CZ20022482A3

CZ20022482A3 - Proteiny obsahující konzervované oblasti povrchového antigenu NhhA Neisseria meningitidis

Info

Publication number: CZ20022482A3
Application number: CZ20022482A
Authority: CZ
Inventors: Ian Richard Anselm Peak; Michael Paul Jennings
Original assignee: The University Of Queensland
Priority date: 2000-01-25
Filing date: 2001-01-25
Publication date: 2003-01-15
Also published as: CZ304379B6; JP2012051902A; KR100698561B1; PL356819A1; BR0107857A; US20090068216A1; NO20023487D0; EP2395013A3; NZ520445A; EP1252182A1; US8367070B2; EP1252182A4; NO332229B1; KR20020065938A; HUP0300696A2; US20020160016A1; CN1419564A; JP2014024849A; ES2389719T3; JP2003523208A

Description

Proteiny obsahující konzervované oblasti povrchového antigenu NhhA z Neisseria meningitidis

Oblast techniky

Tento vynález popisuje nové proteiny, které tvoří modifikované formy povrchového antigenu Neisseria meningitidis, nukleové kyseliny kódující tyto nové peptidy a polypeptidy a jejich použití v diagnostikách, terapeutických a proťylaktických vakcínách a ve vytváření a/nebo testování léčiv. Konkrétněji, modifikované povrchové antigeny vynálezu s delecerni nekonzervovaných aminokyselin mohou být užitečné ve vakcínách, které účinně imuniztjí proti širšímu spektru kmenů N. meningitidis, než by se očekávalo od odpovídajícího povrchového antigenu přirozeně se vyskytujícího typu.

Dosavadní stav techniky ' 1

Neisseria meningitidis je Gram negativní bakterie a agens způsobující meningokokálrí meningitidu a septikémii. Jejím jediným známým hostitelem je člověk a může být bez příznaků přenášena přibližně 10 % populace (Caugant et al, 1994, Journal of Clinical i Microbiology 32 323).

N. meningitidis může vytvářet polysacharidovou kapsuli a to umožňuje klasifikaci tétc bakterie podle podstaty vytvářené kapsule. Existuje nejméně dvanáct sérologických skupin N · meningitidis: A, B, C, 29-E, Η, I, K, L, W135, X, Y a Z, z nichž sérologické skupiny A, B, a l

C způsobují 90 % meningokokálního onemocnění (Poolman et al, 1995, Infectious Agents i and Disease 4 13). Vakcíny proti sérologickým skupinám A a C jsou dostupné, ale i polysacharid kapsuly sérologické skupiny B je špatně imunogenní a neindukuje ochranu u | lidí. j

I

Proto jsou zkoumány jiné membránové a extracelulámí komponenty pro jejich !^!vhodnost zahrnutí do vakcín. Příklady zahrnují vnější membránové proteiny tříd 1, 2 a 3 i (porin; kódovaný genypof) a třídy 4 (Rmp) a 5 (proteiny opacity; kódované geny opa a ope). i.

Přesto dodnes žádný z těchto kandidátů není schopný indukovat kompletní ochranu, i;

zvláště u dětí (Romero et al., 1994, Clinical Microbiology Review, 7 559; Poolman et al., )ΐ 1995, viz výše). · !

I

: 2Pro vytvoření účinné vakcíny je nutné identifikovat složky N. meningitidis, které jsou přítomny ve většině kmenů a které jsou schopné indukovat ochrannou imunitní odpověď (například baktericidní protilátky).

Z tohoto hlediska jsou učiněny odkazy na Mezinárodní publikace WO 99/24578, WO99/36544, WO99/58683 a WO99/57280, které jsou zde všechny začleněny jako odkazy a popisují mnoho kandidátních proteinů, které mohou být užitečné pro vakcíny pro imunizaci proti Neisseria meningitidis.

Z tohoto hlediska je učiněn specifický odkaz na Mezinárodní žádost WO99/31132 a ?eak et al., 2000, FEMS Immunol. Med. Microbiol. 28 329, obojí je zde začleněno jako odkaz a popisuje nový povrchový antigen izolovaný z mnoha různých kmenů N. meningitidis, tento povrchový antigen a jeho alelické varianty budou pro účely této specifikace označovány jako NhhA.

Podstata vynálezu

Předkladatelé vynálezu objevili, že povrchový antigen NhhA má polypeptidové oblasti, které se liší mezi jednotlivými kmeny N. meningitidis, a jiné oblasti, které jsou konzervovány mezi kmeny. Variabilní oblasti mohou být imunogenni a vedou k vyvolání imunitní odpovědi vůči specifickému kmeni, jako například vakcíny obsahující antigen NhhA odvozený z určitého kmene N. meningitidis vedou preferenčně k imunizaci vůči tomuto kmeni. Jako výsledek předkladatelé vynálezu usilovali o produkci modifikovaného polypeptidu NhhA, který vyvolává imunitní odpověď, která není specifická pro určitý kmen jako ty, které byly vyvolány přirozeně se vyskytujícím typem NhhA. Tento modifikovaný antigen NhhA bude vhodný pro výrobu terapeutických a/nebo profylaktických vakcín proti N.

I ' í meningitidis, jak bude popsáno dále. Řízením imunitní odpovědi primárně proti

I · : , konzervovaným epitopům by tyto vakcíny měly účinně imunizovat vůči širšímu spektru kmenů N. meningitidis, než by se očekávalo po imunizaci přirozeně se vyskytujícím typem NhhA.

Tato přihláška je proto široce zaměřena na izolaci proteinů s konzervovanými aminokyselinami polypeptidů NhhA.

Proteiny vynálezu mohou proto mít jednu nebo více delecí nekonzervovaných aminokyselin v porovnání s odpovídajícím přirozeně se vyskytujícím typem polypeptidu

NhhA.

V prvním aspektu vynález zahrnuje izolovaný protein obsahující sekvence dvanácti nebo více sousedních konzervovaných aminokyselin polypeptidu NhhA, přičemž je míněn izolovaný protein s vyloučením přirozeně se vyskytujícího typu polypeptidu NhhA.

Vhodně je protein vynálezu schopný vyvolávat imunitní odpověď.

S výhodou je imunitní odpověď méně kmenově specifická než ta, která byla vyvolaná odpovídajícím přirozeně se vyskytujícím typem polypeptidu NhhA.

Výhodněji zmíněná imunitní odpověď zahrnuje ochranu proti jednomu nebo více kmenům N. meningitidis, nebo ještě výhodněji proti velkému množství kmenů TvJ meningitidis.

Sekvence přirozeně se vyskytujícího typu polypeptidu NhhA jsou uvedeny jako příklad na OBR. 1 (SEQ ED NOS: 1 až 10).

Konzervativní sekvence aminokyselin je také uvedena na OBR. 1 (SEQ ID NO: 11).

Izolovaný protein vynálezu s výhodou obsahuje jednu nebo více konstantních oblastí^!polypeptidu NhhA, které jsou na OBR. 1 označeny jako Cl, C2, C3, C4 a C5 oblasti.

Bude oceněno, že podle tohoto aspektu jsou jedna nebo více nekonzervovaných aminokyselin variabilní oblasti polypeptidu NhhA označené na OBR. 1 jako VI, V2, V3 nebU V4 oblasti vhodně odstraněny vzhledem k přirozeně se vyskytujícímu typu polypeptidu NhhA.

S výhodou je odstraněna oblast VI nebo alespoň její podstatná část.

V určitých provedeních má izolovaný protein aminokyselinovou sekvenci, jaká je uvedena v kterémkoliv z OBR. 5 až 9 (SEQ ID NOS: 23 až 27), které jsou příklady modifikovaného polypeptidu NhhA tohoto vynálezu“. Na OBR. 14 (SEQ ID NOS: 33 až 39) jsou ukázány další příklady „maturovaných“ polypeptidů předpokládané vzniklých jako výsledek odstranění N-koncových signálních sekvencí.

Podle druhého aspektu vynález navrhuje izolovanou nukleovou kyselinu kódující polypeptid podle prvního aspektu.

Přirozeně se vyskytující typy sekvencí nukleových kyselin nhhA jsou uvedeny naj OBR. 2 (SEQ ED NOS. 12 až 21).

Konzervativní sekvence nukleové kyseliny je také uvedena na OBR. 2 (SEQ ID NO:

22).

S výhodou jsou oblasti Cl, C2, C3, C4 a C5 kódovány příslušnými nukleotidovými j i sekvencemi, jak je uvedeno na OBR. 2. i

I ;

S výhodou jsou oblasti VI, V2, V3 a V4 kódovány příslušnými nukleotidovými i i

I i sekvencemi, jak je uvedeno na OBR. 2. | ί

V konkrétním provedení má izolovaná nukleová kyselina vynálezu nukleotidovou sekvenci, jaká je uvedena na kterémkoliv z OBR. 5 až 9 (SEQ ID NOS: 28 až 32) a které jsou konkrétním příkladem ,/nodifikovaných nukleových kyselin nhhA tohoto vynálezu “. ;,

Vynález podle prvního a druhého aspektu zahrnuje homology, fragmenty, varianty a deriváty izolovaných proteinů a nukleových kyselin vynálezu. '

Specificky jsou vyloučeny z pole vynálezu polypeptidy NhhA a ňukleotidové sekvence nnhA přirozeně se vyskytujícího typu.

Podle třetího aspektu vynález spočívá v expresním konstruktu obsahujícím expresní vektor a nukleovou kyselinu podle druhého aspektu, kde je zmíněná sekvence funkčně spojena s jednou nebo více regulačními nukleóvými kyselinami ve zmíněném expresním j vektoru. ,

Podle čtvrtého aspektu vynález zahrnuje hostitelskou buňku obsahující expresní > konstrukt podle třetího aspektu.

Podle pátého aspektu vynálezu je zahrnuta metoda produkce rekombinantního izolovaného proteinu podle prvního aspektu, zmíněná metoda obsahuje kroky: '

i) kultivace hostitelské buňky obsahující expresní vektor podle třetího aspektu tak, že zmíněný polypeptid je exprimován v hostitelské buňce a ii) izolace zmíněného rekombinantního polypeptidu.

Podle šestého aspektu vynález zahrnuje protilátku nebo fragment protilátky, které se vážou na protein vynálezu nebo jeho fragment, variantu nebo derivát. ’-,/ , >,

Podle sedmého aspektu vynález .poskytuje metodu detekce N. meningitidis * v biologických vzorcích, které by ji mohly obsahovat, zmíněná metoda obsahuje kroky: ’ ί

i) izolace biologického vzorku z individua; ;

ii) smíchání výše zmíněné protilátky nebo fragmentu protilátky s biologickým , vzorkem a iii) detekce specificky navázané protilátky nebo fragmentu protilátky, která indikuje přítomnost N. meningitidis.

Podle osmého aspektu je poskytnutá metoda detekce bakterie N. meningitidis v biologickém vzorku, který by ji mohl obsahovat, zmíněná metoda obsahuje kroky:

i) izolace biologického vzorku z pacienta;

ii) detekce sekvence nukleové kyseliny podle zmíněného druhého aspektu ve vzorku, která indikuje přítomnost zmíněné bakterie.

Podle devátého aspektu vynález poskytuje metodu pro diagnózu infekce individua N. meningitidis, zmíněná metoda obsahuje kroky: ; · ’ :5

i) smíchání biologického vzorku z individua s polypeptidem, fragmentem, variantou nebo derivátem vynálezu a ii) stanovení přítomnosti nebo absence komplexu mezi zmíněnýin polypeptidem, fragmentem, variantou nebo derivátem a specifickou protilátkou proti N. meningitidis ve zmíněném vzorku, kdy je přítomnost komplexu indikací infekce.

S výhodou je individuem savec.

Ještě výhodněji je individuem člověk.

Podle desátého aspektu se vynálezu také zahrnuje použití izolovaného proteinu podlé prvního zmíněného aspektu, použití izolovaných nukleových kyselin podle druhého aspektu nebo použití protilátky nebo fragmentu protilátky zmíněných výše v soupravě pro detekci bakterie N. meningitidis v biologickém vzorku.

Podle jedenáctého aspektu vynálezu se poskytuje farmaceutický prostředek obsahující izolovaný protein podle prvního aspektu.

S výhodou je zmíněný farmaceutický prostředek vakcínou.

Podle dvanáctého aspektu vynález zahrnuje metodu prevence infekce pacienta N meningitidis zahrnující krok podání farmaceuticky účinného množství výše zmíněné vakcíny

Podle třináctého aspektu vynález zahrnuje metodu identifikace imunogenního fragmentu izolovaného proteinu, varianty nebo derivátu podle prvního zmíněného aspekte zahrnující kroky:

i) produkce fragmentu zmíněného polypeptidu, varianty nebo derivátu;

ii) podání zmíněného fragmentu individuu a iii) detekce imunitní odpovědi u zmíněného individua, jehož odpověď zahrnuje' produkci elementů, které specificky vážou N. meningitidis a/nebo zmíněný polypeptid, variantu nebo derivát, a/nebo protektivní účinek proti infekci N. meningitidis.

S výhodou je individuem savec.

Ještě výhodněji je individuem člověk.

Krátký popis obrázků a tabulek

Tabulka 1: Identifikace aminokyselin konzervovaných oblastí (Cl, C2, C3, C4 a C5) a variabilních oblastí (VI, V2, V3 a V4) polypeptidu NhhA u všech deseti (10) uvedených kmenů N. meningitidis. Odpovídající SEQ ID NOS jsou také uvedeny. Sloupec 1 = označení kmene. SEQ ID NOS: 1 až 9 byly popsány dříve v souběžně podané žádosti WO99/31132;

^!j, sekvence NhhA a nhhA z kmene Z2491 byly získány ϊ http://www.sanger.ac.uk/Projects/N_ meningitidis/', sloupec 2 = číslování aminokyselin oblasti Cl; sloupec 3 = číslování aminokyselin oblasti VI; sloupec 4 = číslování aminokyselin oblasti C2; sloupec 5 = číslování aminokyselin oblasti V2; sloupec 6 = číslování aminokyselin oblasti C3; sloupec 7 - číslování aminokyselin oblasti V2; sloupec 8 = číslování aminokyselin oblasti C4; sloupec 9 = číslování aminokyselin oblasti V4; sloupec 10 = číslování aminokyselin oblasti C5. Povšimněte si, že číslování aminokyselin konzervované sekvence (SEQ ID NO: 11) je také uvedeno.

Tabulka 2: Tabulka aminokyselinových substitucí.

OBR. 1: Porovnání aminokyselinové sekvence polypeptidu NhhA z deseti (10) kmenů

N. meningitidis (SEQ ID NOS: 1 až 10) spolu s konsensus sekvencí (SEQ ID NO: 11). Názvy kmenů a polypeptidových sekvencí použité v tomto srovnání odpovídají názvům kmenů a SEQ ID NOS ve sloupci 1 Tabulky 1. Aminokyseliny jsou uvedeny standardními jednopísmennými zkratkami. Konsensus aminokyseliny jsou ukázány jen tehdy, když jsou tyto zbytky kompletně konzervovány. Konzervované oblasti (dvakrát podtržené, označené Cl, C2, C3, C4, C5) a variabilní oblasti (jednou podtržené, označené VI, V2, V3, V4) jsou uvedeny pod konsensus sekvencí.

OBR. 2: Porovnání nukleotidové sekvence nukleových kyselin rihhA z deseti (10) kmenů N. meningitidis, které kódují aminokyselinové sekvence z OBR. 1. Oblasti Cl, C2, C3, C4, C5 a VI, V2, V3, V4 jsou takové, jak je popsáno v OBR. 1 a Tabulce 1. j

OBR.3: Plazmidová mapa odpovídající pCO14K sPCR amplifikačním produktem kódujícím přirozeně se vyskytující typ PMC21 NhhA funkčně spojeným s promotorem porA. (Nekresleno v měřítku) 3A: Plné šipky znázorňují uspořádání genů porA a kanR v pCO14K. Jsou ukázány oligonukleotidové primery HOMP5' a H0MP3 AN použité pro amplifikaci genu nhhA z kmene PMC21. Gen nhhA je znázorněn tečkovanou šipkou, promotor porA černým obdélníkem a jsou ukázána restrikční místa Eagl a Ncol použitá pro výměnu porA za nhhA, jak je popsáno v Příkladě 2. 3B Uspořádání genů v pIP52(PMC21), jak je popsáno v Příkladě 2. Místo BgflA použité pro konstrukci mutanty, jak je popsáno v Příkladě 4, je také ukázáno.

OBR. 4: Schematické znázornění strategie „Splice Overlap Extension PCR“ pro * f odstranění specifických oblastí polypeptidů NhhA. Schéma přirozeně se vyskytujícího typu genu nhhA je ukázáno v horní části Obrázků 4A až C a rekombínantní nhhA je ukázán ve spodní části těchto obrázků s variabilními oblastmi znázorněnými jako černé a s konstantními oblastmi znázorněnými jako prázdné obdélníky. Šipky ukazují přibližnou pozici oligonukleotidových primerů. Svislé čerchované čáry ukazují ámplifikační produkty. Tam, kde je oligonukleotidová sekvence z nesouvislých oblastí nukleové kyseliny nhhA, je toto znázorněno tečkovanou čárou mezi těmito nesouvislými oblastmi. Je znázorněno přibližné; měřítko. Dvojité svislé čáry ukazují, že je znázorněna pouze část oblasti C5. A: ukazuje: strategii, jak je popsána v Příkladě 6. B: ukazuje strategii, jak je popsána v Příkladě 7. C:;

I ukazuje strategii, jak je popsána v Příkladě 8.

