KR100735038B1 - 스쿠티카충에 대한 재조합 단백질 백신 및 이를 이용한스쿠티카증의 예방 및 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 스쿠티카충에 대한 재조합 단백질 백신 및 이를 이용한 스쿠티카증의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로, 스쿠티카충의 섬모단백질의 38kDa의 재조합 항원단백질을 제작하여 이 콜라이에서 발현시킨 백신을 넙치에 면역시킨 결과 효과적으로 넙치를 면역시킬 뿐만 아니라 스쿠티카증을 예방 및 치료하는 뛰어난 효과를 나타내었다. 따라서, 본 발명은 양식어의 병원성 기생충의 감염을 예방 및 치료할 수 있다.

스쿠티카충, 재조합 단백질 백신, 섬모단백질, 넙치, 스쿠티카증

Description

스쿠티카충에 대한 재조합 단백질 백신 및 이를 이용한 스쿠티카증의 예방 및 치료용 조성물{Recombinant protein vaccine to Miamiensis avidus and compound for preventing and treating Scuticociliatosis using the vaccine}

도 1은 03-E10 클론의 1035 염기쌍(라인 1)과 이로부터 추정되는 아미노산 서열(라인 2)을 나타낸 것이다.

도 2는 pMAL-c2x 벡터를 이용하여 유도된 단백질의 SDS-PAGE 결과를 도시한 젤 사진도이다(이때, 1은 마커, 2는 유도하지 않은 단백질, 3과 4는 유도된 단백질을 반복해서 로딩하여 나타냄).

도 3은 발현된 단백질을 정제한 결과를 도시한 젤 사진도이다(이때, 1은 마커, 2는 정제된 단백질을 나타냄).

도 4는 발현된 재조합 단백질의 웨스턴 블랏팅 결과를 도시한 젤 사진도이다.

도 5는 스쿠티카충에 감염된 넙치에 본 발명 재조합 단백질 백신을 처리한 후 넙치의 폐사율을 조사한 그래프이다.

도 6은 본 발명 재조합 단백질 백신으로 면역된 넙치의 혈청의 스쿠티카충에 대한 항체가를 조사한 그래프이다.

본 발명은 스쿠티카충에 대한 재조합 단백질 백신 및 이를 이용한 스쿠티카증의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다. 보다 상세하게는 본 발명은 스쿠티카충의 섬모 단백질에서 항원단백질의 염기서열 및 아미노산 서열을 규명하고 백신으로 제조한 다음 넙치에서 백신의 효능을 조사함으로써 이를 이용한 스쿠티카증에 대한 예방 빛 치료용 조성물에 관한 것이다.

스쿠티카충은 우리나라의 대표적 양식어류인 넙치에 빈번하게 발생하며, 어린 시기에 발생하면 폐사율이 아주 높고, 성어에 발생할 경우에도 양식환경 내에 유기물이 많거나 다른 질병과 복합감염이 일어날 경우에는 폐사율이 높다. 스쿠티카충은 아가미, 체표와 지느러미에 기생하여 조직이 붕괴되며, 증상이 진행되면 근육이 노출되고 뇌와 각종 내장기관에까지 침투하여 조직의 괴사를 일으킨다.

스쿠티카충을 구제하기 위하여 포르말린이 주로 사용되고 있으나 200ppm 이상의 스쿠티카충을 구제할 수 있는 농도는 넙치에 심한 스트레스를 주며, 체내에 침투하고 있는 충은 구제가 불가능하다. 담수욕이나 키토산 등도 시도되고 있으나 뚜렷한 효과는 없어 현재로서는 스쿠티카충에 유효한 예방과 구제방법이 없다. 세균이나 바이러스성 질병에 대한 대책으로 항생제와 항바이러스성 물질과 함께 질병의 예방을 위한 백신이 개발되고 있으나 기생충에 대해서는 시험관내에서 배양이 어려워 대량의 항원을 얻기가 힘들고 충체의 항원성에 대해서도 불명확한 점이 많아 몇몇의 한정된 인체와 가축의 기생충에 있어서만 백신이 개발되어 있고, 어류에 있어서의 기생충백신은 전무한 실정이다.

