CN117701777A - WSSV检测引物、crRNA、CRISPR组合物、试剂盒及应用 - Google Patents

WSSV检测引物、crRNA、CRISPR组合物、试剂盒及应用 Download PDF

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Abstract

本申请涉及白斑综合征病毒的检测技术领域，具体涉及WSSV检测引物、crRNA、CRISPR组合物、试剂盒及应用。该引物对与白斑综合征病毒的V28基因的特异性序列匹配，特异性序列如SEQ ID NO.1所示。实施例提供的WSSV检测引物、crRNA、CRISPR组合物、试剂盒及应用，能够对WSSV的特异序列进行快速扩增，使得检测特异性强。扩增产物能够被crRNA或CRISPR组合物靶向切割，切割效率高，切割产物能够极大增强检测的特异性和灵敏度。

Description

WSSV检测引物、crRNA、CRISPR组合物、试剂盒及应用
技术领域
本申请涉及白斑综合征病毒的检测技术领域，具体涉及WSSV检测引物、crRNA、CRISPR组合物、试剂盒及应用。
背景技术
白斑综合症病毒(whitespotsyndromevirus，WSSV)，具有双层囊膜但不形成包涵体。病毒粒子呈椭圆形，具囊膜，囊膜大小平均为430nmx120nm，病毒粒子的核心为电子致密的核衣壳，病毒核衣壳为杆状，直径为50μm，核衣壳大小平均为300μm×85μm，核衣壳的两端各有～帽状结构，一端为较扁的梯形，另一端为三角锥形，此端延伸出一条长尾，尾部有膨胀部分。帽结构之间有14圈螺旋，螺旋与核衣壳的长轴垂直。
白斑病病毒在纯水中1小时能保持感染性，但在3mol/LNaCL的高盐溶液中1小时失去感染力；在30℃中4小时感染活性丧失，在70～90℃10分钟均失去感染力；当环境pH值为5以下或12石以上时，病原在l小时后丧失感染活性；能被NP-40，Tritonx-100，CLO2或甲醛等灭活。
WSSV是近年来对虾病毒研究较活跃的焦点之一，现已初步建成了多种早期快速的检测技术。Lo(1996)构建了WSSV基因组文库，根据其中一个较大片段(1461bp)的序列设计了内外两套引物，PCR产物分别为1447kb及941kb其中1447kb的核酸片段经Dig标记广泛用于WSSV感染的早期检测。Kimura(1996)克隆了PRDV基因组的部分酶切片段，建立了灵敏的巢式PCR检测技术。刘萍(1995)、石正丽(1998)分别克隆了中国对虾WSSV部分基因组酶切片段，并经光敏生物素或地高辛标记成探针用于我国对虾病害的检测。
发明内容
本申请发明人通过对WSSV的V28基因保守序列研究发现，利用其扩增出目的序列并反转录成RNA，构建靶向切割该反转录的RNA的crRNA、Cas酶和报告RNA，依次构建CRISPR反应体系，从而实现对其靶向切割。将其切割产物通过报告RNA的信号放大，能够与免疫层析试纸结合，实现可视化检测，从而使得对WSSV的检测更加方便和准确，检测手段更加便捷。
基于此，本申请实施例至少公开了以下技术方案：
第一方面，实施例公开了一种引物对。所述引物对与白斑综合征病毒的V28基因的特异性序列匹配，特异性序列如SEQ ID NO.1所示。
在第一方面的一些实施例中，所述引物对具有如SEQ ID NO.5～6所示的核苷酸序列。
第二方面，实施例公开了一种crRNA。所述crRNA包括与Cas蛋白结合的锚定序列和靶向白斑综合征病毒V28基因的所述特异性序列的向导序列，特异性序列如SEQ ID NO.1所示。
在第二方面的一些实施例中，所述锚定序列具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
在第二方面的一些实施例中，所述crRNA具有如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。
在第二方面的一些实施例中，所述crRNA还包括位于所述向导序列3’端至少一个PFS识别序列。在一些实施例中，所述PFS识别序列3’端碱基为A，U或C。
