CN109289046A - 一种具核梭杆菌FomA蛋白质疫苗以及制备方法和应用 - Google Patents

一种具核梭杆菌FomA蛋白质疫苗以及制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本公开涉及一种具核梭杆菌FomA蛋白质疫苗及其制备方法和应用。首先将去除信号肽序列且与MBP标签相连的FomA基因连接至表达载体中，再转化大肠杆菌，诱导表达后,Amylose Resin High Flow亲和纯化FomA重组蛋白质，最后将MBP标签使用tev酶酶切去除，得到具核梭杆菌FomA蛋白质疫苗；所述疫苗具有稳定性好，能够有效的提升机体对于具核梭杆菌的免疫能力，提升生存率，延缓结肠肿瘤的发生和发展；在APCMin/+小鼠模型中,FomA蛋白质疫苗对小鼠具有显著的保护作用，可作为新的结肠肿瘤疫苗候选物，具有较大的应用前景。

Description

一种具核梭杆菌FomA蛋白质疫苗以及制备方法和应用
技术领域
本公开属于生物疫苗技术领域，更具体地，涉及一种具核梭杆菌FomA蛋白质疫苗以及制备方法和应用。
背景技术
这里的陈述仅提供与本公开有关的背景信息，而不必然构成现有技术。
肿瘤是当今世界一个重要医学难题，对全球经济发展、社会稳定和人民健康造成了严重危害。目前，生物技术迅猛发展，为改善和提高人类生活质量发挥关键作用。疫苗作为一种生物技术药物，在抗感染性疾病方面不断取得辉煌成就的同时，也为肿瘤治疗领域带来了新的机遇。
具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum,F.nucleatum)是一种专性厌氧的革兰氏阴性菌，在健康状况下，它是口腔中的一种常见的共生菌，特定情况下会引起一系列感染性疾病，包括牙周炎、牙龈炎和肺、肝、心、脑和肠道的侵袭性感染。根据发明人所知晓的，具核梭杆菌在结肠腺瘤和(或)结肠癌组织中富集，加速疾病的进程，促进患者对化疗药物的耐药性，大大降低了患者的远期生存率，对人类的健康造成重大威胁。外膜蛋白质是细菌蛋白质中非常重要的一类，常常作为细菌特异性抗原被机体识别、捕获，激活体液免疫，产生特异性分泌型IgA。FomA蛋白质是具核梭杆菌的主要外膜蛋白质，在脂质双层膜中可形成三聚体。已知FomA蛋白质是具核梭杆菌已标记的具有毒性的毒力因子之一，同时，它也是一种Toll样受体-2(Toll-like receptor 2,TLR2)的激动剂，具有免疫佐剂的活性，可以刺激机体产生IgA和IgG，并且FomA蛋白质还可以招募细菌。在革兰氏阴性细菌中，外膜蛋白质除了具有作为细菌特异性抗原的功能外，还具有多种其他生物学功能,包括营养物质的吸收、信号转导、粘附、接合、孢子形成、参与抗生素抗性、细胞质外蛋白质的折叠、以及参与毒力相关的功能。许多外膜已被证明是潜在的疫苗，成为当前抗菌研究的热点之一。
尽管这些年来一直在努力开发疫苗，但目前已上市的结肠肿瘤疫苗只有自体肿瘤细胞疫苗一种。而正在研究的结肠肿瘤疫苗主要包含以鸟苷酸环化酶C蛋白质、CEA、MUC1蛋白质为靶抗原的肿瘤疫苗。以结肠肿瘤相关细菌外膜蛋白质作为靶抗原的肿瘤疫苗目前仍属空白，但基因工程疫苗已经成为当前医学和生物学中的一个热门研究领域，可见，随着生物科技的不断发展，人们需要有种类多样、适用范围广的结肠肿瘤疫苗来满足人们的健康需求。
目前，还未见有通过FomA蛋白质来制备结肠肿瘤疫苗的相关报道。
发明内容
针对背景技术，本公开提供一种通过FomA蛋白质来制备结肠肿瘤疫苗及其具体的制备方法与应用。
本公开具体采用以下技术方案：
在本公开的第一个方面，提供一种FomA基因或FomA蛋白质在制备抗结肠肿瘤产品和/或抗小肠腺瘤产品和/或抗结肠腺瘤产品和/或抗菌产品中的应用。
在本公开的第二个方面，提供一种抗结肠肿瘤的具核梭杆菌蛋白质疫苗，所述疫苗包FomA蛋白质。
在本公开的第三个方面，提供一种抗结肠肿瘤的具核梭杆菌蛋白质疫苗的制备方法，该方法包括：将去除信号肽序列且与MBP标签基因连接的FomA基因连接至表达载体中，再转化大肠杆菌，诱导表达后使用Amylose Resin High Flow纯化含MBP标签的FomA重组蛋白质；再将制备得到的含MBP标签的FomA重组蛋白质使用tev酶进行酶切后再使用AmyloseResin High Flow去除MBP标签蛋白，得到具核梭杆菌FomA蛋白质疫苗。
