KR100436740B1 - 살모넬라 갈리나룸 약독주 및 이를 포함하는 가금티푸스예방용 백신 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 살모넬라 갈리나룸 약독주 및 이를 포함하는 가금티푸스 예방용 백신 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 국내 분리 살모넬라 갈리나룸 균주로부터 선별되고 낮은 병원성과 높은 면역원성을 가지는 신규한 살모넬라 갈리나룸 약독주 SR2-N6(1-815) 및 이를 포함하는 가금티푸스 예방용 백신 조성물 및 사료첨가제에 관한 것이다. 본 발명의 신규한 살모넬라 갈리나룸 약독주는 병원성이 없고 가금티푸스에 대한 방어능이 뛰어나므로 가금티푸스의 예방용 백신 또는 사료첨가제로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

살모넬라 갈리나룸 약독주 및 이를 포함하는 가금티푸스 예방용 백신 조성물{Attenuated Strain of Salmonella gallinarum and vaccine composition for the prevention of Fowl typhoid comprising the same}

본 발명은 살모넬라 갈리나룸 약독주 및 이를 포함하는 가금티푸스 예방용 백신 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 국내 분리 살모넬라 갈리나룸 균주로부터 선별되고 낮은 병원성과 높은 면역원성을 가지는 신규한 살모넬라 갈리나룸 약독주 및 이를 포함하는 가금티푸스 예방용 백신 조성물 및 사료첨가제에 관한 것이다.

가금티푸스(Fowl typhoid :FT)는 닭 및 칠면조 등의 조류에서 발생하는 급, 만성의 전염병으로서 모든 일령에 나타나는 패혈증에 의한 높은 폐사율이 특징인 질병이며, 원인체는 살모넬라균의 일종인 살모넬라 갈리나룸(Salmonella gallinarum)이라는 세균으로 알려져 있다. 상기 세균은 형태학적으로 그람음성인 단간균으로서 살모넬라 중에서 추백리균과 함께 운동성이 없는 것이 특징이며, 혈청학적으로도 추백리의 원인균인 살모넬라 풀로룸(Salmonella pullorum) 및 사람의 식중독 원인균인 살모넬라 엔테라이티디스(Salmonella enteritidis) 등과 같은 D형에 속한다. 가금티푸스는 1900년대 초기에 전세계적으로 발생하여 양계산업에 막대한 손실을 주었으며, 캐나다, 미국 및 일부 유럽국가 등 양계선진국에서는 국가적인 차원에서의 방역프로그램을 실시하여 그 발생이 매우 낮거나 근절되었으나, 남미, 아프리카 및 동남아시아 등지에서는 최근에도 발생빈도가 높은 것으로 보고되고 있다. 국내에서의 발생은 1992년 처음 보고되었고, 1994년 이후 전국적으로 발병하여 최근 양계농가에 막대한 경제적 손실을 주고 있는 실정이다.

가금티푸스의 감염은 주로 감염계와의 접촉이나 감염된 모계로부터 종란을 통한 후대 병아리의 수직 감염에 의해 이루어지거나, 계사주변의 오염된 환경을 경유하여 전염될 수 있을 뿐만 아니라 농장내 감염 계군에서 분변으로 배출된 균이 양계기구나 음수, 사료 등을 통해 다른 계군으로 전염되기도 한다. 닭이 가금티푸스에 감염되어 나타나는 일반적인 외부 증상으로는 빈혈, 침울 및 소화기 증상 (녹변, 혈변, 또는 설사) 등이 있고, 그에 따라 사료 섭취율 및 산란율이 저하되며, 내독소에 의한 급성폐사나 빈혈 및 사료섭취 저하에 의한 만성폐사가 나타난다.

