KR19990023955A - 베로세포에 적응된 약독화된 일본뇌염바이러스 및 일본뇌염백신 - Google Patents
베로세포에 적응된 약독화된 일본뇌염바이러스 및 일본뇌염백신 Download PDFInfo
- Publication number
- KR19990023955A KR19990023955A KR1019980035007A KR19980035007A KR19990023955A KR 19990023955 A KR19990023955 A KR 19990023955A KR 1019980035007 A KR1019980035007 A KR 1019980035007A KR 19980035007 A KR19980035007 A KR 19980035007A KR 19990023955 A KR19990023955 A KR 19990023955A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- virus
- japanese encephalitis
- vaccine
- vaccines
- vero
- Prior art date
Links
- 241000710842 Japanese encephalitis virus Species 0.000 title claims abstract description 66
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 60
- 229940124726 Japanese encephalitis vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 24
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 title claims abstract description 21
- 229940124868 Japanese encephalitis virus vaccine Drugs 0.000 title description 3
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 64
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 137
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 claims description 32
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 claims description 8
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 4
- 229960001453 live attenuated japanese encephalitis Drugs 0.000 claims description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 claims 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 claims 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 24
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 abstract description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 43
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 39
- 238000000034 method Methods 0.000 description 30
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 25
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 18
- 206010014596 Encephalitis Japanese B Diseases 0.000 description 17
- 201000005807 Japanese encephalitis Diseases 0.000 description 17
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 17
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 15
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 15
- 229960003239 encephalitis vaccine Drugs 0.000 description 15
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 15
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 15
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 15
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 14
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 14
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 14
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 13
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 12
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 11
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 11
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 11
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 11
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 10
- 239000013553 cell monolayer Substances 0.000 description 10
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 10
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 10
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 10
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 10
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 9
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 8
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 7
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 7
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 6
- 239000006145 Eagle's minimal essential medium Substances 0.000 description 6
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 6
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 6
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 6
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 6
- 229940031551 inactivated vaccine Drugs 0.000 description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 6
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 6
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 5
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 5
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 5
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 5
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101710204837 Envelope small membrane protein Proteins 0.000 description 4
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 4
- 101710145006 Lysis protein Proteins 0.000 description 4
- 229920002594 Polyethylene Glycol 8000 Polymers 0.000 description 4
- 229940037003 alum Drugs 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 229940028617 conventional vaccine Drugs 0.000 description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 4
- 230000035931 haemagglutination Effects 0.000 description 4
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 4
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 3
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- 241000255925 Diptera Species 0.000 description 3
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 3
- 102000007327 Protamines Human genes 0.000 description 3
- 108010007568 Protamines Proteins 0.000 description 3
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 3
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 3
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 206010014599 encephalitis Diseases 0.000 description 3
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 3
- 230000036541 health Effects 0.000 description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 3
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 description 3
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 3
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 3
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 3
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 2
- 206010015150 Erythema Diseases 0.000 description 2
- 241000710781 Flaviviridae Species 0.000 description 2
- 206010019233 Headaches Diseases 0.000 description 2
- 102100034349 Integrase Human genes 0.000 description 2
- 241000710843 Japanese encephalitis virus group Species 0.000 description 2
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 description 2
- 206010029350 Neurotoxicity Diseases 0.000 description 2
- 108090001074 Nucleocapsid Proteins Proteins 0.000 description 2
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 2
- 206010044221 Toxic encephalopathy Diseases 0.000 description 2
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 2
- 208000002552 acute disseminated encephalomyelitis Diseases 0.000 description 2
- VREFGVBLTWBCJP-UHFFFAOYSA-N alprazolam Chemical compound C12=CC(Cl)=CC=C2N2C(C)=NN=C2CN=C1C1=CC=CC=C1 VREFGVBLTWBCJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 2
- 231100000869 headache Toxicity 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 231100000225 lethality Toxicity 0.000 description 2
- 229940124590 live attenuated vaccine Drugs 0.000 description 2
- 229940023012 live-attenuated vaccine Drugs 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 230000000926 neurological effect Effects 0.000 description 2
- 231100000189 neurotoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002887 neurotoxic effect Effects 0.000 description 2
- 231100000228 neurotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000007135 neurotoxicity Effects 0.000 description 2
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 2
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 2
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 2
- 229940048914 protamine Drugs 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- SQGYOTSLMSWVJD-UHFFFAOYSA-N silver(1+) nitrate Chemical compound [Ag+].[O-]N(=O)=O SQGYOTSLMSWVJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 229910021653 sulphate ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical group CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 2
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- NOWKCMXCCJGMRR-UHFFFAOYSA-N Aziridine Chemical compound C1CN1 NOWKCMXCCJGMRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 1
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000710831 Flavivirus Species 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 101710085938 Matrix protein Proteins 0.000 description 1
- 101710127721 Membrane protein Proteins 0.000 description 1
- 208000000112 Myalgia Diseases 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000025966 Neurological disease Diseases 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 206010030113 Oedema Diseases 0.000 description 1
- 235000014676 Phragmites communis Nutrition 0.000 description 1
- 208000028017 Psychotic disease Diseases 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 206010038687 Respiratory distress Diseases 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 230000010530 Virus Neutralization Effects 0.000 description 1
- 239000004234 Yellow 2G Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K aluminium phosphate Chemical compound O1[Al]2OP1(=O)O2 ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 229940031567 attenuated vaccine Drugs 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- VEZXCJBBBCKRPI-UHFFFAOYSA-N beta-propiolactone Chemical compound O=C1CCO1 VEZXCJBBBCKRPI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 1
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 238000002298 density-gradient ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 229960003964 deoxycholic acid Drugs 0.000 description 1
- KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N deoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 210000001840 diploid cell Anatomy 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 1
- 231100000321 erythema Toxicity 0.000 description 1
- -1 etc.) Proteins 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000002489 hematologic effect Effects 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000014304 histidine Nutrition 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 229940043026 inactivated japanese encephalitis virus vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N isomaltotriose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O)O1 FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012007 large scale cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000003141 lower extremity Anatomy 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 238000002595 magnetic resonance imaging Methods 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 230000034217 membrane fusion Effects 0.000 description 1
- 201000011475 meningoencephalitis Diseases 0.000 description 1
- 229910001463 metal phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N methanone Chemical compound O=[14CH2] WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 231100001096 no neurotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 229960005030 other vaccine in atc Drugs 0.000 description 1
- TWNQGVIAIRXVLR-UHFFFAOYSA-N oxo(oxoalumanyloxy)alumane Chemical compound O=[Al]O[Al]=O TWNQGVIAIRXVLR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 208000037955 postinfectious encephalomyelitis Diseases 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000001902 propagating effect Effects 0.000 description 1
- 229950008679 protamine sulfate Drugs 0.000 description 1
- 229960003127 rabies vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 1
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 1
- 235000017709 saponins Nutrition 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- 229910001961 silver nitrate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- HRZFUMHJMZEROT-UHFFFAOYSA-L sodium disulfite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S(=O)S([O-])(=O)=O HRZFUMHJMZEROT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229940001584 sodium metabisulfite Drugs 0.000 description 1
- 235000010262 sodium metabisulphite Nutrition 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 235000010356 sorbitol Nutrition 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- DHCDFWKWKRSZHF-UHFFFAOYSA-N sulfurothioic S-acid Chemical compound OS(O)(=O)=S DHCDFWKWKRSZHF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009469 supplementation Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004854 viral vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000010464 virion assembly Effects 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5254—Virus avirulent or attenuated
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55505—Inorganic adjuvants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/24011—Flaviviridae
- C12N2770/24111—Flavivirus, e.g. yellow fever virus, dengue, JEV
- C12N2770/24122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/24011—Flaviviridae
- C12N2770/24111—Flavivirus, e.g. yellow fever virus, dengue, JEV
- C12N2770/24134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/24011—Flaviviridae
- C12N2770/24111—Flavivirus, e.g. yellow fever virus, dengue, JEV
- C12N2770/24151—Methods of production or purification of viral material
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
본 발명은 일본뇌염바이러스를 베로세포에서 계대배양하여 적응시켜 인간용 일본뇌염백신의 제조에 탁월한 생산성 및 우수한 백신 효능을 나타내는 약독화된 일본뇌염바이러스 변이주 및 이 변이주를 포함하여 제조된 안전하고 효능이 탁월한 일본뇌염백신에 관한 것이다.
Description
본 발명은 일본뇌염 백신의 제조에 우수한 성질을 나타내는 일본뇌염 바이러스 변이주에 관한 것이다. 본 발명의 바이러스는 약독화된 바이러스이며 사람 백신의 제조를 위한 세포 기질로서 세계보건기구(WHO)에 의해 승인된 연속 세포주 베로에서 증식할 수 있다. 따라서, 본 발명의 바이러스는 기존의 백신보다 더욱 안전한 불활화 백신 또는 약독화 생 일본뇌염 백신의 제조를 위해 사용될 수 있다. 또한, 본 발명은 안전하고 효능이 우수한 일본뇌염 백신에 관한 것이다.
일본뇌염은 아시아권에서 주요 보건 감시 대상 질병중의 하나로 모기-매개된 아르보바이러스성 질환이다. 매년 이 지역에서 35,000 명 이상의 환자와 10,000 명의 사망자가 발생하는 것으로 보고되고 있으나 이러한 공식적인 보고들은 대체로 실제 발생 건수보다 적게 보고된 것으로 발생 빈도는 더 클 것이다(Okuno, T. World Health Stat Q. 3: 120-31, 1985). 이 질병은 두통 증세, 무균성 수막뇌염 또는 뇌염으로 나타날 수 있으며 생존자의 약 절반은 영구적인 신경 및 정신 속발증이 동반될 수 있다 (Burke, D.S. et al., The Arbovirus: Epidemiology and Ecology, 3:63-92, 1988; Monath, T.P. Virology, 763-814, 1990).
