JPH11503609A - イヌ糸状虫由来の新規な蛋白質および哺乳類におけるイヌ糸状虫の免疫診断法 - Google Patents
イヌ糸状虫由来の新規な蛋白質および哺乳類におけるイヌ糸状虫の免疫診断法Info
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Abstract
(57)【要約】
本発明によれば、D．immitisの推定上のペプシン阻害物質フアミリーの他の構成員を表す３１−３３ｋＤａ糖蛋白質（ＤｉＴ３３）が提供される。他の公知の構成員としては、Ｏｖ３３（a.k.a．Ｏｖ３３．３、Ｏｃ３．６、ＯｖＤ ５Ｂ）、Ｂｍ３３およびＡｖ３３が挙げられる。これらの糸状虫分子は、A．suum由来の公知のペプシン阻害物質（Ａｓｐｉ３）と著しい相同性を有する。組換え融合または非融合蛋白質の形態でＤｉＴ３３またはＯｖ３３を用い、ＤｉＴ３３に対する抗体応答を監視し、哺乳類における糸状虫感染の免疫診断に用いることができる。ＤｉＴ３３またはＯｖ３３と反応性の抗体を用いて哺乳類におけるイヌ糸状虫感染の免役診断の手段としてＤｉＴ３３抗原を検出することもできる。
Description
【発明の詳細な説明】
イヌ糸状虫由来の新規な蛋白質および
哺乳類におけるイヌ糸状虫の免疫診断法
発明の背景
ジロフィラリア・イミティス（Ｄｉｒｏｆｉｌａｒｉａ ｉｍｍｉｔｉｓ，イ
ヌ糸状虫）は、イヌ、ネコおよび野生のイヌ類における心糸状虫症の原因物質で
あり、時に、ヒトに伝染して肺イヌ糸状虫症をもたらす。４０％もの高い有病率
が、合衆国のいくつかの地域で見い出され(Falls & Platt，American Journal o
f Veterinary Research，43:738-739(1982))、この病気を制御および管理しよう
とする努力において慣例的診断スクリーニングが推奨されてきた（アメリカイヌ
糸状虫学会，Proceedings of the Heartworm Symposium，1992(ed．Soll,M.D.)
、289-294ページ）。
伝統的に、診断は、もっぱら血中の糸状虫仔虫の検出に依存していた。しかし
ながら、この方法は、著しいパーセンテージの動物が、成虫は存在するが循環糸
状虫仔虫がいない潜在感染を抱えていることから、不適切であった。更に最近で
は、循環雌性虫抗原を検出する市販の抗原試験キットが入手可能になっ
てきた。これらの試験キットは、高度に特異的ではあるが、検出期前（pre-pate
nt）または非検出期（non-patent）感染における感度がないことが示されてきた
（Courtney等，Proceedings of the Heartworm Symposium，1986（ed.Otto，G.F
.），77-82ページ; Dzimianski & McCall，Proceeding of the Heartworm Sympo
sium，1986（ed．Otto，G.F.）83-86ページ;Wong & Fuller，Proceeding of the
Heartworm Symposium，1986（ed．Otto，G.F.），99-105 ページ; Courtney Jo
urnal of the American Animal Hospital Association，24:27-32(1988)；Wong
& Thomford，Journal of the Amrican Animal Hospital Association，27:33-38
(1991)）。
リンパ性糸状虫症（Brugiamalayi（マレー糸状虫）、B．timori（チモリ糸状
虫）および Wuchereria bancrofti（バンクロフト糸状虫））および回旋糸状虫
症（Onchocerca volvulus（回旋糸状虫）の原因であるヒトの関連糸状虫寄生虫
の診断および管理においても、同様の問題に遭遇している。しかしながら、診断
に有用であるかもしれない、これらの寄生虫由来の多数の抗原が同定されている
。O．volvulus由来のＯｖ３３−３（Ｏｖ３３）は、免疫学的診断の可能性を有
することが報告された
最初の糸状虫抗原の一つである(Lucius 等，Journal of Experimental Medicine
，167:1505-1510(1988a))。この抗原は、次いで、多数の研究者等によりクロー
ンされ(Ov33.3(Lucius等，Journal of Experimental Medicine，168:1199-1204(
1988b))；Oc3.6(Chandrashekar 等，Journal of Clinical Investigation，88:1
460-1466(1991))；OvD5B(Celine Nkenfou，論題，“Onchocerca volvulusに特異
的な抗原をコードする遺伝子の分子クローニング：回旋糸状虫症の診断に用いる
発現蛋白質の評価”Cameroon 大学(1993))、組換え抗原を用いた更なる研究が、
前述の知見を裏付けた（Chandrashekar等，同上、Lucius等，Tropical Medicine
and Parasitology，43:139-145(1992)；Nkenfou，同上）。おそらく驚くべきこ
とには、この抗原の相同体が、B．malayi（Bm33）(Dissanayake等，Molecular a
nd Biochemical Parasitology，62:143-146(1993))およびAcanthocheilonema vi
teae（Av33）(Willenbucher等，Molecular and Biochemical Parasitology，57:
349-351(1993))を含む他の糸状虫寄生虫中で発見された。興味深いことには、Bm
33も、リンパ性糸状虫症の診断の可能性を有することが示された（Dissanayake
等，同上）。
更に最近では、本研究者等は、イヌ糸状虫の相同体の存在を示す、組換えＯｖ
Ｄ５Ｂに対して生じた血清と反応する D．immitis由来の３３ｋＤａ抗原（Ｄｉ
Ｔ３３）について述べた（Mejia 等，Parasjte Immunology，16:297-303(1994)
）。Ｏｖ３３、Ａｖ３３（Willenbucher 等，同上）およびＢｍ３３（Dissanaya
ke等，同上）が、Ascaris suumのアスパルチルプロテアーゼ阻害物質Ａｓｐｉ３
に対し顕著な相同性を共有する（Martzen 等，Biochemistry，29:7366-7372(199
0)）ことから、腸線虫 A．suum内に類似した分子が存在する。しかしながら、A
．suum蛋白質は、診断面での可能性について評価されていない。
D．imitisの検出期前感染を検出することができないことは、調査および制御
活動を制限し、新しい治療法の評価の遅延をもたらしている。従って、初期感染
を検出するための手法は、イヌ糸状虫感染の管理に有用な道具となるであろう。
発明の概要
本発明により、D．immitis由来の抗原ＤｉＴ３３は、同定、精製およびクロー
ン化された。ＤｉＴ３３およびＤｉＴ３３によりもたらされた抗体応答は、哺乳
類、特にネコおよびイヌに
おけるイヌ糸状虫感染の初期（感染後約１１週）免疫診断に用いることができる
。本発明により調製したＤｉＴ３３は、D．immitis由来の他の抗原決定基が実質
的にない。
更に詳しくは、ＤｉＴ３３、それは本研究者等が Onchocerca volvulus Ov33
相同体であると決定した、の精製および発現を、Dirofilaria immitisにおいて
示した。O．volvulusの組換え融合蛋白質ＭＢＰ／ＯｖＤ ５Ｂ（Ｏｖ３３）に対
するラビット抗血清が、D．immitisの成虫の３１−３３ｋＤａ糖蛋白質（ＤｉＴ
３３）と反応することを見い出した。ＭＢＰ／ＯｖＤ ５Ｂに対する抗体応答を
、D．immitisの感染性幼虫での感染後１１週の初期のイヌおよび潜伏感染したイ
ヌで観察した。D．immitisに実験的におよび自然に感染した両方のネコも、組換
え抗原と強力に反応した。対照的に、化学的に短縮した感染物を受けたイヌまた
は種々の他の蠕虫を抱えている動物由来の血清は、反応しなかった。
D．immitis由来のＤｉＴ３３をコードする完全なｃＤＮＡの単離および特徴付
けも説明する。ＤｉＴ３３は、マルトース−結合蛋白質（ＭＢＰ）との融合物と
して大腸菌内で発現された。この融合システムを用い、イヌ糸状虫診断に対する
挑戦を
提供する他の通常の寄生虫に感染したイヌ由来の試料を含む、臨床的に明確なイ
ヌ血清パネルを用いて、血清学的分析を行った。この研究により、ＤｉＴ３３が
、推定上のアスパルチルプロテアーゼ（ペプシン）阻害物質ファミリーの一員で
あることを確認され、この研究の結果は、ＤｉＴ３３が、D．immitis感染の初期
マーカーとして第一の候補であることを示している。
図面の簡単な説明
図１は、種々の段階の D．immitisを用いたラビット抗−ＭＢＰ／ＯｖＤ ５Ｂ
抗血清の反応性を示すものである。成虫雄性ＰＢＳ抽出物（レーン１）、成虫雄
性Ｅ／Ｓ抗原（レーン２）、感染性幼虫（レーン３）および糸状虫仔虫（レーン
４）を、イムノブロット法で調べた。矢印は３１−３３および２１ｋＤａ抗原を
示す。
図２は、D．immitis感染の経過中のＭＢＰ／ＯｖＤ ５Ｂに対するイヌのＩｇ
Ｇ応答を示すものである。血清を、感染後０、５、１１、１５、２１および２７
週目に４匹のイヌから集め、プールし、イムノブロット法で調べた。
図３は、種々の蠕虫感染を抱えているイヌ由来の血清の反応性を示すものであ
る。D．immitis（□）、Dipetalonema
reconditum（△）または腸内寄生虫（○）を抱えているイヌのＭＢＰ／ＯｖＤ
５Ｂに対するＩｇＧ応答をＥＬＩＳＡにより調べた。
図４は、O．volvulus(a)由来のアフィニティ精製したＯｖ３３および D．immi
tis(b)成虫由来のＤｉＴ３３のレクチンブロット分析を示すものである。個々の
レーンは、これらの分子の以下のレクチンとの反応性（矢印参照）を示す：Ｃｏ
ｎ−Ａ（レーン１）、ＥＣＬ（レーン２）、ｊａｃａｌｉｎ（レーン３）、ＬＥ
Ａ（レーン４）、ＰＮＡ（レーン５）、ＰＨＡ−Ｅ（レーン６）、ＲＣＡ１２０
（レーン７）、ＳＢＡ（レーン８）、ＳＪＡ（レーン９）、ＶｖＢ４（レーン１
０）およびＷＧＡ（レーン１１）。４５および２５ｋＤａバンドは、ラビットイ
ムノグロブリンの重鎖および軽鎖を表す。
図５は、Ｏｖ３３−３の配列（配列番号：２）と比較したプライマーＮＥＢ１
２３７を有するＯｖＤ ５Ｂの予備配列（配列番号：１）である（ＯｖＤ ５Ｂ配
列は、１回の配列決定実験から得ており、おそらく配列決定誤差を含むことを注
記する）。上のラインは、ＯｖＤ ５Ｂ配列であり、下のラインは、Ｏｖ３３−
３配列である。縦線は、これらの配列間の同一性を
示し、ピリオドは、配列に導入されたギャップを表す。ＯｖＤ ５Ｂ配列は、お
そらくこのライブラリーを構築するのに用いたリンカー由来であるＥｃｏＲＩ部
位（ＧＡＡＴＴＣ）で始まる。
図６Ａ及び６Ｂは、ＤｉＴ３３ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３
）および演繹されたアミノ酸配列（配列番号：４）である。アミノ酸は、一文字
記号により示す。停止コドンは、***により示す。部分的に切断されたリーダー
配列は、下線を引いてある。
図７Ａ及び７Ｂは、ＤｉＴ３３（配列番号：５）と推定上のペプシン阻害物質
ファミリーの他の構成員の整列を示す。前述の配列の構成員のデータベース受入
れ番号は、Ｏｖ３３，ＪＬＯＯ７５（ＰＩＲ）（配列番号：６）；Ａｖ３３，Ｓ
２３２２９（ＰＩＲ）（配列番号：７）；Ｂｍ３３，Ｌ１１０１１（ＧｅｎＢａ
ｎｋ）（配列番号：８）；Ａｓｐｉ３，Ａ３５７０１（ＰＩＲ）（配列番号：９
）である。整列は、推定上の開始メチオニンで始まる。ＤｉＴ３３と同一のアミ
ノ酸残基を、点により表す。ギャップを、破線により表す。保存されたシステイ
ン残基および推定上の活性部位の６個のアミノ酸を、星印により示す。整列は、
ＧＣＧソフトウェアパッケージのＰＩＬＥＵ
Ｐプログラムを用いて行った。
図８Ａから図８Ｄは、D．immitisの実験的感染後の４匹の個々のイヌにおける
ＥＬＩＳＡにより測定したＭＢＰ／ＤｉＴ３３に対するＩｇＧ応答を示すもので
ある。２７週目にミクロフィラリア血症であったイヌを星印により示す。血清を
１：１００に希釈し、三重に試験した。値は、平均±標準偏差で表す。破線は、
陽性シグナルのカットオフを表す。
発明の詳細な説明
本発明によれば、D．immitis中の推定上のペプシン阻害物質ファミリーの構成
員を表す３１−３３ｋＤａ糖蛋白質（ＤｉＴ３３）が提供される。他の構成員と
