrupo B meningococal , conjuntamente con una secuencia ligadora corta, para dar un plásmido que codifica para la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO 8 . El plásmido se transf ect ó en E. coli y las bacterias se cultivaron para expresar la proteína . La proteína recombinante no se segregó , sino permaneció soluble dentro de la bacteria . Después del crecimiento adecuado, las bacterias se centrifugaron para dar una pasta húmeda y se trataron como sigue: - Hsmogeneización por sistema de alta presión en la presencia de fosfato de sodio 20 rrM, pH 7.00. - Centrifugación y clarificación por filtración ortogonal . - Cromatografía en columna catiónica (Flujo Rápido SP Sepharose) , con elución por NaCl 150 rrM en fosfato de sodio 20 rrM, pH 7.00. - Cromatografía en columna aniónica (Q Sepharose XL) con recolección de flujo de paso. - Cromatografía en columna hidrófoba (Fenil -Sepharose 6 Flujo Rápido, Alto Sub) con elusión por fosfato de sodio 20 rrM, pH 7.00. 0 - Diafiltración contra PBS pH 7.4 con un corte de 10 Kd. - Filtración estéril final y almacenamiento a -20°C. La proteína en el material final fue estable durante al menos 3 meses tanto a -20 °C como a 2 -8 °C . Proteína NadA(?L) ( ) -. La proteína ?adA que codifica para ADN de la cepa 2996 del serogrupo B meningococal se digirió para remover la secuencia que codifica para su C-término, para dar un plásmido que codifica para la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO 1. El plásmido se transfectó en E. coli y las bacterias se cultivaron para expresar la proteína. La proteína recombinante se segregó en el medio de cultivo, y el péptido guía estuvo ausente en la proteína segregada (SEQ ID ?O 2) . El sobrenadante se trató como sigue : Concentración 7X y diafiltración contra amortiguador TRIS 20 mM/HCl pH 7.6 por UF de flujo cruzado (Corte de 30 Kd) . - Cromatografía en columna aniónica (Q Sepharose XL) , con elución por ?aCl 400 mM en TRIS 20 mM/HCl pH 7.6. Paso de cromatografía en columna hidrófoba (Fenil-Sepharose 6, Flujo Rápido, Alto Sub) , con elución cor ?aCl 50 mM en TRIS/HC1 pH 7.6. Cromatografía en columna cerámica de hidroxilapatita (HA Macro. Prep) con elución por fosfato de sodio 200 mM, pH 7.4. - Diafiltración (corte 30 Kd) contra PBS pH 7.4. - Filtración estéril final y almacenamiento a -20°C. La proteína en el material final fue estable durante al menos 6 meses tanto a -20 °C como a 2-8°C. La proteína NadA es susceptible a degradación, y se pueden detectar formas truncadas de NadA por- transferencia western o por espectrometría de masas (por ejemplo por MALDI-TOF) que indica una pérdida de peso molecular de hasta 10 kDa. Los productos de degradación se pueden separar de la NadA nativa por filtración en gel (usando columna TSK 300SWXL, precolumna TSKSWXL, TOSOHAAS) . Esta filtración da tres picos: (i) un primer pico con tiempo de retención de 12.637 minutos y peso molecular aparente de 885.036 Da; (ii) tiempo de retención 13.871 minutos y peso molecular aparente de 530.388 Da; (iii) tiempo de retención 13.871 min y peso molecular aparente de 530.388 Da. El análisis de dispersión de luz de los tres picos reveló valores reales de PM (peso molecular) de (i) 208500 Da, (ii) 98460 Da, (iii) 78760 Da. De esta manera, el primer pico contiene agregados de NadA, y el tercer pico contiene productos de degradación. Puesto que el peso molecular previsto de ?adA(?L) (c) es de 34.113 Da, el pico (ii) contiene una proteína trimérica, que es el antígeno deseado. Combinaciones antigénicas Se inmunizaron ratones con una composición que comprende las tres proteínas y para propósitos de comparación, las tres proteínas también se probaron de forma individual. Se usaron diez ratones por grupo. La mezcla fue capaz de inducir altos títulos bacterianos contra varias cepas: "-" Indica que esta cepa no contiene el gen de NadA. Mirando los ratones individuales, la triple mezcla indujo títulos bactericidas altos y consistentes contra las tres cepas del serogrupo B de las cuales se derivaron los antígenos individuales : Combinación y comparación con OMV En experimentos adicionales, los antígenos (20 µg de cada antígeno por dosis) se administraron en combinación con 10 µg de OMV preparados ya sea de la cepa H44/76 (Noruega) o la cepa 394/98 (Nueva Zelanda) . Los controles positivos fueron el mAb anti-SEAM-3 capsular para el serogrupo B o sacáridos capsulares conjugados a CRM197 para otras cepas. La mezcla casi siempre da mejores títulos de los OMV simples y la adición de la mezcla de los OMV casi siempre mejoró de forma significativa la eficiencia de los OMV. En muchos casos, la mezcla de antígenos correspondió o excedió la respuesta vista con el control positivo.

