CN103228293A - 用于在哺乳动物中预防和治疗金迪普拉病毒感染的疫苗制剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及能够在人类和其他哺乳动物宿主中引发针对金迪普拉病毒感染的保护性免疫反应的药物制剂。免疫原性制剂包括作为重组蛋白从宿主细胞表达和纯化的金迪普拉病毒糖蛋白(G蛋白)和/或核蛋白。包含该重组蛋白的疫苗组合物引发中和抗体，类似于在稳定的制剂中的纯化的灭活金迪普拉病毒的疫苗组合物。公开了灭活金迪普拉病毒用作候选疫苗的方法。此疫苗组合物与增强免疫反应的佐剂一起配制。本发明中公开的疫苗组合物是高度免疫原性的并且在哺乳动物宿主中引发保护性免疫反应。此免疫原性组合物配制为用于向人类体内施用。此免疫原性制剂还可用于此病毒的存在的诊断。

Description

用于在哺乳动物中预防和治疗金迪普拉病毒感染的疫苗制剂

发明领域

本发明涉及用于在哺乳动物中预防和治疗金迪普拉病毒感染的疫苗制剂。更具体地，本发明提供用于向人类施用的免疫原性制剂，包含在稳定制剂中的经热、紫外线、伽玛辐照或化学灭活的金迪普拉病毒的完整病毒粒子或其纯化的病毒抗原。

发明背景

金迪普拉病毒(Chandipura virus，CHPV)是单股负链RNA病毒目(Mononegavirales)、弹状病毒科(Rhabdoviridae)、水泡性病毒属(Vesiculovirus)的成员。CHPV基因组结构与充分表征的水疱性口炎病毒(Vesiculo stomatitis virus，VSV)的相似。CHPV感染在儿童中引起通常是致命的脑炎。临床症状包括高烧、头痛、嗜睡、呕吐和导致昏迷的抽搐。因为尚没有对此病毒感染的疗法，多数患者住院24-48小时内死亡。

1965年在Nagpur高热疾病的爆发期间，金迪普拉病毒(CHPV)首次从患者的血清样本中分离出来。2003年，当此病毒在Andhra Pradesh(Rao等人，2004)和Maharashtra州引起大规模脑炎爆发时，CHPV首次获得公共卫生重要性。由CHPV引起的致死率在Andhra Pradesh州高达55％(Rao等人.2004)。据报道在印度Gujarat发生流行(Chadha等人.2005)期间的死亡率是78.4％的致命性。从那时起，此病毒感染已经再发生流行，并表现为广泛分布，如血清学调查在遍及印度以及也在斯里兰卡和非洲的人类和家养动物中鉴定到针对CHPV的中和抗体。此病毒还已从印度(Geevarghese等人.2005)和西非(Fontenille等人.1994)的白蛉(sandflies)中分离出。

没有可用于预防此病毒感染的疫苗。CHPV具有非分段的～11kb的负链RNA基因组。此病毒基因组的转录由病毒RNA依赖性RNA聚合酶所编码。CHPV基因组编码四种主要蛋白质，核衣壳蛋白(N蛋白)、磷蛋白(P蛋白)、基质蛋白(M蛋白)、糖蛋白(G蛋白)和大蛋白(L蛋白)。N蛋白衣壳化基因组RNA以保护它免受细胞RNA酶。所有弹状病毒的糖蛋白是N-糖基化I类跨膜蛋白，其在病毒表面上形成三聚体刺突。此由糖蛋白形成的刺突介导病毒向细胞受体的附着以便介导内吞作用以及与细胞膜的融合。糖蛋白引发中和抗体并且已被证明在小鼠中对大脑内此病毒的攻击提供保护效果(Venkateswarlu和Arankalle，2009)。对于预防金迪普拉病毒感染没有商业上可用的疫苗。对于CHPV感染的治疗没有特异性的疗法。

金迪普拉糖蛋白(G蛋白)是高免疫原性的并且提供针对金迪普拉病毒感染的保护性免疫反应。CHPV G蛋白已经作为分泌蛋白在杆状病毒感染的昆虫细胞中表达和纯化(Venkateswarlu和Arankalle，2009)。为了工业规模生产疫苗用杆状病毒介导重组蛋白的表达是昂贵的。至今，没有太多来源于杆状病毒感染的昆虫细胞的产品被商品化，把儿科部分作为目标的疫苗更是这样。因此，没有向是此疫苗的主要目标的婴儿和儿童施用杆状病毒来源疫苗的足够的安全记录。

我们用酵母，特别是巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)作为金迪普拉糖蛋白(G蛋白)的表达系统，其提供了明显的经济优势，因为它适合于生产低成本和高效的疫苗。有很好的安全纪录，由于来源于酵母包括巴斯德毕赤酵母的许多商用产品已经被成功地商业化了。由来源于作为表达系统的巴斯德毕赤酵母的乙型肝炎小抗原组成的重组疫苗Revac-Bmcf已经被成功地商业化为用于两岁以下儿童的疫苗。没有可获得的信息表明杆状病毒-昆虫细胞来源的G蛋白在其效能上与完整病毒粒子疫苗是否是相当的。在本发明中，已经将重组毕赤酵母来源的G蛋白疫苗的效能与灭活的金迪普拉病毒完整病毒粒子疫苗比较，以研究它们是否引发可比较水平的中和抗体并且提供针对病毒攻击的保护效能。这个信息非常重要，因为从在表达其的宿主细胞纯化的任何重组抗原应该被假定可与完整病毒粒子疫苗同样有效地引发中和抗体的构象。为了比较这些结果，得到灭活的完整病毒粒子疫苗所采用的方法也很重要，例如，灭活剂的选择、将病毒暴露于灭活剂的时间和温度、和对完整病毒的完整性不是有害的病毒纯化的方法。在本发明中描述了金迪普拉病毒灭活的不同的方法。使用金迪普拉病毒的灭活的完整病毒粒子作为一种非常有前景的候选疫苗是本发明的一个方面。

本发明的一个方面描述了在酵母和大肠杆菌(E.coli)中表达金迪普拉病毒的亚基抗原，重组CHPV G蛋白的纯化以及制备适合作为疫苗施用的稳定药物组合物和/或制剂，以及任选地与CHPV核蛋白和其他细菌的和/或病毒的蛋白组合。本组合物和方法对在哺乳动物中、特别是在人类中预防、治疗性治疗(therapeutic treatment)和诊断金迪普拉病毒感染是有用的。进一步，在疫苗制剂中，通过加入药学上可接受的赋形剂赋予增强的稳定性和延长的保存期限。赋形剂选自包括以下的列表：糖、糖醇、氨基酸、人类血清白蛋白和高分子量聚合物。

