KR20180106825A - 스팅 작용자를 포함하는 면역항원보강제 및 백신 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 STING 작용자를 포함하는 면역항원보강제 조성물 및 백신 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 STING 작용자를 포함하는 면역항원보강제 조성물 및 백신 조성물은 다양한 체내 면역 반응을 효과적으로 활성화시킬 수 있을 뿐만 아니라, 결핵균의 감염을 현저히 감소시키는 효과를 확인하였기 때문에, 결핵균뿐만 아니라 다른 병원균들의 백신과 함께 사용하면 기존의 감염 예방용 백신 효과를 현저히 증가시켜 다양한 병원균의 감염을 효과적으로 감소시킬 수 있을 것으로 기대된다.
Description
본 발명은 STING 작용자를 포함하는 면역항원보강제 조성물 및 백신 조성물에 관한 것이다.
백신 개발에 있어서 다양한 전략이 사용되어 왔다. 생균 또는 약독화된 균으로부터 만들어진 백신은 매우 효과적이나 회귀의 위험, 간혹 자기 복제 등의 문제점으로 인하여 안정성 문제가 종종 보고되고 있다(Neutra MR et al., 2006). 사균을 이용한 백신의 경우에도 치료에는 효과적이지만, LPS 같은 독성 물질이 포함될 수 있는 문제점과 살아있는 균이 존재할 수 있는 가능성이 있다고 알려져 있으며(Ryan EJ et al., 2001), 이와 같은 한계를 극복하기 위해 개발된 DNA 백신도 역시 숙주의 게놈(genome)상으로 삽입되어 돌연변이 발생률을 높이거나(mutagenic), 발암 유전자(oncogenic)로써의 가능성이 대두되고 있다(Schalk JA et al., 2006). 반면, Subunit 백신의 경우 정제된 항원을 사용하기 때문에 다른 백신들 보다 안정적이라고 할 수 있다. 그러나 이렇게 정제된 항원들은 종종 면역원성이 부족하기 때문에 이러한 면역원성을 증진시켜주기 위하여 강력한 면역항원보강제(adjuvant)가 요구된다.
한편, c-di-GMP(cyclic diguanylate)는 Acetobacter xylinum에서 셀룰로오스 생산을 조절하는 세포내 신호전달 물질로써 처음 규명되었다(Ross P et al., 1987). 이러한 c-di-GMP를 통한 신호전달은 진핵생물에서는 존재하지 않으며 박테리아에서만 특징적으로 존재한다고 보고되어져 있다(Galperin MY et al., 2004). 박테리아 내의 c-di-GMP는 신호전달의 두번째 전달자(second messenger)로써의 역할도 보고되고 있는데(Romling U et al., 2006; Schirmer T et al., 2009), 특히 박테리아의 생존에 중요한 박테리아의 운동성(motility), 접착성(adhesioin), 세포간의 상호작용(communication), 생물막(biofilm) 형성, 세포 외 다당류(exopolysaccharide) 합성 등 생리학적 기작을 조절한다고 알려져 있다(Tischler AD et al., 2004; Romling U et al., 2005; Wangxue Chen et al., 2010). 중요하게도 이러한 박테리아 유래 c-di-GMP가 숙주의 세포질 센서(cytosolic sensor)인 스팅(Stimulator of IFN gene; STING)의 리간드(ligand)로 작용하여 TBK1-IRF3를 통한 Type I IFN 생산과 NF-κB 매개 사이토카인(cytokine) 생산을 유도한다고 보고되었으며(Burcu Temizoz et al., 2015; Burdette et al., 2011; Mcwhirter et al., 2009), 최근 c-di-GMP와 같은 STING 작용자(agonist)가 항원 특이 T 세포(antigen-specific T cell)와 체액성 면역 반응(humoral immune response)을 증진시킬 수 있다는 것이 밝혀진 바 있다(Burcu Temizoz et al., 2015; Li et al., 2013).
따라서, 본 발명자들은 STING 작용자를 백신의 면역항원보강제로서 사용 가능한지 확인하기 위하여 본 실험을 진행하였다.
본 발명은 상기와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, STING 작용자를 유효성분으로 포함하는, 면역항원보강제 조성물 및 상기 조성물에 항원을 추가로 포함하는 백신 조성물을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
이하, 본원에 기재된 다양한 구체예가 도면을 참조로 기재된다. 하기 설명에서, 본 발명의 완전한 이해를 위해서, 다양한 특이적 상세사항, 예컨대, 특이적 형태, 조성물, 및 공정 등이 기재되어 있다. 그러나, 특정의 구체예는 이들 특이적 상세 사항 중 하나 이상 없이, 또는 다른 공지된 방법 및 형태와 함께 실행될 수 있다. 다른 예에서, 공지된 공정 및 제조 기술은 본 발명을 불필요하게 모호하게 하지 않게 하기 위해서, 특정의 상세사항으로 기재되지 않는다. "한 가지 구체예" 또는 "구체예"에 대한 본 명세서 전체를 통한 참조는 구체예와 결부되어 기재된 특별한 특징, 형태, 조성 또는 특성이 본 발명의 하나 이상의 구체예에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체에 걸친 다양한 위치에서 표현된 "한 가지 구체예에서" 또는 "구체예"의 상황은 반드시 본 발명의 동일한 구체예를 나타내지는 않는다. 추가로, 특별한 특징, 형태, 조성, 또는 특성은 하나 이상의 구체예에서 어떠한 적합한 방법으로 조합될 수 있다.
명세서에서 특별한 정의가 없으면 본 명세서에 사용된 모든 과학적 및 기술적인 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 당업자에 의하여 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.