しては、糸状虫分子Ｏｖ３３（Ｏｖ３３．３、Ｏｃ３．６、ＯｖＤ ５Ｂ）、Ｂ
ｍ３３およびＡｖ３３が挙げられる。これらの糸状虫蛋白質は、腸線虫 A．suum
由来の公知のペプシン阻害物質（Ａｓｐｉ３）と著しい相同性を共有する。Ｄｉ
Ｔ３３および／またはＯｖＤ ５Ｂまたは O．volvulus ＯｖＤ ５ＢもしくはＤ
ｉＴ３３の組換え融合（もしくは非融合）蛋白質を用い、ＤｉＴ３３に対する抗
体応答を監視し、哺乳類における糸状虫感染の免疫診断に用いることができる。
あるいは、ＤｉＴ３３またはＯｖＤ ５Ｂ
を用いて哺乳類、特にイヌおよびネコにおける循環抗原を測定する診断検査法を
開発することができる。これらの診断アプローチは、商業的に入手可能な抗原検
査の主な欠点の一つ、即ち、D．immitisによる検出期前または非検出期感染の感
度の欠如を克服するものである。
糸状虫感染のマーカーとして有用である抗原に要求されるいくつかの重要な特
性がある。この抗原は、感染性幼虫ではなく未成熟虫により表現され、種特異的
であるべきであり、且つ、抗原検査で直接的にまたは抗体検査で間接的に検出さ
れるのに十分に免疫原性であるべきである。最新世代の商業的に入手可能な抗原
検出測定キットに用いられる抗原は、一つの例外を除いて、上記の基準をすべて
満たす。これらの抗原は、成熟した多産の雌によってのみ産生され、結果的に、
検査は、かなりの期間が経過するまで、感染したイヌにおいて陽性とされない。
従って、未成熟虫により表現される抗原に基づく測定法は、既存の手法を補足す
るのに役立つであろう。
糸状虫感染の初期診断におけるＤｉＴ３３分子の有用性を調査する第一歩とし
て、組換え抗原に基づく抗体検出測定法を開発し、臨床的に明確な血清のパネル
を調べた。組換え抗原は、
大量に製造することができ、O．volvulus(Chandrashekar等，J Clin Invest; 88
:1460-1466(1991); Lobos等，Mol Biochem Parasitol.，39:135-146(1990); Lob
os等，Science 251:1603-1605(1991))および B．malayi(Chandrashekar 等，Mol
Biochem Parasitol.，64:261-271(1994); Dissanayake等，Mol Biochem Parasi
tol 62:143-146(1993))を含むヒトの重要な糸状虫感染を診断するのに効果的に
用いられてきた。
ＤｉＴ３３に対する抗体応答は、検出期前期間中にイヌで観察され、初めＬ4
／Ｌ5脱皮（感染後１１週）頃に現れる。免疫複合体の形成によるもであろう応
答の一時的下降が、１５および２３週の何匹かの動物で観察された。検出期の開
始時（この研究において感染後２７週）、ＤｉＴ３３に対する抗体応答は強力で
あるが、これらの血清の５０％もの多くが市販の抗原検査で陰性と出た。従って
、市販のキットは、検出期前および初期検出期感染に対し低水準の感度を有する
。これらの感染および雄性虫のみによる感染（McCall等，Proc．Am．Assoc．Vet
．Parasitol．1993:36）を検出できないのは、目的とする抗原が、主として雌性
虫の子宮および卵内で発見されるという事実による(Weil 等，J Immunol 134:11
85-1191(1985))。ＤｉＴ３３
抗原は、雄性および雌性虫の両方により発現され、予備研究において、ＤｉＴ３
３に対する抗体応答が、雄性虫の移植を受けたイヌで検出された（データは示さ
ず）。以前の研究では、ＤｉＴ３３が感染性幼虫により発現されないことを示し
ており（Mejia 等，同上）、また本発明により、この抗原が化学的予防を施した
イヌ由来の血清と反応しないことが示された。従って、ＤｉＴ３３測定法は、確
実な感染と常法により処方されたマクロライド系抗生物質を与えられたイヌに見
られる効果的に終結した初期幼虫感染とを識別できるはずである。
粗抗原調製物を用いた歴史的抗体検出法は、市販の抗原検出検査に伴われてい
る特異性が欠けていた。しかしながら、本発明によれば、単一の規定された抗原
を用いる場合、高水準の特異性（１００％）を達成することができることが示さ
れた。これは、イヌ糸状虫診断に抗体検出検査を用いることの可能性を支持する
ものである。おそらく抗原検査の最も重要な利点は、検査が生きている糸状虫と
直接関係していることであり、それにより獣医が過去および現在の感染を識別す
るのを可能にすることである。(Weil等，Am J．Trop．Med．Hyg.,33:425-430(198
4)および Weil等，J．Immunol.，134:1185-1191(1985)、これら
の開示は、参照により本明細書に含めるものとする）。しかしながら、抗原は血
中に、かなりの期間存在し、市販のキットに用いらている抗原が、D．immitisの
殺成虫処理後満足すべき水準に低下するのに１２週を必要とする（アメリカイヌ
糸状虫学会，Proceedings of the American Heartworm Symposium(1992)，289-2
94ページ）。ＤｉＴ３３に対するＩｇＧ応答が処理後４週から８週の間に著しく
減少したという本研究者等の観察は、本来のＤｉＴ３３のクリアランスが現在市
販のキットが検出できる循環抗原と同じくらい早いことを示唆していよう。抗原
検出検査の別の重要な特徴は、より高い感度を提供することのできる免疫複合体
解離工程の含むことである（Hamilton，Am．J．Vet．Res.，45:2055-2061(1984)
およびWeil，(1985)同上、これらの開示は、参照に本明細書に含めるものとする
）。下記の実施例で述べたものは、感染の初期の週において感度の向上を提供す
るであろう、循環ＤｉＴ３３抗原および／または免疫複合体を検出する測定法で
ある。
本発明の総合的知見は、ＤｉＴ３３が、D．immitis感染の初期検出の有望な抗
原であり、心糸状虫症の管理における価値あるアクセサリーであろうことを、示
している。
上述のように、本研究者等の初期の研究により、D．immitisにおけるO．volvu
lus抗原Ｏｖ３３の相同体の存在を示した（実施例１参照）。ＤｉＴ３３を、最
初にラビット抗−ＭＢＰ／ＯｖＤ ５Ｂ抗血清を用いたイムノブロット法で精製
し、D．immitisの成虫、成虫の排泄／分泌成分および糸状虫仔虫抽出物において
３１および３３ｋＤａの二重物を観察した。おそらく、３１−３３ｋＤａ分子の
分解生成物を表す、成虫物質に存在する２１ｋＤａの更なるバンドを抗−ＭＢＰ
／ＯｖＤ ５Ｂ抗体により認識した。これらの抗体は、感染性幼虫由来のいずれ
の抗原とも反応しなかった。以前に、O．volvulus寄生虫が、同様の様式でＯｖ
３３分子を発現することが示されている（Lucius等，Journal of Experimental
Medicine，同上）。この方法で精製したＤｉＴ３３は、D．immitis由来の他の抗
原決定基が実質的にないことが見い出された。
O．volvulusにより実験的に感染されたチンパンジー由来の血清と組換えＯｖ
３３との反応性を調査し、検出期の頃に抗体を検出した（Lucius等，Tropical M
edicine And Hygiene，同上）。本発明により、本研究者等は、潜在的に感染し
ている動物を含め、D．immitisに実験的に感染されたイヌから集めた
血清が、ＭＢＰ／ＯｖＤ ５Ｂ融合ポリペプチドと強力に反応することを示す。
このチンパンジーのデータと対照的に、ＭＢＰ／ＯｖＤ ５Ｂで測定した、D．im
mitisにおけるＯｖ３３相同体に対する応答は、イヌ内でのＬ４／Ｌ５脱皮と一
致する感染後１１週で最初に検出した。D．immitisに感染した比較的多数のイヌ
は、循環糸状虫仔虫がいない潜在的感染を示す。これらの動物は、ＭＢＰ／Ｏｖ
Ｄ ５Ｂに対する顕著な応答を示したこの研究で検査した潜在動物の依然として
８７％の診断に明らかに挑戦を提起する。
D．immitisに感染した動物を検死することができることにより、抗体応答と糸
状虫の負荷とを関係づけるユニークな機会を提供する。感染性幼虫に実験的に感
染された又は成虫が与えられたネコにおいて、本研究者等は、ＭＢＰ／ＯｖＤ
５Ｂに対する顕著な応答を示すことができた。D．immitisに自然に感染したネコ
において、これらの動物が、典型的に、少数の成虫はいるが糸状虫仔虫はいない
という事実にも関わらず、本研究者等は、やはり応答を検出することができた。
イヌ糸状虫感染は、今日、化学的予防により大きく制御されている。治療した
イヌにおける寄生虫がまれにしか発生しない
ことは、現在入手可能な薬物の高い効き目の結果である。しかしながら、薬物投
与の短期の不使用又は不十分な投与は、関連の病理を伴う成熟感染をもたらすで
あろう。本発明により、本研究者等は、感染の一ヶ月後、駆虫薬で治療した動物
がＭＢＰ／ＯｖＤ ５Ｂに応答しなかったことを示す。これは、下記に更に詳細
に示すように、本研究者等が成虫に感染したイヌと初期の幼虫型に露出されただ
けの動物とを識別できることを、示唆する。
以前のサザンブロット実験により、Ｏｖ３３の相同体が、B．malayiおよびD．
immitis中に存在することを示された(Lucius等，Journal of Experimental Med
icine，同上(1988b))。この遺伝子は、最近、B．malayi（Bm33）内でクローン化
された(Dissanayake等，Molecular and Biochemical Parasitology，同上(1993)
)および Acanthocheilonema viteae（Av33）(Willenbucher等，Molecular and B
iochemical Parasitology，同上(1993))。興味深いことには、このファミリーの
蛋白質の構成員による抗原決定基の共有にも関わらず、Ｏｖ３３は、回旋糸状虫
症の診断の可能性を有することが示されてきた。Ｏｖ３３に対するＩｇＧ４応答
の検出に基づき、高水準の特異性が
達成できる（Lucius等，Tropical Medicine and Hygiene，同上(1992)）。本研
究者等は、O．volvulusおよびD．immitis分子間の顕著な抗原交叉反応性を示し
た。この関係は、種々の他の蠕虫感染を抱える動物から集めた多数の血清が、O
．volvulus融合蛋白質と反応しなかったことから、明らかに、ネコおよびイヌの
他の寄生虫には拡大しない。
蛋白質水準で観察されたＯｖ３３およびＤｉＴ３３間の抗原交叉反応性に加え
、その類似性は、翻訳後修飾に及ぶ。Ｏ−結合Ｔ抗原（腫瘍細胞マーカー）に特
異的であるｊａｋａｌｉｎ（Sastry等，Journal of Biological Chemistry，261
:11726-11733(1986)）は、ＤｉＴ３３またはＯｖ３３に結合することがわかった
唯一のレクチンであった。本研究者等は、ｊａｃａｌｉｎが種々の段階のD．imm
itisにおける多数の分子と結合することを以前に示した(Mejia & Carlow，Paras
ite Immunology，16:157-164(1994))。Ｏ−グリカナーゼを用いたＤｉＴ３３の
更なる特徴付けにより、二重物の上の方のバンド（３３ｋＤａ）は完全に抵抗性
であるが、一方、下の方のバンド（３１ｋＤａ）は抵抗性および感受性の両方の
部分を含むことが示された（データは示さず）。Ｏｖ３３およびＤｉＴ３３
の両方のレクチンブロット分析は、Ｎに結合したグリカンがないことを示唆した
。これは、ＰＮＧａｓｅ ＦがＤｉＴ３３に影響しないという本研究者等の観察
と一致する。
本研究者等の総合的知見により、O．volvulusOv33およびD．immitis DiT33 分
子間の密接な関係が示された。更に、本研究者等は、Ｏｖ３３／ＤｉＴ３３に対
する応答を、検出期前または潜在性ネコおよびイヌで検出することができること
を示した。従って、これらの抗原は、イヌ糸状虫感染の診断ならびに薬物および
ワクチン試験におけるD．immitis実験的感染の評価に有用であるはずである。
本発明の別の態様により、ＤｉＴ３３をコードする完全なｃＤＮＡの単離およ
び特徴付けが提供された。ＤｉＴ３３は、融合蛋白質としてクローン化し、大腸
菌中で発現された。更に詳しくは、ＤｉＴ３３は、ＭＢＰとの融合蛋白質として
クローン化し、イヌの血清を用いて血清学的分析を行った。
D．immitisから得た、ＤｉＴ３３をコードするＤＮＡ又はその断片は、他の寄
生性線虫を含む他の生体由来の関連遺伝子の同定および単離に用いることができ
る。例えば、このＤＮＡは、他の生体由来の関連遺伝子をスクリーニングするた
めのサ
ザンブロットに用いることができる。
