JPH02265483A - アデニル酸シクラーゼ誘導体及びその生物学的使用 - Google Patents

アデニル酸シクラーゼ誘導体及びその生物学的使用

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JPH02265483A
JPH02265483A JP1278338A JP27833889A JPH02265483A JP H02265483 A JPH02265483 A JP H02265483A JP 1278338 A JP1278338 A JP 1278338A JP 27833889 A JP27833889 A JP 27833889A JP H02265483 A JPH02265483 A JP H02265483A
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アントワーヌ・ダンシン
Philippe Glaser
フイリツプ・グラセ
Evelyne Krin
エブリヌ・クラン
Octavien Barzu
オクタビエン・バルズ
Daniel Ladant
ダニエル・ラダン
Agnes Ullmann
アニエス・ウルマン
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Institut Pasteur de Lille
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、アデニル酸シクラーゼ誘導体、突然変異誘発
によるその産生、及びそれらの生物学的使用特にワクチ
ンとしての使用に係る。
ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌ！ａ）または炭痘菌（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓａｎＬｈｒａｃｉｓ）に属する病原菌の
急性感染に対するを椎動物の予防免疫接種のために最も
一般的には、ビルレント完全細菌または弱毒細菌が使用
されている。
しかしながら、かかる細菌に起因する疾患を考慮すると
、これらのワクチンが必ずしも無毒であるとはいえない
。
実際、ビルレンスの主因はしばしば、細菌によって産生
されるタンパク質であって細菌自体でない。
細菌の死滅後もこれらのタンパク質は多くの病理作用の
主因となり得る。
百日咳菌（Ｂ、　ｅｒｔｕｓｓｉｓ）によって誘発され
る病理には本質的に、繊維状赤血球凝集素（ＦＨ＾）、
及び宿主細胞のサイクリックＡＨＰ産生を異常に増進さ
せる２つの毒素が作用する。これらの毒素は、宿主のシ
クラーゼを実質的に活性化する百日咳毒素（Ｐｔｘまた
はＬＰＦ）及びカルモジュリンによって活性化されるア
デニル酸シクラーゼ（ＡＣ）である。
最終的に溶血素は、アデニル酸シクラーゼに会合する。
このため百日咳菌のアデニル酸シクラーゼはシクロリジ
ン（ｃｙｃｌｏｌｙｓｉｎｅ）と呼ばれてきた。
上記の考察に基づいて発明者等は、ビルレント菌株また
は弱毒菌株を使用せず初期毒性を破壊するように適当に
変性して産生されたタンパク質を使用する予防免疫接種
手段を研究した。ここで特にアデニル酸シクラーゼに着
目しな。
本発明の目的は、毒性活性が除去されているが毒性タン
パク質を認識し得る抗体を形成し得るアデニル酸シクラ
ーゼの新規な誘導体を提供することである。
本発明の目的はまた、毒性アデニル酸シクラーゼをコー
ドする遺伝子のｉｎ　ｖｉＬｒｏ突然変異誘発によって
前記誘導体を産生ずる方法を提供することである。
本発明の別の目的は、病原体の感染に対して有効な防御
作用を確保するワクチンを提供することである。
本発明のアデニル酸シクラーゼ誘導体の特徴は、毒性タ
ンパク質のアミノ酸とは異なるアミノ酸を１つまたは複
数個含み、該異なるアミノ酸によって無毒性を得ること
である。これらのアミノ酸は、触媒メカニズム及び／ま
たはカルモジュリンによる活性化モード及び／またはア