在本公开的第四个方面，提供一种采用上述方法制备得到的抗结肠肿瘤的具核梭杆菌蛋白质疫苗。
在本公开的第五个方面，提供所述具核梭杆菌蛋白质疫苗在制备抗结肠肿瘤产品和/或抗小肠腺瘤产品和/或抗结肠腺瘤产品和/或抗菌产品中的应用。
与本发明人知晓的相关技术相比，本公开其中的一个技术方案具有如下有益效果：
本公开通过采用FomA蛋白质作为免疫抗原制备得到疫苗，所述疫苗稳定性好，纯度高，所提供的疫苗能够有效的提升机体对于具核梭杆菌的免疫能力。本公开的FomA重组蛋白质对C57BL/6小鼠免疫应答后小鼠粪便上清中特异性分泌型IgA含量显著升高；在APCMin/+小鼠模型中，FomA蛋白质疫苗对小鼠具有显著的保护作用，提高存活率，延缓结肠肿瘤的发生和发展；因此，本公开的FomA蛋白质疫苗可作为结肠肿瘤新的疫苗候选物，具有较大的应用前景。
附图说明
构成本公开一部分的说明书附图用来提供对本公开的进一步理解，本公开的示意性实施例及其说明用于解释本公开，并不构成对本公开的不当限定。
图1为Amylose Resin High Flow亲和纯化的FomA重组蛋白质电泳图。
图2为FomA蛋白质免疫小鼠后粪便上清中抗原特异型分泌型IgA抗体浓度。
图3为APCMin/+小鼠评价FomA疫苗的保护效果；A:对照组和FomA蛋白质抗原免疫组小鼠的生存曲线；B:对照组和FomA蛋白质抗原免疫组小鼠腺瘤数量；C:对照组和FomA蛋白质抗原免疫组小鼠的腺瘤负担。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本公开提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本公开的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。
除非特别说明,本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明,以下实施例所用试剂和材料均为市购。
正如背景技术所介绍的，以结肠肿瘤相关细菌外膜蛋白质作为靶抗原的肿瘤疫苗目前仍属空白，现有技术中还未见有通过FomA蛋白质来制备结肠肿瘤疫苗的相关报道，鉴于此，在本公开的第一个典型的实施方式中，提供一种FomA基因或FomA蛋白质在制备抗结肠肿瘤产品和/或抗小肠腺瘤产品和/或抗结肠腺瘤产品和/或抗菌产品中的应用。
进一步的，所述产品为药物制剂；更进一步的，所述药物制剂为疫苗。
进一步的，所述抗菌产品为抗具核梭杆菌的产品。
由于具核梭杆菌在自然环境中存在着多种株系，不同菌株间FomA基因或FomA蛋白质的序列可能会有差异，只要其FomA基因或FomA蛋白质作为免疫抗原的功能不变，均在本公开保护范围内。
在本公开的一个或一些实施方式中，所述FomA基因核苷酸序列如SEQ ID N0:1或SEQ ID N0:3所示；所述FomA蛋白质为重组蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:4所示。经试验验证，采用如上序列所示的FomA基因或FomA蛋白质制备成为的制剂在防治结肠肿瘤等疾病中具有显著的效果。
在本公开的一个或一些实施方式中，所述FomA基因可以是将SEQ ID N0:1或SEQID N0:3所示核苷酸序列经过一个或多个核苷酸的取代，缺失或添加而形成的不影响其编码蛋白质免疫原性的核苷酸序列。
在本公开的一个或一些实施方式中，所述FomA蛋白质可以是将SEQ ID NO:2或SEQID NO:4所示氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代,缺失或添加而形成的不影响其免疫原性的氨基酸序列。
在本公开的一个或一些实施方式中，所述FomA蛋白质不含有信号肽，而不影响其免疫原性。
在本公开的一个或一些实施方式中，所述FomA蛋白质连接有MBP标签，可在不含有序列表达标签的载体中进行表达，方便后期纯化。
在本公开的第二个典型的实施方式中，提供一种抗结肠肿瘤的具核梭杆菌蛋白质疫苗，所述疫苗包含FomA蛋白质。
在本公开的一个或一些实施方式中，所述FomA蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
