DE60112050T2

DE60112050T2 - Rekombinantes influenza a virus

Info

Publication number: DE60112050T2
Application number: DE60112050T
Authority: DE
Inventors: Boris Ferko; Andre Egorov; Regina Voglauer
Original assignee: Polymun Scientific Immunbiologische Forschung GmbH
Current assignee: Polymun Scientific Immunbiologische Forschung GmbH
Priority date: 2000-03-02
Filing date: 2001-03-02
Publication date: 2006-04-27
Anticipated expiration: 2021-03-03
Also published as: WO2001064860A3; WO2001064860A2; US20030147916A1; EP1259629A2; ATE299943T1; EP1259629B1; RU2280690C2; RU2002126205A; US6800288B2; AU5035201A; DE60112050D1; AU2001250352B2

Description

GEBIET DER TECHNIK
Die Erfindung liegt auf den Gebieten der Impfstoffentwicklung und -anwendung und bezieht sich auf abgeschwächte lebende Impfstoffvektoren, konkreter auf solche Vektoren, die auf genetisch modifizierten Influenza A-Virenstämmen beruhen oder davon abgeleitet sind, sowie auf die Herstellung rekombinanter Influenzaviren und Impfstoffe.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Influenzaviren sind Viren aus segmentierten Negativstrang-RNA und gehören zur Familie der Orthomyxoviridae. Das Influenza-A-Virus besteht aus neun strukturellen Proteinen und kodiert zusätzlich ein nichtstrukturelles NS1-Protein mit regulatorischen Funktionen. Das nichtstrukturelle NS1-Protein wird während des Reproduktionszyklus in grossen Mengen synthetisiert und ist im Zytosol und Kern der infizierten Zellen lokalisiert. Die segmentierte Natur des viralen Genoms ermöglicht es, dass der Mechanismus eines genetischen Reassortments (eines Austausches von Genomsegmenten) bei Mischinfektion einer Zelle mit verschiedenen Virenstämmen abläuft. Mehrere Merkmale machen Influenzaviren zu attraktiven Kandidaten für die Entwicklung wirksamer lebender Impfstoffvektoren gegen verschiedene Krankheiten:

1) Influenzaviren induzieren nach der Infektion starke zelluläre und humorale Immunantworten gegen virale Proteine auf systemischem und auf Schleimhautniveau;
2) als ein RNA-Virus enthält das Influenzavirus in seinem Replikationszyklus keine DNA-Phase. Daher kann eine chromosomale Integration von viralen Genen in den Wirt ausgeschlossen werden;
3) viele verschiedene Subtypen von Influenzaviren sind verfügbar. Da die Antikörper gegen diese verschiedenen Subtypen keine oder nur geringe Kreuzreaktivität zeigen, kann eine schon bestehende Immunität gegenüber dem viralen Vektor im Wirt, die häufig ein Problem für andere lebende Vektoren darstellt, umgangen wer den. Auch könnten wirksame Booster-Immunisierungen mit Influenzaviren unterschiedlicher Subtypen, die die gleichen Antigene exprimieren, möglich sein; und
4) abgeschwächte Influenzaviren sind als lebende Influenza-Impfstoffe, die im Menschen als sicher und immunogen erwiesen worden sind, verfügbar.