이러한 가금티푸스의 예방을 위한 백신은 크게 사균백신과 약독화 생균백신 두 가지가 있는데, 사균백신은 접종후 체내에서 증식할 수 없으므로 많은 양을 접종해야 하며, 내독소에 의한 발열, 침울 및 급성폐사 등의 부작용이 심한 단점이 있다. 또한, 살모넬라균의 세포내 기생성으로 살모넬라증에 대한 백신은 체액성면역반응만을 유도하는 사균백신보다는 체액성면역과 세포성 면역반응을 모두 유도하는 약독화 생균백신이 보다 더 좋은 효과를 나타내는 것으로 알려져 있다(Robertsson, J.A., et.al.Infect. Immun., 41, 742-750, 1983). 이러한 생균백신에 의해 유도된 면역 반응은 사균백신에 비해 일반적으로 강하고 지속 기간이 긴데 그 이유는 생균 백신 균주가 야외주와 유사한 감염경로를 거치며 면역계를 활성화시키기 때문이다. 살모넬라증의 예방을 위한 동물 및 인체용 약독화 생균백신의 이용에 관한 역사는 오래되었는데, 일례로 약독화 경구용 장티푸스 백신인 Ty21a (Vivotif, Swiss Serum Vaccine Institute사 제품) 균주는 장티푸스의 예방을 위한 매우 성공적인 백신임이 증명되었고, 미국과 유럽을 포함한 많은 국가에서 인가를 받아 사용되고 있다.

한편, 최근에는 살모넬라 병원성 관련 유전자 부분을 제거하거나 다양한 방법으로 불활화 한 약독화 생균백신이 개발되었으나, 기존의 약독화 생균백신들에 비해 면역원성이나 병원성면에서 떨어지는 단점이 있다. 또한, 이러한 유전자 변이 백신주들은 대부분 1개의 유전자에 대한 돌연변이를 유도한 것으로서 역돌연변이에 의해 병원성을 회복할 가능성(1/10⁶내지 1/10⁸세균)이 비교적 높아 안전성면에서 문제점이 있다.

현재 가금티푸스의 감염에 대한 약독화 생균백신으로 널리 사용되고 있는 살모넬라 갈리나룸 9R 균주는 자연적으로 변이된 비병원균으로 1950년대 이후 현재까지 병원성의 회귀없이 안전한 백신 균주로 알려져 있다. 9R 균주는 지질다당질(LPS)가 거의 없이 코어(core)만 있는 반조면(semi-rough) 균주로 병원성은 없으나 면역원성 역시 약한 단점을 가지고 있으며, 가격 또한 너무 비싸 적용이 쉽지 않으며 6주령 이후의 닭에 적용하여야 하기 때문에 어린 일령의 산란계나 육계 등에는 적용하지 못하고 있는 실정이다. 따라서, 어린 일령의 병아리에 대한 조기 면역이 가능하며 보다 효과적인 백신의 공급이 시급한 실정이다.

이에, 본 발명자들은 가금티푸스의 종래 생균 백신보다 더욱 효과적인 백신을 개발하고자 노력한 결과, 병원성은 낮아 안전하지만 면역원성은 뛰어나 조기면역이 가능한 살모넬라 갈리나룸 약독주를 선발해 내었고, 이를 가금티푸스의 예방에 유용하게 사용할 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 신규한 살모넬라 갈리나룸 약독주 및 이를 포함하는 가금티푸스 예방용 백신 조성물을 제공하는 것이다.

도 1은 일반적인 살모넬라 갈리나룸 균과 본 발명의 SR2-N6(1-815) 균주의 한천배지에서의 집락 형태를 보여주는 사진이고,

A ; 대조군(SG002 균주), B : SR2-N6(1-815) 균주

도 2는 지질 다당질(lipopolysaccharide, LPS)을 추출하여 전기영동한 후 은 염색(silver staining)한 결과를 보여주는 사진이다.

1 ; SR2-N6(1-815) 균주, 2 ; SR27 균주,

3 ; 9R 균주, 4 ; SG002 균주

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 신규한 살모넬라 갈리나룸 약독주를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 미생물을 유효성분으로 함유하는 가금티푸스 예방용 백신 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 미생물을 유효성분으로 함유하는 사료첨가제를 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 신규한 살모넬라 갈리나룸 약독주를 제공한다.

본 발명의 균주는 국내에서 분리된 야외 강변원성 살모넬라 갈리나룸 SG002 균주로부터 분리되었으며, 'SR2-N6(1-815)'라 명명하였다. 본 발명의 살모넬라 갈리나룸 약독주 SR2-N6(1-815)의 형태 및 생리 생화학적 특성은 다음과 같다.