어류질병의 치료목적으로 사용되는 약제와 약품의 인체에의 안정성과 환경에의 부하가 문제시되면서 어류 스스로의 면역체계를 이용한 백신의 개발과 사용에 대한 관심과 필요성이 대두되고 있다. 어류에 기생하는 기생충에 대한 백신은 담수산 백점충(Ichthyophthirius multifiliis), 아밀로디니움 오셀라툼(Amyloodinium ocellatum)과 크립토비아 살모시티카(Cryptobia salmositica)에 대하여 연구가 진행되고 있으며, 그 효과가 긍정적인 것으로 평가되고 있다. 스쿠티카충은 담수산 백점충(Ichthyophthirius multifiliis)와 같은 섬모충에 속하지만, 이분열로 증식하므로 생활사에 따라 항원단백질이 변화하지 않으며, in vitro 에서의 대량배양이 가능하여 백신으로서의 효능이 검증되면 대단위의 적용이 용이한 이점이 있다.

따라서, 본 발명의 목적은 EST분석을 통하여 넙치에 스쿠티카증을 유발하는 스쿠티카충의 유전자구조, 발현패턴 및 기능을 조사하여 충체에 대한 유전정보를 밝힘과 동시에 백신의 후보유전자를 검색하고 새로운 약제 개발을 위한 정보로 사용하고자 한다.

본 발명의 다른 목적은 EST분석의 결과 검색된 백신의 후보유전자와 38 kDa 항원 단백질을 구성하는 유전자를 대상으로 재조합 단백질 백신을 개발하고 넙치에서의 효능을 검정하고자 한다.

본 발명의 상기 목적은 스쿠티카충에 대한 백신 제조를 위해 항원단백질의 염기서열 및 아미노산 서열을 규명하고, 상기 항원단백질을 발현벡터에 삽입하여 이 콜라이에서 발현시킨 다음, 넙치에서 공격감염과 ELISA 항체가 조사를 통해 백신 효능을 실험함으로써 달성하였다.

이하, 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.

본 발명은 스쿠티카충에 대한 백신 제조를 위한 항원단백질의 아미노산 서열 확인단계; 상기 항원단백질을 이용한 백신제조단계; 및 상기 백신의 효능실험단계로 구성된다.

본 발명은 서열목록 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 이용하여 스쿠티카증의 예방 및 치료를 위한 재조합 단백질 백신을 제공함을 특징으로 한다.

또한, 본 발명의 재조합 단백질 백신을 어체당 10∼50㎍의 농도로 포함하는 스쿠티카증의 예방 및 치료용 조성물을 제공함을 특징으로 한다.

이하, 본 발명의 구체적인 방법을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하지만 본 발명의 권리범위는 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1: 스쿠티카충에 대한 재조합 단백질 백신제조를 위한 항원단백질의 규명

스쿠티카충에 대한 재조합 단백질 백신을 제조하기 위한 항원단백질을 규명하기 위해 스쿠티카충에서 mRNA를 분리하여 cDNA 라이브러리를 제조한 다음, EST 염기서열을 확인 및 분석하고 백신후보클론의 3' 말단의 염기서열을 확인하여 38kDa의 항원단백질의 아미노산 서열을 확인하였다.

이를 위해, 본 발명자들은 넙치 병어에서 분리한 스쿠티카충의 YS-1 스트레인을 어류의 주화세포인 CHSE-214(chum salmon embryo) 세포에서 대량배양하여 원심분리한 후 총 2g의 충체를 모아 총 RNA를 추출하고, Poly(A)⁺ RNA법으로 mRNA를 분리한 후 cDNA를 합성하였다.

합성된 cDNA는 Uni-ZAP XR(Stratagene) 벡터로 클로닝하여 Gigapack Ⅲ Gold로 패킹(packing)하고 아가로우즈 젤로 인서트의 사이즈를 확인하였다(도 1 참조). 라이브러리는 host XL1-Blue-MRF'(Stratagene)에 증폭시켜 매스 엑시젼(mass excison)을 행하여　SOLR 세포에서 역가를 측정하였다(표 1 참조).

파지미드 라이브러리의 타이터

	저 증폭 파지미드 라이브러리(Low amplification phagemid library)
파지 수율(phage yeild)(cfu/㎖)	2.8×105
총 파지 수율(cfu/30㎖)	1.12×107
증폭(cfu/plaque)	11.2

5' 말단의 염기서열(EST 염기서열)은 PRISM BigDye Terminator kit(PE Biosystem)을 이용하여 ABI Prism 377 DNA sequencer(Perkin-Elmer)로 수행하여 확인하였다. 벡터 부분을 제외한 EST 염기서열을 BLASTN, BLASTS, COGnitor 프로그램을 이용하여 GenBank의 데이터와 비교 분석하였다.

