PT92094B

PT92094B - Processo de obtencao de derivados de adenilciclase atoxicos e de preparacao de vacinas contra bordetella e bacillus anthracis

Info

Publication number: PT92094B
Application number: PT92094A
Authority: PT
Inventors: Antoine Danchin; Philippe Glaser; Evelyne Krin; Octavien Barzu; Daniel Ladant; Agnes Ullmann
Original assignee: Pasteur Institut
Priority date: 1988-10-25
Filing date: 1989-10-25
Publication date: 1995-06-30
Also published as: US5183745A; FR2638169A1; FR2638169B1; CA2001320A1; EP0366549A1; PT92094A; DK530689A; JPH02265483A; DK530689D0

Description

/ ντ^ν'·~ ττι nrorDTTTu?, C ‘ - V V-J p*

t t? i ri V refer

10 C cíc seu processo de preparaç utilizações biológicas, em part As vacinações contra as bactérias patogénicas do género nos vertebrados, recorrem gera inteiras virulentas ou atenuada 5or ag; ;uas ;ul ar v* /*“· orno v ir.íecções agudas provocadas por Sordete 11 a ou Saci 1lus anthracis

Irnente utilização de bactérias

No entanto, estas vacinas nao estão necessariamente desprovidas de toxidade pelo facto de o processo evolutivo ser o mesmo que se verifica nas doenças provocadas por estas bactérias.

Com efeito, sco muitas vezes as proteínas produzidas peias bactérias e não as próprias bactérias, que são responsáveis pela virulência. Mesma após a morte bacteriana, estas proteínas podem ser responsáveis por numerosos efeitos patológicos.

Na patologia induzida pela B. pertussis intervêm de forma primordial uma hemaglutinina filamentosa (FHA) assim como duas toxinas que induzem um aumento desregulado da produção de AMP cíclica pelas células hospedeiras. Trata-se da toxina pertussis (Ptx ou LPF) que activa essencialmente a ciclase do hospedeiro, e a adeni1ciclase, activada pela calmodulina (AC).

Por fim, è adeni1cic1 ase está associada uma hemolisina. A adeni1cic1 ase da B.pertussis foi designada por ciclolisina para indicar este facto.

Tendo em conta estas observações, os inventores têm procurado meios de vacinação nos quais não intervenham ma is as bactérias de origem virulenta ou atenuada, mas as proteínas produzidas, modificadas de forma apropriada de modo a destruir a sua toxicidade original. Em relação a este aspecto a adenilcicla-se prendeu mais especialmente a atenção. 0 presente invento tem por cbjectivo obter novos derivados de adeni1cic1 ase, estando estes derivados desprovidos de actividade tóxica mas sendo capazes de formar anticorpos que reconhecem igualmente as proteínas toxicas. A invenção visa igualmente um processo de preparação destes derivados por mutagénese rn vitro dos genes codificando a adeni1ciclase tóxica.

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Um outro objectivo da invenção consiste no processo de preparação de vacinas que assegurem unia acçãc protestara eficaz contra as infecções produzidas peles agentes patogénicos.

Os derivados da adenilciclase da invenção são caracterizados por compreenderem um ou vários aminoácidos diferentes dos da proteína tóxica, conferindo-lhe um carácter atóxico, estando estes aminoácidos implicados no mecanismo catalítico e/ou no modo de activação pela calmodulina e/ou na transferência de informação do local activador para o local catalítico da adeni1cic1 ase e não afectando de maneira notável a configuração tridimensional da proteína tóxica, de modo que os anticorpos formados contra os derivados atóxicos reconhecem igualmente a proteína tóxica.

Uma outra característica da invenção refere-se a proteína inteira cujos aminoácidos responsáveis pela activação hemolítica foram alterados ou eliminados. 0 ou os aminoácidos de substituição são escolhidos em face das suas propriedades fisico-quimicas, de forma a destruir a toxicidade sem afectar grandemente a forma da proteína, pelo menos no que se refere ao seu reconhecimento pelo sistema imunológico.

Possuindo a mesma geometria que a proteína tóxica, estes derivados desempenham vantajosamente o papel de engodo no sistema imunológico sem contudo exercer actividade catalítica tóxica.

De entre as propriedades que permitem intervir no carácter tóxico original da proteína e de o destruir, citar-se-ão, nomeadamente, o tamanho dos aminoácidos, o seu carácter hidrofóbico ou hidrofílico, a sua carga. a sua propensão para formar ou para destruir as estruturas secundárias da sequência de aminoácidos, a sua acção sobre a estrutura da égua, o seu carácter destruidor ou formador de hélice, a sua interaeção com todo ou com parte do ATP intervindo como substrato, ou com a calinodul ina.

De acordo com uma forma preferida de realização da invenção, os derivados de adeni1cic3 ase compreendem um ou, vantajosamente, pelo menos dois aminoácidos diferentes no local catalítico, o que equivale a dizer, no domínio responsável pela produção do AMP cíclico (AMPc). Essa disposição permite suprimir BAD ORIGINAL ' _4_

_4_ 70 115 E0528C ‘ ífc * a produção do AMF ou minimizá-la conservando no entanto as propriedades imunogénicas da proteína. 0 ou os aminoácidcs diferentes no local catalítico são escolhidos, mais especiaImente, de forma a modificar a estrutura da água, ou a interacção da proteína corri a agua ou com o fosfato, a laase nucleica e/ou o açúcar do ΆΤΡ. de modo que a actividade, ou o controlo da actividade do local . seja destruída.

Trata-se, por exemplo, dos aminoácidcs hidrofóbicos substituindo os aminoácidcs hidrofílicos do mesmo tamanho, ou inversarnente, dos aminoácidos que perderam a sua carga eléctrica ou de carga eléctrica modificada, ou ainda de aminoácidos de tamanho diferente que impedirão a colocação do substrato ATP ou a reacção de ciclização no AMPc.

Citar-se-á, a título de exemplo, a substituição de uma ou pelo menos de duas lisinas que interactuam com o ATP, por aminoácidos com o mesmo volume, hidrofílicos mas desprovidos de carga tal como a glutamina (Q).

