CN102427826B - 为脑膜炎球菌因子h结合蛋白添加佐剂 - Google Patents

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Abstract

已有提议将因子H结合蛋白(fHBP)用于免疫以抵御血清群B脑膜炎球菌(‘MenB’)。通过以下措施，可将该抗原有效吸附于羟基磷酸铝佐剂：(i)确保吸附在等于或低于佐剂的零电荷点(PZC)的pH下进行，和/或(ii)选择等电点/PZC范围在5.0-7.0的fHBP和佐剂，和/或(iii)选择等电点高于佐剂的PZC的fHBP并利用缓冲液使pH在PZC的1.2个pH单位内。吸附尤其可用于包含多种fHBP变体的组合物以及应避免氢氧化铝佐剂的情况。经缓冲的药物组合物可包含至少两种不同的脑膜炎球菌fHBP抗原，二者有至少85％吸附于羟基磷酸铝佐剂。

Description

为脑膜炎球菌因子H结合蛋白添加佐剂
本申请要求美国临时申请61/162,999(2009年3月24日提交)的优先权，其全部内容通过引用纳入本文。
技术领域
本发明涉及脑膜炎球菌疫苗的领域，具体而言是含有fHBP抗原的那些疫苗。
背景技术
脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)(脑膜炎球菌)是革兰氏阴性球菌。现有的脑膜炎球菌疫苗均基于荚膜糖。这些疫苗包括单价血清群(serogroup)C偶联物疫苗和血清群A、C、W135和Y的4-价偶联物混合物。目前没有可用的疫苗得到批准普遍用于抗血清群B(‘MenB’)。
提出用于免疫抵御MenB的一种抗原是因子H结合蛋白(fHBP)。该抗原也称为蛋白“741”(参考文献34的SEQ ID 2535和2536)、‘NMB1870’、‘GNA1870’[参考文献1-3]、‘P2086’、‘LP2086’或‘ORF2086’[4-6]。该蛋白质已得到充分研究。其天然为脂蛋白，在所有脑膜炎球菌血清群中表达。现已通过NMR测定了fHbp的C-末端免疫显性结构域(‘fHbpC’)的结构[7]。该蛋白质的该部分形成8-链β-桶(barrel)，其链通过长度不同的环相连。该桶之前是短α-螺旋和易弯曲的N-末端尾。
fHBP抗原分为3种不同变体[8]，现已发现针对给定家族产生的血清在同一家族内具有杀菌性，但对表达另两个家族之一的菌株无活性，即，有家族内交叉保护作用，但没有家族间交叉保护作用。因此，参考文献8提出将fHBP的不同变体结合形成一种疫苗组合物，作为不同蛋白质的混合物或作为不同变体的融合蛋白(后者是“串联蛋白”)，藉此增加菌株覆盖度。
参考文献9也报道了fHBP串联蛋白(参考文献9的第18-19页)。该串联蛋白经纯化并与作为佐剂的磷酸铝混合，但据报道，其不能充分吸附于该佐剂。期望获得抗原的良好吸附，现已发现如果利用氢氧化铝作为替代佐剂，此类混合fHBP蛋白易于吸附。
然而，利用氢氧化铝作为佐剂的问题是其能降解某些抗原。例如，参考文献10报道了即使在低温下其亦能水解B型流感嗜血杆菌(H.influenzae)偶联物疫苗，导致效力降低。类似地，参考文献11报道了伤寒沙门菌(S.typhi)Vi荚膜糖在氢氧化铝存在下水解。因此，期望能利用基于磷酸铝的佐剂配制抗原，特别是如果添加佐剂的疫苗可与易被氢氧化铝破坏的抗原，例如偶联的细菌荚膜糖混合(制备期间或在使用时)的话。
因此，需要fHBP，特别是多种fHBP变体的制剂，其中所述一种或多种fHBP吸附于佐剂，但该佐剂无需氢氧化铝佐剂。
发明内容
本发明人鉴定了通用技术以便实现将fHBP蛋白有效吸附于羟基磷酸铝(aluminium hydroxyphosphate)佐剂。利用羟基磷酸铝可避免使用氢氧化铝的需要，本发明人的技术避免参考文献9中所述的吸附不充分。吸附技术尤其可用于包含多种fHBP变体的组合物。
在本发明的第一方面，发生fHBP吸附的pH等于或低于羟基磷酸铝的零电荷点(PZC)。因此，对于给定的羟基磷酸铝佐剂，选择的水性介质(例如，缓冲液)具有等于或低于佐剂的PZC的pH。相反，对于给定的pH，选择具有相同或较高PZC的羟基磷酸铝。如此选择pH和PZC可获得其中fHBP稳定吸附于羟基磷酸铝的免疫原性组合物。
在第二方面，选择fHBP和羟基磷酸铝佐剂，从而fHBP具有5.0到7.0(包括端点)的等电点(Pi)，在同一范围内选择佐剂的PZC。通过确保抗原和佐剂特征密切匹配，可能获得稳定吸附的组合物，即使吸附pH高于佐剂的PZC。能将pH也维持在5.0到7.0范围的缓冲液的存在促进稳定吸附。
在第三方面，如果fHBO的等电点高于羟基磷酸铝佐剂的PZC，则加入缓冲液将pH调节至该PZC的1.2个pH单位内。
因此，对于第一方面，本发明提供将脑膜炎球菌fHBP抗原吸附于羟基磷酸铝佐剂的方法，其中发生吸附的pH等于或低于羟基磷酸铝的零电荷点。吸附的fHBP抗原可用作免疫原。可以各种方式进行吸附。可通过分别混合所有三种组分或预先混合两种组分再将预混合物与第三种组分混合，从而以任何合适的顺序混合fHBP抗原、羟基磷酸铝和缓冲液。
本发明还提供包含脑膜炎球菌fHBP抗原与羟基磷酸铝佐剂的免疫原性组合物，其中所述羟基磷酸铝佐剂的零电荷点高于该免疫原性组合物的pH。
对于第二方面，本发明提供将脑膜炎球菌fHBP抗原吸附于羟基磷酸铝佐剂的方法，其中(i)所述脑膜炎球菌fHBP抗原具有5.0到7.0的等电点，(ii)所述羟基磷酸铝佐剂具有5.0到7.0的零电荷点，和(iii)所述fHBP抗原的吸附发生在5.0到7.0的pH下。
本发明还提供包含吸附于羟基磷酸铝佐剂的脑膜炎球菌fHBP抗原的免疫原性组合物，其中(i)所述脑膜炎球菌fHBP抗原具有5.0到7.0的等电点，(ii)所述羟基磷酸铝佐剂具有5.0到7.0的零电荷点。所述组合物通常包含将pH维持于5.0到7.0的缓冲液。
对于第三方面，本发明提供将脑膜炎球菌fHBP抗原吸附于羟基磷酸铝佐剂的方法，其中(i)所述脑膜炎球菌fHBP抗原的等电点高于所述佐剂的零电荷点，和(ii)发生吸附的pH在所述佐剂的零电荷点的1.2个pH单位内。优选通过包含将pH维持在所述佐剂的零电荷点的1.2个pH单位内的缓冲液来实现吸附期间的pH。
本发明还提供包含吸附于羟基磷酸铝佐剂的脑膜炎球菌fHBP抗原的免疫原性组合物，其中(i)所述脑膜炎球菌fHBP抗原的等电点高于所述佐剂的零电荷点，和(ii)组合物的pH在所述佐剂的零电荷点的1.2个pH单位内。所述组合物可包含将pH维持在所述佐剂的PZC的1.2个pH单位内的缓冲液。
本发明尤其可用于有关包含多种fHBP变体的组合物的方面。如上所述，以前报道此类组合物不能良好吸附于含磷酸基团的铝佐剂。
因此，本发明提供将两种不同的脑膜炎球菌fHBP抗原吸附于羟基磷酸铝佐剂的方法，其中发生两种fHBP抗原吸附的pH均等于或低于该羟基磷酸铝的零电荷点。吸附的fHBP抗原可用于广谱脑膜炎球菌免疫。可以任何合适的顺序混合fHBP抗原和羟基磷酸铝(及缓冲液)。
本发明还提供包含两种不同fHBP抗原的免疫原性组合物，两种抗原吸附于羟基磷酸铝佐剂。所述组合物通常包含在吸附期间和/或吸附之后控制pH的缓冲液。
本发明还提供包含两种不同的脑膜炎球菌fHBP抗原和羟基磷酸铝佐剂的免疫原性组合物，其中所述羟基磷酸铝佐剂的零电荷点高于所述免疫原性组合物的pH。
本发明还提供将两种不同的脑膜炎球菌fHBP抗原吸附于羟基磷酸铝佐剂的方法，其中(i)所述两种脑膜炎球菌fHBP抗原具有5.0到7.0的等电点，(ii)所述羟基磷酸铝佐剂具有5.0到7.0的零电荷点，和(iii)所述两种fHBP抗原的吸附均发生在5.0到7.0的pH下。可在有缓冲液存在下进行吸附。
本发明还提供包含两种不同的脑膜炎球菌fHBP抗原的免疫原性组合物，其中两种抗原均吸附于羟基磷酸铝佐剂，其中(i)所述两种脑膜炎球菌fHBP抗原具有5.0到7.0的等电点，(ii)所述羟基磷酸铝佐剂具有5.0到7.0的零电荷点。所述组合物通常包含将pH维持于5.0到7.0的缓冲液。
本发明还提供将两种不同脑膜炎球菌fHBP抗原吸附于羟基磷酸铝佐剂的方法，其中(i)所述脑膜炎球菌fHBP抗原的等电点均高于所述佐剂的零电荷点，和(ii)各抗原发生吸附的pH在所述佐剂的零电荷点的1.2个pH单位内。优选通过包含将pH维持在所述佐剂的零电荷点的1.2个pH单位内的缓冲液来实现吸附期间的pH。
本发明还提供包含两种不同的脑膜炎球菌fHBP抗原的免疫原性组合物，其中两种抗原均吸附于羟基磷酸铝佐剂，其中(i)各脑膜炎球菌fHBP抗原的等电点高于所述佐剂的零电荷点，和(ii)所述组合物的pH在所述佐剂的零电荷点的1.2个pH单位内。
本发明还提供通过任何上述方法制备的免疫原性组合物。
在本发明的组合物中，所述或各fHBP抗原优选至少85％吸附，如下文进一步详述。
因子H结合蛋白
本发明组合物包含至少一种脑膜炎球菌因子H结合蛋白(fHBP)。如果组合物包含两种不同的fHBP，优选参考文献8中公开的不同变体。不同fHBP会产生具有不完全交叉反应性并提供针对脑膜炎球菌的更广谱菌株覆盖度的不同免疫应答。
如果组合物包含一种fHBP变体，其可包含以下之一：
(a)包含第一氨基酸序列的第一多肽，其中所述第一氨基酸序列包含的氨基酸序列(i)与SEQ ID NO：1具有至少a％序列相同性和/或(ii)由SEQ ID NO：1的至少x个毗连氨基酸的片段构成；
(b)包含第二氨基酸序列的第二多肽，其中所述第二氨基酸序列包含的氨基酸序列(i)与SEQ ID NO：2具有至少b％序列相同性和/或(ii)由SEQ ID NO：2的至少y个毗连氨基酸的片段构成；
(c)包含第三氨基酸序列的第三多肽，其中所述第三氨基酸序列包含的氨基酸序列(i)与SEQ ID NO：3具有至少c％序列相同性和/或(ii)由SEQ ID NO：3的至少z个毗连氨基酸的片段构成。
如果组合物包含两种不同的脑膜炎球菌fHBP抗原，其可包含以下组合：(i)以上定义的第一和第二多肽；(ii)以上定义的第一和第三多肽；或(iii)以上定义的第二和第三多肽。优选第一和第三多肽的组合。优选所述两种不同脑膜炎球菌fHBP抗原各自具有5.0到7.0的pI的组合，特别是当它们的pI均在5.0到6.0或在5.2到6.2的范围内时。
如果组合物包含两种不同脑膜炎球菌fHBP抗原，虽然这些抗原可共有一些序列，但所述第一、第二和第三多肽具有不同fHBP氨基酸序列。
给予对象时，包含所述第一氨基酸序列的多肽引发的抗体应答包含结合野生型脑膜炎球菌蛋白的抗体，所述蛋白具有新生氨基酸序列SEQ ID NO：20(MC58)。在一些实施方式中，这些抗体的一些或全部不与具有新生氨基酸序列SEQ ID NO：21的野生型脑膜炎球菌蛋白或具有新生氨基酸序列SEQ ID NO：22的野生型脑膜炎球菌蛋白结合。
给予对象时，包含所述第二氨基酸序列的多肽引发的抗体应答包含结合野生型脑膜炎球菌蛋白的抗体，所述蛋白具有新生氨基酸序列SEQ ID NO：21(2996)。在一些实施方式中，这些抗体的一些或全部不与具有新生氨基酸序列SEQ ID NO：20的野生型脑膜炎球菌蛋白或具有新生氨基酸序列SEQ ID NO：22的野生型脑膜炎球菌蛋白结合。
给予对象时，包含所述第三氨基酸序列的多肽引发的抗体应答包含结合野生型脑膜炎球菌蛋白的抗体，所述蛋白具有新生氨基酸序列SEQ ID NO：22(M1239)。在一些实施方式中，这些抗体的一些或全部不与具有新生氨基酸序列SEQ ID NO：20的野生型脑膜炎球菌蛋白或具有新生氨基酸序列SEQ ID NO：21的野生型脑膜炎球菌蛋白结合。
在一些实施方式中，SEQ ID NO：1的至少x个毗连氨基酸的片段不同时存在于SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3内。类似地，SEQ ID NO：2的至少y个毗连氨基酸的片段不同时存在于SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3内。类似地，SEQ ID NO：3的至少z个毗连氨基酸的片段不同时存在于SEQ ID NO：1或SEQID NO：2内。在一些实施方式中，SEQ ID NO：1到3之一的所述片段作为毗连序列与另两个SEQ ID NO比对时，该片段与另两个SEQ ID NO各自的相同性低于75％，例如低于70％、低于65％、低于60％等。
a的值是至少80，例如82、84、86、88、90、92、94、95、96、97、98、99或更高。b的值是至少80，例如82、84、86、88、90、92、94、95、96、97、98、99或更高。c的值是至少80，例如82、84、86、88、90、92、94、95、96、97、98、99或更高。a、b和c的值可以相同或不同。在一些实施方式中，a、b和c相同。
x的值是至少7，例如8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、225、250。y的值是至少7，例如8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、225、250。z的值是至少7，例如8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、225、250。x、y和z的值可以相同或不同。在一些实施方式中，x、y和z相同。
片段优选包含SEQ ID NO：序列各自的表位。其它有用的片段缺少SEQID NO：各自的C-末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)和/或N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)，而保留它们的至少一个表位。
与SEQ ID NO：1、2或3相比，本发明所用氨基酸序列包含一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10等)保守性氨基酸取代，即，用具有相关侧链的另一氨基酸取代某一氨基酸。遗传编码的氨基酸通常分为四个家族：(1)酸性，即，天冬氨酸、谷氨酸；(2)碱性，即，赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性，即，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；和(4)不带电荷的极性氨基酸，即，甘氨酸、天冬酰胺、谷胺酰胺、胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。有时将苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸一起称为芳族氨基酸。通常，这些家族中的单个氨基酸的取代不会对生物活性产生重要影响。相对于参比序列，该多肽可包含一个或多个(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10等)单氨基酸缺失。相对于参比序列，该多肽还可包含一个或多个(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10等)插入(如1、2、3、4或5个氨基酸)。
有用的第一氨基酸序列与SEQ ID NO：1具有至少85％相同性(例如＞95％或100％)。另一有用的第一氨基酸序列与SEQ ID NO：4具有至少95％相同性(例如＞98％或100％)。另一有用的第一氨基酸序列与SEQ IDNO：5具有至少95％相同性(例如＞98％或100％)。
有用的第三氨基酸序列与SEQ ID NO：3具有至少85％相同性(例如＞95％或100％)。另一有用的第三氨基酸序列与SEQ ID NO：6具有至少95％相同性(例如＞98％或100％)。