进一步的，编码所述蛋白质疫苗的cDNA的核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。
在本公开的一个或一些实施方式中，所述FomA蛋白质不含有信号肽。
在本公开的一个或一些实施方式中，所述FomA蛋白质为重组蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
所述FomA蛋白质连接有MBP标签，可在不含有序列表达标签的载体中进行表达，方便后期纯化。另外，经过试验验证，与其他标签相比，比如His标签等，将FomA蛋白质序列连接MBP标签能够在外源表达FomA蛋白质时增强表达量，而且还有助于提升蛋白质的可溶性。
进一步的，所述FomA蛋白质在纯化后切除MBP标签蛋白，而不影响其免疫原性。
在本公开的第三个典型的实施方式中，提供一种抗结肠肿瘤的具核梭杆菌蛋白质疫苗的制备方法，该方法包括：将去除信号肽序列且与MBP标签基因连接的FomA基因连接至表达载体中，再转化大肠杆菌，诱导表达后纯化含MBP标签的FomA重组蛋白质；再将制备得到的含MBP标签的FomA重组蛋白质进行酶切，去除MBP标签蛋白，得到抗结肠肿瘤的具核梭杆菌蛋白质疫苗。
进一步的，所述去除信号肽的FomA基因序列如SEQIDN0:3所示。
本公开制备得到的FomA重组蛋白质抗原含MBP标签，经过试验验证，将FomA蛋白质序列连接MBP标签不仅能够在外源表达FomA蛋白质时增强表达量，而且还能够提升重组蛋白质的可溶性。
在本公开的一个或一些实施方式中，所述表达载体为质粒载体，进一步的，所述表达载体为PetDuet-1载体；所述诱导表达为用IPTG诱导表达。
在本公开的一个或一些实施方式中，导表达后使用Amylose Resin High Flow纯化含MBP标签的FomA重组蛋白质，Amylose Resin High Flow纯化效果优异。
在本公开的一个或一些实施方式中，制备得到的含MBP标签的FomA重组蛋白质使用tev酶进行酶切后，再使用Amylose Resin High Flow去除MBP标签蛋白。
在本公开的一个或一些实施方式中，抗结肠肿瘤的具核梭杆菌蛋白质疫苗的制备方法，具体包括如下步骤：
(1)将去除信号肽且与MBP标签基因连接的FomA基因连接到PetDuet-1载体上获得表达载体，将表达载体导入大肠杆菌中获得表达菌株；将表达菌株接种氨苄青霉素的LB培养基中，振荡培养；
(2)表达菌株增殖至0D600为0.5～0.6时，加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，诱导表达过夜(8～12h)，收集菌体，裂解获得蛋白质；
(3)采用Amylose Resin High Flow进行亲和纯化，得到含MBP标签蛋白的FomA重组蛋白质；
(4)使用tev酶酶切FomA重组蛋白质，采用Amylose Resin High Flow特异性结合MBP标签蛋白，得到去除MBP标签的FomA重组蛋白质。
在本公开的第四个典型的实施方式中，提供一种采用上述方法制备得到的抗结肠肿瘤的具核梭杆菌重组蛋白质疫苗。
进一步的，所述具核梭杆菌重组蛋白质疫苗的分子量为40kD。
在本公开的第五个典型的实施方式中，提供所述具核梭杆菌疫苗在制备抗结肠肿瘤产品和/或抗小肠腺瘤产品和/或抗结肠腺瘤产品和/或抗菌产品中的应用。
进一步的，所述具核梭杆菌疫苗还在制备预防和/或延缓结肠肿瘤发生和发展产品中的应用。
进一步的，所述具核梭杆菌疫苗能够在肠道中诱导分泌型IgA释放增加。
其中，所述抗结肠肿瘤产品和/或抗小肠腺瘤和/或抗结肠腺瘤是指具有预防和/或治疗和/或延缓相关疾病的发生。
本公开中首次研究了FomA蛋白在肠道中诱导分泌型IgA释放增加的情况，并且首次评估了其对结直肠肿瘤的保护和预防作用。具核梭杆菌作为在结直肠肿瘤组织中大量募集的致病菌，本公开首次评估了FomA直接针对致病菌的免疫预防和保护作用。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本公开的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本公开的技术方案。
