KR20020065938A - Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ Ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ 표면 항원ΝｈｈΑ의 보존 부위를 포함하는 단백질 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 변형된 형태의Neisseria meningitidis표면 항원을 구성하는 새로운 단백질 및 코딩 핵산에 관한 것이다. 변형된 표면 단백질은 비보존 아미노산의 결실을 특징으로 하므로,Neisseria meningitidis에 대해 교차-방어 면역 반응을 유도할 수 있다. 본 발명은 상기 변형된 표면 항원을 진단용, 치료용 및 예방용 백신에 사용하는 용도, 그리고 약제의 설계 및/또는 심사에 사용하는 용도로 확장된다. 변형된 표면 항원은 야생형 표면 항원으로부터 기대되는 것보다 광범위한N. meningitidis균주에 대해 효과적으로 면역화하는 백신에 특히 유용하다.
Description
Neisseria meningitidis는 그람-음성 박테리아로 수막구균성 수막염 (meningococcal meningitis) 및 패혈증(septicemia)의 원인 물질이다. 공지된 Neisseria meningitidis의 유일한 숙주는 인간으로, 인구의 대략 10%가 자각증상이 없는 보균자일 수 있다(Caugantet al., 1994,Journal of Clinical Microbiology, 32 323).
N. meningitidis는 다당류 캡슐을 발현시킬 수 있으며, 발현된 캡슐의 성질에 따라 박테리아가 분류된다. Neisseria meningitidis에는 A, B, C, 29-E, H, I, K, L, W135, X, Y 및 Z에 이르는 적어도 12종류의 혈청군이 있고, 이중에서 A, B, 및 C가 수막구균성 질환의 90%를 유발한다(Poolmanet al., 1995,Infectious Agents and Disease,4:13-28). 혈청군 A 및 C에 대항해 유도된 백신은 이용 가능하지만, 혈청군 B의 캡슐 다당류는 면역원성이 부족해서 인간에서는 방어효과를 유도하지 못한다.
따라서, 그 밖의 막 및 세포외 성분을 백신에 포함시키기에 적합한지에 대해 연구하고 있다. 예로는 클래스 1, 2, 및 3(포린;opa및por유전자에 의해 코딩됨) 및 클래스 4(Rmp)와 5(불투명성 단백질;opa및por유전자에 의해 코딩됨)의 외막 단백질을 들 수 있다.
그러나, 지금까지는 이들 대상 중 어느 것도 특히 어린이에게서 완전한 방어효과를 유도할 수 없었다(Romero et al., 1994,Clinical Microbiology Review, 7 559; Poolman et al., 1995, 상기 문헌).
효과적인 백신을 창출하기 위해서는 대부분의 균주에 존재하며 방어 면역 반응(예를 들면, 박테리아성 항체)을 유도할 수 있는N. meningitidis의 성분을 동정해야만 한다.
이런 점에서, 본 명세서에 참고로 인용된 국제특허 공보 WO99/24578, WO99/36544, WO99/58683 및 WO99/57280을 참조할 수 있으며, 이들 각각에는N. meningitidis에 대해 면역화하는 백신에 유용할 수 있는 다수의 후보 단백질들이 수록되어 있다.
이런 점에서, 역시 본 명세서에 참고로 인용된 국제특허 공보 WO99/31132 및 Peak 등의 2000, FEMS Immunol. Med. Microbiol. 28 329를 특히 참조할 수 있으며, 이들 문헌에는N. meningitidis의 많은 상이한 균주로부터 분리된 새로운 표면 항원이 수록되어 있으며, 본 명세서의 목적을 위하여 이들의 표면 항원 및 대립형질 변이체를 NhhA로 칭한다.
본 발명은 변형된 형태의Neisseria meningitidis표면 항원을 구성하는 새로운 단백질, 그리고 이러한 새로운 펩타이드 및 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산, 그리고 진단용, 치료용 및 예방용 백신, 그리고 약제의 설계 및/또는 선별에 이들을 사용하는 용도에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 비보존 아미노산의 결실을 통해, 본 발명의 변형된 표면 항원은 상응하는 야생형 표면 항원으로부터 예상되는 것보다 광범위한N. meningitidis균주에 대해 효과적으로 면역화하는 백신에 유용할 수 있다.
도면 및 표의 간단한 설명
표 1: 지정된 10종의N. meningitidis균주 각각으로부터 유래된 NhhA 폴리펩타이드의 보존 부위(C1, C2, C3, C4 및 C5) 및 가변 부위(V1, V2, V3 및 V4)의 아미노산 동정. 관련 SEQ ID NO도 기재하였다. 칼럼1 = 균주명. SEQ ID NO: 1-9는 본 출원과 함께 계류 중인 WO99/31132에 이미 수록된 것으로, 균주 Z2491의 NhhA 및nhhA의 서열은http://www.sanger.ac.uk/Projects/N_meningitidis에서 얻었으며; 칼럼 2 = C1 부위의 아미노산 번호; 칼럼 3 = V1 부위의 아미노산 번호; 칼럼 4 = C2 부위의 아미노산 번호; 칼럼 5 = V2 부위의 아미노산 번호; 칼럼 6 = C3 부위의 아미노산 번호; 칼럼 7 = V3 부위의 아미노산 번호; 칼럼 8 = C4 부위의 아미노산 번호; 칼럼 9 = V4 부위의 아미노산 번호; 칼럼 10 = C5 부위의 아미노산 번호이다. 공통 서열(SEQ ID NO: 11)의 아미노산 번호도 표시하였음을 주의한다.
표 2: 아미노산 치환 표.
도 1: 10종의N. meningitidis균주로부터 유래된 NhhA 폴리펩타이드 아미노산 서열(SEQ ID NO: 1-10) 및 공통 서열(SEQ ID NO: 11)의 아미노산 서열 배열. 이 배열에 사용된 균주명 및 폴리펩타이드 서열은 표 1의 칼럼 1에 기재된 균주명 및 SEQ ID NO에 상응한다. 아미노산은 표준 1문자 약어로 나타내었다. 공통 아미노산은 잔기가 완전하게 보존된 곳에만 표시되어 있다. 보존 부위(이중 밑줄로 표시된 C1, C2, C3, C4, C5) 및 가변 부위(단일 밑줄로 표시된 V1, V2, V3, V4)는 공통 서열 아래에 나타내었다.
도 2: 도 1의 아미노산 서열을 코딩하는 10종의N. meningitidis균주로부터 유래된nhhA핵산의 뉴클레오타이드 서열의 배열. C1, C2, C3, C4, C5 부위 및V1, V2, V3 및 V4 부위는 도 1 및 표 1에 나타낸 것이다.
도 3:porA프로모터에 유효하게 연결된 야생형 PMC21 NhhA를 코딩하는 PCR 증폭 산물을 함유하는 pCO14K에 해당하는 플라스미드 지도. (비축적 도시) 3A: 직선 화살표는 pCO14K 내의porA및kanR유전자의 배열을 나타낸다. 균주 PMC21의nhhA유전자를 증폭하는 데 사용된 올리고뉴클레오타이드 프라이머 HOMP5' 및 HOMP3'AN이 나타나 있다.nhhA유전자는 점선 화살표로 표시하였고,porA프로모터는 블랙 박스로 표시하였으며, 실시예 2에 기재된porA를nhhA로 대체하는 데 사용된EagI 및NcoI 제한자리가 나타나 있다. 3B: 실시예 2에 기재된 pIP52(PMC21) 내의 유전자 배열. 실시예 4에 기재된 돌연변이의 제작에 사용된BglⅡ 자리가 나타나 있다.
도 4: NhhA 폴리펩타이드의 특정 부위의 결실을 위한 스플라이스 중첩 연장 PCR 방법의 개략도. 야생형nhhA유전자의 개략도는 도 4A-4C의 상부에 나타내었고, 재조합nhhA는 도 4A-4C의 하부에 나타내었으며, 가변 부위는 검은 상자로 나태내고 불변 부위는 흰 상자로 나타내었다. 화살표는 올리고뉴클레오타이드 프라이머의 대략적인 위치를 나타낸다. 수직 빗금선은 증폭 산물을 의미한다. 올리고뉴클레오타이드 서열이nhhA핵산의 불연속 부위로부터 유래되는 곳에는 그러한 불연속 부위 사이에 점선으로 나타냈다. 대략적인 축적도를 표시하였다. 이중 수직선은 C5 부위의 일부만이 나타났음 의미한다. A는 실시예 6에 제시된 방법을 보여준다. B는 실시예 7에 제시된 방법을 보여준다. C는 실시예 8에 제시된 방식을 보여준다.
도 5: (A) 실시예 4에서 제조된 PMC21 NhhA 결실 돌연변이 폴리펩타이드(SEQ ID NO: 23)의 아미노산 서열; (B) 코딩 뉴클레오타이드 서열(SEQ ID NO: 28).
도 6: (A) 실시예 5에서 제조된 H41 NhhA 결실 돌연변이 폴리펩타이드(SEQ ID NO: 24)의 아미노산 서열; (B) 코딩 뉴클레오타이드 서열(SEQ ID NO: 29).
도 7: (A) 실시예 6에서 제조된 PMC21 NhhA 결실 돌연변이 폴리펩타이드(SEQ ID NO: 25)의 아미노산 서열; (B) 코딩 뉴클레오타이드 서열(SEQ ID NO: 30).
도 8: (A) 실시예 7에서 제조된 PMC21 NhhA 결실 돌연변이 폴리펩타이드(SEQ ID NO: 26)의 아미노산 서열; (B) 코딩 뉴클레오타이드 서열(SEQ ID NO: 31).
도 9: (A) 실시예 8에서 제조된 PMC21 NhhA 결실 돌연변이 폴리펩타이드(SEQ ID NO: 27)의 아미노산 서열; (B) 코딩 뉴클레오타이드 서열(SEQ ID NO: 32).
도 10: 야생형 및 NhhA 결실 돌연변이 폴리펩타이드 서열의 아미노산 서열. 이들 폴리펩타이드는 실시예 2, 실시예 3, 실시예 4 및 실시예 5에 기재된 바와 같이 제조되었다. 아미노산은 1문자 약어로 나타내었다. 표 1 및 도 1에 정의된 것들에 상응하는 C1, C2,C3, C4 및 C5로 표시된 보존 부위는 H41 및 PMC21 유래의 전체 길이 서열에 이중 밑줄로 표시하고, 표 1 및 도 1에 정의된 것들에 상응하는 V1, V2, V3 및 V4로 표시된 가변 부위는 H41 및 PMC21 유래의 전체 길이 서열에 단일 밑줄로 표시하였다.
도 11: 과대 발현된 NhhA의 웨스턴 면역블롯. 45 ㎍의 전체 세포 단백질을 4-20% 구배의 SDS-PAGE 상에서 분리한 뒤, 니트로셀룰로스 여과지로 옮기고, 실시예 9에 기재된 바와 같이 웨스턴 면역블로팅하였다. 레인 1: 정상 수준의 NhhA 발현을 나타내는 모체 균주. 레인 2: 균주 P6(실시예 2에 기재된 PMC21 NhhA 과대 발현). 레인 3: 균주 PΔ6(실시예 4에 기재된 PMC21 NhhA 과대 발현). 레인 4: 균주 H14(실시예 3에 기재된 H41 NhhA 과대 발현). 레인 5: 균주 HΔ8(실시예 5에 기재된 H41 NhhA 과대 발현). 레인 6: 균주 2A(국제특허 공보 WO99/31132에 기재된nhhA유전자의 돌연변이에 의해 폐쇄된 NhhA 발현). 표준 이동도는 185 kDa, 119 kDa, 85 kDa, 62 kDa, 51.2 kDa, 38.2 kDa, 22.4 kDa을 가리킨다. 야생형 NhhA 폴리펩타이드는 레인 1에 존재하는 고분자량의 면역 반응성 밴드로서 존재하나, 레인 6에서는 나타나지 않는다.
도 12: 분리된 NhhA 결실 돌연변이 폴리펩타이드. NhhA 폴리펩타이드를 실시예 9에 기재된 바와 같이 분리하고 4-20% SD-PAGE 상에서 분류하였다. 폴리아크릴아미드 겔을 쿠마시 염색하였다. 레인 1: 실시예 6에 기재된 절단 PMC21 NhhA 폴리펩타이드를 과대 발현하는 균주의 OMC 제제. 레인 2: 정제된 절단 PMC21 NhhA 폴리펩타이드. 레인 3: 실시예 4에 기재된 절단 PMC21 NhhA 폴리펩타이드를 과대 발현하는 균주의 OMC 제제. 레인 4: 정제된 절단 PMC21 NhhA 폴리펩타이드. 레인 5: 실시예 2에 기재된 PMC21 NhhA 폴리펩타이드를 과대 발현하는 균주의 OMC 제제. 레인 6: 정제된 절단 PMC21 NhhA 폴리펩타이드. 레인 7: 173 kDa, 111 kDa, 80kDa, 61 kDa, 49 kDa, 36 kDa의 분자량 표준. 레인 6을 제외한 모든 레인의 반응성 고분자량 종은 아마도 NhhA 폴리펩타이드의 멀티머를 의미한다 점을 유의한다. 다른 밴드들은 아미도 덜 안정적인 형태의 NhhA 또는 붕괴 산물들일 것이다. 레인 6에는 이들이 존재하지 않는다는 점을 유의한다.
도 13: 항-NhhA 단백질 마우스 혈청을 이용한 웨스턴 면역블롯. 모든 패널에서, 레인 1, 3, 5 및 7은 PMC21 NhhA 폴리펩타이드를 과대 발현하는 균주의 OMC를 함유하며, 레인 2, 4, 6 및 8은 NhhA를 발현하지 않는 균주 2A의 OMC를 함유한다. 패널 A: 레인 1 및 2: 1:1000의 희석률로 야생형 PMC21 NhhA를 접종한 마우스 A. 레인 3 및 4: 1:10,000의 희석률로 야생형 PMC21 NhhA를 접종한 마우스 A. 레인 5 및 6: 1:1000의 희석률로 야생형 PMC21 NhhA를 접종한 마우스 B. 레인 7 및 8: 1:10,000의 희석률로 야생형 PMC21 NhhA를 접종한 마우스 B. 패널 B: 레인 1 및 2: 1:1000의 희석률로 절단된 PMC21 NhhA 폴리펩타이드(실시예 4)를 접종한 마우스 C. 레인 3 및 4: 1:10,000의 희석률로 절단된 PMC21 NhhA 폴리펩타이드(실시예 4)를 접종한 마우스 C. 레인 5 및 6: 1:1000의 희석률로 절단된 PMC21 NhhA(실시예 4)를 접종한 마우스 D. 레인 7 및 8: 1:10,000의 희석률로 절단된 PMC21 NhhA(실시예 4)를 접종한 마우스 D. 패널 C: 레인 1 및 2: 1:1000의 희석률로 절단된 PMC21 NhhA(실시예 6)를 접종한 마우스 E. 레인 3 및 4: 1:10,000의 희석률로 절단된 PMC21 NhhA(실시예 6)를 접종한 마우스 E. 레인 5 및 6: 1:1000의 희석률로 절단된 PMC21 NhhA(실시예 6)를 접종한 마우스 F. 레인 7 및 8: 1:10,000의 희석률로 절단된 PMC21 NhhA(실시예 6)를 접종한 마우스 F.
도 14: 예측된 완숙한 NhhA 폴리펩타이드 결실 돌연변이. A: 실시예 2에 기재된 예측된 완숙한 돌연변이 단백질(SEQ ID NO: 33); B: 실시예 3에 기재된 예측된 완숙한 돌연변이 단백질(SEQ ID NO: 34); C: 실시예 4에 기재된 예측된 완숙한 단백질(SEQ ID NO: 35); D: 실시예 5에 기재된 예측된 완숙한 단백질(SEQ ID NO: 36); E: 실시예 6에 기재된 예측된 완숙한 단백질(SEQ ID NO: 37); F: 실시예 7에 기재된 예측된 완숙한 단백질(SEQ ID NO: 38); 및 G: 실시예 8에 기재된 예측된 완숙한 단백질(SEQ ID NO: 39).
본 발명자들은 NhhA 표면 항원이N. meningitidis균주 사이에서 가변적일 수 있는 폴리펩타이드 부위 및 균주 사이에 보존된 기타의 부위를 갖는다는 사실을 발견하였다. 가변 부위는 면역원성일 수 있고 균주-특이성 면역 반응을 유도하는 경향이 있으므로,N. meningitidis의 특정 균주로부터 유래된 NhhA 항원을 포함하는 백신은 그러한 특정 균주에 대해 우선적으로 면역화하는 경향이 있다. 결과적으로, 본 발명자들은 야생형 NhhA에 의해 유도되는 바와 같은 균주-특이성이 없는 면역 반응을 유도하는 변형된 NhhA 폴리펩타이드를 제조하려고 노력해 왔다. 이러한 변형된 NhhA 항원은 이하에 설명한 바와 같이N. meningitidis에 대한 치료용 및/또는 예방용 백신의 제조에 유용할 것이다. 이러한 백신들은 보존 에피토프에 대해 우선적으로 면역 반응을 유도함으로써, 야생형 NhhA로 면역화한 후에 예상되는 것보다 광범위한N. meningitidis균주에 대해 효과적으로 면역화할 것이다.
