CN1537162A - 减毒环状病毒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种分离的减毒环状病毒，其在编码病毒蛋白2(VP2)的病毒核酸中含有突变。所述减毒环状病毒特别适用于赋予动物，具体是禽类对环状病毒感染的免疫力。

Description

减毒环状病毒
技术领域
本发明涉及减毒病毒、病毒疫苗组合物，特别是鸡贫血症病毒形式的减毒环状病毒。
背景技术
鸡贫血症病毒(CAV)是环状病毒科(Circoviridae)家族中的一个成员。环状病毒科病毒家族包括许多植物及动物病毒，其特征为具有单链、负义、环状DNA基因组。在CAV和其他表征的下列动物环状病毒之间的基因组序列和结构中有最低的相似性：鹦鹉喙羽病毒(PBFDV)，鸽环状病毒，猪环状病毒1及2。最近以人及其他物种为宿主的TT病毒(TTV)已被鉴定成单链、负义、环状DNA病毒。对这组病毒进行序列分析发现它们同CAV有着总体上最高的同源性，因此有人主张将TTV，SANBAN，YONBAN，TLMV(类TTV小病毒)以及CAV病毒归类为副环状病毒科(paracircoviridae)。但是，关于其发展史，还有很多争论。在非编码区和在TTV的可读框(ORF2)与CAV的VP2序列之间可见和CAV基因序列的同源性最高。CAV同TTV之间高水平的同源性暗示VP2可能在病毒感染和致病方面具有重要的作用。
CAV只编码三个蛋白，其三个ORF互相重叠。ORF3编码病毒的主要蛋白45-52kDa的衣壳蛋白VP1，ORF2编码11-13kDa的VP3蛋白，该蛋白在转化细胞系中表现出致凋亡活性，而ORF1编码一个28kDa的非结构性蛋白VP2，其功能不清。在感染发生时，VP2以痕量表达，但是VP2在病毒感染和在细胞中复制具有关键性的作用。VP2蛋白的低表达符合其作为一种涉及病毒复制和感染的非结构性调节性蛋白的特点。
CAV发病机理的特征为由于全骨髓萎缩及胸腺细胞衰竭而导致免疫抑制及全血细胞减少症。免疫抑制又导致与共感染有关的死亡率和发病率上升，并导致CAV感染鸡只中免疫接种失败。CAV感染直接针对胸腺和脾脏两种不同的T细胞群的细胞毒性。胸腺感染包括未成熟淋巴母细胞前体，而脾脏感染属于受到高度激活的成熟T淋巴细胞。在未被感染的免疫效应细胞中，发现存在着第二种间接免疫抑制的组分。有文献报导巨噬细胞和APC效应细胞功能和B细胞抗原反应也下降。受感染细胞的有限细胞因子图谱暗示总体上间接免疫抑制的基础。在受感染家禽的淋巴细胞中，白介素2(IL-2)，干扰素γ(IFNγ)，淋巴细胞刺激指数，IL-1，T细胞生长因子活性，以及Fc受体水平都发生了下降。病毒对于细胞因子图谱及间接免疫抑制的分子机理尚未知。
对CAV VP2序列同Genbank数据库序列进行初步的比较表明，该蛋白同许多真核受体PTP酶(R-PTPaseα)有相似性。数据库检索表明：人类、大鼠、小鼠和鸡的R-PTPaseα前体同CAV VP2蛋白序列具有同源性。可逆性蛋白磷酸化作用在细胞调控过程中是普遍的，包括代谢、基因调控、细胞周期调控、细胞骨架组织及细胞附着。PTPase家族种类繁多，包括真核细胞受体类跨膜蛋白及可溶性胞质蛋白，以及细菌PTPase，例如致病菌耶尔森氏菌(Yersinia)的YopH PTPase，和在牛痘病毒(痘病毒中的一种)中发现的PTPase VH1。在牛痘病毒感染中，VH1蛋白阻断干扰素γ信号转导途径，因而逃避了机体对病毒的免疫应答。VH1 PTPase在感染中的作用，虽然是目前唯一的了具有表征的体内功能的病毒性PTPase蛋白，但它仍突出了病毒编码的PTPase蛋白在参与病毒的免疫逃避及病毒存留机制中的潜力。
家禽饲养商需要鸡贫血症病毒(CAV)疫苗，以降低由于该病毒临床感染及亚临床感染所造成的经济损失。要想清除成年鸡中与CAV感染相关的亚临床疾病，则需要克服由于感染造成的免疫抑制。CAV感染在小鸡群中具有极大的经济意义。临床及亚临床感染对商业化养鸡的效率及利润都有影响。临床感染可以产生更明显的绩效参数方面的下降，而亚临床感染随着其发生率较高会造成更大规模的经济损失。因此急需一种可以用于雏鸡、小鸡和种鸡的疫苗。由于这种疫苗可能施用于产蛋期的禽类，因此该疫苗在垂直传播给胚胎的事件中必须是安全的。
CAV疫苗的研发有国际申请。根据血清学调查，鸡贫血症病毒(CAV)全世界都有分布，在SPF及商业化肉鸡群中区域性分布，但澳大利亚SPF鸡群除外。检测分离到的CAV病毒并对其全基因组测序的国家有：德国、英国、美国、日本、澳大利亚以及荷兰。使用多克隆抗血清进行免疫荧光及中和试验，根据交叉反应的情况，可以将所有的分离病毒株归为一个单独的血清型中。基因组序列保守性是所有CAV分离株的关键特征。所有的野外病毒分离株在感染试验中都表现出等同的致病性，而CAV接触疾病的发病率及严重性的任何差异是由于病毒作用范围及流行病学因素造成的。病毒剂量是影响野外CAV诱导疾病严重程度的关键因素。预计从任意一分离株开发的活减毒疫苗都有望给全世界的禽类养殖带来福音。
CAV减毒株应该是具有感染性，而同时其致病性下降。根据文献报道，一日龄感染的鸡临床疾病被表征最清楚。一日龄鸡感染的临床疾病表现为衰弱、萎靡、发育迟缓以及贫血。感染后7天时，因为成核红细胞大量崩解，会发生一短暂、但是严重和特急性的贫血，以及由于皮质淋巴细胞萎缩，会导致免疫缺陷。感染后14-20天时，显然会出现严重的骨髓细胞减少、胸腺及淋巴组织萎缩以及血小板减少症。因为原发性凝血障碍，会出现瘀点、瘀斑性出血症。免疫抑制是CAV诱导疾病的重要特征，并且因此常导致继发性感染。受CAV感染的禽类发生恶性水肿、坏疽性皮炎、大肠杆菌感染以及肺曲霉感染的发病率增高。感染后14-35天进入恢复期。在恢复期，红细胞系生成过程要先于粒细胞系生成过程。感染后16天，有大量未成熟红细胞、血小板、粒细胞，感染后28天血细胞比容完全恢复。21天时由于淋巴细胞的第三波移动，胸腺细胞群重新增多。
CAV感染的禽类会产生严重的骨髓萎缩性贫血。血细胞容积小于27％，通常在9-23％之间(正常的7-14日龄鸡血细胞容积为32-37.5％)。在非覆羽皮肤及粘膜表面明显发绀。因为异质性血细胞减少及淋巴细胞减少症，而导致白细胞减少症。凝血时间延长与瘀点、瘀斑性出血相关，所述出血可出现于表皮、骨骼肌、胃粘膜，鲜见出现于心包。
因为全骨髓萎缩及代偿性脂肪组织增生，骨髓呈黄色到白色，质地含水。这种现象在股骨近端骨髓腔最常见。
胸腺表现严重萎缩。可测量到受感染的胸腺重量下降，直径也缩小2-4毫米。受感染胸腺表现为红褐色，而不是正常的灰色，这是因为实质性淋巴细胞群减少，网状细胞增生以及组织充血造成的。
在所有的组织中，存在广泛的淋巴滤泡组分缺失。滑氏囊(bursa ofFabricius)发生一短暂的中度萎缩，而不是肿胀或水肿。在出现临床症状的受感染鸡，囊萎缩现象为适度或不明显。
感染后14天，肝脏、肾脏以及脾脏表现为广泛性脱色及水肿。
病灶处皮肤的出血性损伤是最突出发生在翅上，但也发生在头部、臀部、胸腹侧壁、大腿、小腿及足。病损进展为大的溃疡，并由于下层的真皮缺血性坏死而伴有血性渗出。脓性渗出与继发性感染有关。在商业化养鸡的养殖单位中，常容易并发磨损及断离损伤。
为对减毒效果进行评估，需要建立CAV发病机理的试验模型。这一模型不需要代表野外感染中所观察的全谱病理，但必须能在最严重病理变化方面是否有减毒效应。用高剂量的病毒接种7日龄胚胎卵黄囊是可选用模型中最严格的一种。这种模型可以最好地模拟实际情况，其中将幼稚种鸡在产蛋期时接触CAV，并且介蛋传播病毒。经垂直传播感染的鸡具有最高的发病率(100％)和死亡率(10-70％)，其所发生的病变也是最严重的。目前文献中还没有报道通过实验大量研究7日龄卵黄囊接种感染的胚胎病理。
所有年龄段的鸡都对CAV易感，但是14日龄以上的鸡对该疾病的发生表现出日龄特异性的抗性。鸡胚及1日龄鸡对该疾病最易感。日龄抗性可能同鸡产生血清中和体液反应的能力提高相关。增效禽类病原体共感染，如IBFV共感染，会消除日龄相关抗性，并导致大龄鸡急重症的爆发。
大多数商业化饲养的鸡已经接触过CAV并拥有长效中和体液免疫力。抗体在血清转化后可以持续至少20周。饲养鸡的血清学调查表明97.5-100％的鸡在感染后比较长的一段时期内仍可保留由血清阳性反应。母源性抗体对于保护2周前的小鸡免受疾病侵害具有重要的作用，并可持续至3周龄。母源性抗体呈线性下降，其半衰期大约为1周。低水平的母源性抗体对于防止感染临床疾病是有效的。源自免疫的种鸡孵化出的绝大多数小鸡在母源性抗体衰减后会被横向感染，产生亚临床性疾病，并在感染后8-12周发生血清转化。在一个接触病毒的鸡群中，将近有10％的鸡在接触后的任何时段血清学检查都表现为阴性。有一小部分鸡会被垂直感染并分泌高滴度的病毒，因此成为其他人工孵化鸡横向感染的感染源。在免疫种鸡的后代中，有16％-25％的鸡为亚临床感染。因此即使对于流行CAV地区、并产生持续性中和体液免疫的鸡群，疫苗接种都会有更好的效果。
经鉴定VP2蛋白是一种新的酪氨酸磷酸酶，其一些序列是发挥完全功能所必须的，基于这些认识，本发明人研发了可以用于免疫接种小母鸡、子鸡、种鸡的活的减毒CAV病毒及CAV DNA疫苗。
发明内容
首先，本发明提供一个分离的减毒环状病毒，在其编码病毒蛋白2(VP2)的病毒核酸中有一个突变。
优选的是，该环状病毒为鸡贫血症病毒(CAV)，TT病毒(TTV)或其他相似的病毒。其中更优选的环状病毒是鸡贫血症病毒(CAV)。环状病毒的定义欲包括CAV及其他病毒，这类病毒拥有单链、负义环状DNA基因组，并表达功能上同CAV VP2蛋白具有同等活性的蛋白。
选择突变点最好根据当前对病毒功能的研究来进行。本发明人发现CAV VP2是进行减毒的良好靶位点，通过突变，有可能改变病毒的毒性而同时保留其感染性及免疫原性。作为本发明的部分，CAV VP2作为PTPase建立精确的生化功能极大地推动了合理减毒的方法，并为突变路线指明待突变的热点位置。根据对PTPase体外催化影响的认识，可以设计突变来调整感染过程中PTPase的功能。CAV VP2蛋白预测是一种多功能蛋白，是一种病毒复制及感染过程中关键性的非结构蛋白。因为该蛋白是一种非结构性蛋白，所以突变不一定会影响对免疫原性所必需的表位。因为淋巴细胞是CAV感染的靶细胞，可能病毒的毒力同免疫原性反相关，条件是对抗原刺激能获得足够的病毒复制。降低病毒毒力以及因病毒感染造成的免疫抑制的突变，可能因此而提高病毒相对于野生型病毒的免疫原性特性。
在一优选形式中，突变存在于编码VP2蛋白特征基序的关键氨基酸残基的核酸区域中。这些突变应该会改变病毒感染时PTPase的功能。更优选的情况是，在CAV VP2中突变的靶位点为第86，95，97，101，103和169位。第86位的氨基酸残基正常情况下为C，被突变为S(mut C 86 S)，其他经证实的突变为mut C 95 S，mut C 97 S，mutR101 G，以及mut H 103 Y。突变mut C 95 S，mut C 97 S去除半胱氨酸，而半胱氨酸预测对PTPase活性是必需的，并且为催化半胱氨酸，在催化过程中参与形成半胱氨酰-磷酸(cysteinyl-phosphate)。突变mut R101 G去除碱性、正电的氨基酸残基，预测该氨基酸对PTPase活性是必须的，并参与磷酸酪氨酸底物同催化性半胱氨酸残基的协调过程。第103位和86位氨基酸残基位于预测的特征基序的侧翼，而且在TT病毒和CAV病毒中高度保守。
在另一个优选的形式中，突变存在于编码下列CAV VP2中两个预测区域的核酸区：残基128-143位两性分子α螺旋区，以及残基151-158位两性分子β折叠区。其他适合突变的区域包括CAV VP2的核酸残基第80到110位，128到143位，151到1 58和160到170位。
优选CAV构建体选自mut C 86 R，mut C 95 S，mut C 97 S，mut R101 G，mut H 103 Y，mut R 129 G，mut Q 131 P，mut R/K/K 150/151/152G/A/A，mut D/E 161/162 G/G，mut L 163 P，mut D 169 G，mut K 102 E，mut E 186 G及其组合。
发现其中特别适合作候选疫苗的CAV包括mut C 86 R，mut R 101G，mut K 102 D，mut H 103 Y，mut R 129 G，mut N 131 P，mut R/K/K150/151/152 G/A/A，mut D/E 161/162 G/G，mut L 163 P，mut D 169 G，mut K 102 E以及mut E 186 G。
优选的，CAV构建体选自序列编号1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，25或27。
因为TTV的基因组结构同CAV相似，所以本发明人对CAV研究获得的减毒信息也将适用于TTV。这已得到下列本发明人所示的进一步支持，TLMV的ORF2具有蛋白酪氨酸磷酸酶活性。因此，从本发明人对CAV研究所得的丰富信息，可以预测通过在TTV或其他病毒相应的或类似的ORF2编码区引入突变，可以形成减毒的TTV(或其他相似的环状病毒)。
在第二方面，本发明提供一种环状病毒疫苗组合物，其包含本发明第一方面所述的减毒环状病毒，以及可接受的载体或稀释剂。
一个优选的形式，病毒为CAV，动物为禽类，优选为鸡。
另一个优选的形式，病毒为TTV，动物为哺乳动物，优选为人。
疫苗组合物可配制成制剂，含有载体或稀释剂以及一种或多种本发明的减毒病毒。适合的药物学可接受的载体促进施用病毒，但其生理学上为惰性的和/或对接受者无害。载体可以由本领域的技术人员选择。适宜用作载体的物质包括灭菌盐水、乳糖、蔗糖、磷酸钙、明胶、糊精、琼脂、果胶、花生油、橄榄油、芝麻油及水。此外，载体或稀释剂可以包括延迟病毒释放的物质，例如甘油单硬脂酸酯或甘油二硬脂酸酯，可单独或与石蜡组合使用。另外，还可选用缓释多聚体制剂。
任选的，疫苗组合物还可含防腐剂、化学稳定剂、其他抗原蛋白以及传统的药物成分。可以用于疫苗组合物中与病毒结合的合适成分包括，例如酪蛋白氨基酸、蔗糖、明胶、酚红、N-Z胺、二磷酸单钾盐、乳糖、乳清蛋白水解物以及奶粉。通常，将稳定剂、佐剂以及防腐剂加以优化以对目标动物或人类中的功效确定最佳剂型。合适的防腐剂包括氯代丁醇、山梨酸钾、山梨酸、二氧化硫、没食子酸丙酯、对羟基苯甲酸酯、乙基香草醛、甘油、石炭酸以及对氯酚。
本发明的疫苗组合物最优选生产不含佐剂。当需要时，一种或多种上述的疫苗组分可以与常规佐剂混合或吸附。佐剂是用于非特异性的刺激剂以吸引淋巴细胞或提高免疫应答。这些佐剂包括矿物油和水、氢氧化铝、Amphigen、阿夫立定(Avridine)、L121/角鲨烯、D-丙交酯-多聚丙交酯/糖苷，pluronic plyois、胞壁酰二肽、灭活的博德特氏菌、皂甙、以及Quil A。
另外，除了本发明的病毒，用于治疗病毒感染的其他药剂，诸如免疫刺激剂，预计用于减少和消除疾病症状，尤其在人中。凭借本发明的教导，开发含有这些药剂的疫苗或治疗组合物在本领域一名技术人员的范围内。
根据本发明第二方面的方法，通过施用有效剂量的上述的疫苗组合物，动物或人可以对环状病毒感染进行免疫接种。有效量定义为该数量的环状病毒疫苗能够诱导接受对象产生针对环状病毒感染的保护。疫苗可以由任何适当的形式施用。这种组合物可经胃肠道外施用、优选肌内注射或皮下注射。不过，疫苗也配制成制剂通过任何其他合适的途径施用，包括鼻内、口、阴道内、皮下或皮内，或介蛋途径。
适宜的有效量的本发明中环状病毒可以由一位本领域的技术人员根据所需要的免疫反应的程度而确定。这样一种组合物可以一次施用，和/或也可施用一次强化免疫。不过，适宜的剂量可以由兽医或大夫根据免疫接种动物或人的年龄、性别、体重及总体健康情况加以调整。通常疫苗剂量的范围在1-100百万TCID50。优选的剂量在1000TCID50上下。
类似的，本发明中疫苗组合物的合适剂量可以方便地由一位本领域的技术人员确定下来。使用剂量可以根据在处理动物物种，即体重、年龄和总体健康情况进行调整。
在第三方面，本发明提供了一种使动物产生对环状病毒感染的免疫性的方法，所述方法包括对动物施用根据本发明第二方面的疫苗组合物。
在一个优选的形式，病毒为CAV，动物为禽类，优选为鸡。
在另一个优选形式，病毒为TTV，动物为哺乳动物，优选为人。
疫苗可能以任何适当的途径施用，包括经鼻内、口、阴道内、皮下或皮内，或介蛋(in ovo)途径。
对于禽类，如鸡，优选的施用途径包括经粘膜、气雾剂或经饮水施用。
施用的疫苗组合物也可用于防止环状病毒感染临床症状的出现。
施用的疫苗组合物还可以用于诱导动物产生对环状病毒的免疫反应。
在第四方面，本发明提供一种由环状病毒基因组中衍生或获得的分离的核酸分子，该核酸分子包含至少一部分内含突变的病毒蛋白2(VP2)的编码区。
优选的，环状病毒为鸡贫血症病毒(CAV)，TT病毒(TTV)或其他相似的病毒。更优选的，环状病毒为鸡贫血症病毒(CAV)。环状病毒定义包括CAV及其他病毒，这类病毒具有单链负义环状DNA基因组，并表达功能上同CAV VP2蛋白具有同等活性的蛋白。
优选的，分离的核酸分子包括完整的内含突变的环状病毒基因组，突变可以发生在VP2翻译起始区，或PTPase基序，或酸性α螺旋区，或碱性β折叠区。
优选的，这种分离出的核酸分子选自序列号1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，25，或27。
在第五方面，本发明提供一种环状病毒疫苗组合物，其包括根据本发明第四方面分离的核酸分子，和一种可接受的载体或稀释剂。
在一个优选的形式，病毒为CAV，动物为禽类，优选为鸡。
在另一个优选形式，病毒为TTV，动物为哺乳动物，优选为人。
在第六方面，本发明提供了一种使动物产生对环状病毒感染的免疫性的方法，该方法包括给动物施用根据本发明第五方面的疫苗组合物。
在第七方面，本发明提供一种自环状病毒获得的分离的具有PTPase活性的病毒蛋白2(VP2)。
优选的，环状病毒为鸡贫血症病毒(CAV)，TT病毒(TTV)或其他相似的病毒。更优选的，环状病毒为鸡贫血症病毒(CAV)。环状病毒定义包括CAV及任何其他病毒，这类病毒拥有单链、负义、环状DNA基因组，并表达功能上同CAV VP2蛋白具有同等活性的蛋白。
优选的，分离的VP2经过修饰以改变其PTPase活性。
优选的，分离的VP2分子所含的氨基酸序列选自序列号2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，或28。
在第八方面，本发明提供根据本发明第一方面的减毒环状病毒在生产使动物产生对环状病毒感染的免疫性的疫苗中的应用。
在第九方面，本发明提供根据本发明第四方面的分离的核酸分子使动物产生对环状病毒感染的免疫性的疫苗中的应用。
在第十方面，本发明提供一种根据本发明第二方面的环状病毒疫苗的生产方法，其包括：
(a)将衍生或获自环状病毒基因组的分离的核酸分子接种到一个含胚卵的蛋黄囊中，其中这种核酸分子包括至少包含一部分内含突变的病毒蛋白2(VP2)的编码区；
(b)使环状病毒由分离的核酸开始复制；并且
(c)从卵中收集病毒。
优选的，环状病毒为鸡贫血症病毒(CAV)，TT病毒(TTV)或其他相似的病毒。更优选的，环状病毒为鸡贫血症病毒(CAV)。环状病毒定义包括CAV及其他病毒，这类病毒拥有单链、负义、环状DNA基因组，并表达功能上同CAV VP2蛋白具有同等活性的蛋白。
优选的，分离的核酸分子包括完整的内含突变的环状病毒基因组，突变可以发生在VP2翻译起始区，或PTPase基序，或酸性α螺旋区，或碱性β折叠区。
在本说明书全文中，除非上下文另有要求，“包含”，或其变体“含有”或“包括”将被理解为暗含所述的成分、整体或步骤，或者是一组成分，整体或步骤，而不包括其他任何成分、整体或步骤，或一组成分、整体及步骤。
任何本说明书中已包括的文件、法规、材料、设备、文献等都只适用于本发明。与本申请各个权利要求的优先权之前在澳大利亚存在的不同，这些材料中的任何或全部不应视为承认其形成现有技术基础的部分或与本发明相关的领域中的常识。
为使本发明更清楚地加以理解，参照下列附图和实施例，将对优选形式进行描述。
附图简述
图1为Chou-Fasman图，显示VP2两个预测的残基128-143位两性分子的α螺旋区，以及残基151-158位两性分子的β折叠区。
图2显示mut C 86 R转染MSB1细胞。
图3显示mut C 95 S转染MSB1细胞。
图4显示mut C 97 S转染MSB1细胞。
图5显示mut R 101 G转染MSB1细胞。
图6显示mut H 103 Y转染MSB1细胞。
图7显示mut R 129 G转染MSB1细胞。
图8显示mut Q 131 P转染MSB1细胞。
图9显示mut R/K/K 150/151/152 G/A/A转染MSB1细胞。
图10显示mut D/E 161/162 G/G转染MSB1细胞
图11显示mut L 163 P转染MSB1细胞。
图12显示mut D 169 G转染MSB1细胞。
图13显示与CAV VP2氨基酸序列比对的R-PTPase同系物，使用ECLUSTALW软件(WebANGIS)，并使用Seqvu软件(Garvin Institute)通过图形显示。第一行：鸡α蛋白-酪氨酸磷酸酶(Z32749)，残基302-306，同源性评分30％。第二行：人类αR-PTPase(PP18433)，残基301-353，同源性评分32％。第三行：大鼠αR-PTPase(Q03348)，残基295-347，同源性评分32％。第四行：小鼠αR-PTPase(P18052)，残基328-380，同源性评分32％。第五行：人类αR-PTPase(17011300A)。第六行：人类胎盘蛋白酪氨酸磷酸酶(CAA38065)，残基292-345，同源性评分32％。第七行：CAV VP2。
图14显示CAV VP2氨基酸序列与SANBAN TTV序列的比对，使用ECLUSTALW软件(WebANGIS)，并使用Seqvu软件(GarvinInstitute)通过图形显示。Genebank中TT病毒的登记号被显示出来。
图15显示谷胱甘肽-S-转移酶(GST)融合蛋白在12.5％聚丙烯酰胺凝胶中的电泳分离，考马斯亮蓝染色。第一泳道：宽范围分子量标准(Biorad)；第二泳道：2.6μg CAV VP2-GST融合蛋白；第三泳道：3.0μg GST。
图16显示Western印迹结果，探针使用小鼠抗VP2的COOH-端区的多克隆抗血清。第一泳道：宽范围的分子量标准(Biorad)；第二泳道：3.0μg GST；第三泳道：2.6μg CAV VP2-GST融合蛋白。
图17显示Western印迹结果，探针使用兔抗GST多克隆抗血清。第一泳道：分子量标准(Biorad)；第二泳道：3.0μg GST；第三泳道：2.6μg鸡贫血症病毒VP2-GST融合蛋白。
图18显示磷酸盐从ENDY(Pi)INASL释放时间曲线，以VP2-GST融合蛋白或GST对照制剂催化。反应在底物浓度为15nmol的条件下进行。活性[V]以每个时间点所释放的磷酸盐nmol数来衡量。
图19为在PTPase分析中VP2-GST融合蛋白及GST对照蛋白的PTPase活性。底物浓度为10nmol，反应时间为1分钟。起始活性[V0]以每种底物浓度下所释放的磷酸盐nmol数来衡量。测试中每个底物浓度均值的标准误差小于0.101。
图20显示TLMV VP2 PTPase活性同CAV VP2活性的比较。
实施发明的方式
试验步骤
I.CAV疫苗
CAV基因组分析及突变位点设计