实施例1
一种具核梭杆菌FomA重组蛋白质疫苗的制备方法,包括如下步骤:
(1)将去除信号肽且与MBP标签基因连接的FomA基因连接到PetDuet-1载体上获得表达载体，将表达载体导入大肠杆菌中获得表达菌株；将表达菌株接种于含有100ng/μL氨苄青霉素的LB培养基中，37℃振荡培养；
其中，FomA基因序列如SEQ ID NO:1所示，1～60bp为信号肽对应的序列,SEQ IDNO:3所示的序列为去除信号肽序列的FomA基因序列。
(2)表达菌株增殖至0D600为0.5～0.6时，加入质量浓度为0.1％的IPTG(即培养体系中的IPTG为0.1％)，18℃诱导表达过夜，收集菌体，裂解获得蛋白质；
FomA基因编码的FomA蛋白质序列如SEQ ID NO:2所示,其中1～20个氨基酸残基为信号肽序列；去除信号肽序列的的FomA蛋白质序列如SEQ ID NO:4所示。去除信号肽能够在外源表达FomA蛋白质时增强表达量同时还有助于提升蛋白质的可溶性。
(3)采用Amylose Resin High Flow进行亲和纯化,得到含MBP标签蛋白质的FomA重组蛋白质。
FomA蛋白质连接有MBP标签，将FomA蛋白质序列连接MBP标签能够在外源表达FomA蛋白质时增强表达量同时还有助于提升蛋白质的可溶性。
(4)使用tev酶酶切FomA重组蛋白质，采用Amylose Resin High Flow特异性结合MBP标签蛋白质，得到去除MBP标签的FomA重组蛋白质。
纯化得到FomA重组蛋白质电泳结果如图1所示，分子量约为40kD。可见，采用上述方法制备得到的FomA重组蛋白质抗原具有杂质少、纯度高等的优点。
实施例2
使用实施例1制备得到的FomA重组蛋白质疫苗对C57BL/6小鼠灌胃进行免疫，对照组C57BL/6小鼠使用生理盐水灌胃，50ug蛋白质/只小鼠，每组7只健康小鼠，小鼠体重无显著差异，免疫三次，每次间隔7天，最后一次灌胃结束7天后检测小鼠粪便上清中FomA特异性IgA抗体浓度。免疫应答后粪便上清中的IgA抗体浓度如图2所示，FomA组的小鼠粪便上清中的IgA抗体浓度平均为7.71ug/mL，对照组的小鼠粪便上清中的IgA抗体浓度平均为1.30ug/mL。
结果显示:经过三次免疫后,使用FomA重组蛋白质疫苗灌胃的C57BL/6小鼠粪便上清中的抗体浓度明显高于使用生理盐水灌胃的C57BL/6小鼠，表明FomA蛋白质能够引起明显的体液免疫。
实施例3
本实施例通过APCMin/+小鼠评价FomA重组蛋白质疫苗的保护效果，APCMin/+小鼠体重无显著差异。
用实施例1制备得到的FomA蛋白质对APCMin/+小鼠灌胃进行免疫，对照组APCMin/+使用生理盐水灌胃，50ug蛋白质/只小鼠，每组7只小鼠，免疫三次，每次间隔7天，最后一次免疫结束7天后，分别使用1×109个具核梭杆菌连续灌胃7天，最后一次灌胃结束后每天观察老鼠存活情况，21天后，FomA蛋白质抗原免疫组小鼠的存活率为85.7％，而对照组仅为28.5％，可见，FomA蛋白质抗原免疫组小鼠的存活率明显高于对照组，具有统计学意义(图3A所示)。
通过对两组小鼠进行解剖(中途死亡小鼠在确认死亡后立即进行解剖)，观察小鼠小肠、结肠腺瘤的数量、腺瘤负担，如图3B所示，FomA蛋白质抗原免疫组小肠腺瘤数量平均为37.00个，结肠腺瘤数量平均为6.48个，对照组小肠腺瘤数量平均为48.63个结肠腺瘤数量平均为11.40个；如图3C所示，FomA蛋白质抗原免疫组小肠腺瘤平均腺瘤负担(所有腺瘤的直径总和)为60.78mm，结肠腺瘤平均腺瘤负担为43.12mm，对照组的小肠腺瘤平均腺瘤负担为69.41mm，结肠瘤平均腺瘤负担为52.16mm。可见，FomA蛋白质抗原免疫组小鼠小肠、结肠腺瘤的数量、腺瘤负担均明显低于对照组，具有统计学意义。
上述结果表明，在APCMin/+小鼠中，FomA蛋白质具有保护作用，能够预防和/或延缓结肠肿瘤发生和发展，这表明FomA重组蛋白质抗原可作为新的结肠肿瘤疫苗候选物。
上述实施例为本公开较佳的实施方式，但本公开的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本公开的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本公开的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东大学齐鲁医院