본 발명의 살모넬라 갈리나룸 약독주 SR2-N6(1-815)는 그람(Gram) 음성의 세균으로 호기적인 조건과 혐기적인 조건에서 동시에 성장할 수 있으며, 포자를 형성하지 않고 운동성이 없는 간균이다. 상기 균주는 30 내지 37℃에서 성장하며, 인돌을 생성하지 않고, 질산을 환원하지 않으며, 유당발효(lactose) 음성으로 국내 야외 분리 살모넬라 갈리나룸과 동일한 특성을 보인다(표 1참조). 그러나 집락(colony)의 형태는 거칠며 불규칙한 모양을 띄어 부드러운 집락의 모양을 갖는 야외 분리 살모넬라 갈리나룸과 차이를 보였다(도 1참조).

또한, 본 발명의 살모넬라 갈리나룸 약독주 SR2-N6(1-815)의 지질다당질을 분석한 결과, 상기 균주는 지질다당질을 거의 가지고 있지 않은 반조면 균주로 확인되었으나 종래에 알려진 살모넬라 갈리나룸 약독화 반조면 균주인 9R 균주와 뚜렷이 구분되는 지질다당질 양상을 보여주었다(도 2참조).

본 발명의 살모넬라 갈리나룸 약독주 SR2-N6(1-815)의 RNA 중합효소 베타서브유닛 유전자 (rpoB) 염기서열은 서열번호 1로 기재되며,rpoB염기서열에 기초한 분자계통분류학적 분석을 통하여 본 발명의 균주는 살모넬라 갈리나룸과 동일한 균주로 동정되었다.

본 발명의 균주는 1일령 갈색 산란계 병아리에 피하접종한 결과, 10⁸집락형성단위(CFU)까지는 병변 및 폐사가 관찰되지 않았으며, 평균 50% 폐사 접종 균수(LD₅₀)는 10⁹집락형성단위(CFU) 이상으로 병원성이 약독화 되었음을 확인하였다(표 2참조).

또한, 본 발명의 균주를 갈색 살란계 1일령 병아리 20수 피하에 10⁷집락형성단위로 접종하고, 1주일 후 강병원성 살모넬라 갈리나룸 SG120 균주 10⁶집락형성단위를 경구로 공격 접종한 뒤 10일간 관찰하는 동안 대조군이 55% 폐사한 반면 본 발명의 균주로 면역된 병아리는 한 마리도 폐사하지 않아 1일령 갈색 산란계에서도 종래의 생균 백신보다 더욱 효과적인 면역반응을 보임을 확인하였다(표 3참조).

본 발명자들은 상기 SR2-N6(1-815) 균주를 2003년 8월 26일자로 한국생명공학연구원 유전자은행에 기탁하였다(수탁번호: KCTC 10513BP).

또한, 본 발명은 상기 미생물을 유효성분으로 함유하는 가금티푸스 예방용 백신 조성물을 제공한다.

본 발명에서 사용되는 백신 조성물의 면역학적 유효 용량으로는 면역반응 도출에 적당한 용량이 사용될 수 있다. 특정 용량은 치료하고자 하는 포유동물의 일령, 체중 및 임상 증상과 투여방법에 의해 좌우된다. 이러한 적정용량은 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 백신 조성물은 생리 식염수 또는 인산 완충 식염수 또는 글리세롤이나 프로필렌 글리콜 같은 에탄올 폴리올을 이용하여 약학적 또는 생리학적으로 허용되는 매체(vehicle)에 의해 임의로 투여될 수 있다. 소량의 세제도 본 발명의 백신 조성물의 안정성 증강을 위해 포함시킬 수 있다.

본 발명의 백신 조성물은 식물성 오일 또는 이의 에멀션, 계면활성제, 예를 들면 헥사데실아민, 옥타데실 아미노산 에스테르, 옥타데실아민, 라이소레시틴, 디메틸-디옥타데실암모늄 브로마이드, N,N-디옥타데실-N'-N'비스(2-하이드록시에틸-프로판디아민), 메톡시헥사데실글리세롤, 및 플루로닉 폴리올; 폴리아민, 예를 들면, 피란, 덱스트란설페이트, 폴리 IC, 카보폴; 펩타이드, 예를 들면, 뮤라밀 디펩타이드, 디메틸글라이신, 터프트신; 면역 자극 복합체; 오일 에멀션; 리포폴리사카라이드, 예를 들면 MPLR(3-O-탈아실화 모노포스포릴 리피드 A; RIBI ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, Montana); 및 미네럴 겔 같은 부가적인 보조제를 임의로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 백신 조성물의 유효성분인 상기 SR2-N6(1-815) 균주는 리포솜, 와우상(cochleates), 생분해성 중합체, 예를 들면 폴리-락타이드, 폴리-글리콜라이드 및 폴리-락타이드-코-글리콜라이드, 또는 ISCOMS(면역자극 복합체) 중으로 혼입될 수 있고, 보충성 활성성분이 또한 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 균주는 세균 독소 및 이의 약독화유도체와 함께 투여될 수 있다.