본 발명은 STING 작용자(Stimulator of interferon genes agonist)를 유효성분으로 포함하는 면역항원보강제(adjuvant) 조성물 및 STING 작용자(Stimulator of interferon genes agonist)와 항원을 유효성분으로 포함하는 백신 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 STING 작용자는 바람직하게는 STING 신호전달(signaling)을 활성화(activation)시킬 수 있는 DNA, RNA, 단백질, 펩타이드 단편, 화합물 등이며, 더욱 바람직하게는 c-di-GMP(cyclic diguanylate), cGAMP, 3'3'-cGAMP, c-di-GAMP, c-di-AMP, 2'3'-cGAMP, 10-(카복시메틸)9(10H)아크리돈(CMA)(10-(carboxymethyl)9(10H)acridone(CMA)), 5,6-디메틸크산테논-4-아세트산(5,6-Dimethylxanthenone-4-acetic acidㅡDMXAA), 메톡시본(methoxyvone), 6, 4'-디메톡시플라본(6, 4'-dimethoxyflavone), 4'-메톡시플라본(4'-methoxyflavone), 3', 6'-디하이드록시플라본(3', 6'-dihydroxyflavone), 7, 2'-디하이드록시플라본(7, 2'-dihydroxyflavone), 다이드제인(daidzein), 포르모노네틴(formononetin), 레투신 7-메틸 에터(retusin 7-methyl ether) 및 크산톤(xanthone) 등이나, STING에 결합하여 신호전달을 활성화시킬 수 있는 물질이라면 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 구체예에 있어서 상기 면역항원보강제 조성물은 기존에 알려져 있는 다른 면역항원보강제를 추가로 포함할 수 있으며, 다른 면역항원보강제로는 바람직하게는 모노포스포릴 리피드 A(monophosphoryl lipid A, MPL) 및 GLA-SE(Glucopyranosyl Lipid Adjuvant, formulated in a stable nano-emulsion of squalene oil-in-water) 중 적어도 하나를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 상기 면역항원보강제들은 바람직하게는 리포좀(liposome)에 봉입되어 있을 수 있으나, 체내에 주입되는데 용이한 형태라면 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 상기 항원은 병원균 특이적인 항원이며, 바람직하게는 결핵균 특이적인 항원이며, 더욱 바람직하게는 ESAT-6 항원이나, 기존에 subunit 백신에 사용되고 있는 항원이라면 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 상기 백신 조성물은 결핵균의 감염을 예방하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 조성물은 병원균 예방용 효과를 갖는 공지의 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은, 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약학적으로 허용가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로오스 용액, 수크로오스 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내, 근육 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 투여 대상의 무게, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다.
본 발명에 따른 STING 작용자를 포함하는 면역항원보강제 조성물 및 백신 조성물은 다양한 체내 면역 반응을 효과적으로 활성화시킬 수 있을 뿐만 아니라, 결핵균의 감염을 현저히 감소시키는 효과를 확인하였기 때문에, 결핵균뿐만 아니라 다른 병원균들의 백신과 함께 사용하면 기존의 감염 예방용 백신 효과를 현저히 증가시켜 다양한 병원균의 감염을 효과적으로 감소시킬 수 있을 것으로 기대된다.
도 1A는 c-di-GMP의 면역항원보강제로서의 효능을 검증하기 위한 실험 디자인을 나타낸 도면이고, 도 1B는 ESAT-6 항원을 기반으로 MPL 또는 c-di-GMP로 면역화시킨 마우스의 비장 세포에 ESAT-6 단백질 자극 후 IFN-γ의 생성능을 확인한 결과를 나타낸 도면이다. 도 1C는 면역화된 마우스에서 ESAT-6 항원 특이적인 항체 생성을 확인한 결과를 나타낸 도면이며, 도 1D는 면역화된 마우스의 비장과 폐조직으로 침윤(infiltration)된 memory T 세포를 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 2A는 multifunctional T 세포의 분석 방법을 나타낸 도면이며, 도 2B는 ESAT-6 항원을 기반으로 MPL 또는 c-di-GMP로 면역화시킨 마우스의 폐와 비장 세포에서 ESAT-6 단백질 자극에 의하여 유도되는 항원 특이적인 multifunctional T 세포의 비율을 나타낸 도면이다.
도 3A 및 3B는 ESAT-6 항원을 기반으로 MPL 또는 c-di-GMP로 면역화시킨 마우스에 결핵균을 감염시킨 후, 16주 뒤에 폐 조직을 조직병리학적으로 분석한 결과를 나타낸 도면이며, 도 3C는 폐와 비장의 결핵균 세균 수를 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 4A는 c-di-GMP와 기존 MPL 면역항원보강제에 대한 시너지 효과를 확인하기 위한 실험 디자인을 나타낸 도면이며, 도 4B는 면역화된 마우스에서 T 세포의 활성을 분석한 결과를 나타낸 도면이다. 도 4C는 면역화된 마우스에서 ESAT-6 항원 특이적인 항체 생성을 시기별로 확인한 결과를 나타낸 도면이며, 도 4D는 면역화된 마우스에서 배중심(germinal center) 관련 T 세포와 B 세포의 비율을 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 5A는 ESAT-6 항원을 기반으로 MPL 또는 c-di-GMP/MPL로 면역화시킨 마우스에 결핵균을 감염시킨 후, 4주 뒤에 폐 조직을 조직병리학적으로 분석한 결과를 나타낸 도면이며, 도 5B는 폐에서 증식된 결핵균의 수를 측정한 결과를 나타낸 도면이다. 도 5C는 면역화가 완료된 마우스에 결핵균을 감염시킨 후, 4주 후에 폐와 비장에서 세포를 생체외 분리하여 ESAT-6 단백질 자극을 통한 항원 특이적인 multifunctional T 세포를 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 6은 ESAT-6 항원을 기반으로 c-di-GMP 및/또는 GLA-SE로 면역화시킨 마우스의 폐와 비장 세포에서 ESAT-6 단백질 자극에 의하여 유도되는 항원 특이적인 multifunctional T 세포의 비율을 나타낸 도면이다.
도 7은 면역화된 마우스에서 T 세포의 활성을 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 8은 ESAT-6 항원을 기반으로 GLA-SE 단독 또는 c-di-GMP와 GLA-SE로 면역화시킨 마우스의 폐와 비장에서 결핵균의 수를 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 2A는 multifunctional T 세포의 분석 방법을 나타낸 도면이며, 도 2B는 ESAT-6 항원을 기반으로 MPL 또는 c-di-GMP로 면역화시킨 마우스의 폐와 비장 세포에서 ESAT-6 단백질 자극에 의하여 유도되는 항원 특이적인 multifunctional T 세포의 비율을 나타낸 도면이다.
도 3A 및 3B는 ESAT-6 항원을 기반으로 MPL 또는 c-di-GMP로 면역화시킨 마우스에 결핵균을 감염시킨 후, 16주 뒤에 폐 조직을 조직병리학적으로 분석한 결과를 나타낸 도면이며, 도 3C는 폐와 비장의 결핵균 세균 수를 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 4A는 c-di-GMP와 기존 MPL 면역항원보강제에 대한 시너지 효과를 확인하기 위한 실험 디자인을 나타낸 도면이며, 도 4B는 면역화된 마우스에서 T 세포의 활성을 분석한 결과를 나타낸 도면이다. 도 4C는 면역화된 마우스에서 ESAT-6 항원 특이적인 항체 생성을 시기별로 확인한 결과를 나타낸 도면이며, 도 4D는 면역화된 마우스에서 배중심(germinal center) 관련 T 세포와 B 세포의 비율을 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 5A는 ESAT-6 항원을 기반으로 MPL 또는 c-di-GMP/MPL로 면역화시킨 마우스에 결핵균을 감염시킨 후, 4주 뒤에 폐 조직을 조직병리학적으로 분석한 결과를 나타낸 도면이며, 도 5B는 폐에서 증식된 결핵균의 수를 측정한 결과를 나타낸 도면이다. 도 5C는 면역화가 완료된 마우스에 결핵균을 감염시킨 후, 4주 후에 폐와 비장에서 세포를 생체외 분리하여 ESAT-6 단백질 자극을 통한 항원 특이적인 multifunctional T 세포를 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 6은 ESAT-6 항원을 기반으로 c-di-GMP 및/또는 GLA-SE로 면역화시킨 마우스의 폐와 비장 세포에서 ESAT-6 단백질 자극에 의하여 유도되는 항원 특이적인 multifunctional T 세포의 비율을 나타낸 도면이다.
