JP2003506338A

JP2003506338A - 白点症候群ウイルス由来のタンパク質及びその使用

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Publication number: JP2003506338A
Application number: JP2001514132A
Authority: JP
Inventors: フアン・フルテン，マリア・コルネリア・ウイルヘルミナ; フラツク，ユステイヌス・マリア
Original assignee: アクゾ・ノベル・エヌ・ベー
Priority date: 1999-08-03
Filing date: 2000-07-26
Publication date: 2003-02-18
Anticipated expiration: 2020-07-26
Also published as: CN1170934C; EP1206550A1; AU771049B2; US8114977B2; BR0012919A; ATE310089T1; AU6832000A; JP4786093B2; CA2380833A1; WO2001009340A1; ECSP093601A; EP1206550B1; US20090068212A1; CN1626241A; US20100324125A1; CN1367834A; CA2380833C; DE60024100D1; US7749506B2; MY131143A

Abstract

(57)【要約】本発明は、２８ｋＤａ（ＶＰ２８）、２６ｋＤａ（ＶＰ２６）、２４ｋＤａ（ＶＰ２４）及び１９ｋＤａ（ＶＰ１９）の推定サイズを有する白点症候群ウイルス（ＷＳＳＶ）由来の４つの主要タンパク質の単離及び特性化、及び甲殻類動物をＷＳＳＶ感染から防御するためのワクチンの製造におけるその使用に関する。本発明はまた前記タンパク質をコードするヌクレオチド配列及び前記タンパク質の組換え産生におけるその使用を提供する。更に、本発明は前記タンパク質に対する抗体、受動予防接種におけるその使用、及び前記核酸または前記抗体を含む診断キットを提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、白点症候群ウイルス由来のタンパク質、前記タンパク質をコードす
る核酸配列、及び甲殻類動物において白点症候群を予防及び／または治療するた
めのワクチンの製造における前記タンパク質の使用に関する。

【０００２】白点症候群ウイルス（ＷＳＳＶ）は東南アジアの多くの地域でのシュリンプの
重大なウイルス疾患である。このウイルスは甲殻類動物において広い宿主域を有
し（Ｆｌｅｇｅｌ，１９９７）、単離体間での遺伝子変化はほとんどない（Ｌｏ
ら，１９９９）。電子顕微鏡（ＥＭ）研究から、前記ビリオンはエンベロープを
有し、長さ約２７５ｎｍ、幅１２０ｎｍで一端にテール様付属体を有するロッド
またはビュレット形の外観を有する。エンベロープを欠くヌクレオキャプシドは
網状外観及び約３００ｎｍ×７０ｎｍのサイズを有する（Ｗｏｎｇｔｅｅｒａｓ
ｕｐａｙａら，１９９５）。このビリオン形態、その核局在化及びその形態形成
は昆虫のバキュロウイルスを連想させる（Ｄｕｒａｎｄら，１９９７）。元々、
ＷＳＳＮはバキュロウイルス科の非帰属メンバーとして分類されており（Ｆｒａ
ｎｃｋｉら，１９９１）、よってシステミックエクトダーマルメソダーマル(Sys
temic Ectodermal Mesodermal)バキュロウイルス（ＳＥＭＢＶ）または白点(Whi
te Spot)バキュロウイルス（ＷＳＢＶ）と呼ばれていた。現在、ＷＳＳＶは分子
情報がないのでこの科に属さない（Ｍｕｒｐｈｙら，１９９５）。二本鎖ウイル
スＤＮＡは制限エンドヌクレアーゼ分析（Ｙａｎｇら，１９９７）から推定され
るように２００ｋｂ以上のサイズを有する。

【０００３】東南アジアで養殖シュリンプにＷＳＳＶが流行し、シュリンプが大量に死亡し
ている。この病気の特徴は甲皮、付属体及び及びクチクラ上の白点及びシュリン
プの肝膵臓の赤みがかった色である。感染を受けたシュリンプは致死的兆候及び
餌消費の急速な低下を示し、３〜５日以内にこれらのシュリンプは死亡する。Ｗ
ＳＳＶの流行により、養殖シュリンプ業界はかなりの損失を受け、その結果シュ
リンプをＷＳＳＶ感染から防御し得るワクチンが強く要望されている。前記ワク
チンに使用することができる主要構造ＷＳＳＶタンパク質を同定及び特性化する
と、前記ワクチンが開発されるであろう。

【０００４】クーマシーブリリアントブルー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの移動度から推定さ
れる分子量により、ＶＰ２８（２８ｋＤａ）、ＶＰ２６（２６ｋＤａ）、ＶＰ２
４（２４ｋＤａ）及びＶＰ１９（１９ｋＤａ）と命名されたＷＳＳＰの４つの主
要タンパク質が同定された。ＶＰ２６及びＶＰ２４はヌクレオキャプシドタンパ
ク質であり、ＶＰ２８及びＶＰ１９はエンベロープタンパク質である。ＷＳＳＶ
タンパク質のＮ末端アミノ酸残基はタンパク質の配列決定により得られ、ＷＳＳ
Ｖゲノム上の遺伝子（それぞれ、ｖｐ２８、ｖｐ２６、ｖｐ２４及びｖｐ１９）
を同定するために使用した。ｖｐ２６のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ
）は５５５ヌクレオチドを含み、図２ｂに１８４アミノ酸残基配列（配列番号３
）として示すＶＰ２６の推定アミノ酸配列と共に図２ｂ（配列番号１）に示す。
ｖｐ２６の第２オープンリーディングフレームは６１２ヌクレオチドを含み、配
列番号１０として別に示す２０４残基からなる推定アミノ酸配列と共に配列番号
９に示す。ｖｐ２８のオープンリーディングフレームは６１５ヌクレオチド（配
列番号２）を含み、推定アミノ酸配列（配列番号４）と共に図２ｃに示す。ＶＰ
２８の推定アミノ酸配列は２０４アミノ酸である。ＶＰ２６及びＶＰ２８はＮ末
端に想定膜貫通ドメイン及び多くの想定Ｎ−及びＯ−グリコシル化サイトを含む
。遺伝子ｖｐ２６及びｖｐ２８のＯＲＦはそれぞれ２０ｋＤａ及び２２ｋＤａの
理論サイズを有するタンパク質をコードしていた。ＶＰ２６及びＶＰ２８の推定
アミノ酸配列は直接タンパク質配列決定により確認された。ＶＰ２６及びＶＰ２
８の理論サイズはクーマシーブリリアントブルー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの移
動度により推定されるサイズとは６ｋＤａ異なる。このサイズの差はグリコシル
化、リン酸化等の翻訳後修飾から説明され得る。ＶＰ２４のＮ末端アミノ酸配列
及びＶＰ１９の部分アミノ酸配列をそれぞれ配列番号５及び６に示す。ｖｐ２４
の完全オープンリーディングフレームは６２７ヌクレオチドを含み、ＶＰ２４の
推定アミノ酸配列と共に配列番号１１に示す。ＶＰ２４の推定アミノ酸配列は２
０８残基を有し、配列番号１２に別に示す。４つのタンパク質及び各ヌクレオチ
ド配列はＷＳＳＶに対して特異的である。

【０００５】本発明は第１に甲殻類動物をＷＳＳＶ感染から防御するための組換えワクチン
を作製する手段を提供する。既に同定され、特性化されているＷＳＳＶの４つの
主要タンパク質ＶＰ２８、ＶＰ２６、ＶＰ２４及びＶＰ１９が甲殻類動物をＷＳ
ＳＶ感染から防御するためのサブユニットワクチンの製造に使用するのに適して
いることが判明した。本発明のヌクレオチド配列のクローニング及び特性化によ
り、ＷＳＳＶの構造タンパク質が組換えテクノロジーを用いて作製される。この
ようにして、他のＷＳＳＶタンパク質を実質的に含まない組換え構造ＷＳＳＶタ
ンパク質を得ることができる。単離された構造ＷＳＳＶタンパク質は甲殻類動物
をＷＳＳＶ感染から防御するためのサブユニットワクチンを製造するために使用
され得る。或いは、ＷＳＳＶの構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列は
甲殻類動物をＷＳＳＶ感染から防御するためのベクターワクチンを作製するため
に使用され得る。更に、本発明のヌクレオチド配列は診断目的で、例えば現場で
ＷＳＳＶの存在を検出するために使用され得る。加えて、本発明のＷＳＳＶタン
パク質はＷＳＳＶ特異的抗体を作製するために使用され得る。前記抗体は甲殻類
動物の受動免疫化のためのＷＳＳＶワクチンを作製するために使用され得る。前
記抗体は甲殻類動物においてまたはフィールドでのＷＳＳＶの検出のような診断
目的でも使用され得る。