OBR. 5: A) Aminokyselinová sekvence PMC 21 NhhA polypeptidové deleční mutanty

I (SEQ ID NO: 23) vytvořená v Příkladě 4; a B) ji kódující nukleotidová sekvence (SEQ ID NO: 28).

OBR. 6: A) Aminokyselinová sekvence H4I NhhA polypeptidové deleční mutam (SEQ ID NO: 24) vytvořená v Příkladě 5; a B) ji kódující nukleotidová sekvence (SEQ ID j NO: 29).

OBR. 7: A) Aminokyselinová sekvence PMC21 NhhA polypeptidové deleční mutantiy (SEQ ID NO: 25) vytvořená „Splice overlap PCR“ v Příkladě 6; a B) ji kódující nukleotidová sekvence (SEQ ID NO: 30).

OBR. 8: A) Aminokyselinová sekvence PMC21 NhhA polypeptidové deleční mutanty (SEQ ID NO: 26) vytvořená „Splice overlap PCR“ v Příklade 7; a B) ji kódující nukleotidová sekvence (SEQ ID NO: 31).

OBR. 9: A) Aminokyselinová sekvence PMC21 NhhA polypeptidové deleční mutantv (SEQ ID NO: 27) vytvořená „Splice overlap PCR“ v Příkladě 8; a B) ji kódující nukleotidová sekvence (SEQ ID NO: 32).

OBR. 10: Srovnání aminokyselinových sekvencí polypeptidů přirozeně se vyskytujícího typu NhhA a delečních mutant. Tyto polypeptidy byly vytvořeny tak, jak je popsáno v Příkladě 2, Příkladě 3, Příkladě 4 a Příkladě 5. Aminokyseliny jsou znázorněny jako jednopísmenné zkratky. Konzervované oblasti označené Cl, C2, C3, C4 a C5 odpovídající | těm, které byly definovány v Tabulce 1 a OBR 1, jsou označeny dvojitým podtržením cele délky sekvencí z H41 a PMC21, variabilní oblasti označené VI, V2, V3, V4 odpovídající těm, které byly definovány v Tabulce 1 a OBR. 1, jsou označeny jednoduchým podtržením celé í délky sekvencí z H41 a PMC21.

OBR. 11: Western imunoblot ukazující nadprodukci NhhA 45 pg celkového buněčného proteinu bylo rozděleno na 4 až 20% gradientu SDS-PAGE před přenesením na nitrocelulózovou membránu a byl proveden western imunoblot, jak je popsáno v Příkladě 9. Dráha 1: Výchozí kmen ukazující hladinu exprese přirozeně se vyskytujícího typu NhhA. Dráha 2: Kmen P6 (nadprodukuje PMC 21 NhhA, jak je popsáno v Příkladě 2). Dráha 3: Kmen ΡΔ6 (nadprodukuje zkrácený PMC 21 NhhA popsaný v Příkladě 4). Dráha 4: Kmen

I ' ' & .

H14 (nadprodukuje H41 NhhA, jak je popsáno v Příkladě 3). Dráha 5: Kmen ΗΔ8 (nadprodukuje zkrácený H41 NhhA popsaný v Příkladě 5). Dráha 6: Kmen 2A (exprese NhhA byla odstraněna mutací v genu nhhA, jak bylo popsáno v mezinárodní publikaci WO99/31132). Migrace standardů je ukázána: 185 kDa, 119 kDa, 85 kDa, 62 kDa, 51,2 kDa,

38,2 kDa, 22,4 kDa. Přirozeně se vyskytující typ polypeptidu NhhA je ukázán jako imunoreaktivní pruh s vysokou molekulární hmotností přítomný v dráze 1, ale nevyskytující se v dráze 6. ,

OBR. 12: Izolované polypeptidy delečních mutant NhhA. Polypeptidy NhhA byly izolovány, jak bylo popsáno v Příkladě 9, před separací na 4 až 20% SD. Polyakrylamidový gel byl obarven Coomassie. Dráha 1: OMC příprava kmene nadprodukujícího zkrácený polypeptid PMC21 NhhA popsaný v Příkladě 6. Dráha 2: Purifikovaný zkrácený polypeptid PMC21 NhhA. Dráha 3: OMC příprava kmene nadprodukujícího zkrácený polypeptid PMC21 NhhA popsaný v Příkladě 4. Dráha 4: Purifikovaný zkrácený polypeptid PMC21 NhhA. Dráha 5: OMC příprava kmene nadprodukujícího polypeptid PMC21 NhhA popsaný v Příkladě 2. Dráha 6: Purifikovaný polypeptid PMC21 NhhA. Dráha 7: Standardy molekulové hmotnosti 173 kDa, 111 kDa, 80 kDa, 61 kDa, 49 kDa, 36 kDa. Povšimněte si, že reaktivní vysokomolekulámí pruhy ve všech dráhách kromě 6 pravděpodobně představují multimery polypeptidů NhhA. Ostatní pruhy jsou pravděpodobně méně stabilní formy NhhA nebo rozpadové produkty. Povšimněte si, že chybí v dráze 6.

OBR. 13: Western imunoblot s použitím myšího séra proti proteinu NhhA. Na všech panelech obsahují dráhy 1, 3, 5 a 7 OMC z Kmene nadprodukujícího polypeptid PMC21 NhhA a dráhy 2, 4, 6 a 8 obsahují OMC z kmene 2A, který NhhA neexprimuje. Panel A: Dráhy 1 a 2: myš A inokulovaná přirozeně se vyskytujícím typem PMC21 NhhA v ředění 1:1000. Dráhy 3 a 4: myš A inokulovaná přirozeně se vyskytujícím typem PMC21 NhhA v ředění 1:10 000. Dráhy 5 a 6: myš B inokulovaná přirozeně se vyskytujícím typem PMC21 NhhA v ředění 1:1000. Dráhy 7 a 8; myš B inokulovaná přirozeně se vyskytujícím typem PMC21 NhhA v ředění 1:10 000. Panel B: Dráhy 1 & 2: myš C inokulovaná zkráceným polypetidem PMC21 NhhA (Příklad 4) v ředění 1:1000. Dráhy 3 & 4: myš C inokulovaná zkráceným polypetidem PMC21 NhhA (Příklad 4) v ředění 1:10 000. Dráhy 5 & 6: myš D inokulovaná zkráceným polypetidem PMC21 NhhA (Příklad 4) v ředění 1:1000. Dráhy 7 & 8: myš D inokulovaná zkráceným polypetidem PMC21 NhhA (Příklad 4) v ředění 1:1000. Panel C: Dráhy 1 & 2: myš E inokulovaná zkráceným polypetidem PMC21 NhhA (Příklad 6) v ředění 1:1000. Dráhy 3 a 4: myš E inokulovaná zkráceným polypetidem PMC21 NhhA (Příklad 6) v ředění 1:10 000. Dráhy 5 & 6: myš F inokulovaná zkráceným polypetidem

PMC21 NhhA (Příklad 6) v ředění 1:1000. Dráhy 7 & 8: mys F inokulovaná zkráceným polypetidem PMC21 NhhA (Příklad 6) v ředění 1:1000.

OBR. 14: Předpokládané maturované deleční mutanty polypeptidu NhhA. A/ předpokládaný maturovaný protein popsaný v Příkladě 2 (SEQ ID NO: 33); B: předpokládaný l !

maturovaný protein popsaný v Příkladě 3 (SEQ ID NO: 34); C: předpokládaný maturovaly, protein popsaný v Příkladě 4 (SEQ ID NO: 35); D: předpokládaný maturovaný protein popsaný v Příkladě 5 (SEQ ID NO: 36); E: předpokládaný maturovaný protein popsaný; v Příkladě 6 (SEQ ID NO: 37); F: předpokládaný maturovaný protein popsaný v Příkladě (SEQ ID NO: 38) a G. předpokládaný maturovaný protein popsaný v Příkladě 8 (SEQ ID NO: 39).

Detailní popis vynálezu

V rámci této specifikace, pokud kontext nevyžaduje jinak, budou slova „zahrnují“, „zahrnuje“ a „zahrnující“ chápana tak, že znamenají zahrnutí uvedených celků nebo skupiny celků, ale nevylučují žádný jiný celek nebo skupinu celků.

S ohledem na nomenklaturu je zde NhhA používáno tehdy, když je odkazováno na proteiny vynálezu, zatímco nhhA je používáno tehdy, když je odkazováno na nukleové : kyseliny vynálezu. Bude také chápáno, že proteiny a nukleové kyseliny NhhA/«AA/l zahrnu í | například proteiny a nukleové kyseliny HiaNm/Aíawn uvedené vWO99/31132, a to bez omezení na ně.

Tato přihláška předpokládá, alespoň částečně, objasnění konzervovaných a méně konzervovaných oblastí polypeptidu NhhA u deseti (10) kmenů N. meningitidis. Předpokládá se, že odpovídající oblasti jsou konzervovány v dalších alelických variantách uvedených příkladů polypeptidů NhhA.

Bude oceněno, že hlavním v této přihlášce je pochopení, že delecí nekonzervovaných aminokyselin v přirozeně se vyskytujícím typu polypeptidu NhhA za vytvoření modifikovaného polypeptidu NhhA vynálezu může být navozena imunitní odpověď po ; imunizaci zmíněným polypeptidem vynálezu, která díky zaměření imunitní odpovědi proti j konzervovaným epitopům bude poskytovat ochranu proti jednomu nebo více heterologním í kmenům N. meningitidis. í í

Jak je zde užíváno, „nekonzervované“ aminokyseliny jsou aminokyselinové zbytky j přítomné v přirozeně se vyskytujícím typu polypeptidu NhhA z prvního kmene N. j meningitidis, ale které nejsou přítomné v přirozeně se vyskytujícím typu polypeptidů NhhA ?

v jednom nebo více jiných kmenech.

Vhodně mají polypeptidy podle prvního aspektu alespoň část z jedné oblasti VI, V2,

V3 nebo V4 odstraněnu vzhledem k odpovídajícímu přirozeně se vyskytujícímu typu sekvence a podle toho mohou být společně nazývány jako příklady „delečních mutanť'.

Bude oceněno, že předkladatelé vynálezu identifikovali oblasti VI, V2, V3 a V4 jako oblasti přirozeně se vyskytujících typů polypeptidů NhhA s relativně vysokou frekvencí i nekonzervovaných aminokyselin v porovnání s relativně konzervovanými oblastmi Cl až C5.

Z V oblastí mají VI (hypervariabilní) a V2 oblasti nej vyšší frekvenci nekonzervovaných aminokyselin, zatímco V3 a V4 mají relativně nižší frekvence. Přesto tvoří oblast VI významnější součást přirozeně se vyskytujících polypeptidů NhhA než oblast V2 (s ohledem na celkový počet aminokyselin). Proto je upřednostňováno, že izolované proteiny podle prvního zmíněného aspektu mají minimálně odstraněnu podstatnou Část oblasti; VI.

Zkušenými osobami bude taktéž chápáno, že při konstrukci zmíněných delečních mutant lze „zaměňovat“ oblasti mezi polypeptidy NhhA různých kmenů N. meningitidis. Například polypeptid NhhA vynálezu může; obsahovat oblast H41 Cl společně s oblastí PMC21 C5.

Toto „zaměňování“ je konkrétně zvláště vhodné pro metody rekombiňace DNA.

Pro účely tohoto vynálezu je „ izolovaným “ míněn materiál, který byl vzat ze svého přirozeného stavu nebo byl jinak podroben lidské manipulaci. Izolovaný materiál může být částečně nebo zcela volný od komponent, které jej doprovázejí za normálního stavu, nebo může být manipulován tak, aby byl v umělém stavu spolu s komponentami, , které jej v přirozeném stavu normálně doprovázejí. Izolovaný materiál může být v nativní nebo rekombinantní formě.

„Proteinem“ je míněn aminokyselinový polymer. Aminokyseliny mohou být přírodními nebo nepřírodními aminokyselinami, jak je dobře známo v oboru.

„Peptid“ je protein mající méně než padesát (50) aminokyselin.

Polypeptid je protein mající padesát (50) nebo více aminokyselin.

Jak je zde užíváno, fráze „navozuje -imunitní odpověď“ odkazuje na schopnost izolovaného polypeptidů vynálezu vytvořit imunitní odpověď u savců, kterým byl podán, u nichž je odpověď řízena proti N. meningitidis a/nebo zmíněnému polypeptidů. S výhodou imunitní odpověď zahrnuje tvorbu baktericidních protilátek. Ještě výhodněji je imunitní odpověď protektivní proti infekci N meningitidis.

li:

„Kmenově specifický je zde používáno v kontextu imunitní odpovědi, která zaměřena proti, nebo alespoň převážně zaměřena proti, autolognimu kmeni N. meningitidis.

Jak je zde užíváno, „křížově reaktivní znamená schopnost polypeptidu vynálézu navozovat imunitní odpověď zaměřenou proti jednomu nebo více heterologním kmenům Ač meningitidis. |

Jak je zde používáno, „křížověprotektivní znamená schopnost polypeptidu vynálezů navozovat imunitní odpověď a tak poskytovat ochranu proti infekci jedním nebo víte: heterologními kmeny N. meningitidis. JI

Proto ve smyslu nadcházejícího zmíněný polypeptid vynálezu zde může bý; označován jako „ imunogen nebo jako jsoucí „ imunogenní.

Ačkoliv byly pro účely této přihlášky zmíněné modifikované proteiny NhhA ukázány na příkladech aminokyselinovými sekvencemi uvedenými na OBR. 5 až 9 (SEQ ID NOS: až 27) a OBR. 14, přihláška také uvažuje fragmenty, deriváty a varianty (jako jsou alelické varianty) uvedených proteinů.

Například pro snížení kmenově specifické imunogenity mohou být odstraněryj aminokyseliny z kterékoliv sekvence Cl až C5 uvedené na OBR. 1, zatímco nemusí byt odstraněny všechny nekonzervované aminokyseliny z oblastí VI až V4.

Proto mohou izolované proteiny vynálezu obsahovat fragmenty oblastí Cl až C5 a Vil až V4. I

Vskutku, jak bude dále popsáno v Příkladech, může být výhodné pro účely tvorby polypeptidů vynálezu pomocí metod rekombinantní DNA odstranit jednu nebo více aminokyselin z oblasti Cl, C2, C3, C4 a/nebo C5 nebo oblasti VI, V2, V3 a/nebo V4 v zájmu ' využití vhodných restrikčních endonukleasových míst a dosažení vysoké exprese stabilního ^; i

imunogenního proteinu.

V jednom provedení „fragment zahrnuje aminokyselinovou sekvenci, kterou tvoř méně než 100%, ale alespoň 20%, s výhodou 50%, ještě výhodněji nejméně 80% nebo ješte více výhodněji nejméně 90% zmíněných oblastí Cl, C2, C3, C4 nebo C5. I

I

Fragmenty mohou být například peptidy tvořené méně než dvanácti aminokyselinami, i jako je oblast C2 (SEQ ID NO: 11) nebo sekvencemi nejméně dvaceti sousedních |

I aminokyselin nebo více než stem sousedních aminokyselin odpovídajícím některé nebo všem | oblastem Cl, C2, C3, C4 a/nebo C5 popsaným zde.

Další fragmenty uvedené zde příkladem jsou modifikované polypeptidy NhhA vynálezu, které podstoupily posttranslační úpravy pro vytvoření maturovaného polypeptidu, jak je ukázáno na OBR. 14. |

..... <

V dalším provedení je „fragment“ malým peptideín, například nejméně 6, s výhodou nejméně 10 a ještě výhodněji nejméně 20 aminokyselin dlouhým, který obsahuje jednu nebo více antigenních determinant nebo epitopů odvozených z modifikovaných proteinů NhhA vynálezu. Větší fragmenty obsahující více než jeden peptid jsou také zahrnuty a mohou být získány aplikací standardních technik tvorby rekombinantních nukleových kyselin nebo syntetizovány pomocí konvenčních technik syntézy v tekuté nebo na pevné fázi. Příkladem může být syntéza v roztoku nebo na pevné fázi, jak je popsána například v Kapitole 9 nazvané „Peptide Synthesis“ autorů Atherton a Shephard, která je obsažena v díle nazvaném „Synthetic Vaccines“ editovanou Nicholson a vydanou Blackwell Scientific Publications. Alternativně mohou být peptidy produkovány štěpením polypeptidů vynálezu proteinasami, jako jsou endoLys-C, endoArg-C, endoGlu-C a stafylokokovou proteasou V8. Naštěpené fragmenty mohou být purifikovány například technikami vysokotlaké kapalné chromatografie (HPLC).

Jak je zde užíváno, „varianty“ polypeptidů jsou polypeptidy vynálezu, u kterých byly jedna nebo více aminokyselin nahrazeny jinými aminokyselinami. Je dobře známo voboru, že některé aminokyseliny mohou být změněny na jiné s velmi podobnými vlastnostmi beze změny přirozené aktivity polypeptidu (konzervativní substituce). Příkladné konzervativní substituce v polypeptidu mohou být provedeny podle Tabulky 2.