この組換えペプシン阻害物質の単離および発現のための一つの好ましい方法を
、実施例で詳細に説明する。しかしながら、当業者には当然のことであるが、一
旦ＤｉＴ３３の配列が知られたならば、当業者になじみの深い多数の技法を用い
ＤｉＴ３３または関連遺伝子に相当するＤＮＡ配列を単離することができる。例
えば、ｃＤＮＡまたは発現ライブラリーは、例えばサザンブロット分析により所
望の配列を有することが分かっている生体由来のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮ
Ａ）から逆転写により従来の方法で作成することができる。ＤｉＴ３３または関
連蛋白質をコードするＤＮＡ配列を含有するクローンを選択するために、D．imm
itis ｃＤＮＡの一部に相当するハイブリダイゼーションプローブを作成し、こ
のような配列を含有するクローンを同定するのに用いることができる。好ましい
プローブとしては、配列番号：３のヌクレオチソ３０１からヌクレオチド６４８
までの断片が挙げられる。標的ＤｉＴ３３蛋白質またはＯｖ３３／ＯｖＤ ５Ｂ
／Ｏｃ３．６又はその断片に対して生じた抗体を用いた発現ライブラリーのスク
リーニングにも用いることができる。ゲノミックライブラリーにも用いることが
できる。このような技法は、Sambrook，Molecular Cloning，第２版、Cold Spri
ng Harbor Laboratory，Cold Spring Harrbor Laboratory Press(1989)に教示さ
れている。
所望であれば、このようにして得たＤＮＡは、次いで、当業者になじみの深い
技法を用い更なる操作のためにサブクローンすることができる。例えば、ＤＮＡ
は、ｐＢＲ３２２またはｐＵＣ１９のようなベクター中にサブクローンすること
ができる。
一度同定したならば、ＤｉＴ３３または関連蛋白質をコードするＤＮＡ配列は
、例えばｐＥＴ３Ａ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔまたはｐＵＣ１９のような大腸菌
から誘導したプラスミド、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５およびｐＣ１９４のような枯
草菌から誘導したプラスミド、ｐＳＨ１９およびｐＳＨ１５のような酵母から誘
導したプラスミド、λファージのようなバクテリオファージ、Agrobacterium tu
mefaciensのような細菌、レトロウィルスのような動物ウィルスならびにBaculov
irusのような昆虫ウィルスのような適切なペクター中にクローン化することがで
きる。
標的蛋白質、この場合ＤｉＴ３３、の過剰発現は、例えば、標的蛋白質をコー
ドするＤＮＡをその内因性制御要素から分離
し、次いで、Ｔ７発現ベクターのような非常に厳密に制御されたプロモーターに
ＤｉＴ３３遺伝子を機能可能に結合させることにより達成することができる。Ro
senberg 等，Gene，56:125-135(1987)参照。強力なプロモーターの挿入は、Ｄｉ
Ｔ３３の両端近くの都合の良い制限標的部位およびプロモーター近くのベクター
上の適合性制限標的部位を同定し、強力なプロモーターの転写および翻訳制御下
にあるような方向づけでＤｉＴ３３遺伝子をベクター内に移すことにより達成す
ることができる。
ＤｉＴ３３は、遺伝子の発現を増加させるためにＤｉＴ３３遺伝子の上流に配
置された強力なリボソーム結合部位を用いることによっても過剰発現させること
ができる。Shine and Dalgarno，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，71:1342-1346(1
974)参照。
形質転換およびファージ感染の標準技法を用い、組換えベクターを適切な宿主
中に導入する。例えば、Cohen，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，69:2110(1972)に
より説明されたような塩化カルシウム法を、大腸菌に用いる。バシラスの形質転
換は、Chang等，Molecular and General Genetics，168:111(1979)の方法
により行う。酵母の形質転換は、Parent 等，Yeast，1:83-138(1985)の方法によ
り行う。特定の植物細胞は、Shaw等，Gene，23:315(1983)により説明された方法
によりAgarobacterium tumefaciens を用いて形質転換することができる。動物
細胞の形質転換は、例えば、Virology，52:456(1973)に述べられた方法により行
う。Baculovirus の昆虫細胞への形質転換は、例えば、Biotechnology，6:47(19
88)に述べられた方法により行う。
形質転換体を、用いた宿主細胞に依存する、このような細胞に適した標準技法
を用いて培養する。例えば、大腸菌の培養には、細胞を、３０℃から４２℃のＬ
Ｂ培地中で対数増殖中期または定常期まで生育させる。
ＤｉＴ３３は、例えば、培養細胞または培養溶液のいずれかからの抽出により
、形質転換した宿主細胞の培養物から単離し精製することができる。
蛋白質を培養細胞から抽出する場合、当業界で公知の方法、例えば、遠心分離
により培養物から細胞を集める。次いで、集めた細胞を、適切な緩衝溶液に懸濁
し、超音波処理、リゾチームおよび／または凍結−融解により破壊する。蛋白質
を含有す
る粗抽出液は、遠心分離および／または濾過により得られる。
ＤｉＴ３３または関連蛋白質が、培養液中に、例えば、単独で又はマルトース
結合蛋白質のような分泌蛋白質を有する融合蛋白質として分泌される場合、上澄
を、当業界で公知の方法により細胞から分離する。
培養物上澄または細胞抽出物に含まれるＤｉＴ３３または関連蛋白質の分離お
よび精製は、上記の方法、または公知の分離および精製法の適切な組み合わせに
より行うことができる。これらの方法としては、例えば、塩析および媒析のよう
な溶解度を利用する方法、透析、限外濾過、ゲル濾過、およびＳＤＳ−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動のような分子量の差異を利用する方法、イオン交換カラ
ムクロマトグラフィーのような荷電の差異を利用する方法、特定のアフィニティ
クロマトグラフィーを利用する方法、逆相高性能液体クロマトグラフィーのよう
な疎水性の差異を利用する方法および等電点電気泳動のような等電点の差異を利
用する方法が挙げられる。
上記のように、ＤｉＴ３３は、感染後１１週の早い時期の哺乳類、特にイヌお
よびネコのイヌ糸状虫の存在を検出する、抗体に基づく又は抗原に基づくいずれ
かの測定法の基礎として用
いることができる。
抗体に基づく測定法を、実施例１で更に詳細に説明する。
一般に及びその最も広い態様において、抗原に基づく測定法は、Dirofilaria
immitisに感染した又は感染したと思われるイヌ由来の血清試料を準備し、これ
のDirofilaria immitisの循環ＤｉＴ３３抗原の存在を、本発明のモノクローナ
ル抗体またはポリクローナルもしくは多価抗体を用いた免疫技法の手段により分
析することを含む。従って、本発明によれば、本明細書で述べた循環ＤｉＴ３３
の同定および特徴付けにより、哺乳類の、特にイヌおよびネコのイヌ糸状虫を診
断するためのこのような測定技法の手段による検出が可能になった。
更に詳しくは、抗原に基づく測定は、Dirofilaria immitisに感染したまたは
感染したと思われる動物由来の血液もしくは体液試料とＤｉＴ３３に特異的なモ
ノクローナル抗体とを合わせることにより行うことができ、このモノクローナル
抗体は、その本来（未修飾）の状態であるか又はこのような抗原の存在を容易に
測定することのできる化学的に修飾した状態のいずれかである。モノクローナル
抗体を修飾型で用いる場合、例えば、循環寄生虫抗原の存在がシグナルの手段に
より検出されるとこ
ろの検出可能なシグナルを提供する酵素で標識してもよい。このようなモノクロ
ーナル抗体を、測定物を計数および診断するのに従来用いられた種々の標識で標
識することができるのは当然のことである。このような標識としては、放射性標
識、蛍光化合物、酵素、ビオチン、強磁性標識等が挙げられるが、これらに限定
されるわけではない。いずれの場合も、このモノクローナル抗体が、D．immitis
に感染したイヌの血清又はその構成エピトープに存在するＤｉＴ３３上の結合部
位または決定基に結合することにより、この抗原の存在の検出および測定をがで
きる。抗原の存在のモノクローナル抗体の代わりに。さほど有利ではないが、本
発明のモノクローナル抗体の代わりに、多価またはポリクローナル抗体を用いる
ことができ、同様に標識して検出可能なシグナルを従来の方法で提供することが
できる。
また、本発明のモノクローナル抗体は、当業界で公知の二重抗体測定（例えば
、サンドイッチＥＬＩＳＡ測定法）技法によりＤｉＴ３３の存在を決定する測定
を行うために未修飾または本来の型で用いることができる。このような技法にお
いて、本モノクローナル抗体は、第一および第二抗体の両方として、または第二
抗体として用いられた標識ポリクローナル抗体と共に
用いる第一抗体として、もしくはその逆として用いることができる。
本発明を以下の実施例により更に具体的に説明する。これらの実施例は、本発
明の理解を深めるために提供するものであり、本発明は、それにより制限される
ものではない。
上記および下記の参考文献を、参照により本明細書に含めるものとする。
実施例１
材料および方法 寄生虫
成虫、糸状虫仔虫およびD．immitisの感染性幼虫を含む蚊(Aedes aegypti)を
、TRS laboratories Inc．(Athens，GA)から購入した。Baermann 装置を用いて
冷麻酔した蚊から感染性幼虫を集めた。O．volvulusの雌性虫を、Keele大学，英
国のP．J．Ham教授から親切にも提供された小結節から切り出した。寄生虫抽出物
D．immitisの１０匹の雄性成虫を、ドライアイス上で粉砕し、アンチパイン
ジヒドロクロライド５０μｇ／ｍｌ、ＡＰＭＳＦ１０μｇ／ｍｌ、アプロチニン
１μｇ／ｍｌ、ベスタチ
ン４μｇ／ｍｌ、キモスタチン１０μｇ／ｍｌ、Ｅ−６４ ５μｇ／ｍｌ、ＥＤ
ＴＡ １ｍＭ、ロイペプチン０．５μｇ／ｍｌ、ペプスタチン０．７μｇ／ｍｌ
およびホスホラミドン１０μｇ／ｍｌから成るプロテアーゼ阻害物質のカクテル
(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)を含有する１０ｍｌの燐酸緩衝食塩
水（ＰＢＳ）中で均質にした。このホモジネートを遠心分離（１００，０００ｘ
ｇ、１時間）して可溶性画分（ＰＢＳ抽出物）を得、−７０℃で貯蔵した。
D．immitisの排泄／分泌（Ｅ／Ｓ）抗原を、実質的に説明された(Poole等，Pr
oceedings of the Academy of Science，USA，89:5986-5990(1992)参照により本
明細書に含めるものとする)通りに成虫から得た。虫を、ＲＰＭＩ １６４０培地
、１％（ｗｔ／ｖｏｌ）グルコース、ペニシリン１００ｕ／ｍｌ、ストレプトマ
イシン１００μｇ／ｍｌ、およびアンホテリシン２５μｇ／ｍｌ(Gibco/BRL，Ga
ithersburg，MD)中で３７℃で５％ＣＯ2下でインキュベートした。使用済み培地
をプールし、濾過（０．２２μｍ）し、１０，０００分別Diaflo膜(Amicon，Bev
erly，MA)を有する限外濾過攪拌セルを用いて濃縮した。
O．volvulusの雌性成虫のＳＤＳ抽出物を、１％ＳＤＳ中で
寄生虫を均質化することにより調製した。ホモジネートを上記の通りに処理した
。ＭＢＰ／ＯｖＤ ５Ｂの調整
ＯｖＤ ５Ｂを、下記に述べるようにクローン化した。本来のλｇｔｌｌファ
ージを、O．volvulus特異的抗原をスクリーニングすることによりO．volvulus成
虫ｃＤＮＡライブラリー(Donelson 等，Molecular and Biochemical Parasitolo
gy，31:241-250(1988)、参照により本明細書に含めるものとする)から単離し、
次いで、以下の改変を加えながら製造元の指示書（New England Biolabs，Bever
ly，MA）による「蛋白質融合および精製システム」で過剰発現のためサブクロー
ン化した。０．１−０．５ｍＭのＩＰＴＧを用い２０℃で一晩対数増殖中期にお
いて細胞を誘導した。融合蛋白質を、製造元の指示書による上記の「蛋白質融合
および精製システム」に述べられた通りに調製した。