No seio da sequência peptídica catalítica, o coração 6LNYHAKS pode ser modificado, e G e A substituídos, cada um, por um dos aminoácidos seguintes M, L, I, V ou F. K, tal como está indicado, pode ser substituído por Q mas também por N, D e E, ou ainda por M, L, I e V.

Os significados das letras utilizadas geralmente para designar os aminoácidos que anteriormente se indicaram e os que a seguir se indicarão, são apresentados no fim da descrição. O domínio responsável da actividade hernolítica pode, na proteína inteira, ser vantajosamente eliminado, por exemplo cortando o gene nos locais Bgl II (AGATCT) e eliminando o fragmento correspondente. Consegue-se assim retirar a porção da proteína situada entre EIxxx e EIxxx.

Como variante, ou como disposição suplementar, pode-se tirar partido do facto de a proteína não conter o resíduo cisteína pai a aí introduzir este aminoécido por mutagénese localizada. Este poderá seguidamente sofrer um tratamento quimico (por exemplo, oxidação ou reacção com os reagentes de SH do tipo metálico, com organo-mercurio ou iodoacetamida) cujo resultado sera a inactivação da proteína.

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, -Í.V—W»

-5- tr

Os aminoácidos diferentes podem igualmente ser tre os análogos dos aminoácidos incorporáveis pela escolhidos πια quina ue tradução, se for caso disso. quimicamente modificados. Citar-se-ão, a título de exemplo, a fluorofenilalanina, o bromotriptofano, ou a norleucina.

Numa outra concretização da invenção, posta em práctica neste caso de acordo com o modo preferido anterior, o ou os aminoácidos de substituição estão presentes no local activador sob o efeito da calmodulina, e são escolhidos em função dos mesmos parâmetros e estes, são escolhidos de forma a permitirem uma alteração da ligação com a molécula activadora do hospedeiro.

Deste modo, um resíduo ácido aspártico hidrofílico, carregado negativamente e destruidor da hélice. substituirá vantajosamente um resíduo triptofano de maior tamanho e hidrofóbico e formador de hélice, na região de ligação a calmodu1i na.

Ainda numa outra concretização da invenção posta em práctica sozinha ou em combinação com pelo menos uma das concretizações anteriores, o ou os aminoácidos de substituição, tais como os considerados anteriormente, estão presentes na zona responsável pela transferência de informação do local activador para o local cataiítico.

Preferivelmente, os derivados da invenção são os que são obtidos pela expressão num organismo hospedeiro de um gene codificando uma proteína com a actividade da adeni1cic1 ase, tendo este gene sido modificado i_n vi tro, após clonação, por mutagénese dirigida.

Outros elementos de mutagénese que aqui a seguir se descrevem, podem tambérn operar por eliminação das regiões conhecidas do gene, ou por inserção de oligonucleòtidos de síntese, de forma a destruir um local dotado de actividade.

Estes derivados da invenção são mais especialmente os mutantes de adeni1ciclase de Borte11a responsáveis por patologias respiratórias de vertebrados tais como a Ώ.pertussis e a B. parapertussis. no homem, e a B.bronchiséptica e a B · AVÀMib nos animais. A parte activa da adeni lciclase tóxica da B. pertussi_s. expri bad original

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-6- mida pelo gene clonado, ter; a sequência (I) indicada nas fig0]r la a If. Essa sequência é indicada no pedido de patente Europ*5 n2 88/401. 935.7 de 25 de Julho de 1988. A proteína correspondente à sequência (I), que contém 1 aminoácidos, compreende dois domínios com duas í a ηΦ activida^e principais. .

Os 400 a 500 ami noác idos da parte N-terminal 1 -a responsáveis pela actividade da adeni1cic1 ase e os 1300 a 1200 parte carboxi-termina1 pela actividade hemolitica e pe·1 propriedades de secreção da proteína.

Na parte cata 1 iticamente activa na síntese do AMPc, 1:1 adeni1cic1 ase aparece organizada em dois domínios: o domínio N-terminal de 25 kDa que compreende o local cataiític° e o domínio C-terminal de 12 kDa que compreende o local principal de ligação à calmodulina, mais especialmente a sequência correspondente aos resíduos 235-254.

Numa outra forma de realização da invenção, os derivados adeni 1 ciclase são os mutantes de uma adeni 1 ciclase do tipo da <3ue é expressa pela B.anthracis. A sequência de nucleotidos do gene que codifica essa adenilciclase e a sequência desta última estão descritas no pedido de patente Francesa depositada em nome dos aplicantes, intitulada "SEQUENCES DE NUCLEOTIDES EXPRIMANT L'ADENYL CICLASE DE B. ANTHRACIS. PROTEINES AYANT L'ACTIVITE DE CETTE ADENYL CYCLASE ET APPLICATIONS BIOLOGIQUES". A sequência de aminoácidos da adeni1cic1 ase da B. anthracis apresentam várias regiões comuns com a segregada pela B.nertussis (ver figura 2). A semelhança mais importante corresponde ao peptideo de 24 aminoácidos (da posição 342 a posição 365 na adenilciclase da B.anthracis: GVATKGLNVHGKSSDWGPVAGYIP). Essa sequência contém cinco resíduos gly e a sequência de partida G GKS (AKS na B.pertussis) que se encontra muitas vezes nas proteínas com uma afinidade pelos nucleótidos.

Duas outras regiões apresentam uma semelhança mais fraca. Correspondem na B.anthracis aos domínios que se estendem da posição 487 ò posição 501 (PLTADYDLFALAPSL) para uma região e da posição 573 à posição 594 (DWNHGTEQDNEEFPEKDNEIF) para a outra

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-7- região.