BLASTX 검색 결과 항원으로 작용할 것으로 생각되는 후보유전자는 클론의 3말단의 염기서열을 확인하였다. 그 중 5' 말단과 3' 말단의 염기서열이 겹쳐지는 부분이 있는 클론들은 표 2에 정리하였다.

5' 말단 및 3' 말단 사이에 삽입된 전체 cDNA 서열

명칭(길이)	유전자(5'-3')	evalue	상동성
YUCD01-01-03-E10-T3-T7 (1035 letters)	gi|3452505|emb|CAA09180.1| surface antigen G [Paramecium tetraurelia] Length=2721	1e-07	26
	gi|1752673|emb|CAA65264.1| alpha-51D immobilization antigen [Paramecium tetraurelia]	1e-07	35
YUCD01-03-G01-T3-T7 (920 letters)	gil33518699lgblAAQ20832.1l antigen-5-like protein precursor [Rhodnius prolixus]	1.00E-20	37
	gil39579904emblCAE56318.1l Hypothetical protein CBG23993 [Caenorhabditis briggsae]	1.00E-19	35
YUCD01-09-G06-T3-T7 (940 letters)	gil1581004lgbAAF18411.1l putative integral membrane protein [Phaseolus vulgaris]	3.00E-95	58
	gil15219258reflNP-177993.1l protein transport protein sec61, putative [Arabidopsis thaliana]	5.00E-93	58
YUCD01-09-H03-T3-T7 (721 letters)	gil27462991gblAAN52106.1l variant-specific surface protein AS3 [Giardia intestinalis]	4.00E-19	32
YUCD01-12-H09-T3-T7 (627 letters)	gil27462991gblAAN52106.1l variant-specific surface protein AS3 [Giardia intestinalis]	4.00E-13	32

본 발명자들의 선행연구로부터 스쿠티카충의 38kDa의 섬모에 존재하는 단백질이 항원으로 작용함이 밝혀진바, 섬모 단백질을 12% SDS-PAGE을 이용하여 분자량의 크기에 따라 분리한 후, 웨스턴 블랏팅을 위한 gel-PVDF 멤브레인-블랏팅 페이퍼 샌드위치(gel-PVDF membrane-blotting paper sandwich)를 제작하여 75V에서 45분 블랏팅하였다. 멤브레인을 50% 메탄올, 0.1% 쿠마시블루 R에 5분간 염색한 다음 50% 메탄올, 10% 아세트산을 이용하여 여러 번 탈염(destaining)하였다. 멤브레인을 플라스틱 백(plastic bag)에 넣어 기초과학지원연구센터에 N-말단으로부터 15개의 아미노산 서열을 의뢰하였다.

확인한 아미노산 서열은 X-X-D-F-K-L-P-G-T-E-A-L-V-N-I이였으며 최초의 2개는 판독이 불가능하여 총 13개의 N말단의 아미노산 서열을 알 수 있었다(도 1). EST 클론의 염기서열을 아미노산 서열로 치환하여 확인된 38kDa의 아미노산 서열과 상동성을 가진 클론을 검색하여 YUCD01-03-E10번 클론을 선택하였다. YUCD01-03-E10클론의 핵산 염기서열과 합성한 아미노산 서열, 그리고 38kDa 단백질의 N-말단 아미노산 서열을 도 1에 나타내었다. 도 1에서 밑줄은 합성된 서열(885 염기쌍), 종결코돈의 T는 C로 치환하였으며, 굵은 글씨체는 pMAL-c2x 벡터에 삽입한 서열, *는 푸른색의 N-말단 아미노산 서열을 나타낸다.

이중 5' 말단에서 읽은 염기서열 정보는 GenBank에 등록하였으며, 2006년 1월 1일자로 공개되었고, GenBank accession no.는 DR981578이다.

실시예 2: 항원단백질의 이 콜라이 ( E. coli ) 에서의 발현

상기 실시예 1에서 확인한 38kDa의 항원단백질을 이 콜라이(E.coli)에서 발현시켜 발현단백질의 항원성을 실험하였다.