稍后描述的研究(试验步骤-VP2)已经建立了PTPase活性，并通过同已知的PTPase  特征基序的比较，对特征基序中预测的关键残基已加以鉴定。这些残基是在感染性全长CAV基因组克隆中设计突变策略的基础。根据突变对体外PTPase酶催化影响的了解，可以设计突变来修饰PTPase在感染中的作用。为了证明这一策略的实用性，位于CAV VP2上的突变靶位点为第86，95，97，101，以及103位。第86位残基由正常状态的C突变到S(mut C 86 S)，其他示范性突变为mut C 95 S，mut C 97 S，mut R 101 G和mut H 103 Y。突变mut C 95S和mut C 97 S将预测中认为对PTPase活性起关键作用的半胱氨酸去除，这些半胱氨酸在催化过程中参与形成半胱氨酰-磷酸。突变mutR101 G去除碱性带正电荷的残基，预测这些残基对PTPase活性是必须的，并参与磷酸酪氨酸底物同催化性半胱氨酸残基的协同过程。第103位和86位残基位于预测的特征基序的侧翼，而且在TT病毒和CAV病毒中高度保守。
在ANGIS界面(WebANGIS，澳大利亚国立基因组信息服务(Australian National Genomic Information Service))上使用可获得的软件，对VP2蛋白结构进行了预测。蛋白的一个高级二级结构区被鉴定朝向VP2的C端。该区域的Chou-Fasman图预测由α螺旋组成的酸性区，接着是一个由α螺旋和β折叠组成的碱性区，而后是第二个α螺旋的酸性区。二级结构被一系列脯氨酸残基进一步细分。预测有两个区，一个为128-143位残基的两性分子α螺旋区；另一个是151-158位残基的两性分子β折叠区(图1)。高级二级结构预计同功能蛋白结构域有关联。对该蛋白二级结构的预测可以指导在蛋白中引入突变，以破坏突变所在区域的结构，因而修饰这一区域的功能。为显示在预测的碱性两性分子α螺旋的区域中引入突变的效应，构建了mut R 129 G和mut R/K/K 150/151/152 G/A/A突变体，以中和分布在二级结构中的极性碱性电荷。还在此区域中将mut Q 131 P引入α螺旋中，以破坏螺旋。使用同样的方法，引入mut L 163 P突变可以破坏酸性α螺旋区域。在酸性α螺旋区域引入突变mut D/E 161/162 G/G和mut D 169G，试图中和酸性电荷的分布。突变的CAV基因组核酸序列及VP2氨基酸序列列在序列号1-28中。
引物设计
在所有的试验中，使用CAV的CAU269/7澳大利亚分离株。对于每个要引入突变的位点，都合成一对互相重叠的寡核苷酸，分别同CAV VP2序列的两条链互补。设计寡核苷酸对引入编码氨基酸改变的核苷酸替换。CAV基因组在3个不同的重叠开放读码框中编码3个基因。CAV VP2突变靶区域同ORF1及ORF3重叠，这两个读码框同VP2相比，读码框分别移动一个和两个碱基对。所有引入的突变都没有改变由ORF2和ORF3读码框所编码的氨基酸序列。表1列出了在CAVVP2中引入突变时所使用的引物。
表1.在CAV VP2序列内引入编码定向突变的碱基变化的引物。突变编号根据VP2氨基酸序列的编号设定。突变后的氨基酸残基被标示出来。
导入CAV VP2            正义寡核苷酸           负义寡核苷酸
  的突变
mut C 86 R             ctgcgcgaaCgctcgc       aacgcgagcGttcgcg
                       gttcccacgctaag         cagccacacagcga
mut C 95 S             cgctaagatcAgcaact      cgcagttgcTgatctta
                       gcg                    gcgtg
mut C 97 S             atctgcaacAgcggac       attgtccgcTgttgcag
                       aattc                  atcttag
mut R 101 G            ctgcggacaattcGga       cagtgttttcCgaatt
                       aaacactgg              gtccgcag
mut H 103Y             cagaaaaTactggtttc      gaaaccagtAttttct
                       aagaatgtgccggac        gaattgtccgcag
mut R 129 G            ctgcgacccctcGgag       ccctgtactcCgaggg
                       tacaggg                gtcgcaggatcgc
mut Q131 P             cgagtacCgggtaagc       cgcttcccGgtactc
                       gagctaaaag             ggagg
mut R/K/K 150/151/152  ccgaacGgcGCgGCg        atacaccGCcGCgcCg
G/A/A                  gtgtataag              ttcggggtc
mut D/E 161/162 G/G    taagatggcaagGcg        tgcgagcCcgCcttgc
                       Ggctcgcagacc           catc
mut L 163 P            gacgagcCcgcagacc       ggcctctcggtctgcg
                       gagag                  Ggctcgtc
mut D 169 G            gagaggccgGttttac       gcgtaaaaCcggcctc
                       gccttcag               tcggtc
mut K 102 E            ctgcggacaattcagaGa     gaaaccagtgttCtct
                       acactggtttc            gaattgtccgcag
mut E 186 G            gcgacttcgacgGaga       tttatatctCcgtcgaag
                       tataaatttc             tcgc
重叠延伸PCR突变
通过重叠延伸PCR的方法，将突变引入CAV VP2序列中。除非另有说明，下面的方法适用于所有突变的构建体。PCR模板为CAV(pCAU269/7)在质粒载体pGEX-4Z(Promega)上的全长基因组克隆。模板DNA自E.Coli DH5α中制备，其含pCAU269/7克隆，在含50μg/mL的氨苄青霉素选择下Luria-Bertani琼脂培养基(LA)中于37℃培养。使用Qiagen试剂盒，根据其生产商(Qiagen)提供的使用方法提取质粒。引入突变的PCR反应由两个阶段来实现。第一个阶段包括2个PCR反应：一个反应由上游侧翼引物到负义突变引物；另一个反应由下游侧翼引物到正义突变引物。在第二个阶段，来自第一对引物反应的PCR产物作为模板，使用侧翼引物完成缝合PCR反应。所生成的PCR产物的长度由侧翼序列限定，其两条链上含有在第一阶段PCR中引入模板的突变。
上游侧翼引物CAV.1-5’CTATCGAATTCCGAGTGGTTACTAT3’和下游侧翼引物CAV.10-5’TGCTCACGTATGTCAGGTTC 3’用于缝合PCR反应，构建mut C 95 S和C 97 S。在第一阶段，100μL的反应混合物中含dATP、dCTP、dGTP、和dTTP各300μM，2mMMgSO4，每条引物各200μM，10μL 10×Platinum Pfu Taq DNA聚合酶缓冲液，2U Platinum Pfu Taq DNA聚合酶(Promega)和1μL模板DNA。PCR反应为95℃预热2分钟，而后是30圈循环：95℃40秒，60℃60秒，68℃40秒，最后68℃孵育5分钟。使用Dpn I限制性核酸酶(Life Technologies)消化去除第一阶段的模板。PCR产物经琼脂糖(1％)凝胶电泳鉴定，切割对应于第一阶段PCR反应的产物条带，根据厂商说明书使用Qiaex II(Qiagen)凝胶回收试剂盒纯化。对于缝合PCR反应，100μL的反应混合液中含dATP、dCTP、dGTP、和dTTP各300μM，2mM MgSO4，每条引物各200μM，10μL 10×高保真TaqDNA聚合酶缓冲液，2U高保真Taq DNA聚合酶(Promega)和1μL模板DNA。PCR反应为95℃预热2分钟，而后是一圈循环：95℃40秒，57℃90秒，68℃40秒；接着是15圈循环：95℃40秒，57℃60秒，68℃40秒，最后68℃孵育5分钟。
其他所有突变体的突变方法都按上述实施mut C 95 S和mm C 97S的方案实施，但C 86 R和H 103 Y突变除外。这后两个反应的上游侧翼引物为CAV.2-5’GCGGAGCCGCGCAGGGGCAA 3’，下游侧翼引物为CAV.10。在第二阶段缝合PCR时反应方案为：96℃预热2分钟，而后是15圈循环：96℃40秒，58℃60秒，72℃60秒，最后72℃孵育5分钟。
在试图对mut C 86 R和mut H 103 Y进行PCR缝合突变产物中试验了各种PCR反应条件都失败了。因此在单个PCR反应中，采用全循环重叠延伸突变的办法同时引入mut C 86 R和mut H 103 Y突变。如前文所述设置100μL反应混合物，不过仅使用相应的突变引物。PCR反应为96℃预热2分钟，而后是一圈循环：96℃40秒，55℃90秒，68℃5分钟；接着是40圈循环：96℃40秒，60℃60秒，68℃5分钟，最后68℃孵育5分钟。使用Dpn I限制性核酸酶消化去除模板DNA，PCR反应产物的纯化按标准的酚，酚-氯仿，和酚-氯仿-异戊醇萃取，乙醇沉淀进行。
突变构建体的克隆
除非另有说明，下面的方法适用于所有突变构建体的克隆。含有突变序列的PCR产物被亚克隆到位于质粒载体pGEX-4Z，pCAU269/7上的感染性CAV克隆中。使用StuI和BsmI限制性核酸酶切割PCR产物，琼脂糖(1％)凝胶电泳分析。一个长357bp的条带被切胶回收，并根据厂商的说明书通过Qiaex II(Qiagen)凝胶抽提纯化。pCAU269/7同样也使用StuI和BsmI限制性核酸酶切割，去除将要由突变序列取代的357bp区域，自1％琼脂糖凝胶中纯化4687bp的条带。然后遵照标准方案，将PCR产物连接到同经上述两内切酶切割的CAV-pGEX-4T-2(Promega)骨架上。电穿孔法将连接的质粒转化DH5α大肠杆菌，并在含50μg/mL的氨苄青霉素的Luria-Bertani琼脂培养基(LA)中于37℃培养。从选中的克隆中使用Qiagen试剂盒(Qiagen)根据厂商说明书提取质粒。使用CAV.2正向引物和CAV.10反向引物通过PCR的方法对插入筛选阳性克隆。使用Taq染料脱氧循环测序试剂盒(Taq DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit)(Perkin Elmer)对克隆DNA进行测序，测序引物为CAV.2和CAV.10。
构建mut C 86 R和mut H 103 Y的方法如前所述，除了有下面的变化。根据厂商说明书，将纯化的第二阶段PCR产物首先克隆到pGEM-4T-2载体(Promega)中，而后使用StuI和BsmI限制性核酸酶切割，并亚克隆到pCAU269/7中(方法如前文所述)。mut C 86 R和mut H103 Y PCR产物在用DpnI限制性核酸酶消化后，按照标准方案加以连接，通过电穿孔法转化到DH5α大肠杆菌，在含50μg/mL氨苄青霉素的Luria-Bertani琼脂培养基(LA)中于37℃培养。而后使用前面描述过的方法筛选含有突变序列的克隆。
突变病毒基因组转染MSB1细胞
pCAU269/7，pEGFP-C2作为对照，同构建体mut C 86 R，mut C 95S，mut C 97 S，mut R 101 G，mut H 103 Y，mut R 129 G，mut N 131 P，mut R/K/K 150/151/152 G/A/A，mut D/E 161/162 G/G，mut L 163 P，mut D 169 G以及mut E 186分别转染培养细胞。使用Qiagen质粒纯化试剂盒制备转染用的CAV DNA。所有构建体都使用EcoR I限制性核酸酶切割，以释放基因组插入片段，1％琼脂糖凝胶电泳，从凝胶切割回收2298bp的条带，用Qiaex II(Qiagen)质粒纯化试剂盒，根据厂商使用说明书加以纯化。纯化的CAV DNA重悬浮于灭菌的10mMTris(25℃时pH 8)中。制备转染对照pEGFP-C2 DNA作为未消化的质粒，其中在CMV启动子下游含有绿色荧光蛋白(GFP)基因。
Marek氏病病毒转化的淋巴细胞系MDCC-MSB1细胞系用于所有试验中。细胞在RPMI 1640培养基(Sigma Chemical公司，St.Loius，Misssouri，U.S.A)中生长，内补充有2mM谷氨酰胺(Sigma)，2mM丙酮酸(Sigma)，0.2％NaHCO3，50μg/mL氨苄青霉素(CSL)，50μg/mL庆大霉素(CSL)以及10％胎牛血清(Flow Laboratories)(52℃热灭活)(完全培养基称为RF10)，37℃5％CO2培养。转染前24小时，培养细胞转移到新鲜培养基中，以使细胞周期阶段同步化。细胞在不含FCS的RPMI中漂洗两次，重悬，使其终浓度为107细胞/mL，对每个样品，将700μL等份细胞悬浮液与10μg相关DNA一起转移到一个小离心管中，置冰上。在基因脉冲仪(Gene Pulser apparatus)(Bio Rad)中，用长时间低电压在0.4cm间隙电穿孔杯中脉冲通过电内化作用实现转染。在400v，900μF，电阻∞，扩展电容下产生脉冲。细胞在室温下孵育5分钟，而后重悬于5mL预先温热的生长培养基中。48小时后根据对照转染组中GFP表达阳性的细胞比例评估转染效率。
突变CAV构建体的复制能力及感染性的评估
突变病毒在细胞培养物中的感染性及复制能力的评估来自转染有突变病毒构建体转染的MDCC-MSB1细胞。培养细胞每隔48小时以1/10稀释连续传代，共传10代。根据表达VP3蛋白细胞的百分比，对样品(每48小时取样)的感染性进行评估。使用免疫荧光法检测VP3蛋白。受感染细胞漂洗两次，重悬在200μL pH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)中，并施加到多孔载片上。在所有的孵育之间，细胞都用含有0.1％BSA和0.05％吐温20的PBS溶液漂洗。细胞用冰冷的90％甲醇固定5分钟，而后在37℃加湿室中用5％BSA/PBST溶液封闭1小时。一抗为小鼠抗VP3单克隆抗体(TropBio)，以1/200比例稀释在0.1％BSA/PBST中，37℃加湿室中孵育1小时。二抗为羊抗小鼠单克隆抗体，交联有异硫氰酸荧光素(Dako)，以1/100比例稀释在0.1％BSA/PBST中，孵育1小时。不同传代数的荧光细胞百分比可相对于对照MSB1细胞的背景荧光加以定量测定。
从最早代次的CAV感染率显示至少50％的受感染细胞培养物中制备突变的病毒。培养细胞冻融三次，而后6000g离心10分钟收集上清。使用该病毒制备液重新感染MDCC-MSB1细胞。通过这种方法制备病毒并再次感染细胞培养物，每种情况下重复至少三次病毒传代。通过免疫荧光分析表明复制全能病毒的回收(如上文所述)，PCR检测感染细胞裂解液，之后用CAV特异性探针进行Southern印迹，以及Western印迹检测感染细胞裂解液。在突变CAV感染后48小时自MDCC-MSB1细胞纯化细胞DNA制备物，使用蛋白酶K和十二烷基硫酸钠(SDS)裂解细胞，酚/氯仿抽提。参考文献见Meehan，B.M.，Todd，D.，Creelan，J.L，Earle，J.A.，Hoey，E.M.和McNulty，M.S.(1992)。自感染有鸡贫血症介质的细胞中表征病毒DNA：克隆基因组片段的克隆复制形式的序列分析和转染能力(Characterization of viralDNAs from cells infected with chicken anaemia agent：sequence analysisof the cloned replicative form and transfection capabilities of clonedgenome fragments).Arch Virol 124，301-319。使用CAV.2和CAV.10引物对，根据前文所述的相应的PCR反应条件，对突变序列进行扩增。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，并使用毛细转移法，转移到Hybond-N(Amersham)尼龙膜上(Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.(1989).Molecular Cloning，A Laboratory Mnual，(C.Nolan编).NewYork：Cold Spring Harbor Laboratory Press)。转移后，将尼龙膜在6×SSC缓冲液中漂洗10分钟，并在透射仪上曝露于紫外线照射10分钟。使用商业化试剂盒(Boehringer Mannheim)，按使用说明书用随机六聚体引发DNA合成，从CAV基因组克隆DNA制备放射性标记的CAV特异性探针。该尼龙膜在含5×SSC、5×Denhart氏溶液、100μg/mL变性鲑鱼精子DNA及0.5％SDS的预杂交缓冲液中浸泡，并向其中加入预先制备的放射标记探针。探针同吸附在膜上的DNA 50℃过夜杂交。膜上的印迹用含2×SSC及0.1％SDS的溶液68℃漂洗三次，每次20分钟，而后将放射成像胶片于-70℃曝光印迹4小时。
使用103受突变CAV感染的MDCC-MSB1细胞的裂解液进行Western印迹分析。蛋白在含12.5％十二烷基硫酸钠(SDS)的聚丙烯酰胺胶中电泳，考马斯亮蓝染色(Laemmli，U.K(1970)噬菌体T4头部组装过程中结构蛋白切割(Cleavage of structural proteins during theassembly of the head of bacteriophage T4).Nature 227，680-685)。蛋白经电转移到聚二氟乙烯膜(PVDF：Immobilon，Millipore)上。Western印迹先用探针小鼠抗CAV VP3单克隆抗体(TropBio)，以1/2000比例稀释在0.1％BSA/PBST中，孵育1小时，接着再用二级羊抗小鼠单克隆抗体辣根过氧化物酶(HRP)结合物，1/2000比例稀释，最后用化学发光底物显色(Amersham Pharmacia)。
显示突变CAV病毒的体外表型
对突变病毒的生长特性及细胞致病性进行了研究。根据由pCAU269/7制备的对照病毒，通过平板来估计CAV突变病毒的滴度。在8×12多孔板(Nunc)上每孔加200μL浓度为5×105MSB1细胞/mL，进行滴度测定。病毒储液进行一系列的10倍稀释，重复6次，其最终稀释因素从0.05到0.5×10-10。每隔48小时，受感染细胞按1∶4比例连续传代至新鲜培养基中。每个孔按细胞病理学效应(CPE)的表现进行评分。CPE的指标是细胞肿大、胞核呈空泡状及染色质凝集、细胞片段化及培养基碱化。细胞培养物进行连续传代，直到在终点或最低稀释的情况下，连续传代之间检测没有差别，此时有50％的孔中观察CPE现象。CPE观察经终点稀释的免疫荧光检测证实。使用Karber法，滴度计算为50％感染的组织培养物感染剂量(TCID50/mL)。通常需要传5-7代，才可达到终点。
通过平板滴度试验测定的病毒储液滴度由荧光激活细胞分选技术(FACS)进行证实，亲本病毒作为标准品对照。将病毒储液在0.5mL体积的RPMI中从100到10-4以十倍逐级稀释。病毒稀释液而后吸附到4×106的MSB1-MDCC细胞上，并重悬于4mL RF10中，转移至一个6孔板上。感染48小时后，取2mL细胞以1500g离心5分钟形成沉淀。这些受感染细胞经固定、透化处理、封闭非特异性表面反应性后准备进行免疫荧光染色。所有冲洗使用5mL体积的1％FCS和1mM叠氮钠(NaN3)的PBS。更换缓冲液需经离心，1500g离心5分钟。细胞于4℃在1mL 3％超纯甲醛及1mM NaN3的PBS中孵育45分钟而加以固定。固定的细胞而后用5mL 0.1M的甘氨酸及1mM NaN3漂洗，接着在0.5mL 0.1％Triton-X100和1mM NaN3的PBS中重悬而透化处理5秒，最后用4.5mL的漂洗缓冲液稀释，随后漂洗两次。透化处理后，后面所有的步骤都要在冰上操作细胞。4℃在10％FCS及1mM NaN3的PBS孵育15分钟，封闭非特异性反应，而后漂洗两次。一抗为50μL小鼠抗VP3单克隆抗体(TropBio)，以1/50比例稀释在漂洗缓冲液中，细胞在此于4℃孵育45分钟。二抗为羊抗小鼠单克隆抗体，交联有FITC(Dako)，以1/50比例稀释在漂洗缓冲液中，并将细胞在此于4℃孵育45分钟。免疫染色的细胞在200μL 1％超纯甲醛及1mMNaN3的PBS中存储多达16个小时。
pCAU269/7病毒储液已在前面三次情形下通过平板进行了滴度测试，被用作各个FACS分析的标准对照。使用Cellquest软件进行数据采集和分析。流式细胞仪设置见表2。
表2  流式细胞仪设置
参数        探测器        电压        增益        模式
 P1          FSC          E01         1.81        线性
 P2          SSC          366         1.00        线性
 P3          FL1          469         1.00        对数
门控的淋巴细胞群依赖于荧光强度的变化，以柱状图显示。可以看到两个分开的正常分布的细胞群：一个因背景染色和自发荧光产生的低荧光强度峰，另一个特异性高荧光强度峰。设置了一个可视标记物，从而包括高荧光密度染色的细胞，特别是CAV VP3，以及含有＜0.05％阴性对照未感染的样品中的细胞。标记区中病毒稀释对细胞计数绘制的标准曲线，建自病毒储液。根据三次试验各自独立建立该曲线。测试病毒储液的相对稀释度通过并行标准曲线而来的FACS曲线转换计算得出。
如前文所述，使用特异于VP3的单克隆抗体，通过相差显微镜以及固定细胞的染色来对体外细胞病理学进行评估。细胞在Hoescht中复染2分钟。免疫荧光染色(IFA)的进行也使用针对VP2 C端区的小鼠多克隆抗血清，稀释度为1/100，二抗为羊抗小鼠多克隆抗体，交联有FITC(Dako)，再次以1/100比例稀释在0.1％BSA/PBST中。
含胚卵的攻击模型
在含胚卵中开发了攻击模型，以评估突变CAV病毒的感染力和体内表型。该模型最初用于证实pCAU269/7 DNA(克隆病毒)转染而得到的病毒和亲本CAV病毒株CAU269/7病毒(亲本病毒)之间的等效性。亲本病毒pCAU269/7和模拟MSB1接种体接种7日龄胚胎的蛋黄囊单独重复3次。而后用病毒mut C 86 R，mut R 101 G，mut H 103Y，mut R 129 G，mut N 131 P，mut R/K/K 150/151/152 G/A/A，mut D/E161/162 G/G，mut L 163 P，mut D 169 G，以及mut E 186 G在该模型上进行测试并同克隆病毒及未感染的MSB1细胞对照接种体进行比较。在两个单独场合中重复突变体的攻击试验。