Como variante, os derivados da invenção são os que são obtidos por tratamento quimico da sequência de adeni1cic1 ase modi f i cada. 0 presente invento refere-se igualmente aos anticorpos policlonais dirigidos contra estas adeni1cic1 ases modificadas, bem como aos anticorpos monoclonais capazes de os reconhecerem espec i f i camente,

De acordo com a invenção, os derivados de adeniIciclase definidos anteriormente são obtidos por rnutagénese i_n vitro do gene clonado exprimindo a proteína tóxica, seguida da expressão do gene nos hospedeiros apropriados, por exemplo E.co 1i. B.avium ou Ά1 cal icrenes entrophus eventualmente com um tratamento químico subsequente (caso particular das proteínas com cisteína por exemplo). Esta expressão realiza-se com rendimentos elevados, em particular na E.coli. 0 gene pode ser reintroduzido na bactéria patogénica afim de ai exprimir a proteína atóxica. A bactéria assim modificada faz igualmente parte da invenção. 0 processo de preparação de derivados de adeniIciclase atóxicos, de acordo com a invenção compreende a rnutagénese in vi tro do gene clonado exprimindo a adeniciclase tóxica, essa rnutagénese sendo efectuada na região codificando o local catalítico e/ou o local activador para a calmudulina e/ou o local de transferência de informação do local activador para o local catalítico e/ou a região responsável pela actividade hemolítica, de modo a introduzir um ou vários codões codificando os aminoácidos diferentes dos presentes na proteína tóxica, ou de forma a fazer desaparecer (eliminar) os codões presentes no gene original capazes de lhe conferir um carácter atóxico, não afectando no entanto de forma notável a configuração tri-dimensiona1 apresentada pela proteína tóxica, de modo que os anticorpos formados contra os derivados atóxicos reconheçam igualmente a proteína tóxica. A rnutagénese comporta-se vantajosamente sobre os codões codificando os aminoácidos definidos anteriormente.

De acordo com uma concretização preferida da invenção põe-se em prática o sistema de rnutagénese i_n vi tro de Amersharn ou de

BAD ORIGINAL k .«w— . . -.— —^ Λ

70 115 B052SC -8- qualquer outra companhia que proponha sistemas do mesmo tipo compreendendo a uti1izaçào de um o 1igonuc1eotído mutante para dirigir a mutagénese. Esse oligonucleótido é construído de modo a compreendei' o codão capaz de codificar o aminoócido que se deseja introduzir. O codão final desejado pode ser introduzido numa única etapa, ou por recurso a introdução intermediária de Um outro codão e depois numa etapa ultrior, á sua colocação.

Como variante é também possível utilizar um o 1igonuc1eótido mutante compreendendo uma ambiguidade e capaz de codificar dois aminoácidos diferentes. Do mesmo modo, pode-se utilizar um oligonuc1eótido onde faltam um ou vários codões de forma a conseguir-se uma eliminação. 0 oligonuc1eótido mutante compreende vantajosamente pelo menos 15 nucleótidos, nomeadamente, 20 a 25. De acordo com a técnica clássica de mutagénese _i_n vitro, utilizando o conjunto de mutagénese Amersham, recorre-se às etapas seguintes: - hibridação do oligonucleótido mutante ccm uma sequência de ADN de uma matriz de ADN de cadeia simples construída de forma apropriada, a partir de um vector, por mutagénese i_n vitro: utiliza-se vantajosamente, como vector de ADN de cadeia simples, um fago, nomeadamente derivado de M13; - sintese na presença de —tio dcTP e ligação da cadeia de ADN mutante com uma polimerase tal como o fragmento Klenow da polimerase I de ADN de E.coli; - eliminação da cadeia simples de ADN (não mutante), por exemplo, por filtração; - corte da cadeia de ADN não mutante com o auxílio de uma enzima de restrição, tal como a Ncil; - digestão da cadeia não mutante com o auxílio, por exemplo de uma exonuclease, nomeadamente a exonuclease III; - repolimerização e ligação do ADN parcialmente com falhas; - transformação das células hospedeiras competentes com o ADN. O processo tem a rendimentos elevados, outros métodos de utilizando os locais vantagem de se obter o derivado atóxico com É claro que, no entanto, podem utilizar-se realização da mutagénese, por exemplo de restrição para criar as inserções, as

BAD ORIGINAL —à -9- 70 115 iàrt» eliminações ou as substituições, ou que as modificações podem ser realizadas pelo método baseado na utilizarg ao 'o conjunto cie mutagénese comercializado pela Amersham para introduzir os codões apropriados e obter os derivados de adeni1ciclase atóxicos da i nvençSo. 0 gene· codificando a adeni1ciclase exprimida por um dos microrganismos antericrmente indicados é vantajosamente clonado usando o processo que se descreve no pedido de patente Francesa nQ 87/10614 de 24 de Julho de I9e7 em nome dos aplicantes.

Neste processo, utiliza—se a interacção adeni1ciclase—calmo— dulina que se traduz na produção de cAMP. A clonação do gene efectua-se numa linhagem receptora, deficiente em adeni1ciclase, compreendendo um plasmídeo exprimindo níveis elevados de calmodu-lina. Observar-se-á que os genes que cooperam no processo de clonação, a saber, os que codificam a adenilciclase e os que codificam a calmodulina, são de origens diferentes. 0 fragmento de ADN clonado da parte activa do gene codificando a adeni1ciclase de B.pertuss is. utilizável no processo de mutagénese da invenção, responde igualmente à sequência representada nas figuras 3a a 3f. A parte catalítica para a síntese de AMPc do fragmento de ADN compreende a sequência de nuleótidos localizada entre as posições 0 e 2050, a posição 0 correspondendo ao local de restrição BamHI.

Toda a sequência de nucleótidos que se híbrida com a sequência de nucleótidos das figuras la a lf, 3a a 3j, e que codificam uma proteína com a actividade da adeni1cic1 ase, quer essa sequência se.ia obtida por transição enzimática inversa do ARN correspondente quer por síntese química, é utilizável no processo de acordo com a invenção para a mutagénese. O presente invento refere-se igualmente às sequências de nucleótidos compreendendo ou constituídas pelo gene, codificando pelo menos a parte activa de forma a codificar um derivado de adenilciclase tal como o definido anteriormente, bem como os oligonucleótidos mutantes.

