NO338055B1 - Nukleinsyremolekyl for optimalisert ekspresjon av HPV52-L1 i gjær, vektor og vertscelle, samt fremgangsmåte for fremstilling av HPV52L1 viruslignende partikler, og deres anvendelse ved fremstilling av en vaksine for behandling eller forebygging av HPV-assosiert cervikal kreft. - Google Patents
Nukleinsyremolekyl for optimalisert ekspresjon av HPV52-L1 i gjær, vektor og vertscelle, samt fremgangsmåte for fremstilling av HPV52L1 viruslignende partikler, og deres anvendelse ved fremstilling av en vaksine for behandling eller forebygging av HPV-assosiert cervikal kreft. Download PDFInfo
- Publication number
- NO338055B1 NO338055B1 NO20064815A NO20064815A NO338055B1 NO 338055 B1 NO338055 B1 NO 338055B1 NO 20064815 A NO20064815 A NO 20064815A NO 20064815 A NO20064815 A NO 20064815A NO 338055 B1 NO338055 B1 NO 338055B1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- hpv
- vlps
- yeast
- protein
- sequence
- Prior art date
Links
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 title claims description 63
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 39
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims description 30
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims description 22
- 239000013598 vector Substances 0.000 title claims description 22
- 239000002245 particle Substances 0.000 title claims description 21
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims description 20
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims description 20
- 238000011282 treatment Methods 0.000 title claims description 7
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 title claims description 6
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 title claims description 6
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 title claims description 6
- 230000002265 prevention Effects 0.000 title claims description 6
- 108700042300 human papillomavirus type 52 L1 Proteins 0.000 title description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 126
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 76
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 claims description 61
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 47
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 35
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 35
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 claims description 21
- 241000701828 Human papillomavirus type 11 Species 0.000 claims description 8
- 241001631646 Papillomaviridae Species 0.000 claims description 8
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 7
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 4
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 claims description 3
- 241000320412 Ogataea angusta Species 0.000 claims description 3
- 241000235347 Schizosaccharomyces pombe Species 0.000 claims description 3
- 241001138401 Kluyveromyces lactis Species 0.000 claims description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 2
- 235000014663 Kluyveromyces fragilis Nutrition 0.000 claims 1
- 241000235650 Kluyveromyces marxianus Species 0.000 claims 1
- 241000701806 Human papillomavirus Species 0.000 description 253
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 66
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 34
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 31
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 13
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 13
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 12
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 11
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 11
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 11
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 11
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 11
- 208000022361 Human papillomavirus infectious disease Diseases 0.000 description 10
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 10
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 10
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 10
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 10
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 10
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- 238000011161 development Methods 0.000 description 8
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 8
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 8
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 8
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 7
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 238000012552 review Methods 0.000 description 7
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 7
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 6
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 6
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 6
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 5
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 5
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 5
- 108010058643 Fungal Proteins Proteins 0.000 description 5
- 208000009608 Papillomavirus Infections Diseases 0.000 description 5
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 5
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 5
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 5
- 231100000590 oncogenic Toxicity 0.000 description 5
- 230000002246 oncogenic effect Effects 0.000 description 5
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 5
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 5
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 5
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 4
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 4
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 4
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 4
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 4
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 4
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 4
- 229960002566 papillomavirus vaccine Drugs 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 238000004627 transmission electron microscopy Methods 0.000 description 4
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 4
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 3
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 3
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 208000000260 Warts Diseases 0.000 description 3
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- 208000019065 cervical carcinoma Diseases 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 3
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 3
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 3
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 3
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 3
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 201000010153 skin papilloma Diseases 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 3
- FQVLRGLGWNWPSS-BXBUPLCLSA-N (4r,7s,10s,13s,16r)-16-acetamido-13-(1h-imidazol-5-ylmethyl)-10-methyl-6,9,12,15-tetraoxo-7-propan-2-yl-1,2-dithia-5,8,11,14-tetrazacycloheptadecane-4-carboxamide Chemical compound N1C(=O)[C@@H](NC(C)=O)CSSC[C@@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CC1=CN=CN1 FQVLRGLGWNWPSS-BXBUPLCLSA-N 0.000 description 2
- QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate Chemical compound C1=C(Br)C(Cl)=C2C(OP(O)(=O)O)=CNC2=C1 QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100034035 Alcohol dehydrogenase 1A Human genes 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 2
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 2
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101150094690 GAL1 gene Proteins 0.000 description 2
- 102100028501 Galanin peptides Human genes 0.000 description 2
- 101000892220 Geobacillus thermodenitrificans (strain NG80-2) Long-chain-alcohol dehydrogenase 1 Proteins 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 101000780443 Homo sapiens Alcohol dehydrogenase 1A Proteins 0.000 description 2
- 101100121078 Homo sapiens GAL gene Proteins 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007993 MOPS buffer Substances 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 101150039863 Rich gene Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 2
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 229940037003 alum Drugs 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 235000020030 perry Nutrition 0.000 description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 2
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002028 premature Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 239000012798 spherical particle Substances 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 229940021747 therapeutic vaccine Drugs 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 2
- DGZSVBBLLGZHSF-UHFFFAOYSA-N 4,4-diethylpiperidine Chemical compound CCC1(CC)CCNCC1 DGZSVBBLLGZHSF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 206010059313 Anogenital warts Diseases 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 101100283604 Caenorhabditis elegans pigk-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100480861 Caldanaerobacter subterraneus subsp. tengcongensis (strain DSM 15242 / JCM 11007 / NBRC 100824 / MB4) tdh gene Proteins 0.000 description 1
- 101100447466 Candida albicans (strain WO-1) TDH1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 235000019750 Crude protein Nutrition 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- 241000450599 DNA viruses Species 0.000 description 1
- 206010058314 Dysplasia Diseases 0.000 description 1
- 101150038242 GAL10 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100024637 Galectin-10 Human genes 0.000 description 1
- 102100039555 Galectin-7 Human genes 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710121996 Hexon protein p72 Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000608772 Homo sapiens Galectin-7 Proteins 0.000 description 1
- 241000235649 Kluyveromyces Species 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 101150075239 L1 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 241001467460 Myxogastria Species 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 108010002747 Pfu DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 108700029229 Transcriptional Regulatory Elements Proteins 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 210000002255 anal canal Anatomy 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 1
- 210000003679 cervix uteri Anatomy 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 238000011260 co-administration Methods 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 239000013024 dilution buffer Substances 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 210000004392 genitalia Anatomy 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 108010087005 glusulase Proteins 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000008696 hypoxemic pulmonary vasoconstriction Effects 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000005470 impregnation Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 208000020082 intraepithelial neoplasia Diseases 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 208000024312 invasive carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N methanone Chemical compound O=[14CH2] WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 231100000683 possible toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 229940032313 prophylactic HPV vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 229940021993 prophylactic vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 210000001533 respiratory mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 238000013341 scale-up Methods 0.000 description 1
- 238000001338 self-assembly Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 230000037432 silent mutation Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 101150088047 tdh3 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 210000001215 vagina Anatomy 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 1
- 210000003905 vulva Anatomy 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
- C07K14/01—DNA viruses
- C07K14/025—Papovaviridae, e.g. papillomavirus, polyomavirus, SV40, BK virus, JC virus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
- C12N7/04—Inactivation or attenuation; Producing viral sub-units
- C12N7/045—Pseudoviral particles; Non infectious pseudovirions, e.g. genetically engineered
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5258—Virus-like particles
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/20011—Papillomaviridae
- C12N2710/20022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/20011—Papillomaviridae
- C12N2710/20023—Virus like particles [VLP]
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Public Health (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Immunology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Mycology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
Oppfinnelsens område
Foreliggende oppfinnelse vedrører generelt forebyggingen og/eller terapien av human papillomvirus (HPV)-infeksjon. Mer spesifikt vedrører foreliggende oppfinnelse syntetiske polynukleotider som koder for HPV 52-Ll-protein og til rekombinante vektorer og verter som omfatter nevnte polynukleotider. Denne oppfinnelsen vedrører også HPV 52-viruslignende partikler (VLP-er), der VLP-ene er fremstilt ved ekspresjon av rekombinant HPV 52-L1 eller -LI + -L2 i gjærceller og deres anvendelse i vaksiner og farmasøytiske preparater til forebygging og behandling av HPV-infeksjoner.
Bakgrunn av oppfinnelsen
Det foreligger mer enn 80 typer av humant papillomvirus (HPV), der mange av disse har blitt assosiert med en stor mengde biologiske fenotyper, fra godartede proliferative vorter til maligne karsinomer (for gjennomgang, se McMurray et al., Int. J. Exp. Pathol. 82 (82(1): 15-33 (2001)). HPV 6 og HPV 11 er de typene som vanligst er assosiert med godartede vorter, ikke-malign condyloma acuminata og/eller laveregrads dysplasi på genitale slimhinner eller respiratoriske slimhinner. HPV 16 og HPV 18 er høyrisikotypene som vanligst er assosiert med in s/tu-karsinomer og invaderende karsinomer i cervix, vagina, vulva og analkanalen. Mer enn 90 % av cervixkarsinomer er assosiert med infeksjoner av HPV 16, HPV 18 eller de mindre vanlige onkogene typene HPV 31, -33, -45, -52 og -58 (Schiffmann et al., J. Nati. Cancer Inst. 85(12): 958-64 (1993)). Observasjonen av at HPV-DNA er påvist i 90-100 % av cervixkreftformer, tilveiebringer sterkt epidemiologisk bevis for at HPV-er forårsaker cervixkarsinomer (se Bosch et al., J. Clin. Pathol. 55: 244-265 (2002)).
Papillomvirus er små (50-60 nm), ikke-kappekledde, icosahedriske DNA-virus som koder for opp til åtte tidlig og to sene gener. De åpne leserammene (ORF-ene) i virusgenomene er betegnet i El til E7, og LI og L2, der "E" betegner tidlig og der "L" betegner sent. LI og L2 koder for viruskapsidproteiner, mens E-genene er assosiert med funksjoner, slik som virusreplikasjon og cellulær transformasjon.
Ll-proteinet er hovedkapsidproteinet og har en molekylvekt på 55-60kDa. L2-proteinet er det mindre kapsidproteinet. Immunologiske data tyder på at det meste av L2-proteinet er innvendig i forhold til Ll-proteinet i viruskapsidet. Både LI- og L2-proteinet er svært konservert blant ulike papillomvirus.