包含基于SEQ ID NO：4和6的第一和第三序列(或它们的接近变体)的混合物的组合尤其有用。另一有用的组合包含基于SEQ ID NO：5和6的第一和第三序列(或它们的接近变体)的混合物。因此，组合物可包含含有氨基酸序列SEQ ID NO：23的多肽和含有氨基酸序列SEQ ID NO：25的多肽。
如果组合物包含两种脑膜炎球菌fHBP抗原，其可以是二价fHBP组合物，或者可具有多于两种的不同fHBP抗原，例如在三价或四价fHBP组合物中。
在一些实施方式中，一种或多种fHBP多肽发生脂质化，例如在N-末端半胱氨酸处。然而，在其它实施方案中，一种或多种fHBP多肽未脂质化。对于脂质化的fHBP，连接于半胱氨酸的脂质通常包含棕榈酰残基，例如三棕榈酰基-S-甘油基-半胱氨酸(Pam3Cys)、二棕榈酰基-S-甘油基半胱氨酸(Pam2Cys)、N-乙酰基(二棕榈酰基-S-甘油基半胱氨酸)，等。成熟的脂质化fHBP序列的例子是SEQ ID NO：23(包括SEQ ID NO：4)、SEQ ID NO：24(包括SEQ ID NO：5)和SEQ ID NO：25(包括SEQ ID NO：6)。
给予fHBP优选引发能结合由氨基酸序列SEQ ID NO：1、2或3构成的脑膜炎球菌多肽的抗体。本发明所用的优选fHBP抗原可在给予对象后引发杀菌性的抗脑膜炎球菌抗体。
fHBP多肽的总量通常在1到500微克(μg)/剂，例如60到200微克/剂或120到500μg/毫升(ml)。人疫苗剂量中各fHBP多肽的常见用量是20、40、50、60、80、100或200μg。因此，可将疫苗配制成包含该用量的各fHBP。
如果组合物包含不同的脑膜炎球菌fHBP抗原，这些抗原可以作为上述分离的多肽存在(例如，第一和第二多肽)，或者它们可作为一种“杂合”多肽的部分存在，即，至少两种(例如，2、3、4、5或更多)fHBP抗原表达为一条多肽链，如参考文献12中公开的脑膜炎球菌抗原。
杂合多肽可包含以下两个或三个：以上定义的第一氨基酸序列、以上定义的第二氨基酸序列和/或以上定义的第三氨基酸序列。
杂合多肽可以通式NH2-A-{-X-L-}n-B-COOH表示，其中：X是以上定义的第一、第二或第三氨基酸序列；L是任选的接头氨基酸序列；A是任选的N末端氨基酸序列；B是任选的C末端氨基酸序列；n是2或更大的整数(如2、3、4、5、6等)。n通常是2或3，并且存在第一、第二和第三氨基酸序列中的至少两个。
如果野生型形式中-X-部分具有前导肽序列，那么在杂合蛋白中可以包含或者略去该序列。在一些实施方式中，前导肽可缺失，除非-X-部分的前导肽位于杂合蛋白的N-末端，即X1的前导肽会保留，但X2...Xn的前导肽会略去。这相当于删除所有前导肽并使用X1的前导肽作为-A-部分。
对于{-X-L-}的各个n，接头氨基酸序列-L-可存在或不存在。例如，当n＝2时，杂合体可以是NH2-X1-L1-X2-L2-COOH、NH2-X1-X2-COOH、NH2-X1-L1-X2-COOH、NH2-X1-X2-L2-COOH等。接头氨基酸序列-L-一般较短(如20个或更少的氨基酸，即20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1)。例子包括有利于克隆的短肽序列，聚-甘氨酸接头(即包含Glyn，其中n＝2、3、4、5、6、7、8、9、10或更高)，组氨酸标签(即Hisn，其中n＝3、4、5、6、7、8、9、10或更高)。其它合适的接头氨基酸序列对本领域技术人员是显而易见的。有用的接头是GSGGGG(SEQ ID NO：15)或GSGSGGGG(SEQ ID NO：16)，其中Gly-Ser二肽由BamHI限制位点形成，因而有助于克隆和操作，(Gly)4四肽是常用的多聚甘氨酸接头。另一合适的接头，特别用作最终Ln的是Leu-Glu二肽。
-A-是任选的N-末端氨基酸序列。该序列一般较短(例如，40个或更少的氨基酸，即40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1个)。例子包括指导蛋白质运输的前导序列，或有利于克隆或纯化的短肽序列(例如，组氨酸标签，即Hisn，其中n＝3、4、5、6、7、8、9、10或更多)。其它合适的N-末端氨基酸序列对本领域技术人员是显而易见的。如果X1缺少其自身的N-末端甲硫氨酸，-A-优选提供N-末端甲硫氨酸的寡肽(例如，具有1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸)，如Met-Ala-Ser或单个Met残基。
-B-是任选的C-末端氨基酸序列。该序列一般较短(例如，40个或更少的氨基酸，即39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1个)。例子包括指导蛋白质运输的序列，有利于克隆或纯化的短肽序列(例如，包含组氨酸标签，即Hisn，其中n＝3、4、5、6、7、8、9、10或更多，例如SEQ ID NO：17)，或增强蛋白质稳定性的序列。其它合适的C-末端氨基酸序列对本领域技术人员是显而易见的。
羟基磷酸铝佐剂和吸附
本发明组合物包含羟基磷酸铝佐剂。为方便起见，此类佐剂常称为“磷酸铝”[13]，尽管羟基磷酸盐因存在羟基而与严格的AlPO4不同。例如，3164cm-1的IR光谱带(例如，当加热至200℃时)表明存在结构性羟基。羟基磷酸铝佐剂可含有少量硫酸盐(即，羟基磷酸硫酸铝)，还可包含钠和/或氯离子[14]。可通过沉淀获得该佐剂。
羟基磷酸铝不是化学计量的化合物，其羟基和磷酸组成取决于沉淀反应物和条件。该羟基/磷酸盐组成影响该佐剂的零电荷点(PZC；表面净电荷为0时的pH)。PZC与磷酸根取代羟基的程度(P/Al摩尔比)逆相关。磷酸根阴离子取代羟基阴离子降低PZC。因此，可通过改变溶液中游离磷酸根离子的浓度(磷酸根越多＝PZC酸性越高)或通过添加缓冲液，例如组氨酸缓冲液(使得PZC碱性更高)来改变PZC。本发明所用羟基磷酸铝的PZC通常在5.0-6.6之间，例如5.4到6.2。
羟基磷酸铝佐剂的P/Al摩尔比通常为0.3-1.2，优选为0.8-1.2，或0.85-1.0，更优选约0.9。至少0.5的P/Al摩尔比可提供老化特性更好的佐剂。
羟基磷酸铝通常是无定形的(即，对X-射线是无定形的)。其通常是颗粒状的(例如在透射电子显微照片上所见的板状形态)。板的典型直径是10-100nm，这些形成大小为0.5-20μm(例如，约1-10μm)的聚集体。据报道，pH 7.4时羟基磷酸铝佐剂的吸附容量为0.7-1.5毫克(mg)蛋白质/mgAl+++。
典型的佐剂是P/Al摩尔比为0.84-0.92的无定形的羟基磷酸铝，该佐剂可包含0.6mg Al3+/ml。
给予患者的组合物中Al+++的浓度优选小于5mg/ml，例如≤4mg/ml、≤3mg/ml、≤2mg/ml、≤1mg/ml等。优选范围是0.2-1mg/ml。优选最大Al+++浓度是0.85mg/剂。
本发明组合物中至少85％(重量计)的fHBP吸附于羟基磷酸铝，例如≥90％、≥95％或甚至100％。可通过改变配制期间的盐浓度和/或pH来控制吸附fHBP的比例，例如，通常较高的NaCl浓度能降低fHBP吸附。任何制剂的吸附量取决于参数组合，包括配制期间佐剂的PZC、盐浓度和pH、佐剂浓度、抗原浓度和抗原的pI。不难评估这些参数各自对吸附的影响。可通过比较组合物中fHBP抗原的总量(例如，吸附之前检测的，或通过解吸吸附抗原检测的)与离心后维持在上清液中的含量来测定吸附程度(例如，参见参考文献15的第4章)。离心后上清液中不含可检测的抗原表明发生总体吸附，即，所有的fHBP在含有不可溶佐剂及其吸附的内含物的沉淀物中。
已知在一种疫苗中利用不同铝盐的混合物，例如，参见参考文献16。虽然同时包含羟基磷酸铝和氢氧化铝的佐剂可用于fHBP，但优选组合物不含任何氢氧化铝佐剂，因为如上所述，其能降解可与fHBP混合的某些抗原(特别是偶联的细菌荚膜糖)。
对于第一方面，本发明人发现通过确保发生吸附的pH等于或低于佐剂的PZC，fHBP蛋白可有效吸附于羟基磷酸铝佐剂。因此，可选择PZC等于或高于所需的制剂pH的佐剂，或者可选择等于或低于所需佐剂的PZC的pH。在这些条件下混合佐剂和抗原，并进行吸附。pH不应低至阻止吸附或造成fHBP不可逆地变性。因此，吸附最好在PZC的2个pH单位内进行(最好在1.2个pH单位内)。
对于第二方面，本发明人发现通过利用等电点在5.0到7.0的脑膜炎球菌fHBP抗原和零电荷点也在5.0到7.0的羟基磷酸铝佐剂，fHBP蛋白可有效吸附于羟基磷酸铝佐剂。吸附在pH 5.0-7.0发生，可通过包含缓冲液将pH维持在5.0-7.0来维持pH(吸附之前、期间和/或之后)。在pH 5.0-7.0的范围内，优选的小范围是5.0-6.0。该第二方面不适于所有fHBP，因为一些(例如，SEQ ID NO：20)的pI在所需范围外，但不难选择合适的fHBP。
可通过诸如等电聚焦等技术，凭经验测定fHBP的等电点。然而，更方便的是，所述等电点是理论等电点。可利用参考文献17描述的氨基酸的pKa值，例如利用相关ExPASy工具[18]计算该理论等电点。例如，新生氨基酸序列SEQ ID NO：20的预计pI为7.72，而SEQ ID NO：21和22的预计pI为5.87和6.15。成熟序列SEQ ID NO：23、24和25(分别包含SEQ IDNO：4、5和6)均分别具有相关范围内的预计pI：5.46、5.72和5.86。对阻断N-末端胺(例如脂质化时)的校正将pI降低约0.1，但SEQ ID NO：23、24和25仍具有5.0-6.0范围内的预计pI。优选其中不同的脑膜炎球菌fHBP抗原各自的pI在5.0-7.0的组合，特别是当它们均具有5.0-6.0或5.2-6.2的pI时。
pI范围合适的fHBP抗原的有用组合可包含基于SEQ ID NO：4和6(或它们的接近变体)的第一和第三序列的混合物或基于SEQ ID NO：5和6(或它们的接近变体)的第一和第三序列的混合物。此类抗原配对的其它细节如上所述。例如，SEQ ID NO：23和25的组合尤其有用，这两种蛋白质可脂质化(如上所述)。
对于第三方面，本发明人发现通过确保吸附在羟基磷酸铝佐剂的PZC的1.2个pH单位内进行，pI高于所述PZC的脑膜炎球菌fHBP抗原可有效吸附。吸附可在高于或低于佐剂的PZC的pH下进行，尽管该pH不应是极端pH从而使fHBP不可逆地变性。优选通过包含将pH维持在佐剂的PZC的1.2个pH单位内的缓冲液来实现吸附期间的pH。如果pH在1.2个pH单位内，其可在1个pH单位内或更低，例如0.8个pH单位内、0.6个pH单位内、0.5个pH单位内。
混合的顺序
如上所述，本发明提供将脑膜炎球菌fHBP抗原吸附于羟基磷酸铝佐剂的方法。可通过分别混合所有组分或预先混合两种组分再将预混合物与第三组分混合，以任何合适的顺序混合一种或多种fHBP抗原、羟基磷酸铝和任何缓冲液。
因此，例如，在一个实施方式中，本发明提供制备包含脑膜炎球菌fHBP抗原的免疫原性组合物的方法，包括混合脑膜炎球菌fHBP抗原和羟基磷酸铝佐剂的步骤，其中(i)所述羟基磷酸铝佐剂具有零电荷点；和(ii)该混合步骤在低于所述零电荷点的pH下进行，从而所述fHBP抗原吸附于所述佐剂。
在另一实施方式中，本发明提供制备包含脑膜炎球菌fHBP抗原的免疫原性组合物的方法，包括混合脑膜炎球菌fHBP抗原和羟基磷酸铝佐剂的步骤，其中(i)所述羟基磷酸铝佐剂具有零电荷点；和(ii)所述组合物具有低于所述零电荷点的pH，从而所述fHBP抗原吸附于所述佐剂。
在另一实施方式中，本发明提供制备包含脑膜炎球菌fHBP抗原的免疫原性组合物的方法，包括以下步骤：(i)提供包含脑膜炎球菌fHBP抗原并具有一定pH的水性组合物；(ii)提供具有零电荷点高于所述pH的羟基磷酸铝佐剂；和(iii)混合该水性组合物与羟基磷酸铝佐剂从而得到所述免疫原性组合物。
在另一实施方式中，本发明提供制备包含脑膜炎球菌fHBP抗原的免疫原性组合物的方法，包括以下步骤：(i)提供包含羟基磷酸铝佐剂并具有一定pH的水性组合物，其中所述羟基磷酸铝佐剂具有的零电荷点高于所述pH；和(ii)混合该水性组合物与脑膜炎球菌fHBP抗原从而得到所述免疫原性组合物。
在另一实施方式中，本发明提供制备包含脑膜炎球菌fHBP抗原的免疫原性组合物的方法，包括以下步骤：(i)提供具有一定pH的第一水性组合物；(ii)提供包含脑膜炎球菌fHBP抗原和羟基磷酸铝佐剂的第二水性组合物，所述佐剂具有的零电荷点高于所述pH；和(iii)混合所述第一和第二水性组合物从而得到所述免疫原性组合物。
在另一实施方式中，本发明提供制备包含脑膜炎球菌fHBP抗原的免疫原性组合物的方法，包括以下步骤：(i)提供具有一定pH的第一水性组合物；(ii)提供包含脑膜炎球菌fHBP抗原的第二水性组合物；(iii)提供具有的零电荷点高于所述pH的羟基磷酸铝佐剂；和(iv)以任何顺序混合所述第一水性组合物、第二水性组合物和羟基磷酸铝从而得到所述免疫原性组合物。
本发明还提供将两种不同脑膜炎球菌fHBP抗原吸附于羟基磷酸铝佐剂的方法，其中两种fHBP抗原在等于或低于所述羟基磷酸铝的零电荷点的pH下进行吸附。同样地，可以任何合适的顺序混合fHBP抗原、羟基磷酸铝和缓冲液。
因此，在一个实施方式中，所述两种不同fHBP抗原分别在合适的pH下吸附于羟基磷酸铝，然后混合这两种吸附的抗原。
在另一实施方式中，两种不同的fHBP抗原彼此混合，然后将混合物加入到羟基磷酸铝中，其中所述羟基磷酸铝处于适合吸附的pH或在加入该混合物后调节pH。
在另一实施方式中，将两种不同fHBP抗原依次加入到羟基磷酸铝中，其中所述羟基磷酸铝处于适合吸附的pH或在加入一种或两种fHBP抗原后调节pH。
在另一实施方式中，将一种fHBP与羟基磷酸铝混合，然后将另一fHBP抗原加入到该混合物中，其中所述羟基磷酸铝在加入第一fHBP抗原前即处于适合吸附的pH，或者在加入第一fHBP抗原后调节pH，或者在加入第二fHBP抗原前调节pH，或者在加入第二fHBP抗原后调节pH。
对于本发明的所有实施方式，本领域技术人员可利用这些和其它可能性。
替代性佐剂
作为利用羟基磷酸铝佐剂的替代方法，本发明还可利用免疫刺激性寡核苷酸和聚阳离子性聚合物的颗粒复合物，如“IC31”。以上定义可相应改动。例如，本发明提供包含脑膜炎球菌fHBP抗原和免疫刺激性寡核苷酸与聚阳离子性聚合物的颗粒复合物的免疫原性组合物。本发明还提供包含两种不同脑膜炎球菌fHBP抗原和免疫刺激性寡核苷酸与聚阳离子性聚合物的颗粒复合物的免疫原性组合物。
已知免疫刺激性寡核苷酸是有用的佐剂。它们常含有CpG基序(含有连接于鸟苷的非甲基化胞嘧啶的二核苷酸序列)，它们的佐剂作用见参考文献19-24所讨论。与双链RNA一样，含TpG基序、回文序列、多个连续胸苷核苷酸(例如，TTTT)、多个连续胞嘧啶核苷酸(例如，CCCC)或多聚(dG)序列的寡核苷酸也是已知的免疫刺激剂。虽然本发明可利用各种免疫刺激性寡核苷酸，但优选利用含有脱氧肌苷和/或脱氧尿苷的寡聚脱氧核苷酸，最好是含有脱氧尿苷和脱氧胞嘧啶的寡聚脱氧核苷酸。含有肌苷的寡聚脱氧核苷酸可包含CpI基序(含有连接于肌苷的胞嘧啶的二核苷酸序列)。寡聚脱氧核苷酸可包含多于1个(例如，2、3、4、5、6或更多)CpI基序，这些基序可直接重复(例如，包含序列(CI)x，其中x是2、3、4、5、6或更多)或彼此隔开(例如，包含序列(CIN)x，其中x是2、3、4、5、6或更多，其中各N独立代表一个或多个核苷酸)。胞嘧啶残基最好未甲基化。
寡核苷酸通常具有10-100个核苷酸，例如15-50个核苷酸、20-30个核苷酸、或25-28个核苷酸。其通常是单链的。
