JPH08168381A - 組換え伝染性非セグメント化陰性鎖ｒｎａウイルス - Google Patents

組換え伝染性非セグメント化陰性鎖ｒｎａウイルス

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Abstract

(57)【要約】 【課題】 組換えＤＮＡ技術により産生可能な、遺伝子
操作による伝染性複製非セグメント化陰性鎖ＲＮＡウイ
ルス突然変異体を提供する。 【解決手段】 前記突然変異体は、ＲＶゲノムのＯＲ
Ｆ、偽遺伝子領域又は非コード化領域に挿入及び／又は
欠失を含む。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、遺伝子操作による
伝染性複製非セグメント化陰性鎖ＲＮＡウイルス突然変
異体、及びこのような突然変異体の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】狂犬病
ウイルス（ＲＶ）は、ラブドウイルスファミリーの非セ
グメント化陰性鎖ＲＮＡウイルスの一例である。このフ
ァミリーに属する他の種は、水泡性口内炎ウイルス（Ｖ
ＳＶ）、伝染性造血壊死ウイルス（ＩＨＮＶ）、ウイル
ス性出血性敗血症ウイルス（ＶＨＳ、Ｅｇｔｖｅｄウイ
ルス）、ウシ一過性熱ウイルス（ＢＥＦＶ）、及びｓｏ
ｎｃｈｕｓ ｙｅｌｌｏｗ ｎｅｔウイルス（ＳＹＮ
Ｖ）である。
【０００３】ラブドウイルスファミリーの他に、パラミ
クソウイルス（例えばセンダイウイルス（ＳＶ）、パラ
インフルエンザウイルス（ＰＩＶ）２型及び３型、ニュ
ーカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、おたふくかぜウイル
ス（ＭＵＶ）、はしかウイルス（ＭＥＶ）並びにイヌジ
ステンパーウイルス（ＣＤＶ））やフィロウイルスに属
するウイルス、及びファミリーに帰属しない数種のウイ
ルス（例えばボルナ病ウイルス；ＢＤＶ）も非セグメン
ト化陰性鎖ＲＮＡゲノムを有する。
【０００４】種々のファミリーの非セグメント化陰性鎖
ＲＮＡウイルスの全体的なゲノム構成は似通っている。
特にパラミクソウイルスとラブドウイルスとの全体的な
ゲノム構成の相違はごく僅かである（Ｔｏｒｄｏ等，Ｓ
ｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３：３４１
−３５７，１９９２）。
【０００５】ＲＶは全ての温血動物に感染し得、ほぼ全
ての場合で発症した後に感染から死に至る。イヌ狂犬病
は今でも世界の大部分で重大であり、世界中で年間に発
生する推定７５，０００件のヒト狂犬病症例の大半が感
染したイヌによるものである。ヨーロッパの多くの国々
や、米国、カナダでは、野生生物狂犬病の重大性が増し
ている。
【０００６】狂犬病の臨床的特性は大半の種で同様であ
るが、個人差が大きい。狂犬病動物にかまれた後の潜伏
期間は通常１４日から９０日であるが、これよりも長く
なることもある。１年以上の潜伏期間も報告されてい
る。この疾病では、狂暴性及び緘黙性又は麻痺性の２種
の臨床形態が確認されている。狂暴型では、動物は落ち
着きがなく、神経質で攻撃的になり、ヒトへの恐怖感を
全く喪失し、注意を引く何にでもかみつくためにしばし
ば危険である。動物はしばしば感情を抑制することがで
きず、“狂水病”の症状が現れる。しばしば、唾液過多
となり、光や音への反応が過剰になり、知覚過敏にな
る。脳炎が進行すると、狂暴性から麻痺に移行し、動物
は緘黙型疾病全体で確認される同じ臨床的特徴を示す。
末期になると、しばしば麻痺性発作、昏睡状態や呼吸停
止が起こり、臨床的徴候が発生してから２〜７日後には
死亡する。
【０００７】狂犬病ウイルスは、狂犬病動物にかまれ
て、場合によってはそのかすり傷から、又は狂犬病動物
のウイルス含有唾液が傷口に入って、体内に侵入する。
筋肉のかまれた部位でウイルスが複製し、その後末梢神
経末端に侵入し、軸索細胞質のウイルスゲノムが中枢神
経系に移動する。脊髄、次いで脳（特に大脳辺縁系）へ
のウイルスの侵入は、ニューロン機能不全の臨床的徴候
と関連する。通常、中枢神経系の感染で狂暴的になるの
とほぼ同時に、ビリオンが更に唾液腺の粘液分泌細胞の
先端から放出され、高濃度で唾液に送達される。
【０００８】狂犬病の過程では常に、宿主の特異的な炎
症性免疫応答は最小の刺激を受けるにすぎない。この最
も妥当な理由は、筋肉や神経細胞では感染が非細胞変性
であり、感染が神経系の免疫学的に分離された（seques
tered）環境にかなり集中することである。全てのラブ
ドウイルスのようなＲＶビリオンは、２種の主要構造成
分：（ヌクレオキャプシド又はリボ核タンパク質（ＲＮ
Ｐ）コア及びＲＮＰコアを包囲する二層膜形態のエンベ
ロープ）からなる。全てのラブドウイルスの感染成分は
ＲＮＰコアである。ゲノムＲＮＡは陰性センスであるた
め、メッセンジャーとしては機能し得ないが、ｍＲＮＡ
転写のために自身の内在性ＲＮＡポリメラーゼを必要と
する。ＲＮＡゲノムは、２種の少量タンパク質、即ちＲ
ＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（Ｌ）及びリンタンパク
質（Ｐ）と組合わさったヌクレオキャプシド（Ｎ）タン
パク質によってキャプシド内に被包されてＲＮＰコアを
形成する。膜成分は２種のタンパク質（トランスメンブ
ラン糖タンパク質（Ｇ）及び膜の内側に位置する基質
（Ｍ）タンパク質）を含んでいる。Ｇタンパク質はＲＶ
の細胞付着や膜融合を担い、更には、宿主免疫系の主標
的である。
【０００９】転写中に、ゲノムは短いリーダーＲＮＡと
モノシストロニックでキャップ構造を有する５個のポリ
アデニル化ｍＲＮＡとの逐次合成を指示する。複製中
に、シストロン間の条件転写終結及び開始シグナルが、
ウイルスポリメラーゼによって無視される。トランスク
リプターゼ反応及びレプリカーゼ反応では共に、ＲＮＡ
ゲノムと複合体形成したＮ−タンパク質の存在やＬ及び
Ｐタンパク質が必要である。ＲＶゲノムの遺伝子順が決
定され、図１に示すように３’−リーダー−Ｎ−Ｐ−Ｍ
−Ｇ−Ｌ−５’である。転写直後にＲＶのｍＲＮＡの各
々が翻訳される。複製中に２つの事象が逐次実施され、
即ちまずゲノムと相補的な被包化完全陽性鎖ＲＮＡが産
生され、次いで同様にＮ、Ｌ及びＰタンパク質によって
被包された完全陰性鎖ＲＮＡが産生される。最後に、作
成及び発達（ｂｕｄｄｉｎｇ）プロセス中に新しく作成
されたＲＮＰコアがＭタンパク質やＧタンパク質と結合
すると、完全に形成された伝染性ＲＶビリオンが放出さ
れる。
【００１０】１１．９ｋｂゲノムＲＶ ＲＮＡは、Ｇ遺
伝子とＬ遺伝子との間に偽遺伝子領域（Ψ）が存在する
こと以外に、Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｇ及びＬタンパク質をコード
する５個の読み取り枠（ＯＲＦ）を含んでいる（図
１）。
【００１１】現存の非セグメント化陰性鎖ＲＮＡウイル
スワクチンは、化学的に不活化したウイルスワクチン、
又は細胞培養で何度も継代させて病原性を低減させた弱
毒化ウイルス株を含む改変生ウイルスワクチンからな
る。化学的に不活化した狂犬病ワクチンは例えば、Ｒａ
ｂｉｖａｃ、Ｂｅｈｒｉｎｇｗｅｒｋｅ（ヒト）、ＨＤ
Ｃ、Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ（ヒト）、Ｂａｙｏｖ
ａｃ−ＬＴ、Ｂａｙｅｒ（動物）、Ｍａｄｉｖａｃ、Ｈ
ｏｅｃｈｓｔ（動物）、Ｅｐｉｖａｘ−ＬＴ、Ｐｉｔｍ
ａｎ−Ｍｏｏｒｅ、Ｒａｂｉｓｉｎ、Ｒｈｏｎｅ−Ｍｅ
ｒｉｅｕｘである。前述の弱毒化ＲＶウイルスの例は、
ワクチン株ＳＡＤ Ｂ１９及びＥＲＡである。不活化ワ
クチンは一般に、ごく低レベルの免疫しか誘発しないの
で、繰り返し免疫する必要がある。更には、不活化処理
で病原体の中和誘発抗原決定基が変化して、ワクチンの
防御潜在能力が低下することがある。
【００１２】一般に、弱毒化生ウイルスワクチンは、し
ばしば体液反応及び細胞反応の両方に基づく免疫反応を
誘起するので好ましい。しかしながら、細胞培養継代中
は、非調整突然変異がウイルスゲノム内に導入されて、
毒性や免疫性に関して不均一なウイルス粒子集団が得ら
れ得る。細胞培養継代中の過剰弱毒化はこれらのワクチ
ンでは問題となり得る。ワクチンが尚防御的でありなが
ら毒性をもたないように微妙なバランスを図らなければ
ならない。更には、このような従来の弱毒化生ウイルス
ワクチンが毒性を取り戻して、接種動物が発病し、病原
体が他の動物に伝染する可能性があり得ることもよく知
られている。
【００１３】更には、生ウイルスワクチン併用での問題
は、抗原成分が相互に影響を受けて、１種以上の構成成
分の潜在能力が低下することである。
【００１４】更には、現在投与されている生弱毒化又は
不活化ＲＶワクチンでは、特定動物がＲＶフィールドウ
イルスのキャリアーであるのか、それともその動物がワ
クチン接種を受けたのかを決定することが不可能であ
る。従って、ＲＶワクチンの接種を受けた動物と、フィ
ールドウイルスに感染した動物とを区別して、毒性フィ
ールドウイルスの伝染を抑制する適切な措置を図れるこ
とが重要であり得る。通常感染した宿主動物で抗体を産
生するＲＶの（糖）タンパク質をコードする遺伝子に突
然変異を導入することにより、例えば血清学的に同定可
能なマーカーを導入することができる。
【００１５】例えば得られる突然変異体ＲＮＡが弱毒化
するか又は外来タンパク質（例えば免疫マーカータンパ
ク質又は病原体の抗原）のエピトープをコードする異種
核酸配列を含むように、調節しながらＲＶ ＲＮＡゲノ
ム内に突然変異を導入することが望ましい。このため
に、ＤＮＡウイルスや陽性鎖ＲＮＡウイルスを用いた組
換えＤＮＡ技術が既に広範に使用されている。組換えＤ
ＮＡウイルスの例は、アウジェスキーウイルス（ＰＲ
Ｖ）；アデノウイルス；ワクシニアウイルスである。組
換え陽性鎖ＲＮＡウイルスの例は、アルファウイルス
（Ｓｉｎｄｂｉｓ Ｖ．，Ｓｅｍｌｉｋｉ ｆｏｒｅｓ
ｔ ｖｉｒｕｓ：Ｈ．Ｖ．Ｈｕａｎｇ，Ｃ．Ｍ．Ｒｉｃ
ｅ，Ｃ．Ｘｉｏｎｇ，Ｓ．Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ（１
９８９）ＲＮＡｖｉｒｕｓｅｓ ａｓ ｇｅｎｅ ｅｘ
ｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｖｉｒｕｓ Ｇｅ
ｎｅｓ ３，８５−９１）、ピコルナウイルス（Ｐｏｌ
ｉｏｖｉｒｕｓ，Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ａ−ｖｉｒｕ
