CZ304379B6

CZ304379B6 - Proteiny obsahující konzervované oblasti povrchového antigenu NhhA z Neisseria meningitidis

Info

Publication number: CZ304379B6
Application number: CZ2002-2482A
Authority: CZ
Inventors: Ian Richard Anselm Peak; Michael Paul Jennings
Original assignee: The University Of Queensland
Priority date: 2000-01-25
Filing date: 2001-01-25
Publication date: 2014-04-09
Also published as: JP2012051902A; KR100698561B1; PL356819A1; BR0107857A; US20090068216A1; NO20023487D0; EP2395013A3; NZ520445A; EP1252182A1; US8367070B2; EP1252182A4; NO332229B1; KR20020065938A; HUP0300696A2; US20020160016A1; CN1419564A; JP2014024849A; ES2389719T3; JP2003523208A; US20090068229A1

Abstract

Izolovaný protein, který tvoří modifikované formy povrchového antigenu z Neisseria meningitidis, a je kódující nukleové kyseliny. Modifikované povrchové proteiny jsou charakterizovány tím, že mají odstraněny nekonzervované aminokyseliny, a proto jsou schopné navozovat křížově protektivní imunitní odpovědi proti Neisseria meningitidis. Použití izolovaného proteinu, který tvoří modifikované formy povrchového antigenu v diagnostice, v terapeutických a profylaktických vakcínách a při navrhování a/nebo hledání léků. Modifikované povrchové antigeny jsou zvláště užitečné ve vakcínách, které účinně imunizují proti širšímu spektru kmenů N. meningitidis, než by se očekávalo od odpovídajícího povrchového antigenu přirozeně se vyskytujícího typu.

Description

Oblast techniky

Tento vynález popisuje nové proteiny, které tvoří modifikované formy povrchového antigenu Neisseria meningitidis, nukleové kyseliny kódující tyto nové peptidy a polypeptidy a jejich použití v diagnostikách, terapeutických a profylaktických vakcínách a ve vytváření a/nebo testování léčiv. Konkrétněji, modifikované povrchové antigeny vynálezu s delecemi nekonzervovaných aminokyselin mohou být užitečné ve vakcínách, které účinně imunizují proti širšímu spektru kmenů N. meningitidis, než by se očekávalo od odpovídajícího povrchového antigenu přirozeně se vyskytujícího typu.

Dosavadní stav techniky

Neisseria meningitidis je Gram negativní bakterie a agens způsobující meningokokální meningitidu a septikémii. Jejím jediným známým hostitelem je člověk a může být bez příznaků přenášena přibližně 10 % populace (Caugant et al., 1994, Journal of Clinical Microbiology 32 323).

N. meningitidis může vytvářet polysacharidovou kapsuli a to umožňuje klasifikaci této bakterie podle podstaty vytvářené kapsule. Existuje nejméně dvanáct sérologických skupin N. meningitidis: A, B, C, 29-E, Η, I, K, L, W135, X, Y a Z, z nichž sérologické skupiny A, B, a C způsobují 90 % meningokokálního onemocnění (Poolman et al, 1995, Infectious Agents and Disease 4 13). Vakcíny proti sérologickým skupinám A a C jsou dostupné, ale polysacharid kapsuly sérologické skupiny B je špatně imunogenní a neindukuje ochranu u lidí.

Proto jsou zkoumány jiné membránové a extracelulámí komponenty pro jejich vhodnost zahrnutí do vakcín. Příklady zahrnují vnější membránové proteiny tříd 1, 2 a 3 (porin; kódovaný geny por) a třídy 4 (Rmp) a 5 (proteiny opacity; kódované geny opa a ope).

Přesto dodnes žádný z těchto kandidátů není schopný indukovat kompletní ochranu, zvláště u dětí (Romero et al., 1994, Clinical Microbiology Review, 7 559; Poolman et al., 1995, viz výše).

Pro vytvoření účinné vakcíny je nutné identifikovat složky N. meningitidis, které jsou přítomny ve většině kmenů a které jsou schopné indukovat ochrannou imunitní odpověď (například baktericidní protilátky).

Z tohoto hlediska jsou učiněny odkazy na Mezinárodní publikace WO 99/24578, WO 99/36544, WO 99/586683 a WO 99/57280, které jsou zde všechny začleněny jako odkazy a popisují mnoho kandidátních proteinů, které mohou být užitečné pro vakcíny pro imunizaci proti Neisseria meningitidis.

Z tohoto hlediska je učiněn specifický odkaz na Mezinárodní žádost WO 99/31132 a Peak et al., 2000, FEMS Immunol. Med. Microbiol. 28 329, obojí je zde začleněno jako odkaz a popisuje nový povrchový antigen izolovaný z mnoha různých kmenů N. meningitidis, tento povrchový antigen a jeho alelické varianty budou pro účely této specifikace označovány jako NhhA.

Podstata vynálezu

Předkladatelé vynálezu objevili, že povrchový antigen NhhA má polypeptidové oblasti, které se liší mezi jednotlivými kmeny N. meningitidis, a jiné oblasti, které jsou konzervovány mezi kmeny. Variabilní oblasti mohou být imunogenní a vedou k vyvolání imunitní odpovědi vůči speci- 1 CZ 304379 B6 fickému kmeni, jako například vakcíny obsahující antigen NhhA odvozený z určitého kmene N. meningitidis vedou preferenčně k imunizaci vůči tomuto kmeni. Jako výsledek předkladatelé vynálezu usilovali o produkci modifikovaného polypeptidu NhhA, který vyvolává imunitní odpověď, která není specifická pro určitý kmen jako ty, které byly vyvolány přirozeně se vyskytujícím typem NhhA. Tento modifikovaný antigen NhhA bude vhodný pro výrobu terapeutických a/nebo profylaktických vakcín proti N. meningitidis, jak bude popsáno dále. Řízením imunitní odpovědi primárně proti konzervovaným epitopům by tyto vakcíny měly účinně imunizovat vůči širšímu spektru kmenů N. meningitidis, než by se očekávalo po imunizaci přirozeně se vyskytujícím typem NhhA.

Tato přihláška je proto široce zaměřena na izolaci proteinů s konzervovanými aminokyselinami polypeptidů NhhA.

Proteiny vynálezu mohou proto mít jednu nebo více delecí nekonzervovaných aminokyselin v porovnání s odpovídajícím přirozeně se vyskytujícím typem polypeptidu NhhA.

V prvním aspektu vynález zahrnuje Izolovaný protein, který obsahuje jednu nebo více konzervovaných oblastí polypeptidu NhhA, které zahrnují aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny skládající se ze

i. zbytků 1 až 50 sekvence SEQ ID No:l 1, ii. zbytků 109 až 120 sekvence SEQ ID No: 11, iii. zbytků 135 až 198 sekvence SEQ ID No:l 1, iv. zbytků 221 až 239 sekvence SEQ ID No: 11 a

v. zbytků 249 až 604 sekvence SEQ ID No: 11, a případně jednu nebo více variabilních (V) oblastí, které zahrnují aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny skládající se ze

i) zbytků 121 až 134 sekvence SEQ ID No: 11, ii) zbytků 199 až 220 sekvence SEQ ID No: 11, a iii) zbytků 240 až 248 sekvence SEQ ID No: 11, s výhradou, že jsou nepřítomné všechny nebo podstatná část zbytků 51 až 108 sekvence SEQ ID No: 11, a kde izolovaný protein je schopný vyvolat imunitní odpověď, která je více zkříženě reaktivní než ta vyvolaná NhhA polypeptidem, a kde izolovaný protein není přirozeně se vyskytujícím typem polypeptidu NhhA.

Vhodně je protein vynálezu schopný vyvolávat imunitní odpověď.

S výhodou je imunitní odpověď méně kmenově specifická než ta, která byla vyvolána odpovídajícím přirozeně se vyskytujícím typem polypeptidu NhhA.

Výhodněji zmíněná imunitní odpověď zahrnuje ochranu proti jednomu nebo více kmenům N. meningitidis, nebo ještě výhodněji proti velkému množství kmenů N. meningitidis.

Sekvence přirozeně se vyskytujícího typu polypeptidu NhhA jsou uvedeny jako příklad na OBR. 1 (SEQ ID NOS: 1 až 10).

Konzervativní sekvence aminokyselin je také uvedena na OBR. 1 (SEQ ID NO: 11).

Izolovaný protein vynálezu s výhodou obsahuje jednu nebo více konstantních oblastí polypeptidu NhhA, které jsou na OBR. 1 označeny jako Cl, C2, C3, C4 a C5 oblasti.

-2 CZ 304379 B6

Bude oceněno, že podle tohoto aspektu jsou jedna nebo více nekonzervovaných aminokyselin variabilní oblasti polypeptidu NhhA označené na OBR. 1 jako VI, V2, V3 nebo V4 oblasti vhodně odstraněny vzhledem k přirozeně se vyskytujícímu typu polypeptidu NhhA.

S výhodou je odstraněna oblast VI nebo alespoň její podstatná část.

V určitých provedeních má izolovaný protein aminokyselinovou sekvenci, jaká je uvedena v kterémkoliv z OBR. 5 až 9 (SEQ ID NOS: 23 až 27), které jsou příklady „modifikovaného polypeptidu NhhA tohoto vynálezu“. Na OBR. 14 (SEQ ID NOS: 33 až 39) jsou ukázány další příklady „maturovaných“ polypeptidů předpokládané vzniklých jako výsledek odstranění N-koncových signálních sekvencí.

Podle druhého aspektu vynález navrhuje izolovanou nukleovou kyselinu kódující polypeptid podle prvního aspektu.

Přirozeně se vyskytující typy sekvencí nukleových kyselin nhhA jsou uvedeny na OBR. 2 (SEQ ID NOS: 12 až 21).

Konzervativní sekvence nukleové kyseliny je také uvedena na OBR. 2 (SEQ ID NO: 22).

S výhodou jsou oblasti Cl, C2, C3, C4 a C5 kódovány příslušnými nukleotidovými sekvencemi, jak je uvedeno na OBR. 2.

S výhodou jsou oblasti VI, V2, V3 a V4 kódovány příslušnými nukleotidovými sekvencemi, jak je uvedeno na OBR. 2.

V konkrétním provedení má izolovaná nukleová kyselina vynálezu nukleotidovou sekvenci, jaká je uvedena na kterémkoliv z OBR. 5 až 9 (SEQ ID NOS: 28 až 32) a které jsou konkrétním příkladem „modifikovaných nukleových kyselin nhhA tohoto vynálezu“.

Vynález podle prvního a druhého aspektu zahrnuje homology, fragmenty, varianty a deriváty izolovaných proteinů a nukleových kyselin vynálezu.

Specificky jsou vyloučeny z pole vynálezu polypeptidy NhhA a nukleotidové sekvence nnhA přirozeně se vyskytujícího typu.

Podle třetího aspektu vynález spočívá v expresním konstruktu obsahujícím expresní vektor a nukleovou kyselinu podle druhého aspektu, kde je zmíněná sekvence funkčně spojena s jednou nebo více regulačními nukleovými kyselinami ve zmíněném expresním vektoru.

Podle čtvrtého aspektu vynález zahrnuje hostitelskou buňku obsahující expresní konstrukt podle třetího aspektu.

Podle pátého aspektu vynálezu je zahrnut způsob přípravy rekombinantního izolovaného proteinu podle prvního aspektu, zmíněná metoda obsahuje kroky:

i) kultivace hostitelské buňky obsahující expresní vektor podle třetího aspektu tak, že zmíněný polypeptid je exprimován v hostitelské buňce a ii) izolace zmíněného rekombinantního polypeptidu.

Podle šestého aspektu vynález zahrnuje protilátku nebo fragment protilátky, které se vážou na protein vynálezu nebo jeho fragment, variantu nebo derivát.

Podle sedmého aspektu vynález poskytuje metodu detekce N. meningitidis v biologických vzorcích, které by ji mohly obsahovat, přičemž zmíněná metoda obsahuje následující kroky:

-3 CZ 304379 B6

i) izolace biologického vzorku z individua;

ii) smíchání výše zmíněné protilátky nebo fragmentu protilátky s biologickým vzorkem a iii) detekce specificky navázané protilátky nebo fragmentu protilátky, která indikuje přítomnost N. meningitidis.

Podle osmého aspektu je poskytnuta metoda detekce bakterie N. meningitidis v biologickém vzorku, který by ji mohl obsahovat, zmíněná metoda obsahuje kroky:

i) izolace biologického vzorku z pacienta;

ii) detekce sekvence nukleové kyseliny podle zmíněného druhého aspektu ve vzorku, která indikuje přítomnost zmíněné bakterie.

Podle devátého aspektu vynález poskytuje metodu pro diagnózu infekce individua N. meningitidis, zmíněná metoda obsahuje kroky:

i) smíchání biologického vzorku z individua s polypeptidem, fragmentem, variantou nebo derivátem vynálezu a ii) stanovení přítomnosti nebo absence komplexu mezi zmíněným polypeptidem, fragmentem, variantou nebo derivátem a specifickou protilátkou proti N. meningitidis nq zmíněném vzorku, kdy je přítomnost komplexu indikací infekce.

S výhodou je individuem savec.

Ještě výhodněji je individuem člověk.

Podle desátého aspektu se vynálezu také zahrnuje použití izolovaného proteinu podle prvního zmíněného aspektu, použití izolovaných nukleových kyselin podle druhého aspektu nebo použití protilátky nebo fragmentu protilátky zmíněných výše v soupravě pro detekci bakterie N. meningitidis v biologickém vzorku.

Podle jedenáctého aspektu vynálezu se poskytuje farmaceutický prostředek obsahující izolovaný protein podle prvního aspektu.

S výhodou je zmíněný farmaceutický prostředek vakcínou.

Podle dvanáctého aspektu vynález zahrnuje metodu prevence infekce pacienta N. meningitidis zahrnující krok podání farmaceuticky účinného množství výše zmíněné vakcíny.

Podle třináctého aspektu vynález zahrnuje metodu identifikace imunogenního fragmentu izolovaného proteinu, varianty nebo derivátu podle prvního zmíněného aspektu zahrnující kroky:

i) produkce fragmentu zmíněného polypeptidu, varianty nebo derivátu;

ii) podání zmíněného fragment individuu a iii) detekce imunitní odpovědi u zmíněného individua, jehož odpověď zahrnuje produkci elementů, které specificky vážou N. meningitidis a/nebo zmíněný polypeptid, variantu nebo derivát, a/nebo protektivní účinek proti infekci N. meningitidis.

S výhodou je individuem savec.

Ještě výhodněji je individuem člověk.

-4 CZ 304379 B6

Krátký popis obrázků a tabulek

Tabulka 1: Identifikace aminokyselin konzervovaných oblastí (Cl, C2, C3, C4 a C5) a variabilních oblastí (VI, V2, V3 a V4) polypeptidu NhhA u všech deseti (10) uvedených kmenů N. meningitidis. Odpovídající SEQ ID NOS jsou také uvedeny. Sloupec 1 = označení kmene. SEQ ID NOS: 1 až 9 byly popsány dříve v souběžně podané žádosti WO99/31132; sekvence NhhA a nhhA z kmene Z2491 byly získány z http://www.sanger.ac.uk/Projects/N meningitidis/; sloupec 2 = číslování aminokyselin oblasti Cl; sloupec 3 = číslování aminokyselin oblasti VI; sloupec 4 = číslování aminokyselin oblasti C2; sloupec 5 = číslování aminokyselin oblasti V2; sloupec 6 = číslování aminokyselin oblasti C3; sloupec 7 = číslování aminokyselin oblasti V3; sloupec 8 = číslování aminokyselin oblasti C4; sloupec 9 = číslování aminokyselin oblasti V4; sloupec 10= číslování aminokyselin oblasti C5. Povšimněte si, že číslování aminokyselin konzervované sekvence (SEQ ID NO: 11) je také uvedeno.

Tabulka 2: Tabulka aminokyselinových substitucí.

OBR. 1: Srovnání aminokyselinových sekvencí polypeptidu NhhA z deseti (10) kmenů N. meningitidis (SEQ ID NOS: 1 až 10) spolu s konzervativní sekvencí (SEQ ID NO: 11). Názvy kmenů a polypeptidových sekvencí používané v tomto srovnání odpovídající názvům kmenů a SEQ ID NOS ve sloupci 1 Tabulky 1. Aminokyseliny jsou uvedeny standardními jednopísmennými zkratkami. Konzervativní aminokyseliny jsou ukázány jen tehdy, když jsou tyto zbytky kompletně konzervovány. Konzervované oblasti (dvakrát podtržené, označené Cl, C2, C3, C4 a C5) a variabilní oblasti (jednou podtržené, označené VI, V2, V3 a V4) jsou uvedeny pod konzervativní sekvencí. Aminokyselinové sekvence na tomto obrázku jsou popsány stejně jako v Tabulce 1, a to následovně: PMC21 = SEQ ID NO:1; H41 = SEQ ID NO:2; P20 = SEQ ID NO:3; EG327 = SEQ ID NO:4; EG329 = SEQ ID NO:5; H38 = SEQ ID NO:6; H15 = SEQ ID NO:7; BZ10 = SEQ ID NO:8; BZ198 = SEQ ID NO:9; Z2491 = SEQ ID NO:10 a konsenzus sekvence = SEQ ID NO: 11.

OBR. 2: Srovnání nukleotidové sekvence nukleových kyselin nhhA z deseti (10) kmenů N. meningitidis, které kódují aminokyselinové sekvence z OBR. 1. Oblasti Cl, C2, C3, C4, C5 a VI, V2, V3, V4 jsou takové, jak je popsáno v OBR. 1 a Tabulce 1. Nukleokyselinové sekvence na tomto obrázku jsou popsány následovně: PMC21 = SEQ ID NO:12; H41 = SEQ ID NO: 13; P20 = SEQ ID NO:14; EG327 = SEQ ID NO:15; EG329 = SEQ ID NO:16; H38 = SEQ ID NO: 17; H15 = SEQ ID NO: 18; BZ10 = SEQ ID NO: 19; BZ198 = SEQ ID NO:20; Z2491 = SEQ ID NO:21 a konsenzus sekvence = SEQ ID NO:22.

OBR. 3: Plazmidová mapa odpovídající pCO14K s PCR amplifikačním produktem kódujícím přirozeně se vyskytující typ PMC21 pCO14K s PCR amplifikačním produktem kódujícím přirozeně se vyskytující typ PMC21 NhhA operativně spojeným s promotorempoA. (Nakresleno v měřítku) 3A: Plné šipky znázorňují uspořádání genů porA a kanR v pCO14K. Jsou ukázány oligonukleotidové primery HOMP5' a HOMP3' AN použité pro amplifikaci genu nhhA τ kmene PMC21. Gen nhhA je znázorněn tečkovanou šipkou, promotor porA černým obdélníkem a jsou ukázána restrikční místa Eagl a Acol použitá pro výměnu porA a nhhA, jak je popsáno v Příkladu 2. 3B Uspořádání genů v pIP52(PMC21), jak je popsáno v Příkladu 2. Místo Bglll použité pro konstrukci mutanty, jak je popsáno v Příkladu 4, je ukázáno.

OBR. 4: Schematické znázornění strategie Splice Overlap Extension PCR pro odstranění specifických oblastí polypeptidů NhhA. Schéma přirozeně se vyskytujícího se typu genu nhhA je ukázáno v horní části Obrázků 4A-C a rekombinantní nhhA je ukázán ve spodní části těchto obrázků s variabilními oblastmi znázorněnými jako černé a s konstantními oblastmi znázorněnými jako prázdné obdélníky. Šipky ukazují přibližnou pozici oligonukleotidových primerů. Svislé čerchované čáry ukazují amplifikační produkty. Tam kde je oligonukleotidová sekvence z nesouvislých oblastí nukleové kyseliny nhhA,\e toto znázorněno tečkovanou čárou mezi těmito nesouvislými oblastmi. Je znázorněno přibližné měřítko. Dvojité svislé čáry ukazují, že je

- 5 CZ 304379 B6 znázorněna pouze část oblasti C5. A: ukazuje strategii, jak je popsána v Příkladu 6. B: ukazuje strategii, jak je popsána v Příkladu 7. C: ukazuje strategii, jak je popsána v Příkladu 8.

OBR. 5: A) Aminokyselinová sekvence PMC 21 NhhA polypeptidové deleční mutanty (SEQ ID NO: 23) vytvořená v Příkladu 4; a B) ji kódující nukleotidová sekvence (SEQ ID NO: 28).

OBR. 6: A) Aminokyselinová sekvence H41 NhhA polypeptidové deleční mutanty SEQ ID NO: 24) vytvořená v Příkladu 5; a B) ji kódující nukleotidová sekvence (SEQ ID NO: 29).

OBR. 7: A) Aminokyselinová sekvence PMC21 NhhA polypeptidové deleční mutanty (SEQ ID NO: 25) vytvořená „Splice overlap PCR“ v Příkladu 6; a B) ji kódující nukleotidová sekvence (SEQ ID NO: 30).

OBR. 8: A) Aminokyselinová sekvence PMC21 NhhA polypeptidové deleční mutanty (SEQ ID NO: 26) vytvořená v „Splice overlap PCR“ v Příkladu 7; a B) ji kódující nukleotidová sekvence (SEQ ID NO: 31).

OBR. 9: A) Aminokyselinová sekvence PMC21 NhhA polypeptidové deleční mutanty (SEQ ID NO: 27) vytvořená v „Splice overlap PCR“ v Příkladu 8; a B) ji kódující nukleotidová sekvence (SEQ ID NO: 32).

OBR. 10: Srovnání aminokyselinových sekvencí polypeptidů přirozeně se vyskytujícího typu NhhA a delečních mutant. Tyto polypeptidy byly vytvořeny tak, jak je popsáno v Příkladu 2, Příkladu 3, Příkladu 4 a Příkladu 5. Aminokyseliny jsou znázorněny jako jednopísmenné zkratky. Konzervované oblasti označené Cl, C2, C3, C4 a C5 odpovídající těm, které byly definovány v Tabulce 1 a OBR. 1, jsou označeny dvojitým podtržením celé délky sekvencí z H41 a PMC21, variabilní oblasti označené VI, V2, V3, V4 odpovídající těm, které byly definovány v Tabulce 1 a OBR. 1, jsou označeny jednoduchým podtržením celé délky sekvencí z H41 a PMC21.

OBR. 11: Western imunoblot ukazující nadprodukci NhhA. 45 pg celkového buněčného proteinu bylo rozděleno na 4 až 20% gradientu SDS-PAGE před přenesením na nitrocelulózou membránu a byl proveden western imunoblot, jak je popsáno v Příkladu 9. Dráha 1: Výchozí kmen ukazující hladinu exprese přirozeně se vyskytujícího typu NhhA. Dráha 2: Kmen P6 (nadprodukuje PMC 21 NhhA, jak je popsáno v Příkladu 2). Dráha 3: Kmen ΡΔ6 (nadprodukuje zkrácený PMC 21 NhhA popsaný v Příkladu 4). Dráha 4: Kmen H14 (nadprodukuje H41 NhhA, jak je popsáno v Příkladu 3). Dráha 5: Kmen ΗΔ8 (nadprodukuje zkrácený H41 NhhA popsaný v Příkladu 5). Dráha 6: Kmen 2A (exprese NhhA byla odstraněna mutací v genu nhhA, jak bylo popsáno v mezinárodní publikaci WO99/31132). Migrace standardů je ukázána: 185 kDa, 119 kDa, 85 kDa, 62 kDa, 51,2 kDa, 38,2 kDa, 22,4 kDa. Přirozeně se vyskytující typ polypeptidů NhhA je ukázán jako imunoreaktivní pruh s vysokou molekulární hmotností přítomný v dráze 1, ale nevyskytující se v dráze 6.

OBR. 12: Izolované polypeptidy delečních mutant NhhA. Polypeptidy NhhA byly izolovány, jak bylo popsáno v Příkladu 9, před separací na 4 až 20% SD. Polyakrylamidový gel byl obarven Coomassie. Dráha 1: OMC příprava kmene nadprodukujícího zkrácený polypeptid PMC21 NhhA popsaný v Příkladu 6. Dráha 2: Purifikovaný zkrácený polypeptid PMC21 NhhA. Dráha 3: OMC příprava kmene nadprodukujícího zkrácený polypeptid PMC21 NhhA popsaný v Příkladu 4. Dráha 4: Purifikovaný zkrácený polypeptid PMC21 NhhA. Dráha 5: OMC příprava kmene nadprodukujícího polypeptid PMC21 NhhA popsaný v Příkladu 2. Dráha 6: Purifikovaný polypeptid PMC21 NhhA. Dráha 7: Standardy molekulové hmotnosti 173 kDa, 111 kDa, 80 kDa, 61 kDa, 49, kDa, 36 kDa. Povšimněte si, že reaktivní vysokomolekulámí pruhy ve všech dráhách kromě 6 pravděpodobně představují multimery polypeptidů NhhA. Ostatní pruhy jsou pravděpodobně méně stabilní formy NhhA nebo rozpadové produkty. Povšimněte si, že chybí v dráze 6.

-6CZ 304379 B6

OBR. 13: Western imunoblot s použitím myšího séra proti proteinu NhhA. Na všech panelech obsahují dráhy 1, 3, 5 a 7 OMC z Kmene nadprodukujícího polypeptid PMC21 NhhA a dráhy 2, 4, 6 a 8 obsahují OMC z kmene 2A, který NhhA neexprimuje. Panel A: Dráhy 1 a 2: myš A inokulovaná přirozeně se vyskytujícím typem PMC21 NhhA v ředění 1:1000. Dráhy 3 a 4: myš A inokulovaná přirozeně se vyskytujícím typem PMC21 NhhA v ředění 1:10 000. Dráhy 5 a 6: myš B inokulovaná přirozeně se vyskytujícím typem PMC21 NhhA v ředění 1:1000. Dráhy 7 a 8: myš B inokulovaná přirozeně se vyskytujícím typem PMC21 NhhA v ředění 1:10 000. Panel B: Dráhy 1 & 2: myš C inokulovaná zkráceným polypeptidem PMC21 NhhA (Příklad 4) v ředění 1:1000. Dráhy 3 & 4: myš C inokulovaná zkráceným polypeptidem PMC21 NhhA (Příklad 4) v ředění 1:10 000. Dráhy 5 & 6: myš D inokulovaná zkráceným polypeptidem PMC21 NhhA (Příklad 4) v ředění 1:1000. Dráhy 7 & 8: myš D inokulovaná zkráceným polypeptidem PMC21 NhhA (Příklad 4) v ředění 1:1000. Panel C: Dráhy 1 & 2: myš E inokulovaná zkráceným polypeptidem PMC21 NhhA (Příklad 6) v ředění 1:1000. Dráhy 3 a 4: myš E inokulovaná zkráceným polypeptidem PMC21 NhhA (Příklad 6) v ředění 1:10 000. Dráhy 5 & 6: myš F inokulovaná zkráceným polypeptidem PMC21 NhhA (Příklad 6) v ředění 1:1000. Dráhy 7 & 8: myš F inokulovaná zkráceným polypeptidem PMC21 NhhA (Příklad 6) v ředění 1:1000.

OBR. 14: Předpokládané maturované deleční mutanty polypeptidu NhhA. A: předpokládaný maturovaný protein popsaný v Příkladu 2 (SEQ ID NO: 33); B: předpokládaný maturovaný protein popsaný v Příkladu 3 (SEQ ID NO: 34); C: předpokládaný maturovaný protein popsaný v Příkladu 4 (SEQ ID NO: 35); D: předpokládaný maturovaný protein popsaný v Příkladu 5 (SEQ ID NO: 36); E: předpokládaný maturovaný protein popsaný v Příkladu 6 (SEQ ID NO: 37); F: předpokládaný maturovaný protein popsaný v Příkladu 7 (SEQ ID NO: 38) a G: předpokládaný maturovaný protein popsaný v Příkladu 8 (SEQ ID NO: 39).

Detailní popis vynálezu

V rámci této specifikace, pokud kontext nevyžaduje jinak, budou slova „zahrnují“, „zahrnuje“ a „zahrnující“ chápána tak, že znamenají zahrnutí uvedených celků nebo skupiny celků, ale nevylučují žádný jiný celek nebo skupinu celků.

S ohledem na nomenklaturu je zde NhhA používáno tehdy, když je odkazováno na proteiny vynálezu, zatímco nhhA je používáno tehdy, když je odkazováno na nukleové kyseliny vynálezu. Bude také chápáno, že proteiny a nukleové kyseliny. NhhA/w/z/zT zahrnují například proteiny a nukleové kyseliny WiaNm/hianm uvedené v WO99/31132, a to bez omezení na ně.

Tato přihláška předpokládá, alespoň částečně, objasnění konzervovaných a méně konzervovaných oblastí polypeptidu NhhA u deseti (10) kmenů N. meningitidis. Předpokládá se, že odpovídající oblast jsou konzervovány v dalších alelických variantách uvedených příkladů polypeptidů NhhA.

Bude oceněno, že hlavním v této přihlášce je pochopení, že delecí nekonzervovaných aminokyselin v přirozeně se vyskytujícím typu polypeptidu NhhA za vytvoření modifikovaného polypeptidu NhhA vynálezu může být navozena imunitní odpověď po imunizaci zmíněným polypeptidem vynálezu, která díky zaměření imunitní odpovědi proti konzervovaným epitopům bude poskytovat ochranu proti jednomu nebo více heterologním kmenům N. meningitidis.

Jak je zde užíváno, „nekonzervované“ aminokyseliny jsou aminokyselinové zbytky přítomné v přirozeně se vyskytujícím typu polypeptidu NhhA z prvního kmene N. meningitidis, ale které nejsou přítomné v přirozeně se vyskytujícím typu polypeptidu NhhA v jednom nebo více jiných kmenech.

-7CZ 304379 B6

Vhodně mají polypeptidy podle prvního aspektu alespoň část z jedné oblasti VI, V2, V3 nebo V4 odstraněnu vzhledem k odpovídajícímu přirozeně se vyskytujícímu typu sekvence a podle toho mohou být společně nazývány jako příklady „delečních mutanť.

Bude oceněno, že předkladatelé vynálezu identifikovali oblasti VI, V2, V3 a V4 jako oblasti přirozeně se vyskytujících typů polypeptidů NhhA s relativně vysokou frekvenci nekonzervovaných aminokyselin v porovnání s relativně konzervovanými oblastmi Cl až C5.

Z V oblastí mají VI (hypervariabilní) a V2 oblasti nejvyšší frekvenci nekonzervovaných aminokyselin, zatímco V3 a V4 mají relativně nižší frekvence. Přesto tvoří oblast VI významnější součást přirozeně se vyskytujících polypeptidů NhhA než oblast V2 (s ohledem na celkový počet aminokyselin). Proto je upřednostňováno, že izolované proteiny podle prvního zmíněného aspektu mají minimálně odstraněnu podstatnou část oblasti VI.

Zkušenými osobami bude taktéž chápáno, že při konstrukci zmíněných delečních mutant lze „zaměňovat“ oblasti mezi polypeptidy NhhA různých kmenů N. meningitidis. Například polypeptid NhhA vynálezu může obsahovat oblast H41 Cl společně s oblastí PMC21 C5.

Toto „zaměřování“ je konkrétně zvláště vhodné pro metody rekombinace DNA.

Pro účely tohoto vynálezu je „ izolovaným míněn materiál, který byl vzat ze svého přirozeného stavu nebo byl jinak podroben lidské manipulaci. Izolovaný materiál může být částečně nebo zcela volný od komponent, které jej doprovázejí za normálního stavu, nebo může být manipulován tak, aby byl v umělém stavu spolu s komponentami, které jej v přirozeném stavu normálně doprovázejí. Izolovaný materiál může být v nativní nebo rekombinantní formě.

„Proteinem“ je míněn aminokyselinový polymer. Aminokyseliny mohou být přírodními nebo nepřírodními aminokyselinami, jak je dobře známo v oboru.

„Peptid“ je protein mající méně než padesát (50) aminokyselin.

Polypeptid je protein mající padesát (50) nebo více aminokyselin.

Jak je zde užíváno, fráze „navozuje imunitní odpověď“ odkazuje na schopnost izolovaného polypeptidu vynálezu vytvořit imunitní odpověď u savců, kterým byl podán, u nichž je odpověď řízena proti N. meningitidis a/nebo zmíněnému polypeptidů. S výhodou imunitní odpověď zahrnuje tvorbu baktericidních protilátek. Ještě výhodněji je imunitní odpověď protektívní proti infekci N. meningitidis.

„Kmenově specifický“ je zde používáno v kontextu imunitní odpovědi, která je zaměřena proti, nebo alespoň převážně zaměřena proti, autolognímu kmeni N. meningitidis.

Jak je zde užíváno, „křížově reaktivní“ znamená schopnost polypeptidů vynálezu navozovat imunitní odpověď zaměřenou proti jednomu nebo více heterologním kmenům N. meningitidis.

Jak je zde používáno „křížověprotektívní“ znamená schopnost polypeptidů vynálezu navozovat imunitní odpověď a tak poskytovat ochranu proti infekci jedním nebo více heterologními kmeny N. meningitidis.

Proto ve smyslu nadcházejícího zmíněný polypeptid zde může být označován jako „imunogen“ nebo jako jsoucí „ imunogenní“.

Ačkoliv byly pro účely této přihlášky zmíněné modifikované proteiny NhhA ukázány na příkladech aminokyselinovými sekvencemi uvedenými na OBR. 5 až 9 (SEQ ID NOS: 23 až 27) a

- 8 CZ 304379 B6

OBR. 14, přihláška také uvažuje fragmenty, deriváty a varianty (jako jsou alelické varianty) uvedených proteinů.

Například pro snížení kmenově specifické imunogenity mohou být odstraněny aminokyseliny z kterékoliv sekvence Cl až C5 uvedené na OBR. 1, zatímco nemusí být odstraněny všechny nekonzervované aminokyseliny z oblastí VI až V4.

Proto mohou izolované proteiny vynálezu obsahovat fragmenty oblastí Cl až C5 a VI až V4.

Vskutku, jak bude dále popsáno v Příkladech, může být výhodné pro účely tvorby polypeptidů vynálezu pomocí metod rekombinantní DNA odstranit jednu nebo více aminokyselin z oblasti Cl, C2, C3, C4 a/nebo C5 nebo oblasti VI, V2, V3 a/nebo V4 v zájmu využití vhodných restrikčních endonukleázových míst a dosažení vysoké exprese stabilního imunogenního proteinu.

V jednom provedení ,fragment zahrnuje aminokyselinovou sekvenci, kterou tvoří méně než 100%, ale alespoň 20%, s výhodou 50%, ještě výhodněji nejméně 80% nebo ještě více výhodněji nejméně 90% zmíněných oblastí Cl, C2, C3, C4 nebo C5.

Fragmenty mohou být například peptidy tvořené méně než dvanácti aminokyselinami, jako je oblast C2 (SEQ ID NO: 11) nebo sekvencemi nejméně dvaceti sousedních aminokyselin nebo více než stem sousedních aminokyselin odpovídajícím některé nebo všem oblastem Cl, C2, C3, C4 a/nebo C5 popsaným zde.

Další segmenty uvedené zde příkladem jsou modifikované polypeptidy NhhA vynálezu, které podstoupily posttranslační úpravy pro vytvoření maturovaného polypeptidů, jak je ukázáno na OBR. 14.

V dalším provedení je „fragment“ malým peptidem, například nejméně 6, s výhodou nejméně 10 a ještě výhodněji nejméně 20 aminokyselin dlouhým, který obsahuje jednu nebo více antigenních determinant nebo epitopů odvozených z modifikovaných proteinů NhhA vynálezu. Větší fragmenty obsahující více než jeden peptid jsou také zahrnuty a mohou být získány aplikací standardních technik tvorby rekombinantních nukleových kyselin nebo syntetizovány pomocí konvenčních technik syntézy v tekuté nebo na pevné fázi. Příkladem může být syntéza v roztoku nebo na pevné fázi, jak je popsána například v Kapitole 9 nazvané „Peptide Synthesis“ autorů Atherton a Shepard, která je obsažena v díle nazvaném „Synthetic Vaccines“ editovanou Nicholson a vydanou Blackwell Scientific Publications. Alternativně mohou být peptidy produkovány štěpením polypeptidů vynálezu proteinázami, jako jsou endoLys-C, endoArg-C, endoGlu-C a stafylokokovou proteázou V8. Naštěpené fragmenty mohou být purifikovány například technikami vysokotlaké kapalné chromatografie (HPLC).

Jak je zde užíváno, „varianty“ polypeptidů jsou polypeptidy vynálezu, u kterých byly jedna nebo více aminokyselin nahrazeny jinými aminokyselinami. Je dobře známo v oboru, že některé aminokyseliny mohou být změněny na jiné s velmi podobnými vlastnostmi beze změny přirozené aktivity polypeptidů (konzervativní substituce). Příkladné konzervativní substituce v polypeptidů mohou být provedeny podle Tabulky 2.

Podstatné změny ve funkci jsou vytvořeny výběrem substitucí, které jsou méně konzervativní než ty, které jsou uvedeny v Tabulce 2. Jiná nahrazení mohou být nekonzervativními substitucemi a relativně méně jich může být tolerováno. Obecně substituce, které pravděpodobně vytvářejí větší změny ve vlastnostech polypeptidů, jsou ty, u kterých a) hydrofilní zbytek (např. Ser nebo Thr) je nahrazen nebo nahrazuje hydrofóbní zbytek (např. Ala, Lezu, Ile, Phe nebo Val); b) cystein nebo prolin je nahrazen nebo nahrazuje jiný zbytek; c) zbytek s elektropozitivním postranním řetězcem (např. Arg, His nebo Lys) je nahrazen nebo nahrazuje elektronegativní zbytek (např. Glu nebo Asp) nebo d) zbytek s velkým postranním řetězcem (např. Phe nebo Trp) je

-9CZ 304379 B6 nahrazen nebo nahrazuje zbytek s menším postranním řetězcem (např. Ala, Ser) nebo bez postranního řetězce (např. Gly).