Podstatné změny ve funkci jsou vytvořeny výběrem substitucí, které jsou méně konzervativní než ty, které jsou uvedeny v Tabulce 2. Jiná nahrazení mohou být nekonzervativními substitucemi a relativně méně jich může být tolerováno. Obecně substituce, které pravděpodobně vytvářejí větší změny ve vlastnostech polypeptidu, jsou ty, u kterých a) hydrofilní zbytek (např. Ser nebo Thr) je nahrazen nebo nahrazuje hydrofóbní zbytek (např. Ala, Leu, Ile, Phe nebo Val); b) cystein nebo prolin je nahrazen nebo nahrazuje jiný zbytek; c) zbytek s elektropozitivním postranním řetězcem (např. Arg, His nebo Lys) je nahrazen nebo nahrazuje elektronegativní zbytek (např. Glu nebo Asp) nebo d) zbytek s velkým postranním řetězcem (např. Phe nebo Trp) je nahrazen nebo nahrazuje zbytek s menším postranním řetězcem (např. Ala, Ser) nebo bez postranního řetězce (např. Gly).

Termín „varianta“ také zahrnuje polypeptidy NhhA vynálezu vytvořené podle alelických variant sekvencí uvedených příkladem y této specifikaci.

Polypeptidové varianty NhhA mohou spadat do sféry termínu „polypeptidové homology“.

Polypeptidové homology sdílejí nejméně 70%, s výhodou nejméně 80% a ještě výhodněji 90% sekvenční identitu s aminokyselinovou sekvencí modifikovaných polypepticů

NhhA vynálezu, jak zde byly popsány. j i

Jak je zde obecně používáno, „homolog“ sdílí definovatelnou nukleotidovou nebo j i aminokyselinovou sekvenční příbuznost s nukleovou kyselinou nebo polypeptidem vynálezu.| Například za takovéto homology jsou považovány aminokyselinové sekvence, které) se liší od těch, které jsou zde uvedeny příkladem, ale které jsou imunogenní a poskytují křížóve ochrannou imunitu.

Specificky jsou vyloučeny ze sféry termínu „homology“ polypeptidy přirozeně |sé vyskytujícího typu NhhA a nukleové kyseliny nhhA.

Do sféry homologů jsou zahrnuty „orthology“, což jsou funkčně příbuzné polypeptidy i:

a je kódující nukleové kyseliny izolované z jiných bakteriálních druhů než N. meningitidis. )

I ^:

Termíny používané zde pro popsání příbuznosti sekvencí mezi jednotlivými^ nukleovými kyselinami a polypeptidy zahrnují „porovnávací okno“, „sekvenční identita- ‘j) „procento sekvenční identity“ a „podstatná identita“. Protože jednotlivé nukleoýé: kyseliny/polypeptidy mohou každý obsahovat 1) pouze jednu nebo více částí kompletů sekvence nukleové kyseliny/polypeptidu, které jsou sdíleny nukleovými) kyselinami/polypeptidy, a 2) jednu nebo více částí, které jsou odlišné mezi nukleovými kyselínami/polypeptidy, jsou obvykle porovnání sekvencí dělána porovnáním sekvencí v „porovnávacím okně“ pro identifikaci a porovnání lokálních oblastí sekvenčních podobnost. „Porovnávací okno“ odkazuje na pojmový segment typicky 12 sousedních zbytků, který je porovnáván se srovnávací sekvencí. Porovnávací okno může zahrnovat přidání nebo delecc (tj. mezery) přibližně 20% nebo méně v porovnání se srovnávací sekvencí (která neobsahuje )) přidání nebo delece) pro optimální porovnání jednotlivých sekvencí. Optimální porovnání sekvencí pro porovnání porovnávacího okna může být provedeno počítačovou implementac algoritmů (Geneworks program vytvořený Intelligenetics; GAP, BESTFIT, FASTA a TFASTA z Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Drive Madison, WI, USA, uvedeno zde jako odkaz) nebo prozkoumáním a výběrem nejlepšího srovnání (tj. s nejvyšším procentem homologie v daném porovnávacím okně) vytvořeného kteroukoliv z vybraných metod. Odkaz může být taktéž učiněn na rodinu programů BLAST, jak bylo například popsáno v Altschul et al., 1997, Nucl. Acids Res. 25 3389, který je zde uveden jako odkaz.

Detailní diskuse sekvenční analýzy může být nalezena v Kapitole 19.3 vCURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY Eds. Ausubel et al. (John Wiley & Sons lne NY, 1995-1999).

Termín „sekvenční identita“ je zde používán ve svém nejširším smyslu a zahrnuje počet stejných nukleotidů nebo aminokyselin s ohledem na vhodné srovnání pomocí standardního algoritmu a s ohledem na míru identity sekvencí ve srovnávacím okně. Proto je „procento sekvenční identity “ kalkulováno porovnáním dvou optimálně srovnaných sekvencí ve srovnávacím okně, stanovením počtu pozic, ve kterých se nachází identická báze nukleové kyseliny (např. A, T, C, G, I) v obou sekvencích, jehož výsledkem bude počet odpovídajících si pozic, dělením počtu odpovídajících si pozic celkovým počtem pozic ve srovnávacím okně (tj. velikostí okna) a násobením výsledku 100 pro získání procenta sekvenční identity. Například „sekvenční identita“ může být chápana tak, že vyjadřuje „procento odpovídajících si“ kalkulované pomocí počítačového programu DNASIS (verze 2.5 pro Windows; dostupný od Hitachi Software engineering Co., Ltd., South San Francisco, Califomia, USA),

Proto je v možnostech zkušené osoby připravit polypeptidové homology vynálezu, jako jsou varianty definované dříve, pomocí technologie rekombinantní DNA. Například nukleové kyseliny vynálezu mohou být mutovány pomocí buď náhodné mutageneze například pomocí transpozonové mutageneze, nebo místně specifickou mutagenezou. Výsledné fragmenty DNA jsou následně klonovány do vhodného expresního hostitele, jako je

E. coli, použitím konvenční technologie, a jsou detekovány klony s požadovanou aktivitou. Jestliže byly klony získány pomocí technik náhodné mutageneze, musí být pozitivní klony sekvenovány pro stanovení mutací.

Jak je zde používáno, „odvozené“ polypeptidy jsou polypeptidy vynálezu, které byly pozměněny například konjugací nebo vytvořením komplexu s jinými chemickými zbytky nebo technikami posttranslační modifikace, jak jsou známy voboru. Takovéto deriváty zahrnují delece a/nebo přidání aminokyselin do polypeptidů NhhA vynálezu nebo jejich variant, kde zmíněné deriváty navozují imunitní odpověď.

„Přidání“ aminokyselin může zahrnovat fůzi polypeptidů nebo jejich variant s jinými polypeptidy nebo proteiny. Z tohoto ohledu bude oceněno, že polypeptidy nebo varianty vynálezu mohou být inkorporovány do větších polypeptidů a u takovýchto větších polypeptidů může být předpokládáno, že budou imunogenní. Polypeptidy, jak byly popsány výše, mohou být fúzovány s dalším proteinem, například takovým, který není odvozen zN. meningitidis. Jiný protein může, jak je uvedeno v příkladu, napomáhat při purifikaci proteinu. Například mohou být použity polyhistidinová kotva nebo maltosu vázající protein.

ou

i.

Alternativně může vyvolávat imunitní odpověď účinnou proti N. meningitidis nebo vyvolávat imunitní odpověď vůči jinému patogenu. Dalšími možnými fúzními proteiny jsou ty, které vytvářejí imunomodulační odpověď. Konkrétní příklady takovýchto proteinů zahrnují Proteiri A nebo glutation-S-transferasu (GST). Navíc může být polypeptid sfúzován s vakcínov komponentou založenou na oligosacharidu, kde funguje jako proteinový nosič.

Jiné deriváty zamýšlené ve vynálezu zahrnují, ale nelimitují, modifikaci postranních řetězců, začlenění nepřírodních aminokyselin a/nebo jejich derivátů během peptidove, polypeptidové nebo proteinové syntézy a použití zesíťujících látek nebo jiných metod, ktere způsobují konformační změny polypeptidů, fragmentů a variant vynálezu. Příklaldy modifikací postranních řetězců zamýšlené v patentové přihlášce zahrnují modifikace aminoskupin, jako jsou acylace pomocí anhydridu kyseliny octové; acylace aminoskupin pomocí anhydridu kyseliny jantarové a anhydridu kyseliny tetrahydroftalátové; amidaee pomocí methylacetimidátu; karbamoylace aminokyselin kyanátem, pyridoxylace lysinu pomocí pyridoxal-5-fosfátu s následnou redukcí NaBH₄; redukční alkylace reakcí s aldehydem následovanou redukcí NaBTL a trinitrobenzylace aminoskupin pomocí 2, 4, trinitrobenzensulfonové kyseliny (TNBS).

Karboxylová skupina může být modifikována karboimidovou aktivací přes vznik Óacylismočoviny následovanou derivatizací například na příslušný amid.

Guanidinová skupina argininových zbytků může být modifikována za tvorby heterocyklických kondenzačních produktů s látkami jako jsou 2,3-butandion, fenylglyoxal a glyoxal.

Sulfhydrylové skupiny mohou být modifikovány metodami, jako jsou oxidace kyselinou mravenčí na kyselinu cysteinovou; tvorba rtuťových derivátů pomocí 4 chlorortuťofenylsulfonové kyseliny, 4-chlorortuťobenzoátu; 2-chlorortuťo-4-nitrofenolu chloridu fenylrtuti a dalších rtuťných látek; tvorba smíšených disulfidů s dalšími thiolovým látkami; reakce s maleimidem, anhydridem maleátu nebo jinými substituovanými maleimidy: karboxymethylace s jódoctovou kyselinou nebo jódacetamidem; a karbamoylace s kyanáterJ v alkalickém pH.

Tryptofanové zbytky mohou být modifikovány například alkylací indolového kruhu 2hydroxy-5-nitrobenzyl-bromidem nebo sulfonyl-halogenidy nebo oxidací Nbromosukcinoimidem.

Tyrosinové zbytky mohou být modifikovány nitrací s tetranitromethanem za vzniku 3nitrotyrosinových derivátů.

i6 ,

Imidazolový kruh histidinového zbytku může být - modifikován Nkarbethoxylací diethylpyrokarbonátem nebo alkylací deriváty kyseliny jódoctové.

Příklady inkorporace nepřírodních aminokyselin a derivátů během peptidové syntézy zahrnují, ale nejsou tím limitovány, použití kyseliny 4-aminomáseIné, kyseliny 6aminohexanové, kyseliny 4-amino-3-hydroxy-5-fenylpentanové, kyseliny 4-amino-3hydroxy-6-methylheptanové, t-butylglycinu, norleucinu, norvalinu, fénylglycinu, omithinu, sarkosinu, 2-thienylalaninu a/nebo D-isomerů aminokyselin.

Vynález také zahrnuje kovalentní modifikaci polypeptidu, fragmentu nebo varianty vynálezu dinitrofenolem pro zajištění imunogenity u lidí.

Izolované proteiny vynálezu (včetně fragmentů, variant, derivátů a homologůý mohou být připraveny kteroukoliv vhodnou metodou známou v oboru.

Například protein může být připraven jako rekombinantní polypeptid metodou zahrnující kroky:

i) příprava expresního konstruktu, který obsahuje modifikovanou nukleovou kyselinu nhhA vynálezu funkčně spojenou s jednou nebo více regulačními nukleovými sekvencemi;

ii) transfekce nebo transformace vhodné hostitelské buňky expresním konstruktem;

iii) exprese rekombinantního polypeptidu ve zmíněné hostitelské buňce..

Dále bude uvedeno několik příkladů, které popisují produkci modifikovaných nukleových kyselin nhhA vynálezu pomocí PCR. ]

V jednom konkrétním provedení je PCR „splice overlap PCR“, jak bude popsáno dále, což je metoda založená na metodě popsané v Ho et al., 1989, Gene 77 51 a v Horton et al., 1989, Gene 77 61, které jsou zde uvedeny jako odkazy. /

Pro účely exprese v hostitelské buňce je rekombinantní nukleóvá kyselina funkčně spojena s jednou nebo více regulačními sekvencemi v expresním vektoru.

„Expresní vektor” může být buď samostatně se replikující extrachromozomální vektor, jako je plazmid, nebo vektor, který se integruje.do genomu hostitele.

„Funkčně spojeným” je myšleno, že zmíněná(é) regulační nukleotidové sekvence jefisou) umístČna(y) v sousedství rekombinantní nukleové kyseliny vynálezu za účelem iniciace, regulace nebo jiné kontroly transkripce.',

Regulační nukleotidové sekvence budou obecně vhodné pro hostitelskou buňku použitou k expresi. Mnoho typů vhodných expresních vektorů a vhodné regulační sekvence jsou známy v oboru pro mnoho různých hostitelských buněk.

\Ί

Typicky může zmíněná jedna nebo více regulačních nukleotidových sekvencí zahrnovat, ale není tím limitována, promotorové sekvence, vedoucí nebo signální sekver.ce, vazebná místa pro ribozomy, sekvence počátku a konce transkripce, sekvence počátku konce translace a enhancerové nebo aktivátorové sekvence.

Konstitutivní nebo inducibilní promotory, jak jsou známy v oboru, jsou uvažovány Ve vynálezu. Promotory mohou být buď přirozeně se vyskytujícími promotory, nebo hybridami promotory, které kombinují elementy z více jak jednoho promotoru. i

Ve výhodném provedení obsahuje expresní vektor selektovatelný markerový gen pro umožnění selekce transformovaných hostitelských buněk. Selektovatelné markerové geny jsou dobře známy v oboru a budou se lišit podle použité hostitelské buňky.

V provedení je expresním vektorem pCO14K, který obsahuje promotor porA selekční gen pro kanamycin, jak bude detailně popsáno později. Podle tohoto provedení Ijé hostitelskou buňkou bakterie vybraná ze skupiny obsahující E. coli a N. meningitidis.

Expresní vektor může také obsahovat fuzního partnera (typicky umístěn v expresním vektoru), takže je rekombinantní polypeptid vynálezu exprimován jako fuzní polypeptid se zmíněným fuzním partnerem. Hlavní výhodou fuzních partnerů je, že napomáhají při identifikaci a/nebo purifikaci zmíněného fuzního polypeptidu.

Pro expresi zmíněného fuzního polypeptidu je nezbytné ligo vat nukleotidovou sekvenci podle vynálezu do expresního vektoru tak, že translační čtecí rámce fuzního partnera a nukleotidové sekvence vynálezu na sebe navazují.

Dobře známé příklady fuzních partnerů zahrnují, ale nejsou tím limitovány, glutathion-S-transferasu (GST), Fc část lidského IgG, maltosu vázající protein (MBP) a! hexahistidin (HlSe), které jsou zvláště užitečné pro izolaci fuzního polypeptidu afinitní chromatografií. Pro účely purifikace fuzních polypeptidů afinitní chromatografií jsou odpovídajícími matricemi pro afinitní chromatografii glutathion-, amylosa- a nikl- nebe kobalt- konjugované pryskyřice. Mnoho takovýchto matric je dostupných jako „souprava“, jako jsou QIAexpress™ systém (Qiagen) použitelný pro (HfS₆) fuzní partnery a GST purification systém od firmy Pharmacia.

Preferovaným fuzním partnerem je MBP, který je zde popsán v Příkladě 11.

Dalším fuzním partnerem dobře známým v oboru je zelený fluorescenční protein (GFP). Tento fuzní protein slouží jako fluorescenční „přívěšek“, který umožňuje identifikaci fuzního polypeptidu vynálezu fluorescenční mikroskopií nebo průtokovou cytometrií. GFP přívěšek je užitečný pro zkoumání subbuněčné lokalizace fuzního polypeptidu vynálezu nebo pro izolaci buněk, který exprimuji fuzní polypeptid vynálezu. Metody průtokové cytometrie,

J.8 jako je fluorescenčně aktivované třídění buněk (FACS), jsou zvláště užitečné v této druhé aplikaci.

S výhodou mají fuzní partneři také štěpná místa pro proteasy, jako jsou Faktor X_a nebo thrombin, které umožňují odpovídající protease částečně štěpit fuzní polypeptid vynálezu a tak zněj uvolnit rekombinantní polypeptid vynálezu. Uvolněný polypeptid může být poté izolován od fuzního partnera následnou chromatografickou separací.

Fúzní partneři podle vynálezu zahrnují ve svém významu také „epitopové přívěšky“, což jsou obvykle krátké peptidové sekvence, proti nimž jsou dostupné specifické protilátky. Dobře známé příklady epitopových přívěsků, pro které jsou snadno dostupné specifické monoklonální protilátky, zahrnují přívěšky c-myc, haemagglutinin z viru chřipky a FLAG.

Jak bylo uvedeno dříve, polypeptidy vynálezu mohou být produkovány kultivací hostitelské buňky transformované zmíněným expresním konstruktem obsahujícím nukleovou kyselinu kódující polypeptid nebo polypeptidový homolog vynálezu. Podmínky vhodné pro expresi proteinu se budou lišit podle výběru expresního vektoru a hostitelské buňky. To je snadno zjistitelné osobami zkušenými v oboru rutinními experimenty.

Vhodné hostitelské buňky pro expresi mohou být prokaryotickými nebo eukaryotickými. Jednou výhodnou hostitelskou buňkou pro expresi polypeptidu podle vynálezu je bakterie. Používanou bakterií může být Escherichia coli nebo N. meningitidis.

Ve výhodném provedení je hostitelskou buňkou N. meningitidis, ktreá byla modifikována tak, aby neexprimovala PorA, Opa, Ope nebo kapsulámí polysacharid a exprimovala požadovaný lipopolysacharidový fenotyp.

