WO2022158453A1 - Ｗｓｓｖワクチン - Google Patents

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WO2022158453A1
WO2022158453A1 PCT/JP2022/001638 JP2022001638W WO2022158453A1 WO 2022158453 A1 WO2022158453 A1 WO 2022158453A1 JP 2022001638 W JP2022001638 W JP 2022001638W WO 2022158453 A1 WO2022158453 A1 WO 2022158453A1
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WO
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amino acid
acid sequence
seq
peptide
wssv
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PCT/JP2022/001638
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English (en)
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龍洙 朴
ブーニャキダ ジラユ
シュ ジェン
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国立大学法人静岡大学
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    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/033—Rearing or breeding invertebrates; New breeds of invertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
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    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material

Definitions

  • the present invention relates to a vaccine for preventing or treating infection with white spot syndrome virus (WSSV).
  • WSSV white spot syndrome virus
  • WSD White spot disease
  • WSSV White Spot Syndrome Virus
  • dsDNA supercoiled, circular double-stranded DNA
  • ORFs putative open reading frames
  • WSSV is also known to contain at least six virion proteins, namely VP19 and VP28 derived from envelope proteins, VP24 and VP26 derived from tegument proteins, and VP15 and VP664 derived from nucleocapsid proteins (Non-Patent Document 1, 2).
  • Shrimp infected with WSSV show symptoms such as lethargy, anorexia, reduced food intake, reduced repair activity, loose cuticles, reddish discoloration, and white calcified spots (0.5-3 mm in diameter) on the exoskeleton. is seen, resulting in a mortality rate of 90% within one week.
  • Non-Patent Documents 3, 4 viral protein subunits, attenuated WSSV and DNA/RNA-based immunological agents are known. Most of them are recombinant subunit vaccines such as VP19, VP24, VP26, VP28, VP292 and VP466, among which the use of VP28 has been reported (Non-Patent Documents 5-9). These WSSV subunit vaccines were expressed in E. coli.
  • the present inventor has so far investigated the anti-WSSV effect (WSSV infection-preventing effect) of five recombinant WSSV proteins VP15, VP19, VP24, VP26 and VP28. These proteins were expressed and purified using silkworms and Escherichia coli, and an in vivo antiviral assay using kuruma shrimp confirmed that the nucleocapsid protein VP15 exhibits high immunogenicity against WSSV infection (Non-Patent Document 10). .
  • the purpose of the present invention is to provide a vaccine that has a protective effect against white spot syndrome virus (WSSV) infection.
  • WSSV white spot syndrome virus
  • SR-11 SEQ ID NO: 7
  • a fragment peptide of WSSV protein VP15 has a high WSSV infection-preventing effect, and completed the present invention.
  • the present invention is as follows.
  • An antigenic peptide comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7 or an amino acid sequence having deletion, substitution or insertion of 1 to 3 amino acid residues in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7, wherein 8 to 30
  • WSSV white spot syndrome virus
  • the antigenic peptide consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7, or an amino acid sequence having deletion, substitution or insertion of 1 to 3 amino acid residues in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7 [1] Or the vaccine according to [2].
  • the antigenic peptide is a peptide containing 8 to 30 consecutive amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, or 8 to 30 consecutive amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • the vaccine according to [1] which is a peptide having 80% or more sequence identity with the peptide consisting of the base.
  • the diet according to [6] which is a health feed.
  • the vaccine of the present invention can prevent or treat white spot disease in crustaceans.
  • the antigenic peptide of the present invention is short (8 to 50 amino acid residues) and can be easily mass-produced in E. coli or silkworm, it is expected to be applied to cultured shrimp.
  • FIG. GST glutathione-S-transferase for affinity purification
  • FLAG tag FLAG tag for Western blot analysis (DYKDDDDK; SEQ ID NO: 10)
  • M molecular weight marker
  • S supernatant
  • P precipitate.
  • Example 1 the results of SDS-PAGE of fusion proteins of each VP-15 fragment peptide purified by GST affinity chromatography and GST are shown.
  • M molecular weight marker.
  • 2 is a graph showing the survival rate (%), which is an index of the protective effect against WSSV infection of each peptide fragment of WSSV-VP15 using kuruma shrimp in Example 1.
  • FIG. FIG. 2 is a schematic diagram showing the amino acid position and length of each fragment peptide (KR-11, SR-11, KK-13, SK-10) of VP15 (aa26-57) .
  • the survival rate (%) which is an index of the protective effect of each fragment peptide of VP15 (aa26-57) against WSSV infection, is shown using kuruma shrimp.
  • (a) is a graph showing protective effect by KR-11, SR-11, SK-10 and KK-13
  • (b) is a graph showing protective effect by SR-11.
  • 3 shows the results of confirming the expression of GST-VP15 or GST-VP15 (aa25-36) in silkworm larvae and pupae by Western blotting in Example 3.
  • FIG. 4 shows the result of confirming the interaction between VP15, VP15 (aa26-57) and SR-11 and the receptor in Example 4 by Western blotting.
  • Example 5 the relative survival rate (%), which is an index of the protective effect against WSSV infection after administration of feed containing various vaccines using kuruma shrimp, is shown.
  • FIG. 6 shows the results of examining changes in mRNA expression levels of Dorsal gene (a) and Relish gene (b) after administration of various vaccine-containing feeds using kuruma shrimp in Example 6.
  • FIG. 10 shows the results of examining changes in mRNA expression levels of STAT gene (a) and ProPO gene (b) after administration of vaccine-containing feed using kuruma shrimp in Example 6.
  • the vaccine of this embodiment is a vaccine for preventing or treating infection with white spot syndrome virus (WSSV), and has 1 to 3 antigenic peptides comprising amino acid sequences having deletions, substitutions or insertions of amino acid residues of 8 to 30 amino acid residues.
  • the antigenic peptide means a peptide having antigenicity (immunogenicity), particularly a peptide having antigenicity, particularly WSSV antigenicity, in aquatic crustaceans such as shrimp.
  • VP15 (SEQ ID NO: 1) is an 80 amino acid protein with a very high pI value, showing homology to DNA binding proteins of eukaryotic origin and baculovirus p6.9. VP15 contains 20-21% each of serine, arginine and lysine. Although VP15 is the major nucleocapsid protein involved in packaging the viral genome into capsids, its crystal structure is still unknown.
  • a peptide (full length: 11 amino acid residues) consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7 is a VP15 fragment peptide consisting of the 37th to 47th amino acid residues of the VP15 protein, and is herein referred to as "SR-11". is sometimes called.
  • SR-11 When SR-11 is administered to shrimp, it induces immunity and has a preventive effect against WSSV infection.
  • SR-11 has WSSV antigenicity (WSSV immunogenicity) and functions as a WSSV vaccine, allowing protection against WSSV infection.
  • the antigenic peptide in this embodiment is the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7, or an amino acid having deletion, substitution or insertion of 1 to 3 amino acid residues in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7. including sequences (sometimes referred to herein as "SR-11 variants"). That is, the antigenic peptide in this embodiment includes, at least in part, SR-11 or an SR-11 variant.
  • SR-11 mutants are not particularly limited as long as they have WSSV antigenicity, but deletion or substitution of 1, 2 or 3 amino acid residues at any position in the amino acid sequence of SR-11 or may have an insert. In the case of 2 or 3 amino acid residues, they may be consecutive amino acid residues or discontinuous amino acid residues.
  • Amino acids to be substituted or inserted may be natural or non-natural.
  • Natural amino acids include L-alanine, L-asparagine, L-aspartic acid, L-glutamine, L-glutamic acid, glycine, L-histidine, L-isoleucine, L-leucine, L-lysine, L-arginine, L -methionine, L-phenylalanine, L-proline, L-serine, L-threonine, L-tryptophan, L-tyrosine, L-valine, L-cysteine and the like.
  • Group 1 leucine, isoleucine, norleucine, valine, norvaline, alanine, 2-aminobutanoic acid, methionine, o-methylserine, t-butylglycine, t-butylalanine, cyclohexylalanine
  • Group 2 aspartic acid, glutamic acid, isoaspartic acid, Isoglutamic acid, 2-aminoadipic acid, 2-aminosuberic acid group 3: asparagine, glutamine group 4: lysine, arginine, ornithine, 2,4-diaminobutanoic acid, 2,3-diaminopropionic acid group 5: proline, 3 - Hydroxyproline, 4-Hydroxyproline Group 6: Serine, Threonine, Homoserine Group 7: Phenylalanine
  • the antigenic peptide in this embodiment consists of the above-described SR-11 or SR-11 variant, or contains the above-described SR-11 or SR-11 variant as a part, and has WSSV antigenicity.
  • the length is not particularly limited, but preferably consists of 8 to 30 amino acid residues, more preferably 8 to 25, 8 to 20, 9 to 20, 10 to 20, 9 to 15 , 10-15, 9-13, or 10-12 amino acid residues.
  • the amino acid residues in the portion other than SR-11 or SR-11 mutant in the antigenic peptide are not particularly limited, and the WSSV antigenicity of SR-11 or SR-11 mutant Preferably, it is an amino acid residue that does not affect WSSV antigenicity or improves WSSV antigenicity.
  • the antigenic peptide in this embodiment may also be in the form of a fusion protein formed with a protein tag used for purification of the antigenic peptide.
  • tags include His-tag, Flag-tag, myc-tag, glutathione-S-transferase (GST), maltose-binding protein (MBP), Strep-tag, etc. These tags have short amino acid sequences.
  • the fusion protein with the antigenic peptide may be used as a vaccine as it is, since it does not affect the WSSV antigenicity.
  • the antigenic peptide and protein tag may be separated after purification.
  • the antigenic peptide in this embodiment preferably consists of SR-11 or SR-11 mutants. That is, the antigenic peptide has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7, or deletion or substitution of 1 to 3, preferably 2, more preferably 1 amino acid residue in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7. Alternatively, it preferably consists of an amino acid sequence having an insertion, and particularly preferably consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:7.
  • the antigenic peptide containing SR-11 or SR-11 mutant is a peptide consisting of 8 to 30 consecutive amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, or SEQ ID NO: 8 to 30 amino acid residues having a sequence identity of 80% or more, preferably 85% or more, 90% or more, or 95% or more with a peptide consisting of consecutive amino acid residues of the amino acid sequence shown in 1. It may be a peptide consisting of The protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is the VP15 protein, and the peptide consisting of the 37th to 47th amino acid residues of the VP15 protein is SR-11.
  • the antigenic peptide in this embodiment comprises SR-11 or SR-11 variants as all or part of the sequence. That is, the antigenic peptide in this embodiment is a fragment peptide or fragment peptide variant of the VP15 protein, which contains SR-11 or SR-11 variant as a whole or part of the sequence.
  • the antigenic peptides in this embodiment may be artificially synthesized, they can be mass-produced by expressing them in transformants or recombinant silkworms, which will be described later.
  • the antigenic peptide of interest may or may not be purified.
  • the recombinant silkworm may be dried as it is and mixed with feed for use.
  • the vaccine of this embodiment may consist of only an effective amount of the antigenic peptide, or may contain other components than the effective amount of the antigenic peptide.
  • the dosage form of the vaccine of this embodiment may be, for example, liquid, powder (freeze-dried powder, dry powder), granules, and the like.
  • Components other than antigenic peptides may be carriers commonly used in vaccine manufacture, including, for example, saline, buffered saline, dextrose, water, glycerol, isotonic aqueous buffers, and combinations thereof.