ｓ，Ｆｏｏｔ− ａｎｄ ｍｏｕｔｈ−ｄｉｓｅａｓｅ
ｖｉｒｕｓ：Ｊ．Ｗ．Ａｌｍｏｎｄ及びＫ．Ｌ．Ｂｕ
ｒｋｅ（１９９０）Ｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓ ａｓ ａ
ｖｅｃｔｏｒ ｆｏｒｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏ
ｎ ｏｆ ｆｏｒｅｉｇｎ ａｎｔｉｇｅｎｓ．Ｓｅｍ
ｉｎ．Ｖｉｒｏｌ．１，１１−２０）である。ＲＮＡウ
イルスゲノムの特異的（Ｄｉｒｅｃｔｅｄ）遺伝子操作
は、特定のＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによって鋳
型として受容される組換えＲＮＡの産生能力に依存す
る。多数の標準的なＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ
（例えばＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ又は細胞ＲＮＡポリ
メラーゼＩＩ）によって産生され、ウイルスゲノムを模
倣する転写体は、多数の陽性鎖ＲＮＡウイルスのポリメ
ラーゼによって認識される。これにより、ｃＤＮＡ転写
体から伝染性ウイルス又はレプリコンが回収され、組換
えＤＮＡ技術を適用してこれらのゲノムを部位特異的に
操作することができる。陽性鎖ＲＮＡウイルスのゲノム
に対応するＲＮＡはウイルスポリメラーゼの翻訳用ｍＲ
ＮＡとして機能し得るので、ゲノム類似体を細胞内に導
入することにより感染サイクルが開始し得る。しかしな
がら、陰性鎖ＲＮＡウイルスのポリメラーゼの鋳型は専
ら、ＲＮＰ複合体である。更には、陽性鎖ＲＮＰウイル
スとは対照的に、そのゲノム又は抗ゲノムＲＮＡはｍＲ
ＮＡとして機能し得ず、従って人工ＲＮＡの複製や転写
に関与する全てのウイルスタンパク質はトランスで提供
しなければならない。
【００１６】陰性鎖ＲＮＡウイルスのゲノムＲＮＡ類似
体をセグメント化ゲノムでキャプシド内に被包して適切
な鋳型を提供するための適切な系が最近Ｐａｌｅｓｅ，
Ｐ等によって開示されている（ＷＯ９１／０３５５２
号）。インフルエンザウイルスゲノムセグメント由来の
ＲＮＡ転写体を精製タンパク質でキャプシド内にｉｎｖ
ｉｔｒｏ被包し、これをヘルパーウイルスと併用して細
胞をトランスフェクトすることができる。しかしなが
ら、非セグメント化ゲノムを有するウイルスであるＲＶ
ではこのアプローチは成功しないことが知見された。ウ
イルスタンパク質をコードする遺伝子を含むＲＮＡゲノ
ムの主要部分が欠失しているＶＳＶ及びＲＶの短いモデ
ルゲノムをプラスミドコード化タンパク質でキャプシド
内に被包して発現させることができた（Ｐａｔｔｎａｉ
ｋ，Ａ．Ｋ．等，Ｃｅｌｌ ６９，１０１１−１０２
０，１９９２；Ｃｏｎｚｅｌｍａｎｎ，Ｋ−Ｋ．及び
Ｍ．Ｓｃｈｎｅｌｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６８，７
１３−７１９，１９９４）。このアプローチは、任意に
リポーター遺伝子インサートを含んでいるゲノム類似体
とトランスフェクトしたプラスミドに由来する特定のウ
イルスタンパク質の両方を同時に発現して、欠陥ウイル
ス粒子を産生することからなった。Ｂａｌｌａｒｔ等
は、伝染性はしかウイルス、更には非セグメント化陰性
鎖ＲＮＡウイルスのクローン化ｃＤＮＡからの産生方法
を記載している（Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ，
９：３７９−３８４（１９９０））。この方法に関する
ヨーロッパ特許は、前記文献の著者が発明者の一人とし
て加わって出願されている。
【００１７】しかしながら、想定される全ての組換えウ
イルスは全く組換え体ではなく、単に最初に使用したワ
クチン株の後代ウイルスであることが別の研究によって
判明したので、前記文献及び特許明細書は共に取り下げ
られている。
【００１８】従って、全ゲノムの操作を必要とする大き
な非セグメント化ゲノムを含む伝染性組換え陰性鎖ＲＮ
Ａウイルスの産生は今日まで成功していないと結論付け
なければならない。
【００１９】
【課題を解決するための手段】本発明は、組換えＤＮＡ
技術により産生可能であり、ＲＶゲノムのＯＲＦ、偽遺
伝子領域又は非コード化領域に挿入及び／又は欠失を含
む、遺伝子操作による伝染性複製非セグメント化陰性鎖
ＲＮＡウイルス突然変異体を提供する。
【００２０】特に本発明は、パラミクソウイルスファミ
リー及びラブドウイルスファミリーの非セグメント化陰
性鎖ＲＮＡウイルスを提供する。
【００２１】前述したように、非セグメント化陰性鎖Ｒ
ＮＡウイルスファミリー間のゲノム構成には大きな相同
性が認められる。複製、作成、細胞付着又は細胞融合の
プロセスでのコード化タンパク質の機能が似通っている
場合、これらのタンパク質は更に“類似体”と称する。
例えばあるファミリーの２種のタンパク質の機能が他の
ファミリーで１種のタンパク質に統合していることもあ
る。例えば、一緒になってラブドウイルスの糖タンパク
質Ｇと同じ機能を有するパラミクソウイルスのＦタンパ
ク質とＨＮタンパク質の場合がそうである。この場合、
あるファミリーの２種のタンパク質は、他のファミリー
の１種のタンパク質の類似体（ａｎａｌｏｇｏｎｓ）と
みなされる。
【００２２】対応するウイルスＯＲＦ、偽遺伝子領域又
は非コード化領域に適切な突然変異を取り込むことによ
り、１個以上の核酸残基の挿入や欠失をＲＶゲノムに導
入することができる。この改変は、ＲＶ ＯＲＦ又は親
ＲＶの偽遺伝子の遺伝子情報を変化させて、本発明の挿
入又は欠失ＲＶ突然変異体を得ることである。
【００２３】１種以上のヌクレオチドが他のヌクレオチ
ドで置換される突然変異、いわゆる置換は欠失と挿入の
作用を組み合わせた結果であると考えられる。従って、
この種の突然変異は更に、欠失及び（／又は）挿入とい
う用語に含まれると考えられる。
【００２４】本明細書に記載する任意の突然変異が、得
られるＲＶ突然変異体が尚も伝染性で複製する、即ち突
然変異体ＲＶが感受性細胞に感染し得、その突然変異体
ＲＮＡゲノムが自律的に複製や転写を行い得る、即ちＲ
ＶのＮ、Ｐ及びＬタンパク質の同時発現が不要であるよ
うに、適切なＲＶ配列を変化させることからなることは
明白である。
【００２５】たった１回感染して、複製し得る突然変異
体ＲＶ（Ｖｉｄｅ ｉｎｆｒａ）も本発明に含まれるこ
とは言うまでもない。
【００２６】種々のＲＶ株のゲノム構成は同一である。
ワクチン株ＳＡＤ Ｂ１９及び毒性株ＲＶのヌクレオチ
ド配列や推定上のアミノ酸配列の分析も決定されている
（Ｃｏｎｚｅｌｍａｎｎ等，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７
５，４８５−４９９，１９９０及びＴｏｒｄｏ等，Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４，２６７１−２
６８３，１９８６；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ ＵＳＡ ８３，３９１４−３９１８，１９８６；
Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １６５，５６５−５６７，１９８
８）。Ｃｏｎｚｅｌｍａｎｎ等の文献（１９９０（上
掲））では、ＳＡＤＢ１９株のウイルスゲノムが１１，
９２８ヌクレオチドを含み、５個のウイルスタンパク質
Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｇ及びＬの推定上のアミノ酸配列が、病原
性ＰＶ株のものと非常に類似していることが確定してい
る。同明細書ではＲＶの各ＯＲＦ、偽遺伝子領域及び遺
伝子間非コード化領域の位置が決定されており、ＲＶの
Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｇ及びＬ遺伝子のコード化領域はそれぞ
れ、位置７１−１４２３、１５１４−２４０７、２４９
６−３１０４、３３１７−４８９１、５４１４−１１７
９７に対応する。偽遺伝子領域（Ψ）は位置４９６１−
５３５９に存在し、５個のシストロンを分かち、転写開
始及び終結／ポリアデニル化シグナルを含む非コード化
配列に隣接する遺伝子間領域は位置１４８３−１４８
４；２４７６−２４８０；３２８５−３２８９；５３６
０−５３８３に存在する。突然変異を導入するために本
明細書で使用する親ＲＶ株のＯＲＦ、偽遺伝子領域又は
非コード化領域の番号付けやヌクレオチド配列は必ずし
もＳＡＤ Ｂ１９又はＰＶ株のものと同一ではないが、
前述したこれらの領域の特性は、任意のＲＶ株のゲノム
上での位置を正確に限定する。
【００２７】毒性親ＲＶ株からの弱毒化ＲＶの産生方法
は、ウイルスタンパク質をコードするＯＲＦ内に挿入及
び／又は欠失を導入して、例えば宿主細胞付着や膜融合
のためのウイルスタンパク質の活性を改変する、例えば
低減することである。ＲＶについては、トランスメンブ
ラン糖タンパク質Ｇのアミノ酸配列の変化がＲＶの病原
性に有意に作用することが知られている。更には、弱毒
化に関しても、基質（Ｍ）タンパク質の変化がＧタンパ
ク質のコンホーメーションに影響して、ウイルスを弱毒
化し得る。従って、Ｇ又はＭタンパク質をコードするＯ
ＲＦに欠失又は挿入を含む突然変異体ＲＶが本明細書で
特に好ましい。
【００２８】僅か１回感染して、複製し得る伝染性複製
狂犬病ウイルス突然変異体も本明細書に含まれる。その
利点を以下で説明する。
【００２９】一般的な組換え生ワクチンは安全で効果的
であることが証明されているが、このワクチンウイルス
は、このウイルスに対する感受性がより高い他の動物に
伝染する危険性がある。
【００３０】従って、政治的、倫理的、及び一部には科
学的見地から、この分野で組換えウイルスを使用するこ
とは非常に不本意である。
【００３１】特に、遺伝学的に改変したワクチンウイル
ス、とりわけ外来遺伝子を発現する生ウイルスに関して
の監視当局（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ａｕｔｈｏｒｉｔ
ｉｅｓ）による危険アセスメント研究では、環境でのこ
れらのウイルスの拡散の可能性の観点が非常に重要な観
点である。
【００３２】従って、生ウイルスワクチンの全ての利点
を示すが、接種する動物に限定され、拡散しない狂犬病
ウイルスワクチンが非常に望ましいと理解することがで
きる。