일본뇌염 바이러스는 주로 벡터-유래된, 피복된, 양성-센스, RNA 단일 나선의 특징을 가진 66개 플라비바이러스과(Flaviviridae) 중의 하나이다 (Chambers, T. J. et al. Ann. Rev. Microbiol, 44:649-88, 1990). 형태학적으로, 플라비바이러스는 직경이 약 40 nm인 구형이고 캡시드(C) 단백질과 복합된 11-kb 게놈을 함유한 뉴클레오캡시드에 지질 이중층이 애워쌓고 있다(Rice, C.M. et al. Science, 229:726-33, 1985). 막상의 표면 돌출부는 당화된 표피(E)와 막(M)단백질로 구성되어 있다. 세포내 초기 비리온에 존재하는 프리-M 당단백질은 성숙한 세포외 비리온에서 발견되는 M 단백질로 분해된다. 혈구응집, 바이러스 중화, 비리온 어셈블리, 막융합 및 세포수용체에 바이러스의 결합을 포함한 중요한 생리학적 활성은 53-kd E 단백질과 연관되어 있다(Koshini, E. et al. Virol, 188:714-20, 1992).
사람용으로 세 가지의 일본뇌염 백신이 있다(Tsai, T. et al. Vaccines, 671-713, 1993). 이들 중에서, 마우스 뇌에서 생산된 불활화 일본뇌염 백신만이 국제적으로 이용되고 있고 오사카 대학의 미생물 질병 연구재단 (Research Foundation for Microbial Diseases, Biken)이 그 백신을 대부분 생산하고 있다. 이 백신은 1992년에 미국에서 허가가 났으며 Connaught Laboratories, Inc.이 상표명 JE-VAX로 시판하고 있다. 또한, 초기 햄스터 신장 (PHK)에서 제조된 불활화 백신과 생약독화 백신은 유일하게 중국 내에서만 이용되고 있다.
마우스 뇌에서 생성된 불활화된 일본뇌염 백신은 1954년에 일본에서 허가를 받았다. 이 백신은 유아 마우스의 뇌 주사를 통해 생산되기 때문에 제조과정에 많은 시간과 노동이 소모되며 또한 백신-관련된 신경학적 부작용의 가능성에 관한 우려가 고조되었다. 제조공정에서의 연속적인 정제 개선으로 인해 그 순도 및 효능이 증가되었으나 (Oya, A. Vaccination Theory and Practice, 69-82, 1975; Oya, A. Acta Pediatr Jpn, 30:175-84, 1988; Takaku, K. Biken J. 11:25-39, 1968), 현재까지도 국부적 및 미미한 전신적 반응이 약간의 빈도로 발생하는 것으로 보고되었다 (Hoke, C.H. et al. New 뚜히 J Med. 319-608-14, 1988; Poland, J.D. et al. J Infect Dis. 161-878-82, 1990; Sanchez, J.L. et al. Lancet. 335:972-73, 1990). 백신의 20%에서 주사 부위에서의 국부적 과민증(tenderness), 발적, 및/또는 팽윤이 발생한다. 경증의 전신적 반응, 주로 두통, 낮은 수준의 발열, 근통증, 불쾌감, 및 위장증세가 백신 피접종자의 10 내지 30%에 의해 발생되는 것으로 보고되었다. 1989년 이래로 담마진, 혈과부종, 호흡장애, 다형성홍진, 결정성홍반 및 수종의 신경학적 장애를 포함한 새로운 형태의 부작용이 호주, 유럽 및 북아메리카에서 예방접종된 여행자들에게 주로 나타난 것으로 보고되었다 (Anderson, M.M. et al. Lancet 337:1044, 1991; Ruff, T.A. et al. Lancet 228:881-1, 1991). 또한, 1992년 및 1995년에 예방접종후 자기공명영상(MRI)에서의 변화와 함께 감염후뇌척수염(ADEM) 증상을 보인 7명의 어린이가 보고되었다 (Ohtaki, E. et al. Pediatr Neurol. 8:137-9, 1992; Ohtaki, E. et al. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 59:316-7, 1995). 또한, 주목되는 것은 생산 공정상 필연적으로 동물뇌 조직을 함유한 광견병 백신은 예방접종 한 후 수종의 신경학적 합병증을 유발한다는 점이다 (Plotkin, S.A. et al. Vaccines, 661-2, 1994). 이러한 이유 때문에, WHO는 일본뇌염 백신의 개발을 최우선 순위로 정하였다.
더욱 최근에는, 중국의 불활화 백신과 생 약독화 일본뇌염 백신이 높은 역가의 바이러스-중화 항체를 유도하고 확고한 보호능을 제공하여 효과적인 것으로 보고되었다 (Tsai, T. et al. Vaccines, 671-713, 1993). 그러나, 중국의 백신이 제조된 PHK 세포는 WHO에 의해 인간용 바이러스 백신 생산용으로 승인 받지 못했고 또한 선진국에서 사람에 사용할 수 있도록 허가 받지 못했다. 백신을 생산하는데 초기 햄스터 세포를 사용하는 주된 단점은 백신의 질이 불확실하다는 점이다. 비록 특정 병원체가 없는 햄스터가 사용될지라도, 동물은 예상치 못하게 감염될 수 있는데 이 점이 백신의 제조에 문제가 되는 것이다. 경우에 따라서는 이러한 유형의 감염은 장기간 검출되지 않을 수 있다. 이러한 비평과 함께 백신의 안정성에 대한 좀더 통제된 연구가 그 백신의 폭넓은 사용에 관한 신뢰가 쌓일 수 있도록 하기 위하여 필요한 것이다. 초기 햄스터 세포로부터 백신을 제조하는 경우 또 다른 단점은 바이러스의 회수율이 낮다는 점과 비용이 많이 들어 대량생산을 하기가 어렵다는 것이다.
결국, 사람 백신의 생산세포 기질로서 인정받아온 베로 또는 사람 이배체 세포 (human diploid cell)와 같은 표준 세포주에서 생성되고 비용면에서도 효율적인 새로운 일본뇌염 백신이 필요하다. 베로세포는 원숭이 신장으로부터 유도된 형질전환된 비-종양유도성 세포이다. 베로세포는 큰 규모의 세포 배양에 보다 쉽게 적응하며 형질전환 세포로서 무한한 수명을 지닌다는 점에서 베로세포주는 어떠한 다른 표준 세포주보다도 더욱 유리하다.
일본뇌염 백신의 분야에서 대용량으로 세포배양을 가능하게 하는 표준세포에서 백신을 제조하기 위하여 상당한 노력이 있어왔다. 그럼에도 불구하고 베로세포에서의 배양을 통해 백신의 상업화에 필요한 유전적 안정성, 수율 및 공정을 포함한 바이러스 특성규명 등 사람 백신으로의 개발요건을 충족시켜주지 못했었다. 이러한 사실이나 다른 바이러스 배양에서 얻은 지식을 일본뇌염 바이러스에 응용하는데 따른 어려움 때문에 종래에는 유전적으로 안정하고 연속 세포주로부터의 높은 면역원 특성을 나타내는 일본뇌염 바이러스 백신을 성공적으로 개발하지 못했다. 지금까지의 어떠한 연구도 본 분야에서 언급되는 기준을 충족하는 새로운 백신의 제법을 제시한 바 없다.
마우스 뇌 또는 초기 세포주에서 생성된 일본뇌염 바이러스에서 나타난 종전의 문제점을 극복하는 백신제조용 연속세포주, 즉 베로세포에서 일본뇌염 바이러스를 개발 및 증식하는 것이 본 발명자들에 의해 개발되었다. 본 발명은 일본뇌염 바이러스를 배양하기 위해 개발된 방법 및 효율적인 비용으로 백신을 제조를 위한 일련의 공정을 제시한다.
또한, 본 발명은 다음의 방법에 있어서 종래의 상업화된 일본뇌염 백신보다 개선된 방법을 제시한다.
1. 안전성: 본 발명의 바이러스는 베로세포의 배양을 통해 병독력을 획득하지 않아 생산 위험성을 줄이고 엄격한 통제에 의한 바이러스-불활화 공정으로 추가적인 수준의 안전성을 접종자에게 제공해준다. 이러한 이점은 기존의 상업화된 일본뇌염 백신에 의해 제공된 바 없다.
2. 보다 안전한 생산 세포 기질의 공급 증가: 본 발명의 일본뇌염 백신은 소 혈청이 존재하지 않은 상태에서 제조되어 수율이 높고, 저렴하고 대량 생산에 쉽게 적용 가능하다. 이러한 이점 또한 기존의 상업화된 일본뇌염 백신에서 찾아 볼 수 없다.
3. 감소된 Reactogenicity: 본 발명의 일본뇌염 백신에는 젤라틴 안정화제가 혼입되지 않고 동물의 뇌성분이 근원적으로 포함되지 않으므로 기존의 백신(Saskaguchi M. et al. Vaccines, 68-69, 1998)에서 나타나는 것과 같은 백신 반응의 위험성을 줄여준다. 또한, 기존의 일본뇌염 백신에 혼입된 바람직하지 않은 소-유래된 성분이 효과적으로 제거된다. 결론적으로 본 발명의 이러한 안전성 특징은 종래의 일본뇌염 백신에 의해 제공되지 못했다.