따라서, 본 발명은 넓게는 NhhA 폴리펩타이드의 보존 아미노산을 갖는 분리 단백질(isolated protein)에 관한 것이다.
따라서, 본 발명의 단백질들은 상응하는 야생형 NhhA 폴리펩타이드에 비해비보존 아미노산이 하나 이상 결실되어 있을 수 있다.
제1 양태에서, 본 발명은 NhhA 폴리펩타이드의 보존 아미노산 서열을 12개 이상 포함하는 분리된 단백질을 제공하며, 야생형 NhhA 폴리펩타이드는 상기 분리된 단백질에서 배제된다.
본 발명의 단백질은 면역 반응을 유도할 수 있다.
면역 반응은 상응하는 야생형 NhhA 폴리펩타이드에 의해 유도되는 것보다 균주-특이성이 작은 것이 바람직하다.
상기 면역 반응은 1종 이상의N. meningitidis균주, 또는 더욱 바람직하게는 다수의N. meningitidis균주에 대해 방어효과를 제공하는 것이 더욱 바람직하다.
야생형 NhhA 폴리펩타이드 서열은 도 1(SEQ ID NO: 1-10)에 예시하였다.
공통 아미노산 서열 또한 도 1(SEQ ID NO: 11)에 제시되어 있다.
본 발명의 분리된 단백질은 본 명세서에서 도 1에 C1, C2, C3, C4 및 C5로 지정한 NhhA 폴리펩타이드의 불변 부위를 하나 이상 포함하는 것이 바람직하다.
이 양태에 따르면, 도 1에서 V1, V2, V3 또는 V4로 지정된 NhhA 폴리펩타이드의 가변 부위의 비보존 아미노산 중 하나 이상이 야생형 NhhA 폴리펩타이드에 대해 결실되는 것이 적합하다는 것을 이해할 것이다.
V1 부위 또는 적어도 그의 실질적인 부분이 결실되는 것이 바람직하다.
특정 구현예에서, 분리된 단백질은 "본 발명의 변형된 NhhA 폴리펩타이드"의 예로서 도 5 내지 도 9(SEQ ID NO: 23 내지 27) 중 하나에 제시된 아미노산 서열을갖는다. 도 14(SEQ ID NO: 33 내지 39)에는 N-말단 신호 서열이 제거된 결과로 만들어진 "완숙한(mature)" 폴리펩타이드의 다른 예들이 제시되어 있다.
제2 양태에 따르면, 본 발명은 제1 양태에 따르는 폴리펩타이드를 코딩하는 분리 핵산을 제공한다.
야생형 NhhA 핵산 서열은 도 2(SEQ ID NO: 12 내지 21)에 예시하였다.
공통(consensus) 핵산 서열도 도 2(SEQ ID NO: 22)에 제시되어 있다.
C1, C2, C3, C4 및 C5 부위는 도 2에 제시된 각각의 뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩되는 것이 바람직하다.
V1, V2, V3 및 V4 부위는 도 2에 제시된 각각의 뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩되는 것이 바람직하다.
특정 구현예에서, 분리 핵산은 "본 발명의 변형된nhhA핵산"의 특정한 예들인 도 5 내지 도 9(SEQ ID NO: 28 내지 32) 중 하나에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 갖는다.
제1 및 제2 양태에 따르는 본 발명은 본 발명의 분리 단백질 및 핵산의 동족체, 단편, 변이체 및 유도체로 확장된다.
명확히 말해, 야생형 NhhA 폴리펩타이드 및nhhA핵산은 본 발명의 범위에서 배제된다.
제3 양태에서, 본 발명은 발현 벡터 및 상기 제2 양태에 따르는 핵산을 포함하는 발현 구조체에 관한 것으로서, 상기 서열은 상기 발현 벡터 내에 하나 이상의 조절(regulatory) 핵산에 유효하게 연결된다.
제4 양태에서, 본 발명은 상기 제3 양태에 따르는 발현 구조체를 함유하는 숙주 세포를 제공한다.
제5 양태에서, 본 발명은 다음과 같은 단계를 포함하는 제1 양태에 따르는 재조합 분리 단백질의 제조 방법을 제공한다:
(i) 제3 양태에 따르는 발현 벡터를 함유하는 숙주 세포를 배양해 상기 숙주 세포 내에서 폴리펩타이드를 발현시키는 단계; 및
(ⅱ) 상기 재조합 폴리펩타이드를 분리하는 단계.
제6 양태에서, 본 발명은 본 발명의 단백질, 그의 단편, 변이체 또는 유도체에 결합된 항체 또는 항체 단편을 제공한다.
제7 양태에서, 본 발명은N. meningitidis를 함유할 것으로 추정되는 생물학적 샘플에서N. meningitidis를 검출하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 다음과 같은 단계를 포함한다:
(i) 개체로부터 생물학적 샘플을 분리하는 단계;
(ⅱ) 상기 항체 또는 항체 단편과 생물학적 샘플을 조합하는 단계; 및
(ⅲ)N. meningitidis의 존재를 시사하는 특이적으로 결합된 항체 또는 항체 단편을 검출하는 단계.
제8 양태에서, 본 발명은N. meningitidis박테리아를 함유할 것으로 추정되는 생물학적 샘플에서N. meningitidis박테리아를 검출하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 다음과 같은 단계를 포함한다:
(i) 환자로부터 생물학적 샘플을 분리하는 단계; 및
(ⅱ) 상기 샘플 내에서N. meningitidis박테리아의 존재를 시사하는 제2 양태에 따르는 핵산 서열을 검출하는 단계.
제9 양태에서, 본 발명은N. meningitidis에 의한 개체의 감염을 진단하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 다음과 같은 단계를 포함한다:
(i) 개체로부터 채취한 생물학적 샘플과 본 발명의 폴리펩타이드, 단편, 변이체 또는 유도체를 접촉시키는 단계; 및
(ⅱ) 상기 샘플 내에서N. meningitidis-특이성 항체와 상기 폴리펩타이드, 단편, 변이체 또는 유도체 사이의 복합체의 존재여부를 측정하는 단계(여기서, 복합체의 존재는N. meningitidis의 감염을 시사함).
개체는 포유류인 것이 바람직하다.
더욱 바람직한 개체는 인간이다.
제10 양태에서, 본 발명은 생물학적 샘플 내에서N. meningitidis박테리아를 검출하기 위한 키트에 사용하는 제1 양태에 따르는 분리 단백질의 용도, 제2 양태에 따르는 분리 핵산의 용도, 또는 상기에 언급된 항체 또는 항체 단편의 용도로 확장된다.
제11 양태에서, 본 발명은 제1 양태에 따르는 분리 단백질을 포함하는 제약학적 조성물을 제공한다.
상기 제약학적 제제는 백신인 것이 바람직하다.
제12 양태에서, 본 발명은 상기 백신을 제약학적 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는N. meningitidis에 의한 환자의 감염을 예방하는 방법을 제공한다.
제13 양태에서, 본 발명은 제1 양태에 따르는 분리 단백질, 변이체 또는 유도체의 면역원 단편의 동정 방법을 제공하며, 상기 방법은 다음과 같은 단계를 포함한다:
(i) 상기 폴리펩타이드, 변이체 또는 유도체의 단편을 제조하는 단계;
(ⅱ) 상기 단편을 개체에게 투여하는 단계; 및
(ⅲ) 상기 개체 내에서N. meningitidis및/또는 상기 폴리펩타이드, 변이체 또는 유도체에 특이적으로 결합하는 요소의 생산, 및/또는N. meningitidis감염에 대한 방어효과를 포함하는 면역 반응을 검출하는 단계.
개체는 포유류가 바람직하다.
더욱 바람직한 개체는 인간이다.
발명의 상세한 설명
본 명세서 전반에 걸쳐 달리 지적하지 않는 한, "포함(comprise, comprises, comprising)"이라는 용어는 언급된 요소 또는 요소들의 그룹을 포함하나, 그 외의 요소 또는 요소들의 그룹을 배제하지 않는 것을 의미하는 것으로 이해될 것이다.
명명과 관련하여, 본 명세서에서 NhhA는 본 발명의 단백질을 언급하는 경우에 사용되며,nhhA는 본 발명의 핵산을 언급하는 경우에 사용된다. 또한, NhhA/nhhA단백질 및 핵산은 예를 들면 WO99/31132에 인용된 HiaNm/hianm단백질 및 핵산을 포함하나, 이들로 제한되지 않음을 이해할 것이다.
본 발명은 적어도 부분적으로 10종류의N. meningitidis균주에서 NhhA 폴리펩타이드 내의 보존 또는 비보존 부위의 설명에 입각하여 예측된다. 해당 부위는예시된 NhhA 폴리펩타이드의 다른 대립형질 변이체 내에 보존되어 있는 것으로 예측된다.
본 발명의 중심은 야생형 NhhA 폴리펩타이드 내에서 비보존 아미노산의 결실에 의해 본 발명의 변형된 NhhA 폴리펩타이드의 형성을 구현하는 것이고, 면역 반응은 보존된 에피토프에 대한 면역 반응을 유도함으로써 하나 이상의N. meningitidis이종 균주에 대한 방어효과를 제공하는 본 발명의 폴리펩타이드에 의해 면역화하는 경우 유도될 수 있음을 이해할 것이다.
본 명세서에서 "비보존" 아미노산이란 제1N. meningitidis균주로부터 유래된 야생형 NhhA 폴리펩타이드 내에는 존재하나, 1종 이상의 다른 균주로부터 유래된 야생형 NhhA 폴리펩타이드 내에는 존재하지 않는 아미노산 잔기를 의미한다.
제1 양태의 폴리펩타이드는 상응하는 야생형 서열에 대해 결실된 V1, V2, V3 및 V4 부위 중 적어도 하나의 부위를 가짐으로써, "결실 돌연변이"의 예로서 집합적으로 언급될 수 있는 것이 적합하다.
본 발명자들은 비교적 보존된 C1-5 부위에 비해 비보존 아미노산을 상대적으로 높은 빈도로 함유하는 야생형 NhhA 폴리펩타이드의 부위로서 V1, V2, V3 및 V4 부위를 동정했다.
V 부위에서, V1(과가변성) 및 V2 부위는 비보존 아미노산을 가장 높은 빈도로 함유하고, V3 및 V4는 상대적으로 낮은 빈도로 비보존 아미노산을 함유한다. 그러나, V1 부위는 (전체 아미노산을 기준으로) V2 부위보다 상당히 높은 비율로 야생형 NhhA 폴리펩타이드를 구성한다. 따라서, 제1 양태에 따르는 분리 단백질은적어도 결실된 V1 부위의 실질적인 부분을 함유하는 것이 바람직하다.
당업자들은 상기 결실 돌연변이체를 제작함에 있어, 상이한N. meningitidis균주의 NhhA 폴리펩타이드 사이의 부위가 "셔플링(shuffling)"될 수 있음을 이해할 것이다. 예를 들면, 본 발명의 NhhA 폴리펩타이드는 PMC21 C5 부위와 함께 H41 C1 부위를 포함할 수 있다.
그러한 "셔플링"은 재조합 DNA에 특히 매우 적합하다.
본 발명의 목적을 위하여, "분리된"이란 용어는 그들의 천연 상태에서 벗어났거나 인간에 의해 조작된 물질을 의미한다. 분리된 물질은 천연 상태에서 정상적으로 수반하는 성분이 실질적으로 또는 본질적으로 결여될 수 있거나, 혹은 천연 상태에서 정상적으로 수반하는 성분을 인공 상태에서도 함께 수반하도록 조작될 수 있다. 분리된 물질은 천연 또는 재조합 형태일 수 있다.
"단백질"이란 아미노산 폴리머를 의미한다. 아미노산은 당 기술분야에서 널리 이해되는 바와 같이 천연 또는 인공 아미노산일 수 있다.
"펩타이드"는 50개 이하의 아미노산을 갖는 단백질이다.
폴리펩타이드는 50개 이상의 아미노산을 갖는 단백질이다.
본 명세서에서, "면역 반응을 유도한다"라는 어구는 본 발명의 분리된 폴리펩타이드가 그것이 투여된 포유류 내에서N. meningitidis및/또는 상기 폴리펩타이드에 대해 유도되는 면역 반응을 일으키는 능력을 의미하는 것이다. 면역 반응은 박테리아 항체의 생산을 포함하는 것이 바람직하다. 더욱 바람직한 면역 반응은N. meningitidis감염에 대해 방어적인 것이다.
"균주-특이성"은 자가N. meningitidis균주에 대해 유도되거나, 또는 적어도 우세하게 유도되는 면역 반응의 측면에서 사용된다.
본 명세서에서, "교차-반응성"이란 하나 이상의 이종N. meningitidis균주에 대해 면역 반응을 유도하는 폴리펩타이드의 능력을 의미한다.
본 명세서에서, "교차-방어성"이란 하나 이상의 이종N. meningitidis균주에 의한 감염에 대해 면역 반응을 유도함으로써 방어효과를 제공하는 본 발명의 폴리펩타이드의 능력을 의미한다.
따라서 이상과 같은 측면에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 본 명세서에서 "면역원" 또는 "면역원성"인 것으로 언급될 수 있다.
본 발명의 목적을 위하여, 상기 변형 NhhA 단백질은 도 5 내지 9(SEQ ID NO: 23-27) 및 도 14에 제시된 아미노산 서열에 의해 예시되었으나, 본 발명은 예시된 단백질의 단편, 유도체 및 (대립형질 변이체와 같은) 변이체도 고려한다.
예를 들면, 아미노산은 도 1에 제시된 C1-5 서열 중 하나로부터 결실될 수 있으나, V1-4 부위의 비보존 아미노산 모두를 균주-특이적 면역원성을 감소시키기 위하여 결실시킬 필요는 없다.
따라서, 본 발명의 분리 단백질은 C1-5 및 V1-4 부위의 단편들을 포함할 수 있다.
실제로 이하의 실시예에 기재한 바와 같이, 본 발명의 폴리펩타이드를 재조합 DNA를 근거로 하여 생산하기 위한 목적에서는 간편한 제한 엔도뉴클레아제 자리(convenient restriction endonuclease site)를 활용하고 안정된 면역원성 단백질의 높은 수준의 발현을 달성하기 위하여 C1, C2, C3, C4 및/또는 C5 부위 또는 V1, V2, V3 및/또는 V4 부위의 하나 또는 몇몇 아미노산을 결실시키는 것이 유용할 수 있다.
한 구현예에서, "단편"은 100% 미만 적어도 20% 이상, 바람직하게는 적어도 50% 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 80% 이상, 가장 바람직하게는 적어도 90% 이상의 C1, C2, C3, C4 또는 C5 부위를 구성하는 아미노산 서열을 포함한다.
단편은 예를 들면 C2 부위와 같은 12개 가량의 아미노산을 포함하는 펩타이드(SEQ ID NO: 11) 또는 적어도 20개의 연속된 아미노산의 서열, 혹은 본 명세서에 기재된 C1, C2, C3, C4 및/또는 C5 부위의 일부 또는 전체에 상응하는 100개 이상의 연속된 아미노산의 서열을 포함하는 펩타이드일 수 있다.
본 명세서에 예시된 그 외의 단편들은 번역 후 프로세싱되어 도 14에 제시된 바와 같은 완숙한 폴리펩타이드를 형성하는 본 발명의 변형된 NhhA 폴리펩타이드들이다.
또 다른 구현예에서, "단편"은 예를 들면 적어도 6개, 바람직하게는 적어도 10개, 더욱 바람직하게는 적어도 20개 아미노산 길이의 작은 펩타이드로서, 본 발명의 변형된 NhhA 단백질로부터 유래되는 하나 이상의 항원 결정인자 또는 에피토프를 포함한다. 하나 이상의 펩타이드를 포함하는 거대 단편도 고려되며, 표준 재조합 핵산 기술을 적용하여 얻거나, 종래의 액상 또는 고체상 합성 기술을 이용해 합성할 수 있다. 예를 들면, Nicholson에 의해 편집되고 Blackwell Scientific Publication에 의해 출간된 "Synthetis Vaccines"라는 표제의 간행물에 수록된Atherton 및 Shephard에 의해 "Peptides Synthesis"라는 표제로 제9장에서 설명된 용액 합성 또는 고체상 합성을 참조할 수 있다. 대안적으로, 펩타이드는 엔도Lys-C, 엔도Arg-C, 엔도Glu-C 및 스타필로코신 V8-프로테아제와 같은 프로테이나제와 본 발명의 폴리펩타이드를 결찰시켜 제조할 수도 있다. 분해된 단편들은 예를 들면 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 기술을 통해 정제할 수 있다.
본 명세서에서, "변이체" 폴리펩타이드는 하나 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 대체된 본 발명의 폴리펩타이드이다. 당 기술분야에서는 폴리펩타이드의 성질을 변화시키지 않으면서도 광범위하게 유사한 특성을 갖도록 몇몇 아미노산을 바꿀 수 있는 것으로 공지되어 있다(보존적 치환). 폴리펩타이드에서의 보존적 치환는 예를 들면 표 2에 따라 달성될 수 있다.