【００３３】このようなウイルスは例えば、Ｍ（基質）
タンパク質をコードするＭ遺伝子の突然変異によって産
生され得る。Ｍタンパク質はウイルスの作成で重要な役
割を果たす一方、更に糖タンパク質Ｇの取り込みやコン
ホーメーションに影響を及ぼす。
【００３４】トランスでＭタンパク質を産生する操作済
細胞で、機能的Ｍタンパク質の欠失したＭ（−）突然変
異体を増殖させると、天然宿主に対する伝染性に関して
野生型ウイルスのように挙動する健全なウイルス粒子が
産生される。しかしながらこれらの粒子はＭタンパク質
合成のための遺伝子情報が欠失しているために、宿主細
胞に感染すると、新しい伝染性ウイルスを産生すること
ができない。
【００３５】従って、前記ウイルス粒子は宿主に包含さ
れたままである。このようなウイルスの利点を以下で説
明する。
【００３６】従って、好ましい実施態様では、本発明
は、基質タンパク質Ｍをコードする読み取り枠の挿入及
び／又は欠失によって、非機能的基質タンパク質Ｍを産
生するか又は基質タンパク質Ｍを存在させないことに関
する。基質タンパク質Ｍが非機能的であるか又は不在で
あるＭ(-)突然変異体ウイルスを、基質タンパク質Ｍ類
似体をトランスで提供する細胞で増殖させて、ウイルス
の表現型を相補的なものにしなければならない。
【００３７】あるいは、例えばＧ遺伝子の突然変異によ
ってこのようなウイルスを産生することができる。Ｇタ
ンパク質は前述したように、感染や、細胞付着及び膜融
合のプロセスで早期に重要な役割を果たす。
【００３８】糖タンパク質Ｇがひどく損なわれているか
（又は不在である）ために、得られたＧ突然変異体ウイ
ルスがもはや他の細胞に感染し得ない程度まで挿入及び
／もしくは欠失により（又は全Ｇ遺伝子の欠失により）
Ｇ遺伝子を突然変異させることが可能である。このよう
な突然変異体はＧ−マイナス（Ｇ-−）突然変異体とも
称される。
【００３９】従って、Ｇ遺伝子のこの種の突然変異は単
に毒性を低下させる前述の突然変異よりも困難である。
実際のＧ-突然変異体は機能的糖タンパク質Ｇが欠失し
ているので、非感染性である。
【００４０】このようなＧ-突然変異体ウイルスをＧタ
ンパク質に対して相補性の組換え宿主細胞で増殖させる
と、表現型はＧ陽性であるが、遺伝子型がＧ陰性の後代
ウイルスが分泌される。
【００４１】これらのウイルスは、Ｇ陽性ウイルスに比
べて重要な利点を有する。一方では、これらのウイルス
は、膜内にＧタンパク質を有するために非相補性宿主細
胞に感染し得る。感染した細胞では、Ｇ突然変異体ウイ
ルスは野生型ウイルスとして複製する。これは、組換え
ウイルス内にクローニングされる異種遺伝子を含む全ウ
イルスゲノムが増殖し、コードされたゲノム産物が野生
型ウイルスと同様に発現、処理されるという利点を有す
る。
【００４２】しかしながら他方では、正常宿主細胞はＧ
タンパク質を合成せず、突然変異体ウイルス自体の遺伝
型がＧ陰性であるために、伝染性後代ウイルスを宿主で
産生することはできない。
【００４３】従って、Ｇ突然変異体ウイルスに感染した
動物は環境で伝染性ウイルスを拡散しない。これにより
Ｇ突然変異体（及び前述のＭ(-)突然変異体）はワクチ
ン基材として非常に安全なものとなる。
【００４４】あるいは、本発明のＧ-突然変異体は、細
胞付着である役割を果たすことが知られている他の非狂
犬病糖タンパク質と表現型が相補的になり得る。
【００４５】ウイルス膜から環境内に突出する糖タンパ
ク質が細胞特異性を決定することが知られているので、
全く相補性の（ｒｉｇｈｔ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｉｎ
ｇ）糖タンパク質を選択することにより、組換え伝染性
狂犬病ウイルス突然変異体の標的を、狂犬病の天然宿主
細胞以外の特異細胞とすることが可能である。
【００４６】これらの糖タンパク質は、糖タンパク質Ｇ
のように細胞特異的付着に関与することを示すために
“糖タンパク質Ｇ類似体”とも称される。
【００４７】ウイルスによっては、細胞特異性を決定す
る“糖タンパク質Ｇ類似体”が糖タンパク質ではなく、
非グリコシル化タンパク質であることに留意すべきであ
る。これらのタンパク質も本発明の範囲内であることは
明白である。
【００４８】従って、本発明の他の好ましい実施態様で
は、糖タンパク質Ｇをコードする読み取り枠内の挿入及
び／又は欠失は、糖タンパク質Ｇを非機能的とするか又
は不在とするようなものである。糖タンパク質Ｇが非機
能的であるか又は不在であるＧ(-)突然変異体ウイルス
を、糖タンパク質Ｇ類似体をトランスで提供する細胞で
増殖させて、ウイルスの表現型を相補的にしなければな
らない。
【００４９】本発明の更に好ましい実施態様では、相補
性のために使用する糖タンパク質類似体は狂犬病ウイル
ス糖タンパク質Ｇ自体である。
【００５０】糖タンパク質Ｇ類似体を含む組換え伝染性
狂犬病ウイルスは、いくつかの重要な利点を有する： ａ）前記ウイルスは、選択する糖タンパク質Ｇ類似体の
標的に依存して、ある細胞、器官又は宿主を特異的に標
的とし得る。
【００５１】これは、例えば呼吸管又は消化管を特異的
に標的とすることができることを意味している。従っ
て、例えば所定の部位で粘膜応答が得られ得る。あるい
は、免疫系の特異細胞を標的とすることができる。
【００５２】ｂ）前記ウイルスは更に、前述したように
非狂犬病病原体に由来するエピトープをコードする外来
遺伝子情報のキャリアーであり得る。
【００５３】あるいは、前記ウイルスは、毒性物質をコ
ードする外来遺伝子情報のキャリアーであり得る。
【００５４】本発明のウイルスの非常に重要な適用は、
ａ）の糖タンパク質Ｇ類似体及びｂ）の外来遺伝子情報
の両方を有するウイルスを用いて行われる。
【００５５】特異的な細胞型を標的とし、通常非狂犬病
ウイルスの攻撃を受けると同時に、非狂犬病ウイルスの
免疫防御性決定因子を保有する組換え伝染性狂犬病ウイ
ルスを本発明の方法で産生することができる。
【００５６】このようなウイルスは、糖タンパク質Ｇ類
似体の遺伝子情報が欠失しているために、非狂犬病ウイ
ルスに対する宿主で免疫を誘発すると同時に全く安全で
ある。
【００５７】本発明の他の重要な実施態様は、例えばＣ
Ｄ４細胞を標的とし、ＨＩＶ ｇｐ１２０による遺伝子
型相補化によりＨＩＶの標的細胞を示し、任意に細胞毒
性タンパク質をコードする本発明のウイルスである。
【００５８】このようなウイルスは、ＣＤ４細胞を選択
的に攻撃し、一旦これらの細胞内に入ると、細胞を死滅
させる。
【００５９】あるいは、本発明の組換え伝染性狂犬病ウ
イルスは、現時点では安全な生ワクチンが存在していな
い毒性／病原性ウイルスに対する非常に安全なワクチン
を提供し得る。例えばウシ呼吸器合胞体ウイルス（ＢＲ
ＳＶ）糖タンパク質Ｇ類似体で相補化してＢＲＳＶの天
然標的細胞を標的として、ＢＲＳＶの免疫防御性エピト
ープを発現する組換え伝染性狂犬病ウイルスは、このよ
うな疾病の非常に安全なワクチンとなる。
【００６０】パラインフルエンザウイルスワクチンは今
日まで、ＢＲＳＶワクチンと同じ問題に直面している。
従って、パラインフルエンザ糖タンパク質Ｇ類似体及び
パラインフルエンザの別の免疫原性エピトープを含む組
換え伝染性狂犬病ウイルスは、この疾病の良好で安全な
ワクチンとなる。
【００６１】組換え伝染性狂犬病ウイルスを基材とする
他の重要な動物ワクチンは、 ｉ）トロウイルス；ウマ、ウシ及びブタトロウイルス、 ｉｉ）コロナウイルス；ウシ、イヌ、ブタ及びネココロ
ナウイルス、特にそのスパイクタンパク質 の免疫原性決定因子を組換え狂犬病ウイルス内に導入す
ることにより産生される。
【００６２】従って、本発明の最も好ましい実施態様
は、糖タンパク質Ｇ類似体を補体結合し、病原性ウイル
ス又は微生物のエピトープ又はポリペプチドをコードす
る異種核酸配列を保有する組換え伝染性狂犬病ウイルス
糖タンパク質Ｇ(-)突然変異体に関する。
【００６３】あるいは、酵素活性が低下するようにＲＶ
レプリカーゼ又はトランスクリプターゼの酵素活性を変
化させてＲＶを弱毒化して、宿主動物の感染で伝染性の
低いビリオンを産生することができる。Ｎ、Ｐ及びＬタ
ンパク質はＲＶポリメラーゼ活性に関与するので、Ｎ、
Ｐ又はＬタンパク質をコードするＯＲＦ内に挿入又は欠
失を有するＲＶ突然変異体も本発明の一部分である。
【００６４】本発明のＲＶ欠失及び／又は挿入突然変異
体を使用して宿主にワクチン接種し、前記ＲＶ突然変異
体を含むワクチンを投与した宿主と、親ＲＶに感染した
宿主とを（血清学的に）区別することができる。本発明
のこの実施態様では、ＲＶ挿入突然変異体のインサート
は、接種した宿主の特異的な非ＲＶ免疫応答を誘発し得
る異種エピトープをコードしてもよいし、ＣＡＴ又はｌ
ａｃＺのような酵素活性を有するタンパク質をコードし
てもよい（Ｃｏｎｚｅｌｍａｎｎ及びＳｃｈｎｅｌｌ、
１９９４、上掲）。このようなインサートの取り込みの
ために好ましい領域は、ＲＶ偽遺伝子領域である。実施
例で示すように、ＲＶの主要機能（例えば感染又は複製
に必要な機能）を損なわずに、この領域で挿入及び欠失
を実施することができる。ＲＶ欠失突然変異体は、その
免疫応答が通常ワクチン接種により生じるＲＶタンパク
質のエピトープが欠失していてもよい。特に、Ｇタンパ
ク質をコードするＯＲＦに欠失を含むＲＶ突然変異体が
この目的に適している。ＲＶ挿入突然変異体の場合、挿
入は、血清学的マーカー抗原又はそのエピトープをコー
ドする核酸配列を含んでいる。
【００６５】本発明の別の実施態様では、特異的な病原
体の１個以上の異なる異種エピトープ又はポリペプチド
を発現し得るＲＶ突然変異体を提供する。このような突
然変異体を使用して、動物（家畜動物及び非家畜動物を
含む）に野生動物狂犬病や前記病原体に対するワクチン
を接種することができる。
【００６６】このような生ベクターワクチンを接種し
て、ＲＶポリペプチドと共に異種エピトープ又はポリペ
プチドをｉｎ ｖｉｖｏ発現する接種宿主内でＲＶ突然
変異体を複製することが好ましい。次いで、接種した宿
主内で発現されたポリペプチドは、ＲＶ及び特定病原体
の両方に対する免疫応答を誘発する。特定病原体に由来
する異種ポリペプチドが防御的免疫応答を刺激し得るな
らば、本発明のＲＶ突然変異体を接種した動物は、その
後の病原体感染や、ＲＶ感染に対して免疫がある。従っ
て、ＲＶゲノムの適切な領域内に取り込まれた異種核酸
配列を連続的にｉｎ ｖｉｖｏ発現することにより、病
原体に対して確実、安全で寿命の長い免疫性を提供す
る。
【００６７】特に、本発明は、特異的な病原体のエピト
ープ又はポリペプチドをコードする核酸配列の挿入を含