在第二方面的一些实施例中，所述crRNA还具有位于所述锚定序列与所述向导序列之间的间隔序列。在一些实施例中，所述间隔序列由T7启动序列和Cas13a靶向CRISPR重复区序列(gatttagactaccccaaaaacgaaggggactaaaac)构成。
第三方面，实施例公开了一种CRISPR组合物。所述CRISPR组合物包括Cas蛋白、和crRNA或二者形成的复合体。所述crRNA包括与Cas蛋白结合的锚定序列和靶向白斑综合征病毒V28基因的所述特异性序列的向导序列。所述特异性序列如SEQ ID NO.1所示。所述向导序列具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。所述锚定序列具有如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。
在第三方的一些实施例中，所述CRISPR组合物还包括报告RNA。所述报告RNA的两个末端分别标记生物素和与所述胶体金标记抗体结合的基团。
第四方面，实施例公开了一种试剂盒。所述试剂盒包括免疫层析试纸和CRISPR组合物。所述免疫层析试纸按样品流动方向依次包括含有胶体金标记抗体的样品垫、含有T线和C线的NC膜和吸水滤纸，所述T线由链霉亲和素形成，所述C线由所述胶体金标记抗体的二抗形成。所述CRISPR组合物包括报告RNA、crRNA和Cas蛋白。所述crRNA包括与Cas蛋白结合的锚定序列和靶向白斑综合征病毒V28基因的所述特异性序列的向导序列。所述特异性序列如SEQ ID NO.1所示。所述向导序列具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。所述锚定序列具有如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。所述报告RNA的两个末端分别标记生物素和能与所述胶体金标记抗体结合的基团。所述Cas蛋白为第二类V型或VI型CRISPR系统中的Cas蛋白。
在第四方面的一些实施例中，所述试剂盒还包括与白斑综合征病毒的V28基因的特异性序列匹配的引物对。在一些实施例中，所述引物对具有如SEQ ID NO.5～6所示的核苷酸序列。
在第四方面的一些实施例中，所述case蛋白选自LwCas13a蛋白、Cas12a或Cas12b蛋白中的至少一种。
在第四方面的一些实施例中，所述试剂盒还包括用于扩增白斑综合征病毒的V28基因的特异性序列的试剂，所述特异性序列如SEQ ID NO.1所示。在一些实施例中，所述扩增为等温扩增RAA、变温扩增PCR或等温扩增LAMP中的至少一种。在一些实施例中，所述胶体金标记抗体为抗FITC抗体。
第五方面，实施例公开了第一方面所述的引物对、第二方面所述的crRNA、第三方面所述的CRISPR组合物或第四方面所述的试剂盒在制备具有如下1)-3)中至少一种功能的产品中的应用：
1)检测目标核酸是否为白斑综合征病毒的核酸；
2)检测目标核酸是否为白斑综合征病毒V28基因的核酸；
3)检测目标核酸是否为白斑综合征病毒V28基因特异性序列的核酸，特异性序列如SEQ ID NO.1所示；
4)检测体外样本中是否还有如1)～3)任一所述目标核酸。
在一些实施例中，所述体外样本选自血液样本、个体样本、组织样本、唾液样本、汗液样本、尿液样本、咽拭子样本、乳液样本、精液样本、皮肤擦拭样本、粪便样本、痰液样本中的至少一项。例如，将对虾个体做检测样本。
本申请实施例提供的WSSV检测引物、crRNA、CRISPR组合物、试剂盒及应用，能够对WSSV的特异序列进行快速扩增，使得检测特异性强。扩增产物能够被crRNA或CRISPR组合物靶向切割，切割效率高，切割产物能够极大增强检测的特异性和灵敏度。利用报告RNA对切割产物进行信号关联和放大，能够实现在免疫层析试纸上的可视化检测，促使检测过程更加便捷，便于推广应用。
附图说明