含胚卵的接种
从400mL受MDCC-MSB1感染的细胞培养物中制备用于接种的病毒储液，方法采自Todd，D.，Mackie，D.P.，Mawhinney，K.A.，Conner，T.J.，McNeilly，F.和McNulty，M.S(1990).开发酶联免疫吸附分析以检测对鸡贫血剂的血清抗体(Development of an enzyme-linkedimmunosorbent assay to detect serum antibody to chicken anemia agent).Avian Dis 34，359-363。简而言之，400mL细胞培养物在冰浴中以低频方式超声破碎，加入SDS至5％，细胞裂解液在37℃中孵育30分钟。10000g离心30分钟去除细胞碎片。15℃、80000g超速离心3小时收集病毒。病毒沉淀在RPMI培养基中漂洗，再次以80000g离心3小时。根据前文描述对病毒储液进行滴度测定，将其重悬，终滴度为104.5TCID50/mL。
由SPAFAS Australia Pty.Ltd，James Rd(PO Box641)，WoodendVIC 3442，Australia处获得无特定病原体的(SPF)受精鸡蛋。鸡蛋在Multiplo Brooder孵化器中培养，容量为300个鸡蛋，手工转动。利用24号针头，将0.5mL病毒接种量或104 TCID50接种到7日龄含胚卵的蛋黄囊中。
评估突变病毒的感染性和体内表型
通过免疫荧光法在分离自骨髓、胸腺、脾脏及粘液囊的细胞中检测病毒蛋白VP3来评估病毒的感染性。由股骨髓腔中移出的骨髓制备压片制备物。使用上述对细胞培养物的免疫荧光检测方法，检测骨髓中的CAV VP3蛋白。根据21日龄胚胎的体重、淋巴器官重量、总的病理损害评分对体内表型进行评估。对全胚胎、分离的胸腺、脾脏及滑氏囊称重。Vitteline静脉穿刺或心脏穿刺采集血液，对压缩细胞的体积(PCV)进行测量。使用一个CAV感染靶器官损害评分的标准化系统，对总的病理损害进行评价。
损害评分
建立了一套分级评分系统，以使得与CAV感染有关的损害严重性分类相符。发生在胸腺、骨髓、脾脏、滑氏囊的病理损害，以及出血发生率评估为1到4级。从上述所有损害评分中对病理的总严重性得出损害累计分数，其中胸腺和骨髓损害分数值要乘二，因为它们是感染的关键性器官。在所有的病例中，如果评分值为1，表示没有病理损害发生。表3-8列出对总的病理损害的评分标准。
表3  胸腺损害评分
 分级分数     分类                   描述
    4     严重 80％-100％叶实质丧失，+/-严重出血症状，+/-严重血性渗出
    3     中度 50％-80％叶实质丧失，+/-中度出血症状，+/-中度血性渗出
    2     轻度 小于10％-50％叶实质丧失，或轻微出血症状，或轻微血性渗出
表4  骨髓损害评分
 分级分数     分类                     描述
    4     严重     80-100％骨髓基本上全部丧失，重度苍白
    3     中度     30-50％骨髓点状丧失，中度苍白
    2     轻度     骨髓与正常状态比，稍显苍白；或急性骨髓溶解和出血。
表5  脾脏损害评分
 分级分数     分类                     描述
    4     严重     70-90％体积减少，重度苍白，+/-囊下出血
    3     中度     30-50％体积减少，中度苍白，+/-囊下出血
    2     轻度     体积减少＜30％，或轻度苍白，或轻度囊下出血
表6  滑氏囊损害评分
 分级分数     分类              描述
    3     严重     约50％体积减少，皱褶塌陷
    2     轻度     约30％体积减少
表7  出血损害评分
 分级分数     分类                   描述
    3     严重     出血淤点广泛出现于皮下组织和筋膜层，或在肠系膜，或在器官，或静脉穿刺血液外观呈水性。
    2     中度到轻度     低级淤点仅出现在大腿或肋或翼尖。
表8  总累计损害评分
   分级分数        分类
    19-13     重度CAV损害
    13-18     中度CAV损害
    8-2     轻度CAV损害
结果
1.CAV疫苗
含有突变表型的CAV的构建
通过PCR介导突变的方法，制备构建体mut C 86 R，mut C 95 S，mut C 97 S，mut R 101 G，mut H 103 Y，mut R 129 G，mut Q 131 P，mut R/K/K 150/151/152 G/A/A，mut D/E 161/162 G/G，mut L 163 P，mut D 169 G和mut E 186 G，并将构建体亚克隆到全长基因组CAV克隆pCAU269/7中。通过对最终的构建体从两个方向越过突变位点进行两次测序，证实每个构建体存在突变。将这些构建体转染细胞培养物，得到含有突变基因型的病毒。通过对照质粒pEGFP转染众多细胞后表达GFP的情况来评估转染效率。转染效率是可变的，并在感染后48小时，发现1到40％的细胞对表达GFP是阳性的。pCAU269/7转染导致CAV VP3瞬时表达的最初阶段，正如由IFA所观测的结果。瞬时表达不必代表病毒的活跃复制。需要进行次数不等的传代，才会出现IFA法证实对对照VP3表达为阳性的细胞数呈指数增长的现象。1/10稀释连续传代。因此CAV VP3阳性细胞数呈指数增长代表病毒处于活跃复制和高感染活性的状态，而不仅仅是维持转染的DNA构建体。当采用pCAU269/7和模拟对照进行平行评价时，所有分析的CAV VP2突变构建体都表现出有感染性，并能够在体外进行一定程度的复制(图2到12)。对于每个构建体，病毒复制能力不依赖于细胞结合，这一点可以通过细胞培养物再感染后的细胞裂解及澄清得到证实。这些过程连续重复四代以上。通过检测CAV VP3 western印迹；使用CAV特异探针进行Southern印迹；用Dpn I限制性核酸内切酶消化细胞培养物去除残余的转染DNA再进行PCR，可证实病毒的存在。通过对细胞裂解物中的PCR产物进行测序，可以确认突变基因型。
尽管所有的突变构建体都可以产生有复制能力的病毒，但突变体mut C 95 S和mut C 97 S病毒产生的最大log病毒滴度(TCID50/mL)分别为1.5和1.7，反复尝试优化培养条件后也是如此。这些病毒滴度过低，无法接种胚胎，故没有对突变体mut C 95 S和mut C 97 S进行进一步的研究。突变体mut C 86 R，mut R 101 G，mut H 103 Y，mut R 129G，mut N 131 P，mut R/K/K 150/151/152 G/A/A，mut D/E 161/162 G/G，mut L 163 P，mut D 169 G和mut E 186 G在传代4代以上制备在感染培养物的终体积400mL中、超速离心浓缩、以等效滴度重悬操作后，都获得了4.5的log病毒滴度(TCID50/mL)(表9)。这些病毒滴度足够接种胚胎，通常使用0.5mL的储液或104.2TCID50。
表9.用于胚胎接种的浓缩病毒储液的滴度。滴度的确定通过平板效价以及通过克隆病毒标准相关的FACS分选得出。储液下评价通过PCR及测序确证其突变基因型。FACS滴度估计准确范围是+/-100.5TCID50/mL。
    突变体 Log FACS滴度TCID50/mL Log平板滴度TCID50/mL  储液上的PCR  对突变测序储液
  PCAU269/7     4.5     4.5     阳性     正确
  Mut C 86 R     4.5     4.5     阳性     正确
  Mut C 95 S     1.5     1.5     阳性     正确
  Mut C 97 S     1.5     1.7     阳性     正确
  Mut R 101 G     4.5     4.5     阳性     正确
  Mut H 103 Y     4.5     4.5     阳性     正确
  Mut R 129 G     4.5     4.5     阳性     正确
  Mut L 131 P     4.5     4.8     阳性     正确
  MutR/K/K150/151/152G/A/A     4.5     4.1     阳性     正确
  MutD/E161/162G/G     4.5     4.5     阳性     正确
  mut163     4.5     4.5     阳性     正确
  Mut D 169 G     4.5     3.9     阳性     正确
  Mut E 186 G     未做     4.5     阳性     正确
含胚卵中的感染模型
进行了一系列的感染试验。试验1和2建立了由克隆构建体pCAU269/7(克隆病毒)生成的病毒与亲本病毒之间等效的感染性及毒性。在亲本病毒及克隆病毒处理组中所有的试验鸡都发生了可归为严重CAV病理损害的胸腺、骨髓、脾脏的病变及出血症状。正如MannWhitney检验所确定，两组病毒感染试验鸡的胸腺、骨髓、脾、出血症状的损害评分没有统计学差异。两组损害评分同未感染试验鸡组相比在所有情形下有显著差异，但克隆病毒感染组的骨髓评分除外。同野生型病毒(亲本病毒或克隆病毒)相关的严重病理可以总结如下：所有试验鸡或胚胎的筋膜和皮下组织都可发现轻度到中度瘀点。脾脏体积减小50-80％，总体外观呈异常苍白状，并有囊下出血。在所有的试验鸡中，胸腺叶的体积减小，损害归类为严重级，大部分脾脏外观上可见叶出血或囊下出血，叶中可见凝胶状血性渗出物，与急性细胞溶解相符。骨髓内容物减少，或者表现为苍白油性外观，或者出现严重的急性出血和裂解。一小部分试验鸡的滑氏囊体积减小，囊腔和实质皱褶表现为总体塌陷。
试验3-12涉及突变病毒和克隆病毒以及未感染对照的感染试验。统计学分析感染突变病毒的胚胎组、感染野生型病毒的胚胎组及对照组中胸腺淋巴细胞群、滑氏囊、脾脏的损害评分、体重、淋巴器官重量，结果列在表10-17。简而言之，感染突变病毒的胚胎组中的损害评分要明显低于野生病毒感染组，并在大多数试验鸡的淋巴器官中，损害也明显比较轻(表10)。同样，在体重、胸腺/体重比值、及脾脏/体重比值、囊/体重比值方面，突变病毒感染组同克隆野生型病毒CAU269/7感染组之间发现有显著差异(表11)。
表10.在CAV感染的胚胎中，淋巴组织的损害评分，出血评分以及累计评分。
                                                                                   中值损害评分#
                                                                                                                                             累计评分
                                   胸腺                       脾脏                    囊                 骨髓                    出血
                            S   R    n    P1  P2   S   R     n    P1  P2 S  R    n  P1 P2 S  R    n   P1  P2  S  R     n   P1  P2  S   R     n  P1  P2
CAU269/7                    3   1-4  24   NA   ***   3   1-4   14   NA   ***  1  1-3  24  NA  1   3  1-4  24  NA   ***   2  1-4   24  NA   ***  13  3-18  14  NA   ***
Mut C87R                    2   1-4  23   ***  ***   2   1-4   23   ***  ***  1  1-2  24      2  1-4  13  ***  ***   1  1-2   23  ***     6   2-8   13  ***  ***
Mut R101G
                            1   1-3  11   ***  **    2   1-2   11   **   ***  1  1-2  11      2  1-2  11  ***  ***   2  1-2   11  **   ***  5   3-8   13  ***  ***
Mut H103Y
                            2   1-4  22   ***  **    1   1-3   22   ***  ***  1  1-3  14      2  1-4  13  ***  ***   1  1-2   22  **      6   1-17  13  ***  ***
Mut R129G
                            3   1-4  20   ***  ***   1   1-3   18   ***  *    1  1-2  18      1  1-2  10  ***      1  1-2   19  **   *    4   2-9   10  ***  ***
Mut Q131P
                            2   1-4  14   ***  ***   2   1-4   14   *    ***  1  1-2  14      2  1-2  7   ***  ***   1  1-2   14  *       6   2-8   6   ***  ***
Mut R/K/K150/151/152G/A/A
                            2   1-3  19   ***  ***   1   1-3   19   ***  ***  1  1-2  18      2  1-4  9   *    **    2  1-3   19     ***  7   1-14  9   **   ***
Mut D/E161/162G/G
                            3   1-3  5    *    **    1   1-2   5    **      1  1-2  5       1  1-2  5   **       1  1-1   5   *       6   1-7   5   **   ***
Mut L163P                   2   1-5  20   ***  ***   1   1-4   20   ***  *    1  1-2  20      2  1-3  10  *    **    1  1-3   20  **      9   1-12  10  **   ***
Mut D169G                   3   2-4  10      ***   3   1-4   10      ***  1  1-2  10      2  1-4  10     ***   2  1-3   10     ***  9   6-13  10  *    ***
Mut E186G                   2   1-2  6    ***  *     1   1-2   6    **      1  1-2  6       1  1-2  6   **       1  1-2   6   **      3   2-5   6   ***  **
未感染                      1   1-1  17   ***  NA    1   1-1   17   ***  NA   1  1-1  17      1  1-1  28  ***  NA    1  1-1   18  ***  NA   1   1-1   17  ***  NA
病毒接种E7胚胎
# 中值损害评分
S 中值评分
n 试验组大小
R 范围
P1 CAU269.7与处理组之间的Mann Whitney检验P值
P2 对照阴性组与处理组之间的Mann Whitney检验P值
* P值有统计学差异0.05级
** P值有统计学差异0.01级
*** P值有统计学差异0.001级
 P值无统计学意义0.05级
表11.感染CAV的胚胎的体重，胸腺：体重，脾脏：体重和囊：体重。
Figure A0281514600391
                                         体重#                             胸腺：体重                      脾脏：体重                       囊：体重
                             μ                SEM     n     P1    P2    μ              SD      n    P1  P2  μ            SD     n     P1    P2  μ           SD    n    P1   P2
CAU269/7                     24.8     1.9     24    NA     ***    5.75     2.4     9    NA   ***  0.21   0.06   9     NA     ***  0.64   0.30   9    NA    **
Mut C87R                     34.60    1.4     20    ***         9.85     3.3     23   ***     0.34   0.1    23    **        0.91   0.40   23   *     **
Mut R101G                    37.95    1.9     8     ***         10.54    2.0     7    ***     0.37   0.07   7     ***       1.01   0.24   7    **    
Mut H103Y                    35.02    1.5     10    ***         9.94     3.5     22   ***     0.33   0.13   22    **        0.78   0.26   22       ***
Mut R129G                    34.13    1.8     14    **          10.68    3.5     19   ***     0.39   0.12   19    ***       1.03   0.35   19   **    
Mut Q131P                    36.95    1.6     10    ***         9.38     3.4     13   **      0.39   0.2    13    **        1.08   0.69   13   *     
Mut R/K/K150/151/152G/A/A    31.33    1.8     16    **          10.11    2.4     18   ***     0.32   0.1    18    **        0.82   0.36   18       **
Mut D/E161/162G/G            34.38    3.8     5     *           11.35    3.4     5    ***     0.39   0.05   5     ***       0.78   0.36   5        *
Mut L163P                    32.21    1.5     18    *           10.18    3.4     20   ***     0.42   0.1    20    ***       1.01   0.37   20   **    
Mut D169G                    33.10    3.5     10    *           9.15     2.5     9    **      0.28   0.1    9     *      *    1.40   1.10   9    *     
Mut E186G                    42.94    0.8     6     ***         10.03    2.7     6    **      0.36   0.1    6     ***       1.06   0.14   6    **    
未感染                       37.12    2.4     11    ***    NA     10.99    4.2     16   ***  NA   0.39   0.1    16    ***    NA   1.23   0.52   16   **    NA
Figure A0281514600392
病毒接种E7胚胎
μ 平均重量#(g)，或，平均器官重量(mg)：体重(g)
SEM 均值标准误差
SD 标准偏差
n 处理组中的数目
P1 CAU269/7和处理组之间的t检验P值
P2 对照阴性组和处理组之间的t检验P值
* P值有统计学差异0.05级
** P值有统计学差异0.01级
*** P值有统计学差异0.001级
 P值无统计学意义0.05级
淋巴细胞群的检测
评估病毒感染对主要淋巴器官的淋巴细胞群的影响。由胚胎切除胸腺、脾脏和囊，将其置于冰冷的含1％BSA和1mM NaN3的PBS漂洗缓冲液中。组织经初步浸泡并用50mm孔尼龙网过滤。滤器用冰冷的PBS漂洗缓冲液冲洗，收集组织匀浆并将其充分混合。在滤器上的残余组织的重量通过同滤器最初重量进行比较而得出。抽提的细胞在2000g离心7分钟，并重悬于4ml PBS漂洗缓冲液中。细胞悬浮液在一个Ficoll-Paque(Amersham Pharmacia Biotech)梯度以1000g离心5分钟，收集的细胞用PBS漂洗缓冲液漂洗两次。采集三重Coulter计数器和血球计读数。
检查胸腺、脾脏和囊的淋巴细胞群的体积(表12)，发现所有的突变病毒同野生型病毒相比，对淋巴细胞群的损耗明显降低。