Assim, em relação ao fragmento de ADN das figuras la a lf. BAD ORIGINAL j

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-10- uma sequência nucleotídica de acordo com a invenção compreende um codão CAA em vez de um codão AAA na posição 58, ou ainda um codSo CAG em vez de um codão AAG na posição 65. De preferência, estes cligonucleótidos não poderão permitir uma hibridaçSo não específica com o vector M13.

Os oligonucleótidos mutantes compreendem, por exemplo, um codão CAA em vez de um codão AAA na posição 58 e compreendem toda ou parte da sequência GTG GCC ACC CAA GGA TTG G.

Pode tratar-se igualmente de oligonucleótidos com um codSo CAG em vez de um codão AAG na posição 65 e compreendendo toda ou parte da sequência GTGCACGCCCAGTCGTCCG.

Outros oligonucleótidos compreendem em vez de um codão TGG na posição 242, um codão GAC e correspondem a toda ou a parte da sequência CTTGTTGGACAAAATCGC, ou um codão GAC em vez do codão GAC do oligonucleótido anterior.

Uma mistura de oligonucleótidos pode permitir obter vários mutantes numa única experiência.

Como variante, obtêm-se derivados atóxicos da invenção submetendo a sequência proteica de uma adeni1ciclase ou, pelo menos a sua parte activa, a um tratamento químico, por exemplo, aos tratamentos de inactivação utilizados em vacinação, por exemplo, para as vacinações tetânicas.

Os ensaios de toxicologia realizados sobre os derivados de proteínas da invenção têm demonstrado a sua ausência de toxidade.

As propriedades fortemente imunogénicas dos derivados da invenção são, deste modo, vantajosamente proveitosas para a elaboração de vacinas.

As vacinas da invenção são caracterizadas pelo facto de serem vacinas moleculares compreendendo pelo menos um derivado de adenilciclase atóxico tal como se definiu anteriormente, em associação com um veículo farmacêutico.

Podem igualmente compreender* a bactéria portadora dos genes mutantes tornada deste modo atóxica. » i · j „ -.c doses e com as A vacinação realiza-se de acordo com as uu- formas de administração habituais.

De uma forma vantajosa, os derivados de adenilciclase da invenção dão lugar a uma reacção imunológica cruzada com os

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bAO ant i c arpoe d irigidos co ntr a a. úLv ». ± 1 c i cias e da P Th — · *-· o vf c* As ;:;·ηρο c* -i r* 1*- c» c* ' *_< JL. Vj cí vacinas com ‘f ‘ v- (Zi «-4 4T. » ·', A ^ V-· < i -·. i . i 1 van i 2. ·>' n samen 4- /*· >- ·_ v_» — - iVctiO i cl c- adeni 1c i c1 as e da invenç a o Cl ssoci sdo C .ma p repar Cl Ç L O de 1: actér 16 S de B. pertuss is mortas. uti 1 C cí d ct C 0! I i C 5 d juv ante . D 5 v* a -i ] Λ C* * i. - ustrar a in ven y Ho aprese nta rn-se segt: i dam ente exemp • 1 os de pr eparaça o de mutant es 3 e adenilc i c 1 cise de B. r~· cz> v 4“ ^ i u s s i s . N e s tes exemp los, re ferem-se a C; f iguras 1 õ 6 i f, e _ Od Cl 3 j , que r e p r e sentam. as sequênc ias de nucleò t id 0 3 Cl a par t 0 ã ct i va do g 0 Π0 cod i f i cando a adenilcic 1 as 0. , respect i va ment e da B.pe rtuss is e da B.anthrac i s, c 1 cnadas na E .co1i e Cl sequênc ia de ami noáci dos expr i mida correspondent e, e a figura 2 que repre sent a a s equên cia ccmp 1 eta do po1ipept ide o d a adenici cia se da B. anthrac is (li nha súper i or) e a sequência po 1 i pept idi c a N -ter mina 1 Clã aden i lcicl ase da B. pertuss is (linha i nf e v~ icr) .

EXEMPLOS 1/ - Clonaçao do gene codificando a adeni1ciclase da B.pertussis.

As linhagens cya , restrição de E.coli são transformadas por um plasmídeo portador de um gene especificando a síntese da calmodulina tal como o plasmídeo pVUC-1, ou por todo e qualquer outro plasmídeo que exprime a calmodulina do grupo de incompatibilidade CclEl e portador do gene de resistência à ampi-c i1i na .

Introduzem-se seguidamente nas linhagens cya os vectores compreendendo o ADN total da B.pertussis fragmentado de diversas formas (cortes parciais com enzimas de restrição EcoRI e SauIIIa, sonicação seguida da adição de '“linkers" EcoRI por exemplo).

Devido aos problemas postos pela incompatibilidade de outros plasmídeos com o replicãc ColEI, a clonação dos fragmentos do ADN total de B.pertussis parcialmente cortado com a enzima SauIIIa foi efectuada no vector compatível pACYC184, no único local BamKl. As linhagens receptoras foram transformadas e instaladas sobre caixas Mc Conkey Maltose. Isolaram-se vários clones que fermentaram a maltose. Demonstrou-se seguidamente que estes clones produzem o AMP cíclico. Por outro lado, os plasmídeos extraídos das linhagens produtoras foram integrados por transforrnação em linhagens que não contêm o plasmídeo pVUC-1.

BAD Ur-wuiNAL

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<úr λ η_ _L ου que me i os coiif irm & sínte o contém. No primeiro caso os c1ones são brancos sob de mal tose Mc Cr, nlce v verm • o ' v· »·» C' no segundo cas lande que é de facte a presença de ρ 1 as: r. ide os que permit re c, .Ξ» V', 2/ - se de caimodulina que permitiu 5 clcnação. Mutagénese In vitro do gene clonado codificando

CL adeni1c iclase. por Cartei' et a 1 em Nuc1.Acid -se um codão AAA (codificando a 0), na pos- çâo 58 utilizando a o K)

Operando como é descrito .13. 4431-43, 1985, substitui por um codão CAA (codificando o]igonuc1eotido GTGGCCACCCAAGGATTGG. Do mesmo modo, substitui-se um codão AAG (codificando a K) na posição 65 por um codão CAG (codificando a Q) utilizando o nucleótido GTGCACGCCCAGTCGTCCG.