본 발명의 백신 조성물은 비경구, 동맥내, 피내, 경피(서방형 중합체의 사용 등에 의해), 근육내, 복강내, 정맥내, 피하, 경구 및 비강내 투여경로(이에 국한되지 않음)를 포함하여 다양한 경로에 의해 동물, 바람직하게는 닭에 투여될 수 있다. 이러한 백신에 사용되는 상기 균주의 양은 균주의 동질성에 따라 변동될 수 있다. 본 발명의 백신 조성물에 적용되기 위한 통상의 캐리어 항원과 함께 사용되는 설정용량 범위의 조정과 조작은 당업자의 역량 안에 있다. 본 발명의 백신 조성물은 미숙 및 성체 온혈동물, 바람직하게는 닭의 치료에 사용되기 위한 것이다.

본 발명의 백신 조성물에 있어서, 상기 미생물의 투여량은 체내에서 활성성분의 흡수도, 일령 또는 접종방법에 따라 적절히 선택되나, 일반적으로 10⁴내지 10⁸CFU의 양으로 1회 내지 수회 나누어 투여할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 미생물을 유효성분으로 함유하는 사료첨가제를 제공한다.

본 발명의 사료첨가제는 건조 또는 액체 상태의 제제 형태일 수 있으며, 하나 또는 그 이상의 효소제제를 첨가할 수 있다. 첨가되는 효소제제는 건조 또는 액체 상태가 모두 가능하며 효소제제로는 리파제(lipase)와 같은 지방 분해효소, 파이틱애시드(phytic acid)를 분해하여 인산염과 이노시톨인산염을 만드는 파이타제(phytase), 녹말과 글리코겐(glycogen) 등에 포함되어 있는 알파-1,4-글리코시드 결합(α-1,4-glycoside bond)을 가수분해하는 효소인 아밀라제(amylase), 유기인산에스테르를 가수분해하는 효소인 포스파타제(phosphatase), 셀룰로스(cellulose)를 분해하는 카르복시메틸셀룰라제(carboxymethylcellulase), 자일로스(xylose)를 분해하는 자일라나제(xylanase), 말토오스(maltose)를 두 분자의 글루코스(glucose)로 가수분해하는 말타제(maltase) 및 사카로스(saccharose)를 가수분해하여 글루코스-프룩토스(glucose-fructose) 혼합물을 만드는 전환효소(invertase) 등과 같은 당 생성 효소로 구성된 군으로부터 선택되어 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 균주를 포함하는 사료첨가제에는 비병원성의 다른 미생물이 첨가될 수 있다. 첨가될 수 있는 미생물로는 단백질 분해 효소, 지질 분해효소 및 당 전환 효소를 생산할 수 있는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)와 같은 고초균, 소의 위와 같은 혐기적 조건에서 생리적 활성 및 유기물 분해능이 있는 락토바실러스 균주(Lactobacillussp.), 가축의 체중을 증가시키며 우유의 산유량을 늘리고 사료의 소화 흡수율을 높이는 효과를 보여주는 아스퍼질러스 오리자에(Aspergillus oryzae)와 같은 사상균(Slyter, L. L.J. Animal Sci., 43. 910-926, 1976) 및 사카로미세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)와 같은 효모(Jhonson, D. E et al.J. Anim. Sci., 56, 735-739, 1983; Williams, P. E. V. et al, 211, 1990)로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.