도 7은 면역화된 마우스에서 T 세포의 활성을 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 8은 ESAT-6 항원을 기반으로 GLA-SE 단독 또는 c-di-GMP와 GLA-SE로 면역화시킨 마우스의 폐와 비장에서 결핵균의 수를 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예
1: STING
작용자의
면역항원보강제로서의
역할 확인
STING 작용자(Stimulator of interferon genes(STING) agonist)를 결핵균용 면역항원보강제(adjuvant)로 사용가능한지 확인하기 위하여 하기 실험을 진행하였다.
1.1. 실험동물
특이적 병원체가 없는 생후 6주된 암컷 C57BL/6 마우스(Japan SLC, Inc. Shijuoka, Japan)를 이용하여 실험하였으며, 해당 마우스는 연세대학교 임상의학 연구센터 내의 ABSL-3 바이오해저드 동물실의 제한된 공간에서 멸균된 판매용 마우스 사료와 물을 제공하며 사육하였다.
1.2. 실험디자인
STING 작용자(Stimulator of interferon genes(STING) agonist)의 한 종류인 c-di-GMP(invivogen)를 단독으로 면역항원보강제(adjuvant)로 사용 가능한 지 확인하기 위하여, 동물실험을 수행하였다. 구체적인 실험 방법은 도 1A에 나타내었으며, c-di-GMP의 비교 대조군으로는 기존에 면역항원보강제로 사용되고 있는 TLR4 작용자(agonist)인 모노포스포릴 리피드 A(monophosphoryl lipid A, MPL)을 사용하였다. 각각의 면역항원보강제는 ESAT-6 단백질과 함께 또는 단독으로 디메틸디옥타데실암모늄(Dimethyldioctadecylammonium, DDA) 리포좀(liposome)으로 제형화(formulation)하여 사용하였다.
도 1A에 나타난 바와 같이, 마우스를 결핵균에 감염시키기 10주 전에 MPL/DDA, ESAT-6+MPL/DDA 또는 ESAT-6+c-di-GMP/DDA를 3주 간격으로 총 3회 근육 내(intramuscular injection) 주사로 마우스에 면역화시키고, 결핵균으로 마우스를 감염시키기 전에 일부 마우스는 안락사시킨 후 비장과 폐로부터 비장 세포와 폐 세포를 분리하여 생체외(ex vivo) 실험도 함께 수행하였다. 각각의 분리된 세포는 일반적인 방법으로 계대 및 배양하였다. 면역화 방법은 하기 실시예 1.3에 자세히 기재하였다. 이후 항원 자극에 의한 IFN-γ 생성능과 ESAT-6 단백질 면역화에 의하여 비장과 폐로 침윤(infiltration)되는 memory T 세포의 증가를 확인하였다. 또한, 최근 결핵 방어에 중요하다고 보고되고 있는 다기능 CD4+ T 세포의 형성 능력을 조사하였다. 그리고 결핵균 감염 이후 16주 차에는 비장과 폐 내의 박테리아 수와 폐에서의 염증 정도를 분석하였다.
1.3. 면역화
실험에 사용된 각각의 마우스 등에 3주 간격으로 3회 실험용 백신 조성물을 근육내 주사하여 면역화시켰다. 상기 실험용 백신 조성물은 DDA 리포좀을 최종 농도가 5mg/mL이 되도록 희석시킨 후에 65℃로 열을 가하며 초음파 파쇄(sonication)를 병행하여 용해시킨 후에 각각의 면역항원보강제와 부피가 2:1이 되도록 혼합하여 제조하였다. 마우스당 주사되는 부피는 최종 200㎕가 되도록 하였으며, 주사당 1㎍의 ESAT-6 단백질이 항원으로 포함되도록 하였다. 음성 대조군으로는 항원을 포함하지 않은 MPL/DDA 조성물을 근육 내로 주사하였다.
1.4.
ESAT
-6 항원에 의한
IFN
-γ
생성능
확인
기존에 면역항원보강제로 사용되고 있었던 MPL/DDA 면역항원보강제와 비교하여 c-di-GMP/DDL 면역항원보강제가 면역화시킨 항원에 대한 면역원성에 영향을 미치는지 그 효능을 검증하기 위하여 각각의 마우스 실험군에서 항원 특이적인 IFN-γ 생성능을 분석하였다. 실험을 위하여 실시예 1.2와 동일한 방법으로 획득된 마우스 비장 세포를 생체 외(ex vivo) 상에서 ESAT-6 단백질을 이용하여 자극하였고, 자극된 세포에서 항원 특이적인 IFN-γ 생성능을 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)를 이용하여 확인하였다. 그 결과는 도 1B에 나타내었다.
도 1B에 나타난 바와 같이, ESAT-6 단백질 자극에 대하여 ESAT-6+MPL/DDA 백신 조성물과 ESAT-6+c-di-GMP/DDA 백신 조성물을 이용하여 면역화시킨 실험군 모두에서 항원 특이적인 IFN-γ가 생성되는 것을 확인하였다. 이 중 c-di-GMP를 면역항원보강제로 이용한 ESAT-6+c-di-GMP/DDA 백신 조성물로 면역화된 실험군에서 기존 보조제와 비교하여 IFN-γ 생성능이 유의성있게 증가된 것을 확인하였다.
1.5. 항원 특이적인 항체
생성능
확인
c-di-GMP/DDL 면역항원보강제가 항원 특이적인 항체 생성능에 영향을 미치는지 그 효능을 검증하기 위하여, 총 3회에 걸친 면역화가 최종적으로 완료된 시점에서 각각의 마우스의 혈청(serum)을 분리하여 항체 생성(antibody production) 정도를 확인하였다. 1μg/ml 농도의 ESAT-6 단백질을 96-웰 플레이트에 첨가한 후 상온에서 2시간 동안 반응시켜 각각의 웰(well)을 코팅시킨 후에, 코팅된 웰에 각각의 실험군에 따른 마우스 혈청을 첨가하였다. 그리고 horseradish peroxidase(HRP)가 결합되어있는 항-IgG(sigma), 항-IgG1(BD Bioscience), 또는 항-IgG2c (Southern Biotech)를 각각의 웰에 첨가하여 반응시킨 후에 ELISA를 이용하여 생성된 항원 특이적인 항체의 생성능을 확인하였다. 그 결과는 도 1C에 나타내었다.