As duas modificações são efectuadas sobre o fragmento de ADN BamHI-EcoRV clonado no fago M13tgl30. 0 codão TGG na posição 242 (codificando um triptofano) é deste modo modificado num codão GAC (codificando o ácido aspártico) utilizando o oligonuc1eótido CTTGTTGGACAAAATCGC. 0 codão GAC é de seguida modificado num codão GAG (codificando o ácido glutêmico) utilizando o oligonucleótido CTTGTTGGAGAAAATCGC. Observar-se-á que, neste caso, a mutagénese realiza-se sobre um codão que não se encontra numa zona de semelhança com as sequências de nucleótidos de outros genes codificando uma adeni1cic1 ase, mais especialmente a da E.anthracis.

As modificações sobre a posição 242 fcrarn efectuadas sobre o fragmento de ADN EcoRV-EcoRI clonado no fago N13tgl30. $

Para cada mutagénese controla-se, no fragmente mutado, a ausência de toda e qualquer outra mutação pelo método de sequênciação com um didesoxinuc1eótido. 3/ - Obtenção dos derivados atóxicos da adenilciclase.

Por expressão do gene mutante numa linhagem de E.co1i de acordo com as técnicas habituais, obtém-se adeni1cic1 ase atóxica que é ern seguida purificada.

Constata-se que a substituição do triptofano pelo aspartato reduz de um factor de 1000, a activabi1 idade da enzima pela calmodulina, sendo mantida a sua actividade de base. A substituição da lisina na posição 5 diminui a actividade

BAD ORIGINAL -13-

70 115 B0528C de base i ntrínseca da enzima de um factor de pelo menos ICO vezes. As letras para designar os aiaincoeidos t êm os signifi ca d os s ° guintes: D Acido áspártico 17 i_l Acido glutámico A A lanina R Argi nina N Asparagina C Cisteína Ω G1utamina G G1i c i na H Hist idi na I Isoleuci na L Leucina K Lisina M Metionina F Fenilalanina P Prolina S Serina T Treonina W Triptofano Y T i ros i na V Vaiina bad original

Claims

-14- 70 115 "P n rr 9 Q Γ R E T V I hT D T o. C A C ó E e 1 . P recesso de obt {f . de der \ i % A A V C.!: ? ^ .Ί o n 1 ’ UUUill „ L- u. _ - ase a t c x í CCS , caracter izado po r c r> ti V* a mut agén< íse i n v 11 r o· do ge ne c 1 onado, exprimin A '~i V' 6 ci den i 1 c i c i â L' t‘ tc ! x i 1 c s , sendo e st a mutag énese eíectuada na r egi ão que codi f i c a 0 lc nca 1 cata 1í t i co e / o u o 1 ocal activador pe 1 a Cã 1 modu 1 i na ( ' O!. o local de trans f erên cia da informação do 1 A oca 1 activador P ara o lo ca 1 catai í t i C 0 e/ou a região res pon sáv e 1 pe la h eme 51 : ise , de forma a i ntr o duzir um ou vários cod ões que cod if: i cam aminoác i dos di fer entes dos presentes na P rot eína tóxi c 5 , ou de forma Cl ef ect uar a delecção de cer tos c odo es ca pazes de lhe conferir um c a r ά c ter ci tóxico, sem afe cta r de f erma not ave 1 Ò configura Ç *ji o t r i d i mens i anal apresentada pe la proteína t óx i ca, de modo que os a n t i c orpos formados cont ra os d er i va d o s atóx: icos reconheçam igualmente a proteína atóxica; a expressão num organismo hospedeiro do gene mutado; e a recuperação dos derivados de adeni1cic1 ase atóxicos produzidos.
2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por os codões mutados, codificando aminoacidos diferentes dos da proteína tóxica. apresentarem tamanhos e/ou um carácter hidrofóbico ou hidrófílico e/ou uma carga e/ou uma propensão para formar ou destruir as estruturas secundárias da sequência de aminoacidos e/ou uma acção sobre a estrutura da água e/ou uma interacção com todo ou parte do ATP interveniente com;o substrato e/ou com a calmodulina, diferentes dos dos aminoacidos da * proteína tóxica.
3. Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado por os codões mutados codificarem um ou, vantajosamente, pelo menos, deis aminoécídos diferentes, no local catalítico da adeni1ciclase.
4. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, caracterizado por os codões mutantes codificarem uma ou, pelo menos, duas glutaminas ou asparaginas, aspartatos ou glutamatos em vez de resíduos de lisinas.
5. Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado BAD ORIGINAL - 1

-15- por o núcleo da sequência peptídica catalítica GLNVHAK5 estar rnodif i cado, estando G e A. c a da um, s u t s t i t u í d os p or um dos aminoác idos seguintes; ; M. L, I. V ou F, podendo K estar substituído por Q, mas també: m por N e D, E, cu ainda per M, L, I, V. tendo as letras utilizadas para designar os aminoácidos os signi ficados seguintes: A: a 1anina, F: feni1 a 1ani na, G: g1icina, K: histina, I: isoleucina. K: lisina, L: leucina, F:: rnetionina, N: asparagina, S: serina e V: valina.
6. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, caracterizado por os derivados obtidos comportarem um ou vários resíduos cisteína, em caso de necessidade, quimicamente medi ficados.
7. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por os derivados obtidos compreenderem um ou vários análogos de aminoácidos incorporáveis pela máquina de tradução, em caso de necessidade, quimicamente modificados.
8. Processo de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado por o ou os aminoácido(s) de substituição estar(em) presente(s) nc local activador.
9. Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado por os derivados de adeni1ciclase obtidos comportarem um resíduo aspartato, glutamato, asparagina ou glutarnina, em vez de um resíduo .triptofano da região de ligação à calmodulina. 9
10. Processo de acordo com qualquer das reivindicações de 1 a 9, caracterizado por a mutagénese ser efectuada sobre um gene clonado de adeni1cic1 ase de Bordetella tal como de B.pertussis. B.bronchiseptica. B.avium, e de Baci11us anthracis.
11. Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado per a mutagénese se realizar sobre a parte activa da adenilciclase de B.pertussis representada pela sequência (I) que se segue: J BAD ORIGINAL 70 115 BQ528C ' C