Bisher besteht das Hauptproblem beim Einsatz von Influenzaviren als einem Vektor in der Grösse des Virusgenoms und seiner begrenzten Fähigkeit, fremde Sequenzen zu tolerieren. Von zehn Proteinen des Influenzavirus sind nur die Oberflächen-Glykoproteine Hämagglutinin (HA) und Neuraminidase (NA) erfolgreich gentechnisch für eine stabile Expression fremder Epitope verändert worden. Da das Influenzavirus nur eine Einfügung von ungefähr zehn Aminosäuren in sein HA-Molekül toleriert, bestehen nur begrenzte Möglichkeiten, die Konformationseigenschaften der eingefügten Epitope zu beeinflussen, die wahrscheinlich besser zum Ausdruck kämen, wenn längere Sequenzen eingeführt würden. Ausserdem können Oberflächen-Influenzaglykoproteine wie HA oder NA wegen ihres Zusammenhanges mit antigenen Eigenschaften der Viren nicht als optimale Ziele für die Präsentation fremder Sequenzen betrachtet werden. Ein lebendes HA-Viruskonstrukt, das ein erwünschtes fremdes Antigen enthält, kann wegen der bereits bestehenden Immunität gegen das HA, die durch die erste Immunisierung oder durch eine natürliche Vireninfektion bereits vorhanden ist, nicht für Boost-Immunisierungen (zum Beispiel durch zweite und weitere Verabreichungen) angewendet werden. Eine Boost-Immunisierung wäre nur nach Einführung der erwünschten antigenen Struktur in ein anderes HA-Molekül, das zu einem anderen Influenzaviren-Subtyp gehört, möglich. Es ist offensichtlich, dass ein solcher Prozess schwierig, mühsam und extrem zeitaufwändig und daher für eine routinemässige Impfstoffherstellung wahrscheinlich nicht geeignet ist.
Vorausgegangene Untersuchungen im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung haben Hinweise geliefert, dass das NS-Gen des Influenza-A-Virus eine aussichtsreiche Alternative zu HA als viraler Träger zur Präsentation eines erwünschten fremden Antigens an das tierische oder menschliche Immunsystem sein kann. Das kürzlich begründete Verfahren der reversen Genetik (Egorov und Mitautoren, 1998, J. Virol. 72 (8) 6437–41) ermöglicht die Rettung von Influenzaviren, die lange Deletionen oder Einfügungen fremder Sequenzen auf der Carboxylseite des nichtstrukturellen Proteins 1 (NS1-Protein) enthalten. NS1-Protein ist in mit Influenzaviren infizierten Zellen reichlich vor handen und stimuliert zytotoxische T-Lymphozyten-(CTL-)Antworten wie auch Antikörper-Antworten im natürlichen Verlauf einer Influenzavireninfektion.
Weitere Einzelheiten über das NS-Gen des Influenzavirus finden sich in WO 99/64571 oder WO 99/64068. Ausserdem wird in WO 99/64571 und WO 99/64068 offenbart, dass gefunden wurde, dass abgeschwächte Influenza-A-Virus-Transfektanten, die Knockout-Deletionen des ganzen NS1-Gens enthalten, einen starken, Interferon (IFN) induzierenden Phänotyp besitzen. Das wurde daraus geschlossen, dass solche Transfektanten auf IFN-armen Verozellen, aber nicht auf Hühnereiern oder Madin-Darby-Hundenieren-(MDCK-)Zellen wachsen konnten.
WO 99/64068 offenbart einige Mutanten des Influenzavirus, die Deletionen im NS1-Gen enthalten, darunter Mutanten mit voller Deletion des NS1-Gens wie auch Mutanten mit partiellen Deletionen des NS1-Gens. Weiter wird darin offenbart, dass Deletionen innerhalb des N-endständigen Teils zwischen den Aminosäurepositionen 1 und 124 Mutanten ergeben, die mehr oder weniger stark verfehlen, eine Interferonantwort zu antagonisieren, während die Antagonisierung einer Interferonantwort bei voller Deletion des NS1-Gens gänzlich versagte.
Das Influenza-NS1-Protein ist ein RNA bindendes Protein, das mit einer Anzahl von regulatorischen Funktionen während einer Influenzavireninfektion in Verbindung gebracht worden ist. Es wird in grossen Mengen synthetisiert und findet sich früh während der Infektion hauptsächlich im Kern, aber später im viralen Zyklus im Zytoplasma der infizierten Zellen. Ein anderes regulatorisches virales Protein, nämlich das Nef-Protein von HIV-1, das ein myristyliertes Protein ist, ist zum Unterschied vom Influenza-NS1-Protein im Zytosol in Verbindung mit der Zellmembran lokalisiert.
Eine gegen früh exprimierte regulatorische HIV-1-Proteine gerichtete Immunantwort könnte es möglicherweise erlauben, virusinfizierte Wirtszellen vom Replikationszyklus zu eliminieren, noch ehe neue infizierende virale Teilchen freigesetzt werden. Da das Nef-Protein zu den ersten freigesetzten Proteinen gehört und des Weiteren eines der hauptsächlichen, nach der Infektion erzeugten HIV-Proteine ist, könnte es eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung eines wirksamen Impfstoffes gegen AIDS spielen.
Der „negative Faktor" (Nef) von HIV-1 wird durch einen offenen Leseraster kodiert, der sich teilweise mit der U3-Region der langen 3'-endständigen Wiederholung überlappend am 3'-Ende des Virus befindet. Bis zu 80% der Klasse der frühen, mehrfach gespleissten viralen Transkripte kodieren Nef. Das Nef-Genprodukt ist ein NH₂-endständig myristyliertes Protein von 27 bis 30 kDa, das vorwiegend im Zytoplasma lokalisiert und mit der Membran und der zytoskeletalen Matrix assoziiert ist. Es wird bei den verschiedenen Menschen-(HIV-1- und HIV-2-) und Affen-(SIV-)Immunschwächeviren gut konserviert.
Die nahe entwicklungsgeschichtliche Beziehung zwischen diesen Primaten-Lentiviren legt nahe, dass das Nef-Protein eine wichtige Rolle bei viraler Infektion und Pathogenese spielt, obwohl die genaue Rolle im Lebenszyklus der Viren und seine Funktionen auf der Ebene der Zellen noch Gegenstand laufender Forschungsarbeiten sind.
Verschiedene Einzelheiten über das Nef-Protein und seine Wirkungen sind aber bereits bekannt. Zum Beispiel wird berichtet, dass einige Menschen, die mit HIV infiziert waren, von dem Nef entfernt worden war, krankheitsfrei blieben und 10 bis 14 Jahre nach der Infektion normale CD4-Zählungen aufwiesen, obwohl Nef-Deletion kein universeller Befund in Langzeitüberlebenden ist. Ausserdem ist SIV, dem Nef fehlt, nicht in der Lage, AIDS in infizierten erwachsenen Makaken zu erzeugen. SIV-Mutanten, von denen das Nef-Gen entfernt worden ist, induzieren sogar einen Schutz gegen einen virulenten Challenge. Es konnte gezeigt werden, dass Nef die provirale HIV-1-DNA-Synthese stimuliert, und es wurde auch gefunden, dass seine Expression die wirksame Internalisierung und den Abbau des CD4-Zelloberflächenrezeptors für HIV-1 induziert. Diese Nef-induzierte CD4-Herabregulierung, die die Zellen gegenüber einer viralen Superinfektion resistent macht, besitzt das Potential, die Virenreplikation zu steigern, indem sie die Freisetzung der Nachkommenvirionen erleichtert. Es wurde weiter gezeigt, dass extrazelluläres Nef-Protein HIV-1 sowohl in infizierten T-Zelllinien als auch in PBMC von asymptomatischen Trägern von einer latenten zu einer produktiven Infektion aktivieren konnte. Weiter wurde gezeigt, dass primäre Zellen, die mit HIV-1 infiziert waren, nicht wirksam durch CTL lysiert wurden, wenn das virale Nef-Genprodukt exprimiert wurde.
Der Schutz von HIF-infizierten Zellen vor wirksamer Erkennung und Tötung durch CTL korreliert mit der von Nef vermittelten Herabregulierung von Molekülen der MHC-Klasse 1. Nef stört ferner die Induktion von IL-2-mRNA in T-Zelllinien. Weiter ist eine grosse Anzahl von Zellpartnern gefunden worden, die mit Nef-Expression assoziiert sind, darunter Kinasen der Src-Familie, β-COP, eine Serin-Threonin-Kinase, Thioesterase und p53.
Es wird auch berichtet, dass die Mehrheit (etwa 2/3) von HIV-1-seropositiven Patienten Nef-spezifische CTL erzeugte.
Zwei zentrale, mehrfach begrenzte immunodominante Regionen (Aminosäuren 66 bis 100 und 115 bis 146) sowie eine carboxyl-endständige Region (Aminosäuren 182 bis 206) sind innerhalb des Nef-Proteins identifiziert worden. Diese drei mehrfach begrenzten immunodominanten Regionen (Aminosäuresequenzen, die mehr als ein T-Zellepitop enthalten) werden durch humane CD8+-CTL in Verbindung mit mindestens 14 verschiedenen Molekülen der MHC-Klasse 1 erkannt, darunter die wichtigen MHC-Haplotypen HLA-A1, -A3, -A11, -88, -B17, -B18 und -B37.