淋巴细胞群的荧光激活细胞分离(FACS)
将mAbs小鼠抗鸡TCR1抗体(Southem Biotechnology)，小鼠抗鸡TCR2抗体(Southem Biotechnology)，小鼠抗鸡TCR3(SouthernBiotechnology)，小鼠抗鸡CD4-FITC结合物(Southern Biotechnology)，小鼠抗鸡CD8-FITC结合物(Southem Biotechnology)，以及小鼠抗鸡AvBu-1(Fred Davidson博士惠赠，Compton Laboratories，UK)的浓度进行了优化。两只White Leghorn鸡(SPAFAS)在CO2柜中无痛处死，死后切除胸腺、脾脏和囊，并置于PBS中。如前文所述，纯化收集的淋巴细胞。为确定用于FACS分析的最佳抗体浓度，小鼠抗鸡TCR1单抗以1/100，1/1000以及1/5000稀释度进行评价。小鼠抗鸡TCR2单抗以1/50，1/100以及1/1000稀释度进行评价。小鼠抗鸡TCR3单抗和小鼠抗鸡AvBu-1单抗以1/20，1/50，1/100稀释度进行评价。小鼠抗鸡CD4-FITC结合物和小鼠抗鸡CD8-FITC结合物单抗以1/20，1/50，1/100，1/200以及1/500稀释度进行滴度测定。根据最高抗体稀释度确定最佳稀释，在此最高稀释度可以最清晰地定义FACS分析上背景染色和信号染色，以及特定染色的波峰强度。
从每个胚胎的胸腺和脾脏中分离的淋巴细胞群使用双染色技术，对TCR1，TCR2，TCR3，CD4，CD8细胞表面标记物进行FACS分析以确定阳性细胞的比例。对每个胚胎，双份样品(106个淋巴细胞)都实施8种染色处理。在染色的第一阶段，细胞同下面的一种抗体4℃孵育30分钟：小鼠抗鸡TCR1单抗以1/1000稀释在PBS冲洗缓冲液中，或小鼠抗鸡TCR2单抗，稀释度为1/100，或小鼠抗鸡TCR3单抗，稀释度为1/100，或者全部三种单抗的组合。漂洗细胞，加入兔抗小鼠藻红蛋白(PE)交联的二抗(Sigma Aldrich)，以1/1500稀释，4℃孵育30分钟，而后用10％正常小鼠血清(Sigma Aldrich)的PBS 4℃孵育30分钟封闭。在第三步染色步骤中，每套4种处理用以下抗体4℃下孵育30分钟：1/100稀释的小鼠抗鸡CD4-FITC结合物，1/100稀释的小鼠抗鸡CD8-FITC结合物。
由试验鸡的胸腺、脾脏和囊收集的淋巴细胞样品对B细胞标记物禽Bu-1(AvBu-1)进行染色及分析。含106个淋巴细胞的样品同1/200稀释的AvBu-1小鼠抗鸡单抗孵育，而后用1/1500稀释的兔抗小鼠PE交联二抗4℃孵育30分钟。
使用流式细胞仪对双阳性和单阳性细胞的比例进行分析。
数据使用Cellquest软件(Becton Dickinson)进行分析。含10E8个细胞的样品按密度图表示，FITC染色强度显示在X轴上，PE染色强度显示在Y轴上。由对照细胞图形成的象限用来描绘阳性细胞群和阴性细胞群。计算该淋巴细胞子集的总淋巴细胞库的绝对规模和比例。
使用荧光激活细胞分离法，分析胸腺、脾脏和囊中不同淋巴细胞子集，发现突变病毒对CD4+TCR-，CD4+TCR1+，CD4+TCR2+的细胞数降低明显减少；在一些病例中CD4+TCR3+、胸腺细胞的细胞数降低显著减少(表13)，CD8TCR-的细胞数降低显著减少，而在一些病例是CD8+TCR1+，CD8+TCR2+，CD8+TCR3+，胸腺细胞的数目降低显著减少(表14)。总体上，突变也导致脾脏细胞这些子集中的降低减少(表15及16)。在一些病例，与野生型相比，突变病毒对B淋巴细胞群的影响明显降低(表17)。这些发现说明VP2突变显著降低了CAV的免疫抑制效应。
表12.由野生型病毒、VP2突变体CAU269/7感染的E21胚胎的胸腺、脾脏和囊中分离的淋巴细胞群。
                                                              平均淋巴细胞群(×106)#
                                        胸腺                     脾脏                      囊
                             μ            SEM   n   P1  P2  μ        SEM  n   P1  P2   μ       SEM  n   P1  P2
CAU269/7                     760    22    9   **   NA    27   2    9      NA    13   2    9   ***  NA
Mut C87R                     4002   78    10     **    27   4    10         49   10   10     **
Mut R101G                    1969   42    7      **    93   22   7   **   **    355  30   7   *    ***
Mut H103Y                    4374   61    9      ***   102  41   9      *     751  24   9      **
Mut R129G                    6080   28    7      *     155  64   7   *    *     118  6    7      *
Mut Q131P                    3735   85    5      ***   36   2    5          73   3    5      **
Mut R/K/K150/151/152G/A/A    2452   74    5      **    105  23   5   **   ***   120  9    5   **   ***
Mut D/E161/162G/G            5664   370   7      *     110  34   7   *    **    60   2    7      **
Mut L163P                    1838   22    7      **    163  5    7   **   ***   107  3    7      **
Mut D169G                    4678   173   9      *     248  8    9   **   ***   341  82   9   **   ***
Mut E186G                    1938   94    10  *    ***   80   2    10     *     105  2    10  *    ***
未感染                       3824   11    7   NA   **    31   2    7   NA       62   1    7   NA   ***
病毒接种E7胚胎                             * P值有统计学差异0.05级
#通过coulter细胞计测量的群体大小             ** P值有统计学差异0.01级
μ 平均值                                      *** P值有统计学差异0.001级
SEM 均值标准误差                              P值无统计学意义0.05级
n 样品规模
P1 未感染组与处理组之间的t检验P值
P2 CAU269/7与处理组之间的t检验P值
表13.由VP2突变体及野生型CAU269/7感染的E21胚胎的CD4+胸腺细胞群。
                                                                 平均CD4+胸腺细胞群(×106)#
                                 TCR-                         TCR1+                          TCR2+                          TCR3+
                     μ         SEM     n    P1   P2   μ          SEM    n    P1   P2   μ          SEM     n    P1   P2   μ          SEM     n     P1   P2
CAU269/7
                     133   29     19   ***   NA     7     2      7    **    NA     35    24      7    **    NA     29    15      7     NA    *
Mut C87R
                     728   251    18       **     110   28     10       **     222   85      11   *     *      66    33      10        **
Mut R101G
                     4008  1362   11   **    ***    121   23     8        ***    355   151     7        *      167   80      7         *
Mut H103Y
                     1985  21     22       *      202   48     8        **     332   64      8        ***    295   75      8         **
Mut R129G
                     9529  1839   20   ***   ***    323   134    7        **     2060  577     7    *     **     1311  418     7     *     ***
Mut Q131P
                     2747  366    18   ***   ***    87    32     6        **     143   45      6    *     *      99    50      6         
Mut R/K/K
                     885   184    15       ***    89    31     5        ***    177   70      5    *     *      214   82      5         **
150/151/152G/A/A
Mut D/E 161/162G/G
                     524   170    12       **     105   66     5        *      1291  114     5        *      869   77      5         
Mut L163P            8392  1546   8    ***   ***    75    16     7        ***    544   277     7        *      501   238     7         *
Mut D169G            3204  1027   18   ***   ***    248   153    5        ***    1315  530     5        **     639   287     7         ***
Mut E186G            8495  900    8    ***   ***    195   32     8    *     ***    2911  926     8   **     **     1427  492     8     *     **
未感染               977   178    19   NA    ***    98    35     7    NA    **     692   213     7   NA     **     409   165     7     *     NA
病毒接种E7胚胎
# 免疫染色和通过FACS测量的细胞群
μ 平均值
SEM 均值标准误差
n 样品规模
P1 未感染组与处理组之间的t检验P值
P2 CAU269/7与治疗组之间的t检验P值
* P值有统计学差异0.05级
** P值有统计学差异0.01级
*** P值有统计学差异0.001级
 P值无统计学意义0.05级
表14.由VP2突变体及CAU269/7感染的E21胚胎的CD8+胸腺细胞群。
Figure A0281514600451
                                                                 平均CD8+胸腺细胞群(×106)#
                                 TCR-                         TCR1+                          TCR2+                        TCR3+
                      μ           SEM   n    P1   P2   μ          SEM    n    P1    P2   μ          SEM    n    P1   P2   μ         SEM    n    P1   P2
CAU269/7
                      190    49    19   ***   NA    15    4      7    **     NA     28    22     7    ***   NA    20    15     7    NA    *
Mut C87R
                      560    49    18       *     34    8      10        ***    259   72     11       **    147   33     10       *
Mut R101G
                      5127   1237  11   *     ***   461   249    8         *      60    9      7    ***       255   80     7        *
Mut H103Y
                      2016   174   22   *     ***   229   33     8    *      ***    115   64     8            313   75     8        **
Mut R129G
                      12893  2153  20   **    ***   503   148    7    **     **     172   50     7        **    691   418    7        *
Mut Q131P
                      2830   479   18   ***   ***   66    35     6              64    32     6        ***   61    50     6    *     **
Mut R/K/K
                      595    101   15   **    ***   174   111    5         *      49    18     5        ***   258   82     5        **
150/151/152G/A/A
Mut D/E 161/162G/G
                      816    153   12       ***   188   115    5              258   103    5            1704  77     5        
Mut L163P             8356   80    8    **    ***   121   28     7         ***    150   41     7        **    619   238    7        **
Mut D169G             4162   1027  18   ***   ***   189   64     5         **     96    34     5        *     333   287    7        *
Mut E186G             10172  1203  8    ***   ***   230   18     8    **     ***    505   116    8    **    ***   1919  492    8        
未感染                1370   288   19   NA    ***   118   93     7    NA     **     159   14     7    NA    ***   93    25     7    *     NA
病毒接种E7胚胎
# 免疫染色和通过FACS测量的细胞群
μ 平均值
SEM 均值标准误差
n 样品规模
P1 未感染组与处理组之间的t检验P值
P2 CAU269/7与处理组之间的t检验P值
* P值有统计学差异0.05级
** P值有统计学差异0.01级
*** P值有统计学差异0.001级
 P值无统计学意义0.05级
表15.VP2突变体及CAU269/7感染的E21胚胎的CD4+脾细胞群。
                                                                    平均CD4+脾细胞群(×104)#
                                 TCR-                           TCR1+                          TCR2+                            TCR3+
                      μ         SEM    n    P1    P2   μ          SEM     n      P1    P2  μ           SEM    n     P1   P2   μ            SEM     n    P1  P2
CA U269/7
                      2    1      24   ***    NA     11    6       8      *      NA    78    48     8     *     NA    133     95      8    NA   *
MutC87R
                      3    2      31   ***         519   30      11          *     307   101    11        *     417     18      11      
Mut R101G
                      20   8      11        **     17    6       8           *     32    1      7     *     **    17      6       7    *    **
Mut H103Y
                      56   25     27        *      122   6       8      *      *     7058  291    7     *     **    11192   61      8    *    **
Mut R129G
                      6    1      5    *      **     210   190     7           *     142   119    7             97      72      7       
mut Q131P
                      23   8      18        ***    385   17      6           *     155   71     5             93      74      6       
mut R/K/K
                      14   5      15        ***    2319  13      5           *     2223  55     5     *     ***   3860    142     5    **   **
150/151/152G/A/A
Mut D/E 161/162G/G
                      40   9      12        ***    13    4       5           ***   16    8      5         **    13      5       5       **
Mut L163P
                      24   12     10        *      121   83      7           *     64    28     6     *     **    57      19       7   ***  ***
Mut D169G             241  14     29             4363  3       10          *     3226  273    10        *     3071    263      10     *
Mut E186G             7    1      10   **     **     200   10      8               40    1      8         *     50      10       8      **