Alternativně může být hostitelskou buňkou hmyzí buňka, jako jsou například buňky SF9, které mohou být použity s bakulovirovým expresním systémem.

Rekombinantní protein může být bez obtíží připraven osobou zkušenou v oboru i pomocí standardních protokolů, jak jsou například popsány v Sambrook, et al., MOLECULAR CLONING. A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press, 1989), který je zde uveden jako odkaz, konkrétně v sekcích 16 a 17; CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY Eds. Ausubel et al., (John Wiley & Sons, lne. 1995-1999), kteiý je zde uveden jako odkaz, konkrétně v kapitolách 10 a 16; a v CURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE Eds. Coligan et al., (John Wiley & Sons, lne. 1995-1999), kteiý je zde uveden jako odkaz, konkrétně v kapitolách 1, 5 a 6.

Preferované metody exprese rekombinantních modifikovaných proteinů NhhA vynálezu a metody detekce exprimovaného proteinu jsou zde uvedeny v Příkladech.

•19

Nukleotidové sekvence

Vynález zahrnuje izolovanou nukleovou kyselinu, která kóduje modifikovaný protein NhhA vynálezu.

S výhodou má izolovaná nukleová kyselina sekvenci, která kóduje jednu nebo více

I!' konstantních (C) oblastí polypeptidu NhhA, jak je popsáno na OBR. 1 a 2. Izolovaná nukleová kyselina může dále kódovat jednu nebo více nekonzervovaných (V oblak) aminokyselin, jak je také znázorněno na OBR. 1 a 2. ·

Konkrétní provedení těchto izolovaných nukleových kyselin je ukázáno na SEQ ID¹ i i

NOS: 28 až 32 a na OBR. 5 až 9. ·

Pojem „nukleová kyselina“, jak je zde používán, oznařuje jedno- nebo dvouvláknovoui mRNA, RNA, cRNA a DNA, zmíněnou DNA včetně cDNA a genomické DNA.

„Polynukleotid“ je nukleová kyselina obsahující osmdesát (80) nebo více sousedních nukleotidů, zatímco „oligonukleotid“ obsahuje méně než osmdesát (80) sousedních nukleotidů. ί „Sonda“ může být jedno- nebo dvouvláknový oligonukleotid nebo polynukleotid i vhodně značený pro účely detekce komplementárních sekvencí například při metodě Northern I nebo Southern blotting.

„Primer“ je obvykle jednořetězcový oligonukleotid, s výhodou obsahující 15 až 5 sousedních oligonukleotidů, který je schopný nasednout na komplementární „templáť

I i nukleové kyseliny a být prodloužen podle templátu jako vzoru DNA polymerasou, jako jsou i ί Taq polymerasa, RNA-dependentní DNA polymerasa nebo Sequenase™. j^:

Přihláška také zamýšlí homology nukleových kyselin vynálezu, jak zde byly!

I ' definovány dříve. I:

Tyto homology nukleových kyselin nezahrnují nukleové kyseliny kódující celou délku přirozeně se vyskytujících typů polypeptidů NhhA.

Například homology nukleové kyseliny kódují peptidy a polypeptidy strukturně příbuzné V a C oblastem NhhA vynálezu, které mohou být užitečné pro účely vyvoláni i i křížově protektivní imunity proti N. meningitidis imunizací. i

V jednom provedení homology nukleové kyseliny kódují polypeptidové homology vynálezu včetně jejich variant, fragmentů a derivátů.

V jiném provedení homology nukleové kyseliny sdílejí nejméně 60%, s výhodou nejméně 70%, ještě výhodněji nejméně 80% a ještě více výhodněji nejméně 90% sekvenční identitu s nukleovými kyselinami vynálezu.

V ještě dalším provedení homology nukleové kyseliny hybridízují snukleovými kyselinami vynálezu za nejméně málo stringentních podmínek, s výhodou nejméně středně stringentních podmínek a ještě výhodněji za vysoce stringentní ch podmínek.

Pojmy „hybridizovat a hybridizace“ jsou zde používány pro popis párování přinejmenším částečně komplementárních nukleotidových sekvencí za vzniku hybridů DŇADNA, RNA-RNA nebo DNA-RNA. Hybridní sekvence obsahující komplementární nukleotidové sekvence vznikají párováním bází mezi komplementárními puriny a pyrimidiny, jak je dobře známo v oboru.

Z tohoto ohledu bude oceněno, že se modifikované puriny (například inosin, methylinosin a methyladenosin) a modifikované pyrimidiny (thiouridin, methylcytosin) mohou také podílet na párování bází.

„Stringence“, jak je zde užívána, odkazuje na podmínky teploty a iontové síly a přítomnosti nebo absence určitých organických rozpouštědel a/nebo detergentů během hybridizace. Čím vyšší stringence, tím vyšší bude požadovaná míra komplementarity mezi hybridizovanými nukleotidovými sekvencemi. , „Stringentní podmínky“ popisují takové podmínky, za kterých budou hybridizovat pouze nukleové kyseliny s vysokou frekvencí komplementárních bází.

Odkazy zde uvedené jako málo stringentní podmínky zahrnují:

i) od nejméně 1% v/v do nejméně 15% v/v formamidu a od nejméně 1 M do nejméně 2 M soli pro hybridizaci při 42 °C a od nejméně 1 M do nejméně 2 M soli pro odmývání při 42 °C.

ii) 1% bovinní sérum albumin (BSA), 1 mM EDTA 0,5 M NaHPO₄ (pH 7,2), 7% SDS pro hybridizaci při 65 °C a i) 2x SSC, 0,1% SDS; nebo ii) 0,5% BSA, 1 mM EDTA, 40 mM NaHPO₄ (pH 7,2), 5% SDS pro odmývání při pokojové teplotě.

Středně stringentní podmínky zahrnují:

i) od nejméně 16% v/v do nejméně 30% v/v formamidu a od nejméně 0,5 M do nejméně 0,9 M sob pro hybridizaci při 42 °C a od nejméně 0,5 M do nejméně 0,9 M soli pro odmývání při 42 °C.

ii) 1% bovinní sérum albumin (BSA), 1 mM EDTA, 0,5 MNaHP0₄ (pH 7,2), 7% SDS pro hybridizaci při 65 °C a a) 2x SSC, 0,1% SDS; nebo b) 0,5% BSA 1 mM EDTA 40 mMNaHP0₄ (pH 7,2), 5% SDS pro odmývání při 42 °C.

Vysoce stringentní podmínky zahrnují:

'21

i) od nejméně 31% v/v do nejméně 50% v/v formamidu a od nejméně 0,01 M d<o nejméně 0,15 M soli pro hybridizaci při 42 °C a od nejméně 0,01 M do nejméně 0,15 M soli pro odmývání při 42 °C.

ii) 1% BSA, 1 mM EDTA, 0,5 M NaHPO₄ (pH 7,2), 7% SDS pro hybridizaci j>ři 65 °C a a) 0,lx SSC, 0,1% SDS; nebo b) 0,5% BSA, 1 mM EDTA, 40 níM NaHPO₄ (pH 7,2), 1% SDS pro odmývání při teplotě přesahující 65 °C zhruba jednu hodinu; a iii) 0,2x SSC, 0,1% SDS pro odmývání při nebo více jak 68 °C po 20 minut.

Obecně je odmývání prováděno při T_m = 69,3 + 0,41 (G + C)% - 12°C. Obecně se ' duplexní DNA snižuje o přibližně 1 °C s každým vzestupem o 1% počtu nepárujících se bází.

Nehledě na výše uvedené jsou stringentní podmínky dobře známy v oboru, jako jsou například popsány v kapitolách 2.9 a 2.10 v knize Ausubel et al., viz výše, která je zde uvedena jako odkaz. Znalý adresát také rozpozná, že různé faktory mohou být modifikovány pro optimalizaci specifity hybridizace. Optimalizace stringentnosti posledních odmývá může sloužit pro zajištění vysokého stupně hybridizace.

Typicky jsou komplementární nukleotidové sekvence identifikovány blotovacírůi technikami, které zahrnují krok imobilizace nukleotidů na matrici (s výhodou syntetická membrána, jako je nitrocelulosa), krok hybridizace a krok detekce. Southern blotting je používán pro identifikaci komplementární sekvence DNA; northem blotting je používán proj identifikaci komplementární sekvence RNA. Dot blotting a slot blotting mohou být používány! pro identifikaci komplementárních DNA/DNA, DNA/RNA nebo RNA/RNAj polynukleotidových sekvencí. Tyto techniky jsou dobře známy osobám znalým oboru a byly popsány v Ausubel et al., viz výše na stranách 2.9.1 až 2.9.20. Podle těchto metod zahrnuje Southern blotting rozdělení molekul DNA podle velikosti gelovou elektroforézou, přenesení velikostně rozdělené DNA na syntetickou membránu a hybridizaci DNA vázané na membráně s komplementární nukleotidovou sekvencí.

U dot blotu a slot blotu jsou vzorky DNA před hybridizaci přímo naneseny na syntetickou membránu jako v předešlém případě.

Alternativní blotovací krok je používán při identifikaci komplementárních nukleových kyselin v knihovně cDNA nebo genomické DNA, jako je proces hybridizace plaků nebo kolonií. Další typické příklady této procedury jsou popsány v kapitolách 8 až 12 v Sambrook et al., viz výše, který je zde uveden jako odkaz.

Typicky mohou být následující obecné postupy použity pro určení hybridizačních podmínek. Nukleové kyseliny jsou přeblotovány/přeneseny na syntetickou membránu, jak ^! , b ‘' bylo popsáno výše. Nukleotidová sekvence přirozeně se vyskytujícího typu podle vynálezu je označena, jak je popsáno výše, a je analyzována schopnost této značené nukleové ( kyseliny . . .Jb hybridizovat s mobilizovanou nukleotidovou sekvencí. ,

Zkušení adresáti rozpoznají, že hybridizaci ovlivňuje mnoho faktorů. Specifická aktivita radioaktivně značené polynukleotidové sekvence by typicky měla být vyšší nebo rovna 10⁸ dpm/pg pro zajištění detěkovatelného signálu. Radioaktivně značená nukleotidová sekvence se specifickou aktivitou 10⁸ až 10⁹ dpm/pg může detekovat přibližně 0,5 pg DNA. Je dobře známé v oboru, že pro umožnění detekce musí být na membráně mobilizováno dostatečné množství DNA. Je žádoucí mít nadbytek mobilizované DNA obvykle 1 áž 10 pg. Přidání inertního polymeru, jako je 10% (w/v) dextran-sulfát (MW 500 000) nebo polyethylenglykol 6000, během hybridizace může také zvýšit senzitivitu hybridižace (viz Ausubel et al., viz výše v 2.10.10).

Pro dosažení smysluplných výsledků z hybridizace mezi nukleovou kyselinou mobilizovanou na membráně a značenou nukleovou kyselinou musí po odmývání zůstat hybridizováno dostatečné množství značené nukleové kyseliny na mobilizovanou nukleovou kyselinu. Odmývaní zajišťuje, že se značená nukíeová kyselina hybridizuje pouze na mobilizovanou nukleovou kyselinu s požadovaným stupněm komplementarity ke značené nukleové kyselině.

Metody pro detekci značených nukleových kyselin hybridizovaných k mobilizované nukleové kyselině jsou dobře známy osobám znalým oboru. Tyto metody zahrnují autoradiografii, chemiluminiscenční, fluorescenční , a kolorimetrickou detekci. , · ,

V jiném provedení mohou být hómology nukleové kyseliny vynálezu připraveny podle následujícího postupu:

i) získání extraktu nukleových kyselin z vhodného hostitele;

ii) vytvoření primerů, které jsou optimálně degenerované a každý z nich obsahuje část nukleotidové, sekvence vynálezu a iii) použití těchto primerů, pro J amplifikaci, pomocí technik amplifikace nukleových kyselin, jednoho nebo více amplifikačních produktů ze zmíněného extraktu nukleových kyselin. , \ · ' ' í

Vhodně je hostitelem bakterie,

S výhodou je hostitelem rod Neisseria.

Ještě výhodněji je hostitelem N. meningitidis nebo N lactamica.

Primery použitelné podle metod amplifikace sekvencí nukleových kyselin zahrnují SEQ ID NOS: 40 až 51, jak je popsáno detailněji níže.

Vhodné techniky amplifikace nukleových kyselin jsou dobře známy zkušeným osobám a zahrnují polymerázovou řetězovou reakci (PCR), jak je například popsáno v kapitole 15 vAusubel et al., viz výše, která je zde začleněna jako odkaz; amplifikaci vytěsňováním řetězce (SDA), jak je například popsáno v U.S. Patentu č. 5 422 252, který jé zde začleněn jako odkaz; replikaci rotujícím kružnicí (RCR), jak je například popsáno v Lit e/ al., 1996, J. Am. Chem. Soc. 118 1587 a v mezinárodní žádosti WO 92/01813 a Lizardi et al·., (mezinárodní žádost WO 97/19193), které jsou zde začleněny jako odkazy; amplifikicí i ;

založenou na sekvenci nukleové kyseliny (NASBA), jak je například popsáno v Sooknanan e/ al., 1994, Biotechniques 17 1077, který je zde začleněn jako odkaz; a Q-β replikasovou amplifikaci, jak je například popsáno v Tyagi et al., 1996, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 93 5395, který je zde začleněn jako odkaz.

Jak je zde užíváno, „amplifikační produkt“ odkazuje na produkt nukleové kyselily vytvořený technikami amplifikace nukleových kyselin.

Protilátky

I

Vynález také zahrnuje protilátky proti izolovaným proteinovým fragmentům,! variantám a derivátům vynálezu. Protilátky vynálezu mohou být polyklonální neboj monoklonální. Dobře známé protokoly aplikovatelné na produkci protilátek, jejich purifikacil a použití mohou být nalezeny například v kapitole 2 vColigan et al., CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY (John Wiley & Sons NY, 1991-1994) a Harlow, E. & Lané, D. Antibodies: A Laboratory Marrual, Cold Spring Harbor, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988, které jsou zde uvedeny jako odkazy.

Obecně se protilátky vynálezu vážou na nebo se konjugují s polypeptidem, fragmentem, variantou nebo derivátem vynálezu. Například protilátky mohou zahrnovat polyklonální protilátky. Takovéto protilátky mohou být například připraveny injikováníni polypeptidu, fragmentu, varianty nebo derivátu vynálezu do produkčních druhů, který může; zahrnovat myši nebo králíky, pro získání polyklonálního antiséra. Metody produkce polyklonálních protilátek jsou dobře známy osobám zkušeným v oboru. Příkladové protokoly, které mohou být použity, jsou popsány například v Coligan et al., CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, viz výše, a v Harlow & Lané, 1988, viz výše.

Místo polyklonálního antiséra získaného z produkčního druhu mohou být produkovány monoklonální protilátky použitím standardní metody popsané například v článku Kóhler & Milstein, 1975, Nátuře 256, 495, který je zde uveden jako odkaz, nebo ·,24 - ; · pomocí jejich novějších modifikací jako těch, které jsou uvedeny například v Coligan et al., CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, viz výše imortalizaeí sleziny něho jiných protilátky produkujících buněk odvozených z produkčního druhu, který byl inokulován jedním nebo více polypeptidy, fragmenty, variantami nebo deriváty vynálezu.

Vynález ve své šíři také zahrnuje protilátky, které jsou tvořeny Fc nebo Fab fragmenty polyklonálních nebo monoklonálních protilátek zmíněných výše. Alternativně mohou protilátky obsahovat jeden řetězec Fv protilátky (scFvs) proti peptidu vynálezu. Takovéto scFvs mohou být připraveny například v souladu s metodami popsanými v Patentu Spojených států č. 5 091 513, Evropském patentu č. 239 400 nebo v článku Winter & Mílstein, 1991, Nátuře 349 293, které jsou zde uvedeny jako odkazy.

Protilátky vynálezu mohou být použity pro afinitní chromatografii při izolaci přírodních nebo rekombinantních polypeptidů N. meningitidis. Pro příklad může být uveden odkaz na protokol imunoafinitní chromatografie popsané v kapitole 9.5 v Coligan et al., CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, viz výše.

Protilátky mohou být použity pro::

i) hledání v expresních knihovnách pro identifikaci variant polypeptidů vynálezu;

ii) identifikaci imunoreaktivních fragmentů nebo imunoreaktivních epitopů; a/nebo iii) detekci infekce N. meningitidis-, ; ’ jak bude popsáno dále, ale bez limitování na tato konkrétní použití.

Detekce N. meningitidis ; š

Přítomnost nebo absence N. meningitidis u individua může být stanovena izolací biologického vzorku ze zmíněného individua, smícháním protilátky nebo fragmentu protilátky ' 'jt ^- ' popsané výše s biologickým vzorkem a detekcí specificky navázané protilátky nebo fragmentu protilátky, která indikuje přítomnost Ň. meningitidis ve vzorku.

Termín “biologický vzorek” tak, jak je používán zde, odkazuje na .vzorek, který může být extrahován, neupraven, upraven, zředěn nebo zakoncentrován, z individua, jako je pacient. Vhodně je biologický vzorek vybrán ze skupiny obsahující celou krev, sérum, plasmu, sliny, moč, pot, ascitickou tekutinu, pěritoneální tekutinu, synoviální tekutinu, amniotickou tekutinu, cerebrospinální tekutinu, kožní biopsii a podobné.