Die beiden zentralen, mehrfach begrenzten Domänen des Nef-Proteins sind die am höchsten konservierten Regionen unter den verschiedenen HIV-1-Isolaten und waren für die meisten der untersuchten, asymptomatisch HIV-1-seropositiven Spender immunodominant. Zusätzlich zu der hohen Immunogenität des HIV-1-Nef-Proteins, die durch seine Fähigkeit, starke T-Zellen-Immunantworten zu induzieren, demonstriert worden ist, ist auch über Nef-spezifische B-Zellen-Immunantworten in der Literatur berichtet worden.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Entwicklung von abgeschwächten lebenden Impfstoffvektoren, konkreter auf solche Vektoren, die auf genetisch modifizierten Influenza-A-Virenstämmen beruhen oder davon abgeleitet sind. Sie bezieht sich weiter auf den Aufbau und die Modifizierung von gentechnisch veränderten nichtstrukturellen Genen von Influenza-A-Viren und insbesondere des NS1-Gensegments, wobei die Modifizierungen Deletionen ausgewählter Teile des NS1-Gensegments und/oder Einfügungen von heterologen, bevorzugt antigenen Sequenzen in ausgewählte Plätze des NS1-Gens einschliessen. Ein weiteres Ziel der Erfindung besteht darin, chimärische Influenzaviren zur Verfügung zu stellen, die solche modifizierte NS1-Gensegmente enthalten, aber im Gegensatz zu den Transfektanten, die in WO 99/64571 oder WO 99/64068 offenbart worden sind, frei von dem Nachteil sind, IFN-empfindlich zu sein. Die Erfindung bezieht sich weiter auf rekombinante Proteine, die durch Expression in einem geeigneten Wirtssystem aus den NS1-modifizierten Viren gewonnen werden, und weiter auf einen Impfstoff, der die NS1-modifizierten Viren der vorliegenden Erfindung umfasst.
Noch ein weiteres Ziel der Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur Gewinnung rekombinanter Influenzaviren wie auch abgeschwächter Influenza-Impfstoffe zur Verfügung zu stellen, das auf der Erzeugung kontinuierlicher Zelllinien (zum Beispiel Vero, MDCK usw.) beruht, die synthetische Influenzagene (Minus-Sense-RNA) exprimieren, die natürliche oder gentechnisch veränderte Influenzasequenzen (Deletionen oder Einfügungen) umfassen. Diese Zelllinien, die grosse Mengen solcher Gene erzeugen, können für eine von Auswahlprozeduren gefolgte Infektion mit Influenzaviren verwendet werden, um ein interessantes Gen in die viralen Nachkommen eingebaut zu bekommen.
Die gegenwärtigen Erfinder haben ein System der reversen Genetik an Verozellen aufgebaut, das es ihnen ermöglicht, die Virulenz des PR8-Influenza-A-Virenstammes durch Veränderung der Länge des translatierten NS1-Proteins zu manipulieren. Während der zur vorliegenden Erfindung führenden Forschungsarbeiten ist die Fähigkeit von Influenza-A-Viren untersucht worden, lange Einfügungen im NS-Gen zu tolerieren und zu präsentieren. Eine Sammlung mehrerer chimärischer NS1-Gen-Konstrukte, in denen heterologe Sequenzen einschliesslich der von HIV-1 abgeleiteten Sequenzen, die ELDKWA von gp41 oder Nef kodieren, verwendet werden, ist durch Rasterinsertion einer oder mehrerer der heterologen Sequenzen oder wahlweise mehrerer Wiederholungen irgendeiner solchen Sequenz in das NS1-Protein aufgebaut worden.
Die erwähnten heterologen Sequenzen sind an der nt-Position 400 (die der aa-Position 124 entspricht) eingefügt worden, wahlweise nach einer vorangehenden 2A-Selbstspaltungsstellensequenz und/oder einer vom Influenza-HA-Molekül abgeleiteten Leitersequenz. Andere Konstrukte umfassten zusätzlich eine vom Influenza-HA-Molekül abgeleitete Ankersequenz als eine Einfügung direkt hinter der (den) erwünschten antigenen Sequenz(en), wodurch das Ende der gesamten heterologen Einfügung gebildet wurde. In jedem Falle folgte auf die Einfügungen ein Stopp-Codon, um eine Transkription und Translation des verbleibenden Abschnitts des NS1-Gensegments (einschliesslich der Effektordomäne) zu verhindern, dabei aber die Spaltungsstelle für das NS-Spleissen (die für die Transkription und Translation des NS2- = NEP-Gensegments erforderlich ist) voll funktionsfähig zu erhalten.
Gerettete Viren bewirkten eine Expression und Ansammlung fremder Antigene im Zytosol und/oder auf der Oberfläche der infizierten Zellen. Die Erfinder haben auch transfektante Viren, die eine an T-Zellepitopen des HIV-1-Nef-Proteins reiche, mehrfach begrenzte immunodominante Region (136 Aminosäuren) beherbergten, erfolgreich gerettet.
Alle Transfektanten zeigten normale Wachstumseigenschaften in Verozellen, Hühnerembryonen und MDCK-Zellen, aber wurden in Mäusen abgeschwächt. Chimärische Influenza-NS1-Nef-Viren replizierten nicht in den Atemwegen infizierter Mäuse, aber waren in der Lage, nach einer einzelnen intranasalen Immunisierung eine starke Nef-spezifische CTL-Antwort zu induzieren. Ausserdem wurde eine Nef-spezifische Antikörperantwort nach drei Immunisierungen festgestellt. Eine Übertragung des rekombinanten NS-nef-Gens durch genetisches Reassortment vom viralen PR8-Vektor (Influenza A/PR/8/34; Egorov und Mitautoren, 1994, Vopr. Virusol. 39: 201–205) zu anderen Influenzastämmen führte zum gleichen Niveau der Abschwächung und Immunogenität. Diese Erkenntnis ermöglichte es den gegenwärtigen Erfindern, wirksame Boost-Immunisierungen unter Verwendung mehrerer abgeschwächter Vektoren verschiedener antigener Subtypen vorzunehmen.
Die Erfinder sind somit in der Lage gewesen zu zeigen, dass durch das Vorgehen, einen Satz von chimärischen Influenzastämmen zu schaffen, die zu verschiedenen Influenza-Subtypen gehören, aber das gleiche rekombinante chimärische NS1-Gen tragen, die Möglichkeit gegeben wird, mehrere Stämme für Boost-Immunisierungen zu erzeugen. Sie haben weiter bewiesen, dass ein neues chimärisches NS1-Genkonstrukt, nachdem es einmal gerettet worden ist, routinemässig durch genetisches Reassortment auf einen anderen Influenzastamm übertragen werden kann.
BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 zeigt eine funktionelle Karte des gentechnisch veränderten NS1-Proteins von PR8;
2 zeigt die Struktur von rekombinanten NS1-Proteinen der geretteten transfizierten Influenzaviren, die gp-41- und IL-1β-Peptid exprimieren;
3 zeigt die Struktur des rekombinanten NS1-Proteins des geretteten Influenza-Transfektanten PR82Anef (PR8/Nef), der aa70-206 des Nef-Proteins von HIV-1 NL4-3 exprimiert;
4 zeigt die Replikation von chimärischen Influenza/Nef-Viren in den unteren Atemwegen von Mäusen;
5 zeigt die Anzahl von IFN-γ sekretierenden Zellen von immunisierten Mäusen, die pro 10⁶ Milzzellen gefunden wurde, nachdem immune Milzzellen in Gegenwart von Nef-Peptid, NP-Peptid oder ohne Peptid als Indikator für T-Zellenantworten inkubiert worden waren;
6 zeigt die Anzahl von IFN-γ sekretierenden Zellen aus den die Atemwege entwässernden Lymphknoten von immunisierten Mäusen, die pro 10⁶ Milzzellen gefunden wurde, nachdem immune Milzzellen in Gegenwart von Nef-Peptid, NP-Peptid oder ohne Peptid als Indikator für T-Zellenantworten inkubiert worden waren;
7 zeigt Nef-spezifische Serum-IgG-Immunantworten nach einer zweiten und dritten Immunisierung von mit rekombinanten Influenza/Nef-Viren immunisierten Mäusen;
8 stellt Ergebnisse eines Plaquereduktionstests dar;
9 stellt Ergebnisse eines Interferoninduktionstests dar;
10a bis 10c zeigen die Immunfluoreszenz von Verozellen, die im Voraus mit rekombinanten PR8/Nef-Viren (10a, 10b) und Influenza-PR8-Viren vom Wildtyp (10c) infiziert worden waren;
11 zeigt Nef-Peptid-spezifische und NP-Peptid-spezifische Immunantworten als quantitatives Mass für IFN-γ sekretierende Zellen in Mäusemilzzellen;
12 zeigt Nef-Peptid-spezifische und NP-Peptid-spezifische Immunantworten als quantitatives Mass für IFN-γ sekretierende Zellen in die Atemwege von immunisierten Mäusen entwässernden Lymphknoten;
13 zeigt Nef-Peptid-spezifische und NP-Peptid-spezifische Immunantworten als quantitatives Mass für IFN-γ sekretierende Zellen in urogenitalen Einzelzellpopulationen von immunisierten Mäusen;
14 stellt Ergebnisse eines ELISA-Tests dar, in dem Nef-spezifisches IgG in Seren von Mäusen zwei Wochen nach der dritten Immunisierung mit dem PR8/NS-Nef- oder Aichi/NS-Nef-Vektor bestimmt wurde;
15 ist eine schematische Darstellung eines Influenza-NS-Transkriptionssystems für die Expression von Minus-Sense-RNA zur Verwendung in der Erzeugung von rekombinanten Influenzaviren.
EINGEHENDE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