未感染                17   4      19   NA     ***    98    35      7      NA    **     771   42     8     NA    *     506     217      7   *    NA
Figure A0281514600462
病毒接种E7胚胎
# 免疫染色和通过FACS测量的细胞群
μ 平均值
SEM 均值标准误差
n 样品规模
P1 未感染组与处理组之间的t检验P值
P2 CAU269/7与处理组之间的t检验P值
* P值有统计学差异0.05级
** P值有统计学差异0.01级
*** P值有统计学差异0.001级
 P值无统计学意义0.05级
表16.VP2突变体及CAU269/7感染的E21胚胎的CD8+脾细胞群。
Figure A0281514600471
                                                                 平均CD8+脾细胞群(×104)#
                               TCR-                          TCR1+                          TCR2+                          TCR3+
                     μ        SEM   n     P1   P2    μ         SEM    n     P1   P2   μ          SEM    n     P1   P2   μ          SEM    n     P1   P2
CA U269/7
                     6    2     24    *     NA      45   24     8     **    NA     152   11     8     *     NA     99    7      8     **    NA
MutC87R
                     5    2     32    *     ***     289  10     11        *      755   28     11        *      967   73     8         *
Mut R101G
                     16   7     10        *       23   7      8     *     **     16    4      7     *     **     25    9      7     *     **
Mut H103Y
                     63   4     27              1870 95     9     *     *      6417  28     9     *     *      7805  28     9     **    **
MutR129G
                     136   9    9     *     **      128  107    7              45    18     7     *     **     62    35     7     *     **
MutQ131P
                     28    1    18        **      503   41    6              621   32     6         *      954   57     5         *
Mut R/K/K
                     8     3    15              2246  64    5     **     ***   1312  383    5     *     **     1410  36     5     **    ***
150/151/152G/A/A
Mut D/E
                     39    6    10        ***     20    5     5     **     ***   13    3      5     **    ***    23    11     5     *     **
161/162G/G
Mut L163P            22    5    11        **      38    13    7     **     ***   32    6      8              54    24     6     *     **
Mut D169G            141   7    30        *       1922  69    10         *     1538  96     10        *      801   55     10        *
Mut E186G            5     2    10              40    10    8          **    40    10     8              70    20     8         **
未感染               20    24   10    NA    *       412   14    7     NA     **    508   11     8     NA    *      295   15     8     NA    **
Figure A0281514600472
病毒接种E7胚胎                            * P值有统计学差异0.05级
# 免疫染色和通过FACS测量的细胞群            ** P值有统计学差异0.01级
μ平均值                                    *** P值有统计学差异0.001级
SEM 均值标准误差                             P值无统计学意义0.05级
n 样品规模
P1 未感染组与处理组之间的t检验P值
P2 CAU269/7与处理组之间的t检验P值
表17.由野生型和VP2突变体CAU269/7感染的E21胚胎的胸腺、脾脏和囊中分离的B淋巴细胞群。
Figure A0281514600481
                                     平均AvBul+淋巴细胞群(×106)#
                                    胸腺                         脾脏                       囊
                            μ        SEM  n    P1   P2   μ         SEM  n    P1   P2   μ       SEM    n    P1  P2
CAU269/7
                            44   20   3    *     NA    9.5   0.3  3    ***   NA    0.7  0.3    3    *    NA
Mut C87R
                            213  40   9        *     2.5   0.5  9        **    2.9  0.7    9       **
Mut R101G
                            120  39   7            8.3   0.3  7            53   1.8    7       *
Mut H103Y
                            77   16   9            7.7   1.4  9            45   2.4    9       
Mut R129G
                            116  45   8            2.9   1.5  8            24   1.2    8       
Mut R/K/K150/151/152G/A/A
                            556  219  5        *     14    3.4  5        *     45   7.3    5    *    **
Mut D/E161/162G/G
                            198  155  5            24    0.9  5        *     17   1      5       
Mut L163P                   191  92   8            6.4   0.2  8            13   0.6    8       *
Mut D169G                   103  32   9        *     19    0.8  9            64   2.5    9       
Mut E186G                   118  13   10       **    .3.3  0.8  10   ***   ***   8.9  0.     8    *    *
未感染                      119  76   2    NA    *    6.5   0.3  2     NA    ***   29   1.9    2    NA   *
Figure A0281514600482
病毒接种E7胚胎
# 免疫染色和通过FACS测量的细胞群
μ 平均值
SEM 均值标准误差
n 样品规模
P1 未感染组与处理组之间的t检验P值
P2 CAU269/7与处理组之间的t检验P值
* P值有统计学差异0.05级
** P值有统计学差异0.01级
*** P值有统计学差异0.001级
 P值无统计学意义0.05级
II.CAV VP2翻译起始信号的突变
构建在VP2 ATG密码子周围含有突变的CAV基因组
所有的CAV DNA序列最初来自质粒pCAU269/7。使用重叠PCR延伸法，产生含有所需要核苷酸改变的DNA序列。通过PCR扩增，使用合成寡核苷酸对(CAV1/CAV20，CAV19/CAV11，CAV1/CAV22，CAV21/CAV11)，产生CAV基因组的ApaI/BstBI DNA片段，参见表18。
表18.PCR引物
    寡核苷酸   序列(5’-3’)     突变内容    氨基酸编码改变
    CAV19   CggtccgggAggatgcacggaaacg     -3位变为A    无氨基酸改变
    CAV20   gtgcatccTcccgaccgccttgcgt     -3位变为A    无氨基酸改变
    CAV21   cggtccgggtggatgGacggaaacgg     +4位变为G    VP2中的His变为Arg(二号氨基酸)
    CAV22   GtCcatccacccggaccgccttgcgt     +4位变为G    VP2中的His变为Arg(二号氨基酸)
    CAV1   ctatcgaattccgagtggttactat     正向引物    N/A
    CAV11   Agctcgtcttgccatcttacagtcttatac     反向引物    N/A
N/A-不适用
寡核苷酸对CAV1/CAV20，CAV19/CAV11，CAV1/CAV22和CAV21/CAV11含有所需要的核苷酸改变，单独用于第一轮PCR扩增(25圈)，分别生成347bp，495b，347bp和495bp长度的产物。通过凝胶电泳分析产物确证产物的大小和数量，并随后稀释至25ng/μL，备用(或者是CAV1/CAV20和CAV19/CAV11的PCR产物，或者是CAV1/CAV22和CAV21/CAV11的PCR产物)，而后进行第二轮PCR反应(20圈)，其中只利用寡核苷酸对CAV1/CAV11。由此重叠延伸PCR反应得到的产物与片段CAV1/CAV11相同，除了在VP2 ATG密码子周围引入所需的核苷酸改变(或者是-3位由T变为A，对于pCAU283-3而言；或者是+4位由C变为G，对于pCAU283+4而言)。重叠延伸PCR产物使用ApaI/BstBI切割，分离跨越VP2 ATG密码子的153bp片段，并分别同用相同酶消化的质粒pCAU269/7相连。得到的构建体命名为pCAU283-3和pCAU283+4，经限制性酶切分析和测序证实新引入了突变序列。
序列分析
使用双脱氧末端终止法，在BigDye Terminator测序仪(ABI Prism)上确定DNA序列，测序引物使用载体特异引物(T7和SP6)，以及CAV序列特异合成引物(CAV12，2，10，3，9，4，7，5)。
DNA制备及转染
使用10μg不含内毒素的质粒DNA制备转化用病毒DNA，TritonX-100纯化，用EcoR I切割释放插入的CAV基因组片段。酶切产物使用酚—氯仿抽提，乙醇沉淀，以1μg/μL的浓度重悬。经琼脂糖凝胶电泳检查等份试样证实插入片段的释放和回收效率。
MSB1细胞漂洗3次，重悬于700μL温热的无添加物的RPMI-1640培养基中，至终浓度为4×106。细胞在0.4cm间隙杯(BioRad)中，通过电穿孔以400V 375μF电转化细胞。脉冲细胞在室温(RT)孵育5分钟，而后转移到含有3mL预先温热的RF10的6孔组织培养板中，37℃5％CO2孵育。转染效率(CMV-GFP表达-pEGFPC2，Clonetech)由对照孔电转化24小时后进行评估。观察转化细胞的细胞病理学效应(cpe)，并尝试使用荧光染色检测VP3表达。
间接免疫荧光检测
细胞漂洗两次，重悬于PBS中，以每孔约30-50,000个细胞涂在12孔载玻片上，空气干燥，用冰冷丙酮∶甲醇(90∶10)固定。细胞涂片用5％BSA的PBS/0.05％吐温20封闭，而后与小鼠来源的CAV VP3特异性单克隆抗体JCU/CAV/1C1(JCU TropBio，Townsville，Queensland)，在37℃加湿室中反应60分钟，并且与荧光素异硫氰酸交联的兔抗小鼠IgG抗体反应，条件同上。漂洗三次后，涂片使用VectaShield封固，并使用荧光显微镜观察。
结果
构建在VP2 ATG密码子周围含有突变的CAV基因组
质粒pCAU269/7可以用来产生活的感染性CAV病毒颗粒。在此研究中，本发明人检测了突变的CAV-DNA基因组pCAU283-3和pCAU283+4是否同样可以产生复制有效的病毒。为达到这一目的，将这些修饰的CAV基因组和对照野生型CAV DNA(pCAU269/7)转染MDCC-MSB1细胞。
分析突变CAV同野生型CAV的复制速率的差异
为确定突变病毒基因组的复制能力，跟踪检测转化后的MDCC-MSB1细胞中CAV蛋白VP3的合成。在转染后40小时，取一份经感染的细胞培养物样品，使用抗VP3的mAB JCU/CAV/1C1进行间接荧光免疫分析。同时，经转染的细胞培养物传代(1∶10)到新鲜的培养基中。
转染后40小时检测发现，同野生型(wt)CAV转染细胞相比，经转染CAV突变体的细胞表现出相近的VP3蛋白表达率。在VP3表达的细胞中，可以观察到病理损伤效应，其特征在于外观为增大、畸形细胞，并与其他一些文献报道的CAV分离株的外观一致。感染96小时内，这些细胞明显呈现总体细胞退化的现象。
荧光显微镜检测发现，VP3染色在野生型或突变基因组中的荧光强度和在细胞中的定位没有明显不同。在感染后的几个时间点，对传代病毒感染的培养物取样检测是否有活的感染性CAV病毒颗粒产生。在六天内，在用突变基因组pCAU283-3或pCAU283+4转化的MDCC-MSB1细胞培养物中没有发现VP3阳性细胞。而且，从用这些基因组转染的培养物中所采集的培养基当传代到新鲜MDCC-MSB1细胞时，不会造成细胞病理学效应。
这些结果表明突变DNA同野生型pCAU269/7相比，在MDCC-MSB1细胞中的细胞病理学效应明显降低，并且只是在转染后瞬时表达CAV蛋白。这种突变病毒可以用作鸡的DNA疫苗，因为它们不会产生具有复制能力的病毒，但却能够瞬时表达病毒蛋白。
III病毒蛋白2
免疫抑制性环状病毒-鸡贫血症病毒(CAV)的病毒蛋白2(VP2)已显示在病毒感染性和复制过程中起关键性的作用，但是其功能还没有被完全了解。CAV VP2蛋白的氨基酸序列同许多真核细胞受体、蛋白酪氨酸磷酸酶α蛋白以及与SANBAN组中的一簇TT病毒具有显著的同源性。通过PCR扩增编码VP2的ORF，并将其克隆到细菌表达载体pGEX4T-2上。表达VP2-GST融合蛋白，亲和层析纯化蛋白。使用通用化的肽底物ENDY(Pi)INASL，测定了纯化的VP2-GST的蛋白酪氨酸磷酸酶(PTPase)活性，并用孔雀绿比色分析检测游离磷酸根。VP2-GST表现出蛋白酪氨酸磷酸酶活性，Vmax为14280U/mg.min，Km为16.95μM。pH6-7时具有最佳活性，可被0.01mM原钒酸盐特异性抑制活性。CAV VP2 PTP唯一的特征基序为ICNCGQFRK，对应其94到102位氨基酸残基。
试验步骤-VP2
序列分析
使用NCBI界面上的BLASTX软件(Basic Local Alignment SearchTool)，通过检索Genebank数据库对与CAV VP2同源的蛋白序列进行鉴定。通过这一方法查到的序列而后使用EclustalW软件(WebANGIS，Australian National Genomic Information)同CAV序列进行比对。
CAV病毒蛋白2和TLMV ORF2的分子克隆
澳大利亚CAV分离株CAU269/7用于所有的试验。使用PCR法，以双链复制型CAV基因组为模板，扩增CAV ORF1(VP2)。CAV感染MDCC-MSB1细胞后48小时，使用蛋白酶K和SDS裂解细胞，酚/氯仿抽提，制备细胞DNA，所用方法参考下列文献：Meehan，B.M.，Todd，D.，Creelan，J.L.，Earle，J.A.，Hoey，E.M.和McNulty，M.S.(1992).来自感染有鸡贫血症介质的细胞的病毒DNA的表征：克隆基因组片段的克隆复制型序列分析和转染能力(Characterization of viral DNAs fromcells infected with chicken anaema aget：sequence analysis of the clonedreplicative form and transfectioncapabilities of cloned genome fragments).Arch Virol 124，301-319。合成正向寡核苷酸引物CAV.1-5’CGGTCC GGATCCATGCACGGAAACGGCGGACAAC 3’和反向引物CAV.2-5’GGTTTG GAATTCTCACACTATACGTACCGGGGC 3’，其中在各自的5’端引入BamHI和EcoRI限制性核酸内切酶位点。100μL的反应混合液中含dATP、dCTP、dGTP和dTTP各300μM，2mMMgCl2，每条引物各200μM，10μL 10×Taq DNA聚合酶缓冲液，2UTaq DNA聚合酶(Promega)，和2μL模板DNA。PCR反应为95℃预热2分钟，而后是40圈循环：96℃40秒，60℃40秒，72℃40秒，最后72℃孵育5分钟。PCR产物经琼脂糖凝胶(1％)电泳分析，切胶回收667bp的PCR产物条带，使用Qiaex II(Qiagen)凝胶抽提试剂盒根据其使用说明纯化PCR产物，使用BamHI和EcoRI核酸内切酶切割PCR产物，并同适当消化的pGEX-4T-2(Promega)载体相连。电穿孔法将连接的质粒转化DH5α大肠杆菌，并在含50μg/mL的氨苄青霉素的Luria-Bertani琼脂培养基(LA)中于37℃培养。使用Taq Dye DeoxyTerminator Cycle Sequencing试剂盒(Perkin Elmer)对克隆DNA序列测序，测序引物为特异于pGEX-4T-2的商业化测序引物。
从TLMV株CBD231的引物M-1360到M-1363(258bp-886bp)获得的纯化嵌套式PCR产物由Shunji Mishiro惠赠。TLMV ORF2由M-1360到M-1363模板通过PCR扩增。
合成正向寡核苷酸引物TLMV.1-5’
TT GGATCCATGAGCAGCTTTCTAACACCATC 3’，和反向引物TLMV.2-5’
GGC GAATTCTTACCCATCGTCTTCTTCGAAATC 3’，在各自的5’端引入独特的BamHI和EcoRI限制性酶切位点。
50μL的反应混合液中含dATP、dCTP、dGTP和dTTP各300μM，2mM MgCl2，每条引物各200μM，5μL 10×Taq DNA聚合酶缓冲液，1U Taq DNA聚合酶(Promega)和1μL模板DNA。PCR反应为96℃预热2分钟，而后是40圈循环：96℃40秒，56℃40秒，72℃40秒，最后72℃孵育5分钟。295bp的PCR产物经纯化、酶切后按上文对CAV病毒蛋白2所述，克隆到pGEM-T质粒载体(Promega)中。插入片段而后亚克隆到pGEX-4T-2质粒载体中，测序证实插入片段的序列和可读框。
蛋白表达与纯化
CAV VP2产生作为C端与谷胱甘肽-S-转移酶融合。1L含CAVVP2 pGEX-4T-2构建体的E.Coli DH5α培养物在含50μg/mL氨苄青霉素的Luria-Bertani琼脂培养基(LA)中培养。当培养细胞达到600nm光密度0.6时，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为1mM诱导蛋白表达，培养细胞再孵育一小时而后收集。6000g离心30分钟收集菌体，沉淀用PBS漂洗两次。将细胞悬浮于25mL含0.3M EDTA、200mg融菌酶、100μg苯甲基磺酰氟(PMSF)/mL(Sigma)的PBS中，10秒钟低频超声冲击裂解细胞。裂解物在0.1％Triton X-100中溶解，4℃进一步孵育10分钟，10,000g离心30分钟去除细胞碎片。使用谷胱甘肽琼脂糖树脂(Promega)，根据生产商提供的方案，通过亲和层析纯化融合蛋白。在含137mM NaCl、2.7mM KCl和25mM TrisHCl(TBS)pH 7.4的缓冲液中将洗脱液充分透析。
从用pGEX-4T-2转化的E.Coli DH5α中纯化阴性对照谷胱甘肽-S-转移酶，方法与用于纯化GST-VP2融合蛋白的相同。
纯化的蛋白通过12.5％SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，考马斯亮蓝染色(Laemmli，U.K(1970)在噬菌体T4的头部的组装中切割结构蛋白(Cleavage of structural proteins during the assembly of the head ofbacteriophage T4).Nature 227，680-685)。将蛋白电转转移到聚二氟乙烯膜(PVDF：Immobilon，Millipore)。Western印迹使用兔抗GST多克隆抗体作为探针，以1/500比例稀释，接着是二抗猪抗兔辣根过氧化物酶(HRP)结合物(Dako)，稀释度为1/1000，使用Sigma Fast 3，3’-二氨基联苯胺(DAB)(Sigma)根据使用说明进行显色。第二次Western印迹用收集的免疫鸡血清作为探针，接着是兔抗鸡HRP结合物，稀释度为1/500，然后用DAB底物显色。使用Bradford分析法(BioRad)对蛋白浓度进行定量，以胎牛血清蛋白(BSA)(Sigma)作为标准。