이를 위해, 스쿠티카충의 글루타민을 코딩하는 TAA와 TAG는 유니버셜 제네틱 코드(universal genetic code)인 경우 종결코돈으로 작용하기 때문에 이 콜라이(E.coli)에서 발현시키기 위하여 글루타민의 TAA를 다른 글루타민을 코딩하는 다른 염기로 치환하여야한다. 따라서, 도 1의 붉은색으로 표시된 종결코돈의 3군데의 T를 C로 치환한 염기서열을 다카라(주)에 의뢰하여 885bp의 유전자를 합성하였고, 그 중 시그널 펩타이드 부위와 트랜스멤브레인(transmenbrane) 부위를 제외한 777bp의 유전자를 pMAL-c2x 벡터(New England Biolabs Inc.)에 삽입하여 아래와 같이 재조합 단백질을 제작하였다.

발현벡터로 pMAL-c2x 벡터(New England Biolabs Inc.)의 EcoRI과 HindIII 사이트에 38kDa 항원 단백질의 아미노산 19~277을 클로닝하였다. pMAL-c2x 벡터를 EcoR1과 HindIII 사이트를 제한효소로 절단한 후 절단된 플라스미드 단편을 분리하였다. 상기의 목적 유전자를 증폭하기 위하여 두 개의 프라이머를 설계하여 PCR 반응을 하여 얻어진 DNA 단편은 EcoRI과 HindIII 제한효소로 중복 절단(double digestion)하고 절단된 단편을 DNA 분리 키트를 이용하여 분리하였다. 동일한 제한효소로 자른 pMAL-c2x 벡터와 이중으로 절단된 섬모 단백질의 유전자 단편을 혼합한 후 T4 DNA 리가아제를 이용하여 라이게이션하였다.

forward primer: 5'-gagagagaattcGCTGATTTTAAATGTCCTGGTACTGAAG-3'

reverse primer: 5'-gagagaaagcttTCATTCCCCGTTTGAAGAACTAGCTTT-3'

pET 28a(+), pET 32a(+), pET 44a(+) 벡터와 E. coli BL21(DE3)와 BL21-CodonPlus 컴피턴트 세포의 조합에 의해서는 목적 단백질이 발현되지 않았다.

라이게이션된 벡터를 E. coli K12 TB1 형질전환하여 얻은 콜로니를 colony PCR로 선별하여 선택배양하고, O.D.가 약 1이 되었을 때 1mM IPTG로 30℃에서 3시간 배양 후 원심분리하여 세포를 수확하였다. 수확한 세포를 50㎕의 50mM Tris-HCl(pH 8), 1mM EDTA 완충액에 재현탁하고, 50㎕의 2×샘플 로딩 버퍼(sample loading buffer)를 첨가하여 잘 섞은 다음 95℃에서 5분간 반응하여 세포를 완전히 용해시켜 5～10㎕를 12% SDS 젤에 전기영동하였다. 전기영동한 젤은 쿠마시 브릴리안트 염색액으로 염색한 다음 재조합 항원 단백질의 발현을 확인하였다.

재조합 항원단백질의 대량생산을 위한 38kDa 항원유전자의 분비를 위해, pMAL-c2x 벡터의 EcoR1과 HindIII 사이트에 38kDa 항원단백질의 아미노산 19~277을 클로닝하였다.

도 2에 나타난 바와 같이, 말토오스 바인딩 단백질(Maltose binding protein)이 약 43kDa 정도이고 항원단백질이 약 28kDa으로 전체적으로 약 71kDa 정도로 약 75kDa 부위에 강한 발현 밴드를 볼 수 있었다.

분비된 재조합 단백질을 분리하기 위해 pMAL 단백질 융합 및 정제 시스템(pMAL protein fusion and purification system)을 이용하여 제조사의 매뉴얼에 준하여 재조합 단백질을 정제하였다(도 3).

발현단백질의 항원성을 확인하기 위해 웨스턴 블랏팅을 실시하였다. 상기에서 전기영동한 단백질을 트랜스블랏(transblot) 장치에 의해 75mA에서 45분간 니트로셀룰로우즈 필터(nitrocellurose filter)에 블랏팅하였다. 그 후 니트로셀룰로우즈 필터를 5% 스킴 밀크로 블록킹하여 PBS-Tween으로 씻어내고, 마우스 비장세포로 제작한 단클론 항체를 이용하여 AP3 kit(Oxford)로 검출하였다.

그 결과 발현시킨 단백질에 대하여 양성반응이 나타나 발현된 단백질이 항원단백질임을 확인할 수 있었다(도 4).

실시예 3: 스쿠티카충에 대한 백신 효능 실험

공격감염과 ELISA 항체가 조사를 통해 상기 실시예 2에서 제조된 스쿠티카충에 대한 백신의 효능을 실험하였다.