기능상의 실질적인 변화는 표 2에 제시된 것보다 덜 보존적인 치환을 선택함으로써 달성될 수 있다. 그 밖의 대체는 비보존적 치환일 것이고, 이들 중 상대적으로 소수만이 내성일 수 있다. 일반적으로, 폴리펩타이드의 특성에 있어 지대한 변화를 유발하기 쉬운 치환은 (a) 친수성 잔기(예를 들면, Ser 또는 Thr)가 소수성 잔기(예를 들면, Ala, Leu, ILe, Phe 또는 Val)에 대해 또는 의해 치환되거나; (b) 시스테인 또는 프롤린이 그 외의 다른 잔기에 대해 또는 의해 치환되거나; (c) 양전하를 띠는 측쇄를 갖는 잔기(예를 들며, Arg, His 또는 Lys)가 음전하를 띠는 잔기(예를 들면, Glu 또는 Asp)에 대해 또는 의해 치환되거나; 또는 (d) 부피가 큰 측쇄를 갖는 잔기(예를 들면, Phe 또는 Trp)가 작은 측쇄를 갖는 잔기(예를 들면, Ala, Ser) 또는 측쇄가 없는 잔기(예를 들면, Gly)에 대해 또는 그러한 잔기에 의해 치환되는 것이다.
"변이체"란 용어는 본 명세서에 예시된 서열의 대립형질 변이체로부터 생산된 본 발명의 NhhA 폴리펩타이드도 내포한다.
NhhA 폴리펩타이드 변이체는 "폴리펩이드 동족체"라는 경우에 따라서, 용어의 범위 내에 포함될 수 있다.
폴리펩타이드 동족체는 이상에 제시한 본 발명의 변형된 NhhA 폴리펩타이드의 아미노산 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%의 서열 동일성을 공유한다.
본 명세서에서 일반적으로 사용되는 "동족체"는 본 발명의 핵산 또는 폴리펩타이드와 정의 가능한 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열 관계를 공유한다.
예를 들면, 이러한 동족체는 본 명세서에 예시된 것들과는 다르나, 면역원성이고 교차-방어 면역성을 제공하는 아미노산 서열을 갖는 것으로 여겨진다.
명확히 말해, 야생형 NhhA 폴리펩타이드 및nhhA핵산은 "동족체"라는 용어의 범위에서 배제된다.
N. meningitidis이외의 박테리아종으로부터 분리된 기능적으로 관련된 폴리펩타이드인 "오르토로그(ortholog)" 및 그의 코딩 핵산은 본 동족체의 범위에 포함된다.
개별적인 핵산 및 폴리펩타이드간의 서열 관계를 설명하기 위하여 본 명세서에 사용된 용어들은 "비교창(comparison window)", "서열 동일성(sequece identity)", "서열 동일성의 백분율" 및 "실질적인 동일성"을 포함한다. 개개의핵산/폴리펩타이드는 각각 (1) 핵산/폴리펩타이드에 의해 공유되는 단지 하나 또는 그 이상의 완전한 핵산/폴리펩타이드 서열 부분, 그리고 (2) 핵산/폴리펩타이드 사이에서 분기된 하나 이상의 부분을 포함할 수 있기 때문에, 서열 비교는 "비교창" 상에서 서열을 비교하여 유사한 서열의 국부적인 부위를 동정 및 비교함으로써 이루어진다. "비교창"은 참조 서열에 비교한 통상 12개의 연속된 잔기의 개념적 구획을 의미한다. 비교창은 개별 서열의 최적의 배열을 위해 (첨가 또는 결실을 포함하지 않는) 참조 서열에 비해 약 20 이하의 첨가 또는 결실(즉, 갭)을 포함할 수 있다. 비교창을 배열하기 위한 서열의 최적의 배열은 컴퓨터에 의한 알고리즘의 수행(Intelligenetics의 유전자 작업 프로그램; GAP, BESTIT, FASTA, 및 TFASTA, wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Drive Madison, WI, USA, 본 명세서에 참고로 인용됨) 또는 선택된 다양한 방법 중 하나에 의해 제조된 최상의 배열(즉, 비교창 상에서 최고 백분율의 상동성을 가져오는 배열) 및 정밀 검사에 의해 수행될 수 있다. 예를 들면, 본 명세서에 참고로 인용된 Altschul 등의 1997, Nucl. Acids Res. 25 3389에 설명된 BLAST 부류의 프로그램을 참조할 수 있다.
서열 분석의 상세한 내용은 Ausubel 외 편저의 CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(John Wiley & Sons Inc NY, 1995-1999)의 19.3단원에서 찾아 볼 수 있다.
"서열 동일성"이란 용어는 가장 넓은 의미에서 표준 알고리즘을 이용해 적합한 배열에 대하여 비교창 상에서 서열의 동일성 정도를 고려하여 정확한 뉴클레오타이드 또는 아미노산의 일치하는 개수를 내포하는 데 사용된다. 그러므로, "서열 동일성의 백분율"은 비교창 상에서 최적으로 배열된 두 서열을 비교하고, 동일한 핵산 염기(예를 들면, A, T, C, G, I)가 이들 두 염기 서열에서 발생하는 위치의 수를 측정하여 일치된 위치의 수를 얻고, 비교창에서 위치들의 총 수로 일치된 위치의 수를 나누고, 그 값에 100을 곱해 서열 동일성의 백분율을 계산함으로써 산출된다. 예를 들면, "서열 동일성"은 DNASIS 컴퓨터 프로그램(윈도우용 버전 2.5; Hitachi Software engineering C., Ltd., South San Francisco, California, USA)으로 계산된 "일치 백분률"을 의미하는 것으로 이해될 수 있다.
따라서, 당업자는 재조합 DNA 기술을 이용해 상기에 정의된 변이체와 같은 본 발명의 폴리펩타이드 동족체를 제조할 수 있을 것이다. 예를 들면, 본 발명의 핵산은 예를 들어 트랜스포손 돌연변이 유발과 같은 무작위 돌연변이 유발, 또는 자리-특이성 돌연변이 유발을 이용해 돌연변이시킬 수 있다. 이어서, 얻어진 DNA 단편을 통상의 기술을 이용해E. coli와 같은 적합한 발현 숙주에 클로닝하고, 원하는 활성을 보유하는 클론을 검출한다. 클론을 무작위 돌연변이 유발 기술을 이용해 유도한 경우에는 돌연변이를 검출하기 위해 양성 클론을 시퀀싱할 것이다.
본 명세서에서 "유도체" 폴리펩타이드는 예를 들면, 기타 화학적 모이어티와의 접합 또는 복합, 또는 당 기술분야에 공지된 번역 후 변형 기술에 의해 변형된 본 발명의 폴리펩타이드이다. 이러한 유도체는 면역 반응을 유도하는 본 발명의 NhhA 폴리펩타이드 또는 그의 변이체에 대한 아미노산 결실 및/또는 첨가를 포함한다.
아미노산의 "첨가"는 폴리펩타이드 또는 그의 변이체와 다른 폴리펩타이드 또는 단백질의 융합을 포함할 수 있다. 이런 관점에서, 본 발명의 폴리펩타이드 또는 변이체는 거대 폴리펩타이드에 혼입될 수 있으며, 그러한 거대 폴리펩타이드도 면역원성일 수 있음을 이해할 것이다. 상기에 기재된 폴리펩타이드는 예를 들면,N. meningitidis로부터 유래되지 않은 다른 단백질과 융합될 수 있다. 예를 들면, 이런 다른 단백질은 단백질의 정제를 조력할 수 있다. 대안적으로, 이는N. meningitidis에 대해 효과적인 면역 반응을 유도하거나, 또는 또 다른 병원체에 대한 면역 반응을 유도할 수 있다. 기타 가능한 융합 단백질로는 면역조절 반응을 유도하는 것들이 있다. 이러한 단백질의 특정한 예로는 단백질 A 또는 글루타티온 S-트랜스퍼라제(GST)가 포함된다. 또한, 폴리펩타이드는 담체 단백질로서 작용하는 올리고당계 백신 성분에 융합될 수 있다.
본 발명에서 고려되는 그 외의 유도체로는 비제한적으로, 측쇄 변형, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질 합성 중에 천연 아미노산 및/또는 그 유도체의 혼입, 교차결합 및 본 발명의 폴리펩타이드, 단편 및 변이체에 형태적 압박을 가하는 기타 방법의 사용이 포함된다. 본 발명에서 고려되는 측쇄 변형의 예로는 아세트산 무수물을 이용한 아실화; 숙신산 무수물 및 테트라하이드로프탈산 무수물을 이용한 아미노기의 아실화; 메틸아세트이미데이트를 이용한 아미딘화; 시아네이트를 이용한 아미노시의 카바모일화; 피리독살-5-포스페이트를 이용한 리신의 피리독실화에 이은 NaBH4를 이용한 환원; 알데하이드와의 반응에 이은 NaBH4로의 환원에 의한 환원성 알킬화; 및 2,4,6-트리니트로벤젠 설폰산(TNBS)을 이용한 아미노기의 트리니트로벤질화를 들 수 있다.
카르복시기는 O-아실이소우레아 형성을 통해 카보디이미드를 활성화하고, 후속하여 예를 들면 해당 아미드로 유도하여 변형시킬 수 있다.
아르기닌 잔기의 구아니딘기는 2,3-부타디온, 페닐글리옥살 및 글리옥살과 같은 반응물을 이용한 이종고리 축합 산물의 형성에 의해 변형될 수 있다.
설프하이드릴기는 시스테산으로의 퍼포름산 산화; 4-클로로머큐리페닐설폰산, 4-클로로머큐리벤조에이트, 2-클로로머큐리-4-니트로페놀, 페닐머큐리 클로라이드 및 기타 머큐리류를 이용한 머큐리 유도체의 형성; 기타 티올 화합물을 이용한 혼합 디설파이드의 형성; 말레이미드, 말레산 무수물 또는 기타 치환 말레이미드와의 반응; 요오도아세트산 또는 요오도아세트아미드를 이용한 카르복시메틸화; 및 알칼리 pH에서 시아네이트를 이용한 카바모일화와 같은 방법들에 의해 변형될 수 있다.
트립토판 잔기는 예를 들면, 2-하이드록시-5-니트로벤질 브로마이드 또는 설포닐 할라이드를 이용한 인돌 고리의 알킬화, 혹은 N-브로모숙신이미드를 이용한 산화에 의해 변형될 수 있다.
티로신 잔기는 테트라니트로메탄으로 니트레이트화하여 3-니트로티로신 유도체를 형성함으로써 변형될 수 있다.
히스티딘 잔기의 이미다졸 고리는 디에틸프로카보네이트를 이용한 N-카르브에톡시화 또는 요오도아세트산 유도체를 이용한 알킬화에 의해 변형될 수 있다.
펩타이드를 합성하는 동안 혼입되는 천연 아미노산 및 유도체로는 비제한적으로, 4-아미노 부티르산, 6-아미노헥산산, 4-아미노-3-하이드록시-5-페닐펜탄산, 4-아미노-3-하이드록시-6-메틸헵탄산, t-부틸글리신, 노르류신, 노르발린, 페닐글리신, 오르니틴, 사코신, 2-티에닐 알라닌 및/또는 아미노산의 D-이성체를 들 수 있다.
본 발명은 또한 인체 내에서 면역원성이 되도록 본 발명의 폴리펩타이드, 단편 또는 변이체를 디니트로페놀로 공유 변형시키는 것에 관한 것이다.
본 발명의 분리 단백질(단편, 변이체, 유도체 및 동족체 포함)은 당 기술분야에 공지된 적합한 방법에 의해 제조될 수 있다.
예를 들면, 상기 단백질은 다음과 같은 단계를 포함하는 방법에 의해 재조합 폴리펩타이드로서 제조될 수 있다:
(i) 하나 이상의 조절 뉴클레오타이드 서열에 유효하게 연결된 본 발명의 변형된nhhA핵산을 포함하는 발현 구조체를 제조하는 단계;
(ⅱ) 발현 구조체를 적합한 숙주 세포에 트랜스펙션 또는 형질전환시키는 단계; 및
(ⅲ) 상기 숙주 세포 내에서 재조합 폴리펩타이드를 발현시키는 단계.
PCR에 의한 본 발명의 변형된nhhA핵산의 제조를 설명하는 다수의 실시예가 이하에 제시되어 있다.
특정한 한 구현예에서, PCR은 이하에 설명된 바와 같이 스플라이스 중첩 PCR이며, 이는 Ho 등에 의해 1989년 Gene 77 51 및 Horton 등에 의해 1989년 Gene 7761에 제시된 방법을 근거로 한다.
숙주 세포 발현을 목적으로, 재조합 핵산은 발현 벡터 내의 하나 이상의 조절 서열에 유효하게 연결된다.
"발현 벡터"는 플라스미드와 같은 자가-복제 염색체외 벡터, 또는 숙주 게놈으로 통합되는 벡터 중 하나일 수 있다.
"유효하게 연결된"이란 상기 조절 뉴클레오타이드 서열(들)이 전사를 개시, 조절 또는 달리 통제하는 본 발명의 재조합 핵산에 관련하여 배치되는 것을 의미한다.
조절 뉴클레오타이드 서열은 일반적으로 발현에 사용되는 숙주 세포에 적합할 것이다. 당 기술분야에는 다양한 숙주 세포에 대해 다양한 유형의 적합한 발현 벡터 및 적합한 조절 서열이 공지되어 있다.
통상적으로, 상기 조절 뉴틀레오타이드 서열들 중 하나 이상이 비제한적으로, 프로모터 서열, 리더 또는 신호 서열, 리보좀 결합 자리, 전사 개시 및 종결 서열, 번역 개시 및 종결 서열, 그리고 증폭자(enhancer) 또는 활성화인자 서열을 포함한다.
당 기술분야에 공지된 구조적인 또는 유도 가능한 프로모터들이 본 발명에 고려된다. 프로모터는 천연 프로모터 및 하나 이상의 프로모터 요소들을 조합한 혼성 프로모터 중 하나일 수 있다.
바람직한 구현예에서, 발현 벡터는 형질전환된 숙주 세포를 선별되게 하는 선별 가능한 마커 유전자를 함유한다. 선별 가능한 마커 유전자는 당 기술분야에공지되어 있으며, 사용된 숙주 세포에 따라 달라질 것이다.
한 구현예에서, 발현 벡터는porA프로모터 및 카나마이신 선별 유전자를 함유하는 pCO14K이고, 이에 대해서는 이하에서 상세히 설명될 것이다. 이 구현예에 따르면, 숙주 세포는E. coli및N. meningitidis로 이루어지는 군으로부터 선택되는 박테리아이다.
발현 벡터는 융합 파트너(통상적으로 발현 벡터에 의해 제공됨)를 포함함으로써 본 발명의 재조합 폴리펩타이드가 상기 융합 파트너를 함유하는 융합 폴리펩타이드로서 발현되도록 할 수도 있다. 융합 파트너의 주된 장점은 상기 융합 폴리펩타이드의 동정 및/또는 정제를 조력한다는 것이다.
상기 융합 폴리펩타이드를 발현시키기 위해서는 본 발명에 따르는 뉴클레오타이드 서열을 발현 플라스미드에 결찰시켜 융합 파트너 및 본 발명의 뉴클레오타이드 서열의 번역 리딩 프레임이 동시에 발생되도록 해야 한다.
융합 파트너의 공지된 예로는 비제한적으로, 친화 크로마토그래피에 의한 융합 폴리펩타이드의 분리에 특히 유용한 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST), 인간 IgG의 Fc 부분, 말토스 결합 단백질(MBP) 및 헥사히스티딘(HIS6)을 들 수 있다. 친화 크로마토그래피에 의한 융합 폴리펩타이드 정제의 목적으로, 친화 크로마토그래피를 위한 관련 매트릭스는 글루타티온-, 아밀로스- 및 니켈- 또는 코발트-접합 수지이다. 이러한 많은 매트릭스는 (HIS6) 융합 파트터와 유용한 QIAexpressTM시스템(Qiagen) 및 Pharmacia GST 정제 시스템과 같은 "키트" 형태에 활용 가능하다.
바람직한 융합 파트너로는 MBP가 있으며, 이는 하기 실시예 11에서 설명된다.
당 기술분야에 공지된 또 다른 융합 파트너에는 녹색 형광 단백질(GFP)이 있다. 이 융합 파트너는 형광 현미경 검사 또는 유동 세포계수법에 의한 본 발명의 융합 폴리펩타이드의 동정을 가능하게 하는 형광 "태그"로서 제공된다. GFP 태그는 본 발명의 융합 폴리펩타이드의 준세포 편재를 평가하는 경우, 또는 본 발명의 융합 폴리펩타이드를 발현하는 세포를 분리하는 데 유용하다. 형광 활성화 세포 선별(Fluorescence activated cell sorting; FACS)과 같은 유동 세포계수법은 융합 폴리펩타이드를 발현하는 세포를 분리하는 데 특히 유용하다.
융합 단백질은 인자 Xa또는 트롬빈과 같은 프로테아제 절단 자리를 함유함으로써, 관련 프로테아제가 본 발명의 융합 폴리펩타이드를 부분적으로 분해하도록 하여 본 발명의 재조합 폴리펩타이드를 유리시키도록 하는 것이 바람직하다. 이어서, 유리된 폴리펩타이드는 후속의 크로마토그래피 분류에 의해 융합 파트너로부터 분리될 수 있다.