4. 효능의 증가: 효과적인 정제뿐만 아니라 베로세포에서의 성공적인 대량 생산 및 생산시 보조제를 사용하지 않음으로 인하여 일본뇌염 백신을 제형하는데 효능적인 부형제(adjuvant)를 사용할 수 있음이 가능하다. 일본뇌염 백신에 이러한 부형제의 사용은 처음이다. 비록 백신 제제에 부형제의 사용이 다른 백신에 적용되었을 지라도 이러한 지식을 일본뇌염 백신에 응용하는 것은 종래의 일본뇌염 백신중 어떠한 것도 그의 안전한 제조를 보장한 것이 없었기 때문에 실현된 바 없다.
결론적으로, 어떠한 것도 지금까지 일본뇌염 백신의 상업화에 상기된 이점을 충족하는 새로운 일본뇌염 백신을 제공하지 못했다.
따라서, 본 발명의 목적은 많은 국가에서 허가를 받을 수 있도록 표준 세포 기질에서 생성된 안전하고 효과적인 일본뇌염 백신을 제공하는데 있다. 본 발명의 또 다른 목적은 고도로 정제된 안정된 백신을 제조하고 소량의 항원으로 고도의 면역원 특성을 나타내는 백신을 제형하는 효과적인 방법을 제공하는데 있다.
본 발명자들은 기존의 마우스 뇌를 이용하지 않고, 인간에서 안전성이 검증된 세포에 적응되어 높은 생산성과 면역원성을 가지는 신규의 일본뇌염바이러스를 개발하고자 집중적인 연구를 수행한 결과, 베로세포에 일본뇌염바이러스를 계대배양하여 적응시켰을때 안전하고 효능이 뛰어난 일본뇌염백신의 제조에 적합한 일본뇌염바이러스 변이주를 얻을 수 있음을 발견하였다. 특정하여 예를 들면, 베로(Vero, ATCC CCL 81)세포주에서 일본뇌염바이러스 SA14-14-2(PCK)의 계대배양을 수행하고 계대배양별 선별 과정을 거쳐 베로 세포주에서 상업적 생산이 가능한 CJ50003 바이러스주를 발명하였다.
도 1은 베로세포(Vero Cell)에서의 일본뇌염바이러스 SA14-14-2(PDK)의 계대력 및 적응력을 보여주는 그래프이다. 1 계대 바이러스는 베로세포 단층에 0.1 moi의 SA14-14-2(PDK) 바이러스를 접종한 후 5일 경과하여 회수된 것이다. 일본뇌염 바이러스 역가는 베로세포 단층에 플라크 검정을 실시하여 측정한 것이다. 바이러스 계대는 1 계대 바이러스를 출발물질로 하고 실시예 1에 기술된 바와 같이 연속적으로 바이러스를 감염시키고 역가를 측정하여 30 계대까지 실시하였다.
도2는 회전병에서 일본뇌염 바이러스 CJ50003을 베로세포 단층에 감염시킨 후 3 내지 17일 기간 동안에 2일마다 회수된 일본뇌염 바이러스 CJ50003의 역가를 보여준다. 베로세포 단층은 세포당 0.01 플라크 형성 단위(pfu)의 moi로 감염되었다. 바이러스는 35℃에서 2시간동안 흡착되도록한 다음 PBS로 3회 세척하고 100ml의 무혈청 EMEM을 공급하여 35℃에서 배양되었다. 접종 후 3 내지 17일 기간에 48시간마다 배양물 상등액을 새로운 무혈청 EMEM으로 대체시켰다. 베로세포 단층에서 플라크 검정을 실시하여 바이러스 감염 역가를 측정하였다.
도3은 수크로즈 농도구배 초원심분리에 의해 정제된 일본뇌염 바이러스를 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯하여 분석한 결과를 보여준다. 60ml의 농축된 배양물 상등액을 40ml의 15-60% 수크로즈 농도구배에 적용시키고 45 Ti 로터에서 22,000rpm, 12℃로 18 시간동안 원심분리하였다. 튜브의 바닥으로부터 2ml의 샘플을 수거하여 4-20% 농도구배 SDS-PAGE 하고 분리된 단백질을 니트로셀룰로즈 막으로 옮겼다. 단백질을 쿠마시 블루(패널 A) 및 질산은(패널 B)로 염색하여 가시화하였고 항원을 일본뇌염 바이러스 E 단백질에 대해 반응하는 모노클로날 항체(패널 C)와 반응시켜 가시화하였다. 레인 1은 위로부터 250, 98, 64, 50, 36, 30, 16 및 6 kDa의 분자량을 나타내는 기염색 단백질 표준물(상표명: Novex Seeblue)이고, 레인 2 내지 10은 초원심분리 후 바닥으로부터 분획물 3 내지 11번이며, 영문자 E는 표피 단백질을, 영문자 C는 캡시드 단백질을, 영문자 M은 막 단백질을 가리킨다.
도4는 정제된 본 발명의 일본뇌염바이러스의 포름알데하이드 불활화 동역학을 보여준다. 정제된 바이러스를 4℃ 또는 22℃에서 0.018% 포름알데하이드로 불활화시켰다. 지정된 시간에서 채취된 샘플을 베로세포 단층에서 직접 플라크 검정하여 잔여 감염성 바이러스에 대해 역가 측정하였다. 추가로, 다음과 같이 증폭검정을 실시하여 낮은 역가 수준의 바이러스를 검출하였다. 베로세포 단층이 함유된 두 개의 플라스크에 여러 시점의 바이러스-불활화 샘플을 접종하였다. 35℃에서 2시간 흡착시킨 후 배지를 재공급하고 35℃에서 배양하였다. 세포를 감염후 7 및 14일째 배양물 상등액을 회수하고 플라크 검정하였다. 실험의 재현성 검증을 위해 두 번의 별도 실험으로부터의 불활화 시점을 결정하였는데 검정색 정사각형(■)은 4℃에서 검정색 원형(●)은 22℃에서 실험이 이루어진 것을 보여준다. 포름알데하이드가 없이 단순히 온도에 따른 불활화 대조군이 함께 실시되었으며 개방된 정사각형(□)은 4℃에서, 개방된 원형(○)은 22℃에서 이루어진 것을 보여준다.
본 발명은 베로세포주에 계대배양하여 적응시킨 약독화된 일본뇌염바이러스 변이주를 제공한다. 본 발명의 약독화된 일본뇌염 바이러스는 CJ50003으로 명명하여 1997년 8월 16일에 유전자 은행에 기탁하고 기탁번호 KFCC10982를 부여받았다. 본 발명의 바이러스는 이하에서 CJ50003으로 언급될 것이다.
또한, 본 발명은 베로세포주에 계대배양하여 적응시킨 약독화된 일본뇌염바이러스 변이주를 포함하는 일본뇌염 백신을 제공한다.
본원에서는 본 발명을 대표하여 일본뇌염바이러스 CJ50003 변이주에 관하여 기술할 것이다.
본 발명에서 원형 바이러스로 사용된 일본뇌염 바이러스는 미국육군연구소(Walter Reed Army Institute of Research: WRAIR)에 보존되온 SA14-14-2 (PDK)바이러스주이다. SA14-14-2(PDK)바이러스는 모기에서 분리된 SA14 바이러스 독성주를 초기 햄스터 신장 (Primary Hamster Kidney: PHK) 세포에서 연속 계대를 행하여 분리된 바 있는 SA14-14-2(PHK)바이러스 약독화주를 개의 초기 신장세포(Primary Dog Kidney; PDK)에 적응시켜 분리된 것이다(Vaccine 1988; 6, 513-518).
SA14-14-2(PDK) 바이러스는 Flaviviridae에 속하는 바이러스의 하나이며 유전자가 단일 나선(single-stranded)의 양성 RNA 게놈(positive-sense RNA genome)으로서, RNA의 5' 말단은 메틸화(methylation)되어 있고, 3' 말단은 poly A 구조가 없는 것으로 알려져 있다. RNA 게놈은 약 11 Kb의 크기로 뉴클레오캡시드 단백질 (C: 13,500 Da)과 결합된 상태로 존재하는 물리화학적 특성을 지닌다. 또한 상기 바이러스에는 막단백질 (M: 8,700Da)과 외피단백질 (E: 53,000Da)이 포함되어 있으며 비구조단백질로는 NS1, 2a, 2b, 3, 4a, 4b, 5 등이 포함되어 있는 것으로 알려져 있다.
본 발명에 따르면, 일본뇌염 바이러스는 35℃이하의 온도에서 계대배양하여 베로세포에 적응되었다. 베로세포에서의 연속적인 계대배양 결과 바이러스 역가가 증가하여 배양물 상등액 1ml 당 107pfu (플라크 형성 단위/ml) 이상의 바이러스 역가를 나타내며 또한 최고의 바이러스 역가를 나타내는데 걸리는 배양시간이 감소되었다. 본 발명은 높은 수율의 바이러스 생산성을 낳는 보충제로서 혈청이 요구되지 않는 다중 회수 공정 (multiple time harvesting process)의 개발에 관한 것으로 이는 효율적인 비용으로 백신을 대량 생산할 수 있는 상업상 실시 가능한 특징이 된다. 본 발명에 따른 바이러스 배양에서의 다중 회수 공정은 감염세포의 세포병변효과를 감소시키는 역할을 한다. 본 발명의 일본뇌염 백신은 감소된 수준의 세포병변효과로 인하여 극소량의 잔여 세포 유래된 성분만을 함유한다. 또한, 본 발명의 일본뇌염 백신은 강화된 면역원성과 기존의 일본뇌염 백신보다 질병에 대해 보다 큰 보호능을 제공할 것으로 기대된다. 본 발명의 정제된 일본뇌염 백신은 배양된 베로세포로부터 정제된 바이러스가 사람백신을 위한 개발요건을 충족한다는 점에서 기존의 백신보다 상당한 이점을 지닌다.