Ekspresjon av Ll-proteinet eller en kombinasjon av LI- og 12-proteinet i gjær, insektceller, pattedyrceller eller bakterier, fører til selv-montering av viruslignende partikler (VLP-er), (for gjennomgang, se Schillerog Roden, i Papillomavirus Reviews; Lacey, utg. Leeds, UK: Leeds Medical Information, s. 101-12 (1996)). VLP-er er morforlogisk like autentiske virioner og er i stand til å indusere høye titre av nøytraliserende antistoffer ved administrering til dyr eller mennesker. Fordi VLP-er ikke inneholder det potensielt onkogene virusgenomet, er de et trygt alternativ i forhold til anvendelsen av levende virus i HPV-vaksineutvikling, (for gjennomgang, se Schiller og Hidesheim, J. Clin. Virol. 19: 67-74
(2000)). Av denne grunn har LI- og L2-gener blitt identifisert som immunologiske mål for utviklingen av profylaktiske og terapeutiske vaksiner for HPV-infeksjon og sykdom.
HPV-vaksineutvikling og kommersialisering har blitt hindret av vanskeligheter som er assosiert med å oppnå høye ekspresjonsnivåer av kapsidproteiner i vellykket transformerte vertsorganismer, som begrenser produksjonen av renset protein. På tross av identifiseringen av villtype-nukleotidsekvenser som koder for HPV-Ll-proteiner, slik som HPV 52-Ll-protein, er det derfor svært ønskelig å utvikle en enkelt fornybar kilde for HPV-Ll-råprotein som benytter HPV 52-Ll-kodende nukleotidsekvenser som er optimalisert for ekspresjon i den tiltenkte vertscellen. I tillegg vil det være nyttig å produsere store mengder av HPV 52-Ll-VLP-er som har de immunoverførende egenskapene til de native proteinene for anvendelse i vaksineutvikling.
Oppsummering av oppfinnelsen
Foreliggende oppfinnelse vedrører preparater og fremgangsmåter for å utløse eller forsterke immunitet mot proteinproduktene som er uttrykt fra HPV 52-Ll-gener. Spesifikt tilveiebringer foreliggende oppfinnelse polynukleotider som koder for HPV 52-Ll-protein, der polynukleotidene har blitt kodon-optimalisert for høynivåekspresjon i en gjærcelle. I alternative utførelsesformer av oppfinnelsen er nukleotidsekvensen for polynukleotidet endret for å eliminere transkripsjonstermineringssignaler som gjenkjennes av gjær. Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer ytterligere HPV 52-viruslignende partikler (VLP-er) hvor nevnte VLP-er er fremstilt ved ekspresjon av rekombinant HPV 52-L1 eller LI + L2 i gjærceller, og beskriver anvendelse av HPV 52-VLP-er i immunogene sammensetninger og vaksiner til forebyggingen og/eller behandlingen av HPV-sykdom og HPV-assosiert kreft.
Den foreliggende oppfinnelsen vedrører syntetiske DNA-molekyler som koder for HPV 52-Ll-proteinet. Kodon i de syntetiske molekylene er designet slik at de benytter kodon som er foretrukket av en gjærcelle. I en alternativ utførelsesform av oppfinnelsen er nukleotidsekvensen for det syntetiske molekylet endret for å eliminere transkripsjonstermineringssignaler som er gjenkjent av gjær. De syntetiske molekylene kan benyttes som en kilde for HPV 52-Ll-protein, som kan selv-monteres til VLP-er. Nevnte VLP-er kan benyttes i en VLP-basert vaksine.
En eksempelmessig utførelsesform av foreliggende oppfinnelse omfatter et syntetisk nukleinsyremolekyl som koder for HPV 52-Ll-proteinet som vist i SEQ ID NO: 2, nevnte nukleinsyremolekyl omfatter en sekvens av nukleotider som er kodon-optimalisert for høynivåekspresjon i en gjærcelle.
Også tilveiebrakt er rekombinante vektorer og rekombinante vertsceller, både prokaryote og eukaryote, som inneholder nukleinsyremolekylene beskrevet gjennom hele denne beskrivelsen. I en foretrukket utførelsesform av foreliggende oppfinnelse er vertscellen en gjærcelle.
Den foreliggende oppfinnelsen vedrører også en fremgangsmåte for ekspresjon av et HPV 52-Ll-protein i en rekombinant vertscelle, omfattende: (a) introdusering av en vektor som omfatter en nukleinsyre som koder for et HPV 52-Ll-protein inn i en gjær-vertscelle og (b) dyrking av gjærvertscellen ved betingelser som tillater ekspresjon av nevnte HPV 52-Ll-protein.
Den foreliggende oppfinnelsen vedrører ytterligere en fremgangsmåte for ekspresjon av et HPV 52-Ll-protein i en rekombinant vertscelle, omfattende: (a) introdusering av en vektor som omfatter et nukleinsyremolekyl som koder for et HPV 52-Ll-protein inn i en gjærvertscelle, der nukleinsyremolekylet er kodon-optimalisert for optimal ekspresjon i gjærvertscellen og (b) dyrking av gjærvertscellen ved betingelser som tillater ekspresjon av nevnte HPV 52-Ll-protein.
I foretrukne utførelsesformer omfatter nukleinsyremolekylet en sekvens av nukleotider som vist i SEQ ID NO: 1 (her betegnet "52 Ll-R-sekvens").
Denne oppfinnelsen vedrører også HPV 52-viruslignende partikler (VLP-er) som er fremstilt i gjærceller, fremgangsmåter for å fremstille HPV 52-VLP-er og fremgangs-måter for å anvende HPV 52-VLP-er.
I en foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen er gjæren valgt fra gruppen som består av: Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, Kluyvermyces fragilis, Kluyvermyces lactis, og Schizosaccharomyces pombe.
Et annet aspekt av oppfinnelsen er en HPV 52-VLP der VLP-en er fremstilt ved rekombinant ekspresjon av HPV 52-L1 eller HPV 52-L1 + L2 i en gjærcelle.
Nok et annet aspekt av denne oppfinnelsen er en HPV 52-VLP som omfatter et HPV 52-Ll-protein fremstilt fra et kodon-optimalisert HPV 52-Ll-gen. I en eksempel-messig utførelsesform av dette aspektet av oppfinnelsen omfatter det kodon-optimaliserte HPV 52-Ll-genet en sekvens av nukleotider som vist i SEQ ID NO: 1.
Denne oppfinnelsen kan også anvendes i en fremgangsmåte for å indusere en immunrespons hos et dyr som omfatter å administrere HPV 52-viruslignende partikler til dyret. I en foretrukket utførelsesform er HPV 52-VLP-ene fremstilt fra et kodon-optimalisert gen.
Nok et annet aspekt av denne oppfinnelsen er anvendelse i en fremgangsmåte for å forebygge eller behandle HPV-assosiert cervixkreft som omfatter administrering til et pattedyr av en vaksine som omfatter HPV 52-VLP-er. I en foretrukket utførelsesform av dette aspektet av oppfinnelsen er HPV 52-VLP-ene fremstilt i gjær.
Denne oppfinnelsen vedrører også en vaksine som omfatter HPV 52-viruslignende partikler (VLP-er), der HPV 52 VLP-ene er fremstilt i gjær.
I en alternativ utførelsesform av dette aspektet av oppfinnelsen omfatter vaksinen ytterligere VLP-er og minst en ytterligere HPV-type. Den minst én ytterligere HPV-typen kan være enhver HPV-type av interesse, inkludert enhver HPV-type som er beskrevet på fagområdet eller de som senere blir identifisert. I en foretrukket utførelses-form er HPV- typen en type som er assosiert med en klinisk fenotype, slik som vorter eller cervixkreft. I en ytterligere foretrukket utførelsesform er den minst én ytterligere HPV-typen valgt fra gruppen som består av: HPV 6, HPV 11, HPV 16, HPV 18, HPV 31, HPV 33, HPV 35, HPV 39, HPV 45, HPV 51, HPV 55, HPV 56, HPV 58, HPV 59 og HPV 68.
Denne oppfinnelsen vedrører også farmasøytiske preparater som omfatter HPV 52-viruslignende partikler, der HPV 52-VLP-ene er fremstilt i gjær. Denne oppfinnelsen vedrører ytterligere farmasøytiske sammenseyninger som omfatter HPV 52-VLP-er og VLP-er av minst én ytterligere HPV-type. I en foretrukket utførelsesform er den minst én ytterligere HPV-typen valgt fra gruppen som består av: HPV 6, HPV 11, HPV 16, HPV 18, HPV 31, HPV 33, HPV 35, HPV 39, HPV 45, HPV 51, HPV 55, HPV 56, HPV 58, HPV 59 og HPV 68.
Som benyttet gjennom hele beskrivelsen og i de tilhørende kravene inkluderer de singulære formene "en", "ei" og "et", de flertallsreferansene hvis ikke konteksten klart dikterer noe annet.
Som benyttet gjennom hele beskrivelsen og de tilhørende kravene gjelder de følgende definisjonene og forkortelsene: Uttrykket "promotor" refererer til et gjenkjenningssete på en DNA-tråd til hvilket RNA-polymerasen binder. Promotoren danner et initieringskompleks med RNA-polymerase for å initiere og drive transkripsjonen aktivitet. Komplekset kan modifiseres av aktiverende sekvenser betegnet "enhancere" eller "oppstrømsaktiverende sekvenser" eller inhiberende sekvenser betegnet "silencere".
Uttrykket "vektor" refererer til noen midler ved hvilke DNA-fragmenter kan introduseres inn i vertsorganismer eller vertsvev. Det foreligger ulike typer av vektorer, inkludert plasmider, virus (inkludert adenovirus), bakteriofager og kosmider.
Uttrykket "kassett" refererer til en nukleotid- eller gensekvens som skal uttrykkes fra en vektor, for eksempel nukleotidsekvensen eller gensekvensen som koder for HPV 52-Ll-proteinet. Generelt omfatter en kassett en gensekvens som er innsatt i en vektor som i noen utførelsesformer tilveiebringer regulatoriske sekvenser for ekspresjon av nukleotidsekvensen eller gensekvensen. I andre utførelsesformer tilveiebringer nukleotid-sekvensen eller gensekvensen de regulatoriske sekvensene for sin ekspresjon. I ytterligere utførelsesformer tilveiebringer vektoren noen regulatoriske sekvenser, og nukleotidsekvensen eller gensekvensen tilveiebringer andre regulatoriske sekvenser. For eksempel kan vektoren tilveiebringe en promotor for transkribering og nukleotid-sekvensen eller gensekvensen og nukleotidsekvensen eller gensekvensen tilveiebringer en transkripsjonstermineringssekvens. De regulatoriske sekvensene som kan tilveiebringes av vektoren, inkluderer enhancere, transkripsjonstermineringssekvenser, spleiseakseptorsekvenser og donorsekvenser, intron, ribosombindingssekvenser og poly(A)-addisjonssekvenser.