デニル酸シクラーゼの活性化部位から触媒部位への情報
の伝達に関与するが、毒性タンパク質の三次元配置を顕
著に変化させないため、無毒誘導体に対して形成された
抗体が毒性タンパク質も認識し得る。
本発明の別の特徴は、溶血活性の主因となるアミノ酸が
変化しているがまたは欠失している完全タンパク質を提
供することである。
１つまたは複数の置換アミノ酸は、タンパク質の形態を
少なくとも免疫系による認識が変わるほど顕著に変化さ
せることなく毒性を破壊するように物理化学的特性に基
づいて選択される。
毒性タンパク質と同じ幾何学的形態（ｇｅｏｍｅｔｒｉ
’ｅ）を有するためこれらの誘導体は有毒な触媒活性を
作用させずに免疫系のルアー（Ｉｅｕｒｒｅ）の機能を
果たすという利点を有する。
タンパク質の初期毒性に作用し該毒性を破壊し得る特性
としては特に、アミノ酸のサイズ（ｔａｉｌｌｅ）、疎
水性または親水性、電荷、アミノ酸配列の二次構造の形
成性または破壊性、水の構造に対する作用、螺旋の破壊
性または形成性、基質として作用するＡＴＰの全部もし
くは一部との相互作用またはカルモジュリンとの相互作
用がある。
本発明の好ましい実施態様によれば、アデニル酸シクラ
ーゼ誘導体は、触媒部位即ちサイクリックＡＭＰ（ｃＡ
ＭＰ）産生の主因領域に１つまたは好ましくは２つ以上
の異なるアミノ酸を含む、この構造によって、タンパク
質の免疫原性が維持され同時にｃＡＨＰの産生が阻止さ
れるかまたは最小限に抑制され得る。
触媒部位の１つまたは複数の異なるアミノ酸は部位の活
性を破壊するかまたは活性のコントロールを破壊すべく
、特に水の構造を変えるかまたはタンパク質と水との相
互作用もしくはタンパク質と、ＡＴＰのリン酸エステル
、核塩基及び／または糖との相互作用を変えるように選
択される。
例えば、同じサイズの親水性アミノ酸に置換する疎水性
アミノ酸または逆に疎水性アミノ酸に置換する親水性ア
ミノ酸、電荷を喪失するかまたは電荷が変更されたアミ
ノ酸、または基質ＡＴＰの配置もしくはｃＡＨＰを形成
する環形成反応を阻止するアミノ酸が選択される。
例えば、ＡＴＰと相互作用する１つまたは少なくとも２
つのリジンはグルタミン（Ｑ）のごとく同じ大きさ（ｖ
ｏｌｕｍｅ＞で電荷をもたない親水性アミノ酸で置換さ
れる。
触媒ペプチド配列の内部のコアにＬＮＶＨＡＫＳが変性
され、Ｇ及び＾の各々がアミノ酸Ｍ、Ｌ、Ｉ、　Ｖまた
はＦで置換され、Ｋが前記のごとくＱ、あるいはＮ、　
Ｏ、Ｅ、　Ｍ、Ｌ、　ＩまたはＶで置換されてもよい。
本明細書中で前出及び後出のアミノ酸の略号として用い
た文字に対応するアミノ酸の名称を明細書の末尾にまと
める。
完全タンパク質中の溶菌活性の主因領域を欠失させるた
めには、例えば遺伝子をＢｇＩＩＩ（八〇ＡＴＣＴ）部
位で切断し対応するフラグメントを欠失させるシスティ
ン残基を含有しないことを利用し、該アミノ酸を局在突
然変異誘発によってタンパク質に導入してもよい０次に
該アミノ酸を適宜化学処理（例えば酸化、または金属、
有機水銀もしくはヨードアセトアミド型のＳｌ！試薬と
の反応）し、その結果としてタンパク質を不活性化する
。
異なるアミノ酸はまた、翻訳機槽によって組込み可能な
アミノ酸類似体から選択されてもよい。
必要な場合該アミノ酸は任意に化学的に変性されている
０例えば、フルオロフェニルアラニン、ブロモトリプト
ファンまたはノルロイシンがある。
必要に応じて任意に前記の好ましい実施Ｒ様と併用され
る本発明の別の実施態様によれば、１つまたは複数の置
換アミノ酸は、カルモジュリンの作用下の活性化部位に
存在し、同じパラメータに従って選択され、宿主の活性
化分子との結合を変化させる。
従って、カルモジュリンの結合領域では、負の電荷を有
し螺旋を破壊する親水性アスパラギン酸残基が、より大
きいサイズを有し螺旋を形成する疎水性のトリプトファ
ン残基を置換しているのが有利である。
さらに単独で使用されるかまたは上記の実施態様の少な
くとも１つと併用される別の実施態様によれば、上記の