み、該挿入が偽遺伝子領域で実施されることを特徴とす
るＲＶベクターを提供する。
【００６８】所望とあれば、偽遺伝子領域の一部又は全
体を前述のＲＶベクターで欠失させることができる。
【００６９】ＲＶゲノムの適切な領域内への取り込みに
ついては、イヌパルボウイルス、イヌコロナウイルス及
び従来のブタ熱ウイルス（ＣＳＦＶ）のエピトープ又は
ポリペプチドをコードする核酸配列を考察することが好
ましい。
【００７０】伝染性複製ウイルスを産生させることがで
きなかったため、ＲＶの非セグメント化陰性鎖ＲＮＡゲ
ノムの組換えＤＮＡ技術によるＤＮＡレベルでの操作は
今日まで不可能であった。しかしながら、本明細書で
は、突然変異を組換えＤＮＡ技術によりＤＮＡレベルで
ウイルスゲノムのコード化領域又は非コード化領域内に
作成し、次いでゲノム内に突然変異を保有する伝染性複
製ＲＶを産生する方法を提供する。
【００７１】本発明の方法は、 ａ）ＲＮＡポリメラーゼを発現する細胞内に、 １）ＲＶのＮ、Ｐ及びＬタンパク質をコードする１個以
上のＤＮＡ分子と、 ２）ＲＶのｃＤＮＡゲノムを含むＤＮＡ分子とを導入
し、 ｂ）前記細胞によって産生されるウイルスを単離する 段階からなる。
【００７２】通常、狂犬病ウイルスゲノムのｃＤＮＡ
は、ゲノム内に突然変異を取り込むことにより改変され
る。
【００７３】しかしながら、この方法を使用して、例え
ば汚染したＲＮＡプールを精製してもよい。この場合、
元の突然変異していないｃＤＮＡを使用する。
【００７４】タンパク質をコードするプラスミドを備え
た異種インサートを含むＲＶのモデルミニゲノムのレス
キュー効率は極めて低く、更にはインサート長さと相関
関係にあるという事実を考慮すれば（Ｃｏｎｚｅｌｍａ
ｎｎ及びＳｃｈｎｅｌｌ、１９９４、上掲）、トランス
フェクトした全長ゲノムＲＮＡに由来する増殖性感染
が、ＲＶのＮ、Ｐ及びＬタンパク質をコードするプラス
ミドと同時にトランスフェクトすることにより開始され
得るとは予想できない。これは、同時に発現された陰性
鎖ゲノムＲＮＡ転写体とハイブリダイズすると予想され
る、トランスフェクトしたタンパク質をコードするプラ
スミドにより、多量の陽性センスのＮ、Ｐ及びＬ特異的
ＲＮＡが産生されるだけに一層そうである。しかしなが
ら、ゲノムの半分以上に作用し得る可能なハイブリダイ
ゼーションは、重要なエンカプシデーション段階に介在
すると思われた。更には、Ｎ、Ｐ及びＬ ｍＲＮＡの翻
訳は影響を受け得る。実際、標準的なトランスフェクシ
ョンプロトコルでは伝染性ウイルスは産生できないこと
が知見された。しかしながら、実施例に記載するよう
に、代替トランスフェクションプロトコルと、陽性鎖抗
ゲノムＲＮＡ転写体を生成するＲＶ ｃＤＮＡゲノムの
使用とを組み合わせれば、遺伝学的に作成された複製Ｒ
Ｖが得られた。
【００７５】前述の方法では、組換えＤＮＡ技術により
親ＲＶのゲノム内に突然変異をｉｎｖｉｔｒｏ取り込
み、次いで前記突然変異を有する伝染性複製ＲＶ突然変
異体を産生することができる。突然変異は限定はされな
いが、ＲＶ親ゲノムのＲＶタンパク質をコードするＯＲ
Ｆ、非コード化領域（例えば偽遺伝子領域）又は転写シ
グナル配列内への核酸残基の挿入、欠失又は置換を包含
する。
【００７６】非コード化遺伝子間領域内での突然変異の
作成は特異的なウイルス遺伝子の転写に影響し、ｍＲＮ
Ａの転写及びその後のタンパク質（Ｍ及びＧタンパク質
のようなエンベロープタンパク質又はＮ、Ｐ及びＬタン
パク質のようなポリメラーゼ活性に関与するタンパク
質）の翻訳が低減して、突然変異体の（伝染性）後代ウ
イルスの産生能力が低下するために弱毒性を特徴とする
ウイルス突然変異体が得られる。特に、この遺伝子間領
域及び／又は転写シグナル配列での１個以上の核酸残基
の置換は、転写効率に影響し得る。
【００７７】更には、毒性に関与する毒性ＲＶのゲノム
の領域（例えばＧタンパク質をコードするＯＲＦ）で、
前述の方法を適用して行う１個以上の核酸残基の置換は
本発明の一部である。
【００７８】このような突然変異により、毒性ＲＶ株の
Ｇタンパク質で１個のアミノ酸が交換されて病原性が
（一部分）損なわれる。例えばＡｒｇ（３３３）がＩｌ
ｅ、ＧｌｕもしくはＧｌｎで、又はＬｅｕ（１３２）が
ＰｈｅもしくはＴｒｐで置換され得る。
【００７９】本発明の方法では、ＲＶ遺伝子情報を含む
ＤＮＡ分子は好ましくは、トランスフェクトした宿主細
胞によって同時発現されるポリメラーゼにより認識可能
な適切な転写イニシエーター及びターミネーター配列を
備えたプラスミドを含んでいる。
【００８０】本発明の好ましい方法は、ＲＶ ＤＮＡで
トランスフェクトした宿主細胞を使用することからな
り、前記細胞は、ワクシニアウイルス組換え体から例え
ば細胞質で発現されるバクテリオファージＴ７ ＤＮＡ
依存性ＲＮＡポリメラーゼを発現し得る。この場合、Ｒ
Ｖ ＤＮＡを含むプラスミドは、Ｔ７プロモーター及び
ターミネーター配列を備えている（Ｃｏｎｚｅｌｍａｎ
ｎ及びＳｃｈｎｅｌｌ、１９９４、上掲）。
【００８１】生ワクチンを製造するため、例えばＢＨＫ
又はヒト二倍体細胞に由来する細胞培養で本発明の組換
えＲＶ突然変異体を増殖させることができる。組織細胞
培養液及び／又は細胞を収集することにより、このよう
にして増殖させたウイルスを収集することができる。生
ワクチンは懸濁液の形態で調製してもよいし、凍結乾燥
してもよい。
【００８２】ワクチンは、免疫学的に有効な量の組換え
ＲＶの他に、医薬的に許容可能なキャリアー又は希釈剤
を含み得る。
【００８３】本発明で有用な医薬的に許容可能なキャリ
アー又は希釈剤の例には、ＳＰＧＡのような安定剤、炭
水化物（例えばソルビトール、マンニトール、デンプ
ン、スクロース、グルコース、デキストラン）、ウシ血
清又はスキムミルクのようなタンパク質、及び緩衝液
（例えばリン酸緩衝液）が含まれる。
【００８４】場合によっては、アジュバント活性を有す
る１種以上の化合物をワクチンに添加してもよい。適切
なアジュバントは例えば、水酸化アルミニウム、リン酸
アルミニウム、酸化アルミニウム、（例えばＢａｙｏｌ
Ｆ(R)もしくはＭａｒｃｏｌ ５２(R)の）油状エマル
ジョン、サポニン又はビタミンＥ溶解物である。
【００８５】有用な投与量は、ワクチン接種すべき哺乳
動物の種類、年齢、体重及び投与方法によって異なる。
【００８６】投与量は広範囲で変動し得る。例えば１０
2〜１０7ｐｆｕ／動物が適量である。
【００８７】特定の投与量は例えば約１０6ｐｆｕ／動
物であり得る。
【００８８】本発明のＲＶ突然変異体を使用して、不活
化ワクチンを製造することもできる。
【００８９】動物への投与では、本発明のＲＶ突然変異
体をとりわけ経口投与、経鼻投与、皮内投与、皮下投与
又は筋肉内投与することができる。
【００９０】本発明のＲＶワクチンをイヌだけでなく、
主要ベクター、即ちアライグマ、スカンク及びキツネに
投与することができる。更には、従来のブタ熱ウイルス
のようなブタ病原体の異種遺伝子を発現し得る生ＲＶベ
クターのイノシシへのワクチン接種も考えられる。
【００９１】
【実施例】実施例１ 伝染性複製ＲＶビリオンの 調製 全長ＲＶ ｃＤＮＡの構築（図２）。
【００９２】ＲＶ株ＳＡＤ Ｂ１９の全ゲノムに及ぶｃ
ＤＮＡのクローニングは以前に発表されている（Ｃｏｎ
ｚｅｌｍａｎｎ等、１９９０、上掲；ＧｅｎＢａｎｋ受
託番号Ｍ３１０４６）。本明細書で使用するＲＶヌクレ
オチドやアミノ酸の番号付けは、Ｃｏｎｚｅｌｍａｎｎ
等、１９９０（上掲）のものに対応する。ＳＡＤ Ｂ１
９全長ＤＮＡクローンの作成基材として、転写プラスミ
ドｐＳＤＩ−１に含まれるＲＶミニゲノム配列（Ｃｏｎ
ｚｅｌｍａｎｎ及びＳｃｈｎｅｌｌ、１９９４、上掲）
を使用した（図２）。ｐＳＤＩ−１は、Ｔ７ ＲＮＡポ
リメラーゼプロモーターと、肝炎デルタウイルス（ＨＤ
Ｖ）抗ゲノムリボザイム（ｒｉｂｏｚｙｍｅ）配列との
間に挿入されたＳＡＤ Ｂ１９ゲノム３’末端及び５’
末端（それぞれＳＡＤ Ｂ１９ヌクレオチドの１−６８
及び１１７６０−１１９２８）を含む。陽性鎖ＳＤＩ−
１転写体（ｐＳＤＩ−１プラス）を産生するプラスミド
を生成するために、１１塩基プライマー（５’−ＡＣＧ
ＣＴＴＡＡＣＡＡ−３’）を用いて、ｐＳＤＩ−１に含
まれるＲＶ配列をまずＰＣＲで増幅した。このプライマ
ーは、ＲＶゲノム末端の相補性のために、陽性センス及
び陰性センスの両方のウイルスＲＮＡの５’末端に対応
する。Ｔ７プロモーター配列、次いで３個のＧ残基（下
線）（５’−ＡＡＴＴＣＣＴＧＣＡＧＴＡＡＴＡＣＧＡ
ＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ−３’）を含む合成ＥｃｏＲ
Ｉ／ブラントアダプター（Ｔ７／３）をその後増幅ＲＶ
配列に部分結合した後、結合産物をｐＸ８ｄＴのＥｃｏ
ＲＩ／ＳｍａＩ部位にクローニングした。このプラスミ
ドは、元のＴ７プロモーターを含む多重クローニング部
位のＢｓｓＨＩＩ／ＣｌａＩ断片が欠失しているｐＢｌ
ｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）の誘導
体である。このプラスミドは、ＳｍａＩ部位に８４塩基
ＨＤＶ抗ゲノムリボザイム配列を含み、直後にはＢａｍ
ＨＩ部位にクローニングされたＴ７転写ターミネーター
配列を含んでいる。プラスセンスＲＶ配列の上流にＴ７
プロモーターを含む構築物を、制限分析及び配列決定に
より同定した。次いで、ｐＳＤＩ−１のＭｕｎＩ−Ｂｇ
ｌＩＩ断片（ＳＡＤ Ｂ１９ヌクレオチド４０−６８）
を、種々のＳＡＤ Ｂ１９ ｃＤＮＡクローンの３個の
断片（ＭｕｎＩ−ＳｐｈＩ（ｐＺＡＤ１−９に由来のＳ
ＡＤＢ１９ヌクレオチド４０−４８２）；ＳｐｈＩ−Ａ
ａｔＩＩ（ｐＳＡＤ１３に由来の４０４１−４２７３）
及びＡａｔＩＩ−ＢｇｌＩＩ（ｐＳＡＤ８５に由来の１
１４７２−１１７５９））に由来する、ｐＢｌｕｅｓｃ
ｒｉｐｔＩＩに作成された１ｋｂ ＭｕｎＩ／ＢｇｌＩ
Ｉ ｃＤＮＡで置換して、ｐＳＤＩ−１１７０を得た。
ＮｃｏＩ（ＳＡＤ Ｂ１９ヌクレオチド４８２−４０４
１）によりクローンｐＳＡＤ２５及びｐＳＡＤ１３から
作成したＳｐｈＩ断片、及びＸｈｏＩ（ＳＡＤ Ｂ１９
ヌクレオチド４２７３−１１４７２）によりクローンｐ
ＳＡＤ４９及びｐＳＡＤ８５から作成したＡａｔＩＩ断
片をｐＳＤＩ−１１７０の単一のＳｐｈＩ及びＡａｔＩ
Ｉ部位に挿入して、最終全長クローンｐＳＡＤ Ｌ１６
を完成した。環状プラスミドを使用して、ｉｎ ｖｉｔ
ｒｏ転写を実施し、産物を変性アガロースゲルで分析し
た。１２ｋｂ ＲＶゲノムＲＮＡと共に移動するＲＮＡ