  • emulsifiers, preservatives (eg, thimerosal), tonicity agents, pH adjusters, inactivators (eg, formalin), etc. may be added as appropriate.
  • the vaccine of this embodiment can be obtained by mixing the antigenic peptide with other components such as a carrier and a component that enhances antigenicity, if necessary.
  • the vaccine of the present embodiment is intended to be administered to crustaceans, for example, farmed crustaceans, especially crustaceans suffering from white spot disease, preferably aquatic crustaceans such as shrimp and lobster, Vietnamese crustaceans such as shrimp and lobster, Vietnamesemp include, among others, Marsupenaeus japonicus, Litopenaeus vannamei, Penaeus monodon, and Fenneropenaeus indicus.
  • White spot disease can be effectively prevented or treated by administering the vaccine of this embodiment to a crustacean.
  • the administration route of the vaccine of this embodiment is not particularly limited, and may be intramuscular injection or oral administration, for example.
  • a single administration is effective, but multiple administrations, such as 2, 3, 4, or 5 administrations, provide a high infection-preventing effect.
  • It is also preferred to administer regularly for example 1 to 25 times a year, especially 3 times a year, 4 times a year, 6 times a year, 12 times a year or 1 to 4 times a month.
  • the administration interval is not particularly limited, and may be administered, for example, at intervals of 1 day to 3 months, 1 week to 2 months, 10 to 30 days, or 15 to 25 days.
  • oral administration it is mixed with food and given at regular intervals (e.g., once every 3 months, once every 2 months, once every month, once every 10 days, once every 5 days). or daily).
  • the dosage of the vaccine of this embodiment may vary depending on the administration frequency and administration route. preferably 10-20 ⁇ g antigenic peptide/g body weight or 10-20 ⁇ g antigenic peptide/g body weight.
  • the peptide of this embodiment comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7, or an amino acid sequence having 1 to 3 amino acid residue deletions, substitutions, or insertions in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7, and , is an isolated peptide having 8-30 amino acid residues.
  • the peptide of this embodiment may be an antigenic peptide as described above.
  • the diet of this embodiment comprises an effective amount of the vaccine or peptide of this embodiment.
  • the diet is preferably a diet for crustaceans, and the effective amount of the vaccine or peptide may be 1-100 ⁇ g antigenic peptide/day/g body weight, and 5-50 ⁇ g antigenic peptide/day/day.
  • g body weight preferably 10-45 ⁇ g antigenic peptide/g body weight, or 10-20 ⁇ g antigenic peptide/day/g body weight.
  • Effective amounts may vary with dosing intervals and may be adjusted accordingly. For example, an effective amount for administration once every five days may be 1.5 to 3 times the effective amount for daily administration, preferably twice.
  • the diet of this embodiment may contain, in addition to the vaccine or peptide of this embodiment, dietary components suitable for crustaceans.
  • the diet of the present embodiment may contain, for example, proteins, lipids, carbohydrates, vitamins and minerals, and more specifically, fish meal, krill meal, wheat flour, corn, alfalfa meal, brewer's yeast.
  • vitamins (choline chloride, vitamin E, vitamin C , inositol, vitamin B5 , vitamin B2, Vitamin A , vitamin B1 , vitamin B6, vitamin B3, folic acid, vitamin D3 , biotin), minerals (Ca, Fe, Mg, Zn, Mn, Cu, I) may be included.
  • the diet may be a commercially available feed to which the vaccine or peptide of the present embodiment is added.
  • the vaccine or peptide of the present embodiment is expressed in transformants or recombinant silkworms described later.
  • the dry powder of the transformant or the recombinant silkworm may be used as it is without purifying the target antigenic peptide.
  • a diet of one embodiment may be a health feed containing the vaccine or peptide of this embodiment.
  • the diet of this embodiment is given to crustaceans at regular intervals (e.g., once every 3 months, once every 2 months, once every month, once every 10 days, once every 5 days). , or daily) can effectively prevent or treat white spot disease.
  • the nucleic acid molecule of this embodiment is a peptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7 or an amino acid sequence having deletion, substitution or insertion of 1 to 3 amino acid residues in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7. and encodes an antigenic peptide having 8-30 amino acid residues.
  • the nucleic acid molecule of this embodiment can be obtained, for example, by subjecting the wild-type VP15 gene encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 to error-prone PCR or the like as a template. Alternatively, it can be obtained by introducing site-directed mutation.
  • the nucleic acid molecule of this embodiment can also be obtained by artificial synthesis of a nucleic acid molecule encoding an amino acid sequence designed based on the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 7.
  • the nucleic acid molecule obtained as described above is used as it is or is cleaved with an appropriate restriction enzyme or the like, incorporated into a vector by a conventional method, and the obtained recombinant expression vector is introduced into a host cell.
  • the base sequence of the nucleic acid molecule can be determined by analysis using a base sequence analyzer such as the method.
  • Vectors that can be used for determining the nucleotide sequence of nucleic acid molecules include pFastBac, pGEX-6P-1, and the like.
  • the nucleic acid molecule of this embodiment may contain a nucleic acid that encodes the aforementioned protein tag in addition to the nucleic acid that encodes the antigenic peptide of this embodiment. In this case, it is preferable to allow the antigenic peptide of this embodiment and the protein tag to be expressed as a fusion protein.
  • the transformant of this embodiment can be obtained by transforming a host cell with the nucleic acid molecule of this embodiment.
  • the host cell is not particularly limited as long as it can express the antigenic peptide of the present embodiment, but examples include prokaryotes such as E. coli, yeast, insect cells, plant cells, and animal cells. Escherichia coli, yeast, insect cells or mammalian cultured cells are preferred.
  • the nucleic acid molecule of the present embodiment as it is or a recombinant expression vector obtained by incorporating the nucleic acid molecule of the present embodiment into a vector is used to transform host cells. Conversion is preferred.
  • the vector that can be used for the recombinant expression vector is not particularly limited, and can be appropriately selected depending on the host cell.
  • vectors include pGEX-6P-1 and the like.
  • vectors include pYES2 and the like.
  • vectors include pcDNA3.1(+) and the like.
  • a transformant can be obtained by introducing the above nucleic acid molecule or recombinant expression vector into a host cell. Introduction may be performed by a conventional method.
  • the antigenic peptide of the present embodiment is expressed, collected, and optionally purified to obtain the antigenic peptide of the present embodiment. of antigenic peptides can be obtained.
  • the recombinant silkworm of this embodiment can be obtained by incorporating the nucleic acid molecule of this embodiment.
  • the nucleic acid molecule of the present embodiment can be incorporated into silkworms as it is or by using a recombinant expression vector obtained by incorporating the nucleic acid molecule of the present embodiment into a vector.
  • Vectors for integration into silkworms include, for example, pFastBac.
  • a recombinant silkworm is preferably used for the production of the antigenic peptide of this embodiment.
  • Silkworms can be bred if there is a space where the temperature can be controlled to some extent, and since they feed on mulberry leaves or artificial feed, they do not require control devices such as bioreactors, culture media, and fermenters, and production costs are low.
  • the protein expression level per silkworm is said to be comparable to the expression level of 30 ml of E. coli culture solution, and it is possible to obtain proteins with high quality such as three-dimensional structure and modification.
  • pupae As silkworms, larvae, preferably 5th instar larvae may be used, and pupae may be used. In the case of silkworms, purification costs are high, but in the case of oral administration, pupae may be used from the viewpoint that recombinant silkworms can be directly administered as feed without purifying antigenic peptides. In addition, it may be a pupa from the viewpoint of being rich in protein and lipid and excellent in nutrition.
  • Methods for incorporating the nucleic acid molecule of this embodiment into silkworms include the mNPV Bacmid expression method, which can express an antigenic peptide. Also, after expression, antigenic peptides can be affinity recovered by GST tag or FLAG tag. It can then be purified if desired.
  • Example 1 Screening of WSSV Antigens Showing Anti-WSSV Effect (1) Expression of Fragment Peptide of WSSV-VP15 As shown in FIG. Peptide (VP15 (aa1-25) ; SEQ ID NO: 2), peptide consisting of 26th to 57th amino acid residues (VP15 (aa26-57) ; SEQ ID NO: 3), peptide consisting of 58th to 80th amino acid residues (VP15 ( aa58-80) ; SEQ ID NO: 4), and a peptide (VP15 (aa1-25, 58-80) ; SEQ ID NO: 5) in which the 1st to 25th amino acid residues and the 58th to 80th amino acid residues are directly linked Fragmented into 4 pieces.
  • a DNA encoding a fusion protein was prepared by fusing a FLAG tag (DYKDDDDK; SEQ ID NO: 10) to the C-terminus of WSSV-VP15 (wsv214), and the expression vector pGEX-6P-1 ( GE Healthcare, USA) to form a fusion protein with GST at the C-terminus of GST (glutathione-S-transferase, 26 kDa) (Non-Patent Document 10).
  • This constructed plasmid was named "pGEX-VP15".
  • plasmids expressing VP-15 and each of the above four fragment peptides were constructed. Specifically, inverse PCR was performed using KOD-PLUS-NEO (Toyobo, Japan) and the primer set shown in Table 1. In Table 1, each primer set is a primer set for amplifying the plasmid fragment expressing the fragment peptide described on the left side, FW is the forward primer, and RV is the reverse primer. Inverse PCR was performed after denaturation at 94°C for 2 minutes, followed by 30 cycles of 98°C for 10 seconds, 57°C for 30 seconds, 68°C for 2 minutes and 30 seconds, and finally extension at 68°C for 7 minutes.
  • the amplified product was treated with T4 DNA polymerase (NEB, Japan) and then self-ligated.
  • T4 DNA polymerase NEB, Japan
  • the resulting plasmid containing each peptide fragment was transformed into E. coli DH5 ⁇ by the heat shock method.
  • the transformed E. coli was inoculated onto an agar medium containing 50 ⁇ g/ml ampicillin, plasmids were extracted from ampicillin-positive colonies, and the sequences of each fragment were confirmed by Sanger DNA sequencing.
  • the culture was chilled on ice for 30 minutes and protein expression was determined by adding isopropyl- ⁇ -thiogalactopyranoside (IPTG) to the culture to a final concentration of 0.5 mM. was induced and incubation continued for 18 hours at 16°C. After 18 hours, E. coli were harvested by centrifugation (6,000 ⁇ g, 4° C., 15 minutes), washed twice with phosphate-buffered saline (PBS, pH 7.3), and kept at ⁇ 80° C. until use. saved with
  • IPTG isopropyl- ⁇ -thiogalactopyranoside
  • E. coli was resuspended in PBS containing 1 ⁇ proteinase inhibitor (cOmpleteTM, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail, Sigma-Aldrich, Japan) and 10 ⁇ g/ml lysozyme.
  • the suspension was sonicated on ice (70% amplitude, 30 sec on/off, 15 cycles), centrifuged (10,000 ⁇ g, 4° C., 10 min) and passed through a 0.2 ⁇ m cellulose acetate membrane (Minisart (registered trademark) NML, Sartorius, Japan).
  • FIG. 2(a) shows the results of SDS-PAGE
  • FIG. 2(b) shows the results of Western blotting.
  • the molecular weight of the fusion protein of VP-15 and GST is 37.0 kDa, and the molecular weight of each VP-15 fragment peptide and each fusion protein of GST is 30.8 kDa (VP15 (aa1-25) ), 31 6 kDa (VP15 (aa26-57) ), 30.5 kDa (VP15 (aa58-80) ) and 33.5 kDa (VP15 (aa1-25, 58-80) ).