Betegnelsene "52-Ll-villtypesekvens" og "52-Ll-wt-sekvens" refererer til HPV 52-Ll-sekvensen som er beskrevet her som SEQ ID NO: 3. Selv om HPV 52-Ll-villtype sekvensen tidligere har blitt beskrevet, er det ikke uvanlig å finne mindre sekvensvariasjoner mellom DNA fremskaffet fra kliniske isolater. Derfor ble en representativ HPV 52-Ll-villtypesekvens isolert fra kliniske prøver som tidligere var vist å inneholde HPV 52-DNA (se eksempel 1). HPV 52-Ll-villtypesekvensen ble benyttet som en referanse-sekvens for å sammenligne de kodon-optimaliserte HPV 52-L1-sekvensene som er beskrevet her (se figur 1).
Betegnelsene her "HPV 52-L1-R" og "52-L1-R" refererer til en eksempelmessig syntetisk HPV 52-Ll-nukleotidsekvens (SEQ ID NO: 1), som er beskrevet her, der sekvensen ble ombygd slik at den omfatter kodon som er foretrukket for høynivå-ekspresjon av en gjærcelle.
Uttrykket "effektiv mengde" betyr at tilstrekkelig vaksinepreparat er introdusert for å frembringe de adekvate nivåer av polypeptidet, slik at en immunrespons blir resultatet. En fagperson på området vil innse at dette nivået kan variere.
En "konservativ aminosyresubstitusjon" refererer til erstatningen av en aminosyrerest med en annen, kjemisk tilsvarende aminosyrerest. Eksempler på slike konservative substitusjoner er: substitusjon av én hydrofob rest (isoleucin, leucin, valin eller metionin) med en annen, substitusjon av én polar rest med en annen polar rest med samme ladning (f.eks. arginin for lysin, glutaminsyre for aspa rag i nsy re).
Uttrykket "pattedyr" refererer til ethvert pattedyr, inkludert et menneske.
"VLP" eller "VLP-er" betyr viruslignende partikkel eller viruslignende partikler.
"Syntetisk" betyr at HPV 52-Ll-genet ble dannet slik at det inneholder en sekvens av nukleotider som ikke er den samme som sekvensen av nukleotider som foreligger i det betegnede naturlig forekommende villtype-HPV 52-Ll-genet (52-Ll-wt, SEQ ID NO: 3). Som påpekt ovenfor blir syntetiske molekyler her tilveiebrakt som omfatter en sekvens av nukleotider som omfatter kodon som er foretrukket for ekspresjon i gjærceller. De syntetiske molekylene som er tilveiebrakt her, koder for de samme aminosyresekvensene som villtype-HPV 52-Ll-genet (SEQ ID NO: 2).
Kort beskrivelse av tegningene
FIGUR 1 viseren sekvenssammenstilling som sammenligner nukleotider som ble endret i det syntetiske HPV 52-Ll-genet ifølge foreliggende oppfinnelse (SEQ ID NO: 1, indikert som "52 Ll-R") (se eksempel 2). Referansesekvensen er 52-Ll-villtypesekvensen (SEQ ID NO: 3, indikert som "52-Ll-wt", se eksempel 1). Endrede nukleotider er indikert på deres tilsvarende lokalisering. Nukleotid nummer er inneholdt i parentesene. Identiske nukleotider i den ombygde 52-Ll-sekvensen er indikert med prikker. FIGUR 2 viser den ombygde, syntetiske HPV 52-Ll-dobbeltrådede nukleinsyresekvensen (SEQ ID NO: 1 og 7) og en-kodeaminosyresekvensen (SEQ ID NO: 2). Nukleotid nummer er indikert til venstre. FIGUR 3 viser et Northern-blot av HPV 52-Ll-wt- og HPV 52-Ll-R-transkripter (se eksempel 4). Blottet ble probet med en blanding av DNA-prober som var fremstilt mot både 52-Ll-wt- og 52 Ll-R-sekvensen. Pilen på høyre side indikerer den beregnede posisjonen for et fullengde-52-Ll-transkript. Ingen transkripter av noen lengde ble påvist i sporene med 5 og 10 ug med 52-Ll-wt-RNA. Fullengdetranskripter er synlige i sporene med 5 og 10 ug og 52-L1-R. FIGUR 4 viser et Western-blot av HPV 52-lL-wt (52-wt) og 52-L1-R (52 R)-proteiner. HPV 16-L1 ble inkludert som en referanse (16). Ti, fem og to og et halvt mikrogram med totalt gjærproteinekstrakt ble denaturert og satt på en 10 % SDS-PAGE gel. Proteinet ble Western-overført. HPV 52-Ll-protein ble påvist på det resulterende blottet ved å benytte et gjærabsorbert anti-trpE-HPV-31-Ll-geitepolyklonalt antiserum som kryssreagerer med HPV 52-L1 og HPV 16-L1. Molekylvektsmarkører er indikert i kDa til venstre. Pilen indikerer posisjonen til HPV 52-Ll-proteinet på ca 55 kDa. FIGUR 5 viser en representativ prøve av HPV 52-VLP-er sammensatt av HPV 52-L1-R-proteinmolekyler, som er beskrevet her, slik de er visualisert ved hjelp av transmisjonselektronmikroskopi (se eksempel 7). Diameteren på de sfæriske partiklene i denne råprøven lå i området fra mellom 40 og 70 nm der noen partikler oppviste en regelmessig rekke av kapsomerer. Linjen representerer omtrent 0,1 um.
Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen
De fleste cervixkarsinomer er assosiert med infeksjoner med spesifikke onkogene typer av humant papillomvirus (HPV). Foreliggende oppfinnelse vedrører sammen-setninger og anvendelse i fremgangsmåter for å utløse eller forsterke immunitet for proteinproduktene som uttrykkes av gener i onkogene HPV-typer. Spesifikt tilveiebringer foreliggende oppfinnelse polynukleotider som koder for HPV 52-L1, der polynukleotidene er kodon-optimaliserte for høynivåekspresjon i gjær. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også HPV52-viruslignende partikler (VLP-er) som er fremstilt i gjær, og beskriver anvendelse av nevnte polynukleotider og VLP-er i immunogene sammen-setninger og vaksiner til forebyggingen og/eller behandlingen av HPV-assosiert kreft.
En villtype-HPV52-Ll-nukleotidsekvens har blitt rapportert (Genbankaksesjon # NC 0011592). Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer syntetiske DNA-molekyler som koder for HPV 52-Ll-protein. I et aspekt av oppfinnelsen omfatter de syntetiske molekylene en sekvens av kodoner hvor minst noen av disse kodon har blitt endret, slik at de benytter kodoner som er foretrukket av en gjærcelle for høynivåekspresjon. I et alternativt aspekt av oppfinnelsen er nukleotidsekvensen for det syntetiske molekylet endret for å eliminere transkripsjonstermineringssignaler som blir gjenkjent av gjær. De syntetiske molekylene kan benyttes som en kodende sekvens for ekspresjon av HPV 52-Ll-protein, som kan selv-monteres til VLP-er. Nevnte VLP-er kan benyttes i en VLP-basert vaksine for å tilveiebringe effektiv immunprofylakse mot papillomvirusinfeksjon via nøytraliserende antistoff og cellemediert immunitet. Slike VLP-baserte vaksiner kan også være nyttige i behandling av allerede etablerte HPV-infeksjoner.
Ekspresjon av HPV VLP-er i gjærceller gir fortrinnet av å være kostnadseffektiv og enkelt tilpasset til storskalavekst i fermentorer. I tillegg kan gjærgenomet enkelt endres for å sikre seleksjon av rekombinant, transformert gjær med økt vekst og ekspresjonspotensial. Likevel vil det bli mange HPV-Ll-proteiner, inkludert HPV 52-L1, uttrykt på nivåer i gjær som er lavere enn det som er ønskelig for kommersiell oppskalering (se eksempel 2).
Følgelig vedrører foreliggende oppfinnelse HPV 52-Ll-gensekvenser som er "optimalisert" for høynivåekspresjon i et gjærcellulært miljø.
Et "triplettkodon" av fire mulige nukleotidbaser kan foreligge i over 60 variant-former. Fordi disse ulike kodon tilveiebringer koden for kun 20 forskjellige aminosyrer (i tillegg til transkripsjonsinitiering og terminering), kan noen aminosyrer kodes for av mer enn ett kodon, et fenomen som er kjent som kodon-overskudd. Av grunner som ikke er fullstendig forstått, er ikke alternative kodon jevnt til stede i det endogene DNA hos ulike typer av celler. Faktisk ser det ut til å eksistere et variabelt naturlig hierarki eller "preferanse" forvisse kodon i visse typer av celler. Som ett eksempel er aminosyren leucin spesifisert ved et hvilket som helst av seks DNA-kodon, inkludert CTA, CTC, CTG, CTT, TTA og TTG. Uttømmende analyse av anvendelsesfrekvenser av genomkodon for mikroorganismer har avslørt at endogent DNA hos E. coli vanligvis inneholder det CTG-leucinspesifiserende kodon, mens DNA hos gjær og slimsopper vanligvis inneholder et TTA-leucinspesifiserende kodon. I lys av dette hierarkiet er det generelt antatt at sannsynligheten for å oppnå høynivåekspresjon av et leucinrikt polypeptid i en E. coli- vert i noen grad vil være avhengig av frekvensen av kodonanvendelsen. For eksempel er det sannsynlig at et gen som er rikt på TTA-kodon, vil bli dårlig uttrykt i E. coli, mens et CTG-rikt gen sannsynligvis vil i høy grad være uttrykt i denne verten. Tilsvarende ville et foretrukket kodon for ekspresjon av et leucinrikt polypeptid i gjærvertsceller være TTA.
Implikasjonene av kodonpreferansefenomener på rekombinante DNA-teknikker er manifestert og fenomenet kan være med på å forklare mange tidligere mislykkede forsøk på å oppnå høye ekspresjonsnivåer av eksogene gener i vellykket transformerte vertsorganismer, et mindre "foretrukket" kodon kan være gjentatte ganger tilstede i det innsatte genet og vertscellemaskineriet for ekspresjon virker dermed kanskje ikke så effektivt. Dette fenomenet antyder at syntetiske gener som har blitt designet slik at de inkluderer en prosjektert vertscelles foretrukne kodon, tilveiebringer en optimal form for fremmed genetisk materiale for utøvelse av rekombinant proteinekspresjon. Ett aspekt av denne oppfinnelsen der derfor et HPV 52-Ll-gen som er kodon-optimalisert for høynivå-ekspresjon i en gjærcelle. I en foretrukket utførelsesform av denne oppfinnelsen har det blitt funnet at anvendelsen av alternative kodoner som koder for den samme protein-sekvensen kan fjerne begrensningene på ekspresjon av HPV 52-Ll-proteiner fra gjærceller.