【０００６】従って、第１の態様で、本発明はＷＳＳＶの構造タンパク質を提供する。より
具体的には、本発明は構造タンパク質ＶＰ２４、ＶＰ２６、ＶＰ２８及びＶＰ１
９を提供する。特に、本発明は図２ｂに示すアミノ酸配列（配列番号３）または
その誘導体配列（例えば、配列番号１０）を有するタンパク質ＶＰ２６；及び図
２ｃに示すアミノ酸配列（配列番号４）またはその誘導体配列を有するタンパク
質ＶＰ２８を提供する。本発明は更に配列番号５に示すＮ末端アミノ酸配列ＭＨ
ＭＷＧＶＹＡＡＩＬＡＧＬＴＬＩＬＶＶＩＳＩＶＶＴＮＩＥＬＮＫＫＬＤＫＫＤ
Ｋまたはその誘導体を含むタンパク質ＶＰ２４；及び配列番号６に示す部分アミ
ノ酸配列ＩＶＬＩＳＩ（Ｇ／Ｖ）ＩＬＶＬＡＶＭＮＶ（Ｐ／Ａ／Ｔ）ＭＧＰＫＫ
ＤＳまたはその誘導体を含むタンパク質ＶＰ１９を提供する。好ましくは、タン
パク質ＶＰ２４は配列番号１２に示すアミノ酸配列またはその誘導体配列を有す
る。配列番号３、４、５、６、１０または１２に示すアミノ酸配列の誘導体配列
を有するタンパク質も本発明の範囲に含まれると理解すべきである。本発明では
、タンパク質アミノ酸配列の誘導体は配列番号３、４、１０または１２に示すア
ミノ酸配列或いは配列番号５または６に示す部分配列に比較してタンパク質の抗
原性または免疫原性に影響を及ぼさない程度の変更を含む。本発明では、タンパ
ク質の抗原性特性はＷＳＳＶタンパク質を認識し得る及び／または該タンパク質
と反応し得る抗体を作製するタンパク質の能力と理解される。免疫原性は甲殻類
動物においてＷＳＳＶ感染に対する防御応答を誘発するタンパク質の能力である
と理解される。

【０００７】本発明の配列中で起こり得る変更は、例えば全体配列における１つ以上のアミ
ノ酸の保存アミノ酸の置換、欠失、挿入、逆位または付加により生じ得る。免疫
特性を変更しないと予想されるアミノ酸置換は公知である。関連アミノ酸間のア
ミノ酸置換または進化過程にしばしば起こる置換は、特にＳｅｒ／Ａｌａ、Ｓｅ
ｒ／Ｇｌｙ、Ａｓｐ／Ｇｌｙ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｉｌｅ／Ｖａｌである（Ｄａｙ
ｈｏｆ，Ｍ．Ｄ．，タンパク質配列及び構造のアトラス(Atlas of protein sequ
ence and structure)，Ｎａｔ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓ
ｈｉｎｇｔｏｎＤ．Ｃ．（１９７８），５巻、追補３参照）。この情報に基づ
いて、Ｌｉｐｍａｎ及びＰｅａｒｓｏｎはタンパク質を迅速且つ鋭敏に比較し、
タンパク質相同性を有するタンパク質及びペプチドの機能類似性を調べる方法を
開発した（Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２２７，ｐ．１４３５−１４４１（１９８
５））。所与のアミノ酸配列及びその誘導体を有するタンパク質またはペプチド
間の配列相同性を決定するためにＦＡＳＴＡ、ＴＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ等の数
種のコンピュータプログラムを利用することができる。配列間の最も整合する領
域はこれらのプログラムにより自動的に決定され得る。よって、本発明の誘導体
タンパク質は依然として構造ＷＳＳＶタンパク質を認識し、それと反応すること
ができる抗体を作製するかまたは予防接種した甲殻類動物においてＷＳＳＶ感染
から防御する防御応答を誘発することができる。本発明で使用し得る他の誘導体
タンパク質は、構造ＷＳＳＶタンパク質を認識し、それと反応することができる
抗体を作製するかまたは予防接種した甲殻類動物においてＷＳＳＶ感染から防御
する防御応答を誘発することができるならば、ＷＳＳＶタンパク質の断片である
。

【０００８】第２の態様で、本発明は１つ以上のＷＳＳＶの構造タンパク質をコードする核
酸配列を提供する。より好ましくは、本発明はそれぞれ主要構造タンパク質ＶＰ
２４、ＶＰ２６、ＶＰ２８及び／またはＶＰ１９をコードする核酸配列を提供す
る。特に、本発明はそれぞれＶＰ２６、ＶＰ２８及びＶＰ２４をコードする配列
番号１または９、配列番号２または配列番号１１に示すｖｐ２６、ｖｐ２８及び
ｖｐ２４の核酸配列を提供する。各ヌクレオチド配列は推定アミノ酸配列の第１
Ｍ残基をコードするＡＴＧコドンから始まり、Ｃ末端アミノ酸残基をコードする
コドンまで続く。本発明では、配列番号１、配列番号２、配列番号９または配列
番号１１に示す配列と配列相同性を有する核酸配列も本発明の範囲に入ると理解
すべきである。本発明において配列相同性は少なくとも７０％、好ましくは７５
％、より好ましくは８０％、更に好ましくは８５％であると見做される。配列番
号１、２、９または１１に示す配列と少なくとも９０％、より好ましくは９５％
の配列相同性を有する核酸配列が非常に好ましい。

【０００９】本発明では、配列相同性は当該ヌクレオチド配列を配列番号１、配列番号２ま
たは配列番号１１に示す配列の対応部分と比較することにより決定される。本発
明において配列相同％は比較した配列間での同一ヌクレオチドの％と定義される
。配列相同性は、例えばＢＬＡＳＴＮ等のようなコンピュータプログラムによ
り決定され得る。前記プログラムは自動的に最も整合する領域を定める。

【００１０】本発明の配列相同性を有する核酸配列は、密接に関連するＭＳＳＶ菌株から一
般的なクローニング・ハイブリダイゼーション法により配列番号１、２、１１ま
たは９に示す配列の１つまたは前記配列の断片を用いて容易に単離され得る。本
発明では、ハイブリダイゼーションをストリンジェントな条件下、好ましくは非
常にストリンジェントな条件下で実施する。ストリンジェントなハイブリダイゼ
ーション条件は６５℃の温度で１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの洗浄条件であると
理解される。非常にストリンジェントな条件はＳＣＣ濃度を０．３×ＳＳＣに下
げた洗浄条件を指す。誤って同定された塩基の排除を要するように特定情報を狭
く解釈すべきではない。本明細書に記載の特定配列は他の菌株から相同性ヌクレ
オチド配列を単離するために容易に使用され得る。

【００１１】配列番号１、２または１１に示す配列の１つと配列相同性を有する核酸配列は
、配列番号３、４、１０及び１２に示すアミノ酸配列の１つまたは配列番号５及
び６に示す部分アミノ酸配列の１つと比較してタンパク質の抗原性または免疫原
性に影響を与えない程度の変更を含むアミノ酸配列を有するタンパク質をコード
する。ＶＰ２６タンパク質をコードする前記相同性ヌクレオチド配列の例は配列
番号９に示すヌクレオチド配列であり、これは配列番号３に示すアミノ酸に比較
して変更を有するＶＰ２６タンパク質をコードする。

【００１２】本発明のＷＳＳＶタンパク質は一般的な生化学分離及び精製方法により得るこ
とができ、或いはこのタンパク質は一般的な組換えテクノロジーにより作製され
得る。本発明のヌクレオチド配列は、実質的に他のＷＳＳＶタンパク質を含まな
い構造ＷＳＳＶタンパク質の組換え産生に使用するのに特に適している。ヌクレ
オチド配列はタンパク質を発現し得る適当な発現ベクターに挿入し、適当な宿主
細胞を前記発現ベクターを用いて形質転換し、宿主細胞を適当な培地で培養する
。発現させたタンパク質を細胞または培地から単離、精製することができる。適
当な発現ベクターは、特にプラスミド、コスミド、ウイルス、及び複製及び発現
のために必要な制御領域を含むＹＡＣ（酵母人工染色体）である。発現ベクター
を宿主細胞で発現するために使用し得る。適当な宿主細胞は、例えば細菌、酵母
細胞、昆虫細胞及び哺乳動物細胞である。前記発現技術は当業界で公知である（
Ｓａｍｂｒｏｏｋｅら，分子クローニング：実験マニュアル(Molecular Cloning
: a Laboratory Manual)，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒに所在のＣｏ
ｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ（１９
８９年）発行；ＫｉｎｇａｎｄＰｏｓｓｅｅ，１９９２）。

【００１３】第３態様で、本発明は１つ以上のＷＳＳＶの構造ビリオンタンパク質ＶＰ２４
、ＶＰ２６、ＶＰ２８またはＶＰ１９及び医薬的に許容され得る担体を含むワク
チンを提供する。より具体的には、本発明のワクチンはビリオンタンパク質ＶＰ
２４、ＶＰ２６、ＶＰ２８またはＶＰ１９、または前記タンパク質の２つ以上の
組合せを含む。好ましくは、本発明のワクチンは、配列番号１２に示すアミノ酸
配列、配列番号５に示すＮ末端アミノ酸配列、または前記のいずれかの配列の誘
導体配列を含むＶＰ２４；配列番号３または配列番号１０に示すアミノ酸配列、
または前記のいずれかの配列の誘導体配列を含むＶＰ２６；配列番号４に示すア
ミノ酸配列またはその誘導体配列を含むＶＰ２８；または配列番号６に示すＮ末
端アミノ酸配列またはその誘導体配列を含むＶＰ１９；または前記した２つ以上
のタンパク質の組合せを含む。より好ましくは、本発明のワクチンはＷＳＳＶタ
ンパク質ＶＰ２６及びＶＰ２８、及び任意にＶＰ２４を含む。

【００１４】更に、本発明の核酸配列は甲殻類動物にＷＳＳＶ感染に対する予防接種をする
ためのベクターワクチンを製造するために使用することができる。ベクターワク
チンは、弱毒化生細菌またはウイルスが遺伝子材料に挿入された異種ヌクレオチ
ドを１つ以上含むように修飾されているワクチンであると理解されたい。これら
の所謂ベクター細菌またはウイルスは挿入されたヌクレオチドによりコードされ
る異種タンパク質を同時発現することができる。従って、第４の態様で、本発明
は遺伝子材料中に１つ以上の本発明のヌクレオチド配列を含むように修飾されて
なる弱毒化生細菌または細菌及び医薬的に許容され得る担体を含むベクターワク
チンを提供する。