Pruebas de linaje hipervirulento Los siguientes antígenos se probaron contra una variedad de cepas del serogrupo B de una variedad de linajes hipervirulentos . (a) NadA(NL) (c) (b) ?G287-953 (c) 936-?G741 (d) una mezcla de (a) , (b) y (c) (e) OMV preparados de la cepa H44/76 (Noruega) (f) OMV preparados de la cepa 394/98 (Nueva Zelanda) (g) una mezcla de ?G287 y (e) (h) una mezcla de (d) y (e) (i) una mezcla de (d) y (f) Se usó SEAM-3 como un control positivo. Los resultados fueron como sigue, expresados como el porcentaje de cepas en el linaje hipervirulento indicado en donde el título bactericida sérico excedió 1024: Contra cepas de referencia particulares, los títulos bactericidas fueron como sigue: Las composiciones (d) , (h) e (i) inducen por lo tanto respuestas de anticuerpos bactericidas contra una amplia variedad de cepas de meningococos del serogrupo B desde dentro de los linajes A4 hipervirulentos, ET-5 y linaje 3. Los títulos usando las composiciones (h) e (i) fueron en general mayores que con (d) , pero la cobertura de las cepas dentro de los linajes A4 , ET-5 hipervirulentos y linaje 3 no fueron mejores. La cobertura de las cepas no tipificadas también fue alta con las composiciones (d) , (h) e (i) . Combinación con conjugados de Hib y/o meningococales La triple composición de MenB se combina con una mezcla de conjugados de oligosacáridos para los serogrupos C, W135 y Y, para dar una vacuna que contiene los siguientes Se prepara una vacuna similar, que incluye el conjugado de MenA (10 µg de sacárido + 12.5-33 µg de CRMu-?) y/o un conjugado de Hib de HbOC (10 µg de sacárido + 2-5 µg de CRMig?) . En una serie de pruebas, se combinaron los conjugados de los serogrupos de los conjugados C, W135 e Y, con cada conjugado presente a 40 µg/ml (medido como sacárido) . Para almacenamiento antes del uso con antígenos de MenB, los conjugados combinados se liofilizaron [-45 °C durante 3 horas , -35 °C durante 20 horas a un vacío de 50mTorr, 30°C durante 10 horas a 50mTorr, 30 °C durante 9 horas a 125mTorr] en la presencia de 15 mg de sacarosa amortiguador de fosfato 10 mM (pH 7 .2 ) . El volumen final antes de la liofilización fue 0 .3 ml . Después de la resuspensión en solución acuosa de 0 . 6 ml , por lo tanto, los sacáridos se presentan a 12 µg por serogrupo. Se usó liofilización para conveniencia únicamente, y ni la eficiencia ni la estabilidad durante el almacenamiento normal del producto final requieren liofilización. Se preparó un segundo lote de material de la misma manera, pero incluyendo también el conjugado del serogrupo A a la misma dosis de sacárido como para los serogrupos C, W135 y Y. Se preparó un tercer lote de material de la misma manera (serogrupos A, C, W135 y Y) , pero que incluye también un conjugado de Hib-CRMX97 a la misma dosis de sacárido como para los meningococos . Por comparación, se prepararon preparaciones liofilizadas de los conjugados del serogrupo A y C. El material MenA se liofilizó con 15 mg de sacarosa para dar una dosis de 12 µg de sacárido después de la reconstitución, como se describe anteriormente. El material MenC se liofilizó con 9 mg de mannitol para dar una dosis de 12 µg de sacárido después de la reconstitución. Estos materiales se combinaron con 600 µl de la mezcla (d) de serogrupos (o como un control, es decir, grupos 2 y 3, en una composición idéntica pero que carece de los antígenos), para dar ocho composiciones: *Cantidad mostrada es sacárido Estas composiciones se