I overensstemmelse med denne oppfinnelsen ble HPV 52-Ll-gensegmenter konvertert til sekvenser som har identisk translaterte sekvenser, men med alternativ kodonanvendelse som beskrevet av Sharp and Cowe (Synonymous Codon Usage in Saccharomyces cerevisiae. Yeast 7: 657-678 (1991)). Metodikken består vanligvis av å identifisere kodon i villtypesekvensen som ikke vanligvis er assosiert med høyt uttrykte gjærgener og erstatte den med optimale kodoner for høyekspresjon i gjærceller. Den nye gensekvensen blir deretter inspisert for uønskede sekvenser som er generert av disse kodonerstatningene, (f.eks. "ATTTA"-sekvenser, utilsiktet dannelse av intron spleise-gjenkjenningsseter, uønskede restriksjonsenzymseter, høyt GC-innhold, tilstedeværelse av transkripsjonstermineringssignaler som blir gjenkjent av gjær, osv.). Uønskede sekvenser elimineres ved substitusjon av de eksisterende kodoner med ulike kodoner som koder for den samme aminosyren. De syntetiske gensegmentene testes deretter for forbedret ekspresjon.
Fremgangsmåtene som er beskrevet ovenfor, ble anvendt for å danne syntetiske gensegmenter for HPV 52-L1, som førte til et gen som omfatter kodoner som er optimalisert for høynivåekspresjon. Mens prosedyren ovenfor tilveiebringer en oppsummering av vår metodikk for å designe kodon-optimaliserte gener til anvendelse i HPV-vaksiner, er det åpenbart for en fagperson på området at tilsvarende vaksineeffekt eller økt ekspresjon av gener kan oppnås ved mindre variasjoner i prosedyren eller ved mindre variasjoner i sekvensen.
Følgelig vedrører foreliggende oppfinnelse et syntetisk polynukleotid som omfatter en sekvens av nukleotider som koder for et HPV 52-Ll-protein, eller et biologisk aktivt fragment eller mutant form av et HPV 52-Ll-protein, der polynukleotid-sekvensen omfatter kodoner som er optimalisert for ekspresjon i en gjærvertscelle. Nevnte mutant-former av HPV 52-Ll-proteinet inkluderer: konservative aminosyresubstitusjoner, aminoterminale trunkeringer, karboksyterminale trunkeringer, delesjoner eller addisjoner. Et hvilket som helst slikt biologisk aktivt fragment og/eller mutant vil kode for enten et protein eller proteinfragment som i det minste i det vesentlige etterligner de immunologiske egenskapene til HPV 52-Ll-proteinet som vist i SEQ ID NO: 2. De syntetiske polynukleotidene ifølge foreliggende oppfinnelse koder for mRNA-molekyler som uttrykker et funksjonelt HPV 52-Ll-protein, slik at de er nyttig i utviklingen av en terapeutisk eller profylaktisk HPV-vaksine.
Ett aspekt av denne oppfinnelsen er et kodon-optimalisert nukleinsyremolekyl som koder for HPV 52-Ll-protein som vist i SEQ ID NO: 2, der nevnte nukleinsyremolekyl omfatter en sekvens av nukleotider som er kodon-optimalisert for høynivåekspresjon i en gjærcelle. I en foretrukket utførelsesform av dette aspektet av oppfinnelsen omfatter nukleinsyremolekylet en sekvens av nukleotider som vist i SEQ ID NO: 1.
Foreliggende oppfinnelse vedrører også rekombinante vektorer og rekombinante vertsceller, både prokaryote og eukaryote, som inneholder nukleinsyremolekylene som er beskrevet gjennom hele denne beskrivelsen. I en foretrukket utførelsesform av denne oppfinnelsen er vertscellen en gjærvertscelle.
Det syntetiske HPV 52-L1-DNA, funksjonelle ekvivalenter derav og fragmenter derav, som er konstruert ved hjelp av fremgangsmåtene som er beskrevet her, kan bli rekombinant uttrykt ved molekylær kloning inn i en ekspresjonsvektor som inneholder en passende promotor og andre hensiktsmessige, transkripsjonsregulatoriske elementer. Nevnte ekspresjonsvektor kan overføres inn i prokaryote eller eukaryote vertsceller for å fremstille rekombinant HPV 52-Ll-protein. Teknikker for slike manipuleringer er fullt ut beskrevet i teknikkens stand (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1989), Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., Green Pub. Associates and Wiley-Interscience, New York
(1988), Yeast Genetics: A Laboratory Course Manual, Rose et al., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1990)).
På det vis vedrører foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for ekspresjon av et HPV 52-Ll-protein i en rekombinant vertscelle, omfattende: (a) introdusering av en vektor som omfatter en nukleinsyre som koder for et HPV 52-Ll-protein inn i en gjærvertscelle, og (b) dyrking av gjærvertscellen ved betingelser som tillater ekspresjon av nevnte HPV 52-Ll-protein.
Foreliggende oppfinnelse vedrører videre en fremgangsmåte for ekspresjon av et HPV 52-Ll-protein i en rekombinant vertscelle, omfattende: (a) introdusering av en vektor som omfatteren nukleinsyre som koder for et HPV 52-Ll-protein inn i en gjær-vertscelle, der nukleinsyremolekylet er kodon-optimalisert for optimal ekspresjon i gjær-vertscellen og (b) dyrking av gjærvertscellen under betingelser som tillater ekspresjon av nevnte HPV 52-Ll-protein.
Oppfinnelsen vedrører videre en fremgangsmåte for ekspresjon av et HPV 52-Ll-protein i en rekombinant vertscelle, omfattende: (a) introdusering av en vektor som omfatter en nukleinsyre som fremlagt ifølge SEQ ID NO: 1 inn i en gjærvertscelle, og (b) dyrking av gjærvertscellen under betingelser som tillater ekspresjon av nevnte HPV 52-Ll-protein.
De syntetiske genene ifølge foreliggende oppfinnelse kan settes sammen til en ekspresjonskassett som omfatter sekvenser som er designet for å tilveiebringe effektiv ekspresjon av HPV 52-Ll-proteinet i vertscellen. Kassetten inneholder fortrinnsvis det syntetiske genet, med beslektede transkripsjons- og translasjonskontrollsekvenser opererbart bundet til den, slik som en promotorsekvens og termineringsekvens. I en foretrukket utførelsesform er promotoren GALl-promotoren fra S. cerevisiae, selv om fagfolk på området vil være på det rene med at et hvilket som helst av et antall av andre kjente gjærpromotorer, slik som GAL10-, GAL7-, ADH1-, TDH3- eller PGK-promotoren, eller andre eukaryote genpromotorer, kan benyttes. En foretrukket transkripsjons-terminator er ADHl-terminatoren fra S. cerevisiae, selv om andre kjente transkripsjons-terminatorer også kan benyttes. Kombinasjonen av GALl-promotor-ADHl-terminator er spesielt foretrukket.
Et annet aspekt av denne oppfinnelsen er en HPV 52-viruslignende partikkel (VLP) som er fremstilt ved rekombinant ekspresjon av HPV 52-L1 eller LI + L2 genene i en gjærcelle, fremgangsmåter for å fremstille HPV 52-VLP-er og fremgangsmåter for å anvende HPV 52-VLP-er. VLP-er kan selv-monteres når LI, som er hovedkapsidproteinet i humane papillomvirus og dyrepapillomvirus, uttrykkes i gjær, insektceller, pattedyrceller eller bakterier (for gjennomgang, se Schiller og Roden, i Papillomavirus Reviewes: Current Research on Papillomaviruses, Lacey, utg. Leeds, UK: Leeds Medical Information, s. 101-12
(1996). Morfologisk like HPV-VLP-er kan også fremstilles ved ekspresjon av kombinasjon av LI- og L2-kapsidproteinene. VLP-er er sammensatt av 72 pentamerer av LI i en T=7 icosahedrisk struktur (Baker et al., Biophys. J. 60(6): 1445-56 (1991)).
VLP-er er morfologisk like autentiske virioner og er i stand til å indusere høye titre av nøytraliserende antistoff ved administrering til et dyr. Immunisering av kaniner (Breitburd et al., J. Virol. 69(6): 3959-63 (1995)) og hunder (Suzich et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 92(25): 11553-57 (1995)) med VLP-er ble vist både å indusere nøytraliserende antistoff og beskytte mot eksperimentell papillomvirusinfeksjon. I tillegg ble immunisering av voksne kvinner med HPV 16 VLP-er vist å beskytte mot HPV 16-infeksjon og cervix-HPV 16-intraepitelial neoplasi (Koutsky et al., N. Engl. J. Med. 347: 1645-51 (2002)). Fordi VLP-er ikke inneholder det potensielt onkogene virusgenomet og kan selv-monteres når de uttrykkes fra et enkelt gen, er de et trygt alternativ i forhold til å benytte levende virus i HPV-vaksineutvikling (for gjennomgang, se Schiller og Hidesheim, J. Clin. Virol. 19: 67-74
(2000)).
Slik vedrører foreliggende oppfinnelse viruslignende partikler som er sammensatt av rekombinant Ll-protein eller rekombinant LI- + L2-proteiner fra HPV 52, der det rekombinante proteinet er uttrykt i en gjærcelle.
Som påpekt ovenfor i en foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen blir HPV 52-VLP-ene fremstilt i gjær. I en ytterligere foretrukket utførelsesform er gjæren valgt fra gruppen som består av: Saccharmoyces cerevisiae, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, Kluyveromyces fragil is, Kluyveromyces lactis og Schizosaccharomyces pombe.
Et annet aspekt av denne oppfinnelsen er en HPV 52-VLP som omfatter et HPV 52-Ll-protein som er fremstilt fra et kodon-optimalisert HPV 52-Ll-gen. I en foretrukket utførelsesform av dette aspektet av oppfinnelsen omfatter det kodon-optimaliserte HPV 52-Ll-genet en sekvens av nukleotider som vist i SEQ ID NO: 1.
Nok et annet aspekt av denne oppfinnelsen er en fremgangsmåte for å fremstille HPV 52-VLP-er omfattende: (a) transformering av gjær med et rekombinant DNA-molekyl som koder for HPV 52-Ll-protein eller HPV 52-L1- + -L2-proteiner, (b) dyrking av den transformerte gjæren under betingelser som tillater ekspresjon av det rekombinante DNA-molekylet for å produsere det rekombinante HPV 52-proteinet, og (c) isolering av det rekombinante HPV 52-proteinet for å fremstille HPV 52-VLP-er.
I en foretrukket utførelsesform av dette aspektet av oppfinnelsen blir gjæren transformert med et kodon-optimaliserte HPV 52-Ll-gen for å fremstille HPV 52-VLP-er. I en spesielt foretrukket utførelsesform omfatter det kodon-optimaliserte HPV 52-Ll-genet sekvens av nukleotidet som vist i SEQ ID NO: 1.