【００１５】本発明のワクチンは甲殻類動物、例えばＰ．ｍｏｎｏｄｏｎ、Ｐ．ｖａｎｎａｍｅｉ、Ｐ．ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ、Ｐ．ｍｅｒｇｕｅｎｓｉｓまたはＭｅｔａｐｅａｅｕｓｓｐｐ．のようなＰｅｎａｅｉｄａｅ科のメンバーを含めたシュリ
ンプ類；Ｍａｃｒｏｂｒａｃｈｉｕｍｓｐｐ．またはＰａｌａｅｍｏｎｓｐ
ｐ．のようなＰａｌａｅｍｏｎｉｄａｅ科のメンバーを含めたプローン類；Ｃａｌｉｎｅｃｔｅｓｓｐｐ．、Ｐａｌｉｎｕｒｕｓｓｐｐ．、Ｐａｎｕｌｉｒｉｓｓｐｐ．またはＨｏｍａｒｕｓｓｐｐ．のようなＰａｌｉｎｕｒｉｄａｅ及びＮｅｐｈｒｏｐｉｄａｅ科のメンバーを含めたロブスター類；Ａｓｔａｃｕｓｓｐｐ．、Ｐｒｏｃａｍｂａｒｕｓｓｐｐ．及びＯｒｏｎｅｃｔｅｓ
ｓｐｐ．のようなＡｓｔａｃｉｄａｅ科のメンバーを含めたザリガニ類；Ｃａｎｃｅｒｓｐｐ．、Ｃａｌｌｉｎｅｃｔｅｓｓｐｐ．、Ｃａｒｃｉｎｕｓｓ
ｐｐ．及びＰｏｒｔｕｎｕｓｓｐｐ．のようなＣａｎｃｒｉｄａｅ及びＰｏｒｔｕｉｄａｅ科のメンバーを含めたカニ類を防御するために使用することができ
る。ただし、甲殻類動物は上に挙げたメンバーに限定されない。

【００１６】本発明のワクチンは当業者に公知であり、例えばＡ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏら編
、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ
、第１８版、７２章、ｐ．１３８９−１４０４、ＰｈｉｌａｄｅｌｐｈｉｃＣ
ｏｌｌｅｇｅｏｆＰｈａｒｍａｃｙａｎｄＳｃｉｅｎｃｅ（１９９０年
）発行に記載されている方法に従って製造され得る。

【００１７】本発明のワクチンは有効量の１つ以上の本発明のタンパク質、ベクター細菌ま
たはウイルス、及び医薬的に許容され得る担体を含む。本明細書中、「有効」は
甲殻類動物において防御応答を誘発するのに十分な量として定義される。ベクタ
ーまたはタンパク質の量はベクターまたはタンパク質の種類、投与経路、投与時
期、予防接種対象、年令、全身健康状態、体温及び食餌に依存する。

【００１８】通常、動物１匹あたり０．０１〜１，０００μｇのタンパク質、好ましくは動
物１匹あたり０．５〜５００μｇ、より好ましくは動物１匹あたり０．１〜１０
０μｇのタンパク質が使用され得る。ウイルスベクターワクチンの場合、通常動
物１匹あたり１０３〜１０８ｐｆｕ（プラーク形成単位）の量が使用され得る。

【００１９】本発明のワクチンに使用するのに適した医薬的に許容され得る担体は無菌且つ
生理学的に適合するもの、例えば滅菌水、食塩水、水性緩衝液（例えば、ＰＢＳ
のようなアルカリ金属ホスフェート）、アルコール、ポリオール等である。更に
、本発明のワクチンは他の添加剤、例えば助剤、安定剤、酸化防止剤、保存剤等
を含んでいてもよい。

【００２０】適当な助剤には、アルミニウム塩またはゲル、カルボマー、非イオン性ブロッ
クコポリマー、トコフェロール、モノホスフェリル脂質Ａ、ムラミルジペプチド
、油エマルション、グルカン、サイトカイン、サポニン（例えば、ＱｕｉｌＡ
）等が含まれるが、これらに限定されない。添加される助剤の量は助剤そのもも
のの種類に依存する。

【００２１】本発明のワクチンに使用するのに適した安定剤には、炭水化物（例えば、ソル
ビトール、マンニトール、スターチ、スクロース、デキストリン及びグルコース
）、タンパク質（例えば、アルブミンまたはカゼイン）、または緩衝液（例えば
、アルカリホスフェート）が含まれるが、これらに限定されない。

【００２２】好適な保存剤には、特にチメロサール及びメルチオラートが含まれる。

【００２３】本発明のワクチンは注射、液浸、浸漬、噴霧またはエアゾールを介して、また
は経口的に投与され得る。好ましくは、前記ワクチンは、特に商業的養殖場では
液浸または経口により甲殻類動物に投与される。

【００２４】経口投与の場合、ワクチンを経口投与に適した担体、すなわち、セルロース、
食物、代謝可能物質、例えばα−セルロース、または植物または動物起源の各種
油と混合することが好ましい。本発明のワクチンを経口デリバリーするための特
に好適に食物担体はワクチンをカプセル化することができる生餌生物(lived-fee
d organism)である。好適な生餌生物には、プランクトン様非選択的フィルタフ
ィーダー、好ましくは輪形動物（Ｒｏｔｉｆｅｒａ）、ホウネンエビ（Ａｒｔｅｍｉａ）等が含まれるが、これらに限定されない。ブラインシュリンプＡｒｔｅｍｉａｓｐ．が非常に好ましい。

【００２５】本発明のタンパク質は、当業者が利用できる一般的方法を用いて抗体の作製に
使用することができる。好ましくは、前記タンパク質は特異的モノクローナル抗
体を作製するために使用される。本発明の抗体は標準的方法に従って作製され得
る。動物（例えば、マウス）をタンパク質で免疫化し、タンパク質特異的モノク
ローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択する方法は当業界で公知である（
例えば、Ｃｌｉｇａｎら編，Ｃｕｒｒｅｎｔｐｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎｉｍ
ｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９９２；Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒ
ｅ，２５６，ｐ．４９５−４９７（１９７５）；Ｓｔｅｅｎｂａｋｋｅｒｓら，
Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．，１９，ｐ．１２５−１３４（１９９４）参照）。
得られた抗体は現場でＷＳＳＶを検出するため、または甲殻類動物におけるＷＳ
ＳＶの存在を検出するための診断において使用され得る。本発明のヌクレオチド
配列は診断に使用するのにも適している。前記配列またはその断片は、例えば現
場でまたは甲殻類動物においてＷＳＳＶの存在を検出するためのＰＣＲ法におい
て使用され得る。従って、別の態様で、本発明は１つ以上の本発明のヌクレオチ
ド配列または抗体を含む診断キットを提供する。

【００２６】本発明のタンパク質ＶＰ２８、ＶＰ２６、ＶＰ２４及びＶＰ１９に対する抗体
は更に甲殻類動物の受動免疫化のための抗体ワクチンを製造するために使用され
得る。従って、別の態様で、本発明はＶＰ２８、ＶＰ２６、ＶＰ２４またはＶＰ
１９、または前記タンパク質の２つ以上の組合せに対する抗体を含むＷＳＳＶに
対する受動免疫化のためのワクチンを提供する。前記ワクチンは上記したように
標準的方法により製造され得る。好ましくは、抗体の経口投与用ワクチンは、抗
体を食用担体（例えば、魚の餌）と混合して製造される。より好ましくは、ワク
チンは鶏卵で作製した抗体（ＩｇＹ抗体）から製造される。

【００２７】下記実施例は本発明の例示であり、決して本発明を限定すると解釈すべきでな
い。

【００２８】（図面の説明）図１は、ＷＳＳＶタンパク質。（Ａ）逆染色した無傷のビリオンのＴＥＭ写真
。（Ｂ）逆染色したＷＳＳＶヌクレオキャプシドのＴＥＭ写真。（Ｃ）精製ＷＳ
ＳＶの１５％クーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル。レーン１：低分子量タンパ
ク質マーカー、レーン２：非感染シュリンプの精製「ＷＳＳＶ粒子」、レーン３
：精製ＷＳＳＶ粒子、レーン４：精製ＷＳＳＶヌクレオキャプシド。

【００２９】図２は、ＷＳＳＶＶＰ２６及びＶＰ２８のヌクレオチド配列。（Ａ）ＷＳＳ
Ｖゲノム断片上のＶＰ２６及びＶＰ２８の位置。（Ｂ）ＶＰ２６のヌクレオチド
及びタンパク質配列。（Ｃ）ＶＰ２８のヌクレオチド及びタンパク質配列。ｖｐ
２６及びｖｐ２８のＯＲＦはそれぞれ推定アミノ酸配列の第１Ｍ残基をコードす
るＡＴＧコドンから始まる。Ｎ末端配列アミノ酸は太字で示す。想定Ｎ−グリコ
シル化サイトの位置には下線を付し、想定Ｏ−グリコシル化サイトの位置には二
重下線を付した。ＶＰ２８上の縮重プライマー位置のヌクレオチド配列はイタリ
ックで示す。

【００３０】図３は、（Ａ）ＶＰ２６及び（Ｂ）ＶＰ２８の疎水性プロットである。

【００３１】図４は、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル及びウェスタンブロットで分析した昆
虫細胞におけるＷＳＳＶ構造タンパク質のバキュロウイルス発現。（Ａ）Ｓｆ２
１細胞の抽出物のクーマシー染色ゲル。レーン１：低分子量タンパク質マーカー
、レーン２：モック感染、レーン３：ＡｃＭＮＰＶ−ｗｔ感染、レーン４：Ａｃ
ＭＮＰＶ−ＧＦＰ感染、レーン５：ＡｃＭＮＰＶ−ＷＳＳＶｖｐ２６感染、レー
ン６：ＡｃＭＮＰＶ−ＷＳＳＶｖｐ２６感染、レーン７：ＷＳＳＶ。（Ｂ）精製
ＷＳＳＶに対するポリクローナル抗体を用いたウェスタンブロット。

