KR101640716B1

KR101640716B1 - 면역보조제를 첨가한 스쿠티카충 백신 조성물

Info

Publication number: KR101640716B1
Application number: KR1020150128710A
Authority: KR
Inventors: 정성주; 경 김; 이제희
Original assignee: 제주대학교 산학협력단
Priority date: 2015-09-11
Filing date: 2015-09-11
Publication date: 2016-07-22

Abstract

본 발명은 동결하여 불활화시킨 스쿠티카충 M. avidus를 백신의 항원으로 사용하고 peptidoglycan, lipoteichoic acid, β-glucan중 어느 하나의 것을 면역보조제로서 첨가시킨 스쿠티카충 백신에 관한 것으로, 스쿠티카충 백신 조성물을 실험어에 투여하고 4주째와 8주째에 스쿠티카충을 감염시킨 실험결과, peptidoglycan이 면역보조제로 혼합된 백신은 4주째 스쿠티카충을 감염시킨 실험어군이 대조구와 비교하여 55% 이상의 높은 상대생존율로 유의적인 차이를 나타내고, lipoteichoic acid를 첨가한 백신 그룹에서는 백신 투여 4주째에 저농도 그룹이 40%의 RPS를 나타내었으며, β-glucan을 첨가한 실험에서는 100 ㎍ 첨가 시, 백신 투여 4주째에 35%, 8주째에 37%의 RPS를 나타내었고, 10 ㎍ 첨가구에서도 백신 투여 8주째에서 32%의 RPS를 나타내어 면역보조제로서 면역을 증강시켜 스쿠티카충 구제에 효과가 있다.

Description

면역보조제를 첨가한 스쿠티카충 백신 조성물 { Killed vaccine against scuticociliated ciliate }

본 발명은 스쿠티카충 백신 조성물에 관한 것으로써, 더욱 상세하게는 동결하여 불활화시킨 스쿠티카충 M. avidus를 백신의 항원으로 사용하고 peptidoglycan, lipoteichoic acid, β-glucan을 면역보조제로서 포함하는 스쿠티카충 백신에 관한 것이다.

스쿠티카충은 Oligohymenophorea강 Scuticociliatia아강에 속하는 기생성 원충류로 크기는 약 31.5 (21-37) ㎛ × 18.5 (11-28) ㎛이며, 장축을 따라 길이 8~12개의 섬모열과 꼬리 끝 부분에 1개의 긴 섬모가 있다.

전 세계적으로 해마, Hippocampus erectus, 농어, Dicentrarchus labrax, southern bluefin tuna, Thunnus maccoyii, 터봇, Scuphthalmus maximus, 넙치, Paralichthys olivaceus, silver pomfret, Pampus argenteus 등 다양한 해산어종에 심각한 경제적 손실을 일으키고 있다.

우리나라에서는 1990년대 초반 대표적인 양식 어류인 넙치에서 스쿠티카충의 감염이 처음으로 보고되었다. 넙치에 감염되는 스쿠티카충 중에서 Uronema marinum, Pseudocohnilembus persalinus와 Miamiensis avidus (=Philasterides dicentrachi) 종 등이 질병을 일으키는 것으로 보고되고 있으며 그 중에서, 국내의 양식 넙치에 강한 병원성을 지니고 있는 종은 M. avidus이다.

스쿠티카충에 감염된 어류는 병소에 출혈을 동반한 궤양이 형성되고, 섭이 저하, 체색흑화, 안구돌출이 나타난다. 스쿠티카충은 아가미와 피부를 통해 체내로 빠르게 침투하여 증식하고, 내장기관 및 뇌 조직까지의 심부 감염을 유발하기 때문에 일반적인 화학요법 (formalin, pyrimethamine, salicylanilides niclosamide, oxyclozanide 등)으로는 스쿠티카충을 구제하는데 어려움이 있어, 불활화 바이러스성 출혈성 패혈증 (viral hemorrhagic septicemia virus: VHSV)의 백신 개발이 이루어지고 있다.

현재 국내에서 시판되는 어류백신은 세균성 질병에 국한되어 있으며, 이들은 불활화백신의 형태로 안전성은 높으나 면역보조제가 첨가되어 있지 않아 낮은 면역원성을 보인다.