  • the expression of each fusion protein was confirmed because the molecular weight of each fusion protein shown in FIG. 2 agreed with the estimated molecular weight.
  • FIG. 3 shows the results of SDS-PAGE (12% SDS gel) of the purified fusion protein.
  • control shrimp were also inoculated with 10 ⁇ L/tail of PBS in the PBS group and 10 ⁇ g/g shrimp body weight of GST-VP15 (aa26-57) in the control GST group in the same manner as the experimental group.
  • a control group of shrimp was also injected intramuscularly with PBS or GST in the same manner as the experimental group.
  • WSSV was obtained as follows. A 10 ⁇ 3 dilution of virus prepared from juvenile shrimp infected with natural WSSV was injected intramuscularly into adult tiger shrimps (average body weight 78 g), hemolymph was collected 3 days after infection and stored at -80°C. Prior to each experiment, stored virus was thawed, centrifuged at 1500 xg for 10 minutes at 4°C, and the resulting supernatant diluted in PBS for challenge.
  • Kuruma prawns were reared in dechlorinated electrolyzed seawater (33.05 ⁇ 0.13 ppt) at 24 ⁇ 1.8°C using double-bottom tanks on a sand bed. They were fed commercial shrimp diet (Juveniles P-2, Maruha, Japan) at 3% of body weight per day.
  • the survival rate (%) of each group was obtained by the formula below.
  • the 20-day survival rate of each group is shown in FIG.
  • the PBS control group and the GST control group had a dramatic decrease in survival from day 4 to day 7, reaching 20% and 33.3% survival respectively at 20 days post-challenge.
  • the VP15 (aa1-25) administration group showed the same tendency as the GST group.
  • VP15, VP15 (aa58-80) , or VP15 (aa1-25, 58-80) administration groups showed survival rates of 42.1%, 47.6%, and 38.9% at day 20, respectively. .
  • VP15 (aa26-57) showed a survival rate of 57.9% at 20 days and was the only experimental group showing a significant difference ( ⁇ 2 test, p ⁇ 0:05) ( Fig . 4). .
  • Example 2 Identification of Antigenic Domain in WSSV-VP15 (1) Peptide Synthesis Example 1 revealed that VP15 (aa26-57) has higher antigenicity than other peptide fragments. Therefore, VP15 (aa26-57) was further fragmented to identify the antigenic domain.
  • VP15 (aa26-57) was further subdivided into four peptide fragments: KR-11 (KTKSRRGSKKR, SEQ ID NO:6), SR-11 (STTAGRISKRR, SEQ ID NO:7), KK-13 (KRRSPSMKKRAGK, SEQ ID NO:7). 8), and SK-10 (SPSMKKRAGK, SEQ ID NO: 9), respectively, which were commercially synthesized (GL Biochem Ltd., China).
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • ESI-MS electrospray ionization mass spectrometry
  • HPLC was used for purification of each peptide using an Inertsil ODS-SP column (purity >95%).
  • the purity and molecular weight of the purified synthetic peptides were analyzed using liquid chromatography-electrospray ionization coupled with mass spectrometry (LC-MS/ESI, Agilent-6125B).
  • Example 3 Expression of VP15 and SR-11 in Silkworm Using pGEX-VP15 as a template and using the primer set described in Table 1, VP15 (SEQ ID NO: 1) or SR-11 fragment peptide of VP15 (SEQ ID NO: 1) or SR- A pFastBac vector incorporating a nucleic acid molecule encoding GST-VP15 or SR-11 fused with GST and Flag tag such that 11 (SEQ ID NO: 7) is downstream of GST and upstream of Flag tag. made. Furthermore, a recombinant BmNPV bacmid for silkworm expression was prepared by transforming the pFastBac vector into E.
  • BmNPV bacmid DNA was mixed with DMRIE-C (Thermo Fisher Scientific, Japan) at a concentration of 0.2 ⁇ g BmNPV bacmid/1 ⁇ L, and the resulting solution was injected into 5-instar silkworm larvae or larvae at 20 ⁇ L/mouse with a needle 26-gauge syringe. injected into the pupae. )
  • Proteins were detected using a mouse anti-Flag tag antibody (1:10000, MBL, Japan) as the primary antibody for Western blotting and an anti-mouse antibody (1:10000) as the secondary antibody (MBL, Japan).
  • a mouse anti-Flag tag antibody (1:10000, MBL, Japan)
  • an anti-mouse antibody (1:10000)
  • MBL mouse anti-Flag tag antibody
  • VP15, VP15 (aa26-57) , and SR-11 are nucleic acid molecules encoding fusion proteins fused to GST and Flag tags such that they are downstream of GST and upstream of Flag tag, respectively. It was constructed and expressed in E. coli. As a control, GST alone was used. On the other hand, the receptor MjgCqR-His was expressed in silkworms in the same manner as described above.
  • Example 5 Evaluation of Infection-Protecting Effect by Oral Administration of Various Vaccines
  • purified liquid 1 and powder containing various proteins/peptides shown in Table 2 were prepared. 2 to 6 were used.
  • the GST protein was expressed in E. coli in the same manner as in Example 1 and purified with a GST affinity column to obtain purified solution 1 (negative control, 2 mg protein/mL).
  • GST protein was expressed in silkworm pupae in the same manner as in Example 3, was not purified after expression, was lyophilized and ground in a mortar to obtain powder 2 (negative control).
  • Fusion proteins of antigenic peptides of various purposes (VP15, VP15 (aa26-57) or SR-11) and GST were similarly expressed in silkworm pupae, not purified after expression, freeze-dried, and ground in a mortar. Powders 3-5 were obtained. SR-11 was artificially synthesized in the same manner as in Example 2 to obtain powder 6. The content of the target antigenic peptide (VP15, VP15 (aa26-57) , or SR-11) in the obtained powders 3 to 5 was quantified and shown in Table 2.
  • Purified liquid 1 and powders 2 to 6 were mixed with a commercially available feed (Juveniles P-2, Maruha, Japan) so as to have the composition shown in Table 3 to prepare a total of 29.8 g of mixed feed. 0.5% of spreading agent (Shering-Plough Animal Health, USA) was added to this mixed feed. After that, 1788 ⁇ L of PBS buffer corresponding to 6% of the mixed feed was mixed to obtain vaccine-containing feeds 1 to 6. Vaccine-containing diets 1 and 2 served as negative controls. Feed (PBS feed) prepared in the same manner without the addition of various proteins/peptides was also used as a negative control.
  • the GST-VP15 group, the GST-VP15 (aa26-57) group, the GST-SR-11 group, and the SR-11 group, the prawns were fed vaccine-containing feed 3 to 6 in an amount of 1.3 g / day. and fed for 23 days. After that, the animals were returned to the normal feed, continued to be bred for 6 days, and tested for WSSV infection on the 30th day.
  • GST (derived from E. coli) group, GST (derived from silkworm pupae) group and PBS group were administered vaccine-containing feeds 1 to 2 and PBS feed, respectively, in the same manner as in the experimental group.
  • the WSSV infection test adopted the immersion attack test.
  • Shrimp killed by WSSV infection were added with 9 times the body weight of PBS, ground, centrifuged at 1500 xg for 15 minutes at 4°C, and the resulting supernatant was diluted to a predetermined DNA copy number. was diluted with PBS to obtain a WSSV homogenate.
  • the WSSV homogenate was diluted 10-2.8 with water so as to give 1.27 ⁇ 10 6 DNA copies/g shrimp when the total weight of the challenged shrimp was 30 g/water (L). added and soaked for 2 hours.
  • the shrimps subjected to the test were taken out into a net, washed with clean seawater under running water for 3 minutes, and housed in a breeding tank.
  • FIG. 9 shows the relative survival rate of each group 20 days after the WSSV infection test.
  • the relative survival rates 20 days after the WSSV infection test were 60.3% and 68.8%, respectively.
  • the GST-VP15 group had a relative survival rate of 81.1%, while the GST-VP15 (aa26-57) group had a relative survival rate of 100%. This demonstrates that VP15 (aa26-57) has a high protective effect against WSSV infection.
  • the relative survival rate was 72.2%, which was higher than the relative survival rate of the GST group derived from E. coli and silkworm pupae, but lower than the relative survival rate of the GST-VP15 group. .
  • the SR-11 group also showed a high relative survival rate of 90.5%. Although the relative survival rate of the GST-SR-11 group was lower than that of the GST-VP15 group, the relative survival rate of the SR-11 group was higher than that of the GST-VP15 group. SR-11 alone was shown to be more effective in protecting against WSSV infection than the form containing SR-11. Since both the GST-VP15 group and the GST-VP15 (aa26-57) group had a relative survival rate of 80% or more, various proteins (vaccine) in the experimental group were also effective in protecting shrimp from WSSV infection by oral administration. It is considered to be a target.
  • Example 6 Changes in Gene Expression Levels Due to Administration of Vaccine-Containing Feed
  • various genes that is, transcription factors that play a central role in NF- ⁇ B immune responses. Changes in the expression levels of the Dorsal gene and Relish gene, the STAT gene that induces a signal in the antiviral response and improves the expression of AMP, and the ProPO gene that induces the expression of a protein that blocks the invasion of pathogens before and after administration. evaluated.
  • RNA was extracted from the gills of prawns using NucleoSpin RNA (Macherey-Nagel, Germany). .
  • the extracted total RNA was reverse transcribed using ReverTra Ace qPCR RT Master Mix (Toyobo, Japan) to synthesize first-strand cDNA.
  • ReverTra Ace qPCR RT Master Mix Toyobo, Japan
  • quantitative real-time PCR qPCR
  • FIGS. 10 and 11 The relative expression level of mRNA of each gene is a value relative to the expression level of the ⁇ -actin gene. Also, the expression level of the ⁇ -actin gene was defined as "1".