寡核苷酸可仅包含天然核苷酸、仅包含非天然核苷酸或二者的混合。例如，其可包含一个或多个硫代磷酸酯连接键和/或一个或多个核苷酸可具有2′-O-甲基修饰。
优选的寡核苷酸是包含26-聚体序列5′-(IC)13-3′(SEQ ID NO：18)的单链脱氧核苷酸。该寡聚脱氧核苷酸与聚阳离子性聚合物形成稳定的复合物，从而得到良好的佐剂。
所述聚阳离子性聚合物优选聚阳离子性肽。该聚合物可包含一个或多个亮氨酸氨基酸残基和/或一个或多个赖氨酸氨基酸残基。该聚合物可包含一个或多个精氨酸氨基酸残基。其可包含这些氨基酸其中一个的至少一个直接重复，例如一个或多个Leu-Leu二肽序列、一个或多个Lys-Lys二肽序列或一个或多个Arg-Arg二肽序列。其可包含至少一个(优选多个，例如2或3)Lys-Leu二肽序列和/或至少一个(优选多个，例如2或3)Lys-Leu-Lys三肽序列。
该肽可包含序列R1-XZXZxXZX-R2，其中：x是3、4、5、6或7；各X独立为带正电荷的天然和/或非天然氨基酸残基；各Z独立为氨基酸残基L、V、I、F或W；R1和R2独立选自下组：-H、-NH2、-COCH3或-COH。在一些实施方式中，X-R2可以是该肽C-末端氨基酸残基的酰胺、酯或硫酯。
聚阳离子性肽通常具有5-50个氨基酸，例如6-20个氨基酸、7-15个氨基酸或9-12个氨基酸。
肽可包含仅包含天然氨基酸、仅包含非天然氨基酸或二者的混合。其可包含L-氨基酸和/或D-氨基酸。常见L-氨基酸。
肽可具有天然N-末端(NH2-)或修饰的N-末端，例如羟基、乙酰基等。肽可具有天然C-末端(-COOH)或修饰的C-末端，例如羟基、乙酰基等。此类修饰可提高肽的稳定性。
本发明所用的优选肽是所含均是L-氨基酸的11-聚体KLKLLLLLKLK(SEQ ID NO：19)。N-末端可脱氨基，C-末端可羟基化。优选的肽是所含均是L-氨基酸的H-KLKL5KLK-OH。该寡肽与免疫刺激性寡核苷酸形成稳定的复合物，从而得到良好佐剂。
免疫刺激性寡核苷酸和聚阳离子性聚合物的最优选混合物是TLR9激动剂，称为IC31TM[25-27]，其是寡聚脱氧核苷酸SEQ ID NO：18和聚阳离子性寡肽SEQ ID NO：19的吸附复合物。
可以各种比例混合寡核苷酸和寡肽，但它们通常以摩尔过量与肽混合。摩尔过量可以是至少5∶1，例如10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1等。约25∶1的摩尔比是理想的[28，29]。以此过量比例混合可导致寡核苷酸和寡肽之间形成不可溶的颗粒复合物。该复合物可与水包油乳液混合。
通常可在水性条件下混合寡核苷酸和寡肽，例如可以所需比例混合寡核苷酸溶液和寡肽溶液。通过将干燥的(例如，冻干)材料溶解于水或缓冲液中以形成随后可混合的储备溶液来制备两种溶液。可采用参考文献30公开的方法分析复合物。
聚精氨酸和CpG寡聚脱氧核苷酸类似地形成可用的复合物[31]。
复合物可维持在水性悬液中，例如水或缓冲液中。用于复合物的典型缓冲液是磷酸缓冲液(例如，磷酸缓冲盐水)、Tris缓冲液、Tris/山梨醇缓冲液、硼酸盐缓冲液、琥珀酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、组氨酸缓冲液等。作为替代方法，有时可冻干复合物。
可利用各种浓度的寡核苷酸和聚阳离子性聚合物，例如参考文献25、28或29中所用的任何浓度。例如，聚阳离子性寡肽浓度可以是1100μM、1000μM、350μM、220μM、200μM、110μM、100μM、11μM、10μM等。寡核苷酸的浓度可以是44nM、40nM、14nM、4.4nM、4nM等。聚阳离子性寡肽浓度通常小于2000nM。SEQ ID NO：18和19以摩尔比1∶25混合，因此在本发明的三种实施方式中，以mg/mL计的浓度可以是0.311和1.322、或0.109和0.463、或0.031和0.132。
在包括免疫刺激性寡核苷酸和聚阳离子性聚合物的颗粒复合物的本发明实施方式中，如果该复合物是唯一佐剂，例如组合物不含铝盐且不含水包油乳液，则是有用的。
在特定的实施方式中，本发明提供包含以下的免疫原性组合物：免疫刺激性寡核苷酸和聚阳离子性聚合物的颗粒复合物(例如，IC31)；脑膜炎球菌fHBP抗原；和脑膜炎球菌血清群A、C、W135和/或Y中1、2、3或4种的偶联荚膜糖。合适的偶联糖的其它细节见下文。
其它抗原
除了fHBP抗原，本发明组合物可包含来自脑膜炎球菌或其它病原体，例如来自其它细菌，如肺炎球菌的其它抗原。
其它脑膜炎球菌抗原
除了包含一种或多种脑膜炎球菌fHBP多肽抗原外，组合物可包含一种或多种其它脑膜炎球菌多肽抗原。因此，组合物可包含选自287、NadA、NspA、HmbR、NhhA、App和/或Omp85的多肽抗原。这些抗原通常是纯化的多肽，例如重组多肽。该抗原在给予对象后宜引发杀菌性抗脑膜炎球菌抗体。如果组合物包含PorA抗原，那么在一些实施方式中，仅包含一种脑膜炎球菌PorA血清亚型。在一些实施方式中，组合物中不含脑膜炎球菌PorA外膜蛋白。
本发明的组合物可包含287抗原。脑膜炎球菌血清群B菌株MC58的公布基因组序列中包括287抗原[32]，为基因NMB2132(GenBank登录号GI：7227388；本文的SEQ ID NO：9)。此后公布了许多菌株的287抗原序列。例如，参考文献33的图5和15以及参考文献34的实施例13和图21中可见到287的等位基因形式(其中的SEQ ID 3179到3184)。287抗原的各种免疫原性片段也见诸报道。本发明所用的优选287抗原包含以下氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：9有50％或更高(例如，60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高)的相同性；和/或(b)包含SEQ ID NO：9的至少′n′个毗连氨基酸的片段，其中′n′是7或更高(例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更高)。(b)的优选片段包含SEQ ID NO：9的表位。本发明的最有用287抗原在给予对象后能引发能结合由氨基酸序列SEQ ID NO：9构成的脑膜炎球菌多肽的抗体。本发明所用的优选287抗原在给予对象后能引发杀菌性抗脑膜炎球菌抗体。
本发明组合物可包含NadA抗原。脑膜炎球菌血清群B菌株MC58的公布基因组序列中包括NadA抗原[32]，为基因NMB1994(GenBank登录号GI：7227256；本文的SEQ ID NO：10)。此后公布了许多菌株的NadA抗原序列，已充分证明该蛋白质作为奈瑟球菌粘附素的活性。NadA的各种免疫原性片段也见诸报道。本发明所用的优选NadA抗原包含以下氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：10有50％或更高(例如，60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高)的相同性；和/或(b)包含SEQ ID NO：10的至少′n′个毗连氨基酸的片段，其中′n′是7或更高(例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更高)。(b)的优选片段包含SEQ ID NO：10的表位。本发明的最有用NadA抗原在给予对象后能引发能结合由氨基酸序列SEQ ID NO：10构成的脑膜炎球菌多肽的抗体。本发明所用的优选NadA抗原在给予对象后能引发杀菌性抗脑膜炎球菌抗体。SEQ ID NO：6是一种此类片段。
本发明组合物可包含NspA抗原。脑膜炎球菌血清群B菌株MC58的公布基因组序列中包括NspA抗原[32]，为基因NMB0663(GenBank登录号GI：7225888；本文的SEQ ID NO：11)。该抗原之前从参考文献35和36中已知。此后公布了许多菌株的NspA抗原序列。NspA抗原的各种免疫原性片段也见诸报道。本发明所用的优选NspA抗原包含以下氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：11有50％或更高(例如，60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高)的相同性；和/或(b)包含SEQ ID NO：11的至少′n′个毗连氨基酸的片段，其中′n′是7或更高(例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更高)。(b)的优选片段包含SEQ ID NO：11的表位。本发明的最有用NspA抗原在给予对象后能引发能结合由氨基酸序列SEQ ID NO：11构成的脑膜炎球菌多肽的抗体。本发明所用的优选NspA抗原在给予对象后能引发杀菌性抗脑膜炎球菌抗体。
本发明组合物可包含脑膜炎球菌HmbR抗原。脑膜炎球菌血清群B菌株MC58的公布基因组序列中包括全长HmbR序列[32]，为基因NMB1668(本文的SEQ ID NO：7)。参考文献37报道了不同菌株的HmbR序列(本文的SEQID NO：8)。SEQ ID NO：7和8的长度差1个氨基酸，二者具有94.2％相同性。本发明可利用包含全长HmbR序列的多肽，但常用包含部分HmbR序列的多肽。因此，在一些实施方式中，本发明所用的HmbR序列可包含与SEQ ID NO：7有至少i％序列相同性的氨基酸序列，其中i的值是50、60、70、80、90、95、99或更高。在其它实施方式中，本发明所用的HmbR序列可包含SEQ ID NO：7的至少j个毗连氨基酸的片段，其中j的值是7、8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更高。在其它实施方式中，本发明所用的HmbR序列可包含以下氨基酸序列：(i)与SEQ ID NO：7有至少i％序列相同性；和/或(ii)包含SEQ ID NO：7的至少j个毗连氨基酸的片段。优选的至少j个氨基酸的片段包含SEQ ID NO：7的表位。此类本文常包含位于HmbR表面的氨基酸。有用的表位包括含有参与HmbR结合血红蛋白的氨基酸的那些表位，因为结合这些表位的抗体能阻断细菌结合宿主血红蛋白的能力。参考文献38研究了HmbR的拓扑学特征及其关键的功能性残基。本发明的最有用HmbR抗原在给予对象后能引发能结合由氨基酸序列SEQ ID NO：7构成的脑膜炎球菌多肽的抗体。本发明所用的优选HmbR抗原在给予对象后能引发杀菌性抗脑膜炎球菌抗体。
本发明组合物可包含NhhA抗原。脑膜炎球菌血清群B菌株MC58的公布基因组序列中包括NhhA抗原[32]，为基因NMB0992(GenBank登录号GI：7226232；本文的SEQ ID NO：12)。此后公布了许多菌株的NhhA抗原序列，例如参考文献33和39，NhhA的各种免疫原性片段已见诸报道。其也称为Hsf。本发明所用的优选NhhA抗原包含以下氨基酸序列：(a)与SEQID NO：12有50％或更高(例如，60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高)的相同性；和/或(b)包含SEQ ID NO：12的至少′n′个毗连氨基酸的片段，其中′n′是7或更高(例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更高)。(b)的优选片段包含SEQ IDNO：12的表位。本发明的最有用NhhA抗原在给予对象后能引发能结合由氨基酸序列SEQ ID NO：12构成的脑膜炎球菌多肽的抗体。本发明所用的优选NhhA抗原在给予对象后能引发杀菌性抗脑膜炎球菌抗体。
本发明组合物可包含App抗原。脑膜炎球菌血清群B菌株MC58的公布基因组序列中包括App抗原[32]，为基因NMB1985(GenBank登录号GI：7227246；本文的SEQ ID NO：13)。此后公布了许多菌株的App抗原序列。App的各种免疫原性片段也见诸报道。本发明所用的优选App抗原包含以下氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：13有50％或更高(例如，60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高)的相同性；和/或(b)包含SEQ ID NO：13的至少′n′个毗连氨基酸的片段，其中′n′是7或更高(例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更高)。(b)的优选片段包含SEQ ID NO：13的表位。本发明的最有用App抗原在给予对象后能引发能结合由氨基酸序列SEQ ID NO：13构成的脑膜炎球菌多肽的抗体。本发明所用的优选App抗原在给予对象后能引发杀菌性抗脑膜炎球菌抗体。
本发明组合物可包含Omp85抗原。脑膜炎球菌血清群B菌株MC58的公布基因组序列中包括Omp85抗原[32]，为基因NMB0182(GenBank登录号GI：7225401；本文的SEQ ID NO：14)。此后公布了许多菌株的Omp85抗原序列。Omp85的其它信息可见参考文献40和41。Omp85的各种免疫原性片段也见诸报道。本发明所用的优选Omp85抗原包含以下氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：14有50％或更高(例如，60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高)的相同性；和/或(b)包含SEQ ID NO：14的至少′n′个毗连氨基酸的片段，其中′n′是7或更高(例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更高)。(b)的优选片段包含SEQ ID NO：14的表位。本发明的最有用Omp85抗原在给予对象后能引发能结合由氨基酸序列SEQ ID NO：14构成的脑膜炎球菌多肽的抗体。本发明所用的优选Omp85抗原在给予对象后能引发杀菌性抗脑膜炎球菌抗体。
脑膜炎球菌脂低聚糖
除了包含一种或多种脑膜炎球菌fHBP多肽抗原外，组合物可包含一种或多种脑膜炎球菌脂低聚糖(LOS)抗原。脑膜炎球菌LOS是在细菌外膜的外单层中发现的基于葡糖胺的磷脂。其包含脂质A部分和核心低聚糖区域，其中脂质A部分作为膜中的疏水性锚。低聚糖核心内的异质性在不同脑膜炎球菌菌株之间产生结构和抗原性多样性，可利用这种多样性将菌株再分成12种免疫型(L1到L12)。本发明可利用任何免疫型，例如L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7和/或L8的LOS。
L2和L3α-链天然包含乳-N-新四糖(neotetraose)(LNnT)。如果本发明利用L2或L3免疫型的LOS，该LNnT可不存在。通过利用经工程改造合成α-链内LNnT四糖的能力遭破坏的突变型菌株可方便地实现该缺陷。已知可通过敲除负责相关生物合成添加的酶来实现该目的[42，43]。例如，敲除LgtB酶阻止添加LNnT的末端半乳糖以及阻止下游添加该α-链的末端唾液酸。敲除LgtA酶阻止添加LNnT的N-乙酰基-葡糖胺以及下游的添加。LgtA敲除可伴随LgtC敲除。类似地，敲除LgtE和/或GalE酶阻止添加内部半乳糖，敲除LgtF阻止将葡萄糖添加入HepI残基。可单用或联用任何这些敲除来破坏L2、L3、L4、L7或L9免疫型菌株中的LNnT四糖。优选至少敲除LgtB，因为这在除去LNnT表位的同时提供保留有用免疫原性的LOS。