In einer Ausführungsform bezieht sich die Erfindung auf gentechnisch veränderte NS-Gen-Konstrukte eines Influenza-A-Virus, die Sequenzmodifizierungen, d.h. Einfügungen, an der Nukleotid-(nt-)position 400 des NS1-Gensegments umfassen (die Nummerierung basiert auf dem NS-Gen des Influenza-A/PR/8/34-Virus). Unerwartet erwies es sich, dass ein Erhalt von Funktionalität des NS1-Gensegments bis zur nt-Position 400 (entsprechend der aa-Position 124 des NS1-Proteins) bei gleichzeitiger Deletion des übrigen Abschnitts oder zumindest eines grösseren Teiles davon oder die Einfügung einer fremden nt-Sequenz in die Region hinter der nt-Position 400 oder eine Verschiebung des Leserasters, um eine falsche Transkription und Translation des verbleibenden NS1-Abschnitts zu bewirken, zur Rettung von NS-Genkonstrukten führte, die ihre viralen Vektoren IFN-induzierend, aber nicht IFN-empfindlich machte.
Diese überraschende Entdeckung wurde durch Experimente bestätigt, in denen die chimärischen Influenzaviren, die gemäss der vorliegenden Erfindung gentechnisch erzeugt worden waren, nicht nur eine starke IFN-Antwort in MDCK-Zellen und Hühnereiern induzierten, sondern auch in der Lage waren, mit einem dem PR8-Virus des Wildtyps vergleichbaren Wirkungsgrad auf diesen Wirtssubstraten zu wachsen. Im Gegensatz dazu zeigten chimärische Influenzaviren, die Deletionen des ersten Drittels des NS1-Gens oder Deletionen des ganzen NS1-Gens enthielten, sowohl einen IFN induzierenden als auch einen IFN-empfindlichen Phänotyp. Sie waren nicht in der Lage, auf Hühnereiern oder MDCK-Zellen zu wachsen, und konnten daher nur auf IFN-armen Zelllinien wie Verozellen kultiviert werden. Chimärische Influenzaviren vom letzteren Typ sind in WO 99/64571 bzw. WO 99/64068 offenbart worden. Es wird angenommen, dass die Viren der vorliegenden Erfindung, die nicht so stark abgeschwächt sind wie die Viren von WO 99/64571 bzw. WO 99/64068, stärker immunogen und daher besser für die Herstellung hoch wirksamer lebender Impfstoffe gegen verschiedene Arten viraler Infektionen geeignet sind.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird das gentechnisch veränderte NS-Gen als ein genomisches Fragment des Influenza-A-Virus in einem Verfahren verwendet, wo es durch genetisches Reassortment zu beliebigen erwünschten Influenza-A-Virenstämmen oder lebenden Influenza-Impfstoffen übertragen wird. In diesem Zusammenhang wird bevorzugt, dass das gentechnisch veränderte NS-Gen als ein cDNA-Klon aufgebaut wird, der durch Verfahren der reversen Genetik als ein genomisches Fragment auf einen beliebigen Influenza-A-Virenstamm oder einen lebenden Influenza-Impfstoff übertragen werden kann. Zum Beispiel kann ein anderer Vektor wie Aichi/NS-Nef, der zum H3N2-Subtyp gehört, aber das gleiche rekombinante NS-Gen enthält, auf diese Art und Weise gewonnen werden. Im Gegensatz zu Strategien, die die rekombinanten Influenzaviren, die fremde Antigene exprimieren, im Zusammenhang mit HA- oder NA-Molekülen erzeugt haben, ermöglicht dieses Vorgehen eine schnelle Erzeugung eines Satzes von nicht kreuzreaktiven Vektoren für optimale Boost-Immunisierungen.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das gentechnisch veränderte NS-Gen für die Expression von viralen Antigenen und insbesondere für die Expression der HIV-1-Sequenzen von Nef oder ELDKWA von gp-41 ausgelegt.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird das gentechnisch veränderte NS-Gen als ein genomisches Fragment von Influenzaviren gerettet, dessen Expression als ein Faktor zur Überexpression und Aktivierung von Proteinkinase p-68 (PKR) in infizierten Zellen beiträgt oder einen solchen Faktor hervorruft.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung ist das chimärische NS-Gen Teil eines abgeschwächten (kälte-adaptierten) lebenden Influenza-Impfstoffvektors, in dem das gentechnisch veränderte NS-Gen der Hauptfaktor oder ein zusätzlicher Faktor für die Abschwächung ist. Es ist besonders nützlich für die Herstellung von sicheren und hoch wirksamen, auf Influenzaviren beruhenden Impfstoffen, darunter – ohne darauf beschränkt zu sein – anti-HIV-1-Impfstoffen, worin das transfizierte chimärische NS-Gen-Konstrukt Gensequenzen von nef, 2A und/oder gp-41 oder anderen viralen Genen zur Induktion starker Antikörper- und/oder B- und T-Zellen-Immunantworten umfasst.
Der einen abgeschwächten (kälte-adaptierten) lebenden Influenzavirenvektor umfassende Impfstoff kann in einer geeigneten pharmazeutischen Formulierung hergestellt und sowohl für prophylaktische Immunisierungen als auch für eine therapeutische Impfung verwendet werden, darunter die Induktion von IFN-Freisetzung in Kombination mit einer Stimulierung der B- und T-Zellenantwort. In solchen Formulierungen könnten Influenzavektoren in Kombination mit einem beliebigen anderen Vektor verwendet werden, der analoge Antigene exprimiert, um eine maximale Boostwirkung zu gewährleisten. So bietet die Erzeugung von abgeschwächten Influenza-NS-Vektoren die Möglichkeit, neuartige rekombinante Impfstoffe mit einem nahezu optimalen Gleichgewicht von Sicherheit und gegen eine breite Auswahl von Pathogenen gerichteter Immunogenität zu gewinnen.
In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung umfasst das gentechnisch veränderte NS-Gen eines Influenza-A-Virus eine heterologe Nukleotideinfügung, die vom HIV-1-Nef-Gen (Nukleotide 210–618 des Nef-Gens des HIV-1-Klons NL4-3) abgeleitet ist, sowie eine Einfügung der Selbstspaltungssequenz 2A (54 Nukleotide) N-endständig zu der von HIV-1 abgeleiteten Einfügung an der Position 400 der NS1-Protein-Kodiersequenz. Die ersten 68 Aminosäuren des Nef-Proteins wurden entfernt, um Domänen einschliesslich der Myristoylierungsstelle und weitere, mit den pathogenen Eigenschaften des mehrfunktionellen HIV-1-Nef-Proteins verbundene Domänen auszuschliessen.
In weiteren Versuchen fanden die Erfinder, dass Influenza-PR8/Nef-Virus und Influenza-Aichi/Nef-Virus zu einem hohen Gehalt an Antikörpern gegen den viralen Vektor und einem geringeren, aber immer noch signifikanten Gehalt gegen das Nef-Gen führten. Der PR8/Nef-Virus ist ein PR8-124-Virus mit verkürztem NS1, der eine 2A-Selbstspaltungssequenz an der aa-Position 124 des NS1-Proteins enthält und zusätzlich eine auf die Selbstspaltungsstelle folgende Nef-Sequenz (aa70-206 des HIV-1-Nef-Proteins) umfasst. Der Aichivirus ist reassortiert, insofern als alle Gene ausser dem NS-Gen, aber einschliesslich der die Hüllenproteine HA und NA kodierenden Gene vom H3N2-Aichivirus vom Wildtyp stammen, während das rekombinante NS-Gen vom PR8/Nef-Virus stammt. Ferner wurde beobachtet, dass die PR8/Nef- und Aichi/Nef-Viren starke T-Zellenantworten gegen das Nef-Gen wie auch gegen den viralen Vektor hervorriefen. Dieses Experiment bewies, dass es möglich ist, das chimärische NS-Gen auf einen anderen Influenzavirenstamm zu übertragen, um im Wesentlichen die gleiche Immunantwort hervorzurufen. Diese Entdeckung ist wichtig, da sie es gestattet, Möglichkeiten für Boost- Immunisierungen zu schaffen und jahreszeitliche Influenza-Impfstoffe mit variierenden immunogenen Subtypen, aber einer konstanten, auf chimärischem NS1-Gen beruhenden Aktivität zu entwerfen.
In einer weiteren Ausführungsform schafft die Erfindung ein Verfahren zur Erzeugung rekombinanter Influenzaviren durch Konstruktion eines Vektors, der ein modifiziertes NS-Gen umfasst, worin die NS1-Gensequenz teilweise oder gänzlich entfernt oder verkürzt wurde, Mischen dieses Vektors mit Lipiden, um eine Selbstorganisation von Lipid-DNA-Komplexen zu ermöglichen, und Transfektion der Lipid-DNA-Komplexe in eine erwünschte kontinuierliche Zelllinie, zum Beispiel eine Vero- oder MDCK-Zelllinie, sowie Auswahl von Klonen, die das modifizierte NS-Gen stabil integrieren und replizieren, die dann mit einem beliebigen erwünschten Influenzastamm und insbesondere einem epidemischen Influenzastamm vom Wildtyp infiziert werden, um abgeschwächte virale Nachkommen zu erzeugen, die das modifizierte NS-Gen enthalten. In diesem Verfahren kann das modifizierte NS-Gen weiter Einfügungen heterologer Gensequenzen umfassen, die zum Beispiel andere virale Antigene oder Pathogene kodieren, zum Beispiel die hierin offenbarten.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur raschen Herstellung von Impfstoff zur Verfügung zu stellen, das die Schritte umfasst, eine kontinuierliche Zelllinie zu transformieren, um ein gewünschtes synthetisches virales Gen zu erzeugen, insbesondere ein modifiziertes NS-Gen des Influenza-A-Virus, worin das NS1-Gen teilweise oder gänzlich entfernt oder verkürzt wurde, die transformierte Zelllinie mit einem gewünschten Virus und insbesondere mit einem epidemischen Influenzastamm vom Wildtyp zu infizieren, um abgeschwächte virale Nachkommen zu erzeugen, die das modifizierte NS-Gen enthalten, abgeschwächte rekombinante Viren auszuwählen und solche Viren unter Bedingungen zu vermehren, die für eine wirksame Virenreplikation geeignet sind, bevorzugt unter Verwendung interferonarmer Substrate, und das geerntete Virenmaterial mit einem pharmzeutisch annehmbaren Träger zu kombinieren, was zu einem antiviralen Impfstoff führt. In diesem Verfahren kann das modifizierte NS-Gen weiter Einfügungen heterologer Gensequenzen umfassen, die zum Beispiel andere virale Antigene oder Pathogene kodieren, zum Beispiel die hierin offenbarten.