-16- BamHI GGATCCAAATTTTCCGGATTGGTGGGAATTTGTGCATTTTCACTGCGAATGTTGGAATAA TTTCGCCCATCGTCATACGACATGCTGGATGTTTGGTTCTTGCAGAAGGATGAGGTTCTG 100 AGCGCTACACACCGGTTGCGTCGGTGCGAATCCGTTCAATCGACTACTTATCGACAGATC • · · · · · HisMetGlnGlnSerHisGlnAlaGlyTyrAlaAsnAlaAlaAspArgGluSerGlylle CACATGCAGCAATCGCATCAGGCTGGTTACGCAAACGCCGCCGACCGGGAGTCTGGCATC 200 . ProAlaAlaValLeuAspGlylleLysAlaValAlaLysGluLysAsnAlaThrLeuMet CCCGCAGCCGTACTCGATGGCATCAAGGCCGTGGCGAAGGAAAAAAACGCCACATTGATG . . . . . 300 PheArgLeuValAsnProHisSerThrSerLeuIleAlaGluGlyValAlaThrLysGly TTCCGCCTGGTCAACCCCCATTCCACCAGCCTGATTGCCGAAGGGGTGGCCACCAAAGGA « « * · · ♦ LeuGlyValHisAlaLysSerSerAspTrpGlyLeuGlnAlaGlyTyrlleProValAsn TTGGGCGTGCACGCCAAGTCGTCCGATTGGGGGTTGCAGGCGGGCTACATTCCCGTCAAC 400 ProAsnLeuSerLysLeuPheGlyArgAlaProGluValIleAlaArgAlaAspAsnAsp CCGAATCTTTCCAAACTGTTCGGCCGTGCGCCCGAGGTGATCGCGCGGGCCGACAACGAC ······ ValAsnSerSerLeuAlaHisGlyHisThrAlaValAspLeuThrLeuSerLysGluArg GTCAACAGCAGCCTGGCGCATGGCCATACCGCGGTCGACCTGACGCTGTCGAAAGAGCGG • SOO · ♦ * · LeuAspTyrLeuArgGlnAlaGlyLeuValThrGlyMetAlaAspGlyValValAlaSer CTTGACTATCTGCGGCAAGCGGGCCTGGTCACCGGCATGGCCGATGGCGTGGTCGCGAGC φ a · · · 600 AsnHisAlaGlyTyrGluGlnPheGluPheArgValLysGluThrSerAspGlyArgTyr AACCACGCAGGCTACtÍAGCAGTTCGAGTTTCGCGTGAAGGAAACCTCGGACGGGCGCTAT « · · · · · AlaValGlnTyrArgArgLysGlyGlyAspAspPheGluAlaValLysValIleGlyAsn GCCGTGCAGTATCGCCGCAAGGGCGGCGACGATTTCGAGGCGGTCAAGGTGATCGGCAAT 700 AlaAlaGlylleProLeuThrAlaAspIleAspMetPheAlalleMetProHisLeuSer GCCGCCGGTATTCCACTGACGGCGGATATCGACATGTTCGCCATTATGCCGCATCTGTCC EcoRV • * · * * · AsnPheArgAspSerAlaArgSerSerValThrSerGlyAspSerValThrAspTyrLeu AACTTCCGCGACTCGGCGCGCAGTTCGGTGACCAGCGGCGATTCGGTGACCGATTACCTG • 600 · · ♦ · AlaArgThrArgArgAlaAlaSerGluAlaThrGlyGlyLeuAspArgGluArglleAsp GCGCGCACGCGGCGGGCCGCCAGCGAGGCCACGGGCGGCCTGGATCGCGAACGCATCGAC . . . . . 900 70 115 B0528C