除了或替代突变来破坏LNnT表位，敲除galE基因也提供有用的修饰的LOS，可类似敲除脂质A脂肪转移酶基因[44]。可从LOS除去至少一种一级O-连接脂肪酸[45]。还可利用每个LOS分子的二级酰基链数量减少的LOS[46]。LOS通常至少包含GlcNAc-Hep2磷酸乙醇胺-KDO2-脂质A结构[47]。LOS可包含GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc三糖而缺乏LNnT四糖。
本发明组合物可包含各种形式的LOS。可利用其本身的纯化形式。可将其偶联于载体蛋白。当LOS偶联时，可经LOS的脂质A部分或通过任何其它合适的部分，例如其KDO残基进行偶联。如果LOS缺乏脂质A部分，则需要此类替代性连接。可从，例如参考文献45、47、48、49等知晓LOS的偶联技术。下文讨论了对于这些偶联有用的载体蛋白，例如细菌毒素，如白喉或破伤风毒素或其类毒素或突变体。
LOS可来自具有参考文献50所述的固定(即，无相变异)LOS免疫型的菌株(例如，遗传学工程改造的脑膜炎球菌菌株)。例如，L2和L3LOS免疫型可以是固定的。与原始野生型菌株相比，此类菌株在免疫型之间的转换率降低了2-倍以上(甚至＞50倍)。参考文献50公开了如何通过修饰lgtA和/或lgtG基因产物获得该结果。
LOS可在与其庚糖II残基相连的GlcNac残基上发生O-乙酰化，例如L3[51]。
免疫原性组合物可包含多于一种类型的LOS，例如脑膜炎球菌免疫型L2和L3的LOS。例如，可采用参考文献52中公开的LOS组合。
LOS抗原在给予对象后可优选引发杀菌性抗脑膜炎球菌抗体。
然而，本发明的优选组合物不含脑膜炎球菌脂低聚糖。
脑膜炎球菌荚膜糖抗原
除了包含一种或多种脑膜炎球菌fHBP多肽抗原外，组合物可包含一种或多种脑膜炎球菌荚膜糖偶联物。本发明组合物可包含脑膜炎球菌血清群A、C、W135和Y中1、2、3或4种的荚膜糖的一种或多种偶联物，例如A+C、A+W135、A+Y、C+W135、C+Y、W135+Y、A+C+W135、A+C+Y、A+W135+Y、A+C+W135+Y等。包含偶联的血清群C荚膜糖的组合物是有用的，包含所有4种血清群A、C、W135和Y的糖的组合物是理想的。
血清群A脑膜炎球菌的荚膜糖是(α1→6)-连接的N-乙酰基-D-甘露糖胺-1-磷酸酯的均聚物，其中在C3和C4位有部分O-乙酰化。C-3位的乙酰化可以是70-95％。用于纯化糖的条件可导致脱-O-乙酰化(例如在碱性条件下)，但可用于保留该C-3位的OAc。在一些实施方式中，血清群A糖中至少50％(例如，至少60％、70％、80％、90％、95％或更多)的甘露糖胺残基在C-3位被O-乙酰化。乙酰基可被封闭基团替代以避免水解[53]，这种修饰的糖仍然是本发明涵义内的血清群A糖。
血清群C荚膜糖是(α2→9)-连接的唾液酸(N-乙酰基神经氨酸，或“NeuNAc”)的均聚物。该糖结构写作→9)-Neu p NAc 7/8 OAc-(α2→。大多数血清群C菌株在唾液酸残基的C-7和/或C-8处具有O-乙酰基，但约15％的临床分离物缺乏这些O-乙酰基[54、55]。OAc基团的存在与否产生了独特的表位，与该糖结合的抗体的特异性可影响其针对O-乙酰化(OAc+)和脱-O-乙酰化(OAc-)菌株的杀菌活性[56-58]。本发明所用血清群C糖可从OAc+或OAc-菌株制得。获得许可的MenC偶联物疫苗同时包含OAc-(NEISVAC-CTM)和OAc+(MENJUGATETM和MENINGITECTM)糖。在一些实施方式中，用于生产血清群C偶联物的菌株是OAc+菌株，例如血清型16，血清亚型P1.7a，1等。因此，可使用C:16:P1.7a，1 OAc+菌株。也可使用血清亚型P1.1的OAc+菌株，例如C11菌株。
血清群W135糖是唾液酸-半乳糖二糖单元的聚合物。类似于血清群C糖，其具有可变的O-乙酰化，但是在唾液酸7和9位[59]。该结构写作：→4)-D-Neup5Ac(7/9OAc)-α-(2→6)-D-Gal-α-(1→。
血清群Y糖类似于血清群W135糖，除了二糖重复单元包括葡萄糖而非半乳糖。类似于血清群W135，其在唾液酸7和9位具有可变的O-乙酰化[59]。血清组Y的结构写作：→4)-D-Neup5Ac(7/9OAc)-α-(2→6)-D-Gal-α-(1→。
本发明所用的糖可如上所述是O-乙酰化的(例如，O-乙酰化模式与天然荚膜糖中所见相同)，或者它们可在糖环的一个或多个位置部分或完全脱-O-乙酰化，或者相比于天然荚膜糖它们可以是超-O-乙酰化的。
偶联物中的糖部分可包括由脑膜炎球菌制备的全长糖，和/或可包括全长糖的片段，即，比细菌中所见天然荚膜糖短的糖。因此，糖可以解聚，解聚发生在糖纯化期间或者之后、但在偶联之前。解聚可降低糖链长度。一种解聚方法包含使用过氧化氢。将过氧化氢加入糖中(例如，产生1％的H2O2终浓度)，然后温育混合物(例如在约55℃)直到实现所需的链长降低。另一解聚方法包含酸水解。其它解聚方法是本领域已知的。可通过任何这些解聚方法获得用于制备本发明所用偶联物的糖。可采用解聚提供对于免疫原性的最佳链长和/或出于糖的物理可操作性而降低链长。在一些实施方式中，糖具有以下范围的平均聚合度(Dp)：A＝10-20；C＝12-22；W135＝15-25；Y＝15-25。对于所有血清群，分子量而非Dp的有用范围是：＜100kDa；5kDa-75kDa；7kDa-50kDa；8kDa-35kDa；12kDa-25kDa；15kDa-22kDa。
在一些实施方式中，脑膜炎球菌血清群A、C、W135和Y各自的糖的平均分子量可高于50kDa，例如≥75kDa，≥100kDa，≥110kDa，≥120kDa，≥130kDa等[60]，甚至最高达1500kDa，具体是通过MALLS测定。例如：MenA糖可以是50-500kDa，如60-80kDa；MenC糖可以是100-210kDa；MenW135糖可以是60-190kDa，如120-140kDa；和/或MenY糖可以是60-190kDa，如150-160kDa。
组合物中每种血清群的脑膜炎球菌糖的质量通常为1μg到20μg，例如每种血清群2到10μg，或约4μg或约5μg或约10μg。如果包括一种以上血清群的偶联物，它们存在的质量基本相等，例如各血清群糖的质量在彼此的±10％内。作为相等比例的替代形式，可利用双倍质量的血清群A糖。因此，疫苗可包含10μgMenA糖及各5μg的MenC、W135和Y糖。
脑膜炎球菌偶联物的有用载体蛋白包括细菌毒素，如白喉或破伤风毒素、其类毒素或突变体。这些常用于偶联物疫苗。例如，CRM197白喉毒素突变体是有用的[61]。其它合适的载体蛋白包括合成肽[62，63]、热激蛋白[64，65]、百日咳蛋白[66，67]、细胞因子[68]、淋巴因子[68]、激素[68]、生长因子[68]、包含各种病原体衍生抗原的多种人CD4+ T细胞表位的人工蛋白[69]如N19[70]、流感嗜血杆菌的蛋白D[71-73]、肺炎球菌溶血素[74]或其无毒衍生物[75]、肺炎球菌表面蛋白PspA[76]、摄铁蛋白[77]、艰难梭菌(C.difficile)的毒素A或B[78]、重组铜绿假单胞菌(Pseudomonas.aeruginosa)胞外蛋白A(rEPA)[79]等。优选CRM197。
如果组合物包含多于一种脑膜炎球菌血清群的偶联物，各独立的偶联物可利用相同的载体蛋白，或利用不同的载体蛋白。但在两种情况中，一般通过分别制备各血清群偶联物，然后混合它们以形成独立偶联物的混合物来形成不同偶联物的混合物。
可使用糖∶蛋白质比例(w/w)在1∶5(即蛋白质过量)和5∶1(即糖过量)之间的偶联物，例如比例在1∶2到5∶1之间，比例在1∶1.25到1∶2.5之间。如参考文献80所述，混合物中不同的脑膜炎球菌血清群偶联物可具有不同的糖∶蛋白质比例，例如一种比例可以为1∶2到1∶5之间，而另一种比例在5∶1到1∶1.99之间。
载体蛋白可直接或经接头与脑膜炎球菌糖共价偶联。已知各种接头。例如，可经羰基进行连接，其可通过以下方式形成：使修饰糖的游离羟基与CDI反应[81，82]，之后与蛋白质反应形成氨基甲酸酯连接键。可采用碳二亚胺缩合反应[83]。优可利用己二酸接头，其可通过以下方式形成：将游离-NH2基团(例如通过胺化引入糖中)与己二酸偶联(例如，利用二酰亚胺活化)，然后将蛋白质偶联于所得的糖-己二酸中间体[84，85]。其它接头包括β-丙酰胺基[86]、硝基苯基-乙基胺[87]、卤代酰基卤化物[88]、配糖键[89]、6-氨基己酸[90]、N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二硫)-丙酸(SPDP)[91]、己二酸二酰肼ADH[92]、C4-C12部分[93]等。
可采用经还原胺化的偶联。可首先用高碘酸盐氧化糖以引入醛基，然后其可通过还原胺化与载体蛋白形成直接共价连接，例如连接于赖氨酸的ε-氨基。如果每分子糖中包括多个醛基，则该连接技术可获得交联产物，其中多个醛与多个载体胺反应。
如参考文献94所述，混合物可包含糖/蛋白直接连接的一种偶联物和通过接头连接的另一种偶联物。这种设置在利用不同脑膜炎球菌血清群的糖偶联物时尤其适用，例如MenA和MenC糖可通过接头偶联，而MenW135和MenY糖可直接偶联于载体蛋白。
脑膜炎球菌糖可包含由脑膜炎球菌制备的全长完整的糖，和/或可包含全长糖的片段，即，比细菌中所见的天然荚膜糖短的糖。因此，糖可以解聚，解聚发生在糖纯化期间或者之后、但在偶联之前。解聚可降低糖链长度。可采用解聚提供免疫原性的最佳链长和/或出于糖的物理可操作性而降低链长。
偶联的肺炎球菌荚膜糖
本发明组合物可包含偶联于载体蛋白的肺炎球菌荚膜糖。
本发明可包含一种或多种不同肺炎球菌血清型的荚膜糖。如果组合物包含多于一种血清型的糖抗原，优选分别制备这些抗原，分别偶联，然后混合。本领域已知纯化肺炎球菌荚膜糖的方法(例如，参见参考文献95)，基于23种不同血清型的纯化糖的疫苗已知晓多年。这些方法的改进也已有描述，例如参考文献96中所述的为血清型3所作的改进，，或者参考文献97中所述的为血清型1、4、5、6A、6B、7F和19A所作的改进。
肺炎球菌荚膜糖通常选自以下血清型：1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和/或33F。因此，组合物总体可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或更多种不同血清型的荚膜糖。
有用的血清型组合是7-价组合，例如包含血清型4、6B、9V、14、18C、19F和23F中各血清型的荚膜糖。另一有用的组合是9-价组合，例如包含血清型1、4、5、6B、9V、14、18C、19F和23F中各血清型的荚膜糖。另一有用的组合是10-价组合，例如包含血清型1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F中各血清型的荚膜糖。11价组合还可包含血清型3的糖。可以在10价混合物中加入以下组合形成12价组合：血清型6A和19A；6A和22F；19A和22F；6A和15B；19A和15B；或22F和15B。可以在11价混合物中加入以下组合形成13价组合：血清型19A和22F；8和12F；8和15B；8和19A；8和22F；12F和15B；12F和19A；12F和22F；15B和19A；15B和22F；6A和19A，等等。
因此，有用的13-价组合包含血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19、19F和23F的荚膜糖，例如参考文献98-101所述制备。一种此类组合包含约8μg/ml的血清型6B糖和浓度各约4μg/ml的其它12种糖。另一种此类组合包含各约8μg/ml的血清型6A和6B糖以及各约4μg/ml的其它11种糖。
上文讨论了与脑膜炎球菌偶联物相关的用于偶联物的合适载体蛋白。对肺炎球菌偶联物疫苗尤其有用的载体蛋白是CRM197、破伤风类毒素、白喉类毒素和流感嗜血杆菌(H.influenzae)D蛋白。CRM197用于PREVNARTM。13-价混合物可利用CRM197作为13种偶联物各自的载体蛋白，CRM197的存在浓度可以为约55-60μg/ml。
如果组合物包含多于一种肺炎球菌血清型的偶联物，不同的偶联物各自可利用相同的载体蛋白，或者可利用不同的载体蛋白。但在两种情况中，一般通过分别制备各血清型偶联物，然后混合它们以形成独立偶联物的混合物来形成不同偶联物的混合物。参考文献102描述了在多价肺炎球菌偶联物疫苗中利用不同载体蛋白可能的优势，但PREVNARTM产物中的7种不同血清型各自成功利用相同载体。
如上文关于脑膜炎球菌偶联物所述，载体蛋白可直接或经接头共价偶联于肺炎球菌糖。交联偶联技术对至少肺炎球菌血清型4、6B、9V、14、18C、19F和23F尤其有用。
如上文对脑膜炎球菌糖所述，肺炎球菌糖可包括由肺炎球菌制备的全长完整的糖，和/或可包括全长糖的片段。如果利用多于一种肺炎球菌血清型，则可能利用各血清型的完整的糖、各血清型的片段，或利用一些血清型的完整的糖和其它血清型的片段。如果组合物包含4、6B、9V、14、19F和23F中任何血清型的糖，优选这些糖是完整的。相反，如果组合物包含血清型18C糖，优选其是解聚的。
还可解聚血清型3糖。例如，可对血清型3糖进行酸水解以便解聚[98]，例如利用乙酸。随后可氧化得到的片段进行活化(例如，高碘酸盐氧化，可在有二价阳离子，例如MgCl2存在下)，还原条件下(例如，利用氰基硼氢化钠)与载体(例如，CRM197)偶联，再(任选)将糖中任何未反应的醛封端(例如，利用硼氢化钠)[98]。可对冻干的材料进行偶联，例如在共同冻干活化的糖和载体后。
血清型1糖可至少部分脱-O-乙酰化，例如通过碱性pH缓冲液处理来实现[99]，例如利用碳酸氢盐/碳酸盐缓冲液。可氧化此类(部分)脱-O-乙酰化的糖进行活化(例如，高碘酸盐氧化)，还原条件下(例如，利用氰基硼氢化钠)与载体(例如，CRM197)偶联，再(任选)将糖中任何未反应的醛封端(例如，利用硼氢化钠)[99]。可对冻干的物质进行偶联，例如在共同冻干活化的糖和载体后。
可氧化血清型19A糖进行活化(例如，高碘酸盐氧化)，还原条件下在DMSO中与载体(例如，CRM197)偶联，再(任选)将糖中任何未反应的醛封端(例如，利用硼氢化钠)[103]。可对冻干的物质进行偶联，例如在共同冻干活化的糖和载体后。
肺炎球菌偶联物能理想地引发结合相关糖的抗荚膜抗体，例如引发≥0.20μg/mL的抗-糖抗体水平[104]。可通过酶免疫测定(EIA)和/或检测调理吞噬活性(OPA)来评估抗体。EIA方法已得到广泛验证，抗体浓度与疫苗效力之间有联系。
其它病原体的其它抗原
本发明组合物可包含其它病原体的抗原。就此类组合而言，优选利用羟基磷酸铝佐剂并避免使用氢氧化铝佐剂，因为如上所述，其它抗原(特别是细菌荚膜糖)可能对氢氧化物盐敏感。
例如，所述组合物可包含一种或多种以下其它抗原：
-乙型肝炎病毒的抗原，例如表面抗原HBsAg。
-百日咳博德特菌(Bordetella pertussis)的抗原，如百日咳博德特菌的百日咳全毒素(PT)和丝状血凝素(FHA)，也可任选与百日咳杆菌黏附素(pertactin)和/或凝集原2和3组合。
-白喉抗原，例如白喉类毒素。
-破伤风抗原，例如破伤风类毒素。
-流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)B(Hib)的糖抗原，通常是偶联的。
-灭活的脊髓灰质炎病毒抗原。