所有抗原性制剂的免疫原性通过加入佐剂被进一步增强。

发明目的

本发明的主要目的是通过提供能够引发针对金迪普拉病毒感染的保护性抗体和细胞毒性T细胞应答的药物制剂提供一种针对金迪普拉病毒(CHPV)的稳定的疫苗组合物，由此如果不能完全地，至少基本上排除现有技术的缺点。

本发明的另一个目的是，提供确定序列的金迪普拉病毒抗原、特别是糖蛋白(G蛋白)以便当体内施用时引发保护性免疫反应的疫苗组合物和制备和使用方法，所述抗原从宿主细胞如酵母或大肠杆菌作为重组蛋白表达和纯化。

本发明的另一个目的是，提供确定序列的金迪普拉病毒抗原、特别是核蛋白(N蛋白)以便当体内施用时引发保护性免疫反应的疫苗组合物和制备和使用方法，所述抗原从宿主细胞如大肠杆菌细胞作为重组蛋白表达和纯化。

本发明的另一个方面是提供一种用作在人类中有效的疫苗的免疫原性制剂，其包含通过热、伽玛辐照、紫外线或通过使用灭活剂的化学方法灭活的金迪普拉病毒的完整病毒粒子，并且比较此制剂与亚基抗原的免疫原性。

本发明的另一个目的是提供带有增强此疫苗制剂的免疫原性的佐剂的疫苗组合物。

而本发明的另一个目的是，提供用于在哺乳动物特别是人类中预防、治疗性治疗和诊断金迪普拉病毒(CHPV)感染的金迪普拉病毒的方法和组合物及其亚基抗原的用途。

发明概述

本发明涉及能够引发针对金迪普拉病毒感染的保护性的抗体和细胞毒性T细胞反应的药物制剂。本发明涉及从宿主细胞作为重组蛋白表达和纯化的确定序列的金迪普拉病毒抗原的组合物和制备和使用方法。包含此抗原的组合物用于引发保护性免疫反应。这样的亚基疫苗的效能与由CHPV的完整灭活病毒粒子组成的疫苗所诱发的效能相当。金迪普拉病毒的灭活完整病毒粒子对于预防金迪普拉病毒感染是非常有效的疫苗。本发明的针对此病毒或此亚基抗原的抗体能够用于治疗和诊断金迪普拉病毒感染。纯化的重组CHPV亚基抗原，例如糖蛋白(G蛋白)，以用于人类体内施用的稳定组合物配制。包括单独地或与其他疫苗组合引发保护性抗体和细胞毒性T细胞反应的方法。

本发明的针对病毒或亚基抗原的抗体能够用于治疗和诊断金迪普拉病毒感染。

进一步，纯化的重组CHPV亚基抗原和灭活的病毒粒子以用于体内施用哺乳动物特别是人类的稳定的制剂配制。

包含CHPV病毒的完整灭活病毒粒子或亚基抗原的疫苗组合物可单独使用，或者联合其他病毒和细菌疫苗使用以获得在人类中的广谱保护性效能。包括单独或联合其他疫苗引发保护性抗体和细胞毒性T细胞反应的方法。能够联合使用的其他疫苗包括但不限于针对乙型肝炎、甲型肝炎、流感嗜血杆菌(hemophilus influenzae)、伤寒、霍乱、日本脑炎、白喉、百日咳和破伤风(DTP)的疫苗，脑膜炎球菌疫苗，任何肠道病毒疫苗例如那些针对手足口病(HFMD)、肠道病毒脑炎、肠道病毒非脊髓灰质炎样脑炎(enterovirus non-polio like encephalitis)的疫苗、MMR疫苗、骨髓灰质炎疫苗、轮状病毒疫苗、肺炎球菌疫苗等。

附图简述

图1：图1是用基因特异性引物对(1A)CHPV糖蛋白(G蛋白)基因和(1B)核蛋白(N蛋白)基因PCR扩增的图示。

图2：图2是展示纯化的金迪普拉病毒的凝胶图(2A)。

图3：图3是在诱导的不同时间间隔，巴斯德毕赤酵母中糖蛋白的表达。

图4：图4展示从巴斯德毕赤酵母纯化的重组糖蛋白。

发明详述

在本文公开了本发明的详细的实施方案，然而，应该理解公开的实施方案仅仅是本发明的示例，本发明能够以多种形式实现。因此，在本文公开的特定的结构和功能细节不被解释为限定，而仅仅作为权利要求书的基础并且作为教导本领域技术人员以几乎任何合适的详细结构来多样化地采用本发明的代表性基础。进一步，在本文所用的术语和短语不意味着限定而是提供本发明的可以理解的描述。

包膜糖蛋白(G蛋白)是金迪普拉病毒表面上的主要蛋白。G蛋白刺突是主要的抗原决定簇。因此该糖蛋白是极佳的疫苗候选物并且是为了预防CHPV感染的亚基疫苗的免疫原的选择。候选CHPV G蛋白疫苗的序列和在真核与原核细胞表达系统中克隆和表达的方法包含在本发明的范围中。真核表达系统的选择包括哺乳动物细胞、昆虫细胞中的杆状病毒、以及任何物种的酵母细胞，最优选的是巴斯德毕赤酵母或酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。

由于与其他真核表达系统相比对于大规模生产是成本有效的，巴斯德毕赤酵母作为重组表达宿主在工业规模上是有优势的。来源于巴斯德毕赤酵母的重组蛋白已经成功地商业化并且发现其对人类的使用是安全的。用除常规层析分析法、沉淀和离心技术外的专利的Himax^TM技术纯化病毒抗原帮助以成本有效的方法分离抗原，其是对人类应用安全并且在工业规模上比常规的密度梯度超速离心经济的。这还使得能够生产低成本疫苗。发现巴斯德毕赤酵母中表达的金迪普拉病毒G蛋白与完整病毒粒子疫苗具有同样的免疫原性。