图1为实施例提供的基于免疫层析试纸的RPA-CRISPR方法检测流程图。
图2为实施例提供的WSSV最佳lwCas13a蛋白浓度的确定。
图3为实施例提供的WSSV最佳crRNA浓度的确定。
图4为实施例提供的CRISPR检测不同病毒的扩增曲线，1:WSSV；2:YHV-1；3:TSV；4:IHHNV；5:DIV1；6:IMNV；7:MrNV；8：阴性对照。
图5为实施例提供的WSSV的RPA-CRISPR检测的扩增曲线(A)与常规PCR检测的电泳结果(B)，1-7：1.5×106拷贝/μL～1.5×100拷贝/μL；8-9：阴性对照；10：空白对照；M:DL2000。
图6为实施例提供的RPA-CRISPR检测试纸成品图。
图7为实施例提供的RPA-CRISPR免疫层析试纸检测WSSV特异性实验结果；1:WSSV；2:YHV-1；3:TSV；4:IHHNV；5:DIV1；6:IMNV；7:MrNV；8：不含WSSV的虾组织样品作为阴性对照。
图8为实施例提供的WSSV的RPA-CRISPR免疫层析试纸灵敏度试验结果；1-7：1.5×106拷贝/μL～1.5×100拷贝/μL；8：不含WSSV的虾组织样品作为阴性对照。
具体实施方式
为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。本申请中未详细单独说明的试剂均为常规试剂，均可从商业途径获得；未详细特别说明的方法均为常规实验方法，可从现有技术中获知。
下列实施例涉及的试剂及材料：
报告RNA(5’-FAM-UUUUU-BHQ-3’)和(5’-FAM-UUUUU-Biotin-3’)由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，DNA和寡核苷酸链由青岛擎科生物公司合成。三(2-羧乙基)膦(TCEP)和乙二胺四乙酸(EDTA)购自Sigma公司。双蒸水、无水K2CO3、NaCl、TrionX-100、牛血清蛋白(BSA)和磷酸缓冲盐溶液(PBS)购自生工生物工程(上海)股份有限公司、链霉亲和素(SA)及蛋白A(proteinA)购自Solarbio、抗FAM小鼠IgG抗体购自Abcam有限公司，柠檬酸钠溶液、氯金酸溶液、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫、PVC底板均由华大瑞尔有限公司提供。RPAKit(LiquidBasic)购自英国TwistDx公司。TIANampVirusDNA/RNAKit购自天根生科技公司。FSQ201ReverTraAcekit购自东洋纺生物科技公司。
下列实施例涉及的仪器：
PCR仪(USAMJ&ABI)；电子天秤(Sartorius)；可调式多温水浴锅(PharmaciaLKBMultiTempII)；制冰机(SANYO)；超净工作台(哈东联)；电子天平(Sartorius)；电泳仪及电泳槽(北京六一仪器厂)；凝胶成像系统(US，NucleoTech)；暗箱式紫外透射仪(ZF-90，上海顾村电光仪器厂)；pH计(METTLERTOLEDO320PHMeter)；温控摇床(哈东联、知楚)；超微量分光光度计DS-11(美国-Denovix)；凝胶扫描仪(GelScanner2100XL)；小型离心机(北京博励行仪器公司)；中型离心机(EppendorfCentrifuge5804R)；大型离心机(HITACHICR21GIII)；ATS高压细胞破碎仪；伯乐Bio-radNGC和GE-Healthcare蛋白层析系统纯化仪；GE-Healthcare分子筛；Millipore超滤离心管(上海俊晟生物科技有限公司)；蛋白胶电泳槽(美国BIO-RAD)；荧光定量PCR仪CFX96Touch(美国-BIO-RAD)；小量超声破碎仪；超低温冰箱(LegaciTMRefregerationSystem)。HR8000免疫定量检测仪(武汉观锐生物技术有限公司)。
WSSV的RPA扩增(靶标RNA合成)
