JP4695602B2

JP4695602B2 - ストレプトコッカス・フォカエワクチン

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Publication number: JP4695602B2
Application number: JP2006541941A
Authority: JP
Inventors: フリセズ，ルツク; セーヘルス，ルート・フイリツプ・アントーン・マリア; ン，チヨウ・ヨー
Original assignee: インターベツト・インターナシヨナル・ベー・ベー
Priority date: 2003-12-03
Filing date: 2004-12-01
Publication date: 2011-06-08
Anticipated expiration: 2024-12-01
Also published as: DE602004006026D1; US7939088B2; CA2545470A1; CA2545470C; EP1706142B1; JP2007513124A; ATE359815T1; US20070128215A1; DK176668B1; US20090130142A1; DK200600871A; EP1706142A1; WO2005053716A1; AU2004294732A1; NO20062469L; AU2004294732B2

Description

本発明は、ワクチンの製造のためのストレプトコッカス・フォカエ（Ｓｔｒｐｔｐｃｏｃｃｕｓｐｈｏｃａｅ）種の細菌の使用、このようなワクチンの作製のための方法、ワクチンにおいて使用するためのストレプトコッカス・フォカエ種の細菌、及び魚におけるストレプトコッカス・フォカエ感染に対抗するための方法に関する。

最近、サケ、特にチリ沿海からのタイセイヨウサケ（サルモサラー（Ｓａｌｍｏｓａｌａｒ））において、新規の疾患が見出された。この疾患は、肛門に近い点状出血としての皮膚出血、並びに魚の両側のフルンケル及び筋肉に影響を与える病変、内出血、及び充血を特徴とする。発生は急性であり、しばしば、発生中の最初の所見は死亡率の増加であり、次いで、これが上記のような兆候と関係付けられ得る。発生は、１２月中旬から４月中旬の間に最も高頻度に見出され、水温が摂氏１３．５度を越えると死亡率が上昇する。発生が夏に開始した場合、おそらくこれは水温が摂氏１１度を下回る秋まで続くであろう。水の塩分と発生と間に関係はない。年齢感受性はなく、スモルト後（ｐｏｓｔｓｍｏｌｔｓ）から収穫前の魚が影響を受け得る。１２月には約４％、２月には８％、３月には１０から１５％という死亡率が見出されている。現在までのところ、この疾患は、タイセイヨウサケにのみ見出されており、ギンザケ又はニジマスのような他のサケ科魚には（未だ）見出されていない。しかしながら、この疾患の病原体はこれまで未知であった。

ここでこの疾患の病原体が同定されたこと、さらに、本発明がここでこの魚における疾患に対抗するためのワクチンを初めて提供することが、本発明の利点のうちの一つである。

驚くべきことに、新規の疾患の病原体がストレプトコッカス・フォカエ種の細菌であることがここで見出された。この細菌は、１９９４年頃に初めて見出され、当時は、アザラシジステンパーウイルス（ｐｈｏｃｉｎｅｄｉｓｔｅｍｐｅｒｖｉｒｕｓ）に罹患したアザラシにおける最終死因のうちの一つとして同定された。ウイルスにより大部分が影響を受けたアザラシの集団には、主としてゼニガタアザラシ（フォカ・ビツリナ（Ｐｈｏｃａｖｉｔｕｌｉｎａ））及びハイイロアザラシ（ハリオコエルス・グリプス（Ｈａｌｉｏｃｈｏｅｒｕｓｇｒｙｐｕｓ））が含まれていた。病気のアザラシから高頻度に単離された細菌は、ストレプトコッカス・フォカエという名称を与えられ、ＩｄａＳｋａａｒら（Ｉｎｔ．Ｊ．ｏｆＳｙｓｔｅｍ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．４４：６４６−６５０（１９９４））により広範に特徴決定されている。このように呼ばれる細菌の基準株は、受託番号ＮＣＴＣ１２７１９の下で、ＮａｔｉｏｎａｌＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎｏｆＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅｓ（ＮＣＴＣ），ＰＨＬＳＣｅｎｔｒａｌＰｕｂｌｉｃＨｅａｌｔｈＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，６１ＣｏｌｉｎｄａｌｅＡｖｅｎｕｅ，ＬｏｎｄｏｎＮＷ９５ＨＴ，ＵｎｉｔｅｄＫｉｎｇｄｏｍより、受託番号ＣＣＵＧ３５１０３の下で、ＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎｏｆｔｈｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＧｏｔｅｂｏｒｇ，ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＣｌｉｎｉｃａｌＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｅｎ，Ｇｕｌｄｈｅｄｓｇａｔａｎ１０，ＳＥ−４１３４６，Ｇｏｔｅｂｏｒｇ，Ｓｗｅｄｅｎより入手され得る。

この疾患は、イングランド、スコットランド、オランダ、ノルウェー、ドイツ、デンマーク、及びスウェーデンのような北東欧諸国から南アフリカの海にまで及ぶ多くの離れた場所において、及び南米の一部、即ちチリの沿海において、アザラシに見出されている。