ごとき１つまたは複数の置換アミノ酸は活性化部位から
触媒部位への情報伝達を支配するゾーンに存在する。
好ましくは本発明の誘導体は、アデニル酸シクラーゼ活
性を有するタンパク質をコードする遺伝子を宿主微生物
中で発現させることによって得られた誘導体であり、該
遺伝子は、クローニング後に突然変異誘発によって桓」
亘μ虞性されている。
後述する突然変異誘発エレメント以外にも、遺伝子の既
知領域を欠失させるかまたは合成オリゴヌクレオチドを
挿入させる操作によって活性を有する部位を破壊し得る
。
より特定的には本発明の誘導体は、ヒトの百日咳菌（１
工旦旦旦）及びパラ百日咳菌（ｍｔｕｓｓｉｓ）及び動
物の気管支敗血症菌（Ｂ、ｂｒｏｎｃｈｉｓｅＩお１）
及びトリ・ボルデテラ菌（Ｂ、ａｖｉｕｍ）のごときを
推動物の呼吸器疾患の主因となるボルデテラ（Ｂｏｒｄ
ｅｔｅｌ　ｌａ）属のアデニル酸シクラーゼの突然変異
体である。
クローン遺伝子によって発現された百日咳菌の毒性アデ
ニル酸シクラーゼの活性部位は第１ａ図から第１ｆ図に
示す配列（１）を有する。この配列は１９８８年７月２
５日付けの欧州特許出願箱８８７４０１，９３５．７号
に記載されている。
１７０６個のアミノ酸を含む配列（Ｉ）に対応するタン
パク質は２つの主要活性を有する２つの領域を含む。
Ｎ末端部の４００〜５００のアミノ酸はアデニル酸シク
ラーゼ活性を支配し、カルボキシ末端部の１３００〜１
２００のアミノ酸は溶血活性及びタンパク質の分泌特性
を支配する。
ｃＡＨＰを合成する触媒活性部においてはアデニル酸シ
クラーゼが２つの領域として編成されており、触媒部位
を担う２５ｋＤａのＮ末端領域とカルモジュリンへの主
要結合部位、特に残基２３５〜２５４に対応する配列を
担う１２ｋＤａのＣ末端領域とが形成されている。
本発明の別の実施態様によれば、アデニル酸シクラーゼ
誘導体は炭痘菌によって発現されるタイプのアデニル酸
シクラーゼの突然変異体である。
該アデニル酸シクラーゼをコードする遺伝子のヌクレオ
チド配列及び該アデニル酸シクラーゼの配列は出願人に
よる同日付けのフランス特許出願「炭疽菌のアデニル酸
シクラーゼを発現するヌクレオチド配列、該アデニル酸
シクラーゼの活性を有するタンパク質及びその生物学的
用途」に開示されている。
炭痘菌のアデニル酸シクラーゼのアミノ酸配列は百日咳
菌から分泌されるアデニル酸シクラーゼのアミノ酸配列
と共通の領域をいくつが有する（第２図参照）。
最大の類似性を有する領域は、２４個のアミノ酸から成
るペプチド（炭痘菌のアデニル酸シクラーセノ３４２（
ｆｉ　〜３６５位（７）　７　ミ／　酸：ＧＶＡＴＫＧ
ＬＮＶＨＧＫＳＳＤＷＧＰＶＡＧＹＩＰ）に対応する。
この配列は５つのｇｌｙ残基とコア配列Ｇ−−−ＧＫＳ
（百日咳菌では八ＫＳ）とを含み、このコア配列はこれ
等のヌクレオチドに対する親和性を有するタンパク質中
でしばしば検出される配列である。
２つの別の領域は類似性がより小さい、これら＜７）　
領域ハ、炭痘菌ノ４８７位〜５０１位の領域（ＰＬＴＡ
ＤＹＤＬＦＡＬＡＰＳＬ）及ヒ５７３位〜５９４位ノ領
域（ＤＶＶＮＨＧＴＥＱＤＮＥＥＦＰＥＫＤＮＥＩＦ）
に対応する。
変形例として本発明の誘導体は変性アデニル酸シクラー
ゼ配列の化学的処理によって得られる誘導体でもよい。
本発明の目的は更に、これらの変性アデニル酸シクラー
ゼに対するポリクローナル抗体及び該変性アデニル酸シ
クラーゼを特異的に認識し得るモノクローナル抗体を提
供することである。
本発明によれば、上記のアデニル酸シクラーゼ誘導体は
、毒性タンパク質を発現するクローン遺伝子のｉｎ　ｖ
ｉｔｒｏ突然変異を誘発させ、次いで例えば、大腸菌（
Ｅ、ｃｏｌｉ）、トリ・ボルデテラまたはまたはアルカ
リゲネス・ユウトロファス（＾１Ｃａ１ｉｅｎｅＳ７ユ
）のごとき適当な宿主中で遺伝子を発現させ、引き続い
て任意に（例えばシスティンを含むタンパク質の場合）
化学処理することによって得られる。特に大腸菌中で発
現効率が高い、３１１伝子を病原菌に戻し該病原菌中で