<120> 一种具核梭杆菌FomA蛋白质疫苗以及制备方法和应用
<130> 2018
<160> 4
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<210> 1
<211> 1107
<212> DNA
<213> 包含信号肽的FomA基因
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Lys Val Val Glu Tyr Val Glu Lys Pro Val Ile Val Tyr Arg Asp Arg
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Glu Val Ala Pro Ala Trp Arg Pro Asn Gly Ser Val Asp Val Gln Tyr
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Asp Tyr Ile Tyr Ser Asn Asn Phe Phe Lys Ala Asp Lys Phe Gly Phe
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275 280 285
Phe Glu Gly Gly Tyr Asp Pro Tyr Thr Trp His Gln Tyr Lys Val Val
290 295 300
Ser Ala Lys Asp Ser Asn Lys Tyr Glu Val Tyr Met Leu Pro Thr Leu
305 310 315 320
Gln Val Ser Tyr Lys Pro Thr Asp Phe Val Lys Leu Tyr Ala Ala Ala
325 330 335
Gly Ala Glu Tyr Arg Asn Trp Ala Val Thr Ala Glu Ser Lys Ala Lys
340 345 350
Asn Trp Arg Trp Gln Pro Thr Ala Trp Ala Gly Met Lys Val Thr Phe
355 360 365
<210> 3
<211> 1047
<212> DNA
<213> 去除信号肽序列的FomA基因
<400> 3
aaagaagtta tgcctgcacc tactccagct cctaaaaaag tagtagaata tgttgaaaaa 60
ccagttatag tttacagaga cagagaagtt gctccagctt ggagaccaaa tggatcagtt 120
gatgttcaat acagatggta tggaaatgta gaaaacagaa cgcctaaaaa agaagaccca 180
gcaagtcctt ggttaggaga taatgtaaat gcaggaagat tacaaacttt aacaaaagta 240
aacttcactg aaaaacaaac attagaaata agaacaagaa attatcatac tttaatgaat 300
ccaaaagatt ctcaagcagc tgatgatcaa gtaagagtta gacattttta taaatttggt 360
aagttaggtt cttctaaaat tgatgttaca tcaagattag aatacaaaaa aaataatgga 420
gatgctggaa gaaaacaagc agaagcatca gtattatttg attttgctga ttatatctat 480
tctaataatt tctttaaagc tgataaattt ggatttagac ttggatatca acataaatgg 540
gcaggacata atagtggagt tgttggacaa cctttcaaca aaggtacaca agataactac 600
ttcataaact ttgaatcaga atatacttta ccatgggggt tcagtgctga attaaatgct 660