明らかに哺乳動物の病原体であるこの細菌が、疾患を有する魚から単離され得ることは、驚くべきことであった。このようなことは、アフリカでも、南米でも、北東欧でも、世界の他の地域でも、認められていないし報告されていない。北東欧の至る所に大規模な商業的なサケ養殖が存在するという事実にもかかわらず、この魚における疾患は、これまで、北東欧ではなくチリからのみ報告されている。この疾患が世界の他の地域においてもサケ科の魚に影響を与え始めるのは、単に時間の問題である可能性が非常に高い。

さらに驚くべきことに、この細菌は、魚における原発病原体であると考えられること、即ち、健康な魚において疾患を引き起こし得ることが見出された。

最後に、この細菌が、ストレプトコッカス・フォカエ感染に対抗するためのワクチンの基礎を形成し得ることが見出された。

従って、本発明の一つの実施態様は、魚におけるストレプトコッカス・フォカエ感染に対抗するためのワクチンの製造のための、ストレプトコッカス・フォカエ種の細菌の使用に関する。

驚くべきことに、ストレプトコッカス・フォカエは、哺乳動物種から魚種に移動し得ることが見出されたため、最初の種はサケ科の群であったが、この細菌が他の魚種へも感染するのは、単に時間の問題である可能性が非常に高い。従って、好ましい実施態様において、ストレプトコッカス・フォカエ種の細菌は、サケ科の魚におけるストレプトコッカス・フォカエ感染に対抗するためのワクチンの製造のために使用される。

現在、最も深刻な問題はタイセイヨウサケにおいて認められているため、より好ましい実施態様において、ストレプトコッカス・フォカエ種の細菌は、タイセイヨウサケにおけるストレプトコッカス・フォカエ感染に対抗するためのワクチンの製造のために使用される。

ワクチンは、バクテリン（ｂａｃｔｅｒｉｎ）として、及び／又は生弱毒化型で、ストレプトコッカス・フォカエ種の細菌を含み得る。生弱毒化細菌とは、この野生型カウンターパートほど病原性ではないが、にもかかわらず、比較可能な免疫応答を誘導する細菌である。弱毒化株は、化学的突然変異誘発、紫外線等のような古典的な経路で、又は部位特異的突然変異誘発により入手され得る。バクテリンとは、ここで、不活化された型のストレプトコッカス・フォカエ種の細菌と定義される。当業者であれば、不活化のために使用される方法が、バクテリンの活性とはさほど関係がないことを承知するであろう。紫外線、ガンマ線、ホルマリン処理、二成分エチレンイミン、チメロサール等のような不活化のための古典的な方法は、全て、当技術分野において周知であり、適用可能である。例えば、フレンチプレスを使用した物理学的ストレスによる細菌の不活化は、本発明に係るワクチンの製造のための同等に適切な出発材料を提供する。バクテリンは、必ずしも、不活化された完全細胞の形態である必要はなく、細胞が破壊されていてもよい。

バクテリンは、生弱毒化細菌と比べて、極めて安全であるという利点を有する。従って、好ましい形態において、本発明は不活化されたストレプトコッカス・フォカエ菌の使用に関する。

本発明によって記載され製造されるようなワクチンは、当業者に周知の技術に従い、細菌培養物を出発原料として調製され得る。ワクチンは、基本的には、本発明に従い使用するための有効量の細菌と医薬適合性の担体とを含む。実施例セクションに、本発明に係るワクチンの調製の例が与えられる。

「有効」という用語は、ここで使用されるように、野生型ストレプトコッカス・フォカエにより感染された魚において同じ条件の下で認められる病原の５０％より低いレベルの病原をもたらす、標的の魚において免疫応答を誘導するのに十分な量と定義される。一般的に述べると、バクテリンに基づく、本発明に従い製造されたワクチンは、一般的に、１０^３から１０^１０、好ましくは１０^６から１０^９、より好ましくは１０^８から１０^９細菌という投与量で与えられ得る。１０^１０細菌を越える用量は、免疫学的には適切であるが、経済的理由によりあまり魅力的でなくなる。生弱毒化細菌に基づく、本発明に従い製造されたワクチンは、細菌が投与後にある一定の時間複製し続けるであろうという事実のため、より低い用量で与えられ得る。生弱毒化細菌に基づく、本発明に従い製造されたワクチンは、一般的に、１０^２から１０^８、好ましくは１０^３から１０^５細菌という投与量で与えられ得る。

本発明に係るワクチンにおいて特に適切な医薬適合性の担体の例は、滅菌水、生理食塩水、ＰＢＳのような水性緩衝液等である。さらに、下記のように、本発明に係るワクチンは、アジュバント、安定剤、抗酸化剤等のような他の添加剤を含み得る。