WSSV的VP28基因较为保守，故而选择其特异性序列引物设计。该特异性序列如SEQID NO.1所示。在一些实施例中，采用RPA扩增体系对该特异性序列进行扩增，RPA扩增体系具有较高的反应灵敏性和特异性。实施例设计了多对RPA引物，并按照RPAKit(LiquidBasic)说明书对引物对进行多次筛选，并筛选出了一对扩增效率较高的RPA引物对WSSV-RPA-F和WSSV-RPA-R(如表1)，能够对WSSV的VP28基因的特异性序列进行有效扩增，扩增反应体系以RPAKit(LiquidBasic)说明书为准。
表1 RPA扩增引物
WSSV的CRISPR检测体系
利用特异性RPA引物扩增WSSV的核酸特异性片段，即靶标RNA，该特异性片段经重组聚合酶等温扩增后，再经T7进行转录，生成大量的反转录RNA(靶标RNA)。报告RNA(ssRNA)的两端分别修饰FAM荧光基团和生物素(biotin)基团。结合探针RNA于切割同时产生荧光信号，能够有效地实现对WSSV进行高特异性、高灵敏度检测，并且通过与酶联免疫技术的可视化相结合，为疫病检测突破常规实验室检测仪器与环境的束缚奠定了强有力的基础。
为此，实施例提供了一种crRNA。所述crRNA包括与Cas蛋白结合的锚定序列和靶向白斑综合征病毒V28基因的特异性序列的向导序列，特异性序列如SEQ ID NO.1所示。
在一些实施例中，所述锚定序列具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
在一些实施例中，所述crRNA具有如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。
在一些实施例中，所述crRNA还包括位于所述向导序列3’端至少一个PFS识别序列。在一些实施例中，所述PFS识别序列3’端碱基为A，U或C，Cas酶识别PFS的效率更高。
在一些实施例中，所述crRNA还具有位于所述锚定序列与所述向导序列之间的间隔序列。在一些实施例中，所述间隔序列由T7启动序列(taatacgactcactataggg)和Cas13a靶向CRISPR重复区序列(gatttagactaccccaaaaacgaaggggactaaaac)构成。
在第二方面的一些实施例中，所述间隔序列具有如SEQ ID NO.5所述的核苷酸序列。
Cas13a蛋白只需一条成熟crRNA的引导便可实现对单链RNA的特异性剪切，靶点3’端有一个PFS(protospacer flanking site)识别位点，据此，设计合适的间隔序列actaccccaaaaacgaaggggactaaaac。利用T7启动子、Cas13a靶向CRISPR重复区序列和间隔序列构成crRNA。针对上述RPA引物对的扩增序列，设计了3种病毒的crRNA。根据crRNA合成相应的ssDNA，并设计相应的上下游引物。通过PCR扩增获得大量的dsDNA，用RNA合成试剂盒进行转录，获得crRNA。
WSSV-crRNA:uaauacgacucacuauaggggauuuagacuaccccaaaaacgaaggggacuaaaaccacaauaaauacagcaaucacagcagug，SEQ ID NO.3。
根据上述得到的crRNA，结合Cas蛋白、Cas酶和报告RNA，依次构建CRISPR检测反应体系，从而实现对其靶向切割。为得到最佳检测效果，实施例分别对该CRISPR检测反应体系中的Cas蛋白、crRNA的浓度进行优化，并对该CRISPR检测反应体系的特异性和灵敏度进行评价。
1、CRISPR检测体系优化
(1)最佳lwCas13a蛋白浓度的确定
将纯化后的lwCas13a蛋白(广州博徕斯生物科技股份有限公司)依次以2倍的梯度倍比稀释(69ng/μL～0.269ng/μL)共8个浓度梯度，每个条件做3个复孔。加入lwCas13a蛋白(1μL)、crRNA(1μL)、体外转录获得的WSSV VP28 RNA(0.5μL)、RNaseInhibitor(0.2μL)、MgCl2(0.5μL)、RNAreporter(0.5μL)和无核酸酶的水(6.3μL)。充分混匀之后，将反应体系加入荧光定量PCR管中，上机，选择FAM通道，37℃反应1h。