転写体の存在は、全長抗ゲノムＲＮＡがＴ７ポリメラー
ゼによって転写されることを示していた。
【００９３】伝染性組換えＲＶの回 収 ＲＶのタンパク質Ｎ、Ｐ、Ｌをコードするプラスミド
と、プラスミドｐＳＡＤＬ１６とのコトランスフェクシ
ョンをＣｏｎｚｅｌｍａｎｎ及びＳｃｈｎｅｌｌ，１９
９４（上掲）に記載された方法で実施した。
【００９４】以前に発表された方法でトランスフェクシ
ョン実験を実施した。クローンＢＳＲ細胞のＢＨＫ−２
１を、１０％ウシ血清を補充したイーグル培地を含む
３．２ｃｍ直径の皿に入れて一晩増殖させ８０％の集密
度にして、組換えワクシニアウイルスｖＴＦ７−３を
ｍ．ｏ．ｉ．５で感染させた（Ｆｏｕｒｓ等、Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８３，８１
２２−８１２６、１９８６）。１時間放置したｐｏｎｔ
ｉｆｉｃａｔｉｎｇ細胞を、ウシ血清を含まない培地で
２度洗浄し、哺乳動物トランスフェクションキット（Ｓ
ｔｒａｔａｇｅｎｅ；ＣａＰＯ4プロトコル）を供給業
者の指示に従って用いて、５μｇのｐＴ７Ｔ−Ｎ、２．
５μｇのｐＴ７Ｔ−Ｐ及び２．５μｇのｐＴ７Ｔ−Ｌを
含むプラスミド混合物、並びに２μｇのｐＳＡＤ−Ｌ１
６プラスミドでトランスフェクトした。トランスフェク
トしてから４時間後に沈殿物を除去し、細胞を洗浄し、
１０％ウシ血清を含むイーグル培地でインンキュベート
した。ｐＳＡＤ−Ｌ１６に由来するＴ７ ＲＮＡポリメ
ラーゼ転写体のキャプシド内被包、及びヌクレオキャプ
シドに由来するＲＶタンパク質の発現を間接蛍光法で検
査した。組換えＲＶゲノムからのみ発現し得るＲＶ Ｇ
タンパク質に対するモノクローナル抗体を使用して培養
物をスクリーニングした。トランスフェクトしてから１
日後、染色細胞が存在していた。このことは、ＲＶゲノ
ム由来の遺伝子の発現を実証している。しかしながら、
一連の２０のトランスフェクション実験では、１個の陽
性細胞群のみが観察された。これらの実験では、伝染性
ウイルスの存在を示す蛍光細胞フォーカスは得られなか
った。更には、２日後に、トランスフェクトした細胞に
由来する全上清を接種した細胞培養物からは、伝染性ウ
イルスを回収することができなかった。従って、トラン
スフェクトした細胞で産生した推定上の非常に少量の伝
染性ウイルスを単離するために、実験手順を変更した。
トランスフェクタントウイルスを単離するために、細胞
及び上清をトランスフェクトしてから２日後に採取し
た。細胞をゴムポリスマンで掻き取って、上清に懸濁さ
せた。この懸濁液を３サイクル凍結融解処理した（−７
０℃／３７℃、それぞれ５分）。細胞破片や、このよう
な条件下で凝集物を生成する過剰ワクシニアウイルスを
ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ内にて１０，０００ｇで１０分間遠
心分離にかけてペレット化した。全上清を使用して、培
養皿に集密性単層の細胞を接種した。２時間インキュベ
ートした後に、上清を２ｍｌの新しい培地に代えた。ワ
クシニアウイルスによって生じる細胞変性効果（ｃｐ
ｅ）が感染から１〜２日後に観察された。１０，０００
ｇで遠心分離した後に、平均で僅か１０個のプラークが
観察された。感染から２日後に、全単層の抗Ｎ結合体
（Ｃｅｎｔｏｃｏｒｅ）による直接免疫蛍光染色によ
り、ｃｐｅが検出不能であるＲＶ細胞感染を実証した。
２０のうち２つの実験で、蛍光フォーカスが観察され、
各上清は、ｃＤＮＡ転写体から生成されるトランスフェ
クタントウイルスを示すと思われる伝染性ＲＶ（ＳＡＤ
Ｌ１６）を含んでいた。
【００９５】フォーカスが観察される培養物に由来する
上清の半分を１０，０００ｇで遠心分離にかけた後に第
２の継代で使用した。更なる継代（それぞれ２日）のた
めに、ＲＶ感染の程度によってより少ない上清の分注液
を使用した。ワクシニアウイルスを完全に除去するため
に、全ての細胞の感染に関与する培養物（第三継代）に
由来する上清をｍｉｃｒｏｆｕｇｅにて２度、１４，０
００ｇで１０分間ずつ遠心分離した。次いで、滅菌ＭＩ
ＬＬＥＸ−ＶＶ ０．１μｍフィルターユニット（Ｍｉ
ｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，
ＭＡ０１７３０）を用いて最終上清を濾過し、次いでこ
れを使用して組換えＲＶの高力価ストックを生成した。
【００９６】以下の実施例では後半のトランスフェクシ
ョン及び単離プロトコルを使用した。
【００９７】実施例２ ＲＶ偽遺伝子領域へのオリ ゴヌクレオチドの挿入 ＳＡＤ Ｂ１９ヌクレオチド３８２３−６６６８を示す
ｐＳＡＤ Ｌ１６の２．８ｋｂ ＸｈｏＩ−ＳｃａＩ断
片を含むサブクローンｐＰｓｉＸ８でΨの操作を実施し
た。次いで、改変ｐＰｓｉＸ８プラスミドのＳｔｕＩ断
片を単離し、これを使用して全長クローンｐＳＡＤ Ｌ
１６（図１）の対応断片（ＳＡＤ Ｂ１９位置４０１４
−６３６４）を置換した。ｐＰｓｉＸ８をＨｉｎｄ Ｉ
ＩＩで消化し、エキステンションをクレノー酵素でフィ
ルインし、再結合することにより、４個のヌクレオチド
をΨに挿入して、新たなＮｈｅＩ部位を生成した。ヌク
レオチド５３３８−５３４１を重複させて、最後の全長
クローンｐＳＡＤ Ｕ２をＳＡＤ Ｌ１６と区別する。
【００９８】トランスフェクトした細胞に由来する抽出
物を上清と一緒に新しい細胞に移動させた後に、伝染性
ウイルスの生成が実証された。各一連の実験では、一実
験でフォーカス形成が観察された。更に２回上清を新し
い細胞に移して、トランスフェクタントウイルス（クロ
ーンＳＡＤ Ｕ２−１３及びＳＡＤ Ｕ２−３２）を継
代すると、細胞がほぼ１００％感染した。ＳＡＤ Ｕ２
ウイルスゲノム内への挿入を実証するために、全ＲＮＡ
をＳＡＤ Ｕ２−１３に感染した細胞から単離し、Ψの
逆トランスクリプターゼ−ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を実
施した。それぞれＧ遺伝子及びＬ遺伝子に特異的なプラ
イマーＧ３Ｐ及びＬ４Ｍ（図１）を使用して、トランス
フェクタントウイルスＳＡＤ Ｕ２、ＳＡＤ Ｌ１６、
及び標準ＲＶ ＳＡＤ Ｂ１９のゲノムから約７３０ｂ
ｐのＤＮＡ断片を得た。しかしながら、ＳＡＤ Ｕ２か
ら得られるＰＣＲ ＤＮＡではなく、ＳＡＤ Ｂ１９及
びＳＡＤ Ｌ１６から得られるＰＣＲ ＤＮＡでのみ、
その後のＨｉｎｄＩＩＩでの消化が観察された。逆に、
ＳＡＤ Ｕ２由来のＤＮＡだけがＮｈｅＩで消化され
て、それぞれ約５３０ｂｐ及び２００ｂｐの２個の断片
が得られた（図３）。トランスフェクタントウイルスＳ
ＡＤ Ｕ２のゲノムＲＮＡの直接ＲＴ配列決定により更
に、予測される部位に予想される４個の残基の挿入の存
在が確定され、決定した配列の残部は元のＳＡＤ Ｂ１
９ゲノムのものに対応していた。従って、ＳＡＤ Ｕ２
ウイルスが、作成されたｃＤＮＡに由来するゲノムを含
むトランスフェクタントウイルスを示すことは明白であ
った。
【００９９】ＲＶΨの末端付近に４個のヌクレオチドを
導入しても、トランスフェクタントウイルスＳＡＤ Ｕ
２の生存に影響せず、この導入はＧ ｍＲＮＡの正しい
転写終結も阻害しなかった。
【０１００】実施例３ Ｇコード化領域とＬコード 化領域との間の挿入又は欠 失
によるＲＶ転写の改変 ＳｔｙＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで二重に消化し、クレノー
フィルインし、再結合して、３９６塩基（ＳＡＤ Ｂ１
９ヌクレオチド４９４２−５３３７）を欠失させた。最
終構築物はｐＳＡＤ Ｗ９であった。ｐＳＡＤ Ｖ＊の
構築のために、ＳＡＤ Ｂ１９ Ｎ／Ｐシストロンボー
ダー領域を含む１８０ｂｐ ＢｇＩＩＩ−ＡｓｕＩＩ断
片をｐＳＡＤ１３から単離した（Ｃｏｎｚｅｌｍａｎｎ
等、１９９０、上掲）。その断片は、Ｎコード化領域の
９７ヌクレオチドと、全３’非コード化領域と、Ｎ転写
終結／ポリアデニル化シグナル、遺伝子間領域、及び転
写開始シグナルを含むＰシストロンの最初の１６ヌクレ
オチドからなるＮ／Ｐシストロンボーダーとを含んでい
た。まずｃＤＮＡ断片を、３’陥凹末端をクレノー酵素
でフィルインした後のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのＥｃｏ
ＲＩ部位にサブクローニングした（ｐＮｉｇＰ−１８
０）。ｐＮｉｇＰからＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩで切り
出し、ブラント末端を産生した後、それぞれ１６ｐｂ及
び３４ｂｐのベクター由来配列に隣接するＲＶインサー
トを含む２３０ｂｐ断片産物をｐＰｓｉＸ８のフィルイ
ンしたＳｔｙＩ部位にクローニングした。かくして、最
終全長構築物（ｐＳＡＤ Ｖ*）は、ｐＳＡＤ Ｌ１６
に匹敵する２３４ｂｐの挿入を有していた。
【０１０１】前述のように、ｐＳＡＤ Ｖ*及びｐＳＡ
Ｄ Ｗ９を使用して、２０個の培養皿をそれぞれトラン
スフェクトした。ＳＡＤ Ｖ*でトランスフェクトした
３個の培養物及びＳＡＤ Ｗ９でトランスフェクトした
１個の培養物で、生存可能なウイルスをその後単離する
ことによりレスキューが示された。５回続けて継代した
後に、感染細胞由来のＲＮＡ及び上清を単離し、前述の
実験と同一のプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲにより分
析した。標準ＳＡＤ Ｂ１９ウイルスと比較して、ＳＡ
Ｄ Ｖ*に感染した細胞のＲＮＡから約０．９ｋｂの拡
大ＤＮＡ断片が得られ、このことは、このトランスフェ
クタントウイルスのΨ領域に付加された配列が存在する
ことを示した（図４）。対照的に、ＳＡＤ Ｗ９に感染
した細胞のＲＮＡからは、僅かに０．３ｋｂのＤＮＡ断
片が得られた。この寸法は、ｃＤＮＡゲノムコピーで行
われた欠失によるものと推測された。ＰＣＲ産物の配列
決定により更に、最初に作成したｃＤＮＡ配列がＳＡＤ
Ｖ*及びＳＡＤ Ｗ９トランスフェクタントウイルス
のゲノム内にレスキューされることが確定した。従っ
て、Ｇ読み取り枠とΨとの間に付加された配列（例えば
５０個のベクター由来ヌクレオチド）が存在しても、全
Ψを欠失しても、トランスフェクタント狂犬病ウイルス
の感染性や増殖は妨げられなかった。ＳＡＤ Ｖ*及び
ＳＡＤ Ｗ９のゲノム内に作成される改変は、転写パタ
ーンに表現型の変化をもたらすように設計され、これが
各トランスフェクタントウイルスの増殖性に影響するか
どうかを調査した。しかしながら、細胞培養での増殖及
び伝染性ＳＡＤ Ｖ*及びＳＡＤ Ｗ９ウイルスの最終