Jakákoliv vhodná technika pro stanovení vzniku komplexu může být použita. Například protilátky nebo fragment protilátky podle vynálezu mající značku mohou být použity pro imunotesty. Takovéto imunotesty mohou zahrnovat, ale nejsou tím: limitovány, radioimunotesty (RIA), s enzymem spojené imunosorbentní testy (ELISA) imunochromatografické techniky (ICT), které jsou dobře známy osobám zkušeným v oboru

Pro příklad může být učiněn odkaz na kapitolu 7 v Coligan et al., CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, viz výše, která obsahuje mnoho různých variant imunotestů, které mohou být použity v souladu s touto přihláškou. Imunotesty mohou zahrnovat kompetetivní testy, jak jsou známy v oboru. í

Značka asociovaná s protilátkou nebo fragmentem protilátky může zahmovati následující:

A) přímé spojení značky s protilátkou nebo fragmentem protilátky;

B) nepřímé spojení značky s protilátkou nebo fragmentem protilátky; tj!:

I připojení značky na jinou látku testu, která se následně váže na protilátlii nebo fragment protilátky; a

C) připojení na následný reakční produkt protilátky nebo fragmentu protilátky

Značka může být vybrána ze skupiny obsahující chromogen, katalyzátor, enzym, fluorofor, chemiluminiscenční molekulu, lanthanoidový iont jako je europium (Eu³⁴), radioisotop a přímou vizuální značku. V případě přímé vizuální značky mohou být tyto tvořeny koloidní kovovou nebo nekovovou partikulí, partikulí barviva, enzymem nebo substrátem, organickým polymerem, latexovou partikulí, liposomem nebo jinými vezikuly obsahujícími signál produkující substanci a podobné.

Velké množství enzymů použitelných jako značky je obsaženo ve specifikacích patentů Spojených států U. S. 4 366 241, U. S. 4 843 000 a U. S. 4 849 338, které jsou zde uvedeny jako odkazy. Enzymové značky použitelné v této přihlášce zahrnují alkalickou fosfatasu, křenovou peroxidasu, luciferasu, β-galaktosidasu, glukosaoxidasu, lysozym, malátdehydrogenasu a podobné. Enzymová značka může být použita samostatně nebo v kombinaci s druhým enzymem v roztoku.

Vhodně je fluorofor vybrán ze skupiny obsahující fluoresceinisothiokyanát (FITC), tetramethylrhodaminisothiokyanát (TRITL) nebo R-Phycoerythrin (RPE).

Vynález se také rozšiřuje na metodu detekce infekce N. meningitidis u pacientů, zmíněná metoda zahrnuje kroky spojení biologického vzorku z pacienta s polypeptidem, fragmentem, variantou nebo derivátem vynálezu a detekcí přítomnosti nebo absence komplexu mezi zmíněným polypeptidem, fragmentem, variantou nebo derivátem a specifickými protilátkami proti N. meningitidis ve zmíněném séru, kdy je přítomnost daného komplexu indikací této infekce.

. 26 .

Ve výhodném provedení detekce výše zmíněného komplexu je uskutečňována detekovatelnou modifikací zmíněného polypeptidu, fragmentu, varianty nebo derivátu vhodnou značkou, jak je dobře známo v oboru, a pomocí těchto modifikovaných složek v imunotestu, jak bylo pro příklad popsáno výše. í

V jiném aspektu vynález poskytuje metodu detekce bakterie N. meningitidis v biologickém vzorku podezřelém, že obsahuje zmíněnou bakterii, tato metoda zahrnuje kroky izolace biologického vzorku z pacienta, detekce sekvence nukleové kyséliny podle vynálezu ve zmíněném vzorku, která indikuje přítomnost této bakterie. Detekce’ zmíněné sekvence nukleové kyseliny může být stanovena pomocí jakékoliv vhodné, techniky. Například značená nukleová kyselina podle vynálezu může být použita jako sonda pro Southern blot extraktu nukleových kyselin získaného z pacienta, jak je dobře známo y oboru.

Alternativně může být značená nukleová kyselina podle vynálezu použita jako sonda . pro Northern blot RNA extraktu z pacienta.

S výhodou je extrakt nukleových kyselin z pacienta použit spolu s oligonukleotidovými příměry odpovídajícími sense a antisense sekvencím sekvence nukleové kyseliny podle vynálezu nebo jejím sousedním oblastem pro amplifikační reakci nukleových kyselin, jako jsou PCR nebo lígasová řetězová reakce (LCŘ), která je například popsána v mezinárodní žádosti WO89/09385, která je zde uvedena jako odkaz.

Vhodné je také množství automatizovaných detekčních technik na pevné fázi. Například „Věry large scale immobilized primer arrays“ (VLSIPS™) jsou používány pro detekci nukleových kyselin, jak bylo například popsáno v Fodor et a/.,. 1991, Science 251 767 a vKazal et al., 1996, Nátuře Medicine 2 753. Výše zmíněné obecné techniky jsou dobře známy osobám zkušeným v oboru.

Farmaceutické prostředky

Dalším rysem vynálezu je použití polypeptidu, fragmentu, varianty nebo derivátu vynálezu („imunogenního agens“) jako účinné.složky ve farmaceutických prostředcích pro ochranu pacientů proti infekci N. meningitidis.

Vhodně farmaceutický prostředek obsahuje farmaceuticky přijatelný nosič, diluent nebo excipient.

„Farmaceuticky přijatelným nosičem, diluentem nebo excipientěm“ jsou chápány pevné nebo tekuté plnidlo, diluent nebo enkapsulační látka, které mohou být bezpečně používány pro systematické podávání. V závislosti na konkrétním způsobu podávání může _sbýt použita řada nosičů, které jsou dobře známy v oboru. Tyto nosiče mohou být vybrány ze , skupiny obsahující cukry, škroby, celulosu a její deriváty, slad, želatinu, talek, síran vápenatý, rostlinné oleje, syntetické oleje, polyoly, kyselinu alginátovou, fosfátem pufrované roztoký, emulgátory, isotonické roztoky a soli, jako jsou soli minerálních kyselin zahrnu ící

I \ hydrochloridy, bromidy a sírany, organické kyseliny, jako jsou acetáty, propionáty, malonatý, a vodu neobsahující pyrogeny.

Užitečným odkazem popisujícím farmaceuticky přijatelné nosiče, diluenty a excipienty je Remingtonů Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co. N.J. USA, 1991), který je zde uveden jako odkaz.

Jakákoliv bezpečná cesta podávání může být využita pro podávání prostřed] ai vynálezu pacientovi. Například může být využito orální, rektální, parenterální, sublinguální!, bukální, intravenózní, intraartikulámí, intramuskulámí, intradermální, subkutánní, inhalační intraokulámí, intraperitoneální, intracerebroventrikulámí, transdermální a podobné podávání.' Intramuskulámí a subkutánní injekce je výhodná například pro podávání imunogenních prostředků, vakcín a DNA vakcín.

Dávkové formy zahrnují tablety, disperze, suspenze, injekce, roztoky, sirupy, pastilký, kapsule, čípky, aerosoly, transdermální náplasti a podobné. Tyto dávkové formy mohou taki zahrnovat injikaci nebo implantaci zařízení pro kontrolované uvolňování vytvořené specificky pro tento účel nebo jiné formy implantátů modifikované tak, aby navíc fungovaly tímto způsobem. Kontrolované uvolňování terapeutické látky může být ovlivněno jejím potažením například hydrofóbními polymery zahrnujících akrylové pryskyřice, vosky, vyšší alifatické alkoholy, kyseliny polymléčnou a polyglykolovou, a určitými celulosovými deriváty, jako je hydroxypropyl(methyl)celulosa. Navíc může být kontrolované uvolňování ovlivněno použitím dalších polymerových matric, liposomů a/nebo mikrosfér.

i

Farmaceutické prostředky přihlášky vhodné pro orální nebo parenterální podávám mohou být prezentovány jako jednotlivé jednotky, jako jsou kapsule, sáčky nebo tablety obsahující predeterminované množství jedné nebo více terapeutických látek vynálezu v podobě prášku nebo granulí nebo jako roztoku nebo suspenze ve vodném roztoku, v nevodném roztoku, emulse oleje ve vodě nebo emulze vody v oleji. Takovéto prostředky mohou být připraveny jakoukoliv farmaceutickou metodou, ale všechny metody obsahují krok smísení jedné nebo více imunogenních látek, jak jsou popsány výše, s nosičem, který tvoří jednu nebo více nezbytných součástí. Obecně jsou prostředky připravovány stejnoměrným a dokonalým promíšením imunogenních látek vynálezu s tekutými nosiči nebo jemně dělenými pevnými nosiči nebo oběma a následně, pokud je to nutné, tvarováním produktu do požadované podoby.

Výše zmíněné prostředky mohou být podávány způsobem kompatibilním se složením dávky a v takovém množství, které je imunogenně účinné pro ochranu pacientů před infekcí N. meningitidis. Dávka podávaná pacientovi, v kontextu tohoto vynálezu, by měla být dostatečná pro vyvolání prospěšné odpovědi u pacienta po určitou dobu, jako je snížení množství N. meningitidis nebo zabránění infekce N. meningitidis. Množství imunogenní látky (látek) pro podávání může záviset na léčeném subjektu včetně jeho věku, pohlaví, hmotnosti a zdravotního stavu. Z tohoto pohledu bude záviset přesné množství imunogenní látky (látek) požadovaného pro podání na úsudku lékaře.

Při stanovení účinného množství imunogenní látky pro podávání pro léčbu nebo profylaxi proti N. meningitidis může lékař určit její hladinu cirkulující v plazmě, průběh choroby a produkci protilátek proti N. meningitidis. Při jakékoliv události mohou být vhodné dávky imunogenní látky vynálezu snadno stanoveny osobami zkušenými v oboru. Takovéto dávky mohou být v řádu nanogramů až miligramů imunogenních látek vynálezu.

Výše zmíněné prostředky mohou být použity jako terapeutické nebo profylaktické vakcíny. Podle toho se vynález rozšiřuje i na produkci vakcín obsahujících jako aktivní látku jednu nebo více imunogenních látek vynálezu. Různé aplikovatelné postupy jsou zamýšleny, pro produkci těchto vakcín. Příkladné postupy zahrnují například ty, které jsou popsány v NEW GENERATION VACCINES (1997, Levine et al., Marcel Dekker, lne. New York, Basel Hong Kong), který je zde uveden jako odkaz.

Imunogenní látka podle vynálezu může být smíchána, konjugována nebo, fúzována s jinými antigeny zahrnujícími epitopy jiných aritigénů pro B a T buňky. Navíc může být konjugována s nosičem, jak je popsáno níže.

•í '

Pokud je použit haptenový peptid vynálezu (tj. peptid, který reaguje s danou protilátkou, ale sám nemůže vyvolat imunitní odpověď), může být konjugován s imunogenním nosičem. Použitelné nosiče jsou dobře známy v oboru a zahrnují například: thyreoglobulin; albuminy, jako je lidský sérový albumin; toxiny, toxoidy nebo jakýkoliv mutantní křížově reaktivní materiál (CRM) toxinu z tetanu, záškrtu, černého kašle, Pseudomonas, E. coli, Staphylococcus a Streptococcus; polyaminokyseliny, jako jsou poly(lysin:glutamová kyselina); chřipku; Rotavirus VP6, Parvovirus VPl a VP2; „core“ protein viru hepatitidy B; rekombinantní vakcíňu viru hepatitidy B a podobné. Alternativně j může být použit fragment nebo epitop nosičóyého proteinu nebo jiný imunogenní protein. Například haptenový peptid vynálezu může být spojen sepitopem T buňky pro bakteriální toxin, toxoid nebo CRM. Z tohoto pohledu může být učiněn odkaz na U. S. Patent č. 5 785 973, který je zde začleněn jako odkaz.

Navíc polypeptid, fragment, varianta nebo derivát vynálezu může účinkovat jako

I ^: nosičový protein ve vakcinačním prostředku namířeném proti Neisseria nebo proti jiným bakteriím nebo virům.

Imunogenní látky vynálezu mohou být podávány jako multivalentní podjednót! vakcín v kombinaci s antigeny N. meningitidis nebo antigeny jiných organizmů včetně patogenních bakterií H. influenzae, M. catarrhalis, N. gonorrhoeae, E. coli, S. pneumortiae atd. Alternativně nebo navíc mohou být podávány společně s oligosacharidovými nltL polysacharidovými složkami N. meningitidis.

Vakcíny mohou také obsahovat farmaceuticky přijatelný nosič, diluent nebo excipiénf jak byly definovány dříve.

Vakcíny a imunogenní prostředky mohou obsahovat adjuvans, jak je dobře známo v oboru. Adjuvans zamýšlené přihláškou zahrnují, ale nejsou tím limitovány: povrchově aktivní látky, jako jsou hexadecylamin, oktadecylamin, estery oktadecylaminokysehn, lysolecithin, dimethyl(dioktadecyl)amonium-bromid, N,N-dioktadecyl-N',N '-bis(j2y hydroxyethyl(propandiamin)), methoxy(hexadecyl)glycerol, pluronové polyoly; polyamidy! jako jsou pyran, dextran-sulfát, póly IC karbopol; peptidy, jako jsou muramyl dipeptid á deriváty, dimethylglycin, tuftsin; olejové emulze; a minerální gely, jako jsou fosfát hlinitý, hydroxid hlinitý nebo kamenec; lymfokiny, QuilA a komplexy stimulující imunitu (ISCOMS).

S ohledem na příklady adjuvans je také učiněn odkaz na Mezinárodní publikaci WO99/36544 uvedenou zde jako odkaz.

Vakcinace podáním DNA

Expresní konstrukty obsahující modifikované proteiny NhhA vynálezu mohou být podávány lidem pro jejich profylaktickou a/nebo terapeutickou léčbu. Z tohoto ohledl expresní konstrukty mohou kódovat jeden nebo více modifikovaných peptidů, polypeptidůj fragmentů nebo derivátů NhhA, kolektivně nazývané jako „imunogenni agens“.

Expresní konstrukty také zahrnují konstrukty pro genovou terapii, které využívají specializované vektory pro genovou terapii, jako je vakcinie, a virové vektory použitelné pro genovou terapii. Posledně zmíněné zahrnují adenoviry a adeno-asociované viry (AAV), jako jsou popsány vFranceschi et al., 2000, J. Cell Biochem. 78 476, Braun-Falco et al., 1999, Gene Ther. 6 432, retrovirové a lentivirové vektory, jako jsou popsány v Buchshacher et al., 2000, Blood 95 2499, a vektory odvozené od herpes simplex viru a cytomegaloviru. Obecný souhrn vektorů pro genovou terapii a metody podávání mohou být nalezeny v Robbins et al., 1998, Trends in Biotech. 16 35. Exemplárním odkazem, který popisuje množství vektorů ka ' ' .

potenciálně vhodných pro genovou terapii používajících proteiny z Neisseria a metody podávání, je Mezinárodní publikace WO99/36544, kteráje zde uvedena jako odkaz. _;

Imunogenní agens vynálezu můžé být exprimován atenuovanými virovými hostiteli. „Atenuovaným virovým hostitelem“ jsou míněny virové vektory, které jsou buď přirozeně v podstatě avirulentní, nebo tak byly upraveny. Virus může být upraven, aby byl v; podstatě avirulentní, jakýmkoliv vhodným fyzikálním (tj. působením vysoké teploty) nebo chemickým způsobem (tj. působením formaldehydu). „Vpodstatě avirulentním“ je míněn virus, jehož infektivita byla zničena. Ideálně je infektivita viru zničena bez ovlivnění proteinů, které nesou imunogenitu viru. Z předcházejícího bude oceněno, že ateňuovaný virový hostitel může zahrnovat živé viry nebo inaktivované viry.

Atenuovaní viroví hostitelé, kteří mohou být užiteční ve vakcínách podle vynálezu, mohou obsahovat virové vektory včetně adenoviru, cytomegaloviru a s výhodou poxvirů, jako je vakcinia (viz například Paoletti and Panicali, U.S. Patent č. 4 603 112, který je zde uveden jako odkaz) a atenuovaných kmenů Salmoneíla (viz například Stocker, U.S. Patent č.

550 081, který je zde uveden jako odkaz). Živé vakcíny jsou zvláště výhodné, protože vedou k prodlouženému stimulu, který může udělovat důležitou dlouhotivající imunitu. Další odkaz, který popisuje různé virové vektory potenciálně vhodné pro imunizaci používající proteiny z Neisseria a metody podávání, je Mezinárodní publikace WO99/36544, která je zde , · uvedena jako odkaz. j,

Multivalentní vakcíny mohou být připraveny z jednoho nebo více . mikroorganizmů, které exprimují různé epitopy N. meningitidis (papi. jiné povrchové proteiny nebo epitopy N. > meningitidis). Navíc mohou být do vakcíny inkorporovány epitopy jiných patogenních mikroorganizmů. . , i

Ve výhodném provedení budou zahrnovat přípravu rekombinantního vakcinia viru pro expresi sekvence nukleové kyseliny podle vynálezu. Po zavedení do hostitele exprimuje rekombinantní vakcinia virus imunogenní agens a tak. navozuje hostitelskou CTL odpověď.

Pro příklad může být učiněn odkaz na U.S. Patent č. 4 722 848, který je zde uveden jako odkaz a který popisuje vakcinia vektory a metody užitečné pro imunizační protokoly.

Velké množství dalších vektorů užitečných pro terapeutické podávání nebo imunizaci imunogenními agens vynálezu bude z uvedeného popisu zřejmé pro osoby znalé oboru.