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Abstract

本願発明の課題はホワイトスポットシンドロームウイルス（ＷＳＳＶ）感染に対する防御効果のあるワクチンを提供することである。本発明のホワイトスポットシンドロームウイルス（ＷＳＳＶ）の感染を予防又は治療するためのワクチンは、配列番号７に示すアミノ酸配列、又は、配列番号７に示すアミノ酸配列において、１～３個のアミノ酸残基の欠失、置換若しくは挿入を有するアミノ酸配列を含む抗原性ペプチドであって、８～３０個のアミノ酸残基からなる抗原性ペプチドを含む。

Description

ＷＳＳＶワクチン
　本発明は、ホワイトスポットシンドロームウイルス（ＷＳＳＶ）の感染を予防又は治療するためのワクチンに関する。
　ホワイトスポット病（以下、ＷＳＤ）は、水生甲殻類が罹るウイルス性の感染症であり、外殻に斑点が生じ、発症から２週間以内にほぼ１００％が死滅するため、養殖エビの最も壊滅的な病気の１つとして知られている。ＷＳＤによる世界的な損失は約１５０億ドルと推定され、年間１０億ドルの増加率で被害が拡大していると言われている。したがって、世界的にＷＳＤの有効な対策に対する需要は高い。
　ＷＳＤの原因ウイルスは、ニマウイルス科（Ｎｉｍａｖｉｒｉｄａｅ）Ｗｈｉｓｐｏｖｉｒｕｓ属の唯一の種であるホワイトスポットシンドロームウイルス（ＷＳＳＶ）である。ＷＳＳＶは、スーパーコイル状の環状２本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を含む大きな桿菌型エンベロープウイルスであり、ビリオンのサイズは約８０～１００×２５０～３５０ｎｍであり、棒状のヌクレオカプシドが三層膜で覆われており、ゲノムの長さは２８５～３０５ｋｂｐで、９つのタンデムリピート保存領域と１８０の推定オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）があるが、ＯＲＦの多くはデータベースの既知のタンパク質と相同性がない。またＷＳＳＶは、少なくとも６つのビリオンタンパク質、すなわち、エンベロープタンパク質由来のＶＰ１９及びＶＰ２８、テグメントタンパク質由来のＶＰ２４及びＶＰ２６、並びに、ヌクレオカプシドタンパク質由来のＶＰ１５及びＶＰ６６４を含むことが知られている（非特許文献１、２）。
　ＷＳＳＶに感染したエビには、嗜眠、食欲不振、食物摂取の減少、修復活性の低下、甘皮の弛緩、赤みがかった変色、外骨格上の白い石灰化スポット（直径０．５～３ｍｍ）等の症候が見られ、一週間以内に９０％の致死率をもたらす。
　ＷＳＳＶワクチンの開発において、ウイルスタンパク質サブユニット、弱毒化されたＷＳＳＶ及びＤＮＡ／ＲＮＡベースの免疫剤が知られている（非特許文献３、４）。その大部分は、ＶＰ１９、ＶＰ２４、ＶＰ２６、ＶＰ２８、ＶＰ２９２及びＶＰ４６６等の組換えサブユニットワクチンで、その中ではＶＰ２８の利用が報告されている（非特許文献５～９）。これらのＷＳＳＶサブユニットワクチンは、大腸菌で発現したものである。
　本発明者はこれまでに、５つの組換えＷＳＳＶタンパク質ＶＰ１５、ＶＰ１９、ＶＰ２４、ＶＰ２６及びＶＰ２８の抗ＷＳＳＶ効果（ＷＳＳＶ感染防御効果）を調べた。これらのタンパク質をカイコ及び大腸菌を用いて発現及び精製を行い、クルマエビを用いたｉｎ　ｖｉｖｏ抗ウイルスアッセイにより、ヌクレオカプシドタンパク質ＶＰ１５がＷＳＳＶ感染に対する高い免疫原性を示すことを確認した（非特許文献１０）。
X. Xie, et al., J. Virol. 80, 10615-10623, (2006) Tsai, J. M. et al., J. Virol. 80, 3021-3029, (2006) Chang, Y. H., et al., Dev. Comp. Immunol. 80, 53-66, (2018) Dey, B.K., et al., Reviews in Aquaculture 12, 822-865, (2020) Witteveldt, J., et al., Fish Shellfish Immunol. 16, 571-579, (2004) Thomas, A. et al., J. Invertebr. Pathol. 123, 17-24, (2014) Satoh, J., et al., Dis. Aquat. Org. 82, 89-96, (2008) Vaseeharan, B., et al., Lett. Appl. Microbiol. 43, 137-142, (2006) Ye, T., et al., Fish Shellfish Immunol. 33, 350-358, (2012) Jirayu Boonyakida et al., Fish and Shellfish Immunology 101, 152-158, (2020)
　本発明は、ホワイトスポットシンドロームウイルス（ＷＳＳＶ）感染に対する防御効果のあるワクチンを提供することを目的とする。
　本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、ＷＳＳＶタンパク質ＶＰ１５の断片ペプチドであるＳＲ－１１（配列番号７）が、高いＷＳＳＶ感染防御効果を有することを見出し、本発明を完成させた。
　すなわち、本発明は、以下のとおりである。
［１］
　配列番号７に示すアミノ酸配列、又は、配列番号７に示すアミノ酸配列において、１～３個のアミノ酸残基の欠失、置換若しくは挿入を有するアミノ酸配列を含む抗原性ペプチドであって、８～３０個のアミノ酸残基からなる抗原性ペプチドを含む、ホワイトスポットシンドロームウイルス（ＷＳＳＶ）の感染を予防又は治療するためのワクチン。
［２］
　上記抗原性ペプチドが、８～２０個のアミノ酸残基からなる、［１］に記載のワクチン。
［３］
　上記抗原性ペプチドが、配列番号７に示すアミノ酸配列、又は、配列番号７に示すアミノ酸配列において、１～３個のアミノ酸残基の欠失、置換若しくは挿入を有するアミノ酸配列からなる、［１］又は［２］に記載のワクチン。
［４］
　上記抗原性ペプチドが、配列番号１に示すアミノ酸配列の連続した８～３０個のアミノ残基を含むペプチドであるか、又は、配列番号１に示すアミノ酸配列の連続した８～３０個のアミノ残基からなるペプチドと８０％以上の配列同一性を有するペプチドである、［１］に記載のワクチン。
［５］
　配列番号７に示すアミノ酸配列、又は、配列番号７に示すアミノ酸配列において、１～３個のアミノ酸残基の欠失、置換若しくは挿入を有するアミノ酸配列を含み、かつ、８～３０個のアミノ酸残基を有する、単離されたペプチド。
［６］
　［１］～［４］のいずれかに記載のワクチン、又は、［５］に記載のペプチドを有効量で含む、甲殻類動物のための食餌。
［７］
　健康飼料である、［６］に記載の食餌。
［８］
　配列番号７に示すアミノ酸配列、又は、配列番号７に示すアミノ酸配列において、１～３個のアミノ酸残基の欠失、置換若しくは挿入を有するアミノ酸配列からなるペプチドを含み、８～３０個のアミノ酸残基を有する抗原性ペプチドをコードする、核酸分子。
［９］
　［８］に記載の核酸分子で宿主細胞を形質転換して得られる、形質転換体。
［１０］
　［８］に記載の核酸分子を組み込んだ、組換えカイコ。
［１１］
　幼虫又はサナギである、［１０］に記載の組換えカイコ。
　本発明のワクチンによれば、甲殻類動物においてホワイトスポット病を予防又は治療することができる。また、本発明における抗原性ペプチドが短く（８～５０個のアミノ酸残基）、かつ、大腸菌又はカイコにおいて簡単に大量に生産できるため、養殖エビへの適用が期待される。
ＷＳＳＶの模式図、並びに、断片化したＷＳＳＶ　ＶＰ－１５の各断片ペプチドのアミノ酸位置及び長さを示す模式図である。 実施例１において、大腸菌で発現させた各ＶＰ－１５断片ペプチドとＧＳＴとの融合タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ａ）及びウエスタンブロット（ｂ）で解析した結果を示す。ＧＳＴ：アフィニティー精製用のグルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ、ＦＬＡＧ　ｔａｇ：ウエスタンブロット解析用のＦＬＡＧタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ；配列番号１０）、Ｍ：分子量マーカー、Ｓ：上澄み、Ｐ：沈殿物。 実施例１において、ＧＳＴ親和性クロマトグラフィーによって精製した各ＶＰ－１５断片ペプチドとＧＳＴとの融合タンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を示す。Ｍ：分子量マーカー。 実施例１において、クルマエビを用いたＷＳＳＶ－ＶＰ１５の各ペプチド断片のＷＳＳＶ感染に対する防御効果の指標である生存率（％）を示グラフである。 ＶＰ１５（ａａ２６－５７）の各断片ペプチド（ＫＲ－１１、ＳＲ－１１、ＫＫ－１３、ＳＫ－１０）のアミノ酸位置及び長さを示す模式図である。 実施例２において、クルマエビを用いＶＰ１５（ａａ２６－５７）の各断片ペプチドのＷＳＳＶ感染に対する防御効果の指標である生存率（％）を示す。（ａ）はＫＲ－１１、ＳＲ－１１、ＳＫ－１０及びＫＫ－１３による防御効果、（ｂ）はＳＲ－１１による防御効果を示すグラフである。 実施例３において、カイコ幼虫及びサナギでのＧＳＴ－ＶＰ１５又はＧＳＴ－ＶＰ１５（ａａ２５－３６）の発現をウエスタンブロットで確認した結果を示す。 実施例４において、ＶＰ１５、ＶＰ１５（ａａ２６－５７）、及びＳＲ－１１と受容体との相互作用をウエスタンブロットで確認した結果を示す。 実施例５において、クルマエビを用いた各種ワクチン含有飼料投与後のＷＳＳＶ感染に対する防御効果の指標である相対生存率（％）を示す。 実施例６において、クルマエビを用いた各種ワクチン含有飼料投与後のＤｏｒｓａｌ遺伝子（ａ）及びＲｅｌｉｓｈ遺伝子（ｂ）のｍＲＮＡ発現量の変化を調べた結果を示す。 実施例６において、クルマエビを用いたワクチン含有飼料投与後のＳＴＡＴ遺伝子（ａ）及びＰｒｏＰＯ遺伝子（ｂ）のｍＲＮＡ発現量の変化を調べた結果を示す。
〔ワクチン〕
　本実施形態のワクチンは、ホワイトスポットシンドロームウイルス（ＷＳＳＶ）の感染を予防又は治療するためのワクチンであり、配列番号７に示すアミノ酸配列、又は、配列番号７に示すアミノ酸配列において、１～３個のアミノ酸残基の欠失、置換若しくは挿入を有するアミノ酸配列を含む抗原性ペプチドであって、８～３０個のアミノ酸残基からなる抗原性ペプチドを含む。ここで、抗原性ペプチドとは、抗原性（免疫原性）を有するペプチド、特にエビなどの水生甲殻類動物において、抗原性、特にＷＳＳＶ抗原性を有するペプチドを意味する。