如果所述组合物中包含白喉抗原，也优选包含破伤风抗原和百日咳抗原。类似地，如果包含破伤风抗原，也优选包含白喉和百日咳抗原。类似地，如果包含百日咳抗原，也优选包含白喉和破伤风抗原。因此，优选DTP组合。
临时制品
本发明还提供试剂盒，其装有：(i)包含至少一种fHBP抗原的第一组分，该抗原吸附于羟基磷酸铝佐剂，如上所述；和(ii)包含非脑膜炎球菌免疫原的第二组分。可混合所述试剂盒组分得到免疫原性组合物以便给予患者以抵御多种病原体。
本发明还提供制备组合疫苗的方法，其包括混合以下组分的步骤：(i)包含至少一种fHBP抗原的第一组分，该抗原吸附于羟基磷酸铝佐剂，如上所述；和(ii)包含非脑膜炎球菌免疫原的第二组分。然后可将混合的材料给予患者。可冻干第二组分，从而水性的第一组分可重建它。
药物组合物
本发明涉及给予患者的免疫原性组合物。这些组合物是药学上可接受的，通常包含合适的载体。药学上可接受的载体的全面讨论见参考文献105。
可常规确定有效剂量体积，但组合物的人用剂量一般为约0.5ml体积。
本发明组合物的pH通常介于6和8之间，更优选介于6.5和7.5之间(例如，约7)。如上所述，组合物可包含缓冲液，例如Tris缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、琥珀酸盐缓冲液(例如琥珀酸钠缓冲液)或组氨酸缓冲液。
在本发明的第一方面，在吸附前和/或期间采用特定pH，如上所述。然而，如果吸附稳定，无需在吸附后维持该pH，而可允许其升高至例如接近中性。因此，吸附后可将此类组合物缓冲至高于佐剂的PZC的pH。
类似地，第二方面的组合物在吸附前和/或期间的pH应在5.0-7.0，但在吸附后可超出该范围(例如，7.0-8.0)。然而，宜利用缓冲液将第二方面组合物的吸附后pH维持在5.0-7.0。
如果发生吸附的pH高于佐剂的PZC，那么如果吸附稳定，无需维持该pH，而可允许其降低至例如接近中性。因此，吸附后可将此类组合物缓冲至低于佐剂的PZC的pH。
第三方面组合物在吸附前和/或期间的pH在佐剂PZC的1.2个pH单位内，但在吸附后可超出该范围。然而，宜将第三方面组合物的吸附后pH维持在佐剂PZC的1.2个pH单位内。
在一些实施方式中，本发明组合物包含pKa介于3.5到6.5的缓冲液，特别是与盐水联用时。据参考文献106描述，该制剂可用于fHBP。可利用含1-10mM琥珀酸盐(例如，5mM)，pH在5.8-6.0的琥珀酸盐缓冲液。所述组合物可包含MgCl2、KCl和/或NaCl。
该组合物可以是无菌和/或无热原的。本发明组合物可与人等渗。
本发明组合物可含有钠盐(如氯化钠)以产生张力。NaCl的典型浓度是10±2mg/ml，例如约9mg/ml。
给予患者的本发明组合物具有免疫原性，更优选疫苗组合物。本发明疫苗可以是预防性(即防止感染)或治疗性(即治疗感染)的，但通常是预防性的。用作疫苗的免疫原性组合物包含免疫有效量的抗原，以及需要的任何其它组分。“免疫有效量”指在一次剂量或一系列剂量的一部分中给予个体的对治疗或预防有效的用量。该量根据所治疗个体的健康和身体状况、年龄、所治疗个体的分类学组(例如，非人灵长动物、灵长动物等)、个体免疫系统合成抗体的能力、所需的保护程度、疫苗配方、治疗医生对医学情况的评估和其它相关因素而有所不同。预计所述量将落入可通过常规试验测定的较宽范围内。本发明组合物的抗原含量通常表示为每剂量的蛋白质含量。
脑膜炎球菌影响身体的各部分，因此本发明组合物可制备成各种液体形式。例如，可将所述组合物制备为溶液或悬液的注射剂。所述组合物可以制备成利用细喷雾，例如通过吸入器作肺部给药。所述组合物可以制成鼻部、耳部或眼部给药制剂，例如喷雾剂或滴剂。最常见的是用于肌肉内给药的注射剂。
本发明组合物可包含抗微生物剂，特别是包装成多剂量形式时。疫苗中常见抗微生物剂，如硫柳汞和2-苯氧基乙醇，但优选利用无汞防腐剂或根本不含防腐剂。
本发明组合物可包含去污剂，例如吐温(聚山梨醇酯)，如吐温80。去污剂的存在水平通常较低，例如＜0.01％，但有人提出将较高水平用于稳定抗原制剂[106]，例如最高10％。示例性组合物可包含0.01-0.05％聚山梨醇酯，这在利用脂质化fHBP抗原时尤其有用。
治疗方法
本发明还提供在哺乳动物中引起免疫反应的方法，包括将本发明的组合物给予所述哺乳动物。所述免疫反应优选针对脑膜炎球菌的保护作用，优选包含抗体。所述方法可在已接受初免的患者中产生加强反应。
所述哺乳动物优选人。如果疫苗用于预防，所述人优选儿童(如幼童或婴儿)或青少年；如果疫苗用于治疗，所述人优选成人。打算给予儿童的疫苗也可给予成人，例如以评估其安全性、剂量、免疫原性等。
本发明也提供用作药物的本发明组合物。优选利用所述药物在哺乳动物中产生上述免疫反应(即，其是免疫原性组合物)，所述药物更优选是疫苗。
本发明也提供至少一种fHBP抗原和羟基磷酸铝佐剂在制备使哺乳动物产生上述免疫反应的药物中的应用。
这些应用和方法优选用于预防和/或治疗脑膜炎奈瑟球菌(N.meningitidis)所致疾病，例如细菌性(或者，更具体地说是脑膜炎球菌性)脑膜炎或败血症。
检测治疗性治疗的功效的一种方式包括在给予本发明组合物后监测脑膜炎球菌感染。检测预防性治疗的功效的一种方式包括给予组合物后监测对抗原产生的免疫反应。可以通过给予受试对象(例如，12-16个月大的儿童或动物模型)本发明组合物，然后测定标准参数，包括脑膜炎球菌的血清杀菌抗体(SBA)和ELISA效价(GMT)来测定其免疫原性。通常在给予该组合物后约4周测定这些免疫应答，并与给予该组合物之前测定的值作比较。优选至少4倍或8倍的SBA增长。如果给予多于一个剂量的组合物，可以进行多于一次给药后测定。
本发明组合物通常直接给予患者。可通过胃肠外注射(例如，皮下、腹膜内、静脉内、肌肉内，或注射至组织的间隙)，或通过其它合适的途径实现直接递送。本发明可用来引发全身和/或粘膜免疫力。优选在大腿或上臂进行肌肉内给药。注射可以通过针头(例如皮下针头)进行，但也可以采用无针注射。肌肉内剂量一般为0.5ml。
剂量治疗可以是单剂量方案或多剂量方案。多剂量可用于初免方案和/或加强免疫方案。初次给药方案之后，可以进行加强给药方案。可以常规测定初免剂量之间(例如4-16周)以及初免和加强之间的适当时机。
概述
除非另有说明，本发明的实施将采用本领域技术人员已知的化学、生物化学、分子生物学、免疫学和药理学的常规方法。此类技术在文献中已有充分描述。参见例如，参考文献107-113，等。
术语“包含”包括“包括”以及“由……组成”，例如，“包含”X的组合物可以仅由X组成或可以包括其它物质，例如X+Y。
与数值x相关的术语“约”是任选的，其表示例如x±10％。
如果本发明涉及“表位”，该表位可以是B细胞表位和/或T细胞表位，但通常是B-细胞表位。可凭经验鉴定这些表位(如利用PEPSCAN[114，115]或相似方法)，或可对其进行预测(如利用Jameson-Wolf抗原性指数[116]、基于矩阵的方法[117]、MAPITOPE[118]、TEPITOPE[119，120]、神经网络[121]、OptiMer和EpiMer[122，123]、ADEPT[124]、Tsites[125]、亲水性[126]、抗原性指数[127]或参考文献128-132中所述的方法等)。表位是为抗体或T细胞受体的抗原结合位点所识别并与之结合的抗原的某部分，也称作“抗原决定簇”。
如果本发明利用“纯化的”抗原，该抗原从其天然产生的环境中分离。例如，除了不含存在的任何其它纯化抗原，该抗原基本上不含其它脑膜炎球菌组分。通常分别纯化各抗原，然后重新混合它们来制备纯化抗原的混合物，即使两种抗原天然以混合物形式存在。
提到两条氨基酸序列间的序列相同性百分数表示比对时，所比较的两条序列中相同氨基酸的百分数。可利用本领域已知的软件程序，例如参考文献133的7.7.18部分所描述的那些进行比对并测定同源性百分数或序列相同性百分数。优选通过Smith-Waterman同源性检索算法，采用仿射空位检索进行比对，其中空位开放罚分12，空位延伸罚分2，BLOSUM矩阵为62。参考文献134中公开了Smith-Waterman同源性检索算法。
词语“基本上”不排除“完全”，如“基本上不含”Y的组合物可能完全不含Y。如果需要，词语“基本上”可从本发明定义中省去。
本发明的实施方式
铝佐剂
研究了不同条件下fHBP与不同铝佐剂的吸附。利用了各种fHBP抗原，包括一种fHBP(预计pI是7.4)或2或3种fHBP的杂合混合物。一些实验包括附加的非-fHBP脑膜炎球菌抗原。
pH 6.5±0.5下利用氢氧化铝佐剂，观察到所有单种和混合抗原的fHBP吸附是100％。有10mM组氨酸缓冲液存在时，在略高的pH下也观察到完全吸附。附加脑膜炎球菌多肽佐剂的存在未降低fHBP的吸附程度。
相反，pH 7.0下利用羟基磷酸铝佐剂观察到fHBP抗原仅有50％吸附。该pH低于抗原的预计pI，高于佐剂的PZC。
氢氧化铝佐剂的PZC通常为约11.4。因此，中性pH低于佐剂的PZC。相反，中性pH高于羟基磷酸铝佐剂的PZC。
研究了各种pH下fHBP与羟基磷酸铝佐剂的吸附。以下数据显示了pH和配制后24小时获得的吸附数据。这三种制剂具有相同的蛋白质浓度(50μg/ml)和佐剂浓度(0.5mg/ml)，但利用不同pH下的10mM磷酸钠缓冲液：
  pH   ％吸附
  7.0   ～50％
  5.8   ～95％
  3.5   未吸附
因此，在pH 5.8的组合物中实现约95％的吸附。该pH约等于佐剂的PZC(略高)，但远低于抗原的pI。相反，较高pH(高1.2个pH单位)或较低pH(低2.3个pH单位)下吸附较差。
还可通过将佐剂用量增加4.5-倍来实现高水平吸附。
利用1mg/ml佐剂和100μg/ml抗原，在其它实验中研究了缓冲液和pH的影响。结果如下所示：
因此，可通过选择合适的pH实现与羟基磷酸铝的高度吸附(≥95％)。超过85％的吸附水平仅在pH在佐剂的PZC的1.2个pH单位内观察到(相关缓冲液中)。
如上所述，用pI为7.4的fHBP进行这些研究。下文将该fHBP称为fHBP-v1。用另外两种脑膜炎球菌菌株的fHBP作进一步研究。fHBP-v2的预计pI是5.8，fHBP-v3的是6.1。此外，研究了结合v1、v2和v3中所有三种的融合。将这四种蛋白质各自配成100μg/ml，含0.222mg/ml佐剂和9mg/mlNaCl。研究了三种不同制剂pH，即，pH 5、pH 6和pH 7。然后测定fHBP蛋白与羟基磷酸铝佐剂的吸附程度。结果如下所示：
这些结果证明利用PZC在5.0-7.0的羟基磷酸铝佐剂，v1/v2/v3组合可以实现≥85％的吸附水平，其中包含pI为5.8的一种fHBP和pI为6.1的另一种(即，均在5.0-7.0)。此外，pH在佐剂的零电荷点的1.2个pH单位内时(即，pH 5或pH 6，而非pH 7)，观察到该组合的最高吸附水平。
除了以下情况，均观察到高吸附：(i)pH比佐剂的PZC高1.2个pH单位以上时的v1和v2，(ii)pH低于佐剂的PZC并且fHBP的pI超出5.0-7.0范围时的v1。可通过加入pI在5.0-7.0范围的第二fHBP克服v2 fHBP在pH 7的较低吸附。
因此，可成功地配制pI值不同的多种fHBP变体的混合物，其吸附水平高而无需氢氧化铝。
免疫刺激性寡核苷酸+聚阳离子性聚合物佐剂
作为利用基于铝的佐剂的备选方案，本发明可利用免疫刺激性寡核苷酸和聚阳离子性聚合物的颗粒复合物，例如IC31。
用氢氧化铝和/或IC31作为佐剂配制构成参考文献12中公开的‘5CVMB’疫苗的三种多肽(也参见参考文献135)。这三种多肽之一包括fHBP抗原。
在第一组实验中，9组小鼠接受10μg抗原、3mg/ml氢氧化铝和各种剂量的IC31。各组接受以下9种组合物，其中组7-9接受与1-6相同的抗原，但配制不同：
 抗原剂量(μg)   IC31体积*(μl)   Al-H(mg/ml)
  5  10   0   3
  6  10   100   0
  7  10   0   3
  9  10   100   0
*利用标准IC31悬液。100μl该悬液获得完全强度。较低体积获得较低强度。为保持较低强度组合物的体积，加入缓冲液至100μl。
测试小鼠的血清对一组脑膜炎球菌菌株的杀菌活性。
实验MP03对6种不同菌株，A到F的杀菌效价如下所示：
 A   B   C   D   E   F
  5  ＞65536   2048   4096   8192   256   32768
  6  ＞65536   4096   ＞8192   8192   1024   ＞65536
  7  ＞65536   2048   4096   4096   256   4096
  9  32768   8192   ＞8192   ＞8192   4096   ＞65536
因此，用IC31获得的效价通常好于用Al-H获得的那些。
将‘5CVMB’疫苗与针对血清群A、C、W135和Y的脑膜炎球菌偶联物的四价混合物混合。用Al-H或IC31作为佐剂(高或低浓度)配制该混合物。针对包含血清群A、C、W135和Y各一种菌株的一组对象的杀菌效价如下所示：
  A   C   W135   Y
  未免疫   ＜16   ＜16   ＜16   ＜16
  无佐剂   1024   256   128   512
  IC31高   32768   16384   4096   4096
  IC31低   16384   8192   1024   2048
  氢氧化铝   16384   8192   1024   4096
因此，用IC31观察到最佳滴度。
在不同实验中，用氢氧化铝或IC31作为佐剂配制含fHBP的3种变体的三-融合多肽，顺序为II-III-I(如参考文献27所公开的)。
在第一组实验中，6组小鼠接受20μg抗原(含或不含纯化标签)、3mg/ml氢氧化铝和100μl IC31。各组接受以下组合：
 抗原剂量(μg)   抗原标签  IC31体积(μl)   Al-H(mg/ml)
  1  20   No  100   0
  2  20   Yes  100   0
  5  20   No  0   3
  6  20   Yes  0   3
检验小鼠的血清对一组脑膜炎球菌菌株的杀菌活性。
再次用一组菌株(总共25种)检验实验MP05的血清。组1中56％的菌株的效价≥1∶1024(IC31，无标签)，而组5中只有36％的菌株(Al-H，无标签)。类似地，组1中76％的菌株的效价≥1∶128，而组5中只有64％的菌株观察到该效价。对于无标签的抗原，组2中84％的菌株的效价≥1∶128(IC31)，组6中有76％(Al-H)。因此，用IC31实现较高的杀菌效价。
其它免疫原性实验将fHBPII-III-I抗原与实验MP04中所用的NadA和287-953抗原联用，其中分组和菌株对象相同。组1在100％的菌株中显示杀菌效价≥1∶128，相比之下，组5中只有84％。采用≥1∶1024的更严格阈值，组1的血清对88％的菌株有杀菌性，相比之下，组5中只有56％。用带标签抗原观察到类似结果，其中组2中的88％的杀菌效价≥1∶128，相比之下，组6中为80％。因此，仍是IC31获得较好的抗脑膜炎球菌免疫应答。
在类似的实验中，用Al-H或IC31作为佐剂配制fHBPII-III-I、NadA和287-953的组合。比较这些组合物与用AI-H作为佐剂配制的包含含有外膜囊泡的5CVMB疫苗的组合物。IC31-佐剂配制的疫苗在12种测试菌株中提供的覆盖度％高于任何其它组合物。
因此，IC31是fHBP的有效佐剂。
应理解，仅以举例的方式描述了本发明，可作出改进而仍属于本发明的范围和构思。
参考文献
[1]Masignani等.(2003)J Exp Med 197：789-799.