【００３２】図５は、構造タンパク質ＶＰ２８に対する抗血清によるシュリンプ中のＷＳＳ
Ｖの中和。ネガティブコントロール：ＮａＣｌ溶液を投与されたシュリンプ、ポ
ジティブコントロール：ＷＳＳＶを投与されたが、抗血清を投与されなかったシ
ュリンプ、前免疫血清：ＷＳＳＶ及び前免疫血清を投与されたシュリンプ、ＶＰ
２８抗血清：ウイルス及び抗−ＶＰ２８抗血清を投与されたシュリンプ。

【００３３】図６は、シュリンプへのＷＳＳＶタンパク質の予防接種。ネガティブコントロ
ール：ＮａＣｌ溶液を投与されたシュリンプ、ポジティブコントロール：ＮａＣ
ｌ及びＷＳＳＶを投与されたシュリンプ、群３：ＶＰ２４を予備接種されたシュ
リンプ、群４：ＶＰ２６ｃを予備接種されたシュリンプ、群５：ＶＰ２８を予備
接種されたシュリンプ、群６：ＶＰ２４、ＶＰ２６ｃ及びＶＰ２８の混合物を予
備接種されたシュリンプ。

【００３４】（実施例）方法白点症候群ウイルスの調製及び精製本研究で使用したウイルスはタイからの感染Ｐｅｎａｅｕｓｍｏｎｏｄｏｎシュリンプから単離した。感染組織をＴＮ緩衝液（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ，
４００ｍＭＮａＣｌ，ｐＨ７．４）中で均質化した。１，７００×ｇで１０分
間遠心後、上清を０．４５μｍフィルターを用いて濾過した。濾液を健康なＰ．ｍｏｎｏｄｏｎの第４腹節の外側域に筋肉内注射して、感染を開始した。４日後
に体液を瀕死状態のシュリンプから抜き、抗凝固剤として修飾Ａｌｓｅｖｅｒ溶
液（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚら，１９９５）と混合した。ＴＮＥ（２０ｍＭトリス
−ＨＣｌ，４００ｍＭＮａＣｌ，５ｍＭＥＤＴＡ，ｐＨ７．４）で希釈後、
体液を４℃において１，７００×ｇで１０分間遠心して清澄化した。ウイルス粒
子を４℃において４５，０００×ｇで１時間遠心して沈降させ、ペレットからＴ
Ｎに懸濁させた。

【００３５】ウイルスエンベロープを、ＮｏｎｉｄｅｔＰ４０（ＮＰ４０）で処理して上
記ウイルス粒子から除去した。１％ＮＰ４０をウイルス溶液に添加し、ゆっく
り揺り動かしながら室温で３０分間インキュベートした。ヌクレオキャプシドを
４℃において８０，０００×ｇで３０分間沈降させた。ペレットをＴＥ（１０ｍ
Ｍトリス−ＨＣｌ，１ｍＭＥＦＴＡ，ｐＨ７．５）に溶解した。

【００３６】ビリオン懸濁液のＳＤＳ−ＰＡＧＥタンパク質分析のために、ＷＳＳＶビリオン調製物（エンベロープを有するビ
リオン、ヌクレオカプトジ及びネガティブコントロール）を１５％ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥゲルにおいて分析した。タンパク質をクーマシーブリリアントブルー染色
を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに可視化した。

【００３７】電子顕微鏡検査透過型電子顕微鏡検査（ＴＥＭ）のために、ウイルス懸濁物を、リンタングス
テン酸（２％ＰＴＡ）で逆染色されているｆｏｒｍｖａｒコートした炭素安定
化ニッケルグリッド（４００メッシュ）上に載せた。試料をＰｈｉｌｉｐｓＣ
Ｍ１２電子顕微鏡を用いて検査した。

【００３８】核酸精製ウイルスＤＮＡを、プロテイナーゼＫ（０．２ｍｇ／ｍｌ）及びサルコシル（
１％）を用いて４５℃で３時間処理した後フェノール／クロロホルム抽出し、Ｔ
Ｅ（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ，１ｍＭＥＤＴＡ，ｐＨ７．５）に対して透析
することにより精製ビリオンから単離した。ＤＮＡの純度及び濃度をマーカーを
用いてアガロースゲル電気泳動により測定した。

【００３９】プラスミドの構築ＷＳＳＶサブゲノム断片を標準的方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）を用
いてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ＋（Ｓｔａｔａｇｅｎｅ）にクローン化し、
大腸菌ＤＨ５αに形質転換した、ＤＮＡ単離、制限酵素消化、アガロースゲル電
気泳動及びコロニーリフティングは標準プロトコル（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９
８９）に従って実施した。ＰＣＲは注文設計し、合成したプライマーを用いて実
施した。ｖｐ２８のＮ末端をコードするＤＮＡを、全ＷＳＳＶＤＮＡからＶＰ
２８のＮ末端アミノ酸配列に基づく縮重プライマーを用いてＰＣＲ増幅した。使
用した前進プライマーは５’ＣＡＧＡＡＴＴＣＴＣＤＡＴＮＧＴＹＹＴＮＧＴＮ
ＡＣ３’（配列番号７）であり、逆プライマーは５’ＣＡＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧ
ＡＹＹＴＮＷＳＮＴＴＹＡＣ３’（配列番号８）であり、いずれもＥｃｏＲＩサ
イト（下線部）を有する（Ｄ＝Ａ、ＴまたはＧ；Ｎ＝Ａ、Ｃ、ＧまたはＴ；Ｙ＝
ＣまたはＴ；Ｗ＝ＡまたはＴ；Ｓ＝ＣまたはＧ）。ｖｐ２４のＮ末端を、全ＷＳ
ＳＶＤＮＡからＶＰ２４のＮ末端アミノ酸配列に基づく１組の縮重プライマー
を用いてＰＣＲ増幅した。前進プライマーとして５’ＣＡＧＡＡＴＴＣＡＴＧＣ
ＡＹＡＴＧＴＧＧＧＧＮＧＴ３’（配列番号３）を使用し、逆プライマーとして
５’ＣＡＧＡＡＴＴＣＹＴＴＲＴＣＹＴＴＹＴＴＲＴＣＩＡＲＹＴＴ３’（配列
番号１４）を使用し、いずれもＥｃｏＲＩサイト（下線部）を含む。

【００４０】ＤＮＡ配列決定及びコンピュータ分析配列決定のためのプラスミドＤＮＡを、ＱＩＡｐｒｅｐＭｉｎｉｐｒｅｐシ
ステムまたはＪＥＴｓｔａｒプラスミド精製システム（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．
）を用いて精製した。配列決定は普遍ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ前進及び逆ヌクレ
オチドプライマー及び両鎖由来の注文合成したプライマーを用いて実施した。自
動配列決定はＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ自動化ＤＮＡシーケンサー
（ベルギー国に所在のＥｕｒｏｇｅｎｔｅｃ）を用いて実施した。

【００４１】作製した配列をＵＷＧＣＧコンピュータプログラム（リリース１０．０）を用
いて分析した。ＤＮＡ及び推定アミノ酸排列をプログラムＦＡＳＴＡ、ＴＦＡＳ
ＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎ，１９８８）及びＢＬＡＳＴ（Ａｌｔ
ｓｃｈｕｌら，１９９７）を用いて最新のＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ、ＳＷＩＳ
ＳＰＯＲＴ及びＰＩＲデータベースと比較した細胞及びウイルスＳｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ−ＡＥ−２１）細胞（Ｖ
ａｕｇｈｎら，１９７７）を１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を補充したグレース
昆虫培地（ＧＩＢＣＯＢＲＬ）において培養した。Ａｕｔｏｇｒａｐｈｃａ
ｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）のＥ２−株（Ｓｍｉｔ
ｈ及びＳｕｍｍｅｒｓ，１９８２）を野生型（ｗｔ）ウイルスとして使用した。
日常的な細胞培養維持及びウイルス感染方法は公表された方法（Ｓｕｍｍｅｒｓ
及びＳｍｉｔｈ，１９８７；ＫｉｎｇＰｏｓｓｅｅ，１９９２）に従って実施
した。

【００４２】組換え体の工学処理昆虫細胞においてＷＳＳＶＶＰ２４（配列番号１２）、ＶＰ２６（配列番号
３）、ＶＰ２６ｃ（配列番号１０）及びＶＰ２８（配列番号４）を過剰発現する
ためにＢａｃ−Ｔｏ−Ｂａｃシステム（ＧＩＢＣＯＢＲＬ）を使用した。昆虫
細胞の感染時にＢａｃ−ｔｏ−Ｂａｃ組換え体の検出及び滴定を容易にするため
に、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子をｐ１０プロモーターの下流のｐＦａ
ｓｔＢａｃ−ＤＵＡＬベクターに導入した。プラスミドｐＶＬ９２ＧＦＰ（Ｒｅ
ｉｌａｎｄｅｒら，１９９６）をＸｂａｌ及びｋｐｎｌで消化後このプラスミド
からＧＦＰ遺伝子を除去した。７００ｂｐＧＦＰ含有断片をアガロースゲル電
気泳動及びＧｌａｓｓＭＡＸ精製（ＧＩＢＣＯＢＲＬ）により単離し、ＤＮＡ
ポリメラーゼを用いて平滑末端とし、ｐ１０プロモーターの下流のｐＦａｓｔＢ
ａｃ−ＤＵＡＬの多重クローニング領域ＩＩのＳｍａＩサイトに挿入した。生じ
たプラスミドをｐＦａｓｔＢａｃ−Ｄ−ＧＦＰと呼び、ポリヒドリンプロモータ
ーの下流に外来遺伝子の挿入のための領域１を含んでいた。ｐ１０プロモーター
からＧＦＰのみを発現する組換えウイルスをＢａｃ−ｔｏ−Ｂａｃシステムプロ
トコル（ＧＩＢＣＯＢＲＬ）に従って構築し、このウイルスをＡｃＭＮＰＶ−
ＧＦＰと命名した。