도 1C에 나타난 바와 같이, Total IgG와 더불어 Th2 면역(immunity)과 관련이 있는 IgG1, 그리고 결핵의 방어에 중요하다고 보고되어 있는 Th1 면역과 관련된 IgG2c 모두에서 기존 면역항원보강제 보다 향상된 항체 생성능을 확인하였다.
1.6. c-
di
-
GMP를
면역항원보강제로
사용하였을 때 유도되는 T 세포의 종류 및 수 확인
일반적으로 결핵균에 감염이 되면 결핵균 항원 특이적 T 세포가 복제 및 분화하여 effector T 세포가 되고, 이러한 effector T 세포는 면역반응이 사라지게 되면 대부분 사멸하게 되고, 일부는 오랫동안 지속되는 memory T 세포를 형성하게 된다. 이렇게 형성된 memory T 세포는 빠른 후천적 방어면역의 형성과 T 세포의 기억화를 유지시켜주는 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. 따라서, MPL 또는 c-di-GMP를 면역항원보강제로 이용하여 ESAT-6 단백질로 면역화를 진행하였을 때 memory T 세포에 영향을 미치는지 검증하기 위하여 실험을 진행하였다. 실험을 위하여 실시예 1.2와 동일한 방법으로 획득된 마우스의 비장 세포와 폐 세포를 PBS로 2회 세척한 후 원심분리하였고, 원심분리된 세포에 항-CD3-BV421(BD Bioscience), 항-CD4-PerCP-Cy5.5(BD Bioscience), 항-CD8-APC-Cy7(BD Bioscience), 항-CD44-PE(ebioscience), 항-CD62L-FITC(ebioscience), 항-CD127-APC(ebioscience) 등의 항체를 처리한 후 30분간 4℃에서 반응시켰다. 반응이 완료된 세포는 PBS로 수회 세척하여 결합되지 않은 항체를 제거한 후에 유세포 분석기(FACS verse, BD)를 이용하여 effector T 세포(Teff; CD3+CD4+CD62L-CD44+CD127-), effector/memory T 세포(Tem; CD3+CD4+CD62L-CD44+CD127+), central memory T 세포(Tcm; CD3+CD4+CD62L+CD44+CD127+), 및 naive T 세포(Naive; CD3+CD4+CD62L+CD44-CD127+)를 분석하였다. 그 결과는 도 1D에 나타내었다.
도 1D에 나타난 바와 같이, MPL을 면역항원보강제로 이용하였을 때보다 c-di-GMP를 면역항원보강제로 이용하여 면역화를 진행하였을 때 마우스의 비장 및 폐 세포에서 모두 CD4+/CD8+의 effector/memory T 세포가 현저히 증가되는 것을 확인할 수 있었다.
1.7. c-
di
-
GMP
면역항원보강제를
이용하였을 때 유도되는 T 세포의 활성 확인
다기능(multifunctional) T 세포(IFN-γ, TNF-α 및/또는 IL-2를 모두 분비하는 T 세포)는 결핵균을 방어하는데 필수적인 면역학적 지표로 보고되고 있기 때문에, c-di-GMP를 면역항원보강제로 이용하였을 때 다기능 T 세포가 생성되는지 확인하였다. 실시예 1.2와 동일한 방법으로 분리된 마우스의 폐 세포와 비장 세포를 ESAT-6 단백질을 이용하여 자극하였다. 그리고 생성된 사이토카인(cytokine)이 세포 외로 분비되는 것을 방지하기 위하여 GolgiStop(BD Bioscience)을 세포에 처리한 후 37℃에서 12시간 동안 반응시킨 후 PBS로 2회 세척하였다. 세척된 세포에 항-CD4-PerCP-Cy5.5(BD Bioscience), 항-CD8-APC-Cy7(BD Bioscience), 항-CD44-v450(BD Bioscience) 등의 항체를 처리한 후 30분간 4℃에서 반응시키고, 결합되지 않은 항체는 PBS로 세척하여 제거하였다. 그리고 세포의 투과성(permeability)을 높여주기 위하여 Cytofix/Cytoperm(BD Bioscience)를 세포에 첨가한 후 4℃에서 30분간 반응시킨 후에 PBS로 다시 세척하고, 세척된 세포에 항-IFN-γ-PE(BD Bioscience), 항-IL-2-PE-Cy7(BD Bioscience), 항-TNF-α-APC(BD Bioscience) 등의 항체를 추가적으로 처리하고 4℃에서 30분간 반응시켰다. 반응이 완료된 세포는 Perm/Wash 용액(BD Bioscience)을 이용하여 수회 세척한 후에 유세포 분석기를 통하여 분석하였고, 그 결과는 도 2A에 나타내었다. 그리고 유세포 분석기를 통해 분석된 결과는 FlowJo software를 이용한 gating strategy로 추가 분석하였으며, 그 결과는 도 2B에 나타내었다.
도 2B에 나타난 바와 같이, c-di-GMP 또는 MPL을 면역항원보강제로 이용한 경우 모두에서 IFN-γ, TNF-α 및 IL-2 세 종류의 사이토카인을 모두 분비하는 T 세포가 증가된 것을 확인하였으며, 특히 폐 세포에서는 ESAT-6+c-di-GMP/DDA 조성물로 면역화된 그룹에서 항원 특이적인 다기능 T 세포의 생성이 MPL을 면역항원보강제로 이용한 경우보다 유의성있게 증가되는 것을 확인하였다. 이를 통하여, 기존의 MPL 보다 STING 작용자의 경우 결핵균의 예방 및 치료에 필수적인 multifunctional T 세포의 생성을 증가시킴으로써 기존 면역항원보강제에 비하여 효과적으로 결핵균의 예방 및 치료용 백신에 사용가능하다는 것을 확인할 수 있었다.
1.8. 결핵균 배양 및 공기 감염
고병원성 결핵균인 Mycobacterium tuberculosis HN878 균주를 7H9-OADC 브로쓰(broth)에서 15일간 배양하였다. 그리고 배양된 균을 수집한 후에 6mm 글래스 비드로 부드럽게 볼텍싱(vortexing)하면서 균을 파쇄하였다. 파쇄된 균은 원심분리하여 세포 응집물을 가라앉힌 후에 상층액을 수거하였고, 수거된 상층액은 나누어 분주하여 -70℃에서 보관하였다. 보관된 균은 실험할 때에 해동시킨 후 Middlebrook 7H11 Agar(Difco, Detroit, MI, USA)에서 순차적으로 희석하고 배양하여 균의 수를 확인하였고, 마우스에 감염시키기 위해서는 결핵균을 sonic bath에서 약하게 음파처리한 후에 PBS(pH 7.2)로 희석하여 원하는 수의 결핵균을 획득하였다. 결핵균의 감염은 공기감염 장치인 Glas-Col inhalation device(Terre Haute, IN)를 이용하여 마우스당 200 내지 250개의 결핵균이 감염될 수 있도록 흡입시켜 공기 감염시켰다.