Weitere Ausführungsformen werden in den abhängigen Ansprüchen definiert. Die folgenden Beispiele werden vorgestellt, damit die hierin beschriebene Erfindung vollständiger verstanden werden kann. Die Beispiele dienen lediglich der Veranschaulichung und sind nicht so zu deuten, dass sie diese Erfindung in irgendeiner Hinsicht einschränken.
Beispiel 1: Herstellung von rekombinanten Negativ-Strang-Influenza-A-Viren („Verfahren der reversen Genetik")
Die die Nef-Sequenz enthaltenden Plasmidklone wurden auf der Grundlage des existierenden Plasmidklons des Influenza-NS-Gens pUC 19/NSPR hergestellt (Egorov und Mitautoren, 1998, J. Virol. 72/8, 6437–41). Die Nef-Sequenz wurde abwärts von einer zusätzlichen Sequenz mit offenem Leseraster in das NS1-Protein eingesetzt, nämlich abwärts von einer Protease-Erkennungssequenz P2A (NFDLLKLAGDVESNPG/P), die vom Maul- und Klauenseuche-Virus abgeleitet ist, das posttranslational durch eine allgegenwärtige zelluläre Protease gespalten wurde (Mattion und Mitautoren, 1996, J. Virol. 70 (11), 8124–7; Percy und Mitautoren, 1994, J. Virol. 68 (7), 4486–92), so dass das gp-41-Molekül vom NS1-Polypeptid abgespalten und zur Zelloberfläche transportiert werden sollte. Der Plasmidklon wurde zur Synthese von chimärischen RNA verwendet, die in Verozellen transfiziert wurden, um die rekombinanten Influenzaviren zu retten. In der funktionellen Karte des gentechnisch veränderten NS1-Proteins der vorliegenden Erfindung (1) ist angedeutet, dass die Einfügungen an der aa-Position 124 erfolgen und danach ein Stopp-Codon eingefügt wird, das die Wirkung hat, dass der verbleibende benachbarte Abschnitt des NS1-Gensegments (einschliesslich der Effektordomäne) nicht übersetzt wird. Aus 2 wird verständlich, wie die erwünschten antigenen oder anderweit heterologen Sequenzen (zum Beispiel gp-41- und IL-1β-Sequenzen) angeordnet werden können, um immunogene Konstrukte zu liefern, die nach der Transfektion in einen geeigneten viralen Vektor, bevorzugt ein kälte-adaptiertes Influenzavirus, die Grundlage für einen wirksamen Impfstoff gegen verschiedene Infektionskrankheiten bilden könnten. Analog zeigt 3 die Anordnung der Einfügung von aa70-206 des Nef-Proteins HIV-1 NL4-3 im NS1-Protein des geretteten Influenza-Transfektanten PR82Anef (PR8/Nef).
Allgemein zeigten die Versuche die Tendenz, dass die Länge der heterologen Einfügung(en) dem Grad der Abschwächung des sich ergebenden Virenstammes direkt proportional war. Ausserdem übertraf das immunogene Potential der Expressionsprodukte längerer Einfügungen gewöhnlich das kürzerer Einfügungen. Gemäss vorliegender Erfindung wird daher bevorzugt, Einfügungen zu machen, die mindestens etwa 80 Aminosäuren kodieren.
Um das chimärische Aichi/NS-Nef-Virus herzustellen, wurden die das rekombinante NS-Segment des PR8/NS-Nef-Virus darstellenden RNA durch an Verozellen ausgeführtes genetisches Standard-Reassortment in das Genom des Influenza-A/Aichi/1/68-(H3N2)-Virus eingeführt, wobei zur Selektion hyperimmunes polyklonales anti-PR8-Virus-Serum vom Kaninchen eingesetzt wurde. Die Genotypisierung der Reassortanten wurde mit RT-PCR-Amplifikation und vergleichender Restriktionsanalyse von cDNA-Kopien ausgeführt, die von jedem Genomsegment abgeleitet waren.
Beispiel 2: Transfektion rekombinanter Viren in Verozellen
Synthetische Negativ-Sense-RNA sind durch T3-Transkription in Gegenwart von gereinigtem viralem RNP aus Plasmidklonen abgeleitet worden. Verozellen waren im Voraus mit dem reassortanten Helfer-Influenzavirenstamm 25A-1 (H1N1, Egorov und Mitautoren, 1994, Vopr. Virusol. 39 (5) 201–5) infiziert und dann durch DEAE-Dextran-Transfektion (Egorov und Mitautoren, 1998, J. Virol. 72 (8), 6437–41; Luytjes und Mitautoren, 1989, Cell 59 (6), 1107–13) mit RNA-Komplexen transfiziert worden. Gerettete transfektante Viren wurden einer Plaque-Reinigung unterworfen, dreimal auf Verozellen gereinigt, auf Verozellen amplifiziert und auf ihre biologischen Eigenschaften überprüft.
10a bis 10c zeigen die Immunfluoreszenz von Verozellen, die im Voraus mit rekombinanten RP8/Nef-Viren (MOI 0,01 in 10a, 0,1 in 10b) und mit Influenza PR8-Viren vom Wildtyp (10c) infiziert worden waren. Die Zellen wurden 24 Stunden nach der Infizierung trypsinisiert und mit 100% Aceton auf Abdeckgläsern fixiert. Nach mehreren Waschschritten in PBS wurden die Gläser während 40 min bei 37°C mit einer 1 : 50-Verdünnung von monoklonalem Anti-Nef-(aa179-195-Epitop)Mausantikörper inkubiert, dann zweimal mit PBS gewaschen und mit einer 1 : 100-Verdünnung von konjugiertem IgG-FITC-Ziege-Antimaus-Antikörper inkubiert.
Beispiel 3: Immunisierung von BALB/c-Mäusen
Gruppen von je drei BALB/c-Mäusen wurden mit 2 bis 5 × 10⁵ PFU der Influenzaviren PR8/Nef, Aichi/Nef, PR8-124 je Maus bzw. mit 4 × 10⁴ PFU von PR8wt je Maus immunisiert, wie in 5 angedeutet. Milzzellen wurden neun Tage danach von immunisierten Mäusen gewonnen und als Effektorzellen im ELISPOT-Test verwendet. 5 zeigt die Anzahl von IFN-γ sekretierenden Zellen, die je 10⁶ Milzzellen gefunden wurde, nachdem die immunen Milzzellen in Gegenwart von EWRFDSRLAFHHVAREL-Peptid (Nef-Peptid), TYQRTRALVRTMGD-Peptid (NP-Peptid) oder ohne Peptid inkubiert worden waren. Die Ergebnisse sind als das Mittel ± SEM (Standardfehler) von Duplikatkulturen ausgedrückt.
Gruppen von je drei BALB/c-Mäusen wurden mit 2 bis 5 × 10⁵ PFU der Influenzaviren PR8/Nef, Aichi/Nef, PR8-124 je Maus bzw. mit 4 × 10⁴ PFU von PR8wt je Maus immunisiert, wie in 6 angedeutet. Einfache Zellsuspensionen von den die Atemwege entwässernden Lymphknoten von immunisierten Mäusen wurden neun Tage danach gewonnen und als Effektorzellen im ELISPOT-Test (Power und Mitautoren, J. Immunol. Methods 227: 99–107) verwendet. Kurz gesagt, wurden dreifache serielle Verdünnungen von Zellpopulationen, die von Mäusemilzen, entwässernden Lymphknoten und Urogenitaltrakten abgeleitet worden waren, zu mit IFN-γ mAb (R4-6A2; BD PharMingen) beschichteten Titerplattenlöchern überführt. Die Zellen wurden während 22 Stunden bei 37°C und 5% CO₂ in Gegenwart von synthetischen Peptiden in einem DMEM-Medium inkubiert, das 10% FCS, IL-2 (30 E/ml), Penicillin, Streptomycin und 30 μM 2-ME enthielt. Ein biotinyliertes Anti-IFN-γ mAb (XMG1.2; BD PharMingen) wurde als ein konjugierter Antikörper eingesetzt, dann wurden die Platten mit Streptavidinperoxidase (0,25 E/ml; Boehringer Mannheim Biochemica) inkubiert. Punkte, die IFN-γ sekretierende CD8+-Zellen darstellten, wurden entwickelt, indem als Substrat 3-Amino-9-ethylcarbazol (Sigma) in 0,1 M Natriumacetat von pH 5,0 in Gegenwart von Wasserstoffperoxid eingesetzt wurde. Die Punkte wurden mit Hilfe eines Präparationsmikroskops ausgezählt, die Ergebnisse wurden als Mittel der Anzahl von IFN-γ sekretierenden Zellen ± SEM von Triplikatkulturen ausgedrückt. In Abwesenheit von synthetischen Peptiden inkubierte Zellen entwickelten < 10 Punkte je 10⁶ Zellen. Da die Erschöpfung des Vorrats an CD8+-Zellen gewöhnlich zu einer > 92-%igen Verringerung der Punktebildung führte, wurde in den meisten Tests eine Zelltrennung unterlassen. 6 zeigt die Anzahl von IFN-γ sekretierenden Zellen, die je 10⁶ Milzzellen gefunden wurde, nachdem die immunen Milzzellen in Gegenwart von EWRFDSRLAFHHVAREL-Peptid (Nef-Peptid), TYQRTRALVRTMGD-Peptid (NP-Peptid) oder ohne Peptid inkubiert worden waren.