ＭＢＰ／ＯｖＤ ５Ｂを、製造元（New England Biolabs，Beverly，MA）によ
り述べられた通りにアミロース樹脂上で精製し、ＦＰＬＣ ＭｏｎｏＱカラム（
Pharmacia，Piscataway，NJ）を通過させることにより更に精製した。血清
イヌおよびネコの血清を TRS Laboratoriesから購入した。種特異性研究には
、以下の普通の寄生虫：Toxocara canis（イヌ回虫）、Toxascaris leonina、An
cylostoma caninum（イヌ鉤虫）、Dipetalonema reconditum、Taenia（条虫）亜
種の１種以上を保持するイヌ、または特徴付けされていない腸蠕虫感染したネコ
から集めた。D．immitisに実験的に感染した動物は、腸蠕虫またはD．reconditu
m（イヌ）の感染がないことが知られていた。筋肉内に与えられたフロイント完
全アジュバント（Sigma，St．Louis，MO）中の１００μｇのＭＢＰ／ＯｖＤ ５
Ｂでの免疫感作後ニュージーランドホワイトラビット内にラビット抗−ＭＢＰ／
ＯｖＤ ５Ｂ抗体が生じた。この動物は、２（筋肉内）および６週（皮下）後フ
ロイント不完全アジュバントの同様の注射を受けた。ラビット抗−ＭＢＰ／ＯｖＤ ５Ｂを用いたO．volvulus およびD．immitis由来の本来のＯｖ３３および ＤｉＴ３３のアフィニティ精製
ラビット抗−ＭＢＰ／ＯｖＤ ５Ｂ抗体を、プロテインＡ−セファロースビー
ズ（Sigma，St．Louis，MO）に結合させた。
１００μｌのビーズを、１ｍｌのD．immitis雄性虫ＰＢＳ抽出物（１．６ｍｇ／
ｍｌ）、または１ｍｌのO．volvulusのＳＤＳ抽出物（１％Triton X-100を含有
するＰＢＳで１：１０に希釈）に加えた。室温で１時間インキュベーション後、
ＰＢＳ０．１％ Triton X-100（ＰＢＳ−Ｔ）でビーズを三回洗浄した。免疫精
製した抗原を、２００μｌの０．１Ｍグリシン緩衝液ｐＨ２．５で溶出し、ｐＨ
を１ＭのトリスｐＨ８．０で中和した。イムノブロッティング
ＭＢＰ／ＯｖＤ ５Ｂ（２μｇ）、生の感染性幼虫（１８０／レーン）、糸状
虫仔虫（５０００／レーン）、成虫ＰＢＳ抽出物（６．４μｇ／レーン）または
Ｅ／Ｓ（３．２μｇ／レーン）または免疫精製した物質（３０μｇ）を、ＳＤＳ
−ＰＡＧＥ試料カクテル（３．２Ｍの尿素、１％ＳＤＳおよび５％２−メルカプ
トエタノール最終濃度を含有）中で５分間煮沸した。試料を５分間微小遠心分離
機にかけ、１０−２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥミニーゲル（Diiachi、東京、日本）
上で電気泳動にかけ、ニトロセルロースに移した。ニトロセルロース膜を、５％
酢酸中のPonceau S溶液(Sigma，St．Louis，MO)で染色し、蒸
留水ですすぎ、ＰＢＳ中の１％ミルクでブロックした。この片を、１％ミルクを
含有するＰＢＳ−Ｔで希釈したラビット（１：５００）またはイヌ（１：１００
）血清中で、続いて、ＰＢＳ−Ｔで１：５００に希釈したビオチニル化ヒツジ抗
−ラビットＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）抗体(Vector，Burlingame，CA)またはビオチニル化
ヒツジ抗−イヌ（Ｈ＆Ｌ）抗体(Biodesign International，Kennebunkport，ME)
中でインキュベートした。結合した抗体を、アビジン−ビオチン−ペルオキシダ
ーゼシステム（Vectastain ABC kit，Vector）を用いて検出した。この片を、Ｐ
ＢＳ−Ｔで洗浄し、４−クロロ−１−ナフトール（Sigma，St．Louis，MO）で展
開した。固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）
マイクロタイタープレート（Dynatech Laboratories，Chantilly，VA）のウェ
ルを、０．０５Ｍ炭酸緩衝液、ｐＨ９．６中の最適濃度のＭＢＰ融合蛋白質（５
ｎｇ／ウェル）で４℃で一晩被覆した。０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０（
ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ）中で２回の洗浄後、プレートを、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中の
２％ミルクで３０分間ブロックした。適切に希釈した（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ）イ
ヌ抗体、ビオチニル化ヒツジ抗
−イヌ（Ｈ＆Ｌ）抗体(Biodesign International，Kennebunkport，ME)の１：５
００希釈中での連続インキュベーション後、結合した抗体を、上記のようにアビ
ジン−ビオチン−ペルオキシダーゼシステム（Vectastain ABC kit，Vector）を
用いて検出した。最後に、酵素基質オルトフェニレンジアミン（Sigma，St．Lou
is，MO）を加え、４９５ｎｍでの吸収を測定した。
何匹かのネコは、抗−ＭＢＰ抗体を有することから、融合蛋白質を用いて得ら
れた値からＭＢＰ反応性を控除した。融合蛋白質中に存在するＭＢＰの量（ラビ
ット抗−ＭＢＰ抗体を用いて測定）とほぼ等しい１０ｎｇ融合蛋白質または４ｎ
ｇのＭＢＰでウェルを被覆した。ネコ血清（１：１００）および１：２０００で
希釈したペルオキシダーゼ結合抗−ネコＩｇＧ抗体（Cappel，Durham，NC）を、
次いで、加えた。３，３´５，５´−テトラメチルベンジジン（Kirkegaard & P
erry，Gaithersburg，MD）を基質として用いた。レクチンブロッティング
Ｏｖ３３およびＤｉＴ３３のグリコシル化の程度をレクチンブロット分析によ
り測定した。ビオチニル化コンカナバリン A
(Con-A)、Erythrina cristagalli（アメリカデイゴ）レクチン(ECL)、Artpocarp
us integrifolia(jacalin)、落花生アグルチニン(PNA)、Phaseolus vulgaris（
インゲンマメ）エルスロアグルチニン(PHA-E)、Ricinus communis（ヒマ）アグ
ルチニンＩ(RCA120)、ダイズアグルチニン(SBA)、Sophora japonica（エンジュ
）アグルチニン(SJA)、およびコムギ胚芽アグルチニン(WGA)を Pierce(Rockford
，II)から購入した。ビオチニル化 Lycopersicon esculentum（トマト）(LEA)お
よびViciavillosa（ヘアリーベッチ）イソレクチンＢ4（VvB4）をSigmaから購入
した。電気泳動および移動後、ラビット抗−ＭＢＰ／ＯｖＤ ５Ｂでアフィニテ
ィ精製したO．volvulusまたはD．immitis抗原を含有するニトロセルロース膜を
、ＰＢＳ中の１％ＢＳＡ（ＰＢＳ−ＢＳＡ）で室温で１時間ブロックした。各片
を、次いで、３ｍｌのビオチニル化レクチン（２０μｇ／ｍｌ ＰＢＳ−ＢＳＡ
中）と共にインキュベートし、ＰＢＳ−Ｔで洗浄し、上記のアビジン−ビオチン
−ペルオキシダーゼシステムを用いて展開した。結果 種々の段階のD．immitisによるＯｖ３３相同体の発現
ＭＢＰ／ＯｖＤ ５Ｂに対して生じたポリクローナルラビット血清が、雄性成
虫のＰＢＳ抽出物、雄性Ｅ／ＳおよびD．immitisの糸条虫仔虫抽出物に存在する
３１および３３ｋＤａの二重物と反応することを観察した（図１）。更に、約２
１ｋＤａの少量の成分も、成虫ＰＢＳ抽出物およびＥ／Ｓ調製物の両方で検出し
た。これらの抗原のいずれもが、ＭＢＰに対しるラビット抗体により認識されな
かった。感染性幼虫は、ラビット抗−ＭＢＰ／ＯｖＤ ５Ｂ血清と反応性のいか
なる分子も持たなかった。D ．immitisに感染の間のＭＢＰ／ＯｖＤ ５Ｂに対するイヌの抗体応答
Ｏｖ３３のD．immitis相同体が抗原性であるかどうかを決定するために、D．i
mmitisに実験的に感染した４匹のイヌから得たプール血清を、感染後０、５、１
１、１５、２１および２７週目にＭＢＰ−ＯｖＤ ５Ｂとの反応性を調べた。先
ずその後増加したＩｇＧ応答を感染後１１週にイムノブロットで検出した（図２
）。これらの血清をＥＬＩＳＡにより個別に調べると、応答の一過性の減少が、
感染後約１５週の３匹のイヌで観察された。これらのイヌは、抗−ＭＢＰ抗体を
持たないこと
から、観察された応答は、ＯｖＤ ５Ｂに向けられたものである。２７週で、動
物を検死した際、かなりの数（３２−４１）の成虫が、４匹全てのイヌの心臓か
ら回収された。検出期は、通常、D．immitisに感染後約６．５ヶ月で始まる。検
死時、この研究で４匹の動物のうち２匹は、検出期であった。潜在性イヌ糸状虫感染したイヌの抗体応答
イヌが、循環糸状虫仔虫がいない状態でかなりの数の成虫を抱える潜在感染は
、かなりのパーセンテージの動物で起こり、現在の寄生虫学的検査により検出で
きない。潜在感染を有する１５匹のイヌの群でＭＢＰ／ＯｖＤ ５Ｂに対する反
応性を分析した。抗体を１３匹の動物で検出した。イヌ糸状虫化学的予防後のイヌの抗体応答
ＭＢＰ／ＯｖＤ ５Ｂに対する抗体応答を、D．immitisの５０匹の感染性幼虫
から成る感染を受けた１６匹のイヌで調査した。感染後４週に全ての動物に５０
μｇ／ｋｇのアイバメクチンを与え、感染後４ヶ月に血清を集めた。感染後６ヶ
月で動物を検死したが、成虫は全く回収されなかった。検査した１６の血清の内
１つだけが、ＭＢＰ／ＯｖＤ ５Ｂと弱く反応した。ＭＢＰ／ＯｖＤ ５Ｂに対するイヌの種特異的抗体応答
イヌで観察された応答が種特異的であるかどうかを決定するために、以下のイ
ヌの普通の寄生虫：Toxocara canis（イヌ回虫）、Toxascaris leonina、Ancylo
stoma caninum（イヌ鉤虫）、Dipetalonema reconditum、Taenia（条虫）亜種の
１種以上を保持する動物から集めた６個の血清試料の、ＭＢＰ／ＯｖＤ ５Ｂと
の反応性を測定した。未感染（陰性）またはD．immitis感染（陽性）イヌから集
めた血清を、対照として含めた。陽性の対照血清のみが、組換え抗原と強力に反
応した（図３）。他の蠕虫感染を有するイヌから集めた合計４３の更なる血清を
、同じ方法で分析したが、いずれもこの測定で反応することが観察されなかった
。D ．immitisに感染したネコの抗体応答
ネコの感染は、成虫がほとんどいない及び一過性のミクロフィラリア血症又は
それがない特徴を有する。この研究において、D．immitisの１００ Ｌ３幼虫に
実験的に感染した２匹のネコは、検死時に２匹および９匹の成虫しかいなく、感
染後２４−２８週でミクロフィラリア血症が見られなかった。これらの動物は、
ＭＢＰ／ＯｖＤ ５Ｂに対する強力なＩｇＧ応答を示し
た（表１）。５−８匹の雄性および雌性成虫の移植後早期に応答を検出した。移
植後４−４０週に血清を分析した際、かなりの応答が得られた（表１）。
合衆国南部の動物収容施設から得た１３匹のネコ由来の血清のＭＢＰ／ＯｖＤ
５Ｂに対する反応性を調べた。D．immitis
の成虫を有することが分かった２匹のネコは、顕著な応答が観察された。腸蠕虫
を有するか又は蠕虫病の証拠が無いかのいずれかである残り１１匹の動物は、組
み換え抗原と反応しなかった。Ｏｖ３３およびＤｉＴ３３の本来の抗原の炭水化物分析
ラビット抗−ＭＢＰ／ＯｖＤ ５Ｂ血清により認識された成虫のO．volvulusお
よびD．immitisの本来の抗原を、アフィニティ精製し、レクチンブロット分析に
より更に特徴付けした。いくつかのレクチンを、それらの異なる炭水化物結合特
異性に基づいて選択した：Ｃｏｎ−Ａ（マンノース／グルコース）、ｊａｃａｌ
ｉｎ（ガラクトシル（β−１，３）Ｎ−アセチルガラクトサミン）、ＥＣＬ（Ｎ
−アセチルラクトサミン）、ＬＥＡ（Ｎ−アセチルグルコサミンオリゴマー）、
ＰＮＡ（ガラクトシル末端基）、ＰＨＡ−Ｅ（複合型糖質）、ＳＢＡおよびＲＣ
Ａ（Ｎ−アセチルガラクトサミン／ガラクトース）、ＳＪＡ（β−Ｄ−Ｎ−アセ
チルガラクトサミン）、ＶｖＢ4（Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン）ならび
にＷＧＡ（Ｎ−アセチルグルコサミン）。検査した全てのレクチンの内、ｊａｃ
ａｌｉｎのみが、O．volvulusおよびD．immitisの両方の３１−３
３ｋＤａ分子と反応することが分かった（図４）。３１−３３ｋＤａ分子を、ｊ
ａｃａｌｉｎを用いD．immitis成虫抽出物からアフィニティ精製した相互実験に