从用TLMV ORF2 pGEX-4T-2克隆转化的E.Coli DH5α中纯化TLMV ORF2，按照用于纯化GST-VP2融合蛋白相同的方法。但是蛋白表达诱导时间仅为30分钟。
肽底物的合成
通用的蛋白酪氨酸磷酸酶底物描述于下列文献，参见Daum，G.，Solca，F.，Diltz，C.D.，Zhao，Z.，Cool，D.E.和Fischer，E.H.(1993)。用于蛋白酪氨酸磷酸酶的一般性肽底物(A general peptide substrate forprotein tyrosine phosphatases).Anal Biochem 211，50-54，可用于所有酶分析中。磷酸肽的序列为H-Glu-Asn-Asp-Tyr(PO3H2)-Ile-Asn-Ala-Ser-Leu-OH。简而言之，该九肽是使用Fmoc化学，在固相中手工合成的。肽合成所用到的所有化合物为分析纯级。芴甲氧基羰基(Fmoc)在合成过程中保护氨基酸残基(Auspep，Melbourne，Australia)。用于合成的氨基酸残基为Fmoc-L-Leu-OH，Fmoc-L-Ser(tBu)-OH，Fmoc-L-Ala-OH，Fmoc-L-Asn(Trt)-OH，Fmoc-L-Ile-OH，Fmoc-L-Tyr(MDSPE)，Fmoc-L-Asp(OtBu)-OH，Fmoc-L-Asn(Trt)-OH以及Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH。合成使用载体树脂PAC-PEG-PS(Perspective Biosystems，容量0.18mmol/g)。氨基酸通过与等摩尔的邻苯并三唑-N，N，N’，N’-四甲基-六氟磷酸尿盐(O-benzotriazole-N，N，N’，N’-tetra methyl-uronium-hexafluorophosphate(HBTU))(Auspep)以及1-羟基苯并三唑(HoBt)(Auspep)，以及2当量的二异丙基乙胺(DIPEA)(Auspep)共同孵育而激活。偶联反应进行60分钟，而后进行三硝基苯磺酸测试。每步偶联反应后，2.5％1，8-二氮杂双环-[5.4.0]十一碳-7-烯(DBU)漂洗以去除Fmoc基团。对于偶联4到9位氨基酸残基，每个循环重复两次。使用88％三氟乙酸(TFA)、5％酚、2％三-异丙基硅烷(Aldrich，Milwauke，WI)的水溶液处理，侧链保护基团被去除，肽从树脂上切割下来。粗制肽在冷二乙醚中沉淀，而后进行反相柱高效液相色谱(RP-HPLC)纯化，使用0.1％三氟乙酸Vydac C4半制备柱，2％/分钟梯度乙腈洗脱。使用质谱仪鉴定肽。
蛋白酪氨酸磷酸酶检测
所有蛋白酪氨酸磷酸酶反应采用的方法参见Tonks，N K.，diltz，CD.和Fischer，E.H(1991)。纯化和分析CD45：完整膜蛋白—酪氨酸磷酸酶(Purification and assay of CD45：an integral membrane protein-tyrosine phosphatase).Methods Enzymol 201，442-451。除非另外说明，下面的反应条件用于所有的检测。制备分析缓冲液(AB)，含50mMTris(25℃时pH 7)，1mM EDTA，50mM 2-巯基乙醇和1％(w/v)BSA。制备第二缓冲液(TB)，含50mM Tris(25℃时pH 7)和0.01％w/v Brij35(Sigma)。所有的反应在微滴定板中的200μL反应体系进行。AB缓冲液中加入1mM的磷酸肽底物。将15毫微摩尔底物加入每个1∶1AB和TB缓冲液的三重反应混合物中，共14个。添加9μg VP2-GST或GST启动反应。室温下振荡孵育反应0，1，2，3，4，5或10分钟，并添加孔雀绿终止反应。所有的检测反应至少重复三次，取每个时间点的活性平均值绘制曲线。活性值乘以系数0.52，以说明24kDa GST融合标记的质量，活性值以每微克酶催化底物的nmol数来表示。
孔雀绿检测可溶性磷酸根
释放到溶液中的磷酸根以孔雀绿比色反应来检测。简而言之，孔雀绿储液制备方法如下：将60mL浓硫酸加入到300mL水中，而后冷却到室温，接着加入0.44g孔雀绿(Fisher Scientific)。比色反应液显色前从10mL孔雀绿储液，3％(w/v)(NH4)3MoO3(Sigma)和0.15％吐温20(Sigma)中现配。
50微升比色试剂添加到微滴度板的200μL反应体系中，在室温下平衡20分钟。620nm读取吸光度数值，磷酸释放根据磷酸标准曲线得以校正。
对磷酸值0，2.5，5，7.5，10，15，20，25，30，40和45nmol，绘制磷酸标准曲线。磷酸溶液制备在AB和TB缓冲液以1∶1混合的缓冲液中，微滴定板上的三个孔每孔加200μL。对于每种浓度，加50微升比色试剂，室温下平衡20分钟。然后620nm读取吸光度值。
酶动力学和抑制试验
将底物加到一式三份的反应混合物中，其量为0，2.5，5，7.5，10，15，20，25，30，40nmol。孵育1分钟，其他所有反应条件如前文所述。对于每个底物浓度，至少要重复6次计算活性，并对各个值计算活性均值的标准误差。从双倒数图进行线性回归分析得出Vmax和Km值，从该曲线上根据标准误差及P值得出1/Vmax常数和Km/Vmax系数。
用蒸馏水制备1mM Na3VO3·10H2O储液，并用硫酸调整到pH10。一旦溶解，Na3VO3·10H2O储液加入到AB和TB缓冲液中，比例为1∶1∶1，调整到pH 7。抑制试验用0.1mM，0.01mM和0.001mM的原钒酸钠进行。其他所有反应条件如上文所述。试验在10nmol底物和9μg CAV VP2-GST的条件下进行，每个浓度的抑制剂重复三次。
酶最佳pH
设置反应pH值为pH4，pH5，pH6，pH7，pH8及pH9，每个pH值重复三次测定。试验采用10nmol底物和9μg CAV VP2-GST，其他所有反应条件如上文所述。在添加孔雀绿之前，使用硫酸或氢氧化钠将pH值中和到pH7。
TLMV VP2 GST融合蛋白检测
TLMV-GST融合蛋白根据前文描述的对CAV VP2的反应条件进行检测。反应重复4次。
结果-VP2
序列分析
对CAV VP2蛋白序列通过检索数据库进行同源性分析，发现许多来源于人、大鼠、小鼠和鸡的受体蛋白酪氨酸磷酸酶α(R-PTPase)蛋白的序列同CAV VP2具有同源性。CAV VP2蛋白同源性位于所有R-PTPase同系物P环侧翼的WPD环上。WPD环涉及PTPase活性。P环含有一个催化位点和特征基序。CAV VP2和R-PTPase之间的相似性在30-32％。R-PTPase同系物和CAV VP2氨基酸序列的比对见图13。
从Genebank数据库中还发现了第二个同CAV VP2高度同源的氨基酸序列簇。TT病毒SANBAN组同CAV VP2有显著的同源性。在所有的SANBAN病毒序列中，同源性区域延伸自由推定ORF1编码的氨基酸序列54到80位残基。对于PTPase同系物，同源性序列位于蛋白相同的区域，但是，同源性残基的模式发生了变化。CAV VP2同SANBAN病毒序列之间的同源性为48％。CAV VP2序列和SANBAN病毒的比对见图14。
蛋白表达与纯化
CAV ORF1由CAV澳大利亚分离株CAU269/7进行扩增。CAU269/7分离株的致病力和感染性同其他CAV分离株所述的等效。将PCR产物克隆到载体pGEX 4T-2上，并在细菌表达系统中将VP2-GST融合蛋白在细菌表达系统中生成与谷胱甘肽-S-转移酶重组融合蛋白。12.5％SDS PAGE电泳证实蛋白的大小和同一性，而后进行考马斯亮蓝染色和western印迹分析(图15到17)。亲和层析纯化蛋白，而后经SDS-PAGE电泳证实一个分子量为58kDa的条带，对应于CAV VP2-GST融合蛋白。该蛋白带同抗GTS标记的抗血清反应，并同混合的超敏鸡血清反应。经透析的蛋白容易地溶于TBS缓冲液中，直接用于PTPase活性检测。蛋白浓度通过同标准BSA曲线对比，利用Bradford检测法得出。
肽底物的合成
肽底物是在固相支持物上使用标准Fmoc化学进行合成的。在加入磷酸酪氨酸残基之后，所有随后的循环都要重复两次，以抵消可能的位阻对大磷酸基团偶联的影响。可以在分析型RP-HPLC上见到单个峰与纯磷酸肽相符，质谱分析证实其分子量为1116.3。
蛋白酪氨酸磷酸酶检测
以磷酸根浓度为函数对分析条件建立620nm吸光度的标准曲线。孔雀绿比色探测的灵敏度为2.5nmol磷酸根，在磷酸根浓度为0到45nmol的范围内，log[Pi]同620nm光吸收值呈线性关系。磷酸根浓度大于45nmol会导致磷钼酸盐沉淀，从而破坏了线性关系。
VP2-GST融合蛋白清晰地显示出蛋白酪氨酸磷酸酶活性。CAVVP2-GST蛋白与对照GST蛋白比较，磷酸释放——时间曲线见图18。根据该曲线线性区域所对应的时间范围，在所有以后的反应中，V0在1分钟时测量。VP2-GST蛋白表现出Michaelis-Mentin动力学特性，V0和[S]之间的关系为1/[V0]＝(1.292)·1/[S]+0.060。VP2-GST及GST对照蛋白的活性曲线见图19。VP2-GST的Linewever-Burk双倒数图见图20。从Linewever-Burk双倒数图，通过线性回归，得出1/Vmax为0.060(标准偏差＝0.1085，P＜0.0001)。根据这些结果，Vmax估计为14280U/mg min，Km值为16.95μM。所有的试验都使用两个不同VP2-GST蛋白制品，重复三次，每个底物浓度至少重复4次。
反应pH对酪氨酸磷酸酶活性的影响和原钒酸盐对酪氨酸磷酸酶活性的抑制作用
在不同的反应pH值下(表19)，对蛋白酪氨酸磷酸酶活性进行了测量。pH6-pH7时，VP2-GST PTPase活性最佳。
原钒酸钠对VP2-GST PTPase活性的抑制作用见表20。原钒酸钠的浓度为0.001，0.01，0.1mM可以完全抑制VP2-GST的PTPase活性。
表19：反应pH对CAV VP2-GST PTPase活性的影响
pH                  S             平均V0(nmol)            SD
                    (nmol)
4                   10            1.746                    0.007
5                   10            1.474                    0.018
6                   10            5.636                    0.156
7                   10            5.612                    0.041
8                   10            1.829                    0.049
9                   10            0.000                    0.000
表20  原钒酸钠对VP2-GST PTPase活性的抑制作用
[原钒酸盐]mMol            [S]nmol                  V0
-                         10                       5.612
0.001                     10                       0.002
0.01                      10                       0.000
0.1                       10                       0.000
TLMV ORF2产物的PTPase活性
TLMV VP2-GST融合蛋白的PTPase活性与CAV VP2-GST对照蛋白进行了比较。稳态活性等效于CAV VP2所示(图20)。
III.VP2
本研究的目的之一是探讨CAV VP2蛋白是否是一种新的病毒PTPase。本研究最初设想来源于发现CAV VP2同许多PTPase具有同源性，以及VP2序列中的PTPase特征基序。PTPase的特征是具有最小的PTPASE特征基序CXXXXXR，利用半胱氨酰磷酸酶中间体可以催化脱磷酸化作用。蛋白周围的结构域参与调节蛋白活性及底物特异性。VP2作为一种非结构性蛋白，表达水平很低但是对感染性至关重要，且在CAV和TT病毒间高度保守，这些特征都同重要的调节蛋白，如PTPase的性质相吻合。
本研究首次确认VP2蛋白的功能，发现VP2蛋白是一种新的PTPase。这些酶(PTPase)的定义是指具有从磷酸蛋白底物的磷酸化酪氨酸残基上特异性去除磷酸根的能力。PTPase发现对于不同蛋白底物复合物具有不同的特异活性。上文已描述了通用肽底物ENDY(Pi)INASL，可以用于这些分析中。许多PTPase使用这一底物，因而可以对它们的动力学参数进行比较。时间曲线及动力学研究清晰地显示CAV VP2具有蛋白酪氨酸磷酸酶活性。对PTPase家族还已定义了一系列其他特征。作为一个家族，这些酶对EDTA的抑制活性作用有抗性，并在中性pH值(pH 5.5-7)时有最佳活性。CAV VP2的研究发现，分析缓冲液中添加EDTA对于酶的活性是必须的，活性在pH6-7时最佳。这些结果同该蛋白家族的共性相吻合。
PTPase催化反应过程中，催化中心激活的半胱氨酸形成半胱氨酰磷酸中间体，从而催化去除磷酸酪氨酸中的磷酸根。催化机制独特于PTPase家族，并可被低浓度的原钒酸盐抑制。原钒酸盐化合物是磷酸根的结构类似物，同样可以竞争性抑制半胱氨酰-磷酸中间体。PTPase家族成员在发生抑制作用所需的原钒酸盐浓度方面有差异。对CAV VP2的活性而言，在原钒酸盐浓度低至0.001mM时即可达到最大抑制效应。
在前文所述的反应条件下，CAV VP2的Vmax为14280U/mg min，Km值为16.95μM。CAV VP2活性处于高分子量和低分子量(Mr)PTPase之间的中等水平。低分子量PTPase具有高特异性活性。例如PTP1B，Vmax为20000U/mg min。高分子量PTPase总体上具有低的特异性活性，虽然这一活性取决于底物的特异性。例如人脾脏来源的CD45的Vmax为1000U/mg min。
已详细研究了一些蛋白酪氨酸磷酸酶(PTPase)的晶体结构和催化机制。从高分子量PTPase的研究中，已将共有特征基序定义为(I/V)HCXAGXGR(S/T)。半胱氨酸残基在结合磷酸根方面具有关键性的作用，以及精氨酸协调催化中心中的磷酸酪氨酸。PTPase超家族的最小特征基序限定为CXXXXXR。得出这一结论是因为发现一小组低分子量PTPase没有同源于PTPase保守区的整个序列，但是含有该最小特征基序。同样在很广的pH值范围内低分子量PTPase的特征也具有活性。提出的CAV VP2催化基序为ICNCGQFRK，由94到102位氨基酸残基组成。推论的CAV VP2特征基序同高分子量PTPase所见的高度保守的共有基序不同。但是，CAV VP2在延伸区同高分子量PTPase具有序列同源性，这一点没有在低分子量PTPase上观察到。此外，诸如最适pH的动力学特性也是高分子量PTPase亚组的特征。
对数据库同源性检索发现，许多真核受体PTPase(R-PTPase)与CAV VP2蛋白在将近53个氨基酸残基的延伸区内的同一性评分为30-32％，所述延伸区包括提出的特征基序。这一组R-PTPase相互之间具有显著的同源性。矛盾的是，CAV VP2同真核PTPase间的序列同源性部分位于真核PTPase蛋白催化基序的上游区域。真核PTPase的蛋白结构域已显示为PTPase蛋白的组织模型，在许多PTPase中有两个串联的保守催化区，但只有其中一个具有功能。活性VP2催化折叠与位于同样功能的真核基序侧翼的蛋白折叠之间显著的同源性可以说明真核蛋白功能上的冗余性。PTPase的冗余性可能不仅以上述已经了解的整个区域存在，而且还可能表现在蛋白折叠内的二级结构水平上。
另一个令人感兴趣的发现是CAV VP2和TT病毒中的SANBAN亚组间的相同区域上有显著同源性。TT病毒最近已从人类宿主中分离出来，特征为一异源簇的单链、负义环状DNA病毒。这组病毒的序列分析显示它们总体上同CAV有最大的同源性。同CAV序列同源性最高的部位位于非编码区以及在TTV病毒的ORF2和CAV VP2之间。所有的TTV，SANBAN，YONBAN及TLMV病毒(类TTV迷你病毒(mini virus))具有同CAV ORF2内的序列WX7HX3CXCX5H共同的序列。这一同源序列对应于预测的PTPase特征基序的5’端。但是SANBAN分离株同CAV VP2具有更广泛的同源性，提出的特征基序的整个序列都具有同源性。最近有人建议将TTV，SANBAN，YONBAN，TLMV以及CAV归类为副环状病毒科。当前在TT病毒中对ORF的命名只是根据序列分析而制定的，因为这些病毒还没有在培养物中生长，或者这些病毒蛋白的表达模式也不清楚。
以上分析结果明确提示，TLMV ORF2是第二个新的病毒PTPase。TLMV ORF2显示的PTPase活性指示一种普遍的存在于CAV和TT病毒感染和复制过程中的机制。这一发现同在基因组结构中所发现的密切相似性以及TTV和CAV间的序列同源性相吻合。
蛋白酪氨酸磷酸酶已知在有丝分裂、基因转录、信号转导、细胞-细胞相互作用、细胞分化的调节以及淋巴细胞的细胞因子反应中起作用。CAV感染多达21日龄的鸡的T淋巴细胞及成血细胞群，导致严重的免疫抑制及贫血症。感染过程中的VP2 PTPase活性可代表一种通过在受感染淋巴细胞群中病毒诱导的调节变化的病毒毒性机理。所有前述的病毒编码的调节蛋白中都含有大的基因组以及大量的编码容量的病毒。这表明这些病毒可以在表达关键病毒结构和复制蛋白的同时，还保留有细胞调控蛋白。这些蛋白包括上文描述的牛痘病毒的VH1PTPase。因此本发现具有不一般的意义，因为CAV病毒具有极小的基因组(2.3kb)，从重叠的开放读码框中只表达3个病毒蛋白。所以CAV高度依赖于宿主功能，以完成其复制周期，有可能调节淋巴细胞周期是该病毒的一个关键性的功能。我们目前所知道的是，CAV VP2 PTPase仅仅是第二个被发现的PTPase，而且是这类病毒中唯一的PTPase。
IV.单链及双链CAV基因组DNA接种胚胎
前言
通过双链DNA转染MDCC-MSB1细胞，由CAV基因组制备感染性病毒的标准方法见Noteborn，M.H.，de Boer，G.F.，van Roozelaar，D.J.，Karreman，C.，Kranenburg，O.，Vos，J.G.，Jeurissen，S.H.，Hoeben，R.C.，Zantema，A.和Koch，G.(1991)。含有传染性复制周期所有元件的克隆鸡贫血症病毒DNA的表征(Characterisation of cloned chickenanemia virus DNA that contains all elements for the infectious replicationcycle).J Virol 65，3131-3139。其他由基因组制备CAV病毒粒的方法还未见报道，也没有将任何病毒的裸基因组接种鸡蛋黄囊的文献报道。可以用裸DNA基因组介蛋生成感染性病毒，将允许不经转染MDCC-MSB1细胞的中间步骤即可得到疫苗病毒。这一方法具有提高生物安全性的潜力，因为经转化的MDCC-MSB1细胞系含有潜伏的Marek氏病病毒基因组，而且细胞传代也要冒因疏忽导致的疫苗病毒污染的危险。
鸡贫血症病毒，同其他环状病毒科成员一样，具有一个环形、负义单链DNA基因组，包裹在非衣壳蛋白中。有人研究过该病毒的正常感染周期，发现病毒复制经历一段双链的复制中间体。双链的复制形式为2.3kbp，1.3kbp和0.8kbp，开放或封闭环状，已在感染有CAV的MDCC-MSB1细胞中得到鉴定。双链的复制中间体、转录本以及衣壳化的单链病毒基因组合成的顺序现在还不清楚。有研究发现单独使用双链形式的基因组转化MDCC-MSB1细胞，可以容易地从中回收到感染性病毒。因此，2319bp克隆的CAV DNA序列含有宿主细胞中生成感染性病毒所需的所有遗传信息。从转染单链DNA基因组中回收复制能力的病毒还未加以研究。对于由单链DNA基因组转化开始进行的病毒复制而言，病毒需要从胞质中单链基因组合成具复制能力的双链形式。
本研究的目的是探讨病毒复制是否可以从用不同CAV基因组的构建体转染的MDCC-MSB1细胞中进行。研究从单链或双链形式的基因组、线性或环状、正义链或负义链中进行病毒复制的能力。进一步的目标是研究将这些DNA构建体接种到蛋黄囊后，病毒复制是否可以在体内进行，并研究不同形式的基因组构建体在接种到蛋黄囊后产生感染性病毒的相对效率。
CAV基因组双向克隆到M13.t130噬菌体中
为获得正义链和负义链、单链CAV基因组，将病毒基因组由pGEX-4Z质粒载体亚克隆到M13.t130噬菌体中。在pGEX-4Z载体中构建pCAU269/7基因组克隆的方法参见下列文献：Brown，H.K.，Browning，G.F.，Scott，P.C.和Crabb，B.S.(2000)。全长感染性克隆鸡贫血症病毒的致病性澳大利亚分离株(Full-length infectious clone of apathogenic Australian isolate of chicken anaemia virus).Aust Vet J 78，637-640。将CAU269/7基因组由pGEX-4Z质粒载体双向克隆到M13.t130噬菌体中。在M13.t130噬菌体载体中插入基因组的方向通过PstI酶切模式分析而得以确定。PstI酶切含有插入正义链方向为5’-3’的CAV基因组的M13.t130克隆(命名为CAV.M13.pos)后，可看到将近8.9kbp和0.6kbp的条带。PstI酶切含有插入负义链方向为5’-3’的CAV基因组的M13.t130克隆(命名为CAV.M13.neg)后，可看到将近7.8kbp和1.8kbp的条带。这些克隆中CAV基因组的方向经双向测序进一步证实，测序引物可与位于克隆位点侧翼的序列杂交。
使用CAV基因组构建体转染MDCC-MSB1细胞
不同CAV基因组构建体转染MDCC-MSB1细胞后，对病毒生长效率进行了评估。制备了单链及双链形式的CAV基因组。双链CAVDNA由pCAU269/7质粒的培养物制备。通过EcoRI酶切pCAU269/7克隆，释放出CAV基因组，从中得到大小正确的条带，而后经1％凝胶电泳纯化及重新连接成环状。1％凝胶电泳纯化大小正确的由CAV.M13.pos和CAV.M13.neg噬菌体克隆培养物中制备的单链CAVDNA的条带。通过使用特异性消化单链DNA的绿豆核酸内切酶消化所有DNA，证明制备物中只有单链DNA。将与位于克隆位点两侧的序列杂交的引物与单链的CAV.M13.pos以及CAV.M13.neg制备物退火，而后使用EcoRI内切酶消化。DNA经连接反应重新环化，而后通过光谱定量分析。
在用这些DNA构建体转染后的病毒再生经依序细胞培养物传代后，通过免疫荧光法加以评价，从细胞裂解物中收集无细胞的病毒制备液。使用下面的基因组DNA构建体转染细胞后，回收病毒：