無毒タンパク質を発現させることも可能である。このよ
うに変性された細菌も本発明の一部を成す。
本発明による無毒アデニル酸シクラーゼ誘導体の産生方
法は、毒性アデニル酸シクラーゼを発現するクローン遺
伝子のｉｎ　ｖｉｔｒｏ突然変異誘発を特徴とする。こ
の突然変異誘発は、触媒部位及び／またはカルモジュリ
ンによって活性化される部位及び／または活性化部位か
ら触媒部位に情報を伝達する部位をコードする領域及び
／または溶血活性の主因となる領域で行なわれる。毒性
タンパク質の三次元配置の顕著な変化を伴うことなく無
毒性の誘導体が得られるように、毒性タンパク質中に存
在するアミノ酸とは異なるアミノ酸をコードする１つま
たは複数のコドンを導入するかまたは出発遺伝子に存在
する（無）毒性を与え得るコドンを消滅（欠失）させる
。従って無毒誘導体に対して形成された抗体が毒性タン
パク質をも認識し得る。
突然変異誘発は、以下のアミノ酸をコードするコドンに
対して行なうのが有利である。
本発明の好ましい実施態様によれば、突然変異誘発のた
めに、＾ｔｍ　ｅ　ｒ　ｓ　ｈ　ａ　ｖａのｉｎ　ｖｉ
ｔｒｏ突然変異誘発系を使用するかまたは突然変異オリ
ゴヌクレオチドを利用する別の会社によって提案された
同種の系を使用し得る。該オリゴヌクレオチドは導入す
べき所望のアミノ酸をコードし得るコドンを含むように
構築されている。所望の最終コドンは１段階で導入され
てもよく、または中間段階で別のコドンを導入し次いで
最終段階で該別のコドンを最終コドンで置換してもよい
。
また変形例として、異なる２つのアミノ酸をコードし得
る曖昧な突然変異オリゴヌクレオチドを利用することも
可能である。また、欠失を生じさせるように１つまたは
複数のコドンが欠落・した突然変異オリゴヌクレオチド
を使用してもよい。
突然変異オリゴヌクレオチドは、少なくとも１５、特に
２０〜２５個のヌクレオチドを含むのが有利である。＾
ｍｅｒｓｈａｍキットを用いる従来のｉｎ　ｖｉｔｒｏ
突然変異誘発方法は以下の段階から成る。
−Ｗ然変異によりベクターから適当な方法で構築された
単鎖ＤＮ＾の鋳型のＤＮＡ配列と、前記突然変異オリゴ
ヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを行う、有利
には、単鎖Ｄ　Ｎ　Ａベクターとしてファージ、特にＭ
１３系ファージを使用する。
−大腸菌のＤＮＡポリメラーゼｌのＫｌｅｎｏｗフラグ
メントのごときポリメラーゼによって単鎖突然変異ＤＮ
＾をα−チオｄＣＴＰの存在下に合成し結合する。
−（突然変異体でない）単鎖ＤＮＡを例えば濾過によっ
て除去する。
一非突然変異ＤＮ＾鎖をＮａ１ｌのごとき制限酵素で切
断する。
一非突然変異鎖を例えばエキソヌクレアーゼ、特にエキ
ソヌクレアーゼ■で分解する。
部分的に欠失したＤＮＡを再重合し結合するーコンピテ
ント宿主細胞をＤＮＡで形質転換する。
この方法の利点は、無毒誘導体が高収率で得られること
である。しかしながら、例えば制限部位を利用して挿入
、欠失または置換を行なう別の突然変異誘発方法を使用
できること、また、Δｍｅｒｓｈａｍの市販キラ）・に
基づく方法を適宜修正して適当なコドンを導入し本発明
の無毒アデニル酸シクラーゼ誘導体な産生じ得ることも
明らかである。
前記微生物のいずれかによって発現されるアデニル酸シ
クラーゼをコードする遺伝子は、１９８７年７月２４日
付けの出願人名義のフランス特許出願第８７／１０６１
４号に記載の方法でクローニングされるのが有利である
。
該方法においては、アデニル酸シクラーゼ−カルモジュ
リンの相互作用を利用してｃＡＭＰを産生ずる。遺伝子
のクローニングは、カルモジュリンを高レベルで発現す
るプラスミドを保有しアデニル酸シクラーゼが欠失した
受容菌株中で行なう、このクローニング方法で組み込ま
れる遺伝子、即ちアデニル酸シクラーゼをコードする遺
伝子とカルモジュリンをコードする遺伝子とが異なる起
源に由来することは理解されよう。
本発明の突然変異誘発方法で使用できる百日咳菌のアデ