本発明において記載されたようにして製造されたワクチンは、好ましい提示において、免疫刺激物質、いわゆるアジュバントも含有し得る。アジュバントには、一般的に、非特異的に宿主の免疫応答を追加刺激する物質が含まれる。多数の異なるアジュバントが当技術分野において既知である。魚介類の養殖において高頻度に使用されるアジュバントの例は、ムラミルジペプチド、リポ多糖、いくつかのグルカン及びグリカン、並びにカルボポール（Ｃａｒｂｏｐｏｌ）（登録商標）である。魚介類ワクチンに適しているアジュバントの広範な概説は、ＪａｎＲａａによる概説論文（ＲｅｖｉｅｗｓｉｎＦｉｓｈｅｒｉｅｓＳｃｉｅｎｃｅ４（３）：２２９−２８８（１９９６））に与えられている。ワクチンは、いわゆる「媒体」も含み得る。媒体とは、細菌が、共有結合することなく付着する化合物である。このような媒体は、即ち、バイオマイクロカプセル、ミクロアルギン酸、リポソーム、マクロゾル（ｍａｃｒｏｓｏｌｓ）であり、これらは全て当技術分野において既知である。抗原が媒体に部分的に包埋されるこのような媒体の特別な型は、いわゆるＩＳＣＯＭ（欧州特許ＥＰ１０９．９４２、ＥＰ１８０．５６４、ＥＰ２４２．３８０）である。さらに、ワクチンは、一つ以上の適切な表面活性化合物又は乳化剤、例えば、スパン（Ｓｐａｎ）又はトゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）を含み得る。

油中水型エマルジョンにおいて使用するのに適している油性アジュバントは、例えば、鉱油又は代謝可能油である。鉱油は、例えば、ベイオール（Ｂａｙｏｌ）（登録商標）、マルコール（Ｍａｒｃｏｌ）（登録商標）、及びドラケオール（Ｄｒａｋｅｏｌ）（登録商標）である。代謝可能油は、例えば、落花生油及び大豆油のような植物油、魚油スクアラン及びスクアレン、並びにトコフェロール及びこの誘導体のような動物油である。適切なアジュバントは、例えば、ｗ／ｏ型エマルジョン、ｏ／ｗ型エマルジョン、及びｗ／ｏ／ｗ二重エマルジョンである。極めて適切なｏ／ｗ型エマルジョンは、例えば、５から５０％ｗ／ｗの水相及び９５から５０％ｗ／ｗの油性アジュバント、より好ましくは２０から５０％ｗ／ｗの水相及び８０から５０％ｗ／ｗの油性アジュバントを出発原料として得られる。

添加されるアジュバントの量は、アジュバント自体の性質に依って異なり、このような量に関する情報は、製造業者により提供されるであろう。

例えば、分解されやすいタンパク質を分解から防御するため、ワクチンの貯蔵寿命を増強するため、又は凍結乾燥効率を改良するため、ワクチンは、しばしば、安定剤と混合される。有用な安定剤は、即ち、ＳＰＧＡ（Ｂｏｖａｒｎｉｋら；Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ５９：５０９（１９５０））、炭水化物、例えば、ソルビトール、マンニトール、トレハロース、デンプン、ショ糖、デキストラン、又はグルコース、アルブミン又はカゼインのようなタンパク質又はこれらの分解生成物、及びアルカリ金属リン酸塩のような緩衝剤である。

好ましくは、記載されたようなワクチンは、凍結乾燥形態で提示される。

さらに、ワクチンは生理学的に許容される希釈剤に懸濁させられてもよい。アジュバントの添加、媒体化合物又は希釈剤の添加、タンパク質の乳化又は安定化の他の方式も、本発明において具現化されることは、言及するまでもない。

全て当技術分野において既知である多くの投与方式が適用され得る。記載されたようなワクチンは、好ましくは、例えば、腹腔内注射のような注射、液浸、噴霧、浸漬を介して、又は経口により魚へ投与される。しかしながら、投与経路もワクチンの型に依って異なり得ることを考慮するべきである。ワクチンが生弱毒化ストレプトコッカス・フォカエ菌を含む場合、これは、投与の容易さのため、浸漬により容易に投与され得る。他方、ワクチンがバクテリンの形態でストレプトコッカス・フォカエ菌を含む場合、又はより一般的に述べると、ワクチンがアジュバントを混和することにより改良され得る場合には、好ましい投与方式は腹腔内経路であろう。免疫学的な観点からは、腹腔内予防接種が、特にアジュバントの取り込みを可能にするため、バクテリンの場合には確実に、魚における予防接種の最も効果的な経路である。

投与プロトコルは、標準的な予防接種実務に従い最適化され得る。Ｂｏｗｄｅｎら（ＦｉｓｈｅｒｉｅｓＲｅｓｅａｒｃｈＳｅｒｖｉｃｅＭａｒｉｎｅＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ａｂｅｒｄｅｅｎ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ）により著述された魚予防接種の最近の概観は、ｗｗｗ．ｉｎｔｒａｆｉｓｈ．ｃｏｍより入手可能である。

明らかに、初期の段階においてストレプトコッカス・フォカエ感染に対する予防接種を行うことが望まれるであろうが、予防接種を受ける魚の齢は重大ではない。サケ科の魚のワクチンの多くが、魚がスモルト前（ｐｒｅ−ｓｍｏｌｔ）段階にあり、１５から３５グラムの重量を有している時に投与されている。これは、ストレプトコッカス・フォカエについての予防接種にとっても極めて適切な時期である。