면역보조제는 백신 제조 시 항원과 함께 항체 생산 및 세포성 면역을 강화시키는 기능을 지닌 면역반응을 향상시키기 위한 첨가 물질로서, 미네랄 오일을 면역보조제로 이용하여 불활화 P. dicentrachi의 백신 연구가 보고되어 있으나, 효율적인 면역력을 제공하기는 어려운 문제점이 있다. 이와같은 문제점에도 불구하고 해외에서는 아직까지 일부 세균성 질병의 백신에서 오일 면역보조제가 첨가되어 유통되고 있어 면역보조제 관련 연구는 미흡한 상황이다.

최근에 면역자극제 투여에 의한 M. avidus를 제어할 수 있는 방안들이 제시되고 있지만, 면역 자극제의 높은 원가 및 낮은 면역원성 등의 문제로 인하여 이러한 치료법을 상용화 시키는데 한계가 따른다. 따라서, M. avidus 감염에 대한 장기적인 대책으로 저비용, 고효율성을 지닌 백신 개발을 통한 M. avidus 제어가 필요하다.

국내 공개특허공보 제10-2002-0068189호에는 어류에 기생하는 섬모충인 스쿠티카충에 대한 불활화백신에 관한 것으로 스쿠티카충을 배양하여 포르말린으로 불활화시킨 후 어류에 접종하면 스쿠티카충에 대한 어체의 면역능력이 증가되어 감염의 예방과 폐사 지연의 효과가 있는 어류의 스쿠티카충에 관하여 개시되어 있다. 국내 등록특허번호 제10-0735038호에는 스쿠티카충에 대한 재조합 단백질 백신 및 이를 이용한 스쿠티카증의 예방 및 치료용 조성물로서 양식어의 병원성 기생충의 감염을 예방 및 치료할 수 있는 스쿠티카충에 대한 재조합 단백질 백신 및 이를 이용한 스쿠티카충의 예방 및 치료용 조성물에 관하여 개시되어 있다. 국내 등록특허번호 제10-1434553호에는 클로라민-티(chloramine-T) 및 과산화수소(hydrogen peroxide)로 구성되며, 상기 클로라민-티 및 과산화수소는 투여순서와 무관하게 순차적으로 투여되는 것을 특징으로 하는 어류의 스쿠티카충 또는 병원성 세균 구제용 조성물, 및 클로라민-티 및 과산화수소를 함유하는 약액에 순서와 무관하게 순차적으로 어류를 약욕시키는 것을 특징으로 하는 어류의 스쿠티카충 및 병원성 세균 구제용 조성물 및 이들의 구제방법에 관하여 개시되어 있다. 국내 공개특허공보 제10-2011-7009653호에는 스쿠티카증, 특히 폐사율이 높은 Philasterides dicentrarchi에 대해서, 감염 방어를 갖는 유효적인 예방ㆍ치료 백신에 관하여 개시되어 있다. 그러나 상기선행문헌들은 본 발명의 냉동하여 불활화시킨 스쿠티카 충 M. avidus를 백신의 항원으로 사용하고 면역보조제로서 peptidoglycan, lipoteichoic acid, β-glucan들 중 하나를 선택하여 적정농도로 혼합시킨 스쿠티카충 백신 조성물과는 상이하다.

본 발명은 상기문제점을 해결하기 위해, 스쿠티카충 M. avidus종에서 분리된 항원 YS2를 배양하여 불활화시키고, peptidoglycan, lipoteichoic acid, β-glucan 중 어느 하나의 것을 선택하여 첨가시킨 후, 혼합하여 이루어지는 스쿠티카충 백신 조성물을 제공하고자 한다.

상기 과제를 해결하기 위한 수단으로서의 본 발명은, peptidoglycan, lipoteichoic acid, β-glucan 중 어느 하나를 선택한 면역보조제; 및 불활화된 스쿠티카충 M. avidus종 항원으로 이루어진 스쿠티카충 백신조성물을 제공한다.

본 발명의 스쿠티카충 백신조성물의 제조방법은 스쿠티카충의 항원을 분리하고 배양한 후, 항원을 불활화 시키는 단계; 상기 불화화시킨 항원과 peptidoglycan, lipoteichoic acid, β-glucan 중 어느 하나의 것을 적정농도로 첨가시켜 백신을 제조하는 단계로 이루어진다.