다른 관점에서, 본 발명은 또한 일본뇌염 백신의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 백신의 높은 생산성, 순도 및 효능을 제공할 수 있다. 일본뇌염 바이러스 SA14-14-2(PDK)를 35℃이하의 온도에서 베로조직 배양 세포에서 4회 이상 계대배양하여 적응시키고 베로세포 및/또는 LLC-MK2 세포에서 형성된 포커스(Focus) 수를 기준으로 바이러스의 증식을 모니터하면서 배양된 바이러스를 선별함으로써 본 발명의 일본뇌염 바이러스 CJ50003을 수득하였다. 이러한 적응으로부터 수득된 본 발명의 바이러스는 베로세포 배양물의 상등액 1ml당 1x107pfu 이상의 피크역가와 회수를 위한 배양 시간이 크게 감소된 특징을 갖는다.
일본뇌염 바이러스 SA14-14-2는 모기에서 분리된 SA14 바이러스 독성주를 초기 햄스터 신장 (PHK) 세포에서 연속 계대를 행하여 분리된 바 있는 SA14-14-2(PHK)바이러스 약독화주를 개의 신장세포(PDK)에 적응시켜 분리되었다(Kenneth H. Eckels, et al. Vaccine 1988; 6, 513-518). 그러나, PHK 및 PDK 세포는 WHO에 의해 인정되지 않은 것으로 사람에 적용되는 백신의 제조를 위해서는 적합하지 않다. 반면에, 베로세포는 WHO에 의해 사람에 적용될 수 있는 것으로 승인된 것이므로, 본 발명의 베로세포 적응된 일본뇌염 바이러스 변이주 CJ50003은 사람용 백신의 제조를 위해 매우 적합한 것이다.
본 발명의 베로 적응된 일본뇌염 바이러스 변이주 CJ50003은 베로세포에서 30계대 이상 계대시켜 보았을 때 바이러스 역가 및 플라크의 형태는 계대시키는 동안에 변동이 없었으며 이러한 사실은 본 발명의 바이러스가 베로세포 계대 중에 안정한 표현형 특성을 유지하고 있음을 시사한다.
본 발명의 바이러스 CJ50003의 생물학적 특징과 관련된 분자적 기초를 파악하기 위해 본 바이러스의 물리화학적 성질을 분석하였다. cDNA 클로닝 및 서열분석으로 본 발명 바이러스의 게놈의 염기서열을 결정한 결과, 원형의 SA14-14-2(PDK) 바이러스와 달리 CJ50003은 외피(E) 단백질 유전자의 염기 서열 1,032번째 아데닌, 1,506번째 아데닌, 1704번째 아데닌 및 1,769번째 구아닌이 각각 구아닌, 구아닌, 구아닌 및 티민으로 치환되어 있으며, 그에 따라 그 유전 정보에 상응하는 아미노산 서열 19번째 트레오닌, 177번째 트레오닌, 243번째 라이신 및 264번째 글루타민이 각각 알라닌, 알라닌, 글루타민산, 히스티딘으로 변환되어 있음을 알 수 있었다. E 단백질에서의 아미노산 변환은 베로세포에서 그 바이러스의 30계대까지 계속 유지되었다.
본 발명의 일본뇌염 바이러스 CJ50003은 베로 세포주에의 계대과정 별로 바이러스주를 어린 마우스의 뇌내에 주사하여 마우스 치사를 살펴 보았을 때 마우스 치사를 전혀 초래하지 않는 것으로 나타났다. 이는 베로 세포주에 적응된 일본뇌염 바이러스 CJ50003이 신경독력을 전혀 나타내지 않는 약독화주로서 매우 안정된 백신균주임을 입증한다. 따라서, 본 발명의 바이러스는 생 일본뇌염 바이러스 백신 및/또는 불활화된 백신을 위해 사용될 수 있음이 명백하다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 조(crude) 또는 중간의 순도 물질을 동결시키지 않고 세포배양물로부터 바이러스를 정제하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 세포편을 제거하고, 바이러스를 농축시키며, 세포기원의 물질을 침전시키고 수크로즈 농도구배 초원심분리시켜 바이러스를 정제하고, 구배를 분별하며, 바이러스의 분획물을 검정하는 단계를 포함한다. 더욱 구체적으로는, 본 발명은 바이러스를 혈청 단백질 보충제의 존재 또는 부재하에 연속 세포주에서 바이러스를 높은 역가로 증식시키고 이 바이러스를 초원심분리한 후 바이러스-양성 분획을 수거함으로써 정제된 일본뇌염 바이러스를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일본뇌염 바이러스 CJ50003은 베로 조직 배양 세포에서 증식된다. 회전병내의 표면에 연속층으로 성장된 베로세포를 CJ50003 바이러스로 감염시키고 배양한다. 바이러스의 회수는 다중 회수 방법에 의해 이루어질 수 있다. 배양물 상등액의 회수는 감염의 moi에 따라 감염 후 2 또는 3일째 수행하고 새로운 배지를 그 배양물에 재공급한다. 이 배양물을 2일간 배양한 후 배양물 상등액을 다시 회수한다. 회수는 감염 후 8 또는 9일까지 4회에 걸쳐 반복할 수 있으며 바이러스 역가는 배양물 상등액 107pfu/ml 이상으로 유지되었다. 다중 회수 방법은 회전병 단위당 높은 수율의 바이러스를 제공하였고 이에 따라 본 발명은 보다 더 시장성이 있게 되었다. 게다가, 다중 회수 방법은 감염 세포의 세포병변효과를 감소시켜 주었다. 이렇게 감소된 세포병변효과의 수준은 본 발명의 일본뇌염 백신에 세포 파생된 잔여 성분이 극히 적은 수준으로만 존재하도록 해준다. 회수된 배양물 상등액은 정제할 때까지 4℃에서 보존할 수 있다. 회수된 배양물 상등액의 정제는 본 분야에 알려진 통상의 방법에 의해 달성될 수 있는데 예들 들면 1500g의 저속으로 10분간 원심분리하고/하거나 0.45 기공크기의 필터를 통해 여과한 것이다. 회수된 배양액은 농축할 때까지 4℃에서 보존한다. 바이러스를 농축하기 위하여 배양액을 초원심분리하고 잔여물을 회수한다. 다른 농축방법으로서, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 8000을 배양액에 10%까지 용해시키고 침전물을 인산염-완충 염수(PBS, pH7.0)과 같은 적당한 완충액중에 용해시킨다. 세포로부터 파생된 DNA 또는 다른 물질을 제거하기 위하여 프로타민 설페이트 침전을 수행하며 이것은 바이러스 농축용액에 프로타민 설페이트를 첨가하고 예들 들면 12,000g의 고속으로 5분 동안 원심분리하여 달성할 수 있다. 바이러스를 좀더 정제하기 위하여 밀도 구배 초원심분리를 15-60% 연속 또는 다층 수크로즈 농도구배상에서 수행한다. 수크로즈 구배를 분별하고 분획을 바이러스에 대해 검정한다. 바이러스 양성 분획을 검정하는 방법에는 플라크 검정, 혈구응집 검정, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 및 항원 검정 (예, 면역검정)이 포함된다. 높은 정제도의 확보를 위해 분획을 높은 바이러스 역가 및 낮은 수준의 기타 불순물을 기준으로 모았다. 베로 세포 파생된 염색체성 DNA 및 단백질을 검사하여 정제된 바이러스 수거물의 순도를 결정하였다. 그 결과 숙주 세포 DNA 및 단백질의 양은 각각 정제된 일본뇌염 바이러스 5㎍당 2.5pg 및 2ng이하인 것으로 나타났다. 이러한 사실은 상기된 정제방법이 바이러스 항원으로부터 다른 불순물을 효과적으로 제거하였음을 입증한다. 1L의 감염된 배양액으로부터 일본뇌염 바이러스 수율은 약 2.3밀리그램인 것으로 결정되었다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 일본뇌염 바이러스를 불활화시켜 항원성은 보존하면서 감염성을 파괴하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 유효량의 포름알데하이드를 첨가하고 바이러스가 불활화되도록 하는 조건하에서 바이러스를 포름알데하이드와 배양하는 것이다. 구체적으로 설명하면, 모은 분획에 PBS와 같은 적당한 완충액을 가하여 적절한 단백질 농도로 희석시키고 이 희석물에 포름알데하이드를 첨가한다. 포름알데하이드와의 배양은 22℃ 또는 4℃에서 수행한다. 바이러스의 항원성을 상실하지 않고 바이러스의 감염성을 완전히 파괴하기 위해서는 22℃에서는 적어도 4일, 4℃에서는 46일이 걸린다. 대규모로 배양할 경우에는 22℃에서 일본뇌염 바이러스를 불활화하는 방법이 간단하기 때문에 바람직하며 배양 시간은 안전성을 확보하기 위하여 7일간 더 연장했다. 그러나, 효과적인 불활화제의 예로는 포름알데하이드를 들 수 있지만 이로서 한정되는 것은 아니다. 일반적으로, 불활화는 화학적 수단 또는 물리적 수단에 의해 달성될 수 있다. 화학적 불활화는 예를 들면 효소, β-프로피온락톤, 에틸렌이민 또는 이의 유도체, 또는 트윈, 트리톤, 나트륨 데옥시콜레이트 및 설포헤타인과 같은 유기 용매로 바이러스를 처리함으로써 달성될 수 있다. 필요한 경우, 불활화 물질은 후에 중화될 수 있다. 포름알데하이드로 불활화된 경우는 예를 들면 티오설페이트로 중화될 수 있다. 물리적 불활화는 바람직하게는 바이러스에 UV, X선 또는 감마선과 같이 에너지가 풍부한 방사선을 쪼여 달성될 수 있다.