経口投与の場合、ワクチンは、好ましくは、経口投与のための適切な担体、即ち、セルロース、アルファセルロースのような食物もしくは代謝可能物質、又は植物もしくは動物起源の種々の油と混合される。ワクチンを高濃度の生飼料（ｌｉｖｅ−ｆｅｅｄ）生物へ投与した後、この生飼料生物を魚へ与えるのも、魅力的な方法である。本発明に係るワクチンの経口送達のための特に好ましい食物担体は、ワクチンを封入することができる生飼料生物である。適切な生飼料生物には、プランクトン様の非選択的な濾過摂食生物、好ましくは、ロチフェラ（Ｒｏｔｉｆｅｒａ）、アーテミア（Ａｒｔｅｍｉａ）のメンバー等が含まれる。高度に好ましいのは、ブラインシュリンプ、アーテミアｓｐ．である。

ストレプトコッカス・フォカエ菌と共に、１種以上の他の魚病原性の細菌もしくはウイルス、又はこれら細菌もしくはウイルスの抗原を、ワクチンの製造のために使用することも有益であろう（従って、これは組み合わせワクチンになるであろう）。

有名な商業的に重要な魚病原体の例は、ビブリオ・オルダリー（Ｖｉｂｒｉｏｏｒｄａｌｉｉ）、ビブリオ・アングイラルム（Ｖｉｂｒｉｏａｎｇｕｉｌｌａｒｕｍ）セロタイプＯ１及びビブリオ・アングイラルムセロタイプＯ２のようなビブリオ種、アエロモナス・サルモニシダ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ）、フラボバクテリウム・コルムナラエ（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｃｏｌｕｍｎａｒａｅ）、テナシバキュラ・ムマリチマム（Ｔｅｎａｃｉｂａｃｕｌｕｍｍａｒｉｔｉｍｕｍ）、エドワードシエラ・イクタルリ（Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａｉｃｔａｌｕｒｉ）及びエドワードシエラ・ターダ（Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａｔａｒｄａ）のようなエドワードシエラ種、フォトバクテリウム・ダムセラエ（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｄａｍｓｅｌａｅ）亜種ピスシディダ（ｐｉｓｃｉｄｉｄａ）、フラボバクテリウム・サイクロフィラム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｕｍ）、ピスシリケッチア・サルモニス（Ｐｉｓｃｉｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｓａｌｍｏｎｉｓ）、モリテラ・ビスコサ（Ｍｏｒｉｔｅｌｌａｖｉｓｃｏｓａ）（以前は、ビブリオ・ビスコサス（Ｖｉｂｒｉｏｖｉｓｃｏｓｕｓ）として知られていた）、エルシニア・ルッケリ（Ｙｅｒｓｉｎｉａｒｕｃｋｅｒｉ）、ビブリオ・サルモニシダ（Ｖｉｂｒｉｏｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ）、伝染性膵臓壊死症ウイルス（ＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓＰａｎｃｒｅａｔｉｃＮｅｃｒｏｔｉｃＤｉｓｅａｓｅｖｉｒｕｓ）（ＩＰＮＶ）、伝染性サケ貧血症ウイルス（ＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓＳａｌｍｏｎＡｎａｅｍｉａｖｉｒｕｓ）（ＩＳＡＶ）並びにサケ膵臓病ウイルス（ＳａｌｍｏｎＰａｎｃｒｅａｔｉｃＤｉｓｅａｓｅｖｉｒｕｓ）（ＳＰＤＶ）である。

このような組み合わせワクチンの利点は、ストレプトコッカス・フォカエに対する防御のみならず、他の疾患に対する防御も提供する点である。従って、好ましい実施態様において、ストレプトコッカス・フォカエ種の細菌は、１種以上の他の魚病原性の細菌もしくはウイルス、又はこれら細菌もしくはウイルスの抗原と共に、ワクチンの製造のために使用される。より好ましい実施態様において、魚病原性の細菌もしくはウイルス、又はこれら細菌もしくはウイルスの抗原は、上述のような有名な商業的に重要な魚病原体の群より選択される。

一例に過ぎないが、（ストレプトコッカス・フォカエに加え）アエロモナス・サルモニシダ菌又はこの抗原性サブユニット及びウイルス抗原としての伝染性膵臓壊死症ウイルス（ＩＰＮＶ）を含む組み合わせワクチンは、フルンケル症、膵臓壊死、及びストレプトコッカス・フォカエ感染に対する防御を同時に行うであろう。このような組み合わせワクチンの有用な成分になるであろう他の重要なウイルス抗原は、伝染性サケ貧血症ウイルス（ＩＳＡＶ）及びサケ膵臓病ウイルス（ＳＰＤＶ）又はこれらのウイルスの抗原性サブユニットである。ウイルス抗原は、完全ウイルスであってもよいし、又は、例えば、ＩＰＮウイルスＶＰ２タンパク質のようなウイルスのサブユニットのみであってもよい。この場合、ウイルス抗原は完全ウイルスに由来すべきと言われる。