Termín „varianta“ také zahrnuje polypeptidy NhhA vynálezu vytvořené podle alelických variant sekvencí uvedených příkladem v této specifikaci.

Polypeptidové varianty NhhA mohou spadat do sféry termínu „polypeptidové homology“.

Polypeptidové homology sdílejí nejméně 70%, s výhodou nejméně 80% a ještě výhodněji 90% sekvenční identitu s aminokyselinovou sekvencí modifikovaných polypeptidů NhhA vynálezu, jak zde byly popsány.

Jak je zde obecně používáno, „homolog“ sdílí definovatelnou nukleotidovou nebo aminokyselinovou sekvenční příbuznost s nukleovou kyselinou nebo polypeptidem vynálezu.

Například za takovéto homology jsou považovány aminokyselinové sekvence, které se liší od těch, které jsou zde uvedeny příkladem, ale které jsou imunogenní a poskytují křížově ochrannou imunitu.

Specificky jsou vyloučeny ze sféry termínu „homology“ polypeptidy přirozeně se vyskytujícího typu NhhA a nukleové kyseliny nhhA.

Do sféry homologů jsou zahrnuty „orthology“, což jsou funkčně příbuzné polypeptidy aje kódující nukleové kyseliny izolované z jiných bakteriálních druhů než A. meningitidis.

Termíny používané zde pro popsání příbuznosti sekvencí mezi jednotlivými nukleovými kyselinami a polypeptidy zahrnují „porovnávací okno“, „sekvenční identita“, „procento sekvenční identity“ a „podstatná identita“. Protože jednotlivé nukleové kyseliny/polypeptidy mohou každý obsahovat 1) pouze jednu nebo více částí kompletní sekvence nukleové kyseliny/polypeptidů, které jsou sdíleny nukleovými kyselinami/polypeptidy, a 2) jednu nebo více částí, které jsou odlišné mezi nukleovými kyselinami/polypeptidy, jsou obvykle porovnání sekvencí dělána porovnáním sekvencí v „porovnávacím okně“ pro identifikaci a porovnání lokálních oblastí sekvenčních podobností. „Porovnávací okno“ odkazuje na pojmový segment typicky 12 sousedních zbytků, který je porovnáván se srovnávací sekvencí. Porovnávací okno může zahrnovat přidání nebo delece (tj. mezery) přibližně 20% nebo méně v porovnání se srovnávací sekvencí (která neobsahuje přidání nebo delece) pro optimální porovnání jednotlivých sekvencí. Optimální porovnání sekvencí pro porovnání porovnávacího okna může být provedeno počítačovou implementací algoritmů (Geneworks program vytvořený Intelligenetics; GAP, BESTFIT, FASTA a TFASTA z Wisconsín Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Drive Madison, Wl, USA, uvedeno zde jako odkaz) nebo prozkoumáním a výběrem nejlepšího srovnání (tj. s nejvyšším procentem homologie vdaném porovnávacím okně) vytvořeného kteroukoliv z vybraných metod. Odkaz může být taktéž učiněn na rodinu programů BLAST, jak bylo například popsáno v Altschul et al., 1997, Nucl. Acids Res. 25 3389, který je zde uveden jako odkaz.

Detailní diskuse sekvenční analýzy může být nalezena v Kapitole 19.3 v CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY Eds. Ausubel et al. (John Wiley & Sons lne NY, 1995-1999).

Termín „sekvenční identita“ je zde používán ve svém nejširším smyslu a zahrnuje počet stejných nukleotidů nebo aminokyselin s ohledem na vhodné srovnání pomocí standardního algoritmu a s ohledem na míru identity sekvencí ve srovnávacím okně. Proto je „procento sekvenční identity“ kalkulováno porovnáním dvou optimálně srovnaných sekvencí ve srovnávacím okně, stanovením počtu pozic, ve kterých se nachází identická báze nukleové kyseliny (např. A, T, C, G, 1) v obou sekvencích, jehož výsledkem bude počet odpovídajících si pozic, dělením počtu

- 10CZ 304379 B6 odpovídajících si pozic celkovým počtem pozic ve srovnávacím okně (tj. velikostí okna) a násobením výsledku 100 pro získání procenta sekvenční identity. Například „sekvenční identita může být chápána tak, že vyjadřuje „procento odpovídajících si“ kalkulované pomocí počítačového programu DNASIS (verze 2.5 pro Windows; dostupný od Hitachi Software engineering Co., Ltd., South San Francisco, Califomia, USA).

Proto je v možnostech zkušené osoby připravit polypeptidové homology vynálezu, jako jsou varianty definované dříve, pomocí technologie rekombinantní DNA. Například nukleové kyseliny vynálezu mohou být mutovány pomocí buď náhodné mutageneze například pomocí transpozonové mutageneze, nebo místně specifickou mutagenezou. Výsledné fragmenty DNA jsou následně klonovány do vhodného expresního hostitele, jako je E. coli, použitím konvenční technologie a jsou detekovány klony s požadovanou aktivitou. Jestliže byly klony získány pomocí technik náhodné mutageneze, musí být pozitivní klony sekvenovány pro stanovení mutací.

Jak je zde používáno, „odvozené polypeptidy jsou polypeptidy vynálezu, které byly pozměněny například konjugací nebo vytvořením komplexu s jinými chemickými zbytky nebo technikami posttranslační modifikace, jak jsou známy v oboru. Takovéto deriváty zahrnují delece a/nebo přidání aminokyselin do polypeptidů NhhA vynálezu nebo jejich variant, kde zmíněné deriváty navozují imunitní odpověď.

„Přidání aminokyselin může zahrnovat fúzi polypeptidů nebo jejich variant sjinými polypeptidy nebo proteiny. Z tohoto ohledu bude oceněno, že polypeptidy nebo varianty vynálezu mohou být inkorporovány do větších polypeptidů a u takovýchto větších polypeptidů může být předpokládáno, že budou imunogenní. Polypeptidy, jak byly popsány výše, mohou být fúzovány s dalším proteinem, například takovým, který není odvozen z A. meningitidis. Jiný protein může, jak je uvedeno v příkladu, napomáhat při purifikaci proteinu. Například mohou být použity polyhistidinová kotva nebo maltózu vázající protein. Alternativně může vyvolávat imunitní odpověď účinnou proti N. meningitidis nebo vyvolávat imunitní odpověď vůči jinému patogenu. Dalšími možnými fúzními proteiny jsou ty, které vytvářejí imunomodulační odpověď. Konkrétní příklady takovýchto proteinů zahrnují Protein A nebo glutation-S-transferasu (GST). Navíc může být polypeptid sfúzován s vakcínovou komponentou založenou na oligosacharidu, kde funguje jako proteinový nosič.

Jiné deriváty zamýšlené ve vynálezu zahrnují, ale nelimitují, modifikaci postranních řetězců, začlenění nepřírodních aminokyselin a/nebo jejich derivátů během peptidové, polypeptidové nebo proteinové syntézy a použití zesíťujících látek nebo jiných metod, které způsobují konformační změny polypeptidů, fragmentů a variant vynálezu. Příklady modifikací postranních řetězců zamýšlené v patentové přihlášce zahrnují modifikace aminoskupin, jako jsou acylace pomocí anhydridu kyseliny octové; acylace aminoskupin pomocí anhydridu kyseliny jantarové a anhydridu kyseliny tetrahydrofitalátové; amidace pomocí methylacetimidátu; karbamoylace aminokyselin kyanátem; pyridoxylace lysinu pomocí pyridoxal-5-fosfátu s následnou redukcí NaBIf; redukční alkylace reakcí s aldehydem následovanou redukcí NaBH₄ a trinitrobenzylace aminoskupin pomocí 2, 4, 6-trinitrobenzensulfonové kyseliny (TNBS).

Karboxylová skupina může být modifikována karboimidovou aktivací přes vznik O-acylisomočoviny následovanou derivatizací například na příslušný amid.

Guanidinová skupina argininových zbytků může být modifikována za tvorby heterocyklických kondenzačních produktů s látkami, jako jsou 2,3-butandion, fenylglyoxal a glyoxal.

Sulfhydrylové skupiny mohou být modifikovány metodami, jako jsou oxidace kyselinou mravenčí na kyselinu cysteinovou; tvorba rtuťových derivátů pomocí 4—chlorortuťofenylsulfonové kyseliny, 4-chlorortuťobenzoátu; 2-chlorortuťo-4-nitrofenolu, chloridu fenylrtuti a dalších rtuťnatých látek; tvorba smíšených disulfidů s dalšími thiolovými látkami; reakce s maleimidem,

- 11 CZ 304379 B6 anhydridem maleátu nebo jinými substituovanými maleimidy; karboxymethylace sjódoctovou kyselinou nebo jódacetamidem; a karbamoylace s kyanátem v alkalickém pH.

Tryptofanové zbytky mohou být modifikovány například alkylací indolového kruhu 2-hydroxy5 5-nitrobenzyl-bromidem nebo sulfonyl-halogenidy nebo oxidací N-bromosukcinimidem.

Tyrosinové zbytky mohou být modifikovány nitrací s tetranitromethanem za vzniku 3-nitrotyrosinových derivátů.

Imidazolový kruh histidinového zbytku může být modifikován N-karbethoxylací diethylpyrokarbonátem nebo alkylací deriváty kyseliny jódoctové.

Příklady inkorporace nepřírodních aminokyselin a derivátů během peptidové syntézy zahrnují, ale nejsou tím limitovány, použití kyseliny 4-aminomáselné, kyseliny 6-aminohexanové, kyseliny 4-amino-3-hydroxy-5-fenylpentanové, kyseliny 4-amino-3-hydroxy-6-methylheptanové, t-butylglycinu, norleucinu, norvalinu, fenylglycinu, omithinu, sarkosinu, 2-thienylalaninu a/nebo D-izomerů aminokyselin.

Vynález také zahrnuje kovalentní modifikaci polypeptidu, fragmentu nebo varianty vynálezu dinitrofenolem pro zajištění imunogenity u lidí.

Izolované proteiny vynálezu (včetně fragmentů, variant, derivátů a homologů) mohou být připraveny kteroukoliv vhodnou metodou známou v oboru.

Například protein může být připraven jako rekombinantní polypeptid metodou zahrnující kroky:

i) příprava expresního konstruktu, který obsahuje modifikovanou nukleovou kyselinu nhhA vynálezu funkčně spojenou s jednou nebo více regulačními nukleovými sekvencemi;

ii) transfekce nebo transformace vhodné hostitelské buňky expresním konstruktem;

iii) exprese rekombinantního polypeptidu ve zmíněné hostitelské buňce.

Dále bude uvedeno několik příkladů, které popisují produkci modifikovaných nukleových kyselin nhhA vynálezu pomocí PCR.

V jednom konkrétním provedení je PCR „splice overlap PCR“, jak bude popsáno dále, což je metoda založená na metodě popsané v Ho et al., 1989, Geene 77 51 a v Horton et al., 1989, Gene 77 61, které jsou zde uvedeny jako odkazy.

Pro účely exprese v hostitelské buňce je rekombinantní nukleová kyselina funkčně spojena sjed40 nou nebo více regulačními sekvencemi v expresním vektoru.

„Expresní vektor“ může být buď samostatně se replikující extrachromozomální vektor, jako je plazmid, nebo vektor, který se integruje do genomu hostitele.

„Funkčně spojeným“ je myšleno, že zmíněná(é) regulační nukleotidové sekvence je(jsou) umístěna(y) v sousedství rekombinantní nukleové kyseliny vynálezu za účelem iniciace, regulace nebo jiné kontroly transkripce.

Regulační nukleotidové sekvence budou obecně vhodné pro hostitelskou buňku použitou k expresi. Mnoho typů vhodných expresních vektorů a vhodné regulační sekvence jsou známy v oboru pro mnoho různých hostitelských buněk.

Typicky může zmíněná jedna nebo více regulačních nukleotidových sekvencí zahrnovat, ale není tím limitována, promotorové sekvence, vedoucí nebo signální sekvence, vazebná místa pro

- 12 CZ 304379 B6 ribozomy, sekvence počátku a konce transkripce, sekvence počátku a konce translace a enhancerové nebo aktivátorové sekvence.

Konstitutivní nebo inducibilní promotory, jak jsou známy v oboru, jsou uvažovány ve vynálezu. Promotory mohou být buď přirozeně se vyskytujícími promotory, nebo hybridními promotory, které kombinují elementy z více jak jednoho promotoru.

Ve výhodném provedení obsahuje expresní vektor selektovatelný markerový gen pro umožnění selekce transformovaných hostitelských buněk. Selektovatelné markerové geny jsou dobře známy v oboru a budou se lišit podle použité hostitelské buňky.

V provedení je expresním vektorem pCO14K, který obsahuje promotor porA a selekční gen pro kanamycin, jak bude detailně popsáno později. Podle tohoto provedení je hostitelskou buňkou bakterie vybraná ze skupiny obsahující E. coli a N. meningitidis.

Expresní vektor může také obsahovat fúzního partnera (typicky umístěn v expresním vektoru), takže je rekombinantní polypeptid vynálezu exprimován jako fúzní polypeptid se zmíněným fúzním partnerem. Hlavní výhodou fúzních partnerů je, že napomáhají při identifikaci a/nebo purifikaci zmíněného fúzního polypeptidu.

Pro expresi zmíněného fúzního polypeptidu je nezbytné ligovat nukleotidovou sekvenci podle vynálezu do expresního vektoru tak, že translační čtecí rámce fúzního partnera a nukleotidové sekvence vynálezu na sebe navazují.

Dobře známé příklady fúzních partnerů zahrnují, ale nejsou tím limitovány, glutathion-S-transferasu (GHT), Fc část lidského IgG, maltózu vázající protein (MBP) a hexahistidin (HISď), které jsou zvláště užitečné pro izolaci fúzního polypeptidu afinitní chromatografií. Pro účely purifikace fúzních polypeptidů afinitní chromatografií jsou odpovídajícími matricemi pro afinitní chromatografii glutathion-, amylóza- a nikl- nebo kobalt- konjugované pryskyřice. Mnoho takovýchto matric je dostupných jako „souprava“, jako jsou QIAexpress™ systém (Qiagen) použitelný pro (H1S₆) fúzní partnery a GST purification systém od firmy Pharmacia.

Preferovaným fúzním partnerem je MBP, který je zde popsán v Příkladu 11.

Dalším fúzním partnerem dobře známým v oboru je zelený fluorescenční protein (GFP). Tento fúzní protein slouží jako fluorescenční „přívěšek“, který umožňuje identifikaci fúzního polypeptidu vynálezu fluorescenční mikroskopií nebo průtokovou cytometrií. GFP přívěšek je užitečný pro zkoumání subbuněčné lokalizace fúzního polypeptidu vynálezu nebo pro izolaci buněk, který exprimují fuzní polypeptid vynálezu. Metody průtokové cytometrie, jako je fluorescenčně aktivované třídění buněk (FACS), jsou zvláště užitečné v této druhé aplikaci.

S výhodou mají fúzní partneři také štěpná mísa pro proteázy, jako jsou Faktor X_a nebo thrombin, které umožňují odpovídající proteáze částečně štěpit fúzní polypeptid vynálezu a tak z něj uvolnit rekombinantní polypeptid vynálezu. Uvolněný polypeptid může být poté izolován od fúzního partnera následnou chromatografickou separací.

Fúzní partneři podle vynálezu zahrnují ve svém významu také „epitopové přívěšky“, což jsou obvykle krátké peptidové sekvence, proti nimž jsou dostupné specifické protilátky. Dobře známé příklady epitopových přívěšků, pro které jsou snadno dostupné specifické monoklonální protilátky, zahrnují přívěšky c-myc, haemaglutinin z viru chřipky a FLAG.

Jak bylo uvedeno dříve, polypeptidy vynálezu mohou být produkovány kultivací hostitelské buňky transformované zmíněným expresním konstruktem obsahujícím nukleovou kyselinu kódující polypeptid nebo polypeptidový homolog vynálezu. Podmínky vhodné pro expresi proteinu se

- 13 CZ 304379 B6 budou lišit podle výběru expresního vektoru a hostitelské buňky. To je snadno zjistitelné osobami zkušenými v oboru rutinními experimenty.

Vhodné hostitelské buňky pro expresi mohou být prokaryotickými nebo eukaryotickými. Jednou výhodnou hostitelskou buňkou pro expresi polypeptidu podle vynálezu je bakterie. Používanou bakterií může být Escherichia coli nebo N. meningitidis.

Ve výhodném provedení je hostitelskou buňkou N. meningitidis, která byla modifikována tak, aby neexprimovala PorA, Opa, Ope nebo kapsulámí polysacharid a exprimovala požadovaný lipopolysacharidový fenotyp.

Alternativně může být hostitelskou buňkou hmyzí buňka, jako jsou například buňky SF9, které mohou být použity s bakulovirovým expresním systémem.

Rekombinantní protein může být bez obtíží připraven osobou zkušenou v oboru pomocí standardních protokolů, jak jsou například popsány v Sambrook, et al., MOLECULAR CLONING. A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press, 1989), který je zde uveden jako odkaz, konkrétně v sekcích 16 a 17; CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY Eds. Ausubel et al., (John Wiley & Sons, lne. 1995-1999), který je zde uveden jako odkaz, konkrétně v kapitolách 10 a 16; a v CURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE Eds. Coligan et al., (John Wiley & Sons, lne. 1995-1999), který je zde uveden jako odkaz, konkrétně v kapitolách 1, 5 a 6.

Preferované metody exprese rekombinantních modifikovaných proteinů NhhA vynálezu a metody detekce exprimovaného proteinu jsou zde uvedeny v Příkladech.

Nukleotidové sekvence

Vynález zahrnuje izolovanou nukleovou kyselinu, která kóduje modifikovaný protein NhhA vynálezu.

S výhodou má izolovaná nukleová kyselina sekvenci, která kóduje jednu nebo více konstantních (C) oblastí polypeptidu NhhA, jak je popsáno na OBR. 1 a 2. Izolovaná nukleová kyselina může dále kódovat jednu nebo více nekonzervovaných (V oblast) aminokyselin, jak je také znázorněno na OBR. 1 a 2.

Konkrétní provedení těchto izolovaných nukleových kyselin je ukázáno na SEQ ID NOS: 28 až 32 a na OBR. 5 až 9.

Pojem „nukleová kyselina, jak je zde používán, označuje jedno— nebo dvouvláknovou mRNA, RNA, cRNA a DNA, zmíněnou DNA včetně cDNA a genomické DNA.

„Polynukleotid“ je nukleová kyselina obsahující osmdesát (80) nebo více sousedních nukleotidů, zatímco „oligonukleotid“ obsahuje méně než osmdesát (80) sousedních nukleotidů.

„Sonda“ může být jedno- nebo dvouvláknový oligonukleotid nebo polynukleotid vhodně značený pro účely detekce komplementárních sekvencí například při metodě Northern nebo Southern blotting.

„Primer“ je obvykle jednořetězcový oligonukleotid, s výhodou obsahující 15 až 50 sousedních oligonukleotidů, který je schopný nasednout na komplementární „templát“ nukleové kyseliny a být prodloužen podle templátu jako vzoru DNA polymerázou, jako jsou Taq polymeráza, RNA-dependentní DNA polymeráza nebo Sequenase™.

Přihláška také zamýšlí homology nukleových kyselin vynálezu, jak zde byly definovány dříve.

- 14CZ 304379 B6

Tyto homology nukleových kyselin nezahrnují nukleové kyseliny kódující celou délku přirozeně se vyskytujících typů polypeptidů NhhA.

Například homology nukleové kyseliny kódují peptidy a polypeptidy strukturně příbuzné V a C oblastem NhhA vynálezu, které mohou být užitečné pro účely vyvolání křížově protektivní imunity proti N. meningitidis imunizací.

V jednom provedení homology nukleové kyseliny kódují polypeptidové homology vynálezu včetně jejich variant, fragmentů a derivátů.

V jiném provedení homology nukleové kyseliny sdílejí nejméně 60%, s výhodou nejméně 70%, ještě výhodněji nejméně 80% a ještě více výhodněji nejméně 90% sekvenční identitu snukleovými kyselinami vynálezu.

V ještě dalším provedení homology nukleové kyseliny hybridizují snukleovými kyselinami vynálezu za nejméně málo stringentních podmínek, s výhodou nejméně středně stringentních podmínek a ještě výhodněji za vysoce stringentních podmínek.

Pojmy „ hybridizovat a hybridizace “jsou zde používány pro popis párování přinejmenším částečně komplementárních nukleotidových sekvencí za vzniku hybridů DNA-DNA, RNA-RNA nebo DNA-RNA. Hybridní sekvence obsahující komplementární nukleotidové sekvence vznikají párováním bází mezi komplementárními puriny a pyrimidiny, jakje dobře známo v oboru.

Z tohoto ohledu bude oceněno, že se modifikované puriny (například inosin, methylinosin a methyladenosin) a modifikované pyrimidiny (thiouridin, methylcytosin) mohou také podílet na párování bází.

„Stringence“, jakje zde užívána, odkazuje na podmínky teploty a iontové síly a přítomnosti nebo absence určitých organických rozpouštědel a/nebo detergentů během hybridizace. Čím vyšší stringence, tím vyšší bude požadovaná míra komplementarity mezi hybridizovanými nukleotidovými sekvencemi.

„Stringentnípodmínky“ popisují takové podmínky, za kterých budou hybridizovat pouze nukleové kyseliny s vysokou frekvencí komplementárních bází.

Odkazy zde uvedené jako málo stringentní podmínky zahrnují:

i) od nejméně 1% v/v do nejméně 15% v/v formamidu a od nejméně 1 M do nejméně 2 M soli pro hybridizaci při 42 °C a od nejméně 1 M do nejméně 2 M soli pro odmývání při 42 °C.

ii) 1% bovinní sérum albumin (BSA), 1 mM EDTA, 0,5 NaHPO₄ (pH 7,2), 7% SDS pro hybridizaci při 65 °C a i) 2x SSC, 0,1% SDS; nebo ii) 0,5% BSA, 1 mM EDTA, 40 mM NaHPO₄(pH 5,2), 5% SDS pro odmývání při pokojové teplotě.

Středně stringentní podmínky zahrnují:

i) od nejméně 16% v/v do nejméně 30% v/v formamidu a od nejméně 0,5 M do nejméně 0,9 M soli pro hybridizaci při 42 °C a od nejméně 0,5 M do nejméně 0,9 M soli pro odmývání při 42 °C.

ii) 1% bovinní sérum albumin (BSA), 1 mM EDTA, 0,5 M NaHPO₄ (pH 7,2), 7% SDS pro hybridizaci při 65 °C a a) 2x SSC, 0,1% SDS; nebo b) 0,5% BSA, 1 mM EDTA, 40 mM NaHPO₄ (pH 7,2), 5% SDS pro odmývání při 42 °C.

Vysoce stringentní podmínky zahrnují:

- 15 CZ 304379 B6

i) od nejméně 31 % v/v do nejméně 50% v/v formamidu a od nejméně 0,01 M do nejméně 0,15 M soli pro hybridizaci při 42 °C a od nejméně 0,01 M do nejméně 0,15 M soli pro odmývání při 42 °C.

ii) 1% BSA, 1 mM EDTA, 0,5 M NaHPO₄ (pH 7,2), 7% SDS pro hybridizaci při 65 °C a a) 0,1 x SSC, 0,1% SDS; nebo b) 0,5% BAS, 1 mM EDTA, 40 mM NaHPO₄ (pH 7,2), 1% SDS pro odmývání při teplotě přesahující 65 °C zhruba jednu hodinu; a iii) 0,2x SSC, 0,1% SDS pro odmývání při nebo více jak 68 °C po 20 minut.

Obecně je odmývání prováděno při T_m = 69,3 + 0,4+ (G + C)% - 12 °C. Obecně se T_m duplexní DNA snižuje o přibližně 1 °C s každým vzestupem o 1% počtu nepárujících se bází.

Nehledě na výše uvedené jsou stringentní podmínky dobře známy v oboru, jako jsou například popsány v kapitolách 2.9 a 2.10 v knize Ausubel et al., viz výše, která je zde uvedena jako odkaz. Znalý adresát také rozpozná, že různé faktory mohou být modifikovány pro optimalizaci specifity hybridizace. Optimalizace stringentnosti posledních odmývání může sloužit pro zajištění vysokého stupně hybridizace.

Typicky jsou komplementární nukleotidové sekvence identifikovány blotovacími technikami, které zahrnují krok imobilizace nukleotidů na matrici (s výhodou syntetická membrána, jako je nitrocelulóza), krok hybridizace a krok detekce. Southern blotting je používán pro identifikaci komplementární sekvence DNA; northern blotting je používán pro identifikaci komplementární sekvence RNA. Dot blotting a slot blotting mohou být používány pro identifikaci komplementárních DNA/DNA, DNA/RNA nebo RNA/RNA polynukleotidových sekvencí. Tyto techniky jsou dobře známy osobám znalým oboru a byly popsány v Ausubel et al., viz výše na stranách

2.9.1 až 2.9.20. Podle těchto metod zahrnuje Southern blotting rozdělení molekul DNA podle velikosti gelovou elektroforézou, přenesení velikostně rozdělené DNA na syntetickou membránu a hybridizaci DNA vázané na membráně s komplementární nukleotidovou sekvencí.

U dot blotu a slot blotu jsou vzorky DNA před hybridizaci přímo naneseny na syntetickou membránu jako v předešlém případě.

Alternativní blotovací krok je používán při identifikaci komplementárních nukleových kyselin v knihovně cDNA nebo genomické DNA, jako je proces hybridizace plaků nebo kolonií. Další typické příklady této procedury jsou popsány v kapitolách 8 až 12 v Sambrook et al., viz výše, který je zde uveden jako odkaz.

Typicky mohou být následující obecné postupy použity pro určení hybridizačních podmínek. Nukleové kyseliny jsou přeblotovány/přeneseny na syntetickou membránu, jak bylo popsáno výše. Nukleotidová sekvence přirozeně se vyskytujícího typu podle vynálezu je označena, jak je popsáno výše, a je analyzována schopnost této značené nukleové kyseliny hybridizovat s imobiíizovanou nukleotidovou sekvencí.

Zkušení adresáti rozpoznají, že hybridizaci ovlivňuje mnoho faktorů. Specifická aktivita radioaktivně značené polynukleotidové sekvence by typicky měla být vyšší nebo rovna 10⁸dpm/pg pro zajištění detekovatelného signálu. Radioaktivně značená nukleotidová sekvence se specifickou aktivitou 10⁸ až 10⁹ dpm/pg může detekovat přibližně 0,5 pg DNA. Je dobře známé v oboru, že pro umožnění detekce musí být na membráně imobilizováno dostatečné množství DNA. Je žádoucí mít nadbytek imobilizované DNA, obvykle 1 až 10 pg. Přidání inertního polymeru, jako je 10% (w/v) dextran-sulfát (MW 500 000) nebo polyethylenglykol 6000, během hybridizace může také zvýšit senzitivitu hybridizace (viz Ausubel et al., viz výše v 2.10.10).

Pro dosažení smysluplných výsledků z hybridizace mezi nukleovou kyselinou imobilizovanou na membráně a značenou nukleovou kyselinu musí po odmývání zůstat hybridizováno dostatečné množství značené nukleové kyseliny na imobilizovanou nukleovou kyselinu. Odmývání zajišťu- 16CZ 304379 B6 je, že se značená nukleová kyselina hybridizuje pouze na imobilizovanou nukleovou kyselinu s požadovaným stupněm komplementarity ke značené nukleové kyselině.

Metody pro detekci značených nukleových kyselin hybridizovaných k imobilizované nukleové kyselině jsou dobře známy osobám znalým oboru. Tyto metody zahrnují autoradiografii, chemiluminiscenční, fluorescenční a kolorimetrickou detekci.

V jiném provedení mohou být homology nukleové kyseliny vynálezu připraveny podle následujícího postupu:

i) získání extraktu nukleových kyselin z vhodného hostitele;

ii) vytvoření primerů, které jsou optimálně degenerované a každý z nich obsahuje část nukleotidové sekvence vynálezu a iii) použití těchto primerů pro amplifikaci, pomocí technik amplifikace nukleových kyselin, jednoho nebo více amplifikačních produktů ze zmíněného extraktu nukleových kyselin.

Vhodně je hostitelem bakterie.

S výhodou je hostitelem rod Neisseria.

Ještě výhodněji je hostitelem N. meningitidis nebo N. lactamica.

Primery použitelné podle metod amplifikace sekvencí nukleových kyselin zahrnují SEQ ID NOS: 40 až 51, jak je popsáno detailněji níže.

Vhodné techniky amplifikace nukleových kyselin jsou dobře známy zkušeným osobám a zahrnují polymerázovou řetězovou reakci (PCR), jakje například popsáno v kapitole 15 v Ausubel et al., viz výše, která je zde začleněna jak odkaz; amplifikaci vytěsňováním řetězce (SDA), jak je například popsáno v U.S. Patentu 5 422 252, který je zde začleněn jako odkaz; replikaci rotujícím kružnicí (RCP), jakje například popsáno v Liu et al., 1996, J. Am. Chem. Soc. 118 1587 a v mezinárodní žádosti WO 92/01813 a Lizardi et al., (mezinárodní žádost WO 97/19193), které jsou zde začleněny jako odkazy; amplifikaci založenou na sekvenci nukleové kyseliny (NASBA), jakje například popsáno v Sooknanan et al., 1994, Biotechniques 17 1077, který je zde začleněn jako odkaz; a Q-β replikasovou amplifikaci, jak je například popsáno v Tyagi et al., 1996, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 93 5395, který je zde začleněn jako odkaz.

Jakje zde užíváno, „amplifikační produkt“ odkazuje na produkt nukleové kyseliny vytvořený technikami amplifikace nukleových kyselin.

Protilátky

Vynález také zahrnuje protilátky proti izolovaným proteinovým fragmentům, variantám a derivátům vynálezu. Protilátky vynálezu mohou být polyklonální nebo monoklonální. Dobře známé protokoly aplikovatelné na produkci protilátek, jejich purifikaci a použití mohou být nalezeny například v kapitole 2 v Coligan et al., CURRENT PROTOCLS IN IMMUNOLOGY (John Wiley & Sons NY, 1991-1994) a Harlow, E. & Lané, D. Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988, které jsou zde uvedenyjako odkazy.

Obecně se protilátky vynálezu vážou na nebo se konjugují s polypeptidem, fragmentem, variantou nebo derivátem vynálezu. Například protilátky mohou zahrnovat polyklonální protilátky. Takovéto protilátky mohou být například připraveny injikováním polypeptidu, fragmentu, varianty nebo derivátu vynálezu do produkčních druhů, který může zahrnovat myši nebo králíky, pro získání polyklonálního antiséra. Metody produkce polyklonálních protilátek jsou dobře známy osobám zkušeným v oboru. Příkladové protokoly, které mohou být použity, jsou popsány

- 17CZ 304379 B6 například v Coligan et al., CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, viz výše, a v Harlow & Lané, 1988, viz výše.

Místo polyklonálního antiséra získaného z produkčního druhu mohou být produkovány monoklonální protilátky použitím standardní metody popsané například v článku Kohler & Milstein, 1975, Nátuře 256, 495, který je zde uveden jako odkaz, nebo pomocí jejich novějších modifikací jako těch, které jsou uvedeny například v Coligan et al., CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, viz výše imortalizací sleziny nebo jiných protilátky produkujících buněk odvozených z produkčního druhu, který byl inokulován jedním nebo více polypeptidy, fragmenty, variantami nebo deriváty vynálezu.

Vynález ve své šíři také zahrnuje protilátky, které jsou tvořeny Fc nebo Fab fragmenty polyklonálních nebo monoklonálních protilátek zmíněných výše. Alternativně mohou protilátky obsahovat jeden řetězec Fv protilátky (scFvs) proti peptidu vynálezu. Takovéto scFvs mohou být připraveny například v souladu s metodami popsanými v Patentu Spojených států 5 091 513, Evropském patentu 239 400 nebo v článku Winter & Milstein, 1991, Nátuře 349 293, které jsou zde uvedeny jako odkazy.

Protilátky vynálezu mohou být použity pro afinitní chromatografií při izolaci přírodních nebo rekombinantních polypeptidů N. meningitidis. Pro příklad může být uveden odkaz na protokol imunoafínitní chromatografie popsané v kapitole 9.5 v Coligan et al., CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, viz výše.

Protilátky mohou být použity pro:

i) hledání v expresních knihovnách pro identifikaci variant polypeptidů vynálezu;

ii) identifikaci imunoreaktivních fragmentů nebo imunoreaktivních epitopů; a/nebo iii) detekci infekce N. meningitidis', jak bude popsáno dále, ale bez limitování na tato konkrétní použití.

Detekce N. meningitidis

Přítomnost nebo absence N. meningitidis u individua může být stanovena izolací biologického vzorku ze zmíněného individua, smícháním protilátky nebo fragmentu protilátky popsané výše s biologickým vzorkem a detekcí specificky navázané protilátky nebo fragmentu protilátky, která indikuje přítomnost N. meningitidis ve vzorku.

Termín „biologický vzorek“ tak, jak je používán zde, odkazuje na vzorek, který může být extrahován, neupraven, upraven, zředěn nebo zakoncentrován, z individua, jako je pacient. Vhodně je biologický vzorek vybrán ze skupiny obsahující celou krev, sérum, plazmu, sliny, moč, pot, ascitickou tekutinu, peritoneální tekutinu, synoviální tekutinu, amniotickou tekutinu, cerebrospinální tekutinu, kožní biopsii a podobné.

Jakákoliv vhodná technika pro stanovení vzniku komplexu může být použita. Například protilátky nebo fragment protilátky podle vynálezu mající značku mohou být použity pro imunotesty. Takovéto imunotesty mohou zahrnovat, ale nejsou tím limitovány, radioimunotesty (RIA), s enzymem spojené imunosorbentní testy (ELISA) a imunochromatografické techniky (ICT), které jsou dobře známy osobám zkušeným v oboru.

Pro příklad může být učiněn odkaz na kapitolu 7 v Coligan et al., CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, viz výše, která obsahuje mnoho různých variant imunotestů, které mohou být použity v souladu s touto přihláškou. Imunotesty mohou zahrnovat kompetitivní testy, jak jsou známy v oboru.

-18CZ 304379 B6

Značka asociovaná s protilátkou nebo fragmentem protilátky může zahrnovat následující:

A) přímé spojení značky s protilátkou nebo fragmentem protilátky;

B) nepřímé spojení značky s protilátkou nebo fragmentem protilátky; tj. připojení značky na jinou látku testu, která se následně váže na protilátku nebo fragment protilátky; a

C) připojení na následný reakční produkt protilátky nebo fragmentu protilátky.

Značka může být vybrána ze skupiny obsahující chromogen, katalyzátor, enzym, fluorfor, chemiluminiscenční molekulu, lanthanoidový iont jako je europium (Eu³⁴), radioisotop a přímou vizuální značku. V případě přímé vizuální značky mohou být tyto tvořeny koloidní kovovou nebo nekovovou partikulí, partikulí barviva, enzymem nebo substrátem, organickým polymerem, latexovou partikulí, liposomem nebo jinými vezikuly obsahujícími signál produkující substancí a podobné.

Velké množství enzymů použitelných jako značky je obsaženo ve specifických patentů Spojených států U. S. 4 366 341, U. S. 4 843 000 a U. S. 4 849 338, které jsou zde uvedeny jako odkazy. Enzymové značky použitelné v této přihlášce zahrnují alkalickou fosfatázu, křenovou peroxidasu, luciferázu, β-galaktosidázu, glukosaoxidázu, lysozom, malátdehydrogenázu a podobné. Enzymová značka může být použita samostatně nebo v kombinaci s druhým enzymem v roztoku.

Vhodně je fluorofor vybrán ze skupiny obsahující fluoresceinisothiokyanát (FITC), tetramethylrhodaminisothiokyanát (TRITL) nebo R-Phycoerythrin (RPE).

Vynález se také rozšiřuje na metodu detekce infekce N. meningitidis u pacientů, zmíněná metoda zahrnuje kroky spojení biologického vzorku z pacienta s polypeptidem, fragmentem, variantou nebo derivátem vynálezu a detekcí přítomnosti nebo absence komplexu mezi zmíněným polypeptidem, fragmentem, variantou nebo derivátem a specifickými protilátkami proti N. meningitidis ve zmíněném séru, kdy je přítomnost daného komplexu indikací této infekce.

Ve výhodném provedení detekce výše zmíněného komplexu je uskutečňována detekovatelnou modifikací zmíněného polypeptidů, fragmentu, varianty nebo derivátu vhodnou značkou, jak je dobře známo v oboru, a pomocí těchto modifikovaných složek v imunotestu, jak bylo pro příklad popsáno výše.

V jiném aspektu vynález poskytuje metodu detekce bakterie N. meningitidis v biologickém vzorku podezřelém, že obsahuje zmíněnou bakterii, tato metoda zahrnuje kroky izolace biologického vzorku z pacienta, detekce sekvence nukleové kyseliny podle vynálezu ve zmíněném vzorku, která indikuje přítomnost této bakterie. Detekce zmíněné sekvence nukleové kyseliny může být stanovena pomocí jakékoliv vhodné techniky. Například značená nukleová kyselina podle vynálezu může být použita jako sonda pro Southern blot extraktu nukleových kyselin získaného z pacienta, jak je dobře známo v oboru.

Alternativně může být značená nukleová kyselina podle vynálezu použita jako sonda pro Northern blot RNA extraktu z pacienta.