administraron de manera intraperitoneal en un volumen de 200 µl a ratones CD/1 (8 por grupo) en los días 0, 21 y 35, con un sangrado final en el día 49. Los sueros del día 49 se probaron en ensayos de SBA contra una variedad de sepas meningococales en los serogrupos A, B, C, W135 e Y. Los resultados fueron B A C W135 Y Grupo 2996 W1G58 394/9844/76 F6124 C11 312294 C4678 M1569 LPN17592 860800 1 1024 4096 1024 8192 2048 2048 <16* 64* 128* 512 65536 2 <4 <4 128 <16 4096 8192 — — — 32 32768 3 <4 <4 <4 <16 4096 16384 — — — 512 32768 4 64 4096 512 8192 8192 128 — — — 256 32768 256 4096 1024 8192 256 8192 >8192 >8192 >8192 512 32768 6 128 1024 256 8192 128 8192 8192 >8192 >8192 512 16384 7 256 512 512 16384 1024 8192 4096 >8192 >8192 1024 16384 8 256 2048 512 8192 1024 8192 2048 >8192- >8192 512 32768 De esta manera, los antígenos de proteína meningococal permanecen efectivos aún después de la adición de los antígenos de sacárido de Hib y meningococales conjugados. De manera similar, los conjugados meningococales retienen eficiencia aún después de la adición de los antígenos de proteína. En realidad, los datos sugieren que la adición de los antígenos de proteína a los conjugados mejora la eficiencia anti-Men W135 (comparar grupos 2 y 7) . Además, hay un nivel de reactividad cruzada, en particular para el serogrupo Y, puesto que los antígenos de proteína sólo dan un buen título anti-MenY [comparar referencia 220] , como lo hacen los grupos 4 y 5.

Los datos también indican que la adición de un conjugado de Hib a conjugados meningococales (comparar grupos 2 y 3) mejora la actividad anti-W135. Uso de monosacárido MenA modificado Se purificó el polisacárido capsular de MenA y se hidrolizó para dar el oligosacárido de MenA. El polisacárido (2 g) se hidrolizó a 50 °C en amortiguador de acetato de sodio 50 mM, pH 4.75, a una concentración de polisacárido de 10 mg/ml durante aproximadamente 4 horas [73] .- Después de la hidrólisis, la solución se secó por evaporación giratoria. El oligosacárido se activó usando el siguiente esquema de reacción: O Sacc—O—C—NR1!?2 El oligosacárido se disolvió en DMSO para dar una concentración de sacárido de 10 mg/ml. De acuerdo a una relación molar de oligosacárido: CDI que es de 1:20, entonces se adicionan 21.262 g de CDI y la mezcla de reacción se agitó durante 16 horas a temperatura ambiente. El compuesto de MenA-CDI resultante se purificó por precipitación selectiva en una mezcla de acetona :DMSO 80 : 20 (v/v) seguido por centrifugación . La eficiencia de la reacción de activación se calculó que es de 67 . 9 % al determinar la relación de imidazol libre a imidazol unido . En el segundo paso de reacción, se solubilizó el oligosacárido de MenA-CDI en DMSO a una concentración de sacárido de aproximadamente 10 mg/mL . De acuerdo a una relación molar de unidad MenA-CDI :DMA que desde 1:100 se adicionaron 36.288 g de clorhidrato de dimetilamina al 99 % (es decir, R1 y R2 = Me) y la mezcla de reacción se agitó durante 16 horas a terrperatura ambiente. El producto de reacción se liofilizó y se re-solubilizó en 10 mg/rriL de solución de agua. Para remover el reactivo de reacción de bajo peso molecular (en particular la dimetilamina (DMA) ) de la preparación de oligosacárido, se realizó un paso de diálisis a través de una membrana MWCO de 3.5 kDa (Spectra/Por1*1) . Se llevaron a cabo cuatro pasos de diálisis : (i) 16 horas contra 2 L de cloruro de sodio 1 M (factor de diálisis 1 :20) (ii) 16 horas contra 2 L de cloruro de sodio 0.5 M (factor de diálisis 1 :20) , (iii) y (iv) 16 horas contra 2 L de WFI 0 (factor de diálisis 1 :20) . Para mejorar la purificación también se realizó un paso de diafiltración a través de una membrana MWCO de KDa . (CentriconMR) El producto MenA- CDI -DMA, purificado se amortiguó a pH 6 . 