極めて適切な組み合わせワクチンの例は、ストレプトコッカス・フォカエの次に、ＩＰＮ−ＶＰ２と共にビブリオ・サルモニシダ及びアエロモナス・サルモニシダも含むワクチンである。このようなワクチンは、ビブリオ病、伝染性膵臓壊死、フルンケル症、及びストレプトコッカス・フォカエ感染に対する防御を提供する。

ストレプトコッカス・フォカエの次に、サケ科の魚における三つの最も多い疾患が、非定型（ａ−ｔｙｐｉｃａｌ）フルンケル症、ピスシリケッチア・サルモニス（ＳＲＳ）、及び伝染性膵臓壊死であるチリの場合、好ましいワクチンは、本発明に係るストレプトコッカス・フォカエワクチン成分に加え、アエロモナス・サルモニシダ成分、抗リケッチア成分、及びウイルス抗原としてのＩＰＮ−ＶＰ２を含むであろう。

他の高度に好ましい組み合わせワクチンは、ストレプトコッカス・フォカエ成分に加え、以下の種のうちの少なくとも二つ、好ましくはそれ以上を含むワクチンである：ビブリオ・アングイラルムセロタイプＯ１、ビブリオ・アングイラルムセロタイプＯ２、アエロモナス・サルモニシダ、モリテラ・ビスコサ、エルシニア・ルッケリ、ビブリオ・サルモニシダ、及びＩＰＮＶ−ＶＰ２。

本発明のもう一つの実施態様は、ワクチンにおいて使用するためのストレプトコッカス・フォカエ種の細菌に関する。

本発明のさらにもう一つの実施態様は、魚におけるストレプトコッカス・フォカエ感染に対抗するためのワクチンの作製のための方法に関する。このような方法は、弱毒化又は不活化された型の生ストレプトコッカス・フォカエ菌と医薬適合性の担体との混合を含む。この実施態様の好ましい形態は、アジュバントの混合をさらに含む方法に関する。

最後に、本発明の実施態様は、弱毒化又は不活化された型の生ストレプトコッカス・フォカエ菌と医薬適合性の担体との混合を含む方法によって得られたワクチンを、有効量、魚へ投与することを含む、魚におけるストレプトコッカス・フォカエ感染を防止し、及び／又はこれに対抗するための方法に関する。「有効」という用語は、ここで使用されるように、野生型ストレプトコッカス・フォカエにより感染された魚において同じ条件の下で認められる病原の５０％より低いレベルの病原をもたらす、標的の魚において免疫応答を誘導するのに十分なワクチンの量と定義される。

生化学的関連性に基づく、魚及びアザラシから単離された７７のストレプトコッカス種及び他のグラム陽性種の「関連距離（ｌｉｎｋｉｎｇｄｉｓｔａｎｃｅ）」の決定。試験された株の中には、チリにおいて疾患を有するサケ科の魚から単離されたストレプトコッカス・フォカエ単離物が含まれている。

チリストレプトコッカスｓｐ．株
ＩＮＳ／ＡＳ−コード
ＡＳ９６８
ＩＮＳ２４８
ＡＳ９７２
ＡＳ９７３
ＡＳ９７０

単離された株からＩＮＳ／ＡＳコード
２００１年２月タイセイヨウサケ、１．５００ｇＡＳ９６０
２００２年３月タイセイヨウサケ、２．０００ｇＡＳ９５８
２００３年３月タイセイヨウサケ、１．５００ｇＡＳ９５９

これらの株は異なる養殖場から単離された。株は、高い死亡率をもたらした、汽水及び海水で培養されたタイセイヨウサケにおける春及び夏の発生から単離された。

カルチャーコレクションより得られた基準株
株説明ＩＮＳ／ＡＳコード
ＣＣＵＧ３５１０３基準株ＡＳ９６９
ＣＣＵＧ３５１０４参考株ＡＳ９７１
ＣＣＵＧ３５１０５参考株ＡＳ９８０

Ｓｋａａｒら，１９９４（前記参照）に記載された、ＩｄａＳｋａａｒＮｏｒｗａｙ（２００３年８月１８日）により肺炎に罹患したアザラシより単離され、このアザラシから得られた株：