1.9. 조직병리학적 분석 및 결핵균 감염 억제 효과 확인
c-di-GMP를 면역항원보강제로 이용한 면역화 반응이 결핵균 감염 억제 효과가 있는지 확인하기 위하여, 실시예 1.8과 동일한 방법으로 마우스를 결핵균으로 감염시키고 16주가 지난 후에 감염시킨 마우스를 안락사시키고, 각각의 마우스 실험군으로부터 폐 조직을 적출하였다. 그리고 10% neutral-buffered formalin에 보존시킨 후, 파라핀에 고정시켰다. 고정시킨 폐 조직은 4 내지 5mm의 두께로 절편을 만들고 Hematoxylin & Eosin (H&E) 염색을 시행하였다. 그 결과는 도 3A에 나타내었다. 그리고 염색된 결과를 이용하여 염증이 나타난 부분의 면적을 ImageJ software program(National Institute of Health, MD, USA)를 이용하여 수치화하였다. 그 결과는 도 3B에 나타내었다. 또한, 안락사시킨 마우스의 폐와 비장에 붙어있는 결핵균을 PBS로 추출하여 균질현탁액을 획득하고, 각각의 균질현탁액을 단계적으로 희석한 후 Middlebrook 7H11 Agar(Difco, Detroit, MI, USA)에서 배양하여 감염된 결핵균의 수를 확인하고, 감염된 결핵균 수는 전체 폐 또는 비장 조직 당 평균 log10CFU±표준편차로 나타내었다. 그 결과는 도 3C에 나타내었다.
도 3B에 나타난 바와 같이, 면역항원보강제를 이용하여 면역화시킨 마우스의 폐 조직에서는 면역항원보강제만을 이용한 음성 대조군과 비교하여 염증이 감소되었고, 특히 ESAT-6+c-di-GMP/DDA 백신 조성물을 이용하여 면역화시킨 실험군이 ESAT-6+MPL/DDA 백신 조성물을 이용하여 면역화시킨 실험군에서 보다 염증이 감소된 것을 확인하였다.
또한, 도 3C에 나타난 바와 같이, 면역항원보강제만을 이용하여 면역화시킨 음성 대조군과 비교하여 ESAT-6+c-di-GMP/DDA 백신 조성물을 이용하여 면역화시킨 실험군에서 감염된 결핵균의 수가 유의성있게 감소된 것을 확인하였다. 이를 통하여 c-di-GMP를 단독으로 면역항원보강제로 사용하여 고병원성 결핵균 HN878 strain의 감염을 효과적으로 예방할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.
상기 결과들을 통하여, c-di-GMP(cyclic diguanylate)와 같은 STING 작용자는 단독으로 항원보강제활성(adjuvanticity)을 가지고 있을 뿐만 아니라 기존의 면역항원보강제인 MPL과 비교하여 그 효과가 증대된 것을 확인할 수 있었다. 또한, 이를 통하여 STING 작용자를 단독으로 면역항원보강제로 사용하여 다양한 결핵균의 감염을 효과적으로 예방할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.
실시예
2: STING
작용자와
면역항원보강제의
시너지 효과 확인
STING 작용자(Stimulator of interferon genes(STING) agonist)와 기존에 알려져 있던 면역항원보강제(adjuvant)인 MPL을 병용하여 사용하는 경우 시너지 효과를 확인하기 위하여 하기 실험을 진행하였다.
2.1. 실험동물
특이적 병원체가 없는 생후 6주된 암컷 C57BL/6 마우스(Japan SLC, Inc. Shijuoka, Japan)를 이용하여 실험하였으며, 해당 마우스는 연세대학교 임상의학 연구센터 내의 ABSL-3 바이오해저드 동물실의 제한된 공간에서 멸균된 판매용 마우스 사료와 물을 제공하며 사육하였다.
2.2. 실험디자인
c-di-GMP(invivogen)와 기존에 알려져 있던 면역항원보강제를 병용하여 사용할 경우 시너지 효과가 나타나는지 확인하기 위하여, 동물실험을 수행하였다. 구체적인 실험 방법은 도 4A에 나타내었다. 실험군은 c-di-GMP와 MPL을 함께 DDA 리포좀에 제형화하여 사용하였다.
도 4A에 나타난 바와 같이, 마우스를 결핵균에 감염시키기 10주 전에 각각의 백신 조성물을 3주 간격으로 총 3회 근육내(intramuscular injection) 주사로 마우스에 면역화시키고, 결핵균으로 마우스를 감염시키기 전에 일부 마우스는 안락사시킨 후 비장과 폐로부터 비장 세포와 폐 세포를 분리하여 생체외(ex vivo) 실험도 함께 수행하였다. 각각의 분리된 세포는 일반적인 방법으로 계대 및 배양하였다. 면역화 방법은 하기 실시예 2.3에 자세히 기재하였다. 이후 항원 자극에 의한 IFN-γ 생성능과 ESAT-6 단백질 면역화에 의하여 비장과 폐로 침윤(infiltration)되는 memory T 세포의 증가를 확인하였다. 또한, 최근 결핵 방어에 중요하다고 보고되고 있는 다기능 CD4+ T 세포의 형성 능력을 조사하였다. 그리고 결핵균 감염 이후 4주 차에는 비장과 폐 내의 박테리아 수와 폐에서의 염증 정도를 분석하였다.
2.3. 면역화
실험에 사용된 각각의 마우스 등에 3주 간격으로 3회 실험용 백신 조성물을 근육내 주사하여 면역화시켰다. 상기 실험용 백신 조성물은 DDA 리포좀을 최종 농도가 5mg/mL이 되도록 희석시킨 후에 65℃로 열을 가하며 초음파파쇄(sonication)를 병행하여 용해시킨 후에 5와 부피가 2:1이 되도록 혼합하여 제조하였다. 마우스당 주사되는 부피는 최종 200㎕가 되도록 하였으며, 주사당 1㎍의 ESAT-6 단백질이 항원으로 포함되도록 하였다. 음성 대조군으로는 항원을 포함하지 않은 MPL/DDA 조성물을 근육 내로 주사하였다.
2.4. CD4
+
/CD8
+
T 세포의 활성 확인
복합면역항원보강제가 T 세포의 활성에 영향을 주는지 확인하기 위하여, T 세포의 활성 마커인 CD44, PD-1, CD62L, CD127을 이용하여 실시예 1.11과 동일한 방법으로 T 세포의 활성을 확인하였다. 그 결과는 도 4B에 나타내었다.