-17- LeuLeuTrpLysIleAlaArgAlaGlyAlaArgSerAlaValGlyThrGluAlaArgArg TTGTTGTGGAAAATCGCTCGCGCCGGCGCCCGTTCCGCAGTGGGCACCGAGGCGCGTCGC • · · · · t GlnPheArgTyrAspGlyAspMetAsnlleGlyValIleThrAspPheGluLeuGluVal CAGTTCCGCTACGACGGCGACATGAATATCGGCGTGATCACCGATTTCGAGCTGGAAGTG 1000 ArgAsnAlaLeuAsnArgArgAlaHisAlaValGlyAlaGlnAspValValGlnHisGly CGCAATGCGCTGAACAGGCGGGCGCACGCCGTCGGCGCGCAGGACGTGGTCCAGCATGGC • · · · · , ThrGluGlnAsnAsnProPheProGluAlaAspGluLysIlePheValValSerAlaThr ACTGAGCAGAACAATCCTTTCCCGGAGGCAGATGAGAAGATTTTCGTCGTATCGGCCACC . 1100 . GlyGluSerGlnMetLeuThrArgGlyGlnLeuLysGluTyrlleGlyGlnGlnArgGly GGTGAAAGCCAGATGCTCACGCGCGGGCAACTGAAGGAATACATTGGCCAGCAGCGCGGC 1200 GluGlyTyrValPheTyrGluAsnArgAlaTyrGlyValAlaGlyLysSerLeuPheAsp GAGGGCTATGTCTTCTACGAGAACCGTGCATACGGCGTGGCGGGGAAAAGCCTGTTCGAC • · · · ♦ · AspGlyLeuGlyAlaAlaProGlyValProSerGlyArgSerLysPheSerProAspVal GATGGGCTGGGAGCCGCGCCCGGCGTGCCGAGCGGACGTTCGAAGTTCTCGCCGGATGTA 1300 LeuGluThrValProAlaSerProGlyLeuArgArgProSerLeuGlyAlaValGluArg CTGGAAACGGTGCCGGCGTCACCCGGATTGCGGCGGCCGTCGCTGGGCGCAGTGGAACGC • · · i « · GlnAspSerGlyTyrAspSerLeuAspGlyValGlySerArgSerPheSerLeuGlyGlu CAGGATTCCGGCTATGACAGCCTTGATGGGGTGGGATCGCGATCGTTCTCGTTGGGCGAG • 1400 · · · · ValSerAspMetAlaAlaValGluAlaAlaGluLeuGluMetThrArgGlnValLeuHis GTGTCCGACATGGCCGCCGTGGAAGCGGCGGAACTGGAAATGACCCGGCAAGTCTTGCAC . . . . . 1500 AlaGlyAlaArgGlnAspAspAlaGluProGlyValSerGlyAlaSerAlaHisTrpGly GCCGGGGCGCGGCAGGACGATGCCGAGCCGGGCGTGAGCGGTGCGTCGGCGCACTGGGGG « · · · · · GlnArgAlaLeuGlnGlyAlaGlnAlaValAlaAlaAlaGlnArgLeuValHisAlalle CAGCGGGCGCTGCAGGGCGCCCAGGCGGTGGCGGCGGCGCAGCGGCTGGTTCATGCCATT 1600 AlaLeuMetThrGlnPheGlyArgAlaGlySerThrAsnThrProGlnGluAlaAlaSer GCCCTGATGACGCAATTCGGCCGGGCCGGTTCCACCAACACGCCGCAGGAAGCGGCCTCG • · * · · · LeuSerAlaAlaValPheGlyLeuGlyGluAlaSerSerAlaValAlaGluThrValSer TTGTCGGCGGCCGTGTTCGGCTTGGGCGAGGCCAGCAGCGCCGTGGCCGAAACCGTGAGC 17 0 0 GlyPhePheArgGlySerSerArgTrpAlaGlyGlyPheGlyValAlaGlyGlyAlaMet GGTTTTTTCCGCGGGTCTTCGCGCTGGGCCGGCGGTTTCGGCGTGGCTGGCGGCGCGATG ιβοο -18- 70 115 B0523C AlaLeuGlyGlyGlylleAlaAlaAlaValGlyAlaGlyMetSerLeuThrAspAspAla GCGCTGGGAGGCGGCATCGCCGCGGCCGTTGGCGCCGGGATGTCGTTGACCGATGACGCG « · · · · ♦ ProAlaGlyGlnLysAlaAlaAlaGlyAlaGluIleAlaLeuGlnLeuThrGlyGlyThr CCGGCCGGACAGAAGGCCGCCGCCGGCGCCGAGATCGCGCTGCAGTTGACAGGTGGAACG . . . 1900 ValGluLeuAlaSerSerlleAlaLeuAlaLeuAlaAlaAlaArgGlyValThrSerGly GTCGAGCTGGCTTCTTCCATCGCGTTGGCGCTGGCCGCGGCGCGCGGCGTGACCAGCGGC LeuGlnValAlaGlyAlaSerAlaGlyAlaAlaAlaGlyAlaLeuAlaAlaAlaLeuSer TTGCAGGTGGCCGGGGCGTCGGCCGGGGCGGCTGCCGGCGCATTGGCCGCGGCGCTCAGT 2000 . ProMetGluIleTyrGlyLeuValGlnGlnSerHisTyrAlaAspGlnLeuAspLysLeu CCCATGGjAGATCflACGGCCTGGTGCAGCAATCGCACTATGCGGATCAGCTGGACAAGCTG 2100 AlaGlnGluSerSerAlaTyrGlyTyrGluGlyAspAlaLeuLeuAlaGlnLeuTyrArg GCGCAGGAATCGAGCGCATACGGTTACGAGGGCGACGCCTTGCTGGCCCAGCTGTATCGC AspLysThrAlaAlaGluGlyAlaValAlaGlyValSerAlaValLeuSerThrValGly GACAAGACGGCCGCCGAGGGCGCCGTCGCCGGCGTCTCCGCCGTCCTGAGCACGGTGGGG . . . 2200 AlaAlaValSerlleAlaAlaAlaAlaSerValValGlyAlaProValAlaValValThr GCGGCGGTGTCGATCGCCGCGGCGGCCAGCGTGGTAGGGGCCCCGGTGGCGGTGGTCACT SerLeuLeuThrGlyAlaLeuAsnGlylleLeuArgGlyValGlnGlnProllelleGlu TCCTTGCTGACCGGGGCTCTCAACGGCATCCTGCGCGGCGTGCAGCAGCCCATCATCGAA 2300 . LysLeuAlaAsnAspTyrAlaArgLysIleAspGluLeuGlyGlyProGlnAlaTyrPhe AAGCTGGCCAACGATTACGCTCGCAAGATCGACGAGCTGGGCGGGCCGCAAGCGTACTTC . . . . . 2400 GluLysAsnLeuGlnAlaArgHisGluGlnLeuAlaAsnSerAspGlyLeuArgLysMet GAGAAAAACCTGCAGGCGCGTCACGAACAACTGGCCAATTCGGACGGCCTACGGAAAATG LeuAlaAspLeuGlnAlaGlyTrpAsnAlaSerSerValIleGlyValGlnThrThrGlu CTGGCCGACCTGCAGGCCGGTTGGAACGCCAGCAGCGTGATCGGGGTGCAGACGACAGjÃG 2500 IleSerLysSerAlaLeuGluLeuAlaAlalleThrGlyAsnAlaAspAsnLeuLysSer ATCljCCAAGTCGGCGCTCGAACTGGCCGCCATTACCGGCAACGCGGACAACCTGAAATCC « · · · ♦ · ValAspValPheValAspArgPheValGlnGlyGluArgValAlaGlyGlnProValVal GTCGACGTGTTCGTGGACCGCTTCGTCCAGGGCGAGCGGGTGGCCGGCCAGCCGGTGGTC • 2600 · · · · LeuAspValAlaAlaGlyGlylleAspIleAlaSerArgLysGlyGluArgProAlaLeu CTCGACGTCGCCGCCGGCGGCATCGATATCGCCAGCCGCAAGGGCGAGCGGCCGGCGCTG EcoRV 2700 70 115 B0528C