おいて、ラビット抗−ＭＢＰ／ＯｖＤ ５Ｂ血清との強力な反応性を観察した。
実施例ＩＩ
ＯｖＤ ５Ｂのクローニング
雌性O．volvulus成虫ｃＤＮＡライブラリー(Donelson等，(1988)Molecular an
d Biochemical Parasitology 31:241-250)を、可溶性雌性O．volvulus虫抽出物
に対して生じた血清でスクリーニングした。陽性のクローンをプラーク精製し、
Ascaris Lumbricoides（回虫）およびLoa loa（ロア糸状虫）抗原との交叉反応
性をスクリーニングした。これらの血清と交叉反応しなかったクローンを、更に
研究した。このインサートを、マルトース結合蛋白質（ＭＢＰ）発現システム(N
ew England Biolabs，Inc.，Beverly，MA)内にサブクローンし、断片末端を配列
した。ＯｖＤ ５Ｂをこのように単離した。O ．volvulus、A．lumbricoidesおよびL．loa抗原ならびにラビット血清の調製
これらの各虫の試料を、凍結し、鉛の乳鉢および乳棒を用い、
ＰＢＳ ｐＨ７中で粉砕した。混合物を再凍結し、再度粉砕した；このプロセス
を１時間間隔で５回繰り返した。混合物を５℃で２５分間１５０００ＲＰＭで遠
心分離し上澄を吸い出すことにより可溶性抽出物を集めた。これらの上澄（可溶
性抗原）を、小分けし、−２０℃で貯蔵し、それぞれの虫の「粗抽出物」、「虫
抽出物」又は単に「抽出物」と呼んだ。これらの抽出物の蛋白質濃度を、標準と
してＢＳＡを用い、Bradford(Analytical Biochemistry，72:248-254(1976))(Bi
oRrad)の方法により測定した。
ニユージーランドホワイトラビットを、これらの抽出物のそれぞれで個別に免
疫感作した。初めの投与量は、同容量のフロイント完全アジュバントと混合した
１００μｇの抗原から成った。これを、各ラビットの大腿に筋肉内に注射した。
１週間後、今回はフロイント不完全アジュバント中で乳化した同量の抗原の２回
目の投与量を、同じ経路により投与した。最後の追加免疫は、１週間後に与えた
。それは、０．１ｘＰＢＳに溶解した同量の抗原から成っていた。最後の抗原追
加免疫から１週間後、ラビットの主耳静脈から採血した。室温で２時間の凝固後
、血液を４℃で一晩貯蔵し、次いで、１５００ＲＰＭで１５分間遠
心分離した。血清を、次いで、吸出し、−２０℃で必要になるまで貯蔵した。こ
れらの血清を、抗−ＯＶ、抗−ＡＬ、および抗−ＬＬ血清と命名する。
ライブラリーのスクリーニング中のバックグラウンド干渉を減少させるために
、大腸菌に対する抗体を除去すべく大腸菌蛋白質が結合したカラムに血清を予備
吸収させた。ＢＮＮ９７細胞(Young and Davis（1983）Proc．Natl．Acad．Sci
．USA．80:1194-1198)の培養物を、ＬＢ培地中で、６００ｎｍでのＯＤの読み取
りが０．５になるまで生育させた。次いで、回収し、カップリング緩衝液（０．
１ＭのヘペスｐＨ７、８０ｍＭのＣａＣｌ2）中で洗浄した。細胞をカップリン
グ緩衝液に再懸濁してＯＤ600nmの読み＝１．００とし、その後、氷上で超音波
処理した。これらの破片を、１０，０００ＲＰＭで遠心分離し、上澄の可溶性蛋
白質に関してBradford蛋白質測定を行った。Ａｆｆｉ−ｇｅl １０（BioRad Lab
oratories，Richmond，CA）樹脂を、５０ｍｌの試験管に移し、室温で５分間１
５００ｇでペレット状にした。樹脂を、次いで、冷水中で３回、カップリング緩
衝液中で１回洗浄した。樹脂をＢＮＮ９７可溶性抽出物と混合し、カップリング
反応を、室温で４時間進行させた。
余分なＢＮＮ９７抽出物を、室温で５分間１５００ｇで遠心分離することにより
除去し、カップリング効率の測定のためにとっておいた。この樹脂を、室温で１
時間１カラム容量の１Ｍのエタノールアミン−ＨＣｌと反応させた。これは、樹
脂の未結合の部位をブロックすることになる。次いで、洗浄液のＯＤ280が０．
２になるまでカップリング緩衝液中で洗浄し、以後、０．１％アジ化ナトリウム
を加えたカップリング緩衝液中で４℃で貯蔵した。ＢＮＮ９７ イムノソルベン
トカラムを用いた抗−血清の予備吸収を、樹脂１ｍｌ当たり１から５ｍｌの抗−
血清を用いて行った。結合した樹脂を、再懸濁およびペレット化によりＴＢＳ緩
衝液（２０ｍＭのトリス７．５−８、１５０ｍＭのＮａＣｌ）中で２回洗浄した
。１％ＢＳＡ、１ｍＭのＰＭＳＦを含有するＴＢＳで１／２または１／５希釈し
た抗血清を、樹脂と混合し、４℃で一晩インキュベートした。この混合物を、連
続振とうにかけた。翌朝、樹脂を、１５００ｇで１分間室温で遠心分離した。回
収した抗血清を清浄な試験管に移した。最終的希釈を算定し、清浄な抗血清を小
分けし、スクリーニングに用いる前に、−２０℃または−７０℃で貯蔵した。ラビット抗−O．volvulus血清を用いたO．volvuluscＤＮＡライブラリーのスク リーニング
ライブラリーを以下の通り（Sambrook 等、同上）にタイターした。大腸菌菌
株ＥＲ１５７８（New England Biolabs，Inc.，Beverly，MA）を、プレーティン
グストックとして用いた。ライブラリーの連続希釈（１０-2、１０-3、１０-4、
１０-5、１０-6、および１０-7）を、ＳＭ緩衝液（Sambrook等、同上）で行った
。２００μｌのＥＲ１５７８細胞（ＯＤ600＝２）を、３ｍｌの溶融したトップ
アガーと混合した。この混合物を、次いで、予め温めておいたＬＢアンピシリン
プレート上に注ぎ、室温で５分間放置して固めた。ファージの各希釈物の１μｌ
を、このプレート上にスポットし、ファージを、室温で１０分間細胞上に吸着さ
せ、続いて３７℃で一晩インキュベーションした。翌日、プラークを計数し、ラ
イブラリーのタイターを算定した。
力価がみられたら、ｃＤＮＡライブラリーを、ラビット抗−ＯＶ血清（Young
and Davis 同上）でスクリーニングした。プレート当たり２５，０００から３５
，０００のプラーク形成単位を、以下の通りにスクリーニングした。２００μｌ
のＥＲ １５７８に、１０ｍｌのガラスの試験管内の適切な希釈の組み換
えファージを加えた。混合物を撹拌することなく室温で１５分間ファージを細胞
表面上に吸着させた。６ｍｌの溶融したトップアガーをファージに加え、予め温
めた１５ｃｍ幅のＬＢアンピシリンプレート上に直ちに注いだ。プレート上の寒
天を、室温で約５分間放置して固まらせた。プレートを、プラークが形成しはじ
める（通常約２時間）まで４２℃でインキュベートした。１０ｍＭのＩＰＴＧ滅
菌溶液中で予め湿らせたＳ＆Ｓニトロセルロース円状濾紙を、無菌条件下で、気
泡を形成することなく慎重にプレートの表面上に供した。プレートを、３７℃で
２から５時間インキュベートした。どちら側がプレートの表面に接触していたか
を見分けるためだけではなく陽性のプラークの位置確認を容易にするためにこの
濾紙にマークをつけた。濾紙をプレートから慎重に引き剥がし、ウェスタンブロ
ッティング技法を用いたスクリーニング手法を続ける前に、ＴＢＳＴＴ（２０ｍ
Ｍのトリス７.５−８、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．％Ｔｗｅｅｎ２０、０．０
５％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ １００）で洗浄した。濾紙を、３−５％無脂肪粉乳を
有するＴＢＳＴＴ中で１時間ブロックした。濾紙を、次いで、各洗浄を５分間続
けながらＴＢＳＴＴ中で３回洗浄した。濾紙を、ＴＢＳＴＴ中の
少なくとも１／１００希釈の抗−ＯＶ血清と共に室温で１−２時間インキュベー
トした。第一抗体と共にインキュベーション後、濾紙を、ＴＢＳＴＴで１回５分
で３回洗浄した。Ｐｒｏｍｅｇａ（Madison，WI）アルカリホスファターゼ結合
抗−ラビット抗体を、ＴＢＳＴＴに溶解した３％粉乳で１／７５００に希釈し、
ニトロセルロース濾紙と共に室温で３０分間インキュベートした。第二抗体と共
にインキュベーション後、濾紙を、それぞれ５分間ずつ３回ＴＢＳＴＴで洗浄し
た。反応物を、製造元の指示書通りにＰｒｏｍｅｇａ（Madison，WI）ＮＢＴお
よびＢＣＩＰで０から６０分間暗所で展開した。反応を、蒸留水で停止した。陽
性のプラークを計数し、それらを回収した元のプレート上で確認した。陽性のプ
ラークを、細胞を殺す１滴のクロロホルムを含有するＳＭ緩衝液（Sambrook 等
，同上）に再懸濁し、更なるスクリーニングのため原液として４℃で貯蔵した。
陽性のファージを上記のようにプラーク精製した。
一次スクリーニング中、約５００，０００のプラークをスクリーニングし、１
０，０００のファージ当たり７個の陽性の可能性がある、３４７のクローンが抗
−ＯＶ血清と強力に反応した。これらの陽性のプラークの内４４個を更なる実験
のため無
作為に選択した。これらの４４個のファージを、各ファージストックの均一性を
保証するため、小さなプレート当たり９０から１００％の陽性が得られるよう４
回プラーク精製した。陽性のファージを、抗−ＡＬおよび抗−ＬＬラビット血清
との交叉反応性について検査した。各ファージの適切な希釈物を用い、１μｌの
ファージをＬＢプレート上にスポットし、プラークを形成するまで４２℃でイン
キュベートした。ＩＰＴＧで湿らせたニトロセルロース濾紙を、プレートの表面
上に供し、３７℃で更に３時間インキュベートした。濾紙を、プレートから引き
剥がし、上記のように抗−ＬＬおよび抗−ＡＬ血清を用いて抗−ＯＶ血清一次ス
クリーニングのため測定した。ファージは、抗−ＬＬまたは抗−ＡＬまたは抗−
Schistosoma mansoni（マンソン住血吸虫）血清(Center for Disease Control，
Atlanta GA)からギフトとして得た感染旅行者由来のヒト血清）と反応させた。
更なる実験用の陽性組み換えファージのストックを作るために、プレート洗浄
法を用い高タイターファージ溶解産物を調製した。２００μｌのプレート培養物
（ＥＲ１５７８）を２５，０００−５０，０００のファージと混合した。混合物
を室温で
１５分間インキュベートした。６ｍｌの溶融トップアガロースをこの混合物に加
え、１５ｃｍ幅のＬＢアンピシリンプレート上に注いだ後、ファージプラークの
生育が集密になるまで３７℃でインキュベートした。これは、通常、約５から７
時間かかる。アガロースを固めるため又回収中の細胞の感染を防ぐためにもプレ
ートを４℃で３０分間冷却した。プレート当たり５から１０ｍｌの冷ＳＭ緩衝液
でプレートを重層した。４℃で２時間から一晩、必要に応じてプレートを穏やか
にゆすりながらファージの溶出を行った。ファージを含むＳＭを各プレートから
集め、それぞれの組み換え体を別々にプールした。これらのプレートを、再度、
５ｍｌのＳＭで連続的に洗浄し、洗浄の最後に回収してプールに加えた。約４適
のクロロホルムを溶解物に加え、細菌を完全に溶解するよう穏やかに混合した。
ファージをタイターし、将来の用途に備え４℃で貯蔵した。ＯｖＤ ５Ｂに重点をおいた O．volvulus特異的組み換え体の分析
抗−ＬＬおよび抗−ＡＬ血清と交叉反応できなかったファージを、更に抗原発
現について分析した。一過性溶原物を用いて、クローンにより発現された蛋白質
を大きさに従って分ける目的
で組み換え蛋白質を非常にすばやく調製した。これは、β−ガラクトシダーゼに
融合したものを選ぶのを容易にした。必須工程は、以下の通りであった。ＯＤ60 0
＝２の１ｍｌの大腸菌菌株Ｙ１０８９（Young and Davis，同上）を、１０ｍｌ
のガラスの試験管内で約１０10のファージと混合し、次いで混合物を室温で１５
分間振蕩することなくインキュベートした。６ｍｌのＬＢ培地をファージ／細胞
混合物に加えた。感染した細胞を、すばやく振とうしながら４２−４５℃で１５
分間インキュベートした。ＩＰＴＧ溶液を最終濃度が５ｍＭになるように培養物
に加えた。アンピシリンを同様に１００μｇ／ｍｌの濃度になるように加えた。
培養物を、３７℃で１時間絶えず振とうし、それぞれの組み換えクローンで最良
のファージ生産が得られるよう培養条件を最適化した。細胞をエッペンドルフチ
ューブ内で遠心分離した（７０００ＲＰＭ室温で２時間）。ペレットを、次いで
、ドライアイス上で凍結−融解して細胞を破壊した。尿素溶解法を用いて組み替
え抗原を単離した。細胞ペレットを、尿素溶解緩衝液（４Ｍ尿素、２．５ｘＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ試料緩衝液（Laemmli，U.K．（1979）Nature 227:680-685）に再懸