为了测试WSSV检测体系的最佳lwCas13a蛋白浓度，设置了不同的蛋白浓度(69ng/μL～0.269ng/μL)检测WSSV。结果如图2所示：当lwCas13a蛋白浓度为2.2ng/μL时，荧光强度表现为显著增加，当继续增加蛋白浓度时，荧光强度没有明显增加。因此，2.2ng/μL为lwCas13a蛋白的最佳工作浓度。
(2)最佳crRNA浓度的确定
将crRNA-1依次以2倍的梯度倍比稀释(10.52～0.164ng/μL)，共7个浓度梯度，每个条件做3个复孔。加入lwCas13a蛋白(1μL)、crRNA1(1μL)、体外转录获得的WSSVVP28RNA(0.5μL)、RNaseInhibitor(0.2μL)、MgCl2(0.5μL)、RNAreporter(0.5μL)和无核酸酶的水(6.3μL)。充分混匀之后，将反应体系加入荧光定量PCR管中，上机，选择FAM通道，37℃反应1h。
为了测试CRISPR检测体系的最佳crRNA浓度，设置了不同的crRNA浓度(25～0.39nmol/μL)检测WSSV。结果如图3所示：当crRNA浓度为6.25ng/μL时，荧光信号最强，与其他组有极显著性差异。因此，6.25ng/μL为crRNA的最佳工作浓度。
(3)检测反应体系的确定
基于上述优化结果，得到该CRISPR检测反应体系如表2所示，以WSSV标准质粒为模板，每个条件做3个复孔，37℃反应1h。
表2 WSSV的CRISPR检测体系
组分 体积(50μL)
2×ReactionBuffer 25μL
10×BasicE-mix 5μL
20×CoreReactionMix 1μL
MgOAc(280mmol/L) 2.5μL
dNTPs(25mmol/L) 3.6μL
WSSV-RPA-F(100μmol/L) 2.5μL
WSSV-RPA-R(100μmol/L) 2.5μL
WSSV标准质粒或靶标RNA 0.9μL
T7Mix 0.5μL
NTPBuffer 2.5μL
RNaseinhibitor 0.5μL
MgCl2(250mmol/L) 1μL
报告RNA(10μmol/L) 1μL
lwCas13aprotein 1μL
crRNA 0.5μL
其中，WSSV标准质粒的构建方法包括：利用WSSVVP28囊膜蛋白基因PCR产物的粘性末端的两个A碱基，将WSSV纯化后的PCR扩增产物通过T4 DNA连接酶连接到pMD18-T载体上构建重组质粒，16℃连接1h。连接反应体系如表4所示。
表3 T4连接反应体系
PCR产物 13μL
载体 1μL
T4DNA连接酶 2μL
10×T4DNA连接酶缓冲液 2μL
50％PEG4000 2μL
总计 20μL
2、CRISPR检测的特异性测试
利用优化后的RPA-CRISPR检测体系(表3)对WSSV、虹彩病毒1(简称为DIV1)、桃拉综合症病毒(Taura syndrome virus，简称TSV)、黄头病毒基因1型(YHV-1)、肌肉坏死病毒(Infectious Myonecrosis Virus,IMNV)、罗氏沼虾诺达病毒(MrNV)以上病毒均由深圳海关动植物检验检疫技术中心保存并提供，进行检测。其中，ssRNA探针为5’-FAM-UUUUU-BHQ-3’，检测涉及阴性对照，以评估其特异性。
结果如图4所示，采用上述RPA-CRISPR反应体系对几种常见虾病的相关病原进行了检测，仅能检测出WSSV病毒，而其他病毒无检出，且与其他疫病病原无交叉反应，由此说明本申请提供的RPA扩增体系以及其与CRISPR结合的荧光检测体系具有优良的特异性。
3、CRISPR检测的灵敏度测试
以WSSV标准质粒按10倍倍比稀作作为模板，采用表5中常规PCR特异性扩增引物对其进行常规PCR扩增，扩增产物经1.5％(m/V)琼脂糖凝胶电泳鉴定。比较WSSV的RPA扩增检测和CRISPR检测结合的方法与对应的常规PCR方法的灵敏度。WSSV常规PCR方法引物及反应条件见表4和表5。