S výhodou je extrakt nukleových kyselin z pacienta použit spolu s oligonukleotidovými primery odpovídajícími sense a antisense sekvencím sekvence nukleové kyseliny podle vynálezu nebo jejím sousedním oblastem pro amplifikační reakci nukleových kyselin, jako jsou PCR nebo ligázová řetězová reakce (LCR), která je například popsána v mezinárodní žádosti WO89/09385, která je zde uvedena jako odkaz.

Vhodné je také množství automatizovaných detekčních technik na pevné fázi. Například „Věry large scale immobilized primer arrays“ (VLSIPS™) jsou používány pro detekci nukleových kyselin, jak bylo například popsáno v Fodor et al., 1991, Science 251 767 a v Kazal et al., 1996,

- 19CZ 304379 B6

Nátuře Medicine 2 753. Výše zmíněné obecné techniky jsou dobře známy osobám zkušeným v oboru.

Farmaceutické prostředky

Dalším rysem vynálezu je použití polypeptidů, fragmentu, varianty nebo derivátu vynálezu („imunogenniho agens“) jako účinné složky ve farmaceutických prostředcích pro ochranu pacientů proti infekci N. meningitidis.

Vhodně farmaceutický prostředek obsahuje farmaceuticky přijatelný nosič, diluent nebo excipient.

„Farmaceuticky přijatelným nosičem, diluentem nebo excipientem“ jsou chápány pevné nebo tekuté plnidlo, diluent nebo enkapsulační látka, které mohou být bezpečně používány pro systematické podávání. V závislosti na konkrétním způsobu podávání může být použita řada nosičů, které jsou dobře známy v oboru. Tyto nosiče mohou být vybrány ze skupiny obsahující cukry, škroby, celulózu a její deriváty, slad, želatinu, talek, síran vápenatý, rostlinné oleje, syntetické oleje, polyoly, kyselinu alginátovou, fosfátem pufrované roztoky, emulgátory, isotonické roztoky a soli, jako jsou soli minerálních kyselin zahrnující hydrochloridy, bromidy a sírany, organické kyseliny, jako jsou acetáty, propionáty, malonáty, a vodu neobsahující pyrogeny.

Užitečným odkazem popisujícím farmaceuticky přijatelné nosiče, diluenty a excipienty je Remingtonů Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co. N.J. USA, 1991), který je zde uveden jako odkaz.

Jakákoliv bezpečná cesta podávání může být využita pro podávání prostředku vynálezu pacientovi. Například může být využito orální, rektální, parenterální, sublinguální, bukální, intravenózní, intraartikulámí, intramuskulámí, intradermální, subkutánní, inhalační, intraokulámí, intraperitoneální, intracerebrovaskulární, transdermální a podobné podávání. Intramuskulámí a subkutánní injekce je výhodná například pro podávání imunogenních prostředků, vakcín a DNA vakcín.

Dávkové formy zahrnují tablety, disperze, suspenze, injekce, roztoky, sirupy, pastilky, kapsule, čípky, aerosoly, transdermální náplasti a podobné. Tyto dávkové formy mohou také zahrnovat injikaci nebo implantaci zařízení pro kontrolované uvolňování vytvořené specificky pro tento účel nebo jiné formy implantátů modifikované tak, aby navíc fungovaly tímto způsobem. Kontrolované uvolňování terapeutické látky může být ovlivněno jejím potažením například hydrofóbními polymery zahrnujících akrylové pryskyřice, vosky, vyšší alifatické alkoholy, kyseliny polymléčnou a polyglykolovou, a určitými celulózovými deriváty, jako je hydroxypropyl(methyl)celulóza. Navíc může být kontrolované uvolňování ovlivněno použitím dalších polymerových matric, liposomů a/nebo mikrosfér.

Farmaceutické prostředky přihlášky vhodné pro orální nebo parenterální podávání mohou být prezentovány jako jednotlivé jednotky, jako jsou kapsule, sáčky nebo tablety obsahující predeterminované množství jedné nebo více terapeutických látek vynálezu v podobě prášku nebo granulí nebo jako roztoku nebo suspenze ve vodném roztoku, v nevodném roztoku, emulse oleje ve vodě nebo emulze vody v oleji. Takovéto prostředky mohou být připraveny jakoukoliv farmaceutickou metodou, ale všechny metody obsahují krok smísení jedné nebo více imunogenních látek, jak jsou popsány výše, s nosičem, který tvoří jednu nebo více nezbytných součástí. Obecně jsou prostředky připravovány stejnoměrným a dokonalým promíšením imunogenních látek vynálezu s tekutými nosiči nebo jemně dělenými pevnými nosiči nebo oběma a následně, pokud je to nutné, tvarováním produktu do požadované podoby.

Výše zmíněné prostředky mohou být podávány způsobem kompatibilním se složením dávky a v takovém množství, které je imunogenně účinné pro ochranu pacientů před infekcí N. meningitidis. Dávka podávaná pacientovi, v kontextu tohoto vynálezu, by měla být dostatečná pro

-20CZ 304379 B6 vyvolání prospěšné odpovědi u pacienta po určitou dobu, jako je snížení množství N. meningitidis nebo zabránění infekce N. meningitidis. Množství imunogenní látky (látek) pro podávání může záviset na léčeném subjektu včetně jeho věku, pohlaví, hmotnosti a zdravotního stavu. Z tohoto pohledu bude záviset přesné množství imunogenní látky (látek) požadovaného pro podání na úsudku lékaře.

Při stanovení účinného množství imunogenní látky pro podávání pro léčbu nebo profylaxi proti N. meningitidis může lékař určit její hladinu cirkulující v plazmě, průběh choroby a produkci protilátek proti N. meningitidis. Při jakékoliv události mohou být vhodné dávky imunogenní látky vynálezu snadno stanoveny osobami zkušenými v oboru. Takovéto dávky mohou být v řádu nanogramů až miligramů imunogenních látek vynálezu.

Výše zmíněné prostředky mohou být použity jako terapeutické nebo profylaktické vakcíny. Podle toho se vynález rozšiřuje i na produkci vakcín obsahujících jako aktivní látku jednu nebo více imunogenních látek vynálezu. Různé aplikovatelné postupy jsou zamýšleny pro produkci těchto vakcín. Příkladné postupy zahrnují například ty, které jsou popsány v NEW GENERATION VACCINES (1997, Levine et al., Marcel Dekker, lne. New York, Basel Hong Kong), který je zde uveden jako odkaz.

Imunogenní látka podle vynálezu může být smíchána, konjugována nebo fúzována s jinými antigeny zahrnujícími epitopy jiných antigenů pro B a T buňky. Navíc může být konjugována s nosičem, jak je popsáno níže.

Pokud je použit haptenový peptid vynálezu (tj. peptid, který reaguje s danou protilátkou, ale sám nemůže vyvolat imunitní odpověď), může být konjugován s imunogenním nosičem. Použitelné nosiče jsou dobře známy v oboru a zahrnují například: thyreoglobulin; albuminy, jako je lidský sérový albumin; toxiny, toxoidy nebo jakýkoliv mutantní křížově reaktivní materiál (CRM) toxinu z tetanu, záškrtu, černého kašle, Pseudomonas, E. coli, Staphylococcus a Streptococcus; polyaminokyseliny, jako jsou poly(lysin:glutamová kyselina); chřipku; Rotavirus VP6, Parvovirus VP1 a VP2; „core“ protein viru hepatitidy B; rekombinantní vakcínu viru hepatitidy B a podobné. Alternativně může být použit fragment nebo epitop nosičového proteinu nebo jiný imunogenní protein. Například haptenový peptid vynálezu může být spojen s epitopem T buňky pro bakteriální toxin, toxoid nebo CRM. Z tohoto pohledu může být učiněn odkaz na U. S. Patent 5 785 973, který je zde začleněn jako odkaz.

Navíc polypeptid, fragment, varianta nebo derivát vynálezu může účinkovat jako nosičový protein ve vakcinačním prostředku namířeném proti Neisseria nebo proti jiným bakteriím nebo virům.

Imunogenní látky vynálezu mohou být podávány jako multivalentní podjednotka vakcín v kombinaci s antigeny N. meningitidis nebo antigeny jiných organizmů včetně patogenních bakterií H. influenzae, M. catarrhalis, N. gonorrhoeae, E. coli, S. pneumoniae atd. Alternativně nebo navíc mohou být podávány společně s oligosacharidovými nebo polysacharidovými složkami N. meningitidis.

Vakcíny mohou také obsahovat farmaceuticky přijatelný nosič, diluent nebo excipient, jak byly definovány dříve.

Vakcíny a imunogenní prostředky mohou obsahovat adjuvans, jak je dobře známo v oboru. Adjuvans zamýšlené přihláškou zahrnují, ale nejsou tím limitovány: povrchově aktivní látky, jako jsou hexadecylamin, oktadecylamin, estery oktadecylaminokyselin, lysolecithin, dimethyl(dioktadecyl)amonium-bromid, N,N-dioktadecyl-N',N'-dioktadecyl-N',N'-bis(2-hydroxyethyl)propandiamin)), methoxy(hexadecyl)glycerol, pluronové polyoly; polyaminy, jako jsou pyran, dextran-sulfát, póly 1C karbopol; peptidy, jako jsou muramyl dipeptid a deriváty,

-21 CZ 304379 B6 dimethylglycin, tuftsin; olejové emulze; a minerální gely, jako jsou fosfát hlinitý, hydroxid hlinitý nebo kamenec; lymfokiny, QuilA a komplexy stimulující imunitu (1SCOMS).

S ohledem na příklady adjuvans je také učiněn odkaz na Mezinárodní publikaci WO 99/36544 uvedenou zde jako odkaz.

Vakcinace podáním DNA

Expresní konstrukty obsahující modifikované proteiny NhhA vynálezu mohou být podávány lidem pro jejich profylaktickou a/nebo terapeutickou léčbu. Z tohoto ohledu expresní konstrukty mohou kódovat jeden nebo více modifikovaných peptidu, polypeptidů, fragmentů nebo derivátů NhhA, kolektivně nazývané jako „imunogenní agens.

Expresní konstrukty také zahrnují konstrukty pro genovou terapii, které využívají specializované vektory pro genovou terapii, jako je vakcinie, a virové vektory použitelné pro genovou terapii. Posledně zmíněné zahrnují adenoviry a adeno-asociované viry (AAV), jako jsou popsány v Franceschi et al., 2000, J. Cell Biochem. 78 476, Braun-Falco et al., 1999, Gene Ther. 6 432, retrovirové a lentivirové vektory, jako jsou popsány v Buschacher et al., 2000, Blood 95 2499, a vektory odvozené od herpes simplex viru a cytomegaloviru. Obecný souhrn vektorů pro genovou terapii a metody podávání mohou být nalezeny v Robbins et al., 1998, Trends in Biotech. 16 35. Exemplárním odkazem, který popisuje množství vektorů potenciálně vhodných pro genovou terapii používajících proteiny zNeisseria a metody podávání, je Mezinárodní publikace WO 99/36544, která je zde uvedena jako odkaz.

Imunogenní agens vynálezu může být exprimován atenuovanými virovými hostiteli. „Atenuovaným virovým hostitelem“ jsou míněny virové vektory, které jsou buď přirozeně v podstatě avirulentní, nebo tak byly upraveny. Virus může být upraven, aby byl v podstatě avirulentní, jakýmkoliv vhodným fyzikálním (tj. působením vysoké teploty) nebo chemickým způsobem (tj. působením formaldehydu). „ V podstatě avirulentním“ je míněn virus, jehož infektivita byla zničena. Ideálně je infektivita viru zničena bez ovlivnění proteinů, které nesou imunogenitu viru. Z předcházejícího bude oceněno, že atenuovaný virový hostitel může zahrnovat živé viry nebo inaktivované viry.

Atenuovaní viroví hostitelé, kteří mohou být užiteční ve vakcínách podle vynálezu, mohou obsahovat virové vektory včetně adenoviru, cytomegaloviru a s výhodou poxvirů, jako je vakcinia (viz například Paoletti and Panicali, U.S. Patent 4 603 112, který je zde uveden jako odkaz) a atenuovaných kmenů Salmonella (viz například Stocker, U.S. Patent 4 550 081, který je zde uveden jako odkaz). Živé vakcíny jsou zvláště výhodné, protože vedou k prodlouženému stimulu, který může udělovat důležitou dlouhotrvající imunitu. Další odkaz, který popisuje různé virové vektory potenciálně vhodné pro imunizaci používající proteiny zNeisseria a metody podávání, je Mezinárodní publikace WO 99/36544, která je zde uvedena jako odkaz.

Multivalentní vakcíny mohou být připraveny z jednoho nebo více mikroorganizmů, které exprimují různé epitopy N. meningitidis (např. jiné povrchové proteiny nebo epitopy N. meningitidis'}. Navíc mohou být do vakcíny inkorporovány epitopy jiných patogenních mikroorganizmů.

Ve výhodném provedení budou zahrnovat přípravu rekombinantního vakcinia viru pro expresi sekvence nukleové kyseliny podle vynálezu. Po zavedení do hostitele exprimuje rekombinantní vakcinia virus imunogenní agens a tak navozuje hostitelskou CTL odpověď. Pro příklad může být učiněn odkaz na U.S. Patent 4 722 848, který je zde uveden jako odkaz a který popisuje vakcinia vektory a metody užitečné pro imunizační protokoly.

Velké množství dalších vektorů užitečných pro terapeutické podávání nebo imunizaci imunogenními agens vynálezu bude z uvedeného popisu zřejmé pro osoby znalé oboru.

-22 CZ 304379 B6

V dalším provedení nukleotidová sekvence může být použita jako vakcína ve formě „nahé DNA“ vakcíny, jak je známo v oboru. Například expresní vektor vynálezu může být vnesen do savce, kde způsobí produkci polypeptidů in vivo, proti kterému hostitel vyvine imunitní odpověď, jak je například popsáno v Barry, M. et al., (1995, Nátuře, 377: 632 až 635), který je zde uveden jako odkaz.

Detekční soupravy

Přihláška také zahrnuje soupravy pro detekci N. meningitidis v biologickém vzorku. Ty budou obsahovat jedno nebo více agens popsaných výše v závislosti na podstatě použité testovací metody. Z tohoto pohledu mohou soupravy obsahovat jeden nebo více polypeptidů, fragmentů, variant, derivátů, protilátek, fragmentů protilátek nebo nukleovou kyselinu podle vynálezu. Soupravy mohou také libovolně obsahovat vhodné reagencie pro detekci značek, pozitivní a negativní kontroly, promývací roztoky, ředící pufry a podobné. Například souprava založená na detekci nukleových kyselin může obsahovat i) nukleovou kyselinu podle vynálezu (která může být použita jako pozitivní kontrola), ii) oligonukleotidový primer podle vynálezu a libovolně DNA polymerázu, DNA u atd. podle použité techniky amplifikace nukleových kyselin.

Příprava imunoreaktivních fragmentů

Vynález se také rozšiřuje na metodu identifikace imunoreaktivních fragmentů polypeptidů, variant nebo derivátů podle vynálezu. Tato metoda v podstatě zahrnuje vytvoření fragmentu polypeptidů, varianty nebo derivátu, podávání fragmentu savci; a detekci imunitní odpovědi u savce. Tato odpověď bude zahrnovat produkci elementů, které specificky vážou N. meningitidis a/nebo zmíněný polypeptid, variantu nebo derivát, a/nebo ochranný účinek proti infekci N. meningitidis.

Před testováním určitého fragmentu na imunoreaktivitu ve výše zmíněné metodě může být použito mnoho predikčních metod pro odhad, zda konkrétní fragment může být použit pro získání protilátky, která bude křížově reagovat s přirozeným antigenem. Tyto predikční metody mohou být založeny na aminokoncových nebo karboxykoncových sekvencích, jak je například popsáno v kapitole 11.14 v Ausubel et al., viz výše. Alternativně mohou být tyto predikční metody založeny na odhadu hydrofility, jak je například popsáno v Kyte & Doolittle 1982, J. Mol. Bio. 157 105 a v Hopp & Woods, 1993, Mol. Immunol. 20 483, které jsou zde uvedeny jako odkazy, nebo na odhadu sekundární struktury, jak je například popsáno v Choo & Fasman, 1978, Ann. Rev. Biochem. 47 251, který je zde uveden jako odkaz.

Navíc „mapování epitopů“ používá monoklonální protilátky vynálezu pro identifikaci křížově reaktivních epitopů nejdříve testováním jejich schopnosti poskytovat křížovou ochranu a následně jsou identifikovány epitopy rozpoznávané zmíněnými protilátkami. Příkladná metoda je poskytnuta v Coligan et al., CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, viz výše.

Obecně poskytují optimální výsledky peptidové fragmenty tvořené 10 až 15 zbytky. Peptidy tak malé jako 6 a tak velké jako 20 zbytků byly úspěšně použity. Tyto peptidové fragmenty mohou být následně chemicky připojeny k nosičové molekule, jako je „keyhole limpet hemocyanin“ (KLH) nebo bovinní sérum albumin (BSA), jak je například popsáno v sekcích 11.14 a 11.15 v Ausubel et al., viz výše.

Bude taktéž oceněno, že peptidy mohou být synteticky cirkularizovány, jak je například popsáno v Hoogerhout et al., 1995, Infect. Immun. 63 3473, který je zde uveden jako odkaz.

Peptidy mohou být použity pro imunizaci živočichů, jak je například diskutováno výše. Titry protilátek proti přirozenému nebo výchozímu polypeptidů, ze kterého byl peptid vybrán, mohou být poté stanoveny například radioimunotestem nebo ELISA metodou, jak je například popsáno v sekcích 11.16a 114 v Ausubel et al., viz výše.

-23 CZ 304379 B6

Protilátky mohou být poté purifikovány z příslušné biologické tekutiny živočicha frakcionací sulfátem amonným nebo chromatograficky, jak je dobře známo v oboru. Příkladové protokoly pro purifikaci protilátek jsou obsaženy v sekcích 10.11 a 11.13 v Ausubel et al., viz výše, který je zde uveden jako odkaz.

Imunoreaktivita protilátky proti přirozenému nebo výchozímu polypeptidu může být stanovena jakoukoliv relevantní metodou, jako je například Western blot.

Funkční blokátory

U polypeptidů přirozeně se vyskytujícího typu NhhA/HiaNm uvedených v WO 99/31132 se předpokládají adhezní vlastnosti. Ve skutečnosti mají určitou podobnost s adheziny iHaemophilus influenzae, což jsou povrchové antigeny. Konkrétně jsou přibližně ze 67% homologní s proteinem Hia z H. influenzae (Barenkamp & St. Geme 111, 1996, Molecular Microbiology 19 1215) a ze 74% homologní s proteinem Hsf z H. influenzae (St. Geme III, J. et al., 1996, Journal of Bacteriology 178 6281; a U.S. Patent 5 646 259). Pro toto porovnání byly použity váha mezery 3 a váha délky 0,01 v GAP programu (Deveraux, 1984, viz výše). Proto může mít narušení funkce těchto polypeptidů významný terapeutický přínos, neboť bude zabraňovat bakterii N. meningitidis v adhezi a invazi do buněk. Narušení funkce může být dosaženo několika způsoby.

Například mohou být podávány sloučeniny, jako jsou chemické reagencie nebo polypeptidy, které blokují receptory na povrchu buněk, jež interagují s polypeptidy vynálezu. Ty kompletují s infekčním organizmem o receptorová místa. Tyto sloučeniny mohou například zahrnovat polypeptidy vynálezu, zvláště fragmenty nebo jejich funkční ekvivalenty stejně jako mimetika.

Termín „mimetika“ zde odkazuje na chemikálie, které jsou navrženy tak, aby se podobaly určitým funkčním oblastem proteinů nebo peptidů. Anti-idiotypické protilátky vytvořené proti výše popsaným protilátkám, které blokují vazbu bakterií na povrch buňky, mohou být také použity. Alternativně mohou sloučeniny, které interagují s receptor-vazebnými místy polypeptidu vynálezu, účinně zabraňovat infekci buňky N. meningitidis. Takovéto sloučeniny mohou zahrnovat blokující protilátky, peptidy nebo jiné chemické látky.

Všechny takovéto sloučeniny, farmaceutické prostředky, ve kterých jsou kombinovány s farmaceuticky přijatelnými nosiči, a metody léčby podáváním takovýchto sloučenin nebo prostředků pacientům trpícím infekcí N. meningitidis jsou dalším aspektem vynálezu.

Polypeptidy vynálezu mohou být použity pro hledání sloučenin pro jejich použití ve výše uvedených metodách. Například polypeptidy vynálezu mohou být kombinovány se značkou a vystaveny vlivu buněčné kultury za přítomnosti testované látky. Schopnost látky inhibovat vazbu značeného polypeptidu na buněčný povrch může být následně pozorována. V takovémto testu mohou být značené polypeptidy použity přímo na organizmu, jako je E. coli. Alternativně může být upravena sama N. meningitidis tak, aby exprimovala modifikovanou a detekovatelnou formu polypeptidu. Použití upravených kmenů N. meningitidis v této metodě je preferováno, protože je více pravděpodobné, že terciární struktura proteinu bude více podobná té, která je exprimována v bakterii přirozeně se vyskytujícího typu.

Proto, aby byl vynález snadno porozumitelný a dán do praktického používání, budou popsána konkrétní výhodná provedení v následujících nelimitujících příkladech.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Identifikace konstantních a variabilních oblastí polypeptidů NhhA

-24CZ 304379 Β6

Předkladatelé zkoumali aminokyselinové sekvence NhhA, které jsou konzervovány a/nebo nekonzervovány mezi deseti (10) kmeny N. meningitidis. Nekonzervované oblasti se rozdělí do čtyř variabilních oblastí (VI, V2, V3 a V4) a konzervované oblasti se rozdělují na Cl, C2, C3, C4 a C5 (jak je ukázáno na OBR. 1 a v Tabulce 1; SEQ ID NOS: 1 až 11). Srovnání odpovídající nukleotidové sekvence je ukázáno na OBR. 2 (SEQ ID NOS: 12 až 22).

Příklad 2

Nadprodukce polypeptidu PMC 21 NhhA

Protein NhhA kódovaný genem nhhA z kmene PMC21 N. meningitidis se nadprodukuje pomocí expresního konstruktu, v něm je gen nhhA funkčně spojen s promotorem.

Následující oligonukleotidové primery se použijí pro PCR amplifikací otevřeného čtecího rámce nukleové kyseliny nhhA z kmene PMC21 N. meningitidis:

HOMP5': 5'- CAA TTA ACG GCC GAA TAA AAG GAA GCC GAT ATG AAC AAA

ATA TAC CGC ATC - 3' (SEQ ID NO 40); který obsahuje restrikční místo pro Eag\ (podtrženo) a sekvenci kódující prvních 7 (sedm) aminokyselin NhhA (tučně).

ΗΟΜΡ3ΆΝ 5'- TGG AAT CCA TGG AAT CGC CAC CCT TCC CTT C - 3' (SEQ ID NO 41); který obsahuje restrikční místo pro Ncol (podtrženo) a reverzně komplementární sekvenci nukleotidů 48 až 61 za koncem otevřeného čtecího rámce nhhA z kmene ¢3 (tučně).

Produkt amplifikace obsahuje restrikční místa, která se následně naštěpí restrikčními endonukleázami Eagl a Ncol.

Pro subklonování se použije plazmid pCO14K, který obsahuje promotor porA před genem kódujícím silně exprimovaný vnější membránový protein Třídy 1 N. meningitidis společně s přilehlou sekvencí N. meningitidis kmene 2996 a selektabilní gen pro kanamycinovou rezistenci, jak bylo popsáno v Rouppe van der Voort, et al., Infect Immun 1996 64 2745.

Naštěpený amplifikační produkt se zaliguje do pCO14K naštěpeného restrikčními endonukleázami Eagl a JVcoI. Tato ligace vede k záměně většiny otevřeného čtecího rámce porA za amplifikační produkt nhhA (OBR. 3). Takto se vytvoří expresní konstrukt rekombinantní nukleové kyseliny (otevřený čtecí rámec je ukázán v SEQ ID NO 12), který kóduje polypeptid z 591 aminokyselin, jak je ukázáno v SEQ ID NO 1.

Tímto se dosáhne exprese nukleové kyseliny nhhA tohoto vynálezu pod kontrolou silného promotoru porA. Translace začíná na kodonu ATG začínajícího v pozici 31 HOMP5'. Aby se zabránilo fúzi mezi porA a nhhA, sekvence HOMP5' obsahuje TAA stop kodon před iniciačním ATG popsaným výše.

Výsledný plazmid, pIP52(PMC21), se linearizuje restrikčními štěpením a použije se pro transformaci N. meningitidis kmene 7G2 pomocí metody popsané v Janík et al., 1976, Journal of Clinical Microbiology 4 71. Transformanti se selektují inkubací přes noc při 37 °C v 5% CO₂ na tuhém médiu obsahujícím 100 pg/ml kanamycinu. Kolonie rezistentní na kanamycin se vyberou, subkultivují přes noc a prověří se na nadprodukci polypeptidu NhhA elektroforetickou separací celkových buněčných proteinů na 10% SDS-PAGE, po které následuje přenos na nitrocelulózovou membránu pomocí Semi-Dry blotter (BioRad). Membrána se poté postupně inkubuje s králičím anti-NhhA sérem (jak je popsáno v Mezinárodní publikaci WO 99/31132) a alkalickou fosfatasou konjugovanou s anti—králičí IgG (Sigma) před kolorimetrickou detekcí pomocí NBT/BCIP (Sigma). Izoluje se jeden klon, který exprimuje polypeptid NhhA ve velikém

-25 CZ 304379 B6 množství ve srovnání s výchozím kmenem (OBR. 11). Analýzou předpokládané aminokyselinové sekvence pomocí počítačového programu SIGCLEAVE (součást programového balíku eGCG umístěného na www.angis.org.au) se ukáže, že prvních 51 aminokyselin se odštěpí, aby se vytvořil maturovaný polypeptid (OBR. 14; SEQ ID NO: 33).

Plazmidový konstrukt pIP52 (PMC21) se může transformovat do jakéhokoliv transformačně kompetentního kmene N. meningitidis.

Příklad 3

Nadprodukce polypeptidů H41 NhhA

Protein NhhA kódovaný genem nhhA z kmene H41 N. meningitidis se nadprodukuje použitím stejných metod popsaných v Příkladu 2. Takto se vytvoří expresní konstrukt rekombinantní nukleové kyseliny (otevřený čtecí rámec ukázán v SEQ ID NO: 13), který kóduje polypeptid z 591 aminokyselin, jak je ukázáno v SEQ ID NO: 2. V tomto příkladu se výsledný plazmid pIP52(H41) linearizuje a transformuje do N. meningitidis kmene 7G2. Kolonie rezistentní na kanamycin se analyzují a z nich se vybere tak, která pomocí Western imunoblotu vykazuje nadprodukci NhhA (OBR. 11). Analýzou předpokládané aminokyselinové sekvence pomocí počítačového programu SIGCLEAVE (součást programového balíku eGCG umístěného na www.angis.org.au) se ukáže, že prvních 51 aminokyselin se odštěpí, aby se vytvořil maturovaný polypeptid (OBR. 14; SEQ ID NO: 34).

Tato strategie se může použít pro tvorbu expresních konstruktů obsahujících přirozeně se vyskytující sekvenci nhhA dalších kmenů N. meningitidis.

Příklad 4

Konstrukce deleční mutanty NhhA pomocí vhodného restrikčního místa

Pro jednoduché odkazování je aminokyselinová sekvence polypeptidů NhhA kódovaného nukleovou kyselinou nhhA z kmene PMC21 ukázána v SEQ ID NO 1. Předkladatelé vytvořili deleční mutantu z přirozeně se vyskytujícího typu nhhA z PMC21, kde je nejvíce variabilní oblast mezi kmeny odstraněna. Amplifikační produkt kódující aminokyseliny 1 až 54 přirozeně se vyskytujícího typu polypeptidů NhhA z PMC21 se vytvoří PCR amplifikací z templátu nukleové kyseliny nhhA použitím následujících primerů:

HOMP5': 5'- CAA TTA ACG GCC GAA TAA AAG GAA GCC GAT ATG AAC AAA

ATA TAC CGC ATC - 3' (SEQ ID NO: 40); který je stejný jako oligonukleotid použitý pro tvorbu nadprodukujícího konstruktu pIP52.

NH3'BG: 5'- GGT CAG ATC TGT TTC ATT GTT AGC ACT TGC - 3' (SEQ ID NO

42); který obsahuje restrikční místo Bglll (podtrženo) a reverzně komplementární sekvenci kódující aminokyseliny 134 (dvojitě podtrženo) a 49 až 54 přirozeně se vyskytujícího typu NhhA z PMC21 (tučně).

Výsledný amplifikační produkt obsahuje místa pro restrikční endonukleázy Eagl a Bglll. pIP52(PMC21) obsahuje jedno místo pro Eagl 20 bp před začátkem otevřeného čtecího rámce (ORF) nhhA a jedno místo pro Bglll, které je umístěno uvnitř ORF (viz Obrázek 3B). Proto se pIP52(PMC21) a amplifikační produkt vystaví štěpení restrikčními endonukleázami Eagl a Bglll, zaligují se a použijí pro transformaci kompetentního kmene DH5a bakterií E. coli; tím se zamění Eagl/Bglll fragment z pIP52(PMC21) PCR produktem. Tím se vytvoří expresní konstrukt rekombinantní nukleové kyseliny (otevřený čtecí rámec ukázán na OBR. 5; SEQ ID NO 28), který kóduje polypeptid z 512 aminokyselin, jak je ukázáno na OBR. 5 SEQ ID NO 23. Tato

-26CZ 304379 B6 aminokyselinová sekvence obsahuje aminokyseliny 1 až 54 a 134 až 592 sekvence přirozeně se vyskytujícího typu, takže se odstraní většina oblasti VI, celé oblasti V2 a C2 a část oblasti C3 z přirozeně se vyskytujícího typu polypeptidu NhhA z PMC21.

Tento plazmid se linearizuje restrikčním štěpením a transformuje se do kmene 7G2 N. meningitidis. Pomocí metod popsaných v Příkladu 1 se vybere jeden klon, který nadprodukuje zkrácený NhhAzPMC21 (OBR. 11).

Analýzou předpokládané aminokyselinové sekvence pomocí počítačového programu SIGGLEAVE (součást programového balíku eGCG umístěného na www.angis.org.au) se ukáže, že prvních 51 aminokyselin se odštěpí, aby se vytvořil maturovaný polypeptid (OBR. 14; SEQ ID NO: 35). Pro potvrzení přítomnosti odštěpitelné signální sekvence a pro potvrzení identity nadprodukovaného proteinu se částečně purifikují vnější membránové proteiny izolací frakce, která je nerozpustná v detergentu sarkosylu.

Izolované membránové proteiny se elektroforeticky separují před přenosem na Nylonovou membránu. Poloha nadprodukovaného proteinu se prokáže barvením pomocí Coomassie. Tato oblast membrány se vystřihne a protein se sekvenuje od N konce. Prvních jedenáct aminokyselin tohoto proteinu je XXETDLTSVGT (SEQ ID NO:52), které odpovídají aminokyselinovým zbytkům 52 až 62 (včetně) aminokyselinové sekvence, která se předpokládá, že bude exprimována nadprodukujícím konstruktem, jak je definován v tomto příkladu.

Toto je příklad delece využívající existující restrikční místa uvnitř polynukleotidové sekvence. Tento konstrukt může být transformován do jakékoliv transformačně kompetentní N. meningitidis.

Příklad 5

Konstrukce deleční mutanty NhhA pomocí vhodného restrikčního místa

Expresní konstrukt obsahující sekvenci přirozeně se vyskytujícího typu nhhA zH41 se připraví podle popisu v Příkladu 2. Výsledný expresní konstrukt se pojmenuje pIP52(H41). Deleční mutanta se připraví pomocí strategie popsané v tomto příkladu. V tomto případě se použijí oligonukleotidové primery:

HOMP5': 5'- CAA TTA ACG GCC GAA TAA AAG GAA GCC GAT ATG AAC AAA

ATA TAC CGC ATC - 3' (SEQ ID NO 40); který je stejný jako oligonukleotid použitý pro tvorbu nadprodukujícího konstruktu pIP52.

NH3'STU: 5'- GAT CAG GCC TGT ATC TTC ATC GGT AGC ATT - 3' (SEQ ID NO

43); který obsahuje restrikční místo Stul (podtrženo) a reverzně komplementární sekvenci kódující aminokyseliny 134 (dvojitě podtrženo) a 49 až 54 přirozeně se vyskytujícího typu H41 NhhA (tučně).

Výsledný amplifikační produkt obsahuje jedno místo pro restrikční endonukleázy Eagl a Stul. Expresní konstrukt pIP52(H41) obsahuje tato restrikční místa. Proto se pIP52(H41) a amplifikační produkt vystaví štěpení restrikčními endonukleázami Eagl a Stul, zaligují se a použití pro transformaci kompetentního kmene DH5a bakterií E. coli; touto ligací se zamění Eagl/Stul fragment zpIP52(H41) PCR produktem. Tím se vytvoří expresní konstrukt rekombinantní nukleové kyseliny (otevřený čtecí rámec ukázán na OBR. 6 a SEQ ID NO 29), který kóduje polypeptid z 513 aminokyselin, jak je ukázáno na OBR. 6 a SEQ ID NO 24. Tato aminokyselinová sekvence obsahuje aminokyseliny 1 až 54 a 134 až 593 sekvence přirozeně se vyskytujícího typu, takže se odstraní většina oblasti VI, celé oblasti V2 a C2 a část oblasti C3 z přirozeně se vyskytujícího typu polypeptidu NhhA z H41.

-27CZ 304379 B6

Tento plazmid se linearizuje restrikčním štěpením a transformuje se do kmene 7G2 N. meningitidis. Pomocí metod popsaných v Příkladu 1 se vybere jeden klon, který nadprodukuje zkrácený NhhAzH41 (OBR. 11).

Analýzou předpokládané aminokyselinové sekvence pomocí počítačového programu SIGCLEAVE (součást programového balíku eGCG umístěného na www.angis.org.au) se ukáže, že prvních 51 aminokyselin se odštěpí, aby se vytvořil maturovaný polypeptid (OBR. 14; SEQ ID NO: 36). Tento konstrukt může být transformován do jakékoliv kompetentní N. meningitidis.

Příklad 6

Konstrukce deleční mutanty NhhA pomocí „splice-overlap“ PCR

Kromě použití vhodných restrikčních míst pro deleci variabilních oblastí z nukleotidů kódujících NhhA mohou se mutanty také připravit pomocí „Splice Overlap Extension“ PCR, jak popsali Ho et al., 1989, viz výše a Horton, R. M. et al., 1989, viz výše. Tímto způsobem se mohou vytvářet polynukleotidy, které kódují konstantní oblasti, ale variabilní oblasti mají odstraněny (viz Obrázek 5A, 5B, 5C).

V tomto případě se vytvoří konstrukt obsahující oblasti Cl a C5 a všechny ostatní oblasti jsou odstraněny (viz Obrázek 5A).

Následující oligonukleotidové primery se použijí v PCR reakcích pro amplifikací DNA odpovídající oblasti Cl (viz OBR. 1) z chromozomální DNA kmene PMC21:

HOMP5': 5'- CAA TTA ACG GCC GAA TAA AAG GAA GCC GAT ATG AAC AAA

ATA TAC CGC ATC - 3' (SEQ ID NO 40); který je stejný jako oligonukleotid použitý pro tvorbu nadprodukujícího konstruktu plP52(PMC21).

SO-C: 5 - GAC GAA ATC AAC GTT CTT AGC ACT TGC CTG AAC CGT TGC

- 3'(SEQ ID NO 44); což je reverzně komplementární sekvence k sekvenci kódující aminokyseliny 237 až 241 na začátku oblasti C5 (podtrženo) a aminokyseliny 45 až 52 na konci oblasti C5 (podtrženo) a aminokyseliny 45 až 52 na konci oblasti Cl (tučně) přirozeně se vyskytujícího typu NhhA z kmene PMC21.

Amplifíkační produkt této reakce je HOMP57SO-C.

Následující oligonukleotidové primery se použijí v PCR reakcích pro amplifikací C5 z chromozomální DNA kmene PMC21:

SO-D: 5'- AAC GTT GAT TTC GTC CGC ACT TAC - 3' (SEQ ID NO 45); který kóduje aminokyseliny 237 až 244 na začátku C5 (podtržené je ukázána sekvence reverzně komplementární k primeru SO-C),

Η03ΆΝ: 5'- TGG AAT CCA TGG AAT CGC CAC CCT TCC CTT C-3' (SEQ ID NO

41); který je stejný jako primer použitý pro konstrukci pIP52.

Amplifíkační produkt této reakce je SO-D/HO3'AN.

Amplifíkační produkty HOMP57SO-C a SO-D/HO3'AN se po elektroforetické separaci purifíkují z agarózového gelu, smíchají se a podrobí se další amplifikací pomocí primerů HOMP5' a ΗΟ3ΆΝ. Výsledný amplifíkační produkt kóduje aminokyseliny 1 až 52 a 337 až 591 přirozeně se vyskytujícího typu NhhA zPMC21. Tento amplifíkační produkt se vystaví restrikčnímu štěpení Eagi a Vcol a nakloňuje se do pCO14K, jakje popsáno v Příkladu 1. Tato rekombinantní molekula obsahuje oblasti Cl a C5, takže jsou odstraněny oblasti VI až V4 a C2 až C4.

-28 CZ 304379 B6

Nukleotidová sekvence otevřeného čtecího rámce je ukázána na OBR. 7 a SEQ ID NO 30 a předpokládaná polypeptidová sekvence odvozená od této nukleotidové sekvence je ukázána na OBR. 7 a SEQ ID NO 25.