tataactatt ataatgttca taataaaaaa ttcgcaacat ataacaaagg taacaagaaa 720
tctcaattct atggagaaat tgaagcttac ttatatcaac acactccatt atacaaaaca 780
aataatgtag aattatcatt tgattttgaa ggaggatatg atccatatac ttggcaccaa 840
tataaagttg ttagtgcaaa agatagcaac aaatatgaag tttatatgtt accaacatta 900
caagtttctt ataaaccaac agattttgta aaactatatg ctgcagctgg tgctgaatat 960
agaaactggg cagttacagc tgaatctaaa gctaaaaact ggagatggca accaactgct 1020
tgggctggta tgaaagttac tttctaa 1047
<210> 4
<211> 348
<212> PRT
<213> 去除信号肽序列的FomA蛋白质
<400> 4
Lys Glu Val Met Pro Ala Pro Thr Pro Ala Pro Lys Lys Val Val Glu
1 5 10 15
Tyr Val Glu Lys Pro Val Ile Val Tyr Arg Asp Arg Glu Val Ala Pro
20 25 30
Ala Trp Arg Pro Asn Gly Ser Val Asp Val Gln Tyr Arg Trp Tyr Gly
35 40 45
Asn Val Glu Asn Arg Thr Pro Lys Lys Glu Asp Pro Ala Ser Pro Trp
50 55 60
Leu Gly Asp Asn Val Asn Ala Gly Arg Leu Gln Thr Leu Thr Lys Val
65 70 75 80
Asn Phe Thr Glu Lys Gln Thr Leu Glu Ile Arg Thr Arg Asn Tyr His
85 90 95
Thr Leu Met Asn Pro Lys Asp Ser Gln Ala Ala Asp Asp Gln Val Arg
100 105 110
Val Arg His Phe Tyr Lys Phe Gly Lys Leu Gly Ser Ser Lys Ile Asp
115 120 125
Val Thr Ser Arg Leu Glu Tyr Lys Lys Asn Asn Gly Asp Ala Gly Arg
130 135 140
Lys Gln Ala Glu Ala Ser Val Leu Phe Asp Phe Ala Asp Tyr Ile Tyr
145 150 155 160
Ser Asn Asn Phe Phe Lys Ala Asp Lys Phe Gly Phe Arg Leu Gly Tyr
165 170 175
Gln His Lys Trp Ala Gly His Asn Ser Gly Val Val Gly Gln Pro Phe
180 185 190
Asn Lys Gly Thr Gln Asp Asn Tyr Phe Ile Asn Phe Glu Ser Glu Tyr
195 200 205
Thr Leu Pro Trp Gly Phe Ser Ala Glu Leu Asn Ala Tyr Asn Tyr Tyr
210 215 220
Asn Val His Asn Lys Lys Phe Ala Thr Tyr Asn Lys Gly Asn Lys Lys
225 230 235 240
Ser Gln Phe Tyr Gly Glu Ile Glu Ala Tyr Leu Tyr Gln His Thr Pro
245 250 255
Leu Tyr Lys Thr Asn Asn Val Glu Leu Ser Phe Asp Phe Glu Gly Gly
260 265 270