본 발명의 일본뇌염 백신은 주사제, 즉 액제 또는 현탁제로서 제조된다. 탄수화물 (솔비톨, 만니톨, 전분, 수크로즈, 덱스트란, 글루코즈 등), 단백질 (알부민, 카세인 등), 단백질 함유제 (소혈청, 탈지유 등) 및 완충액 (알카리 금속 포스페이트)과 같은 안정화제를 첨가할 수 있다. 안정화제를 첨가한 후 제제는 동결건조시키고 진공 또는 질소하에 보존할 수 있다. 필요한 경우, 부형제 작용을 나타내는 하나 이상의 화합물을 첨가할 수 있다. 이러한 목적에 적합한 화합물로서는 예들 들면 수산화알루미늄, 인산알루미늄 또는 산화 알루미늄, 광유 (예, Bayol, Marcol 52) 및 사포닌이 있다. 또한, 필요한 경우, 트윈 및 스판과 같은 하나 이상의 유화제가 바이러스 물질에 첨가될 수 있다.
부형제의 유효성은 부형제에 흡착되는 백신중의 불활성 바이러스를 실험 통물에 투여하여 발생되는 바이러스에 대한 중화항체의 양을 측정하여 결정할 수 있다. 효과적인 부형제의 예로는 수산화알루미늄이 포함되나 이로써 한정되는 것은 아니다. 백신의 효능은 백신을 마우스에 접종한 후 면역된 마우스로부터 채취한 혈청으로 야생형 독성주 바이러스를 중화시키는 정도를 검사하는 플라크 감소 중화 시험(PRNT) 또는 면역된 마우스에 독성주 바이러스를 뇌내주사하여 마우스의 생존률을 검사하는 직접도전법에 의해 결정되었다. 그 결과 본 발명의 백신은 대조 백신과 비교하여 중화항체를 발생하는 효능에 있어서 같거나 보다 나은 것으로 밝혀졌다.
상이한 계대 수에 따라 베로 적응된 바이러스의 면역원성의 변화 가능성을 결정하기 위하여 상이한 계대 수로 백신을 제조하고 각 백신의 효능을 비교하였다. 베로세포에서 연속적으로 계대배양하면서 그 계대 수를 달리하여 얻은 바이러스로부터 제조된 백신은 서로간에 비교했을 때 현저한 효능차이는 없었다. 따라서, 베로 적응된 일본뇌염 바이러스 CJ50003은 계대 별로 안정한 면역원성을 나타낸다고 말할 수 있다.
이하 실시예에서 본 발명에 따라 베로 세포에 적응된 약독화된 일본뇌염 바이러스 및 이를 함유한 일본뇌염 백신이 구체적으로 예시되어 설명될 것이다. 지금까지의 설명내용과 이하의 실시예로 부터 당업자는 본 발명을 용이하게 실시할 수 있을 것이다.
실시예
실시예 1
베로 세포에서 일본뇌염바이러스 SA14-14-2(PDK)의 적응
베로세포 배양물에서 연속 계대를 개시하기 위해 일본뇌염 바이러스 SA14-14-1(PDK) (개신장세포에서 8 계대된 SA14-14-2 바이러스)를 사용하였다. 베로세포 단층에 SA14-14-2(PDK)를 세포당 0.1 pfu의 moi로 접종하였다. 감염된 세포 배양물은 10% 소태혈청으로 보충된 이글 최소 필수 배지로 구성된 영양배지 5ml가 함유된 25㎠ 배양 플라스크에서 공기중 약 5% CO2의 대기 및 약 35℃ 이하의 온도, 전형적으로 약 32℃ 내지 35℃, 바람직하게는 약 35℃에서 성장시켰다. 세포병변효과를 현미경으로 관찰하고 혈구흡착(HA) 검정, 플라크 검정 및 엘라이자(ELISA)를 포함한 여러 검정법을 통해 바이러스 항원의 존재을 검정하여 바이러스의 성장을 모니터하였다. 배양물이 최고의 바이러스 역가를 나타냈을 때인 감염 후 5일째에 바이러스를 회수하고 원심분리로 분리하였다. 상등물을 베로세포에 플라크 검정하여 플라크 크기가 상대적으로 큰 단일 플라크를 분리하고 베로세포에 감염시켜 그 양을 증폭시켰다. 추가의 계대를 위하여 증폭된 단일 플라크 유래 바이러스를 베로세포에 재감염시켰다. 상기된 바와 같이 연속적인 바이러스 감염, 역가측정 및 플라크 검정을 하면서 30 계대를 실시하였다. 도1에서 볼 수 있듯이 베로세포에서 4 계대시 바이러스 역가는 배양물 상등액 1ml당 약 4x107pfu였으며 이후로 계속 계대했을 때 역가는 그 수준을 계속 유지하였다. 바이러스 회수를 위한 최적 기간은 1 계대시 5일 기간에서 4 계대시 2 내지 3일로 줄어들었다. 베로세포에서의 4 계대시 1계대대비 바이러스 수율이 약 105pfu/ml 에서 107pfu/ml이상으로 증가하고 최적 배양시간도 5일에서 2일로 감소되어 이때의 바이러스를 일본뇌염 백신을 제조하기 위한 출발물질로서 선택하였다. 베로세포에서 4 계대된 바이러스를 CJ50003 (베로, PS4)로서 명명하였다. PS는 세포에서의 바이러스 계대 수를 의미한다.
실시예 2
CJ50003 바이러스의 성상확인: 외피 유전자의 서열분석 및 신경독력 연구
CJ50003 바이러스의 생물학적 특징에 대한 분자적 근거를 파악하기 위하여 주요 중화 에피토프를 보유한 외피(E) 유전자를 암호화한 1500개 뉴클레오타이드 서열을 결정하고 모 백신 바이러스 SA14-14-14-2(PDK), SA14-14-2(PHK) 및 야생형 SA14 바이러스(Aihira, S. et al. Virus Genes, 5:95-109, 1991; Ni, H. et al. J Gen Virol. 76-401-407, 1995; Ni, H. et al. J Gen Virol. 76:409-413, 1995; Nitayaphan, S. et al. Virology 177:541-542, 1990)의 서열과 비교하였다. CJ50003 바이러스 (베로, PS4)를 서열분석을 위해 사용하였다. 그 결과 C-말단 영역(아미노산 280 내지 500)은 완전히 보존되어 있는 한편 N-말단 영역(아미노산 1 내지 279)은 바이러스간에 서열변화가 일어난 것으로 밝혀졌다. N-말단 영역에서의 변이는 거의 일정하게 분포되어 일어났다. CJ50003의 E 단백질 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 SA14/CDC와 8개 뉴클레오타이드와 7개 아미노산이 상이하였으며 SA14-14-2(PDK)는 SA14/CDC와 7개 뉴클레오타이드와 5개 아미노산이 상이하였다. 이의 결과는 하기 표1에 요약되어 있다.
CJ50003 바이러스의 서열은 5개 위치에서 SA14-14-2(PDK) 바이러스의 공지된 서열과 다르다: 위치 1032, 1506, 1704 및 1769에서의 뉴클레오타이드 변화는 SA14-414-2(PDK)와 CJ50003사이에 4개의 아미노산 차이를 유발하였다. 그러나 위치 989에서의 뉴클레오타이드 변화는 아미노산 치환을 유발하지 않았다. CJ50003 바이러스를 계속해서 계대배양한 경우, 즉 15 및 30 계대배양한 경우 더 이상 뉴클레오타이드의 변화는 일어나지 않았다. 따라서, CJ50003 바이러스와 모 바이러스 SA14-14-2(PDK)사이에는 5개의 뚜렷한 뉴클레오타이드와 4개의 아미노산 변화가 있다. 다른 약독화된 일본뇌염 바이러스와 비교하여 특이하게 상이한 SA14-14-2(PDK)에서 243번의 리신 잔기는 CJ50003에서 글루탐산 잔기로 치환되었다.
CJ50003 서열은 SA14-14-2(PHK) 바이러스의 공지 서열(Aihira, S. et al. Virus Genes, 5:95-109, 1991)과 상이하였다. 1032번에서의 뉴클레오타이드 차이는 위치 E19에서의 아미노산 차이를 일으켰으나 뉴클레오타이드 989번에서의 변화는 아미노산 치환을 일으키지 않았다. CJ50003에서 1506 및 1704번의 뉴클레오타이드는 SA14-14-2(PHK)에서 존재하는 그들 위치에서의 뉴클레오타이와 동일하였으나 SA14-14-2(PDK)에서 존재하는 그들 위치에서의 뉴클레오타이드와는 상이하였다. CJ50003과 SA14-14-2(PHK) E 유전자의 N-말단 영역을 통한 치환 양상은 E19에서의 아미노산 치환을 제외하고 거의 동일하다.