Tento plazmid se linearizuje restrikčním štěpením a transformuje se do kmene 7G2 N. meningitidis. Pomocí metod popsaných v Příkladu 2 se vybere jeden klon, který naprodukuje zkrácený NhhAzPMC21.

Analýzou předpokládané aminokyselinové sekvence pomocí počítačového programu SIGCLEAVE (součást programového balíku eGCG umístěného na www.angis.org.au) se ukáže, že prvních 51 aminokyselin se odštěpí, aby se vytvořil maturovaný polypeptid (OBR. 14; SEQ ID NO: 37).

Tento plazmid může být transformován do jakéhokoliv transformačně kompetentního kmene N. meningitidis.

Příklad 7

Konstrukce deleční mutanty NhhA pomocí „splice-overlap“ PCR

Bude oceněno, že se obdobná strategie může použít pro tvorbu rekombinantních polynukleotidů kódujících různé oblasti NhhA. Pomocí následující strategie (viz Obrázek 5B) se může vyrobit konstrukt obsahující oblasti C1, C4, V4 a C5:

Cl oblast se amplifíkuje použitím oligonukleotidových primerů:

HOMP5': 5'- CAA TTA ACG GCC GAA TAA AAG GAA GCC GAT ATG AAC AAA

ATA TAC CGC ATC - 3' (SEQ ID NO 40);

SO-E: 5'- AAC GCT TGC CGC ACG CTT AGC ACT TGC CTG CAA CGT TGC

- 3'(SEQ ID NO 46); který kóduje reverzně komplementární sekvenci kódující aminokyselin 211 až 215 na začátku oblasti C4 (podtrženo) a na konci oblasti Cl (tučně) z kmene PMC21.

Amplifikační produkt této reakce je HOMP57SO-E.

Následující oligonukleotidové primery se použijí v PCR reakcích pro amplifikaci oblasti C4-V4V5 z chromozomální DNA kmene PMC21 :

SO-F: 5'- CGT GCG GCA AGC GTT AAA GAC GTA - 3' (SEQ ID NO 47); který kóduje aminokyseliny 211 až 218 na začátku C4 (podtržené je ukázána sekvence reverzně komplementární k primerů SO-E),

ΗΟ3ΆΝ: 5'- TGG AAT CCA TGG AAT CGC CAC CCT TCC CTT C-3' (SEQ ID

NO: 41).

Amplifikační produkt této reakce je SO-F/HOMP3'.

Amplifikační produkty HOMP57SO-E a SO-F/HO3'AN se po elektroforetické separaci purifíkují z agarózového gelu, smíchají a podrobí se další amplifikaci pomocí primerů HOMP5' a ΗΟ3ΆΝ. Výsledný produkt kóduje aminokyseliny 1 až 52 a 211 až 591 přirozeně se vyskytujícího typu NhhA zPMC21. Tento amplifikační produkt se vystaví restrikčnímu štěpení Eag\ aNco\ a nakloňuje se do pCO14K. Tato rekombinantní molekula obsahuje oblasti Cl, C4, V4 a C5, takže jsou odstraněny oblasti VI až V3 a C2 až C3. Nukleotidová sekvence otevřeného čtecího rámce je ukázána na OBR. 8 a SEQ ID NO 31 a předpokládaná polypeptidová sekvence odvozená od této nukleotidové sekvence je ukázána na OBR. 8 a SEQ ID NO 26. Analýzou

-29CZ 304379 B6 předpokládané aminokyselinové sekvence pomocí počítačového programu SIGCLEAVE (součást programového balíku eGCG umístěného na www.angis.org.au) se ukáže, že prvních 51 aminokyselin se odštěpí, aby se vytvořil maturovaný polypeptid (OBR. 14; SEQ ID NO: 38).

Tento konstrukt může být transformován do jakékoliv transformačně kompetentní kmene N. meningitidis.

Příklad 8

Konstrukce deleční mutanty NhhA pomocí „splice-overlap“ PCR

Bude oceněno, že se obdobná strategie může použít pro tvorbu rekombinantních polynukleotidů kódujících různé oblasti NhhA. Pomocí následující strategie (viz Obrázek 5C) se může vyrobit konstrukt obsahující oblasti Cl, C4, V4 a C5.

Cl a C2 se amplifikuje použitím oligonukleotidových primerů:

HOMP5': 5'- CAA TTA ACG GCC GAA TA A AAG GAA GCC GAT ATG AAC AAA

ATA TAC CGC ATC - 3' (SEQ ID NO 40);

SO-G: 5'- CAG CGA GTA GGT GAA TTG TTT GAT TTT CAG GTT GTC GCC

GGC TTT GAG GGT GTT AGC ACT TGC CTG AAC CGT - 3'(SEQ ID NO 48); který kóduje reverzně komplementární sekvenci aminokyselin 125 až 129 na začátku oblasti C3 (podtrženo), celou oblast C2 (aminokyseliny 109 až 120, tučně a dvojitě podtrženo) a konec oblasti Cl (aminokyseliny 46 až 52, tučně) z kmene PMC21.

Amplifikační produkt této reakce je HOMP57SO-G.

C3 a část oblasti C4 se amplifikují použitím následujících oligonukleotidových primerů:

SO-H: 5'- TTC ACC TAC TCG CTG AAA AAA GAC - 3' (SEQ ID NO 49); který kóduje aminokyseliny 125 až 132 na začátku C3 (podtržené je ukázána sekvence reverzně komplementární k primerů SO-G)

SO I: 5 - GCC AGC GTT TAA TAC GTC TTT AAC GCT TGC CGC ACG ATC

GGT CAA AGT CGA ACC AAT - 3' (SEQ ID NO 50); který kóduje reverzně komplementární sekvenci aminokyselin 182 až 188 na konci C3 (podtrženo) a aminokyselin 211 až 222 z C4 (tučně).

Amplifikační produkt této reakce je SO-H/SO-I.

Amplifikační produkty HOMP57SO-G a SO-H/SO-I se po elektroforetické separaci purifikují z agarózového gelu, smíchají se a podrobí se další amplifikaci pomocí primerů HOMP5' a SO-I, aby byl získán produkt kódující aminokyseliny 1 až 52, 103 až 114, 125 až 188 a 211 až 222, tj. oblasti Cl, C2, C3 a část C4. Amplifikační produkt této reakce je HOMP57SO-I.

C5 a část oblasti C4 se amplifikují použitím následujících oligonukleotidových primerů:

SO-J: 5'- GTA TTA AAC GCT GGC TGG AAC ATT AAA GGC GTT AAA AAC

GTT GAT TTC GTC CGC ACT - 3' (SEQ ID NO 51); který kóduje aminokyseliny 218 až 229 zC4 (podtrženo) a aminokyseliny 238 až 243 zC5 (tučně) přirozeně se vyskytujícího typu NhhA z kmene PMC21. (Podtržené a tučně je ukázána sekvence reverzně komplementární k SO-I)

Η03ΆΝ: 5'- TGG AAT CCA TGG AAT CGC CAC CCT TCC CTT C-3' (SEQ ID

NO: 41).

-30CZ 304379 B6

Amplifikační produkt této reakce je SO-J/HO3'AN.

Amplifikační produkty HOMP57SO-I a SO-J/HO3'AN se po elektroforetické separaci purifikují zagarózového gelu, smíchají se a podrobí se další amplifikaci pomocí primerů HOMP5' a ΗΟ3ΆΝ. Výsledný produkt kóduje aminokyseliny 1 až 52, 103 až 114, 125 až 188, 211 až 229 a 237 až 591 přirozeně se vyskytujícího typu NhhA z kmene PMC21. Výsledný produkt se vystaví restrikčnímu štěpení Eag\ a Nco\ a nakloňuje se do pCO14K. Tato rekombinantní molekula obsahuje oblasti Cl, C2, C3, C4 a C5, takže jsou odstraněny oblasti VI, V2, V3 a V4. Nukleotidová sekvence otevřeného čtecího rámce je ukázána na OBR. 9 a SEQ ID NO 32 a předpokládaná polypeptidová sekvence odvozená od této nukleotidové sekvence je ukázána na OBR. 9 a SEQ ID NO 27. Analýzou předpokládané aminokyseliny sekvence pomocí počítačového programu SIGCLEAVE (součást programového balíku eGCG umístěného na www.angis.org.au) se ukáže, že prvních 49 aminokyselin se odštěpí, aby se vytvořil maturovaný polypeptid (OBR. 14; SEQ ID NO: 39).

Tento konstrukt může být transformován do jakékoliv transformačně kompetentního kmene N. meningitidis.

Příklad 9

Purifikace nadprodukovaných polypeptidů NhhA

Rekombinování polypeptid NhhA popsaný v předcházejících příkladech se může izolovat následujícím postupem. Bakterie se nechají růst přes noc (12 až 14 hodin) při 37 °C v atmosféře 5% CO₂. (V tomto případě se použije médium BHI doplněné agarem s Leventhalovou bází. Další růstová média jsou dobře známa osobám zkušeným v oboru.) Bakterie z deseti 25 ml agarózových misek se sklidí a suspendují ve 25 ml 10 mM Tris upraveného na pH 8,0 pomocí HCI. Přidá se stejné množství lOmM Tris (pH 8,0) obsahujícího 2% sarkosyl a směs se jemně míchá 1 hodinu při 4 °C. Toto se centrifuguje při 100 000 x g sedmdesát minut při 20 °C a supematant se vyhodí. Peleta se resuspenduje páskováním přes jehlu tloušťky 25 v 25 ml 10 mM Tris (pH 8,0) obsahujícího 1% sarkosyl. Toto se centrifuguje při 100 000 x g sedmdesát minut při 20 °C a supematant se vyhodí. Peleta se resuspenduje páskováním přes jehlu tloušťky 25 v 10 ml 10 mM Tris (pH 8,0). Tato frakce obsahuje v sarkosylu nerozpustné buněčné komponenty a je obohacena o proteiny vnější membrány. Může se přidat dodatečný krok pro odstranění reziduálního detergentu sarkosylu, přičemž se proteinový roztok dialyzuje při čtyřech cyklech 4 až 8 hodin proti 100 až 1000 objemům například lOmM Trus.Cl pH 8,0 nebo PBS (fosfátem pufrovaný roztok) při 4 °C.

Po určení koncentrace proteinů v suspenzi pomocí absorbance při vlnové délce 280 nm nebo použitím BCA soupravy (Pierce) se přibližně 1 ml roztoku obsahující 10 mg proteinu v roztoku obsahujícím 1% SDS (laurylsulfát sodný), 2% β-merkaptoethanol se separuje na 1,5 mm silném 6% SDS-PAGE v přístroji Mini-protean II od firmy BioRad. NhhA s vysokou molekulární hmotností se z gelu eluuje použitím „mini Whole gel Eluter“ od firmy BioRad. Přibližně 10 % z každé eluované frakce se zkontroluje separací na SDS-PAGE a následným barvením Coomassie. Frakce obsahující NhhA významně čisté od ostatních proteinů se spojí dohromady. Tento postup se použije pro izolaci nadprodukovaného maturovaného NhhA popsaného v Příkladu 2 (SEQ ID NO: 1), nadprodukované delece Rg/II maturovaného NhhA popsaného v Příkladu 4 (SEQ ID NO: 23) a nadprodukované deleční mutanty Nhh|A popsané v Příkladu 6 (SEQ ID NO: 25). Izolovaný protein je ukázán na OBR. 12.

-31 CZ 304379 B6

Příklad 10

Imunogenita purifikovaných polypeptidů deleční mutanty NhhA

Myši se inokulují purifikovanými polypeptidy NhhA přirozeně se vyskytujícího typu a delečními mutantami popsanými v předcházejících Příkladech. V první skupině se každá Balb/C myš subkutánně inokuluje přibližně 130 pg PMC21 NhhA s MPL + TDM adjuvans (získáno od Sigma-Aldrich) v den 0, 115 pg v den 14. Ve druhé skupině se každá myš inokuluje přibližně 120 pg proteinu s MPL + TDM™ adjuvans (získáno od Sigma-Aldrich) v den 0 a 190 pg v den 14. Ve třetí skupině se každá myš inokuluje přibližně 260 pg proteinu s MPL + TDM adjuvans (získáno od Sigma-Aldrich) v den 0 a 1240 pg v den 14. Krevní vzorky se odeberou v den 21 a izoluje se sérum. Tato séra se testují na přítomnost protilátek rozpoznávajících celou délku NhhA z PMC 21 pomocí Western imunoblotu (OBR. 13). Preparáty OMC (5 mg) z P6 (nadprodukuje PMC21 NhhA) a z kmene 2A (exprese NhhA zrušena) se separují na 6% SDS-PAGE pomocí elektroforetického aparátu Mini Protean II od firmy BioRad. Proteiny se elektroforeticky přenesou na nitrocelulózu a filtr se nařeže na 3 mm proužky, následně se blokuje v 5% odtučněném sušeném mléku v PBS. Myší séra se ředí 1:1000 až 1:10 000 v 5% odtučněném mléku a inkubují se s nitrocelulózovými proužky. Vazba protilátky se detekuje použitím alkalické fosfatasy konjugované s anti-myší IgG (Sigma) před kolorimetrickou detekcí pomocí NBT/BCIP (Sigma). Jak může být vidět na OBR. 13, je možné vyvolat imunitní odpověď proti celé délce maturovaného polypeptidů PMC21 NhhA inokulací delečních mutant NhhA nebo nezkráceným maturovaným polypeptidem NhhA.

Příklad 11

Exprese polypeptidů deleční mutanty v E. coli

Kromě exprese mutantních polypeptidů tohoto vynálezu v N. meningitidis mohou být tyto také exprimovány v bakteriích E. coli. Jakákoliv deleční mutanta rekombinantního nhhA z Příkladů 4 až 8 může být použita jako templát pro PCR amplifikaci. Jako oligonukleotidové primery se mohou použít ty, které byly popsány v Mezinárodní Publikaci WO99/31132 (jako SEQ ID NO 24 a SEQ ID NO 25 tohoto dokumentu). Amplifikační produkt se může restrikčně naštěpit enzymy BamH\!HintňW a ligovat s BamH\iHindXW restrikčně naštěpeným plazmidem pMALC2 (New England BioLabs) a výsledný plazmid se transformuje do kompetentních E. coli kmene DH5ot. Výsledný kmen se může indukovat k expresi velkého množství rekombinantního proteinu za podmínek doporučovaných výrobcem pMALC2. Výsledný rekombinantní protein je fuzát proteinu vázajícího maltózu a polypeptidů deleční mutanty NhhA tohoto vynálezu. Ten se může částečně purifikovat separací na SDS-PAGE následované elektroelucí použitím Mini-Gel Electro-eluter (BioRad) podle pokynů výrobce. Částečně purifikovaný fúzní protein se může následně dialyzovat proti PBS před štěpením proteázou enzymem Faktor Xa, aby se odstranila skupina proteinu vázajícího maltózu z rekombinantního proteinu NhhA. Rekombinantní protein NhhA se může purifikovat standardními metodami, jaké například popsal R. K. Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, New York, NY USA, 1993).

Ve specifikaci cílů byla popsána výhodná provedení tohoto vynálezu bez omezování vynálezu na jakékoliv provedení nebo specifický soubor znaků Proto bude oceněno osobami zkušenými v oboru na základě zveřejnění, že různé modifikace a změny mohou být učiněny v jednotlivých ukázkových provedeních, aniž by došlo k odklonu od záměru přihlášky.

Všechny počítačové programy, algoritmy, patent a vědecká literatura, na které se zde odkazuje, jsou zde zahrnuty jako odkazy.

-32CZ 304379 B6

Průmyslová využitelnost

Polypeptidy a nukleové kyseliny vynálezu jsou využitelné pro přípravu protilátek, pro detekci .-V. meningitidis v biologických vzorcích, pro přípravu farmaceutických prostředků pro ochranu pacientů před infekcí N. meningitidis, pro DNA vakcinaci, pro přípravu imunoreaktivních fragmentů a jako funkční blokátory. Konkrétně jsou využitelné v diagnostice, v terapeutických a profylaktických vakcínách a při navrhování a/nebo hledání léků. Polypeptidy a nukleové kyseliny vynálezu jsou zvláště užitečné ve vakcínách, které účinně imunizují proti širšímu spektru kmenů N. meningitidis, než by se očekávalo od odpovídajícího povrchového antigenu přiro10 ženě se vyskytujícího typu.

-33 CZ 304379 B6

TABULKA 1

<ZY o	249-604	237-591	237-591	235-589 i	239-594	237-591	244-599	243-598	243-598	239-594	237-592
>	240-248	230-236	i 230-236 L	225-234 1	232-238	230-236 .. 1	237-243	236-242	236-242	232-238	228-236
u	221-239	211-229	211-229	206-224	213-231	211-229	218-236 L.....	217-235	217-235	213-231	r- CM CM O CM
>	199-220	189-210	189-210	186-205 L .....	191-212	189-210	I 196-217 L........	195-216	195-216 \|	191-212	189-208
en O	135-198	125-188	125-188	122-185	127-190	125-188	O\ CM r—H	131-194	131-194	127-190	125-188
>	121-134	121-124	115-124	118-121	117-126	121-124 I	118-131	O cn T“-< 1 Ť—(	117-130	117-126	115-124
cm U	109-120	109-120	103-114 i	106-117 I	: 105-116	109-120	106-117	SD 1 o t—<	(105-116	105-116	103-114 j
r~4 >	51-108	51-108	51-102	:51-105	51-104	51-108	51-105	'φ o T ) 1	51-104	51-104	51-102
o	1-50	1-50	1-50	1-50	I'⁵⁰	1-50	1-50 i	; 1-50	1-50	1-50	p-50
	Konsensus SEQ ID NO: 11	PPMC21 SEQ ID NO: 1	H41 SEQ ID NO: 2	P20 SEQ ID NO: 3	EG327 SEQ ID NO: 4	EG329 SEQ ID NO: 5	H38 SEQ ID NO: 6	H15 SEQ ID NO: 7	BZ10 SEQ ID NO: 8	BZ198 SEQ ID NO: 9	Z2491 SEQ ID NO: 10

-34CZ 304379 B6

TABULKA 2

Původní zbytek	Příkladné substituce
Ala	Ser
Arg	Lys
Asn	Gin, His
Asp	Glu
Cys	Ser
Gin	Asn
Glu	Asp
Gly	Pro
His	Asn, Gin
Ile	Leu, Val
Leu	Ile, Val
Lys	Arg, Gin, Glu
Met	Leu, Ile
Phe	Met, Leu, Tyr
Ser	Thr
Thr	Ser
Trp	Tyr
Tyr	Trp, Phe
Val	Ile, Leu

-35CZ 304379 B6

	SEQUENCE LISTING
<110>	The University of Queensland
<120>	Modifikovaný povrchový antigen
<130>	j enningspeak
<140>	XXXXX
<141>	2001-01-25
<150>	US 60/177,917
<151>	2000-01-25
<150>	PCT/AU01/00069
<151>	2001-01-25
<160>	52
<170>	Patentln version 3.1
<210>	1
<211>	591
<212>	PRT
<213>	Neisseria meningitidis
<400>	1

Met Asn Lys Ile Tyr Arg Ile Ile Trp Asn Ser,Ala Leu Asn Ala Trp 15 10 15

-36CZ 304379 B6

Val Val Val Ser Glu Leu Thr Arg Asn His Thr Lys Arg Ala Ser Ala 20 25 30

Thr Val Lys Thr Ala Val Leu Ala Thr Leu Leu Phe Ala Thr Val Gin 35 40 45

Ala Ser Ala Asn Asn Glu Glu Gin Glu Glu Asp Leu Tyr Leu Asp Pro 50 55 60

Val Gin Arg Thr Val Ala Val Leu Ile Val Asn Ser Asp Lys Glu Gly 65 70 75 80

Thr Gly Glu Lys Glu Lys Val Glu Glu Asn Ser Asp Trp Ala Val Tyr 85 90 95

Phe Asn Glu Lys Gly Val Leu Thr Ala Arg Glu Ile Thr Leu Lys Ala 100 105 110

Gly Asp Asn Leu Lys Ile Lys Gin Asn Gly Thr Asn Phe Thr Tyr Ser 115 120 125

Leu Lys Lys Asp Leu Thr Asp Leu Thr Ser Val Gly Thr Glu Lys Leu 130 135 140

Ser Phe Ser Ala Asn Gly Asn Lys Val Asn Ile Thr Ser Asp Thr Lys 145 150 155 160

Gly Leu Asn Phe Ala Lys Glu Thr Ala Gly Thr Asn Gly Asp Thr Thr 165 170 175

Val His Leu Asn Gly Ile Gly Ser Thr Leu Thr Asp Thr Leu Leu Asn 180 185 190

Thr Gly Ala Thr Thr Asn Val Thr Asn Asp Asn Val Thr Asp Asp Glu 195 200 205

Lys Lys Arg Ala Ala Ser Val Lys Asp Val Leu Asn Ala Gly Trp Asn 210 215 220

Ile Lys Gly Val Lys Pro Gly Thr Thr Ala Ser Asp Asn Val Asp Phe 225 230 235 240

Val Arg Thr Tyr Asp Thr Val Glu Phe Leu Ser Ala Asp Thr Lys Thr 245 250 255

-37CZ 304379 B6

Thr Thr Val Asn Val Glu Ser Lys Asp Asn Gly Lys Lys Thr Glu Val 260 265 270

Lys Ile Gly Ala Lys Thr Ser Val Ile Lys Glu Lys Asp Gly Lys Leu 275 280 285

Val Thr Gly Lys Asp Lys Gly Glu Asn Gly Ser Ser Thr Asp Glu Gly 290 295 300

Glu Gly Leu Val Thr Ala Lys Glu Val Ile Asp Ala Val Asn Lys Ala 305 310 315 320

Gly Trp Arg Met Lys Thr Thr Thr Ala Asn Gly Gin Thr Gly Gin Ala 325 330 335

Asp Lys Phe Glu Thr Val Thr Ser Gly Thr Asn Val Thr Phe Ala Ser 340 345 350

Gly Lys Gly Thr Thr Ala Thr Val Ser Lys Asp Asp Gin Gly Asn Ile 355 360 365

Thr Val Met Tyr Asp Val Asn Val Gly Asp Ala Leu Asn Val Asn Gin 370 375 380

Leu Gin Asn Ser Gly Trp Asn Leu Asp Ser Lys Ala Val Ala Gly Ser 385 390 395 400

Ser Gly Lys Val Ile Ser Gly Asn Val Ser Pro Ser Lys Gly Lys Met 405 410 415

Asp Glu Thr Val Asn Ile Asn Ala Gly Asn Asn Ile Glu Ile Thr Arg 420 425 430

Asn Gly Lys Asn Ile Asp Ile Ala Thr Ser Met Thr Pro Gin Phe Ser 435 440 445

Ser Val Ser Leu Gly Ala Gly Ala Asp Ala Pro Thr Leu Ser Val Asp 450 455 460

Gly Asp Ala Leu Asn Val Gly Ser Lys Lys Asp Asn Lys Pro Val Arg 465 470 475 480

-38CZ 304379 B6

Ile Thr Asn Val Ala Pro Gly Val 485

Lys Glu Gly Asp Val Thr Asn Val 490 495

Ala Gin Leu Lys Gly Val Ala Gin 500

Asn Leu Asn Asn Arg Ile Asp Asn 505 510

Val Asp Gly Asn Ala Arg Ala Gly 515 520

Ile Ala Gin Ala Ile Ala Thr Ala 525

Gly Leu Val Gin Ala Tyr Leu Pro 530 535

Gly Lys Ser Met Met Ala Ile Gly 540

Gly Gly Thr Tyr Arg Gly Glu Ala 545 550

Gly Tyr Ala Ile Gly Tyr Ser Ser 555 560

Ile Ser Asp Gly Gly Asn Trp Ile 565

Ile Lys Gly Thr Ala Ser Gly Asn 570 575

Ser Arg Gly His Phe Gly Ala Ser

580
<210>	2
<211>	592
<212>	PRT
<213>	Neisseria meningitidis

Ala Ser Val Gly Tyr Gin Trp 585 590 <400> 2

Met Asn Lys Ile Tyr Arg Ile Ile Trp Asn Ser Ala Leu Asn Ala Trp 15 10 15

Val Ala Val Ser Glu Leu Thr Arg Asn His Thr Lys Arg Ala Ser Ala 20 25 30

Thr Val Lys Thr Ala Val Leu Ala Thr Leu Leu Phe Ala Thr Val Gin 35 40 45

Ala Asn Ala Thr Asp Glu Asp Glu Glu Glu Glu Leu Glu Ser Val Gin 50 55 60

Arg Ser Val Val Gly Ser Ile Gin Ala Ser Met Glu Gly Ser Val Glu 65 70 75 80

-39CZ 304379 B6

Leu Glu Thr Ile Ser Leu Ser Met 85

Thr Asn Asp Ser Lys Glu Phe Val 90 95

Asp Pro Tyr Ile Val Val Thr Leu 100

Lys Ala Gly Asp Asn Leu Lys Ile 105 110

Lys Gin Asn Thr Asn Glu Asn Thr 115 120

Asn Ala Ser Ser Phe Thr Tyr Ser 125

Leu Lys Lys Asp Leu Thr Gly Leu 130 135

Ile Asn Val Glu Thr Glu Lys Leu 14 0

Ser Phe Gly Ala Asn Gly Lys Lys 145 150

Val Asn Ile Ile Ser Asp Thr Lys 155 160

Gly Leu Asn Phe Ala Lys Glu Thr 165

Ala Gly Thr Asn Gly Asp Thr Thr 170 175

Val His Leu Asn Gly Ile Gly Ser 180

Thr Leu Thr Asp Met Leu Leu Asn 185 190

Thr Gly Ala Thr Thr Asn Val Thr 195 200

Asn Asp Asn Val Thr Asp Asp Glu 205

Lys Lys Arg Ala Ala Ser Val Lys 210 215

Asp Val Leu Asn Ala Gly Trp Asn 220

Ile Lys Gly Val Lys Pro Gly Thr 225 230

Thr Ala Ser Asp Asn Val Asp Phe 235 240

Val Arg Thr Tyr Asp Thr Val Glu 245

Phe Leu Ser Ala Asp Thr Lys Thr 250 255

Thr Thr Val Asn Val Glu Ser Lys 260

Asp Asn Gly Lys Lys Thr Glu Val 265 270

Lys Ile Gly Ala Lys Thr Ser Val 275 280

Ile Lys Glu Lys Asp Gly Lys Leu 285

Val Thr Gly Lys 290

Gly Lys Gly 295

Glu Asn

Gly Ser Ser Thr Asp 300

Glu Gly

-40CZ 304379 B6

Glu Gly Leu Val Thr Ala Lys Glu Val Ile Asp Ala Val Asn Lys Ala 305 310 315 320

Gly Trp Arg Met Lys Thr Thr Thr Ala Asn Gly Gin Thr Gly Gin Ala 325 330 335

Asp Lys Phe Glu Thr Val Thr Ser Gly Thr Lys Val Thr Phe Ala Ser 340 345 350

Gly Asn Gly Thr Thr Ala Thr Val Ser Lys Asp Asp Gin Gly Asn Ile 355 360 365

Thr Val Lys Tyr Asp Val Asn Val Gly Asp Ala Leu Asn Val Asn Gin 370 375 380

Leu Gin Asn Ser Gly Trp Asn Leu Asp Ser Lys Ala Val Ala Gly Ser 385 390 395 400

Ser Gly Lys Val Ile Ser Gly Asn Val Ser Pro Ser Lys Gly Lys Met 405 410 415

Asp Glu Thr Val Asn Ile Asn Ala Gly Asn Asn Ile Glu Ile Thr Arg 420 425 430

Asn Gly Lys Asn Ile Asp Ile Ala Thr Ser Met Thr Pro Gin Phe Ser 435 440 445

Ser Val Ser Leu Gly Ala Gly Ala Asp Ala Pro Thr Leu Ser Val Asp 450 455 460

Asp Glu Gly Ala Leu Asn Val Gly Ser Lys Asp Ala Asn Lys Pro Val 465 470 475 480

Arg Ile Thr Asn Val Ala Pro Gly Val Lys Glu Gly Asp Val Thr Asn 485 490 495

Val Ala Gin Leu Lys Gly Val Ala Gin Asn Leu Asn Asn Arg Ile Asp 500 505 510

Asn Val Asn Gly Asn Ala Arg Ala Gly Ile Ala Gin Ala Ile Ala Thr 515 520 525

Ala Gly Leu Val Gin Ala Tyr Leu Pro Gly Lys Ser Met Met Ala Ile 530 535 540

-41 CZ 304379 B6

Gly Gly Gly Thr Tyr Leu Gly Glu Ala Gly Tyr Ala Ile Gly Tyr Ser

545 550 555 560

Ser Ile Ser Ala Gly Gly Asn Trp Ile Ile Lys Gly Thr Ala Ser Gly

565 570 575

Asn Ser Arg Gly His Phe Gly Ala Ser Ala Ser Val Gly Tyr Gin Trp 580 585 590 <210> 3 <211> 589 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 3

Met Asn Lys Ile Tyr Arg Ile Ile Trp Asn Ser Ala Leu Asn Ala Trp 15 10 15

Val Val Val Ser Glu Leu Thr Arg Asn His Thr Lys Arg Ala Ser Ala 20 25 30

Thr Val Ala Thr Ala Val Leu Ala Thr Leu Leu Ser Ala Thr Val Gin 35 40 45

Ala Asn Ala Thr Asp Thr Asp Glu Asp Glu Glu Leu Glu Ser Val Ala 50 55 60

Arg Ser Ala Leu Val Leu Gin Phe Met Ile Asp Lys Glu Gly Asn Gly 65 70 75 80

Glu Ile Glu Ser Thr Gly Asp Ile Gly Trp Ser Ile Tyr Tyr Asp Asp 85 90 95

His Asn Thr Leu His Gly Ala Thr Val Thr Leu Lys Ala Gly Asp Asn 100 105 110

Leu Lys

Ile Lys Gin Ser Gly 115

Lys Asp 120

Phe Thr Tyr Ser Leu Lys Lys 125

-42 CZ 304379 B6

Glu Leu Lys Asp Leu Thr Ser Val Glu Thr Glu Lys Leu Ser Phe Gly 130 135 140

Ala Asn Gly Asn Lys Val Asn Ile Thr Ser Asp Thr Lys Gly Leu Asn 145 150 155 160

Phe Ala Lys Glu Thr Ala Gly Thr Asn Gly Asp Pro Thr Val His Leu 165 170 175

Asn Gly Ile Gly Ser Thr Leu Thr Asp Thr Leu Ala Gly Ser Ser Ala 180 185 190

Ser His Val Asp Ala Gly Asn Gin Ser Thr His Tyr Thr Arg Ala Ala 195 200 205

Ser Ile Lys Asp Val Leu Asn Ala Gly Trp Asn Ile Lys Gly Val Lys 210 215 220

Thr Gly Ser Thr Thr Gly Gin Ser Glu Asn Val Asp Phe Val Arg Thr 225 230 235 240

Tyr Asp Thr Val Glu Phe Leu Ser Ala Asp Thr Lys Thr Thr Thr Val 245 250 255

Asn Val Glu Ser Lys Asp Asn Gly Lys Arg Thr Glu Val Lys Ile Gly 260 265 270

Ala Lys Thr. Ser Val Ile Lys Glu Lys Asp Gly Lys Leu Val Thr Gly 275 280 285

Lys Gly Lys Gly Glu Asn Gly Ser Ser Thr Asp Glu Gly Glu Gly Leu 290 295 300

Val Thr Ala Lys Glu Val Ile Asp Ala Val Asn Lys Ala Gly Trp Arg 305 310 315 320

Met Lys Thr Thr Thr Ala Asn Gly Gin Thr Gly Gin Ala Asp Lys Phe 325 330 335

Glu Thr Val Thr Ser Gly Thr Lys Val Thr Phe Ala Ser Gly Asn Gly 340 345 350

Thr Thr Ala Thr Val Ser Lys Asp Asp Gin Gly Asn Ile Thr Val Lys 355 360 365

-43 CZ 304379 B6

Tyr Asp Val Asn Val Gly Asp Ala 370 375

Leu Asn Val Asn Gin Leu Gin Asn 380

Ser Gly Trp Asn Leu Asp Ser Lys 385 390

Ala Val Ala Gly Ser Ser Gly Lys 395 400

Val Ile Ser Gly Asn Val Ser Pro 405

Ser Lys Gly Lys Met Asp Glu Thr 410 415

Val Asn Ile Asn Ala Gly Asn Asn 420

Ile Glu Ile Thr Arg Asn Gly Lys 425 430

Asn Ile Asp Ile Ala Thr Ser Met 435 440

Thr Pro Gin Phe Ser Ser Val Ser 445

Leu Gly Ala Gly Ala Asp Ala Pro 450 455

Thr Leu Ser Val Asp Asp Glu Gly 460

Ala Leu Asn Val Gly Ser Lys Asp 465 470

Ala Asn Lys Pro Val Arg Ile Thr 475 480

Asn Val Ala Pro Gly Val Lys Glu 485

Gly Asp Val Thr Asn Val Ala Gin 490 495

Leu Lys Gly Val Ala Gin Asn Leu 500

Asn Asn Arg Ile Asp Asn Val Asn 505 510

Gly Asn Ala Arg Ala Gly Ile Ala 515 520

Gin Ala Ile Ala Thr Ala Gly Leu 525

Ala Gin Ala Tyr Leu Pro Gly Lys 530 535

Ser Met Met Ala Ile Gly Gly Gly 540

Thr Tyr Leu Gly Glu Ala Gly Tyr 545 550

Ala Ile Gly Tyr Ser Ser Ile Ser 555 560

Asp Thr Gly Asn Trp Val Ile Lys 565

Gly Thr Ala Ser Gly Asn Ser Arg 570 575

Gly His Phe Gly Thr Ser Ala Ser 580

Val Gly Tyr,Gin Trp 585

-44CZ 304379 B6

<210>	4
<211>	594
<212>	PRT
<213>	Neisseria meningitidis

<400> 4
Met Asn Lys	Ile Tyr Arg Ile	Ile Trp Asn Ser Ala	Leu Asn Ala Trp
1	5	10	15