Tyr Asp Pro Tyr Thr Trp His Gln Tyr Lys Val Val Ser Ala Lys Asp
275 280 285
Ser Asn Lys Tyr Glu Val Tyr Met Leu Pro Thr Leu Gln Val Ser Tyr
290 295 300
Lys Pro Thr Asp Phe Val Lys Leu Tyr Ala Ala Ala Gly Ala Glu Tyr
305 310 315 320
Arg Asn Trp Ala Val Thr Ala Glu Ser Lys Ala Lys Asn Trp Arg Trp
325 330 335
Gln Pro Thr Ala Trp Ala Gly Met Lys Val Thr Phe
340 345

Claims (10)

1.一种FomA基因或FomA蛋白质在制备抗结肠肿瘤产品和/或抗小肠腺瘤产品和/或抗结肠腺瘤产品和/或抗菌产品中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征是，FomA基因核苷酸序列如SEQ ID N0:1或SEQ IDN0:3所示；所述FomA蛋白质为重组蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4所示；
进一步的，FomA基因是将SEQ ID N0:1或SEQ ID N0:3所示核苷酸序列经过一个或多个核苷酸的取代，缺失或添加而形成的不影响其编码蛋白质免疫原性的核苷酸序列；
进一步的，所述FomA蛋白质是将SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4所示氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代,缺失或添加而形成的不影响其免疫原性的氨基酸序列。
3.一种抗结肠肿瘤的具核梭杆菌蛋白质疫苗，其特征是，所述疫苗包含FomA蛋白质。
4.如权利要求3所述的蛋白质疫苗，其特征是，所述FomA蛋白质不含有信号肽；
进一步的，所述FomA蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
5.一种抗结肠肿瘤的具核梭杆菌蛋白质疫苗的制备方法，其特征是，该方法包括：将去除信号肽序列且与MBP标签基因连接的FomA基因连接至表达载体中，再转化大肠杆菌，诱导表达后纯化含MBP标签的FomA重组蛋白质；再将制备得到的含MBP标签的FomA重组蛋白质进行酶切，去除MBP标签蛋白，得到抗结肠肿瘤的具核梭杆菌蛋白质疫苗。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征是，所述去除信号肽的FomA基因序列如SEQIDN0:3所示。
7.如权利要求5所述的制备方法，其特征是，所述表达载体为质粒载体，进一步的，所述表达载体为PetDuet-1载体；所述诱导表达为用IPTG诱导表达。
8.如权利要求5所述的制备方法，其特征是，具体制备方法包括：
(1)将去除信号肽且与MBP标签基因连接的FomA基因连接到PetDuet-1载体上获得表达载体，将表达载体导入大肠杆菌中获得表达菌株；将表达菌株接种氨苄青霉素的LB培养基中，振荡培养；
(2)表达菌株增殖至0D600为0.5～0.6时，加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，诱导表达过夜，收集菌体，裂解获得蛋白质；
(3)采用Amylose Resin High Flow进行亲和纯化，得到含MBP标签蛋白的FomA重组蛋白质；
(4)使用tev酶酶切FomA重组蛋白质，采用Amylose Resin High Flow特异性结合MBP标签蛋白，得到去除MBP标签的FomA重组蛋白质。
9.权利要求5～8中任一项所述的方法制备得到的抗结肠肿瘤的具核梭杆菌蛋白质疫苗。
10.权利要求3或4或9所述的蛋白质疫苗在制备抗结肠肿瘤产品和/或抗小肠腺瘤和/或抗结肠腺瘤和/或抗菌产品中的应用；
进一步的，权利要求3或4或9所述的蛋白质疫苗在制备提高肠道中分泌型IgA的产品中的应用。
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