본 발명에 따르는 융합 파트너도 특정 항체가 활용 가능한 통상의 짧은 펩타이드 서열인 "에피토프 태그"의 범주에 포함된다. 특이적인 단일 클론성 항체가 용이하게 활용 가능한 에피토프 태그의 공지된 예로는 c-myc, 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 및 FLAG 태그가 포함된다.
이상에서와 같이, 본 발명의 폴리펩타이드는 본 발명의 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 동족체를 코딩하는 핵산을 포함하는 상기 발현 플라스미드로 형질전화된 숙주 세포를 배양함으로써 제조할 수 있다. 단백질 발현에 적합한 조건은 발현 벡터 및 숙주 세포의 선택에 따라 가변적일 것이다. 당업자들은 일상적인 실험을 통해 이들을 용이하게 확인할 수 있다.
발현에 적합한 숙주 세포는 원핵생물 또는 진핵생물일 수 있다. 본 발명에 따르는 폴리펩타이드의 발현용으로 바람직한 숙주 세포는 박테리아이다. 사용되는 박테리아는Escherichia coli또는N. meningitidis일 수 있다.
바람직한 구현예에서, 숙주 세포는 ProA, Opa, Opc 또는 캡슐 다당류는 발현하지 않고 원하는 지질다당류 표현형질은 발현하도록 변형된N. meningitidis이다.
대안적으로, 숙주 세포는 예를 들면 바큘로바이러스 발현 시스템과 함께 이용할 수 있는SF9과 같은 곤충 세포일 수도 있다.
당업자들은 예를 들면, 본 명세서에 참고로 인용된 Sambrook 등의 MOLECULAR CLONING. A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Press, 1989), 보다 구체적으로 16절 및 17절; 본 명세서에 참고로 인용된 Ausubel 등에 의해 편저된 CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, 보다 구체적으로 10장 및 16장; 및 본 명세서에 참고로 인용된 Coligan 등에 의해 편저된 CURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE, 보다 구체적으로 1장, 5장 및 6장에 제시된 표준 프로토콜을 이용하여 간편하게 재조합 단백질을 제조할 수 있다.
본 발명의 재조합 변형 NhhA 단백질의 바람직한 발현 방법, 그리고 발현 단백질의 바람직한 결실 방법은 이하의 실시예에서 설명한다.
뉴클레오타이드 서열
본 발명은 본 발명의 변형된 NhhA 단백질을 코딩하는 분리 핵산을 제공한다.
상기 분리 핵산은 도 1 및 2에 제시된 하나 이상의 NhhA 폴리펩타이드 불변(C) 부위를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 함유한다. 분리 핵산은 도 1 및 2에도 지정된 하나 이상의 비보존(V 부위) 아미노산을 추가로 코딩할 수 있다.
이러한 분리 핵산의 특정한 구현예들은 SEQ ID NO: 28-32 및 도 5-9에 제시되어 있다.
본 명세서에 사용된 "핵산"이란 용어는 단일 가닥 또는 이중 가닥 mRNA, RNA, cRNA 및 DNA를 의미하고, 상기 DNA는 cDNA 및 게놈 DNA를 포함한다.
"폴리뉴클레오타이드"는 80개 이상의 연속된 뉴클레오타이드를 갖는 핵산이고, "올리고뉴클레오타이드"는 80개 미만의 연속된 뉴클레오타이드를 갖는 핵산이다.
"프로브"는 예를 들면 노던 블로팅 또는 서던 블로팅에서 상보적인 서열을 검출하기 위한 목적으로 적합하게 표지된 단일 가닥 또는 이중 가닥 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드일 수 있다.
"프라이머"는 통상적으로 상보적인 핵산 "주형"에 어닐링(annealing)될 수 있고, Taq 폴리머라제, RNA-의존성 DNA 폴리머라제 또는 SequenaseTM와 같은 DNA 폴리머라제의 작용에 의해 주형-의존적 양식으로 확장되는, 바람직하게는 15개 내지50개의 연속된 뉴클레오타이드를 갖는 단일 가닥의 올리고뉴클레오타이드이다.
본 발명은 또한 이상에서 정의된 본 발명의 핵산의 동족체도 고려한다.
이러한 핵산 동족체에서 전체 길이의 야생형 NhhA 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산은 배제된다.
예를 들면, 핵산 동족체는 본 발명의 NhhA V 및 C 부위와 구조적으로 관련된 펩타이드 및 폴리펩타이드를 코딩하는데, 이들은 면역화에 의해N. meningitidis에 대한 교차-방어 면역성을 제공하기 위한 용도로 유용할 수 있다.
한 구현예에서, 핵산 동족체는 그의 변이체, 단편 및 유도체를 포함하는 본 발명의 폴리펩타이드 동족체를 코딩한다.
다른 구현예에서, 핵산 동족체는 본 발명의 핵산과 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 70%, 더욱 바람직하게는 적어도 80%, 가장 바람직하게는 적어도 90%의 서열 동일성을 공유한다.
또 다른 구현예에서, 핵산 동족체는 적어도 낮은 극한(stringency) 조건, 바람직하게는 적어도 보통의 극한 조건, 더욱 바람직하게는 고도의 극한 조건 하에 본 발명의 핵산과 혼성화한다.
본 명세서에서 "혼성화"는 적어도 부분적으로 상보적인 뉴클레오타이드 서열의 짝짓기에 의해 DNA-DNA, RNA-RNA 또는 DNA-RNA 혼성체를 생산하는 것을 의미한다. 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 혼성 서열은 당 기술분야에 공지된 상보적임 퓨린 및 피리미딘 사이의 염기 짝짓기를 통해 발생한다.
이런 점에서, 변형된 퓨린(예를 들면, 이노신, 메틸이노신 및 메틸아데노신)및 변형된 피리미딘(티오우리딘 및 메틸사이토신)도 염기 짝짓기에 참여할 수 있음을 이해할 것이다.
본 명세서에 사용된 "극한성"이란 혼성화되는 동안의 온도 및 이온 강도 조건, 그리고 유기 용매 및/또는 세제의 존재 여부를 의미한다. 극한성이 커질수록 혼성화 뉴클레오타이드 서열 사이에 더 높은 상보 수준이 요구된다.
"극한 조건"은 단지 상보적인 염기의 빈도가 높은 핵산만이 혼성화되는 조건을 의미한다.
참고로, 낮은 극한 조건은 다음을 포함 또는 내포한다:
(ⅰ) 42℃에서의 혼성화를 위한 적어도 약 1 v/v% 내지 적어도 약 15 v/v%의 포름아미드 및 적어도 약 1M 내지 적어도 약 2M의 염, 그리고 42℃에서의 세척을 위한 적어도 약 1M 내지 적어도 약 2M의 염; 및
(ⅱ) 65℃에서의 혼성화를 위한 1% 소의 혈청 알부민(BSA), 1 mM EDTA, 0.5M NaHPO(pH 7.2), 7%의 SDS, 그리고 실온에서의 세척을 위한 (a) 2 x SSC, 0.1% SDS; 또는 (b) 0.5% BSA, 1 mM EDTA, 40 mM NaHPO4(pH 7.2), 5% SDS.
보통의 극한 조건은 다음을 포함 및 내포한다:
(ⅰ) 42℃에서의 혼성화를 위한 적어도 약 16 v/v% 내지 적어도 약 30 v/v%의 포름아미드 및 적어도 약 0.5M 내지 적어도 약 0.9M의 염, 그리고 42℃에서의 세척을 위한 적어도 약 0.5M 내지 적어도 약 0.9M의 염; 및
(ⅱ) 65℃에서의 혼성화를 위한 1% 소의 혈청 알부민(BSA), 1 mM EDTA,0.5M NaHPO(pH 7.2), 7%의 SDS, 그리고 42℃에서의 세척을 위한 (a) 2 x SSC, 0.1% SDS; 또는 (b) 0.5% BSA, 1 mM EDTA, 40 mM NaHPO4(pH 7.2), 5% SDS.
고도의 엄격한 조건은 다음을 포함 및 내포한다:
(ⅰ) 42℃에서의 혼성화를 위한 적어도 약 31 v/v% 내지 적어도 약 50 v/v%의 포름아미드 및 적어도 약 0.01M 내지 적어도 약 0.15M의 염, 그리고 42℃에서의 세척을 위한 적어도 약 0.01M 내지 적어도 약 0.15M의 염;
(ⅱ) 65℃에서의 혼성화를 위한 1% BSA, 1 mM EDTA, 0.5M NaHPO(pH 7.2), 7%의 SDS, 그리고 65℃에서 약 1시간 동안의 세척을 위한 (a) 0.1 x SSC, 0.1% SDS; 또는 (b) 0.5% BSA, 1 mM EDTA, 40 mM NaHPO4(pH 7.2), 1% SDS; 및
(ⅲ) 68℃에서 약 20분간의 세척을 위한 0.2 x SSC, 0.1% SDS.
일반적으로, 세척은 Tm= 69.3 + 0.41(G+C)% - 12℃에서 수행된다. 일반적으로 이중 가닥 DNA의 Tm은 제짝이 아닌 염기의 수가 1% 증가할 때마다 약 1℃씩 감소한다.
이상에도 불구하고, 극한 조건은 본 명세서에 참고로 인용된 Ausubel 등의 상기 문헌 2.9장 및 2.10장에 설명된 바와 같이 당 기술분야에 공지되어 있다. 당업자는 혼성화의 특이성을 최적화하기 위하여 다양한 인자들을 조작할 수 있을 것이다. 최종 세척의 극한성을 최적화하면 고도의 혼성화를 달성할 수 있다.
통상적으로, 상보적인 뉴클레오타이드 서열은 뉴클레오타이드를 매트릭스(바람직하게는 니트로셀룰로스와 같은 합성막)상에 고정하는 단계, 혼성화 단계 및 검출 단계를 포함하는 블로팅 기술에 의해 동정된다. 서던 블로팅은 상보적인 DNA 서열을 동정하는 데 이용되고; 노던 블로팅은 상보적인 RNA 서열을 동정하는 데 사용된다. 도트 블로팅 및 슬롯 블로팅은 상보적인 DNA/DNA, DNA/RNA 또는 RNA/RNA 폴리뉴클레오타이드 서열을 동정하는데 사용될 수 있다. 이러한 기술들은 당 기술분야에 공지된 것으로, Ausubel 등의 상기 문헌의 페이지 2.9.1에서 2.9.20에 기재되어 있다.
이러한 방법에 따르면, 서던 블로팅은 겔 전기영동에 의해 크기에 따라 DNA 분자를 분리하는 단계; 크기에 따라 분류된 DNA를 합성막으로 옮기는 단계; 및 막에 결합된 DNA와 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 혼성화하는 단계를 포함한다.
도트 블로팅 및 슬롯 블로팅에서, DNA 샘플은 앞에서와 같이 혼성화 전에 합성막에 직접 적용된다.
대안적인 블로팅 단계는 플라크 또는 콜로니 혼성화 과정을 통해 cDNA 또는 게놈 DNA 라이브러리에서 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 동정하는 경우에 사용된다. 이런 방법의 통상적인 다른 예는 본 명세서에 참고로 인용된 Sambrook 등의 상기 문헌 8장-12장에 기재되어 있다.
통상적으로, 다음과 같은 일반적인 방법들이 혼성화 조건을 결정하는 데 사용될 수 있다. 핵산을 상기에 설명한 바와 같이 합성막으로 블로팅한다/옮긴다. 본 발명의 야생형 뉴클레오타이드 서열을 상기에 설명한 바와 같이 표지하고, 이 표지된 핵산이 고정된 뉴클레오타이드 서열과 혼성화하는 능력을 분석한다.
당업자들은 다수의 인자들이 혼성화에 영향을 준다는 것을 인지할 것이다.방사선 표지된 폴리뉴클레오타이드 서열의 특이적 활성은 검출 가능한 신호를 제공하기 위해서 통상적으로 약 108dpm/㎎ 이상이어야 한다. 108내지 109dpm/㎎의 특이적 활성을 갖는 방사선 표지된 뉴클레오타이드 서열은 대략 0.5 pg의 DNA를 검출할 수 있다. 당업자들은 검출이 가능하기 위해서는 충분한 DNA가 막에 고정되어야 한다는 것이 잘 알고 있다. 과도의 고정된 DNA, 통상 1-10 ㎍의 DNA을 가지는 것이 바람직하다. 10 %(w/v) 덱스트란 설페이트(MW 500,000) 또는 폴리에틸렌 글리콜 6000과 같은 불활성 폴리머를 첨가하는 것도 혼성화의 감응성을 증가시킬 수 있다(Ausubel 외, 상기 문헌 2.10.10 참조).
막에 고정된 핵산 및 표지된 핵산 사이의 혼성화로부터 의미 있는 결과를 달성하기 위해서는, 충분한 양의 표지된 핵산이 세척 후 고정된 핵산에 혼성화되어야 한다. 세척은 표지된 핵산이 이 표지된 핵산과 원하는 정도의 상보성을 갖는 고정된 핵산에만 혼성화되도록 한다.
고정된 핵산에 혼성화되는 표지된 핵산을 검출하는 방법은 당업자들에게 공지되어 있다. 이러한 방법에는 방사선 자동사진법(autoradiography), 화학발광분석법(chemiluminescent), 형광분석법 및 색채계 분석법이 포함된다.
다른 구현예에서, 본 발명의 핵산 동족체는 다음과 같은 절차에 따라 제조될 수 있다:
(ⅰ) 적합한 숙주로부터 핵산 추출물을 수득하는 단계;
(ⅱ) 각각이 본 발명의 핵산의 일부를 포함하는 선택적으로 축퇴하는 프라이머를 제작하는 단계; 및
(ⅲ) 상기 프라이머를 이용해 핵산 증폭 기술을 통해 상기 핵산 추출물로부터 하나 이상의 증폭 산물을 증폭하는 단계.
숙주는 박테리아가 적합하다.
숙주는Neisseria속이 바람직하다.
더욱 바람직한 숙주는N. meningitidis또는N. Lactamica이다.
핵산 증폭 방법에 따라 유용한 프라이머에는 이하에 상세히 설명한 SEQ ID NO: 40-51이 포함된다.
적합한 핵산 증폭 기술은 당업자들에게 공지된 것으로, 예를 들면 본 명세서에 참고로 인용된 Ausubel 등의 상기 문헌 15장에 기재된 바와 같은 폴리머라제 연쇄 반응(PCR); 본 명세서에 참고로 인용된 U.S. 특허 5,422,252에 기재된 바와 같은 표준 대체 증폭(SDA); 본 명세서에 참고로 인용된 Liu 등의 1996,J. Am. Chem. Soc.118 1587 및 국제출원 공보 WO92/01813 및 Lizardi 등의 국제출원 공보 WO 97/19193에 기재된 바와 같은 회전 환 복재(RCR); 본 명세서에 참고로 인용된 Sooknanan 등의 1994, Biotechniques 17 1077에 기재된 바와 같은 핵산 서열계 증폭(NASBA); 및 본 명세서에 참고로 인용된 Tyagi 등의 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 5395에 의해 기재된 바와 같은 Q-β 리플리카제 증폭을 들 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "증폭 산물"은 핵산 증폭기술에 의해 생성되는 핵산 산물을 의미한다.
항체
본 발명은 또한 본 발명의 분리 단백질 단편, 변이체 및 유도체에 대한 항체에 관한 것이다. 본 발명의 항체들은 단일 클론성 항체 또는 다중 클론성 항체일 수 있다. 항체 생산, 정제 및 사용에 적용 가능한 공지된 프로토콜은 본 명세서에 참고로 인용된 Coligan 등의 CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY(John Wiley & Sons, Inc, 1991-1994) 및 Harlow, E 및 Lane, D의Antibodies; 본 명세서에 참고로 인용된A Laboratory Manual, Cold Spring Horbor, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988을 참조할 수 있다.
일반적으로, 본 발명의 항체는 발명의 폴리펩타이드, 단편, 변이체 또는 유도체에 결합 또는 접합한다. 예를 들면, 상기 항체는 다중 클론성 항체일 수 있다. 이러한 항체는 다중 클론성 항혈청을 얻기 위하여, 본 발명의 폴리펩타이드, 단편, 변이체 또는 유도체를 마우스 또는 토끼를 포함하는 생산종에 주입하여 제조할 수 있다. 다중 클론성 항체의 제조 방법은 당 기술분야에 공지되어 있다. 사용될 수 있는 대표적인 프로토콜은 예를 들면 Coligan 등의 CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY 상기 문헌 및 Harlow 및 Lane 등의 상기 문헌에 제시되어 있다.
생산종에서 얻어지는 다중 클론 항혈청 대신, 예를 들어 본 명세서에 참고로 인용된 Koeler 및 Milstein의 논문(1975, Nature 256, 495)에 제시된 표준 방법, 또는 예를 들어 Coligan 등의 상기 문헌 CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOG에 기재된 바와 같이 본 발명의 폴리펩타이드, 단편, 변이체 또는 유도체 중 하나 이상이 접종된 생산종으로부터 유래된 비장 또는 다른 항체 생산 세포를 영구화(immortalizing)함으로써 상기 방법을 가장 최근에 변형시킨 방법을 이용해제조할 수 있다.