실험예 1: 공격감염을 통한 스쿠티카충에 대한 백신 효능 실험

공격감염실험을 위해 다음과 같이 면역용 실험구와 면역스케쥴을 디자인하였다.

즉, 백신 10㎍/fish, 50㎍/fish, 0㎍/fish(감염 대조구)을 처리한 넙치 30마리를 각 수조에 분주하고, 백신을 처리하지 않은 스쿠티카충을 감염시키지 않는 사육대조구 수조를 준비하여 면역용실험구를 디자인하였다.

면역스케쥴은 백신을 어체에 주사하고 2주 후에 2차 주사한 다음 3일째에 공격감염을 실시하는 것으로 하였다. 공격 감염을 위해 주화세포 CHSE-214에 배양한 스쿠티카충을 1500rpm에서 5분 원심분리하여 모은 후 카운팅하였다.

백신 10㎍/fish, 50㎍/fish, 0㎍/fish(감염 대조구)을 처리한 넙치 20마리를 각 수조에 분주하고 백신을 처리하지 않은 스쿠티카충을 감염시키지 않은 사육 대조구를 준비하여 공격용 수조를 디자인하였다. 공격 감염(booster 후 4일째 날)을 위해 수조의 물을 5L만 남기고 제거한 후, 넙치 20마리씩 넣은 실험구 10㎍/fish, 50㎍/fish, 0㎍/fish의 수조와 대조구 수조에, 준비한 스쿠티카충을 각각 3.96×10⁴ cells 의 농도로 침지하였다. 하루 후 수조의 물을 10L까지 채우고, 이틀 후 수조의 물을 20L까지 채운 후 공격 감염 3일째부터, 사료를 주면서 매일 5L씩 환수하였다. 매일 관찰하면서 폐사어는 제거하고 빈사어는 병리조직학적 병변의 관찰을 위해 10% 중성 포르말린에 고정하였다.

도 5에 나타난 바와 같이, 백신 10㎍/fish 접종구의 폐사율은 10%이고, 백신 50㎍/fish 접종구의 폐사율은 15%, 백신을 처리하지 않은 실험구의 폐사율을 60%로 백신처리에 의해 폐사율이 현저히 경감되었다.

실험예 2: ELISA 항체가 실험

스쿠치카충의 초음파처리한 액을 코팅 완충액(coating buffer)으로 희석하여 100㎕ 씩 웰에 첨가하여 실온에서 한 시간 방치한 후에 3회 PBS/tween으로 세정하였다. 여기에 면역시킨 넙치에서 얻은 혈청을 10배 희석액부터 2단계 희석하여 반응시켜 세정한 후에, anti-flounder Ig M monoclonal antibody(넙치의 면역글로불린의 heavy chain을 인식하는 것으로 본 발명자들이 제작함)와 반응시켰다. 세정 후, 2,000배 희석한 페록시다아제 컨쥬게이트 항-마우스 고우트 혈청(peroxidase conjugated anti-mouse goat serum)을 첨가하여 1시간 실온에서 반응시켜 세정 후, 발색시약으로 발색시켜 492nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다.

도 5에 나타난 바와 같이, 백신처리한 어체에서 취한 혈청의 항체가가 대조구보다 높게 나와 백신에 대해 효과적으로 면역이 생성되어 있음을 알 수 있었다.

상기 실시예와 실험예를 통해 살펴본 바와 같이, 본 발명은 스쿠티카충에 대한 재조합 단백질 백신 및 이를 이용한 스쿠티카증의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로, 스쿠티카충의 섬모단백질의 38kDa의 재조합 항원단백질을 제작하여 이 콜라이에서 발현시킨 백신을 넙치에 면역시킨 결과 효과적으로 넙치를 면역시킬 뿐만 아니라 스쿠티카증을 예방 및 치료하는 뛰어난 효과를 나타내었다. 따라서, 본 발명은 양식어의 병원성 기생충의 감염을 예방 및 치료할 수 있어 수산업 산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims (3)

1. 서열목록 서열번호 1에 기재된 염기서열에 의해 코딩되는 스쿠티카증의 예방 및 치료를 위한 재조합 단백질 백신.
2. 제1항 기재의 재조합 단백질 백신을 유효성분으로 함유함을 특징으로 하는 스쿠티카증의 예방 및 치료용 조성물.
3. 제1항 기재의 재조합 단백질 백신을 어체당 10∼50㎍를 투여하여 스쿠티카증을 예방 및 치료하는 방법.

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