力価は、標準ＳＡＤ Ｂ１９ ＲＶの場合と同様であっ
た。ｍ．ｏ．ｉ．０．０１で細胞感染させてから３日後
に、ＳＡＤ Ｂ１９、ＳＡＤ Ｖ*及びＳＡＤ Ｗ９の
上清で１０8フォーカス形成単位（ｆｆｕ）の力価に達
した。このことは、ＲＶ Ψが細胞培養の増殖で重要で
ないことを示している。
【０１０２】Ψ特異的プローブを用いると、Ψ欠失ＳＡ
Ｄ Ｗ９ウイルスに感染した細胞に由来するＲＮＡでハ
イブリダイゼーションは検出されなかった。他のウイル
スのゲノムＲＮＡ及びＳＡＤ Ｂ１９及びＳＡＤ Ｌ１
６のＧ ｍＲＮＡはこのプローブで認識されたが、ＳＡ
Ｄ Ｖ*Ｇ ｍＲＮＡは反応しなかった。対照的に、Ｓ
ＡＤ Ｖ*Ψ配列に先行する余分のＰ遺伝子転写開始シ
グナルの存在によって予測される新たな余分のΨ−ｍＲ
ＮＡの寸法に相当する弱いＲＮＡバンドが出現した。天
然ＲＶとは対照的に、トランスフェクタントウイルスＳ
ＡＤ Ｖ*は、ゲノムが６個の機能的シストロンからな
るＲＶを示している。
【０１０３】実施例４ 組換えＲＶ由来の外来タン パク質コード化遺伝子の発 現 ブラント末端をクレノー酵素で生成した後に、実施例３
に記載した多重制限部位に隣接するＮ／Ｐシストロンボ
ーダーを含む２３０ｂｐ ｃＤＮＡ断片を、全長ｃＤＮ
Ａ ｐＳＡＤ Ｌ１６の偽遺伝子領域のＢｓｔＸＩ部位
（ＳＡＤ Ｂ１９位置４９９５）に導入した。得られた
ｃＤＮＡ ｐＳＡＤ Ｖを細菌クロラムフェニコール−
アセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子の導入基
材として使用した。ｐＳＡＤ ＸＣＡＴを得るため、全
ＣＡＴコード化領域を含むｐＣＭ７（Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ）の０．８ｋｂ ＤＮＡ断片を、偽遺伝子配列の上流
のＮ／Ｐシストロンボーダーに含まれるｐＳＡＤ Ｖの
ＡｓｕＩＩ部位にクローニングした。ｐＳＡＤ ＶＣＡ
Ｔの構築のために、偽遺伝子配列（ＳＡＤ Ｂ１９位置
５３３７）の末端付近に位置する、ＡｓｕＩＩ部位とＨ
ｉｎｄＩＩＩ部位との間のｃＤＮＡを欠失し、クレノー
酵素でブラント末端を形成した後に、ｐＣＭ７由来のＣ
ＡＴコード化ＨｉｎｄＩＩＩ−ＤＮＡで置換した。従っ
て、組換えＲＶ ＳＡＤ ＸＣＡＴの転写により、偽遺
伝子配列を非翻訳化３’領域として有するＣＡＴ ｍＲ
ＮＡが得られるはずであり、ＳＡＤ ＶＣＡＴは偽遺伝
子配列の欠失したＣＡＴ ｍＲＮＡを転写するはずであ
る。
【０１０４】実施例１に記載したようにＲＶのＮ、Ｐ及
びＬタンパク質、ｐＳＡＤ−ＸＣＡＴ、ｐＳＡＤ−ＶＣ
ＡＴをそれぞれコードするプラスミドをトランスフェク
トした後に、組換え狂犬病ウイルスはレスキューされ
た。ワクシニアウイルスを除去した後に、組換えＲＶの
転写パターンをノーザンハイブリダイゼーションで分析
した。両方のウイルスは、予想される寸法及び組成のＣ
ＡＴ ｍＲＮＡを転写した（図５）。ＣＡＴ酵素活性の
発現を、２種のウイルスに感染した細胞でそれぞれ標準
ＣＡＴアッセイ（Ｃｏｎｚｅｌｍａｎｎ及びＳｃｈｎｅ
ｌｌ、１９９４、上掲）により決定した。両者とも、Ｃ
ＡＴを効果的に発現することが知見された。細胞培養細
胞での連続継代により、導入した外来配列が遺伝学的に
安定であることが判明した。４０継代後でも、両方のウ
イルスはＣＡＴを効果的に発現した（図６）。感染動物
の組換えウイルスの発現や挙動を調べるために別の実験
を実施した。６週齢マウス（５匹ずつ）に１０4ｆｆｕ
のＳＡＤ ＶＣＡＴ、ＳＡＤＸＣＡＴ及び標準配列ＲＶ
ＳＡＤ Ｌ１６をそれぞれ大脳内注射した。感染から
７日後に、全ての動物は典型的な狂犬病の症状を示し、
次週までに狂犬病で死亡した。ＳＡＤ ＶＣＡＴ及びＳ
ＡＤ ＸＣＡＴにそれぞれ感染したマウスの脳でＣＡＴ
活性が示された。両方のウイルスをマウス脳から再度単
離することができ、これらはＣＡＴ細胞培養を発現し
た。従って、外来遺伝子は、伝染性ＲＶのゲノムに導入
して、安定的に発現させることができ、更には組換えウ
イルスを区別するためのマーカーとして機能し得る。
【０１０５】実施例５ 組換えＲＶ由来の異種ウイ ルス抗原の発現及びＲＶ及 び
異種ウイルスに対する免疫応答の誘導 従来のブタ熱ウイルス（ＣＳＦＶ）のゲノムは、３種の
構造糖タンパク質（Ｅ０、Ｅ１及びＥ２）をコードす
る。ＣＳＦＶ感染動物では、中和抗体はＥ２に対するも
のであり、Ｅ０は細胞免疫応答を誘発する。ＣＳＦＶ株
ＡｌｆｏｒｔのＥ２タンパク質及びＥ０タンパク質それ
ぞれのコード化領域を包含するｃＤＮＡを使用して、実
施例４に記載したようにｐＳＡＤ ＶのＡｓｕＩＩ部位
とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間の偽遺伝子を置換した。実
施例１で詳述したように、組換えウイルス（それぞれＳ
ＡＤ−ＶＥ０及びＳＡＤ−ＶＥ２）をトランスフェクシ
ョン実験から回収した。。感染細胞では、ウイルスはそ
れぞれＣＳＦＶ Ｅ０タンパク質及びＣＳＦＶ Ｅ２タ
ンパク質を発現した（図７）。
【０１０６】組換えウイルスＳＡＤ ＶＥ０及びＶＥ２
を使用して、経口経路によりブタを免疫した。通常、キ
ツネを弱毒化ＲＶ ＳＡＤ Ｂ１９株で経口免疫するた
めに使用されている標準的なキツネ餌に１０７ｐｆｕの
ＳＡＤ−ＶＥ０、ＳＡＤ−ＶＥ２及びＳＡＤ Ｂ１９を
それぞれ導入した。各調製物の餌をそれぞれ２匹のブタ
に２回与えた（ブタ＃１及び＃２：ＳＡＤ ＶＥ０、＃
３及び＃４：ＳＡＤＢ１９、＃５及び＃６：ＳＡＤ Ｖ
Ｅ２）。免疫から４週間後に、ＲＶ及びＣＳＦＶに対す
る中和抗体の存在を分析した。＃５の場合を除いて、全
てのブタは、ワクチン餌の吸収を確定するＲＶ中和抗体
（力価＞２５０）を有していた。従って、ブタ５は以後
考察しなかった。ブタ＃６は、１６より大きい力価でＣ
ＳＦＶ中和抗体を産生した。予想通り、ブタ＃１〜＃４
はＣＳＦＶ中和抗体を産生しなかった。免疫から５週間
後に、１０7ｐｆｕのＣＳＦＶ株Ａｌｆｏｒｔで経鼻攻
撃した。攻撃後にブタの白血球数と体温を監視し、これ
をそれぞれ図８及び図９に示す。全てのブタは発熱した
が、ブタ＃１、＃２、＃６はより早く回復した。対照動
物＃４は典型的なＣＳＦＶ症状を示し、攻撃から１５日
後に死亡し、対照＃３は２１日目に死亡した。ＳＡＤ
ＶＥ２を与えたブタにＣＳＦＶ中和抗体が存在し、ＳＡ
Ｄ ＶＥ０又はＳＡＤ ＶＥ２の投与を受けたブタが一
部感染予防を示すことは、２種の異種ウイルスに対する
体液免疫反応及び細胞免疫反応が共に、経口経路による
投与後に組換えＲＶ生ワクチンによって誘発され得るこ
とを実証している。
【０１０７】実施例６ Ｇ遺伝子配列内への突然変 異導入による弱毒化ＲＶの 生
成 標準ウイルスＳＡＤ Ｂ１９ほどは効率的に増殖しない
ウイルスを生成するために、突然変異Ｇタンパク質を有
する組換え体を調製した。
【０１０８】このために、Ｇタンパク質の最後の４６ア
ミノ酸をコードする配列を欠失させた。Ｇタンパク質コ
ード化プラスミド：ｐＴ７Ｔ−Ｇ（Ｃｏｎｚｅｌｍａｎ
ｎ及びＳｃｈｎｅｌｌ、１９９４、上掲）をＡｆｌＩＩ
Ｉ（ＳＡＤ Ｂ１９配列の位置４７５２）及びＥｃｏＲ
Ｖ（後半部位はプラスミドの多重クローニング部位に存
在する）で消化し、クレノー酵素によりブラント末端を
生成した。得られたＡｆｌＩＩＩ末端及びＥｃｏＲＶ末
端を結合すると、前者のＡｆｌＩＩＩ配列に翻訳終結コ
ドンが形成された。改変領域を含む０．３ｋｂ ＤＮＡ
ＰｐｕＭＩ−ＳＭａＩ断片を使用して、ｐＳＡＤ Ｌ
１６の本物のＰｐｕＭＩ−ＢｓｔＸＩ断片４４６９−４
９９５を置換した。この操作により、Ｇタンパク質細胞
質テールのカルボキシ末端４６ａａ及び偽遺伝子配列の
一部分をコードするＳＡＤ Ｂ１９ヌクレオチド４７５
３−４９９５が欠失した。別の結果は、新しいＧ翻訳終
結コドンのすぐ下流に１８個のベクター由来ヌクレオチ
ドが導入されることである。
【０１０９】実施例１に記載したように組換えＲＶ（Ｓ
ＡＤ ＤＣＤ）を回収した。予想通り、端を切り取った
Ｇタンパク質はＳＡＤ ＤＣＤに感染した細胞で発現さ
れた（図１０）。標準配列ウイルスＳＡＤ Ｌ１６と比
較して、ＳＡＤ ＤＣＤウイルスではｍ．ｏ．ｉ．１で
細胞に感染させた後に１００分の１の力価が得られた。
更には、細胞培養物で低い伝染速度が観察され（図１
１）、このことはＧタンパク質の先端を切ることで、ビ
リオンの作成が低下するか又はビリオンの細胞感染が低
下することを示している。感染動物でのＳＡＤ ＤＣＤ
の挙動を分析するために、５匹のマウスに１０5ｆｆｕ
のＳＡＤ ＤＣＤを脳内注射し、５匹のマウスに同量の
ＳＡＤ Ｌ１６を脳内注射した。
【０１１０】実施例７ トランス相補化による狂犬 病ウイルスＧ−マイナス（ Ｇ
- ）突然変異体の生成 ＲＶゲノム由来の全Ｇタンパク質コード化領域を欠失さ
せるために、全長クローンｐＳＡＤ ＵＥ（実施例２）
を使用した。このクローンは、Ｇ遺伝子の非翻訳化３’
領域（ＳＡＤ Ｂ１９位置５３３９）内に単一のＮｈｅ
Ｉ部位が存在することがｐＳＡＤ Ｌ１６と異なる。ｐ
ＳＡＤ Ｕ２をＰｆｌＭＩ（ＳＡＤ位置３１７６）で部
分的に消化し、ＮｈｅＩで完全消化し、その後クレノー
酵素でフィルインし、再結合することにより、ＳＡＤ
Ｂ１９ヌクレオチド３１７７−５３３９を含むｃＤＮＡ
断片を除去した。得られたクローンｐＳＡＤ ｄＧをト
ランスフェクション実験で使用して、組換えウイルスを
回収した。しかしながら、Ｎ、Ｐ及びＬタンパク質をコ
ードするプラスミドの他に、Ｇタンパク質をコードする
プラスミドをｐＳＡＤ ｄＧと一緒にトランスフェクト
して、ウイルスゲノムのＧ欠失を補った。得られたウイ
ルスＳＡＤ ｄＧを、Ｇコード化プラスミドで再度トラ
ンスフェクトした細胞に通し、ワクシニアウイルスｖＴ
Ｆ−７−３に感染させて、Ｇタンパク質を得た。
【０１１１】ノーザンブロッティング実験により、ＳＡ
Ｄ ｄＧのＲＮＡ転写体を分析した。Ｎ特異的プローブ
でハイブリダイズした後に、ＳＡＤ ｄＧゲノムが狂犬
病ウイルスｗｔゲノムよりも遥かに小さいことが知見さ
れた。このことは、２．１ｋｂのｃＤＮＡの欠失を反映
している。しかしながら、全Ｇコード化領域に及ぶプロ
ーブでは、ＳＡＤ ｄＧ ＲＮＡとハイブリダイズでき
ず、このことはＧコード化配列の欠失を示している（図
１２）。欠失の同定は更にＲＴ−ＰＣＲ及び配列決定に
より確定された。
【０１１２】表現型が相補化したＳＡＤ ｄＧは、非相
補性ＢＳＲ細胞に感染し、そのゲノムを複製して、ゲノ
ムによってコードされる遺伝子を発現することができ
た。しかしながら、伝染性ビリオンを生成することはで