【００４３】ＰＣＲをｖｐ２６（配列番号１）及びｖｐ２８（配列番号２）の推定完全オー
プンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むＷＳＳＶプラスミドに対して実施し
、ＯＲＦの３’末端にＢａｍＨＩサイト及び５’末端にＨｉｎｄＩＩＩサイトを
導入した。ｖｐ２６（配列番号１）及びｖｐ２８（配列番号２）をまずｐＥＴ２
８ａベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）にクローン化し、ＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩで切
除し、プラスミドｐＦａｓｔＢａｃ−Ｄ／ＧＦＰのポリヒドリンプロモーターの
下流に挿入した。生じたプラスミドをそれぞれｐＦａｓｔＢａｃ−Ｄ／Ｇ−ｖｐ
２６及びｐＦａｓｔＢａｃ−Ｄ／Ｇ−ｖｐ２８と命名した。ｖｐ２６ｃ（配列番
号９）及びｖｐ２４（配列番号１１）を５’末端にＢａｍＨＩサイト及び３’末
端にＥｃｏＲＩサイトに導入するプライマーを用いて推定ＯＲＦ含有プラスミド
に対してＰＣＲ増幅した。消化後、ｖｐ２６ｃ（配列番号９）及びｖｐ２４（配
列番号１１）のＯＲＦをｐＦａｓｔＢａｃ−Ｄ／ＧＦＰのポリヒドリンプロモー
ターの下流に挿入すると、プラスミドｐＦａｓｔＢａｃ−Ｄ／Ｇ−ｖｐ２６ｃ及
びｐＦａｓｔＢａｃ−Ｄ／Ｇ−ｖｐ−２４が生じた。ｐ１０プロモーターからＧ
ＦＰ及びポリヒドリンプロモーターからＶＰ２４（配列番号１２）、ＶＰ２６（
配列番号３）、ＶＰ２６ｃ（配列番号１０）またはＶＰ２８（配列番号４）を発
現する組換えウイルスをＢａｃ−ｔｏ−Ｂａｃシステムプロトコル（ＧＩＢＣＯ
ＢＲＬ）を用いて構築し、これらのウイルスをそれぞれＡｃＭＮＰＶ−ＷＳＳ
Ｖｖｐ２４、ＡｃＭＮＰＶ−ＷＳＳＶｖｐ２６、ＡｃＭＮＰＶ−ＷＳＳＶｖｐ２
６ｃ及びＡｃＭＮＰＶ−ＷＳＳＶｖｐ２８と命名した。

【００４４】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、タンパク質配列決定及び免疫ブロッティング野生型ＡｃＭＮＰＶ及び異種タンパク質（ＧＦＰ、ＶＰ２６、ＶＰ２８）を発
現する組換えＡｃＭＮＰＶを感染させた昆虫細胞を１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲ
ルにおいて分析した。タンパク質をクーマシーブリリアントブルー染色を用いて
可視化した。半乾燥ブロッティングは、ＣＡＰＳ緩衝液（１０％メタノール中１
０ｍＭＣＡＰＳ）を用いてポリビニリデンジフロリド（ＰＶＤＦ）膜（Ｂｉｏ
−Ｒａｄ）に対して、またはトリス−グリシン緩衝液（２５ｍＭトリス塩基，
１９２ｍＭグリシン，１０％（ｖ／ｖ）メタノール，ｐＨ３．８）を用いてＩ
ｍｍｕｎｏｂｉｌｏｎ（商標）−Ｐ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に対して実施した。
タンパク質をクーマシーブリリアントブルー染色を用いてＰＶＤＦ膜上に可視化
した。ＷＳＳＶビリオン調製物からの主要タンパク質バンドをフィルターから切
除し、Ｎ−末端の配列を決定した（マサチュセッツに所在のＰｒｏＳｅｑ，Ｉｎ
ｃ．）。

【００４５】Ｉｍｍｏｂｕｌｏｎ−Ｐ膜をＴＢＳ（０．２ＭＮａＣｌ，５０ｍＭトリス
−ＨＣｌ，ｐＨ７．４）中２％低脂肪粉乳（オランダ国のＣａｍｐｉｎａ）でブ
ロックした。ブロットをＴＢＳ中で０．２％低脂肪粉乳で１：２，０００希釈し
たポリクローナル家兎抗−ＷＳＳＶ血清（ハワイ州ホノルル大学のＰ．Ｃ．Ｌｏ
ｈ教授から提供された）において室温で１時間インキュベートすることにより免
疫検出した。その後、ホースラディシュペルオキシダーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）
をコンジュゲートした抗−家兎抗体を１：２，０００の濃度で使用し、強化化学
ルミネセント光検出キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で実施した。

【００４６】ＶＰ２８ポリクローナル抗体主要ＷＳＳＶ構造エンベロープタンパク質ＶＰ２８をバキュロウイルスＡｃＭ
ＮＰＶ−ＷＳＳＶｖｐ２８を用いて昆虫細胞において発現させ、Ｐｒｅｐｃｅｌ
ｌ（Ｂｉｏｒａｄ）及び分画コレクターを用いて精製した。ＶＰ２８を含有する
分画を収集し、濃縮した。精製ＶＰ２８タンパク質を家兎に注入して、ポリクロ
ーナル抗体を作製した。この抗体を精製ＷＳＳＶビリオンを含有するウェスタン
ブロットで検査し、ＷＳＳＶビリオン由来のＶＰ２８と十分反応させた。このＶ
Ｐ２８抗血清をＷＳＳＶ中和実験において使用した。

【００４７】ＷＳＳＶウイルスストック１週間前に低濃度ＷＳＳＶを筋肉内注射したザリガニＰｒｏｃａｍｂａｒｕｓｃｌａｒｋｉｉの体液からウイルスを精製して白点症候群ウイルス（ＷＳＳＶ
）ウイルスストックを調製した。前記体液を連続スクロース勾配で精製し、ウイ
ルスバンドを採取した。ウイルスをペレット化した後、ウイルスをＴＥ（ｐＨ７
．５）に溶解した。実験に使用するまでウイルスストックを−７０℃で保存した
。

【００４８】タンパク質のワクチン接種主要ＷＳＳＶ構造エンベロープタンパク質ＶＰ２８（配列番号４）、ヌクレオ
キャプシドタンパク質ＶＰ２６ｃ（配列番号１０）及びＶＰ２４（配列番号１２
）を、ｐ１０プロモーターからＧＦＰ及びポリヒドリンプロモーターからＷＳＳ
Ｖ構造タンパク質を発現するバキュロウイルスＡｃＭＮＰＶ−ＷＳＳＶｖｐ２８
、ＡｃＭＮＰＶ−ＷＳＳＶｖｐ２６ｃ及びＡｃＭＮＰＶ−ＷＳＳＶｖｐ２４を用
いて昆虫細胞において発現させた。感染から３日後に、感染した昆虫細胞を収集
し、音波により破壊した。上清をＰ．ｍｏｎｏｄｏｎに予防接種するために使用
した。本実験には６群のシュリンプを使用した。

【００４９】

【表１】

【００５０】ミックスでは、等容量のＶＰ２８溶液、ＶＰ２６ｃ溶液及びＶＰ２４溶液を混
合してから注射した。予防接種から５日後、シュリンプに追加接種する。２日後
、ＷＳＳＶ（ストックウイルス、中和実験参照）を注射することによりチャレン
ジする。注射後、シュリンプを６日間追跡し、死亡したシュリンプについては電
子顕微鏡によりＷＳＳＶの存在を調べた。

【００５１】結果配列決定のためのＷＳＳＶタンパク質の単離精製ウイルス調製物を筋肉内注射することによりＰｅｎａｅｕｓｍｏｎｏｄｏｎシュリンプをＷＳＳＶ感染させた。感染から４日後、感染動物の体液からウ
イルスを単離した。ネガティブコントロールとして、非感染シュリンプから体液
を採取した。これらの調製物をＷＳＳＶビリオンの存在及び純度について電子顕
微鏡により分析した。非感染動物のサンプルにはウイルス粒子が観察されなかっ
たが、感染動物のサンプル中には多くの主にエンベロープビリオンが観察された
（図１ａ）。ＮＰ４０で処理後ウイルス粒子からウイルスエンベロープを除去す
ると、ＷＳＳＶヌクレオキャプシドの表面に近いセグメント外観特徴（Ｄｕｒａ
ｎｄｓら，１９９７）を有する精製ヌクレオキャプシドが生じた（図１ｂ）。エ
ンベロープビリオン及びヌクレオキャプシドのタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで
分離した（図１ｃ）。ビリオン中にそれぞれ２８ｋＤａ（ＶＰ２８）、２６ｋＤ
ａ（ＶＰ２６）、２４ｋＤａ（ＶＰ２４）及び１９ｋＤａ（ＶＰ１９）の見かけ
分子量を有する４つの主要ペプチドが同定された。数個のやや弱いバンドも観察
された。そこには３０〜６５ｋＤａの範囲に約６個のバンドがあり、８６〜１３
０ｋＤａの範囲に少なくとも７つの弱いタンパク質バンドがある。体液に由来す
る３つの主要タンパク質バンドはビリオンと共精製され、６７〜７８ｋＤａの範
囲に存在する。この領域に存在する小さいタンパク質バンドはこのゲルでは観察
できなかった（図１）。主要ＷＳＳＶタンパク質ＶＰ２８及びＶＰ１９で見られ
るサイズは精製ヌクレオキャプシドを含むレーン（図１ｃ）には存在せず、よっ
てウイルスエンベロープまたは外皮に由来しているようである。ＶＰ２６及びＶ
Ｐ２４はヌクレオキャプシド及びビリオンの両方に存在していた。これから、Ｖ
Ｐ２６及びＶＰ２４はヌクレオキャプシドに由来すると示唆される。