Denne oppfinnelsen anvendes også i en fremgangsmåte for å indusere en immunrespons hos et dyr som omfatter administrering av HPV 52-viruslignende partikler til dyret. I en foretrukket utførelsesform er HPV 52-VLP-ene fremstilt ved rekombinant å uttrykke et kodon-optimalisert gen som koder for HPV 52-L1 eller HPV 52-L1 + -L2.
Nok et annet aspekt av denne oppfinnelsen er anvendelse i en fremgangsmåte for å forebygge og/eller behandle HPV-assosiert cervixkreft som omfatter å administrere til et pattedyr en vaksine som omfatter HPV 52-VLP-er. I en foretrukket utførelsesform av dette aspektet av oppfinnelsen er HPV 52-VLP-ene fremstilt i gjær.
Denne oppfinnelsen vedrører også en vaksine som omfatter HPV 52-viruslignende partikler (VLP-er).
I en alternativ utførelsesform av dette aspektet av oppfinnelsen omfatter vaksinen ytterligere VLP-er av minst én ytterligere HPV-type. I en foretrukket utførelsesform er den minst én ytterligere HPV-typen valgt fra gruppen som består av: HPV 6, HPV 11, HPV 16, HPV 18, HPV 31, HPV 33, HPV 35, HPV 39, HPV 45, HPV 51, HPV 55, HPV 56, HPV 58, HPV 59 og HPV 68.
I en foretrukket utførelsesform av dette aspektet av oppfinnelsen omfatter vaksinen ytterligere HPV 16 VLP-er.
I en annen foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen omfatter vaksinen ytterligere 16 VLP-er og HPV 18-VLP-er.
I nok en annen foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen omfatter vaksinen ytterligere HPV 6-VLP-er, HPV 11-VLP-er, HPV 16-VLP-er og HPV 18-VLP-er.
Denne oppfinnelsen vedrører også farmasøytiske sammensetninger som omfatter HPV 52-viruslignende partikler. Videre vedrører denne oppfinnelsen farmasøytiske
sammensetninger som omfatter HPV 52-VLP-er og VLP-er av minst en ytterligere HPV-type. I en foretrukket utførelsesform er den minst én ytterligere HPV-typen valgt fra gruppen som består av: HPV 6, HPV 11, HPV 16, HPV 18, HPV 31, HPV 33, HPV 35, HPV 39, HPV 45, HPV 51, HPV 55, HPV 56, HPV 58, HPV 59 og HPV 68.
Vaksinepreparater ifølge foreliggende oppfinnelse kan benyttes alene ved passende doseringer som tillater optimal inhibering av HPV 52-infeksjon med minimal potensiell toksisitet. I tillegg kan koadministrering eller sekvensiell administrering av andre midler være ønskelig.
Mengden av viruslignende partikler som skal introduseres inn i en vaksine-mottaker, vil være avhengig av immunogenisiteten til det uttrykte genproduktet. Generelt blir en immunologisk eller profylaktisk effektiv dose på omtrent 10 ug til 100 ug, og fortrinnsvis omtrent 20 ug til 60 ug av VLP-er administrert direkte inn i muskelvevet. Subkutan injeksjon, intradermal introduksjon, impregnering gjennom huden og andre administreringsmåter, slik som intraperitonealt, intravenøst eller ved inhalering er også omfattet. Det er også omfattet at boostervaksineringer kan tilveiebringes. Parenteral administrering, slik som intravenøs administrering, intramuskulær administrering, subkutan administrering eller annen administreringsform med adjuvanser, slik som alum eller Merck alumadjuvans, samtidig med eller påfølgende parenteral introduksjon av vaksinen ifølge denne oppfinnelsen, er også fordelaktig.
De følgende eksemplene illustrerer oppfinnelsen.
EKSEMPEL 1
Bestemmelse av en representativ HPV 52-Ll-sekvens
HPV 52-Ll-sekvensen har tidligere blitt beskrevet (Genbankaksesjon # NC 001592). Det er likevel ikke uvanlig å finne mindre sekvensvariasjoner blant DNA som er fremskaffet fra kliniske isolater. For å bestemme en representativ HPV 52-Ll-villtype-sekvens ble DNA isolert fra tre kliniske prøver som tidligere var blitt vist å inneholde HPV 52-DNA. HPV 52-L1-sekvenser ble amplifisert ved en polymerasekjedereaksjon (PCR) ved å benytte Taq-DNA-polymerase og de følgende primere: 5' LI 5' - ATGTCCGTGTGGCCTAGT-3' (SEQ ID NO: 4) og 3' 52 Bal II 5'-GAGATCTCAATTACACAAAGTG-3' (SEQ ID NO: 5). De amplifiserte produktene ble elektroforesekjørt på agarosegel og visualisert ved hjelp av etidiumbromidfarging. Ll-båndene på ca 1500 bp ble skåret ut og DNA ble renset ved å benytte Geneclean Spin Kit (Q-Bio Gene, Carlsbad, CA). DNA ble deretter ligert til TA-kloningsvektoren, pCR2.1 (Invitrogen). TOP10F' E. co//'-celler ble transformert med ligeringsblandingen og platet på LB-agar med kanamycin pluss IPTG og X-gal for blå/hvit koloniseleksjon. Platene ble vendt opp ned og inkubert i 16 timer ved 37 °C.
Koloni-PCR ble utført på fem hvite kolonier som stammet fra hver av de tre kliniske isolatene som var amplifisert. 5' LI- og 3' 52 Bql H-primere ble benyttet i en totrinns-PCR der det første trinnet omfattet 10 sykluser ved 96 °C i 15 sekunder (denaturering), 55 °C i 30 sekunder (annealing) og 68 °C i 2 minutter (forlengning), og det andre trinnet omfattet
35 sykluser med et essensielt tilsvarende program, bortsett fra at annealingstrinnet ble utført ved 50 °C i 30 sekunder. PCR-produkter ble elektroforese-kjørt på agarose-geler og visualisert med etidiumbromidfarging. Flere kolonier fra hvert kliniske isolat inneholdt amplifiserte produkter med bånd på ca 1500 bp. Koloniene ble dyrket i LB-medium med kanamycin, risting ved 37 °C i 16 timer. Minipreps ble utført for å ekstrahere plasmid-DNA, som ble fordøyd med restriksjonsendonukleaser for å vise tilstedeværelsen av Ll-genet i
plasmidet. De resulterende restriksjonsfragmentene ble synliggjort ved hjelp av agarosegelelektroforese og etidiumbromidfarging. DNA-sekvensering ble utført på plasmider som inneholdt klonede Ll-innskudd fra hver av de tre kliniske isolatene. DNA og translaterte aminosyresekvenser ble sammenlignet med hverandre og de tidligere publiserte Genbank-HPV 52-Ll-sekvensene. Sekvensanalyse av de tre kliniske isolatene avslørte at ingen sekvenser var identiske med Genbanksekvensen (aksesjon # NC 001592). PCR2.1-HPV 52-Ll-klon # 2C ble valgt å være den representative HPV 52-Ll-sekvensen og er her referert til som "52-Ll-villtypesekvens" (SEQ ID NO: 3, se figur 1). Sekvensen som ble valgt som 52-Ll-villtype (wt), inneholdt en punktmutasjon når den ble sammenlignet med Genbank-sekvensen, som besto av en stille mutasjon på nukleotid 1308 (adenin -v guanin). Aminosyre-sekvensen til HPV 52-Ll-wt-sekvensen var identisk med 52-Ll-Genbanksekvensen. HPV 52-Ll-villtypesekvensen ble amplifisert ved å benytte 5' LI Bal H- primeren (5' -GAGATCTCACAAAACAAAATGTCCGTGTGGC-3' (SEQ ID NO: 6)) og 31 52 Bal H-<p>rimeren beskrevet ovenfor for å påføre Bgl II-forlengninger. PCR ble utført ved å benytte Taq-polymerase. PCR-produktet ble elektroforesekjørt på en agarosegel og visualisert ved hjelp av etidiumbromidfarging. Båndet på ca 1500 bp ble skåret ut og DNA ble renset ved å benytte Gene Clean Spin kit (Q-Bio Gene, Carlsbad, CA). PCR-produktet ble deretter ligert til pCR2.1-vektoren og TOPlOF-celler ble transformert med ligeringsblandingen. Hvite kolonier ble dyrket i LB-medium med kanamycin, risting ved 37 °C i 16 timer. Minipreps ble utført for å ekstrahere plasmid-DNA. HPV 52-Ll-genet ble frigjort fra vektorsekvensen med Bgl II-restriksjons-endonukleasefordøyinger. Det fordøyde DNA ble utsatt for agarosegelelektroforese og synliggjort ved hjelp av etidiumbromidfarging. Ll-båndet ble renset ved å benytte Geneclean kit og ligert til en defosforylert BamHI-fordøyd pGALHO-vektor. TOP10P- E. co//'-celler ble transformert med ligeringsblandingen. For å screene for HPV 52-Ll-innskuddet i den korrekte orienteringen ble plasmid-DNA fra koloniene PCR-amplifisert. DNA-sekvensering ble utført for å bekrefte sekvensen og orienteringen til innskuddene. Den valgte klonen ble kalt pGAL110-HPV 52-Ll-#5. Maksiprep-DNA fra den valgte klonen ble fremstilt. Saccharomyces cerevisiae- ceWer ble gjort kompetente ved sfæroplasting med glusulase og transformert med pGAL110-HPV 52L1 #5. Gjærtransformasjons-blandingen ble platet ut i Leu" -sorbitol-toppagar på Leu" -sorbitolplater og inkubert opp ned i 3 til 5 dager ved 30 °C. Kolonier ble plukket og streket ut for isolering på Leu_sorbitol-plater. Isolerte kolonier ble deretter dyrket i 5 ml med 5 X Leu" Ade" -sorbitol med 1,6 % glukose og 4 % galaktose i roterende rørkulturer ved 30 °C for å indusere HPV 52-Ll-transkripsjon og -proteinekspresjon.