본 발명은 또한 상기에서 언급한 다중 클론 또는 단일 클론 항체의 Fc 또는 Fab 단편을 포함하는 항체도 본 발명의 범위에 포함한다. 대안적으로, 항체는 본 발명의 펩타이드에 대한 단일 사슬 Fv 항체(scFvs)를 포함할 수 있다. 이러한 scFvs는 예를 들면 미국 특허 제5,091,513호, 유럽 특허 제239,400호 또는 본 명세서에 참고로 인용된 Winter 및 Milstein의 논문인 1991, Nature, 349, 293에 각각 제시된 방법들에 따라 제조될 수 있다.
본 발명의 항체는 천연 또는 재조합N. meningitidis폴리펩타이드를 분리하는데 있어 친화 크로마토그래피에 사용될 수 있다. 예를 들면, Coligan 등이 상기 문헌 CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOG의 9.5장에 설명한 면역친화 크로마토그래피 방법을 참조할 수 있다.
항체는 이하에서 상세히 설명되는 다음과 같은 용도로 사용될 수 있으나, 이들로 제한되는 것은 아니다:
(i) 본 발명의 변이체 폴리펩타이드를 동정하기 위한 발현 라이브러리의 선별;
(ⅱ) 면역 반응성 단편 또는 면역 반응성 에피토프의 동정; 및
(ⅲ)N. meningitidis의 감염 검출.
N. meningitidis 검출
개체 내의N. meningitidis의 존재 여부는 상기 개체로부터 생물학적 샘플을 분리하고, 이 생물학적 샘플과 상기에 기재한 항체 또는 항체 단편을 혼합한 뒤,샘플에서N. meningitidis의 존재를 의미하는 특이적으로 결합된 항체 또는 항체 단편을 검출함으로써 측정할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 "생물학적 샘플"이란 용어는 환자와 같은 개체로부터 추출, 비처리, 처리, 희석 또는 농축될 수 있는 샘플을 의미한다. 생물학적 샘플은 전체 혈액, 혈청, 혈장, 타액, 소변, 땀, 복수(ascitic fluid), 복막 액(peritoneal fluid), 활액(synovial fluid), 양수(amniotic fluid), 뇌척수액(cerebrospinal fluid), 피부 생검물(skin biopsy) 등으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 적합하다.
복합체 형성의 측정에 적합한 임의의 기술이 사용될 수 있다. 예를 들면, 이것과 관련된 표지를 갖는 본 발명에 따르는 항체 또는 항체 단편을 면역분석에 활용할 수 있다. 이러한 면역분석법에는 당 기술분야에 공지된 방사면역분석(radioimmunoassay), 효소-결합 면역용매 분석(immunosorbent assay: ELISAs) 및 면역크로마토그래피 기술(ICTs)이 포함되나, 이들로 한정되는 것은 아니다.
예를 들면, 본 발명에 따라 사용될 수 있는 각종 면역분석법이 제시된 Coligan 등의 CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY 7장을 참조할 수 있다. 면역분석법은 당 기술분야에 이해된 바와 같은 경쟁 분석법을 포함할 수 있다.
상기 항체 또는 항체 단편과 관련된 표지로는 다음과 같은 것들을 들 수 있다:
(A) 항체 또는 항체 단편에 표지의 직접 부착;
(B) 항체 또는 항체 단편에 표지의 간접 부착: 예를 들면, 표지를 다른 분석 시료에 부착한 후, 항체 또는 항체 단편에 결합시킴; 및
(C) 항체 또는 항체 단편의 후속 반응 산물에 부착.
표지는 크로모겐, 촉매, 효소, 플루오로포어(fluorophore), 화학발광 분자, Europium(Eu34)과 같은 란탄계열 원소의 이온, 방사성 동위원소 및 직접 가시화 표지를 포함하는 군으로부터 선택할 수 있다. 직접 가시화 표지의 경우, 콜로이드성 금속 또는 비금속 입자, 염료 입자, 효소 또는 기질, 유기 폴리머, 라텍스 입자, 리포좀 또는 신호 생산 기질을 함유하는 기타의 비히클 등에 사용될 수 있다.
표지로서 유용한 많은 효소가 본 명세서에 참고로 인용된 U.S. 4,366,241, U.S. 4,843,000 및 U.S. 4,849,338에 기재되어 있다. 본 발명에 유용한 효소 표지로는 알칼리성 포스파타아제, 호스래디쉬 퍼옥시다제, 루시퍼라제, β-갈락토시다제, 글루코스 옥시다제, 라이소자임, 말레이트 디하이드로게나제 등이 포함된다. 효소 표지는 단독으로 또는 용액 중의 제 2 효소와 함께 사용할 수 있다.
플루오로포어는 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC), 테트라메틸로다민 이소티오시아네이트(TRITL) 또는 R-피코에리트린(RPE)을 포함하는 군에서 선택된다.
본 발명은 또한,N. meningitidis에 의한 환자의 감염을 검출하는 방법으로 확장되며, 상기 방법은 환자로부터 채취한 생물학적 샘플을 본 발명의 폴리펩타이드, 단편, 변이체 또는 유도체와 접촉시키는 단계, 및 상기 혈청 내에서N.meningitidis-특이성 항체와 상기 폴리펩타이드, 단편, 변이체 또는 유도체 사이의 복합체의 존재 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 여기서 상기 복합체의 존재는 감염의 지표이다.
바람직한 구현예에 있어서, 상기 복합체의 검출은 당 기술분야에 공지된 적절한 표지로 상기 폴리펩타이드, 단편, 변이체 또는 유도체를 변형시키고, 이들 변형 화합물을 앞에서 설명한 예에서와 같이 면역분석에 사용함으로써 달성된다.
다른 양태에서, 본 발명은N. meningitidis박테리아를 함유할 것으로 의심되는 생물학적 샘플에서 상기 박테리아를 검출하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 환자로부터 상기 생물학적 샘플을 분리하는 단계, 및 상기 샘플에서 상기 박테리아의 존재를 시사하는 본 발명에 따르는 핵산 서열을 검출하는 단계를 포함한다. 상기 핵산 서열의 검출은 어떠한 적합한 기술을 이용해서도 측정할 수 있다. 예를 들면, 본 발명에 따르는 표지된 핵산은 당 기술분야에서 공지된 바와 같이 환자로부터 얻은 핵산 추출물의 서던 블롯에서 프로브로서 사용할 수 있다.
대안적으로, 본 발명에 따르는 표지된 핵산 서열은 환자로부터 얻은 RNA 추출물의 노던 블럿에서 프로브로 사용할 수 있다.
환자로부터 얻은 핵산 추출물은 본 발명에 따르는 핵산 서열의 센스 및 안티센스 서열에 상응하는 올리고뉴클레오타이드 프라이머, 또는 예들 들면 본 명세서에 참고로 인용된 국제출원 공보 WO89/09385에 기재된 리가제 사슬 반응(LCR) 또는 PCR과 같은 핵산 증폭 반응에서 이들의 측면 공격 서열(flanking sequence)과 함께 사용하는 것이 바람직하다.
각종 자동화 고체상 검출 기술(automated solid-phase detection technique) 또한 적합하다. 예를 들면, 대규모 고정화 프라이머 어레이(very large scale immobilized primer array: VLSIPSTM)는 예를 들면 Fodor 등(1991, Science 251 767) 및 Kazal 등(1996, Nature Medicine 2:753-759)이 제시한 바와 같이 핵산 검출에 사용할 수 있다. 상기 유전학적 기술은 당 기술분야에 공지되어 있다.
제약학적 조성물
본 발명의 또 다른 특징은N. meningitidis에 의한 감염에 대하여 환자를 보호하기 위한 제약학적 조성물에 활성제로서 본 발명의 폴리펩타이드, 단편, 변이체 또는 유도체("면역원성 제제")를 사용하는 것이다.
상기 제약학적 조성물은 제약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함한다.
"제약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제"란 전신 투여에 안전하게 사용될 수 있는 고체 또는 액체 충전제, 희석제 또는 캡슐화 물질을 의미한다. 상세한 투여의 경로에 따라 당 기술분야에 공지된 각종 담체가 사용될 수 있다. 이들 담체는 당, 전분, 셀룰로스 및 그의 유도체, 맥아(malt), 젤라틴, 탈크, 칼슘 설페이드, 식물성 기름, 합성 기름, 폴리올, 알긴산, 포스페이트 완충액, 유화제, 등장 염수(isotonic saline) 및 미네랄과 같은 염과 하이드로클로라이드, 브로마이드 및 설페이트와 같은 염, 아세테이트, 프로피오네이트 및 말로네이트와 같은 유기산, 그리고 파이로겐을 함유하지 않는 물(pyrogen-free water)을 포함하는군에서 선택될 수 있다.
제약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 및 부형제가 수록된 참고문헌으로는 본 명세서에 참고로 인용된 Remington's Pharmaceutical Sciences(Mark Publishing Co., N.J. USA, 1991)가 있다.
본 발명의 상기 조성물을 환자에게 적용하는 데는 안전한 투여 경로이면 어느 경로도 사용할 수 있다. 예를 들면, 경구, 직장, 비경구, 설하, 구강, 정맥내, 관절내, 근육내, 피부내, 피하, 흡입, 안구내, 복막내, 뇌실내(intracerebroventricular), 경피 등의 경로가 사용될 수 있다. 근육내 및 설하 주사는 예를 들면 면역원성 조성물, 백신 및 DNA 백신의 투여에 적합하다.
투약 형태에는 정제, 분산액, 현탁액, 주사액, 용액, 시럽, 트로치(troche), 캡슐, 좌약, 에어로졸, 경피 패치(transdermal patch) 등이 포함된다. 이들 투약 형태는 이런 목적을 위하여 특별히 고안된 주사 또는 이식 조절 방출기, 또는 이런 양식으로 부가적으로 작동하도록 변형시킨 다른 형태의 이식체를 포함한다. 치료제의 조절된 방출은 예를 들면 아크릴 수지, 왁스, 고급 지방족 알콜, 폴리액트산(polyactic acid) 및 폴리글리콜산을 포함하는 소수성 폴리머, 그리고 하이드로옥시프로필메틸 셀룰로스와 같은 특정 셀룰로스 유도체로 이들 치료체를 코팅함으로써 달성할 수 있다. 또한, 조절된 방출은 기타 폴리머 매트릭스, 리포좀 및/또는 미세구(microsphere)의 사용에 의해 달성될 수 있다.
경구 또는 비경구 투여에 적합한 본 발명의 제약학적 조성물은 분말 또는 과립, 또는 용액 또는 수용액 중의 현탁액, 비수용액, 수중유적 에멀젼 또는 유중수적 에멀젼으로 소정양의 본 발명의 치료제를 1종 이상 함유하는 캡슐, 사셋(sachet) 또는 정제와 같은 개별 단위로 존재할 수 있다. 이러한 조성물은 어떠한 제약 방법으로도 제조할 수 있으나, 모든 방법은 상기에 기재된 하나 이상의 면역원성 제제를 하나 이상의 필수 성분으로 구성된 담체와 혼합하는 단계를 포함한다. 일반적으로, 상기 조성물은 본 발명의 면역원성 제제를 액체 담체 또는 미세하게 분쇄된 고체 담체, 또는 이 둘 모두와 균일하고 세밀하게 혼합한 후, 필요한 경우, 산물을 원하는 형태로 성형하여 제조할 수 있다.
상기 조성물은 투약 제형과 상용 가능한 방식으로, 그리고N. meningitidis감염으로부터 환자를 보호하는 면역학적 유효량으로 투여될 수 있다. 본 발명의 범위 내에서 환자에게 투여되는 용량은N. meningitidis수준에 있어서의 감소와 같은 기간 경과에 따라 환자에게서 이로운 반응을 일으키거나, 또는N. meningitidis에 의한 감염을 억제하기에 충분해야한다. 투여될 면역원성 제제의 양은 환자의 연령, 성별, 체중 및 전반적인 건강 상태를 포함해서 치료되는 환자에 따라 결정될 수 있다. 이런 측면에서, 투여에 요구되는 면역원성 제제의 정확한 양은 의사의 판단에 따를 것이다.
N. meningitidis에 대한 치료 또는 예방에 있어 투여되는 면역원성 제제의 유효량을 결정하는데 있어서, 의사는 순환 혈장 수준, 질병의 진전 및 항-N. meningitidis항체의 생산을 평가할 수 있다. 어떠한 경우에도, 본 발명의 면역원성 제제의 적합한 투여량은 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 이러한 투여량은 대략적으로 수 나노그램에서 수 밀리그램일 수 있다.
상기 조성물은 치료용 또는 예방용 백신으로 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 활성제로서 본 발명의 면역원성 제제를 하나 이상 함유하는 백신의 제조 방법으로 확장된다. 이러한 백신을 제조하는 데는 적용 가능한 많은 방법들이 고려된다. 대표적인 방법에는 예를 들면 본 명세서에 참고로 인용된 NEW GENERATION VACCINES(1997, Levineet al., Marcel Dekker, Inc. New York, Basel Hong kong)에 기술된 방법들이 포함된다.
본 발명에 따르는 면역원성 제제는 다른 항원의 B 또는 T 세포 에피토프를 포함하는 다른 항원과 혼합, 접합 또는 융합될 수 있다. 또한, 이들 면역원성 제제는 이하에 기재한 담체와 접합될 수 있다.
본 발명의 합텐성 펩타이드(haptenic peptide)가 사용되는 경우(즉, 동계 항체와는 반응하나 그 자체가 면역 반응을 유도할 수 없는 펩타이드), 이는 면역원성 담체와 접합될 수 있다. 유용한 담체는 당 기술분야에 공지되어 있으며, 예를 들면, 티로글로블린; 인간 혈청 알부민과 같은 알부민; 독소, 변성 독소, 파상풍, 디프테리아, 백일해,Pseudomonas,E. coli,Staphylococcus및Streptococcus유래 독소의 돌연변이 교차반응성 물질(mutant crossreactive material: CRM); 폴리(리신:글루탐산)과 같은 폴리아미노산; 인플루엔자; 로타바이러스 VP6, 파르보바이러스 VP1 및 VP2; B형 간염 바이러스 중심 단백질; B형 간염 바이러스 재조합 백신 등이 포함된다. 대안적으로, 담체 단백질 또는 기타 면역원성 단백질의 절편 또는 에피토프가 사용될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 합텐성 펩타이드는 박테리아 독소, 변성 독소 또는 CRM의 T 세포 에피토프에 결합될 수 있다. 이에 관해서는본 명세서에서 참고로 인용된 미국 특허 제5,785,973호를 참조할 수 있다.
또한, 본 발명의 폴리펩타이드, 단편, 변이체 또는 유도체는Neisseria,또는 다른 박테리아 또는 바이러스에 대항해 유도되는 백신 조성물에서 담체 단백질로 작용할 수 있다.
본 발명의 면역원성 제제는N. meningitidis의 항원 또는, 병원성 박테리아H. influenzae,M. catarrhalis,N. gonorrhoeae,E. coli,S. pneumoniae등을 포함하는 다른 유기체의 항원과 함께 다가 서브유닛 백신(multivalent subunit vaccine)으로 투여될 수 있다. 대안적으로 또는 부가적으로,N. meningitidis의 올리고당 또는 다당류 성분과 함께 투여될 수 있다.
상기 백신은 또한 상기에 기재한 제약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 함유할 수 있다.
상기 백신 및 면역원성 조성물은 당 기술분야에 공지된 아쥬번트를 함유할 수 있다. 본 발명에 고려되는 아쥬번트에는 비제한적으로 헥사데실아민, 옥타데실아민, 옥타데실 아미노산 에스테르, 리솔레시틴, 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드, N,N-디옥타데실-N',N'비스(2-하이드로옥시에틸-프로판디아민), 메톡시헥사데실글리세롤 및 플루론 폴리올; 피란, 덱스트란설페이트, 폴리 IC 카보폴과 같은 폴리아민; 뮤라밀 디펩타이드 및 유도체, 디메틸글리신, 터프트신(tuftsin)과 같은 펩타이드; 오일 에멀젼; 및 알루미늄 포스페이트, 알루미늄 하이드록사이드 또는 알룸과 같은 미네랄 겔; 림포카인, QuilA 및 면역 자극 복합체(ISCOMS)가 포함된다.
아쥬번트의 예에 대해서는 본 명세서에 참고로 인용된 국제출원 공보WO99/36544를 참조한다.
DNA 전달에 의한 백신접종
본 발명의 변형 NhhA 단백질을 포함하는 발현 구조체는 숙주를 예방 목적으로 및/또는 치료 목적으로 처리하기 위하여 인간에게 투여될 수 있다. 이와 관련하여, 발현 구조체는 집합적으로 "면역원성 제제"라 불리는 이들의 변형된 NhhA 펩타이드, 폴리펩타이드, 단편 또는 유도체를 하나 이상 코딩할 수 있다.