　ＷＳＳＶのゲノム配列（ＷＳＳＶ　ＣＮ０１、ＮＣＢＩ、アクセッション番号：ＮＣ＿００３２２５）は知られており、また、５つのタンパク質：ＶＰ１５（ｗｓｖ　２１４）、ＶＰ１９（ｗｓｖ　４１４）、ＶＰ２４（ｗｓｖ　００２）、ＶＰ２６（ｗｓｖ　３１１）及びＶＰ２８（ｗｓｖ　４２１）の存在も知られている。ＶＰ１５（配列番号１）は、８０アミノ酸からなるタンパク質であり、極めて高いｐＩ値を有し、真核生物起源のＤＮＡ結合タンパク質やバキュロウイルスｐ６．９との相同性を示している。ＶＰ１５は、セリン、アルギニン及びリジンをそれぞれ２０～２１％含む。ＶＰ１５は、ウイルスゲノムのキャプシドへのパッケージングに関与している主要なヌクレオカプシドタンパク質であるにもかかわらず、その結晶構造は未だに知られていない。
　配列番号７に示すアミノ酸配列からなるペプチド（全長：１１アミノ酸残基）は、ＶＰ１５タンパク質の３７番目～４７番目のアミノ酸残基からなるＶＰ１５の断片ペプチドであり、本明細書において「ＳＲ－１１」と呼ばれる場合がある。ＳＲ－１１は、エビに投与することによって、免疫を惹起し、ＷＳＳＶに対する感染予防効果をもたらす。すなわち、ＳＲ－１１はＷＳＳＶ抗原性（ＷＳＳＶ免疫原性）を持ち、ＷＳＳＶ感染防御を可能にする、ＷＳＳＶワクチンとして機能する。
　本実施形態における抗原性ペプチドは、上述のとおり、配列番号７に示すアミノ酸配列、又は、配列番号７に示すアミノ酸配列において、１～３個のアミノ酸残基の欠失、置換若しくは挿入を有するアミノ酸配列（本明細書において「ＳＲ－１１変異体」と呼ぶ場合がある）を含む。すなわち、本実施形態における抗原性ペプチドは、少なくともその一部として、ＳＲ－１１又はＳＲ－１１変異体を含む。ＳＲ－１１変異体は、ＷＳＳＶ抗原性を持っていれば特に限定されないが、ＳＲ－１１のアミノ酸配列中の任意の位置における、１個、２個若しくは３個のアミノ酸残基の欠失、置換若しくは挿入を有してよい。２個若しくは３個のアミノ酸残基の場合、連続したアミノ酸残基であっても、不連続のアミノ酸残基であってもよい。
　置換又は挿入付加されるアミノ酸は天然型と非天然型を問わない。天然型アミノ酸としては、Ｌ－アラニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－グルタミン、Ｌ－グルタミン酸、グリシン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－リジン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－プロリン、Ｌ－セリン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－チロシン、Ｌ－バリン、Ｌ－システイン等が挙げられる。
　以下に、相互に置換可能なアミノ酸の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸は相互に置換可能である。
群１：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２－アミノブタン酸、メチオニン、ｏ－メチルセリン、ｔ－ブチルグリシン、ｔ－ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン
群２：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２－アミノアジピン酸、２－アミノスベリン酸
群３：アスパラギン、グルタミン
群４：リジン、アルギニン、オルニチン、２，４－ジアミノブタン酸、２，３－ジアミノプロピオン酸
群５：プロリン、３－ヒドロキシプロリン、４－ヒドロキシプロリン
群６：セリン、スレオニン、ホモセリン
群７：フェニルアラニン、チロシン
　本実施形態における抗原性ペプチドは、上述のＳＲ－１１又はＳＲ－１１変異体からなるか、又は上述のＳＲ－１１又はＳＲ－１１変異体を一部として含み、ＷＳＳＶ抗原性を持っていればその長さは特に限定されないが、好ましくは８～３０個のアミノ酸残基からなり、より好ましくは、８～２５個、８～２０個、９～２０個、１０～２０個、９～１５個、１０～１５個、９～１３個、又は１０～１２個のアミノ酸残基からなる。抗原性ペプチドがＷＳＳＶ抗原性を有する限り、抗原性ペプチドにおけるＳＲ－１１又はＳＲ－１１変異体以外の部分のアミノ酸残基は特に限定されず、ＳＲ－１１又はＳＲ－１１変異体のＷＳＳＶ抗原性に影響を与えないか、ＷＳＳＶ抗原性を向上させるアミノ酸残基であることが好ましい。
　本実施形態における抗原性ペプチドはまた、当該抗原性ペプチドの精製に利用されるタンパク質タグと融合タンパク質を形成した形態であってもよい。タグとしては、例えばＨｉｓタグ、Ｆｌａｇタグ、ｍｙｃタグ、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、ストレップ-タグ等が挙げられ、これらのタグは短いアミノ酸配列を有しており、ＷＳＳＶ抗原性に影響を与えないため、抗原性ペプチドとの融合タンパク質のままにワクチンとして使用されてもよい。または、精製後抗原性ペプチドとタンパク質タグとを切り離してもよい。
　本実施形態における抗原性ペプチドは、ＳＲ－１１又はＳＲ－１１変異体からなることが好ましい。すなわち、抗原性ペプチドが、配列番号７に示すアミノ酸配列、又は、配列番号７に示すアミノ酸配列において、１～３個、好ましくは２個、より好ましくは１個のアミノ酸残基の欠失、置換若しくは挿入を有するアミノ酸配列からなることが好ましく、配列番号７に示すアミノ酸配列からなることが特に好ましい。
　本実施形態における、ＳＲ－１１又はＳＲ－１１変異体を含む抗原性ペプチドは、配列番号１に示すアミノ酸配列の連続した８～３０個のアミノ残基からなるペプチドであるか、又は、配列番号１に示すアミノ酸配列の連続した複数のアミノ残基からなるペプチドと８０％以上、好ましくは８５％以上、９０％以上、又は９５％以上の配列同一性を有する、８～３０個のアミノ残基からなるペプチドであってもよい。配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質は、ＶＰ１５タンパク質であり、ＶＰ１５タンパク質の３７番目～４７番目のアミノ酸残基からなるペプチドはＳＲ－１１である。上述したように、本実施形態における抗原性ペプチドは、ＳＲ－１１又はＳＲ－１１変異体を配列の全部又は一部として含む。すなわち、本実施形態における抗原性ペプチドは、ＶＰ１５タンパク質の断片ペプチド又は断片ペプチド変異体であって、ＳＲ－１１又はＳＲ－１１変異体を配列の全部又は一部として含むものである。
　本実施形態における抗原性ペプチドは、人工的に合成してもよいが、後述の形質転換体や組換えカイコにて発現させることによって大量生産することができる。後述の形質転換体又は組換えカイコにて発現させたペプチドを用いる場合、目的の抗原性ペプチドを精製しても精製しなくてもよい。特に経口投与の場合は、組換えカイコをそのまま乾燥させて、餌に混ぜて使用してもよい。
　本実施形態のワクチンは、有効量の抗原性ペプチドのみからなるものであってもよく、有効量の抗原性ペプチド以外の他の成分を含んでいてもよい。
　本実施形態のワクチンの剤形は、例えば、液状、粉末状（凍結乾燥粉末、乾燥粉末）、顆粒状等であってもよい。抗原性ペプチド以外の他の成分としては、ワクチン製造に通常用いられる担体であってよく、例えば、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセロール、等張水性緩衝液及びそれらの組み合わせが挙げられる。他の成分としてはさらに、乳化剤、保存剤（例えば、チメロサール）、等張化剤、ｐＨ調整剤、不活化剤（例えば、ホルマリン）等が、更に適宜配合されてもよい。
　本実施形態のワクチンは、抗原性ペプチドと、必要に応じて、担体、抗原性を増強する成分等の他の成分と混合することにより得ることができる。
　本実施形態のワクチンは、甲殻類動物、例えば養殖用甲殻類動物、特にホワイトスポット病に罹患する甲殻類動物、好ましくはエビ、ロブスター等の水生甲殻類動物に投与されるためのものであり、エビとしては、特にクルマエビ（Ｍａｒｓｕｐｅｎａｅｕｓ　ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、バナメイエビ（Ｌｉｔｏｐｅｎａｅｕｓ　ｖａｎｎａｍｅｉ）、ウシエビ（Ｐｅｎａｅｕｓ　ｍｏｎｏｄｏｎ）、及びインドエビ（Ｆｅｎｎｅｒｏｐｅｎａｅｕｓ　ｉｎｄｉｃｕｓ）などが挙げられる。本実施形態のワクチンを甲殻類動物に投与することによって、ホワイトスポット病を有効に予防又は治療できる。
　本実施形態のワクチンの投与経路は特に限定されず、例えば、筋肉内注射であってもよく、経口投与であってもよい。投与回数は１回でも効果があるが、複数回の投与、例えば、２回、３回、４回若しくは５回投与するとよい高い感染防御効果が得られる。また、定期的に投与すること、例えば年に１～２５回、特に年に３回、年に４回、年に６回、年に１２回又は月に１～４回投与することが好ましい。複数回投与の場合、投与間隔は特に限定されず、例えば１日～３ヶ月、１週間～２か月、１０～３０日間又は１５～２５日間あけて投与してもよい。また、経口投与の場合、食餌に混ぜて、一定の間隔で（例えば、３か月に１回、２か月に１回、１か月に１回、１０日に１回、５日に１回、又は毎日）給餌することによって投与してもよい。
　本実施形態のワクチンの投与量は、投与頻度及び投与経路によって異なり得るが、例えば、１～１００μｇ抗原性ペプチド／ｇ体重であればよく、５～５０μｇ抗原性ペプチド／ｇ体重、１０～４５μｇ抗原性ペプチド／ｇ体重、又は、１０～２０μｇ抗原性ペプチド／ｇ体重であることが好ましい。
〔ペプチド〕
　本実施形態のペプチドは、配列番号７に示すアミノ酸配列、又は、配列番号７に示すアミノ酸配列において、１～３個のアミノ酸残基の欠失、置換、若しくは挿入を有するアミノ酸配列を含み、かつ、８～３０個のアミノ酸残基を有する、単離されたペプチドである。本実施形態のペプチドは、上述の抗原性ペプチドであってよい。
〔食餌〕
　本実施形態の食餌は、本実施形態のワクチン又はペプチドを有効量で含む。食餌は、甲殻類動物のための食餌であることが好ましく、ワクチン又はペプチドの有効量としては、１～１００μｇ抗原性ペプチド／日／ｇ体重であればよく、５～５０μｇ抗原性ペプチド／日／ｇ体重、１０～４５μｇ抗原性ペプチド／ｇ体重、又は、１０～２０μｇ抗原性ペプチド／日／ｇ体重であることが好ましい。有効量が投与間隔によって異なり得、適宜に調整することができる。例えば、５日に１回の投与の有効量は、毎日投与の有効量が１．５～３倍、好ましくは２倍であってよい。
　本実施形態の食餌は、本実施形態のワクチン又はペプチドの他に、甲殻類動物に適した食餌成分を含むものであればよい。本実施形態の食餌は、具体的には、例えばタンパク質、脂質、炭水化物、ビタミン及びミネラル類を含んでいてもよく、より具体的には、フィッシュミール、オキアミミール、小麦粉、とうもろこし、アルファルファミール、ビール酵母、小麦胚芽、イカミール、海藻粉末、濃縮アルファルファ、魚油、スピルリナ、キトサン、ケール、海苔、アミノ酸、カロチノイド、ガーリック、ビタミン類（塩化コリン、ビタミンＥ、ビタミンＣ、イノシトール、ビタミンＢ５、ビタミンＢ２、ビタミンＡ、ビタミンＢ１、ビタミンＢ６、ビタミンＢ３、葉酸、ビタミンＤ３、ビオチン）、ミネラル類（Ｃａ、Ｆｅ、Ｍｇ、Ｚｎ、Ｍｎ、Ｃｕ、Ｉ）を含んでもよい。