Aus 4, die die Replikation der chimärischen Influenza/Nef-Viren in den unteren Atemwegen von Mäusen zeigt, wird verständlich, dass die PR8/Nef- und Aichi/Nef-Viren in diesem Gewebe nicht replizierten, also stark abgeschwächt waren, während sie gleichzeitig für die Mäuse hoch immunogen waren, indem sie starke T- und B-Zellen-Immunantworten hervorriefen (wie in 5, 6 und 7 gezeigt). Um die für die Einfügung (Nef-Peptid) und den Vektor (NP-Peptid) spezifischen CD8+-T-Zellenantworten zu charakterisieren, wurden weibliche BALB/c-Mäuse einmal oder zweimal i.n. ohne Narkose mit 10⁶ PFU des PR8/NS-Nef-, Aichi/NS-Nef-, PR8/NS-124- bzw. PR8wt-Virus pro Tier immunisiert.
Drei BALB/c-Mäuse je Gruppe wurden einmal oder zweimal i.n. ohne Anästhesie mit 10⁶ PFU von Influenza PR8/NS-Nef, Aichi/NS-Nef, PR8/NS-124 bzw. PR8wt je Maus immunisiert, wie in 11 angedeutet. Die Boost-Immunisierung erfolgte 21 Tage nach der ersten Immunisierung. Die 10 Tage nach Immunisierung von Mäusemilzen gewonnenen Einzelzellsuspensionen wurden in einem ELISPOT-Test auf Nef-Peptid-spezifisch (A) oder NP-Peptid-spezifisch (B) IFN-γ sekretierende CD8+-T-Zellen analysiert. 11 zeigt die mittlere Anzahl von antigen-spezifisch IFN-γ sekretierenden Zellen ± SEM von Triplikatkulturen.
Die Atemwege entwässernde Lymphknoten (mediastinale und postbronchiale Lymphknoten) wurden 10 Tage nach der Immunisierung von immunisierten BALB/c-Mäusen gesammelt, wie in 11 beschrieben. Einzelzellsuspensionen wurden in einem ELISPOT-Test auf Nef-Peptid-spezifisch (A) oder NP-Peptid-spezifisch (B) IFN-γ sekretierende CD8+-T-Zellen analysiert. 12 zeigt die mittlere Anzahl von antigen-spezifisch IFN-γ sekretierenden Zellen ± SEM von Triplikatkulturen.
Drei BALB/c-Mäuse je Gruppe wurden zweimal i.n. ohne Anästhesie mit 10⁶ PFU von Influenza-PR8/NS-Nef-, Aichi/NS-Nef- bzw. PR8/NS-124-Viren je Maus immunisiert, wie in 13 angedeutet. Die Boost-Immunisierung erfolgte 21 Tage nach der ersten Immunisierung. Die 10 Tage nach der zweiten Immunisierung aus digerierten Urogenitaltrakten (Scheide, Gebärmutterhals, Gebärmutterhorn und Harnröhren) von immunisierten Mäusen gewonnenen Einzelzellsuspensionen wurden in einem ELISPOT-Test auf Nef-Peptid-spezifisch (A) oder NP-Peptid-spezifisch (B) IFN-γ sekretierende CD8+-T-Zellen analysiert. 13 zeigt die mittlere Anzahl von antigen-spezifisch IFN-γ sekretierenden Zellen ± SEM von Triplikatkulturen.
Einmal entweder mit PR8/NS-Nef- oder mit Aichi/NS-Nef-Viren immunisierte Mäuse induzierten eine signifikante Anzahl von Nef-Peptid-spezifischen CD8+-T-Zellen in Einzelzellsuspensionen, die von Milzen (139 ± 4 Punkte in PR8/NS-Nef-immunisierten Mäusen; 137 ± 39 Punkte in Aichi/NS-Nef-immunisierten Mäusen; 11B) und Lymphknoten (173 ± 23 Punkte in PR8/NS-Nef-immunisierten Mäusen, 160 ± 25 Punkte in Aichi/NS-Nef-immunisierten Mäusen; 12B) abgeleitet waren. Keine erhebliche Nef-Peptid-spezifische CD8+-T-Zellenantwort wurde in den beiden Abteilungen von Mäusen festgestellt, die mit PR8/NS-124- oder PR8wt-Viren immunisiert worden waren (die Anzahl der Punkte war immer kleiner als 13; 11B und 12B).
Beim Vergleich der vektor-(NP-Peptid-)spezifischen CD8+-T-Zellenantworten wurde eine ähnliche Anzahl von spezifischen CD8+-Milzzellen in allen geprüften Mäusegruppen gefunden (11A). Im Gegensatz zur systemischen Abteilung (Milzen) wurden signifikante Unterschiede in den mit Schleimhaut assoziierten Atemwege-Lymphknoten gefunden. Der replikationskompetente PR8/NS-124-Virus induzierte eine deutlich höhere Frequenz von NP-Peptid-spezifischen CD8+-T-Zellen, während rekombinante Influenza/NS-Nef-Viren und der pathogene PR8wt-Virus geringere Grössenordnungen von NP-Peptid-spezifischen CD8+-T-Zellen induzierten (12A).
In 7, die die Nef-spezifischen Serum-IgG-Immunantworten von mit rekombinanten Influenza/Nef-Viren immunisierten Mäusen zeigt, wurde gefunden, dass die auf eine zweite und dritte Immunisierung folgenden Immunantworten der B-Zellen am stärksten in dem Falle waren, in denen die Mäuse zweimal mit PR8/Nef und danach in einer dritten Immunisierung mit Aichi/Nef immunisiert worden waren, während die Antwort bei zwei Immunisierungen mit PR8-124-Virus weniger auffällig war.
Des Weiteren wurde eine Gruppe von Mäusen i.n. zuerst mit dem PR8/NS-Nef-Virus immunisiert und erhielt dann 21 Tage später eine Boost-Immunisierung mit dem Aichi/NS-Nef-Virus. Eine weitere Gruppe von Mäusen wurde mit den gleichen Viren immunisiert, aber in der umgekehrten Reihenfolge. In 11 und 12 gezeigte Daten deuten darauf hin, dass die Reihenfolge, in der die betreffenden rekombinanten Vektoren für eine erste und eine Boost-Immunisierung verwendet wurden, entscheidend zu sein scheint, da einheitlich beobachtet wurde, dass eine erste Immunisierung mit Aichi/NS-Nef (H3N2), gefolgt von einer Boost-Immunisierung mit PR8/NS-Nef (H1N1) eine signifikant niedrigere Anzahl (ungefähr im Bereich der primären CD8+-T-Zellenantwort) der Nef-Peptid-spezifischen und NP-Peptid-spezifischen CD8+-T-Zellen in Milzen und entwässernden Lymphknoten induzierte als bei der umgekehrten Reihenfolge der Immunisierung. Eine starke sekundäre antigen-spezifische CD8+-T-Zellenantwort wurde in beiden geprüften Abteilungen nach einer ersten Immunisierung der Mäuse mit rekombinantem RP8/NS-Nef-(H1N1-)Vektor, gefolgt von einer Boost-Immunisierung mit dem H3N2-Vektor des Aichi-NS/Nef-Subtyps, gefunden. In diesem Fall waren die Nef- und NP-Peptid-spezifischen sekundären Antworten ungefähr 1,5 bis dreimal höher als nach einer einzelnen Immunisierung (11 und 12).
Aus den Urogenitaltrakten abgeleitete Einzelzellsuspensionen wurden von immunisierten Mäusen gewonnen. Zwei Immunisierungen waren erforderlich, ehe eine signifikante Anzahl von Nef-Peptid-spezifischen CD8+-T-Zellen nachgewiesen werden konnte. Die stärkste Nef-Peptid-spezifische CD8+-T-Zellenantwort wurde gefunden, wenn die Mäuse eine erste i.n. Immunisierung mit PR8/NS-Nef-(H1N1-)Virus und danach eine Boost-Immunisierung mit dem Aichi/NS-Nef-(H3N2-)Virus erhielten (342 ± 18 IFN-γ sekretierende Zellen je 10⁶ Zellen; 13B). Es wurde gefunden, dass das gleiche Immunisierungsprotokoll auch die stärkste NP-Peptid-spezifische CD8+-T-Zellenantwort induziert (13A).
Wie für den Nachweis der T-Zellen-Antworten beschrieben, wurden Mäuse benutzt, um die Nef-spezifische Serum-Antikörperantwort zu beurteilen. Mäuse erhielten eine erste Immunisierung i.n. mit 10⁶ PFU/ml, entweder des PR8/NS-Nef-(H1N1-) oder des Aichi/NS-Nef-(H3N2-)Virus, und drei Wochen später eine Boost-Immunisierung mit dem gleichen Vektor. Die dritte Immunisierung erfolgte nach weiteren drei Wochen mit dem Vektor eines anderen Subtyps. Die Kontrollgruppe wurde dreimal mit dem PR8wt-Virus immunisiert. Die Reaktivitäten der Serummuster (gewonnen zwei Wochen nach der dritten Immunisierung) mit dem GST-Nef-Fusionspeptid wurden durch ELISA bestimmt und sind in 14 gezeigt. Nef-spezifische Antikörper wurden nur in Gruppen von Mäusen gefunden, die aufeinanderfolgend mit dem H1N1- und dem H3N2-Vektor immunisiert worden waren (14). Das höchste Niveau von Nef-spezifischem IgG wurde in Mäusen gefunden, die zweimal i.n. mit 10⁶ PFU des RP8/NS-Nef-(H1N1-)Virus immunisiert worden waren und eine Boost-Immunisierung mit 10⁶ PFU des Aichi/NS-Nef-(H3N2-)Virus erhalten hatten, verglichen mit der Kontrollgruppe, die dreimal i.n. mit PR8wt-Virus immunisiert worden war (14).
Beide Influenzavirusvektoren (PR8/NS-Nef und Aichi/NS-Nef) waren in Mäusen vollkommen abgeschwächt, da keine viralen Titer im Atemwegegewebe der Mäuse nachgewiesen werden konnten. Diese abgeschwächten Phänotypen der beiden rekombinanten Viren weisen darauf hin, dass die Einführung von zusätzlichen Aminosäuren abwärts von der Position 125 des NS1-Proteins gewisse Funktionen des NS1-Proteins beeinträchtigen kann, da PR8/NS-124-Viren, die die gleiche Grösse des NS1-Proteins kodieren, in den Atemwegen von Mäusen wirksam wuchsen (4). Die geringe Wirksamkeit der 2A-Stelle insbesondere im späten Stadium der Infektion, Nef-Antigen vom N-endständigen Teil des NS1-Proteins abzuspalten, könnte für die zusätzliche Abschwächung verantwortlich sein, obwohl eine direkte Wirkung des mit bestimmten intrazellulären Komponenten wechselwirkenden Nef-Polypeptids nicht ausgeschlossen werden kann.