EKSEMPEL 2
Gjærkodon-optimalisering
Kodon foretrukket av gjær har blitt beskrevet (Sharp, Paul M og Cowe, Elizabeth. Ekspresjon av HPV 52-Ll-wt-proteinet var påvisbart, likevel var nivået på transkripsjon svært lav og ikke påvisbart ved hjelp av Northern blot. Det ble postulert at prematur transkripsjonsterminering kunne være ansvarlig forde lave ekspresjonsnivåene fra HPV 52-Ll-genet. For å øke transkripsjonen av dette genet og for å sikre at fullengde-transkripter ville bli produsert, ble HPV 52-Ll-genet ombygget ved å benytte gjær-foretrukne kodon. Sekvensen ble inspisert for tilstedeværelsen av gjærtranskripsjons-termineringssignaler som er gjenkjent av gjær, og disse sekvensene ble eliminert ved substitusjon med alternative kodoner, mens aminosyresekvensen ble bevart. Den ombygde HPV 52-Ll-sekvensen, som omfatter gjærkodon-optimaliserte sekvenser, inneholdt 379 nukleotidendringer sammenlignet med HPV 52-Ll-wt-sekvensen. Den resulterende sekvensen er her referert til som "52-L1-R" (R = ombygd, se figur 1). Nukleotidendringene mellom 52-Ll-wt-(SEQ ID NO: 3) og 52-Ll-R-(SEQ ID NO: 1) sekvensene er vist i figur 1. Den translaterte aminosyresekvensen til 58-L1-R var ikke endret (SEQ ID NO: 2, se figur 2). Den ombygde sekvensen tilveiebringer økt HPV 52-Ll-proteinekspresjon, som er et signifikant fortrinn i forhold til villtypen for anvendelse i vaksineutvikling.
Strategien som ble benyttet for å fremstille det optimaliserte genet, var å designe lange overlappende sens- og antisensoligomerer som dekket genet ved å substituere nukleotider med gjærforetrukne kodonsekvenser, mens aminosyresekvensen ble opprettholdt. Disse oligomerene ble benyttet i stedet for templat-DNA- i en PCR-reaksjon med Pfu-DNA-polymerase. Ytterligere amplifiseringsprimere ble designet og benyttet for å amplifisere de ombygde sekvensene fra templatoligomerer.
De optimale betingelsene for amplifisering var seksjonsspesifikke, men allikevel benyttet de fleste reaksjonene et program som ligner 94 °C i 5 minutter (denaturering), etterfulgt av 25 sykluser ved 95 °C i 30 sekunder (denaturering), 50-55 °C i 30 sekunder (annealing), 72 °C i 1,5 minutter (forlengning) etterfulgt av 72 °C i 7 minutter og 4 °C holding foren siste forlengning. PCR-produkter ble undersøkt ved hjelp av agarosegelelektroforese. Bånd av den passende størrelsen ble skåret ut og DNA ble renset fra gelbiten. De amplifiserte fragmentene ble deretter benyttet som templater for å sette sammen det ombygde HPV 52-Ll-genet på 1512 nt.
Etter ombygning ble båndet på 1512 nt gelrenset og ligert til pCR4-blunt-vektor (Invitrogen, Carlsbad, CA). Etter ligering ble kompetente E. coli TOPlO-celler transformert med ligeringsblandingen. Koloniene ble dyrket i 4 ml LB med ampicillin og plasmid-DNA ble ekstrahert fra koloniene ved hjelp av miniprep teknikker. Plasmid-DNA ble sekvensert for å bekrefte tilstedeværelsen av de ønskede endringene i ombygd HPV 52-L1. For å påsette BamHI-forlengninger på begge ender ble 52-L1-R (ombygd) reamplifisert fra pCR4Blunt-52-Ll-R. Det amplifiserte fragmentet ble klonet som ovenfor og det resulterende plasmid-DNA ble sekvensert. Plasmidet pCR4-Blunt-51-Ll-R (Barn) ble fordøyd med BamHI og de resulterende DNA-fragmentinnskuddene ble elektroforesekjørt på en agarosedel. HPV 52-L1- R (Bam)-fragmentet på ca 1530 bp ble gelrenset og ligert til BamHI-fordøyd pGALHO. TOP10F'-E. coli (Invitrogen)-celler ble transformert med ligeringsblandingen.
De resulterende koloniene ble screenet ved hjelp av PCR for HPV 52-L1-R-innskuddet i den korrekte orienteringen. Sekvens og orientering ble bekreftet ved hjelp av DNA-sekvensering. Maksiprep-plasmid-DNA ble fremstilt. S. cerew's/'ae-celler ble gjort kompetente ved hjelp av sfæroplasting og transformert. Gjærtransformasjonen ble platet på Leu" sorbitol-toppagar på Leu" sorbitolagarplater og inkubert opp ned i 7 dager. Kolonier ble plukket og streket ut for klonisolering på Leu -sorbitolagarplater. Isolerte kolonier ble deretter dyrket i 5 ml 5 X Leu" Ade"-sorbitol med 1,6 % glukose og 4 % galaktose i roterende rørkulturer ved 30 °C for å indusere Ll-transkripsjon og protein-ekspresjon. Etter 48 og/eller 72 timer ble et kulturvolum ekvivalent til en OD600= 10 spunnet til pellet, supernatanten ble fjernet og pelletene ble frosset og lagret ved -70 °C.
EKSEMPEL 3
RN A-f rem sti Iling
Cellepelleter av transformert gjær som er indusert for ekspresjon av HPV 52-L1 ved hjelp av galaktoseinduksjon, ble tint på is, suspendert i 0,8 ml Trizol-reagens (Life Technologies, Gibco BRL) og inkubert ved romtemperatur i 5 minutter. En femdels volum med kloroform ble tilsatt til røret. Dette ble deretter ristet kraftig i 15 sekunder for å blande og inkubert ved romtemperatur i 3 minutter. Etter en 5 minutters sentrifugering ved 13 k rpms ble den øvre fasen samlet og overført til nytt rør. 0,4 ml isopropanol ble tilsatt til røret. Blandingen ble inkubert ved romtemperatur i 10 minutter. For å lage en pellet av RNA ble sentrifugering utført ved 13 k rpms i 10 minutter. Supernatanten ble dekantert, RNA-pelleten ble vasket med 75 % EtOH og sentrifugeringstrinnet ble gjentatt. Supernatanten ble dekantert og RNA-pelleten ble tillatt å tørke i 15 minutter etterfulgt av suspensjon i RNase-fritt vann. Spektrofotometri ble utført for å bestemme konsentrasjon av RNA i prøven ved å benytte antagelsen av at en A26o-avlesning på 1 = 40 ug/ml RNA når A26o/28oer 1,7-2,0.
EKSEMPEL 4
Northern Blot-analyse
En agaroseformaldehydgel på 1,1 % ble støpt. Fem og ti mikrogram RNA ble kombinert med denatureringsbuffer (siste konsentrasjoner: 6 % formaldehyd, 50 % formamid og 0,1 x MOPS) og varmet til 65 °C i 10 minutter. Et volum på en tidel med gelpåsettingsbuffer ble tilsatt og prøven ble påsatt gelen. Elektroforese ble utført ved 75 volt i 1 x MOPS-buffer i ca 3 timer. Gelen ble vasket i 60 minutter i 10 x SSC.
RNA ble overført til en Hybond-N+-nylonmembran (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) ved kapillærvirkning i løpet av 16 timer i 10 x SSC. RNA ble deretter fiksert til nylonmembranen ved hjelp av kryssbinding ved å benytte Stratagene UV Stratalinker autocrosslink function (Stratagene, LA Jolla, CA). Etter fiksering ble nylon-membranen tillatt å lufttørke.
DIG High Prime DNA Labeling and Detection Kit I fra Roche (Hoffmann-La Roche Ltd., Basel, Sveits) ble benyttet for å merke 52-Ll-wt og 52-Ll-R-DNA-sekvenser med DIG for å benyttes som prober for å påvise 52-Ll-wt og HPV 52-L1-R-RNA på Northern-blottet. Prehybridiseringen, hybridiseringen og den immunologiske utviklingen ved å benytte et anti-DIG alkalisk fosfatasekonjugert antistoff ble utført i henhold til produsentens anbefalinger. Kort fortalt ble blottet prehybridisert ved 37 °C i 30 minutter ved forsiktig risting. Proben ble denaturert ved oppvarming til 95 °C i 5 minutter og påfølgende slukking på is. Proben ble tilsatt hybridiseringsløsningen og påsatt membran i 4 timer ved 44,6 °C med forsiktig risting. Hybridiseringsløsningen ble deretter fjernet og vasket 2 x i 5 minutter i 2 x SSC med 0,1 % SDS ved romtemperatur, etterfulgt av en ytterligere vask ved 65 °C med 0,5 x SSC og 0,1 % SDS. Blottet ble deretter blokkert i 30 minutter og anti-DIG alkalisk fosfatasekonjugert antistoff ble påsatt ved en fortynning på 1:5000 i 30 minutter. Blottet ble vasket og tilstedeværelsen av probebundet RNA ble bestemt ved hjelp av NBT/BCIP-substratpåvisning av det alkaliske fosfatasekonjugerte anti-DIG-bundne antistoffet.
Utgangsanalyse av gjær som uttrykker HPV 52-Ll-wt tyder på at HPV 52-Ll-protein ble uttrykt, selv om nivået var lavt. Northern-blot-analyse av RNA fra gjær-ekstrakter fra kulturer som er indusert til å uttrykke HPV 52-Ll-wt avslørte ikke noe påvisbart HPV 52-L1-RNA. Siden noe protein av den passende størrelsen ble påvist, var det klart at noen fullengde-RNA-transkripter ble fremstilt. HPV 52-Ll-genet ble ombygd med gjærforetrukne kodonsekvenser og ble fremstilt for å unngå alle mulige premature transkripsjonstermineringsseter for å sikre robust transkripsjon. Northern-blot-analyse av HPV 52-Ll-R-transkriptet avslørte at fullengdetranskripter ble generert og var påvisbare ved hjelp av Northern-blot-analyse (figur 3).
EKSEMPEL 5
HPV 52-Ll-proteinekspresjon
Frosne gjærcellepelleter fra galaktoseinduserte kulturer ekvivalente med
OD600 = 10 ble tint på is og suspendert i 300 ul PC-buffer (100 mM Na2HP04og 0,5 M NaCI, pH 7,0) med 2 mM PMSF. Syrevaskede 0,5 mm glasskuler ble tilsatt ved en konsentrasjon på ca 0,5 g/rør. Rørene ble vortekset i 3 sykluser av 5 minutter ved 4 °C med et opphold på 1 minutt. 7,5 ul 20 % TritonXlOO ble tilsatt og vortekstrinnet ble gjentatt i 5 minutter ved 4 °C. Rørene ble plassert på is i 15 minutter, etterfulgt av sentrifugering i 10 minutter ved 4 °C. Supernatanten ble overført til et sterilt mikro-sentrifugerør som var merket som totalt gjærproteinekstrakt, datert og lagret ved -70 °C.
EKSEMPEL 6
Western blot analyse
Totalt gjærproteinekstrakt fra tjue isolerte gjærkolonier for hver HPV 52-L1-konstruksjon ble analysert ved hjelp av Western-blot for å bekrefte ekspresjon av HPV 52-Ll-protein etter galaktoseinduksjon.