또한, 본 발명의 스쿠티카충 백신 조성물을 이용하여 넙치, 터봇, 농어, 돌돔, 우럭, 참돔 중에서 선택되는 어류의 감염을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명의 스쿠티카충 백신 조성물을 실험어에 투여하고 4주째와 8주째에 스쿠티카충을 감염시킨 실험결과, peptidoglycan이 면역보조제로 혼합된 백신은 4주째 스쿠티카충을 감염시킨 실험어군이 대조구와 비교하여 55% 이상의 높은 상대생존율로 유의적인 차이를 나타내고, lipoteichoic acid를 첨가한 백신 그룹에서는 백신 투여 4주째에 저농도 그룹이 40%의 RPS를 나타내었으며, β-glucan을 첨가한 실험에서는 100 ㎍ 첨가 시, 백신 투여 4주째에 35%, 8주째에 37%의 RPS를 나타내었고, 10 ㎍ 첨가구에서도 백신 투여 8주째에서 32%의 RPS를 나타내어 면역보조제로서 면역을 증강시키는 효과가 있다.

도 1은 본 발명의 스쿠티카충 백신조성물의 백신을 투여 후, 4주째에 M. avidus strain YS2로 감염시킨 실험어의 누적폐사율을 나타낸다.
도 2는 본 발명의 스쿠티카충 백신조성물의 백신을 투여 후, 8주째에 M. avidus strain YS2로 감염시킨 실험어의 누적폐사율을 나타낸 그래프이다.

본 발명은 스쿠티카충 M. avidus종에서 분리된 항원 YS2를 배양하여 불활화시키고 peptidoglycan, lipoteichoic acid, β-glucan 중 어느 하나의 것을 선택하여 첨가시킨 후, 혼합하여 이루어지는 스쿠티카충 백신 조성물에 관한 것이다. 이하, 본 발명의 스쿠티카충 백신 조성물과 관련한 구체적인 실시예와 첨부한 도면을 참조하여 상세히 설명하면 다음과 같다.

Ⅰ. 스쿠티카충 백신 조성물 제조방법

본 발명의 스쿠티카충 백신 조성물 제조방법은 스쿠티카충 M. avidus종의 항원을 분리하고 배양한 후, 항원을 불활화시키는 단계; 상기 불화화시킨 항원과 peptidoglycan, lipoteichoic acid, β-glucan 중 어느하나의 것을 적정농도로 첨가시켜 백신을 제조하는 단계로 이루어질 수 있다.

이하, 구체적인 실험예와 설명하면 다음과 같다. 본 발명의 항원을 불활화시키는 단계의 항원은 스쿠티카충 M. avidus 종에서 2005년에 여수연안의 양식수에서 분리한 YS2이다. 분리한 스쿠티카충은 Fetal bovine serum (FS) 10% (Gibco, USA), penicillin (50 IU/ml)과 streptomycin (50 ㎍/ml) (Gibco, USA)를 첨가한 Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (Gibco, USA)을 사용하여 25㎠ 세포배양용 플라스크 (Nunc, Denmark)에 배양한 Chinook salmon, Oncorhynchus tshawytscha embryo 세포 (CHSE-214)에 접종한 후 20℃에 배양하였다.

CHSE-214 세포에서 5일간 배양한 스쿠티카충을 15℃에서 10분간 1,500rpm으로 원심 분리하여 -80℃에 2일간 냉동하여 불활화시킨 후 백신의 항원으로 사용하였다.

백신을 제조하는 단계는 상기 불화화된 스쿠티카 항원(YS2, 4.44×10⁵ cells/fish)과 peptidoglycan (10 ㎍, 100 ㎍), lipoteichoic acid (5 ㎍, 50 ㎍), β-glucan (10㎍, 100 ㎍)을 적정 농도로 첨가한 후, 혼합하여 이루어질 수 있다.

통계분석은 graph pad prism 5 software (Version 5.02)를 이용하여 long lank (mantel-cox) test로 하였고, 상대생존율(Relative percentage survival, RPS)의 계산은 RPS = [1-(% mortality of vaccinated group/% mortality in control)] × 100 수식으로 계산하였다(Amend, 1981).