编码G蛋白的基因被克隆、表达和纯化为多肽。多肽或者病毒样颗粒都能够用作疫苗候选物。它还能够作为包含CHPV糖蛋白联合CHPV核蛋白(N蛋白)和其他细菌或病毒抗原的嵌合蛋白表达。所述抗原在被施用给宿主时能够诱导强的抗体反应和细胞毒性T细胞反应。糖蛋白基因序列可以是来自病毒的天然序列或为了在合适的真核宿主如酵母细胞、特别是巴斯德毕赤酵母中表达而优化的合成的基因序列。本发明中所用的糖蛋白基因序列由为在酵母细胞中表达而优化的全长序列组成。为酵母表达的序列优化包括在基因5’端添加Kozak共有序列如(gcc)gccRccATGG(其中R是A/G)，如SEQ ID NO.1中所示的，或利用酵母共有序列(5′-[(A/Y)A(A/T)AATGTCT]-3′，其中Y是嘧啶核苷酸)，如SEQ ID NO.2中所示的。N末端没有膜靶向序列(前21个氨基酸)的截短序列也为了在酵母细胞中表达而优化，在G基因5’端带有Kozak共有序列，如SEQ IDNO.3中所示的，以及在G基因5’端带有酵母共有序列，如SEQ ID NO.4中所示的。SEQ ID NO.3的翻译产生SEQ ID NO.8的蛋白。此外，编码全长糖蛋白的核苷酸序列为了在巴斯德毕赤酵母中表达而密码子优化，如SEQ ID NO.9中所示的。SEQ ID NO.9能够用来克隆没有N-末端膜靶向序列的成熟糖蛋白基因。为了增强SEQ ID NO.3的表达和翻译，用掺入有Kozak共有序列的引物PCR扩增序列产生在成熟糖蛋白序列N-末端起始密码子甲硫氨酸后用天冬氨酸代替天然酪氨酸残基的蛋白。氨基酸变化帮助掺入为了增强的表达的Kozak共有序列。全长G蛋白序列是SEQ IDNO.5，并且缺失N-末端膜靶向序列的成熟G蛋白是SEQ ID No.6。为了帮助通过亲和层析来纯化，这些蛋白能够任选地在蛋白的N-末端或C-末端包括6-8个氨基酸的组氨酸标签。重组蛋白SEQ ID No.5和SEQ ID No.6有相等的免疫原性，并且是用于预防CHPV感染的极佳的疫苗候选物。如SEQ ID NO.7所示的核衣壳蛋白还能够单独地或与G蛋白联合地用作候选疫苗。向蛋白添加组氨酸标签简化了纯化过程。

上述的蛋白作为细胞内蛋白在酵母中表达或作为分泌蛋白表达并从其纯化。任何合适的表达载体(vector)选自包括但不限于以下的列表：pPIC3.5、pPIC3.5K、pA018、pPIC9、pPIC9K pHIL-D2、pHIL-S1、pGAPZ和pGAPαA、B、C、pPICZ A、B、C载体等。可以使用适合在任何酵母生物体中表达的任何质粒载体，所述酵母生物体如巴斯德毕赤酵母、酿酒酵母、多形汉逊酵母(Hanensula polymorpha)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、克鲁维酵母属(Kluveromyces spp)或任何其他属/种的酵母。使用如GS115、KM71的巴斯德毕赤酵母株以及如SMD1168或SMD1163的蛋白酶缺陷株。上述序列的CHPV G基因能够以单个拷贝或者多于一个拷贝被克隆到上述酵母载体的任一种以及任何酵母株中。G蛋白能够在细胞内表达或能够作为分泌蛋白表达，其中蛋白从酵母细胞分泌出、进入培养基中。在用保护小鼠免遭活病毒攻击感染的中和抗体引发强免疫反应方面，酵母来源和纯化的重组G蛋白与完整CHPV病毒粒子是同样有效的。因此酵母来源的CHPV G蛋白是用于预防CHPV感染的优良的亚基疫苗。病毒G蛋白的纯化由包括但不限于以下的任何下述技术来进行：区带超速离心、密度梯度离心和膜超滤、离子交换层析、亲和层析、疏水相互作用层析、凝胶过滤层析、如硫酸铵的无机盐盐析、以及通过使用专利的Himax^TM技术、其他无机盐、有机溶剂和如聚乙二醇的其他有机化合物。N-末端或C-末端带有组氨酸标签的蛋白能够通过任何金属亲和层析来纯化。已通过上面提及的方法中的一种或两种或更多种的组合实现病毒抗原的纯化。

将酵母来源的疫苗提供保护性免疫反应的效能与金迪普拉病毒完整病毒粒子疫苗相比较，所述酵母来源的疫苗以以下方式制备，并且其作为候选疫苗的开发被包括在本发明的范围内。方法是在连续细胞培养物中建立稳定感染，病毒纯化方法、用于生产疫苗批次的灭活方法在实施例中充分描述。Vero细胞(ATCC CCL-81)被用作金迪普拉病毒株适应以及从这种细胞基质最终产生疫苗的细胞基质。在培养中能够体外繁殖的细胞系能够用作病毒培养的宿主。例如，可利用如MRC-5和WI-38的二倍体细胞系以及如Vero、BHK-21、CHO细胞等的连续传代的细胞系。为了繁殖CHPV株，优选地选择允许病毒良好地生长的允许细胞(permissive cells)。可使用例如常规地用于生产病毒疫苗的Vero细胞、BHK-21、C6/C3蚊细胞系、MRC-5、CV-1、BSC-1、MA104、MDCK、WI-38、CHO细胞、CaCO-2etch以及DBS-FLC-1、DBS-FLC-2、DBS-FRhl-2、ESK-4、HEL、IMR-90、WRL68等(“ATCC Microbes and Cell at Work”，第二版，144页，美国典型培养物保藏中心(ATCC)1991，美国)。本发明中所用的一种此类细胞系是Vero细胞，其已被确认用作疫苗生产的宿主细胞。确认的Vero细胞系符合世界卫生组织(WHO)推荐的关于生物制品生产的细胞的使用要求的第50号生物制品要求(Requirements for Biological Substances No.50)，从而确定这些细胞系对疫苗生产是有资格的(WHO Technical report Series，878号，19-52页，1998)。并且为了在细胞培养中维持上述提及的细胞系，能够采用单层静止培养、灌注系统培养、摇瓶、滚动管/瓶培养、悬浮培养、微载体培养(microcarrier culture)、细胞工厂(cell factories)和细胞堆集室(cell stacks)及类似的方法。可使用例如Cytodex(Pharmacia Biotech，瑞典)的任何商业上可获得的微载体和其他动物细胞培养装置。

本发明中所描述的方法可适用于金迪普拉病毒的任何基因型/血清型/病毒株。从感染的患者获得或从该病毒驻留的病毒载体分离的病毒颗粒能够在细胞系中适应并且在细胞培养中体外繁殖数代。在可选的方案中，此病毒颗粒通过2天大的乳鼠传代一次并且再次分离病毒和在体外细胞培养中传代。这增加了细胞培养中病毒的效价。