(i)由CAV.M13.pos克隆制备的环状、正义、单链CAV DNA
(ii)由CAV.M13.pos克隆制备的线性、正义，单链CAV DNA
(iii)由CAV.M13.neg克隆制备的环状、负义、单链CAV DNA；
(iv)由CAV.M13.neg克隆制备的线性、负义、单链CAV DNA；以及
(v)pCAU269/7经EcoRI消化后释放的双链、环状CAV DNA。
在用对照质粒DNA转染后，没有回收到病毒。使用pEGFP质粒转染后48小时检测荧光细胞的比例，发现双链DNA的转染效率为10％。
同感染有双链形式的DNA构建体相比，用所有单链构建体转染导致转染细胞的比例显著提高。在用各种单链形式的基因组转染后，通过第二次培养物传代，MDCC-MSB1细胞中至少有50％受到病毒感染。但是，在双链CAV基因组转染的细胞中，只有经过第四次传代后，才可观测到50％的感染率。正义或负义单链基因组转染细胞后的效果没有区别，线性和环状基因组转染效果也没有区别。
胚胎中接种DNA
不同CAV基因组构建体介蛋(in ovo)接种后，对病毒生长效率进行了评估。将不同CAV基因组构建体接种到7日龄胚胎(E7)组的蛋黄囊中。整个E18鸡胚的匀浆上清中的病毒滴度通过接种MDCC-MSB1细胞进行评估(表21)。从接种有下面基因组DNA构建体E18胚胎匀浆中回收病毒(表21)：
(i)由CAV.M13.pos克隆制备的环状、正义、单链CAV DNA；
(ii)由CAV.M13.pos克隆制备的线性、正义，单链CAV DNA；
(iii)由CAV.M13.neg克隆制备的环状、负义、单链CAV DNA；
(iv)由CAV.M13.neg克隆制备的线性、负义、单链CAV DNA；以及
(v)pCAU269/7经EcoRI消化后衍生的，双链、环状CAV DNA。
从用对照质粒DNA接种的E18胚匀浆物中没有回收到病毒(表21)。在用正义、环状、单链基因组接种的胚中，病毒生长的效率很低，仅从五分之一的胚胎中回收到病毒(表21)。使用环状、负义、单链基因组接种的鸡胚具有最高的病毒生长效率，这也是基因组在病毒粒中存在的形式。环状、负义、单链基因组接种后所得到的平均滴度在0.001的水平，高于双链基因组接种的平均滴度。
用仍含在质粒载体中的克隆突变病毒基因组接种孵育6天后的鸡蛋黄囊中，以证实本研究的发现。三个突变基因组为mut C86R，mutH103Y，以及mut Q13P。在孵育16天时，从胚胎中获取标本，制备尿囊绒膜和骨髓涂片，而后用抗CAV VP3免疫荧光抗体染色。在所有的接种的鸡蛋中，都可观察到病毒复制的证据，如特异性VP3染色所表明。
V.使用单链或双链CAV基因组DNA接种胚胎
本研究中开发了一项新的方法，即使用裸DNA基因组接种E6或E7鸡胚后，介蛋(in ovo)培养CAV。这是第一次研究表明，使用DNA接种后，CAV可以在体内生长，这也是第一次报道将任何禽类病毒病原体的裸病毒基因组接种到蛋黄囊。
本研究已表明了DNA接种到蛋黄囊中用于培养CAV病毒的效率。将CAV DNA传递到胚胎的蛋黄囊或通过其他介蛋(in ovo)途径可用作免疫接种的途径。
这一方法代表显著的生物安全性方面的进展，因为该方法能够从无细胞系统的操作基因组中制备具有感染力的病毒。操作基因组转染MDCC-MSB1细胞的方法培养病毒，用这样的方法制备的疫苗可能混有细胞培养系统的成分，而这些成分可能带来生物安全方面的问题。用基因组DNA接种胚胎蛋黄囊制备病毒的能力因此可以显著提高生物安全性。从MDCC-MSB1细胞中获得的CAV病毒滴度通常局限在105到106 TCID50这一较低的水平。可以通过多轮蛋黄囊接种有可能增加病毒的滴度。
对于单链、负义、环状基因组而样，蛋黄囊接种的效率最高(表21)。单链、负义、环状基因组接种可以获得高滴度的感染性病毒，双链、环状基因组接种的蛋黄囊中可以获得中等滴度的感染性病毒(表21)。从单链、负义、环状基因组接种中获得的病毒滴度比双链基因组接种的高3log倍(表21)。环状、负义基因组和线性、负义基因组接种所获得的滴度显著不同。从负义、线性基因组，正义、环状基因组或正义、线性基因组接种获取的病毒滴度低。假设在MDCC-MSB1细胞转染的效率中，单链DNA构建体不同形式之间转染效率没有差异，蛋黄囊接种后效率的差异可能是由于病毒基因组一旦在胞质中加工后影响其上游而造成的。将DNA构建体胞外接种到蛋黄囊后必须保持不被降解，并进入宿主靶细胞用于开始病毒复制。因此，在正义和负义构建体之间观察到的差异很可能同蛋黄囊接种后的构建体稳定性有关，还和其吸收到靶细胞的能力有关。负义、环状链的折叠形式及确证可能是造成这种差异的原因。
单链基因组转染MDCC-MSB1细胞后可以得到有感染性的病毒。在正义链和负义链之间的效果没有不同，环状结构和线性结构之间也没有差异。这很可能是因为一旦正义链或负义链进入细胞质，就可合成环状、双链复制型中间体。单链、负义基因组转染与双链基因组相比，在更早传代时，可以导致感染性更高。
CAV双链基因组转染MDCC-MSB1细胞的方法参见文献：Noteborn，M.H.，de Boer，G.F.，van Roozelaar，D.J.，Karreman，C.，Kranenburg，O.，Vos，J.G.，Jeurissen，S.H.，Hoeben，R.C.，Zantema，A.和Koch，G.(1991)。含有感染性复制周期的所有元件的克隆鸡贫血症病毒DNA的表征(Characterisation of cloned chicken anemia virus DNA thatcontains all elements for the infectious replication cycle).J Virol 65，3131-3139，这一技术已经在多篇出版的文献中重复使用。使用这一技术，DNA基因组可以容易地在体外进行操作，并可以精确地加以改变，而后再通过细胞培养生成病毒粒。单链构建体进行转染可提高这一过程的效率。转染效率提高的方法特别有利于病毒突变株的培养，这种突变株可以改变其生长特性，如延长潜伏期或降低爆发病毒量。在M13噬菌体克隆系统中引物突变只包括单个突变步骤，以产生单链突变基因组，因此在技术上更快速更简单。M13噬菌体载体因此是合适的质粒增殖的替代系统，可用于CAV基因组的操作。
进一步的研究显示，使用在质粒载体上的克隆基因组，也能够接种到含胚卵的蛋黄囊中作为产生感染性病毒的方法。因此这一过程可以用于回收突变基因组，也用于疫苗的生产。研究还显示，直接将克隆的突变CAV基因组接种到卵中，可以用作一种免疫接种的方法，特别是突变病毒对鸡胚为减毒的情形。
表21.不同基因组构建体接种蛋黄囊后E18胚胎中CAV的平均滴度。
DNA接种          
Figure A0281514600701
     SD            P值#
对照阴性               0              0              NA
dsa                  2.9            0.6            ***
(-ve)bssc circd    5.5            0.7            ***
(-ve)ss line          1.3            0.9            **
(+ve)fss circ         0.6            0.9            
(+ve)ss lin            1.6            0.3            ***
平均滴度，以log10TCID50/胚胎表示
SD  标准偏差
#  对照阴性组与处理组之间的t检验P值
a  双链
b  负义
c  单链
d  环状基因组
e  线性基因组
f  正义
NA  不适用
* P值有统计学差异0.05级
** P值有统计学差异0.01级
*** P值有统计学差异0.001级
 P值无统计学意义0.05级
VI.对选中的突变CAV病毒的减毒和诱导日龄鸡的保护性免疫力的评估
目的
为了评估选中的CAV突变病毒施用于日龄鸡的安全性，并评估日龄鸡接种CAV突变体后诱导的保护性免疫力。
方法
有六个试验组：
组               处理第1天              处理第21
1                培养基                 培养基
2                培养基                 野生型CAV
3                野生型CAV              野生型CAV
4                突变体169              野生型CAV
5                突变体101              野生型CAV
6                变体161/162            野生型CAV
每个试验组由10只鸡组成，每个组关在一个单独分开的正压纤维玻璃隔离室中饲养，该隔离室所有进出空气都要经过高效颗粒空气过滤器过滤，所有的食物及饮水在进入隔离室之前都经过消毒。所有的试验鸡都配有各自的翅膀标识环。
一半试验鸡在第14天时无痛处死，用于评估突变病毒的安全性。剩余的试验鸡继续在隔离室再呆21天。
试验鸡皮下接种0.5mL CAV，含104中值组织培养物的感染剂量的病毒；或接种0.5mL未受感染的MSB1细胞裂解液。
在第14天，每个试验组的5只试验鸡用氟烷无痛处死。处死后测量体重，检查所有的淋巴器官、骨髓、肝脏、脾脏以及真皮(寻找出血证据)，用于总的病理学分析。切除胸腺串(thymic chain)并称重。
在第21天，每组剩余的试验鸡皮下接种0.5mL CAV，含104中值组织培养物的感染剂量的病毒；或接种0.5mL未受感染MSB1的细胞裂解液。
在第35天，剩余的试验鸡用氟烷无痛处死。处死后测量体重，检查/照相所有的淋巴器官、骨髓、肝脏、脾脏以及真皮(寻找出血证据)，用于总的病理学分析。切除胸腺串并称重。
结果及讨论
没有证据显示在第14天时，受病毒感染鸡比未受感染鸡的体重要低；并且没有证据显示任何试验组之间在第35天时，体重指标有任何差异。
第14天时，没有证据显示在胸腺重量及胸腺/体重比值这两个指标上，感染有突变病毒101和161/162的鸡和未感染的鸡之间存在差异。但是同未感染鸡相比，感染有野生型恶性病毒的试验鸡的胸腺重量及胸腺/体重比值这两个指标明显降低。同未感染鸡及野生型恶性病毒感染鸡相比，感染有突变体169的鸡的胸腺重量及胸腺/体重比值这两个指标没有明显的差异。
第14日试验结果
组               处理第1天          胸腺重量(g)       胸腺/体重比值
                                                      (mg/g)
1                未感染             1.3±0.3a        8.8±1.6a
2                未感染             1.1±0.3ab       8.4±1.6a
3                野生型CAV          0.8±0.3b        4.9±2.0b
4                变体169            1.1±0.3ab       7.1±2.1ab
5                突变体101          1.3±0.4a        8.9±2.3a
6                突变体161/162      1.3±0.3a        8.3±1.5a
在同一栏中的值如果有相同的上标字母，表示它们之间无显著性差异
这些结果显示对鸡胚表现出减毒的突变病毒同样也对日龄鸡表现出减毒，其中突变体169同突变体101及161/162相比，减毒效果居中。
保护试验
在第35天时，没有证据表明免疫接种有突变病毒169并在21天用野生型恶性病毒攻击的鸡、未受感染的鸡、1日龄时接种有野生型恶性CAV并在21天用野生型恶性CAV攻击的鸡之间的胸腺重量及胸腺/体重比值这两个指标有任何差异。但是，在一日龄时没有接触CAV而在21日龄时用野生型恶性病毒感染的鸡，胸腺重量及胸腺/体重比值这两个指标明显低于这些试验组。免疫接种有突变体101或161/162并用野生型恶性病毒攻击的鸡，表现出中等水平的保护作用。
第35天的试验结果
组           处理第1天       处理第21天      胸腺重量(g)     胸腺/体重比值
                                                             (mg/g)
1            未感染          未感染          4.1±0.8a      9.5±1.4a
2            未感染          野生型CAV       1.3±0.3b      3.3±0.9b
3            野生型CAV       野生型CAV       5.1±1.2a      10.5±1.9a
4            突变体169       野生型CAV       3.5±0.4a      9.0±0.8a
5            突变体101       野生型CAV       2.2±0.4c      5.0±1.4b
6            突变体161/162   野生型CAV       2.0±1.0bc     5.2±2.1b
在同一栏中的值如果有相同的上标字母，表示它们之间无显著性差异
这些结果显示免疫接种突变病毒可以保护试验鸡免于CAV感染的影响。
因此，突变CAV病毒不仅是减毒的，而且同样能够诱导1日龄鸡产生保护性免疫。
讨论
I.CAV疫苗
本发明人开发了CAV活的减毒DNA疫苗，适用于接种雏鸡、小鸡和种鸡。本发明方法包括以下众多步骤：
-  建立一种体外细胞培养系统，用于分析病毒的生长情况；
-  分析病毒适合进行突变的位点，并研究病毒的功能；
-  使用PCR法，在病毒全长基因组克隆上进行定点突变；
-  突变病毒转染细胞培养系统，并评估其感染性、细胞病理学效应及病毒功能特异性变化；
-  使用SPF鸡胚在攻击模型中，测试具有疫苗潜力的突变病毒；以及
-  评估在攻击模型中，突变病毒的表型和体内感染性。
鸡胚致病性测试的结果可以清晰地显示，在所鉴定的结构和功能的关键区对VP2进行突变，能够用于开发适用于免疫接种的减毒病毒，或者是减毒病毒形式，或者是DNA疫苗形式。根据总的病理损害评分，除mut163突变体外，所有的突变体都可以显著地减毒。但是，从胸腺及脾脏病理损害评分看，mut163突变体显著地得以减毒。
值得注意的是，残基突变预计直接参与VP2的PTPase功能，具有最明显的减毒效果，但是发生在VP2蛋白C端的酸性和碱性区域的突变也可以达到同样的减毒效果。
另外，VP2基因翻译起始位点Kozac氏序列突变，导致产生更多VP2，使得该构建体不再能够多产复制。这样的构建体虽然不适合用于开发活的减毒疫苗，却可以用作DNA疫苗。
这些研究显示，VP2蛋白具有潜在的免疫调节作用。突变VP2因此可用于实施免疫系统中不太强烈的变化。
II.CAV VP2翻译起始信号的突变
这些研究表明了一种通用方法，即对CAV的VP2基因进行突变，以及对其他环状病毒的同系物进行突变，从而获得用作活疫苗的减毒株或DNA疫苗和产生可以用作DNA疫苗的非复制型基因组克隆。
另外，本发明人已清楚地显示，VP2蛋白在CAV感染过程具有免疫调节作用。发现VP2及其同系物可以影响免疫系统的功能。
利用复制缺陷型突变体还具有一定应用潜力，pCAU283-3和pCAU283+4可以用作鸡的DNA疫苗，因为瞬时表达VP2/VP3可足够引发免疫反应。
总结
本发明人已发现，直接突变是一种生产减毒病毒株的有效策略。首先，因为CAV基因组较小，易于进行分子生物学操作；其次，单独转染基因组即可容易地获得病毒颗粒。直接突变可以在一个无细胞及病毒的系统中导入到基因组中，并且可以在产生病毒之前精确地加以表征。因此这一策略是高效的，在应用上具有最佳的生物安全性。减毒活疫苗应用的一个限制因素是病毒体外生长的滴度低，以及在含胚SPF鸡蛋中培养病毒所要求的小的不便。开发DNA疫苗可以规避因细胞培养产物带来的生物安全方面的风险，以及病毒滴度低这样的限制因素，因此证明可以有效地应用于介蛋(in ovo)接种。另一种获得减毒活疫苗的方法是经过细胞传代得到的灭活疫苗或减毒活疫苗。接种试验鸡，共表达VP1和VP2蛋白可以使试验鸡产生中和性血清抗体，对病毒攻击产生保护作用。但是，减毒活疫苗通常具有更大的免疫原性能力，因为可以同时诱导体液和细胞介导的免疫。经传代而获得的减毒株不是用作疫苗的最好选择，因为它们仍保留有低水平的致病性。此外，经传代获得的减毒株在试验鸡中传代后迅速回复其毒力形式。因此，在重组基因组上使用定点突变策略，用作DNA疫苗或衍生减毒活疫苗具有明显的优势。疫苗接种程序可以将DNA疫苗施用到含胚卵以及将减毒活疫苗施用到较大龄的鸡只中。
CAV基因组的结构特征使其在应用突变策略制造减毒活疫苗的同时保持其感染性和免疫原性的过程中既有优势又有劣势。CAV病毒极其经济地利用它的编码容量。其基因组只有2.3kb，编码三个重叠的ORF，这给突变的选择带来了限制。一个ORF的突变必须设计成不会破坏重叠的ORF。所有的三个病毒蛋白的功能对于病毒的感染性都是必须的，因此突变的引入必须保证其蛋白功能可以保留。减毒的稳定性可以通过多因子途经而得以增强。依赖简单的点突变制备的减毒株，病毒会发生低频率的毒性恢复。在CAV病毒所有表征的分离株中，含有重叠读码框的编码区具有极高的保守性。这提示在野外条件下，该病毒容许自发突变的几率远小于预计的与聚合酶系统错误率相关的天然发生的突变率。这很可能是由于重叠框中同时变化是有害的，结果在一个框中限制强加在密码子改变上。上述讨论还提示：通过传代获得减毒株的过程将非常漫长，而且可能无法得到由靶突变获得的优化减毒株。自然发生的突变只有在一定条件下才是耐受的，即以可测量的频率突变发生在重叠读码框具有密码子摇摆的密码子中。定点突变因此可以进行优化设计，它不需要依赖低频发生的突变事件，而且可以通过仔细的设计，其中重叠ORF具有最低密码子摇摆的位点可容易地得以突变。通过定点突变体外导入的突变保留了重叠读码框，这将会降低毒性回复发生的频率，因为病毒需要保证其重叠编码区序列的保守性。减毒突变需要进行仔细、合理的设计，以利用定点突变构建突变体。
本领域技术人员将意识到，在不背离本发明所述的实质或范围的情形下，可对本发明所示的具体实施方案进行各种改变和/或修改。本发明的实施方案因而在所有方面应该看作是说明性的，而不是限制性的。
                           序列表
<110>墨尔本大学(The University of Melbourne)
<120>减毒环状病毒(Attenuated Circovirus)
<130>SCT033795-47
<150>PR5674
<151>2001-06-14
<160>68
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>2286
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>pCAU269/7的DNA序列
<400>1
ccccccttga acccccccct gggggggatt cccccccaga cccccccttt ataaagcact   60
caataaacgc agctaattcg ttcaccgcac aatcgctttc cgagtggtta ctattccatc   120
accattctag cctgtacaca aaaagtaaag atggacgaat cgctcgactt cgctcgcgat   180
tcgtcgaagg cggggggccg gaggcccccc ggtggccccc tccaaggagt ggagcgtgta   240
caggggggta cgtcatccgt acaggggggg tacgtcacaa gaaggcgttc ccgtacaggg   300
gggtacgtaa catgttcagg ggggtacgtc acaaccaatc aggagctgcc acgttgcgaa   360
agtgacgttt cgaaaatggg cggcgcaaga ctccctatat attgcgcgca cataccggtc   420
ggcagtaggt atacgcaagg cggtccgggt ggatgcacgg aaacggcgga caaccggccg   480
ctgggggcag tgaatcggcg cttagccgag aggggcaacc tgggcccagc ggagccgcgc   540
aggggcaagt aatttcaaat gaacgctcac caagaagata ctccaccagg accatcaacg   600
gtgttcaggc caccaacaag ttcacggccg ttggaaaccc ctcactgcag agagatccgg   660
attggtatcg ctggaattac agtcactcta tcgctgtgtg gctgcgcgaa tgctcgcgtt   720
cccacgctaa gatctgcaac tgcggacaat tcagaaaaca ctggtttcaa gaatgtgccg   780
gacttgagga ccgatcaacc caagcctccc tcgaagaagc gatcctgcga cccctccgag   840
tacagggtaa gcgagctaaa agaaagcttg attaccacta ctcccagccg accccgaacc   900
gcaagaaggt gtataagact gtaagatggc aagacgagct cgcagaccga gaggccgatt   960
ttacgccttc agaagaggac ggtggcacca cctcaagcga cttcgacgaa gatataaatt   1020
tcgacatcgg aggagacagc ggtatcgtag acgagctttt aggaaggcct ttcacaaccc   1080
ccgccccggt acgtatagtg tgaggctgcc aaacccccag tccacgatga ctatccgctt   1140
ccaaggagtc atctttctca ccgaaggact cattctacct aaaaacagca cagctggggg   1200
ctatgcggac cacatgtacg gggcgagagt cgccaagatc tcagtgaacc tgaaagagtt   1260
cctcctagca tcaatgaacc tgacatacgt gagcaagata ggaggcccca tcgccggtga   1320
gttgattgcg gacgggtcta aatcgcaagc cgcggagaac tggccaaatt gctggctgcc   1380
gctagataat aacgtgccct ccgctacacc atctgcatgg tggagatggg ctttaatgat   1440
gatgcagcca acggactcct gccggttttt taatcaccct aagcaaatga ccctgcaaga   1500
catgggtcgg atgtttgggg gctggcatct gttccgacac attgaaaccc gctttcagct  1560