きず、従って、感染を他の細胞に拡散させることも（図
１３）、培養上清の他の細胞培養への継代により移行さ
せることもできなかった。
【０１１３】実施例８ 異種糖タンパク質によるＧ 突然変異体の相補化：ウイ ル
スの特異細胞への指向 異種表面タンパク質が組換えウイルスのエンベロープに
機能的に取り込まれ得ることを実証するために、Ｇ突然
変異体ＳＡＤ ｄＧを狂犬病ウイルスＧについて実施例
７に記載したように組換えウイルス糖タンパク質で相補
化した。Ｍｏｋｏｌａウイルス、狂犬病ウイルス属の他
の類、ラブドウイルス水泡性口内炎ウイルス（ＶＳＶ；
血清型Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，ベシキュロウイルス
属）、及びレトロウイルスヒト免疫不全ウイルス（ＨＩ
Ｖ−１、株ＮＬ−４３）に由来するスパイクタンパク質
を含む伝染性偽型粒子を生成した。
【０１１４】真正のＭｏｋｏｌａ及びＶＳＶ−Ｇタンパ
ク質のトランスフェクトプラスミドからの発現や、細胞
のＳＡＤ ｄＧ感染により、伝染性偽型ウイルスが生成
した。しかしながら、狂犬病ウイルスＧや密接に関連す
るＭｏｋｏｌａウイルスＧに比べて、ＶＳＶ−Ｇでは低
い力価が観察された（１０6／ｍｌとは対照的に１０4／
ｍｌ）。しかしながら、ＶＳＶ−Ｇの細胞質ドメイン配
列及びトランスメンブランドメイン配列を、狂犬病ウイ
ルスＧタンパク質の対応するドメインで置換した後に、
１０6個の伝染性粒子が生成した。このことは、ＲＶ
Ｇの細胞質ドメインがそのタンパク質をウイルスエンベ
ロープに指向させることを示唆している。
【０１１５】真正のＨＩＶ ｇｐ１６０（ｇｐ１２０／
４０）スパイクを含む偽型粒子の生成は観察されなかっ
た。対照的に、ＲＶ Ｇの細胞質ドメインに融合したＨ
ＩＶｇｐの膜外及びトランスメンブランドメインからな
るキメラタンパク質の発現により、ＲＶ（ＨＩＶ）偽型
が形成された。これにより、Ｇタンパク質の細胞質ドメ
インがラブドウイルスのエンベロープ内へのスパイクタ
ンパク質の効果的な取り込みを担うことが確定した。Ｒ
Ｖ（ＨＩＶ）偽型粒子は、ヒトＣＤ４表面タンパク質を
発現するＶｅｒｏ細胞（Ｔ４+細胞）にはうまく感染し
たが、ＣＤ８を発現する対照細胞（Ｔ８+細胞）には感
染しなかった（細胞はＡＩＤＳ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａ
ｎｄ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｐｒｏｇ
ｒａｍｍｅから入手）。従って、偽型ウイルスはＨＩＶ
の宿主範囲及び細胞特異性を有する。
【０１１６】図面の説明 図１：ＲＶ偽遺伝子（Ψ）の構成及び組換えＲＶゲノム
の構築（一定の比率で記述）。番号は、ＳＡＤ Ｂ１９
の抗ゲノム配列のヌクレオチド位置を示す。上部に、５
個の読み取り枠を有する全ＲＶゲノムを示す。ゲノムの
一部（３８２３−６６６８）を含むｐＰｓｉＸ８で突然
変異を実施し、ＳｔｕＩ断片（４０１４−６３６４）を
交換して前記突然変異を全長クローンｐＳＡＤ Ｌ１６
に再度導入した。詳細な図面では、コード化領域を灰色
の枠で示し、非コード化配列は線として示す。機能的転
写シグナル配列は黒い縦棒（終結／ポリアデニル化）及
び矢印（ｍＲＮＡ転写開始）で示す。Ψ領域の開始を限
定する非機能的シグナル様配列は白い縦棒で示す。矢印
は、Ψ領域のＲＴ−ＰＣＲ分析で使用するオリゴヌクレ
オチドプライマーＧ３Ｐ及びＬ４Ｍの位置を示す。ＳＡ
Ｄ Ｕ２では、ＨｉｎｄＩＩＩエキステンションのフィ
ルインにより、４個のヌクレオチドが挿入され、単一の
ＮｈｅＩ部位が生成した。ＳＡＤ Ｖ*では、ＲＶ Ｎ
／Ｐシストロンボーダーを含むｃＤＮＡ断片（ＳＡＤ
Ｂ１９ヌクレオチド１３２３−１５０２）をＳｔｙＩ部
位に挿入した。ＳＡＤ Ｗ９はＳｔｙＩ／ＨｉｎｄＩＩ
Ｉ断片の欠失を有する。
【０１１７】図２：全長ＲＶ ｃＤＮＡを含む転写プラ
スミドの構築概略図。番号は、ＳＡＤ Ｂ１９ ＲＶ抗
ゲノム配列（Ｃｏｎｚｅｌｍａｎｎ等、１９９０）のヌ
クレオチド位置を示す。全長ＲＶゲノムＤＮＡの再構築
の基材として機能するプラスミドｐＳＤＩ−１プラス
は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター（Ｔ７）及
び肝炎デルタウイルス抗ゲノムリボザイム配列（ＨＤ
Ｖ）に対して反対方向に末端ヌクレオチド１−６８及び
１１７６０−１１９２８を含むＳＤＩ−１ ＲＶミニ−
ゲノムを含むｐＳＤＩ−１（Ｃｏｎｚｅｌｍａｎｎ及び
Ｓｃｈｎｅｌｌ、１９９４）の対応プラスミドである。
ｐＳＤＩ−１プラスのＭｕｎＩ−ＢｇｌＩＩ断片を、前
述の３個のＳＡＤ Ｂ１９ ｃＤＮＡクローンから作成
した１ｋｂ ｃＤＮＡ構築物で置換した。２個のｃＤＮ
Ａクローンからそれぞれ作成した３．６ｋｂＳｐｈＩ断
片及び７．２ｋｂ ＡａｔＩＩ断片を挿入すると、全長
ＳＡＤ Ｂ１９ ｃＤＮＡを含む最終プラスミドｐＳＡ
Ｄ Ｌ１６が得られた。このプラスミドをＴ７ ＲＮＡ
ポリメラーゼで転写すると、リボザイムの自己融解の後
に、５’末端及び正に３’末端に３個の余分の非ウイル
スＧ残基を有する陽性鎖（抗ゲノム）ＲＮＡが得られる
はずである。（Ｔ７）Ｔ７プロモーター；（Ｔ７Ｔ）Ｔ
７転写ターミネーター；（ＨＤＶ）ＨＤＶ抗ゲノムリボ
ザイム配列。
【０１１８】図３：トランスフェクタントウイルスＳＡ
Ｄ Ｕ２のゲノム内の遺伝子タグの例示。
【０１１９】標準ＲＶ ＳＡＤ Ｂ１９（Ｂ１９）及び
トランスフェクタントウイルスＳＡＤ Ｌ１６（Ｌ１
６）、ＳＡＤ Ｕ２（Ｕ２）に感染した細胞に由来する
全ＲＮＡを感染から２日後に単離し、これをプライマー
Ｇ３Ｐ及びＬ４Ｍを用いる各Ψ領域のＲＴ−ＰＣＲ増幅
のために使用した。それぞれＨｉｎｄＩＩＩ及びＮｈｅ
Ｉで消化した後に、増幅したＤＮＡを直接１％アガロー
スゲルで分離した。ＮｈｅＩ制限部位は、ＳＡＤ Ｕ
２．Ｍ，ＤＮＡサイズマーカー由来のＤＮＡにのみ存在
する。
【０１２０】図４：ＳＡＤ Ｂ１９（Ｂ１９）、ＳＡＤ
Ｖ*（Ｖ*）及びＳＡＤ Ｗ９（Ｗ９）ゲノムのＰＣＲ
分析。プライマーＧ３Ｐ及びＬ４Ｍを用いる図３に記載
の方法で、ＲＴ−ＰＣＲを実施した。増幅産物を１％ア
ガロースゲルで分離した。
【０１２１】図５：組換えＲＶＳによって転写されるＣ
ＡＴ ｍＲＮＡの例示。
【０１２２】ＳＡＤ Ｌ１６（Ｌ１６）、ＳＡＤ ＸＣ
ＡＴ（Ｘ６）及びＳＡＤ ＶＣＡＴ（ＶＣ１８）に感染
した細胞に由来する全ＲＮＡのノーザンブロットを、そ
れぞれＧ遺伝子（Ｇ）、偽遺伝子（Ｙ）及びＣＡＴ遺伝
子に特異的なプローブでハイブリダイズした。左側にウ
イルスゲノム（ｖ）及び特定のｍＲＮＡを示す。ＳＡＤ
ＸＣＡＴは、ＣＡＴ及び偽遺伝子配列（“ＣＡＴ
Ｙ”）の両方を含むｍＲＮＡを転写するが、ＳＡＤ Ｖ
ＣＡＴは偽遺伝子配列が欠失し、ＣＡＴ配列のみを有す
るｍＲＮＡ（“ＣＡＴ”）を転写する。ＲＮＡマーカー
の寸法はｋｂで示す。
【０１２３】図６：細胞培養で多数回継代した後のＳＡ
Ｄ ＸＣＡＴ及びＳＡＤ ＶＣＡＴのＣＡＴ活性。細胞
に特定継代（継代数は記載の通り）のウイルスを感染さ
せ、同量の細胞抽出物の、感染から２日後のＣＡＴ活性
を分析した。レーン“−”では、ＳＡＤ Ｌ１６感染細
胞由来の抽出物を分析した。
【０１２４】図７：組換えＲＶによるＥ０及びＥ２タン
パク質の発現。
【０１２５】細胞にそれぞれＳＡＤ ＶＥ０（単離物
１、２、３）及びＳＡＤ ＶＥ２（単離物ａ、ｂ、ｃ）
を感染させた。感染から２日後、細胞抽出物を還元条件
下にてＰＡＡゲル中で分離し、ニトロセルロース膜に移
した。それぞれＣＳＦＶ Ｅ０及びＥ２タンパク質に対
するモノクローナル抗体、次いでアルカリ性ホスファタ
ーゼに結合した二次抗体と共にインキュベートした後
に、基質を添加し、Ｘ線フィルムに暴露してタンパク質
を可視化した。対照としては、バキュロウイルスが発現
した、Ｅ０及びＥ２精製タンパク質を使用した（Ｂ）。
更には、ＣＳＦＣ（Ｖ）感染細胞に由来する抽出物を比
較のため使用した。
【０１２６】図８：ＳＡＤ ＶＥ０（＃１及び＃２）、
ＳＡＤ ＶＥ２（＃６）及び標準狂犬病ウイルスＳＡＤ
Ｂ１９（＃３及び＃４）で免疫し、ＣＳＦＶで攻撃し
たブタの白血球。白血球量は、攻撃（０日）前に存在し
た絶対数のパーセントで表す。＊（＃１、攻撃から１０
日後）：計測せず、推定値である。
【０１２７】図９：ＣＳＦＶ攻撃（０日）後のブタの体
温。
【０１２８】ａ．ＳＡＤ ＶＥ０で免疫した動物（＃１
及び＃２）は、１１日まで微熱を生じた（＃１）か又は
発熱しなかった（＃２）。ＳＡＤ Ｂ１９で免疫した対
照動物（＃３及び＃４）は共に、長期間にわたり高熱を
示した。＃４は重症のため、通常のブタ熱により攻撃か
ら１５日後に死亡し、＃４は攻撃から２１日後に死亡し
た。
【０１２９】ｂ．ＳＡＤ ＶＥ２で免疫した動物は、６
〜８日のみ微熱を生じた。対照はａ）と同一である。
【０１３０】図１０：ＳＡＤ ＤＣＤ感染細胞での端を
切り取ったＧタンパク質の発現。
【０１３１】ＢＳＲ細胞にＳＡＤ ＤＣＤ又はＳＡＤ
Ｌ１６をｍ．ｏ．ｉ．１で感染させ、感染から１６時間
後に、５０μＣｉの［35Ｓ］メチオニンで３時間標識し
た。細胞抽出物を抗狂犬病Ｇ ＭＡｂと共にインキュベ
ートし、免疫沈殿試料の分注物をＰＮＧａｓｅＦ（＋Ｐ
Ｆ）で消化してタンパク質バックボーンを示すか又は偽
性処理（−）してグリコシル化タンパク質を示した。＋
ＴＭ：標識前９０分間及び３時間の標識期間中に、感染
細胞を２μｇ／ｍｌのツニカマイシンの存在下でインキ
ュベートした。タンパク質を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで
分離し、オートラジオグラフィーで可視化した。細胞抽
出物を前述したように分析した。Ｌ１６：ＳＡＤ Ｌ１
６ウイルス、ΔＣＤ：ＳＡＤ ＤＣＤ突然変異体ウイル
ス、Ｍ：タンパク質サイズマーカー。
【０１３２】図１１：細胞培養物でのＳＡＤ Ｌ１６及
びＳＡＤ ＤＣＤの伝染。
【０１３３】培養細胞にそれぞれＳＡＤ Ｌ１６（Ｌ１
６）及びＳＡＤ ＤＣＤ（ＤＣＤ）をｍ．ｏ．ｉ．０．
０５で感染させ、感染後規定の時間に、狂犬病ウイルス
Ｎタンパク質に対する結合体（Ｃｅｎｔｏｃｏｒ(R)）
による直接免疫蛍光により分析した。ＳＡＤ ＤＣＤ感
染細胞の方が隣接細胞への伝染速度が遅いことが観察さ
れた。
【０１３４】図１２：ＳＡＤ ｄＧ（実施例７）及びＳ
ＡＤ ｄＣＤ（実施例６）に特異的なＲＮＡの分析。
【０１３５】ＳＡＤ Ｌ１６（実施例１）、ＳＡＤ ｄ
ＣＤ（ΔＣＤ）及び表現型が相補化したＳＡＤ ｄＧウ
イルス（ΔＧ）をｍ．ｏ．ｉ．１で感染させたＢＳＲ細