株説明ＩＮＳコード
７９０８Ｐ２ＡＳ９７４
８０２６Ｌ２ＡＳ９７５
８０５６Ｐ２ＡＳ９７６
８０５９Ｐ２ＡＳ９７７
８２０５Ｈ２ＡＳ９７８
８２５２ＡＳ９７９

同定
全ての株（チリ株、Ｓ．フォカエの基準株及び参考株、並びに残りのノルウェーからの寄託されていない株）を、４６の表現型的及び形態学的な試験（グラム反応、カタラーゼ反応、オキシダーゼ反応、溶血、４０％胆汁酸塩上での増殖、ゼラチナーゼ産生、ＡＰＩ（ＡＰＩ２０ＳｔｒｅｐテストキットＢｉｏＭｒｉｅｕｘ）、酸化／発酵被験（ｗ＆ｗ／ｏ油）、クリグラー三重糖（ＫｌｉｇｌｅｒＴｒｉｐｌｅＳｕｇａｒ）反応（乳糖、グルコース、ガス産生、Ｈ_２Ｓ産生）、アミグダリン、ガラクトース、グリセロール、マルトース、メリビオース、メリジトース（Ｍｅｌｉｚｉｔｏｓｅ）、ショ糖、硝酸の発酵、ｐＨ９．６、６．５％塩における増殖、３％塩に対する耐性、インドール産生、及び運動性）において同定した。得られた同定プロファイルを、魚病原性グラム陽性菌種（ストレプトコッカス・アガラクチアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓ．ディフィシル（ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、Ｓ．イニアエ（ｉｎｉａｅ）、カルノバクテリウム・ピスシコラ（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｐｉｓｃｉｃｏｌａ）、バゴコッサス・サルモニナルム（Ｖａｇｏｃｏｓｓｕｓｓａｌｍｏｎｉｎａｒｕｍ）、ノカルディア・セリオラエ（Ｎｏｃａｒｄｉａｓｅｒｉｏｌａｅ）、及びラクトコッカス・ガルビエアエ（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｇａｒｖｉｅａｅ））、並びにＳ．ミュータンス（ｍｕｔａｎｓ）、Ｓ．ズーエピデルミクス（ｚｏｏｅｐｉｄｅｒｍｉｃｕｓ）、及びＳ．エクイ（ｅｑｕｉ）の参考株を含有している既存のデータマトリックスに組み込み、ＵＰＧＭＡ分析を使用して類似性を計算した。この系統樹分析の結果は、図１中の樹状図に表される。ＩＮＳ２４８からＡＳ９５８まで（これらも含む）の列の中の全ての株が、同一クラスタに属する、即ち、Ｓ．フォカエ種に属する。表現型的及び形態学的な試験に基づき、チリから単離された株は、ノルウェーにおいて肺炎を有するアザラシから初めに単離された株と区別不能である。

結論：ストレプトコッカス疾患の病原体としてチリにおいてタイセイヨウサケから単離された細菌株は、生化学的関連性に基づき、ストレプトコッカス・フォカエとして同定された。

１６ＳｒＲＮＡ配列分析に基づく、Ｓ．フォカエ株及び他のストレプトコッカス株の系統学的距離の決定。ストレプトコッカス・フォカエ基準参考株ＮＣＴＣ１２７１９、並びにチリにおいて疾患を有するサケ科の魚から単離された二つのストレプトコッカス・フォカエ単離物（ＡＳ９７２及びＡＳ９７３）に対して、１６ＳｒＲＮＡ配列分析を実施した。Ｓ．フォカエ基準株、二つのチリ単離物、及び他のストレプトコッカス種のいくつかのメンバー：Ｓ．ディスガラクチアエ（ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ）、Ｓ．イニアエ（ｉｎｉａｅ）、及びＳ．アガラクチアエ（ａｇａｌａｃｔｉａｅ）を比較した。１６ＳｒＲＮＡ配列は、Ｋｕｈｎｅｒｔら（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，４６；１１７４−１１７６（１９９６））により記載されたようにして決定した。両方の株について、およそ１４１０ｎｔの配列を得た。これらの配列を、ＢｌａｓｔＮソフトウェアを使用して、利用可能なヌクレオチド配列データベースと比較した。スコアが最も高い配列を、以下の設定でベクター（Ｖｅｃｔｏｒ）ＮＴＩソフトウェアパッケージ（ＩｎｆｏｒｍａｘＩｎｃ．）の中のクラスタル（Ｃｌｕｓｔａｌ）Ｘを使用して整列化した：対整列化及び多重整列化の両方について、ギャップ開始ペナルティ（ｇａｐｏｐｅｎｉｎｇｐｅｎａｌｔｙ）１５及びギャップ伸長ペナルティ（ｇａｐｅｘｔｅｎｓｉｏｎｐｅｎａｌｔｙ）６．６６。樹の構築のため、Ｓａｕｔｏｕ，Ｎ．及びＮｅｉ，Ｍ．による近隣結合（Ｎｅｉｇｈｂｏｒ−Ｊｏｉｎｉｎｇ）法を使用した（近隣結合法：系統樹を再構築するための新たな方法（Ｔｈｅｎｅｉｇｈｂｏｒ−ｊｏｉｎｉｎｇｍｅｔｈｏｄ：ａｎｅｗｍｅｔｈｏｄｆｏｒｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｔｒｅｅｓ）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．４，４０６−４２５（１９８７））。ギャップを含む位置は分析から排除した。様々なストレプトコッカス株の関連性を示す系統樹を図２に与える。

結論：図２より一見して明らかなように、チリ単離物ＡＳ９７２及びＡＳ９７３はＳ．フォカエ株と同じ分枝内にある。これは、アザラシ及び魚からの様々なＳ．フォカエ単離物の生化学的関連性を表す図１の統計樹の結果及び結論と完全に一致する。