ccttgccact aagaatgagg gatccttcag ccccgtggcg agtcttctct cccagggaga  1620
gtacctcacg cgccgcgacg atgttaagta cagcagcgac caccagaacc ggtggcgaaa  1680
aggcgagcaa ccgatgacgg gggggattgc ttacgcgacc ggtaaaatga gactcgacga  1740
gcaacaatac cctgctatgc ccccggaccc cccgatcatc accactacca ctgcgcaagg  1800
cacgcaagtc cgctgcatga atagcacgca agcttggtgg tcgtgggaca catatatgag  1860
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Val Ile Ser Asn Glu Arg Ser Pro Arg Arg Tyr Ser Thr Arg Thr Ile
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<211>2286
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<400>23
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<212>DNA
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<220>
<223>鸡贫血症病毒基因组的mut K 102 E
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<213>人工序列
<220>
<223>mut C 95 S-寡核苷酸
<400>32
cgcagttgct gatcttagcg tg                              22
<210>33
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>mut C 97 S+寡核苷酸
<400>33
atctgcaaca gcggacaatt c                             21
<210>34
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>mut C 97 S-寡核苷酸
<400>34
attgtccgct gttgcagatc ttag                             24
<210>35
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>mut R 101 G+寡核苷酸
<400>35
ctgcggacaa ttcggaaaac actgg                          25
<210>36
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>mut R 101 G-寡核苷酸
<400>36
cagtgttttc cgaattgtcc gcag                             24
<210>37
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>mut H 103 Y+寡核苷酸
<400>37
cagaaaatac tggtttcaag aatgtgccgg ac                      32
<210>38
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>mut H 103 Y-寡核苷酸
<400>38
gaaaccagta ttttctgaat tgtccgcag                         29
<210>39
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>mutR 129 G+寡核苷酸
<400>39
ctgcgacccc tcggagtaca ggg                           23
<210>40
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>mut R 129 G-寡核苷酸
<400>40
ccctgtactc cgaggggtcg caggatcgc                        29
<210>41
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>mut Q 131 P+寡核苷酸
<400>41
cgagtaccgg gtaagcgagc taaaag                        26
<210>42
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>mut Q 131 P-寡核苷酸
<400>42
cgcttacccg gtactcggag g                             21
<210>43
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>mut R/K/K 150/151/152 G/A/A+寡核苷酸
<400>43
ccgaacggcg cggcggtgta taag                         24
<210>44
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>mut R/K/K 150/151/152 G/A/A-寡核苷酸
<400>44
atacaccgcc gcgccgttcg gggtc                         25
<210>45
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>mut D/E 161/162 G/G+寡核苷酸
<400>45
taagatggca aggcgggctc gcagacc                       27
<210>46
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>mut D/E 161/162 G/G
<400>46
tgcgagcccg ccttgccatc                            20
<210>47
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>mut L 163 P+寡核苷酸
<400>47
gacgagcccg cagaccgaga g                          21
<210>48
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>mut L 163 P-寡核苷酸
<400>48
ggcctctcgg tctgcgggct cgtc                           24
<210>49
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>mut D 169 G+寡核苷酸
<400>49
gagaggccgg ttttacgcct tcag                           24
<210>50
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>mut D 169 G-寡核苷酸
<400>50
gcgtaaaacc ggcctctcgg tc                          22
<210>51
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>mut K 102 E+寡核苷酸
<400>51
ctgcggacaa ttcagagaac actggtttc                       29
<210>52
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>mut K 102 E-寡核苷酸
<400>52
gaaaccagtg ttctctgaat tgtccgcag                        29
<210>53
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>mut E 186 G+寡核苷酸
<400>53
gcgacttcga cggagatata aatttc                          26
<210>54
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>mut E 186 G-寡核苷酸
<400>54
tttatatctc cgtcgaagtc gc                               22
<210>55
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>CAV.1引物
<400>55
ctatcgaatt ccgagtggtt actat                            25
<210>56
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>CAV.10引物
<400>56
tgctcacgta tgtcaggttc                                20
<210>57
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>CAV.2引物
<400>57
gcggagccgc gcaggggcaa                           20
<210>58
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>CAV 19寡核苷酸
<400>58
cggtccggga ggatgcacgg aaacgg                        26
<210>59
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>CAV 20寡核苷酸
<400>59
gtgcatcctc ccgaccgcct tgcgt                          25
<210>60
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>CAV 21寡核苷酸
<400>60
cggtccgggt ggatggacgg aaacgg                        26
<210>61
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>CAV 22寡核苷酸
<400>61
gtccatccac ccggaccgcc ttgcgt                          26
<210>62
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>CAV 1寡核苷酸
<400>62
ctatcgaatt ccgagtggtt actat                            25
<210>63
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>CAV 11寡核苷酸
<400>63
agctcgtctt gccatcttac agtcttatac                         30
<210>64
<211>9
<212>PRT
<213>鸡贫血症病毒—特征基序CAV VP2 PTP
<400>64
Ile Cys Asn Cys Gly Gln Phe Arg Lys
1         5
<210>65
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>CAV.1引物
<400>65
cggtccggat ccatgcacgg aaacggcgga caac                   34
<210>66
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>CAV.2引物
<400>66
ggtttggaat tctcacacta tacgtaccgg ggc                      33
<210>67
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>TLMV.1引物
<400>67
ttggatccat gagcagcttt ctaacaccat c                       31
<210>68
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>TLMV.2引物
<400>68
ggcgaattct tacccatcgt cttcttcgaa atc                      33

Claims (55)

1.一种分离的减毒环状病毒，其在编码病毒蛋白2(VP2)的病毒核酸中含有突变。
2.根据权利要求1所述的分离的减毒环状病毒，其中所述环状病毒衍生自或得自鸡贫血症病毒(CAV)，TT病毒(TTV)，或其他相似的表达VP2蛋白的病毒。
3.根据权利要求2所述的分离的减毒环状病毒，其中所述环状病毒衍生自或得自鸡贫血症病毒(CAV)。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的分离的减毒环状病毒，其中所述突变存在于编码VP2特征基序的核酸区域中。
5.根据权利要求4所述的分离的减毒环状病毒，其中所述突变改变病毒PTPase活性、PTPase基序、酸性α螺旋区或碱性β折叠区域。
6.根据权利要求3所述的分离的减毒环状病毒，其中所述突变存在于CAV VP2的核酸残基第80到110，128到143，151到158以及160到170位的区域中。
7.根据权利要求6所述的分离的减毒环状病毒，其中在CAVVP2内突变靶位点选自第86，95，97，101，103以及169位。
8.根据权利要求6所述的分离的减毒环状病毒，其中所述突变选自mut C86R，mut C95S，mut C97S，mut R101G，mut K102E，mut H103Y，mut R129G，mut Q131P，mut R/K/K 150/151/152G/A/A，mut D/E 161/162 G/G，mut L163P，mut D169G，mut E186G及其组合。
9.根据权利要求8所述的分离的减毒环状病毒，其包含mut D169G。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的分离的减毒环状病毒，其含有选自序列号1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，25以及27的核酸序列。
11.一种环状病毒疫苗组合物，其包括一种减毒的环状病毒和可接受的载体或稀释剂，所述减毒的环状病毒在编码病毒蛋白2(VP2)的病毒核酸中含有突变。
12.根据权利要求11所述的环状病毒疫苗组合物，其中所述减毒的环状病毒衍生自或得自鸡贫血症病毒(CAV)，TT病毒(TTV)，或其他相似的表达VP2蛋白的病毒。
13.根据权利要求12所述的环状病毒疫苗组合物，其中所述减毒的环状病毒衍生自或得自鸡贫血症病毒(CAV)。
14.根据权利要求11-13中任一项所述的环状病毒疫苗组合物，其中所述突变存在于编码VP2特征基序的核酸区域中。
15.根据权利要求14所述的环状病毒疫苗组合物，其中所述突变改变病毒PTPase活性、PTPase基序、酸性α螺旋区或碱性β折叠区。
16.根据权利要求13所述的环状病毒疫苗组合物，其中所述突变存在于CAV VP2的核酸残基第80到110，128到143，151到158以及160到170位的核酸残基区域中。
17.根据权利要求16所述的环状病毒疫苗组合物，其中在CAVVP2中突变靶位点选自第86，95，97，101，103以及169位。
18.根据权利要求16所述的环状病毒疫苗组合物，其中所述突变选自mut C86R，mut C95S，mut C97S，mut R101G，mut K102E，mut H103Y，mut R129G，mut Q131P，mut R/K/K 150/151/152G/A/A，mut D/E 161/162 G/G，mut L163P，mut D169G，mut E186G及其组合。
19.根据权利要求18所述的环状病毒疫苗组合物，其包含mut D169G。
20.根据权利要求11-19中任一项所述的环状病毒疫苗组合物，其包括一种选自序列号1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，25以及27的核酸序列。
21.一种赋予动物对环状病毒感染的免疫力的方法，其包括给动物施用有效量的权利要求11-20中任一项所述的环状病毒疫苗。
22.根据权利要求21所述的赋予动物对环状病毒感染的免疫力的方法，其中所述动物为禽类。
23.根据权利要求22所述的赋予动物对环状病毒感染的免疫力的方法，其中禽类为鸡。
24.根据权利要求21-23中任一项所述的赋予动物对环状病毒感染的免疫力的方法，其中疫苗的施用途径为肠胃外、肌内、皮下、口服、经鼻、或介蛋。
25.根据权利要求24所述的赋予动物对环状病毒感染的免疫力的方法，其中动物为禽类，疫苗的施用途径为粘膜给药、气雾剂给药或经饮用水给药。
26.根据权利要求25所述的赋予动物对环状病毒感染的免疫力的方法，其中禽类为鸡。
27.根据权利要求21-26中任一项所述的赋予动物对环状病毒感染的免疫力的方法，其中疫苗施用的剂量范围是1-100百万TCID50。
28.根据权利要求27所述的赋予动物对环状病毒感染的免疫力的方法，其中疫苗施用的剂量范围为约1000TCID50。
29.一种分离的核酸分子，其衍生自或得自一种环状病毒基因组，所述核酸分子包括至少部分病毒蛋白2(VP2)的编码区，其中含有突变。
30.根据权利要求29所述的分离的核酸分子，其中环状病毒衍生自或得自鸡贫血症病毒(CAV)，TT病毒(TTV)，或其他相似的表达VP2蛋白的病毒。
31.根据权利要求30所述的分离的核酸分子，其中环状病毒衍生自或得自鸡贫血症病毒(CAV)。
32.根据权利要求29-31中任一项所述的分离的核酸分子，其中所述突变存在于编码VP2特征基序的核酸区中。
33.根据权利要求32所述的分离的核酸分子，其中所述突变改变病毒PTPase活性、PTPase基序、酸性α螺旋区或碱性β折叠区。
34.根据权利要求31所述的分离的核酸分子，其中所述突变存在于CAV VP2的核酸残基第80到110，128到143，151到158以及160到170位的区域中。
35.根据权利要求34所述的分离的核酸分子，其中在CAV VP2内突变靶位点选自第86，95，97，101，103以及169位。
36.根据权利要求34所述的分离的核酸分子，其中所述突变选自mut C86R，mut C95S，mut C97S，mut R101G，mut K102E，mut H103Y，mut R129G，mut Q131P，mut R/K/K 150/151/152G/A/A，mut D/E 161/162 G/G，mut L163P，mut D169G，mut E186G及其组合。
37.根据权利要求36所述的分离的核酸分子，其包含mut D169G。
38.根据权利要求29-37中任一项所述的分离的核酸分子，其包括一种选自序列号1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，25以及27的序列。
39.一种疫苗组合物，其包括权利要求29-38中任一项所述的分离的核酸分子以及可接受的载体或稀释剂。
40.一种赋予动物对环状病毒感染的免疫力的方法，其包括给动物施用权利要求39所述的疫苗组合物。
41.根据权利要求40所述的赋予动物对环状病毒感染的免疫力的方法，其中环状病毒感染是CAV感染。
42.根据权利要求41所述的赋予动物对环状病毒感染的免疫力的方法，其中动物是禽类。
43.根据权利要求42所述的赋予动物对环状病毒感染的免疫力的方法，其中禽类是鸡。
44.根据权利要求1-10中任一项所述的分离的减毒环状病毒在制备用于赋予动物对环状病毒感染的免疫力的疫苗中的应用。
45.根据权利要求29-38中任一项所述的分离的核酸分子在制备用于赋予动物对环状病毒感染的免疫力的疫苗中的应用。
46.一种生产环状病毒疫苗的方法，其包括：
(a)将一种衍生自或得自环状病毒基因组的分离的核酸分子接种到含胚卵的蛋黄囊中，其中所述核酸分子包括至少部分病毒蛋白2(VP2)的编码区，其中含有突变；
(b)使环状病毒从分离的核酸中复制；以及
(c)从所述卵中收集所述环状病毒。
47.根据权利要求46所述的生产环状病毒疫苗的方法，其中所述的分离的核酸分子衍生自或得自鸡贫血症病毒(CAV)，TT病毒(TTV)，或其他相似的表达VP2蛋白的病毒。
48.根据权利要求47所述的生产环状病毒疫苗的方法，其中分离的核酸分子衍生自或得自鸡贫血症病毒(CAV)。
49.根据权利要求46-48中任一项所述的生产环状病毒疫苗的方法，其中所述突变存在于编码VP2特征基序的核酸区域中。
50.根据权利要求49所述的生产环状病毒疫苗的方法，其中所述突变改变病毒PTPase活性、PTPase基序、酸性α螺旋区或碱性β折叠区。
51.根据权利要求48所述的生产环状病毒疫苗的方法，其中所述突变存在于CAV VP2的核酸残基第80到110，128到143，151到158以及160到170位的区域中。
52.根据权利要求51所述的生产环状病毒疫苗的方法，其中CAVVP2内突变靶位点选自第86，95，97，101，103以及169位。
53.根据权利要求51所述的生产环状病毒疫苗的方法，其中所述突变选自mut C86R，mut C95S，mut C97S，mut R101G，mut K102E，mut H103Y，mut R129G，mut Q131P，mut R/K/K 150/151/152G/A/A，mut D/E 161/162 G/G，mut L163P，mut D169G，mut E186G及其组合。
54.根据权利要求53所述的生产环状病毒疫苗的方法，其包含mut D169G。
55.根据权利要求46-54中任一项所述的生产环状病毒疫苗的方法，其含有的核酸序列选自序列号1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，25以及27。
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