V dalším provedení nukleotidová sekvence může být použita jako vakcíňá ve formě „nahé DNA“ vakcíny, jak je známo v oboru. Například expresní vektor vynálezu může být vnesen do savce, kde způsobí produkci polypeptidů in vivo, proti kterému hostitel vyvine ;ι imunitní odpověď, jak je například popsáno vBarry, M. et al., (1995, Nátuře, 377: 632 |až

635), který je zde uveden jako odkaz.

Detekční soupravy

Přihláška také zahrnuje soupravy pro detekci N. meningitidis v biologickém vzorkuj Ty budou obsahovat jedno nebo více agens popsaných výše v závislosti na podstatě použité testovací metody. Z tohoto pohledu mohou soupravy obsahovat jeden nebo více polypeptidů, fragmentů, variant, derivátů, protilátek, fragmentů protilátek nebo nukleovou kyselinu podle vynálezu. Soupravy mohou také libovolně obsahovat vhodné reagencie pro detekci značek pozitivní a negativní kontroly, promývací roztoky, ředící pufry a podobné. Například souprava založená na detekci nukleových kyselin může obsahovat i) nukleovou kyselinu podle vynálezu (která může být použita jako pozitivní kontrola), ii) oligonukleotidový primeij podle vynálezu a libovolně DNA polymerasu, DNA ligasu atd podle použité techniky amplifikace nukleových kyselin.

Příprava imunoreaktivntch fragmentů

Vynález se také rozšiřuje na metodu identifikace imunoreaktivních fragmentů polypeptidu, variant nebo derivátů podle vynálezu. Tato metoda v podstatě zahrnuje vytvoření fragmentu polypeptidu, varianty nebo derivátu, podávání fragmentu savci; a detekci imunitní odpovědi u savce. Tato odpověď bude zahrnovat produkci elementů, které specificky vážou N. meningitidis a/nebo zmíněný polypeptid, variantu nebo derivát, a/nebo ochranný účine < proti infekci N. meningitidis.

Před testováním určitého fragmentu na imunoreaktivitu ve výše zmíněné metodě může být použito mnoho predikčních metod pro odhad, zda konkrétní fragment může být použit pro získání protilátky, která bude křížově reagovat s přirozeným antigenem. Tyto predikční metody mohou být založeny na aminokoncových nebo karboxykoncových sekvencích, jak je například popsáno v kapitole 11.14 vAusubel et al., viz výše. Alternativně mohou být tyto i predikční metody založeny na odhadu hydrofility, jak je například popsáno v Kyte & Doolittle 1982, J. Mol. Biol. 157 105 a v Hopp & Woods, 1983, Mol. Immunol. 20 483, ktere jsou zde uvedeny jako odkazy, nebo na odhadu sekundární struktury, jak je například popsáno v Choo & Fasman, 1978, Ann. Rev. Biochem. 47 251, který je zde uveden jako odkaz.

Navíc „mapování epitopů“ používá monoklonální protilátky vynálezu pro identifikaci křížově reaktivních epitopů nejdříve testováním jejich schopnosti poskytovat křížovou ochranu a následně jsou identifikovány epitopy rozpoznávané zmíněnými protilátkami

Příkladná metoda je poskytnuta vColigan et al., CURRENT PROTOCOLS IN

IMMUNOLOGY, viz výše.

Obecně poskytují optimální výsledky peptidové fragmenty tvořené 10 až 15 zbytky.

•i

Peptidy tak malé jako 6 a tak velké jako 20 zbytků byly úspěšně použity. Tyto peptidové fragmenty mohou být následně chemicky připojeny k nosičové molekule, jako je „keyhole limpet hemocyanin“ (KLH) nebo bovinní sérum albumin (BSA), jak je například popsáno v sekcích 11.14 a 11.15 v Ausubel et al., viz výše.

Bude taktéž oceněno, že peptidy mohou být synteticky cirkularizovány,¹ jak jě například popsáno vHoogerhout et al., 1995, Infect. Immun. 63 3473, který je zde uveden jako odkaz.

Peptidy mohou být použity pro imunizaci živočichů, jak je například diskutováno výše. Titry protilátek proti přirozenému nebo výchozímu polypeptidů, ze kterého byl peptid vybrán, mohou být poté stanoveny například radioimunotestem nebo ELISA metodou, jak je například popsáno v sekcích 11.16 a 114 v Ausubel et al., viz výše.

Protilátky mohou být poté purifikovány z příslušné biologické tekutiny živočicha frakcionací sulfátem amonným nebo chromátograficky, jak je dobře známo v oboru. Příkladové protokoly pro purifikaci protilátek jsou obsaženy v sekcích 10.11 a 11:13 v Ausubel et al., viz výše, který je zde uveden jako odkaz.

Imunoreaktivita protilátky proti přirozenému nebo výchozímu polypeptidů může být stanovena jakoukoliv relevantní metodou, jako je například Western blót.

Funkční blokátory

U polypeptidů přirozeně se vyskytujícího typu NhhA/HiaNm uvedených vWO99/31132 se předpokládají adhezní vlastnosti. Ve skutečnosti mají určitou podobnost s adheziny z Haemophilus influenzae, což jsou povrchové antigeny. Konkrétně jsou přibližně ze 67% homologní s proteinem Hia z //. influenzae (Barenkamp & St. Geme III, 1996, Molecular Microbiology 19 1215) a ze 74% homologní s proteinem Hsf zH. influenzae (St. Geme ΠΙ, J. et al., 1996, Journal of Bacteriology 178 6281; a U.S. Patent č. 5 646 259). Pro tato porovnání byly použity váha mezery 3 a váha délky 0,01 v GAP programu (Deveraux, 1984, viz výše). Proto může mít narušení funkce těchto polypeptidů významný terapeutický přínos, neboť bude zabraňovat bakterii N. meningitidis v adhezi a invazi do buněk. Narušení funkce může být dosaženo několika způsoby. ; ' *

Například mohou být podávány sloučeniny, jako jsou chemické reagencie nebo polypeptidy, které blokují receptory na povrchů .buněk, jež interagují s polypeptidy vynálezu. Ty kompetují s infekčním organizmem o receptorová místa. Tyto sloučeniny mohou například zahrnovat polypeptidy vynálezu, zvláště fragmenty nebo jejich funkční ekvivalenty stejně jako mimetika.

33'

Termín „mimetika“ zde odkazuje na chemikálie, které jsou navrženy tak, aby se podobaly určitým funkčním oblastem proteinů nebo peptidů. Anti-idiotypické protilátky vytvořené proti výše popsaným protilátkám, které blokují vazbu bakterií na povrch buňkyI mohou být také použity. Alternativně mohou sloučeniny, které interagují sreceptorvazebnými místy polypeptidu vynálezu, účinně zabraňovat infekci buňky N. meningitidis. Takovéto sloučeniny mohou zahrnovat blokující protilátky, peptidy nebo jiné chemické látky.

Všechny takovéto sloučeniny, farmaceutické prostředky, ve kterých jsou kombinovány s farmaceuticky přijatelnými nosiči, a metody léčby podáváním takovýchto sloučenin něh o! prostředků pacientům trpícím infekcí N. meningitidis jsou dalším aspektem vynálezu.

Polypeptidy vynálezu mohou být použity pro hledání sloučenin pro jejich použití vé výše uvedených metodách. Například polypeptidy vynálezu mohou být kombinovány se značkou a vystaveny vlivu buněčné kultury za přítomnosti testované látky. Schopnost látky inhibovat vazbu značeného polypeptidu na buněčný povrch může být následně pozorována. V takovémto testu mohou být značené polypeptidy použity přímo na organizmu, jako je E. coli. Alternativně může být upravena sama N. meningitidis tak, aby exprimovaa modifikovanou a detekovatelnou formu polypeptidu. Použití upravených kmenů N. meningitidis v této metodě je preferováno, protože je více pravděpodobné, že terciární struktura proteinu bude více podobná té, která je exprimována v bakterii přirozeně se vyskytujícího typu.

Proto, aby byl vynález snadno porozumitelný a dán do praktického používám, budou popsána konkrétní výhodná provedení v následujících nelimitujících příkladech.

Příklady provedeni vynálezu

Příklad 1

I

Identifikace konstantních a variabilních oblastí polypeptidů NhhA

Předkladatelé zkoumali aminokyselinové sekvence NhhA, které jsou konzervovány a/nebo nekonzervovány mezi deseti (10) kmeny N. meningitidis. Nekonzervované oblasti se rozdělují do čtyř variabilních oblastí (VI, V2, V3 a V4) a konzervované oblasti se rozdělují na Cl, C2, C3, C4 a C5 (jak je ukázáno na OBR. 1 a Tabulce 1; SEQ ED NOS: 1 až 11).

Srovnání odpovídající nukleotidové sekvence je ukázáno na OBR. 2 (SEQ ID NOS: 12 až

22).

i

I

34-j

Příklad 2

Nadprodukce polypeptidu PMC 21 NhhA

Protein NhhA kódovaný genem nhhA τ kmene PMC21 N. meningitidis se nadprodukuje pomocí expresního konstruktu, v němž je gen nhhA funkčně { spojen s promotorem. ¹

Následující oligonukleotidové primery se použijí pro PCR amplifikaci otevřeného čtecího rámce nukleové kyseliny nhhA ž kmene PMC21N. meningitidis'. * i

H0MP5': 5'- CAA TTA ACG GCC GAA TAA AAG GAA GCC GAT ATG

AAC AAA ATA TAC CGC ATC - 3' (SEQ ID NO 40); který obsahuje restrikční místo pro Eagl (podtrženo) a sekvenci kódující prvních 7 (sedm) aminokyselin NhhA (tučně). , . i i ·

HOMP3 AN 5'- TGG AAT CCA TGG AAT CGC CAC CCT TCC CTT C - 3' (SEQ ID NO 41); který obsahuje restrikční místo pro Ncol (podtrženo) a reverzně komplementární sekvenci nukleotidů 48 až 61 za koncem otevřeného čtecího rámce nhhA z kmene ¢3 (tučně).

'i

Produkt amplifikace obsahuje restrikční místa, která se následně naštěpí restrikčními endonukleasami Eagl a Ncol. j ‘

Pro subklonování se použije plazmid pCO14K, který obsahuje promotor porA před genem kódujícím silně exprimovaný vnější membránový protein Třídy 1 N. meningitidis společně s přilehlou sekvencí N. meningitidis kmene 2996 a selektabilní gen pro kanamycinovou rezistenci, jak bylo popsáno vRouppe van der Voort, et al., Infect Immun 1996 64 2745. . ,

Naštěpený amplifikační produkt se zaliguje do pCO14K naštěpeného restrikčními endonukleasami Eagl a Ncol. Tato ligace vede k záměně většiny otevřeného čtecího rámce porA za amplifikační produkt nhhA (OBR.’ 3). Takto se vytvoří expresní konstrukt rekombinantní nukleové kyseliny (otevřený čtecí rámec je ukázán v SEQ ID NO 12), který _{ ' i. · · 4 · .. / kóduje polypeptid z 591 aminokyselin, jak je ukázáno v SEQ ED NO 1.

. ' * _J ) ^kl ' . í

Tímto se dosáhne exprese nukleové kyseliny nhhA tohoto vynálezu pod kontrolou silného promotoru porA. Translace začíná na kodonu ATG začínajícího v pozici 31 H0MP5'.

Aby se zabránilo fůzi mezi porA a nhhA, sekvence HOMP5' obsahuje TAA stop kodon před ' i ' iniciačním ATG popsaným výše.

Výsledný plazmid, pIP52(PMC2l), sejlinearizuje restrikčňím štěpením a použije se ^! pro transformaci N. meningitidis kmene 7G2 pomocí metody popsané v Janik et al., 1976, Journal of Clinical Microbiology 4 71. Transformanti se selektují inkubací přes noc při 37 °C v 5% CO2 na tuhém médiu obsahujícím 100 pg/ml kanamycinu. Kolonie rezistentní na kanamycin se vyberou, subkultivují přes noc a prověří se na nadprodukci polypeptidu NhhA elektroforetickou separací celkových buněčných proteinů na 10% SDS-PAGE, po které následuje přenos na nitrocelulózovou membránu pomocí Semi-Dry blotter (BioRai Membrána se poté postupně inkubuje s králičím anti-NhhA sérem (jak je popsáno v Mezinárodní publikaci WO99/31132) a alkalickou fosfatasou konjugovanou s anti-kráJičí IgG (Sigma) před kolorimetrickou detekcí pomocí NBT/BCIP (Sigma). Izoluje se jeden klon, který exprimuje polypeptid NhhA ve velikém množství ve srovnání s výchozím kmenem (OBR. 11). Analýzou předpokládané aminokyselinové sekvence pomocí počítačového programu SIGCLEAVE (součást programového balíku eGCG umístěného na www.angis.org.au) se ukáže, že prvních 51 aminokyselin se odštěpí, aby se vytvořil maturovaný polypeptid (OBR. 14; SEQ ID NO: 33).

Plazmidový konstrukt pIP52(PMC21) se může transformovat do jakéhoko ív transformačně kompetentního kmene N. meningitidis.

Příklad 3

Nadprodukce polypeptidu 1141 NhhA

Protein NhhA kódovaný genem nhhA z kmene H41 N. meningitidis se nadprodukůie použitím stejných metod popsaných v Příkladě 2. Takto se vytvoří expresní konstrud rekombínantní nukleové kyseliny (otevřený čtecí rámec ukázán v SEQ ID NO: 13), kteý kóduje polypeptid z 591 aminokyselin, jak je ukázáno v SEQ ID NO: 2. V tomto příkladě se výsledný plazmid pIP52(H41) linearizuje a transformuje do N. meningitidis kmene 7G2. Kolonie rezistentní na kanamycin se analyzují a z nich se vybere ta, která pomocí Western imunoblotu vykazuje nadprodukci NhhA (OBR. 11). Analýzou předpokládaré aminokyselinové sekvence pomocí počítačového programu SIGCLEAVE (součást programového balíku eGCG umístěného na www, angi s. org, au) se ukáže, že prvních 51 aminokyselin se odštěpí, aby se vytvořil maturovaný polypeptid (OBR. 14; SEQ ID NO. 34).

Tato strategie se může použít pro tvorbu expresních konstruktů obsahujících přirozegě se vyskytující sekvenci nhhA dalších kmenů N meningitidis.

Příklad 4

Konstrukce deleční mutanty NhhA pomocí vhodného restrikčního místa

Pro jednoduché odkazování je aminokyselinová sekvence polypeptidu NhhA kódovaného nukleovou kyselinou nhhA z kmene PMC21 ukázána v SEQ ID NO 1.

I

I i

I

I .' , . , ·. . . ,

Předkladatelé vytvořili deleční mutaňtu ž přirozeně se vyskytujícího typu nhhA z PMC21, kde je nejvíce variabilní oblast mezi kmeny odstraněna. Amplifíkační produkt kódující aminokyseliny 1 až 54 přirozeně se vyskytujícího typu polypeptidu NhhA zPMC21 se vytvoří PCR amplifikací z templátu nukleové kyseliny nhhA použitím následujících primerů: ‘

H0MP5': 5 - CAA TTA ACG GCC GAA TAA AAG GAA GCC GAT

ATG AAC AAA AT A TAC CGC ATC - 3' (SEQ ID NO 40); který je stejný jako oligonukleotid použitý pro tvorbu nadprodukujícího konstruktu pIP52.

NH3 BG: 5 - GGT CAG ATC TGT TTC ATT GTT AGC ACT TGC 3'(SEQ ID NO 42); který obsahuje restrikční místo Bglll (podtrženo) a reverzně komplementární sekvenci kódující aminokyseliny 134; (dvojitě podtrženo) a 49 až 54 přirozeně se vyskytujícího typu NhhA z PMC21 (tučně).

Výsledný amplifíkační produkt obsahuje místa pro restrikční endonukleasy Eagl a Bg/II. pIP52(PMC21) obsahuje jedno místo pro Eagl 20 bp před začátkem otevřeného čtecího rámce (ORF) nhhA a jedno místo pro BgZH, které je umístěno uvnitř ORF (viz Obrázek 3B). Proto se pIP52(PMC21) a amplifíkační produkt vystaví štěpení restrikčními endonukleasami Eagl a BglU, zaligují se a použijí pro transformaci kompetentního kmene DH5a bakterií E. coli; tím se zamění Eagl/BglU fragment z pEP52(PCM21) PCR produktem. Tím se vytvoří ‘i ř ' *! · ' ' ' expresní konstrukt rekombinantní nukleové kyseliny (otevřený čtecí rámec ukázán na OBR. 5; SEQ ID NO 28), kteiý kóduje polypeptid z 512 aminokyselin, jak je ukázáno na OBR. 5 SEQ ID NO 23. Tato aminokyselinová sekvence obsahuje aminokyseliny 1 až 54 a í34 až 592 sekvence přirozeně se vyskytujícího typu, takže se odstraní většina oblasti VI, celé oblasti V2 a C2 a část oblasti C3 z přirozeně se vyskytujícího typu polypeptidu NhhA zPMC21.

Tento plazmid se linearizuje restrikčním štěpením a transformuje se do kmene 7G2 N. meningitidis. Pomocí metod popsaných v Příkladě 1 se vybere jeden klon, kteiý nadprodukuje zkrácený NhhA z PMC21 (OBR. 11).