발현 구조체는 또한 백시니아(vaccinia)와 같은 특수화된 유전자 치료 벡터 및 유전자 치료에 유용한 바이러스 벡터를 사용하는 유전자 치료 구조체를 포함한다. 상기 바이러스 벡터는 Franceschi 외, 2000, J. Cell BioChem. 78 476, Braun-Falco 외, 1999, Gene Ther. 6 432에 제시된 것과 같은 아데노바이러스 및 아데노바이러스-관련 바이러스(AAV), Buchshacher 외, Blood 95 2499에 제시된 것과 같은 레트로바이러스성 및 렌티바이러스성 벡터, 그리고 헤르페스 단순 바이러스 및 사이토메갈로바이러스로부터 유래된 벡터를 포함한다. 유전자 치료 벡터 및 전달 방법에 대한 일반적인 내용은 Robbin 외, 1998, Trends in Biotech를 참조할 수 있다.Neisseria단백질을 이용하는 유전자 치료에 있어 잠재적으로 적합한 다양한 벡터 및 전달 방법이 수록된 참고문헌으로는 본 명세서에 참고로 인용된 국제특허 공보 WO99/36544가 있다.
본 발명의 면역원성 제제는 약독화 바이러스성(attenuated viral) 숙주에 의해 발현될 수 있다. "약독화 바이러스 숙주"는 천연적으로 무독성이거나, 또는 실질적인 무독성으로 조작된 바이러스 벡터를 의미한다. 바이러스는 적당한 물리적수단(예를 들면, 열처리) 또는 화학적 수단(예를 들면, 포름알데하이드 처리)에 의해 실질적인 무독성이 조작될 수 있다. "실질적인 무독성"이란 감염성이 파괴된 바이러스를 의미한다. 실제로, 바이러스의 감염성은 바이러스의 면역원성을 운반하는 단백질에 영향을 주지 않고 파괴된다. 이상으로부터, 약독화 바이러스 숙주는 생 바이러스(live virus) 또는 비활성화 바이러스(inactivated virus)를 포함할 수 있음을 이해할 것이다.
본 발명에 따르는 백신에 유용할 수 있는 약독화 바이러스 숙주는 아데노바이러스, 사이토메갈로바이러스 및 바람직하게는 백시나아(예를 들면, 본 명세서에 참고로 인용된 Paolette 및 Panicali의 미국 특허 제4,603,112호 참조) 및 약독화Salmonella균주(예를 들면, 본 명세서에 참고로 인용된 Stoker의 미국 특허 4,550,081 참조)와 같은 천연두 바이러스(pox virus)를 포함하는 바이러스 벡터를 포함할 수 있다. 생 백신은 실질적으로 장시간 면역성을 부여할 수 있는 지속된 자극을 유도하기 때문에 특히 유용하다.Neisseria단백질을 이용하는 면역화에 있어 잠재적으로 적합한 다양한 바이러스 벡터 및 전달 방법이 수록된 참고문헌으로는 본 명세서에 참고로 인용된 국제특허 출원 공보 WO99/36544가 있다.
다가 백신은N. meningitidis의 상이한 에피토프(예를 들면,N. meningitidis의 다른 표면 단백질 또는 에피토프)를 발현하는 하나 이상의 미생물로부터 제조될 수 있다. 또한, 다른 병원성 미생물의 에피토프를 백신에 혼입할 수 있다.
바람직한 구현예에서, 본 발명은 본 발명에 따르는 핵산 서열을 발현하는 재조합 백신 바이러스의 구조체에 관한 것이다. 숙주에 도입되는 경우, 상기 재조합 백시니아 바이러스는 면역원성 제제를 발현함으로써 숙주의 CTL 반응을 유도한다. 예를 들면, 본 명세서에 참고로 인용된 미국 특허 4,722,848을 참조할 수 있으며, 상기 특허에는 백시니아 벡터 및 면역화 프로토콜에 유용한 방법이 기재되어 있다.
당업자들은 이상의 내용을 통해 본 발명의 면역원성 제제를 이용한 치료 목적의 투여 또는 면역화에 유용한 다른 여러 벡터들을 쉽게 알 수 있을 것이다.
또 다른 구현예에서, 상기 뉴클레오타이드 서열은 당 기술분야에 공지된 "나출(naked) DNA" 형태의 백신으로 사용될 수 있다. 본 발명의 발현 벡터는 포유류에게 도입될 수 있으며, 본 명세서에 참고로 인용된 Barry, M 등(1995)에 의해Nature, 377:632-635에 제시된 바와 같이 숙주가 면역 반응에 착수한 것에 대해 생체내 폴리펩타이드의 생산을 유발할 수 있다.
검출 키트
본 발명은 또한 생물학적 샘플에서N. meningitidis를 검출하기 위한 키트를 제공한다. 이들 진단 키트는 사용된 테스트 방법의 특성에 따라 상술한 특정 제제를 하나 이상 함유할 것이다. 이런 점에서, 상기 키트는 본 발명에 따르는 폴리펩타이드, 단편, 변이체, 유도체, 항체, 항체 단편 또는 핵산을 하나 이상 포함할 수 있다. 상기 키트는 또한 표지의 검출에 적합한 시약, 양성 및 음성 대조군, 세척액, 희석 완충액 등을 선택적으로 포함할 수 있다. 예를 들면, 핵산-계열 검출 키트는 (ⅰ) 본 발명에 따르는 핵산(양성 대조군으로 사용될 수 있음), (ⅱ) 본 발명에 따르는 올리고뉴클레오타이드 프라이머, 그리고 선택적으로 사용된 핵산 증폭기술에 따르는 DNA 폴리머라제 및 DNA 리가제 등을 포함할 수 있다.
면역 반응성 단편 제조
본 발명은 또한 본 발명에 따르는 폴리펩타이드, 변이체 또는 유도체의 면역 반응성 절편을 동정하는 방법으로 확장된다. 이 방법은 본질적으로 폴리펩타이드, 변이체 또는 유도체의 단편을 제조하는 단계; 상기 단편을 포유류에 투여하는 단계; 및 상기 포유류에서 면역 반응을 검출하는 단계를 포함한다. 이러한 반응은N. meningitidis및/또는 상기 폴리펩타이드, 변이체 또는 유도체를 특이적으로 결합시키는 요소의 생성 및/또는N. meningitidis감염에 대한 보호효과의 생성을 포함한다.
상기 방법에서 면역 반응성에 대한 특정 단편을 테스트하기 전, 다양한 예측 방법을 사용해 특정 단편을 천연 항원과 교차-반응하는 항원을 얻는 데 사용할 수 있는지를 판단할 수 있다. 이러한 예측 방법은 예를 들면 Ausubel 등의 상기 문헌 11.14장에 기술된 바와 같이 아미노-말단 또는 카르복시-말단 서열을 근거로 한다. 대안적으로, 이러한 예측 방법은 본 명세서에 참고로 인용된 Kyte 및 Doolittle(1982, J. Mol. Biol. 157 105) 그리고 Hopp 및 Woods(1983, Mol. Immunol. 20 483)에 제시된 친수성 예측, 또는 본 명세서에 참고로 인용된 Choo 및 Fasman(1978, Ann. Rev. Biochem. 47:251-276)에 의해 제시된 이차 구조의 예측을 근거로 할 수 있다.
또한, "에피토프 지도작성"은 교차-방어효과를 제공하는 능력을 1차 테스트하여 교차-반응성 에피토프를 동정하기 위해 본 발명의 단일 클론성 항체를 사용한다. 이러한 방법의 예는 Coligan 등의 상기 문헌 CURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE에 제시되어 있다.
일반적으로, 10개 내지 15개의 잔기로 구성된 펩타이드 단편이 최적의 결과를 제공한다. 6개 이하 또는 20개 이상의 잔기를 갖는 펩타이드가 성공적으로 달성되었다. 이어서, 이러한 펩타이드 단편은 Ausubel 등의 상기 문헌 11.14 및 11.15 단원에 제시된 키홀 림페트 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin: KLH) 또는 소의 혈청 알부민(bovine serum albumin: BSA)과 같은 담체 분자에 화학적으로 결합될 수 있다.
펩타이드는 예를 들면 본 명세서에 참고로 인용된 Hoogerhout 등의 1995, Infect. Immun. 63 3473에 기재된 바와 같이 합성을 통해 환형화될 수 있음을 이해할 것이다.
상기 펩타이드는 상술한 예에서와 같이 동물의 면역화에 사용될 수 있다. 펩타이드가 선택된 본래 또는 모체 폴리펩타이드에 대한 항체 역가는 예를 들면 Ausubel 등의 상기 문헌의 11.16단원 및 114단원에 기술된 바와 같이 방사면역분석 또는 ELISA에 의해 측정될 수 있다.
이어서, 항체는 당 기술분야에 공지된 암모늄 설페이트 분류 또는 크로마토그래피를 통해 동물의 관련 생물학적 유체로부터 정제할 수 있다. 항체 정체에 대한 프로토콜의 예는 본 명세서에 참고로 인용된 Ausubel 등의 상기 문헌 10.11단원 및 11.13단원에 제시되어 있다.
상기 본래 또는 모체 폴리펩타이드에 대한 항체의 면역 반응성은 예를 들면웨스턴 블롯과 같은 적절한 방법에 의해 측정할 수 있다.
기능적 차단체(functional blocker)
WO99/31132에 제시된 야생형 NhhA/HiaNM 폴리펩타이드는 어드헤신(adhesin) 특성을 갖는 것으로 여겨진다. 사실, 이들은 표면 항원인Haeophlus influenzae의 어드헤신과 다소의 유사성을 갖는다. 보다 구체적으로, 이들 폴리펩타이드는H. influenzae의 Hia 단백질에 대해서는 대략 67%의 상동성이 있으며(Barenkamp, S 및 St. Geme Ⅲ, 1996 Molecular Microbiology 19 1215),H. influenzae의 Hsf 단백질에 대해서는 대략 74%의 상동성이 있다(St. Geme Ⅲ, J. et al, 1996, Journal of Bacteriology 178 6281; 미국특허 제5,646,259호). 이들을 비교하기 위하여, GAP 프로그램을 이용해 3의 갭 중량(gap weight) 및 0.01의 길이 중량(length weight)을 사용했다(Deveraux, 1984, 상기 문헌). 따라서, 상기 폴리펩타이드는N. meningitidis박테리아가 세포에 부착되고 침투하는 것을 방지하기 때문에, 이들 폴리펩타이드의 기능을 저지하면 상당한 치료 효과가 얻어질 것이다. 기능의 저지는 여러 방식으로 달성될 수 있다.
예를 들면, 본 발명의 폴리펩타이드와 상호 작용하는 세포 표면 수용체를 차단하는 화학 시료 또는 폴리펩타이드과 같은 모이어티를 투여할 수 있다. 이들은 수용체 자리에 대해 감염 유기체와 경쟁한다. 이러한 모이어티는 예를 들면 본 발명의 폴리펩타이드, 특히 이들의 단편 또는 기능적 등가체뿐 아니라 모방체(mimetic)를 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용된 "모방체'란 용어는 단백질 또는 펩타이드의 특정 기능성부위를 모방해 고안된 화학물질을 의미한다. 세포 표면에 대한 박테리아의 결합을 차단하는 상기 항체에 대항해 발생되는 항-특수형(anti-idiotypic) 항체도 사용될 수 도 있다. 대안적으로, 본 발명의 폴리펩타이드에서 상기 수용체 결합 자리와 상호 작용하는 모이어티는N. meningitidis에 의한 세포의 감염을 효과적으로 방어할 수 있다. 이러한 모이어티는 차단 항체, 펩타이드 또는 기타 화학 반응물을 포함할 수 있다.
이러한 모든 모이어티, 제약학적으로 허용 가능한 담체와 조합된 제약학적 조성물, 그리고 이러한 모이어티 또는 조성물의 투여에 의한N. meningitidis감염 환자의 치료 방법은 본 발명의 또 다른 양태이다.
본 발명의 폴리펩타이드는 상기 방법에 사용하기 위한 화합물을 선별하는 데 사용될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 폴리펩타이드는 표지와 조합하여 테스트 중에 시료의 존재 하에서 세포 배양물에 노출시킬 수 있다. 이어서, 상기 세포 표면에 대한 표지된 폴리펩타이드의 결합을 억제하는 시료의 능력을 관찰할 수 있다. 이러한 선별에 있어, 표지된 폴리펩타이드는E. coli와 같은 유기체에 직접 사용될 수 있다. 대안적으로,N. meningitidis자체를 폴리펩타이드의 변형된 검출 가능한 형태로 발현되도록 조잘할 수도 있다. 단백질의 3차원 구조는 야생형 박테리아에서 발현되는 것과 매우 유사하기 때문에, 상기 방법에는 조작된N. meningitidis균주를 사용하는 것이 바람직하다.
이하에서는 본 발명의 쉬운 이해 및 실질적인 구현을 돕기 위하여, 특히 바람직한 구현예를 비제한적인 실시예를 통해 설명한다.
실시예 1
NhhA 폴리펩타이드의 불변 부위 및 가변 부위의 동정
본 발명자들은 10종의N. meningitidis균주 사이의 보존 및/또는 비보존 NhhA 아미노산 서열을 밝혀냈다. 비보존 부위는 4개의 가변 부위(V1, V2 V3 및 V4)로 세분되며, 보존 부위는 C1, C2, C3, C4 및 C5(도 1 및 표 1에 나타냄; SEQ ID NO: 1-11)로 세분된다. 해당 뉴클레오타이드 서열 비교를 도 2에 나타내었다(SEQ ID NO: 12-22).
실시예 2
PMC21 NhhA 폴리펩타이드 과대 발현
nhhA유전자가 프로모터에 유효하게 연결된 발현 구조체를 제조함으로써N.meningitidis균주 PMC21의nhhA유전자에 의해 코딩되는 NhhA 단백질을 과대 발현시켰다.
PCR에 의해N. meningitidis균주 PMC21의nhhA핵산의 오픈 리딩 프레임을 증폭하는 데는 다음과 같은 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하였다:
HOMP5': 5'-CAA TTA ACG GCC GAA TAA AAG GAA GCC GATATG AAC AAA ATA TAC CGC ATC-3' (SEQ ID NO 40); NhhA의EagI 제한 자리(밑줄) 및 의 처음 7개 아미노산을 코딩하는 서열(볼드체) 함유
HOMP3'AN: 5'-TGG AATCCA TGG AAT CGC CAC CCT TCC CTT C-3' (SEQ ID NO 41);NcoI 제한 자리(밑줄) 및 균주 ￠3의nhhA오픈 리딩 프레임의 단부 뒤의 서열 48-61 뉴클레오타이드의 역상보체(볼드체) 함유
증폭 산물은 제한 자리를 함유하며, 이 제한 자리는 후속하여EagI 및NcoI 제한 엔도뉴클레아제를 이용해 분해하였다.
서브클로닝에 사용된 플라스미드는N. meningitidis균주 2996의 측면 공격 서열(flanking sequence)과 함께N. meningitidis의 강하게 발현된 클래스 1의 외막 단백질을 코딩하는 유전자의 상류에porA프로모터를 함유하며, Rouppe van der Voort 등에 의해 Infect Immun 1996 64 2745에 기재된 선별 가능한 카라마이신 내성 유전자를 함유하는 pCO14K이었다.
이어서, 분해된 증폭 산물을EagI 및NcoI 제한 엔도뉴클레아제-분해된 pCO14K에 결찰시켰다. 이런 결찰 결과 대다수의porA오픈 리딩 프레임이nhhA증폭 산물로 대체되었다(도 3). 이렇게 하여 SEQ ID NO: 1에 제시된 591개 아미노산의 폴리펩타이드를 코딩하는 재조합 핵산 발현 구조체(SEQ ID NO: 12에 제시된 오픈 리딩 프레임)가 제작되었다.
이것은 강력한porA프로모터의 통제하에 본 발명의nhhA핵산의 발현을 개시한다. 번역은 HOMP5'의 31번 위치에서 시작되는 ATG 코돈에서 시작된다.porA와nhhA사이의 융합 형성을 방지하기 위하여, HOMP5' 서열은 상기 ATG 개시 코돈 앞에 TAA 정지 코돈을 함유한다.
얻어진 플라스미드 pIP52(PMC21)를 제한 분해시켜 선형화하고, 이를 사용해 Janik 등이 1976년에 Journal of Clinical Microbiology 4 71에 제시한 방법을 이용해서N. meningitidis균주 7G2를 형질전환시켰다. 형질전환체를 37℃에서 5% CO2하에 100 ㎍/㎖의 카나마이신을 함유하는 고체 배지 상에서 하룻밤 동안 배양하여 선별하였다. 카나마이신 내성 콜로니를 선별하고, 하룻밤 동안 계대배양한 후, 10% SDS-PAGE 상에서 전기영동을 이용해 전체 세포 단백질을 분리한 뒤, Semi-Dry Blotter(BioRad)를 이용해 니트로셀룰로스 막으로 옮겨 NhhA 폴리펩타이드의 과대-발현을 선별하였다. 이어서, 막을 토끼의 항-NhhA 혈청(국제특허 공보 WO99/31132에 기재됨) 및 알칼리 포스페이타제 접합된 항-토끼 IgG(Sigma)와 함께 순차적으로 배양한 다음, NBT/BCIP(Sigma)를 이용해 비색 검출하였다. 모체 균주에 비해 높은 수준의 NhhA 폴리펩타이드를 발현하는 하나의 클론이 분리되었다(도 11).
컴퓨터 프로그램 SIGCLEAVE(www.angis.org.au 소유의 프로그램 eGCC 스위트 중 일부)을 이용해 예측된 아미노산 서열을 분석한 결과, 처음 51개의 아미노산이절단되어 완숙한 폴리펩타이드(도 14; SEQ ID NO: 33)를 생산하는 것으로 확인되었다.