表4常规PCR扩增引物序列
表5常规PCR方法反应条件
病毒 变性 退火 延伸 循环数 延伸 保存
WSSV 94℃1min 58℃1min 72℃,2min 35 72℃,10min 4℃
如图5所示，WSSV的荧光RPA-CRISPR方法检测限均可以达到单个拷贝的核酸，而常规PCR/RT-PCR仅能够有效扩增和检测出10000个拷贝的标准质粒，因而本申请实施例提供的RPA-CRISPR检测方法的灵敏度是常规PCR/RT-PCR的1000倍。也即，可以确定本申请实施例提供的荧光RPA-CRISPR检测WSSV的灵敏度为1.5拷贝/μL。
WSSV的检测试剂盒
如图1所示，通过将上述的CRISPR检测体系与试纸条结合，能够实现对WSSV的可视化检测，检测结果判读更加便捷。其工作过程包括：当反应体系中Cas13a/crRNA复合体识别靶标RNA时，会激活Cas13a的附带切割活性，进而切割报告RNA，产生荧光信号。37℃反应1h后，将反应液稀释10倍滴入样品孔。若反应体系中存在大量的目标病毒核酸，ssRNA的报告基团会被全部切割，即FAM会与生物素分离，样品垫里金标FAM抗体会与FAM结合，随着虹吸作用，流向免疫层析试纸顶部。当经过质控区，质控线上的链霉素会结合体系生物素，进而显色，被剪切下来的FAM继续向上进入检测区。检测区包被FAM抗体的二抗，结合FAM抗体后显色。当反应体系中存在少量的目标病毒核酸，报告基团切割不完全，即仍有部分金标FAM抗体/FAM/生物素，T线上的二抗会结合这部分FAM，进而显色，但颜色较浅，呈弱阳性。当反应体系中不存在目标病毒核酸，ssRNA报告基团被胶体金标记，质控线上的链霉素会结合报告基团上的生物素，进而显色，ssRNA无法继续流向检测区，截留至质控区，而检查区不显色呈阴性。
基于此，实施例公开了一种WSSV的检测试剂盒。该检测试剂盒包括免疫层析试纸和CRISPR组合物。所述免疫层析试纸按样品流动方向依次包括含有胶体金标记抗体的样品垫、含有T线和C线的NC膜和吸水滤纸，所述T线由链霉亲和素形成，所述C线由所述胶体金标记抗体的二抗形成。所述CRISPR组合物包括报告RNA、crRNA和Cas蛋白，所述的crRNA，其包括与Cas蛋白结合的锚定序列和靶向白斑综合征病毒V28基因的特异性序列的向导序列，所述报告RNA的两个末端分别标记生物素和能与所述胶体金标记抗体结合的基团，所述Cas蛋白为第二类V型或VI型CRISPR系统中的Cas蛋白。
在一些实施例中，该免疫层析试纸的制备过程具体包括：
1、抗FHM抗体和链霉亲和素蛋白的包被
将抗FHM抗体和链霉亲和素蛋白包被在硝酸纤维素(NC)膜上，室温干燥，包被好的NC膜和干燥剂放置于铝箔袋，避光干燥4℃保存备用。
2、免疫层析试纸的组装
(1)胶体金标记抗FAM小鼠IgG抗体的最佳浓度
利用MEY氏稳定性试验确定抗FAM小鼠IgG抗体与胶体金最佳标记量，分别在酶标孔加入胶体金溶液100μL(20nm颗粒大小的胶体金)，依次加入抗FAM小鼠IgG抗体3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14μg/mL。混匀静置5min，而后加入10％氯化钠溶液20μL，静置15min观察，随着加入单抗量的增加，胶体金颜色由紫黑色逐渐变为红色并稳定。最接近胶体金本色的溶液中所含的浓度最合适，即最佳标记量为8μg/mL。
(2)胶体金标记抗FAM小鼠IgG抗体的最佳pH值
取一条酶标板，在前七个加入100μL的胶体金溶液和上面确定的最合适浓度抗FAM小鼠IgG抗体，之后从前往后依次加入5μL，7μL，9μL，11μL，13μL，15μL，17μL的0.01mol/L的K2CO3溶液，室温静置15min；使用酶标仪进行扫描，获得胶体金可见光OD520值，以出现最大OD520值时所对应的胶体金pH为最佳标pH值。即每毫升胶体金加入13μL 0.01mol/L K2CO3为最佳标记pH。
(3)蛋白A和链霉亲和素蛋白包被浓度和金标抗体喷量的确定