5 en L-histidina 25 mM (Fluka"11) . _. Para preparar conjugados del monosacárido de MenA Modificado (MenA-CDl-DMA) , el proceso completo fue como sigue : hHidrólisis del polisacárido para dar fragmentos de oligosacárido-5 - dimensionamiento de los fragmentos de oligosacárido . aminación reductiva de grupos aldehidos terminales en los oligosacáridos dimensionados; protección de grupos -NH2 terminales por el 10 grupo Fmoc antes de la reacción con CDI - desprotección intrínseca de grupos NH2 durante la reacción de DMA; activación de grupos -NH2 terminales por SIDEA (ácido N-hidroxisuccinimia-adípico) . 15 Unión covalente a la proteína SR. El conjugado de oligosacárido de MenA modificado fue mucho más resistente a hidrólisis que su contraparte natural a temperaturas elevadas. Después de 28 días a 37°C, por ejemplo, ejemplo, el porcentaje de sacárido liberado es 20 6.4 % para el oligosacárido codificado modificado Versus 23.5 % del antígeno natural. Además, los títulos inducidos por los oligosacáridos modificados no son significativamente menores que aquellos obtenidos usando las estructuras de los azúcares nativos. El conjugado de MenA se combinó con los conjugados _.. de MenC, MenW135 y MenY como un sustituto para el conjugado 9 de oligosacárido no modificado. Esta mezcla es tetravalente y se mezcla con los tres polipéptidos de MenB para dar una vacuna efectiva contra los serogrupos A, B, C, W135 y Y de N. meningitidis en una dosis individual. Combinaciones pneumococcales Las tres proteínas de MenB combinadas se mezclaron con conjugados de sacáridos pneumococales para dar una concentración final de 2 µg/dosis de cada uno de los serotipos pneumococales (doble para el serotipo 6B) . La vacuna reconstituida contiene de esta manera los diferentes antígenos : Componente Cantidad por dosis de 0.5 ml Conjugado que se serotipo 14 2 µg de sacárido + 2.5 µg de P . neumococo . CRM?97 Conjugado de serotipo 18C de µg de sacárido + 2.5 µg P . neumococo CRM?97 Conjugado de serotipo 19F 2 µg de sacárido + 2.5 µg pneumococo CRM?97 conjugado de serotipo 23F de µg de sacárido + 2.5 µg pneumococo CRM197 Pneumococo conjugado de 6B de 4 µg de sacárido + 5 µg CRMX97 serotipo de pneumococo Se entenderá que la invención se ha descrito a manera de ejemplo únicamente y se pueden hacer modificaciones en tanto que se mantenga dentro del alcance y espíritu de la invención.

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Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la presente invención, es el que resulta claro a partir de la presente descripción de la invención.

Claims (11)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Composición inmunogénica acuosa que, después .de la administración a un sujeto, es capaz de inducir una respuesta inmunitaria que es bactericida contra los serotipos B, C, W135 y Y de N. meningi tidis, en donde la composición está caracterizada porque comprende: (i) un antígeno de ' sacárido capsular de serogrupo C conjugado; (ii) un antígeno de sacárido capsular de serogrupo W135 conjugado; (iii) un antígeno de sacárido capsular de serogrupo Y conjugado; (iv) uno o más antígenos de polipéptido de serogrupo B..