ニル酸シクラーゼをコードする遺伝子の活性部のクロー
ンＤＮＡフラグメントも第１ａ図から第１ｒ図の配列あ
るいは第３ａ図から第３ｊ図の配列に対応する。
Ｄ）ＩＡフラグメント中のｃＡＨＰ合成の触媒部は０位
と２０５０位との間に局在するヌクレオチド配列を含む
。
０位はＢａｍＨｌ制限部位に対応する。
第１ａ図から第１ｆ図及び第３ａ図から第３ｊ図のヌク
レオチド配列とハイブリダイズしアデニル酸シクラーゼ
活性をもつタンパク質をコードするすべてのヌクレオチ
ド配列は、対応するＲＮＡの逆酵素転写によって得られ
たかまたは化学合成によって得られたかにかかわりなく
本発明方法の突然変異誘発のために使用し得る。
本発明の目的はまた、アデニル酸シクラーゼの少なくと
も活性部をコードする遺伝子を含むかまたは該遺伝子か
ら構成され前記に定義したアデニル酸シクラーゼ誘導体
及び突然変異オリゴヌクレオチドをコードするように突
然変異されたヌクレオチド配列を提供することである。
従って、第１ａ図から第１ｒ図のＤＮＡフラグメントに
比較して本発明のヌクレオチド配列は、５８位のコドン
ＡＡＡに置換してコドンＣＡＡを含むかまたは６５位の
コドンＡＡＧに置換してコドンＣＡＧを含む、好ましく
は、これらのオリゴヌクレオチドはベクター８１３との
非特異的ハイブリダイゼーションを行なうことができな
い。
突然変異オリゴヌクレオチドは例えば、５８位のコドン
ＡＡＡに置換してコドンＣＡＡを含み、配列ＧＴＧＧＣ
ＣＡｃｅ　ＣＡＡＧＧＡ　ＴＴＧ　（：の全部または一
部を含む。
また、オリゴヌクレオチドが６５位のコドン＾ΔＣに１
換してコドンＣＡＧを含み、配列ＧＴＧＣＡＣ（：ＣＣ
ＣＡ（：ＴＣＧＴＣＣＧの全部または一部を含んでもよ
い。
別のオリゴヌクレオチド配列は、２４２位のコドンＴＧ
Ｇに置換してコドンＧＡＣを含み、配列ＣＴＴＧＴＴＧ
Ｇ＾ＣＡＡ＾＾ＴＣＧＣの全部または一部を含んでもよ
く、または該オリゴヌクレオチド配列のコドンＧＡＣに
置換してコドンＧＡＣを含んでもよい。
１つの実験で複数の突然変異体を得るようにオリゴヌク
レオチドの混合物を使用してもよい。
変形例によれば、アデニル酸シクラーゼのタンパク質配
列または該配列の少なくとも活性部に対し、例えば破傷
風ワクチンのごときワクチンの製造で使用される不活化
処理のごとき化学的処理を行なって本発明の無毒誘導体
を製造してもよい。
毒性試験の結果によれば、本発明のタンパク質誘導体が
毒性をもたないことが判明した。
従って、本発明の誘導体の強力な免疫原性はワクチンの
製造に有利である。
本発明のワクチンは、少なくとも１つの前記のごとき無
毒アデニル酸シクラーゼ誘導体を製剤用賦形剤と共に含
む分子ワクチンであることを特徴とする。
本発明のワクチンはまた、突然変異遺伝子を担っており
従って無毒化された細菌を含んでもよい。
ワクチン接種は、常用の投与量及び投与形態で行なわれ
る。
本発明のアデニル酸シクラーゼ誘導体は百日咳菌のアデ
ニル酸シクラーゼに対する抗体と交叉免疫反応を生じる
という利点をもつ、好ましいワクチン組成物は本発明の
アデニル酸シクラーゼ誘導体とアジュバントとして使用
される百日咳菌の死菌の調製物とを含む。
本発明を更に十分に理解するために百日咳菌のアデニル
酸シクラーゼの突然変異体の調製実施例を添付図面に基
づいて以下に説明する。
！ＬＩＬＬ 百日咳菌のアデニル酸シクラーゼをコードする遺伝子の
クローニング 大腸菌ｃｙａ−１制限−株を、プラスミドｐｖｕｃ−ｔ
のごときカルモジュリン合成に特異的な遺伝子を担うプ
ラスミド、またはアンピシリン耐性遺伝子を担いＣｏＩ
Ｅ１不和合型不和小型ジュリンを発現する別の任意のプ
ラスミドによって形質転換した。
次いでｃｙａ−株に、種々の方法（例えば制限酵素Ｅｃ
ｏＲＩ及び５ａｕｌ［ａによる切断、超音波処理及びＥ
ｃｏＲＩ　’リンカー」の付加を順次行なう処理）でフ
ラグメント化された、完全百日咳菌ＤＮＡを含むベクタ
ーを導入した。
ＣｏｆＥルブリコンを有する別のプラスミドの不和合性