通过物理的或化学的手段并且优选地二者的组合实现病毒的纯化。物理的方法利用例如密度、尺寸、质量、沉降系数等物理特性并且包括但不限于任何下面的技术：区带超速离心、密度梯度离心、用截留尺寸大于100kDa的膜超滤以除去血清和细胞组分。通过化学手段纯化使用例如通过化学的或生理化学的反应的吸附/解吸附的方法并且包括例如通过超速离心、密度梯度离心、离子交换层析、亲和层析、疏水相互作用层析、凝胶过滤层析，如硫酸铵的无机盐盐析、以及通过使用专利的Himax^TM技术、有机盐、有机溶剂、磷酸铝、氢氧化铝和如聚乙二醇的有机化合物而纯化。对病毒的纯化通过上述方法的一种或两种或更多种的组合来实现。病毒能够通过利用2％(w/v)乙酸双氧铀负染色法来可视化，在放大大约20,000至大约200,000倍的电子显微镜下能够观察到。

病毒通过热、伽玛辐照、紫外线或者通过化学灭活而灭活。化学灭活剂选自包括但不限于以下的列表：福尔马林、β丙内酯(BPL)、戊二醛、N-乙酰乙烯亚胺、双乙烯亚胺、三乙烯亚胺、抗坏血酸、辛酸、psolarens、包含非离子去垢剂等的去垢剂被添加到病毒悬液以灭活病毒。例如，当应用福尔马林和β丙内酯时，将添加的量是大约0.001％至0.5％(v/v)。最优地用于灭活的福尔马林的浓度是福尔马林比病毒悬液1∶2000至1∶4000，优选地，1∶2500和1∶3000稀释度；在β丙内酯的情况下，β丙内酯比病毒悬液的最优浓度范围从1∶1500至1∶4000，最优选地，在1∶2500至1∶3500之间的范围。最优灭活温度是大约2-8℃，持续48小时至200小时，优选地在4℃下持续7天。在大约22℃的中间温度较短的持续到4-5天灭活也是有效的。对于金迪普拉病毒，在高于37℃的任何温度下，优选地从50℃至65℃下持续30分钟至6小时热灭活是有效的。发现伽玛辐照对病毒传染性是有效的，并且伽玛辐照的疫苗引发高水平的中和抗体。病毒对伽玛辐照的最优暴露是10千戈瑞至25千戈瑞持续30分钟至48小时的时间段，暴露于辐照的不同时间段引发不同水平的中和抗体效价。通过用伽玛辐照的以稳定制剂的疫苗制剂免疫获得的中和抗体效价通过体外血清中和测试来估计并是疫苗保护功效的量度。通过本发明中所描述的方法灭活病毒颗粒可在病毒纯化之前或之后进行。

为了在人类中免疫，金迪普拉病毒的抗原性组合物用药学上可接受的运载体(carrier)来配制。在加强免疫反应的明矾中配制抗原性制剂。磷酸铝也提供类似的效能；如硫酸铝磷酸盐的其他铝化合物也能够与金迪普拉病毒抗原一起使用。与伽玛菊粉一起配制提高疫苗的效能。如α菊粉、δ菊粉和ε形式的菊粉或任何其他高分子量菊粉的其他多态形式的菊粉能够被用作金迪普拉病毒抗原的佐剂。伽玛菊粉的制备方法可以在现有技术中(US4,954,622；PCT/AU86/00311)获得。被称为阿伽目林(algammulin)的菊粉和明矾的组合被发现是高效佐剂，其增加疫苗的效能数倍。伽玛菊粉和阿伽目林的制备方法与它们作为疫苗佐剂的用途也公开于现有技术中(Cooper和Steele，1991)。本发明的新颖性是金迪普拉病毒抗原与作为疫苗佐剂增加病毒抗原的免疫原性数倍的伽玛菊粉/阿伽目林的疫苗组合物。当佐剂化疫苗被接种到小鼠时没有观察到不利事件。菊粉可以与其他有机和无机化合物组合使用，如硫酸铝磷酸盐和磷酸钙、及其他。其他佐剂能够选自包括但不限于以下的列表：磷酸钙、脂质体、壳聚糖以及复杂糖类(complex carbohydrates)例如右旋糖酐、糊精、淀粉、甘露聚糖和葡甘露聚糖、半乳甘露聚糖、β-葡聚糖、肝素、纤维素、果胶和果胶酸盐(pectinates)、凝集素和任何其他糖类，无论是合成的或者来源于任何来源；任何可生物降解的和生物相容性的聚合物，例如聚丙交酯、聚(丙交酯-共-乙交酯；PLG)或PLGA；任何乳剂，包括但不限于水包油乳剂，一个例子是ASO3，其他基于鲨烯的佐剂如MF59等，任何油包水乳剂；用胆钙化醇作为成分之一与其他脂溶性化合物一起制备的脂质体；其他组成的脂质体；RIBI佐剂系统；皂苷包括但不限于QS-21、QuilA、番茄苷、ISCOM、ISCOMATRIX等、脂肽、糖肽、脂多糖、胞壁酰二肽以及任何基于肽的佐剂、寡核苷酸、作为佐剂的任何TLR配体、任何细胞因子、维生素和无毒细菌毒素如单磷酰脂A和衍生物、含CpG和不含CpG的寡核苷酸、等。当与金迪普拉病毒抗原组合时增加体液和细胞介导的免疫的任何其他有机的和无机的化合物适合用在此疫苗制剂中。

当单独使用时或者当组合使用时金迪普拉病毒抗原引发高水平的保护性中和抗体。例如，当与日本脑炎(JE)疫苗组合使用时，灭活的CHPV疫苗引发针对两种病毒的中和抗体并且因此良好地组合用于预防脑炎感染。组合疫苗还能够包括针对肠道病毒介导的脑炎的疫苗与CHPV疫苗和JE疫苗、或者CHPV灭活病毒疫苗联合单独JE疫苗的组合。在小鼠中检测时，发现如此的组合引发针对两种病毒的保护性中和抗体。可选择地，抗原性制剂可以包括CHPV糖蛋白与两种或者更多种纯化的抗原如灭活日本脑炎病毒和肠道病毒的组合。重组肠道病毒抗原或完整灭活病毒粒子可以组合使用。上述疫苗的组合是病毒抗原在用于人类施用的药学上可接受的制剂中的混合物。上述组合的疫苗抗原能够以引发针对候选疫苗病毒的保护性抗体所需的适合的比例混合。抗原性制剂能够通过多种方法之一在哺乳动物优选地人类受治疗者中递送，通过口腔、粘膜或通过肠胃外途径，优选地皮内的或肌内途径，以引发保护性抗体和/或细胞毒性T细胞反应。抗原还能够在药学上可接受的生物可降解的聚合物中递送。上述制剂用于金迪普拉病毒感染的预防或治疗性治疗。针对G蛋白的抗体用于CHPV感染的诊断和治疗性治疗。