Ti, fem og to og et halvt mikrogram med totalt gjærproteinekstrakt ble kombinert med SDS-PAGE-påsetningsbuffer og varmet til 95 °C i 10 minutter. HPV 16-Ll-proteinet, som har en størrelse på omtrent 55 kDa, ble inkludert som en positiv kontroll, sammen med HPV-Ll-fritt total gjærproteinekstrakt som en negativ kontroll (data ikke vist). Proteinene ble påsatt en 10 % SDS-PAGE-gel og elektroforesekjørt i tris-glysinbuffer. Etter proteinseparasjonen ble proteinet Western-overført fra gel til nitrocellulose og det resulterende blottet ble blokkert i 1 x fortynningsbuffer (Kirkegaard og Perry Laboratories, Gaithersburg, MD) i 1 time ved romtemperatur med risting. Blottet ble vasket tre ganger og gjærabsorbert geit-anti-trpE-HPV-31-Ll-serum, som kryssreagerer med HPV 16 og HPV 52-Ll-proteiner, ble påsatt ved romtemperatur i 16 timer. Blottet ble deretter vasket tre ganger og inkubert med anti-geit-HRP-konjugert antistoff med en fortynning på 1:2500 i 1 time. Blottet ble igjen vasket tre ganger og NBT/BCIP-påvisningssubstrat ble tilført (Kirkegaard og Perry Laboratories). Immunreaktive proteiner ble påvist som rosa bånd på blottet.
I alle tilfeller ble HPV 52-Ll-proteinet påvist som et avgrenset immunreaktivt bånd på nitrocellulosen som tilsvarte omtrent 55 kDa. (Figur 4). Intensiteten til HPV 52-L1-R-båndet (2,5 ug tørrspor?) så ut til å være vesentlig større enn HPV 52-Ll-wt-båndet (10 ug). Ved ombygning var det klart at utrykkingsnivået av kodon-optimalisert HPV 52-L1-R økte mer enn fire ganger, som er begrensningen for direkte sammenligning på western blottet.
EKSEMPEL 7
Transmisjonselektronmikroskopi
For å vise at det 52-Ll-proteinet faktisk var selvsammensettende, slik at det dannet pentamere-Ll-kapsomerer, som i sin tur selvsammensettes til viruslignende partikler, ble et delvis renset HPV 52-Ll-R-proteinekstrakt utsatt for transmisjons-elektronmikroskopi (TEM).
Gjær ble dyrket ved småskalafermentering og spunnet til pellet. De resulterende
pelletene ble utsatt for rensingsbehandlinger. Pellet og klarede gjærekstrakter ble analysert ved hjelp av immunblott for å vise HPV 52-Ll-proteinekspresjon og tilbakeholdelse gjennom renseprosedyren. Klarede gjærekstrakter ble deretter utsatt for sentrifugering over en sukrosepute på 45 % og den resulterende pelleten ble suspendert i buffer for analyse av HPV 52-Ll-VLP-er ved hjelp av TEM.
En representativ prøve og HPV 52-Ll-R-VLP-ene som er fremstilt, er vist i figur 5. Diameteren på de sfæriske partiklene i denne råprøven lå mellom 40 og 70 nm der noen partikler viste en regulær sammensetning av kapsomerer.
Claims (16)
1. Nukleinsyremolekyl,
karakterisert vedat den omfatter en sekvens av nukleotider som koder for et HPV 52-Ll-protein ifølge SEQ ID NO: 2, der nukleinsyresekvensen omfatter en sekvens av nukleotider ifølge SEQ ID NO: 1.
2. Vektor,
karakterisert vedat den omfatter nukleinsyremolekylet ifølge krav 1.
3. Vertscelle,
karakterisert vedat den omfatter vektoren ifølge krav 2.
4. Vertscelle ifølge krav 3, hvor vertscellen er en gjærcelle.
5. Vertscelle ifølge krav 4, hvor gjærcellen er valgt fra gruppen som består av: Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces lactis og Schizosaccharomyces pombe.
6. Vertscelle ifølge krav 4, hvor vertscellen er Saccharomyces cerevisiae.
7. Fremgangsmåte for fremstilling av HPV52L1 viruslignende partikler (VLP-er),karakterisert vedat den omfatter å: (a) transformere gjær med et nukleinsyremolekyl ifølge krav 1, (b) dyrke den transformerte gjæren under betingelser som tillater uttrykking av nukleinsyremolekylet for å fremstille et rekombinant papillomvirus-protein, og (c) isolere det rekombinante papillomvirusproteinet for å fremstille HPV52L1 VLP-ene.
8. Fremgangsmåte for fremstilling av en vaksine for behandling eller forebygging av
HPV-assosiert cervikal kreft,
karakterisert vedat fremgangsmåten omfatter fremstilling av HPV52L1 VLP-er
ifølge fremgangsmåten i krav 7.
9. Fremgangsmåte ifølge krav 8, hvor vaksinen ytterligere omfatter VLP-er av minst én ytterligere HPV-type.
10. Fremgangsmåte ifølge krav 9, hvor den minst én ytterligere HPV-typen er valgt fra gruppen som består av: HPV 6, HPV 11, HPV 16, HPV 18, HPV 31, HPV 33, HPV 35, HPV 39, HPV 45, HPV 51, HPV 55, HPV 56, HPV 58, HPV 59 og HPV 68.
11. Fremgangsmåte ifølge krav 10, hvor den minst ene HPV-typen omfatter HPV 16.
12. Fremgangsmåte ifølge krav 11, hvor vaksinen ytterligere omfatter HPV 18-VLP-er.
13. Fremgangsmåte ifølge krav 12, hvor vaksinen ytterligere omfatter HPV 6-VLP-er og HPV 11-VLP-er.
14. Fremgangsmåte ifølge krav 12 eller 13, hvor vaksinen ytterligere omfatter HPV 31-VLP-er.
15. Fremgangsmåte ifølge krav 14, hvor vaksinen ytterligere omfatter HPV 45-VLP-er.
16. Fremgangsmåte ifølge krav 15, hvor vaksinen ytterligere omfatter HPV 58-VLP-er.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US55592604P | 2004-03-24 | 2004-03-24 | |
| PCT/US2005/009199 WO2005097821A1 (en) | 2004-03-24 | 2005-03-18 | Optimized expression of hpv 52 l1 in yeast |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO20064815L NO20064815L (no) | 2006-10-23 |
| NO338055B1 true NO338055B1 (no) | 2016-07-25 |
Family
ID=34964085
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO20064815A NO338055B1 (no) | 2004-03-24 | 2006-10-23 | Nukleinsyremolekyl for optimalisert ekspresjon av HPV52-L1 i gjær, vektor og vertscelle, samt fremgangsmåte for fremstilling av HPV52L1 viruslignende partikler, og deres anvendelse ved fremstilling av en vaksine for behandling eller forebygging av HPV-assosiert cervikal kreft. |
| NO2017005C NO2017005I1 (no) | 2004-03-24 | 2017-01-20 | Human pappilomavirus vaksine [type 6, 11, 16, 18, 31, 33, 45, 52, 58] |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO2017005C NO2017005I1 (no) | 2004-03-24 | 2017-01-20 | Human pappilomavirus vaksine [type 6, 11, 16, 18, 31, 33, 45, 52, 58] |
Country Status (30)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US7700103B2 (no) |
| EP (1) | EP1730175B1 (no) |
| JP (1) | JP4833962B2 (no) |
| KR (1) | KR101203403B1 (no) |
| CN (1) | CN1934131B (no) |
| AR (1) | AR048191A1 (no) |
| AT (1) | ATE466022T1 (no) |
| AU (1) | AU2005230907C1 (no) |
| BR (1) | BRPI0509079B8 (no) |
| CA (1) | CA2560487C (no) |
| CY (2) | CY1110349T1 (no) |
| DE (1) | DE602005020913D1 (no) |
| DK (1) | DK1730175T3 (no) |
| ES (1) | ES2343255T3 (no) |
| FR (1) | FR15C0085I2 (no) |
| HU (1) | HUS1500062I1 (no) |
| IL (1) | IL178140A (no) |
| LT (2) | LTC1730175I2 (no) |
| LU (1) | LU92903I2 (no) |
| MY (1) | MY148656A (no) |
| NL (1) | NL300777I2 (no) |
| NO (2) | NO338055B1 (no) |
| NZ (1) | NZ549898A (no) |
| PL (1) | PL1730175T3 (no) |
| PT (1) | PT1730175E (no) |
| RU (1) | RU2373219C2 (no) |
| SI (1) | SI1730175T1 (no) |
| TW (1) | TWI349036B (no) |
| WO (1) | WO2005097821A1 (no) |
| ZA (1) | ZA200607575B (no) |
Families Citing this family (25)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7858098B2 (en) * | 2002-12-20 | 2010-12-28 | Glaxosmithkline Biologicals, S.A. | Vaccine |
| CN1869215B (zh) * | 2006-05-19 | 2012-07-04 | 长春百克生物科技股份公司 | 一种制备人乳头瘤病毒的病毒样颗粒的方法 |
| US7709010B2 (en) | 2007-03-09 | 2010-05-04 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Papillomavirus vaccine compositions |
| EP2479187A1 (en) * | 2007-11-23 | 2012-07-25 | Shanghai Zerun Biotechnology Co., Ltd. | Genes encoding major capsid protein L1 of human papilloma viruses |
| CN101440371B (zh) * | 2007-11-23 | 2012-09-05 | 上海泽润生物科技有限公司 | 一种16型人乳头状瘤病毒主要衣壳蛋白l1基因 |
| US8623375B2 (en) * | 2010-05-14 | 2014-01-07 | Baxter International Inc. | Chimeric OspA genes, proteins, and methods of use thereof |
| US9376727B2 (en) | 2010-05-25 | 2016-06-28 | Qiagen Gaithersburg, Inc. | Fast results hybrid capture assay and associated strategically truncated probes |
| IN2013CN00536A (no) | 2010-07-02 | 2015-07-03 | Univ Xiamen | |
| US8361720B2 (en) * | 2010-11-15 | 2013-01-29 | Exact Sciences Corporation | Real time cleavage assay |
| BR112013013377A2 (pt) | 2010-12-03 | 2016-11-22 | Ms Technologies Llc | molécula de ácido nucléico codificante de uma sintase de ácido 5-enolpiruvil-3-fosfo-chiquímico (epsps), constructo, vetor, célula de planta, planta, método para produzir uma planta tendo |
| CN102154325B (zh) * | 2011-01-01 | 2013-08-21 | 上海生物制品研究所有限责任公司 | 针对人乳头瘤状病毒的疫苗及其制法和用途 |