[2]Welsch等.(2004)J Immunol 172：5605-15.
[3]Hou等.(2005)J Infect Dis 192(4)：580-90.
[4]WO03/063766.
[5]Fletcher等.(2004)Infect Immun 72：2088-2100.
[6]Zhu等.(2005)Infect Immun 73(10)：6838-45.
[7]Cantini等.(2006)J.Biol.Chem.281：7220-7227
[8]WO2004/048404
[9]WO03/020756.
[10]Sturgess等.(1999)Vaccine 17：1169-1178.
[11]美国专利7,404,960.
[12]Giuliani等.(2006)PNAS USA 103：10834-9.
[13]Hem和HogenEsch(2007)《疫苗佐剂和递送系统》第4章(VaccineAdjuvants and Delivery Systems)(Singh编).
[14]Burrell等.(2001)Vaccine 19：275-81.
[15]《分子医学方法》(Methods in Moelcular Medicine)，第42卷(O’Hagan编)《疫苗佐剂...》(Vaccine Adjuvants...)
[16]WO01/22992.
[17]Bjellqvist等.(1993)Electrophoresis 14：1023-31.
[18]Gasteiger等.(2005)《蛋白质组学方法手册中ExPASy服务的蛋白质鉴定和分析工具》(Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASyServer in The Proteomics Protocols Handbook)(John M.Walker编)，休玛娜出版社(Humana Press)(2005).
[19]Krieg(2003)Nature Medicine 9：831-835.
[20]McCluskie等.(2002)FEMS Immunology and Medical Microbiology32：179-185.
[21]WO98/40100.
[22]US 6,207,646.
[23]US 6,239,116.
[24]US 6,429,199.
[25]Schellack等.(2006)Vaccine 24：5461-72.
[26]Lingnau等.(2007)Expert Rev Vaccines 6：741-6.
[27]WO2004/084938.
[28]Kamath等.(2008)Eur J Immunol 38：1247-56.
[29]Riedl等.(2008)Vaccine 26：3461-8.
[30]Kritsch等.(2005)J Chromatography B 822：263-70.
[31]Lingnau等.(2003)Vaccine 20：3498-508.
[32]Tettelin等.(2000)Science 287：1809-1815.
[33]WO00/66741.
[34]WO99/57280
[35]Martin等.(1997)J Exp Med 185(7)：1173-83.
[36]WO96/29412.
[37]US-5,698,438.
[38]Perkins-Balding等.(2003)Microbiology 149：3423-35.
[39]WO01/55182.
[40]WO01/38350.
[41]WO00/23595.
[42]Ram等.(2003)J Biol Chem 278：50853-62.
[43]WO2004/014417.
[44]WO98/53851
[45]US-6531131
[46]WO00/26384.
[47]US-6645503
[48]WO03/070282.
[49]WO94/08021
[50]WO2004/015099.
[51]WO2007/144316.
[52]WO2007/144317.
[53]WO03/080678.
[54]Glode等.(1979)J Infect Dis 139：52-56
[55]WO94/05325；美国专利5,425,946.
[56]Arakere和Frasch(1991)Infect.Immun.59：4349-4356.
[57]Michon等.(2000)Dev.Biol.103：151-160.
[58]Rubinstein和Stein(1998)J.Immunol.141：4357-4362.
[59]WO2005/033148
[60]WO2007/000314.
[61]Research Disclosure，453077(2002年1月)
[62]EP-A-0378881.
[63]EP-A-0427347.
[64]WO93/17712
[65]WO94/03208.
[66]WO98/58668.
[67]EP-A-0471177.
[68]WO91/01146
[69]Falugi等.(2001)Eur J Immunol 31：3816-3824.
[70]Baraldo等.(2004)Infect Immun 72(8)：4884-7.
[71]EP-A-0594610.
[72]Ruan等.(1990)J Immunol 145：3379-3384.
[73]WO00/56360.
[74]Kuo等.(1995)Infect Immun 63：2706-13.
[75]Michon等.(1998)Vaccine.16：1732-41.
[76]WO02/091998.
[77]WO01/72337
[78]WO00/61761.
[79]WO00/33882
[80]WO2007/000341.
[81]Bethell G.S.等.，J.Biol.Chem.，1979，254，2572-4
[82]Hearn M.T.W.，J.Chromatogr.，1981，218，509-18
[83]WO2007/000343.
[84]Mol.Immunol.，1985，22，907-919
[85]EP-A-0208375
[86]WO00/10599
[87]Gever等.，Med.Microbiol.Immunol，165：171-288(1979).
[88]美国专利4,057,685.
[89]美国专利4,673,574；4,761,283；4,808,700.
[90]美国专利4,459,286.
[91]美国专利5,204,098
[92]美国专利4,965,338
[93]美国专利4,663,160.
[94]WO2007/000342.
[95]WHO技术报告丛书(WHO Technical Report Series)第927号，2005.第64-98页.
[96]US-2008/0102498.
[97]US-2006/0228381.
[98]US-2007/0231340.
[99]US-2007/0184072.
[100]US-2006/0228380.
[101]WO2008/143709.
[102]WO2007/071707
[103]US-2007/0184071.
[104]Jodar等.(2003)Vaccine 21：3265-72.
[105]Gennaro(2000)《雷明顿：药物科学和实践》(Remington：TheScience and Practice of Pharmacy).第20版，ISBN：0683306472.
[106]WO2007/127665.
[107]《酶学方法》(Methods In Enzymology)(S.Colowick和N.Kaplan编.，学术出版社(Academic Press，Inc.))
[108]《实验免疫学手册》(Handbook of Experimental Immunology)，第I-IV卷(D.M.Weir和C.C.Blackwell编，1986，布莱克威尔科学出版公司(Blackwell Scientific Publications))
[109]Sambrook等.(2001)《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)，第3版(冷泉港实验室出版社).
[110]《表面和胶体化学手册》(Handbook of Surface and ColloidalChemistry)(Birdi，K.S编.，CRC出版社，1997)
[111]Ausubel等.(编)(2002)《分子生物学简便方法》(Short protocolsin molecular biology)，第5版(最新方案).
[112]《分子生物学技术：精深实验室进程》(Molecular BiologyTechniques：An Intensive Laboratory Course)，(Ream等编.，1998，学术出版社)
[113]《PCR：生物技术导言丛书》(PCR(Introduction to BiotechniquesSeries))，第2版.(Newton和Graham编.，1997，Springer Verlag)
[114]Geysen等.(1984)PNAS USA 81：3998-4002.
[115]Carter(1994)Methods Mol Biol 36：207-23.
[116]Jameson，BA等.1988，CABIOS 4(1)：181-186.
[117]Raddrizzani和Hammer(2000)Brief Bioinform 1(2)：179-89.
[118]Bublil等.(2007)Proteins 68(1)：294-304.
[119]De Lalla等.(1999)J.Immunol.163：1725-29.
[120]Kwok等.(2001)Trends Immunol 22：583-88.
[121]Brusic等.(1998)Bioinformatics 14(2)：121-30
[122]Meister等.(1995)Vaccine 13(6)：581-91.
[123]Roberts等.(1996)AIDS Res Hum Retroviruses 12(7)：593-610.
[124]Maksyutov和Zagrebelnaya(1993)Comput Appl Biosci 9(3)：291-7.
[125]Feller和de la Cruz(1991)Nature 349(6311)：720-1.
[126]Hopp(1993)Peptide Research 6：183-190.
[127]Welling等.(1985)FEBS Lett.188：215-218.
[128]Davenport等.(1995)Immunogenetics 42：392-297.
[129]Tsurui和Takahashi(2007)J Pharmacol Sci.105(4)：299-316.
[130]Tong等.(2007)Brief Bioinform.8(2)：96-108.
[131]Schirle等.(2001)J Immunol Methods.257(1-2)：1-16.
[132]Chen等.(2007)Amino Acids 33(3)：423-8.
[133]《分子生物学最新方案》(Current Protocols in Molecular Biology)(F.M.Ausubel等编.，1987)增刊30
[134]Smith和Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2：482-489.
[135]WO2004/032958.