　食餌としては、市販の飼料に本実施形態のワクチン又はペプチドを添加したものであってもよく、ここで、本実施形態のワクチン又はペプチドとして、後述の形質転換体又は組換えカイコにて発現させたペプチドを用いる場合、目的の抗原性ペプチドを精製することなく、形質転換体又は組換えカイコの乾燥粉末をそのまま用いてもよい。一実施形態の食餌は、本実施形態のワクチン又はペプチドを含む健康飼料であってよい。
　本実施形態の食餌を、甲殻類動物に一定の間隔で（例えば、３か月に１回、２か月に１回、１か月に１回、１０日に１回、５日に１回、又は毎日）投与することによって、ホワイトスポット病を有効に予防又は治療できる。
〔核酸分子〕
　本実施形態の核酸分子は、配列番号７に示すアミノ酸配列、又は、配列番号７に示すアミノ酸配列において、１～３個のアミノ酸残基の欠失、置換若しくは挿入を有するアミノ酸配列からなるペプチドを含み、８～３０個のアミノ酸残基を有する抗原性ペプチドをコードする。
　本実施形態の核酸分子は、例えば、配列番号１に示すアミノ酸配列をコードするワイルドタイプＶＰ１５遺伝子を鋳型としてエラープローンＰＣＲ等に供することにより取得することができる。または、部位特異的変異を導入することによっても得ることができる。本実施形態の核酸分子は、また配列番号１又は７のアミノ酸配列に基づき設計したアミノ酸配列をコードする核酸分子を人工合成によって得ることができる。
　上記のように取得した核酸分子は、そのまま、又は適当な制限酵素等で切断し、常法によりベクターに組み込み、得られた組換え発現ベクターを宿主細胞に導入した後、通常用いられる塩基配列解析方法等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、該核酸分子の塩基配列を決定することができる。
　核酸分子の塩基配列を決定する際に用いることができるベクターとしては、ｐＦａｓｔＢａｃ、又はｐＧＥＸ－６Ｐ－１等が挙げられる。
　本実施形態の核酸分子は、本実施形態の抗原性ペプチドをコードする核酸の他に、上述のタンパク質タグをコードする核酸を含んでもよい。この場合、本実施形態の抗原性ペプチドとタンパク質タグとが融合タンパク質として発現できるようにすることが好ましい。
〔形質転換体・組換えカイコ〕
　本実施形態の形質転換体は、本実施形態の核酸分子で宿主細胞を形質転換することによって得ることができる。
　宿主細胞としては、本実施形態の抗原性ペプチドを発現できるものであれば特に限定されないが、例えば、大腸菌等の原核生物、酵母、昆虫細胞、植物細胞、動物細胞等が挙げられる。好ましくは大腸菌、酵母、昆虫細胞又は哺乳類動物培養細胞である。これらの宿主細胞で抗原性ペプチドを発現させるために、本実施形態の核酸分子をそのまま、又は本実施形態の核酸分子をベクターに組み込んで得られた組換え発現ベクターを用いて、宿主細胞を形質転換することが好ましい。
　組換え発現ベクターに利用できるベクターは特に限定されず、宿主細胞によって適宜に選択することができる。例えば、宿主細胞が大腸菌の場合、ベクターとしては、ｐＧＥＸ－６Ｐ－１等が挙げられる。また、酵母細胞の場合、ベクターとしては、ｐＹＥＳ２等が挙げられる。動物細胞の場合は、ベクターとしては、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）等が挙げられる。
　形質転換体は、上記核酸分子又は組換え発現ベクターを宿主細胞に導入することによって得ることができる。導入は常法によって行えばよい。
　形質転換体を適切な培地にて培養し、必要に応じて発現誘導することによって、本実施形態の抗原性ペプチドを発現させ、それを回収し、必要に応じて精製することで、本実施形態の抗原性ペプチドを得ることができる。
　本実施形態の組換えカイコは、本実施形態の核酸分子を組み込むことによって得ることができる。
　本実施形態の核酸分子はそのまま、又は、本実施形態の核酸分子をベクターに組み込んで得られた組換え発現ベクターを用いてカイコに組み込むことができる。カイコに組み込むためのベクターとしては、例えばｐＦａｓｔＢａｃ等が挙げられる。
　本実施形態の抗原性ペプチドの産生に組換えカイコが好ましく用いられる。カイコはある程度温度制御が可能な空間があれば飼育でき、また、桑の葉又は人工飼料等を餌とするため、バイオリアクター、培地、発酵槽等の制御装置は必要とせず生産コストも低い。さらにカイコ一頭あたりのタンパク質発現量は、大腸菌培養液３０ｍｌの発現量に匹敵するといわれ、立体構造、修飾等の品質が高いタンパク質を得ることもできる。
　カイコとしては、幼虫、好ましくは５齢幼虫を用いてもよく、サナギを用いてもよい。カイコの場合、精製コストが高いが、経口投与の場合は、抗原性ペプチドを精製せず、組換えカイコをそのまま飼料として投与できる観点から、サナギであってよい。また、タンパク質及び脂質が豊富であり栄養的に優れている観点からも、サナギであってよい。
　本実施形態の核酸分子をカイコに組み込む方法としては、ｍＮＰＶ　Ｂａｃｍｉｄ発現方法が挙げられ、抗原性ペプチドを発現させることがでる。また、発現させた後に、抗原性ペプチドをＧＳＴタグ、又はＦＬＡＧタグによってアフィニティー回収できる。その後、必要に応じて精製することができる。
　以下に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明は何らこれらに限定されるものではない。
実施例１　抗ＷＳＳＶ効果を示すＷＳＳＶ抗原のスクリーニング
（１）ＷＳＳＶ－ＶＰ１５の断片ペプチドの発現
　図１に示すように、ＷＳＳＶ－ＶＰ１５タンパク質（配列番号１）を、１～２５番目アミノ酸残基からなるペプチド（ＶＰ１５（ａａ１－２５）；配列番号２）、２６～５７番目アミノ酸残基からなるペプチド（ＶＰ１５（ａａ２６－５７）；配列番号３）、５８～８０番目アミノ酸残基からなるペプチド（ＶＰ１５（ａａ５８－８０）；配列番号４）、及び、１～２５番目アミノ酸残基と５８～８０番目アミノ酸残基とを直接連結したペプチド（ＶＰ１５（ａａ１－２５，５８－８０）；配列番号５）の４つに断片化した。
　発明者らの以前の研究では、ＷＳＳＶ－ＶＰ１５（ｗｓｖ　２１４）のＣ末端にＦＬＡＧタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ；配列番号１０）を融合した融合タンパク質をコードするＤＮＡを作製し、発現ベクターｐＧＥＸ－６Ｐ－１（ＧＥヘルスケア、米国）に、ＧＳＴ（グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ、２６ｋＤａ）のＣ末端にＧＳＴと融合タンパク質となるように、クローニングした（非特許文献１０）。この構築されたプラスミドを「ｐＧＥＸ－ＶＰ１５」と名付けた。
　ｐＧＥＸ－ＶＰ１５を鋳型とし、ＶＰ－１５及びその上記４つの断片ペプチドのそれぞれを発現するプラスミドを作製した。具体的には、ＫＯＤ－ＰＬＵＳ－ＮＥＯ（東洋紡、日本）を用いて、表１に示すプライマーセットを用いて、逆ＰＣＲを行った。表１において、各プライマーセットはその左側に記載される断片ペプチドを発現するプラスミド断片を増幅するためのプライマーセットであり、ＦＷはフォーワードプライマーであり、ＲＶはリバースプライマーである。逆ＰＣＲは、９４℃で２分間の変性の後、９８℃で１０秒間、５７℃で３０秒間、６８℃で２分３０秒間の３０サイクルを行い、最後に６８℃で７分間伸長した。次に、増幅産物をＴ４ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ、日本）で処理した後に、自己連結（セルフライゲーション）させた。得られた各ペプチド断片を含むプラスミドを熱ショック法により大腸菌ＤＨ５αに形質転換した。形質転換した大腸菌をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含む寒天培地に接種し、アンピシリン陽性コロニーからプラスミドを抽出し、それぞれの断片の配列をサンガーＤＮＡ配列決定により確認した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
（２）組換えタンパク質の発現及び精製
　（１）で得られた各プラスミドを、エレクトロポレーション法で大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ　ｇａｍｉ－Ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｉｎｃ．、日本）に形質転換した。形質転換された大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ　ｇａｍｉ－Ｂ細胞を、５０μｇ／ｍｌアンピシリンを添加したＬＢ培地中で３７℃、一晩増殖させた。次いで、得られた培養物を、２５０ｍｌのアンピシリン含有ＬＢ培地が入ったフラスコに移し、１５０ｒｐｍで振盪しながら３７℃でインキュベートした。ＯＤ６００が０．５に達したとき、培養物を氷上で３０分間冷却し、イソプロピル－β－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を培養物に最終濃度０．５ｍＭになるまで添加することによってタンパク質発現を誘導し、１６℃で１８時間インキュベーションを継続した。１８時間後、大腸菌を遠心分離（６，０００×ｇ、４℃、１５分）により回収し、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．３）で２回洗浄し、使用されるまで－８０℃で保存した。
　大腸菌を、１×プロテイナーゼ阻害剤（ｃＯｍｐｌｅｔｅ（商標）、Ｍｉｎｉ、ＥＤＴＡ－ｆｒｅｅ　Ｐｒｏｔｅａｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　Ｃｏｃｋｔａｉｌ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、日本）、及び、１０μｇ／ｍｌリゾチームを含有するＰＢＳ中に再懸濁した。懸濁液を氷上で超音波処理し（７０％振幅、３０秒オン／オフ、１５サイクル）、遠心分離し（１０，０００×ｇ、４℃、１０分）、０．２μｍ酢酸セルロース膜（Ｍｉｎｉｓａｒｔ（登録商標）ＮＭＬ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、日本）を通して濾過した。
　得られた各ＶＰ－１５断片ペプチドとＧＳＴの融合タンパク質を含む上澄み及び沈殿物をそれぞれ、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（１５％ＳＤＳゲル）、及び抗ＦＬＡＧタグ抗体（１：１００００、ＭＢＬ、日本）を用いたウエスタンブロット法で解析した。図２（ａ）はＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を、図２（ｂ）はウエスタンブロットの結果をそれぞれ示す。