Die Daten weisen darauf hin, dass völlig abgeschwächte rekombinante Influenza/NS-Nef-Viren in der Lage sind, in Milzen und in den die Atemwege entwässernden Lymphknoten von i.n. ohne Anästhesie immunisierten Mäusen eine primäre CD8+-T-Zellenantwort zu induzieren, die auf das eingefügte Nef-Polypeptid gerichtet ist. Gleichzeitig lagen die vektor-(NP-Peptid-)spezifischen CD8+-T-Zellenantworten in den Milzen und entwässernden Lymphknoten von Mäusen, die i.n. entweder mit dem PR8/NS-Nef- oder dem Aichi/NS-Nef-Vektor immunisiert worden waren, im Bereich der durch den virulenten PR8wt-Virus induzierten, obwohl die stärkste NP-Peptid-spezifische CD8+-T-Zellenantwort, die in entwässernden Lymphknoten nachgewiesen wurde, in Mäusen gefunden wurde, die mit dem PR8/NS-124-Virus immunisiert worden waren, der in der Lunge wirksam repliziert.
Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass es möglich ist, eine ähnliche Wirkung unter Einsatz von Influenzavektoren zu erzielen, die zu unterschiedlichen antigenen Subtypen gehören. Es ist wichtig, dass Influenzavirusvektoren in der Lage sind, eine CD+-T-Zellenantwort zu induzieren, wobei eine durch einen anderen Influenzaviren-Subtyp verursachte, schon existierende Immunität umgangen wird.
Das immunogene Potential von abgeschwächten Influenza/NS-Nef-Vektoren kann vielleicht durch die Tatsache erklärt werden, dass Viren, die verkürzte Formen des NS1-Proteins enthalten, hohe Spiegel des Typ-1-Interferons in vivo induzieren. Nef-exprimierende Vektoren ebenso wie PR8/NS-124-Viren induzieren nach einer Immunisierung von Mäusen signifikant höhere Spiegel des Typ-1-Interferons im Serum als die entsprechenden Mutterviren vom Wildtyp (Daten nicht gezeigt).
Beispiel 4: Plaquereduktionstest
MDCK-Zellen wurden während 24 Stunden mit einem Überstehenden von MDCK-Zellen behandelt, die mit delNS-Viren infiziert worden waren (das gleiche Konstrukt wie in WO 99/64571 offenbart, d.h. gänzliche NS1-Deletion enthaltend), die als potente IFN-α/β-Induzierer bekannt sind (8). Der Gehalt an IFN-α/β wurde nach einer Behandlung über Nacht mit pH 2 zu 100 Einheiten geschätzt. Die Ergebnisse in 8 sind als der Logarithmus der plaque-bildenden Einheiten (PFU) angegeben und reflektieren die Unterschiede in den viralen Titern zwischen unbehandelten Zellen und Zellen, die mit IFN-α/β behandelt worden waren.
Beispiel 5: Interferoninduktion
MDCH-Zellen wurden während 24 Stunden mit 5 MOI verschiedener Influenzaviren infiziert, wie in 9 umrissen. Die Überstehenden wurden über Nacht zur Vireninaktivierung bei 4°C mit pH 2 behandelt. Die behandelten Überstehenden wurden mit 1 N NaOH auf pH 7,4 eingestellt. Zweimalige serielle Verdünnungen dieser Überstehenden wurden während 24 Stunden auf MDCK-Monoschichten gegeben, und 50 PFU des vesikulären Stomatitisvirus (VSV) wurden dann pro Titerplattenloch hinzugefügt. Die Ergebnisse stellen die Verdünnung des Überstehenden dar, bei der sich die VSV-Plaquebildung um 50% verringert hatte.
Beispiel 6: Verfahren zur beschleunigten Herstellung von rekombinanten Viren und antiviralen Impfstoffen
a) Erzeugung rekombinanter Zelllinien, die modifiertes NS-Gen produzieren:
Ein Plasmidvektor wurde in Übereinstimmung mit der schematischen Darstellung in 15 konstruiert. Das NS-Gen wurde in die Hauptkette eines pS65T-C1-Vektors (Clontech) geklont, wobei der CMV-Promotor verwendet wurde, um die Transkription zu initiieren. Eine Einfügung von NS in der umgekehrten Ausrichtung (das 3'-Ende zum CMV-Promotor hin) führt zur Transkription von Minus-Sense-RNA. Die Transkription wird durch eine Häpatitis-δ-Virus-(HDV-)Sequenz beendet, die eine selbstspaltende RNA-Stelle einschliesst. Dieser Vektor enthält folglich ein Influenza-A-NS-Gen, wo die Kassette der Mehrstopp-Codons an der nt-Position 140 so eingeführt worden ist, dass eine Translation dieses Gens (Leseraster 3) zu einer verkürzten Form des NS1-Proteins (mit nur 38 Aminosäuren) führt. Es wurde gefunden, dass Influenza-A-Viren, die ein so kurzes NS1-Protein exprimieren, in Tieren stark abgeschwächt sind (Egorov und Mitautoren, 1998, J. Virol. 72 (8) Seite 6473).
Sequenz von HDV (85 nt):
Sequenz von PR8NS38 (906 nt):
Dieser Plasmidvektor wurde für die Transfizierung verwendet, um Verozellen zu transformieren. Vor der Transfizierung wurden Zellen in geeigneten Zellkulturgefässen (z.B. 25 cm) ausgesät und bei 37°C inkubiert, bis sie eine Konfluenz von etwa 50% erreicht hatten. Um die Transfektionswirkung zu verbessern, können die kationischen Lipidreagentien (Lipofectin, Lipofectamin 2000) in einem Medium ohne Serum vorinkubiert werden, ehe es mit den Plasmid-DNA gemischt wird. Entsprechend wurden 2 bis 6 μl des kationischen Lipidreagens in 100 μl serumfreiem OPTI-MEM I-Transfektionsmedium verdünnt und 30 min bei Zimmertemperatur inkubiert. In der Zwischenzeit wurden 1 bis 2 μg DNA in 100 μl OPTI-MEM I verdünnt, dann mit der Lipidlösung vermischt und 15 min bei Zimmertemperatur inkubiert. Während sich die DNA-Lipid-Komplexe bildeten, wurden die Zellen zweimal mit serumfreiem Transfektionsmedium gewaschen, um restliche Proteine zu entfernen. Der Transfektionscocktail wurde mit Transfektionsmedium auf ein Gesamtvolumen von 1 ml verdünnt und zu den Zellen hinzugefügt. Die Zellen wurden während 5 bis 8 Stunden bei 37°C mit 7% CO₂ inkubiert. Danach wurde das Überstehende der Zellkultur entfernt, und die Zellen wurden mit normalem Kulturmedium gefüttert. Stabile Transfektanten wurden 24 Stunden nach der Transfizierung durch Hinzufügen eines Selektionsmediums ausgewählt, das Geneticinsulfat G418 (400 μg/ml) enthielt. Drei Wochen später traten stabile Transfektanten auf, die durch Grenzverdünnungen subkloniert wurden. Verschiedene Subklone wurden auf ihre Fähigkeit geprüft, das ts-Helfervirus (25A-1-Mutant, ein reassortantes Virus, worin das für den ts-Phänotyp verantwortliche NS-Gen vom kälte-adaptierten Influenzastamm A/Leningrad/134/47/57 stammt, während die übrigen Gene vom PR8-Virus stammen; Egorov und Mitautoren, 1994, Vopr. Virusol. 39: 201–205) bei einer Temperatur von 40°C zu retten. Zu diesem Zweck wurden die Zellen mit dem 25A-1-Mutanten infiziert und während 72 Stunden bei 40°C inkubiert. Diejenigen Subklone, die eine virale Nachkommenschaft lieferten, die Influenzaviren enthielten, die das rekombinante NS-Gen trugen, wurden ausgewählt und unter Bedingungen vermehrt, unter denen ein wirksames Zellenwachstum möglich ist.
b) Produktion von rekombinanten Influenzaviren und Impfstoff:
Umgewandelte Zellen, die ein modifiziertes NS-Gensegment exprimieren, das ein verkürztes NS1-Gen mit oder ohne Einfügungen bevorzugt wie hier zuvor beschrieben umfasst, werden unter den oben beschriebenen Bedingungen mit einem gewünschten Influenzavirus und insbesondere mit einem epidemischen Virus vom Wildtyp infiziert und inkubiert, um die Entwicklukng einer viralen Nachkommenschaft zu ermöglichen, in der das NS-Gen vom Wildtyp durch das rekombinante modifizierte NS-Gen ersetzt ist, das durch die transformierten Wirtszellen geliefert wird. Die virale Ausbeute kann mit Plaque-Verfahren (zum Beispiel negativen Kolonien unter einer Agar-Schicht) auf eine normale Verozelllinie geklont werden, und jede virale Kolonie kann mit der RT-PCR-Methode und/oder anderen Methoden (je nachdem wie das Gen modifiziert worden war) auf das Vorhandensein des modifizierten rekombinanten NS-Gens hin überprüft werden. Positive virale Plaques werden dann durch weitere Plaquereinigungsschritte gereinigt. Schliesslich sind die rekombinanten Influenzastämme wegen des abgekürzten NS-Proteins stark abgeschwächt. Sie dienen als Impfstoffkandidaten und werden zur raschen Herstellung von stark abgeschwächten lebenden Influenza-Impfstoffen bevorzugt unter Verwendung IFN-armer Substrate wie Verozellen, junger Hühnerembryonen (weniger als zehn Tage alt) und dergleichen) vermehrt.
Es wird aber darauf hingewiesen, dass das in diesem Beispiel beschriebene Verfahren nur eine Möglichkeit darstellt, das zugrunde liegende allgemeine Konzept der Herstellung und Etablierung von Säugerzelllinien und insbesondere von immortalisierten oder kontinuierlichen Zelllinien beispielhaft zu belegen, die nach der Transformation mit beliebigen erwünschten viralen Gensequenzen diese Sequenzen stabil integrieren und exprimieren und so eine verhältnismässig einfache und rasche Auslegung und Herstellung von reassortierten rekombinanten Viren beliebigen Urspungs ermöglichen.
ABKÜRZUNGEN