SA14-14-2(PHK), SA14-14-2(PDK) 및 CJ50003 바이러스는 모 SA14 바이러스의 서열과 비교하여 E107, E138, E176 및 E279 위치에서 4개의 동일한 아미노산 치환을 나타낸다. 이들 가운데 바이러스의 신경독력 약독화에 기여하는 것으로 알려진 E138 및 E176 위치에서의 아미노산(Ni, H. et al. J Gen Virol. 76:409-413, 1995)은 베로세포에서의 적응후에도 여전히 보존되었다. 이러한 사실은 CJ50003이 이의 약독화된 특성을 상실하지 않았음을 시사한다.
AA: 아미노산; NT: 뉴클레오타이드 위치
CJ50003 또는 모 바이러스 SA14-14-2(PDK)를 생후 4주된 BALB/c 마우스 뇌내로 주사하여 그들의 마우스에 대한 신경독력을 시험하였다. 이들의 결과는 하기 표 2에 나타나 있다. CJ50003과 SA14-14-2(PDK)사이에는 어린 성숙 마우스의 치사율에 있어서 유의적인 차이는 없었으나 원형 SA14 바이러스와 비교하여서는 CJ50003은 상당히 낮았다. 따라서, 베로 세포 기질로의 도입이 SA14-14-2(PDK)에 신경독력 표현형으로의 재변이를 유발하지 않았고 CJ50003 바이러스는 여전히 약독화된 특성을 갖고 있는 것으로 보여 약독화 생 백신으로의 개발 가능성을 시사한다.
a: Kenneth H. Eckels et al (Vaccine 6:513-518, 1988)
b: 희석되지 않은 바이러스로 접종후 치사된 마우스가 10마리중 하나도 없었음.
실시예 3
바이러스 증식 및 정제
베로세포에서 CJ50003 바이러스를 5 계대하여 종균을 준비하고 동결건조기에 보존해 두었다. 10% 소태혈청(FBS, Gibco)를 함유한 이글 최소 필수 배지(EMEM, Gibco)에서 베로세포를 성장시켰다. 베로세포 단층의 회전병 배양물에 종균 바이러스를 세포당 0.01 내지 0.1 pfu의 moi로 감염시켰다. 배양물을 PBS로 3회 세척하고 혈청이 없는 EMEM을 재공급한 다음 35℃에서 배양하였다. 감염된 베로세포 배양물에서 감염후 2 또는 3일째에 바이러스의 역가는 약 107내지 108pfu/ml였다. 감염후 2 또는 3일째 되는 날부터 감염후 8 또는 9일까지 2일 간격으로 4회에 걸쳐 바이러스를 회수하였는데 이때 세포병변효과는 매우 약한 한편 바이러스 역가는 여전히 107pfu/ml이상을 유지하였다. 그러나, 감염 후 9일이 지난 후에 역가는 107pfu/ml이하였다(도 2). 모은 회수물을 8000rpm으로 15분간 원심분리하고 상등액을 0.45㎛ 필터에 통과시켜 여과하였다. 바이러스 배양물 상등액을 한외여과(Ultrasette, Filtron, 100k) 또는 PEG로 침전시켜 농축시켰다. PEG에 의해 침전된 바이러스를 원심분리하여 수거하고 PBS 또는 STE(10mM 트리스 pH7.2, 1mM EDTA, 150mM NaCl) 완충액중에 현탁시켰다. 한외여과후 잔여물을 250ml로 농축시키고 카세트를 PBS 100ml로 세척하였다. 바이러스 농축물을 0.5-2mg/ml의 프로타민 설페이트를 첨가한 후 얼음속에서 2시간동안 급냉시키고 10,000rpm으로 5분간 원심분리하여 상등액을 수득하였다. 수크로즈 구배상에서 초원심분리하여 농축된 바이러스를 정제하였다. 초원심분리는 38,000g로 18시간 수행하였다. 분획을 세정제 나트륨 도데실 설페이트(SDS-PAGE)가 함유된 폴리아크릴아미드 겔상에서 전기영동(SDS-PAGE)하였다. 뉴클레오캡시드 단백질(C, 13,500Da), 막단백질(M, 8,700Da) 및 외피단백질(E, 53,000Da) 밴드가 SDS-PAGE에서 나타났다(도 3, 패널A). 외피 항원(E)가 마우스 항-일본뇌염 바이러스 모노클로날 항체를 이용한 웨스턴 블롯팅에 의해 검출되었다(도 3, 패널C). 바이러스 단백질을 제외한 다른 단백질 밴드가 은염색된 겔(도 3, 패널B)에서 보이지 않는 바이러스 양성 분획 4 내지 9번을 모으고, 로우리 방법에 의해 단백질 농도를 결정하였다. 접선 유동 한외여과로 농축되거나 또는 PEG8000 침전에 의해 농축된 감염된 베로 배양물로부터 실시한 정제를 단계별로 분석하여 결과를 비교하였다(표 2 및 표 3). 정제된 바이러스를 2배 용량의 PBS로 희석하고 트윈80을 최종 0.01%가 되게 첨가한 후 0.22㎛ 필터를 통과시켜 여과하였다.
특이적 활성 측정(즉, pfu/mg 단백질)을 사용하여 바이러스 제제의 상대적인 순도를 비교하였다. 한외여과에 의한 농축물로부터 정제된 바이러스는 PEG8000 침전에 의한 농축물로부터 정제된 바이러스와 거의 동일한 활성을 나타냈다. 또한, 정제된 바이러스의 순도를 베로세포 파생된 염색체성 DNA 및 단백질을 시험하여 결정하였다. 그 결과 숙주 세포 DNA와 단백질의 양은 농축방법과는 상관없이 정제된 일본뇌염 바이러스 5㎍당 각각 2.5pg와 2ng이하인 것으로 나타났다. 이것은 상기된 두 정제방법이 바이러스 항원으로부터 다른 불순물을 효과적으로 제거하였음을 입증하는 것이다. 그러나, 정제된 바이러스의 단백질 수율의 관점에서 한외여과를 이용한 정제방법이 PEG8000 침전을 이용한 정제방법보다 2배나 더 양호하였다.
실시예 4
바이러스 불활화
정제된 바이러스는 PBS로 투석후 생 약독화된 백신의 제조를 위해 직접사용하거나 불활화된 백신의 제조를 위해 포름알데하이드로 불활화시켰다. 불활화는 0.018% 포름알데하이드로 22℃ 또는 4℃에서 수행하였다. 샘플을 정규적으로 채집하고 플라크 역가측정으로 감염성 바이러스에 대해 직접 검정하였다(도 4). 직접 플라크 검정에 의해 음성으로 판정된 샘플은 낮은 수준의 바이러스를 증폭시키기 위하여 베로세포 단층에 계대하고 재차 플라크 검정을 실시하였다. 감염성이 완전히 불활화되기 까지는 22℃에서는 4일, 4℃에서는 46일이 걸리는 것으로 밝혀졌다(표 5 및 표 6). 불활화 동안에 샘플을 항원 점적 블롯 검정 및 폴리클로날 항혈청으로 검사하여 바이러스의 항원성을 모니터하였다. 이 검정에서 0.018% 포름알데하이드에 22℃에서 10일까지 또는 4℃에서 15일까지 노출후 항원성이 검출될 정도로 상실된 것은 없었다.
안전성을 확보하기 위하여 이들 조건하에서 포름알데하이드로의 불활화는 22℃에서 7일 이상 또는 4℃에서 60일 이상 수행하였다. 불활화 후 샘플중의 포름알데하이드는 0.038%의 나트륨 메타비설파이트를 첨가하여 중화시켰다. 동시에 PBS로 투석을 실시한 다음 0.22㎛ 필터를 통해 여과하였다.
실시예 5
정제되고 불활화된 CJ50003 바이러스(PIV)와 생 약독화된 CJ50003 바이러스(LAV)의 마우스에서의 면역원성
LAV와 PIV의 면역원성을 마우스에서 생산되어 현재 시판품인 불활화 백신 Biken을 양성대조군으로 하여 시험하였다. 이들 세 종류의 면역원을 20마리의 생후 6주된 Balb/c 마우스 그룹에 복강내로 주사하여 면역화시켰다. 면역화는 2주의 간격으로 부형제없이 2회 접종으로 실시하였다. 2차 접종후 2주 경과하여 혈청을 각 그룹의 마우스로부터 채취하여 모은 후 PRNT 방법에 의해 중화항체의 존재에 대해 검사하였다(표 7). 표 7에서 보는 바와 같이 세 종류의 면역원이 접종된 마우스 그룹간에 중화항체역가는 유의적 차이가 없이 높게 나왔다.
a: 중화항체의 역가는 마우스뇌에 계대된 나카야마 바이러스 플라크의 50% 감소를 유발하는 혈청희석의 역수로서 정의된다.
b: Biken 백신 1회 용량은 5㎍의 바이러스 단백질(TCA-침전물)을 함유한다.