アジアシーバス（ラテス・カルカリファー（Ｌａｔｅｓｃａｌｃａｒｉｆｅｒ））における安全性試験及び血清転換
まず、Ｓ．フォカエに対して感受性でない魚種においてＳ．フォカエワクチンの安全性及び血清転換を試験することを決定した。

ワクチン調製：
３２℃で、施回シェーカー（１２９ＲＰＭ）上で、ＳＧＭ５×グルコース培地において、２２．５時間、ＡＳ９７２株を培養することにより、粗ワクチンを調製した。インキュベーション後、得られた総数は２．９×１０^９細胞／ｍｌであった。培養物を０．５％ホルマリンにより不活化し、続いて、遠心分離により１．５×１０^１０細胞／ｍｌの最終濃度にまで濃縮した。細菌細胞を培養上清に再懸濁させた。

予防接種：
計５６匹の魚（アジアシーバス）に、０．１ｍｌの上記のワクチンを腹腔内（ＩＰ）注射し、５５匹の魚にＰＢＳを注射した。後者の群は対照として使用した。実験開始時、予防摂取を受けた魚及び対照魚の平均重量はそれぞれ１９．７及び２０．１グラムであった。死亡は予防接種直後には存在しなかった。予防摂取を受けた魚及び対照魚は、同じ水槽内で維持し、水槽の中央に置かれた垂直分離網によって分離した。

安全性評価：
予防接種後、計２１日間、魚を観察した。この期間中、対照群においても予防接種群においても死亡は存在しなかった。予防摂取魚及び対照魚の観察期間終了時の平均魚重量は、それぞれ２５．７及び２５．０グラムであった。調製されたワクチンはアジアシーパスにとって安全であったと結論付けることができる。

病原性評価：
チャレンジモデルを生ストレプトコッカス・フォカエ株のＩＰ注射により評価した。

ＡＳ９７２／ＡＳ９６０（５×１０^４、５×１０^６及び５×１０^７ＣＦＵ／ｆｉｓｈ）
試験されたいずれの細菌濃度／株でも死亡が得られず、シーバスがＳ．フォカエ感染に対して感受性でないことが見出された。従って、ワクチンの効力は、アジアシーバスでは評価し得ない。

血清転換：
図３中の表から直接明らかなように、水性ワクチンによる初回予防接種から３週間後に得られた血清転換は、既に、生ストレプトコッカス・フォカエによるチャレンジから３週間後に見出された血清転換の約８０％であった。水性ワクチンによる初回予防接種から３週間後の追加予防接種は、チャレンジ後と等しい力価を与えた。水／油型エマルジョンに基づくワクチンによる初回予防接種から３週間後の追加予防接種は、チャレンジ後よりわずかに低い力価を与えた。これは、水／油型エマルジョンに基づくワクチンで一般的に認められる正常な効果であり、追加刺激効果は、水性ワクチンと比較してより長い期間の後に認められるであろう。血清転換は以下のように決定した：ストレプトコッカス・フォカエを１０^７細菌／ウェルでＮＵＮＣＭａｘｉｓｏｒｂに一晩コーティングした。ＥＬＩＳＡは、ヨーロッパシーバスＩｇＭ（アジアシーバスＩｇＭと交差反応性）の軽鎖に対するマウスモノクローナル抗体を使用し、続いて、ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウス抗体と共にインキュベートすることにより現像した。力価はＯＤ_４５０読み取り値として表される。

結論：単回予防接種ですら、既に、チャレンジされた魚に見出されるものに近い抗体力価を誘導することができ、追加予防接種は、チャレンジされた魚に見出されるものと等しい抗体力価を与える。

タイセイヨウサケにおける安全性試験及び血清転換
ワクチン調製：
実施例３に記載されたようにして、ワクチンを調製した。

予防接種：
計２５０匹の魚（タイセイヨウサケ）に、上記のワクチン０．１ｍｌを腹腔内（ＩＰ）注射し、１３０匹の魚にＰＢＳを注射した。後者の群は対照として使用した。実験開始時、予防接種を受けた魚及び対照魚の平均重量は２８グラムであった。死亡は予防接種直後には存在しなかった。予防接種を受けた魚及び対照魚を、パンジェットラベリング（Ｐａｎｊｅｔｌａｂｅｌｉｎｇ）により標識し、同じ水槽内に維持した。

安全性評価：
予防接種後、計４２日間、魚を観察した。この期間中、対照群にも予防接種群にも死亡は存在しなかった。異常行動は認められなかった。ワクチンはタイセイヨウサケにとって安全であると結論付けることができる。チャレンジは、１匹当たり１．５×１０^９ＣＦＵの生ストレプトコッカス・フォカエを用いて実施される。

血清転換：
ホルマリンにより不活化されたストレプトコッカス・フォカエ株ＩＮＳ９７２を、コーティング緩衝液で１０^７細菌／ｍｌに希釈した。続いて、０．１ｍｌを９６穴ＮＵＮＣＭａｘｉｓｏｒｂプレートの個々のウェルに添加し、２から８℃で一晩インキュベートし、３回洗浄した。次いで、ウェルをサケ血清の段階希釈物と共にインキュベートした。続いて、結合した抗体を、ウサギ抗サケＩｇＧ、ＨＲペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ、及びペルオキシダーゼ基質を使用して定量した。力価はＯＤ_４９２読み取り値として表される。