金迪普拉病毒疫苗的免疫原是针对由金迪普拉病毒的任何株或金迪普拉病毒的基因型变体引起的感染性疾病的疫苗的免疫原的代表性例子。本发明的疫苗以液体或冻干形式在密封小瓶或安瓿瓶中提供。在液体制剂的情形中，其可以每人大约0.05ml至5ml的量肠胃外或口腔或通过鼻内途径施用于待接种的受治疗者。在干燥的冻干制剂的情形中，将其用合适的增溶溶液重新溶解后注射。

根据本发明，适用于本发明中所用的金迪普拉病毒株的方法适用于具有广抗原谱的任何CHPV株。广谱抗原反应将提供针对除用于疫苗生产的病毒株外的多种CHPV株的满意的免疫保护。如本领域技术人员所知的，二价或多价疫苗可以通过混合从已经在遗传学上被确认为CHPV的两种或多种CHPV株产生的疫苗来制备，并且混合是以基于免疫原性蛋白含量的合适的比例。如此混合将提供具有保护免受感染的更广的抗原谱的疫苗制品。

用任何合适的药学上可接受的稀释剂稀释本发明的灭活病毒颗粒以便获得所需的效价。制剂中所用的缓冲液可以是磷酸盐缓冲液或者磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液或其他任何药学上可接受的缓冲液。疫苗可以任选地包含防腐剂、稳定剂等。还原性和非还原性糖、如山梨糖醇和甘露醇的糖醇、甘油、氨基酸、人类血清白蛋白对于液体制剂以0.01％至10％的范围添加，并且对于冻干制剂以总固体的最多到60％添加。如此的免疫原稳定制剂是以液态或冻干形式，并且在药学上可接受的缓冲液或水中重构后适合于在人类宿主中肠胃外施用，还能够配制为用于口服和鼻内施用。

在本发明的另一方面，根据本发明所获得的病毒颗粒、以及重组病毒蛋白和抗病毒抗体或病毒抗原能够用作诊断检测的试剂，例如，用作免疫沉淀方法、血凝抑制(HI)检测、补体结合(CF)反应、ELISA、放射免疫测试、免疫荧光、Western印迹以及类似方法中的抗原。更具体地，利用本发明的灭活病毒颗粒的整体或部分，能够为检测金迪普拉病毒不同株感染提供高灵敏度和特异性的诊断检测。如在本文所用的术语灭活病毒颗粒的“部分”指的是保留期望的抗原性并且来源于病毒颗粒的病毒部分，包括例如，在所给实施例中描述的纯化步骤期间溶解或者在重组表达系统中表达的结构蛋白。对病毒特异的多克隆抗体或单克隆抗体能够用于金迪普拉病毒感染的诊断测试。

对于疫苗的效能测试，在Balb/c小鼠中测试疫苗制剂，且使用兔来产生多克隆抗血清。所得的血清通过中和针对CHPV的抗体的体外中和测试来检测，且用ELISA来确定抗体效价。在用本发明中描述的疫苗制剂免疫的动物中观察到了血清转化。本发明的疫苗是稳定的。本发明的疫苗是更有效和安全的，因为之前已在新生儿和儿童中施用酵母来源的疫苗。本发明的疫苗是成本有效的，并且酵母表达系统在工业规模上生产低成本和安全的疫苗是高度有益的。

实施例

实施例1-

在Vero细胞中金迪普拉病毒培养的建立：

2007年在知情同意和医务监督下，从怀疑患有日本脑炎或者其他未知感染的患者的血清样本和咽喉拭子样本分离金迪普拉病毒。通过用基因特异性引物做RT-PCR，样本对JE和基孔肯雅病毒(Chikungunya viruses)是阴性的。在培养中在Vero细胞中生长时产生细胞病变效应(cpe)的病毒的身份后来通过PCR扩增和对糖蛋白基因测序鉴定为金迪普拉病毒。病毒通过蚀斑纯化，并且在Vero细胞(ATCC No.CCL-81)和BHK-21细胞和MRC-5细胞中连续细胞培养增殖。用于病毒感染的培养基是包含0％-1％FBS的DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle Medium；Sigma-Aldrich，产品号D5523，按照制造商的说明使用)。48小时感染结束时，细胞病变效应在Vero和BHK21细胞中接近完全，并且病毒主要存在于细胞外培养基中。病毒效价经过2天大的小鼠脑传代后显著地提高到大于10^8.5TCID_50/ml。病毒感染和增殖还交替地在无血清培养基中测试。为了扩大病毒感染细胞的生产，包含来自工作细胞库的5x10⁶个活Vero细胞的一个冷冻管用来接种一个T175细胞培养等级烧瓶。包含5％FBS和50μg/ml硫酸新霉素的DMEM用来复苏和补充细胞。在T175烧瓶中细胞单层的90％汇合后，细胞被胰酶化并进一步在细胞工厂/细胞堆集室(CF10)中繁殖。DMEM培养基被用于繁殖(～2.0L/CF10)。使用基因特异性引物通过病毒糖蛋白(G蛋白)和核蛋白(N蛋白)的完全RT-PCR以及通过DNA测序来证实金迪普拉病毒分离株的身份。

实施例2-

灭活病毒的制备：

将金迪普拉病毒的纯化的病毒粒子在50℃-60℃范围的不同温度加热灭活最多6小时。通过在Vero细胞中病毒的再次感染来检查病毒粒子的感染性。当在从50℃至60℃的温度范围热处理直到6小时时，在病毒的三个连续传代中没有观察到再次感染。用福尔马林或者β丙内酯来执行病毒的化学灭活。当使用福尔马林(甲醛)时，从2-8℃至22℃的温度范围从直到14天的不同时间段在1∶1500至1∶4000范围内测试浓度。用福尔马林灭活的最优时间和温度是2-8℃在1∶3000或1∶3500的稀释度下7天。在22℃下4天或2-8℃下7天从1∶1500至1∶3500的稀释度下测试时，β丙内酯完全地灭活病毒。福尔马林和β丙内酯灭活的制剂都有高免疫原性并在用作疫苗制剂时引发中和抗体。以从30分钟至48小时的不同时间间隔用⁶⁰Co源照射10kGy(千戈瑞)执行伽玛辐照疫苗，并且在免疫小鼠后测试在不同的暴露时间下的中和抗体效价。在辐照期间病毒母液在干冰中保持冷冻。病毒灭活的完成度通过在配制为疫苗之前在Vero细胞中连续传代而测试。用于伽玛辐照的疫苗制剂缓冲液任选地包含20mM抗坏血酸和20mM组氨酸。