Claims (72)

1.一种经缓冲的免疫原性组合物，其包含两种不同的脑膜炎球菌fHBP抗原，二者均至少85％吸附于羟基磷酸铝佐剂，其中，(i)所述羟基磷酸铝佐剂的零电荷点在5.0-7.0，且(ii)所述经缓冲组合物的pH在5.0-7.0；
其中，所述两种不同的fHBP抗原是：(a)如SEQ ID NO:23所示的第一多肽；和(b)如SEQ ID NO:25所示的第二多肽；
其中，各fHBP抗原的含量为1到500微克/剂；
其中，Al+++浓度<2mg/ml；和
其中，所述经缓冲的免疫原性组合物用选自以下的缓冲液缓冲：Tris缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、琥珀酸盐缓冲液和组氨酸缓冲液。
2.如权利要求1所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述羟基磷酸铝的等电点在5.0-6.0。
3.如权利要求1所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述免疫原性组合物的pH范围维持在5.0-6.0。
4.如权利要求2所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述免疫原性组合物的pH范围维持在5.0-6.0。
5.如权利要求1所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述缓冲液为组氨酸缓冲液。
6.如权利要求1所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述组合物的pH在所述佐剂的零电荷点的1.2个pH单位内。
7.如权利要求6所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述组合物的pH在所述佐剂的零电荷点的0.5个pH单位内。
8.如权利要求1－7中任一项所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述第一多肽和第二多肽都是脂蛋白。
9.如权利要求1－7中任一项所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述组合物不包含氢氧化铝佐剂。
10.如权利要求9所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述组合物包含偶联的细菌荚膜糖。
11.如权利要求1－7中任一项所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述fHBP多肽在N-末端半胱氨酸处脂质化。
12.如权利要求11所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述fHBP多肽在N-末端半胱氨酸处被选自包含棕榈酰基的脂质脂质化。
13.如权利要求11所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述N-末端半胱氨酸被脂质化成三棕榈酰基-S-甘油基-半胱氨酸。
14.如权利要求1－7中任一项所述的组免疫原性合物，其特征在于，所述羟基磷酸铝的PZC在5.4-6.2。
15.如权利要求1－7中任一项所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述羟基磷酸铝的P/Al摩尔比在0.85-1.0。
16.如权利要求1－7中任一项所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述羟基磷酸铝是无定形的和颗粒状的。
17.如权利要求16所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述羟基磷酸铝是直径在10-100nm的板。
18.如权利要求1－7中任一项所述的免疫原性组合物，其特征在于，各fHBP抗原的含量为120到500μg/毫升。
19.如权利要求1－7中任一项所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述免疫原性组合物是人疫苗，每剂人疫苗中各fHBP多肽的含量是20、40、50、60、80、100或200μg。
20.一种将两种不同脑膜炎球菌fHBP抗原吸附于羟基磷酸铝佐剂以获得免疫原性组合物的方法，其中，(i)所述羟基磷酸铝佐剂的零电荷点在5.0-7.0，和(ii)所述两种fHBP抗原均在5.0-7.0的pH下进行吸附；
其中，所述两种不同的fHBP抗原是：(a)如SEQ ID NO:23所示的第一多肽；和(b)如SEQ ID NO:25所示的第二多肽；
其中，各fHBP抗原的含量为1到500微克/剂；
其中，Al+++浓度<2mg/ml；和
其中，所述免疫原性组合物包含缓冲液以将pH范围维持在5.0-7.0，所述缓冲液选自：Tris缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、琥珀酸盐缓冲液和组氨酸缓冲液。
21.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述缓冲液为组氨酸缓冲液。
22.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述羟基磷酸铝的等电点在5.0-6.0。
23.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述免疫原性组合物的pH范围维持在5.0-6.0。
24.如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述免疫原性组合物的pH范围维持在5.0-6.0。
25.如权利要求20－24中任一项所述的方法，其特征在于，所述第一多肽和第二多肽都是脂蛋白。
26.如权利要求20－24中任一项所述的方法，其特征在于，所述组合物不包含氢氧化铝佐剂。
27.如权利要求26所述的方法，其特征在于，所述组合物包含偶联的细菌荚膜糖。
28.如权利要求20－24中任一项所述的方法，其特征在于，所述fHBP多肽在N-末端半胱氨酸处脂质化。
29.如权利要求28所述的方法，其特征在于，所述fHBP多肽在N-末端半胱氨酸处被选自包含棕榈酰基的脂质脂质化。
30.如权利要求28所述的方法，其特征在于，所述N-末端半胱氨酸被脂质化成三棕榈酰基-S-甘油基-半胱氨酸。
31.如权利要求20－24中任一项所述的方法，其特征在于，所述羟基磷酸铝的PZC在5.4-6.2。
32.如权利要求20－24中任一项所述的方法，其特征在于，所述羟基磷酸铝的P/Al摩尔比在0.85-1.0。
33.如权利要求20－24中任一项所述的方法，其特征在于，所述羟基磷酸铝是无定形的和颗粒状的。
34.如权利要求33所述的方法，其特征在于，所述羟基磷酸铝是直径在10-100nm的板。
35.如权利要求20－24中任一项所述的方法，其特征在于，各fHBP抗原的含量为120到500μg/毫升。
36.如权利要求20－24中任一项所述的方法，其特征在于，所述免疫原性组合物是人疫苗，每剂人疫苗中各fHBP多肽的含量是20、40、50、60、80、100或200μg。
37.一种经缓冲的免疫原性组合物，其包含两种不同的脑膜炎球菌fHBP抗原，二者吸附于羟基磷酸铝佐剂，其中(i)各脑膜炎球菌fHBP抗原的等电点高于所述佐剂的零电荷点，和(ii)所述组合物的pH在所述佐剂的零电荷点的1.2个pH单位内，且，所述羟基磷酸铝佐剂的零电荷点在5.0-7.0；
其中，所述两种不同的fHBP抗原是：(a)如SEQ ID NO:23所示的第一多肽；和(b)如SEQ ID NO:25所示的第二多肽；
其中，各fHBP抗原的含量为1到500微克/剂；
其中，Al+++浓度<2mg/ml；和
其中，所述经缓冲的免疫原性组合物用选自以下的缓冲液缓冲：Tris缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、琥珀酸盐缓冲液和组氨酸缓冲液。
38.如权利要求37所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述缓冲液是组氨酸缓冲液。
39.如权利要求38所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述羟基磷酸铝的等电点在5.0-6.0。
40.如权利要求37所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述免疫原性组合物的pH范围维持在5.0-6.0。
41.如权利要求39所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述免疫原性组合物的pH范围维持在5.0-6.0。
42.如权利要求37所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述组合物的pH在所述佐剂的零电荷点的0.5个pH单位内。
43.如权利要求42所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述组合物包含将pH维持在所述佐剂的零电荷点的0.5个pH单位内的缓冲液。
44.如权利要求37－43中任一项所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述第一多肽和第二多肽都是脂蛋白。
45.如权利要求37－43中任一项所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述组合物不包含氢氧化铝佐剂。
46.如权利要求45所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述组合物包含偶联的细菌荚膜糖。
47.如权利要求37－43中任一项所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述fHBP多肽在N-末端半胱氨酸处脂质化。
48.如权利要求47所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述fHBP多肽在N-末端半胱氨酸处被选自包含棕榈酰基的脂质脂质化。
49.如权利要求47所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述N-末端半胱氨酸被脂质化成三棕榈酰基-S-甘油基-半胱氨酸。
50.如权利要求37－43中任一项所述的组免疫原性合物，其特征在于，所述羟基磷酸铝的PZC在5.4-6.2。
51.如权利要求37－43中任一项所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述羟基磷酸铝的P/Al摩尔比在0.85-1.0。
52.如权利要求37－43中任一项所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述羟基磷酸铝是无定形的和颗粒状的。
53.如权利要求52所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述羟基磷酸铝是直径在10-100nm的板。
54.如权利要求37－43中任一项所述的免疫原性组合物，其特征在于，各fHBP抗原的含量为120到500μg/毫升。
55.如权利要求37－43中任一项所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述免疫原性组合物是人疫苗，每剂人疫苗中各fHBP多肽的含量是20、40、50、60、80、100或200μg。
56.一种将两种不同脑膜炎球菌fHBP抗原吸附于羟基磷酸铝佐剂的方法，其中(i)所述脑膜炎球菌fHBP抗原的等电点均高于所述佐剂的零电荷点，和(ii)各抗原在缓冲pH下进行吸附，而所述pH在所述佐剂的零电荷点的1.2个pH单位内，且其中所述羟基磷酸铝佐剂的零电荷点在5.0-7.0；
其中，所述两种不同的fHBP抗原是：(a)如SEQ ID NO:23所示的第一多肽；和(b)如SEQ ID NO:25所示的第二多肽；
其中，各fHBP抗原的含量为1到500微克/剂；
其中，Al+++浓度<2mg/ml；和
其中，所述免疫原性组合物包含缓冲液以将pH范围维持在5.0-7.0，所述缓冲液选自：Tris缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、琥珀酸盐缓冲液和组氨酸缓冲液。
57.如权利要求56所述的方法，其特征在于，所述缓冲液是组氨酸缓冲液。
58.如权利要求56所述的方法，其特征在于，所述羟基磷酸铝的等电点在5.0-6.0。
59.如权利要求56所述的方法，其特征在于，所述免疫原性组合物包含缓冲液以将pH范围维持在5.0-6.0。
60.如权利要求58所述的方法，其特征在于，所述免疫原性组合物包含缓冲液以将pH范围维持在5.0-6.0。
61.如权利要求56－60中任一项所述的方法，其特征在于，所述第一多肽和第二多肽都是脂蛋白。
62.如权利要求56－60中任一项所述的方法，其特征在于，所述组合物不包含氢氧化铝佐剂。
63.如权利要求62所述的方法，其特征在于，所述组合物包含偶联的细菌荚膜糖。
64.如权利要求56－60中任一项所述的方法，其特征在于，所述fHBP多肽在N-末端半胱氨酸处脂质化。
65.如权利要求64所述的方法，其特征在于，所述fHBP多肽在N-末端半胱氨酸处被选自包含棕榈酰基的脂质脂质化。
66.如权利要求64所述的方法，其特征在于，所述N-末端半胱氨酸被脂质化成三棕榈酰基-S-甘油基-半胱氨酸。
67.如权利要求56－60中任一项所述的方法，其特征在于，所述羟基磷酸铝的PZC在5.4-6.2。
68.如权利要求56－60中任一项所述的方法，其特征在于，所述羟基磷酸铝的P/Al摩尔比在0.85-1.0。
69.如权利要求56－60中任一项所述的方法，其特征在于，所述羟基磷酸铝是无定形的和颗粒状的。
70.如权利要求69所述的方法，其特征在于，所述羟基磷酸铝是直径在10-100nm的板。
71.如权利要求56－60中任一项所述的方法，其特征在于，各fHBP抗原的含量为120到500μg/毫升。
72.如权利要求56－60中任一项所述的方法，其特征在于，所述免疫原性组合物是人疫苗，每剂人疫苗中各fHBP多肽的含量是20、40、50、60、80、100或200μg。
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Families Citing this family (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2261351A3 (en) 1998-05-01 2012-01-11 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Neisseria meningitidis antigens and compositions
EP2270172B1 (en) 1999-05-19 2016-01-13 GlaxoSmithKline Biologicals SA Combination neisserial compositions
CN1796404A (zh) 1999-10-29 2006-07-05 启龙有限公司 奈瑟球菌的抗原性肽
ATE503837T1 (de) 2000-02-28 2011-04-15 Novartis Vaccines & Diagnostic Hybride expression neisserscher proteine
GB0118249D0 (en) 2001-07-26 2001-09-19 Chiron Spa Histidine vaccines
GB0121591D0 (en) 2001-09-06 2001-10-24 Chiron Spa Hybrid and tandem expression of neisserial proteins
MX339524B (es) 2001-10-11 2016-05-30 Wyeth Corp Composiciones inmunogenicas novedosas para la prevencion y tratamiento de enfermedad meningococica.
GB0227346D0 (en) 2002-11-22 2002-12-31 Chiron Spa 741
GB0408977D0 (en) 2004-04-22 2004-05-26 Chiron Srl Immunising against meningococcal serogroup Y using proteins
GB0419408D0 (en) * 2004-09-01 2004-10-06 Chiron Srl 741 chimeric polypeptides
GB0524066D0 (en) 2005-11-25 2006-01-04 Chiron Srl 741 ii
EP2245048B1 (en) 2008-02-21 2014-12-31 Novartis AG Meningococcal fhbp polypeptides
BRPI1009828A2 (pt) 2009-03-24 2019-03-12 Novartis Ag adjuvante de proteína de ligação de fator h meningocócica
WO2010109324A1 (en) * 2009-03-24 2010-09-30 Novartis Ag Combinations of meningococcal factor h binding protein and pneumococcal saccharide conjugates
US20130011429A1 (en) * 2010-03-10 2013-01-10 Jan Poolman Immunogenic composition
CN110845585A (zh) 2010-03-30 2020-02-28 奥克兰儿童医院及研究中心 改性的h因子结合蛋白（fhbp）及其使用方法
CA2803239A1 (en) * 2010-06-25 2011-12-29 Novartis Ag Combinations of meningococcal factor h binding proteins
HUE052850T2 (hu) 2010-08-23 2021-05-28 Wyeth Llc Neisseria meningitidis RLP2086 antigéneket tartalmazó stabil készítmények
ES2585328T5 (es) 2010-09-10 2022-12-14 Wyeth Llc Variantes no lipidadas de antígenos ORF2086 de Neisseria meningitidis
WO2013098589A1 (en) * 2011-12-29 2013-07-04 Novartis Ag Adjuvanted combinations of meningococcal factor h binding proteins
SA115360586B1 (ar) 2012-03-09 2017-04-12 فايزر انك تركيبات لعلاج الالتهاب السحائي البكتيري وطرق لتحضيرها
MY167723A (en) 2012-03-09 2018-09-21 Pfizer Neisseria meningitidis compositions and methods thereof
BR112014031386A2 (pt) 2012-06-14 2017-08-01 Pasteur Institut vacinas para meningococos do sorogrupo x
US10000545B2 (en) 2012-07-27 2018-06-19 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale CD147 as receptor for pilus-mediated adhesion of Meningococci to vascular endothelia
JP6446377B2 (ja) 2013-03-08 2018-12-26 ファイザー・インク 免疫原性融合ポリペプチド
US9707154B2 (en) 2013-04-24 2017-07-18 Corning Incorporated Delamination resistant pharmaceutical glass containers containing active pharmaceutical ingredients
SG11201600334SA (en) * 2013-08-02 2016-02-26 Children S Hospital & Res Ct Oakland Non-naturally occurring factor h binding proteins (fhbp) and methods of use thereof
CA2923129C (en) 2013-09-08 2020-06-09 Pfizer Inc. Neisseria meningitidis compositions and methods thereof
US10266572B2 (en) 2014-07-23 2019-04-23 Children's Hospital & Research Center At Oakland Factor H binding protein variants and methods of use thereof
BR112017017460A2 (pt) 2015-02-19 2018-04-10 Pfizer Inc. composições de neisseria meningitidis e métodos das mesmas
US10183070B2 (en) 2017-01-31 2019-01-22 Pfizer Inc. Neisseria meningitidis compositions and methods thereof
CN112138155B (zh) * 2019-06-28 2022-04-12 怡道生物科技(苏州)有限公司 一种复合佐剂系统及制备该佐剂的方法
GB202115151D0 (en) 2021-10-21 2021-12-08 Glaxosmithkline Biologicals Sa Methods
WO2024030931A1 (en) 2022-08-03 2024-02-08 Sanofi Pasteur Inc. Adjuvanted immunogenic composition against neisseria meningitidis b

Family Cites Families (112)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4057685A (en) 1972-02-02 1977-11-08 Abbott Laboratories Chemically modified endotoxin immunizing agent
EP0046771A1 (en) 1980-02-19 1982-03-10 Rondel Limited Mattress
US4673574A (en) 1981-08-31 1987-06-16 Anderson Porter W Immunogenic conjugates
US4459286A (en) 1983-01-31 1984-07-10 Merck & Co., Inc. Coupled H. influenzae type B vaccine
US4663160A (en) 1983-03-14 1987-05-05 Miles Laboratories, Inc. Vaccines for gram-negative bacteria
US4761283A (en) 1983-07-05 1988-08-02 The University Of Rochester Immunogenic conjugates
US4808700A (en) 1984-07-09 1989-02-28 Praxis Biologics, Inc. Immunogenic conjugates of non-toxic E. coli LT-B enterotoxin subunit and capsular polymers
IT1187753B (it) 1985-07-05 1987-12-23 Sclavo Spa Coniugati glicoproteici ad attivita' immunogenica trivalente
US5204098A (en) 1988-02-16 1993-04-20 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Polysaccharide-protein conjugates
NL8802046A (nl) 1988-08-18 1990-03-16 Gen Electric Polymeermengsel met polyester en alkaansulfonaat, daaruit gevormde voorwerpen.
ES2055785T3 (es) 1989-01-17 1994-09-01 Eniricerche Spa Peptidos sinteticos y su uso como vehiculos universales para la preparacion de conjugados inmunogenos aptos para el desarrollo de vacunas sinteticas.
AU651949B2 (en) 1989-07-14 1994-08-11 American Cyanamid Company Cytokine and hormone carriers for conjugate vaccines
IT1237764B (it) 1989-11-10 1993-06-17 Eniricerche Spa Peptidi sintetici utili come carriers universali per la preparazione di coniugati immunogenici e loro impiego per lo sviluppo di vaccini sintetici.
SE466259B (sv) 1990-05-31 1992-01-20 Arne Forsgren Protein d - ett igd-bindande protein fraan haemophilus influenzae, samt anvaendning av detta foer analys, vacciner och uppreningsaendamaal
IE912559A1 (en) 1990-07-19 1992-01-29 Merck & Co Inc The class ii protein of the outer membrane of neisseria¹meningitidis, and vaccines containing same
DE69113564T2 (de) 1990-08-13 1996-05-30 American Cyanamid Co Faser-Hemagglutinin von Bordetella pertussis als Träger für konjugierten Impfstoff.
IT1262896B (it) 1992-03-06 1996-07-22 Composti coniugati formati da proteine heat shock (hsp) e oligo-poli- saccaridi, loro uso per la produzione di vaccini.
IL102687A (en) 1992-07-30 1997-06-10 Yeda Res & Dev Conjugates of poorly immunogenic antigens and synthetic pepide carriers and vaccines comprising them
PT658118E (pt) 1992-08-31 2002-05-31 Baxter Healthcare Sa Vacinas contra neisseria meningitidis do grupo c
US5425946A (en) 1992-08-31 1995-06-20 North American Vaccine, Inc. Vaccines against group C Neisseria meningitidis
NL9201716A (nl) 1992-10-02 1994-05-02 Nederlanden Staat Buitenmembraanvesikel dat voorzien is van een groep polypeptiden welke ten minste de immuunwerking van aan membraan gebonden buitenmembraaneiwitten (OMP's) hebben, werkwijze ter bereiding ervan alsmede een vaccin dat een dergelijk buitenmembraanvesikel omvat.
GB9407984D0 (en) 1994-04-22 1994-09-21 Marconi Gec Ltd Model generation
US6207646B1 (en) 1994-07-15 2001-03-27 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
US6429199B1 (en) 1994-07-15 2002-08-06 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules for activating dendritic cells
US6239116B1 (en) 1994-07-15 2001-05-29 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
US5698438A (en) 1994-10-18 1997-12-16 Oregon Health Sciences University Bacterial hemoglobin receptor gene
IL117483A (en) 1995-03-17 2008-03-20 Bernard Brodeur MENINGITIDIS NEISSERIA shell protein is resistant to proteinase K.