2. 2. Composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque además comprende: (v) un antígeno de sacárido capsular de serogrupo conjugado.
3. 3. Composición de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque el sacárido capsular de serogrupo A se modifica tal que al menos 20 % de sus unidades de onosacárido no tienen -OH en 0 ninguna de las posiciones 3 o 4,
4. 4. Composición de conformidad con la reivindicación 2 o la reivindicación 3 , caracterizada porque la composición se puede almacenar durante 28 días a 37°C y después de ese periodo, estarán sin conjugar menos de 20 % de _. la cantidad total inicial del sacárido de MenA conjugado.
5. 5. Composición de conformidad con cualquier reivindicación anterior, caracterizada porque los sacáridos conjugados son oligosacáridos.
6. 6. Composición de conformidad con cualquier reivindicación anterior, caracterizada porque los sacáridos se conjugan a una proteína portadora seleccionada de: toxoide de difteria, toxoide de tétano, proteína D de H. influenzae y CRMi9
7. 7. 7. Composición de conformidad con cualquier reivindicación anterior, caracterizada porque la composición comprende además de 1 a 10 antígenos de polipéptido de serogrupo B definido, y en donde la composición puede inducir una respuesta inmunitaria que es bactericida contra dos ó tres de los linajes hipervirulentos A4, ET-5 u linaje 3 de 5 serogrupo B de N. meningitidis .
8. 8. Composición de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque comprende uno o más de los siguientes 5 antígenos: (i) una proteína "NadA" en forma oligomérica.- (ii) una proteína "741"; (iii) una proteína 0 "936"; (iv) una proteína "953"; y (v) una proteína "287".
9. 9. Composición de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque comprende un primer polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID ?O:2, un segundo polipéptido que comprende la secuencia de a C- aminoácidos SEQ ID ?O:7; y un tercer polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO : 8.
10. 10. Composición de conformidad con cualquier reivindicación anterior, caracterizada porque además comprende un antígeno de sacárído que protege contra H. influenzae tipo B (Hib) .
11. 11. Composición de conformidad con cualquier reivindicación anterior, caracterizada porque además comprende un antígeno que protege contra Streptococcus pneumoniae . 1 . Composición de conformidad con cualquier reivindicación anterior, caracterizada porque comprende un adyuvante de fosfato de aluminio. 13. Composición de conformidad con cualquier reivindicación anterior, caracterizada porque está envasada 5 en un recipiente herméticamente sellado. 14. Composición de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque el recipiente es un frasco o una jeringa. 15. Composición de conformidad con cualquier 0 reivindicación anterior, caracterizada porque es para el uso como un medicamento. 16. Uso de (i) un antígeno de sacárido capsular de serogrupo C conjugado; (ii) un antígeno de sacárido capsular de serogrupo W135 conjugado; (iii) un antígeno de sacárido _. capsular de serogrupo Y conjugado; (iv) uno o más antígenos polipeptídicos del serogrupo B; y opcionalmente , (v) un antígeno de sacárido capsular de serogrupo A conjugado , en la elaboración de un medicamento para formular una respuesta inmunitaria en un mamífero . 17 . Método para formular una respuesta de anticuerpos en un mamífero, caracterizado porque comprende administrar una composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 al mamífero . 18 . Composición inmunogénica acuosa que, después de la ao'ministración a un sujeto, es capaz de inducir una respuesta inmunitaria que es (a) bactericida contra al menos el serogrupo W135 de N. meningitidis y (b) protectora contra la enfermedad H. influenzae tipo b, en donde la composición está caracterizada porque corrprende: (i) un antígeno de sacárido capsular de serogrupo W135 conjugado; (ii) un antígeno de sacárido capsular de H. influenzae tipo b conjugado. 19. Composición de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada porque además comprende antígenos de sacáridos capsulares conjugados de los serogrupos C y Y y opcionalmente A. 20 . Composición de conformidad con la reivindicación 18 ó la reivindicación 19 , caracterizada porque además comprende uno o más antígenos de polipéptido del serogrupo B de N. meningi tidis .