Analýzou předpokládané aminokyselinové sekvence pomocí počítačového programu SIGCLEAVE (součást programového balíku JeGCG umístěného na www.angis.org.au) se ukáže, že prvních 51 aminokyselin se odštěpí, aby se vytvořil maturovaný polypeptid (OBR. 14; SEQ ID NO: 35). Pro potvrzení přítomnosti odštěpitelné signální sekvence a pro potvrzení identity nadprodukovaného proteinu se částéčně purifikují vnější membránové proteiny izolací frakce, která je nerozpustná v detergentu sarkosylu.

37’

Izolované membránové proteiny se elektroforeticky separují před přenosem ra Nylonovou membránu. Poloha nadprodukovaného proteinu se prokáže barvením pomocí Coomassie. Tato oblast membrány se vystřihne a protein se sekvenuje od N konce. Prvních jedenáct aminokyselin tohoto proteinu je XXETDLTSVGT, které odpovídají aminokyselinovým zbytkům 52 až 62 (včetně) aminokyselinové sekvence, která se předpokládá, že bude exprimována nadprodukujícím konstruktem, jak je definován v tomto příkladě.

Toto je příklad delece využívající existující restrikční místa uvnitř polynukleotidové sekvence. Tento konstrukt může být transformován do jakékoliv transformačně kompetentní N. meningitidis.

Příklad 5

Konstrukce deleční mutanty NhhA pomocí vhodného restrikčního místa

Expresní konstrukt obsahující sekvenci přirozeně se vyskytujícího typu nhhA z H41 de připraví podle popisu v Příkladě 2. Výsledný expresní konstrukt se pojmenuje pIP52(H41) Deleční mutanta se připraví pomocí strategie popsané v tomto příkladě. V tomto případě s e použijí oligonukleotidové primery:

H0MP5': 5 - CAA TTA ACG GCC GAA TAA AAG GAA GCC GA|T

ATG AAC AAA ATA TAC CGC ATC - 3' (SEQ ID NO 40); který je stejný jako oligonukleotid použitý pro tvorbu nadprodukujícího konstruktu pIP52.

NH3 STU 5 - GAT CAG GCC TGT ATC TTC ATC GGT AGC ATT 3' (SEQ ED NO 43); který obsahuje restrikční místo Stil (podtrženo) a reverzně komplementární sekvenci kódující aminokyseliny 134 (dvojitě podtrženo) a 49 až 54 přirozeně se vyskytujícího typu H41 NhhA (tučně).

Výsledný amplifikační produkt obsahuje jedno místo pro restrikční endonukleasy Eagl a Stul. Expresní konstrukt pIP52(H41) obsahuje tato restrikční místa. Proto se pIP52(H41) a amplifikační produkt vystaví štěpení restrikčními endonukleasami Eagl a Stul, zaligují se a použijí pro transformaci kompetentního kmene DH5a bakterií E. coli·, touto ligací se zamění EagUStul fragment zpIP52(H41) PCR produktem. Tím se vytvoří expresní konstrukt rekombinantní nukleové kyseliny (otevřený čtecí rámec ukázán na OBR. 6 a SEQ ID NO 29), který kóduje polypeptid z 513 aminokyselin, jak je ukázáno na OBR 6 a SEQ ID NO 24. Tato aminokyselinová sekvence obsahuje aminokyseliny 1 až 54 a 134 až 593 sekvence přirozeně se vyskytujícího typu, takže se odstraní většina oblasti VI, celé oblasti V2 a C2 a část oblasti C3 z přirozeně se vyskytujícího typu polypeptidů NhhA z H41.

Tento plazmid se linearizuje restrikčním štěpením a transformuje se do kmene 7G2 N. meningitidis. Pomocí metod popsaných v Příkladě 1 se vybere jeden klon, který nadprodukuje zkrácený NhhA z H41 (OBR. 11).

Analýzou předpokládané aminokyselinové sekvence pomocí počítačového programu SIGCLEAVE (součást programového balíku eGCG umístěného na www, angis. org, au) se ukáže, že prvních 51 aminokyselin se odštěpí, aby se vytvořil maturovaný polypeptid (OBR. 14; SEQ Π) NO: 36).

Tento konstrukt může být transformován do jakékoliv kompetentní N. meningitidis.

Příklad 6

Konstrukce deleční mutanty NhhA pomocí “splice-overlap “ PCR

Kromě použití vhodných restrikčních míst pro deleci variabilních oblastí z nukleotidů kódujících NhhA mohou se mutanty také připravit pomocí „Splice Overlap Extension” PCR, jak popsali Ho et al., 1989, viz výše a Horton, R.M., et al., 1989, viz výše. Tímto způsobem se mohou vytvářet polynukleotidy, které kódují konstantní oblasti, ale variabilní oblasti mají odstraněny (viz Obrázek 5 A, 5B, 5C).

V tomto případě se vytvoří konstrukt obsahující oblasti Cl a C5 a všechny ostatní oblasti jsou odstraněny (viz Obrázek 5 A).

Následující oligonukleotidové primery se použijí v PCR reakcích pro amplifikaci DNA odpovídající oblasti Cl (víz OBR. 1) z chromozomální DNA kmene PMC21:

H0MP5'. 5 - CAA TTA ACG GCC GAA TAA AAG GAA GCC GAT

ATG AAC AAA ATA TAC CGC ATC - 3' (SEQ ID NO 40); který je stejný jako oligonukleotíd použitý pro tvorbu nadprodukujícího konstruktu pIP52(PMC21).

SO-C: 5' - GAC GAA ATC AAC GTT CTT AGC ACT TGC CTG

AAC CGT TGC - 3'(SEQ ID NO 44); což je reverzně komplementární sekvence k sekvenci kódující aminokyseliny 237 až 24Tna začátku oblasti C5 (podtrženo) a aminokyseliny 45 až 52 na konci oblastí Cl (tučně) přirozeně se vyskytujícího typu NhhA z kmene PMC21.

Amplifikační produkt této reakce je HOMP5 '/SO-C.

.39

Následující oligonukleotidé primery se použijí vPCR reakcích pro amplifikaci C5 z chromozomální DNA kmene PMC21:

SO-D: 5'- AAC GTT GAT TTC GTC CGC ACT TAC - 3' (SEQ tt>

NO 45); kteiý kóduje aminokyseliny 237 až 244 na začátku C5 (podtržené je ukázána sekvence reverzně komplementární k primeru SO-C),

HO3'AN: 5'- TGG AAT CCA TGG AAT CGC CAC CCT TCC CTT C 3' (SEQ ID NO 41); který je stejný jako primer použitý pro konstrukci pIP52.

Amplifikační produkt této reakce je S0-D/H03'AN.

Amplifikační produkty HOMP57SO-C a S0-D/H03AN se po elektroforeticke separaci purifikují zagarózového gelu, smíchají se a podrobí se další amplifikaci pomocí primerů H0MP5' a HO3 AN. Výsledný amplifikační produkt kóduje aminokyseliny 1 až 52 a 337 až 591 přirozeně se vyskytujícího typu NhhA zPMC21. Tento amplifikační produkt se vystaví restrikčnímu štěpení Eag\ a Ncol a nakloňuje se do pCO14K, jak je popsáno v Příkladě 1. Tato rekombinantní molekula obsahuje oblasti Cl a C5, takže jsou odstraněný oblasti VI až V4 a C2 až C4. Nukleotidová sekvence otevřeného čtecího rámce je ukázána na OBR. 7 a SEQ ED NO 30 a předpokládaná polypeptidová sekvence odvozená od této nukleotidové sekvence je ukázána na OBR. 7 a SEQ ID NO 25.

Tento plazmid se linearizuje restrikčním štěpením a transformuje se do kmene 7G2 Vi meningitidis. Pomocí metod popsaných v Příkladě 2 se vybere jeden klon, který nadproduktje zkrácený NhhA z PMC21.

Analýzou předpokládané aminokyselinové sekvence pomoci počítačového programu SIGCLEAVE (součást programového balíku eGCG umístěného na www.angis.org. au) >e ukáže, že prvních 51 aminokyselin se odštěpí, aby se vytvořil maturovaný polypeptid (OBR 14; SEQ ID NO: 37).

Tento plazmid může být transformován do jakéhokoliv transformačně kompetentní!} kmene N. meningitidis.

Příklad 7

Konstrukce deleční mutanty NhhA pomocí “spiice-overlap“ PCR

Bude oceněno, že se obdobná strategie může použít pro tvorbu rekombinantnícl] polynukleotidů kódujících různé oblasti NhhA. Pomocí následující strategie (viz Obrázek 511) se může vyrobit konstrukt obsahující oblasti Cl, C4, V4 a C5:

. . ' l ý , ' \

Cl oblast se amplifikuje použitím oligonukleotidových primerů: »

H0MP5': 5'- CAA TTA ACG GCC GAA TAA ÁAG GAA GCC GAT

ATG AAC AAA ÁTA TAC CGC ATC - 3' (SEQ ID NO 40);

SO-E: 5' - AAC GCT TGC CGC ACG GTT AGC ACT TGC CTG · ·' ’

CAA CGT TGC - 3 '(SEQ ID NO 46); který kóduje reverzně komplementární sekvenci aminokyselin 211 až 215 na začátku oblasti C4 (podtrženo) a na konci oblasti Cl (tučně); z kmene PMC21. ’

Amplifikační produkt této reakce je H0MP5'/SO-E.

Následující oligonukleotidé primery se použijí v PCR reakcích pro amplifikaci oblasti

C4-V4-C5 z chromozomální DNA kmene PMC21: í

SO-E. 5' - CGT GCG GCA AGC GTT AAA GAC GTA - 3' (SEP ID !

'A ;

NO 47); který kóduje aminokyseliny 211 až 218 na začátku C4 í · · -^k ’ 1 (podtržené je ukázána sekvence reverzně komplementární ¹k primerů SO-E), :

HO3'AN: 5'- TGG AAT CCA TGG AAT CGC CAC CCT TCC CTT C 3' (SEQ ID NO: 41). .

Amplifikační produkt této reakce je SO-F/HOMP3'. ;

Amplifikační produkty HOMP57SO-E a SO-F/HO3AN se po elektroforetické separaci purifikují zagarózového gelu,: smíchají a podrobí se další amplifikaci pomocí primerů H0MP5' a Η03ΆΝ. Výsledný produkt kóduje aminokyseliny 1 až 52 a 211 až 591 přirozeně se vyskytujícího typu NhhA zPMC21. Tento amplifikační produkt se vystaví restrikčnímu štěpení Eagl a Ncol a nakloňuje se do pCO14K. Tato rekombinantní molekula « obsahuje oblasti Cl, C4, V4 a C5, takže jsou odstraněny oblasti VI až V3 a C2 až C3. i

Nukleotidová sekvence otevřeného čtecího rámce je ukázána na OBR. 8 a SEQ ED NO 31a předpokládaná polypeptidová sekvence odvozená od této nukleotidové sekvence je ukázána na OBR. 8 a SEQ ID NO 26. Analýzou předpokládané aminokyselinové sekvence pomocí počítačového programu SIGCLEAVE (součást programového balíku eGCG umístěného na www.angis.org.au) se ukáže, že prvních 51 aminokyselin se odštěpí, aby se vytvořil · i- ’ ' maturovaný polypeptid (OBR. 14; SEQ ID NO: 38).

< !. ♦·*

Tento konstrukt může být transformován do jakékoliv transformačně kompetentní V. meningitidis.

Příklad 8

Konstrukce deleční mutanty NhhA pomocí “splice-overlap“ PCR

Bude oceněno, že se obdobná strategie může použít pro tvorbu rekombinantrích polynukleotidů kódujících různé oblasti NhhA. Pomocí následující strategie (viz Obrázek 5C) se může vyrobit konstrukt obsahující oblasti Cl, C2, C3, C4 a C5.

Cl a C2 se amplifikuje použitím oligonukleotidových příměrů:

H0MP5'; 5 - CAA TTA ACG GCC GAA TAA AAG GAA GCC GAT

ATG AAC AAA ATA TAC CGC ATC - 3' (SEQ ID NO 40) SO-G: 5' - CAG CGA GTA GGT GAA TTG TTT GAT TTT CÁG

GTT GTC GCC GGC TTT GAG GGT GTT AGC ACT TGC CTG AAC CGT - 3 (SEQ ID NO 48); který kódlije reverzně komplementární sekvenci aminokyselin 125 až 129 na začátku oblasti C3 (podtrženo), celou oblast C2 (aminokyseliny

I :

109 až 120, tučně a dvojitě podtrženo) a konec oblasti C;1 (aminokyseliny 46 až 52, tučně) z kmene PMC21.

Amplifikační produkt této reakce je HOMP57SO-G.

C3 a část oblasti C4 se amplifikují použitím následujících oligonukleotidových primerů:

SO-H. 5' - TTC ACC TAC TCG CTG AAA AAA GAC - 3' (SEQ ED

NO 49); který kóduje aminokyseliny 125 až 132 na začátku C3 (podtržené je ukázána sekvence reverzně komplementáři k primeru SO-G)

SO-I: 5 - GCC AGC GTT TAA TAC GTC TTT AAC GCT TGC

CGC ACG ATC GGT CAA AGT CGA ACC AAT - 3' (SEQ Π) NO 50); který kóduje reverzně komplementární sekver.ci aminokyselin 182 až 188 na konci C3 (podtrženo) aminokyselin 211 až 222 z C4 (tučně).

Amplifikační produkt této reakce je SO-H/SO-I.

Amplifikační produkty HOMP57SO-G a SO-H/SO-I se po elektroforetické separaci purifíkují zagarózového gelu, smíchají se a podrobí se další amplifikaci pomocí prime ř

H0MP5' a SO-I, aby byl získán produkt kódující aminokyseliny 1 až 52, 103 až 114, 125 iž

188 a 211 až 222, tj. oblasti Cl, C2, C3 a část C4. Amplifikační produkt této reakce je

HOMP5/SO-I.

' 42 .: ' í

C5 a část oblasti C4 se amplifikujíJ použitím následujících oligonukleotidových * primerů: I _t

SO-J: 5 - GTA ΤΓΑ AÁC GCT .GGC TGG AAC ATT AAA GGC

GTT AAA AAC GTT GAT TTC GTC CGCACT - 3 (SEQ ID NO 51); který kóduje aminokyseliny 218 až 229 z, C4 (podtrženo) a aminokyseliny 237 až 243 z C5 (tučně) přirozeně se vyskytujícího typu NhhA z kmene PMC21. (Podtržené a tučně je ukázána sekvence reverzně komplementární k SO-I);

HO3 AN: 5 - TGG AAT CCA TGG AAT CGC CAC CCT TCC CTT C3'(SEQ ID NO. 41).

Amplifikační produkt této reakce je SO-J/HO3 AN.

Amplifikační produkty HOMP57SO-I a S0-J/HO3 AN se po elektroforetické' separaci purifikují z agarózového gelu, smíchají se a podrobí se další amplifikaci pomocí! primerů H0MP5' a H03 AN. Výsledný produkt kóduje aminokyseliny 1 až 52, 103 až 114, 125, až ! 188, 211 až 229 a 237 až 591 přirozeně se vyskytujícího typu NhhA z kmenePMC21. Výsledný produkt se vystaví restrikčnímu štěpení Eagl a Ncól a nakloňuje se do pCO14K.

Tato rekombinantní molekula obsahuje oblasti Cl, C2, C3, C4 a C5, takže jsou odstraněny oblasti VI, V2, V3 a V4. Nukleotidová sekvence otevřeného čtecího rámce je ukázána na OBR. 9 a SEQ ID NO 32 a předpokládaná polypeptidová sekvence odvozená od této » nukleotidové sekvence je ukázána na OBR! 9 a SEQ ID NO 27. Analýzou předpokládané aminokyselinové sekvence pomocí počítačového programu SIGCLEAVE (součást programového balíku eGCG umístěného na www.angis.org.au) se ukáže, že prvních 49 ¹ aminokyselin se odštěpí, aby se vytvořil maturovaný polypeptid (OBR. 14; SEQ ID NO: 39). !

Tento konstrukt může být transformován do jakéhokoliv transformačně kompetentního kmene N. meningitidis. \Příklad 9 ; ϊ ’···'. ,i| ' '

Purifikace nadprodukovaných polypeptidů. NhhA

Rekombinantní polypeptid NhhA popsaný v předcházejících příkladech se může / i , .· _o · '' ' - _v izolovat následujícím postupem. Bakterie se nechají růst přes noc (12 až 14 hodin) ;při 37°C : ·' L ' ¹ v atmosféře 5% CO₂. (V tomto případě sé · použije médium BHI doplněné agarem s Leventhalovou bází. Další růstová média jsou dobře známa osobám zkušeným v oboru.) Bakterie z deseti 25 ml agarových misek se sklidí a suspendují ve 25 ml 10 mM Tris upraveného na pH 8,0 pomocí HC1. Přidá se stejné množství 10 mM Tris (pH 8,0)

45:

obsahujícího 2% sarkosyl a směs se jemně míchá 1 hodinu při 4°C. Toto se centrifuguje p 100 000 x g sedmdesát minut při 20°C a supematant se vyhodí. Peleta se resuspendi páskováním přes jehlu tloušťky 25 v 25 ml 10 mM Tris (pH 8,0) obsahujícího 1% sarkosy Toto se centrifuguje při 100 000 x g sedmdesát minut při 20°C a supematant se vyhodí. Peleta se resuspenduje páskováním přes jehlu tloušťky 25 v 10 ml 10 mM Tris (pH 8,0). Tato frak ce obsahuje v sarkosylu nerozpustné buněčné komponenty a je obohacena o proteiny vnější membrány. Může se přidat dodatečný krok pro odstranění reziduálního detergentu sarkosylu, přičemž se proteinový roztok dialyzuje při čtyřech cyklech 4 až 8 hodin proti 100 až 1000 objemům například 10 mM Tris.Cl pH 8,0 nebo PBS (fosfátem pufrovaný roztok) při 4°C.