濁して元々の培養物容量の３％を得た。この混合物を、粘
度を減らすため２１シリンダーゲージニードルを数回通過させるか、又はその代
わりに超音波にかけた。混合物を７０℃で２分間加熱し、不溶性物質がエッペン
ドルフチューブ内でペレット状になった（７０００ＲＰＭ室温で１から３分間）
。組み換え蛋白質を含む上澄を、次いで、分析のため−２０℃で貯蔵した。ウェ
スタンブロット分析（Towbin，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，76: 4350-4354(19
79)）は、クローンＯｖ Ｄ５Ｂが１４５ｋＤａβ−ガラクトシダーゼ融合蛋白質
を発現したことを示した。〜１１４ｋＤａは、β−ガラクトシダーゼ配列を表す
。
陽性のファージのＤＮＡインサートのサイズを、λｇｔｌｌ内の対立プライマ
ーを用いポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）により分析した。１００μｌのＰＣ
Ｒ反応液調製のため、以下のものを混合した：１μｌのＮＥＢプライマー１２２
２（５０−１００ｎｇ／μｌ）、１μｌのＮＥＢプライマー１２１８（５０−１
００ｎｇ／μｌ）、１０μｌの１０Ｘ Ｖｅｎｔポリメラーゼ緩衝液（New Engla
nd Biolabs，Inc．Beverly，MA）、５μｌのｄＮＴＰ Ｍｉｘ(New England Biol
abs，Inc.，Beverly，MA，それぞれ４ｍＭ)、７９μｌの脱イオン水、１μｌの
ファージ溶解産物（上記参照）、２μｌのＶｅｎｔ ＤＮＡポリメ
ラーゼ（New England Biolabs，Inc.，Beverly，MA）。この混合物を、Perkin E
lmer（Norwakl，CT）Thermocylcer 480 内で２０回の増幅サイクル（変性のため
９４℃で３０秒、アニーリングのため５０℃で３０秒および伸長のため７２℃で
２分間）に供した。ＰＣＲの生産物を、１％アガロースゲル電気泳動により分析
した。ファージＯｖ Ｄ５Ｂから増幅した断片は、約１．１ｋｂであった。ＯｖＤ ５Ｂの過剰発現および精製
ｐＭＡＬベクターは、大腸菌内で発現する蛋白質の発現および精製の有用な道
具を提供する。クローンした遺伝子を、マルトース結合蛋白質（ＭＢＰ）をコー
ドするｍａｌＥ遺伝子の下流に挿入する。それによって、ＭＢＰ融合蛋白質の発
現をもたらす。この方法は、クローン配列の高水準の発現を得るために強力なｔ
ａｃプロモーターおよびｍａｌＥ翻訳開始シグナルを用いる。これは、ＭＢＰの
マルトースに対する親和性を用いた、融合生成物の一工程精製を必要とする。用
いたｐＭＡｌ Ｃ２ベクターは、シグナル配列に欠け、発現した蛋白質は、従っ
て、細胞質内に存在する。また、このベクターは、特異的プロテアーゼ、因子Ｘ
ａの認識部位をコードする配列も含有する。これ
は、精製後、目的とする蛋白質からＭＢＰが切断されるのを可能にする。
λｇｔ１１ライブラリーが、元々、ＥｃｏＲＩ部位中へｃＤＮＡをクローニン
グすることにより構築されたこと、およびＯｖＤ ５Ｂがβ−ガラクトシダーゼ
融合物を産生したことから、ＥｃｏＲＩ断片のｐＭＡＬベクター(New England B
iolabs，Inc．Beverly，MA)中への単純なサブクローニングにより、ｐＭＡＬベ
クター中でのマルトース結合蛋白質（ＭＢＰ）とのフレーム内融合をもたらすで
あろう。ｐＭＡＬ Ｃベクターを、制限酵素ＥｃｏＲＩで消化する。酵素および
ベクターの両方を、５００μｌのベクター（５０μｇ）ＤＮＡ(New England Bio
labs，Inc.，Beverly，MA)、６０μｌの１０Ｘ ＥｃｏＲＩ緩衝液（New England
Biolabs，Inc.，Beverly，MA）、６μｌの１０ｍＭのＭｇＣｌ2、２４μｌの脱
イオン水（ｄＨ2Ｏ）、１０μｌのＥｃｏＲＩ(１００単位、New England Biolab
s，Inc.，Beverly，MA)からなる６００μｌの制限消化液中で３７℃で２時間イ
ンキュベートした。環状化をもたらすベクター末端の再アニーリングを防止する
ために、ベクターを脱ホスホリル化してベクターの５´−末端の燐酸基を除去し
た。反応は、以下の通りであ
った。消化したベクター（４９μｇ）に４．９μｇの仔牛腸アルカリホスファタ
ーゼを加えた。反応を３７℃で１時間進行させた。１μｇの消化および脱ホスホ
リル化したベクター(Cip'edベクター)を取り出し、ライゲーション実験にとって
おいた。
ＰＣＲ増幅したＯｖ Ｄ５Ｂインサート断片を、フェノール−クロロホルム抽
出によりきれいにした。このＤＮＡに同容量のフェノールを加え、３０秒間穏や
かに混合し、５分間遠心分離し、上相を回収した。この後、１／２容量のフェノ
ールおよび１／２容量のクロロホルムを上相に加え、３０秒間撹拌し、次いで、
５分間遠心分離し、再度上相を吸い出した。最後の抽出は、上記のように１容量
のクロロホルムで行った。上相を回収し、ＤＮＡを、−２０℃で一晩エタノール
沈殿させた。遠心分離後、ペレットを、１容量のエタノールで洗浄し、風乾した
。この断片を、ベクターのために前述したようにＥｃｏＲＩ制限酵素で消化した
。消化した断片を単離し、下記のように低溶融アガロース法（Sambrook 等，同
上）により精製した。消化した断片を１％溶融アガロースゲル（FMC Corp.，Roc
kland，Me）中での電気泳動により分離した。ゲルを長波ＵＶランプで照射し、
ＤＮＡバンドを、きれいなかみそりの刃で切断し、清浄な
エッペンドルフチューブに入れた。アガロースゲルのこの片を、４５℃の水浴中
で３０分間溶融し、ＤＮＡをフェノール−クロロホルムにより抽出し、上記のよ
うにエタノールで沈殿させた。
インサートのベクターへのライゲーションを、いくつかのモル比（１：１，１
：２，１：４、ベクター：インサート）で試験した。ライゲーション混合物は、
２５ｎｇの CIP'ed ベクター、２．５μｌの１０Ｘライゲーション緩衝液(New E
ngland Biolabs，Inc.，Beverly，MA)、上記で選択した比率に依存して変化した
ナノグラムのインサート、２４μｌにする脱イオン水および１μｌのＴ４ ＤＮ
Ａリガーゼ(New England Biolabs，Tnc.，Beverly，MA、４単位)を含有した。混
合物を１６℃で一晩インキュベートした。この反応では、陽性の対照として役立
てるため及びバックグラウンドを評価するためベクターのみをライゲートした。
各ライゲーション反応物６μｌを用いてＴＢ１コンピテント細胞（(New England
Biolabs，Inc.，Beverly，MA）を形質転換した。形質転換手順は、以下の通り
である。１２．５ｎｇのライゲーション試料を、２００μｌのコンピテント細胞
に加え、３０分間氷上に置いた。この混合物を４２℃で９０秒間熱ショックを与
え、次いで、氷上で５分間冷却した。
これに８００μｌのＬＢ培地を加え、次いで、３７℃で４５分間インキュベート
した。形質転換混合物の１０-1、１０-2希釈物１００μｌを、予め８０μｌの２
％Ｘ−ｇａｌおよび８０μｌのＩＰＴＧを広げておいたＬＢアンピシリンプレー
ト上にプレーティングした。これらのプレートを３７℃で一晩インキュベートし
た。翌日、クローンを計数した。いくつかの方法を用いて陽性のサブクローンを
同定した。初めの方法は、ＩＰＴＧおよびＸ−ｇａｌが入ったプレートを用いた
色によるスクリーニングであった。インサートを含むプラスミドは、青色の代わ
りに白色になるであろう。従って白色コロニーを探すことになるであろう。白色
クローンを、New England Biolabs，Inc．蛋白融合マニュアル(Riggs，Current
Protocols in Molecular Biology，Supplement 19，Unit 16.6，16.6.1-16.6.14
ページ)に述べられた通りに蛋白質生産を調べた。手短に説明すると、白色コロ
ニーの１０ｍｌの培養物を、ＩＰＴＧで誘導し、溶解産物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
ゲルのクマシーブルー染色後に調べた。コロニーが産生する正確なサイズの蛋白
質（期待値＝ＭＢＰからくる４２ｋＤａおよびインサートから〜３０ｋＤａで〜
７０−８０ｋＤａ）を、更に特徴付けした。
次に、１リットルの培養物を用いてアミロース樹脂(New England Biolabs，In
c.，Beverly，MA)上でＭＢＰ融合蛋白質をアフィニティ精製した。１００ｍｇ／
ｍｌのアンピシリンを含有する１リットルの富栄養ブロスにＯｖ Ｄ５Ｂプラス
ミドを含有するＴＢ１細胞の一夜培養物１０ｍｌを加えた。細胞を２ｘ１０8細
胞／ｍｌ（ＯＤ600〜０．５）に培養し、３ｍＭのＩＰＴＧで誘導した。誘導は
、３７℃で３時間であった。細胞を、４℃で１０分間４０００ｘｇで遠心分離す
ることにより回収し、５０ｍｌの溶解緩衝液（１０ｍＭの燐酸Ｎａ、ｐＨ７．２
、３０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのβ−メルカプトエタノール、１ｍＭのＥＤＴ
Ａ）に再懸濁した。細胞は、細胞溶解を容易にするため凍結するが又は直接用い
た。細胞を、次いで、超音波処理し、最大値が得られるまでＢｒａｄｆｏｒｄ（
同上）の方法により遊離させた蛋白質を測定することにより溶解を監視した。完
全な超音波処理後、細胞破片を遠心分離し、上澄を集めた。アフィニティカラム
を準備するために、予め膨潤しておいたアミロース樹脂(New England Biolabs，
Inc.，Beverly，MA)を、５カラム容量のアミロースカラム緩衝液（１０ｍＭの燐
酸Ｎａ、ｐＨ７．２、０．５ＭのＮａＣｌ）で洗浄した。粗
上澄をカラム緩衝液で５倍に希釈し、４℃で１ｍｌ／分の流速で洗浄樹脂上に供
した。未結合の蛋白質および非特異的に弱く結合した蛋白質を、１０カラム容量
のカラム緩衝液でカラムを通過洗浄した。結合した蛋白質を、カラム緩衝液中の
１０ｍＭのマルトースで溶出し、３ｍｌの画分を集めた。これらの画分を、定量
はＢｒａｄｆｏｒｄ法ならびにサイズおよび純度はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析
した。ＭＢＰ−ＯｖＤ ５Ｂ融合物を含有するこれらの画分をプールし、更なる
精製または直接使用のため−２０℃で凍結した。ＯｖＤ ５Ｂの場合、３７℃で
の誘導は、主として切断されたＭＢＰおよび、少量の全長を有する融合物をもた
らした。異なる誘導時間および温度で調査した。ＯｖＤ ５Ｂでは、誘導の最適
温度は、２０℃未満で３時間から一晩である。崩壊産物から全長を有する融合物
を分離する必要がある場合、ＭｏｎｏＱカラム(Pharmacia，Piscataway，NJ)上
で高速蛋白質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）を用いた。
融合物のＯｖＤ ５Ｂ部分からＭＢＰを取り出すための因子Ｘａ切断を、いく
つかの濃度（０．５−２％ｗ／ｗ比）、温度（室温または４℃）および時間（１
時間から一晩）で試みた。ＯｖＤ ５Ｂの部分的ＤＮＡ配列決定
ＭＢＰ−ＯｖＤ ５Ｂ融合物をコードする組み換えｐＭＡＬＣプラスミドを、
ベクター配列（ＮＥＢ １２３７およびＮＥＢ １２２４）内由来のプライマーを
用いて部分的に配列決定した（Sanger ら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，74:54
63-5467(1977)）。ＯｖＤ ５Ｂインサートの末端の配列分析は、それが、Ｏｖ３
３−３と呼ばれ最初にLucius等，(1988)，同上により、Ｏｃ３．６と呼ばれ後に
Chandrashekar 等，(1991)同上により説明されたＯｖ３３ファミリーの一員を
コードすることを示した。綿密な分析は、本発明者等のクローンが上記既述のク
ローンより大きいこと及び、本発明者等の配列が１回の配列決定実験から得られ
た予備的データであったことから５´−末端（図５）にいくらかの相違があった
。ＮＥＢプライマー１２２４を用いて得られた配列は、ｃＤＮＡ断片の３´−末
端を表し、アンチセンス鎖（即ち、翻訳の逆方向）を表す。それは、Ｏｖ３３−
３配列の３´−末端と類似しているが、Ｏｖ３３−３の末端の先に続いている。
非常に予備的配列データであるにも関わらず、この情報は、ＯｖＤ ５ＢがＯｖ
３３様蛋白質をコードしていることを示すのに十分であった。
プライマーＮＥＢ １２２４を有するＯｖ Ｄ５Ｂ配列（配列番号：１０）（こ
の配列がＥｃｏＲＩ部位（ＧＡＡＴＴＣ）を含むことに注目）：
ＯｖＤ ５Ｂ融合ベクターをコードするプラスミドＤＮＡを、ブダペスト条約