确保免疫层析试纸的检测线(T)在一定的范围内颜色不消失，同时检测线(T)和质控线(C)的比值呈一定的比例变化。确立的最佳反应条件为：检测线(T)包被蛋白A浓度为0.12mg/mL，以1μL/cm的浓度喷洒；质控线(C)包被链霉亲和素蛋白浓度为1mg/mL，以1μL/cm的浓度喷洒；样品垫上金标抗体的喷量为3.8μL/cm。此时，阳性结果的T线和C线显色适中，且能呈一定的比例变化。
(4)免疫层析试纸的组装
根据上述摸索的条件，用胶体金制作系统将蛋白A和链霉亲和素蛋白包被在硝酸纤维素(NC)膜上，室温干燥，包被好的NC膜和干燥剂放置于铝箔袋，避光干燥4℃保存备用。从上至下依次将样品垫、金垫、硝酸纤维素膜(NC膜)、吸水纸首尾互相衔接，粘贴在PVC底板上，用胶体金制作系统将免疫层析试纸裁剪合适的规格，免疫层析试纸和干燥剂放置于铝箔袋，避光干燥4℃保存备用(见图6)。
3、RPA-CRISPR免疫层析试纸的特异性检测
图7所示，RPA-CRISPR检测免疫层析试纸可检测出特异性相应的WSSV病毒，并且与其他病毒无交叉反应。
4、RPA-CRISPR免疫层析试纸的灵敏度检测
将不同浓度的1.5×106～1.5×100copies/μL的WSSV的标准质粒分别作为RPA-CRISPR反应，进行RPA-CRISPR扩增反应，产物经RPA-CRISPR免疫层析试纸检测，肉眼观察着免疫层析试纸颜色变化，也可采用Gelpro图像分析软件进行色度值分析，比较色度值与肉眼观察结果的差异，检测免疫层析试纸的灵敏度。
如图8所示，可清晰判读出1.5×102copies/μL的标准质粒的T线。
如表6可知，进一步利用Gelpro图像分析软件测量T线及C线的OD值。当质粒浓度低至1.5×101copies/μL与阴性对照组相比具有显著差异，OD值大于1.5为阳性。由此可知，本申请提供的RPA-CRISPR免疫层析试纸能够有效检出1.5×101copies/μL的WSSV标准质粒，即检测灵敏度可达15copies/μL。
表6 RPA-CRISPR免疫层析试纸检测WSSV标准质粒OD值
标准品浓度 OD值
1.5×106copies/μL 110.39
1.5×105copies/μL 104.51
1.5×104copies/μL 83.14
1.5×103copies/μL 43.27
1.5×102copies/μL 30.52
1.5×101copies/μL 8.96
1.5×100copies/μL 0.36
阴性对照 0.37
对虾样本检测
利用本申请实施例提供的荧光RPA-CRISPR、RPA-CRISPR试纸条、常规PCR以及RT-PCR分别对大量的对虾样本中的WSSV核酸进行检测。这些荧光RPA-CRISPR、RPA-CRISPR试纸条、常规PCR以及RT-PCR如上述实施例所述。对虾样本及检测结果如表8所示。
如表8所示，荧光RPA-CRISPR、RPA-CRISPR试纸与实时PCR方法检测结果相同，共计14份阳性，常规PCR方法12份阳性，其中弱阳性1份。除1份PCR弱阳性样品外，其余PCR检出阳性样品均经测序确证为WSSV阳性。阳性检出样品涉及四种被采样虾品种。
表7 WSSV荧光RPA-CRISPR、RPA-CRISPR试纸、常规PCR与实时PCR检测结果
另外，由表7可知，常规PCR方法不能检出的假阴性样品(WSSV编号46、71)和弱阳性样品(WSSV编号51，YHV编号67)样本，而荧光RPA-CRISPR及其试纸条对于有明显的检出，且检测结果与实时定量PCR方法完全一致，通过对这些样品斑点值及Ct值的观察发现，弱阳性检出样品的Ct值与斑点值均位于各自PCR检测方法的检测限临界点，假阴性样品的Ct值和斑点值低于临界点，因而可以有效的证明，荧光RPA-CRISPR及其试纸的高灵敏度是有效的，避免了假阳性检出。而常规PCR检测方法检出的弱阳性样品，由于不能满足测序对样本浓度的要求，因而不能进行有效测序，参照WOAH水生动物疫病诊断手册和我国检验检疫行业标准，由于不能进行有效测序，因而不能作为疫病阳性检出确诊的依据。