각종 곡물 및 대두 단백을 비롯한 땅콩, 완두콩, 사탕무우, 펄프, 곡물 부산물, 동물 내장 가루 및 어분 가루 등과 같은 사료원료는 가공되지 않거나 또는 가공된 것을 사용할 수 있다. 가공과정은 사료원료가 충진된 상태에서 가압 하에 일정한 배출구로 압축되는 공정으로 단백질의 경우에는 변성이 되어 이용성이 증가되는 압출 성형(extrusion)을 제공한다. 압출 성형(extrusion)은 열처리 과정을 통해 단백질을 변성시키고 항효소인자를 파괴시키며, 단백질 분해효소의 활성을 분자적 구조변화에 의한 새로운 부위로의 효소적 노출에 의해 증가시키는 등의 장점을 갖는다. 또한, 대두 단백질과 같은 경우에는 압출 성형을 통해서 단백질의 소화율을 향상시키고 대두에 존재하는 단백질 분해효소의 저해재 중의 하나인 트립신 저해제(trypsin inhibitor)와 같은 항 영양인자들을 불활성화시키며 단백질 분해효소에 의한 소화율 향상을 증가시켜 대두 단백의 영양적 가치를 증가시킬 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 가금티푸스 백신 후보 균주의 선별

2002년 인트론 바이오테크놀로지 생명공학연구소에서 국내 가금으로부터 분리한 살모넬라 갈리나룸 균주 중 알려진 항균제 내성유전자를 갖지 않는 야외 강병원성 살모넬라 갈리나룸 SG002 균주를 5 ×10⁷집락형성단위(colony forming unit, 이하 'CFU'라 약칭함)/㎖의 농도가 되도록 액체배지(LB: Difco, USA)로 희석한 뒤, 살모넬라 갈리나룸 균주의 지질다당질(LPS)을 수용체(receptor)로 하여 이를 특이적으로 용해하는 박테리오파아지 SG-φ-JL2(인트론 생명공학연구소에서 2001년 서울 중랑 하수처리장에서 분리)를 10배의 감염용량(MOI; multiplicity of infection)으로 첨가하였다. 48시간 배양한 후 100 ㎍/㎖ 농도의 날리딕산(Nalidixic acid)이 첨가된 멕콩키 한천 배지(MacConKey agar: Difco, USA)에서 날리딕산 저항 집락을 각각 분리하였다.

분리된 각각의 집락을 날리딕산이 100 ㎍/㎖ 농도로 첨가된 멕콩키 한천 배지에 계대 배양하여 각각의 순수한 집락을 확보하였으며, 상기 과정에서 조면집락형태를 갖는 집락만을 선별하였다. 이렇게 얻은 집락 중 병원성은 낮지만 강한 면역원성을 갖는 균주를 선발하기 위하여 각각의 균주를 액체배지(LB: Difco, USA)에 밤새 배양한 후 1일령 산란계 병아리 10마리씩에 각각 10⁸CFU씩 피하에 주사하여 접종하고 1주일간 관찰하였다. 이때, 병아리가 폐사하지 않으며 부검했을때 간과 비장등에 육안으로 병변을 관찰할 수 없고, 증체율에 있어서 스트레스가 없으며, 비장대 체중 비율이 높은 균주만을 선발하였으며 이러한 과정을 5회 이상 반복하였다. 상기와 같은 과정을 통하여 집락의 형태는 조면집락형태이며, 1일령병아리에 10⁸CFU를 피하 주사하여도 1주일간 1마리도 폐사하지 않고, 부검시 육안적 병변이 관찰되지 않는 병원성이 결핍된 균주들을 선발하였다.

상기에서 선발된 병원성이 없는 균주들 중 면역원성이 강한 균주를 선발하기 위하여 각각의 균 주를 1일령 산란계 병아리 10마리씩에 각각 10⁷CFU씩 피하에 접종하고 1주일 후 강병원성 야외 살모넬라 갈리나룸 SG120주(서울대학교 수의과대학조류질병학실로부터 분양받은 2000년 국내 분리주)를 경구로 각각 10⁶CFU씩 투여한 후 10일간 관찰하였다. 이때 대조군의 폐사율이 50%인데 반해 폐사율 0%를 보인 접종 균주를 가금티푸스 백신 후보 균주로 선발하였고, 이를 'SR2-N6(1-815)'라 명명하였다.

<실시예 2> SR2-N6(1-815)의 동정

<2-1> 형태 및 생화학적인 특성 분석

상기 실시예 1에서 분리된 SR2-N6(1-815) 균주를 멕콩키 한천 배지에 직접 도말하여 37℃에서 24시간 배양하였을 때 작고 투명한 집락을 형성함을 관찰하였다. 이러한 집락의 특성에서 락토스의 분해능이 없음과 그람 음성 균임을 확인하였으며, 그람 염색하여 관찰한 결과 그람음성 간균임을 확인하였다. 또한, TSIA(Triple Sugar Iron Agar, Difco사 제품) 및 MIO 배지(Difco사 제품)에 접종하여 가스 형성 및 H₂S 생성, 인돌 생성, 오니틴디카복실레이즈(Ornitihine decarboxylase) 반응, 덜시톨(Dulcitol), 말토즈(Maltose), 락토즈(Lactose) 등의 당분해능을 관찰하였다.