도 4B에 나타난 바와 같이, 단독 면역항원보강제를 사용한 경우보다 c-di-GMP와 MPL을 복합적으로 사용하였을 때, CD8+ T 세포는 비장에서 그 수가 증가되었고, CD4+ T 세포의 경우에는 비장과 폐 모두에서 CD44+PD-1+, CD62L-CD127- T 세포의 수가 현저히 증가되는 것을 확인하였다.
2.5. 항원 특이적인 항체
생성능
확인
복합면역항원보강제가 항원 특이적인 항체 생성능에 영향을 미치는지 그 효능을 검증하기 위하여, 총 3회에 걸친 면역화가 최종적으로 완료된 시점에서 각각의 마우스의 혈청(serum)을 분리하여 항체 생성(antibody production) 정도를 확인하였다. 1μg/ml 농도의 ESAT-6 단백질을 96-웰 플레이트에 첨가한 후 상온에서 2시간 동안 반응시켜 각각의 웰(well)을 코팅시킨 후에, 코팅된 웰에 각각의 실험군에 따른 마우스 혈청을 첨가하였다. 그리고 겨자무과산화효소(horseradish peroxidase, HRP)가 결합되어있는 항-IgG(sigma), 항-IgG1(BD Bioscience), 또는 항-IgG2c (Southern Biotech)를 각각의 웰에 첨가하여 반응시킨 후에 ELISA를 이용하여 생성된 항원 특이적인 항체의 생성능을 확인하였다. 그 결과는 도 4C에 나타내었다.
도 4C에 나타난 바와 같이, Total IgG와 더불어 Th2 면역(immunity)과 관련이 있는 IgG1, 그리고 결핵의 방어에 중요하다고 보고되어 있는 Th1 면역과 관련된 IgG2c 모두에서 단독 면역항원보강제를 사용한 경우보다 c-di-GMP와 MPL을 복합 면역항원보강제를 사용한 경우가 항체 생성이 증가된 것을 확인하였으며, 이를 통하여 균형적인 면역반응이 유도되었다는 것을 확인할 수 있었다.
2.6.
배중심
관련 세포의 확인
배중심(germinal center; GC)은 2차림프조직(secondary lymphoid tissue) B 세포의 여포(folicle) 에 위치하며, 배중심 관련 B 세포는 체세포초돌연변이(somatic hypermutation)와 B 세포의 기억(memory) 형성과 같은 방어적 체액성 면역을 조절하는데 중요한 기능적인 성숙 과정을 거치게 된다고 알려져 있다. 또한, CD4+ T cell의 한 종류인 follicular helper T 세포(TFH)는 B 세포의 항체 반응을 증진시킬 수 있는 중요한 세포이며, TFH 세포의 CXCR5 유전자의 발현은 TFH 세포가 B 세포 구역으로 이동하여 cognate B 세포와 상호작용하는데 중요한 역할을 한다고 보고되고 있다. 따라서 체액성 면역을 통한 높은 친화성을 가진 수식인자(effector)의 지속적인 정착을 위해서는 배중심의 면역반응을 유도할 수 있는 TFH 세포의 활성을 증진시키는 것이 중요하다. 따라서, 본 발명의 복합면역항원보강제가 TFH 세포를 활성화시키는지 확인하기 위하여, 최종적으로 면역화시킨 마우스로부터 비장 세포를 분리하여, 배중심 관련 세포들을 유세포 분석기를 이용하여 확인하였다. 그 결과는 도 4D에 나타내었다.
도 4D에 나타난 바와 같이, MPL을 단독으로 면역항원보강제로 사용한 실험군과 비교하여 c-di-GMP와 MPL의 복합면역항원보강제를 사용한 실험군의 경우 CD4+CXCR5+PD-1+ TFH 세포와 B220+CD138+ 형질세포(plasma cell)의 수가 유의성있게 증가된 것을 확인하였다. 이는 c-di-GMP에 의한 STING 신호전달(signaling)이 매개되어 영향을 준 것으로 보여진다. 반면 배중심 관련 세포인 CD4+CD44hiCXCR5+GL7+ TFH 세포(GC TFH cell)와 CD19+B220+Fas+GL7+ B 세포(GC B cell)의 경우에는 약간 증가하였으나, 큰 차이는 없는 것을 확인하였다.
2.7. 결핵균 배양 및 공기 감염
고병원성 결핵균인 Mycobacterium tuberculosis HN878 strain을 7H9-OADC broth에서 15일간 배양하였다. 그리고 배양된 균을 수집한 후에 6mm 글래스 비드로 부드럽게 볼텍싱(vortexing)하면서 균을 파쇄하였다. 파쇄된 균은 원심분리하여 세포 응집물을 가라앉힌 후에 상층액을 수거하였고, 수거된 상층액은 나누어 분주하여 -70℃에서 보관하였다. 보관된 균은 실험할 때에 해동시킨 후 Middlebrook 7H11 Agar(Difco, Detroit, MI, USA)에서 순차적으로 희석하고 배양하여 균의 수를 확인하였고, 마우스에 감염시키기 위해서는 결핵균을 sonic bath에서 약하게 음파처리한 후에 PBS(pH 7.2)로 희석하여 원하는 수의 결핵균을 획득하였다. 결핵균의 감염은 공기감염 장치인 Glas-Col inhalation device(Terre Haute, IN)를 이용하여 마우스당 200 내지 250개의 결핵균이 감염될 수 있도록 흡입시켜 공기 감염시켰다.
2.8. 조직병리학적 분석 및 결핵균 감염 억제 효과 확인
c-di-GMP를 면역항원보강제로 이용한 면역화 반응이 결핵균 감염 억제 효과가 있는지 확인하기 위하여, 실시예 2.7과 동일한 방법으로 마우스를 결핵균으로 감염시키고 4주가 지난 후에 감염시킨 마우스를 안락사시키고, 각각의 마우스 실험군으로부터 폐 조직을 적출하였다. 그리고 10% 중화 포르말린(neutral-buffered formalin)에 보존시킨 후, 파라핀에 고정시켰다. 고정시킨 폐 조직은 4 내지 5mm의 두께로 절편을 만들고 Hematoxylin & Eosin (H&E) 염색을 시행하였다. 그 결과는 도 5A에 나타내었다. 또한, 안락사시킨 마우스의 폐에 붙어있는 결핵균을 PBS로 추출하여 균질현탁액을 획득하고, 각각의 균질현탁액을 단계적으로 희석한 후 Middlebrook 7H11 Agar(Difco, Detroit, MI, USA)에서 배양하여 감염된 결핵균의 수를 확인하고, 감염된 결핵균 수는 전체 폐 또는 비장 조직 당 평균 log10CFU±표준편차로 나타내었다. 그 결과는 도 5B에 나타내었다.