| RU2445357C1 (ru) * | 2011-02-15 | 2012-03-20 | Закрытое акционерное общество научно-производственная компания "Комбиотех" | Рекомбинантный штамм дрожжей pichia angusta - продуцент капсидного белка l1 вируса папилломы человека типа 16 |
| RU2445358C1 (ru) * | 2011-02-15 | 2012-03-20 | Закрытое акционерное общество научно-производственная компания "Комбиотех" | Рекомбинантный штамм дрожжей pichia angusta - продуцент капсидного белка l1 вируса папилломы человека типа 18 |
| CN104120089B (zh) * | 2013-04-26 | 2019-09-24 | 北京安百胜生物科技有限公司 | 用汉逊酵母表达系统产生hpv52 l1蛋白的方法 |
| CN104164374B (zh) * | 2013-05-17 | 2019-10-22 | 北京安百胜生物科技有限公司 | 用汉逊酵母表达系统产生hpv31 l1蛋白的方法 |
| EP3057612B1 (en) | 2013-10-16 | 2020-05-06 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Method of obtaining thermostable dried vaccine formulations |
| CN104878022A (zh) * | 2015-04-27 | 2015-09-02 | 段青姣 | 编码hpv58l1、hpv52l1蛋白的核苷酸序列及其应用 |
| CN106701796B (zh) * | 2015-08-12 | 2021-11-16 | 北京康乐卫士生物技术股份有限公司 | 52型重组人乳头瘤病毒病毒样颗粒及其制备方法 |
| CN109750049B (zh) * | 2017-11-07 | 2023-08-18 | 上海泽润生物科技有限公司 | 重组人乳头瘤病毒52亚型蛋白表达 |
| CR20220395A (es) | 2020-02-14 | 2022-10-27 | Merck Sharp & Dome Llc | Vacuna contra hpv |
| CN114539365B (zh) * | 2020-11-26 | 2023-12-01 | 中国医学科学院基础医学研究所 | 一种改造的人乳头瘤病毒52型l1蛋白及其用途 |
| CN113073105B (zh) * | 2021-03-23 | 2023-06-13 | 重庆博唯佰泰生物制药有限公司 | 一种表达hpv 56l1的多核苷酸序列及其表达载体、宿主细胞和应用 |
| CN113549634B (zh) * | 2021-06-07 | 2023-03-31 | 郑州大学 | 编码可溶性hpv58 l1蛋白的基因及其重组质粒的构建与应用 |
| US20230048144A1 (en) | 2021-08-06 | 2023-02-16 | Merck Sharp & Dohme Llc | Hpv vaccine |
| CA3229064A1 (en) | 2021-08-19 | 2023-02-23 | Andrew Bett | Thermostable lipid nanoparticle and methods of use thereof |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001014416A2 (en) * | 1999-08-25 | 2001-03-01 | Merck & Co., Inc. | Synthetic papillomavirus genes optimized for expression in human cells |
Family Cites Families (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1339729C (en) * | 1988-10-26 | 1998-03-17 | Wayne D. Lancaster | Human papillomavirus type 52 dna sequences and methods for employing thesame |
| IL117591A0 (en) | 1995-03-30 | 1996-07-23 | Merck & Co Inc | Synthetic DNA encoding human papillomavirus type 11 L1 protein |
| US5821087A (en) | 1995-03-30 | 1998-10-13 | Merck & Co., Inc. | Production of recombinant human papillomavirus type II protein utilizing papillomavirus 6/11 hybrid DNA |
| CA2280195A1 (en) | 1997-02-07 | 1998-08-13 | Merck & Co., Inc. | Synthetic hiv gag genes |
| JP4434479B2 (ja) | 1997-07-09 | 2010-03-17 | ザ・ユニバーシティ・オブ・クイーンズランド | 標的の細胞および組織においてタンパク質を選択的に発現するための核酸配列および方法 |
| JP4563582B2 (ja) | 1998-08-14 | 2010-10-13 | メルク・シャープ・エンド・ドーム・コーポレイション | ヒトパピローマウイルスのウイルス様粒子を使用するタンパク質送達系 |
| IL141130A0 (en) * | 1998-08-14 | 2002-02-10 | Merck & Co Inc | Process for purifying human papilloma virus-like particles |
| SE514982C2 (sv) * | 1999-09-30 | 2001-05-28 | Active Biotech Ab | Bärare innehållande ett huvudkapsidprotein L1 från humant papillomavirus samt dess användning |
| US6436402B1 (en) | 1999-10-15 | 2002-08-20 | Merck & Co., Inc. | Process for making human papillomavirus virus-like particles with improved properties |
| IL154009A0 (en) | 2000-07-21 | 2003-07-31 | Glaxo Group Ltd | Codon-optimized papilloma virus sequences |
| US20030226155A1 (en) * | 2001-08-30 | 2003-12-04 | Biorexis Pharmaceutical Corporation | Modified transferrin-antibody fusion proteins |
| KR101080628B1 (ko) | 2003-03-24 | 2011-11-08 | 머크 샤프 앤드 돔 코포레이션 | 효모에서 ｈｐｖ 31 ｌ1의 최적 발현 |
| MY140664A (en) | 2003-09-29 | 2010-01-15 | Merck Sharp & Dohme | Optimized expression of hpv 45 l1 in yeast |
| MY139500A (en) | 2003-11-12 | 2009-10-30 | Merck Sharp & Dohme | Optimized expression of hpv 58 l1 in yeast |
-
2005
- 2005-03-18 PL PL05725933T patent/PL1730175T3/pl unknown
- 2005-03-18 EP EP05725933A patent/EP1730175B1/en active Active
- 2005-03-18 CA CA2560487A patent/CA2560487C/en active Active
- 2005-03-18 DE DE602005020913T patent/DE602005020913D1/de active Active
- 2005-03-18 SI SI200531052T patent/SI1730175T1/sl unknown
- 2005-03-18 NZ NZ549898A patent/NZ549898A/en unknown
- 2005-03-18 BR BRPI0509079A patent/BRPI0509079B8/pt active IP Right Grant
- 2005-03-18 DK DK05725933.5T patent/DK1730175T3/da active
- 2005-03-18 PT PT05725933T patent/PT1730175E/pt unknown
- 2005-03-18 KR KR1020067019673A patent/KR101203403B1/ko active IP Right Grant
- 2005-03-18 CN CN2005800095956A patent/CN1934131B/zh active Active
- 2005-03-18 WO PCT/US2005/009199 patent/WO2005097821A1/en active Application Filing
- 2005-03-18 ES ES05725933T patent/ES2343255T3/es active Active
- 2005-03-18 TW TW094108431A patent/TWI349036B/zh active
- 2005-03-18 RU RU2006137363/13A patent/RU2373219C2/ru active
- 2005-03-18 US US10/594,064 patent/US7700103B2/en active Active
- 2005-03-18 AU AU2005230907A patent/AU2005230907C1/en active Active
- 2005-03-18 MY MYPI20051180A patent/MY148656A/en unknown
- 2005-03-18 JP JP2007505032A patent/JP4833962B2/ja active Active
- 2005-03-18 AT AT05725933T patent/ATE466022T1/de active
- 2005-03-23 AR ARP050101174A patent/AR048191A1/es active IP Right Grant
-
2006
- 2006-09-11 ZA ZA200607575A patent/ZA200607575B/xx unknown
- 2006-09-17 IL IL178140A patent/IL178140A/en active IP Right Grant
- 2006-10-23 NO NO20064815A patent/NO338055B1/no active Protection Beyond IP Right Term
-
2009
- 2009-10-14 US US12/578,995 patent/US7744892B2/en active Active
-
2010
- 2010-07-26 CY CY20101100698T patent/CY1110349T1/el unknown
-
2015
- 2015-11-30 NL NL300777C patent/NL300777I2/nl unknown
- 2015-12-02 HU HUS1500062C patent/HUS1500062I1/hu unknown
- 2015-12-04 FR FR15C0085C patent/FR15C0085I2/fr active Active
- 2015-12-07 CY CY2015052C patent/CY2015052I1/el unknown
- 2015-12-08 LT LTPA2015050C patent/LTC1730175I2/lt unknown
- 2015-12-08 LT LTPA2015050D patent/LTPA2015050I1/lt unknown
- 2015-12-08 LU LU92903C patent/LU92903I2/xx unknown
-
2017
- 2017-01-20 NO NO2017005C patent/NO2017005I1/no unknown
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001014416A2 (en) * | 1999-08-25 | 2001-03-01 | Merck & Co., Inc. | Synthetic papillomavirus genes optimized for expression in human cells |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| LIU et al; Polynucleotide viral vaccines: codon optimisation and ubiquitin conjugation enhances prophylactic and therapeutic efficacy; VACCINE, vol. 20, nr. 5-6, 2001, s. 862-869, ISSN 0264-410X. , Dated: 01.01.0001 * |
| ZHOU et al; Papillomavirus capsid protein expression level depends on the match between codon usage and tRNA availability; JOURNAL OF VIROLOGY, vol. 73, nr. 6, 1999, s. 4972-4982, ISSN 0022-538X. , Dated: 01.01.0001 * |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| NO338055B1 (no) | Nukleinsyremolekyl for optimalisert ekspresjon av HPV52-L1 i gjær, vektor og vertscelle, samt fremgangsmåte for fremstilling av HPV52L1 viruslignende partikler, og deres anvendelse ved fremstilling av en vaksine for behandling eller forebygging av HPV-assosiert cervikal kreft. | |
| EP1687329B1 (en) | Optimized expression of hpv 58 l1 in yeast | |
| EP1608767B1 (en) | Optimized expression of hpv 31 l1 in yeast | |
| AU2004277934B2 (en) | Optimized expression of HPV 45 L1 in yeast | |
| MXPA06010983A (en) | Optimized expression of hpv 52 l1 in yeast | |
| MXPA06005306A (en) | Optimized expression of hpv 58 l1 in yeast |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| SPCF | Filing of supplementary protection certificate |
Free format text: PRODUCT NAME: HPV 52L1 PROTEIN; NAT. REG. NO/DATE: NO , EU/1/15/1007/001-003 20150618; FIRST REG. NO/DATE: EU , EU/1/15/1007/001-003 20150612 Spc suppl protection certif: 2017005 Filing date: 20170120 |
|
| SPCG | Granted supplementary protection certificate |
Free format text: PRODUCT NAME: HPV 52L1 PROTEIN; NAT. REG. NO/DATE: NO , EU/1/15/1007/001-003 20150618; FIRST REG. NO/DATE: EU , EU/1/15/1007/001-003 20150612 Spc suppl protection certif: 2017005 Filing date: 20170120 Extension date: 20300318 |
|
| CHAD | Change of the owner's name or address (par. 44 patent law, par. patentforskriften) |
Owner name: MERCK SHARP & DOHME LLC, US |
|
| SPCF | Filing of supplementary protection certificate |
Free format text: PRODUCT NAME: HPV 52L1 PROTEIN - FORLENGET SPC; REG. NO/DATE: EU/1/15/1007/001-003 20150618 Spc suppl protection certif: 2022050 Filing date: 20221130 |