상기의 방법으로 결정한 SR2-N6(1-815)의 형태 및 생화학적 특성을 하기 표 1에 나타내었다.

SR2-N6(1-815)의 형태 및 생화학적 특성

특성	결과
	SG002	SR2-N6(1-815)
운동성	-	-
인돌생성(Indole)	-	-
Ornithine decarboxylase	-	-
Glucose 분해	+	+
가스생성	-	-
락토스(Lactose) 분해	-	-
갈락토스(Galactose) 분해	+	+
덜시톨(Dulcitol) 분해	+	+
말토스(Maltose) 분해	+	+
H2S 생성	-	-
그람 염색	-	-
세균 형태	간균	간균

그 결과, 본 발명의 균주는 국내 야외 분리 살모넬라 갈리나룸 균주인 SG002주와 유사한 특성을 보였다(표 1).

<2-2> 염기서열 및 상동성 분석

본 발명의 SR2-N6(1-815) 균주의 RNA 중합효소 서브유닛B(RpoB) 유전자의 염기서열을 하기 방법으로 결정하였다. 구체적으로, 권 등(H.-J. Kwonet al., Veterinary Microbiology, 82,121-129, 2001)의 방법에 의하여 추출한 DNA와 서열번호 2 및 서열번호 3으로 기재되는 염기서열을 가지는 프라이머 쌍을 이용하여 상기 권 등의 방법에 개시된 반응 조건에 따라 PCR 반응을 시행함으로써RpoB유전자를 증폭하였다. 증폭된RpoB유전자는 PCR 생성물 정제 키트(iNtRON사, 한국)를 사용하여 정제한 후 DNA 염기서열 키트(Applied Biosystems사)를 사용하여 염기서열을 분석하였다. 염기서열은 유전자 분석기(ABI377 DNA sequencer, Perkin Elmer사)를 사용하여 결정하였다. 그 결과, 본 발명의 균주의RpoB유전자는 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 가짐을 확인하였다.

RpoB유전자 염기서열에 기초한 분자계통분류학적 분석에서 본 발명의 SR2-N6 균주는 살모넬라(Salmonella)속에 속하는 균주로서 살모넬라 갈리나룸과 살모넬라 엔테라이티디스 등의 균주와 100%의 상동성을 보여 이들 균주와 가장 높은 분자계통학적 유연관계를 보여주는 균주로 동정되었다. 그러나 상기 표 1에서와 같이 SR2-N6(1-815)는 운동성에서 음성을 보이는 등 생화학적 성상에서 살모넬라 엔테라이티디스와는 구별되어 살모넬라 갈리나룸으로 동정되었다.

<실시예 3> SR2-N6(1-815)의 집락 형태 관찰 실험

상기 실시예 1에서 분리된 SR2-N6(1-815) 균주를 100 CFU로 액체배지(LB)에 희석하여 멕콩키 한천 배지에 펼친 후 37℃ 항원기에서 24시간동안 배양하여 집락의 모양을 관찰한 결과, 거친면을 가진 특징적인 집락의 형태를 보여 부드러운 집락모양의 살모넬라 갈리나룸균과 차이가 있음을 확인하였다. 야외 분리 살모넬라 갈리나룸 균주인 SG002의 집락이 부드러운 원형의 모양을 취하는 것과 달리 SR2-N6(1-815) 균주의 경우는 매우 거칠고 불규칙한 집락의 형태를 하고 있었다(도 1).