도 5A에 나타난 바와 같이, 복합면역항원보강제를 이용하여 면역화시킨 마우스의 폐 조직에서는 MPL 면역항원보강제만을 이용한 실험군과 비교하여 염증이 감소된 것을 확인하였다.
또한, 도 5B에 나타난 바와 같이, MPL 면역항원보강제만을 이용한 실험군과 비교하여 복합면역항원보강제를 이용하여 면역화시킨 실험군에서 감염된 결핵균의 수가 유의성있게 감소된 것을 확인하였으며, 이를 통하여 c-di-GMP와 MPL을 복합적으로 면역항원보강제로 사용할 경우 단독으로 사용하는 경우보다 고병원성 결핵균 HN878 strain의 감염을 효과적으로 예방할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.
2.9.
복합면역항원보강제를
이용하였을 때 유도되는 T 세포의 활성 확인
다기능 T 세포(IFN-γ, TNF-α 및/또는 IL-2를 모두 분비하는 T 세포)는 결핵균을 방어하는데 중요한 면역학적 지표로 보고되고 있기 때문에, 복합면역항원보강제로 이용하였을 때 다기능 T 세포가 생성되는지 확인하였다. 면역화된 마우스를 결핵균에 감염시킨 후, 4주 후에 실시예 2.2와 동일한 방법으로 분리된 마우스의 폐 세포와 비장 세포를 ESAT-6 단백질을 이용하여 자극하였다. 그리고 생성된 사이토카인(cytokine)이 세포 외로 분비되는 것을 방지하기 위하여 GolgiStop(BD Bioscience)을 세포에 처리한 후 37℃에서 12시간 동안 반응시킨 후 PBS로 2회 세척하였다. 세척된 세포에 항-CD4-PerCP-Cy5.5(BD Bioscience), 항-CD8-APC-Cy7(BD Bioscience), 항-CD44-v450(BD Bioscience) 등의 항체를 처리한 후 30분간 4℃에서 반응시키고, 결합되지 않은 항체는 PBS로 세척하여 제거하였다. 그리고 세포의 투과성(permeability)을 높여주기 위하여 Cytofix/Cytoperm(BD Bioscience)를 세포에 첨가한 후 4℃에서 30분간 반응시킨 후에 PBS로 다시 세척하고, 세척된 세포에 항-IFN-γ-PE(BD Bioscience), 항-IL-2-PE-Cy7(BD Bioscience), 항-TNF-α-APC(BD Bioscience) 등의 항체를 추가적으로 처리하고 4℃에서 30분간 반응시켰다. 반응이 완료된 세포는 Perm/Wash 용액(BD Bioscience)을 이용하여 수회 세척한 후에 유세포 분석기를 통하여 분석하였고, 분석된 결과는 FlowJo software를 이용한 gating strategy로 추가 분석하였으며, 그 결과는 도 5C에 나타내었다.
도 5C에 나타난 바와 같이, c-di-GMP와 MPL을 복합적으로 면역항원보강제로 이용한 경우에 단독면역항원보강제를 이용한 실험군보다 CD4+IFN-γ+TNF-α+IL-2+, CD4+IFN-γ+TNF-α+ 그리고 CD4+IFN-γ+IL-2+의 multifunctional T 세포가 유의성있게 증가되는 것을 확인하였다.
상기 결과들을 통하여, c-di-GMP와 같은 STING 작용자와 함께 MPL과 같은 기존의 면역항원보강제를 복합적으로 사용할 경우 그 효과가 현저히 증가된 것을 확인할 수 있었다. 또한 이를 통하여, 기존에 사용되고 있는 면역항원보강제에 STING 작용자를 추가로 사용하면 다양한 결핵균의 감염을 효과적으로 예방할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.
실시예
3: STING
작용자와
기존
면역항원보강제의
시너지 효과 확인
STING 작용자(Stimulator of interferon genes(STING) agonist)와 기존에 알려져 있던 면역항원보강제(adjuvant)인 GLA-SE(Glucopyranosyl Lipid Adjuvant, formulated in a stable nano-emulsion of squalene oil-in-water)를 병용하여 사용하는 경우 시너지 효과를 확인하기 위하여 하기의 실험을 진행하였다.
3.1. STING
작용자
및
GLA
-SE를 이용하였을 때 유도되는 T 세포의 활성 확인
복합면역항원보강제가 T 세포의 활성에 영향을 주는지 확인하기 위하여, 단일면역항원보강제 또는 복합면역항원보강제로 면역화시킨 마우스를 결핵균으로 감염시키기 전에 비장 및 폐를 분리하였다. 그리고 생체 외(ex vivo)에서 ESAT-6 펩타이드풀(peptide pool) 또는 단백질을 처리한 후에 유도되는 항원 및 T 세포의 생성을 유세포 분석기를 이용하여 확인하였다. 자세한 실험 방법은 실시예 1.7에 기재된 방법과 동일한 방법으로 진행하였다. 그 결과는 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타난 바와 같이, 모든 실험 군에서 GLA-SE를 단독으로 면역화시킨 군과 비교하여 c-di-GMP 및 GLA-SE의 복합면역항원보강제를 이용하여 면역화시킨 군에서 CD4+IFN-γ+TNF-α+의 다기능 T 세포의 생성이 현저히 증가되는 것을 확인하였다.
또한, 추가적으로 (1) 음성대조군, (2) 결핵균(tuberculosis) 단독 처리군, (3) BCG(bacille de Calmette-Guerin vaccine) 단독 처리군, (4) BCG prime, ESAT-6, 및 GLA-SE 처리군, (5) BCG prime, ESAT-6, GLA-SE 및 STING 작용자(c-di-GMP) 처리군, (6) ESAT-6 및 GLA-SE 처리군, (7) ESAT-6, STING 작용자 및 GLA-SE 처리군 총 7개의 처리군에 대하여 효능을 검증하기 위하여, 총 3회에 걸친 면역화가 최종적으로 완료된 시점에 마우스를 안락사시킨 후 실시예 1.5, 1.7 및 1.11과 동일한 방법으로 T 세포의 활성을 확인하였다. 면역화는 근육내 주사를 이용하였다. 그 결과는 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타난 바와 같이, 단독 복합면역항원보강제를 사용한 경우보다 c-di-GMP와 GLA-SE를 복합적으로 사용하였을 때, IFN-γ, TNF-α, IL-2 등과 같은 싸이토카인(cytokine)의 분비가 증가되는 것을 확인하였다.
상기 결과들을 통하여, GLA-SE 및 STING 작용자를 복합면역항원보강제로 이용하면 다양한 결핵균의 감염을 효과적으로 예방할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.