플라스미드 구조체 pIP52(PMC21)는N. meningitidis의 형질전환-가능한 어떠한 균주로도 형질전환될 수 있다.
실시예 3
H41 NhhA 폴리펩타이드 과대 발현
실시예 2에서와 동일한 방법을 이용해N. meningitidis균주 H41의nhhA유전자에 의해 코딩되는 NhhA 단백질을 과대 발현시켰다. 이렇게 하여 SEQ ID NO: 2에 제시된 591개 아미노산의 폴리펩타이드를 코딩하는 재조합 핵산 발현 구조체(SEQ ID NO: 13에 제시된 오픈 리딩 프레임)가 제작되었다. 본 실시예에서는 얻어진 플라스미드 pIP52(H41)를 선형화하고,N. meningitidis균주 7G2에 형질전환시켰다. 카나마이신 내성 콜로니를 분석하고, 웨스턴 면역블롯을 이용해 NhhA의 과대 발현을 조사했다(도 11). 컴퓨터 프로그램 SIGCLEAVE (www.angis.org.au 소유의 프로그램 eGCC 스위트 중 일부)을 이용해 예측된 아미노산 서열을 분석한 결과 처음 51개의 아미노산이 절단되어 완숙한 폴리펩타이드(도 14; SEQ ID NO: 34)를 생산하는 것으로 확인되었다.
이 방법은 다른N. meningitidis의 야생형nhhA서열을 함유하는 발현 구조체를 제작하는 데도 사용될 수 있다.
실시예 4
간편한 제한 자리를 이용한 NhhA 결실 돌연변이체 제작
참조의 용이성을 위하여, 균주 PMC21의nhhA핵산에 의해 코딩되는 NhhA 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 1에 제시하였다. 본 발명자들은 균주들 사이에서 가장 가변적인 부위가 결실된 야생형 PMC21nhhA의 결실 돌연변이체를 제작하였다. 다음과 같은 프라이머를 이용해nhhA로부터 PCR 증폭하여 야생형 PMC21 NhhA 폴리펩타이드의 아미노산 1-54를 코딩하는 증폭 산물을 제조하였다:
HOMP5': 5'-CAA TTA ACG GCC GAA TAA AAG GAA GCC GAT ATG AAC AAA ATA TAC CGC ATC-3'(SEQ ID NO 40); 과대 발현 구조체 pIP52의 제작에 사용된 것과 동일한 올리고뉴클레오타이드
NH3'BG: 5-GGT CAG ATC TGT TTC ATT GTT AGC ACT TGC-3(SEQ ID NO 42);BglⅡ 제한 자리(밑줄) 및 PMC21 NhhA의 아미노산 134(이중 밑줄)와 49-54(볼드체)를 코딩하는 서열의 역상보체 함유.
얻어진 증폭 산물은EagI 및BglⅡ 제한 엔도뉴클레아제 자리를 포함한다. pIP52(PMC21)는nhhA오픈 리딩 프레임(ORF)의 개시 자리 상류에 하나의EagI 자리 20bp 및 상기 ORF 내에 위치하는 하나의BglⅡ 자리를 포함한다. 따라서, pIP52(PMC21) 및 증폭 산물은EagI 및BglⅡ를 이용해 제한 엔도뉴클레아제 분해하고, 결찰시켜 유력한 DH5α 균주E. coli박테리아에 형질전환시켰다. 그 결과, pIP52(PMC21)의EagI/BglⅡ 단편이 상기 PCR 산물로 대체되었다. 이렇게 하여 도 5에 제시된 512개 아미노산의 폴리펩타이드(SEQ ID NO: 23)를 코딩하는 재조합 핵산 발현 구조체(SEQ ID NO: 28에 제시된 오픈 리딩 프레임)가 제작되었다. 이 아미노산 서열은 상기 야생형 서열의 아미노산 1-54 및 134-592를 포함하며, 따라서야생형 PMC21 NhhA 폴리펩타이드의 V1 부위의 대부분, V2 및 C2 부분의 모두, 그리고 C3 부분의 일부가 결실되어 있다.
이 플라스미드를 제한 분해에 의해 선형화하고,N. meningitidis균주 7G2으로 형질전환시켰다. 실시예 1에 기재된 것과 동일한 방법을 이용해, 절단된 PMC21 NhhA를 과대 발현하는 하나의 클론을 분리하였다(도 11).
컴퓨터 프로그램 SIGCLEAVE(www.angis.org.au 소유의 프로그램 eGCC 스위트 중 일부)을 이용해 예측된 아미노산 서열을 분석한 결과, 처음 51개의 아미노산이 절단되어 완숙한 폴리펩타이드(도 14; SEQ ID NO: 35)를 생산하는 것으로 확인되었다. 절단 가능한 신호 서열의 존재 및 과대 발현 단백질의 동일성을 확인하기 위하여, 세제 사코실(sarkosyl)에 불용성인 분획을 분리하여 외막 단백질을 반정제하였다.
분리된 막 단백질을 전기영동을 통해 분류하고 나일론 막으로 옮겼다. 과대 발현된 단백질 부분은 쿠마시 염색에 의해 드러났다. 막의 이 부위을 절제하고 단백질의 N-말단을 시퀀싱하였다. 이 단백질의 처음 11개의 아미노산은 XXETDLTSVGT이었고, 이는 본 실시예에 정의된 과대 발현 구조체에 의해 발현되는 아미노산 서열의 52번에서 62번 아미노산 잔기(포괄적)에 해당한다.
이것은 상기 폴리뉴클레오타이드 서열 내에 존재하는 제한 자리를 이용한 결실의 예이다. 이 구조체는 어떠한 형질전환 가능한N. meningitidis에도 형질전환될 수 있다.
실시예 5
간편한 제한 자리를 이용한 NhhA 결실 돌연변이체 제작
H41의 야생형nhhA서열을 함유하는 발현 구조체를 실시예 2에서와 같이 제작하였다. 얻어진 발현 구조체를 pIP52(H41)라 칭하였다. 본 실시예에 개괄적으로 설명된 방법을 이용해 결실 돌연변이를 만들었다. 여기에 사용된 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 다음과 같다:
HOMP5': 5'-CAA TTA ACG GCC GAA TAA AAG GAA GCC GAT ATG AAC AAA ATA TAC CGC ATC-3' (SEQ ID NO:40); 과대 발현 구조체 pIP52의 제작에 사용된 것과 동일한 올리고뉴클레오타이드
NH3'STU: 5'-GAT CAG GCC TGT ATC TTC ATC GGT AGC ATT-3' (SEQ ID NO 43);StuI 제한 자리(밑줄) 및 야생형 H41 NhhA의 아미노산 134(이중 밑줄)와 49-54(볼드체)를 코딩하는 서열의 역상보체 함유.
얻어진 증폭 산물은EagI 및StuI 제한 엔도뉴클레아제 자리를 포함한다. 발현 구조체 pIP52(H41)는 이들 제한 자리를 함유한다. 따라서, pIP52(H41) 및 증폭 산물은EagI 및StuI를 이용해 제한 엔도뉴클레아제 분해를 수행하고, 결찰시켜 유력한 DH5α 균주E. coli박테리아로 형질전환시켰다. 이러한 결찰의 결과, pIP52(H41)의EagI/StuI 단편이 상기 PCR 산물로 대체되었다. 이렇게 하여 도 6 및 SEQ ID NO: 24에 제시된 513개 아미노산의 폴리펩타이드를 코딩하는 재조합 핵산 발현 구조체(도 6 및 SEQ ID NO: 29에 제시된 오픈 리딩 프레임)가 제작되었다. 이 아미노산 서열은 상기 야생형 서열의 아미노산 1-54 및 134-592를 포함하며, 따라서 야생형 H41 폴리펩타이드의 V1 부위의 대부분, V2 및 C2 부분의 모두, 그리고C3 부분의 일부가 결실되어 있다.
이 플라스미드를 제한 분해에 의해 선형화하고,N. meningitidis균주 7G2로 형질전환시켰다. 실시예 1에 기재된 것과 동일한 방법을 이용해, 절단된 H41 NhhA를 과대 발현하는 하나의 클론을 분리하였다(도 11).
컴퓨터 프로그램 SIGCLEAVE(www.angis.org.au 소유의 프로그램 eGCC 스위트 중 일부)을 이용해 예측된 아미노산 서열을 분석한 결과, 처음 51개의 아미노산이 절단되어 완숙한 폴리펩타이드(도 14; SEQ ID NO: 36)를 생산하는 것으로 확인되었다.
이 구조체는 형질전환 가능한 어떠한N. meningitidis에도 형질전환될 수 있다.
실시예 6
스플라이스-중첩 PCR을 이용한 NhhA 결실 돌연변이체 제작
NhhA를 코딩하는 뉴클레오타이드로부터 가변 부위를 결실시키기 위하여 간편한 제한 자리를 이용하는 것 이외에도, 돌연변이체는 Ho 등에 의해 1989년에 상기 문헌에서 설명되고 Horton R.M 등에 의해 1989년에 상기 문헌에서 설명된 "스플라이스 중첩 발현" PCR을 이용해서 제작할 수 있다. 이 방식으로는 불변 부위는 코딩하지만 가변 부위는 결실된 폴리뉴클레오타이드를 제작할 수 있다(도 5A, 5B 및 5C 참조).
본 실시예에서는 C1 및 C5 부위는 함유하고 다른 부위들은 결실된 구조제가 만들어졌다.
PCR 반응에 다음과 같은 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용해 균주 PMC21의 염색체 DNA로부터 C1 부위(도 1 참조)에 해당하는 DNA 단편을 증폭하였다:
HOMP5': 5'-CAA TTA ACG GCC GAA TAA AAG GAA GCC GAT ATG AAC AAA ATA TAC CGC ATC-3'(SEQ ID NO:40); 과대 발현 구조체 pIP52(PMC21)의 제작에 사용된 것과 동일한 올리고뉴클레오타이드
SO-C: 5'-GAC GAA ATC AAC GTT CTT AGC ACT TGC CTG AAC CGT TGC-3'(SEQ ID NO 44); 균주 PMC21의 야생형 NhhA의 C5 부위의 처음 아미노산 237-241(밑줄) 및 C1 부위의 말단 아미노산 45-52(볼드체)를 코딩하는 서열의 역상보체.
이 반응의 증폭 산물은 HOMP5'/SO-C이다.
PCR 반응에 다음과 같은 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용해 균주 PMC21의 염색체 DNA로부터 C5 부위를 증폭하였다:
SO-D: 5'-AAC GTT GAT TTC GTCCGC ACT TAC-3'(SEQ ID NO 45); C5의 처음 아미노산 237-244(밑줄로 표시된 것은 프라이머 SO-C의 역상보체)
HO3'AN: 5'-TGG AAT CCA TGG AAT CGC CAC CCT TCC CTT C-3'(SEQ ID NO 41); pIP52의 제작에 사용된 것과 동일한 올리고뉴클레오타이드 프라이머.
이 반응의 증폭 산물은 SO-D/HO3'AN이다.
증폭 산물 HOMP5'/SO-C 및/또는 SO-D/HO3'AN을 아가로스 겔로부터 정제한 뒤, 전기영동으로 분류하고 혼합하여 프라이머 HOMP5' 및 HO3'AN을 이용해 추가 증폭하였다. 얻어진 증폭 산물은 PMC21의 야생형 NhhA 의 아미노산 1-52 및 337-591을 코딩한다. 이 증폭 산물을EagI 및StuI를 이용해 제한 분해하고, 실시예 1에기재된 pCO14K로 클로닝하였다. 이 재조합 분자는 C1 및 C5 부위를 함유하므로, V1 내지 V4 및 C2 내지 C4 부위는 결실되어 있다. 오픈 리딩 프레임의 뉴클레오타이드 서열은 도 7 및 SEQ ID NO: 30에 제시되어 있고, 이 뉴클레오타이드 서열로부터 유래된 예측 폴리펩타이드 서열은 도 7 및 SEQ ID NO: 25에 제시되어 있다.
이 플라스미드를 제한 분해에 의해 선형화하고,N. meningitidis균주 7G2로 형질전환시켰다. 실시예 2에 기재한 것과 동일한 방법을 이용해 절단된 PMC21 NhhA를 과대 발현하는 하나의 클론을 분리하였다.
컴퓨터 프로그램 SIGCLEAVE(www.angis.org.au 소유의 프로그램 eGCC 스위트 중 일부)을 이용해 예측된 아미노산 서열을 분석한 결과 처음 51개의 아미노산이 절단되어 완숙한 폴리펩타이드(도 14; SEQ ID NO: 37)를 생산하는 것으로 확인되었다.
이 구조체는 형질전환 가능한 어떠한N. meningitidis에도 형질전환될 수 있다.
실시예 7
스플라이스-중첩 PCR을 이용한 NhhA 결실 돌연변이체 제작
NhhA의 다양한 부위를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오타이드의 제작에도 유사한 방식이 사용될 수 있음을 이해할 것이다. 다음과 같은 방식으로 C1, C4, V4 및 C5 부위을 포함하는 구조체를 만들 수 있다(도 5B 참조).
C1 부위는 하기의 올리고뉴클레오타이드를 이용해 증폭하였다:
HOMP5': 5'-CAA TTA ACG GCC GAA TAA AAG GAA GCC GAT ATG AAC AAA ATA TACCGC ATC-3'(SEQ ID NO:40),
SO-E: 5'-AAC GCT TGC CGC ACG CTT AGC ACT TGC CTG CAA CGT TGC-3'(SEQ ID NO 46); 균주 PMC21의 C4 부위의 처음 아미노산 211-215(밑줄) 및 C1 부위의 단부(볼드체)를 코딩하는 서열의 역상보체를 코딩함.
이 반응의 증폭 산물은 HOMP5'/SO-E이다.
PCR 반응에 다음과 같은 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용해 균주 PMC21의 염색체 DNA로부터 C4-V4-C5 부위를 증폭하였다:
SO-F: 5'-CGT GCG GCA AGC GTTAAA GAC GTA-3'(SEQ ID NO 47); C4의 처음 아미노산 211-218(밀줄로 표시된 부분은 프라이머 SO-E의 역상보체),
HO3'AN: 5'-TGG AAT CCA TGG AAT CGC CAC CCT TCC CTT C-3'(SEQ ID NO: 41); pIP52의 구조체에 사용된 동일한 프라이머.
이 반응의 증폭 산물은 SO-F/HOMP3'이다.
증폭 산물 HOMP5'/SO-E 및/또는 SO-D/HO3'AN을 아가로스 겔로부터 정제한 뒤, 전기영동으로 분류하고 혼합하여 프라이머 HOMP5' 및 HO3'AN을 이용해 추가 증폭하였다. 얻어진 증폭 산물은 PMC21의 야생형 NhhA 의 아미노산 1-52 및 211-591을 코딩한다. 이 증폭 산물을EagI 및NcoI을 이용해 제한 분해하고, pCO14K로 클로닝하였다. 이 재조합 분자는 C1, C4, V4 및 C5 부위를 함유하므로, V1-3 내지 C2-3 부위는 결실되어 있다. 오픈 리딩 프레임의 뉴클레오타이드 서열은 도 8 및 SEQ ID NO: 31에 제시되어 있고, 이 뉴클레오타이드 서열로부터 유래된 예측 폴리펩타이드 서열은 도 8 및 SEQ ID NO: 26에 제시되어 있다. 컴퓨터 프로그램SIGCLEAVE(www.angis.org.au 소유의 프로그램 eGCC 스위트 중 일부)을 이용해 예측된 아미노산 서열을 분석한 결과 처음 51개의 아미노산이 절단되어 완숙한 폴리펩타이드(도 14; SEQ ID NO: 38)를 생산하는 것으로 확인되었다.
이 구조체는 형질전환 가능한 어떠한N. meningitidis에도 형질전환될 수 있다.
실시예 8
스플라이스-중첩 PCR을 이용한 NhhA 결실 돌연변이체 제작
NhhA의 다양한 부위를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오타이드의 제작에도 유사한 방식이 사용될 수 있음을 이해할 것이다. 다음과 같은 방식으로 C1, C2, C3, C4 및 C5 부위을 포함하는 구조체를 만들 수 있다(도 5C 참조).
C1 및 C2 부위는 하기의 올리고뉴클레오타이드를 이용해 증폭될 것이다:
HOMP5': 5'-CAA TTA ACG GCC GAA TAA AAG GAA GCC GAT ATG AAC AAA ATA TAC CGC ATC-3'(SEQ ID NO 40),
SO-G: 5'-CAG CGA GTA GGT GAA TTG TTT GAT TTT CAG GTT GTC GCC GGC TTT GAG GGT GTT AGC ACT TGC CTG AAC CGT-3'(SEQ ID NO 48); 균주 PMC21의 C1 부위의 처음 아미노산 125-129(밑줄), C2 부위의 모든 아미노산(아미노산 109-120, 볼드체 및 밑줄), 그리고 C1 부위의 단부(아미노산 46-52)의 역상보체를 코딩함.
이 반응의 증폭 산물은 HOMP5'/SO-G이다.