<실시예 4> SR2-N6(1-815)의 지질다당질 관찰 실험

상기 실시예 1에서 분리된 SR2-N6(1-815) 균주 109 CFU를 1.5 ㎖ 튜브에 넣고 13,000 rpm으로 30초간 원심분리하여 세포를 모으고 PBS로 1회 세척하였다. 원심분리된 세포는 잘 현탁시킨 다음 1 ㎖의 용해버퍼(LPS 추출 키트, iNtRON사, 한국)를 첨가하여 혼탁시켰다. 이후 200 ㎕의 클로로포름을 넣고 10 내지 20초간 강하게 혼탁한 후 실온에서 10분 동안 정치시켰다. 이를 13,000 rpm으로 10분간 원심 분리한 후, 상층액 400 ㎕를 새로운 1.5 ㎖ 튜브로 옮겼다. 용해된 세포에 800 ㎕의 정제버퍼(purification buffer; LPS 추출 키트, iNtRON사 제품)를 첨가하고 잘 섞어준 다음 -20℃에서 20분동안 정치시켰다. 이를 다시 13,000 rpm으로 15분간 원심분리하고 얻어진 지질다당질(LPS pellet)을 1 ㎖의 70% 에탄올로 씻어준 후 거조시켰다. 얻어진 지질다당질에 50 ㎕의 10 mM 트리스버퍼(Tris-HCl buffer pH 8.0)를 첨가하고 5분간 끓여주어 지질다당질을 완전히 용해시켰다. 이후 100 ㎍의 단백분해효소 K(proteinase K)를 넣고 55℃에서 2시간동안 정치시켰다. 추출된 지질다당질 10 ㎕를 12% SDS-PAGE에 60 V에서 2시간동안 전기영동한 후 지질다당질은 염색 키트(iNtRON사)를 이용하여 은 염색하였다(도 2).

그 결과, 강병원성을 갖는 살모넬라 갈리나룸 SG002의 경우 지질다당질이 낮은분자무게 지질다당질에서 높은분자무게 지질다당질까지 수많은 지질다당질이 존재하였으며, 약 병원성의 생균 백신 주인 9R의 지질다당질은 코어 1개만 가지고 있었다. 본 발명의 SR2-N6(1-815) 균주의 경우 높은분자무게 지질다당질은 완전히 소실되었고 낮은분자무게 지질다당질의 경우는 대부분 소실되었지만 9R 균주와는 다르게 코어와 몇 가지 낮은분자무게 지질다당질을 가지고 있음을 확인하였다(도 2).

<실시예 5> SR2-N6(1-815)의 병원성 실험

상기 실시예 1에서 분리된 SR2-N6(1-815) 균주의 병원성을 실험하기 위하여 특정 병원균에 감염되지 않은(SPF) 갈색 산란계 1일령 병아리 320마리를 실험에 사용하였다. 대조군으로 사용한 강병원성 살모넬라 갈리나룸균의 경우 액상배지(LB)에 밤새 배양한 후 10⁶CFU 만큼을 1 ㎖ 주사기를 이용하여 20마리의 1일령 병아리의 목 뒤 피하에 접종하였으며, SR2-N6(1-815) 균주의 경우 10⁷, 10⁸, 10⁹CFU의 세균을 각각 200마리, 40마리, 40마리의 1일령 산란계 병아리에 접종하였다. 그 결과, 강병원성의 살모넬라 갈리나룸 균의 경우 접종 3일만에 100% 폐사한 반면, SR2-N6의 경우 10⁷과 10⁸CFU를 피하 접종한 경우에는 접종 7일후 까지 전혀 폐사가 일어나지 않았으며 부검시 간장과 비장을 비록하여 병변을 육안적으로 전혀 관찰 할 수 없어 병원성에서 확실히 약독화 되었음을 확인하였다. SR2-N6(1-815) 균주를 10⁹CFU로 접종한 경우에도 폐사율이 5% 이하로 나타나 평균 50% 폐사 접종 균 수(LD₅₀)는 10⁹CFU 이상이었다(표 2). 또한, 몸무게의 평균이나 증체량에서 SR2-N6(1-815) 접종 군과 무접종 대조군과는 통계적으로 유의적인 차이가 없었다. 따라서 본 발명 균주를 10⁸CFU 까지는 피하접종시 독성이 관찰되지 않음을 확인하였다.