3.2. STING
작용자
및
GLA
-SE를 이용하였을 때 결핵균 감염 억제 효과 확인
복합면역항원보강제로 이용한 면역화 반응이 결핵균 감염 억제 효과가 있는지 확인하기 위하여, 마우스를 결핵균에 감염시키기 10주 전에 (1) BCG(bacille de Calmette-Guerin vaccine) 단독, (2) ESAT-6 및 GLA-SE, (3) ESAT-6, STING 작용자 및 GLA-SE의 백신 조성물을 3주 간격으로 총 3회 근육내(intramuscular injection) 주사로 마우스에 면역화시키고, 실시예 2.7과 동일한 방법으로 마우스를 결핵균으로 감염시키고 4주가 지난 후에 감염시킨 마우스를 안락사시키고, 각각의 마우스의 폐에 붙어있는 결핵균을 PBS로 추출하여 균질현탁액을 획득하고, 각각의 균질현탁액을 단계적으로 희석한 후 Middlebrook 7H11 Agar(Difco, Detroit, MI, USA)에서 배양하여 감염된 결핵균의 수를 확인하고, 감염된 결핵균 수는 전체 폐 또는 비장 조직 당 평균 log10CFU±표준편차로 나타내었다. 그 결과는 도 8에 나타내었다.
도 8에 나타난 바와 같이, c-di-GMP와 GLA-SE를 복합면역항원보강제로 동시에 이용한 경우는 GLA-SE를 단독으로 면역항원보강제로 이용한 실험군과 비교하여 감염된 결핵균의 수가 유의성있게 감소된 것을 확인하였다. 이를 통하여 c-di-GMP와 GLA-SE을 복합적으로 면역항원보강제로 사용하는 경우 고병원성 결핵균 HN878 strain의 감염을 효과적으로 예방할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.
상기 결과들을 통하여, c-di-GMP와 같은 STING 작용자와 함께 MPL 및 GLA-SE 등과 같은 기존의 면역항원보강제를 복합적으로 사용할 경우 그 효과가 현저히 증가된 것을 확인할 수 있었다. 특별히, 최근 결핵균의 예방 및 치료에는 CD4+IFN-γ+TNF-α+의 다기능 T 세포의 생성이 필수적이라는 것이 밝혀졌는데, 본원 발명의 STING 작용자는 다른 기존의 면역항원보강제를 단독으로 사용한 경우보다 비장 및/또는 폐에서 multifunctional T 세포의 생성을 현저히 증가시키는 것을 확인할 수 있었다. 상기 결과들을 통하여 기존에 사용되고 있는 면역항원보강제에 STING 작용자를 추가로 사용하면 기존에 결핵균에 대한 예방 및 치료 효과가 낮은 기존의 면역항원보강제의 효과를 현저히 증가시킬 수 있다는 것을 확인할 수 있었으며, 이를 통하여 STING 작용자를 포함하는 복합면역항원보강제는 다양한 결핵균의 감염을 효과적으로 예방할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
Claims (13)
- STING 작용자(Stimulator of interferon genes agonist)를 유효성분으로 포함하는, 면역항원보강제(adjuvant) 조성물.
- 제 1 항에 있어서,
상기 STING 작용자는 c-di-GMP(cyclic diguanylate), cGAMP, 3'3'-cGAMP, c-di-GAMP, c-di-AMP, 및 2'3'-cGAMP로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인, 면역항원보강제 조성물. - 제 1 항에 있어서,
상기 STING 작용자는 c-di-GMP(cyclic diguanylate), cGAMP, 3'3'-cGAMP, c-di-GAMP, c-di-AMP, 2'3'-cGAMP, 10-(카복시메틸)9(10H)아크리돈(CMA)(10-(carboxymethyl)9(10H)acridone(CMA)), 5,6-디메틸크산테논-4-아세트산(5,6-Dimethylxanthenone-4-acetic acidㅡ DMXAA), 메톡시본(methoxyvone), 6, 4'-디메톡시플라본(6, 4'-dimethoxyflavone), 4'-메톡시플라본(4'-methoxyflavone), 3', 6'-디하이드록시플라본(3', 6'-dihydroxyflavone), 7, 2'-디하이드록시플라본(7, 2'-dihydroxyflavone), 다이드제인(daidzein), 포르모노네틴(formononetin), 레투신 7-메틸 에터(retusin 7-methyl ether) 및 크산톤(xanthone)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인, 면역항원보강제 조성물. - 제 1 항에 있어서,
상기 조성물은 MPL(monophosphoryl lipid A) 및 GLA-SE(Glucopyranosyl Lipid Adjuvant, formulated in a stable nano-emulsion of squalene oil-in-water) 중 적어도 하나의 면역항원보강제를 추가로 포함하는, 면역항원보강제 조성물. - 제 4 항에 있어서,
상기 면역항원보강제는 리포좀(liposome)에 봉입되어 있는 것인, 면역항원보강제 조성물. - STING 작용자(Stimulator of interferon genes agonist) 및 항원을 유효성분으로 포함하는, 백신 조성물.
- 제 6 항에 있어서,
상기 STING 작용자는 c-di-GMP(cyclic diguanylate), cGAMP, 3'3'-cGAMP, c-di-GAMP, c-di-AMP, 및 2'3'-cGAMP로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인, 백신 조성물. - 제 6 항에 있어서,
상기 STING 작용자는 c-di-GMP(cyclic diguanylate), cGAMP, 3'3'-cGAMP, c-di-GAMP, c-di-AMP, 2'3'-cGAMP, 10-(카복시메틸)9(10H)아크리돈(CMA)(10-(carboxymethyl)9(10H)acridone(CMA)), 5,6-디메틸크산테논-4-아세트산(5,6-Dimethylxanthenone-4-acetic acidㅡ DMXAA), 메톡시본(methoxyvone), 6, 4'-디메톡시플라본(6, 4'-dimethoxyflavone), 4'-메톡시플라본(4'-methoxyflavone), 3', 6'-디하이드록시플라본(3', 6'-dihydroxyflavone), 7, 2'-디하이드록시플라본(7, 2'-dihydroxyflavone), 다이드제인(daidzein), 포르모노네틴(formononetin), 레투신 7-메틸 에터(retusin 7-methyl ether) 및 크산톤(xanthone)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인, 백신 조성물. - 제 6 항에 있어서,
상기 조성물은 MPL(monophosphoryl lipid A) 및 GLA-SE(Glucopyranosyl Lipid Adjuvant, formulated in a stable nano-emulsion of squalene oil-in-water) 중 적어도 하나의 면역항원보강제를 추가로 포함하는, 백신 조성물. - 제 9 항에 있어서,
상기 면역항원보강제는 리포좀(liposome)에 봉입되어 있는 것인, 백신 조성물. - 제 6 항에 있어서,
상기 항원은 결핵균 특이적인 항원인, 백신 조성물. - 제 11 항에 있어서,
상기 결핵균 특이적인 항원은 ESAT-6인, 백신 조성물. - 제 6 항에 있어서,
상기 백신 조성물은 결핵균의 감염을 예방하는 것인, 백신 조성물.
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