胞の全ＲＮＡを感染から２日後に単離し、ノーザンハイ
ブリダイゼーションで分析した。Ｎ遺伝子特異的プロー
ブ（Ａ）とのハイブリダイゼーションで示すように、Ｓ
ＡＤ ｄＧのゲノムは標準狂犬病ウイルスゲノム（ｖ）
よりもかなり小さく、Ｇ遺伝子の２．１ｋｂ欠失を反映
している。全Ｇタンパク質コード化配列に及ぶプローブ
はＳＡＤ ｄＧ ＲＮＡとはハイブリダイズしない。Ｓ
ＡＤ ｄＣＤゲノムの細胞質ドメインコード化領域の小
さな欠失が、標準狂犬病ウイルスＧ ｍＲＮＡよりも短
いＧ ｍＲＮＡ（Ｇ）の出現により実証される。
【０１３６】ｖ：ゲノムＲＮＡ；Ｎ，Ｇ：モノシストロ
ニックｍＲＮＡ；Ｎ＋Ｐ，Ｍ＋Ｇ，Ｇ＋Ｌ：ビシストロ
ニック（ｂｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）ｍＲＮＡ。
【０１３７】図１３： Ｇ-突然変異体ＳＡＤ ｄＧの非伝染性 ＢＳＲ細胞に、表現型が相補化されたＳＡＤ ｄＧを感
染させ、トランスフェクションから３６時間後に免疫蛍
光顕微鏡検査法により分析した。（Ａ）では、細胞をＮ
タンパク質に対するＦＩＴＣ結合抗体（Ｃｅｎｔｏｃｏ
ｒｅ）と共にインキュベートして、Ｎタンパク質の発現
を示す。単細胞のみが感染し、隣接細胞へのウイルスの
伝染は観察されなかった。（Ｂ）：Ｇ特異抗体での対
照。
【０１３８】図１４ ＲＶ（ＨＩＶ）偽型ビリオンの生成に使用する機能的キ
メラＨＩＶ／ＲＶ糖タンパク質の組成。トランスメンブ
ランドメインのすぐ下流にある３個のアミノ酸を除く全
ＨＩＶ−ＮＬ４３ｇｐ１６０細胞質ドメインを、完全Ｐ
Ｖ−Ｇ細胞質ドメインで置換した。“ｐ”は、親タンパ
ク質に存在しないプロリン残基を示す。細胞質ドメイン
配列とトランスメンブランドメイン配列はスラッシュ
（／）で離す。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＲＶ偽遺伝子（Ψ）の構成及び組換えＲＶゲノ
ムの構築を示す図である。
【図２】全長ＲＶ ｃＤＮＡを含む転写プラスミドの構
築概略図である。
【図３】トランスフェクタントウイルスＳＡＤ Ｕ２の
ゲノム内の遺伝子タグを示す図である。
【図４】ＳＡＤ Ｂ１９（Ｂ１９）、ＳＡＤ Ｖ
*（Ｖ*）及びＳＡＤ Ｗ９（Ｗ９）ゲノムのＰＣＲ分析
を示す図である。
【図５】組換えＲＶＳによって転写されるＣＡＴ ｍＲ
ＮＡを例示する図である。
【図６】細胞培養で多数回継代した後のＳＡＤ ＸＣＡ
Ｔ及びＳＡＤ ＶＣＡＴのＣＡＴ活性を示す図である。
【図７】組換えＲＶによるＥ０及びＥ２タンパク質の発
現を示す図である。
【図８】ＳＡＤ ＶＥ０（＃１及び＃２）、ＳＡＤ Ｖ
Ｅ２（＃６）及び標準狂犬病ウイルスＳＡＤ Ｂ１９
（＃３及び＃４）で免疫し、ＣＳＦＶで攻撃したブタの
白血球を示す図である。
【図９Ａ】ＣＳＦＶ攻撃（０日）後のブタの体温を示す
図である。
【図９Ｂ】ＣＳＦＶ攻撃（０日）後のブタの体温を示す
図である。
【図１０】ＳＡＤ ＤＣＤ感染細胞での端を切り取った
Ｇタンパク質の発現を示す図である。
【図１１】細胞培養物でのＳＡＤ Ｌ１６及びＳＡＤ
ＤＣＤの伝染を示す図である。
【図１２】ＳＡＤ ｄＧ（実施例７）及びＳＡＤ ｄＣ
Ｄ（実施例６）に特異的なＲＮＡの分析を示す図であ
る。
【図１３】Ｇ-突然変異体ＳＡＤ ｄＧの非伝染性を示
す図である。
【図１４】ＲＶ（ＨＩＶ）偽型ビリオンの生成に使用す
る機能的キメラＨＩＶ／ＲＶ糖タンパク質の組成を示す
図である。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成７年１２月５日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】ＲＶ偽遺伝子（Ψ）の構成及び組換えＲＶゲノ
ムの構築を示す図である。
【図２】全長ＲＶ ｃＤＮＡを含む転写プラスミドの構
築概略図である。
【図３】トランスフェクタントウイルスＳＡＤ Ｕ２の
ゲノム内の遺伝子タグを示す電気泳動の写真である。
【図４】ＳＡＤ Ｂ１９（Ｂ１９）、ＳＡＤ Ｖ＊（Ｖ
＊）及びＳＡＤ Ｗ９（Ｗ９）ゲノムのＰＣＲ分析を示
す電気泳動の写真である。
【図５】組換えＲＶＳによって転写されるＣＡＴ ｍＲ
ＮＡを例示する電気泳動の写真である。
【図６】細胞培養で多数回継代した後のＳＡＤ ＸＣＡ
Ｔ及びＳＡＤ ＶＣＡＴのＣＡＴ活性を示すクロマトグ
ラフの写真である。
【図７】組換えＲＶによるＥ０及びＥ２タンパク質の発
現を示す電気泳動の写真である。
【図８】ＳＡＤ ＶＥ０（＃１及び＃２）、ＳＡＤ Ｖ
Ｅ２（＃６）及び標準狂犬病ウイルスＳＡＤ Ｂ１９
（＃３及び＃４）で免疫し、ＣＳＦＶで攻撃したブタの
白血球を示す図である。
【図９Ａ】ＣＳＦＶ攻撃（０日）後のブタの体温を示す
図である。
【図９Ｂ】ＣＳＦＶ攻撃（０日）後のブタの体温を示す
図である。
【図１０】ＳＡＤ ＤＣＤ感染細胞での端を切り取った
Ｇタンパク質の発現を示す電気泳動の写真である。
【図１１】細胞培養物でのＳＡＤ Ｌ１６及びＳＡＤ
ＤＣＤの伝染を示す顕微鏡写真である。
【図１２】ＳＡＤ ｄＧ（実施例７）及びＳＡＤ ｄＣ
Ｄ（実施例６）に特異的なＲＮＡの分析を示す電気泳動
の写真である。
【図１３】Ｇ−突然変異体ＳＡＤ ｄＧの非伝染性を示
す顕微鏡写真である。
【図１４】ＲＶ（ＨＩＶ）偽型ビリオンの生成に使用す
る機能的キメラＨＩＶ／ＲＶ糖タンパク質の組成を示す
図である。
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１】
【図２】
【図３】
【図８】
【図４】
【図１４】
【図５】
【図６】
【図９Ａ】
【図７】
【図９Ｂ】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｂ Ｃ１２Ｎ 7/00 8931−4Ｂ

Claims (19)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ウイルスゲノムの読み取り枠、偽遺伝子
    領域又は遺伝子間領域に挿入及び／又は欠失を含む遺伝
    子操作による伝染性複製非セグメント化陰性鎖ＲＮＡウ
    イルス突然変異体。
  2. 【請求項２】 ウイルス突然変異体が偽遺伝子領域に挿
    入及び／又は欠失を含むことを特徴とする請求項１に記
    載のウイルス突然変異体。
  3. 【請求項３】 ウイルス突然変異体が読み取り枠に挿入
    及び／又は欠失を含むことを特徴とする請求項１に記載
    のウイルス突然変異体。
  4. 【請求項４】 ウイルス突然変異体が基質タンパク質又
    はその類似体をコードする読み取り枠に挿入及び／又は
    欠失を含むため、機能的基質タンパク質が不在となり、
    前記突然変異体の表現型が基質タンパク質で相補化され
    ることを特徴とする請求項３に記載のウイルス突然変異
    体。
  5. 【請求項５】 ウイルス突然変異体が糖タンパク質Ｇを
    コードする読み取り枠に挿入及び／又は欠失を含むこと
    を特徴とする請求項３に記載のウイルス突然変異体。
  6. 【請求項６】 挿入及び／又は欠失により、機能的糖タ
    ンパク質Ｇが不在化し、前記突然変異体の表現型が糖タ
    ンパク質Ｇ類似体で相補化されることを特徴とする請求
    項５に記載のウイルス突然変異体。
  7. 【請求項７】 糖タンパク質Ｇ類似体が狂犬病糖タンパ
    ク質Ｇであることを特徴とする請求項６に記載のウイル
    ス突然変異体。
  8. 【請求項８】 病原性ウイルス又は微生物のエピトープ
    又はポリペプチドをコードする異種核酸配列を保有する
    ことを特徴とする請求項１から７のいずれか一項に記載
    のウイルス突然変異体。
  9. 【請求項９】 ウイルス突然変異体がパラミクソウイル
    スファミリーに属することを特徴とする請求項１から８
    のいずれか一項に記載のウイルス突然変異体。
  10. 【請求項１０】 ウイルス突然変異体がラブドウイルス
    ファミリーに属することを特徴とする請求項１から８の
    いずれか一項に記載のウイルス突然変異体。
  11. 【請求項１１】 ウイルス突然変異体が狂犬病ウイルス
    であることを特徴とする請求項１０に記載のウイルス突
    然変異体。
  12. 【請求項１２】 ワクチンが請求項１から１１のいずれ
    か一項に記載のウイルス突然変異体と医薬的に許容可能
    なキャリアー又は希釈剤とを含んでなることを特徴とす
    る、哺乳動物の非セグメント化陰性鎖ＲＮＡウイルスに
    よって引き起こされる感染を予防するためのワクチン。
  13. 【請求項１３】 ａ）ＲＮＡポリメラーゼを発現する宿
    主細胞内に、 １）ウイルスのＮ、Ｐ及びＬタンパク質又はその類似体
    をコードする１個以上のＤＮＡ分子と、 ２）非セグメント化陰性鎖ＲＮＡウイルスゲノムのｃＤ
    ＮＡを含むＤＮＡ分子とを導入し、 ｂ）前記細胞によって産生されるウイルスを単離する 段階からなる伝染性複製非セグメント化陰性鎖ＲＮＡウ
    イルスの製造方法。
  14. 【請求項１４】 非セグメント化陰性鎖ＲＮＡウイルス
    ゲノムのｃＤＮＡが突然変異の取り込みによって改変さ
    れることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
  15. 【請求項１５】 非セグメント化陰性鎖ＲＮＡウイルス
    ｃＤＮＡゲノムの転写体が陽性鎖抗ゲノムＲＮＡである
    ことを特徴とする請求項１３又は１４に記載の方法。
  16. 【請求項１６】 ＲＮＡポリメラーゼが、好ましくは組
    換えワクシニアウイルスから発現されるＴ７ ＲＮＡポ
    リメラーゼであることを特徴とする請求項１３から１５
    のいずれか一項に記載の方法。
  17. 【請求項１７】 非セグメント化陰性鎖ＲＮＡウイルス
    ゲノムがパラミクソウイルスファミリーから得られるこ
    とを特徴とする請求項１３から１６のいずれか一項に記
    載の方法。
  18. 【請求項１８】 非セグメント化陰性鎖ＲＮＡウイルス
    ゲノムがラブドウイルスファミリーから得られることを
    特徴とする請求項１３から１６のいずれか一項に記載の
    方法。
  19. 【請求項１９】 非セグメント化陰性鎖ＲＮＡウイルス
    ゲノムが狂犬病ウイルスから得られることを特徴とする
    請求項１８に記載の方法。
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