FR2734484B1 (fr) 1995-05-24 1997-06-27 Pasteur Merieux Serums Vacc Composition vaccinale liquide et procede de fabrication
EP1082965B1 (en) * 1995-06-23 2009-06-10 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. A vaccine composition comprising a polysaccharide conjugate antigen adsorbed onto aluminium phosphate
DE19643772C1 (de) 1996-10-23 1998-06-18 Wasagchemie Sythen Gmbh Verfahren zum Herstellen von Sprengstoffen aus Alt-Explosivstoffen
WO1998017805A2 (en) 1996-10-24 1998-04-30 THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, represented by THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES, c/o Centers for Disease Control and Prevention, Technology Transfer Office Invasion associated genes from neisseria meningitidis serogroup b
EP1770164B1 (en) 1996-10-31 2010-09-01 Human Genome Sciences, Inc. Streptococcus pneumoniae antigens and vaccines
DK1005368T3 (da) 1997-03-10 2010-01-04 Ottawa Hospital Res Inst Anvendelse af nukleinsyrer, der indeholder ikke-metyleret CpG dinukleotid i kombination med alun som hjælpestoffer
WO1998053851A1 (en) 1997-05-28 1998-12-03 University Of Iowa Research Foundation Laft mutants of pathogenic gram-negative bacteria
GB9713156D0 (en) 1997-06-20 1997-08-27 Microbiological Res Authority Vaccines
US6914131B1 (en) 1998-10-09 2005-07-05 Chiron S.R.L. Neisserial antigens
US6645503B1 (en) 1998-03-10 2003-11-11 Wyeth Holdings Corporation Antigenic conjugates of conserved lipopolysaccharides of gram negative bacteria
DE19814925C2 (de) * 1998-04-03 2000-10-05 Thomas Harrer Arzneimittel zur Induktion zytotoxischer T-Zellen
EP2261351A3 (en) 1998-05-01 2012-01-11 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Neisseria meningitidis antigens and compositions
US20070026021A1 (en) 1998-05-01 2007-02-01 Chiron S.R.I. Neisseria meningitidis antigens and compositions
EP1109576B1 (en) 1998-08-19 2009-10-21 Baxter Healthcare SA Immunogenic beta-propionamido-linked polysaccharide protein conjugate useful as a vaccine produced using an n-acryloylated polysaccharide
AU1202200A (en) 1998-10-09 2000-05-01 Chiron Corporation Neisseria genomic sequences and methods of their use
RU2223492C2 (ru) * 1998-10-09 2004-02-10 Чирон Корпорейшн БЕЛОК, ПОЛУЧЕННЫЙ ИЗ neisseria meningitidis (ВАРИАНТЫ), ЕГО ФРАГМЕНТ, КОДИРУЮЩАЯ НУКЛЕИНОВАЯ КИСЛОТА (ВАРИАНТЫ), ЗОНД, ПРАЙМЕР, КОМПОЗИЦИЯ
CA2347849C (en) 1998-10-22 2013-06-25 The University Of Montana Omp85 proteins of neisseria gonorrhoeae and neisseria meningitidis, compositions containing same and methods of use thereof
AU762369B2 (en) 1998-11-03 2003-06-26 De Staat Der Nederlanden Vertegenwoordigd Door De Minister Van Welzijn, Volksgezonheid En Cultuur LPS with reduced toxicity from genetically modified gram negative bacteria
WO2000033882A1 (en) 1998-12-04 2000-06-15 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services A vi-repa conjugate vaccine for immunization against salmonella typhi
SI1162999T1 (sl) 1999-03-19 2007-04-30 Glaxosmithkline Biolog Sa Vakcina proti Streptococcus pneumoniae
JP2002541808A (ja) 1999-04-09 2002-12-10 テクラブ， インコーポレイテッド ポリサッカリド結合体ワクチンのための組換えトキシンａタンパク質キャリア
DK1185691T3 (da) 1999-04-30 2009-06-22 Novartis Vaccines & Diagnostic Genomiske neisseriasekvenser og fremgangmåder til anvendelse deraf
ES2477194T3 (es) 1999-04-30 2014-07-16 Novartis Vaccines And Diagnostics S.R.L. Ant�genos neisseriales conservados
EP2270172B1 (en) 1999-05-19 2016-01-13 GlaxoSmithKline Biologicals SA Combination neisserial compositions
US6531131B1 (en) 1999-08-10 2003-03-11 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Conjugate vaccine for Neisseria meningitidis
GB9923176D0 (en) 1999-09-30 1999-12-01 Smithkline Beecham Biolog Novel composition
CN1796404A (zh) 1999-10-29 2006-07-05 启龙有限公司 奈瑟球菌的抗原性肽
JP4840956B2 (ja) 1999-11-29 2011-12-21 ノバルティス ヴァクシンズ アンド ダイアグノスティクス エスアールエル ８５ｋＤａのナイセリア抗原
MXPA02006962A (es) 2000-01-17 2002-12-13 Chiron Spa Vacuna de vesicula de membrana exterior que comprende proteinas de membrana exterior de neisseria meningitidis serogrupo b.
NZ520445A (en) 2000-01-25 2004-02-27 Univ Queensland Proteins comprising conserved regions of neisseria meningitidis surface antigen NhhA
ATE503837T1 (de) 2000-02-28 2011-04-15 Novartis Vaccines & Diagnostic Hybride expression neisserscher proteine
GB0007432D0 (en) 2000-03-27 2000-05-17 Microbiological Res Authority Proteins for use as carriers in conjugate vaccines
AU2002309706A1 (en) 2001-05-11 2002-11-25 Aventis Pasteur, Inc. Novel meningitis conjugate vaccine
GB0118249D0 (en) * 2001-07-26 2001-09-19 Chiron Spa Histidine vaccines
WO2003009869A1 (en) 2001-07-26 2003-02-06 Chiron Srl. Vaccines comprising aluminium adjuvants and histidine
GB0121591D0 (en) 2001-09-06 2001-10-24 Chiron Spa Hybrid and tandem expression of neisserial proteins
FR2828406B1 (fr) 2001-08-08 2005-06-24 Aventis Pasteur Composition vaccinale bivalente havi
MX339524B (es) 2001-10-11 2016-05-30 Wyeth Corp Composiciones inmunogenicas novedosas para la prevencion y tratamiento de enfermedad meningococica.
GB0129007D0 (en) 2001-12-04 2002-01-23 Chiron Spa Adjuvanted antigenic meningococcal compositions
CA2477068A1 (en) 2002-02-22 2003-08-28 National Research Council Of Canada Synthesis of lipopolysaccharide-protein conjugate vaccines via the lipid a region following removal of the glycosidic phosphate residue
PT1777236T (pt) 2002-03-26 2017-02-13 Glaxosmithkline Biologicals Sa Sacáridos modificados possuindo estabilidade melhorada em água para utilização como um medicamento
ES2537737T3 (es) 2002-08-02 2015-06-11 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Composiciones de vacuna que comprenden lipooligosacáridos de inmunotipo L2 y/o L3 de Neisseria meningitidis de IgtB
GB0220194D0 (en) 2002-08-30 2002-10-09 Chiron Spa Improved vesicles
US7785608B2 (en) 2002-08-30 2010-08-31 Wyeth Holdings Corporation Immunogenic compositions for the prevention and treatment of meningococcal disease
BRPI0315228A8 (pt) 2002-10-11 2018-04-03 Chiron Srl Vacinas de polipeptídeo para ampla proteção contra linhagens meningocócicas hipervirulentas
GB0227346D0 (en) * 2002-11-22 2002-12-31 Chiron Spa 741
US20070148729A1 (en) 2003-01-15 2007-06-28 Farley John E Methods for increasing neisseria protein expression and compositions thereof
EP2172213B1 (en) 2003-01-30 2013-04-03 Novartis AG Injectable vaccines against multiple meningococcal serogroups
WO2004094596A2 (en) 2003-04-16 2004-11-04 Wyeth Holdings Corporation Novel immunogenic compositions for the prevention and treatment of meningococcal disease
CA2522666A1 (en) 2003-04-18 2004-10-28 Pharmacia & Upjohn Company Llc Combination therapies for chronic obstructive pulmonary disease (copd)
WO2005032583A2 (en) 2003-10-02 2005-04-14 Chiron Srl Liquid vaccines for multiple meningococcal serogroups
GB0323103D0 (en) 2003-10-02 2003-11-05 Chiron Srl De-acetylated saccharides
US7484413B2 (en) 2003-12-12 2009-02-03 The Boeing Company Remote radius inspection tool for composite joints
GB0408977D0 (en) 2004-04-22 2004-05-26 Chiron Srl Immunising against meningococcal serogroup Y using proteins
GB0419408D0 (en) 2004-09-01 2004-10-06 Chiron Srl 741 chimeric polypeptides
CA2590974C (en) 2005-01-27 2017-10-03 Children's Hospital & Research Center At Oakland Gna1870-based vesicle vaccines for broad spectrum protection against diseases caused by neisseria meningitidis
US7709001B2 (en) 2005-04-08 2010-05-04 Wyeth Llc Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition
US20070184072A1 (en) 2005-04-08 2007-08-09 Wyeth Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition
BRPI0607026B1 (pt) 2005-04-08 2022-02-15 Wyeth Processos para redução do teor de proteína e preservação do teor de polissacarídeo capsular em um caldo de lisado celular de streptococcus pneumoniae complexo antes da purificação
US7955605B2 (en) 2005-04-08 2011-06-07 Wyeth Llc Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition
EP2425851A1 (en) 2005-04-08 2012-03-07 Wyeth LLC Multivalent Pneumococcal Polysaccharide-Protein Conjugate Composition
SI1896065T2 (sl) 2005-06-27 2014-12-31 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Postopek za pripravo cepiv
GB0524066D0 (en) * 2005-11-25 2006-01-04 Chiron Srl 741 ii
ES2707499T3 (es) 2005-12-22 2019-04-03 Glaxosmithkline Biologicals Sa Vacuna de conjugado de polisacárido neumocócico
TW200806315A (en) 2006-04-26 2008-02-01 Wyeth Corp Novel formulations which stabilize and inhibit precipitation of immunogenic compositions
ES2337309T5 (es) 2006-06-12 2013-07-30 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Vacuna
AU2007307800C1 (en) 2006-10-10 2014-03-13 Wyeth Llc Purification of Streptococcus pneumoniae type 3 polysaccharides
AR064642A1 (es) 2006-12-22 2009-04-15 Wyeth Corp Polinucleotido vector que lo comprende celula recombinante que comprende el vector polipeptido , anticuerpo , composicion que comprende el polinucleotido , vector , celula recombinante polipeptido o anticuerpo , uso de la composicion y metodo para preparar la composicion misma y preparar una composi
GB0700562D0 (en) 2007-01-11 2007-02-21 Novartis Vaccines & Diagnostic Modified Saccharides
US20100150912A1 (en) 2007-04-11 2010-06-17 Novartis Ag Blocking interaction between pathogen factors and factor h to inhibit hemorrhagic syndromes
AU2008259423A1 (en) * 2007-06-04 2008-12-11 Novartis Ag Formulation of meningitis vaccines
CA2695467A1 (en) * 2007-08-02 2009-03-26 Children's Hospital & Research Center At Oakland Fhbp- and lpxl1-based vesicle vaccines for broad spectrum protection against diseases caused by neisseria meningitidis
EP2245048B1 (en) 2008-02-21 2014-12-31 Novartis AG Meningococcal fhbp polypeptides
WO2009114485A2 (en) 2008-03-10 2009-09-17 Children's Hospital & Research Center At Oakland Chimeric factor h binding proteins (fhbp) containing a heterologous b domain and methods of use
US8470340B2 (en) 2008-09-03 2013-06-25 Children's Hospital & Research Center Oakland Peptides presenting an epitope of a domain of factor H binding protein and methods of use
IT1394288B1 (it) * 2008-09-12 2012-06-06 Novartis Vaccines & Diagnostic Immunogeni di proteine che legano il fattore h.
GB0819633D0 (en) 2008-10-25 2008-12-03 Isis Innovation Composition
BRPI1009828A2 (pt) * 2009-03-24 2019-03-12 Novartis Ag adjuvante de proteína de ligação de fator h meningocócica
WO2010109324A1 (en) 2009-03-24 2010-09-30 Novartis Ag Combinations of meningococcal factor h binding protein and pneumococcal saccharide conjugates
MX2012004850A (es) 2009-10-27 2012-05-22 Novartis Ag Polipeptidos fhbp meningococicos modificados.
US20130011429A1 (en) 2010-03-10 2013-01-10 Jan Poolman Immunogenic composition
CN110845585A (zh) 2010-03-30 2020-02-28 奥克兰儿童医院及研究中心 改性的h因子结合蛋白（fhbp）及其使用方法
ES2585328T5 (es) 2010-09-10 2022-12-14 Wyeth Llc Variantes no lipidadas de antígenos ORF2086 de Neisseria meningitidis
WO2013177397A1 (en) 2012-05-24 2013-11-28 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services Multivalent meningococcal conjugates and methods for preparing cojugates
CN104602705A (zh) 2012-09-06 2015-05-06 诺华股份有限公司 血清组b脑膜炎球菌和d/t/p的联合疫苗

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A.S. Anderson et al.Functional cross-reactive antibodies are elicited by a Group B Neisseria meningitidis bivalent recombinant lipidated LP2086 vaccine in Cynomolgus macaques.《16th international pathogenic conference》.2008,P100. *
Functional cross-reactive antibodies are elicited by a Group B Neisseria meningitidis bivalent recombinant lipidated LP2086 vaccine in Cynomolgus macaques;A.S. Anderson et al;《16th international pathogenic conference》;20081231;P100 *
Predicting the adsorption of proteins by aluminium-containing adjuvants;Sally J. Seeber et al;《Vaccine》;19910331;第9卷;第201－203页 *
Sally J. Seeber et al.Predicting the adsorption of proteins by aluminium-containing adjuvants.《Vaccine》.1991,第9卷第201－203页. *

Also Published As

Publication number Publication date
RU2557315C2 (ru) 2015-07-20
LT2411048T (lt) 2020-06-25
US20140294887A1 (en) 2014-10-02
JP5850998B2 (ja) 2016-02-03
EP2411048A1 (en) 2012-02-01
HK1210015A1 (zh) 2016-04-15
JP2014237696A (ja) 2014-12-18
CN102427826A (zh) 2012-04-25
US20170360915A1 (en) 2017-12-21
CY1123299T1 (el) 2021-12-31
WO2010109323A1 (en) 2010-09-30
RU2011142790A (ru) 2013-04-27
US10568953B2 (en) 2020-02-25
EP2411048B1 (en) 2020-05-06
US8834888B2 (en) 2014-09-16
CA2756522A1 (en) 2010-09-30
CN104548082A (zh) 2015-04-29
ES2797504T3 (es) 2020-12-02
SI2411048T1 (sl) 2020-08-31
PT2411048T (pt) 2020-07-14
HUE049695T2 (hu) 2020-10-28
JP6101330B2 (ja) 2017-03-22
CA2756522C (en) 2018-06-26
US8398988B2 (en) 2013-03-19
AU2010227219A1 (en) 2011-10-13
JP2016014049A (ja) 2016-01-28
US20120148619A1 (en) 2012-06-14
PL2411048T3 (pl) 2020-11-16
US20120070458A1 (en) 2012-03-22
US10245311B2 (en) 2019-04-02
HRP20201076T1 (hr) 2020-10-30
BRPI1009828A2 (pt) 2019-03-12
JP5597245B2 (ja) 2014-10-01
US20190151430A1 (en) 2019-05-23
JP2012521402A (ja) 2012-09-13
US20170119868A1 (en) 2017-05-04
US20130149326A1 (en) 2013-06-13
NZ595234A (en) 2013-12-20
DK2411048T3 (da) 2020-06-15
AU2010227219B2 (en) 2014-02-27
US9572884B2 (en) 2017-02-21

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