aa

amino acid = Aminosäure

CMV

Cytomegalovirus

CTL

zytotoxischer T-Lymphozyt

gp

Glykoprotein

HA

Hämagglutinin

IFN

Interferon

Ig

Immunoglobulin

IL

Interleukin

i.n.

intranasal

mAb

monoclonal antibody = monoklonaler Antikörper

MHC

major histocompatibility complex = Haupthistokompatibilitätskomplex

NA

Neuramidase

nef

negativer Faktor von HIV

NP

Nukleoprotein

NS

nichtstrukturell

ORF

open reading frame = offener Leseraster

RNP

Ribonukleoprotein

SIV

simian immunodeficiency virus = Affen-Immunschwächevirus

ts

temperature sensitive = temperaturempfindlich

v

viral

VSV

vesikulärer Stomatitisvirus

wt

Wildtyp

Claims

Gentechnisch verändertes Influenzavirus mit einem modifizierten NS-Gensegment, das eine Bindungsdomäne für funktionelle RNA und eine Gensequenzmodifizierung am NS1-Gen besitzt, wobei diese Modifizierung eine Translation des verbleibenden NS1-Genabschnitts verhindert, dadurch gekennzeichnet, dass die Modifizierung bei der Aminosäureposition 124 vorliegt und das Virus zu einem Interferon induzierenden, aber gegenüber Interferon unempfindlichen Phänotyp macht, dessen Natur sich durch seine Fähigkeit bestätigt, eine Interferonantwort in MDCK-Zellen und in Hühnerembryos zu induzieren sowie auf diesen MDCK-Zellen und auf diesen Hühnerembryos zu wachsen, und worin die Modifizierung eine Einfügung einer heterologen Nukleotidsequenz bei der der Aminosäureposition 124 entsprechenden Nukleotidposition 400 (gezählt auf der Basis des Influenza A/PR/8/34-Virus) umfasst, die ein Antigen oder Pathogen zur Induktion einer Immunantwort von B- und/oder T-Zellen gegen dieses Antigen oder Pathogen kodiert.
Gentechnisch verändertes Influenzavirus nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Einfügung eine Sequenz von mindestens 80 Aminosäuren kodiert.
Gentechnisch verändertes Influenzavirus nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Modifizierung eine Einfügung von zumindest einer Sequenz umfasst, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einer 2A-Selbstspaltungsstelle, einer Gensequenz aus HIV-1-nef, den die ELDKWA- oder ELDKWAS-Epitope von HIV-1-gp41 kodierenden Sequenzen, der IL-1β oder einen Teil davon kodierenden Sequenz, einer Leitersequenz oder einer Ankersequenz besteht.
Impfstoff, zumindest ein gentechnisch verändertes Influenzavirus umfassend, das in einem der Ansprüche 1 bis 3 definiert ist, in einer geeigneten pharmazeutischen Formulierung.
Impfstoff nach Anspruch 4, worin das Virus ein abgeschwächtes, insbesondere ein lebend abgeschwächtes und kälteadaptiertes rekombinantes Influenzavirus ist.
Impfstoff nach Anspruch 4 oder 5, das eine zytotoxische T-Lymphozyten-(CTL-)Antwort induziert.
Impfstoff nach einem der Ansprüche 4 bis 6 zur Verwendung gegen Grippe- oder HIV-1-Infektion.
Verfahren zur Herstellung des in Anspruch 1 beanspruchten, rekombinanten Influenzavirus, die Schritte umfassend: Transformation einer Säugerzelle mit einem DNA-Vektor, der ein modifiziertes NS-Gen-Segment des Influenzavirus umfasst, wie in Anspruch 1 definiert, Auswahl transformierter Zellen, die das modifizierte virale Gensegment exprimieren, Infizierung der ausgewählten Zellen mit einem erwünschten Influenzavirus, Inkubation der infizierten Zellen, um die Entwicklung von Nachkommenviren zu ermöglichen, die das modifizierte virale Gensegment enthalten, sowie Auswahl und Ernte der das modifizierte virale Gensegment enthaltenden Nachkommenviren, dadurch gekennzeichnet, dass die Transformation der Säugerzelle erreicht wird durch Mischen des genannten DNA-Vektors mit Lipiden, um eine Selbstorganisation des Lipids und der DNA zu Lipid-DNA-Komplexen zu ermöglichen, und Inkubation der Säugerzellen in Gegenwart der Lipid-DNA-Komplexe, was zu einer Aufnahme der Lipid-DNA-Komplexe in die Zellen führt.
Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das erwünschte Influenzavirus ein epidemischer Stamm vom Wildtyp ist.
Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass der DNA-Vektor ein Transkriptionssystem für Minus-Sense-Influenza-RNA ist.