の期間および条件下でアメリカンタイプカルチャーコレクションに１９９６年４
月２２日に寄託し、ＡＴＣＣ登録番号９７５０７を受け取った。
実施例ＩＩＩ
Dirofilaria immitisのＤｉＴ３３抗原をコードする
ＤＮＡの単離および特徴付け イヌ抗−ＯｖＤ ５Ｂ／ＤｉＴ３３抗体のアフィニティ精
研究所で育てたイヌを、述べられたように（Mejia＆Carlow（1994）同上）D．
immitisで実験的に感染させた。
ＭＢＰ／ＯｖＤ ５Ｂと反応性の抗体を、D．immitisでの感染後２７週目に集
めた血清からニトロセルロース上で精製した。
ＭＢＰ／ＯｖＤ５Ｂ（５０μｇ）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料カクテル（３．２Ｍ
の尿素、１％ＳＤＳおよび５％２−メルカプトエタノールの最終濃度で含有）中
で５分間煮沸した。試料を５分間微小遠心分離機にかけ、上澄を１０−２０％Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥミニ−ゲル（Diiachi，東京，日本）上で電気泳動にかけ、ニト
ロセルロースに移した。ニトロセルロース膜を、５％酢酸中のＰｏｎｃｅａｕ
Ｓ溶液(Sigma，St．Louis，MO)で染色し、蒸留水ですすぎ、融合蛋白質に相当す
るバンドを、次いで、一つの片として水平に切断した。この片を、ＰＢＳ中の１
％ミルクでブロックし、１％ミルクを含有するＰＢＳ−Ｔで希釈したイヌ血清（
１：１００）中で３７℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳ０．１％Ｔｒｉｔ
ｏｎ Ｘ−１００で３回の洗浄後、免疫精製した抗体を０．１Ｍグリシン緩衝液
ｐＨ２．５で溶出し、ｐＨを１ＭのトリスｐＨ８．０で中和した。D ．immitis ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング
特に断らない限り、クローニングおよび発現（下記）に用いた全ての試薬、キ
ットおよび細菌の菌株は、New England Biolabs，Inc．(Beverly，MA)から入手
しており、製造元により説明された通りに用いた。λｇｔ１１中のD．immitis成
虫ｃＤＮＡラ
イブラリー(Grandea等，Mol．Biochem．Parasitol．35:31-41(1989))は、親切に
もL．McReynolds博士(New England Biolabs，Inc.，Beverly，MA)により提供さ
れ、約１００，０００のファージを、アフィニティ精製したイヌ抗−ＭＢＰ／Ｏ
ｖＤ５Ｂ抗体で免疫スクリーニングした。配列決定
陽性のクローンを、次いで、配列決定のためｐＵＣ１９内にサブクローンした
。ＤｉＴ３３をコードするｃＤＮＡの完全な配列を、CircumVent Thermal Cycle
Dideoxy DNA Sequencing Kitを用い、またはABI 373A 自動化シーケンサー（Ap
plied BioSystems Division，Perkin-Elmer Corporation，Foster City，CA）お
よびTaq DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit（Applied BioSystems Div
ision，Perkin-Elmer Corparation，Foster City，CA）を用いて両方向で測定し
た。
ＤＮＡ配列を、ジェネティックスコンピューターグループ（ＧＣＧ）ソフトウ
ェアを用いて分析した。誘導したアミノ酸配列を、プログラムＰＩＬＥＵＰを用
いて一列にした（ギャップ重量＝３．０、ギャップ鎖長当たり重量＝０．１）。ＤｉＴ３３のヌクレオチドおよび推測されるアミノ酸配列
同定した７個のクローンの内４個は、末端配列分析によりＯｖ３３と類似して
おり、３個は、ＤｉＴ３３の配列をコードする全鎖長を含有していた。最も長い
５´非翻訳配列を有するクローンを、両方向で完全に配列決定した。このｃＤＮ
Ａ（図６）は、７８５ｂｐ鎖長であり、線虫に特異的な２２のヌクレオチドの１
２のヌクレオチドがスプライスされたリーダー配列（Takacs 等，Proc．Natl．A
cad．Sci 85:7932-7936(1988)）を含有する。転写解読枠は、８．１の予想ｐＩ
を有する２３４のアミノ酸（ａａ）蛋白質（２６．４ｋＤ）をコードする。残基
１７（アラニン）の後に切断部位を示唆するポテンシャルシグナルペプチドが存
在する（von Heijne，Eur．J．Biochem．133:17-21(1983)）。予想されたアミノ
酸配列は、コンセンサス配列ＮＸＳ／Ｔがないことに基づくポテンシャルＮ−結
合グリコシル化部位を含まない(Kornfield & Kornfield Ann．Rev．Biochem．54
:631-634(1985)）。
推測されたＤｉＴ３３アミノ酸配列を、Ascaris suum由来のペプシン阻害物質
（Ａｓｐｉ３）の既知のアミノ酸配列および種々の糸状虫種由来の相同体の推測
されたアミノ酸配列と比
較した（図７）。糸状虫蛋白質は、３つの更なるブロックの配列（ＤｉＴ３３残
基１−２８、８２−１１２、１７３−２０１）のため、大きさがAscaris蛋白質
（１４９アミノ酸）よりかなり大きい（２３３−２３５アミノ酸）。このファミ
リーの蛋白質の他の構成員と同様に、D．immitis配列もまた、保存されたシステ
イン残基、およびペプシン阻害物質の「活性部位」であることが仮定されてきた
全ＹＶＲＤＬＴ（配列番号：１１）モチーフ(Willenbucher，Mol．Biochem．Par
asitol．57:349-351(1993))を含有している。D．immitis配列は、Ａｓｐｉ３（
３０％／４９％）配列よりもＯｖ３３（８３％／８９％）、Ｂｍ３３（７６％／
８７％）およびＡｖ３３（７５％／８８％）配列とより密接に関連している。
実施例ＩＶ
組み換えＤｉＴ３３の精製および特徴付け ｐＭＡＬｃ２内へのサブクローニングおよびＭＢＰ融合蛋白質の発現
ＭＢＰとの融合蛋白質を得るために、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）によ
り細菌発現ベクターｐＭＡＬ−ｃ２中へのＤｉＴ３３のクローニングができるよ
うにプライマーを設計した。
前方向プライマーは、ＤｉＴ３３の転写解読枠の開始点に対応し（推定上のシグ
ナルペプチドを除く、残基１−１７）、配列５´−ＡＧＣＧＴＣＡＴＡＡＡＴＣ
ＧＡＣＡＣＡＡＣＡＡＡＣＧＴ−３´（配列番号：１２）を有した。逆方向プラ
イマーは、蛋白質の最後の６個の残基に対応し、２つの停止コドンおよびＨｉｎ
ｄＩＩＩ認識部位（５´−ＣＧＣＧＡＡＧＣＴＴＣＴＡＴＴＡＡＴＡＡＡＴＴＧ
ＣＡＡＴＡＣＡＧＡＡ−３´（配列番号：１３））を含有した。１μｇの鋳型ｐ
ＵＣ１９ＤＮＡについてＤｅｅｐ Ｖｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼを用い９５℃／
１分、５０℃／１分、７２℃／２分を１０サイクル、続いて７２℃で５分間、Ｐ
ＣＲ法を行った。ＰＣＲ生成物を、１％低融点アガロースゲルにかけ、２Ｕのβ
−アガラーゼ（New England Biolabs，Inc.，Beverly，Massachusetts）で３０
分間切断消化した。上澄を、次いで、フェノール抽出し、エタノール沈殿し、次
いで、蒸留水に再懸濁した。ライゲーション前に、ＤＮＡを、ＸｍｎＩおよびＨ
ｉｎｄＩＩＩで消化した。ｐＭＡＬ−ｃ２中へのライゲーションおよび形質転換
ライゲーションおよび形質点を、実質的にNew England Biolabs Protein Fusi
on and Purification System
Instruction マニュアル(New England Biolabs，Inc.，Beverly，Massachusetts
)に記載されている通りに行った。手短に言うと、ｐＭＡＬ−ｃ２ベクターを、
ＸｍｎＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ベクターとインサートの比率１：２８
のライゲーションを用いた。４０００ Ｕ Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（New England B
iolabs，Inc.，Beverly，Massachusetts）を用い１６℃で一晩ライゲーションを
行った。ライゲーション混合物を５０μｌのコンピテント細胞（ＥＲ ２２６７
）に加え、氷上で３０分間インキュベートし、２分間４２℃に加熱し、３７℃で
１時間９００μｌＬＢと混合し、次いで、ＬＢ／アンピシリンプレート上でプレ
ーティングし、一晩生育させた。
白色コロニーの選択のため、８０μｇ／ｍｌのＸ−ＧＡＬおよび０．１Ｍのイ
ソプロピルβ−Ｄ−チオガタラクト−ピラノシド（IPTG，Sigma，St．Louis，MO
）を含むＬＢ／アンピシリンプレート上に陽性の形質転換体をストリークした。
Ｑｉａｇｅｎ（Studio City，CA）ミニプレップシステムを用い製造元の指示書
に従って陽性のコロニーからミニプレップＤＮＡを調製した。ＭＢＰ／ＤｉＴ３３の生産および精製
１個のコロニーを拾い２０ｍｌのＬＢアンピシリン中で３７℃で一晩生育させ
、これを、２Ｌの予め温めておいた富栄養ブロスプラスアンピシリンに移した。
ＤｉＴ３３−ＭＢＰ融合物（ＮＥＢ＃１００１）を含有する細菌細胞（菌株ＥＲ
２２６７）を、３７℃で対数増殖期（ＯＤ600＝０．８）に生育させ、１２℃で
一晩０．５ｍＭのＩＰＴＧで誘導した。５，０００ｘｇで遠心分離し、細胞を２
００ｍｌのカラム緩衝液（２０ｍＭトリスＨＣｌ、２００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍ
ＭのＥＤＴＡ）に再懸濁し、−２０℃で一晩冷凍した。懸濁物を冷水中で解凍し
、懸濁液が透明になるまで毎回１分間超音波処理した。超音波処理物を、次いで
、３０，０００ｘｇで遠心分離し、上澄を、１０容量のカラム緩衝液で平衡にし
ておいた２．５ｘ１５ｃｍのアミロースカラムにかけた。カラムを、８容量の正
規のカラム緩衝液および、０．５ＭのＮａＣｌを含有する２容量のカラム緩衝液
で洗浄した。ＭＢＰ／ＤｉＴ３３を、カラム緩衝液プラス１０ｍＭのマルトース
で溶出した。この手法で４５−６０ｍｇの融合蛋白質／Ｌを得た。
大腸菌ＥＲ２２６７（ＮＥＢ＃１００１）中のＤｉＴ３３の
試料を、ブダペスト条約の期間および条件下で１９９６年３月２９日アメリカン
タイプカルチャーコレクションに寄託し、ＡＴＣＣ登録番号９８０１８を受け取
った。
実施例Ｖ
血清学的分析
イヌの血清を、TRS Laboratories Inc．(Athens，GA)から購入した。D．immit
isを実験的に感染させた全ての動物は、研究所で飼育され腸蠕虫およびDipetalo
nema reconditumの両方の感染がないことが分かっている。種特異性の研究のた
め、血清試料を、以下のイヌの普通の寄生虫：Toxocara canis（イヌ回虫）、To
xascars leonina、Ancylostoma caninum（イヌ鉤虫）、Dipetalonema reconditu
m、Taenia（条虫）亜種の１種以上を保持するイヌから集めた。
用いた固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）は、前述（Mejia & Carlow，(1994)
，同上）の通りである。全ての血清試料は、二重または三重に試験した。マイク
ロタイトレーションプレート
のウェルを、４℃で一晩、０．０５Ｍの重炭酸緩衝液、ｐＨ９．６中の最適濃度
のＭＢＰ／ＤｉＴ３３（２００ｎｇ／１００μ
ｌ／ウェル）またはＭＢＰ（８０ｎｇ／１００μｌ／ウェル、対照として）で被
覆し、次いで、４℃で一晩、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含有する燐
酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（ＰＢＳ−Ｔｗ）中の２％ミルクでブロックした。プレ
ートを真空で乾燥し、使用する時まで密封した。１００μｌのイヌ血清（ＰＢＳ
−Ｔｗで１：１００または１：２００に希釈）およびＰＢＳ−Ｔｗで１：５００
に希釈したビオチニル化ヒツジ抗−イヌＩｇＧ（Biodesign International，Ken
nebunkport，ME）中で３７℃で連続１時間のインキュベーション後、結合した抗
体を、
ABC キット，Vector，Burlingame，CA）および基質オルトフェニレンジアミン（