Ⅱ. 스쿠티카충 백신의 효능실험

본 발명의 방법으로 제조한 면역보조제가 첨가된 스쿠티카충 백신 및 면역보조제의 농도에 따른 효능을 알아보기 위해 M. avidus항원과 그람양성균의 세포벽 구성물질인 peptidoglycan (10㎍, 100㎍), lipoteichoic acid (5㎍, 50㎍)와 유글레나에서 유래된 β-glucan (10㎍, 100㎍)을 면역보조제로 첨가한 백신을 넙치에 투여한 후 4주와 8주째에 M. avidus로 감염실험을 실시하여 백신의 효능을 알아보았다.

1. 감염실험

표 1은 면역보조제로서 peptidoglycan, lipoteichoic acid, β-glucan와 항원 농도를 나타낸다. peptidoglycan(PG)은 Bacillus subtilis (Sigma, Israel)균으로부터, lipotheichoic acid(LTA) Bacillus sp. (Sigma, Israel)균으로부터 β-glucan은 Euglena gracilis (Sigma, Germany)로부터 추출하였다.

면역보조제로서 peptidoglycan, lipoteichoic acid, β-glucan와 항원 농도

Group	Concentration in 100
Group	Antigen dose (cells)	Adjuvant (ug)
Naive	-	-
Control	-	-
M. avidus + PG¹⁾ 10	4.4×10⁵	10
M. avidus + PG 100	4.4×10⁵	100
M. avidus + LTA²⁾ 5	4.4×10⁵	5
M. avidus + LTA 50	4.4×10⁵	50
M. avidus + -glucan³⁾10	4.4×10⁵	10
M. avidus + -glucan 100	4.4×10⁵	100

상기 백신을 접종시키기 위한 실험어는 넙치 (24.8 ± 1.9g, 15.2 ± 0.4cm)로 50마리씩 평균 수온 23.5℃ 해수 150ℓ가 담긴 수조에 각각 수용하고, 3일간 순치 후 제조한 실험백신을 1마리당 100 ㎕씩 복강 주사하였다. 대조구는 FBS가 첨가되지 않은 MEM을 100 ㎕씩 접종하였다.

상기 실험어에 백신을 투여한 후의 4주, 8주가 경과한 시점에서 스쿠티카충을 넙치에 감염시켰다. 감염실험은 23℃로 유지된 해수 25ℓ가 들어있는 수조에 넙치를 20마리씩 수용하였다. 스쿠티카충 감염은 백신 투여 4주째에서 평균 전중 33.2 ± 4.1g, 평균 전장 15.9 ± 0.6cm인 넙치에 7.2×10⁵cells/100 ㎕를, 백신 투여 8주째에서는 넙치 (33.6 ± 3.1g, 16.1 ± 0.5cm) 한 마리 당 7.1×10⁵cells/100 ㎕를 복강 감염시켰고, 22일까지 누적폐사율을 측정하였다.

2. 감염실험 결과

표 2는 백신투여 후 4주째에 스쿠티카충을 감염시킨 백신효능실험의 결과를 나타내고 표 3은 백신투여 후 8주째에 스쿠티카충을 감염시킨 백신효능실험의 결과를 나타낸다.

도 1 은 백신투여 후, 4주째에 M. avidus strain YS2로 감염시킨 실험어의 누적폐사율을 나타내고, 도 2는 백신투여 후, 8주째에 M. avidus strain YS2로 감염시킨 실험어의 누적폐사율을 나타낸 그래프이다. 실험어는 22일간 23℃에서 순치된다.

도 1 내지 도 2 그래프에 도시된 기호는 다음을 나타낸다. ◆는 Naive를 ■는 Control (non-vaccinated fish)을, ▲는 M. avidus pellet과 면역보조제로 peptidoglycan 10 ㎍ (PG 10)이 혼합된 백신이 투여된 실험어군을, △는 M. avidus pellet과 면역보조제로 peptidoglycan 100 ㎍ (PG 100)이 혼합된 백신이 투여된 실험어군을, ●는 M. avidus pellet과 면역보조제로 lipoteichoic acid 5 ㎍ (LTA 5)이 혼합된 백신이 투여된 실험어군을, ○는M. avidus pellet과 면역보조제로 lipoteichoic acid 50 ㎍ (LTA 50)이 혼합된 백신이 투여된 실험어군을 |은 M. avidus pellet과 면역보조제로 β-glucan 10 ㎍ (β-glucan 10)이 혼합된 백신이 투여된 실험어군을, ×는 M. avidus pellet과 면역보조제로 β-glucan 100 ㎍ (β-glucan 100)이 혼합된 백신이 투여된 실험어군을 나타낸다.