図４から直接明らかなように、水性ワクチンによる予防接種は、６週間後に５００％という相対的な力価の増加を与え、ｗ／ｏ型エマルジョンに基づくワクチンは、２００％という相対的な力価の増加を与える。

結論：水性ワクチンによる単回予防接種は、予防接種から６週間後に、生理食塩水を注射された対照群と比較して、およそ５００％抗体レベルを増加させることができた。同じ予防接種スケジュールで水／油型エマルジョンに基づくワクチンを使用した場合には、遅れた開始が観察され、抗体レベルは、生理食塩水を注射された対照群と比較して、およそ２００％増加した。

生化学的関連性に基づく、魚及びアザラシから単離された７７のストレプトコッカス種及び他のグラム陽性種の系統樹。１６ＳｒＲＮＡ配列分析に基づく、Ｓ．フォカエ株（参考株ＮＣＴＣ１２７１９及び二つの魚からのチリストレプトコッカス・フォカエ単離物）及び他のストレプトコッカス株の系統樹。シーバスにおけるＳ．フォカエの予防接種／チャレンジの後のＥＬＩＳＡ測定。タイセイヨウサケにおけるＳ．フォカエの予防接種／チャレンジの後のＥＬＩＳＡ測定。

Claims

魚におけるストレプトコッカス・フォカエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｈｏｃａｅ）感染に対抗するためのワクチンの製造のためのストレプトコッカス・フォカエ種の細菌の使用。
魚がサケ科に属することを特徴とする、請求項１に記載の使用。
魚がタイセイヨウサケであることを特徴とする、請求項２に記載の使用。
ストレプトコッカス・フォカエ種の細菌が不活化された型であることを特徴とする、請求項１から３に記載の使用。
ワクチンの製造のため、付加的な魚病原性の微生物もしくはウイルス又はこれらの抗原が使用されることを特徴とする、請求項１から４に記載の使用。
付加的な魚病原性の微生物又はウイルスが、ビブリオ・オルダリー（Ｖｉｂｒｉｏｏｒｄａｌｉｉ）、ビブリオ・アングイラルム（Ｖｉｂｒｉｏａｎｇｕｉｌｌａｒｕｍ）セロタイプＯ１、ビブリオ・アングイラルムセロタイプＯ２、アエロモナス・サルモニシダ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ）、フラボバクテリウム・コルムナラエ（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｃｏｌｕｍｎａｒａｅ）、フレキシバクター・マリチマム（Ｆｌｅｘｉｂａｃｔｅｒｍａｒｉｔｉｍｕｍ）、エドワードシエラ・イクタルリ（Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａｉｃｔａｌｕｒｉ）、エドワードシエラ・ターダ（Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａｔａｒｄａ）、フォトバクテリウム・ダムセラエ（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｄａｍｓｅｌａｅ）亜種ピスシディダ（ｐｉｓｃｉｄｉｄａ）、フラボバクテリウム・サイクロフィラム（Ｆｌａｂｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｕｍ）、モリテラ・ビスコサ（Ｍｏｒｉｔｅｌｌａｖｉｓｃｏｓａ）、ピシリケッチア・サルモニス（Ｐｉｓｃｉｒｉｋｅｔｔｓｉａｓａｌｍｏｎｉｓ）、エルシニア・ルッケリ（Ｙｅｒｓｉｎｉａｒｕｃｋｅｒｉ）、ビブリオ・サルモニシダ（Ｖｉｂｒｉｏｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ）、伝染性膵臓壊死症ウイルス（ＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓＰａｎｃｒｅａｔｉｃＮｅｃｒｏｔｉｃＤｉｓｅａｓｅｖｉｒｕｓ）、伝染性サケ貧血症ウイルス（ＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓＳａｌｍｏｎＡｎａｅｍｉａｖｉｒｕｓ）、及びサケ膵臓病ウイルス（ＳａｌｍｏｎＰａｎｃｒｅａｔｉｃＤｉｓｅａｓｅｖｉｒｕｓ）の群より選択されることを特徴とする、請求項５に記載の使用。
ワクチンの製造のため、付加的にアジュバントが使用されることを特徴とする、請求項１から６に記載の使用。
ワクチンが凍結乾燥形態であることを特徴とする、請求項１から７に記載の使用。
ストレプトコッカス・フォカエ種の細菌を含む、魚におけるストレプトコッカス・フォカエ感染に対抗するためのワクチン。
弱毒化又は不活化された型のストレプトコッカス・フォカエ種の生細菌と医薬適合性の担体とを混合することを含む、魚におけるストレプトコッカス・フォカエ感染に対抗するためのワクチンの作製のための方法。
請求項１０の方法により得られたワクチンを、有効量、魚に投与することを含む、魚におけるストレプトコッカス・フォカエ感染に対抗するための方法。