实施例3-

金迪普拉病毒的纯化：

来自CF10细胞工厂的病毒收获物用0.45μm滤器来净化，通过300kDa截留膜过滤来浓缩，并且用50mM磷酸盐缓冲液，pH7.4交换缓冲液。将浓缩的病毒收获物上样到用相同缓冲液平衡的柱中预充注的cellufinesulphate树脂上。柱用包含50mM NaCl的缓冲液彻底冲洗，并且在从150mM至1000mM增加的盐浓度下连续地洗脱结合的病毒。合并包含病毒的级分并在凝胶上分析纯度。浓缩包含病毒颗粒的级分，并且用300kDa截留膜交换缓冲液。浓缩的主体病毒用0.22μm囊式过滤器无菌过滤，并且在使用前冻存于-80℃。

实施例4-

病毒糖蛋白和核蛋白基因的重组克隆和表达：

糖蛋白(G蛋白)和核蛋白(N蛋白)基因在CHPV病毒RNA的逆转录酶-聚合酶链式反应(RT-PCR)之后分别克隆到酵母载体和大肠杆菌载体中。用Absolutely RNA微量制备试剂盒(Stratagene，La Jolla，CA，USA)来从感染的Vero细胞(ATCC CCL-81)中分离病毒RNA。用AccuScript高保真第一链cDNA合成试剂盒(Stratagene)依照试剂盒的方案进行RT-PCR，并且糖蛋白和核蛋白基因用PfuUltra高保真DNA聚合酶(Stratagene)来扩增。用基因特异性引物扩增编码糖蛋白(G蛋白)基因和核蛋白(N蛋白)基因的基因。当通过RT-PCR从CHPV病毒中克隆天然G蛋白基因时，用于G蛋白基因的RT-PCR扩增的引物为：

正向引物1：5’ACATGAATTCGCCGCCACCATGGATTTGAGTATAG3’

或

正向引物2：5’ACATGAATTCGCCGCCACCATGGCTTTGAGTATAG3’

反向引物1：5’GCATGGATCCGCGGCCGCTCATACTCTGGCTCTCATGTTG3’

可选择地，编码G蛋白的密码子优化的合成基因用作模板，用如下PCR引物通过PCR克隆成熟的G蛋白基因：

正向引物3：5’CATGAATTCGCCGCCACCATGGACTTGTCCATCGCATTCCCTGAG3’

反向引物2：5’GCATGGATCCGCGGCCGCTTAGACTCTTGCTCTCATG3’

PCR扩增如下进行：94℃下变性40秒、58℃下退火45秒和70℃下延伸3分钟的30个循环，和70℃下最终延伸10分钟。扩增后的PCR片段用凝胶纯化并用EcoR1和Not1消化，并且克隆到pPIC3.5K或pPIC9载体的EcoR1和Not1位点中的在AOX1启动子控制下的AOX1基因座中，并且转化入巴斯德毕赤酵母GS115株，依照Invitrogen corporation，Carlsbad，USA概述的方案通过甲醇诱导，并且转化入巴斯德毕赤酵母GS115是依照制造商(Invitrogen)的用户手册“A Manual of Methods for Expression ofRecombinant Proteins in Pichia pastoris”(M版2002年1月，毕赤酵母表达试剂盒，目录编号K1710-01，Invitrogen corporation，Carlsbad，USA)。

编码核蛋白的序列用RT-PCR扩增。CHPV cDNA的PCR用如下基因特异性引物来执行：

NP FP1(正向引物)：5’ACACCATATGAGTTCTCAAGTATTCTGC3’

以及

NP RP1(反向引物)：5’ACATGGATCCTCATGCAAAGAGTTTCCTGGC3’

PCR片段用Nde1和BamH1消化并且克隆到原核表达载体pET-11B的Nde1和BamH1位点中，并且将包含插入物的重组质粒转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞。为了蛋白的重组表达，将从DH5α细胞分离的重组质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)细胞。

实施例5-

CHPV重组抗原的纯化：

收获用甲醇诱导后的酵母细胞，并且在含有0.2％Triton X-100和5mMEDTA的50mM Tris-HCl缓冲液，pH8.0中通过超声和/或用玻璃珠裂解。细胞悬液在8000×g下离心10分钟。上清液用盐处理(Himax，专利的混合物)来沉淀并且沉淀了。用Tris-HCl缓冲液，pH8.2从盐沉淀物洗脱蛋白。浓缩洗脱液，用50mM Tris-HCl，pH8.2渗滤并且上样到用同样的缓冲液平衡的cellufine sulphate柱。蛋白质用不同浓度的NaCl洗脱。制备物的纯度用银染在12％SDS-PAGE上检查。蛋白的身份用Western印迹来确认。在大肠杆菌细胞中克隆的核蛋白基因在20℃下用0.2mM IPTG(异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷)诱导12小时。8,000rpm离心10分钟后的细胞沉淀用含2mM EDTA和0.1％Triton X-100的pH8.0的50mM Tris-HCl来冲洗。细胞用超声来裂解，10,000rpm离心20分钟，包含可溶性核蛋白的上清液在强阳离子交换

柱和苯基琼脂糖柱上连续地纯化。合并包含蛋白质的级分并通过10kDa膜过滤来浓缩。通过二喹啉甲酸(BCA)方法来估计纯化的重组糖蛋白和核蛋白的蛋白浓度。

实施例6-

疫苗制剂的制备：

金迪普拉病毒抗原的制剂在包含154mM NaCl的pH6.9-7.2的40mM磷酸盐缓冲液中制备。病毒制品在0.025％至4％终浓度的氢氧化铝/磷酸铝的液体制剂中配制并测试。用于疫苗制剂的终浓度为从0.025％至0.1％的氢氧化铝。其他佐剂的添加进一步增强疫苗制品的效能。如通过ELISA确定的以及通过血清中和测试(SNT)估计中和抗体效价，菊粉的多态形式、特别是伽玛菊粉的添加，增加疫苗效能至少五倍。试验了在5mg/ml至200mg/ml的范围的多种浓度的伽玛菊粉浓度。伽玛菊粉包含8000道尔顿以上的分子量的颗粒并且在37℃的水中是几乎不溶的。伽玛菊粉的制备在现有技术中是众所周知的。高分子量菊粉