以上所述，仅为本申请较佳的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本申请揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种引物对，其与白斑综合征病毒的V28基因的特异性序列匹配，特异性序列如SEQID NO.1所示。
2.一种crRNA，其包括与Cas蛋白结合的锚定序列和靶向白斑综合征病毒V28基因的特异性序列的向导序列，特异性序列如SEQ ID NO.1所示。
3.根据权利要求2所述的crRNA，可选地，所述锚定序列具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；
可选地，所述crRNA具有如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；
可选地，所述crRNA还包括位于所述向导序列3’端至少一个PFS识别序列；可选地，所述PFS识别序列3’端碱基为A，U或C；
可选地，所述crRNA还具有位于所述锚定序列与所述向导序列之间的间隔序列；可选地，所述间隔序列由T7启动序列和lwCas13aRepeatRNA构成。
4.一种CRISPR组合物，包括Cas蛋白和crRNA，和/或所述Cas蛋白和所述crRNA形成的复合体；
所述crRNA包括与Cas蛋白结合的锚定序列和靶向白斑综合征病毒V28基因的特异性序列的向导序列，特异性序列如SEQ ID NO.1所示。
5.根据权利要求4所述的CRISPR组合物，还包括报告RNA，所述报告RNA的两个末端分别标记生物素和能与所述胶体金标记抗体结合的基团。
6.一种试剂盒，其包括：
免疫层析试纸，所述免疫层析试纸按样品流动方向依次包括含有胶体金标记抗体的样品垫、含有T线和C线的NC膜和吸水滤纸，所述T线由链霉亲和素形成，所述C线由所述胶体金标记抗体的二抗形成；
CRISPR组合物，所述CRISPR组合物包括报告RNA、crRNA和Cas蛋白，所述的crRNA，其包括与Cas蛋白结合的锚定序列和靶向白斑综合征病毒V28基因的特异性序列的向导序列，所述报告RNA的两个末端分别标记生物素和能与所述胶体金标记抗体结合的基团，所述Cas蛋白为第二类V型或VI型CRISPR系统中的Cas蛋白。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，还包括与白斑综合征病毒的V28基因的特异性序列匹配的引物对。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，所述引物对具有如SEQ ID NO.4～5所示的核苷酸序列。
9.根据权利要求6所述的试剂盒，可选地，所述case蛋白选自Cas13a蛋白、Cas12a或Cas12b蛋白中的至少一种；
可选地，所述试剂盒还包括用于扩增白斑综合征病毒的V28基因的特异性序列的试剂，特异性序列如SEQ ID NO.1所示；
可选地，所述扩增为等温扩增RAA、变温扩增PCR或等温扩增LAMP中的至少一种；
可选地，所述胶体金标记抗体为抗FITC抗体。
10.如权利要求1所述的引物对、如权利要求2所述的crRNA、如权利要求4所述的CRISPR组合物或如权利要求6～9任一所述的试剂盒在制备具有如下1)-3)中至少一种功能的产品中的应用：
1)检测目标核酸是否为白斑综合征病毒的核酸；
2)检测目标核酸是否为白斑综合征病毒V28基因的核酸；
3)检测目标核酸是否为白斑综合征病毒V28基因特异性序列的核酸，特异性序列如SEQID NO.1所示；
4)检测体外样本中是否还有如1)～3)任一所述目标核酸，可选地，所述体外样本选自血液样本、个体样本、组织样本、唾液样本、汗液样本、尿液样本、咽拭子样本、乳液样本、精液样本、皮肤擦拭样本、粪便样本、痰液样本中的至少一项。
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