백신투여 후 4주째에 스쿠티카충을 감염시킨 백신효능실험의 결과

Groups	Mortality (%)	RPS (%)	P value
4 weeks post vaccination
Naive	-	-	-
Control	100	-	-
M. avidus + PG 10	45	55	0.0001
M. avidus +PG 100	35	65	0.0001
M. avidus +LTA 5	60	40	0.0007
M. avidus +LTA 50	95	5	0.4363
M. avidus +β-glucan 10	100	0	0.3151
M. avidus +β-glucan 100	65	35	0.0177

백신투여 후 8주째에 스쿠티카충을 감염시킨 백신효능실험의 결과

Groups	Mortality (%)	RPS (%)	P value
8 weeks post vaccination
Naㅿve	-	-	-
Control	95	-	-
M. avidus + PG 10	85	11	0.8707
M. avidus +PG 100	85	11	0.5103
M. avidus +LTA 5	90	5	0.2366
M. avidus +LTA 50	75	21	0.3585
M. avidus +β-glucan 10	65	32	0.1560
M. avidus +β-glucan 100	60	37	0.0400

Peptidoglycan을 면역보조제로서 첨가시킨 백신은 도 1에 도시된 바와 같이, 백신투여 후 4주째 M. avidus를 감염시켰을 경우에 대조구 그룹은 4일째 급격한 폐사를 보이기 시작하여 16일에 이르러 100%의 폐사율을 나타내었으나, peptidoglycan을 농도별로 첨가한 그룹에서는 3일째부터 폐사가 발생하기 시작하였다.

표 2를 살펴보면, 10㎍의 peptidoglycan이 포함된 그룹 (PG 10)은 45%, 100㎍의 peptidoglycan이 포함된 그룹 (PG 100)은 35%의 최종폐사율을 나타냈다. RPS는 각각 65, 55%로 나타났다.

도 2에 도시된 바와 같이, 백신투여 후 8주째에 M. avidus으로 감염시켰을 경우에는 대조구 그룹은 95%의 누적폐사가 발생하였다. Peptidoglycan을 첨가한 그룹은 3일째부터 폐사가 발생하여 10 ㎍을 첨가한 그룹은 6일째, 100 ㎍을 첨가한 그룹은 9일째까지 각각 85%의 누적폐사율을 나타내었으며, RPS는 각각 11%를 나타낸다.

상기 결과를 살펴보면, 백신 투여 4주째에서 모든 그룹 중 peptidoglycan을 첨가한 그룹이 대조구와 비교하여 55% 이상의 높은 상대생존율로 유의적인 차이를 나타내어 (P＜0.05) 면역보조제로서 peptidoglycan이 면역증강효과를 보인 것으로 사료된다. 또한, 펩티도글리칸을 10 ㎍을 첨가한 그룹의 PRS가 55%, 100 ㎍를 첨가한 그룹의 PRS가 65%를 각각 나타내어 항원농도가 4.4×10⁵ 인 100 ㎕백신에 펩티도글리칸의 농도는 10~100㎍이 적절한 것으로 사료된다.

Lipoteichoic acid 첨가 백신을 살펴보면, Lipoteichoic acid를 면역보조제로 첨가한 백신을 투여한 그룹에 백신 투여 4주째에 M. avidus 감염을 실시하였을 때 도 1에 도시된 바와 같이, 감염 3일째부터 폐사가 발생하여 LTA 5 그룹은 19일째까지 60%의 폐사가 나타났고, LTA 50 그룹에서 5일째에 95%의 급격한 폐사를 나타내었다. 표 2를 살펴보면 LTA 50 그룹은 5%의 RPS를 보임으로써, 40%의 상대생존율을 보인 LTA 5 그룹보다 낮은 효능을 보였다.