是从比利时Beneo Orafti获得的。伽玛菊粉级分通过现有技术(US4,954,622；PCT/AU86/00311)中概述的方法制备，并且依照Cooper和Steele1991年所描述的方法来制备阿伽目林。在从0.1mg/ml至50mg/ml浓度范围下测试这些后，0.5mg/ml的浓度的伽玛菊粉和阿伽目林制品用在疫苗制剂中。添加佐剂和抗原并且允许在室温下吸附2小时并且立即用于注射。另外包含糖如蔗糖、麦芽糖、海藻糖、乳糖、葡萄糖、甘露醇或山梨醇以及菊粉的一种或者组合的制剂赋予疫苗制剂良好的稳定性。0.5％-10％范围以及优选地0.5％-5％的范围的糖的存在赋予制剂良好的稳定性，如在37℃四周下加速的稳定性所确定的。相似的制剂还在pH6.8-7.2的磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液中测试，没有观察到区别。高达总固体的60％的上述糖、缓冲液和盐的较高浓度赋予疫苗冻干制剂良好的稳定性。向制剂添加从0.2％直到5％的人类血清白蛋白增加了冻干制剂的疫苗稳定性。制剂的稳定性通过在37℃四周的加速稳定性测试，随后在小鼠中做效能测试。

实施例7-

疫苗制品的免疫原性的确定：

每组中使用六只一月龄的Balb/c小鼠。对每组中的动物肌肉注射大约0.1ml/小鼠的从20μg的最高剂量开始并且稀释直到100ng/小鼠的连续地稀释的疫苗制品。金迪普拉病毒抗原通过BCA方法和用兔抗金迪普拉病毒抗血清的ELISA来估计。在如先前实施例所概述的包含合适量的佐剂和稳定剂的缓冲液中进行稀释。对于对照动物，注射无病毒抗原、包含相同量的佐剂的相等体积。试验的疫苗抗原包括如实施例中其他地方所描述的用β丙内酯(BPL)或福尔马林或伽玛辐照或热灭活的CHPV的完整病毒粒子，以及纯化的CHPV糖蛋白和核蛋白。还试验了糖蛋白和核蛋白的组合。如本实施例所描述的所有疫苗制剂和稀释度在7、14和28天的三个剂量施用。在加强注射7天后收集血液。对每组合并相等量的血清并且在56℃灭活补体大约30分钟。所得的血清被用于通过血清微中和测试估计中和抗体，并且通过间接ELISA估计总抗体效价。在一种替代的试验中，通过其他途径施用相似量的灭活病毒制品。用于所有制剂的缓冲液是包含150mM NaCl的40mM磷酸盐缓冲液，pH6.8-7.2。

通过给兔肌内注射100μg纯化的病毒分离株，并且在首次抗原施用后的14和28天注射相似量的抗原作为加强剂量来产生多克隆抗体。对于ELISA，在pH9.6的碳酸盐缓冲液的96孔ELISA板中2-8℃包被1μg的抗原过夜。板用pH7.4的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中3％脱脂奶粉封闭。板在37℃下孵育一小时，并且板用含0.05％吐温-20的PBS(PBST)冲洗五次。在PBST中进行疫苗抗血清的系列稀释，并在37℃培养两小时。用PBST冲洗板8次，然后添加在PBST中1∶2500稀释的小鼠抗IgG作为二抗并且在37℃下孵育一小时。孔用PBST冲洗五次，用PBS冲洗三次并且通过添加OPD(邻苯二胺，Sigma Aldrich，美国)和H₂O₂来显色。添加1N硫酸10分钟后获取读数。作为动物中血清转化的量度的抗体效价以高于对照动物的血清稀释度的倒数+3×对照的标准差来估计。ELISA结果显示，来自甚至100ng的BPL灭活CHPV抗原的疫苗引发高抗体反应。由ELISA的IgG抗体效价(血清稀释度的倒数)在没有明矾时对于100ng是3200直到对于20μg是64,000，在有明矾作为佐剂时从12,800直到320,000。由于中和估计对于疫苗效能是重要的，疫苗抗血清中的中和抗体效价通过100TCID50/ml的CHPV在Vero E6细胞单层中细胞病变效应的完全抑制来确定。计算出50％组织培养感染剂量(TCID₅₀)，并且每次分析用100TCID₅₀的病毒。微中和检测用在最小必须培养基(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA)中连续稀释的血清来执行。将血清稀释液与包含100TCID₅₀病毒的相等体积培养基一起在37℃孵育90分钟，并且添加到96孔平底板中的Vero E6细胞单层(每孔100,000细胞)。板在5％CO₂温箱中37℃孵育六天。中和效价表示为导致完全抑制病毒的细胞病变效应的血清最高稀释度。每种血清稀释度以四份测试。来自对照动物的合并的血清用作测试中的对照。在另一试验中，试验了从0.5μg至20μg浓度范围的CHPV联合包含6μg日本脑炎(JE)灭活完整病毒粒子疫苗

的灭活疫苗。组合疫苗以0.25mg明矾配制并且给6只小鼠肌肉注射。在7、14和28天施用三剂，并且在最后一剂施用7天后收集血液样本。为了估计抗JE中和抗体效价，采用了蚀斑减少中和试验(PRNT50)。疫苗抗血清连续地四倍稀释并且与合适的CHPV稀释度混合并且在37℃下孵育90分钟。抗血清/病毒混合物被添加到6孔板中的Vero细胞汇合单层并且在37℃下孵育60分钟。向每个孔添加0.9％羧甲基纤维素溶液，并且板在CO₂温箱中在37℃下孵育5天。在孵育结束时，计数蚀斑数量。与无血清病毒相比减少50％蚀斑数量的血清的稀释度是作为PRNT₅₀值的病毒中和抗体的量度。

附图中的图1显示用基因特异性引物对(1A)大约～1.53Kb CHPV糖蛋白(G蛋白)基因和(1B)～1.3Kb核蛋白(N蛋白)基因的PCR扩增。在两种情形中，扩增的基因片段的尺寸显示为相对于1Kb梯子。在两个凝胶图片中，G基因和N基因的PCR产物标为粗箭头。

图-2显示凝胶图(2A)显示纯化的金迪普拉病毒；纯化的CHPV在变性条件下在10％SDS-PAGE上运行；三种主要蛋白糖蛋白(G)、核蛋白(N)和基质蛋白(M)在图中示出。2B是用兔抗CHPV多克隆血清对CHPV显色的Western印迹。CHPV抗原用粗箭头来表明。

图-3显示在甲醇诱导不同时间间隔时在巴斯德毕赤酵母中糖蛋白的表达。泳道1-未诱导的细胞；泳道2-添加甲醇后0小时；泳道3-甲醇诱导后24小时；泳道4-甲醇诱导后48小时，泳道5-分子大小标记；泳道6-甲醇诱导后72小时；泳道6-甲醇诱导后96小时；泳道7-甲醇诱导后120小时。粗箭头示出诱导的～65kD G蛋白。