PIV의 면역원성을 마우스에서 좀더 시험하기 위하여 동종번식된 성숙한 마우스를 알룸(수산화알루미늄) 부형제를 함유한 또는 함유하지 않은 불활화된 바이러스의 여러 희석물로 면역화하였다. 20마리의 생후 6주된 BALB/c 마우스 그룹에 PIV 500ng, 50ng 및 5ng을 수산화알루미늄과 섞어서 또는 단독으로 피하주사하여 면역하였다. 마우스는 3주 간격으로 2회 접종되었다. 2차 면역화후 3주 경과하여 각 그룹의 마우스로부터 혈청을 모으고 마우스뇌에 계대된 야생형 독성주 나카야마 바이러스와 중화반응시켜 중화항체의 역가에 대해 검사하였다(표 8). PIV는 모든 용량에서 Biken 백신보다 양호하였으며 부형제는 PIV 50ng 및 500ng에 대한 마우스의 면역반응을 각각 약 4배 및 8배로 상당히 증가시켜 주었다.
a: 중화항체의 역가는 마우스뇌에 계대된 나카야마 바이러스 플라크의 50% 감소를 유발하는 혈청희석의 역수로서 정의된다.
b: Biken 백신 1회 용량은 5㎍의 바이러스 단백질(TCA-침전물)을 함유한다.
PIV의 생체내에서의 야생주 감염 치사 보호 효능을 BALB/c 마우스에서 직접도전법으로 시험하였다. 보호 검정을 위해 그룹당 10마리의 생후 3주된 BALB/c 마우스 그룹에 불활화된 일본뇌염 바이러스를 수산화알루미늄과 섞어서 또는 단독으로 뒷다리에 피하주사하여 접종하였다. 동일한 주령의 대조마우스 그룹에 PBS 또는 비특이적 항원을 수산화알루미늄과 섞어 접종하여 음성대조군으로 했다. 3주후에 마우스를 동일용량으로 이차 접종하였다. 면역화 후 3주째에 PBS 30㎕에 함유된 야생형 독성주 일본뇌염 바이러스(나카야마, 마우스뇌에 적응됨) 500pfu를 마우스의 두개내에 접종하였다. 도전된 마우스의 생존율과 치사율을 21일까지 매일 모니터하였다. 표 9에 나타나 있듯이, PIV 50ng으로 면역화된 마우스는 90% 보호된 것으로 나타났다. 게다가, 알룸과 혼합된 PIV 50ng 및 5ng으로 면역화된 마우스는 각각 100% 및 70% 보호된 반면 1/100 용량의 Biken 백신은 면역화된 마우스의 50%를 보호하였다. 음성 대조군의 모든 마우스는 도전 후 5 내지 7일째에 병들고 사망하였다. 따라서 PRNT범에서와 상통하게 마우스 직접도전법에서도 PIV는 기존의 시판품에 비해 알룸혼합제제나 알룸비혼합제제 형태로 동등 또는 우세한 백신 효능을 나타내었다.
a: 마우스는 3주 간격으로 시험백신을 2회 접종하여 면역화한 다음 나카야마 바이러스주 500 pfu로 도전되었다.
b: 동일한 주령의 대조 마우스는 PBS 또는 알룸 혼합 비특이적 항원으로 접종되었다.
c: Biken 백신 1회 용량은 5㎍의 바이러스 단백질(TCA-침전물)을 함유한다.
베로세포에서의 계대중에 CJ50003 바이러스의 면역학적 안정성을 조사하기 위하여 베로세포에서의 서로 다른 계대수를 갖는 바이러스를 개별적으로 정제하고 면역원성을 상기 표 8에 기술된 방법으로 결정하였다. 하기 표 10에서 볼 수 있듯이, 베로세포에서의 상이한 바이러스 계대수를 갖는 바이러스로부터 제조된 백신은 중화항체를 유도하는 능력에 있어서 서로간에 현저한 차이가 없었다. 상기 결과는 CJ50003 바이러스는 베로세포 계대수가 상당히 증가해도 면역원성에 영향을 미치는 변이가 발생하지 않아 면역학적으로 매우 안정한 균주임을 시사한다.
a: 면역원(PIV-Xps): 베로세포에서의 계대수가 X인 CJ50003 바이러스로 제조된 정제된 불활화 백신
b: 중화항체의 역가는 마우스뇌에 계대된 나카야마 바이러스 플라크의 50% 감소를 유발하는 혈청희석의 역수로서 정의되며 세 번의 별개 실험에서 얻은 결과의 평균값이다. 50% 종점은 리드앤드뮌히법(Reed와 Muench)에 의해 결정되었다.
c: 표준편차
상기 결과들을 종합해 볼 때 CJ50003을 이용한 불활화된 일본뇌염 바이러스 백신과 생 약독화된 백신 모두는 유용한 사람 백신이 될 수 있음을 시사한다. 표준 세포주인 베로세포에서 일본뇌염 바이러스를 고역가로 증식시키고, 이들 바이러스를 정제한 다음 이들을 면역원성이 상실되지 않으면서 불활화하고, 효과적으로 면역원성을 유발하는 항원량과 부형제는 혼합하는 비교적 빠르고 효율적인 공정이 개발되었다. 이들 제제는 기존의 백신에 비해 마우스에서 백신효능이 동등 또는 그 이상인 것으로 밝혀졌다.
이상의 결과로부터 본 발명의 약독화된 일본뇌염 바이러스 변이주는 안전하고 효능적인 면역원으로서 작용하여 인간 일본뇌염 백신의 제조에 매우 유용하게 사용될 수 있다.
Claims (7)
- 베로 세포에 계대배양하여 베로세포에 적응시킨 약독화된 일본뇌염 바이러스.
- 제 1항에 있어서, 바이러스 역가가 베로세포에서 1 x 107PFU/ml 이상이고, 성숙한 어린 마우스에 대한 LD50/pfu가 0.000001 미만인 약독화된 일본뇌염 바이러스.
- 제 1항 또는 2항에 있어서, CJ50003(기탁번호: KFCC10982)인 약독화된 일본뇌염 바이러스.
- 제 1항의 약독화된 일본뇌염 바이러스를 포함한 일본뇌염 백신.
- 제 4항에 있어서, 바이러스가 불활화제에 의해 불활화된 백신.
- 제 4항에 있어서, 바이러스가 불활화제에 의해 처리되지 않은 생 약독화된 일본뇌염 바이러스인 백신.
- 제 4, 5 또는 6항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 첨가제를 추가로 포함하는 백신.
Applications Claiming Priority (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1019970042002 | 1997-08-28 | ||
| KR19970042002 | 1997-08-28 | ||
| KR97-42001 | 1997-08-28 | ||
| KR1019970042001 | 1997-08-28 | ||
| KR97-42002 | 1997-08-28 | ||
| KR19970042001 | 1997-08-28 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR19990023955A true KR19990023955A (ko) | 1999-03-25 |
| KR100314404B1 KR100314404B1 (ko) | 2002-10-12 |
Family
ID=26633032
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1019980035007A KR100314404B1 (ko) | 1997-08-28 | 1998-08-27 | 베로세포에적응된약독화된일본뇌염바이러스및일본뇌염백신 |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6309650B1 (ko) |
| EP (2) | EP1025209B1 (ko) |
| JP (1) | JP4161017B2 (ko) |
| KR (1) | KR100314404B1 (ko) |
| CN (1) | CN1142271C (ko) |
| AU (1) | AU748730B2 (ko) |
| CA (1) | CA2301000C (ko) |
| DE (2) | DE69837211T2 (ko) |
| DK (2) | DK1604685T3 (ko) |
| ES (2) | ES2281929T3 (ko) |
| FR (1) | FR09C0037I2 (ko) |
| MY (1) | MY129773A (ko) |
| NL (1) | NL300391I2 (ko) |
| NZ (1) | NZ503522A (ko) |
| WO (1) | WO1999011762A1 (ko) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9453055B2 (en) | 2007-12-26 | 2016-09-27 | Kitasato Daiichi Sankyo Vaccine Co., Ltd. | Method of producing japanese encephalitis vaccine stably storable over long time and use of the vaccine |
Families Citing this family (30)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2000083657A (ja) * | 1998-07-13 | 2000-03-28 | Chemo Sero Therapeut Res Inst | 日本脳炎ウイルスワクチン |
| AU743546B2 (en) | 1998-10-05 | 2002-01-31 | Research Foundation For Microbial Diseases Of Osaka University, The | Enhanced immunogen for inactivated vaccine for infection with Japanese encephalitis viruses and process for producing the same |
| EP2251419B1 (en) * | 1999-04-22 | 2012-05-30 | United States Department of Agriculture | Porcine reproductive and respiratory syndrome vaccine, based on isolate JA-142 |
| WO2001076624A1 (fr) * | 2000-04-07 | 2001-10-18 | Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute | Vaccin inactive contre l'encephalite japonaise b et procede d'elaboration associe |
| CN1253220C (zh) * | 2001-06-29 | 2006-04-26 | 贝克顿迪肯森公司 | 通过微管在真皮内输入疫苗和基因治疗剂 |
| JP2007068401A (ja) * | 2003-08-07 | 2007-03-22 | Chemo Sero Therapeut Res Inst | 西ナイルウイルスワクチン |
| JP2007522814A (ja) * | 2004-02-23 | 2007-08-16 | クルセル ホランド ベー ヴェー | ウイルスの精製方法 |
| CN100340596C (zh) * | 2004-05-20 | 2007-10-03 | 佛山市顺德区汉达精密电子科技有限公司 | 回收聚碳酸酯/丙烯腈－丁二烯－苯乙烯共聚物及其回收方法 |
| WO2006108707A1 (en) * | 2005-04-11 | 2006-10-19 | Crucell Holland B.V. | Virus purification using ultrafiltration |
| CA2676775A1 (en) * | 2007-01-31 | 2008-09-25 | Sanofi Pasteur Biologics Co. | Flavivirus vaccine vector against influenza virus |
| ES2588913T3 (es) * | 2008-06-04 | 2016-11-07 | The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute | Uso de una partícula vírica de encefalitis japonesa como adyuvante |
| WO2010013601A1 (ja) * | 2008-07-30 | 2010-02-04 | 久光製薬株式会社 | マイクロニードルデバイスおよびマイクロニードルデバイスによる日本脳炎ウイルス抗原の奏功性を上昇させる方法 |
| KR20120027381A (ko) * | 2009-05-25 | 2012-03-21 | 파나세아 바이오테크 리미티드 | 일본뇌염 백신 및 그것의 제조 방법 |
| KR101144993B1 (ko) * | 2009-06-18 | 2012-06-27 | 대한민국 | 돼지 일본뇌염 바이러스의 고농축 혈구응집용 항원 |
| NO3106176T3 (ko) | 2011-12-06 | 2018-03-10 | ||
| RU2706693C2 (ru) * | 2013-09-14 | 2019-11-20 | Бхарат Байотек Интернэшнл Лимитед | Вирусная вакцина и способы ее производства |
| CN105695424B (zh) * | 2015-04-01 | 2019-06-14 | 中国食品药品检定研究院 | 乙型脑炎减毒活疫苗株sa14-14-2在人二倍体细胞2bs上的适应株及其疫苗 |
| EP3393510B1 (en) * | 2015-12-23 | 2023-02-22 | Valneva Austria GmbH | Zika virus vaccine |
| AU2017207076B2 (en) * | 2016-01-15 | 2021-04-29 | Km Biologics Co., Ltd. | Vaccine containing immobilized virus particles |