Val Ala Val Ser Glu Leu Thr Arg Asn His Thr Lys Arg Ala Ser Ala 20 25 30

Thr Val Ala Thr Ala Val Leu Ala Thr Leu Leu Phe Ala Thr Val Gin 35 40 45

Ala Ser Thr Thr Asp Asp Asp Asp Leu Tyr Leu Glu Pro Val Gin Arg 50 55 60

Thr Ala Val Val Leu Ser Phe Arg Ser Asp Lys Glu Gly Thr Gly Glu 65 70 75 80

Lys Glu Val Thr Glu Asp Ser Asn Trp Gly Val Tyr Phe Asp Lys Lys 85 90 95

Gly Val Leu Thr Ala Gly Thr Ile Thr Leu Lys Ala Gly Asp Asn Leu 100 105 110

Lys Ile Lys Gin Asn Thr Asn Glu Asn Thr Asn Ala Ser Ser Phe Thr 115 120 125

Tyr Ser Leu Lys Lys Asp Leu Thr Asp Leu Thr Ser Val Gly Thr Glu 130 135 140

Lys Leu Ser Phe Ser Ala Asn Ser Asn Lys Val Asn Ile Thr Ser Asp 145 150 155 160

Thr Lys Gly Leu Asn Phe Ala Lys Lys Thr Ala Glu Thr Asn Gly Asp 165 170 175

Thr Thr Val His Leu Asn Gly Ile Gly Ser Thr Leu Thr Asp Thr Leu 180 185 190

-45 CZ 304379 B6

Leu Asn Thr Gly Ala Thr Thr Asn Val Thr Asn Asp Asn Val Thr Asp 195 200 205

Asp Glu Lys Lys Arg Ala Ala Ser Val Lys Asp Val Leu Asn Ala Gly 210 215 220

Trp Asn Ile Lys Gly Val Lys Pro Gly Thr Thr Ala Ser Asp Asn Val 225 230 235 240

Asp Phe Val Arg Thr Tyr Asp Thr Val Glu Phe Leu Ser Ala Asp Thr 245 250 255

Lys Thr Thr Thr Val Asn Val Glu Ser Lys Asp Asn Gly Lys Arg Thr 260 265 270

Glu Val Lys Ile Gly Ala Lys Thr Ser Val Ile Lys Glu Lys Asp Gly 275 280 285

Lys Leu Val Thr Gly Lys Asp Lys Gly Glu Asn Asp Ser Ser Thr Asp 290 295 300

Lys Gly Glu Gly Leu Val Thr Ala Lys Glu Val Ile Asp Ala Val Asn 305 310 315 320

Lys Ala Gly Trp Arg Met Lys Thr Thr Thr Ala Asn Gly Gin Thr Gly 325 330 335

Gin Ala Asp Lys Phe Glu Thr Val Thr Ser Gly Thr Asn Val Thr Phe 340 345 350

Ala Ser Gly Lys Gly Thr Thr Ala Thr Val Ser Lys Asp Asp Gin Gly 355 360 365

Asn Ile Thr Val Met Tyr Asp Val Asn Val Gly Asp Ala Leu Asn Val 370 375 380

Asn Gin Leu Gin Asn Ser Gly Trp Asn Leu Asp Ser Lys Ala Val Ala 385 390 395 400

Gly Ser Ser Gly Lys Val Ile Ser Gly Asn Val Ser Pro Ser Lys Gly 405 410 415

-46CZ 304379 B6

Lys Met Asp Glu Thr Val Asn Ile Asn Ala Gly Asn Asn Ile Glu Ile 420 425 430

Thr Arg Asn Gly Lys Asn Ile Asp Ile Ala Thr Ser Met Thr Pro Gin 435 440 445

Phe Ser Ser Val Ser Leu Gly Ala Gly Ala Asp Ala Pro Thr Leu Ser 450 455 460

Val Asp Asp Glu Gly Ala Leu Asn Val Gly Ser Lys Asp Ala Asn Lys 465 470 475 480

Pro Val Arg Ile Thr Asn Val Ala Pro Gly Val Lys Glu Gly Asp Val 485 490 495

Thr Asn Val Ala Gin Leu Lys Gly Val Ala Gin Asn Leu Asn Asn His 500 505 510

Ile Asp Asn Val Asp Gly Asn Ala Arg Ala Gly Ile Ala Gin Ala Ile 515 520 525

Ala Thr Ala Gly Leu Val Gin Ala Tyr Leu Pro Gly Lys Ser Met Met 530 535 540

Ala Ile Gly Gly Gly Thr Tyr Arg Gly Glu Ala Gly Tyr Ala Ile Gly 545 550 555 560

Tyr Ser Ser Ile Ser Asp Gly Gly Asn Trp Ile Ile Lys Gly Thr Ala 565 570 575

Ser Gly Asn Ser Arg Gly His Phe Gly Ala Ser Ala Ser Val Gly Tyr 580 585 590

Gin Trp

<210>	5
<211>	591
<212>	PRT
<2I3>	Neisseria meningitidis

-47CZ 304379 B6 <400> 5

Met Asn Glu Ile Leu Arg Ile Ile 1 5

Trp Asn Ser Ala Leu Asn Ala Trp 10 15

Val Val Val Ser Glu Leu Thr Arg 20

Asn His Thr Lys Arg Ala Ser Ala 25 30

Thr Val Lys Thr Ala Val Leu Ala 35 40

Thr Leu Leu Phe Ala Thr Val Gin 45

Ala Ser Ala Asn Asn Glu Glu Gin 50 55

Glu Glu Asp Leu Tyr Leu Asp Pro 60

Val Leu Arg Thr Val Ala Val Leu 65 70

Ile Val Asn Ser Asp Lys Glu Gly 75 80

Thr Gly Glu Lys Glu Lys Val Glu 85

Glu Asn Ser Asp Trp Ala Val Tyr 90 95

Phe Asn Glu Lys Gly Val Leu Thr 100

Ala Arg Glu Ile Thr Leu Lys Ala 105 110

Gly Asp Asn Leu Lys Ile Lys Gin 115 120

Asn Gly Thr Asn Phe Thr Tyr Ser 125

Leu Lys Lys Asp Leu Thr Asp Leu 130 135

Thr Ser Val Gly Thr Glu Lys Leu 140

Ser Phe Ser Ala Asn Gly Asn Lys 145 150

Val Asn Ile Thr Ser Asp Thr Lys 155 160

Gly Leu Asn Phe Ala Lys Glu Thr 165

Ala Gly Thr Asn Gly Asp Thr Thr 170 175

Val His Leu Asn Gly Ile Gly Ser 180

Thr Leu Thr Asp Thr Leu Leu Asn 185 190

Thr Gly Ala Thr Thr Asn Val Thr 195 200

Asn Asp Asn Val Thr Asp Asp Glu 205

Lys Lys Arg Ala Ala Ser Val Lys 210 215

Asp Val Leu Asn Ala Gly Trp Asn 220

-48 CZ 304379 B6

Ile Lys Gly Val Lys Pro Gly Thr Thr Ala Ser Asp Asn Val Asp Phe 225 230 235 240

Val Arg Thr Tyr Asp Thr Val Glu Phe Leu Ser Ala Asp Thr Lys Thr 245 250 255

Thr Thr Val Asn Val Glu Ser Lys Asp Asn Gly Lys Lys Thr Glu Val 260 265 270

Lys Ile Gly Ala Lys Thr Ser Val Ile Lys Glu Lys Asp Gly Lys Leu 275 280 285

Val Thr Gly Lys Asp Lys Gly Glu Asn Gly Ser Ser Thr Asp Glu Gly 290 295 300

Glu Gly Leu Val Thr Ala Lys Glu Val Ile Asp Ala Val Asn Lys Ala 305 310 315 320

Gly Trp Arg Met Lys Thr Thr Thr Ala Asn Gly Gin Thr Gly Gin Ala 325 330 335

Asp Lys Phe Glu Thr Val Thr Ser Gly Thr Asn Val Thr Phe Ala Ser 340 345 350

Gly Lys Gly Thr Thr Ala Thr Val Ser Lys Asp Asp Gin Gly Asn Ile 355 360 365

Thr Val Met Tyr Asp Val Asn Val Gly Asp Ala Leu Asn Val Asn Gin 370 375 380

Leu Gin Asn Ser Gly Trp Asn Leu Asp Ser Lys Ala Val Ala Gly Ser 385 390 395 400

Ser Gly Lys Val Ile Ser Gly Asn Val Ser Pro Ser Lys Gly Lys Met 405 410 415

Asp Glu Thr Val Asn Ile Asn Ala Gly Asn Asn Ile Glu Ile Thr Arg 420 425 430

Asn Gly Lys Asn Ile Asp Ile Ala Thr Ser Met Thr Pro Gin Phe Ser 435 440 445

Ser Val Ser Leu Gly Ala Gly Ala Asp Ala Pro Thr Leu Ser Val Asp 450 455 460

-49CZ 304379 B6

Gly Asp Ala Leu Asn Val Gly Ser Lys Lys Asp Asn Lys Pro Val Arg 465 470 475 480

Ile Thr Asn Val Ala Pro Gly Val Lys Glu Gly Asp Val Thr Asn Val 485 490 495

Ala Gin Leu Lys Gly Val Ala Gin Asn Leu Asn Asn Arg Ile Asp Asn 500 505 510

Val Asp Gly Asn Ala Arg Ala Gly Ile Ala Gin Ala Ile Ala Thr Ala 515 520 525

Gly Leu Val Gin Ala Tyr Leu Pro Gly Lys Ser Met Met Ala Ile Gly 530 535 540

Gly Gly Thr Tyr Arg Gly Glu Ala Gly Tyr Ala Ile Gly Tyr Ser Ser 545 550 555 560

Ile Ser Asp Gly Gly Asn Trp Ile Ile Lys Gly Thr Ala Ser Gly Asn 565 570 575

Ser Arg Gly His Phe Gly Ala Ser Ala Ser Val Gly Tyr Gin Trp

580
<210>	6
<211>	599
<212>	PRT
<213>	Neisseria meningitidis

<400> 6

Met Asn Lys Ile Tyr Arg Ile Ile Trp Asn Ser Ala Leu Asn Ala Trp 15 10 15

Val Ala Val

Ser Glu 20

Leu Thr Arg Asn His 25

Thr

Lys Arg Ala 30

Ser Ala

Thr Val Lys 35

Thr Ala Val

Leu

Ala Thr 40

Leu Leu.Phe Ala

Thr Val Gin

-50CZ 304379 B6

Ala Asn Ala Thr Asp Glu Asp Glu Glu Glu Glu. Leu Glu Pro Val Val 50 55 60

Arg Ser Ala Leu Val Leu Gin Phe Met Ile Asp Lys Glu Gly Asn Gly 65 70 75 80

Glu Asn Glu Ser Thr Gly Asn Ile Gly Trp Ser Ile Tyr Tyr Asp Asn 85 90 95

His Asn Thr Leu His Gly Ala Thr Val Thr Leu Lys Ala Gly Asp Asn 100 105 110

Leu Lys Ile Lys Gin Asn Thr Asn Lys Asn Thr Asn Glu Asn Thr Asn 115 120 125

Asp Ser Ser Phe Thr Tyr Ser Leu Lys Lys Asp Leu Thr Asp Leu Thr 130 135 140

Ser, Val Glu Thr Glu Lys Leu Ser Phe Gly Ala Asn Gly Asn Lys Val 145 150 155 160

Asn Ile Thr Ser Asp Thr Lys Gly Leu Asn Phe Ala Lys Glu Thr Ala 165 170 175

Gly Thr Asn Gly Asp Thr Thr Val His Leu Asn Gly Ile Gly Ser Thr 180 185 190

Leu Thr Asp Thr Leu Leu Asn Thr Gly Ala Thr Thr Asn Val Thr Asn 195 200 205

Asp Asn Val Thr Asp Asp Lys Lys Lys Arg Ala Ala Ser Val Lys Asp 210 215 220

Val Leu Asn Ala Gly Trp Asn Ile Lys Gly Val Lys Pro Gly Thr Thr 225 230 235 240

Ala Ser Asp Asn Val Asp Phe Val His Thr Tyr Asp Thr Val Glu Phe 245 250 255

Leu Ser Ala Asp Thr Lys Thr Thr Thr Val Asn Val Glu Ser Lys Asp 260 265 270

Asn Gly Lys Arg Thr Glu Val Lys Ile Gly Ala Lys Thr Ser Val Ile 275 280 285

-51 CZ 304379 B6

Lys Glu Lys Asp Gly Lys Leu Val 290 295

Thr Gly Lys Gly Lys Gly Glu Asn 300

Gly Ser Ser Thr Asp Glu Gly Glu 305 310

Gly Leu Val Thr Ala Lys Glu Val 315 320

Ile Asp Ala Val Asn Lys Ala Gly 325

Trp Arg Met Lys Thr Thr Thr Ala 330 335

Asn Gly Gin Thr Gly Gin Ala Asp 340

Lys Phe Glu Thr Val Thr Ser Gly 345 350

Thr Asn Val Thr Phe Ala Ser Gly 355 360

Lys Gly Thr Thr Ala Thr Val Ser 365

Lys Asp Asp Gin Gly Asn Ile Thr 370 375

Val Lys Tyr Asp Val Asn Val Gly 380

Asp Ala Leu Asn Val Asn Gin Leu 385 390

Gin Asn Ser Gly Trp Asn Leu Asp 395 400

Ser Lys Ala Val Ala Gly Ser Ser 405

Gly Lys Val Ile Ser Gly Asn Val 410 415

Ser Pro Ser Lys Gly Lys Met Asp 420

Glu Thr Val Asn Ile Asn Ala Gly 425 430

Asn Asn Ile Glu Ile Thr Arg Asn 435 440

Gly Lys Asn Ile Asp Ile Ala Thr 445

Ser Met Thr Pro Gin Phe Ser Ser 450 455

Val Ser Leu Gly Ala Gly Ala Asp 460

Ala Pro Thr Leu Ser Val Asp Asp 465 470

Lys Gly Ala Leu Asn Val Gly Ser 475 480

Lys Asp Ala Asn Lys Pro Val Arg 485

Ile Thr Asn Val Ala Pro Gly Val 490 495

Lys Glu Gly Asp Val Thr Asn 500

Val Ala 505

Gin

Leu,Lys Gly Val Ala 510

Gin

-52CZ 304379 B6

Asn Leu Asn Asn Arg Ile Asp Asn Val Asp Gly Asn Ala Arg Ala Gly 515 520 525

Ile Ala Gin Ala Ile Ala Thr Ala Gly Leu Val Gin Ala Tyr Leu Pro 530 535 540

Gly Lys Ser Met Met Ala Ile Gly Gly Gly Thr Tyr Arg Gly Glu Ala 545 550 555 560

Gly Tyr Ala Ile Gly Tyr Ser Ser Ile Ser Asp Gly Gly Asn Trp Ile 565 570 575

Ile Lys Gly Thr Ala Ser Gly Asn Ser Arg Gly His Phe Gly Ala Ser 580 585 590

Ala Ser Val Gly Tyr Gin Trp 595 <210> 7 <211> 598 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 7

Met Asn Lys Ile Tyr Arg Ile Ile Trp Asn Ser Ala Leu Asn Ala Trp 15 10 15

Val Val Val Ser Glu Leu Thr Arg Asn His Thr Lys Arg Ala Ser Ala 20 25 30

Thr Val Ala Thr Ala Val Leu Ala Thr Leu Leu Phe Ala Thr Val Gin 35 40 45

Ala Asn Ala Thr Asp Asp Asp Asp Leu Tyr Leu Glu Pro Val Gin Arg 50 55 60

Thr Ala Val Val Leu Ser Phe Arg Ser Asp Lys Glu Gly Thr Gly Glu 65 70 75 80

Lys Glu Gly Thr Glu Asp Ser Asn Trp Ala Val Tyr Phe Asp Glu Lys 85 90 95

-53 CZ 304379 B6

Arg Val Leu Lys Ala Gly Ala Ile Thr Leu Lys Ala Gly Asp Asn Leu 100 105 110

Lys Ile Lys Gin Asn Thr Asn Glu Asn Thr Asn Glu Asn Thr Asn Asp 115 120 125

Ser Ser Phe Thr Tyr Ser Leu Lys Lys Asp Leu Thr Asp Leu Thr Ser 130 135 140

Val Glu Thr Glu Lys Leu Ser Phe Gly Ala Asn Gly Asn Lys Val Asn 145 150 155 160

Ile Thr Ser Asp Thr Lys Gly Leu Asn Phe Ala Lys Glu Thr Ala Gly 165 170 175

Thr Asn Gly Asp Pro Thr Val His Leu Asn Gly Ile Gly Ser Thr Leu 180 185 190

Thr Asp Thr Leu Leu Asn Thr Gly Ala Thr Thr Asn Val Thr Asn Asp 195 200 205

Asn Val Thr Asp Asp Glu Lys Lys Arg Ala Ala Ser Val Lys Asp Val 210 215 220

Leu Asn Ala Gly Trp Asn Ile Lys Gly Val Lys Pro Gly Thr Thr Ala 225 230 235 240

Ser Asp Asn Val Asp Phe Val Arg Thr Tyr Asp Thr Val Glu Phe Leu 245 250 255

Ser Ala Asp Thr Lys Thr Thr Thr Val Asn Val Glu Ser Lys Asp Asn 260 265 270

Gly Lys Lys Thr Glu Val Lys Ile Gly Ala Lys Thr Ser Val Ile Lys 275 280 285

Glu Lys Asp Gly Lys Leu Val Thr Gly Lys Gly Lys Asp Glu Asn Gly 290 295 300

Ser Ser Thr Asp Glu Gly Glu Gly Leu Val Thr Ala Lys Glu Val Ile 305 310 315 320

-54CZ 304379 B6

Asp Ala Val Asn Lys Ala Gly Trp Arg Met Lys Thr Thr Thr Ala Asn 325 330 335

Gly Gin Thr Gly Gin Ala Asp Lys Phe Glu Thr Val Thr Ser Gly Thr 340 345 350

Lys Val Thr Phe Ala Ser Gly Asn Gly Thr Thr Ala Thr Val Ser Lys 355 360 365

Asp Asp Gin Gly Asn Ile Thr Val Lys Tyr Asp Val Asn Val Gly Asp 370 375 380

Ala Leu Asn Val Asn Gin Leu Gin Asn Ser Gly Trp Asn Leu Asp Ser 385 390 395 400

Lys Ala Val Ala Gly Ser Ser Gly Lys Val Ile Ser Gly Asn Val Ser 405 410 415

Pro Ser Lys Gly Lys Met Asp Glu Thr Val Asn Ile Asn Ala Gly Asn 420 425 430

Asn Ile Glu Ile Thr Arg Asn Gly Lys Asn Ile Asp Ile Ala Thr Ser 435 440 445

Met Thr Pro Gin Phe Ser Ser Val Ser Leu Gly Ala Gly Ala Asp Ala 450 455 460

Pro Thr Leu Ser Val Asp Asp Glu Gly Ala Leu Asn Val Gly Ser Lys 465 470 475 480

Asp Ala Asn Lys Pro Val Arg Ile Thr Asn Val Ala Pro Gly Val Lys 485 490 495

Glu Gly Asp Val Thr Asn Val Ala Gin Leu Lys Gly Val Ala Gin Asn 500 505 510

Leu Asn Asn Arg Ile Asp Asn Val Asp Gly Asn Ala Arg Ala Gly Ile 515 520 525

Ala Gin Ala Ile Ala Thr Ala Gly Leu Ala Gin Ala Tyr Leu Pro Gly 530 535 540

Lys Ser Met Met Ala Ile Gly Gly Gly Thr Tyr Arg Gly Glu Ala Gly 545 550 555 560

-55CZ 304379 B6

Tyr Ala Ile Gly Tyr Ser Ser Ile Ser Asp Thr Gly Asn Trp Val Ile 565 570 575

Lys Gly Thr Ala Ser Gly Asn Ser Arg Gly His Phe Gly Ala Ser Ala 580 585 590

Ser Val

Gly Tyr Gin Trp 595 <210> 8 <211> 598 <212> PRT <213 > Neisseria meningitidis <400> 8

Met Asn Lys Ile Ser Arg Ile Ile Trp Asn Ser Ala Len Asn Ala Trp 15 10 15

Val Val Val Ser Glu Leu Thr Arg Asn His Thr Lys Arg Ala Ser Ala 20 25 30

Thr Val Ala Thr Ala Val Leu Ala Thr Leu Leu Phe Ala Thr Val Gin 35 40 45

Ala Asn Ala Thr Asp Asp Asp Asp Leu Tyr Leu Glu Pro Val Gin Arg 50 55 60

Thr Ala Val Val Leu Ser Phe Arg Ser Asp Lys Glu Gly Thr Gly Glu 65 70 75 80

Lys Glu Gly Thr Glu Asp Ser Asn Trp Ala Val Tyr Phe Asp Glu Lys 85 90 95

Arg Val Leu Lys Ala Gly Ala Ile Thr Leu Lys Ala Gly Asp Asn Leu 100 105 110

Lys Ile Lys Gin Asn Thr Asn Glu Asn Thr Asn .Glu Asn Thr Asn Asp 115 120 125

-56CZ 304379 B6

Ser Ser Phe Thr Tyr Ser Leu Lys Lys Asp Leu Thr Asp Leu Thr Ser 130 135 140

Val Glu Thr Glu Lys Leu Ser Phe Gly Ala Asn Gly Asn Lys Val Asn 145 150 155 160

Ile Thr Ser Asp Thr Lys Gly Leu Asn Phe Ala Lys Glu Thr Ala Gly 165 170 175

Thr Asn Gly Asp Pro Thr Val His Leu Asn Gly Ile Gly Ser Thr Leu 180 185 190

Thr Asp Thr Leu Leu Asn Thr Gly Ala Thr Thr Asn Val Thr Asn Asp 195 200 205

Asn Val Thr Asp Asp Glu Lys Lys Arg Ala Ala Ser Val Lys Asp Val 210 215 220

Leu Asn Ala Gly Trp Asn Ile Lys Gly Val Lys Pro Gly Thr Thr Ala 225 230 235 240

Ser Asp Asn Val Asp Phe Val Arg Thr Tyr Asp Thr Val Glu Phe Leu 245 250 255

Ser Ala Asp Thr Lys Thr Thr Thr Val Asn Val Glu Ser Lys Asp Asn 260 265 270

Gly Lys Arg Thr Glu Val Lys Ile Gly Ala Lys Thr Ser Val Ile Lys 275 280 285

Glu Lys Asp Gly Lys Leu Val Thr Gly Lys Gly Lys Gly Glu Asn Gly 290 295 300

Ser Ser Thr Asp Glu Gly Glu Gly Leu Val Thr Ala Lys Glu Val Ile 305 310 315 320

Asp Ala Val Asn Lys Ala Gly Trp Arg Met Lys Thr Thr Thr Ala Asn 325 330 335

Gly Gin Thr Gly Gin Ala Asp Lys Phe Glu Thr Val Thr Ser Gly Thr 340 345 350

Lys Val Thr Phe Ala Ser Gly Asn Gly Thr Thr Ala Thr Val Ser Lys 355 360 365

-57CZ 304379 B6

Asp Asp Gin Gly Asn Ile Thr Val Lys Tyr Asp Val Asn Val Gly Asp 370 375 380

Ala Leu Asn Val Asn Gin Leu Gin Asn Ser Gly Trp Asn Leu Asp Ser 385 390 395 400

Lys Ala Val Ala Gly Ser Ser Gly Lys Val Ile Ser Gly Asn Val Ser 405 410 415

Pro Ser Lys Gly Lys Met Asp Glu Thr Val Asn Ile Asn Ala Gly Asn 420 425 430

Asn Ile Glu Ile Thr Arg Asn Gly Lys Asn Ile Asp Ile Ala Thr Ser 435 440 445

Met Thr Pro Gin Phe Ser Ser Val Ser Leu Gly Ala Gly Ala Asp Ala 450 455 460

Pro Thr Leu Ser Val Asp Asp Glu Gly Ala Leu Asn Val Gly Ser Lys 465 470 475 480

Asp Ala Asn Lys Pro Val Arg Ile Thr Asn Val Ala Pro Gly Val Lys 485 490 495

Glu Gly Asp Val Thr Asn Val Ala Gin Leu Lys Gly Val Ala Gin Asn 500 505 510

Leu Asn Asn Arg Ile Asp Asn Val Asp Gly Asn Ala Arg Ala Gly Ile 515 520 525

Ala Gin Ala Ile Ala Thr Ala Gly Leu Ala Gin Ala Tyr Leu Pro Gly 530 535 540

Lys Ser Met Met Ala Ile Gly Gly Gly Thr Tyr Arg Gly Glu Ala Gly 545 550 555 560

Tyr Ala Ile Gly Tyr Ser Ser Ile Ser Asp Thr Gly Asn Trp Val Ile 565 570 575

Lys Gly Thr Ala Ser Gly Asn Ser Arg Gly His Phe Gly Thr Ser Ala 580 585 590

-58CZ 304379 B6

Ser Val Gly Tyr Gin Trp 595 <210> 9 <211> 594 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 9

Met Asn Lys Ile Tyr Arg Ile Ile Trp Asn Ser Ala Leu Asn Ala Trp 15 10 15

Val Val Val Ser Glu Leu Thr Arg Asn His Thr Lys Arg Ala Ser Ala 20 25 30

Thr Val Ala Thr Ala Val Leu Ala Thr Leu Leu Phe Ala Thr Val Gin 35 40 45

Ala Asn Ala Thr Asp Asp Asp Asp Leu Tyr Leu Glu Pro Val Gin Arg 50 55 60

Thr Ala Val Val Leu Ser Phe Arg Ser Asp Lys Glu Gly Thr Gly Glu 65 70 75 80

Lys Glu Gly Thr Glu Asp Ser Asn Trp Ala Val Tyr Phe Asp Glu Lys 85 90 95

Arg Val Leu Lys Ala Gly Ala Ile Thr Leu Lys Ala Gly Asp Asn Leu 100 105 110

Lys Ile Lys Gin Asn Thr Asn Glu Asn Thr Asn Asp Ser Ser Phe Thr 115 120 125

Tyr Ser Leu Lys Lys Asp Leu Thr Asp Leu Thr Ser Val Glu Thr Glu 130 135 140

Lys Leu Ser Phe Gly Ala Asn Gly Asn Lys Val Asn Ile Thr Ser Asp 145 150 155 160

Thr Lys Gly Leu Asn Phe Ala Lys Glu Thr Ala Gly Thr Asn Gly Asp 165 170 175

-59CZ 304379 B6

Pro Thr Val His Leu. Asn Gly Ile 180

Gly Ser Thr Leu Thr Asp Thr Leu 185 190

Leu Asn Thr Gly Ala Thr Thr Asn 195 200

Val Thr Asn Asp Asn Val Thr Asp 205

Asp Glu Lys Lys Arg Ala Ala Ser 210 215

Val Lys Asp Val Leu Asn Ala Gly 220

Trp Asn Ile Lys Gly Val Lys Pro 225 230

Gly Thr Thr Ala Ser Asp Asn Val 235 240

Asp Phe Val Arg Thr Tyr Asp Thr 245

Val Glu Phe Leu Ser Ala Asp Thr 250 255

Lys Thr Thr Thr Val Asn Val Glu 260

Ser Lys Asp Asn Gly Lys Lys Thr 265 270

Glu Val Lys Ile Gly Ala Lys Thr 275 280

Ser Val Ile Lys Glu Lys Asp Gly 285

Lys Leu Val Thr Gly Lys Gly Lys 290 295

Asp Glu Asn Gly Ser Ser Thr Asp 300

Glu Gly Glu Gly Leu Val Thr Ala 305 310

Lys Glu Val Ile Asp Ala Val Asn 315 320

Lys Ala Gly Trp Arg Met Lys Thr 325

Thr Thr Ala Asn Gly Gin Thr Gly 330 335

Gin Ala Asp Lys Phe Glu Thr Val 340

Thr Ser Gly Thr Asn Val Thr Phe 345 350

Ala Ser Gly Lys Gly Thr Thr Ala 355 360

Thr Val Ser Lys Asp Asp Gin Gly 365

Asn Ile Thr Val Lys Tyr Asp Val 370 375

Asn Val Gly Asp Ala Leu Asn Val 380

Asn Gin Leu Gin Asn Ser Gly Trp 385 390

Asn Leu Asp Ser Lys Ala Val Ala 395 400

-60CZ 304379 B6

Gly Ser Ser Gly Lys Val Ile Ser Gly Asn Val Ser Pro Ser Lys Gly 405 410 415

Lys Met Asp Glu Thr Val Asn Ile Asn Ala Gly Asn Asn Ile Glu Ile 420 425 430

Thr Arg Asn Gly Lys Asn Ile Asp Ile Ala Thr Ser Met Ala Pro Gin 435 440 445

Phe Ser Ser Val Ser Leu Gly Ala Gly Ala Asp Ala Pro Thr Leu Ser 450 455 460

Val Asp Asp Glu Gly Ala Leu Asn Val Gly Ser Lys Asp Thr Asn Lys 465 470 475 480

Pro Val Arg Ile Thr Asn Val Ala Pro Gly Val Lys Glu Gly Asp Val 485 490 495

Thr Asn Val Ala Gin Leu Lys Gly Val Ala Gin Asn Leu Asn Asn Arg 500 505 510

Ile Asp Asn Val Asp Gly Asn Ala Arg Ala Gly Ile Ala Gin Ala Ile 515 520 525

Ala Thr Ala Gly Leu Val Gin Ala Tyr Leu Pro Gly Lys Ser Met Met 530 535 540

Ala Ile Gly Gly Asp Thr Tyr Arg Gly Glu Ala Gly Tyr Ala Ile Gly 545 550 555 560

Tyr Ser Ser Ile Ser Asp Gly Gly Asn Trp Ile Ile Lys Gly Thr Ala 565 570 575

Ser Gly Asn Ser Arg Gly His Phe Gly Ala Ser Ala Ser Val Gly Tyr 580 585 590

Gin Trp

<210>	10
<211>	592
<212 >	PRT

<213> Neisseria meningitidis <400> 10

Met Asn Lys Ile Tyr Arg Ile Ile 1 5

Trp Asn Ser Ala Leu Asn Ala Trp 10 15

Val Ala Val Ser Glu Leu Thr Arg 20

Asn His Thr Lys Arg Ala Ser Ala 25 30

Thr Val Lys Thr Ala Val Leu Ala 35 40

Thr Leu Leu Phe Ala Thr Val Gin 45

Ala Asn Ala Thr Asp Glu Asp Glu 50 55

Glu Glu Glu Leu Glu Ser Val Gin 60

Arg Ser Val Val Gly Ser Ile Gin 65 70

Ala Ser Met Glu Gly Ser Gly Glu 75 80

Leu Glu Thr Ile Ser Leu Ser Met 85

Thr Asn Asp Ser Lys Glu Phe Val 90 95

Asp Pro Tyr Ile Val Val Thr Leu 100

Lys Ala Gly Asp Asn Leu Lys Ile 105 110

Lys Gin Asn Thr Asn Glu Asn Thr 115 120

Asn Ala Ser Ser Phe Thr Tyr Ser 125

Leu Lys Lys Asp Leu Thr Gly Leu 130 135

Ile Asn Val Glu Thr Glu Lys Leu 140

Ser Phe Gly Ala Asn Gly Lys Lys 145 150

Val Asn Ile Ile Ser Asp Thr Lys 155 160

Gly Leu Asn Phe Ala Lys Glu Thr 165

Ala Gly Thr Asn Gly Asp Thr Thr 170 175

Val His Leu Asn Gly Ile Gly Ser 180

Thr Leu Thr Asp Thr Leu Ala Gly 185 190

Ser Ser Ala Ser His Val Asp Ala 195 200

Gly Asn Gin,Ser Thr His Tyr Thr 205

-62CZ 304379 B6

Arg Ala Ala Ser Ile Lys Asp Val Leu Asn Ala Gly Trp Asn Ile Lys 210 215 220

Gly Val Lys Thr Gly Ser Thr Thr Gly Gin Ser Glu Asn Val Asp Phe 225 230 235 240

Val Arg Thr Tyr Asp Thr Val Glu Phe Leu Ser Ala Asp Thr Lys Thr 245 250 255

Thr Thr Val Asn Val Glu Ser Lys Asp Asn Gly Lys Arg Thr Glu Val 260 265 270

Lys Ile Gly Ala Lys Thr Ser Val Ile Lys Glu Lys Asp Gly Lys Leu 275 280 285

Val Thr Gly Lys Gly Lys Gly Glu Asn Gly Ser Ser Thr Asp Glu Gly 290 295 300

Glu Gly Leu Val Thr Ala Lys Glu Val Ile Asp Ala Val Asn Lys Ala 305 310 315 320

Gly Trp Arg Met Lys Thr Thr Thr Ala Asn Gly Gin Thr Gly Gin Ala 325 330 335

Asp Lys Phe Glu Thr Val Thr Ser Gly Thr Asn Val Thr Phe Ala Ser 340 345 350

Gly Lys Gly Thr Thr Ala Thr Val Ser Lys Asp Asp Gin Gly Asn Ile 355 360 365

Thr Val Met Tyr Asp Val Asn Val Gly Asp Ala Leu Asn Val Asn Gin 370 375 380

Leu Gin Asn Ser Gly Trp Asn Leu Asp Ser Lys Ala Val Ala Gly Ser 385 390 395 400

Ser Gly Lys Val Ile Ser Gly Asn Val Ser Pro Ser Lys Gly Lys Met 405 410 415

Asp Glu Thr Val Asn Ile Asn Ala Gly Asn Asn Ile Glu Ile Ser Arg 420 425 430

Asn Gly Lys Asn Ile Asp Ile Ala Thr Ser Met Ala Pro Gin Phe Ser 435 440 445

-63 CZ 304379 B6

Ser Val Ser Leu Gly Ala Gly Ala Asp Ala Pro Thr Leu Ser Val Asp 450 455 460

Asp Glu Gly Ala Leu Asn Val Gly Ser Lys Asp Ala Asn Lys Pro Val 465 470 475 480

Arg Ile Thr Asn Val Ala Pro Gly Val Lys Glu Gly Asp Val Thr Asn 485 490 495

Val Ala Gin Leu Lys Gly Val Ala Gin Asn Leu Asn Asn Arg Ile Asp 500 505 510

Asn Val Asp Gly Asn Ala Arg Ala Gly Ile Ala Gin Ala Ile Ala Thr 515 520 525

Ala Gly Leu Val Gin Ala Tyr Leu Pro Gly Lys Ser Met Met Ala Ile 530 535 540

Gly Gly Gly Thr Tyr Arg Gly Glu Ala Gly Tyr Ala Ile Gly Tyr Ser 545 550 555 560

Ser Ile Ser Asp Gly Gly Asn Trp Ile Ile Lys Gly Thr Ala Ser Gly 565 570 575

Asn Ser Arg Gly His Phe Gly Ala Ser Ala Ser Val Gly Tyr Gin Trp 580 585 590 <210> 11 <211> 604 <212 > PRT <213> Neisseria meningitidis <220>

<221> misc_feature <222> (1)..(596) <223> X is any or absent amino acid at a corresponding position in an y one of SEQ ID NOS 1-10 or a conservative substitution thereof

-64CZ 304379 B6 <400> 11

Met Asn Xaa Ile Xaa Arg Ile Ile Trp Asn Ser Ala Leu Asn Ala Trp 15 10 15

Val Xaa Val Ser Glu Leu Thr Arg Asn His Thr Lys Arg Ala Ser Ala 20 25 30

Thr Val Xaa Thr Ala Val Leu Ala Thr Leu Leu Xaa Ala Thr Val Gin 35 40 45

Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Xaa 50 55 60

Val Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Gly 65 70 75 80

Xaa Xaa Glu Xaa Glu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 85 90 95

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Leu Lys Ala 100 105 110

Gly Asp Asn Leu Lys Ile Lys Gin Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 115 120 125

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Thr Tyr Ser Leu Lys Lys Xaa Leu Xaa 130 135 140

Xaa Leu Xaa Xaa Val Xaa Thr Glu Lys Leu Ser Phe Xaa Ala Asn Xaa 145 150 155 160

Xaa Lys Val Asn Ile Xaa Ser Asp Thr Lys Gly Leu Asn Phe Ala Lys 165 170 175

Xaa Thr Ala Xaa Thr Asn Gly Asp Xaa Thr Val His Leu Asn Gly Ile 180 185 190

Gly Ser Thr Leu Thr Asp Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Xaa Xaa Xaa 195 200 205

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Ala Ala Ser 210 215 220

Xaa Lys Asp Val Leu Asn Ala Gly 225 230

Trp Asn Ile Lys Gly Val Lys Xaa 235 240

Gly Xaa Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 245

Asn Val Asp Phe Val Xaa Thr Tyr 250 255

Asp Thr Val Glu Phe Leu Ser Ala 260

Asp Thr Lys Thr Thr Thr Val Asn 265 270

Val Glu Ser Lys Asp Asn Gly Lys 275 280

Xaa Thr Glu Val Lys Ile Gly Ala 285

Lys Thr Ser Val Ile Lys Glu Lys 290 295

Asp Gly Lys Leu Val Thr Gly Lys 300

Xaa Lys Xaa Glu Asn Xaa Ser Ser 305 310

Thr Asp Xaa Gly Glu Gly Leu Val 315 320

Thr Ala Lys Glu Val Ile Asp Ala 325

Val Asn Lys Ala Gly Trp Arg Met 330 335

Lys Thr Thr Thr Ala Asn Gly Gin 340

Thr Gly Gin Ala Asp Lys Phe Glu 345 350

Thr Val Thr Ser Gly Thr Xaa Val 355 360

Thr Phe Ala Ser Gly Xaa Gly Thr 365

Thr Ala Thr Val Ser Lys Asp Asp 370 375

Gin Gly Asn Ile Thr Val Xaa Tyr 380

Asp Val Asn Val Gly Asp Ala Leu 385 390

Asn Val Asn Gin Leu Gin Asn Ser 395 400

Gly Trp Asn Leu Asp Ser Lys Ala 405

Val Ala Gly Ser Ser Gly Lys Val 410 415

Ile Ser Gly Asn Val Ser Pro Ser 420

Lys Gly Lys Met Asp Glu Thr val 425 430

Asn Ile Asn Ala Gly Asn Asn Ile 435 440

Glu Ile Xaa.Arg Asn Gly Lys Asn 445

-66CZ 304379 B6

Ile Asp

Ile Ala

Thr

Ser

Met 455

Xaa

Pro

Gin

Phe

Ser 460

Ser

Val

Ser

Leu

450

Gly

Ala

Gly

Ala

Asp

Ala

Pro

Thr

Leu

Ser

Val

Asp

Xaa

Ala

465

470

475

480

Leu

Asn

Val

Gly

Ser

Lys

Xaa

Asn

Lys

Pro

Val

Arg

Ile

Thr

Asn

485

490

495

Val

Ala

Pro

Gly

val

Lys

Glu

Gly

Asp

Val

Thr

Asn

Val

Ala

Gin

Leu

500

505

510

Lys

Gly

Val

Ala

Gin

Asn

Leu

Asn

Xaa

Ile

Asp

Asn

Val

Xaa

Gly

515

520

525

Asn

Ala

Arg

Ala

Gly

Ile

Ala

Gin

Ala

Ile

Ala

Thr

Ala

Gly

Leu

Xaa

530

535

540

Gin

Ala

Tyr

Leu

Pro

Gly

Lys

Ser

Met

Ala

Ile

Gly

Xaa

Thr

545

550

555

560

Tyr

Xaa

Gly

Glu

Ala

Gly

Tyr

Ala

Ile

Gly

Tyr

Ser

Ile

Ser

Xaa

565

570

575

Xaa

Gly

Asn

Trp

Xaa

Ile

Lys

Gly

Thr

Ala

Ser

Gly

Asn

Ser

Arg

Gly

580

585

590

His

Phe

Gly

Xaa

Ser

Ala

Ser

Val

Gly

Tyr

Gin

Trp

595 600 <210> 12 <211> 1776 <212> DNA <213> Neisseria meningitidis <400? 12 atgaacaaaa tataccgcat catttggaat agtgecctca atgcatgggt cgtcgtatcc gagctcacac gcaaccacac caaacgcgcc tccgcaaccg tgaagaccgc cgtattggcg actetgttgt ttgcaacggt tcaggcaagt gctaacaatg aagagcaaga agaagattta tatttagacc ccgtacaacg cactgttgcc gtgttgatag tcaattccga taaagaaggc