图-4显示来自巴斯德毕赤酵母的纯化的重组糖蛋白。

表1：

下面的表-1阐明了通过血清中和抗体效价来估计金迪普拉病毒灭活的完整病毒粒子和重组抗原的免疫原性。每个剂量组注射六只balb/c小鼠。括号内的数字表明接种疫苗的动物的血清转化的％。对照动物被注射相等体积的载运体(vehicle)(数据未显示)。抗体效价表示为导致在Vero细胞中病毒的细胞病变效应的完全抑制的血清稀释度的倒数。ND-未确定。

表-1-

表2：

下面的表2阐明了用如实施例所示的不同佐剂试验的CHPV抗原的免疫原性。磷酸铝和氢氧化铝以0.25mg/剂使用；伽玛菊粉和阿伽目林以1mg/剂使用，连同2.5μg不同的如所示的CHPV抗原。每剂量组用六只balb/c小鼠。括号内的数字表示接种疫苗的动物的血清转化的％。对照动物被注射相等体积的包含仅佐剂的载运体，在血清样本中没有能够检测到针对病毒抗原的中和抗体(数据未显示)。抗体效价表示为在Vero细胞中引起病毒的细胞病变效应的完全抑制的血清稀释度的倒数。

表-2-

表3：2.5μg金迪普拉病毒抗原(BPL灭活的)和6μg日本脑炎灭活的完整病毒粒子疫苗以7、14和28天的间隔给6只balb/c小鼠肌肉注射。

序列表以电子形式附于光盘中。

参考文献：

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Claims (16)

1.一种用于在哺乳动物中预防和治疗金迪普拉病毒感染的疫苗制剂，所述疫苗制剂包含任何基因型的金迪普拉病毒或其病毒抗原作为治疗活性成分。

2.如权利要求1所述的疫苗制剂，其中所述金迪普拉病毒是由热、紫外线、通过化学方法或通过伽玛辐照灭活的。

3.如权利要求2所述的疫苗制剂，其中金迪普拉病毒的所述化学灭活由选自如下的条件进行：

a.使用β丙内酯(BPL)：病毒悬液为1∶1500至1∶4000、优选地在1∶2000至1∶3500之间的稀释度的浓度的BPL，在2-8℃下2-14天的时间段、优选地在2-8℃下7天、或者在22℃下4-6天的时间段；

b.使用福尔马林(甲醛)比病毒悬液为1∶2500至1∶4000稀释度的浓度的福尔马林，在2-8℃下4-15天的时间段或在25℃的温度下4-8天的时间段。

4.根据权利要求2所述的疫苗制剂，其中在Vero细胞中培养的所述金迪普拉病毒是灭活的，其中所述灭活在所述病毒的纯化之前或之后进行。

5.根据权利要求1所述的疫苗制剂，其中所述金迪普拉病毒抗原是纯化的金迪普拉病毒的糖蛋白。

6.如权利要求5所述的疫苗制剂，其中所述糖蛋白是从真核表达系统表达和纯化的重组蛋白，所述真核表达系统例如杆状病毒介导的昆虫细胞表达系统、酵母或者哺乳动物细胞。

7.用于根据权利要求6中所述的重组表达的宿主细胞是酵母，例如酵母菌属(Saccharomyces spp)、克鲁维酵母菌属(Kluveromyces spp)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、多形汉逊酵母(Hanensulapolymorpha)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)等，优选巴斯德毕赤酵母。

8.一种重组DNA构建体，包含(i)载体和(ii)编码根据前述权利要求任一项所述的氨基酸序列为SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6或SEQ IDNO.8的糖蛋白的SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ IDNO.4或SEQ ID NO.9中的至少一种核酸片段。

9.根据权利要求1所述的免疫原性制品，其中所述金迪普拉病毒抗原是从原核宿主例如大肠杆菌(E.coli)表达和纯化的SEQ ID NO.7的重组核蛋白。

10.一种用于产生前述权利要求中任一项所述的重组蛋白的方法，包括下列步骤：

i)培养用权利要求8和9所述的重组构建体克隆的宿主细胞；

ii)收集细胞并且从中分离所述重组蛋白；

iii)通过以下方法中的至少一种纯化所述蛋白：离子交换层析、凝胶过滤、亲和层析、疏水柱层析、用盐、有机溶剂分级、离心等。

11.一种浓缩和纯化病毒的方法，包括下列方法的一种或多种：

a.通过100kD-1000kD膜超滤；

b.超速离心和密度梯度离心；

c.柱层析，例如凝胶过滤、离子交换层析、疏水相互作用层析、亲和基质层析、用聚乙二醇、Himax^TM、有机盐和无机盐沉淀。

12.如权利要求1所述的稳定的疫苗制剂，包含：

a.纯化和灭活的金迪普拉病毒抗原；

b.磷酸盐缓冲液10mM至500mM pH6.7至7.4、或者相似pH的磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液；

c.浓度在0.1％至5％范围内的糖和糖醇，其中所述糖选自包括以下的列表：乳糖、麦芽糖、蔗糖、葡萄糖、海藻糖、和糖醇例如甘露醇或山梨醇、菊粉和/或其中不同糖的组合；

d.25mM-200mM NaCl；

e.选自以下组成的列表的佐剂：氢氧化铝、磷酸铝、伽玛菊粉、阿伽目林或其组合；

f.任选地包括浓度在0.1％至5％的蛋白添加剂，例如人类血清白蛋白。

13.根据权利要求1所述的冻干制剂，包含：

a.纯化和灭活的金迪普拉病毒作为抗原；

b.磷酸盐缓冲液10mM至500mM pH6.7至7.4、或者相似pH的磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液；

c.浓度在0.1％至50％范围内的糖或糖醇，优选地1-5％，其中所述糖选自以下组成的列表：乳糖、麦芽糖、蔗糖或海藻糖、菊粉、糖醇或其组合；

d.25mM-200mM NaCl；

e.任选地，以在0.1％至5％的浓度范围使用的蛋白添加剂例如人类血清白蛋白。

14.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据前述权利要求任一项所述的抗原，所述抗原以将作为疫苗施用的有效量在药理学可接受的运载体中，通过以下途径的至少一种施用，所述途径例如肌内、皮内、皮下、静脉内、口服、和鼻内途径在哺乳动物中优选地在人类中施用以引发保护性抗体反应。

15.一种使用根据前述权利要求任一项所述的抗原性分子用于制备针对金迪普拉病毒感染的疫苗制剂、免疫诊断剂和免疫治疗剂的体外或体内方法。

16.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物是金迪普拉病毒抗原和日本脑炎病毒抗原的组合，所述免疫原性组合物用于人类施用，用于预防金迪普拉病毒感染和日本脑炎病毒感染二者。

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