| WO2017210215A1 (en) | 2016-05-31 | 2017-12-07 | The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army | Zika virus vaccine and methods of production |
| CN111263642B (zh) | 2017-09-21 | 2024-06-21 | 瓦尔尼瓦公司 | 包含免疫原性屈公病毒chikv-delta5nsp3的医药组成物的制备方法 |
| EP3703741A1 (en) | 2017-11-03 | 2020-09-09 | Takeda Vaccines, Inc. | Zika vaccines and immunogenic compositions, and methods of using the same |
| EP3717511A4 (en) | 2017-11-30 | 2021-09-15 | Takeda Vaccines, Inc. | ZIKA VIRUS VACCINES, IMMUNOGENIC COMPOSITIONS AND THEIR USE PROCEDURES |
| CN110684747B (zh) * | 2018-07-06 | 2024-05-24 | 厦门大学 | 灭活及保存呼吸道合胞病毒的方法 |
| WO2020045368A1 (ja) * | 2018-08-27 | 2020-03-05 | マイキャン・テクノロジーズ株式会社 | 不死化単球細胞および誘導細胞を用いた抗感染症薬，ワクチンなどの評価方法 |
| EP3895729A1 (en) | 2020-03-01 | 2021-10-20 | Valneva Austria GmbH | Cpg-adjuvanted sars-cov-2 virus vaccine |
| AU2021229710A1 (en) | 2020-03-01 | 2022-10-06 | Dynavax Technologies Corporation | CPG-adjuvanted SARS-CoV-2 virus vaccine |
| TW202203967A (zh) | 2020-04-06 | 2022-02-01 | 奧地利商瓦爾尼瓦奧地利有限責任公司 | 不活化ＳＡＲＳ—ＣｏＶ—２病毒疫苗 |
| WO2023148256A1 (en) | 2022-02-02 | 2023-08-10 | Valneva Austria Gmbh | Inactivated sars-cov-2 virus vaccine |
| WO2024153686A1 (en) | 2023-01-18 | 2024-07-25 | Valneva Austria Gmbh | Process for virus production in a bioreactor |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2704258B2 (ja) * | 1987-10-31 | 1998-01-26 | 日本臓器製薬株式会社 | 組み換えワクチニアウイルス |
| GB8821656D0 (en) * | 1988-09-15 | 1988-10-12 | Health Lab Service Board | Pharmaceutical compositions for eliciting immunostimulant effect |
| JPH085803B2 (ja) * | 1988-11-10 | 1996-01-24 | 武田薬品工業株式会社 | 日本脳炎ワクチンの製造法 |
| EP0562136A1 (en) | 1992-03-24 | 1993-09-29 | Division Of Microbiology, Kyoto Biken Laboratories, Inc. | Live vaccine to getah virus infectious disease, and trivalent live vaccine to Japanese encephalitis virus, porcine parvovirus and getah virus infectious diseases |
| US6010894A (en) * | 1997-06-13 | 2000-01-04 | Research Development Foundation | Method of screening for attenuating viruses |
-
1998
- 1998-08-25 DE DE69837211T patent/DE69837211T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-08-25 DE DE122009000037C patent/DE122009000037I2/de active Active
- 1998-08-25 DK DK05014317.1T patent/DK1604685T3/da active
- 1998-08-25 AU AU90047/98A patent/AU748730B2/en not_active Expired
- 1998-08-25 CA CA002301000A patent/CA2301000C/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-08-25 ES ES98941885T patent/ES2281929T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-08-25 EP EP98941885A patent/EP1025209B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-08-25 CN CNB988097974A patent/CN1142271C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1998-08-25 NZ NZ503522A patent/NZ503522A/en not_active IP Right Cessation
- 1998-08-25 JP JP2000508774A patent/JP4161017B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1998-08-25 EP EP05014317A patent/EP1604685B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-08-25 US US09/486,392 patent/US6309650B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-08-25 ES ES05014317T patent/ES2382946T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-08-25 DK DK98941885T patent/DK1025209T3/da active
- 1998-08-25 WO PCT/KR1998/000259 patent/WO1999011762A1/en active IP Right Grant
- 1998-08-26 MY MYPI98003899A patent/MY129773A/en unknown
- 1998-08-27 KR KR1019980035007A patent/KR100314404B1/ko not_active IP Right Cessation
-
2009
- 2009-06-10 NL NL300391C patent/NL300391I2/nl unknown
- 2009-08-14 FR FR09C0037C patent/FR09C0037I2/fr active Active
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9453055B2 (en) | 2007-12-26 | 2016-09-27 | Kitasato Daiichi Sankyo Vaccine Co., Ltd. | Method of producing japanese encephalitis vaccine stably storable over long time and use of the vaccine |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE69837211T2 (de) | 2007-12-06 |
| CN1142271C (zh) | 2004-03-17 |
| EP1025209B1 (en) | 2007-02-28 |
| ES2281929T3 (es) | 2007-10-01 |
| AU748730B2 (en) | 2002-06-13 |
| EP1604685A3 (en) | 2006-07-05 |
| DE122009000037I2 (de) | 2011-06-16 |
| NZ503522A (en) | 2001-06-29 |
| CN1272879A (zh) | 2000-11-08 |
| EP1604685A2 (en) | 2005-12-14 |
| DK1025209T3 (da) | 2007-06-25 |
| DK1604685T3 (da) | 2012-06-18 |
| KR100314404B1 (ko) | 2002-10-12 |
| NL300391I2 (nl) | 2009-11-02 |
| JP4161017B2 (ja) | 2008-10-08 |
| CA2301000A1 (en) | 1999-03-11 |
| FR09C0037I2 (fr) | 2021-11-05 |
| CA2301000C (en) | 2003-07-08 |
| US6309650B1 (en) | 2001-10-30 |
| EP1025209A1 (en) | 2000-08-09 |
| WO1999011762A1 (en) | 1999-03-11 |
| FR09C0037I1 (ko) | 2009-09-25 |
| DE122009000037I1 (de) | 2009-11-05 |
| NL300391I1 (nl) | 2009-08-03 |
| MY129773A (en) | 2007-04-30 |
| EP1604685B1 (en) | 2012-02-22 |
| DE69837211D1 (de) | 2007-04-12 |
| JP2001514844A (ja) | 2001-09-18 |
| AU9004798A (en) | 1999-03-22 |
| ES2382946T3 (es) | 2012-06-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR100314404B1 (ko) | 베로세포에적응된약독화된일본뇌염바이러스및일본뇌염백신 | |
| CN108601825B (zh) | 疫苗组合物 | |
| JP5095685B2 (ja) | 日本脳炎ウイルス群感染症に対する不活化ワクチンのための増強免疫原およびその製造方法 | |
| WO2016070178A1 (en) | Methods and compositions for recombinant dengue viruses for vaccine and diagnostic development | |
| EP4200409A1 (en) | Coronavirus vaccine and method for preparation thereof | |
| KR102253190B1 (ko) | 지카 바이러스 변이주와 이를 포함한 지카 백신 조성물 | |
| JP6985384B2 (ja) | 弱毒変異型ジカウイルスを含むワクチン組成物 | |
| EP3481848B1 (en) | Genomic sequences encoding for an attenuated mutant zika virus | |
| WO2012073257A2 (en) | Vaccine formulation for prophylaxis and treatment of chandipura virus infections in mammals | |
| WO2010137036A2 (en) | Novel japanese encephalitis vaccine and method of manufacturing the same | |
| WO2005014803A1 (ja) | 西ナイルウイルスワクチン | |
| TWI228147B (en) | An attenuated Japanese encephalitis virus adapted to Vero cell and a Japanese encephalitis vaccine | |
| JPH0923880A (ja) | 高度に弱毒化された組換え日本脳炎ウイルスを産生する感染性日本脳炎ウイルスｃＤＮＡクローンおよびそのワクチン |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant | ||
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20120917 Year of fee payment: 12 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20130829 Year of fee payment: 13 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20140902 Year of fee payment: 14 |
|
| LAPS | Lapse due to unpaid annual fee |