から生じる問題を配慮し、酵素５ａｕｎｌａで部分切断
した百日咳菌の完全ＤＮＡのフラグメントを適合ベクタ
ーｐＡＣＹＣ１８４の非反復ＢａｍＨ１部位にクローニ
ングした。受容菌株を形質転換しＭｅ　ＣｏｎｋｅｙＨ
ａｌｔｏｓｅ皿に塗布した。マルトースを発酵させる複
数のクローンを単離した０次にクローンがサイクリック
八ＨＰを産生することを証明した。更に、産生菌株から
抽出されたプラスミドは、菌株が１ラスミドｐＶｔｌｃ
−１を含有するかまたは非含有であるかにかかわりなく
形質転換によって菌株に取り込まれた。菌株がプラスミ
ドｐＶｔｌｃ−１を含む場合には、Ｍｅ　Ｃｏｎｋｅｙ
　ｎａｌｔｏｓｅ培地上のクローンが白色であり、非含
有の場合には赤色であってカルモジュリンを合成し得る
プラスミドの存在を証明しており、これによりクローニ
ングが可能となった。
Ｋ１匠Ｌ アデニル酸シクラーゼをコードするクローン遺伝子のｉ
ｎ　ｖｉＬｒｏ突然変異誘発 Ｈｕｅ　ｌ　、＾ａｉｄｓ　Ｒｅｓ、　１３−１４４３
１〜４３，１９８５のＣａｒｔｅｒ等の方法で処理し、
オリゴヌクレオチドＧＴＧＧＣＣＡＣＣＣＡＡににＡＴ
ＴＣＧを用い５８位の（Ｋをコードする）コドン＾＾＾
を（Ｑをコードする）コドンＣＡＡで置換する。また、
オリゴヌクレオチドＧＴＧＣＡＣＧＣＣり旦ＴＣＧＴＣ
ＣＧを用い６５位の（Ｋをコードする）コドンＡＡＧを
（Ｑをコードする）コドンＣＡＧで置換する。
ファージＭｆ３ｔｆＩ１３０中でクローニングされたＤ
ＮＡのＢａｗｌ　Ｉ−ＥｃｏＲＶフラグメン）−の２つ
のコドンを変更した。
丈ず、オリゴヌクレオチドＣＴＴＧＴＴににＡＣＡＡＡ
ＡＴＣＧＣを用い（トリプトファンをコードする）２４
２位のＴＧＧコドンを（アスパラギン酸をコードする）
ＧＡＣコドンに変える。次にオリゴヌクレオチドＣＴＴ
ＧＴＴＧ凋＾＾＾ΔＴＣＧＣを使用しＧＡＣコドンを（
グルタミン酸をコードする）ＧＡＣコドンに変える。こ
の場合、アデニル酸シクラーゼをコードする別の遺伝子
のヌクレオチド配列と類似のゾーン特に炭痘菌の該ゾー
ンに存在しないコドンの突然変異を誘発する。
ファージＭ１１ｔｙ１３０中にクローニングされたＤＮ
ＡのＥｃｏＲＶ　−ＥｃｏＲｌフラグメントの２４２位
を変更する。
各突然変異誘発において、ジデオキシヌクレオチドによ
る配列決定方法を用い突然変異フラグメントに別の突然
変異が全く存在しないようにコントロールする。
実」ｌ阻」− アデニル酸シクラーゼの無毒誘導体の産生常用の方法で
大腸菌中で突然変異遺伝子を発現させることによってア
デニル酸シクラーゼ誘導体を産生しこれを精製する。
トリプトファンがアスパラギン酸でＷ換されるとカルモ
ジュリンによる酵素の活性化が１７１０００に低下する
。基本活性は維持されている。
６５位のリジンを置換すると酵素の固有基本活性は１／
１００以下に低下する。
本文中でアミノ酸の略号として用いた文字は夫々以下の
アミノ酸を示す。
Ｄ　　　　アスパラギン酸 Ｅ　　　　　グルタミン酸 ＾　　　　アラニン Ｒアルギニン Ｎ　　　　アスパラギン Ｃシスティン Ｑ　　　　　グルタミン Ｃグリシン Ｈヒスチジン １　　　　イソロイシン Ｌ　　　　ロイシン Ｋ　　　　　リジン Ｈメチオニン Ｆ　　　　フェニルアラニン Ｐ　　　　　プロリン Ｓ　　　　セリン Ｔ　　　　トレオニン −トリプトファン Ｙ　　　　チロシン Ｖ　　　　バリン
【図面の簡単な説明】
第１ａ図から第１ｒ図及び第３ａ図から第３ｊ図は大腸
菌中でクローニングされた百日咳菌及び炭疽菌のアデニ
ル酸シクラーゼをコードする遺伝子の活性部のヌクレオ
チド配列及び発現される対応するアミノ酸の配列を示し
、第２図は炭疽菌のアデニル酸シクラーゼのポリペプチ
ドの完全配列（上列）及び百日咳菌のアデニル酸シクラ
ーゼのＮ末端ポリペプチド配列（下列）を示す。 図面の浄ｔ（内容に変更なし） 二Ｔ石５ｉｂ 二ｍζノＣ 二り万１１ｅ ニＩＭ１ｄ 二り万ｉＪｆ 三り万Ｃ２ （ぞのＩ） ＭＱＱＳＨＱＡＧＹλＮＸ ＶＱＸＱＤＷＱＨＧＴ ２Ｂ０　　　　　　２９０ 二ｈ２（ｆｏｒ２　）