C3 및 C4 부위는 다음과 같은 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용해 증폭될 것이다:
SO-H: 5'-TTC ACC TAC TCG CTGAAA AAA GAC-3'(SEQ ID NO 49); C3의 처음 아미노산 125-132를 코딩(밑줄로 표시된 부분은 프라이머 SO-G의 역상보체),
SO-I: 5'-GCC AGC GTT TAA TAC GTC TTT AAC GCT TGC CGC ACG ATC GGT CAA AGT CGA ACC AAT-3'(SEQ ID NO 50); C3의 단부 아미노산 182-88(밑줄) 및 C4의 아미노산 211-222(볼드체)의 역상보체를 코딩.
이 반응의 증폭 산물은 SO-H/SO-I이다.
증폭 산물 HOMP5'/SO-G 및/또는 SO-H/SO-I를 아가로스 겔로부터 정제한 뒤, 전기영동으로 분류하고 혼합하여 프라이머 HOMP5' 및 SO-I를 이용해 추가 증폭하여, 아미노산 1-52, 103-114, 125-188 및 211-222, 즉 C1 부위, C2 부위, C3 부위 및 C4 부위의 일부를 코딩하는 산물을 얻었다. 이 반응의 증폭 산물은 HOMP5'/SO-I이다.
C5 부위 및 C4 부위의 일부는 하기의 올리고뉴클레오타이드를 이용해 증폭될 것이다:
SO-J: 5'- GTA TTA AAC GCT GGC TGG AAC ATT AAA GGC GTT AAA AAC GTT GAT TTC GTC CGC ACT-3'(SEQ ID NO 51); 균주 PMC21의 야생형 NhhA의 C4 부위의 아미노산 218-229(밑줄) 및 C5 부위의 아미노산 237-243(볼드체)(밑줄 친 볼드체는 SO-I의 역상보체를 나타냄),
HO3'AN: 5'-TGG AAT CCA TGG AAT CGC CAC CCT TCC CTT C-3'(SEQ ID NO:41).
이 반응의 증폭 산물은 SO-J/HO3'AN이다.
증폭 산물 HOMP5'/SO-I 및/또는 SO-J/HO3'AN을 아가로스 겔로부터 정제한뒤, 전기영동으로 분류하고 혼합하여 프라이머 HOMP5' 및 HO3'AN을 이용해 추가 증폭하였다. 얻어진 증폭 산물은 PMC21의 야생형 NhhA의 아미노산 1-52, 103-114, 125-188, 211-229 및 237-591을 코딩한다. 얻어진 산물을EagI 및NcoI을 이용해 제한 분해하고, pCO14K로 클로닝하였다. 이 재조합 분자는 C1, C2, C3, C4 및 C5 부위를 함유하므로, V1, V2 V3 및 V4 부위는 결실되어 있다. 오픈 리딩 프레임의 뉴클레오타이드 서열은 도 9 및 SEQ ID NO: 32에 제시되어 있고, 이 뉴클레오타이드 서열로부터 유래된 예측 폴리펩타이드 서열은 도 9 및 SEQ ID NO: 27에 제시되어 있다. 컴퓨터 프로그램 SIGCLEAVE(www.angis.org.au 소유의 프로그램 eGCC 스위트 중 일부)을 이용해 예측된 아미노산 서열을 분석한 결과 처음 49개의 아미노산이 절단되어 완숙한 폴리펩타이드(도 14; SEQ ID NO: 39)를 생산하는 것으로 확인되었다.
이 구조체는 형질전환 가능한 어떠한N. meningitidis에도 형질전환될 수 있다.
실시예 9
과대 발현된 NhhA 폴리펩타이드의 정제
상기 실시예들에 기재된 재조합 NhhA 폴리펩타이드는 다음과 같은 절차로 분리하였다. 박테리아를 5% CO2대기 하의 37℃에서 하룻밤(12-14시간) 동안 배양하였다. (본 실시예에서, 배지는 Leventhal 염기가 강화된 BHI 아가이었다. 그 밖의 성장 배지는 당 기술분야에 공지된 것들이다.) 25 ㎖의 아가 플레이트로부터박테리아를 수집하고, HCl를 이용해 pH 8로 조절된 10 mM 트리스 25 ㎖ 중에 현탁하였다. 2%의 사코실을 함유하는 동일 부피의 10 mM 트리스(pH 8.0)를 첨가하고, 혼합물을 4℃에서 1시간 동안 혼합하였다. 이것을 20℃에서 70분간 100,000 x g로 원심분리하고 상청액을 제거하였다. 펠릿을 25 게이지의 니들을 통과시켜 1%의 사코실을 함유하는 10 mM 트리스(pH 8.0) 25 ㎖ 중에 재현탁하였다. 이것을 20℃에서 70분간 100,000 x g로 원심분리하고 상청액을 제거하였다. 펠릿을 25 게이지의 니들을 통과시켜 10 mM 트리스(pH 8.0) 10 ㎖ 중에 재현탁하였다. 이 분획은 세포의 사코실 불용성 성분을 함유하며, 외막 단백질이 풍부하다. (예를 들면, 4℃에서 10 mM 트리스ㆍHCl(pH 8.0) 또는 PBS(포스페이트 완충 염수) 100-1000 부피 중에서 단백질을 4-8시간 동안 4회 투석하여 잔류하는 사코실 세제를 제거하는 추가의 단계를 도입할 수 있다.)
280 nm의 파장에서 흡광도를 측정하거나, BCA 키트(Pierce), 1% SDS(소듐 라이릴 설페이트)를 이용해 현탁액 중의 단백질 농도를 측정함으로써, 2% β-머켑토에탄올을 함유하는 용액 중에 단백질 10 mg을 함유하는 용액 약 1 ㎖를 BioRad Mni-Protean Ⅱ 장치 내의 1.5 mm 두께의 6% SDS-PAGE 상에서 분류하였다. BioRad "mini Whol gel Eluter"를 이용해 겔로부터 고분자량의 NhhA를 용리시켰다. 용리된 각각의 분획 중 대략 10%를 SDS-PAGE로 분류한 뒤 쿠마시 염색하였다. 본질적으로 다른 단백질을 함유하지 않는 NhhA를 함유하는 분획들을 혼합하였다. 이런 절차를 수행해 실시예 2에서 과대 발현된 완숙한 NhhA(SEQ ID NO: 1), 실시예 4에서 과대 발현된BglⅡ 결실 완숙한 NhhA(SEQ ID NO: 23) 및 실시예 6에서 과대 발현된 NhhA 결실 돌연변이체(SEQ ID NO: 25)를 분리하였다. 분리된 단백질은 도 12에 나타내었다.
실시예 10
정제된 NhhA 결실 돌연변이 폴리펩타이드의 면역화
상기 실시예들에 제시된 바와 같은 정제된 야생형 NhhA 폴리펩타이드 및 결실 돌연변이체를 마우스에게 접종하였다. 제1 그룹의 Balb/C 마우스 각각에게는 MPL + TDM™ 아쥬번트(Sigma-Aldrich사 제품)와 함께 PMC21 NhhA를 당일에 대략 130 ㎍을 접종하고 14일째에 115 ㎍을 접종하였다. 제2 그룹의 마우스 각각에게는 MPL + TDM™ 아쥬번트(Sigma-Aldrich사 제품)와 함께 단백질을 당일에 대략 120 ㎍을 접종하고 14일째에 190 ㎍을 접종하였다. 제3 그룹의 마우스 각각에게는 MPL + TDM™ 아쥬번트(Sigma-Aldrich사 제품)와 함께 단백질을 당일에 대략 260 ㎍을 접종하고 14일째에 1240 ㎍을 접종하였다. 21일째에 혈액 샘플을 채취하고 혈청을 추출하였다. 이들 혈청을 웨스턴 면역블롯을 통해 전체 길이의 PMC21 NhhA를 인식하는 항체의 존재에 대해 테스트하였다(도 13). BioRad Mini Protean Ⅱ 전기영동 장치를 이용한 65 SDS-PAGE에 의해 (PMC21 NhhA를 과대 발현하는) P6 및 (NhhA 발현이 폐쇄된) 균주 2A의 OMC 제제(5 mg)를 분리하였다. 단백질을 전기영동을 통해 니트로셀룰로스로 옮기고, 3 mm 절편으로 절단한 뒤, PBS 중의 5% 탈지 분유로 1:1000 및 1:10000배 희석하고 니트로셀룰로스 절편과 함께 배양하였다. 알칼리-포스페이트 접합된 항-마우스 IgG(Sigma)를 이용해 항체 결합을 검출한 뒤, NBT/BCIP(Sigma)를 이용해 비색 검출하였다. 도 13에서 알 수 있듯이, NhhA 결실돌연변이체 또는 전체 길이의 완숙한 NhhA 폴리펩타이드의 접종에 의해 전체 길이의 PMC21 NhhA 폴리펩타이드에 대한 면역 반응을 유도할 수 있다.
실시예 11
E. coli 내에서의 결실 돌연변이 폴리펩타이드의 발현
N. meningitidis내에서 본 발명의 돌연변이 폴리펩타이드를 발현시키는 것 외에도, 이들 폴리펩타이드는E. coli박테리아 내에서도 발현될 수 있다. 실시예 4-8의 재조합nhhA결실 돌연변이 중 어느 것이라도 PCR 증폭용 주형으로 사용될 수 있다. 사용된 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 국제특허 공보 WO99/31132(동 문헌의 SEQ ID NO: 24 및 SEQ ID NO: 25)에 수록된 것일 수 있다. 증폭 산물은BamHI/HindⅢ 효소를 이용해 제한 분해하고,BamHI/HindⅢ 제한 분해 플라스미드 pMALC2(New England BioLabs)와 결찰시킨 뒤, 얻어진 플라미미드를E. coli균주 DH5α로 형질전환시킬 수 있다. 얻어진 균주는 pMALC2 제조자의 지침에 따른 조건을 이용해 재조합 단백질을 높은 수준으로 발현하도록 유도될 수 있다. 얻어진 재조합 단백질은 말토스 결합 단백질과 본 발명의 결실 돌연변이 NhhA 폴리펩타이드의 융합체이다. 이것을 SDS-PAGE 상에서 분리하여 반정제한 뒤, Mini-Gel Electro-eluter(BioRad)를 이용해 제조자의 지침에 따라 용리시킬 수 있다. 이어서, 반정제된 용합 단백질을 PBS에 대해 투석한 뒤, 프로테아제 효소 인자 Xa로 분해하여 재조합 NhhA 단백질로부터 말토스 결합 단백질 모이어티를 절단할 수 있다. 재조합 NhhA 단백질은 예를 들면, R.K. Scopes에 의해 ProteinPurification(Springer-Verlag, New York, Ny USA, 1993)에 제시된 표준 방법에 따라 정제할 수 있다.
본 명세서는 전반에 걸쳐 본 발명을 어떠한 하나의 구현예 또는 특정한 특징의 집합으로 제한하지 않고 본 발명의 바람직한 구현예를 설명하는 것을 목적으로 하였다. 따라서, 당업자라면 예시된 특정 구현예들이 본 발명의 범위를 벗어나지 않으면서 본 명세서에 비추어 다양하게 변형 및 변화될 수 있음을 이해할 것이다.
본 명세서에서 참조된 컴퓨터 프로그램, 알고리즘, 특허 및 특정 문헌들 모두는 본 명세서에 참고로 인용되었다.
[ 표 1 ]
[ 표 2 ]
Claims (25)
- 야생형 NhhA 폴리펩타이드를 제외한 NhhA 폴리펩타이드의 12개 이상의 연속된 보존 아미노산을 포함하는 분리 단백질.
- 제1항에 있어서,면역 반응을 유도할 수 있는 분리 단백질.
- 제2항에 있어서,상기 면역 반응이 대응하는 상기 NhhA 폴리펩타이드에 의해 유도되는 것보다 균주-특이성이 작은 분리 단백질.
- 제3항에 있어서,상기 면역 반응이 하나 이상의N. meningitidis균주에 대해 방어효과를 제공하는 분리 단백질.
- 제3항에 있어서,상기 면역 반응이 다수의N. meningitidis균주에 대해 방어효과를 제공하는 분리 단백질.
- 제1항에 있어서,20개 이상의 연속된 보존 아미노산을 포함하는 분리 단백질.
- 제6항에 있어서,50개 이상의 연속된 보존 아미노산을 포함하는 분리 단백질.
- 제7항에 있어서,100개 이상의 연속된 보존 아미노산을 포함하는 분리 단백질.
- 제1항에 있어서,상기 NhhA 폴리펩타이드가 SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 9; 및 SEQ ID NO: 10으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 분리 단백질.
- (i) SEQ ID NO: 11의 잔기 1 내지 50;(ⅱ) SEQ ID NO: 11의 잔기 109 내지 120;(ⅲ) SEQ ID NO: 11의 잔기 135 내지 198;(ⅳ) SEQ ID NO: 11의 잔기 221 내지 239; 및(ⅴ) SEQ ID NO: 11의 잔기 249 내지 604으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 분리 단백질로서, 상기 분리 단백질이 야생형 NhhA 폴리펩타이드가 아닌 분리 단백질.
- 제10항에 있어서,상기 분리 단백질이 하기 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 분리 단백질:(i) SEQ ID NO: 1의 잔기 1 내지 50;(ⅱ) SEQ ID NO: 2의 잔기 1 내지 50;(ⅲ) SEQ ID NO: 3의 잔기 1 내지 50;(ⅶ) SEQ ID NO: 4의 잔기 1 내지 50;(ⅷ) SEQ ID NO: 5의 잔기 1 내지 50;(ⅸ) SEQ ID NO: 6의 잔기 1 내지 50;(x) SEQ ID NO: 7의 잔기 1 내지 50;(xi) SEQ ID NO: 8의 잔기 1 내지 50;(xⅱ) SEQ ID NO: 9의 잔기 1 내지 50;(xⅲ) SEQ ID NO: 10의 잔기 1 내지 50;(xⅳ) SEQ ID NO: 1의 잔기 125 내지 188;(xv) SEQ ID NO: 2의 잔기 125 내지 188;(xⅵ) SEQ ID NO: 3의 잔기 122 내지 185;(xⅶ) SEQ ID NO: 4의 잔기 127 내지 190;(xⅷ) SEQ ID NO: 5의 잔기 125 내지 188;(xix) SEQ ID NO: 6의 잔기 132 내지 195;(xx) SEQ ID NO: 7의 잔기 131 내지 194;(xxi) SEQ ID NO: 8의 잔기 131 내지 194;(xxⅱ) SEQ ID NO: 9의 잔기 127 내지 190;(xxⅲ) SEQ ID NO: 10의 잔기 125 내지 188;(xxⅳ) SEQ ID NO: 1의 잔기 211 내지 229;(xxv) SEQ ID NO: 3의 잔기 206 내지 224;(xxⅵ) SEQ ID NO: 1의 잔기 237 내지 591;(xxⅶ) SEQ ID NO: 2의 잔기 237 내지 592;(xxⅷ) SEQ ID NO: 3의 잔기 235 내지 589;(xxⅸ) SEQ ID NO: 4의 잔기 239 내지 594;(xxx) SEQ ID NO: 5의 잔기 237 내지 591;(xxxi) SEQ ID NO: 6의 잔기 244 내지 599;(xxxⅱ) SEQ ID NO: 7의 잔기 243 내지 598;(xxxⅲ) SEQ ID NO: 8의 잔기 243 내지 598;(xxxⅳ) SEQ ID NO: 9의 잔기 239 내지 594; 및(xxxv) SEQ ID NO: 10의 잔기 237 내지 592;
- 제10항에 있어서,NhhA 폴리펩타이드의 가변(V) 부위 아미노산을 하나 이상 추가로 포함하는 분리 단백질.
- 제11항에 있어서,SEQ ID NO: 23; SEQ ID NO: 24; SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 26; SEQ ID NO: 27; SEQ ID NO: 33; SEQ ID NO: 34; SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 36; SEQ ID NO: 37; SEQ ID NO: 38; 및 SEQ ID NO: 39로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 분리 단백질.
- 제10항의 분리 단백질의 대립형질 변이체.
- 제10항의 분리 단백질의 단편 또는 유도체.
- 제14항에 있어서,면역원성인 단편.
- 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따르는 분리 단백질을 하나 이상 포함하는 제약학적 조성물.
- 제17항에 있어서,백신인 제약학적 조성물.
- 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 분리 단백질을 코딩하는 분리 핵산.
- 제19항에 있어서,(i) SEQ ID NO: 22의 잔기 1 내지 150;(ⅱ) SEQ ID NO: 22의 잔기 325 내지 361;(ⅲ) SEQ ID NO: 22의 잔기 403 내지 595;(ⅳ) SEQ ID NO: 22의 잔기 661 내지 717; 및(ⅴ) SEQ ID NO: 22의 잔기 745 내지 1815으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 분리 핵산.
- 제20항에 있어서,SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 29; SEQ ID NO: 30; SEQ ID NO: 31; 및 SEQ ID NO: 32로 이루어지는 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 분리 핵산.
- 제20항 또는 제21항의 분리 핵산을 포함하는 발현 벡터.
- 제22항의 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포.
- 제23항에 있어서,박테리아인 숙주 세포.
- 제24항에 있어서,Neisseria meningitidis인 숙주 세포.
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