【００５２】ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの内容物を半乾燥ブロッティングによりポリビニリデン
ジフロリド膜に移し、主要ウイルスタンパク質バンドを切り取り、配列決定した
。ＶＰ２８及びＶＰ２６から４０以上のアミノ酸がＮ末端から配列決定された（
それぞれ、図２ｂ及び２ｃに太字で示す）。ＶＰ２６のＮ末端配列はＭＥＦＧＮ
ＬＴＮＬＤＶＡＩＩＡＩＬＳＩＡＩＩＡＬＩＶＩＭＶＩＭＩＶＦＮＴＲＶＧＲＳ
ＶＶＡＮを含んでいた。ＶＰ２８のＮ末端配列決定により、アミノ酸配列ＭＤＬ
ＳＦＴＬＳＶＶＳＡＩＬＡＩＴＡＶＩＡＶＦＩＶＩＦＲＹＨＮＴＶＴＫＴＩＥｔ
ＨｓＤが得られ、このうち３９位のスレオニン及び４１位のセリンは未確定であ
る。Ｎ末端配列はいずれも疎水性である（図３）。ＶＰ２４についてＮ末端ペプ
チド配列決定して得たＮ末端アミノ酸配列はＭＨＭＷＧＶＹＡＡＩＬＡＧＬＴＬ
ＩＬＶＶＩＳＩＶＶＴＮＩＥＬＮＫＫＬＤＫＫＤＫ（配列番号５）である。ＶＰ
１９はＮ末端ブロックされていることが判明し、ＶＰ１９の部分内部配列はＮ末
端ブロックしたペプチドをＣＮＢｒ消化すると得られ、アミノ酸配列ＩＬＶＩＳ
Ｉ（Ｇ／Ｎ）ＩＬＶＬＡＶＭＮＶ（Ｐ／Ａ／Ｔ）ＭＧＰＫＫＤＳ（配列番号６）
であった。ＶＰ１９部分配列の７位のアミノ酸残基はＧまたはＶであり、１７位
はＰ、ＡまたはＴ残基であり得る。

【００５３】２４ｋＤａタンパク質遺伝子の局在化及び配列ＶＰ２４のＮ末端タンパク質配列に基づいて、いずれもＥｃｏＲＩサイト（下
線）を含む、前進プライマーとして５’ＣＡＧＡＡＴＴＣＡＴＧＣＡＹＡＴＧＴ
ＧＧＧＧＮＧＴ３’（配列番号１３）、逆プライマーとして５’ＣＡＧＡＡＴＴＣＹＴＴＲＴＣＹＴＴＹＴＴＲＴＣＩＡＲＹＴＴ３’（配列番号１４）を有する
１組の縮重ＰＣＲプライマーを開発した。鋳型としてＷＳＳＶゲノムＤＮＡを用
いてＰＣＲを実施した。１３３ｂｐ長断片を得、２％アガロースゲルから精製後
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ＋にクローン化し、配列決定した。このＰＣＲ産
物の配列はＷＳＳＶＶＰ２４のＮ末端タンパク質配列（配列番号５）に相当し
、ＶＰ２４の完全ＯＲＦを同定するためにＷＳＳＶプラスミドライブラリーに対
するコロニーリフトアッセイ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，１９８９）におけるプローブ
として使用した。この断片とハイブリダイズする１８ｋｂｐＢａｍＨＩ断片を
更なる分析のために選択した。

【００５４】６２７ヌクレオチドを含む完全ｖｐ２４ＯＲＦ及びこの遺伝子のプロモータ
ー領域が１８ｋｂｐＢａｍＨＩ断片上で認められた。翻訳開始コドンは効率的
な真核翻訳開始（Ｋｏｚａｋ，１９８９）のための好ましい範囲（ＡＡＡＡＴＧＣ）に存在していた。プロモーター領域には、Ａ／Ｔリッチ配列のストレッチが
見られたが、コンセンサスＴＡＴＡボックスは見られなかった。ポリＡシグナル
は翻訳停止コドンと重複していた。ｖｐ２４ＯＲＦ（配列番号１１）は、ＶＰ
２４の実験的に決定したＮ末端配列（配列番号５）を含むアミノ酸配列を有する
２０８アミノ酸（配列番号１２）の推定タンパク質をコードした。ＶＰ２４は２
３ｋＤａの理論サイズ及び８．７の等電点を有する。Ｎ−結合グリコシル化に対
する４つの潜在的サイト（Ｎ−｛Ｐ｝−［ＳＴ］−｛Ｐ｝）、Ｏ−グリコシル化
に対する１つのサイト（Ｈａｎｓｅｎら，１９９８）及び９つの可能なリン酸化
サイト（［ＳＴ］−Ｘ−Ｘ−［ＤＥ］または［ＳＴ−Ｘ−［ＲＸ］）がＶＰ２４
内に認められたが、これらの修飾が起こったかどうかは不明である。ＰＲＯＳＩ
ＴＥデータベースに存在する他のモチーフはＶＰ２４中には見られなかった。２
０８アミノ酸のコンピュータ分析から、ＶＰ２４のＮ末端にアミノ酸６〜２５に
より形成される想定膜貫通α−らせんを含む非常に疎水性の領域が存在すること
が判明した。Ｇａｒｎｉｅｒら（１９７８）のアルゴリズムから、タンパク質に
沿って数個の他のα−らせん及びβ−シートが予測された。

【００５５】２６ｋＤａタンパク質遺伝子の局在化及び配列ＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩの部分ＷＳＳＶゲノムライブラリーをｐＢｌｕ
ｅｓｃｒｉｐｔ−ＳＫ＋（ｖａｎＨｕｌｔｅｎら，２０００）において構築し
、多くのＷＳＳＶ断片から末端ヌクレオチド配列を得た。ＶＰ２６のＮ末端配列
をコードするヌクレオチド配列は６ｋｂＢａｍＨＩ断片の末端近くに存在して
いた（図２ａ）。メチオニン出発コドン（ＡＡＡＡＴＧＧ）の周りの配列は効率
的な真核翻訳開始のＫｏｚａｋルール（Ｋｏｚａｋ，１９８９）に一致した。ｖ
ｐ２６の非翻訳リーダーの４９ヌクレオチドのみが決定され得、末端ＢａｍＨＩ
サイトまで延びていた（図２ａ）。

【００５６】６ｋｂＢａｍＨＩ断片は、ＶＰ２６のＮ末端アミノ酸をコードするものを含
めた５５５ｎｔのオープンリーディングフレームを含んでいた（図２ｂ）。ポリ
Ａシグナルはｖｐ２６の翻訳停止コドンの９４ヌクレオチド（ｎｔ）下流に存在
している。このＯＲＦ（ｖｐ２６）は２０ｋＤａの理論サイズを有する１８４ア
ミノ酸のタンパク質をコードした。推定タンパク質は９．４の等電点を有する塩
基性であった。Ｎ−結合グリコシル化のための３つの潜在サイト（Ｎ−｛Ｐ｝−
［ＳＴ］−｛Ｐ｝）が存在し、３つの想定Ｏ−グリコシル化サイト（図２ｂ）を
プログラムＮｅｔＯｇｌｙｃ（Ｈａｎｓｅｎら，１９９８）を用いて予想した。
１３の可能なリン酸化サイト（［ＳＴ］−Ｘ−Ｘ−［ＤＥ］または［ＳＴ−Ｘ−
［ＲＫ］）が見つかったが、他のモチーフはＰＲＯＳＩＴＥデータベースには存
在しない。ＶＰ２６の１８４アミノ酸の疎水性分析は、非常に疎水性の領域がタ
ンパク質のＮ末端に存在することを示した（図３ａ）。この領域は、α−らせん
の形態でアミノ酸１２〜３４で形成される想定膜貫通アンカーを含んでいた。こ
のアンカーの後には２つのアルギニンを含む正帯電領域があり、このことからＣ
末端部分が細胞質側に向いていることが示唆される（Ｓｏｎｎｈａｍｍｅｒら，
１９９８）。膜貫通α−らせんの他に、Ｇａｍｉｅｒら（１９７８）のアルゴリ
ズムを用いて１２７〜１４１位に潜在的なβ−シートが見つかった。タンパク質
には１つのシステインしか存在せず、タンパク質内ジスルフィド架橋が形成され
得ないことが示された。このシステインはＶＰ２８の場合のようにタンパク質の
Ｃ末端部分に局在化していた。