Claims (19)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）毒性タンパク質アデニル酸シクラーゼのアミノ酸
    とは異なるアミノ酸を１つまたは複数個含み該異なるア
    ミノ酸によって無毒化されたアデニル酸シクラーゼ誘導
    体であり、前記アミノ酸が、触媒部位及び／またはカル
    モジュリンによって活性化される部位及び／または活性
    化部位から触媒部位に情報を伝達する部位及び／または
    溶血領域に存在し、毒性タンパク質の三次元配置を顕著
    に変化させないこと、従って無毒誘導体に対して形成さ
    れた抗体が毒性タンパク質も認識し得ることを特徴とす
    るアデニル酸シクラーゼ誘導体。
  2. （２）１つまたは複数の置換アミノ酸が毒性タンパク質
    のアミノ酸に比較して、異なるサイズ及び／または異な
    る疎水性もしくは親水性及び／または異なる電荷及び／
    またはアミノ酸配列の二次構造の異なる形成性もしくは
    破壊性及び／または水の構造に対する異なる作用及び／
    または基質として作用するＡＴＰの全部または一部との
    異なる相互作用及び／またはカルモジュリンとの異なる
    相互作用を示すことを特徴とする請求項１に記載の誘導
    体。
  3. （３）アデニル酸シクラーゼの触媒部位に１つまたは好
    ましくは２つ以上の異なるアミノ酸を含むことを特徴と
    する請求項１または２に記載の誘導体。
  4. （４）リジン残基に置換して、１つまたは２つ以上のグ
    ルタミン、アスパラギン、アスパラギン酸またはグルタ
    ミン酸を含むことを特徴とする請求項１から３のいずれ
    か一項に記載の誘導体。
  5. （５）触媒ペプチド配列のコアＧＬＮＶＨＡＫＳが変性
    されており、Ｇ及びＡの各々がアミノ酸Ｍ、Ｌ、Ｉ、Ｖ
    またはＦの１つによって置換されており、ＫはＱ、Ｎ、
    Ｏ、Ｅ、Ｍ、Ｌ、ＩまたはＶによって置換され得る〔Ａ
    はアラニン、Ｆはフェニルアラニン、Ｇはグリシン、Ｈ
    はヒスチジン、Ｉはイソロイシン、Ｋはリジン、Ｌはロ
    イシン、Ｍはメチオニン、Ｎはアスパラギン、Ｓはセリ
    ン及びＶはバリンを示す〕ことを特徴とする請求項３に
    記載の誘導体。
  6. （６）必要に応じて任意に化学的に変性された１つまた
    は複数のシステイン残基を含むことを特徴とする請求項
    １から３のいずれか一項に記載の誘導体。
  7. （７）必要に応じて任意に化学的に変性され翻訳機構に
    よって組込み可能な１つまたは複数のアミノ酸類似体を
    含むことを特徴とする請求項１から３のいずれか一項に
    記載の誘導体。
  8. （８）１つまたは複数の置換アミノ酸が活性化部位に存
    在することを特徴とする請求項１から７のいずれか一項
    に記載の誘導体。
  9. （９）カルモジュリン結合領域のトリプトファン残基に
    置換してアスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン
    またはグルタミンの残基を含むことを特徴とする請求項
    １または２に記載の誘導体。
  10. （１０）百日咳菌（￥Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ￥）、気
    管支敗血症菌（￥Ｂ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ￥
    ）、トリ・ボルデテラ菌（Ｂ．ａｖｉｕｍ）のごときボ
    ルデテラ（￥Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ￥）属及び炭疽菌（