120

180

240

-67CZ 304379 B6

acgggagaaa	aagaaaaagt	agaagaaaat	tcagattggg	cagtatattt	caacgagaaa	300
ggagtactaa	cagccagaga	aatcaccctc	aaagccggcg	acaacctgaa	aatcaaacaa	360
aacggcacaa	acttcaccta	ctcgctgaaa	aaagacctca	cagatctgac	cagtgttgga	420
actgaaaaat	tatcgtttag	cgcaaacggc	aataaagtca	acatcacaag	cgacaccaaa	480
ggcttgaatt	ttgcgaaaga	aacggctggg	acgaacggcg	acaccacggt	tcatctgaac	540
ggtattggtt	cgactttgac	cgatacgctg	ctgaataccg	gagcgaccac	aaacgtaacc	600
aacgacaacg	ttaccgatga	cgagaaaaaa	cgtgcggcaa	gcgttaaaga	cgtattaaac	660
gctggctgga	acattaaagg	cgttaaaccc	ggtacaacag	cttccgataa	cgttgatttc	720
gtccgcactt	acgacacagt	cgagttcttg	agcgcagata	cgaaaacaac	gactgttaat	780
gtggaaagca	aagacaacgg	caagaaaacc	gaagttaaaa	tcggtgcgaa	gacttctgtt	840
attaaagaaa	aagacggtaa	gttggttact	ggtaaagaca	aaggcgagaa	tggttcttct	900
acagacgaag	gcgaaggctt	agtgactgca	aaagaagtga	ttgatgcagt	aaacaaggct	960
ggttggagaa	tgaaaacaac	aaccgctaat	ggtcaaacag	gtcaagctga	caagtttgaa	1020
accgttacat	caggcacaaa	tgtaaccttt	gctagtggta	aaggtacaac	tgcgactgta	1080
agtaaagatg	atcaaggcaa	catcactgtt	atgtatgatg	taaatgtcgg	cgatgcccta	1140
aacgtcaatc	agctgcaaaa	cagcggttgg	aatttggatt	ccaaagcggt	tgcaggttct	1200
tcgggcaaag	tcatcagcgg	caatgtttcg	ccgagcaagg	gaaagatgga	tgaaaccgtc	1260
aacattaatg	ccggcaacaa	catcgagatt	acccgcaacg	gtaaaaatat	cgacatcgcc	1320
acttcgatga	ccccgcagtt	ttccagcgtt	tcgctcggcg	cgggggcgga	tgcgcccact	1380
ttgagcgtgg	atggggacgc	attgaatgtc	ggcagcaaga	aggacaacaa	acccgtccgc	1440
attaccaatg	tcgccccggg	cgttaaagag	ggggatgtta	caaacgtcgc	acaacttaaa	1500
ggcgtggcgc	aaaacttgaa	caaccgcatc	gacaatgtgg	acggcaacgc	gcgtgcgggc	1560
atcgcccaag	cgattgcaac	cgcaggtctg	gttcaggcgt	atttgcccgg	caagagtatg	1620
atggcgatcg	gcggcggcac	ttatcgcggc	gaagccggtt	acgccatcgg	ctactccagt	1680
atttccgacg	gcggaaattg	gattatcaaa	ggcacggctt	ccggcaattc	gcgcggccat	1740
ttcggtgctt	ccgcatctgt	cggttatcag	tggtaa			1776

<210> 13 <211> 1779

-68CZ 304379 B6 <212> DNA <213> Neisseria meningitidis

<400> 13 atgaacaaaa	tataccgcat	catttggaat	agtgccctca	atgcctgggt	cgccgtatcc	60
gagctcacac	gcaaccacac	caaacgcgcc	tccgcaaccg	tgaagaccgc	cgtattggcg	12 0
acactgttgt	ttgcaacggt	tcaggcgaat	gctaccgatg	aagatgaaga	agaagagtta	180
gaatccgtac	aacgctctgt	cgtagggagc	attcaagcca	gtatggaagg	cagcgtcgaa	240
ttggaaacga	tatcattatc	aatgactaac	gacagcaagg	aatttgtaga	cccatacata	300
gtagttaccc	tcaaagccgg	cgacaacctg	aaaatcaaac	aaaacaccaa	tgaaaacacc	360
aatgccagta	gcttcaccta	ctcgctgaaa	aaagacctca	caggcctgat	caatgttgaa	420
actgaaaaat	tatcgtttgg	cgcaaacggc	aagaaagtca	acatcataag	cgacaccaaa	480
ggcttgaatt	tcgcgaaaga	aacggctggg	acgaacggcg	acaccacggt	tcatctgaac	540
ggtatcggtt	cgactttgac	cgatatgctg	ctgaataccg	gagcgaccac	aaacgtaacc	600
aacgacaacg	ttaccgatga	cgagaaaaaa	cgtgcggcaa	gcgttaaaga	cgtattaaac	660
gcaggctgga	acattaaagg	cgttaaaccc	ggtacaacag	cttccgataa	cgttgatttc	720
gtccgcactt	acgacacagt	cgagttcttg	agcgcagata	cgaaaacaac	gactgttaat	780
gtggaaagca	aagacaacgg	caagaaaacc	gaagttaaaa	tcggtgcgaa	gacttetgtt	840
attaaagaaa	aagacggtaa	gttggttact	ggtaaaggca	aaggcgagaa	tggttcttct	900
acagacgaag	gcgaaggctt	agtgactgca	aaagaagtga	ttgatgcagt	aaacaaggct	960
ggttggagaa	tgaaaacaac	aaccgctaat	ggtcaaacag	gtcaagctga	caagtttgaa	1020
accgttacat	caggcacaaa	agtaaccttt	gctagtggta	atggtacaac	tgcgactgta	1080
agtaaagatg	atcaaggcaa	catcactgtt	aagtatgatg	taaatgtcgg	cgatgcccta	1140
aacgtcaatc	agctgcaaaa	cagcggttgg	aatttggatt	ccaaagcggt	tgcaggttct	1200
tcgggcaaag	tcatcagcgg	caatgtttcg	ccgagcaagg	gaaagatgga	tgaaaccgtc	1260
aacattaatg	ccggcaacaa	catcgagatt	acccgcaacg	gcaaaaatat	cgacatcgcc	1320
acttcgatga	ccccgcaatt	ttccagcgtt	tcgctcggcg	cgggggcgga	tgcgcccact	1380
ttaagcgtgg	atgacgaggg	cgcgttgaat	gtcggcagca	aggatgccaa	caaacccgtc	1440
cgcattacca	atgtcgcccc	gggcgttaaa	gagggggatg	ttacaaacgt	cgcgcaactt	1500
aaaggtgtgg	cgcaaaactt	gaacaaccgc	atcgacaatg	tgaacggcaa	cgcgcgtgcg	1560

-69CZ 304379 B6

ggcatcgccc	aagcgattgc aaccgcaggt ctggttcagg cgtatctgcc cggcaagagt	1620
atgatggcga	tcggcggcgg cacttatctc ggcgaagccg gttatgccat cggctactca	1680
agcatttccg	ccggcggaaa ttggattatc aaaggcacgg cttccggcaa ttcgcgcggc	1740
catttcggtg	cttccgcatc tgtcggttat cagtggtaa	1779

<210>	14
<211>	1770
<212>	DNA
<213>	Neisseria meningitidis
<400>	14

atgaacaaaa	tataccgcat	catttggaat	agtgccctca	atgcctgggt	agtcgtatcc	60
gagctcacac	gcaaccacac	caaacgcgcc	tccgcaaccg	tggcgaccgc	cgtattggcg	120
acactgctgt	ccgcaacggt	tcaggcgaat	gctaccgata	ccgatgaaga	tgaagagtta	180
gaatccgtag	cacgctctgc	tctggtgttg	caattcatga	tcgataaaga	aggcaatgga	240
gaaatcgaat	ctacaggaga	tataggttgg	agtatatatt	acgacgatca	caacactcta	300
cacggcgcaa	ccgttaccct	caaagccggc	gacaacctga	aaatcaaaca	aagcggcaaa	360
gacttcacct	actcgctgaa	aaaagagctg	aaagacctga	ccagtgttga	aactgaaaaa	420
ttatcgtttg	gcgcaaacgg	taataaagtc	aacatcacaa	gcgacaccaa	aggcttgaat	480
tttgcgaaag	aaacggctgg	gacgaacggc	gaccccacgg	ttcatctgaa	cggtatcggt	54 0
tcgactttga	ccgatacgct	tgcgggttct	tctgcttctc	acgttgatgc	gggtaaccaa	600
agtacacatt	acactcgtgc	agcaagtatt	aaggatgtgt	tgaatgcggg	ttggaatatt	660
aagggtgtta	aaactggctc	aacaactggt	caatcagaaa	atgtcgattt	cgtccgcact	720
tacgacacag	tcgagttctt	gagcgcagat	acgaaaacaa	cgactgttaa	tgtggaaagc	780
aaagacaacg	gcaagagaac	cgaagttaaa	atcggtgcga	agacttctgt	tattaaagaa	840
aaagacggta	agttggttac	tggtaaaggc	aaaggcgaga	atggttcttc	tacagacgaa	900
ggcgaaggct	tagtgactgc	aaaagaagtg	attgatgcag	taaacaaggc	tggttggaga	960
atgaaaacaa	caaccgctaa	tggtcaaaca	ggtcaagctg	acaagtttga	aaccgttaca	1020
tcaggcacaa	aagtaacctt	tgctagtggt	aatggtacaa	ctgcgactgt	aagtaaagat	1080
gatcaaggca	acatcactgt	taagtatgat	gtaaatgtcg	gcgatgccct	aaacgtcaat	1140

-70CZ 304379 B6 cagctgcaaa acagcggttg gaatttggat tccaaagcgg ttgcaggttc ttcgggcaaa 1200 gtcatcagcg gcaatgtttc gecgagcaag ggaaagatgg atgaaaccgt caacattaat 1260 gccggcaaca acatcgagat tacccgcaac ggcaaaaata tcgacatcgc cacttcgatg 1320 accccgcaat tttccagcgt ttcgctcggc gcgggggcgg atgcgcccac tttaagcgtg 1380 gatgacgagg gcgcgttgaa tgtcggcagc aaggatgcca acaaacccgt ccgcattacc 1440 aatgtcgccc cgggcgttaa agagggggat gttacaaacg tcgcacaact taaaggtgtg 1500 gcgcaaaact tgaacaaccg catcgacaat gtgaacggca acgcgcgcgc gggtatcgcc 1560 caagcgattg caaccgcagg tttggctcag gcctatttgc ccggcaagag tatgatggcg 1620 atcggcggcg gtacttatct cggcgaagcc ggttacgcca tcggctactc gagcatttct 1680 gacactggga attgggttat caagggcacg gcttccggca attcgcgcgg teatttcggt 1740 acttccgcat ctgtcggtta tcagtggtaa 1770 <210> 15 <211> 1785 <212> DNA <213> Neisseria meningitidis <400> 15 atgaacaaaa tataccgcat catttggaat agtgccctca átgcctgggt cgccgtatcc 60 gagctcacac gcaaccacac caaacgcgcc tccgcaaccg tggcgaccgc cgtattggcg 120 acactgttgt ttgcaacggt tcaggcgagt actaccgatg acgacgattt atatttagaa 180 cccgtacaac gcactgctgt cgtgttgagc ttccgttccg ataaagaagg cacgggagaa 240 aaagaagtta cagaagattc aaattgggga gtatatttcg acaagaaagg agtactaaca 300 gccggaacaa tcaccctcaa agccggcgac aacctgaaaa tcaaacaaaa caccaatgaa 360 aacaccaatg ccagtagctt cacctactcg ctgaaaaaag acctcacaga tctgaccagt 420 gttggaactg aaaaattatc gtttagcgca aacagcaata aagtcaacat cacaagcgac 480 accaaaggct tgaatttcgc gaaaaaaacg gctgagacca acggcgacac cacggttcat 540 ctgaacggta tcggttcgac tttgaccgat acgctgctga ataccggagc gaccacaaac 600 gtaaccaacg acaacgttac cgatgacgag aaaaaacgtg cggcaagcgt taaagacgta 660 ttaaacgcag gctggaacat taaaggcgtt aaacccggta caacagcttc cgataacgtt 720

-71 CZ 304379 B6

gatttcgtcc	gcacttacga	cacagtcgag	ttcttgagcg	cagatacgaa	aacaacgact	780
gttaatgtgg	aaagcaaaga	caacggcaag	agaaccgaag	ttaaaatcgg	tgcgaagact	840
tctgttatca	aagaaaaaga	cggtaagttg	gttactggta	aagacaaagg	cgagaatgat	900
tcttctacag	acaaaggcga	aggcttagtg	actgcaaaag	aagtgattga	tgcagtaaac	960
aaggctggtt	ggagaatgaa	aacaacaacc	gctaatggtc	aaacaggtca	agctgacaag	1020
tttgaaaccg	ttacatcagg	cacaaatgta	acctttgcta	gtggtaaagg	tacaactgcg	1080
actgtaagta	aagatgatca	aggcaacatc	actgttatgt	atgatgtaaa	tgtcggcgat	1140
gccctaaacg	tcaatcagct	gcaaaacagc	ggttggaatt	tggattccaa	agcggttgca	1200
ggttcttcgg	gcaaagtcat	cagcggcaat	gtttcgccga	gcaagggaaa	gatggatgaa	1260
accgtcaaca	ttaatgccgg	caacaacatc	gagattaccc	gcaacggcaa	aaatatcgac	1320
atcgccactt	cgatgacccc	gcaattttcc	agcgtttcgc	tcggcgcggg	ggcggatgcg	1380
cccactttaa	gcgtggatga	cgagggcgcg	ttgaatgtcg	gcagcaagga	tgccaacaaa	1440
cccgtccgca	ttaccaatgt	cgccccgggc	gttaaagagg	gggatgttac	aaacgtcgca	1500
caacttaaag	gcgtggcgca	aaacttgaac	aaccacatcg	acaatgtgga	cggcaacgcg	1560
cgtgcgggca	tcgcccaagc	gattgcaacc	gcaggtctgg	ttcaggcgta	tctgcccggc	1620
aagagtatga	tggcgatcgg	cggcggcact	tatcgcggcg	aagccggtta	tgccatcggc	1680
tactcaagca	tttccgacgg	cggaaattgg	attatcaaag	gcacggcttc	cggcaattcg	1740
cgcggccatt	tcggtgcttc	cgcatctgtc	ggttatcagt	ggtaa		1785

<210>	16
<211>	1776
<212>	DNA
<213>	Neisseria meningitidis
<400>	16

atgaacgaaa	tattgcgcat catttggaat agcgccctca atgcctgggt cgttgtatcc	60
gagctcacac	gcaaccacac caaacgcgcc tccgcaaccg tgaagaccgc cgtattggcg	12 0
actctgttgt	ttgcaacggt tcaggcaagt gctaacaatg aagagcaaga agaagattta	18 0
tatttagacc	ccgtgctacg cactgttgcc gtgttgatag tcaattccga taaagaaggc	240
acgggagaaa	aagaaaaagt agaagaaaat tcagattggg cagtatattt caacgagaaa	300

-72CZ 304379 B6

ggagtactaa	cagccagaga	aatcaccctc	aaagccggcg	acaacctgaa	aatcaaacaa	360
aacggcacaa	acttcaccta	ctcgctgaaa	aaagacctca	cagatctgac	cagtgttgga	420
actgaaaaat	tatcgtttag	cgcaaacggc	aataaagtca	acatcacaag	cgacaccaaa	480
ggcttgaatt	ttgcgaaaga	aacggctggg	acgaacggcg	acaccacggt	tcatctgaac	54 0
ggtattggtt	cgactttgac	cgatacgctg	ctgaataccg	gagcgaccac	aaacgtaacc	600
aacgacaacg	ttaccgatga	cgagaaaaaa	cgtgcggcaa	gcgttaaaga	cgtattaaac	660
gctggctgga	acattaaagg	cgttaaaccc	ggtacaacag	cttccgataa	cgttgatttc	720
gtccgcactt	acgacacagt	cgagttcttg	agcgcagata	cgaaaacaac	gactgttaat	780
gtggaaagca	aagacaacgg	caagaaaacc	gaagttaaaa	tcggtgcgaa	gacttctgtt	840
attaaagaaa	aagacggtaa	gttggttact	ggtaaagaca	aaggcgagaa	tggttcttct	900
acagacgaag	gcgaaggctt	agtgactgca	aaagaagtga	ttgatgcagt	aaacaaggct	960
ggttggagaa	tgaaaacaac	aaccgctaat	ggtcaaacag	gtcaagctga	caagtttgaa	1020
accgttacat	caggcacaaa	tgtaaccttt	gctagtggta	aaggtacaac	tgcgactgta	1080
agtaaagatg	atcaaggcaa	catcactgtt	atgtatgatg	taaatgtcgg	cgatgcccta	1140
aacgtcaatc	agctgcaaaa	cagcggttgg	aatttggatt	ccaaagcggt	tgcaggttct	1200
tcgggcaaag	tcatcagcgg	caatgtttcg	ccgagcaagg	gaaagatgga	tgaaaccgtc	1260
aacattaatg	ccggcaacaa	catcgagatt	acccgcaacg	gtaaaaatat	cgacatcgcc	1320
acttcgatga	ccccgcagtt	ttccagcgtt	tcgctcggcg	čgggggcgga	tgcgcccact	1380
ttgagcgtgg	atggggacgc	attgaatgtc	ggcagcaaga	aggacaacaa	acccgtccgc	1440
attaccaatg	tcgccccggg	cgttaaagag	ggggatgtta	caaacgtcgc	acaacttaaa	1500
ggcgtggcgc	aaaacttgaa	caaccgcatc	gacaatgtgg	acggcaacgc	gcgtgcgggc	1560
atcgcccaag	cgattgcaac	cgcaggtctg	gttcaggcgt	atttgcccgg	caagagtatg	1620
atggcgatcg	gcggcggcac	ttatcgcggc	gaagccggtt	acgccatcgg	ctactccagt	1680
atttccgacg	gcggaaattg	gattatcaaa	ggcacggctt	ccggcaattc	gcgcggccat	1740
ttcggtgctt	ccgcatctgt	cggttatcag	tggtaa			1776

<210> 17 <211> 1800 <212> DNA

-73 CZ 304379 B6 <213> Neisseria meningitidis

<400> 17 atgaacaaaa	tataccgcat	catttggaat	agtgccctca	atgcctgggt	cgccgtatcc	60
gagctcacac	gcaaccacac	caaacgcgcc	tccgcaaccg	tgaagaccgc	cgtattggcg	12 0
acgctgttgt	ttgcaacggt	tcaggcgaat	gctaccgatg	aagatgaaga	agaagagtta	180
gaacccgtag	tacgctctgc	tctggtgttg	caattcatga	tcgataaaga	aggcaatgga	240
gaaaacgaat	ctacaggaaa	tataggttgg	agtatatatt	acgacaatca	caacactcta	300
cacggcgcaa	ccgttaccct	caaagccggc	gacaacctga	aaatcaaaca	aaacaccaat	360
aaaaacacca	atgaaaacac	caatgacagt	agcttcacct	actcgctgaa	aaaagacctc	420
acagatctga	ccagtgttga	aactgaaaaa	ttatcgtttg	gcgcaaacgg	caataaagtc	480
aacatcacaa	gcgacaccaa	aggcttgaat	ttcgcgaaag	aaacggctgg	gacgaacggc	540
gacaccacgg	ttcatctgaa	cggtattggt	tcgactttga	ccgatacgct	gctgaatacc	600
ggagcgacca	caaacgtaac	caacgacaac	gttaccgatg	acaagaaaaa	acgtgcggca	660
agcgttaaag	acgtattaaa	cgcaggctgg	aacattaaag	gcgttaaacc	cggtacaaca	720
gcttccgata	acgttgattt	cgtccacact	tacgacacag	tcgagttctt	gagcgcagat	780
acgaaaacaa	cgactgttaa	tgtggaaagc	aaagacaacg	gcaagagaac	cgaagttaaa	840
atcggtgcga	agacttctgt	tattaaagaa	aaagacggta	agttggttac	tggtaaaggc	900
aaaggcgaga	atggttcttc	tacagacgaa	ggcgaaggct	tagtgactgc	aaaagaagtg	960
attgatgcag	taaacaaggc	tggttggaga	atgaaaacaa	caaccgctaa	tggtcaaaca	1020
ggtcaagctg	acaagtttga	aaccgttaca	tcaggcacaa	atgtaacctt	tgctagtggt	1080
aaaggtacaa	ctgcgactgt	aagtaaagat	gatcaaggca	acatcactgt	taagtatgat	1140
gtaaatgtcg	gcgatgccct	aaacgtcaat	cagctgcaaa	acagcggttg	gaatttggat	1200
tccaaagcgg	ttgcaggttc	ttcgggcaaa	gtcatcagcg	gcaatgtttc	gccgagcaag	1260
ggaaagatgg	atgaaaccgt	caacattaat	gccggcaaca	acatcgagat	tacccgcaac	1320
ggtaaaaata	tcgacatcgc	cacttcgatg	accccgcagt	tttccagcgt	ttcgctcggc	1380
gcgggggcgg	atgcgcccac	tttgagcgtg	gatgacaagg	gcgcgttgaa	tgtcggcagc	1440
aaggatgcca	acaaacccgt	ccgeattacc	aatgtcgccc	cgggcgttaa	agagggggat	1500
gttacaaacg	tcgcacaact	taaaggcgtg	gcgcaaaact	tgaacaaccg	catcgacaat	1560
gtggacggca	acgcgcgtgc	gggcatcgcc	caagcgattg	caaccgcagg	tctggttcag	1620

-74CZ 304379 B6 gcgtatctgc ccggcaagag tatgatggcg atcggcggcg gcacttatcg cggcgaagcc 1680 ggttacgcca tcggctactc cagtatttcc gacggcggaa attggattat caaaggcacg 1740 gcttccggca attcgcgcgg tcatttcggt gcttccgcat ctgtcggtta tcagtggtaa 1800 <210> 18 <211> 1797 <212> DNA <213> Neisseria meningitidis <400> 18 atgaacaaaa tataccgcat catttggaat agtgccctca atgcctgggt cgtcgtatcc 60 gagctcacac gcaaccacac caaacgcgcc tccgcaaccg tggcgaccgc cgtattggcg 120 acactgttgt ttgcaacggt tcaggcgaat gctaccgatg acgacgattt atatttagaa 180 cccgtacaac gcactgctgt cgtgttgagc ttccgt.tccg ataaagaagg cacgggagaa 240 aaagaaggta cagaagattc aaattgggca gtatatttcg acgagaaaag agtactaaaa 300 gccggagcaa tcaccctcaa agccggcgac aacctgaaaa tcaaacaaaa caccaatgaa 360 aacaccaatg aaaacaccaa tgacagtagc ttcacctact ccctgaaaaa agacctcaca 420 gatctgacca gtgttgaaac tgaaaaatta tcgtttggcg caaacggtaa taaagtcaac 480 atcacaagcg acaccaaagg cttgaatttt gcgaaagaaa cggctgggac gaacggcgac 540 cccacggttc atctgaacgg tatcggttcg actttgaccg atacgctgct gaataccgga 600 gcgaccacaa acgtaaccaa cgacaacgtt accgatgacg agaaaaaacg tgcggcaagc 660 gttaaagacg tattaaacgc aggctggaac attaaaggcg ttaaacccgg tacaacagct 720 tccgataacg ttgatttcgt ccgcacttac gacacagtcg agttcttgag cgcagatacg 780 aaaacaacga ctgttaatgt ggaaagcaaa gacaacggca agaaaaccga agttaaaatc 840 ggtgcgaaga cttctgttat taaagaaaaa gacggtaagt tggttactgg taaaggcaaa 900 gacgagaatg gttcttctac agacgaaggc gaaggcttag tgactgcaaa agaagtgatt 960 gatgcagtaa acaaggctgg ttggagaatg aaaacaacaa ccgctaatgg tcaaacaggt 1020 caagctgaca agtttgaaac cgttacatca ggcacaaaag taacctttgc tagtggtaat 1080 ggtacaactg cgactgtaag taaagatgat caaggcaaca tcactgttaa gtatgatgta 1140 aatgtcggcg atgccctaaa cgtcaatcag ctgcaaaaca gcggttggaa tttggattcc 1200

-75 CZ 304379 B6

aaagcggttg	caggttcttc	gggcaaagtc	atcagcggca	atgtttcgcc	gagcaaggga	1260
aagatggatg	aaaccgtcaa	cattaatgcc	ggcaacaaca	tcgagattac	ccgcaacggc	1320
aaaaatatcg	acatcgccac	ttcgatgacc	ccgcaatttt	ccagcgtttc	gctcggcgcg	1380
ggggcggatg	cgcccacttt	aagcgtggat	gacgagggcg	cgttgaatgt	cggcagcaag	1440
gatgccaaca	aacccgtccg	cattaccaat	gtcgccccgg	gcgttaaaga	gggggatgtt	1500
acaaacgtcg	cacaacttaa	aggtgtggcg	caaaacttga	acaaccgcat	cgacaatgtg	1560
gacggcaacg	cgcgcgcggg	tatcgcccaa	gcgattgcaa	ccgcaggttt	ggctcaggcg	1620
tatttgcccg	gcaagagtat	gatggcgatc	ggcggcggta	cttatcgcgg	cgaagccggt	1680
tacgccatcg	gctactcgag	catttctgac	actgggaatt	gggttatcaa	gggcacggct	1740
tccggcaatt	cgcgcggcca	tttcggtgct	tccgcatctg	tcggttatca	gtggtaa	1797

<210> 19 <211> 1797 <212> DNA <213> Neisseria meningitidis <400> 19

atgaacaaaa	tatcccgcat	catttggaat	agtgccctca	atgcctgggt	cgtcgtatcc	60
gagctcacac	gcaaccacac	caaacgcgcc	tccgcaaccg	tggcgaccgc	cgtattggcg	120
acactgttgt	ttgcaacggt	tcaggcgaat	gctaccgatg	acgacgattt	atatttagaa	180
cccgtacaac	gcactgctgt	cgtgttgagc	ttccgttccg	ataaagaagg	cacgggagaa	240
aaagaaggta	cagaagattc	aaattgggca	gtatatttcg	acgagaaaag	agtactaaaa	300
gccggagcaa	tcaccctcaa	agccggcgac	aacctgaaaa	tcaaacaaaa	caccaatgaa	360
aacaccaatg	aaaacaccaa	tgacagtagc	ttcacctact	ccctgaaaaa	agacctcaca	420
gatctgacca	gtgttgaaac	tgaaaaatta	tcgtttggcg	caaacggtaa	taaagtcaac	480
atcacaagcg	acaccaaagg	cttgaatttt	gcgaaagaaa	cggctgggac	gaacggcgac	540
cccacggttc	atctgaacgg	tatcggttcg	actttgaccg	atacgctgct	gaataccgga	600
gcgaccacaa	acgtaaccaa	cgacaacgtt	accgatgacg	agaaaaaacg	tgcggcaagc	660
gttaaagacg	tattaaacgc	aggctggaac	attaaaggcg	ttaaacccgg	tacaacagct	720
tccgataacg	tcgatttcgt	ccgcacttac	gacacagtcg	agttcttgag	cgcagatacg	780

-76CZ 304379 B6

aaaacaacga	ctgttaatgt	ggaaagcaaa	gacaacggca	agagaaccga	agttaaaatc	840
ggtgcgaaga	cttctgttat	taaagaaaaa	gacggtaagt	tggttactgg	taaaggcaaa	900
ggcgagaatg	gttcttctac	agacgaaggc	gaaggcttag	tgactgcaaa	agaagtgatt	960
gatgcagtaa	acaaggctgg	ttggagaatg	aaaacaacaa	ccgctaatgg	tcaaacaggt	1020
caagctgaca	agtttgaaac	cgttacatca	ggcacaaaag	taacctttgc	tagtggtaat	1080
ggtacaactg	cgactgtaag	taaagatgat	caaggcaaca	tcactgttaa	gtatgatgta	1140
aatgtcggcg	atgccctaaa	cgtcaatcag	ctgcaaaaca	gcggttggaa	tttggattcc	1200
aaagcggttg	caggttcttc	gggcaaagtc	atcagcggca	atgtttcgcc	gagcaaggga	1260
aagatggatg	aaaccgtcaa	cattaatgcc	ggcaacaaca	tcgagattac	ccgcaacggc	1320
aaaaatatcg	acatcgccac	ttcgatgacc	ccgcaatttt	ccagcgtttc	gctcggcgcg	1380
ggggcggatg	cgcccacttt	aagcgtggat	gacgagggcg	cgttgaatgt	cggcagcaag	1440
gatgccaaca	aacccgtccg	cattaccaat	gtcgccccgg	gcgttaaaga	gggggatgtt	1500
acaaacgtcg	cacaacttaa	aggtgtggcg	caaaacttga	acaaccgcat	cgacaatgtg	1560
gacggcaacg	cgcgcgcggg	fcatcgcccaa	gcgattgcaa	ccgcaggttt	ggctcaggcc	1620
tatttgcccg	gcaagagtat	gatggcgatc	ggcggcggta	cttatcgcgg	cgaagccggt	1680
tacgccatcg	gctactcgag	catttctgac	actgggaatt	gggttatcaa	gggcacggct	1740
tccggcaatt	cgcgcggtca	tttcggtact	tccgcatctg	tcggttatca	gtggtaa	1797

<210>	20
<211>	1785
<212>	DNA
<213>	Neisseria meningitidis
<400>	20

atgaacaaaa	tatacegcat	catttggaat	agtgccctca	atgcctgggt	cgtcgtatcc	60
gagctcacac	gcaaccacac	caaacgcgcc	tccgcaaccg	tggcgaccgc	cgtattggcg	120
acactgttgt	ttgcaacggt	teaggcgaat	gctaccgatg	acgacgattt	atatttagaa	180
cccgtacaac	gcactgctgt	cgtgttgagc	ttccgttccg	ataaagaagg	cacgggagaa	240
aaagaaggta	cagaagattc	aaattgggca	gtatatttcg	acgagaaaag	agtactaaaa	300
gccggagcaa	tcaccctcaa	agecggcgac	aacctgaaaa	tcaaacaaaa	caccaatgaa	360

-77 CZ 304379 B6

aacaccaatg acagtagctt cacctactcc ctgaaaaaag acctcacaga tctgaccagt	420
gttgaaactg aaaaattatc gtttggcgca aacggtaata aagtcaacat cacaagcgac	480
accaaaggct tgaattttgc gaaagaaacg gctgggacga acggcgaccc cacggttcat	540
ctgaacggta tcggttcgac tttgaccgat acgctgctga ataccggagc gaccacaaac	600
gtaaccaacg acaacgttac cgatgacgag aaaaaacgtg cggcaagcgt taaagacgta	660
ttaaacgcag gctggaacat taaaggcgtt aaacccggta caacagcttc cgataacgtt	720
gatttcgtcc gcacttacga cacagtcgag ttcttgagcg cagatacgaa aacaacgact	780
gttaatgtgg aaagcaaaga caacggcaag aaaaccgaag ttaaaatcgg tgcgaagact	840
tctgttatta aagaaaaaga cggtaagttg gttactggta aaggcaaaga cgagaatggt	900
tcttctacag acgaaggcga aggcttagtg actgcaaaag aagtgattga tgcagtaaac	960
aaggctggtt ggagaatgaa aacaacaacc gctaatggtc aaacaggtca agctgacaag	1020
tttgaaaccg ttacatcagg cacaaatgta acctttgcta gtggtaaagg tacaactgcg	1080
actgtaagta aagatgatca aggcaacatc actgttaagt atgatgtaaa tgtcggcgat	1140
gccctaaacg tcaatcagct gcaaaacagc ggttggaatt tggattccaa agcggttgca	1200
ggttcttcgg gcaaagtcat cagcggcaat gtttcgccga gcaagggaaa gatggatgaa	1260
accgtcaaca ttaatgccgg caacaacatc gagattaccc gcaacggtaa aaatatcgac	1320
atcgccactt cgatggcgcc gcagttttcc agcgtttcgc tcggtgcggg ggcggatgcg	1380
cccactttga gcgtggatga cgagggcgcg ttgaatgtcg gcagcaagga taccaacaaa	1440
cccgtccgca ttaccaatgt cgccccgggc gttaaagagg gggatgttac aaacgtcgca	1500
caacttaaag gcgtggcgca aaacttgaac aaccgcatcg acaatgtgga cggcaacgcg	1560
cgtgcgggca tcgcccaage gattgcaacc gcaggtctag ttcaggcgta tctgcccggc	1620
aagagtatga tggcgatcgg cggcgacact tatcgcggcg aagccggtta cgccatcggc	1680
tactcaagta tttccgacgg cggaaattgg attatcaaag gcacggcttc cggcaattcg	1740
cgcggccatt tcggtgcttc cgcatctgtc ggttatcaat ggtaa	1785

<210> 21 <211> 1779 <212> DNA <213> Neisseria meningitidis

-78CZ 304379 B6

<4OO> 21 atgaacaaaa	tataccgcat	catttggaat	agtgccctca	atgcctgggt	cgccgtatcc	60
gagctcacac	gcaaccacac	caaacgcgcc	tccgcaaccg	tgaagaccgc	cgtattggcg	12 0
acactgttgt	ttgcaacggt	tcaggcgaat	gctaccgatg	aagatgaaga	agaagagtta	180
gaatccgtac	aacgctctgt	cgtagggagc	attcaagcca	gtatggaagg	cagcggcgaa	240
ttggaaacga	tatcattatc	aatgactaac	gacagcaagg	aatttgtaga	cccatacata	300
gtagttaccc	tcaaagccgg	cgacaacctg	aaaatcaaac	aaaacaccaa	tgaaaacacc	360
aatgccagta	gcttcaccta	ctcgctgaaa	aaagacctca	caggcctgat	caatgttgaa	420
actgaaaaat	tatcgtttgg	cgcaaacggc	aagaaagtca	acatcataag	cgacaccaaa	480
ggcttgaatt	tcgcgaaaga	aacggctggg	acgaacggcg	acaccacggt	tcatctgaac	540
ggtatcggtt	cgactttgac	cgatacgctt	gcgggttctt	ctgcttctca	cgttgatgcg	600
ggtaaccaaa	gtacacatta	cactcgtgca	gcaagtatta	aggatgtgtt	gaatgcgggt	660
tggaatatta	agggtgttaa	aactggctca	acaactggtc	aatcagaaaa	tgtcgatttc	720
gtccgcactt	acgacacagt	cgagttcttg	agcgcagata	cgaaaacaac	gactgttaat	780
gtggaaagca	aagacaacgg	caagagaacc	gaagttaaaa	tcggtgcgaa	gacttctgtt	840
attaaagaaa	aagacggtaa	gttggttact	ggtaaaggca	aaggcgagaa	tggttcttct	900
acagacgaag	gcgaaggctt	agtgactgca	aaagaagtga	ttgatgcagt	aaacaaggct	960
ggttggagaa	tgaaaacaac	aaccgctaat	ggtcaaacag	gtcaagctga	caagtttgaa	1020
accgttacat	caggcacaaa	tgtaaccttt	gctagtggta	aaggtacaac	tgcgactgta	1080
agtaaagatg	atcaaggcaa	catcactgtt	atgtatgatg	taaatgtcgg	cgatgcccta	1140
aacgtcaatc	agctgcaaaa	cagcggttgg	aatttggatt	ccaaagcggt	tgcaggttct	1200
tcgggcaaag	tcatcagcgg	caatgtttcg	ccgagcaagg	gaaagatgga	tgaaaccgtc	1260
aacattaatg	ccggcaacaa	catcgagatt	agccgcaacg	gtaaaaatat	cgacatcgcc	1320
acttcgatgg	cgccgcagtt	ttccagcgtt	tcgctcggcg	cgggggcaga	tgcgcccact	1380
ttaagcgtgg	atgacgaggg	cgcgttgaat	gtcggcagca	aggatgccaa	caaacccgtc	1440
cgcattacca	atgtcgcccc	gggcgttaaa	gagggggatg	ttacaaacgt	cgcacaactt	1500
aaaggcgtgg	cgcaaaactt	gaacaaccgc	atcgacaatg	tggacggcaa	cgcgcgtgcg	1560
ggcatcgccc	aagcgattgc	aaccgcaggt	ctggttcagg	cgtatctgcc	cggcaagagt	1620
atgatggcga	tcggcggcgg	cacttatcgc	ggcgaagccg	gttacgccat	cggctactcc	1680

-79CZ 304379 B6 agtatttccg acggcggaaa ttggattatc aaaggcacgg cttccggcaa ttcgcgcggc 1740 catttcggtg cttccgcatc tgtcggttat cagtggtaa 1779 <210> 22 <211> 1815 <212> DNA <213> Neisseria meningitidis

<220>
<221>	mise feature
<222>	(1) ..(1815)
<223>	n is any nucleotide, synonymous nucleotide or at a corresponding position in any one of SEQ	absent nucleotide ID NOS:12-21

<400> 22 atgaacnaaa	tatnncgcat	catttggaat	agngccctca	atgcntgggt	ngnngtatcc	60
gagctcacac	gcaaccacac	caaacgcgcc	tccgcaaccg	tgnngaccgc	cgtattggcg	120
acnctgntgt	nngcaacggt	teaggenant	netanenatn	nngannnnnn	nnnngannna	180
nanttagann	ccgtnnnacg	cnctgnnnnn	gnnnnnnnnn	tnnnnnncnn	tanngaaggc	240
anngnngaan	nngaannnnn	annnrmnnnn	nnnnnnnnnn	nnnnnnannn	nnnnnnnnnn	300
nnnnnnnnnn	nnnnnnnnnn	nntnaccctc	aaagccggcg	acaacctgaa	aatcaaacaa	360
ancnnnnnnn	nnnnnnnnnn	nnnnnnnnnn	nnnnnnnnnn	ncttcaccta	ctcnctgaaa	420
aaaganctna	nagnnctgan	cantgttgna	actgaaaaat	tatcgtttng	cgcaaacngn	480
aanaaagtca	acatcanaag	cgacaccaaa	ggcttgaatt	tngcgaaana	aacggctgng	540
acnaacggcg	acnccacggt	tcatctgaac	ggtatnggtt	cgactttgac	egatangetn	600
nngnntncnn	nngcnncnnn	nnnngnnncn	nnnnacnann	ntacnnatna	cnnrmnnann	660
cgtgcngcaa	gnnttaanga	ngtnttnaan	gcnggntgga	anattaangg	ngttaaancn	720
ggnncaacan	ctnnnnnntc	nganaangtn	gatttcgtcc	ncacttacga	cacagtcgag	780
ttcttgagcg	cagatacgaa	aacaacgact	gttaatgtgg	aaagcaaaga	caacggcaag	840
anaaccgaag	ttaaaatcgg	tgcgaagact	tctgttatna	aagaaaaaga	cggtaagttg	900