　ＶＰ－１５とＧＳＴとの融合タンパク質の分子量は３７．０ｋＤａであり、そして、各ＶＰ－１５断片ペプチドとＧＳＴの各融合タンパク質の分子量は、それぞれ３０．８ｋＤａ（ＶＰ１５（ａａ１－２５））、３１．６ｋＤａ（ＶＰ１５（ａａ２６－５７））、３０．５ｋＤａ（ＶＰ１５（ａａ５８－８０））及び３３．５ｋＤａ（ＶＰ１５（ａａ１－２５，　５８－８０））であると推測される。図２に示す各融合タンパク質の分子量は推測分子量と一致したことから、各融合タンパク質の発現が確認された。
　各ＧＳＴ融合組換えタンパク質を含む上澄みはさらに、ＧＳＴ親和性クロマトグラフィー（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ、ＧＥヘルスケア、日本）によって精製した。タンパク質濃度は、Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ－１５　３０Ｋ遠心フィルターユニット（メルク、日本）を用いてＰＢＳに対して透析した後、Ｐｉｅｒｃｅ　ＢＣＡ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、日本）によって測定した。精製後の融合タンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥ（１２％ＳＤＳゲル）結果を図３に示す。
（３）各ＶＰ－１５断片ペプチドのＷＳＳＶ感染に対する防御効果
　クルマエビ（平均体重３．１～６．８ｇ、ｎ＝２０／群）は、７つの群（５つの実験群と２つの対照群）に分けた。実験群の、ＶＰ１５群、ＶＰ１５（ａａ１－２５）群、ＶＰ１５（ａａ２６－５７）群、ＶＰ１５（ａａ５８－８０）群、又はＶＰ１５（ａａ１－２５、５８－８０）群のクルマエビには、それぞれの断片ペプチドを１０μｇ／ｇエビ体重の量で筋肉内注射（ＩＭ）によって接種し（初回免疫）、さらに２０日後に２回目の接種（追加免疫）を行い、さらに１０日後、ＷＳＳＶ（２．６９×１０４ＤＮＡコピー／尾）でチャレンジ（感染）を行った。対照群のエビにも、実験群と同じ要領で、ＰＢＳ群には１０μＬ／尾のＰＢＳを、対照群のＧＳＴ群には１０μｇ／ｇエビ体重のＧＳＴ－ＶＰ１５（ａａ２６－５７）をそれぞれ接種した。対照群のエビにも、実験群と同じ要領でＰＢＳ又はＧＳＴを筋肉内注射した。
　なお、ＷＳＳＶは以下のように入手した。天然のＷＳＳＶに感染した稚エビから調製したウイルスの１０－３希釈液をクルマエビ成体（平均体重７８ｇ）に筋肉内注射し、血リンパは感染３日後に採取し、－８０℃で保存した。各実験の前に、保存されたウイルスを解凍し、４℃にて１０分間１５００×ｇで遠心分離し、得られた上清をＰＢＳで希釈してチャレンジ試験を行った。
　クルマエビは、砂床のダブルボトムタンクを使用して、２４±１．８°Ｃの脱塩素電気分解海水（３３．０５±０．１３ｐｐｔ）で飼育した。１日あたり体重の３％の市販のエビの餌（Ｊｕｖｅｎｉｌｅｓ　Ｐ－２、マルハ、日本）を与えた。
　チャレンジ後、各群のエビの死亡率を２４時間間隔で２０日間観察し、生存率（％）を調べた。各群の生存率（％）は、下の式のように求めた。各群の２０日間の生存率を図４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000002
　ＰＢＳ対照群及びＧＳＴ対照群は、４日目から７日目までの生存率が劇的に低下し、チャレンジ後２０日目で生存率がそれぞれ２０％及び３３．３％に達した。ＶＰ１５（ａａ１－２５）投与群の場合、ＧＳＴ群と同様の傾向を示した。ＶＰ１５、ＶＰ１５（ａａ５８－８０）、又はＶＰ１５（ａａ１－２５、５８－８０）投与群は、２０日目でそれぞれ４２．１％、４７．６％、及び３８．９％の生存率を示した。一方、ＶＰ１５（ａａ２６－５７）は、２０日目で生存率が５７．９％を示し、有意差を示す唯一の実験群であった（χ２テスト、ｐ＜０：０５）（図４）。
実施例２　ＷＳＳＶ－ＶＰ１５における抗原性ドメインの同定
（１）ペプチドの合成
　実施例１により、ＶＰ１５（ａａ２６－５７）は他のペプチド断片よりも高い抗原性を有することが分かった。そこで、ＶＰ１５（ａａ２６－５７）をさらに断片化し、抗原性ドメインを同定した。
　図５に示すように、ＶＰ１５（ａａ２６－５７）をさらに４つのペプチド断片：ＫＲ－１１（ＫＴＫＳＲＲＧＳＫＫＲ、配列番号６）、ＳＲ－１１（ＳＴＴＡＧＲＩＳＫＲＲ、配列番号７）、ＫＫ－１３（ＫＲＲＳＰＳＭＫＫＲＡＧＫ、配列番号８）、及び、ＳＫ－１０（ＳＰＳＭＫＫＲＡＧＫ、配列番号９）に断片化し、それぞれ商業的に合成した（ＧＬ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｌｔｄ．，中国）。
　ペプチドの特性をそれぞれ高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）及びエレクトロスプレイイオン化質量分析（ＥＳＩ－ＭＳ）により分析した。ＨＰＬＣを、Ｉｎｅｒｔｓｉｌ　ＯＤＳ－ＳＰカラム（純度＞９５％）を用いて各ペプチドの精製のために使用した。精製した合成ペプチドの純度及び分子量を、液体クロマトグラフィー－質量分析と組み合わせたエレクトロスプレイイオン化（ＬＣ－ＭＳ／ＥＳＩ、Ａｇｉｌｅｎｔ－６１２５Ｂ）を用いて分析した。
（２）ＶＰ１５（ａａ２６－５７）の各断片ペプチドのＷＳＳＶ感染に対する防御効果
　実施例１の（３）と同様な方法で、各ペプチド断片のクルマエビのＷＳＳＶ感染に対する防御効果を確認した。実験群の、ＧＳＴ－ＶＰ１５（ａａ２６－５７）群（ｎ＝１１）、ＫＲ－１１群（ｎ＝１３）、ＳＲ－１１群（ｎ＝１１）、ＳＫ－１０群（ｎ＝１１）、ＫＫ－１３群（ｎ＝１３）のクルマエビには、それぞれの断片ペプチドを１０μｇ／ｇエビ体重の量で筋肉内注射（ＩＭ）によって接種し（初回免疫）、さらに２０日後に２回目の接種（追加免疫）を行い、さらに１０日後、ＷＳＳＶ（２．６９×１０４ＤＮＡコピー／尾）でチャレンジを行った。ＰＢＳ対照群（ｎ＝１０）のエビにも、実験群と同じ要領で、１０μＬ／尾エビのＰＢＳを接種した。
　各群のエビを１４日間観察し、生存率（％）を算出した（図６（ａ））。ＫＲ－１１、ＳＫ－１０、及びＫＫ－１３を接種した実験群のエビは、チャレンジ２週間後の生存率は約５４％であり、ＰＢＳ対照群の５３％と同程度であった。一方、ＳＲ－１１の場合、チャレンジ２週間後の生存率が約８０％であり、陽性対照のＧＳＴ－ＶＰ１５（ａａ２６－５７）群と同程度であった。このことは、ＳＲ－１１がＷＳＳＶ感染に対して高い防御効果を有することを示唆しており、ＳＲ－１１が有効なＷＳＳＶ抗原性ペプチドであると考えられる。
（３）ＳＲ－１１によるＷＳＳＶ感染に対する防御効果の再現性
　（２）の結果の再現性を確認するために、エビ尾数を２５尾に増やして同様な実験を行った。対照群としてＰＢＳ群、実験群としてＳＲ－１１群とＧＳＴ－ＶＰ１５（ａａ２６－５７）群を用いた。ＷＳＳＶチャレンジ後２０日まで観察を行った（図６（ｂ））。その結果、ＰＢＳ群では、チャレンジ６日間後から生存率が急速に低下し、２０日目には５０％まで低下した。一方、ＳＲ－１１群及びＧＳＴ－ＶＰ１５（ａａ２６－５７）群の場合、チャレンジ２０日後の生存率はそれぞれ７７％と７３％であり、ＳＲ－１１による高いＷＳＳＶ感染防御効果が認められた。
実施例３　カイコにおけるＶＰ１５及びＳＲ－１１の発現
　ｐＧＥＸ－ＶＰ１５を鋳型とし、表１に記載されたプライマーセットを用いて、逆ＰＣＲによって、ＶＰ１５（配列番号１）又はＶＰ１５の断片ペプチドであるＳＲ－１１（配列番号７）が、ＧＳＴの下流になり、かつ、Ｆｌａｇタグの上流となるように、ＧＳＴ及びＦｌａｇタグと融合したＧＳＴ－ＶＰ１５又はＳＲ－１１をコードする核酸分子を組み込んだｐＦａｓｔＢａｃベクターを作製した。さらに、該ｐＦａｓｔＢａｃベクターを、ＢｍＮＰＶバクミド（特許第４２８８３８９号）をもつ大腸菌ＢｍＤＨ１０Ｂａｃに形質転換することによって、カイコ発現用組換えＢｍＮＰＶバクミドを作製した。なお、得られた組換えＢｍＮＰＶバクミドをカイコ幼虫及びサナギに注射して発現させた。注射は、ＢｍＮＰＶバクミドＤＮＡを０．２μｇＢｍＮＰＶバクミド／１μＬの濃度でＤＭＲＩＥ－Ｃ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、日本）に混合し、得られた溶液を針２６ゲージの注射器で２０μＬ／匹でカイコ５齢幼虫又はサナギに注射した。）
　バクミドを注射して５日後、カイコ幼虫又はサナギの脂肪体を回収し、ＴＢＳ（１．３７ｍｏｌ／ｌ　ＮａＣｌ、２６．８ｍｍｏｌ／ｌ　ＫＣｌ、２５０ｍｍｏｌ／ｌ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、０．１％　Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ、ｐＨ７．６）に懸濁し、超音波破砕後、８０００ｇ×１５分間遠心分離し、上清部と沈殿部とに分け、ウエスタンブロットを行った。上清部サンプル、沈殿部サンプルのそれぞれに、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ用Ｓａｍｐｌｅ　Ｂｕｆｆｅｒ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（０．１２５Ｍ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、４（ｗ／ｖ）％　ＳＤＳゲル、２０（ｖ／ｖ）％　Ｇｌｙｃｅｒｏｌ、０．０１（ｗ／ｖ）％　２－メルカプトエタノール）を加え、１００℃で１０分間熱処理した。熱処理後のサンプルを３μＬ、ＳＤＳアクリドアミドゲル（１２％）にアプライし、２５ｍＡ×６５分で電気泳動を行い、ウエスタンブロットに用いた。ウエスタンブロットの一次抗体にマウス抗Ｆｌａｇタグ抗体（１：１００００、ＭＢＬ、日本）、二次抗体に抗マウス抗体（１：１００００）を用い、タンパク質を検出した（ＭＢＬ、日本）。カイコ幼虫では、上清部に多くのＶＰ１５とＶＰ１５ペプチドの発現が確認されたが、サナギの場合、上清部と沈殿部にほぼ同量発現されたことが確認された（図７）。
実施例４　ＶＰ１５、ＶＰ１５（ａａ２６－５７）、及びＳＲ－１１と受容体との相互作用
　ＶＰ１５、ＶＰ１５（ａａ２６－５７）、及びＳＲ－１１と、受容体であるＭｊｇＣｑＲ－Ｈｉｓとの相互作用をウエスタンブロットで確認した。
　ＶＰ１５、ＶＰ１５（ａａ２６－５７）、及びＳＲ－１１は、それぞれが、ＧＳＴの下流になり、かつ、Ｆｌａｇタグの上流となるように、ＧＳＴ及びＦｌａｇタグと融合した融合タンパク質をコードする核酸分子を作製して、大腸菌にて発現させた。対照として、ＧＳＴのみを用いた。一方、受容体ＭｊｇＣｑＲ－Ｈｉｓは、上述と同様な方法でカイコで発現させた。
　精製したそれぞれのタンパク質又はペプチドを用いてウエスタンブロットを行った。レーン１及び２にはＧＳＴ、レーン３及び４にはＧＳＴ－ＶＰ１５、レーン５及び６にはＧＳＴ－ＶＰ１５（ａａ２６－５７）、レーン７及び８にはＧＳＴ－ＳＲ１１をそれぞれロードし、ウエスタンブロットによって、受容体ＭｊｇＣｑＲとの結合を調べた（図８）。（Ａ）及び（Ｂ）は抗Ｈｉｓタグ（ＭＢＬ、日本）を用いＭｊｇＣｑＲ－Ｈｉｓを検出し、（Ｃ）は抗ＧＳＴタグを用いＧＳＴを検出し、（Ｄ）は抗Ｆｌａｇタグを用いＧＳＴ－ＶＰ１５、ＧＳＴ－ＶＰ１５（ａａ２６－５７）及びＧＳＴ－ＳＲ１１ＧＳＴを検出した。