    ￥Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｎｔｈｒａｃｉｓ￥）のアデニ
    ル酸シクラーゼの突然変異体であることを特徴とする請
    求項１から９のいずれか一項に記載の誘導体。
  11. （１１）第１ａ図から第１ｆ図の配列（ I ）または第
    ３ａ図から第３ｊ図の配列（II）で示される百日咳菌の
    アデニル酸シクラーゼの活性部の突然変異体であること
    を特徴とする請求項１０に記載の誘導体。
  12. （１２）アデニル酸シクラーゼ活性を有するタンパク質
    をコードする遺伝子をクローニング後に突然変異誘発に
    よって￥ｉｎ　ｖｉｔｒｏ￥変性し、この遺伝子を宿主
    微生物中で発現させることによって得られることを特徴
    とする請求項１に記載のアデニル酸シクラーゼ誘導体。
  13. （１３）請求項１の無毒アデニル酸シクラーゼ誘導体を
    産生する方法であって、毒性アデニル酸シクラーゼを発
    現するクローン化遺伝子の￥ｉｎ　ｖｉｔｒｏ￥突然変
    異誘発を含み、前記突然変異誘発が、触媒部位及び／ま
    たはカルモジュリンによって活性化される部位及び／ま
    たは活性化部位から触媒部位に情報を伝達する部位をコ
    ードする領域及び／または溶血の主因領域で生起され、
    前記突然変異誘発は、毒性タンパク質の三次元配置を顕
    著に変化させることなく従って無毒誘導体に対して 形成された抗体が無毒タンパク質も認識し得るように無
    毒性を与え得る毒性タンパク質中に存在するアミノ酸と
    は異なるアミノ酸をコードする１つまたは複数のコドン
    を導入するかまたはいくつかのコドンを欠失させること
    を特徴とする方法。
  14. （１４）突然変異コドンが、請求項２から９のいずれか
    一項に定義した毒性タンパク質のアミノ酸とは異なるア
    ミノ酸をコードすることを特徴とする請求項１３に記載
    の方法。
  15. （１５）突然変異を誘発するために突然変異オリゴヌク
    レオチドを利用することを特徴とする請求項１４に記載
    の方法。
  16. （１６）突然変異オリゴヌクレオチドが、百日咳菌のア
    デニル酸シクラーゼの５８位のコドンＡＡＡに置換した
    コドンＣＡＡを含み配列ＧＴＧＧＣＣＡＣＣＣＡＡＧＧ
    ＡＴＴＧＧの全部または一部を含むか、または６５位の
    コドンＡＡＧに置換したコドンＣＡＧを含み配列ＧＴＧ
    ＣＡＣＧＣＣＣＡＧＴＣＧＴＣＣＧの全部または一部を
    含むか、または２４２位のコドンＴＧＧに置換したコド
    ンＧＡＣを含み配列ＣＴＴＧＴＴＧＧＧＡＣＡＡＡＡＴ
    ＣＧＣの全部または一部を含むか、または該オリゴヌク
    レオチドのコドンＧＡＣに置換したコドンＧＡＣを含む
    ことを特徴とする請求項１５に記載の方法。
  17. （１７）請求項１から１２のいずれか一項のアデニル酸
    シクラーゼ誘導体を製剤用賦形剤または必要に応じて突
    然変異遺伝子を担う完全細菌と共に含む分子ワクチンで
    あることを特徴とするボルデテラ属及び炭疽菌の感染に
    対する防御作用を有する抗体の合成を誘発するワクチン
    。
  18. （１８）アデニル酸シクラーゼ誘導体がアジュバントと
    して使用される百日咳菌の死菌調製物と組合せられてい
    ることを特徴とする請求項１７に記載のワクチン組成物
    。
  19. （１９）請求項１から１２のいずれか一項の誘導体をコ
    ードするように突然変異されたアデニル酸シクラーゼ配
    列から成ることを特徴とする、アデニル酸シクラーゼの
    少なくとも活性部をコードする遺伝子を含むかまたは該
    遺伝子から構成されたヌクレオチド配列及びかかる配列
    の一部から形成された突然変異オリゴヌクレオチド。
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