【００５７】２８ｋＤａタンパク質遺伝子の局在化及び配列ＶＰ２８のアミノ酸配列はＷＳＳＶ末端断片配列の翻訳から得られなかった。
このペプチドのＮ末端配列に基づいて、１組の縮重プライマーが開発された。前
進プライマーは５’ＣＡＧＡＡＴＴＣＴＣＤＡＴＮＧＴＹＴＴＮＧＴＮＡＣ３
’（配列番号７）であり、逆プライマーは５’ＣＡＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＡＹＹ
ＴＮＷＳＮＴＴＹＡＣ３’（配列番号８）であり、いずれもＥｃｏＲＩサイト
（下線）を含んでいた。配列上のプライマーの位置を図２ｃに示す。鋳型として
ゲノムＷＳＳＶＤＮＡを用いてＰＣＲを実施した。１２８ｂｐ長断片が得られ
、２．５％アガロースゲルから精製後ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ＋にクロー
ン化し、配列決定した。ヌクレオチド配列はＷＳＳＶＶＰ２８のＮ末端タンパ
ク質配列をコードし、この１２８ｂｐ断片を数個のＷＳＳＶプラスミドライブラ
リーに対するコロニーリフトアッセイ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）で使用
した。３ｋｂＨｉｎｄＩＩＩ断片をこの断片とハイブリダイズし、更に分析し
た。

【００５８】この遺伝子の６１２ｎｔ及びプロモーター領域の完全ＯＲＦ（ｖｐ２８）が３
ｋｂＨｉｎｄＩＩＩ断片に認められた（図２ｃ）。メチオニン出発コドン（Ｇ
ＴＣＡＴＧＧ）は効率的な真核翻訳開始（Ｋｏｚａｋ，１９８９）のための好ま
しい範囲にある。プロモーター領域には、コンセンサスＴＡＴＡボックスは存在
しなかったが、Ａ／Ｔリッチ領域のストレッチは存在していた。ポリＡシグナル
は翻訳停止コドンの５５ヌクレオチド下流に観察された。前記ＯＲＦはＮ末端配
列アミノ酸を含む２０４アミノ酸の推定タンパク質をコードした。この酸性タン
パク質の理論サイズは２２ｋＤであり、等電点は４．６であった。５つの可能な
Ｎ−結合グリコシル化サイト（Ｎ−｛Ｐ｝−［ＳＴ］−｛Ｐ｝）、２つのＯ−グ
リコシル化サイト（Ｈａｎｓｅｎら，１９９８）（図２ｃ）及び９つの可能なリ
ン酸化サイト（［ＳＴ］−Ｘ−Ｘ−［ＤＥ］または［ＳＴ−Ｘ］−［ＲＫ］）が
見られた。ＰＲＯＳＩＴＥデータベース中に存在する他のモチーフはＶＰ２８で
は認められなかった。

【００５９】２０４アミノ酸タンパク質のコンピユータ分析は、アミノ酸９〜２７により形
成される想定膜貫通α−らせん配列を含む非常に疎水性の領域がタンパク質のＮ
末端に存在したことを示した（図３ｂ）。ＶＰ２６の場合のように、前記膜貫通
アンカー配列の後に正帯電領域があり、これから前記タンパク質は外から内に向
かっていると示唆される。配列のＣ末端部分には、膜貫通配列を構成するであろ
う他の疎水性領域が認められた。しかしながら、Ｇａｒｎｉｅｒら（１９７８）
のアルゴリズムはＶＰ２８のこの位置にα−らせんを予測していなかった。前記
アルゴリズムは８９〜９９位に別のα−らせんを予測したが、タンパク質に沿っ
たβ−シートは予測していなかった。ＶＰ２６の場合のように、ＶＰ２８には１
つのシステインしか存在していなかった。このシステインはタンパク質のＣ末端
部分に局在化していた。

【００６０】組換えｖｐ２４、ｖｐ２６及びｖｐ２８の発現及び分析昆虫細胞において推定ＷＳＳＶビリオンタンパク質ＶＰ２４、ＶＰ２６、ＶＰ
２６ｃ及びＶＰ２８を発現する組換えバキュロウイルスを作製するためにＢａｃ
−ｔｏ−Ｂａｃシステム（ＧＩＢＣＯＢＲＬ）を使用した。ｖｐ２４、ｖｐ２
６、ｖｐ２６ｃ及びｖｐ２８遺伝子（それぞれ、配列番号１１、配列番号１、配
列番号９及び配列番号２）を、ｐ１０プロモーターの下流にＧＦＰ遺伝子を含む
プラスミドｐＦａｓｔＢａｃ−Ｄ／ＧＦＰ由来のポリヒドリンプロモーターの下
流にクローン化した。ｐＦａｓｔＢａｃ−Ｄ／ＧＦＰ（コントロール）及びｖｐ
２４、ｖｐ２６、ｖｐ２６ｃ及びｖｐ２８を含むプラスミドから作製した組換え
ウイルスをそれぞれＡｃＭＮＰＶ−ＧＦＰ、ＡｃＭＮＰＶ−ＷＳＳＶｖｐ２４、
ＡｃＭＮＰＶ−ＷＳＳＶｖｐ２６、ＡｃＭＮＰＶ−ＷＳＳＶｖｐ２６ｃ及びＡｃ
ＭＮＰＶ−ＷＳＳＶｖｐ２８と命名した。すべての組換えウイルスはｐ１０プロ
モーターからＧＦＰを発現した。後者の４つは更にポリヒドリンプロモーターか
らＶＰ２４（配列番号１２）、ＶＰ２６（配列番号３）、ＶＰ２６ｃ（配列番号
１０）及びＶＰ２８（配列番号４）を発現した。

【００６１】ＡｃＭＮＰＶ−ｗｔ、ＡｃＭＮＰＶ−ＧＦＰ、ＡｃＭＮＰＶ−ＷＳＳＶｖｐ２
６及びＡｃＭＮＰＶ−ＷＳＳＶｖｐ８を感染させたＳｆ２１細胞の抽出物を１５
％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分析した。野生型ＡｃＭＮＰＶを感染させた細胞（
図４ａのレーン３）では、ポリヒドリンである３２ｋＤａバンドが目視された。
ＡｃＭＮＰＶ−ＧＦＰ感染細胞（レーン４）及びＷＳＳＶタンパク質を発現する
組換え体を感染させた細胞（レーン５及び６）の抽出物を含むレーンでは、約２
９ｋＤａでＧＦＰタンパク質バンドが観察された。ＡｃＭＮＰＶ−ＧＦＰ感染細
胞におけるＧＦＰ発現はポリヒドリンプロモーター由来のＷＳＳＶタンパク質を
発現するバキュロウイルスにおけるＧＦＰ発現に比してより強かった（レーン５
及び６）。これは、各種ＡｃＭＮＰＶ−ＧＦＰ組換え体を感染させた細胞をＵＶ
照射後にも容易に観察された。ＡｃＭＮＰＶ−ＧＦＰ感染細胞中のＧＦＰの蛍光
が最強である（図示せず）。ポリヒドリンプロモーター由来のＷＳＳＶタンパク
質の発現はｐ１０プロモーター由来のＧＦＰの発現に比して有意に高い（レーン
５及び６）。多分ＷＳＳＶＶＰ２６を表す２１ｋＤａタンパク質の強い発現は
ＡｃＭＮＰＶ−ＷＳＳＶｖｐ２６感染細胞の抽出物で観察された（レーン５）。
２８ｋＤａタンパク質の強い発現はＡｃＭＮＰＶ−ＷＳＳＶｖｐ２８感染細胞で
観察された（レーン６）。これらのゲル中のＧＦＰの位置は抗−ＧＦＰ抗血清を
用いるウェスタン分析により確認された（データ示さず）。

【００６２】ＳＤＳＰＡＧＥゲルで電気泳動にかけた野生型及び組換えＡｃＭＮＰＶ感染
Ｓｆ２１細胞のサンプルをウェスタン分析した。組換えＶＰ２６及びＶＰ２８を
検出するためにＷＳＳＶビリオンに対するポリクローナル抗体を使用した（図４
ｂ）。ＶＰ２６及びＶＰ２８の両方が前記細胞抽出物中で検出された。ＶＰ２６
は２１ｋＤａで検出され、クマーシーブリリアントブルー染色ゲルと一致した（
図４ａのレーン５；図４ｂのレーン５）。組換えＶＰ２８はＶＰ２８と同一位置
でＷＳＳＶビリオンから遊走し、このタンパク質の理論サイズ２２ｋＤａよりも
有意に高い。ポリクローナル抗体は、前記サンプルの非常に低いバックグラウン
ド反応で観察されたように昆虫細胞（レーン２）またはバキュロウイルス（レー
ン３及び４）と主要な交差反応性を示さなかった。

【００６３】ＡｃＭＮＰＶ−ＷＳＳＶｖｐ２６ｃ及びＡｃＭＮＰＶ−ＷＳＳＶｖｐ２４を感
染させたＳｆ２１細胞の抽出物を１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分析した。低
分子量マーカー及び精製ＷＳＳＶビリオンをも同一ゲルで分析した。ＡｃＭＮＰ
Ｖ−ＷＳＳＶｖｐ２６ｃ及びＡｃＭＮＰＶ−ＷＳＳＶｖｐ２４感染細胞を含むレ
ーンでは２９ｋＤａでＧＦＰを表す弱いバンドが観察され、このバンドは感染細
胞をＵＶ照射後はっきりと観察された。更に、ＡｃＭＮＰＶ−ＷＳＳＶｖｐ２６
ｃ感染細胞を含むレーンでは、ゲル中のＷＳＳＶビリオンの２６ｋＤバンドと同
じ位置に強いバンドが２６ｋＤで観察された。ＡｃＭＮＰＶ−ＷＳＳＶｖｐ２４
感染細胞を含むレーンでは、ＷＳＳＶビリンオンの２４ｋＤａタンパク質の位置
に相当する２４ｋＤａに明らかなバンドが観察された。ＡｃＭＮＰＶ−ＷＳＳＶ
ｖｐ２６ｃ感染細胞中の２６ｋＤａバンド及びＡｃＭＮＰＶ−ＷＳＳＶｖｐ２４
感染細胞中の２４ｋＤａバンドがＷＳＳＶビリンオンの２６ｋＤａ及び２４ｋＤ
ａタンパク質に相当することを確認するために、このゲルのウェスタンブロット
をＷＳＳＶビリオンに対するポリクローナル抗体を用いて実施した。ＡｃＭＮＰ
Ｖ−ＷＳＳＶｖｐ２６ｃ感染細胞中の２６ｋＤａバンド及びＡｃＭＮＰＶ−ＷＳ
ＳＶｖｐ２４感染細胞中の２４ｋＤａバンドがうまく検出された。