Po určení koncentrace proteinů v suspenzi pomocí absorbance při vlnové délce 280 nm nebo použitím BCA soupravy (Pierce) se přibližně 1 ml roztoku obsahující 10 ng proteinu v roztoku obsahujícím 1% SDS (laurylsulfát sodný), 2% β-merkaptoethanol se separuje na 1,5 mm silném 6% SDS-PAGE v přístroji Mini-protean Π od firmy BioRad. NhhA s vysokou molekulární hmotností se z gelu eluuje použitím „mini Whole gel Eluter“ od firmy BioRad. Přibližně 10% z každé eluované frakce se zkontroluje separací na SDS-PAGE a následným barvením Coomassie. Frakce obsahující NhhA významně čisté od ostatních proteinů se spojí dohromady. Tento postup se použije pro izolaci nadprodukované ιό maturovaného NhhA popsaného v Příkladě 2 (SEQ ID NO : 1), nadprodukované delece Bg, Π maturovaného NhhA popsaného v Příkladě 4 (SEQ ID NO: 23) a nadprodukované delecní mutanty NhhA popsané v Příkladě 6 (SEQ ID NO: 25). Izolovaný protein je ukázán na OBR

12.

Příklad 10

Imunogenita puňfikovaných polypeptidů deleční mutanty NhhA

Myši se inokulují purifikovanými polypeptidy NhhA přirozeně se vyskytujícího typu delečními mutantami popsanými v předcházejících Příkladech. V první skupině se kažcla Balb/C myš subkutánně inokuluje přibližně 130 pg PMC21 NhhA s MPL + TDM™ adjuvans(získáno od Sigma-Aldrich) v den 0, 115 pg v den 14. Ve druhé skupině se každá myši inokuluje přibližně 120 pg proteinu s MPL + TDM ™ adjuvans (získáno od Sigma-Aldrich); v den 0 a 190 pg v den 14. Ve třetí skupině se každá myš inokuluje přibližně 260 pg proteinu s MPL + TDM™ adjuvans (získáno od Sigma-Aldrich) v den 0 a 1240 pg v den 14. Krevní vzorky se odeberou v den 21 a izoluje se sérum. Tato séra se testují na přítomnost protilátek rozpoznávajících celou délku NhhA zPMC 21 pomocí Western imunoblotu (OBR. 13).

Preparáty OMC (5 mg) z P6 (nadprodukuje PMC21 NhhA) a z kmene 2A (exprese NhhA zrušena) se separují na 6% SDS-PAGE pomocí elektroforetického aparátu Mini Protean Π od firmy BioRad. Proteiny se elektroforeticky přenesou na nitrocelulózu a filtr se nařeže na 3 mm proužky, následně se blokuje v 5% odtučněném sušeném mléku vPBS. Myší séra se ředí 1:1000 a 1:10 000 v 5% odtučněném mléku a inkubují se s mtrocelulózovými proužky. Vazba protilátky se detekuje použitím alkalické fosfatasy konjugované santi-myší IgG (Sigma) před kolorimetrickou detekcí půmocí NBT/BCIP (Sigma). Jak může být vidět na OBR. 13, je možné vyvolat imunitní odpověď proti celé délce maturovaného polypeptidu PMC21 NhhA inokulací delečních mutant NhhA nebo nezkráceným maturovaným polypeptidem NhhA.

Přikladli

Exprese polypeptidu deleční mutanty v E; coli

Kromě exprese mutantních polypeptidů tohoto vynálezu v N. meningitidis mohou být tyto také exprimovány v bakteriích E.coli, jakákoliv deleční mutanta rekombinantního nhhA z Příkladů 4 až 8 může být použita jako templát přo PCR amplifikaci. Jako oligonukleotidové primery se mohou použít ty, které byly popsány v Mezinárodní Publikaci WO99/31132 (jako SEQ ED NO 24 a SEQ ED NO 25 tohoto dokumentu). Amplifikační produkt se může restrikčně naštěpit enzymy BamHMHindiW a ligOvat s BamHUHindSL restrikčně naštěpeným plazmidem pMALC2 (New England BioLábs) a výsledný plazmid se transformuje do kompetentních E. coli kmene DH5a. Výsledný; kmen se může indukovat k expresi velkého množství rekombinantního proteinu za podmínek doporučovaných výrobcem pMALC2. Výsledný rekombinantní protein je íuzát proteinu vazájícího maltózu a polypeptidu deleční mutanty NhhA tohoto vynálezu. Ten se může částečně purifikovat separací na SĎS-PAGE následované elektroelucí použitím Mini-Gel Electro-eluter (BioRad) podle pokynů výrobce. Částečně purifikovaný fuzní protein se může následně dialyzovat proti PBS před štěpením proteasou enzymem Faktor Xa, aby se odstranila skupina proteinu vázajícího maltózu z rekombinantního proteinu NhhA. Rekombinantní protein NhhA se může purifikovat standardními metodami, jaké například popsal R. K. Scopes, Protein Purification (SpringerVerlag, New York, NY USA, 1993).

Ve specifikaci cílů byla popsána výhodná provedení tohoto vynálezu bez omezování vynálezu na jakékoliv provedení nebo specifický soubor znaků. Proto bude oceněno osobami zkušenými v oboru na základě zveřejnění, že různé modifikace a změny mohou být učiněny v jednotlivých ukázkových provedeních, aniž by dóšlo k odklonu od záměru přihlášky.

Všechny počítačové programy, algoritmy, patent a vědecká literatura, na které se odkazuje, jsou zde zahrnuty jako odkazy.

de

Průmyslová využitelnost

Polypeptidy a nukleové kyseliny vynálezu jsou využitelné pro přípravu protilátek, pro detekci N. meningitidis v biologických vzorcích, pro přípravu farmaceutických prostředků pro ochranu pacientů před infekcí N. meningitidis, pro DNA vakcinaci, pJo přípravu imunoreaktivních fragmentů a jako funkční blokátory. Konkrétně jsou využité Jé v diagnostice, v terapeutických a profylaktických vakcínách a při navrhování a/nebo hled mí léků. Polypeptidy a nukleové kyseliny vynálezu jsou zvláště užitečné ve vakcínách, které účinně imunizují proti širšímu spektru kmenů N. meningitidis, než by se očekávalo odpovídajícího povrchového antigenu přirozeně se vyskytujícího typu.

od

I

TABULKA 1

-604

O\ VD

o> m

-589

-594

4“H O\ <n

!

599

•598

598

594

592

O

249

t> cn 04

l> co 04

235-

239-

237-

244-

243-

cn 'xl“ CM

1 O\ cn CM

237-

-248

SO cn 04

-234

-238

236

243

•242 I

242 1

238. |

236

.>

240

O co 04

230·

225·

232-

230-

237-

236-

232-

228-

-239

OS 04 04

-229

-224

i—4 cn cm

Os 04 04

•236

235 1

235 I

^«4 cn CM

•227

ČT~

4—H Ol 04

i—4 4-H 04

f—1 4—4 CM

206·

cn 1—4 04

F—4 ^4 CM

7 ·'

00 F-4 CM

217-

o- 4—4 04

cn r4 04

209-

-220

O F—4 04

-210

-205

-212

210 I

' '

217

216 I

216 |

212

208

>

OS OS F=M

C\ oo 1 — <

O\ oo 4—4

186-

Os ^-4

189-

SO Os ^—4

wn o> i-H

in σ\

1—4 os

189-

00 O\

00 00 1—4

00 00 1—<

WD 00 i—-4

190

00 00 1—4

m O\ F—4

•194 1

f—4

o os 4—4

00 00 F—4

cn o

m cn F—4

0Ί CM

A cm ^•4

04 04 f·^

θ' 04 1

cm f—4

CM cn 1—4

4—4 cn i—4

4-H cn

4> 04

<n CM 4—4

-134

CM 1—4

CM 4“^

i—< Ol

126

. f f’ . i

xr Ol FH

b

1—1 cn I-—1

O cn 4—4

130 Ί

SO 04 4—4

Tt CM 1“H

ol >

<s

4—^ 04 4—4

A i-H

00 i—1

o 1—4

i . i .

04 1—4

00 F-í

o- 4—4 ^4

r4 FK

o- 4^4

wv

O 04

O 04 i-H

Γ·Ή 1“H

t> f—4

so i-H r-4

I 1 ·

O 04 4—^

I> 4-H

SO 4—M

SO 4—4

SO ^•4

4—4

04 O

60 Ij

Os O 4—H

A o 1—4

106-

A o

109-

Ί

SO o 4—4

o ^4

105-

vn o

103-

00 o t—4

00 o

04 O i—4

VD O 1—^

xr o r—4

00 o 4—4

i ·

m o 4--4

-

104

o ^—4

o 1—4

102

1—4 >

»n

^•4 wn

ΟΊ

1—4 un

/n

1 .

4—4 in

j

4“H 0Ί

in

4—4 in

^4 <n

o <n

O *n

-50

-50 .

l··'

-50

5.' <'

50

-50

50

o

4-H

4—H

^“4

r—4

4—4

• ;

i—4

F—4

4“H

—

F“4

1—4 1—4

04

cn

?r

í

SO

00

0s

o 4“^

Konsensus

SEQ ID NO:

f^4 04 O s CL PL

SEQ ID NO:

i—4 3

SEQ ID NO:

O 04 CL

SEQ ID NO:

EG327

SEQ ID NO:

EG329

SEQ ID NO:

H38

SEQ ID NO:

m t—4

SEQ ID NO:

BZ10

SEQ ID NO:

BZ198

SEQ ID NO .

Z2491

ó Θ o ω co

I

TABULKA 2

Původní zbytek	Příkladné substituce
Ala	Ser
Arg	Lys
Asn	Gin, His
Asp	Glu
Cys	Ser
Gin	Asn
Glu	Asp
Gly	Pro
His	Asn, Gin
He	Leu, Val
Leu	Ile, Val
Lys	Arg, Gin, Glu
Met	Leu, He
Phe	Met, Leu, Tyr
Ser	Thr
Thr	Ser
Trp	Tyr
Tyr	Trp, Phe
Val	Ile, Leu

I

Claims

PATENTO VÉ NÁROKY

1. Izolovaný protein, vyznačujlící še tím, že obsahuje dvanáct nebo více ' i i' · · sousedních konzervovaných aminokyselin polypeptidu NhhA, kde izolovaný protein není přirozeně se vyskytujícím typem polypeptidu NhhA.
2. Izolovaný protein podle nároku 1, v y z n a č u j i c i se t i m, že je schopen vyvolat imunitní odpověď.
3. Izolovaný protein podle nároku 2, vyznačuj ici se tim, že imunitní odpověď je méně kmenově specifická než ta, která,je vyvolána odpovídajícím zmíněným polypeptidem NhhA.
4. Izolovaný protein podle nároku 3, vyznačující se tim, že imunitní odpověď poskytuje ochranu proti jednomu nebo více kmenům N. meningitidis.

i
5. Izolovaný protein podle nároku 3,yyznačující se tím, že imunitní odpověď poskytuje ochranu proti mnoha kmenům N. meningitidis.
6. Izolovaný protein podle nároku 1, v y z na čující se t i m, že obsahuje dvacet nebo více sousedních konzervovaných aminokyselin.
7. Izolovaný protein podle nároku 6, vyznačující se tim, že obsahuje padesát nebo více sousedních konzervovaných aminokyselin.
8. Izolovaný protein podle nároku 7, v y z na čuj ící se t i m, že obsahuje sto nebo více sousedních konzervovaných aminokyselin.

• -j. ¹ ' '
9. Izolovaný protein podle nároku 1,; v y z n a č u j i c i se tím, že polypeptid NhhA má aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny obsahující SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO? 4; SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 9 a SEQ ID NO: 10.
10. Izolovaný protein, vyznačující se tím, že obsahuje aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny obsahující:

i) zbytky 1 až 50 ze SEQ ID NO: 11;

ii) zbytky 109 až 120 ze SEQ ID NO: 11;

iii) zbytky 135 až 198 ze SEQ ED NO: 11;

iv) zbytky 221 až 239 ze SEQ ID NO: 11;

v) zbytky 249 až 604 ze SEQ ID NO: 11, kde izolovaný protein není přirozeně se vyskytujícím typem polypeptidů NhhA.
11. Izolovaný protein podle nároku 10, vyznačující se tím, že izolovaný proi má aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny obsahující:

i) zbytky 1 až 50 ze SEQ ID NO. 1;

em ii) zbytky 1 až 50 ze SEQ ID NO:2;

iii) zbytky 1 až 50 ze SEQ ID NO:3;

vii) zbytky 1 až 50 ze SEQ ID NO:4;

viii) zbytky 1 až 50 ze SEQ ID NO:5;

ix) zbytky 1 až 50 ze SEQ ED NO:6;

x) zbytky 1 až 50 ze SEQ ED NO:7;

xi) zbytky 1 až 50 ze SEQ ID NO:8;

xii) zbytky 1 až 50 ze SEQ ID NO.9;

xiii) zbytky 1 až 50 ze SEQ ID NO: 10;

xiv) zbytky 125 až 188 ze SEQ ID NO. 1;

xv) zbytky 125 až 188 ze SEQ ID NO:2;

xvi) zbytky 122 až 185 ze SEQ ID NO:3;

xvii) zbytky 127 až 190 ze SEQ ED NO:4; xviii) zbytky 125 až 188 ze SEQ ID NO:5;

xix) zbytky 132 až 195 ze SEQ ID NO:6;

xx) zbytky 131 až 194 ze SEQ Π) NO.7;

xxi) zbytky 131 až 194 ze SEQ ID NO:8;

xxii) zbytky 127 až 190 ze SEQ ID NO:9; xxiii) zbytky 125 až 188 ze SEQ ID NO: 10;

xxiv) zbytky 211 až 229 ze SEQ ID NO: 1;

xxv) zbytky 206 až 224 ze SEQ ID NO: 3;

xxvi) zbytky 237 až 591 ze SEQ ED NO:1;

I xxvii) zbytky 237 až xxviii) zbytky 235 až xxix) zbytky 239 až xxx) zbytky 237 až xxxi) zbytky 244 až xxxii) zbytky 243 až xxxiii) zbytky 243 až xxxiv) zbytky 239 až xxxv) zbytky 237 až

592 ze SEQ ID N0:2; 589zeSEQIDNO:3; 594 ze SEQ ID NO: 4;

591 zeSEQIDN0:5; 599 zeSEQIDN0:6; 598 ze SEQ ID N0:7; 598 ze SEQ ID NO:8; 594 ze SEQ ID NO:9 a

592 ze SEQ ID NO: 10 . · '· \i

11. Izolovaný protein podle nároku Í0, vyznačuj i cí se tím, že dále obsahuje jednu nebo více aminokyselin z variabilní (V) oblasti polypeptidu NhhA.

í: ^{; :s}'·'

1 ’ , í i j π ’
12. Izolovaný protein podle nároku 11, vyznačuj ící se tím, že má aminokyselinovou sekvenci vybranou ze Skupiny obsahující: SEQ ID NO:23; SEQ ID NO:24; SEQ ID NO:25; SEQ ID NO:26; SEQ ID NO:27; SEQ ID NO:33; SEQ ID NO:34; SEQ ID NO:35; SEQ ID NO:36; SEQ ID NO:37; SEQ ID NO: 3 8 a SEQ ID NO:39. !' ;· : > / ,í 7..

i. ý. .
13. Alelická varianta, v y z n a č u j í c-í se tím, že je alelickou variantou izolovaného proteinu podle nároku 10.
14. Fragment nebo derivát, vyznačující se derivátem izolovaného proteinu podle nároku 10.

t í m, že je fragmentem nebo
15. Fragment podle nároku 13, v y z n a č u j ící s e t í m, že je imunogenní.
16. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje jeden nebo více t ,ř izolovaných proteinů podle kteréhokoliv z nároků 1 až 15.
17. Farmaceutický prostředek podle nároku 16, vy z n a čuj í c í s e tím, že je vakcínou.

5.1
18. Izolovaná nukleová kyselina, vyznačující se tím, že kóduje izolovaný protein podle kteréhokoliv z nároků 1 až 15.
19. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 18, vyznačující se tím, že p nukleotidovou sekvenci vybranou ze skupiny obsahující:

i) zbytky 1 až 150 ze SEQ ID NO:22;

ii) zbytky 325 až 361 ze SEQ ID NO:22;

iii) zbytky 403 až 595 ze SEQ ID NO:22;

iv) zbytky 661 až 717 ze SEQ ID NO:22 a

v) zbytky 745 až 1815 ze SEQ ID NO:22.
20. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 19, vy z n a č u j í c i se tím, že nukleotidovou sekvenci vybranou ze skupiny obsahující SEQ ID NO:28; SEQ NO:29; SEQ ID NO:30; SEQ ID NO:31 a SEQ ID NO:32.
21. Expresní vektor, vyznačující se tím, že obsahuje izolovanou nukleov¹kyselinu podle nároku 19 nebo nároku 20.

ma

IĎ ou
22. Hostitelská buňka, vyznačující se tím, že je transformovaná expresním vektorem podle nároku 21.
23. Hostitelská buňka podle nároku 22, vyznačující se tím, že je bakterií.
24. Hostitelská buňka podle nároku 23, vyznačující se tím, že je Neisseria meningitidis.