　その結果、ＶＰ１５、ＶＰ１５（ａａ２６－５７）、及びＳＲ－１１と、受容体ＭｊｇＣｑＲ－Ｈｉｓとの結合が確認できた（図８（Ｂ））。一方、ＧＳＴのみでは受容体との結合が見られなかった（図８（Ａ））。このことから、ＶＰ１５、ＶＰ１５（ａａ２６－５７）、及びＳＲ－１１は明確に受容体と相互作用を行っていることが確認できた。
　以上より、ＶＰ１５の断片ペプチドのうち、２６～５７番目アミノ酸残基からなるペプチド（ＶＰ１５（ａａ２６－５７）；配列番号３）が最も高いＷＳＳＶ感染防御効果を示し、特にＶＰ１５（ａａ２６－５７）の断片であるＳＲ－１１（ＳＴＴＡＧＲＩＳＫＲＲ、配列番号７）が最も高いＷＳＳＶ感染防御効果を示すことを、初めて発見した。
実施例５　各種ワクチンの経口投与による感染防御効果の評価
（１）各種ワクチン含有飼料の調製
　経口投与による感染防御効果を評価するため、表２に示す各種タンパク質／ペプチドを含有する精製液１及び粉末２～６を用いた。ＧＳＴタンパク質は、実施例１と同様にして大腸菌で発現させ、ＧＳＴアフィニティカラムで精製することによって、精製液１（陰性対照、２ｍｇタンパク質／ｍＬ）を得た。ＧＳＴタンパク質は、実施例３と同様にしてカイコサナギで発現させ、発現後に精製せず、凍結乾燥させ、乳鉢ですりつぶして粉末２（陰性対照）を得た。各種目的の抗原性ペプチド（ＶＰ１５、ＶＰ１５（ａａ２６－５７）、又はＳＲ－１１）とＧＳＴとの融合タンパク質は、同様にカイコサナギで発現させ、発現後に精製せず、凍結乾燥させ、乳鉢ですりつぶして粉末３～５を得た。ＳＲ－１１は、実施例２と同様に人工合成し、粉末６を得た。得られた粉末３～５における目的の抗原性ペプチド（ＶＰ１５、ＶＰ１５（ａａ２６－５７）、又はＳＲ－１１）の含有量を定量し、表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　精製液１及び粉末２～６を、表３に示す組成となるように、市販の餌（Ｊｕｖｅｎｉｌｅｓ　Ｐ－２、マルハ、日本）に混合して、合計２９．８ｇの混合餌を調製した。この混合餌に、展着剤（Ｓｈｅｒｉｎｇ－Ｐｌｏｕｇｈ　Ａｎｉｍａｌ　Ｈｅａｌｔｈ、ＵＳＡ）を０．５％添加した。その後、混合餌の６％に当たるＰＢＳ緩衝液１７８８μＬを混合し、ワクチン含有飼料１～６を得た。ワクチン含有飼料１及び２を陰性対照とした。また、各種タンパク質／ペプチドを添加せず、同様に調製した飼料（ＰＢＳ飼料）も陰性対照とした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
（２）ワクチン含有飼料の投与による感染防御効果
　表４に示すように、クルマエビ（体重０．６５ｇ、ｎ＝１５～２５／群）を７つの群（３つの対照群と４つの実験群）に分けた。実験群の、ＧＳＴ－ＶＰ１５群、ＧＳＴ－ＶＰ１５（ａａ２６－５７）群、ＧＳＴ－ＳＲ－１１群、ＳＲ－１１群のクルマエビには、それぞれワクチン含有飼料３～６を１．３ｇ／日の量で投与し、２３日間飼育した。その後、通常の飼料に戻し、６日間飼育を続け、３０日目にＷＳＳＶ感染試験を行った。対照群のエビにも、実験群と同じ要領で、ＧＳＴ（大腸菌由来）群、ＧＳＴ（カイコサナギ由来）群及びＰＢＳ群には、それぞれワクチン含有飼料１～２、ＰＢＳ飼料を投与した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　ＷＳＳＶ感染試験は、浸漬攻撃試験を採用した。ＷＳＳＶ感染によって死亡したエビを体重の９倍量のＰＢＳを添加し磨砕した後、４℃にて１５分間１５００×ｇで遠心分離し、得られた上清を所定のＤＮＡコピー数となるようにＰＢＳで希釈し、ＷＳＳＶ磨砕液とした。浸漬攻撃試験では、例えば、攻撃エビ個体の総重量３０ｇ／水量（Ｌ）として、１．２７×１０６ＤＮＡコピー／ｇエビとなるように、ＷＳＳＶ磨砕液を水量の１０－２．８希釈で添加し、２時間浸漬した。浸漬攻撃が終了後、試験に供したエビをネットに取り出し、清浄な海水により３分間の流水洗浄を行い、飼育水槽に収容した。
　ＷＳＳＶ感染試験後、各群のエビの死亡率を２４時間間隔で２０日間経過観察し、相対生存率を調べた。相対生存率は、下記の式のように求めた。各群のＷＳＳＶ感染試験から２０日経過後の相対生存率を図９に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000006
　陰性対照として用いた大腸菌又はカイコサナギ由来のＧＳＴ群では、ＷＳＳＶ感染試験２０日後の相対生存率が、それぞれ６０．３％及び６８．８％であった。ＧＳＴ－ＶＰ１５群では、相対生存率は８１．１％であったが、ＧＳＴ－ＶＰ１５（ａａ２６－５７）群では相対生存率が１００％であった。このことから、ＶＰ１５（ａａ２６－５７）のＷＳＳＶ感染に対する防御効果が高いことが明らかになった。また、ＧＳＴ－ＳＲ－１１群の場合、相対生存率が７２．２％であり、大腸菌及びカイコサナギ由来のＧＳＴ群の相対生存率より高かったが、ＧＳＴ－ＶＰ１５群の相対生存率よりは低かった。ＳＲ－１１群も、９０．５％と高い相対生存率を示した。ＧＳＴ－ＳＲ－１１群の相対生存率がＧＳＴ－ＶＰ１５群よりも低かったが、ＳＲ－１１群の相対生存率はＧＳＴ－ＶＰ１５群よりも高いことから、ＳＲ－１１の場合、融合タンパク質に存在する形態よりもＳＲ－１１のみの方が、ＷＳＳＶ感染に対する防御効果が高いことが示された。ＧＳＴ－ＶＰ１５群及びＧＳＴ－ＶＰ１５（ａａ２６－５７）群のいずれも相対生存率が８０％以上であることから、実験群の各種タンパク質（ワクチン）は、経口投与によるエビのＷＳＳＶ感染防御にも効果的であると考えられる。
実施例６　ワクチン含有飼料の投与による遺伝子発現量の変化
　ワクチン含有飼料の投与によるエビの免疫系に対する影響を調べるため、各種遺伝子、すなわち、ＮＦ－κＢ免疫反応において中心的役割を果たす転写因子であるＤｏｒｓａｌ遺伝子及びＲｅｌｉｓｈ遺伝子、抗ウイルス応答におけるシグナルを誘導し、ＡＭＰの発現を向上するＳＴＡＴ遺伝子、並びに、病原体の侵入を阻止するタンパク質の発現を誘導するＰｒｏＰＯ遺伝子の、投与前後の発現量の変化を評価した。
　実施例５の（２）と同様に、ワクチン含有飼料を投与してから０、１、３及び４日後、クルマエビの鰓からトータルＲＮＡを、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ　ＲＮＡ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ、ドイツ）を用いて抽出した。抽出したトータルＲＮＡを、ＲｅｖｅｒＴｒａ　Ａｃｅ　ｑＰＣＲ　ＲＴ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（東洋紡、日本）を用いて逆転写し、ファーストストランドｃＤＮＡ合成した。ファーストストランドｃＤＮＡを鋳型として、表５に示す各プライマーセットを使用して定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によって、Ｄｏｒｓａｌ、Ｒｅｌｉｓｈ、ＳＴＡＴ及びＰｒｏＰＯ遺伝子のｍＲＮＡの発現量を評価した。対照としてβ－アクチンを用いた。ｑＰＣＲは、Ｔｈｕｎｄｅｒｂｉｒｄ　ＳＹＢＲ　ｑＰＣＲ　Ｍｉｘ（Ｍｘ３０００Ｐ、Ａｇｉｌｅｎｔ、日本）を用いて、９５℃で１分間、９５℃で１５秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で１分間を４０サイクル行った。その結果を図１０及び１１に示す。なお、各遺伝子のｍＲＮＡの相対発現量は、β－アクチン遺伝子の発現量に対する相対値である。また、β－アクチン遺伝子の発現量を「１」とした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　図１０及び１１から、Ｄｏｒｓａｌ、Ｒｅｌｉｓｈ、ＳＴＡＴ及びＰｒｏＰＯの遺伝子発現はいずれも１４日目に最高値を示したことが分かった。Ｄｏｒｓａｌ、Ｒｅｌｉｓｈについては、初期には、ＳＲ－１１群の遺伝子発現が著しく高かったが、１４日目にはＧＳＴ－ＶＰ１５（ａａ２６－５７）群、ＧＳＴ－ＶＰ１５群及びＧＳＴ－ＳＲ－１１群の遺伝子発現が高く、いずれもカイコサナギで発現させたものであった（図１０）。ＳＴＡＴとＰｒｏＰＯの場合も、初期にはＳＲ－１１群の遺伝子発現が高かったが、１４日目にはＳＴＡＴはＧＳＴ－ＳＲ－１１群が、ＰｒｏＰＯはＧＳＴ－ＶＰ１５群及びＧＳＴ－ＶＰ１５（ａａ２６－５７）群の遺伝子発現が最高であった（図１１）。したがって、ＳＴＡＴ又はＰｒｏＰＯの遺伝子発現におけるＳＲ－１１とＶＰ１５との機能が若干異なると考えられる。人工合成したＳＲ－１１の場合、初期のいずれの遺伝子発現量も高い値であったが、時間と共に低下傾向であった。一方で、カイコサナギで発現させたＶＰ１５やＳＲ－１１の場合、効果が持続的であることが確認された。

Claims (11)

  1. 　配列番号７に示すアミノ酸配列、又は、配列番号７に示すアミノ酸配列において、１～３個のアミノ酸残基の欠失、置換若しくは挿入を有するアミノ酸配列を含む抗原性ペプチドであって、８～３０個のアミノ酸残基からなる抗原性ペプチドを含む、ホワイトスポットシンドロームウイルス（ＷＳＳＶ）の感染を予防又は治療するためのワクチン。
  2. 　前記抗原性ペプチドが、８～２０個のアミノ酸残基からなる、請求項１に記載のワクチン。
  3. 　前記抗原性ペプチドが、配列番号７に示すアミノ酸配列、又は、配列番号７に示すアミノ酸配列において、１～３個のアミノ酸残基の欠失、置換若しくは挿入を有するアミノ酸配列からなる、請求項１又は２に記載のワクチン。
  4. 　前記抗原性ペプチドが、配列番号１に示すアミノ酸配列の連続した８～３０個のアミノ残基を含むペプチドであるか、又は、配列番号１に示すアミノ酸配列の連続した８～３０個のアミノ残基からなるペプチドと８０％以上の配列同一性を有するペプチドである、請求項１に記載のワクチン。
  5. 　配列番号７に示すアミノ酸配列、又は、配列番号７に示すアミノ酸配列において、１～３個のアミノ酸残基の欠失、置換若しくは挿入を有するアミノ酸配列を含み、かつ、８～３０個のアミノ酸残基を有する、単離されたペプチド。
  6. 　請求項１～４のいずれか一項に記載のワクチン、又は、請求項５に記載のペプチドを有効量で含む、甲殻類動物のための食餌。
  7. 　健康飼料である、請求項６に記載の食餌。
  8. 　配列番号７に示すアミノ酸配列、又は、配列番号７に示すアミノ酸配列において、１～３個のアミノ酸残基の欠失、置換若しくは挿入を有するアミノ酸配列からなるペプチドを含み、８～３０個のアミノ酸残基を有する抗原性ペプチドをコードする、核酸分子。
  9. 　請求項８に記載の核酸分子で宿主細胞を形質転換して得られる、形質転換体。
  10. 　請求項８に記載の核酸分子を組み込んだ、組換えカイコ。
  11. 　幼虫又はサナギである、請求項１０に記載の組換えカイコ。
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