【００６４】ＶＰ２６及びＶＰ２８の関連性ＷＳＳＶＶＰ２４、ＶＰ２６、ＶＰ２６ｃ及びＶＰ２８の相同性研究をＦＡ
ＳＴＡ、ＴＦＡＳＴＡ及びＢＬＡＳＴを用いてＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ、ＳＷ
ＩＳＳＰＯＲＴ及びＰＩＲデータベースに対して実施した。ＧｅｎＢａｎｋ中の
配列は、バキュロウイルスエンベロープまたはキャプシドタンパク質、他の大き
なＤＮＡウイルス由来の構造タンパク質と有意な相同性が認められなかった。

【００６５】中和実験ウイルスストックの力価を滴定実験で求めた。ウイルスストックを１×１０^７〜５×１０^１１倍希釈し、各希釈物１０μｌを１０シュリンプ（Ｐｅｎａｅｕｓｍｏｎｏｄｏｎ，３〜４カ月令）に筋肉内注射した。ストックＷＳＳＶ溶液の
１×１０^８希釈物では７〜１２日後の死亡率は５０％であり、これを更なる実験
で使用した。４群のシュリンプを中和実験で使用した。

【００６６】

【表２】

【００６７】１シュリンプに投与したウイルスの総量はすべての群で一定であり、ウイルス
ストックの１×１０^８希釈物１０μｌに等しい。群３及び４における血清濃度は
同じである（注射１回につき、ＷＳＳＶ１μｌ及び血清９μｌ）。注射後、
シュリンプを４週間追跡し、死亡したシュリンプをＷＳＳＶの存在について電子
顕微鏡で調べた。結果を図５に示す。

【００６８】群１（ネガティブコントロール）のシュリンプはいずれもＷＳＳＶで死亡しな
かったので、死亡率は０％である。群２（ポジティブコントロール）では、２３
日後に死亡率は１００％に達した。前免疫血清（家兎にＶＰ２８タンパク質を注
射する前に採取した血清）をＷＳＳＶに添加した群（群３）では、２５日後に死
亡率は１００％に達した。ＶＰ２８抗血清をＷＳＳＶに添加したとき（群４）、
すべてのシュリンプが生存しており、死亡率は０％であった。これらの結果は、
ＶＰ２８抗血清がＰ．ｍｏｎｏｄｏｎにおけるＷＳＳＶ感染を中和できることを
示す。

【００６９】タンパク質の予防接種群３〜６に異なるタンパク質溶液５μｌ（予防接種）及びｌ０μｌ（追加接種
）を注射した。予防接種のために、群３にはＶＰ２８タンパク質２．５μｇ、群
４にはＶＰ２６ｃタンパク質３．６μｇ、群５にはＶＰ２４タンパク質０．７μ
ｇを与えた。群６には等容量のＶＰ２８溶液、ＶＰ２６ｃ溶液及びＶＰ２４溶液
を含む混合物（タンパク質総量２．７μｇ）を与えた。追加接種のためにはシュ
リンプに高量のタンパク質を与えた。すなわち、群３にはＶＰ２８タンパク質９
．６μｇ、群４にはＶＰ２６ｃタンパク質５．７μｇ、群５にはＶＰ２４タンパ
ク質５．９μｇ、群６にはタンパク質総量７．１μｇを与えた。すべての群のシ
ュリンプにストックＷＳＳＶ溶液の１×１０^８希釈物１０μｌを注射した。

【００７０】予防接種の結果を図６に示す。群１（ネガティブコントロール）のシュリンプ
はいずれもＷＳＳＶで死亡せず、よって死亡率は０％である。群２では、シュリ
ンプは１日後からＷＳＳＶ感染のために死亡しはじめ、死亡率は増加し続ける。
これらのシュリンプには中和実験のシュリンプと同一用量のＷＳＳＶウイルスを
与えたが、群２のシュリンプは早くから死亡している。これは多分、この実験で
シュリンプが複数回注射を受けたストレスの結果であろう。群３〜５（それぞれ
ＶＰ２４、ＶＰ２６ｃ及びＶＰ２８を予防接種したシュリンプ）では、死亡は遅
くなったが、群６（ＶＰ２４、ＶＰ２６ｃ及びＶＰ２８の混合物を予防接種した
シュリンプ）ではＷＳＳＶで死亡したシュリンプはなく、よって死亡率は０％で
ある。予防接種中の各タンパク質の用量を最適にすると、ＷＳＳＶ感染に対して
高い防御効果が得られる。

【００７１】

【参考文献】

【表３】

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１ａ】ＷＳＳＶタンパク質であり、逆染色した無傷のビリオンの形態を示す写真であ
る。

【図１ｂ】ＷＳＳＶタンパク質であり、逆染色したＷＳＳＶヌクレオキャプシドの形態を
示す写真である。

【図１ｃ】ＷＳＳＶタンパク質であり、精製ＷＳＳＶの１５％クーマシー染色ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥゲル（ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動の写真である）。

【図２ａ】ＷＳＳＶＶＰ２６及びＶＰ２８のヌクレオチド配列であり、ＷＳＳＶゲノム
断片上のＶＰ２６及びＶＰ２８の位置を示す。

【図２ｂ】ＷＳＳＶＶＰ２６及びＶＰ２８のヌクレオチド配列であり、ＶＰ２６のヌク
レオチド及びタンパク質配列を示す。

【図２ｃ】ＷＳＳＶＶＰ２６及びＶＰ２８のヌクレオチド配列であり、ＶＰ２８のヌク
レオチド及びタンパク質配列を示す。

【図３ａ】ＶＰ２６の疎水性プロットである。

【図３ｂ】ＶＰ２８の疎水性プロットである。

【図４ａ】１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル及びウェスタンブロットで分析した昆虫細胞に
おけるＷＳＳＶ構造タンパク質のバキュロウイルス発現を示す。

【図４ｂ】１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル及びウェスタンブロットで分析した昆虫細胞に
おけるＷＳＳＶ構造タンパク質のバキュロウイルス発現を示す。

【図５】構造タンパク質ＶＰ２８に対する抗血清によるシュリンプ中のＷＳＳＶの中和
の結果を示す。

【図６】シュリンプへのＷＳＳＶタンパク質の予防接種の結果を示す。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１３年８月６日（２００１．８．６）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｑ 1/68 ＡＣ１２Ｑ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ // Ｇ０１Ｎ 33/53 33/569 Ｌ 33/569 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＵ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡＦターム(参考） 4B024 AA01 BA31 CA02 EA02 HA17 4B063 QA19 QQ02 QQ58 QR55 QS34 4C085 AA03 BA51 CC21 CC22 DD62 4H045 AA10 AA11 AA30 CA01 DA75 DA86 EA31

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】医薬的に許容され得る担体及び１つ以上のタンパク質を含む
甲殻類動物における白点症候群の予防及び／または治療に使用するためのワクチ
ンであって、前記タンパク質はそれぞれ配列番号３、配列番号４、配列番号５、
配列番号６、配列番号１０または配列番号１２に示すアミノ酸配列の少なくとも
１つを含む前記ワクチン。
【請求項２】ワクチンが配列番号３または１０に示すアミノ酸配列を有す
るタンパク質、配列番号４に示すアミノ酸配列を有するタンパク質及び配列番号
１２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の混合物を含む請求の範囲第１項に
記載のワクチン。
【請求項３】ゲノム中にＷＳＳＶタンパク質をコードする異種核酸配列を
含む弱毒化細菌またはウイルスを含む甲殻類動物における白点症候群の予防また
は治療に使用するためのベクターワクチンであって、前記ＷＳＳＶタンパク質は
それぞれ配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号１０また
は配列番号１２に示すアミノ酸配列の少なくとも１つを含む前記ベクターワクチ
ン。
【請求項４】白点症候群ウイルス由来の構造タンパク質であって、該タン
パク質のアミノ酸配列がそれぞれ配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番
号６、配列番号１０または配列番号１２に示すアミノ酸配列の少なくとも１つを
含むことを特徴とする前記構造タンパク質。
【請求項５】請求の範囲第４項に記載の構造タンパク質をコードする核酸
配列。
【請求項６】配列番号１、配列番号２、配列番号９または配列番号１１に
示す核酸配列を含む請求の範囲第５項に記載の核酸配列。
【請求項７】請求の範囲第４項に記載の構造タンパク質の薬剤としての使
用。
【請求項８】医薬的に許容され得る担体、及び少なくとも請求の範囲第４
項に記載の構造タンパク質または少なくとも請求の範囲第５項または第６項に記
載の核酸配列を含む医薬組成物。
【請求項９】請求の範囲第４項に記載の構造タンパク質に対する抗体。
【請求項１０】医薬的に許容され得る担体またはビヒクル及び少なくとも
請求の範囲第９項に記載の抗体を含むワクチンまたは医薬組成物。
【請求項１１】請求の範囲第５項または第６項に記載の核酸配列または請
求の範囲第９項に記載の抗体を含むＷＳＳＶ検出用診断キット。