-80CZ 304379 B6

gttactggta aagncaaagn cgagaatgnt tcttctacag acnaaggcga aggcttagtg	960
actgcaaaag aagtgattga tgcagtaaac aaggctggtt ggagaatgaa aacaacaacc	1020
gctaatggtc aaacaggtca agctgacaag tttgaaaccg ttacatcagg cacaaangta	1080
acctttgcta gtggtaangg tacaactgcg actgtaagta aagatgatca aggcaacatc	1140
actgttangt atgatgtaaa tgtcggcgat gccctaaacg tcaatcagct gcaaaacagc	1200
ggttggaatt tggattccaa agcggttgca ggttcttcgg gcaaagtcat eagcggcaat	1260
gtttcgccga gcaagggaaa gatggatgaa accgtcaaca ttaatgccgg caacaacatc	1320
gagattancc gcaacggnaa aaatatcgac atcgccactt cgatgncncc geanttttcc	1380
agcgtttcgc tcggngcggg ggcngatgcg cccactttna gcgtggatnn nnnggncgcn	1440
ttgaatgtcg gcagcaagna nnncaacaaa cccgtccgca ttaccaatgt cgccccggge	1500
gttaaagagg gggatgttac aaacgtcgcn caacttaaag gngtggcgca aaacttgaac	1560
aaccncatcg acaatgtgna cggcaacgcg cgngcgggna tcgcccaagc gattgcaaec	1620
gcaggtntng ntcaggcnta tntgcccggc aagagtatga tggcgatcgg cggcgnnact	1680
tatcncggcg aagccggtta ngccatcggc tactcnagna tttcngncnn nggnaattgg	1740
nttatcaang gcacggcttc cggcaattcg cgcggncatt tcggtncttc cgcatctgtc	1800
ggttatcant ggtaa	1815

<210 >	23
<211>	512
<212>	PRT
<213>	Neisseria meningitidis

<400> 23

Met Asn Lys Ile Tyr Arg Ile Ile Trp Asn Ser Ala Leu Asn Ala Trp 15 10 15

Val Val Val Ser Glu Leu Thr Arg Asn His Thr Lys Arg Ala Ser Ala 20 25 30

Thr Val Lys Thr Ala Val Leu Ala Thr Leu Leu Phe Ala Thr Val Gin 35 40 45

Ala Ser Ala Asn Asn Glu Thr Asp Leu Thr Ser Val Gly Thr Glu Lys

-81 CZ 304379 B6

55 60

Leu Ser Phe Ser Ala Asn Gly Asn Lys Val Asn Ile Thr Ser Asp Thr 65 70 75 80

Lys Gly Leu Asn Phe Ala Lys Glu Thr Ala Gly Thr Asn Gly Asp Thr 85 90 95

Thr Val His Leu Asn Gly Ile Gly Ser Thr Leu Thr Asp Thr Leu Leu 100 105 110

Asn Thr Gly Ala Thr Thr Asn Val Thr Asn Asp Asn Val Thr Asp Asp 115 120 125

Glu Lys Lys Arg Ala Ala Ser Val Lys Asp Val Leu Asn Ala Gly Trp 130 135 140

Asn Ile Lys Gly Val Lys Pro Gly Thr Thr Ala Ser Asp Asn Val Asp 145 150 155 160

Phe Val Arg Thr Tyr Asp Thr Val Glu Phe Leu Ser Ala Asp Thr Lys 165 170 175

Thr Thr Thr Val Asn Val Glu Ser Lys Asp Asn Gly Lys Lys Thr Glu 180 185 190

Val Lys Ile Gly Ala Lys Thr Ser Val Ile Lys Glu Lys Asp Gly Lys 195 200 205

Leu Val Thr Gly Lys Asp Lys Gly Glu Asn Gly Ser Ser Thr Asp Glu 210 215 220

Gly Glu Gly Leu Val Thr Ala Lys Glu Val Ile Asp Ala Val Asn Lys 225 230 235 240

Ala Gly Trp Arg Met Lys Thr Thr Thr Ala Asn Gly Gin Thr Gly Gin 245 250 255

Ala Asp Lys Phe Glu Thr Val Thr Ser Gly Thr Asn Val Thr Phe Ala 260 265 270

Ser Gly Lys Gly Thr Thr Ala Thr Val Ser Lys Asp Asp Gin Gly Asn 275 280 285

-82CZ 304379 B6

Ile Thr Val Met Tyr Asp Val Asn Val Gly Asp Ala Leu Asn Val Asn 290 295 300

Gin Leu Gin Asn Ser Gly Trp Asn Leu Asp Ser Lys Ala Val Ala Gly 305 310 315 320

Ser Ser Gly Lys Val Ile Ser Gly Asn Val Ser Pro Ser Lys Gly Lys 325 330 335

Met Asp Glu Thr Val Asn Ile Asn Ala Gly Asn Asn Ile Glu Ile Thr 340 345 350

Arg Asn Gly Lys Asn Ile Asp Ile Ala Thr Ser Met Thr Pro Gin Phe 355 360 365

Ser Ser Val Ser Leu Gly Ala Gly Ala Asp Ala Pro Thr Leu Ser Val 370 375 380

Asp Gly Asp Ala Leu Asn Val Gly Ser Lys Lys Asp Asn Lys Pro Val 385 390 395 400

Arg Ile Thr Asn Val Ala Pro Gly Val Lys Glu Gly Asp Val Thr Asn 405 410 415

Val Ala Gin Leu Lys Gly Val Ala Gin Asn Leu Asn Asn Arg Ile Asp 420 425 430

Asn Val Asp Gly Asn Ala Arg Ala Gly Ile Ala Gin Ala Ile Ala Thr 435 440 445

Ala Gly Leu Val Gin Ala Tyr Leu Pro Gly Lys Ser Met Met Ala Ile 450 455 460

Gly Gly Gly Thr Tyr Arg Gly Glu Ala Gly Tyr Ala Ile Gly Tyr Ser 465 470 475 480

Ser Ile Ser Asp Gly Gly Asn Trp Ile Ile Lys Gly Thr Ala Ser Gly 485 490 495

Asn Ser Arg Gly His Phe Gly Ala Ser Ala Ser Val Gly Tyr Gin Trp 500 505 510

-83 CZ 304379 B6

<210> 24 <2I1> 513
<212> PRT <213> Neisseria	t meningitidis
<400> 24
Met Asn Lys Ile 1	Tyr Arg Ile Ile 5
Val Ala Val Ser 20	Glu Leu Thr Arg
Thr Val Lys Thr 35	Ala Val Leu Ala 40
Ala Asn Ala Thr 50	Asp Glu Thr Gly 55
Leu Ser Phe Gly 65	Ala Asn Gly Lys 70
Lys Gly Leu Asn	Phe Ala Lys Glu 85
Thr Val His Leu 100	Asn Gly Ile Gly
Asn Thr Gly Ala 115	Thr Thr Asn Val 120
Glu Lys Lys Arg 130	Ala Ala Ser Val 135
Asn Ile Lys Gly 145	Val Lys Pro Gly 150
Phe Val Arg Thr	Tyr Asp Thr Val 165
Thr Thr Thr Val 180	Asn Val Glu Ser

Trp Asn Ser Ala Leu Asn Ala Trp 10 15

Asn His Thr Lys Arg Ala Ser Ala 25 30

Thr Leu Leu Phe Ala Thr Val Gin 45

Leu Ile Asn Val Glu Thr Glu Lys 60

Lys Val Asn Ile Ile Ser Asp Thr 75 80

Thr Ala Gly Thr Asn Gly Asp Thr 90 95

Ser Thr Leu Thr Asp Met Leu Leu 105 110

Thr Asn Asp Asn Val Thr Asp Asp 125

Lys Asp Val Leu Asn Ala Gly Trp 140

Thr Thr Ala Ser Asp Asn Val Asp 155 160

Glu Phe Leu Ser Ala Asp Thr Lys 170 175

Lys Asp Asn Gly Lys Lys Thr Glu 185 190

-84CZ 304379 B6

Val Lys Ile Gly Ala Lys Thr Ser Val Ile Lys Glu Lys Asp Gly Lys 195 200 205

Leu Val Thr Gly Lys Gly Lys Gly Glu Asn Gly Ser Ser Thr Asp Glu 210 215 220

Gly Glu Gly Leu Val Thr Ala Lys Glu Val Ile Asp Ala Val Asn Lys 225 230 235 240

Ala Gly Trp Arg Met Lys Thr Thr Thr Ala Asn Gly Gin Thr Gly Gin 245 250 255

Ala Asp Lys Phe Glu Thr Val Thr Ser Gly Thr Lys Val Thr Phe Ala 260 265 270

Ser Gly Asn Gly Thr Thr Ala Thr Val Ser Lys Asp Asp Gin Gly Asn 275 280 285

Ile Thr Val Lys Tyr Asp Val Asn Val Gly Asp Ala Leu Asn Val Asn. 290 295 300

Gin Leu Gin Asn Ser Gly Trp Asn Leu Asp Ser Lys Ala Val Ala Gly 305 310 315 320

Ser Ser Gly Lys Val Ile Ser Gly Asn Val Ser Pro Ser Lys Gly Lys 325 330 335

Met Asp Glu Thr Val Asn Ile Asn Ala Gly Asn Asn Ile Glu Ile Thr 340 345 350

Arg Asn Gly Lys Asn Ile Asp Ile Ala Thr Ser Met Thr Pro Gin Phe 355 360 365

Ser Ser Val Ser Leu Gly Ala Gly Ala Asp Ala Pro Thr Leu Ser Val 370 375 380

Asp Asp Glu Gly Ala Leu Asn Val Gly Ser Lys Asp Ala Asn Lys Pro 385 390 395 400

Val Arg Ile Thr Asn Val Ala Pro Gly Val Lys Glu Gly Asp Val Thr 405 410 415

-85CZ 304379 B6

Asn Val Ala Gin Leu Lys Gly Val 420

Ala Gin Asn Leu Asn Asn Arg Ile 425 430

Asp Asn Val Asn Gly Asn Ala Arg 435 440

Ala Gly Ile Ala Gin Ala Ile Ala 445

Thr Ala Gly Leu Val Gin Ala Tyr 450 455

Leu Pro Gly Lys Ser Met Met Ala 460

Ile Gly Gly Gly Thr Tyr Leu Gly 465 470

Glu Ala Gly Tyr Ala Ile Gly Tyr 475 480

Ser Ser Ile Ser Ala Gly Gly Asn 485

Trp Ile Ile Lys Gly Thr Ala Ser 490 495

Gly Asn Ser Arg Gly His Phe Gly 500

Ala Ser Ala Ser Val Gly Tyr Gin 505 510

Trp <210> 25 <211> 407 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 25

Met Asn Lys Ile Tyr Arg Ile Ile 1 5

Trp Asn Ser Ala Leu Asn Ala Trp 10 15

Val Val Val Ser Glu Leu Thr Arg 20

Asn His Thr Lys Arg Ala Ser Ala 25 30

Thr Val Lys Thr Ala Val Leu Ala 35 40

Thr Leu Leu Phe Ala Thr Val Gin 45

Ala Ser Ala Asn Asn Val Asp Phe 50 55

Val Arg Thr Tyr Asp Thr Val Glu 60

Phe Leu Ser Ala Asp Thr Lys Thr 65 70

Thr Thr Val Asn Val Glu Ser Lys 75 80

-86CZ 304379 B6

Asp Asn Gly Lys Lys Thr Glu Val Lys Ile Gly Ala Lys Thr Ser Val 85 90 95

Ile Lys Glu Lys Asp Gly Lys Leu Val Thr Gly Lys Asp Lys Gly Glu 100 105 110

Asn Gly Ser Ser Thr Asp Glu Gly Glu Gly Leu Val Thr Ala Lys Glu 115 120 125

Val Ile Asp Ala Val Asn Lys Ala Gly Trp Arg Met Lys Thr Thr Thr 130 135 140

Ala Asn Gly Gin Thr Gly Gin Ala Asp Lys Phe Glu Thr Val Thr Ser 145 150 155 160

Gly Thr Asn Val Thr Phe Ala Ser Gly Lys Gly Thr Thr Ala Thr Val 165 170 175

Ser Lys Asp Asp Gin Gly Asn Ile Thr Val Met Tyr Asp Val Asn Val 180 185 190

Gly Asp Ala Leu Asn Val Asn Gin Leu Gin Asn Ser Gly Trp Asn Leu 195 200 205

Asp Ser Lys Ala Val Ala Gly Ser Ser Gly Lys Val Ile Ser Gly Asn 210 215 220

Val Ser Pro Ser Lys Gly Lys Met Asp Glu Thr Val Asn Ile Asn Ala 225 230 235 240

Gly Asn Asn Ile Glu Ile Thr Arg Asn Gly Lys Asn Ile Asp Ile Ala 245 250 255

Thr Ser Met Thr Pro Gin Phe Ser Ser Val Ser Leu Gly Ala Gly Ala 260 265 270

Asp Ala Pro Thr Leu Ser Val Asp Gly Asp Ala Leu Asn Val Gly Ser 275 280 285

Lys Lys Asp Asn Lys Pro Val Arg Ile Thr Asn Val Ala Pro Gly Val 290 295 300

-87CZ 304379 B6

Lys Glu. Gly Asp Val Thr Asn Val Ala Gin Leu Lys Gly Val Ala Gin

305

310

315

320

Asn

Leu

Asn

Arg

Ile

Asp

Asn

Val

Asp

Gly

Asn

Ala

Arg

Ala

Gly

325

330

335

Ile

Ala

Gin

Ala

Ile

Ala

Thr

Ala

Gly

Leu

Val

Gin

Ala

Tyr

Leu

Pro

340

345

350

Gly

Lys

Ser

Met

Ala

Ile

Gly

Thr

Tyr

Arg

Gly

Glu

Ala

355

360

365

Gly

Tyr

Ala

Ile

Gly

Tyr

Ser

Ile

Ser

Asp

Gly

Asn

Trp

Ile

370

375

380

Ile

Lys

Gly

Thr

Ala

Ser

Gly

Asn

Ser

Arg

Gly

His

Phe

Gly

Ala

Ser

385

390

395

400

Ala

Ser

Val

Gly

Tyr

Gin

Trp

405 <210> 26 <211> 433 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis

<400> :

26

Met

Asn

Lys

Ile

Tyr

Arg

Ile

Trp

Asn

Ser

Ala

Leu

Asn

Ala

Trp

1

5

10

15

Val

Ser

Glu

Leu

Thr

Arg

Asn

His

Thr

Lys

Arg

Ala

Ser

Ala

20

25

30

Thr

Val

Lys

Thr

Ala

Val

Leu

Ala

Thr

Leu

Phe

Ala

Thr

Val

Gin

35

40

45

Ala

Ser

Ala

Asn

Arg

Ala

Ser

Val

Lys

Asp

Val

Leu

Asn

Ala

Gly

50

55

60

Trp

Asn

Ile

Lys

Gly

Val

Lys

Pro

Gly

Thr

Ala

Ser

Asp

Asn

Val

65

70

75

80

-88CZ 304379 B6

Asp Phe Val Arg Thr Tyr Asp Thr Val Glu Phe Leu Ser Ala Asp Thr 85 90 95

Lys Thr Thr Thr Val Asn Val Glu Ser Lys Asp Asn Gly Lys Lys Thr 100 105 110

Glu Val Lys Ile Gly Ala Lys Thr Ser Val Ile Lys Glu Lys Asp Gly 115 120 125

Lys Leu Val Thr Gly Lys Asp Lys Gly Glu Asn Gly Ser Ser Thr Asp 130 135 140

Glu Gly Glu Gly Leu Val Thr Ala Lys Glu Val Ile Asp Ala Val Asn 145 150 155 160

Lys Ala Gly Trp Arg Met Lys Thr Thr Thr Ala Asn Gly Gin Thr Gly 165 170 175

Gin Ala Asp Lys Phe Glu Thr Val Thr Ser Gly Thr Asn Val Thr Phe 180 185 190

Ala Ser Gly Lys Gly Thr Thr Ala Thr Val Ser Lys Asp Asp Gin Gly 195 200 205

Asn Ile Thr Val Met Tyr Asp Val Asn Val Gly Asp Ala Leu Asn Val 210 215 220

Asn Gin Leu Gin Asn Ser Gly Trp Asn Leu Asp Ser Lys Ala Val Ala 225 230 235 240

Gly Ser Ser Gly Lys Val Ile Ser Gly Asn Val Ser Pro Ser Lys Gly 245 250 255

Lys Met Asp Glu Thr Val Asn Ile Asn Ala Gly Asn Asn Ile Glu Ile 260 265 270

Thr Arg Asn Gly Lys Asn Ile Asp Ile Ala Thr Ser Met Thr Pro Gin 275 280 285

Phe Ser Ser Val Ser Leu Gly Ala Gly Ala Asp Ala Pro Thr Leu Ser 290 295 300

-89CZ 304379 B6

Val Asp Gly Asp Ala Leu Asn Val Gly Ser Lys Lys Asp Asn Lys Pro 305 310 315 320

Val Arg Ile Thr Asn Val Ala Pro Gly Val Lys Glu Gly Asp Val Thr 325 330 335

Asn Val Ala Gin Leu Lys Gly Val Ala Gin Asn Leu Asn Asn Arg Ile 340 345 350

Asp Asn Val Asp Gly Asn Ala Arg Ala Gly Ile Ala Gin Ala Ile Ala 355 360 365

Thr Ala Gly Leu Val Gin Ala Tyr Leu Pro Gly Lys Ser Met Met Ala 370 375 380

Ile Gly Gly Gly Thr 385

Tyr Arg Gly Glu Ala 390

Gly Tyr Ala 395

Ile Gly Tyr 400

Ser Ser

Ile

Ser Asp 405

Gly Gly Asn Trp

Ile

410

Ile Lys Gly Thr Ala Ser 415

Gly Asn Ser Arg Gly His Phe Gly Ala Ser Ala 420 425

Ser Val Gly Tyr Gin 430

Trp <210> 27 <211> 502 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 27

Met Asn Lys Ile Tyr Arg Ile Ile Trp Asn Ser Ala Leu Asn Ala Trp 15 10 15

Val Val Val

Ser Glu Leu 20

Thr Arg Asn His 25

Thr Lys

Arg Ala 30

Ser Ala

Thr Val

Lys Thr Ala Val Leu 35

Ala Thr 40

Leu Leu Phe

Ala

Thr Val

Gin

-90CZ 304379 B6

Ala Ser Ala Asn Thr Leu Lys Ala Gly Asp Asn Leu Lys Ile Lys Gin 50 55 60

Phe Thr Tyr Ser Leu Lys Lys Asp Leu Thr Asp Leu Thr Ser Val Gly 65 70 75 80

Thr Glu Lys Leu Ser Phe Ser Ala Asn Gly Asn Lys Val Asn Ile Thr 85 90 95

Ser Asp Thr Lys Gly Leu Asn Phe Ala Lys Glu Thr Ala Gly Thr Asn 100 105 110

Gly Asp Thr Thr Val His Leu Asn Gly Ile Gly Ser Thr Leu Thr Asp 115 120 125

Arg Ala Ala Ser Val Lys Asp Val Leu Asn Ala Gly Trp Asn Ile Lys 130 135 140

Gly Val Lys Asn Val Asp Phe Val Arg Thr Tyr Asp Thr Val Glu Phe 145 150 155 160

Leu Ser Ala Asp Thr Lys Thr Thr Thr Val Asn Val Glu Ser Lys Asp 165 170 175

Asn Gly Lys Lys Thr Glu Val Lys Ile Gly Ala Lys Thr Ser Val Ile 180 185 190

Lys Glu Lys Asp Gly Lys Leu Val Thr Gly Lys Asp Lys Gly Glu Asn 195 200 205

Gly Ser Ser Thr Asp Glu Gly Glu Gly Leu Val Thr Ala Lys Glu Val 210 215 220

Ile Asp Ala Val Asn Lys Ala Gly Trp Arg Met Lys Thr Thr Thr Ala 225 230 235 240

Asn Gly Gin Thr Gly Gin Ala Asp Lys Phe Glu Thr Val Thr Ser Gly 245 250 255

Thr Asn Val Thr Phe Ala Ser Gly Lys Gly Thr Thr Ala Thr Val Ser 260 265 270

-91 CZ 304379 B6

Lys Asp Asp Gin Gly Asn Ile Thr Val Met Tyr Asp Val Asn Val Gly 275 280 285

Asp Ala Leu Asn Val Asn Gin Leu Gin Asn Ser Gly Trp Asn Leu Asp 290 295 300

Ser Lys Ala Val Ala Gly Ser Ser Gly Lys Val Ile Ser Gly Asn Val 305 310 315 320

Ser Pro Ser Lys Gly Lys Met Asp Glu Thr Val Asn Ile Asn Ala Gly 325 330 335

Asn Asn Ile Glu Ile Thr Arg Asn Gly Lys Asn Ile Asp Ile Ala Thr 340 345 350

Ser Met Thr Pro Gin Phe Ser Ser Val Ser Leu Gly Ala Gly Ala Asp 355 360 365

Ala Pro Thr Leu Ser Val Asp Gly Asp Ala Leu Asn Val Gly Ser Lys 370 375 380

Lys Asp Asn Lys Pro Val Arg Ile Thr Asn Val Ala Pro Gly Val Lys 385 390 395 400

Glu Gly Asp Val Thr Asn Val Ala Gin Leu Lys Gly Val Ala Gin Asn 405 410 415

Leu Asn Asn Arg Ile Asp Asn Val Asp Gly Asn Ala Arg Ala Gly Ile 420 425 430

Ala Gin Ala Ile Ala Thr Ala Gly Leu Val Gin Ala Tyr Leu Pro Gly 435 440 445

Lys Ser Met Met Ala Ile Gly Gly Gly Thr Tyr Arg Gly Glu Ala Gly 450 455 460

Tyr Ala Ile Gly Tyr Ser Ser Ile Ser Asp Gly Gly Asn Trp Ile Ile 465 470 475 480

Lys Gly Thr Ala Ser Gly Asn Ser Arg Gly His Phe Gly Ala Ser Ala 485 490 495

Ser Val Gly Tyr Gin Trp 500

-97CZ 304379 B6

<210>	28
<211>	1539
<212>	DNA
<213>	Neisseria meningitidis
<400>	28

atgaacaaaa tatacegcat catttggaat agtgccctca atgcatgggt cgtcgtatcc 60 gagctcacac gcaaccacac caaacgcgcc tccgcaaccg tgaagaccgc cgtattggcg 120 actctgttgt ttgcaacggt tcaggcaagt gctaacaatg aaacagatct gaccagtgtt 180 ggaactgaaa aattatcgtt tagcgcaaac ggcaataaag tcaacatcac aagcgacacc 240 aaaggcttga attttgcgaa agaaacggct gggacgaacg gcgacaccac ggttcatctg 300 aacggtattg gttcgacttt gaccgatacg ctgctgaata ccggagcgac cacaaacgta 360 accaacgaca acgttaccga tgacgagaaa aaacgtgcgg caagcgttaa agacgtatta 420 aacgctggct ggaacattaa aggcgttaaa cccggtacaa cagcttccga taacgttgat 480 ttcgtccgca cttacgacac agtcgagttc ttgagcgcag atacgaaaac aacgactgtt 540 aatgtggaaa gcaaagacaa cggcaagaaa accgaagtta aaatcggtgc gaagaettet 600 gttattaaag aaaaagacgg taagttggtt actggtaaag acaaaggcga gaatggttct 660 tctacagacg aaggcgaagg cttagfcgact gcaaaagaag tgattgatgc agtaaacaag 720 gctggttgga gaatgaaaac aacaaccgct aatggtcaaa caggtcaagc tgacaagttt 780 gaaaccgtta catcaggcac aaatgtaacc tttgctagtg gtaaaggtac aactgcgact 840 gtaagtaaag atgatcaagg caacatcact gttatgtatg atgtaaatgt cggcgatgcc 900 ctaaacgtca ateagetgea aaacagcggt tggaatttgg attccaaagc ggttgcaggt 960 tcttcgggca aagtcatcag cggcaatgtt tcgccgagca agggaaagat ggatgaaacc 1020 gtcaacatta atgccggcaa caacatcgag attacccgca acggtaaaaa tatcgacatc 1080 gccacttcga tgaccccgca gttttccagc gtttcgctcg gcgcgggggc ggatgcgccc 1140 actttgagcg tggatgggga cgcattgaat gtcggcagca agaaggacaa caaacccgtc 1200 cgcattacca atgtcgcccc gggcgttaaa gagggggatg ttacaaacgt cgcacaactt 1260 aaaggcgtgg cgcaaaactt gaacaaccgc atcgacaatg tggacggcaa cgcgcgtgcg 1320 ggcatcgccc aagcgattgc aaccgcaggt ctggttcagg cgtatttgcc cggcaagagt 1380

-93 CZ 304379 B6 atgatggcga tcggcggcgg cacttatcgc ggcgaagccg gttacgccat cggctactcc 1440 agtatttccg acggcggaaa ttggattatc aaaggcacgg cttccggcaa ttcgcgcggc 1500 catttcggtg cttccgcatc tgtcggttat cagtggtaa 1539 <210> 29 <211> 1542 <212> DNA <213> Neisseria meningitidis <400> 29 atgaacaaaa tataccgcat catttggaat agtgccctca átgcctgggt cgccgtatcc 60 gagctcacac gcaaccacac caaacgcgcc tccgcaaccg tgaagaccgc cgtattggcg 120 acactgttgt ttgcaacggt tcaggcgaat gctaccgatg aaacaggcct gatcaatgtt 180 gaaactgaaa aattatcgtt tggcgcaaac ggcaagaaag tcaacatcat aagcgacacc 240 aaaggcttga atttcgcgaa agaaacggct gggacgaacg gcgacaccac ggttcatctg 300 aacggtatcg gttcgacttt gaccgatatg ctgctgaata ccggagcgac cacaaacgta 360 accaacgaca acgttaccga tgacgagaaa aaacgtgcgg caagcgttaa agacgtatta 420 aacgcaggct ggaacattaa aggcgttaaa cccggtacaa cagcttccga taacgttgat 480 ttcgtccgca cttacgacac agtcgagttc ttgagcgcag atacgaaaac aacgactgtt 540 aatgtggaaa gcaaagacaa cggcaagaaa accgaagtta aaatcggtgc gaagacttct 600 gttattaaag aaaaagacgg taagttggtt actggtaaag gcaaaggcga gaatggttct 660 tctacagacg aaggcgaagg cttagtgact gcaaaagaag tgattgatgc agtaaacaag 720 gctggttgga gaatgaaaac aacaaccgct aatggtcaaa caggtcaagc tgacaagttt 780 gaaaccgtta catcaggcac aaaagtaacc tttgctagtg gtaatggtac aactgcgact 840 gtaagtaaag atgatcaagg caacatcact gttaagtatg atgtaaatgt cggcgatgcc 900 ctaaacgtca atcagctgca aaacagcggt tggaatttgg attccaaagc ggttgcaggt 960 tcttcgggca aagtcatcag cggcaatgtt tcgccgagca agggaaagat ggatgaaacc 1020 gtcaacatta atgccggcaa caacatcgag attacccgca acggcaaaaa tatcgacatc 1080 gccacttcga tgaccccgca attttccagc gtttcgctcg gcgcgggggc ggatgcgccc 1140 actttaagcg tggatgacga gggcgcgttg aatgtcggca gcaaggatgc caacaaaccc 1200

-94CZ 304379 B6

gtccgcatta	ccaatgtcgc	cccgggcgtt	aaagaggggg	atgttacaaa	cgtcgcgcaa	1260
cttaaaggtg	tggcgcaaaa	cttgaacaac	cgcatcgaca	atgtgaacgg	caacgcgcgt	1320
gcgggcatcg	cccaagcgat	tgcaaccgca	ggtctggttc	aggcgtatct	gcccggcaag	1380
agtatgatgg	cgatcggcgg	cggcacttat	ctcggcgaag	ccggttatgc	catcggctac	1440
tcaagcattt	ccgccggcgg	aaattggatt	atcaaaggca	cggcttccgg	caattcgcgc	1500
ggccatttcg	gtgcttccgc	atctgtcggt	tatcagtggt	aa		1542

<210>	30
<211>	1224
<212>	DNA
<213>	Neisseria meningitidis
<400>	30

atgaacaaaa	tataccgcat	catttggaat	agtgccctca	atgcatgggt	cgtcgtatcc	60
gagctcacac	gcaaccacac	caaacgcgcc	tccgcaaccg	tgaagaccgc	cgtattggcg	120
actctgttgt	ttgcaacggt	tcaggcaagt	gctaacaacg	ttgatttcgt	ccgcacttac	180
gacacagtcg	agttcttgag	cgcagatacg	aaaacaacga	ctgttaatgt	ggaaagcaaa	240
gacaacggca	agaaaaccga	agttaaaatc	ggtgcgaaga	cttctgttat	taaagaaaaa	300
gacggtaagt	tggttactgg	taaagacaaa	ggcgagaatg	gttcttctac	agacgaaggc	360
gaaggcttag	tgactgcaaa	agaagtgatt	gatgcagtaa	acaaggctgg	ttggagaatg	420
aaaacaacaa	ccgctaatgg	tcaaacaggt	caagctgaca	agtttgaaac	cgttacatca	480
ggcacaaatg	taacctttgc	tagtggtaaa	ggtacaactg	cgactgtaag	taaagatgat	54 0
caaggcaaca	tcactgttat	gtatgatgta	aatgtcggcg	atgccctaaa	cgtcaatcag	600
ctgcaaaaca	gcggttggaa	tttggattcc	aaagcggttg	caggttcttc	gggcaaagtc	660
atcagcggca	atgtttcgcc	gagcaaggga	aagatggatg	aaaccgtcaa	cattaatgcc	720
ggcaacaaca	tcgagattac	ccgcaacggt	aaaaatatcg	acatcgccac	ttcgatgacc	780
ccgcagtttt	ccagcgtttc	gctcggcgcg	ggggcggatg	cgcccacttt	gagcgtggat	840
ggggacgcat	tgaatgtcgg	cagcaagaag	gacaacaaac	ccgtccgcat	taccaatgtc	900
gccccgggcg	ttaaagaggg	ggatgttaca	aacgtcgcac	aacttaaagg	cgtggcgcaa	960
aacttgaaca	accgcatcga	caatgtggac	ggcaacgcgc	gtgcgggcat	cgcccaagcg	1020

-95CZ 304379 B6

attgcaaccg	caggtctggt tcaggcgtat ttgcccggca agagtatgat ggcgatcggc	1080
ggcggcactt	atcgcggcga agccggttac gccatcggct actccagtat ttccgacggc	1140
ggaaattgga	ttatcaaagg cacggcttcc ggcaattcgc gcggccattt cggtgcttcc	1200
gcatctgtcg	gttatcagtg gtaa	1224

<210>	31
<211>	1302
<212>	DNA
<213>	Neisseria meningitidis
<400>	31

atgaacaaaa	tataccgcat	catttggaat	agtgecctca	atgcatgggt	cgtcgtatcc	60
gagctcacac	gcaaccacac	caaacgcgcc	tccgcaaccg	tgaagaccgc	cgtattggcg	120
actetgttgt	ttgcaacggt	tcaggcaagt	gctaaccgtg	cggcaagcgt	taaagacgta	180
ttaaacgctg	gctggaacat	taaaggcgtt	aaacccggta	caacagcttc	cgataacgtt	240
gatttcgtcc	gcacttacga	cacagtcgag	ttcttgagcg	cagatacgaa	aacaacgact	300
gttaatgtgg	aaagcaaaga	caacggcaag	aaaaccgaag	ttaaaatcgg	tgcgaagact	360
tctgttatta	aagaaaaaga	cggtaagttg	gttactggta	aagacaaagg	cgagaatggt	420
tcttctacag	acgaaggcga	aggcttagtg	actgcaaaag	aagtgattga	tgcagtaaac	480
aaggctggtt	ggagaatgaa	aacaacaacc	gctaatggtc	aaacaggtca	agctgacaag	540
tttgaaaccg	ttacatcagg	cacaaatgta	acctttgcta	gtggtaaagg	tacaactgcg	600
actgtaagta	aagatgatca	aggcaacatc	actgttatgt	atgatgtaaa	tgtcggcgat	660
gccctaaacg	tcaatcagct	gcaaaacagc	ggttggaatt	tggattccaa	agcggttgca	720
ggttcttcgg	gcaaagtcat	cagcggcaat	gtttcgccga	gcaagggaaa	gatggatgaa	780
accgtcaaca	ttaatgccgg	caacaacatc	gagattaccc	gcaacggtaa	aaatatcgac	84 0
atcgccactt	cgatgacccc	gcagttttcc	agcgtttcgc	tcggcgcggg	ggcggatgcg	900
cccactttga	gcgtggatgg	ggacgcattg	aatgtcggca	gcaagaagga	caacaaaccc	960
gtccgcatta	ccaatgtcgc	cccgggcgtt	aaagaggggg	atgttacaaa	cgtcgcacaa	1020
cttaaaggcg	tggcgcaaaa	cttgaacaac	cgcatcgaca	atgtggacgg	caacgcgcgt	1080
gcgggcatcg	cccaagcgat	tgcaaccgca	ggtctggttc	aggcgtattt	gcccggcaag	1140

-96CZ 304379 B6

agtatgatgg	cgatcggcgg	cggcacttat	cgcggcgaag	ccggttacgc	catcggctac	1200
tccagtattt	ccgacggcgg	aaattggatt	atcaaaggca	cggcttccgg	caattcgcgc	1260
ggccatttcg	gtgcttccgc	atctgtcggt	tatcagtggt	aa		1302

<210> 32 <211> 1509 <212> DNA <213> Neisseria meningitidis

<400> 32 atgaacaaaa	tataccgcat	catttggaat	agtgccctca	atgcatgggt	cgtcgtatcc	60
gagctcacac	gcaaccacac	caaacgcgcc	tccgcaaccg	tgaagaccgc	cgtattggcg	120
actctgttgt	ttgcaacggt	tcaggcaagt	gctaacaccc	tcaaagccgg	cgacaacctg	180
aaaatcaaac	aattcaccta	ctcgctgaaa	aaagacctca	cagatctgac	cagtgttgga	240
actgaaaaat	tatcgtttag	cgcaaacggc	aataaagtca	acatcacaag	cgacaccaaa	300
ggcttgaatt	ttgcgaaaga	aacggctggg	acgaacggcg	acaccacggt	tcatctgaac	360
ggtattggtt	cgactttgac	cgatcgtgcg	gcaagcgtta	aagacgtatt	aaacgctggc	420
tggaacatta	aaggcgttaa	aaacgttgat	ttcgtccgca	cttacgacac	agtcgagttc	480
ttgagcgcag	atacgaaaac	aacgactgtt	aatgtggaaa	gcaaagacaa	cggcaagaaa	540
accgaagtta	aaatcggtgc	gaagacttct	gttattaaag	aaaaagacgg	taagttggtt	600
actggtaaag	acaaaggcga	gaatggttct	tctacagacg	aaggcgaagg	cttagtgact	660
gcaaaagaag	tgattgatgc	agtaaacaag	gctggttgga	gaatgaaaac	aacaaccgct	720
aatggtcaaa	caggtcaagc	tgacaagttt	gaaaccgtta	catcaggcac	aaatgtaacc	780
tttgctagtg	gtaaaggtac	aactgcgact	gtaagtaaag	atgatcaagg	caacatcact	84 0
gttatgtatg	atgtaaatgt	cggcgatgcc	ctaaacgtca	atcagctgca	aaacagcggt	900
tggaatttgg	attccaaagc	ggttgcaggt	tcttcgggca	aagtcatcag	cggcaatgtt	960
tcgccgagca	agggaaagat	ggatgaaacc	gtcaacatta	atgccggcaa	caacatcgag	1020
attacccgca	acggtaaaaa	tatcgacatc	gccacttcga	tgaccccgca	gttttccagc	1080
gtttcgctcg	gcgcgggggc	ggatgcgccc	actttgagcg	tggatgggga	cgcattgaat	1140
gtcggcagca	agaaggacaa	caaacccgtc	cgcattacca	atgtcgcccc	gggcgttaaa	1200

-97CZ 304379 B6

gagggggatg	ttacaaacgt	cgcacaactt	aaaggcgtgg	cgcaaaactt	gaacaaccgc	1260
atcgacaatg	tggacggcaa	cgcgcgtgcg	ggcatcgccc	aagcgattgc	aaccgcaggt	1320
ctggttcagg	cgtatttgcc	cggcaagagt	atgatggcga	tcggcggcgg	cacttatcgc	1380
ggcgaagccg	gttacgccat	cggctactcc	agtatttccg	acggcggaaa	ttggattatc	1440
aaaggcacgg	cttccggcaa	ttcgcgcggc	catttcggtg	cttccgcatc	tgtcggttat	1500
cagtggtaa						1509

<210>	33
<211>	540
<212>	PRT
<213>	Neisseria meningitidis

<400> 33
Asn Asn Glu	Glu Gin Glu Glu	Tyr Leu Tyr Leu His	Pro Val Gin Arg
1	5	10	15