Lipoteichoic acid를 면역보조제로 첨가한 백신을 투여한 그룹에 백신 투여 8주째에 표 3에 기재된 바와 같이, LTA 5 그룹은 5일째에 이르러 90%의 급격한 누적 폐사율을 나타내었고, LTA 50 그룹은 9일째까지 75%의 폐사율을 보여 RPS는 각각 5%, 21%를 나타낸다.

상기 결과를 살펴보면, lipoteichoic acid를 첨가한 백신 그룹에서는 백신 투여 4주째에 저농도 그룹이 40%의 RPS를 나타내어 면역보조제로서 면역증강효과를 나타내었다고 사료된다. 또한, lipoteichoic acid를 5㎍을 첨가한 그룹의 PRS가 40%, 50 ㎍를 첨가한 그룹의 PRS가 5%를 각각 나타내어 항원농도가 4.4×10⁵ 인 100 ㎕백신에 lipoteichoic acid의 첨가범위는 5㎍이 적절한 것으로 사료된다.

β-glucan 첨가 백신을 살펴보면, β-glucan을 10 ㎍ 또는 100 ㎍ 첨가하여 제조한 백신을 투여한 후, 4주째에 M. avidus 감염을 실시한 결과, 표 2에 기재된 수치와 도 1에 도시된 바와 같이, β-glucan 10 그룹과 β-glucan 100 그룹은 각각 100% (16일째)와 65% (8일째)의 최종폐사율을 나타내었으며 RPS는 각각 35%, 0% 였다.

표 3을 살펴보면, 백신 투여 후 8주째 실시한 감염실험의 결과 β-glucan 10 그룹에서의 폐사율은 65%로 백신 투여 4주째 실시한 감염실험의 결과보다 낮았으나, β-glucan 100 그룹은 백신 투여 4주째 감염실험과 유사하게 60%의 폐사가 나타났다. 각각의 RPS는 32%, 37%를 나타낸다.

상기 결과를 살펴보면, β-glucan을 첨가한 실험에서는 100 ㎍ 첨가 시, 백신 투여 4주째에 35%, 8주째에 37%의 RPS를 나타내었고, 10 ㎍ 첨가구에서도 백신 투여 8주째에서 32%의 RPS를 보여 면역보조제로서 면역증강효과를 나타낸 것으로 사료된다.

또한, β-glucan를 10㎍을 첨가한 그룹의 PRS가 0%, 100 ㎍를 첨가한 그룹의 PRS가 35%를 각각 나타내어 항원농도가 4.4X10⁵ 인 100 ㎕백신에 β-glucan의 첨가범위는 100㎍이 적절한 것으로 판단된다.

동결하여 불활화시킨 스쿠티카충 M. avidus를 백신의 항원으로 사용하고 peptidoglycan, lipoteichoic acid, β-glucan 중 어느 하나 선택한 것을 면역보조제로서 포함하는 스쿠티카충 백신 조성물을 제공함으로써 뚜렷한 구제 방안이 없는 스쿠티카충의 면역증강과 더불어, 면역보조제의 개발이 미흡한 스쿠티카충 백신분야에서 면역증강이 있는 면역보조제가 첨가된 백신으로 양식어가의 생산량 증대 및 양식 기반확대 및 수산분야의 발전은 물론, 양식 기술의 국제경쟁력 제고로 어업인 소득증대에 기여가능하므로 산업상 이용가능성이 있다.

Claims

peptidoglycan 또는 lipoteichoic acid으로 이루어지는 면역보조제와 불활화된 M. avidus종의 스쿠티카충 항원으로 이루어지며,
상기 면역보조제는 항원 4.4×10⁵ 인 100 ㎕백신에 펩티도글리칸은 10~100㎍이고, lipoteichoic acid는 5㎍으로 첨가되는 것을 특징으로 하는 어류용 스쿠티카충 백신 조성물
M. avidus종의 스쿠티카충 항원을 분리하고 배양한 후, 항원을 불활화시키는 단계;
상기 불활화시킨 항원에 면역보조제로서 peptidoglycan 또는 lipoteichoic acid를 항원 4.4×10⁵ 인 100 ㎕백신에 펩티도글리칸은 10~100㎍으로, lipoteichoic acid는 5㎍으로 첨가하여 백신을 제조하는 단계로 이루어진 것을 특징으로 하는 어류용 스쿠티카충 백신 제조방법
삭제
삭제