SR2-N6(1-815)의 병원성 실험

접종 세균	피하 접종량	병아리숫자	접종 후 일자별 누적 폐사수	폐사율 (%)	육안적병변 관찰 여부	접종전 몸무게 평균(g)	접종 7일후 몸무게 평균(g)
			1					2	3	4	5	6	7
-	-	20	0	0	0	0	0	0	0	0	0/20	39.99	72.66
SG120	106	20	0	4	20	20	20	20	20	100	관찰안함	40.23	-
SR2-N6(1-815)	107	200	0	0	0	0	0	0	0	0	0/200	41.35	71.91
SR2-N6(1-815)	108	40	0	0	0	0	0	0	0	0	0/40	40.82	72.89
SR2-N6(1-815)	109	40	0	0	0	0	0	2	2	5	1/38	40.77	70.59

<실시예 6> SR2-N6(1-815)의 백신 효능 실험

상기 실시예 1에서 분리된 SR2-N6(1-815) 균주의 백신으로의 효능을 평가하기 위하여 특정 질병에 감염되지 않은 1일령 갈색 산란계 병아리 60수를 대상으로 실험을 실시하였다. 구체적으로, 9R 생균백신과 본 발명의 SR2-N6(1-815) 균주를 갈색 살란계 1일령 병아리 피하에 각각 10⁷CFU로 20수씩 접종하였으며, 1주일 후 강병원성 살모넬라 갈리나룸 SG120 균주 10⁶CFU를 경구로 공격 접종한 뒤 10일간 관찰하였다.

SR2-N6(1-815)의 가금티푸스 균 방어능

백신종류	접종량	병아리 수	공격 접종 후 일자별 누적폐사 수	공격접종 후 폐사율 (%)
			1		2	3	4	5	6	7	8	9	10
-	-	20	0	0	0	0	2	5	9	10	10	11	55
9R	107S.C	20	0	0	0	0	0	3	6	8	9	10	50
SR2-N6	107S.C	20	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0

그 결과, 상기 표 3에서와 같이 9R생균 백신의 경우 백신을 하지 않은 대조군과 폐사율에서 큰차이 없이 50%의 폐사가 일어나 어린 병아리에서의 방어가 잘 일어나지 않음을 보였으나, 본 발명의 SR2-N6(1-815)의 경우 가금티푸스 균 공격 접종 후 10일 까지도 100% 생존함을 보여 어린 병아리에서도 뛰어난 방어효과를 보임을 확인하였다.

상기의 결과로부터, 본 발명의 SR2-N6(1-815) 균주는 종래의 가금티푸스 백신 9R 균주와는 다른 살모넬라 갈리나룸 약독 주로 동정하였고, 병원성은 결핍되었으며, 면역원성에서 9R보다 우수한 가금티푸스 백신 후보 주로 확인되었다.

본 발명자들은 상기 살모넬라 가리나룸 SR2-N6(1-815) 약독주를 2003년 8월 26일자로 한국생명공학연구원 유전자은행에 기탁하였다(수탁번호: KCTC 10513BP).

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 살모넬라속의 살모넬라 갈리나룸의 새로운 약독 주인 SR2-N6(1-815)는 병원성은 결핍되어 있으며, 가금티푸스균 및 기타 살모넬라 균에 대한 강한 면역원성을 가지고 있어, 1일령 병아리에도 적용할 수 있는 매우 안전하면서도 효과적인 생백신 주로 사용될 수 있다.

<110> YOON, Seong Jun <120> Attenuated Strain of Salmonella gallinarum and vaccine composition for the prevention of Fowl typhoid comprising the same <130> 3p-09-12B <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 326 <212> DNA <213> Salmonella gallinarum SR2-N6(1-815) <400> 1 gcctgcgacc atcatcctgc gtgcgctgaa ctacaccact gagcagatcc ttgacctgtt 60 ctttgagaaa gtcgtcttcg aaattcgcga caacaaactg cagatggagc tgattccaga 120 acgtctgcgc ggcgaaaccg cgtcgttcga tatcgaagct aacggcaaag tgtacgttga 180 aaaaggccgt cgcattaccg cgcgtcacat ccgtcagctg gaaaaagacg atatcaagca 240 tatcgaagtt ccggttgagt acatcgcagg taaagtcgtc tctaaagact acgttgacga 300 atccactggc gagctgatct gcgcgg 326 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RpoB forward primer <400> 2 cgatccgaag gacaacctgt t 21 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RpoB reverse primer <400> 3 ctggctcagc ttagccagca 20

Claims (3)

1. 살모넬라 갈리나룸 약독주 SR2-N6(1-815)(수탁번호: KCTC 10513BP).
2. 제 1항의 미생물을 유효성분으로 함유하는 가금티푸스 예방용 백신 조성물.
3. 제 1항의 미생물을 유효성분으로 함유하는 사료첨가제.