Thr Val Ala Val Leu Ile Val Asn Ser Asp Lys Glu Gly Ala Gly Glu 20 25 30

Lys Glu Lys Val Glu Glu Asn Ser Asp Trp Ala Val Tyr Phe Asn Glu 35 40 45

Lys Gly Val Leu Thr Ala Arg Glu Ile Thr Leu Lys Ala Gly Asp Asn 50 55 60

Leu Lys Ile Lys Gin Asn Gly Thr Asn Phe Thr Tyr Ser Leu Lys Lys 65 70 75 80

Asp Leu Thr Asp Leu Thr Ser Val Gly Thr Glu Lys Leu Ser Phe Ser 85 90 95

Ala His Gly Asn Lys Val Asn Ile Thr Ser Asp Thr Lys Gly Leu Asn 100 105 110

Phe Ala Lys Glu Thr Ala Gly Thr Asn Gly Asp Thr Thr Val His Leu 115 120 125

-98CZ 304379 B6

Asn Gly Ile Gly Ser Thr Leu Thr Asp Thr Leu Leu Asn Thr Gly Ala 130 135 140

Thr Thr Asn Val Thr Asn Asp Asn Val Thr Asp Asp Glu Lys Lys Arg 145 150 155 160

Ala Ala Ser Val Lys Asp Val Leu Asn Ala Gly Trp Asn Ile Lys Gly 165 170 175

Val Lys Pro Gly Thr Thr Ala Ser Asp Asn Val Asp Phe Val Arg Thr 180 185 190

Tyr Asp Thr Val Glu Phe Leu Ser Ala Asp Thr Lys Thr Thr Thr Val 195 200 205

Asn Val Glu Ser Lys Asp Asn Gly Lys Lys Thr Glu Val Lys Ile Gly 210 215 220

Ala Lys Thr Ser Val Ile Lys Glu Lys Asp Gly Lys Leu Val Thr Gly 225 230 235 240

Lys Asp Lys Gly Glu Asn Gly Ser Ser Thr Asp Glu Gly Glu Gly Leu 245 250 255

Val Thr Ala Lys Glu Val Ile Asp Ala Val Asn Lys Ala Gly Trp Arg 260 265 270

Met Lys Thr Thr Thr Ala Asn Gly Gin Thr Gly Gin Ala Asp Lys Phe 275 280 285

Glu Thr Val Thr Ser Gly Thr Asn Val Thr Phe Ala Ser Gly Lys Gly 290 295 300

Thr Thr Ala Thr Val Ser Lys Asp Asp Gin Gly Asn Ile Thr Val Met 305 310 315 320

Tyr Asp Val Asn Val Gly Asp Ala Leu Asn Val Asn Gin Leu Gin Asn 325 330 335

Ser Gly Trp Asn Leu Asp Ser Lys Ala Val Ala Gly Ser Ser Gly Lys 340 345 350

Val Ile Ser Gly Asn Val Ser Pro Ser Lys Gly Lys Met Asp Glu Thr 355 360 365

-99CZ 304379 B6

Val Asn Ile Asn Ala Gly Asn Asn Ile Glu Ile Thr Arg Asn Gly Lys 370 375 380

Asn Ile Asp Ile Ala Thr Ser Met Thr Pro Gin Phe Ser Ser Val Ser 385 390 395 400

Leu Gly Ala Gly Ala Asp Ala Pro Thr Leu Ser Val Asp Gly Asp Ala 405 410 415

Leu Asn Val Gly Ser Lys Lys Asp Asn Lys Pro Val Arg Ile Thr Asn 420 425 430

Val Ala Pro Gly Val Lys Glu Gly Asp Val Thr Asn Val Ala Gin Leu 435 440 445

Lys Gly Val Ala Gin Asn Leu Asn Asn Arg Ile Asp Asn Val Asp Gly 450 455 460

Asn Ala Arg Ala Gly Ile Ala Gin Ala Ile Ala Thr Ala Gly Leu Val 465 470 475 480

Gin Ala Tyr Leu Pro Gly Lys Ser Met Met Ala Ile Gly Gly Gly Thr 485 490 495

Tyr Arg Gly Glu Ala Gly Tyr Ala Ile Gly Tyr Ser Ser Ile Ser Asp 500 505 510

Gly Gly Asn Trp Ile Ile Lys Gly Thr Ala Ser Gly Asn Ser Arg Gly 515 520 525

His Phe Gly Ala Ser Ala Ser Val Gly Tyr Gin Trp

530	535
<210>	34
<211>	541
<212>	PRT
<213>	Neisseria meningitidis
<400>	34

- 100CZ 304379 B6

Thr Asp Glu Asp Glu Glu Glu Glu Leu Glu Ser Val Gin Arg Ser Val 15 10 15

Val Gly Ser Ile Gin Ala Ser Met Glu Gly Ser Val Glu Leu Glu Thr 20 25 30

Ile Ser Leu Ser Met Thr Asn Asp Ser Lys Glu Phe Val Asp Pro Tyr 35 40 45

Ile Val Val Thr Leu Lys Ala Gly Asp Asn Leu Lys Ile Lys Gin Asn 50 55 60

Thr Asn Glu Asn Thr Asn Ala Ser Ser Phe Thr Tyr Ser Leu Lys Lys 65 70 75 80

Asp Leu Thr Gly Leu Ile Asn Val Glu Thr Glu Lys Leu Ser Phe Gly 85 90 95

Ala Asn Gly Lys Lys Val Asn Ile Ile Ser Asp Thr Lys Gly Leu Asn 100 105 110

Phe Ala Lys Glu Thr Ala Gly Thr Asn Gly Asp Thr Thr Val His Leu 115 120 125

Asn Gly Ile Gly Ser Thr Leu Thr Asp Met Leu Leu Asn Thr Gly Ala 130 135 140

Thr Thr Asn Val Thr Asn Asp Asn Val Thr Asp Asp Glu Lys Lys Arg 145 150 155 160

Ala Ala Ser Val Lys Asp Val Leu Asn Ala Gly Trp Asn Ile Lys Gly 165 170 175

Val Lys Pro Gly Thr Thr Ala Ser Asp Asn Val Asp Phe Val Arg Thr 180 185 190

Tyr Asp Thr Val Glu Phe Leu Ser Ala Asp Thr Lys Thr Thr Thr Val 195 200 205

Asn Val Glu Ser Lys Asp Asn Gly Lys Lys Thr Glu Val Lys Ile Gly 210 215 220

Ala Lys Thr Ser Val Ile Lys Glu Lys Asp Gly Lys Leu Val Thr Gly 225 230 235 240

- 101 CZ 304379 B6

Lys Gly Lys Gly Glu Asn Gly Ser Ser Thr Asp Glu Gly Glu Gly Leu 245 250 255

Val Thr Ala Lys Glu Val Ile Asp Ala Val Asn Lys Ala Gly Trp Arg 260 265 270

Met Lys Thr Thr Thr Ala Asn Gly Gin Thr Gly Gin Ala Asp Lys Phe 275 280 285

Glu Thr Val Thr Ser Gly Thr Lys Val Thr Phe Ala Ser Gly Asn Gly 290 295 300

Thr Thr Ala Thr Val Ser Lys Asp Asp Gin Gly Asn Ile Thr Val Lys 305 310 315 320

Tyr Asp Val Asn Val Gly Asp Ala Leu Asn Val Asn Gin Leu Gin Asn 325 330 335

Ser Gly Trp Asn Leu Asp Ser Lys Ala Val Ala Gly Ser Ser Gly Lys 340 345 350

Val Ile Ser Gly Asn Val Ser Pro Ser Lys Gly Lys Met Asp Glu Thr 355 360 365

Val Asn Ile Asn Ala Gly Asn Asn Ile Glu Ile Thr Arg Asn Gly Lys 370 375 380

Asn Ile Asp Ile Ala Thr Ser Met Thr Pro Gin Phe Ser Ser Val Ser 385 390 395 400

Leu Gly Ala Gly Ala Asp Ala Pro Thr Leu Ser Val Asp Asp Glu Gly 405 410 415

Ala Leu Asn Val Gly Ser Lys Asp Ala Asn Lys Pro Val Arg Ile Thr 420 425 430

Asn Val Ala Pro Gly Val Lys Glu Gly Asp Val Thr Asn Val Ala Gin 435 440 445

Leu Lys Gly Val Ala Gin Asn Leu Asn Asn Arg Ile Asp Asn Val Asn 450 455 460

- 102CZ 304379 B6

Gly Asn Ala Arg Ala Gly Ile Ala 465 470

Gin Ala Ile Ala Thr Ala Gly Leu 475 480

Val Gin Ala Tyr Leu Pro Gly Lys 485

Ser Met Met Ala Ile Gly Gly Gly 490 495

Thr Tyr Leu Gly Glu Ala Gly Tyr 500

Ala Ile Gly Tyr Ser Ser Ile Ser 505 510

Ala Gly Gly Asn Trp Ile Ile Lys

	515	520
Gly His 530	Phe Gly Ala Ser Ala Ser 535
<210>	35
<211>	461
<212>	PRT
<213>	Neisseria	meningitidis

Val Gly Tyr Gin Trp 540

Gly Thr Ala Ser Gly Asn Ser Arg 525 <400> 35

Asn Asn Glu Thr Asp Leu Thr Ser 1 5

Val Gly Thr Glu Lys Leu Ser Phe 10 15

Ser Ala Asn Gly Asn Lys Val Asn 20

Ile Thr Ser Asp Thr Lys Gly Leu 25 30

Asn Phe Ala Lys Glu Thr Ala Gly 35 40

Thr Asn Gly Asp Thr Thr Val His 45

Leu Asn Gly Ile Gly Ser Thr Leu 50 55

Thr Asp Thr Leu Leu Asn Thr Gly 60

Ala Thr Thr Asn Val Thr Asn Asp 65 70

Asn Val Thr Asp Asp Glu Lys Lys 75 80

Arg Ala Ala Ser Val Lys Asp Val 85

Leu Asn Ala Gly Trp Asn Ile Lys 90 95

Gly Val Lys Pro Gly Thr Thr Ala 100

Ser Asp Asn Val Asp Phe Val Arg 105 110

- 103 CZ 304379 B6

Thr Tyr Asp Thr Val Glu Phe Leu Ser Ala Asp Thr Lys Thr Thr Thr 115 120 125

Val Asn Val Glu Ser Lys Asp Asn Gly Lys Lys Thr Glu Val Lys Ile 130 135 140

Gly Ala Lys Thr Ser Val Ile Lys Glu Lys Asp Gly Lys Leu Val Thr 145 150 155 160

Gly Lys Asp Lys Gly Glu Asn Gly Ser Ser Thr Asp Glu Gly Glu Gly 165 170 175

Leu Val Thr Ala Lys Glu Val Ile Asp Ala Val Asn Lys Ala Gly Trp 180 185 190

Arg Met Lys Thr Thr Thr Ala Asn Gly Gin Thr Gly Gin Ala Asp Lys 195 200 205

Phe Glu Thr Val Thr Ser Gly Thr Asn Val Thr Phe Ala Ser Gly Lys 210 215 220

Gly Thr Thr Ala Thr Val Ser Lys Asp Asp Gin Gly Asn Ile Thr Val 225 230 235 240

Met Tyr Asp Val Asn Val Gly Asp Ala Leu Asn Val Asn Gin Leu Gin 245 250 255

Asn Ser Gly Trp Asn Leu Asp Ser Lys Ala Val Ala Gly Ser Ser Gly 260 265 270

Lys Val Ile Ser Gly Asn Val Ser Pro Ser Lys Gly Lys Met Asp Glu 275 280 285

Thr Val Asn Ile Asn Ala Gly Asn Asn Ile Glu Ile Thr Arg Asn Gly 290 295 300

Lys Asn Ile Asp Ile Ala Thr Ser Met Thr Pro Gin Phe Ser Ser Val 305 310 315 320

Ser Leu Gly Ala Gly Ala Asp Ala Pro Thr Leu Ser Val Asp Gly Asp 325 330 335

- 104CZ 304379 B6

Ala Leu Asn Val Gly Ser Lys Lys Asp Asn Lys Pro Val Arg Ile Thr 340 345 350

Asn Val Ala Pro Gly Val Lys Glu Gly Asp Val Thr Asn Val Ala Gin 355 360 365

Leu Lys Gly Val Ala Gin Asn Leu Asn Asn Arg Ile Asp Asn Val Asp 370 375 380

Gly Asn Ala Arg Ala Gly Ile Ala Gin Ala Ile Ala Thr Ala Gly Leu 385 390 395 400

Val Gin Ala Tyr Leu Pro Gly Lys Ser Met Met Ala Ile Gly Gly Gly 405 410 415

Thr Tyr Arg Gly Glu Ala Gly Tyr Ala Ile Gly Tyr Ser Ser Ile Ser 420 425 430

Asp Gly Gly Asn Trp Ile Ile Lys Gly Thr Ala Ser Gly Asn Ser Arg 435 440 445

Gly His Phe Gly Ala Ser Ala Ser Val Gly Tyr Gin Trp
450	455	460
<210>	36
<211>	462
<212>	PRT
<213>	Neisseria meningitidis

<400> 36

Thr Asp Glu Thr Gly Leu Ile Asn Val Glu Thr Glu Lys Leu Ser Phe 15 10 15

Gly Ala Asn Gly Lys Lys Val Asn Ile Ile Ser Asp Thr Lys Gly Leu 20 25 30

Asn Phe Ala Lys Glu Thr Ala Gly Thr Asn Gly Asp Thr Thr Val His 35 40 45

Leu Asn Gly Ile Gly Ser Thr Leu Thr Asp Met Leu Leu Asn Thr Gly 50 55 60

- 105 CZ 304379 B6

Ala Thr Thr Asn Val Thr Asn Asp Asn Val Thr Asp Asp Glu Lys Lys 65 70 75 80

Arg Ala Ala Ser Val Lys Asp Val Leu Asn Ala Gly Trp Asn Ile Lys 85 90 95

Gly Val Lys Pro Gly Thr Thr Ala Ser Asp Asn Val Asp Phe Val Arg 100 105 110

Thr Tyr Asp Thr Val Glu Phe Leu Ser Ala Asp Thr Lys Thr Thr Thr 115 120 125

Val Asn Val Glu Ser Lys Asp Asn Gly Lys Lys Thr Glu Val Lys Ile 130 135 140

Gly Ala Lys Thr Ser Val Ile Lys Glu Lys Asp Gly Lys Leu Val Thr 145 150 155 160

Gly Lys Gly Lys Gly Glu Asn Gly Ser Ser Thr Asp Glu Gly Glu Gly 165 170 175

Leu Val Thr Ala Lys Glu Val Ile Asp Ala Val Asn Lys Ala Gly Trp 180 185 190

Arg Met Lys Thr Thr Thr Ala Asn Gly Gin Thr Gly Gin Ala Asp Lys 195 200 205

Phe Glu Thr Val Thr 210

Ser Gly Thr Lys Val 215

Thr

Phe Ala 220

Ser Gly Asn

Gly Thr Thr Ala Thr 225

Val

230

Ser Lys Asp Asp

Gin Gly Asn 235

Ile Thr Val 240

Lys

Tyr Asp Val

Asn Val 245

Gly Asp Ala Leu Asn Val Asn Gin Leu Gin 250 255

Asn Ser

Gly Trp Asn 260

Leu Asp Ser

Lys Ala 265

Val Ala

Gly

Ser

270

Ser Gly

Lys Val

Ile Ser Gly Asn Val 275

Ser Pro 280

Ser Lys-Gly Lys 285

Met Asp Glu

- 106CZ 304379 B6

Thr Val Asn Ile Asn Ala Gly Asn Asn Ile Glu Ile Thr Arg Asn Gly 290 295 300

Lys Asn Ile Asp Ile Ala Thr Ser Met Thr Pro Gin Phe Ser Ser Val 305 310 315 320

Ser Leu Gly Ala Gly Ala Asp Ala Pro Thr Leu Ser Val Asp Asp Glu 325 330 335

Gly Ala Leu Asn Val Gly Ser Lys Asp Ala Asn Lys Pro Val Arg Ile 340 345 350

Thr Asn Val Ala Pro Gly Val Lys Glu Gly Asp Val Thr Asn Val Ala 355 360 365

Gin Leu Lys Gly Val Ala Gin Asn Leu Asn Asn Arg Ile Asp Asn Val 370 375 380

Asn Gly Asn Ala Arg Ala Gly Ile Ala Gin Ala Ile Ala Thr Ala Gly 385 390 395 400

Leu Val Gin Ala Tyr Leu Pro Gly Lys Ser Met Met Ala Ile Gly Gly 405 410 415

Gly Thr Tyr Leu Gly Glu Ala Gly Tyr Ala Ile Gly Tyr Ser Ser Ile 420 425 430

Ser Ala Gly Gly Asn Trp Ile Ile Lys Gly Thr Ala Ser Gly Asn Ser 435 440 445

Arg Gly His Phe Gly Ala Ser Ala Ser Val Gly Tyr Gin Trp 450 455 460

<210>	37
<211>	356
<212>	PRT
<213>	Neisseria meningitidis
<400>	37

Asn Asn Val Asp Phe Val Arg Thr Tyr Asp Thr Val Glu Phe Leu Ser 15 10 15

- 107CZ 304379 B6

Ala Asp Thr Lys Thr 20

Thr Thr Val Asn Val Glu 25

Ser Lys Asp Asn Gly 30

Lys Lys Thr Glu Val 35

Lys Ile Gly Ala Lys Thr 40

Ser Val Ile Lys Glu 45

Lys Asp Gly Lys Leu 50

Val Thr Gly Lys Asp Lys 55

Gly Glu Asn Gly Ser 60

Ser Thr Asp Glu Gly 65

Glu Gly Leu Val Thr Ala 70 75

Lys Glu Val Ile Asp 80

Ala Val Asn Lys Ala 85

Gly Trp Arg Met Lys Thr 90

Thr Thr Ala Asn Gly 95

Gin Thr Gly Gin Ala 100

Asp Lys Phe Glu Thr Val 105

Thr Ser Gly Thr Asn 110

Val Thr Phe Ala Ser 115

Gly Lys Gly Thr Thr Ala 120

Thr Val Ser Lys Asp 125

Asp Gin Gly Asn Ile 130

Thr Val Met Tyr Asp Val 135

Asn Val Gly Asp Ala 140

Leu Asn Val Asn Gin 145

Leu Gin Asn Ser Gly Trp 150 155

Asn Leu Asp Ser Lys 160

Ala Val Ala Gly Ser 165

Ser Gly Lys Val Ile Ser 170

Gly Asn Val Ser Pro 175

Ser Lys Gly Lys Met 180

Asp Glu Thr Val Asn Ile 185

Asn Ala Gly Asn Asn 190

Ile Glu Ile Thr Arg 195

Asn Gly Lys Asn Ile Asp 200

Ile Ala Thr Ser Met 205

Thr Pro Gin Phe Ser 210

Ser Val Ser Leu Gly Ala 215

Gly Ala Asp Ala Pro 220

Thr Leu Ser Val Asp 225

Gly Asp Ala Leu Asn Val 230 235 .Gly Ser Lys Lys Asp 240

- 108 CZ 304379 B6

Asn Lys Pro Val Arg Ile Thr Asn Val Ala Pro Gly Val Lys Glu Gly 245 250 255

Asp Val Thr Asn Val Ala Gin Leu Lys Gly Val Ala Gin Asn Leu Asn 260 265 270

Asn Arg Ile Asp Asn Val Asp Gly Asn Ala Arg Ala Gly Ile Ala Gin 275 280 285

Ala Ile Ala Thr Ala Gly Leu Val Gin Ala Tyr Leu Pro Gly Lys Ser 290 295 300

Met Met Ala Ile Gly Gly Gly Thr Tyr Arg Gly Glu Ala Gly Tyr Ala 305 310 315 320

Ile Gly Tyr Ser Ser Ile Ser Asp Gly Gly Asn Trp Ile Ile Lys Gly 325 330 335

Thr Ala Ser Gly Asn Ser Arg Gly His Phe Gly Ala Ser Ala Ser Val 340 345 350

Gly Tyr Gin Trp 355 <210> 38 <211> 382 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 38

Asn Arg Ala Ala Ser Val Lys Asp Val Leu Asn Ala Gly Trp Asn Ile 15 10 15

Lys Gly Val Lys Pro Gly Thr Thr Ala Ser Asp Asn Val Asp Phe Val 20 25 30

Arg Thr Tyr Asp Thr Val Glu Phe Leu Ser Ala Asp Thr Lys Thr Thr 35 40 45

Thr Val Asn Val Glu Ser Lys Asp Asn Gly Lys Lys Thr Glu Val Lys 50 55 60

- 109CZ 304379 B6

Ile Gly Ala Lys Thr Ser Val Ile Lys Glu Lys Asp Gly Lys Leu Val 65 70 75 80

Thr Gly Lys Asp Lys Gly Glu Asn Gly Ser Ser Thr Asp Glu Gly Glu 85 90 95

Gly Leu Val Thr Ala Lys Glu Val Ile Asp Ala Val Asn Lys Ala Gly 100 105 110

Trp Arg Met Lys Thr Thr Thr Ala Asn Gly Gin Thr Gly Gin Ala Asp 115 120 125

Lys Phe Glu Thr Val Thr Ser Gly Thr Asn Val Thr Phe Ala Ser Gly 130 135 140

Lys Gly Thr Thr Ala Thr Val Ser Lys Asp Asp Gin Gly Asn Ile Thr 145 150 155 160

Val Met Tyr Asp Val Asn Val Gly Asp Ala Leu Asn Val Asn Gin Leu 165 170 175

Gin Asn Ser Gly Trp Asn Leu Asp Ser Lys Ala Val Ala Gly Ser Ser 180 185 190

Gly Lys Val Ile Ser Gly Asn Val Ser Pro Ser Lys Gly Lys Met Asp 195 200 205

Glu Thr Val Asn Ile Asn Ala Gly Asn Asn Ile Glu Ile Thr Arg Asn 210 215 220

Gly Lys Asn Ile Asp Ile Ala Thr Ser Met Thr Pro Gin Phe Ser Ser 225 230 235 240

Val Ser Leu Gly Ala Gly Ala Asp Ala Pro Thr Leu Ser Val Asp Gly 245 250 255

Asp Ala Leu Asn Val Gly Ser Lys Lys Asp Asn Lys Pro Val Arg Ile 260 265 270

Thr Asn Val Ala Pro Gly Val Lys Glu Gly Asp Val Thr Asn Val Ala 275 280 285

-110CZ 304379 B6

Gin

Leu 290

Lys

Gly

Val

Ala

Gin 295

Asn

Leu

Asn

Arg 300

Ile

Asp

Asn Val

Asp 305

Gly

Asn

Ala

Arg

Ala 310

Gly

Ile

Ala

Gin

Ala 315

Ile

Ala

Thr

Ala Gly 320

Leu

Val

Gin

Ala

Tyr 325

Leu

Pro

Gly

Lys

Ser 330

Met

Ala

Ile

Gly Gly 335

Gly

Thr

Tyr

Arg 340

Gly

Glu

Ala

Gly

Tyr 345

Ala

Ile

Gly

Tyr

Ser 350

Ser Ile

Ser

Asp

Gly 355

Gly

Asn

Trp

Ile

Ile 360

Lys

Gly

Thr

Ala

Ser 365

Gly

Asn Ser

Arg

Gly

His

Phe

Gly

Ala

Ser

Ala

Ser

Val

Gly

Tyr

Gin

Trp

370 375 380 <210> 39 <211> 201 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis

<4oo> :

39

Ser

Ala

Asn

Thr

Leu

Lys

Ala

Gly

Asp

Asn

Leu

Lys

Ile

Lys

Gin

Phe

1

5

10

15

Thr

Tyr

Ser

Leu

Lys

Asp

Leu

Thr

Asp

Leu

Thr

Ser

Val

Gly

Thr

20

25

30

Glu

Lys

Leu

Ser

Phe

Ser

Ala

Asn

Gly

Asn

Lys

Val

Asn

Ile

Thr

Ser

35

40

45

Asp

Thr

Lys

Gly

Leu

Asn

Phe

Ala

Lys

Glu

Thr

Ala

Gly

Thr

Asn

Gly

50

55

60

Asp

Thr

Val

His

Leu

Asn

Gly

Ile

Gly

Ser

Thr

Leu

Thr

Asp

Arg

65

70

75

80

Ala

Ser

Val

Lys

Asp

Val

Leu

Asn

Ala

Gly

Trp

Asn

Ile

Lys

Gly

85

90

95

- 111 CZ 304379 B6

Val Lys Asn Val Asp Phe Val Arg Thr Tyr Asp Thr Val Glu Phe Leu 100 105 110

Ser Ala Asp Thr Lys Thr Thr Thr Val Asn Val Glu Ser Lys Asp Asn 115 120 125

Gly Lys Lys Thr Glu Val Lys Ile Gly Ala Lys Thr Ser Val Ile Lys 130 135 140

Glu Lys Asp Gly Lys Leu Val Thr Gly Lys Asp Lys Gly Glu Asn Gly 145 150 155 160

Ser Ser Thr Asp Glu Gly Glu Gly Leu Val Thr Ala Lys Glu Val Ile 165 170 175

Asp Ala Val Asn Lys Ala Gly Trp Arg Met Lys Thr Thr Thr Ala Asn 180 185 190

Gly Gin Thr Gly Gin Ala Asp Lys Phe 195 200 <210> 40 <211> 51 <212> DNA <213> Neisseria meningitidis <400> 40 caattaacgg ccgaataaaa ggaagccgat atgaacaaaa tataccgcat c 51

<210>	41
<211>	31
<212>	DNA
<213>	Neisseria meningitidis
<400>	41

tggaatccat ggaatcgcca cccttccett c

-112CZ 304379 B6

<210>	42
<211>	30
<212>	DNA
<213>	Neisseria meningitidis
<400>	42
ggtcagatct gtttcattgt tagcacttgc	30
<210>	43
<211>	30
<212>	DNA
<213>	Neisseria meningitidis
<400>	43
gatcaggcct gtatcttcat cggtagcatt	30
<210>	44
<211>	39
<212>	DNA
<213>	Neisseria meningitidis
<400>	44
gacgaaatca acgttcttag cacttgcctg aaccgttgc	39
<210>	45
<211>	24
<212>	DNA
<213>	Neisseria meningitidis
<400>	45
aacgttgatt tcgtccgcac ttac	24
<210>	46

- 113 CZ 304379 B6

<211>	39
c212>	DNA
<213>	Neisseria meningitidis

<400> 46 aacgcttgcc gcacgcttag cacttgcctg caacgttgc 39

<210>	47
<211>	24
<212>	DNA
<213>	Neisseria meningitidis

<400> 47 cgtgcggcaa gcgttaaaga cgta 24

<210>	48
<211>	72
<212>	DNA
<213>	Neisseria meningitidis

<400> 48 cagcgagtag gtgaattgtt tgattttcag gttgtcgccg gctttgaggg tgttagcact 60 tgcctgaacc gt 72

<210>	49
<211>	24
<212>	DNA
<213>	Neisseria meningitidis

<400> 49 ttcacctact cgctgaaaaa agac 24 <210> 50

-114CZ 304379 B6

<211>	57
<212>	DNA
<213>	Neisseria meningitidis

<400> 50 gccagcgttt aatacgtctt taacgcttgc cgcacgatcg gtcaaagtcg aaccaat 57

<210>	51
<211>	57
<212>	DNA
<213>	Neisseria meningitidis

<400> 51 gtattaaacg ctggctggaa cattaaaggc gttaaaaacg ttgatttcgt ccgcact 57

<210>	52
<211>	11
<212>	PRT
<213>	Neisseria meningitidis

<220>

<221>	mise feature
<222>	(1) .. (2)
<223>	X is any amino acid or aosent. amino acid
<400>	52

Xaa Xaa Glu Thr Asp Leu Thr Ser Val Gly Thr

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Izolovaný protein, který obsahuje jednu nebo více konzervovaných oblastí polypeptidu NhhA, které zahrnují aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny skládající se ze

i. zbytků 1 až 50 sekvence SEQ ID No: 11, ii. zbytků 109 až 120 sekvence SEQ ID No:l 1, iii. zbytků 135 až 198 sekvence SEQ ID No:l 1, iv. zbytků 221 až 239 sekvence SEQ ID No: 11 a

v. zbytků 249 až 604 sekvence SEQ ID No: 11, a případně jednu nebo více variabilních (V) oblastí, které zahrnují aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny skládající se ze

i) zbytků 121 až 134 sekvence SEQ ID No:l 1, ii) zbytků 199 až 220 sekvence SEQ ID No: 11, a iii) zbytků 240 až 248 sekvence SEQ ID No: 11, s výhradou, že jsou nepřítomné všechny nebo podstatná část zbytků 51 až 108 sekvence SEQ ID No: 11, a kde izolovaný protein je schopný vyvolat imunitní odpověď, která je více zkříženě reaktivní než ta vyvolaná NhhA polypeptidem, a kde izolovaný protein není přirozeně se vyskytujícím typem polypeptidu NhhA.
2. Izolovaný protein podle nároku 1, který je deleční mutant polypeptidu NhhA.
3. Izolovaný protein podle nároku 1 nebo 2, schopný vyvolat imunitní odpověď poskytující ochranu proti většině kmenů N. meningitidis.
4. Izolovaný protein podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, kde polypeptid NhhA zahrnuje aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny skládající se z SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO:2; SEQ ID NO:3; SEQ ID NO:4; SEQ ID NO:5; SEQ ID NO:6; SEQ ID NO:7; SEQ ID NO:8; SEQ ID NO:9 a SEQ ID NO: 10.

5. Izolovaný protein podle nároku 4, zahrnující aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny skládající se z:

i) zbytků 1 až 50 ze SEQ ID NO: 1;

ii) zbytků 1 až 50 ze SEQ ID NO:2; iii) zbytků 1 až 50 ze SEQ IDNO:3; iv) zbytků 1 až 50 ze SEQ ID NO:4; V) zbytků 1 až 50 ze SEQ IDNO:5; vi) zbytků 1 až 50 ze SEQ ID NO:6; vii) zbytků 1 až 50 ze SEQ ID NO:7; viii) zbytků 1 až 50 ze SEQ ID NO:8; ix) zbytků 1 až 50 ze SEQ ID NO:9; X) zbytků 1 až 50 ze SEQ ID NO: 10; xi) zbytků 109 až 120 ze SEQ IDNO:1; xii) zbytků 103 až 114 ze SEQIDNO:2; xiii) zbytků 106 až 117 ze SEQ IDNO:3; xiv) zbytků 105 až 116 ze SEQ IDNO:4; xv) zbytků 109 až 120 ze SEQ IDNO:5;

-116CZ 304379 B6 xvi) xvii) xviii) xix) xx) xxi) xxii) xxiii) xxiv) xxv) xxvi) xxvii) xxviii) xxix) xxx) xxxi) xxxii) xxxiii) xxxiv) xxxv) xxxvi) xxxvii) xxxvi i i) xxxix) xl) xli) xlii) xliii) xl iv) xlv) xlvi) xl vii) xlviii) xlix)

1) zbytků 106 zbytků 105 zbytků 105 zbytků 105 zbytků 103 zbytků 125 zbytků 125 zbytků 122 zbytků 127 zbytků 125 zbytků 132 zbytků 131 zbytků 131 zbytků 127 zbytků 125 zbytků 211 zbytků 211 zbytků 206 zbytků 213 zbytků 211 zbytků 218 zbytků 217 zbytků 217 zbytků 213 zbytků 209 zbytků 237 zbytků 237 zbytků 235 zbytků 239 zbytků 237 zbytků 244 zbytků 243 zbytků 243 zbytků 239 zbytků 237 až 117 ze až 116 ze až 116 ze až 116 ze až 114 ze až 188 ze až 188 ze až 185 ze až 190 ze až 188 ze až 195 ze až 194 ze až 194 ze až 190 ze až 188 ze až 229 ze až 229 ze až 224 ze až 231 ze až 229 ze až 236 ze až 235 ze až 235 ze až 231 ze až 227 ze až 591 ze až 592 ze až 589 ze až 594 ze až 591 ze až 599 ze až 598 ze až 598 ze až 594 ze až 592 ze

SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SE1 ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO:

6;

:7;

8;

9;

10;

1;

:2

3;

4;

5;

6;
7;
8;
9;
10;

1;

2;

3;

4;

5;

6;

7;

8;

9;

10;

i;

2;

3;

4;

5;

6;

7;

8;

9a

10.

6. Izolovaný protein podle kteréhokoliv z předchozích nároků 1 až 5, zahrnující aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny skládající se z: SEQ ID NO:23; SEQ ID NO:24; SEQ ID NO:25; SEQ ID NO:26; SEQ ID NO:27; SEQ ID NO:33; SEQ ID NO:34; SEQ ID NO:35; SEQ ID NO:36; SEQ ID NO:37; SEQ ID NO:38 a SEQ ID NO:39.

7. Izolovaný protein podle kteréhokoliv z předchozích nároků 1 až 5, zahrnující nejméně dvě sousední konzervované oblasti.

- 117CZ 304379 B6

8. Izolovaný protein podle nároku 7, zahrnující aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny skládající se z: SEQ ID NO:25; SEQ ID NO:27 a SEQ ID NO:39.

9. Izolovaný protein mající nejméně 80% sekvenční identitu s izolovaným proteinem podle nároku 6, schopný vyvolat imunitní odpověď, která je více zkříženě reaktivní než ta vyvolaná NhhA polypeptidem, a kde izolovaný protein není přirozeně se vyskytujícím typem polypeptidu NhhA.

10. Izolovaný protein mající nejméně 90% sekvenční identitu s izolovaným proteinem podle nároku 6, schopný vyvolat imunitní odpověď, která je více zkříženě reaktivní než ta vyvolaná NhhA polypeptidem, a kde izolovaný protein není přirozeně se vyskytujícím typem polypeptidu NhhA.
11. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje jeden nebo více izolovaných proteinů podle kteréhokoliv z nároků 1 až 10 a farmaceuticky přijatelný nosič, diluent nebo excipient.
12. Farmaceutický prostředek podle nároku 11, vyznačující se tím, že je vakcínou.
13. Protilátka nebo fragment protilátky, které se vytváří proti izolovanému proteinu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 10.
14. Izolovaná nukleová kyselina kódující izolovaný protein podle kteréhokoliv z nároků 1 až 10.
15. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 14, zahrnující nukleotidovovou sekvenci vybranou ze skupiny skládající se ze:

i) zbytků 1 až 150 ze SEQ ID NO:22;

ii) zbytků 325 až 361 ze SEQ ID NO:22;

iii) zbytků 403 až 595 ze SEQ ID NO:22;

iv) zbytků 661 až 717 ze SEQ ID NO:22 a

v) zbytků 745 až 1815 ze SEQ ID NO:22.
16. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 15, zahrnující nukleotidovou sekvenci vybranou ze skupiny skládající se ze SEQ ID NO:28; SEQ ID NO:29; SEQ ID NO:30; SEQ ID NO:31 a SEQ ID NO:32.
17. Izolovaná nukleová kyselina, která má nejméně 80% sekvenční identitu s izolovanou nukleovou kyselinou podle kteréhokoliv z nároků 14 až 16.
18. Izolovaná nukleová kyselina, která má nejméně 90% sekvenční identitu s izolovanou nukleovou kyselinou podle kteréhokoliv z nároků 14 až 16.
19. Expresní vektor, obsahující izolovanou nukleovou kyselinu podle kteréhokoliv z nároků 14 až 18 operativně navázanou na promotor.
20. Hostitelská buňka, obsahující expresní vektor podle nároku 19.
21. Hostitelská buňka podle nároku 20, kterou je bakterie.
22. Hostitelská buňka podle nároku 21, kterou je Neisseria meningitidis.

-118CZ 304379 B6
23. Způsob přípravy rekombinantního proteinu, vyznačující se tím, že se

i) hostitelská buňka podle nároku 20 kultivuje tak, že se v ní exprimuje rekombinantní protein, a ii) rekombinantní protein se izoluje.
24. Způsob detekce N. meningitidis v podezřelém biologickém vzorku, vyznačující se tím, že se

i) biologický vzorek získaný od jedince smíchá s protilátkou nebo fragmentem protilátky podle nároku 13, a ii) detekuje se specificky navázaná protilátka nebo fragment protilátky, indikující přítomnost N. meningitidis.
25. Způsob detekce bakterie N. meningitidis v podezřelém biologickém vzorku, vyznačující se tím, že se v biologickém vzorku získaném od jedince detekuje izolovaná nukleová kyselina podle kteréhokoliv z nároků 14 až 18, která indikuje přítomnost bakterie.
26. Způsob diagnostikování infekce N. meningitidis u jedince, vyznačující se tím, že se

i) biologický vzorek získaný od jedince smíchá s izolovaným proteinem podle kteréhokoliv z nároků I až 10, a ii) ve vzorku se stanoví přítomnost nebo nepřítomnost komplexu vytvořeného mezi izolovaným proteinem a protilátkami specifickými proti N. meningitidis, přičemž přítomnost komplexu je pro infekci indikativní.
27. Použití farmaceuticky účinného množství izolovaného proteinu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 10 pro výrobu léčiva pro prevenci nebo léčbu jedince při infekci N. meningitidis.
28. Použití farmaceuticky účinného množství izolované nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků 14 až 18 pro výrobu léčiva pro prevenci nebo léčbu jedince při infekci N. meningitidis.
29. Použití podle kteréhokoliv z nároku 27 nebo 28, kde jedinec je člověk.
30. Použití izolovaného proteinu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 10 pro identifikaci imunogenního fragmentu izolovaného proteinu, kde imunogenní fragment se identifikuje detekcí imunitní odpovědi na izolovaný protein, která zahrnuje produkci prvků, které specificky váží N. meningitidis a/nebo izolovaný protein, a/nebo protektívní účinek proti infekci N. meningitidis.
31. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 24 až 26, vyznačující se tím, že jedinec je savec.
32. Způsob podle nároku 31, vyznačující se tím, že savec je člověk.