Sigma，St．Louis，MO）を用いて検出した。４ＭのＨ2ＳＯ4の添加により呈色反
応を、停止させた。４９０ｎｍでの吸収（Ａ490）を、次いで、測定した。分析
前に、吸収値を、D．immitisに感染したイヌ由来の血清の標準プールに補正した
。カットオフ値は、平均吸収値プラス感染前血清のプールの３つの標準偏差値と
した。
原検査キットを、購入し、指示された通りに用いた。D ．immitisでの実験的感染の経過中の組み替えＤｉＴ３３に対するイヌの抗体応 答
実験的イヌ糸状虫感染後、一定の間隔で４匹のイヌから血清を集めた。２７週
目に動物を検死した時、かなりの数の成虫（３１−４１）を各イヌから回収し、
２匹の動物がミクロフィラリア血症であった。
図８Ａ−図８Ｄは、感染の間のＭＢＰ／ＤｉＴ３３に対するイヌのＩｇＧ応答
を示す。著しい抗体応答が、感染後１１週の全てのイヌで観察され、これは、次
いで、次第に増加していき、感染後２５または２７週でピークになった。ＭＢＰ
／ＤｉＴ３３に対するミクロフィラリア血症および非ミクロフィラリア血症のイ
ヌの応答に著しい差異はなかった。ＥＬＩＳＡ（ＭＢＰ）の対照では、イヌの血
清は、ＭＢＰ抗原と反応しなかった。従って、観察された応答は、ＤｉＴ３３に
向けられていた。
料は、両方の検査で陰性を示した。２７週目に集めた血清は、
では２つの試料がきわどく陽性であった（表２、初期検出期）。また、これら４
つの血清をSnapTMを用いて検査した。ただ一つの試料が、きわどく陽性の読みを
出した（表２、初期検出期）。
潜在期対検出期イヌ糸状虫感染を有するイヌの抗体応答
ＭＢＰ／ＤｉＴ３３に対する抗体応答を、免疫が仲介する潜在期（ｎ＝１５）
または検出期（ｎ＝４）イヌ糸状虫感染を有する動物で評価した。表２に示すよ
うに、１匹を除く全動物（潜在期）が、ＭＢＰ／ＤｉＴ３３に対する抗体反応を
有した。両方の群の血清試料で同様のＡ490値および範囲を得た。他方、市販の
抗原検査は、２−４の潜在期感染を検出できなかった。ＤｉＴ３３ ＥＬＩＳＡ
で陰性を示した潜在期のイヌ由来の試料は、やはり、３種のキットすべてにより
陰性を示した。
表２に示したデータ（初期検出期、検出期および潜在期試料）に基づき、４つ
の測定法の全体の感度を測定した(表３)。DiT33
６％（２２／２３）、７０％（１６／２３）、８３％（１９／２３）および６３
％（１２／１９）の感度値を算定した。しかしながら、初期検出期の試料を算定
から除くと、市販のキットの値は著しく（それぞれ、８４％、９０％および７３
％）改善される。
ＤｉＴ３３に対するイヌの種特異的抗体応答
イヌで観察された応答が種特異的であるかどうかを決定するために、以下の普
通の寄生虫の１種以上に感染したイヌから集めた合計５１の血清試料のＭＢＰ／
ＤｉＴ３３に対する反応性を測定した：Dipetalonema reconditum、Taenia（条
虫）亜種、Toxocara canis（イヌ回虫）、Toxascaris leonina、Ancylostoma ca
ninum（イヌ鉤虫）、および Trichuris（鞭虫属）亜種。これらの動物は、検死
時、D．immitisの成虫を有さなかった。これらの血清を、やはり上記の標準抗原
測定法を用いて処理し、抗体および抗原測定法から得られた結果を比較
した（表２）。
SnapTM検査は、他の感染を有するイヌ由来の試料全てに関して実施しておらず、
従って、この検査の特異性値は測定しなかった。しかしながら、同じ試料を用い
たＤｉＴ３３抗体検査で１００％の特異性が観察された（表３）。D ．immitisの予防処を施されたイヌの抗体応答
５０匹のD．immitisの感染性幼虫に感染し、次いで４週間後に５０μｇ／ｋｇ
のアイバメクチンを与えられた１６匹のイヌでＭＢＰ／ＤｉＴ３３に対する抗体
応答を調べた。感染後４ヶ月に各動物から血清を集めた。感染後６ヶ月で動物を
検死したが、成虫は発見されなかった。いずれの試料もＤｉＴ３３と
キットを用いて得られた（SnapTMは評価されなかった）。
実施例ＶＩ
Dirofilaria immitisの循環ＤｉＴ３３抗原、それに特異的なポリクローナルお
よびモノクローナル抗体並びにこのような抗体の調製法およびこのような抗原の
検出法ポリクローナル抗−ＤｉＴ３３抗体の産生
ＤｉＴ３３を含有するポリアクリルアミドゲルスライス片での免疫感作後、ニ
ュージーランドホワイトラビットでラビット抗−ＤｉＴ３３抗体を得た。融合蛋
白質からのＭＢＰの切断を、１％因子Ｘａプロテアーゼを用い３７℃で１時間行
い、試料（５５０−７５０μｇ）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料カクテル（３．２Ｍ
の尿素、１％ＳＤＳおよび５％２−メルカプトエタノールの最終濃度で含有）中
で５分間煮沸した。試料を５分間微小遠心分離機にかけ、上澄を１０−２０％Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥミニ−ゲル（Diiachi，東京，日本）上で電気泳動にかけた。Ｄ
ｉＴ３３に相当するバンドを切り出し、粉砕した。２００−２７５μｇのＤｉＴ
３３の合計６回の皮下／筋肉内注射を、フロイント完全（初めの注射）および不
完全アジュバント（Sigma，St．Louis，MO）にて投与し、注射は２−８週おきに
行った。ポリクローナル抗体は、感染したイヌの血清で発見された循環ＤｉＴ３
３上の抗原決定基と結合する。モノクローナル抗−ＤｉＴ３３抗体の産生
モノクローナル抗体は、マウスのミエローマ系から得た細胞と予めＤｉＴ３３
で免疫感作したマウスから得た脾臓細胞との
融合により形成されたハイブリドーマ細胞系により産生することができる（Carl
ow等，J．Parasiotol．73:1054-1057(1987)）。上記のようなＥＬＩＳＡ手法は
、所望の抗体をスクリーニング、選択およびクローンするのに用いる。モノクロ
ーナル抗体は、感染したイヌの血清で発見された循環ＤｉＴ３３上の抗原決定基
と結合する。マウスの免疫感作およびハイブリドーマ選択
ＢＡＬＢ／ｃ系雌性マウス（６−８週齢）（The Jackson Laboratory，Bar Ha
rbor，ME）を、ＤｉＴ３３を含有するポリアクリルアミドゲルのスライス片で免
疫感作した。融合蛋白質からのＭＢＰの切断を、１％因子Ｘａプロテアーゼを用
い３７℃で１時間行い、試料（５５−８２μｇ）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料カク
テル（３．２Ｍの尿素、１％ＳＤＳおよび５％２−メルカプトエタノールの最終
濃度で含有）中で５分間煮沸した。試料を５分間微小遠心分離機にかけ、上澄を
１０−２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥミニ−ゲル（Diiachi，東京，日本）上で電気泳
動にかけた。ＤｉＴ３３に相当するバンドを切り出し、粉砕した。動物は、２０
−３０μｇのＤｉＴ３３の３回の皮下または腹腔内注射のいずれかを、フロイン
ト完全（初めの注射）
およびフロイント不完全アジュバントにて受けた。
細胞融合の基本的手法は、実質的にFazekas de St．Groth and Scheidegger(J
．Immunol．Meth．35:l-21(1980))のそれである。融合後１０から１４日のハイ
ブリドーマを、ＤｉＴ３３に基づくＥＬＩＳＡを用い少なくとも２回、抗体産生
についてスクリーニングする。陽性のウェルから得た細胞を、スクリーニングの
５−１０日以内に限界希釈法によりクローンし、その後１回再クローンする。モノクローナル抗体の特徴付け
クローンした細胞系によりインビトロで産生した抗体のイソタイプを、商業的
に入手可能なキット(Linscott Catalogue of Immunological Reagents(1996))に
より測定する。プリスタンの初回抗原刺激をうけたマウス内へのハイブリドーマ
細胞の腹腔内注射後、更なる特徴付けのための抗体を得る。モノクローナル抗体
の抗原特異性を、ＤｉＴ３３および、他の蠕虫から調製した抗原抽出物を用いＥ
ＬＩＳＡにより評価する。モノクローナル抗体のエピトープ特異性を、阻害研究
（Nomura 等，J．Immunol．Meth．58:1131(1979)）で測定する。ポリビニルマイ
クロタイタープレートを、上記のようにＤｉＴ３３抗原で被
覆する。ブロック後、ウェルを、未標識のモノクローナル抗体の２倍希釈物に露
出し、３７℃で２時間インキュベートする。洗浄後、適切に希釈したビオチニル
化モノクローナル抗体を加え、プレートを３７℃で１時間インキュベートする。
次いで、反応物を、上記のＤｉＴ３３ ＥＬＩＳＡで述べたように更に展開させ
る。威染したイヌ由来の血清中のＤｉＴ３３を検出するためのポリクローナルまたは モノクローナル抗体の使用法
抗原捕獲測定を、述べられた（Antibodies，Ed Harlow，David Lane による実
験室用マニュアル．Cold Spring Harbor Laboratory 出版(1988)）ようにＥＬＩ
ＳＡフォーマットを用いて行う。ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体又は
その両方のいずれかの種々の組み合わせで、抗原捕獲および検出工程を調べる。
この測定法の個々の工程は、実質的に、ＤｉＴ３３ ＥＬ１ＳＡ抗体検出測定法
のために上記されたように行う。マイクロタイタープレートを、ポリクローナル
またはモノクローナル抗体で被覆する。免役複合体から抗原を遊離するよう前処
理した抗原またはイヌの血清の量を変えて、ウェルに加える。同容量の２００μ
ｌの０．２Ｍの二ナトリウムＥＤＴＡ（ｐＨ
７．５）および０．１Ｍの硼酸緩衝液ｐＨ８．３中の１００μｌの１２％ポリエ
チレングリコール（PEG 8000，Pharmacia，Piscataway，New Jersey）を加える
ことにより、免役複合体を単離する。混合物を、次いで、４℃で１８時間インキ
ュベートし、次いで、１５、０００ｘｇで３０分間遠心分離する。沈殿物を、次
いで、硼酸緩衝液中の冷２．４％ＰＥＧで洗浄する。沈殿物をＰＢＳに溶解し、
５分間煮沸し、０．１Ｍのトリス／ＨＣｌ、ｐＨ２．６を加えるか又は０．１Ｍ
のトリス／ＨＣｌ、ｐＨ２．６中で煮沸し、続いて０．０６ＭのＮａ2ＣＯ3緩衝
液ｐＨ９．６で中和することを含むいくつかの前処理法を用いる。インキュベー
ションおよび洗浄後、適切に希釈したビオチニル化抗体（１００μｌ）を加える
。結合ビオチニル化抗体の検出は、ＤｉＴ３３ＥＬＩＳＡで説明した通りである
。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ
Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｇ０１Ｎ 33/569 Ａ
//(Ｃ１２Ｐ 21/02
Ｃ１２Ｒ 1:19）
(72)発明者 ホン，クシキアン
アメリカ合衆国、マサチユーセツツ・
01923、デンバーズ、ローカスト・ストリ
ート・44
(72)発明者 メヒア，ホン・サンチアゴ
コロンビア国、メデイン、カレラ・69・
セ・ヌメロ・30・セ・79
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １． 分子量約３１−３３ｋＤａを有するディ・イミティス（D.immitis）（イ ヌ糸状虫）由来の実質的に純粋な蛋白質であって、ＯｖＤ ５ＢまたはＤｉＴ３ ３に対して生成した抗血清と反応する前記蛋白質。 ２． 単離するＤＮＡをジロフィラリア・イミティス（Dirofilaria immitis） から得ることのできる、ＤｉＴ３３をコードする単離したＤＮＡ。 ３． ＤｉＴ３３をコードするＤＮＡセグメントを挿入したベクターを含んで成 る組み換えＤＮＡベクター。 ４． 単離するＤＮＡをＡＴＣＣ登録番号９８０１８から得ることのできる、Ｄ ｉＴ３３をコードする単離したＤＮＡ。 ５． 請求項４の単離したＤＮＡを含んで成るクローニングベクター。 ６． 請求項３または５のクローニングベクターにより形質転換される宿主細胞 。 ７． ＤｉＴ３３を生産する方法であって、請求項３または５のベクターで形質 転換した宿主細胞を当該分子の発現に好適な 条件下で培養して成ることを特徴とする前記方法。 ８． 哺乳類におけるイヌ糸状虫感染の免役診断法であって、ｉ）ＤｉＴ３３抗 原またはｉｉ）ＤｉＴ３３、ＯｖＤ５Ｂ、Ｏｖ３３、Ｏｃ３．６又はその誘導体 もしくは断片から成る群から選ばれる抗原に反応性である抗体の存在を測定して 成る前記方法。
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