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-20- ArgLeuAsnAspArglleAlaGlyAspAspGlnAspAsnGluLeuTrpGlyHisAspGly CGCCTAAACGACCGCATCGCCGGCGACGACCAGGACAACGAGCTCTGGGGCCACGATGGC Saci ··♦··· AsnAspThrlleArgGlyArgGlyGlyAspAspIleLeuArgGlyGlyLeuGlyLeuAsp AACGACACGATACGCGGCCGGGGCGGCGACGACATCCTGCGCGGCGGCCTGGGCCTGGAC 3700 ThrLeuTyrGlyGluAspGlyAsnAspIlePheLeuGlnAspAspGluThrValSerAsp ACGCTGTATGGCGAGGACGGCAACGACATCTTCCTGCAGGACGACGAGACCGTCAGCGAT «····· AspIleAspGlyGlyAlaGlyLeuAspThrValAspTyrSerAlaMetlleHisProGly GACATCGACGGCGGCGCGGGGCTGGACACCGTCGACTACTCCGCCATGATCCATCCAGGC • 3800 · · · · ArglleValAlaProHisGluTyrGlyPheGlylleGluAlaAspLeuSerArgGluTrp AGGATCGTTGCGCCGCATGAATACGGCTTCGGGATCGAGGCGGACCTGTCCAGGGAATGG . . . . . 3900 ValArgLysAlaSerAlaLeuGlyValAspTyrTyrAspAsnValArgAsnValGluAsn GTGCGCAAGGCGTCCGCGCTGGGCGTGGACTATTACGATAATGTCCGCAATGTCGAAAAC ······ ValIleGlyThrSerMetLysAspValLeuIleGlyAspAlaGlnAlaAsnThrLeuMet GTCATCGGTACGAGCATGAAGGATGTGCTCATCGGCGACGCGCAAGCCAATACCCTGATG 4000 GlyGlnGlyGlyAspAspThrValArgGlyGlyAspGlyAspAspLeuLeuPheGlyGly GGCCAGGGCGGCGACGATACCGTGCGCGGCGGCGACGGCGATGATCTGCTGTTCGGCGGC ·«·«·« AspGlyAsnAspMetLeuTyrGlyAspAlaGlyAsnAspThrLeuTyrGlyGlyLeuGly GACGGCAACGACATGCTGTATGGCGACGCCGGCAACGACACCCTCTACGGGGGGCTGGGC . 4100 . AspAspThrLeuGluGlyGlyAlaGlyAsnAspTrpPheGlyGlnThrGlnAlaArgGlu GACGATACCCTTGAAGGCGGCGCGGGCAACGATTGGTTCGGCCAGACGCAGGCGCGCGAG . . . . . 4200 HisAspValLeuArgGlyGlyAspGlyValAspThrValAspTyrSerGlnThrGlyAla CATGACGTGCTGCGCGGCGGAGATGGGGTGGATACCGTCGATTACAGCCAGACCGGCGCG ···*·· HisAlaGlylleAlaAlaGlyArglleGlyLeuGlylleLeuAlaAspLeuGlyAlaGly CATGCCGGCATTGCCCÍCGGGTCGCATCGGGCTGGGCATCCTGGCTGACCTGGGCGCCGGC 4300 ArgValAspLysLeuGlyGluAlaGlySerSerAlaTyrAspThrValSerGlylleGlu CGCGTCGACAAGCTGGGCGAGGCCGGCAGCAGCGCCTACGATACGGTTTCCGGTATCGAG ♦ ····· AsnValValGlyThrGluLeuAlaAspArglleArgAlaMetArgArgProThrCysCys AACGTGGTGGGCACGGAACTGGCCGACCGCATCCGGGCGATGCGCAGGCCAACGTGCTGC . 4400 . AlaAlaArgValAlaProThrCysLeuArgAlaAlaArgAlaThrMetCysCysTrpAla GCGGCGCGGGTGGCGCCGACGTGCTTGCGGGCGGCGAGGGCGACGATGTGCTGCTGGGCG 4500 -21- 70 115 B0528C AlaThrAlaThrThrSerCysArgAlaThrProAspAlalleAlaCysThrAlaLysPro GCGACGGCGACGACCAGCTGTCGGGCGACGCCGGACGCGATCGCTTGTACGGCGAAGCCG • « · · · · ValThrThrGlySerSerArgMetProProMetProAlaAsnLeuLeuAspGlyGlyAsp GTGACGACTGGTTCTTCCAGGATGCCGCCAATGCCGGCGAATCTGCTCGACGGCGGCGAC . . . 4600 GlyArgAspThrValAspGlnArgPro GGCCGCGATACCGTGGATCAGCGCCCGGG Sinal
12. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 11, caracterizado por se utilizar um oligonucleótido mutante para dirigir a mutagénese.
13. Processo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por o oligonucleótido mutante compreender um codão CAA em vez de um codão AAA, na posição 58 da adeni1cic1 ase da B.pertussis. e por compreender toda ou parte da sequência GTGGCCACCCAAGGATTGG ou ainda, por comportar, um codão CAG em vez de um codão AAG na posição 65 e por compreender toda ou parte da sequência GTGCACGCCCAGTCGTCCG ou um codão GAC em vez de um codão TGG na posição 242 e por compreender toda ou parte da sequência CTTGTT-GGGACAAAATCGC ou um codão GAG em vez do codão GAC do oligonucleótido anterior.
14. Processo de preparação de vacinas indutoras da síntese de anticorpos dotadas de uma acção protectora contra as infecções por Bordete11 a e Baci1lus anthracis. caracterizado por se associarem vacinas moleculares compreendendo um derivado de adenilciclase, preparado de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 13, com um veículo farmacêutico, ou em caso de necessidade, com bactérias inteiras portadoras de genes mutados.
15. Processo de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por o derivado de adenilciclase ser associado a uma preparação de bactérias mortas de B.pertussis utilizadas como adjuvante. Lisboa, - T /r a ir. i. Por INSTITUI PASTEUR OFICIAL^.

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