CN111053788B - 一种用于慢性出血辅助治疗的组合物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种用于慢性出血辅助治疗的组合物及其应用，所述组合物由巨核祖细胞和内皮祖细胞外泌体组成，可根据不同的适应症进行配比，科学经济。本发明使用的内皮祖细胞外泌体，是在内皮祖细胞培养后，通过对内皮祖细胞的培养基进行超高速离心的方法获得，可把更有临床治疗价值的内皮祖细胞留给其他重症疾病，更全面的利用生物资源；本发明的组合物用于慢性出血辅助治疗，兼顾凝血和血管修复，避免因输血带来的感染或免疫排斥问题，成本更低，更安全，疗效更好、更持久，具有重要的临床应用价值。

Description

一种用于慢性出血辅助治疗的组合物及其应用
技术领域
本发明属于细胞生物学、分子生物学及药物研发技术领域，具体涉及一种用于慢性出血辅助治疗的组合物及其应用。
背景技术
各种原因引起的慢性出血病症，诸如：内脏溃疡出血、尿血、便血、功能性子宫出血、外伤出血等，为临床常见病、多发病，其发病原因复杂、病机转化快。长期慢性出血可引起贫血、营养不良、机体抵抗力下降等系列连锁反应，严重影响人们的身心健康。
对于患有慢性出血疾病的患者，其血小板损耗远比健康机体严重，由于其失血过程缓慢而连续，与创伤或手术导致的急性失血有较大差异，因此一般的血小板输注并不能有效改善其长期出血的症状。同时，国内的成分血需求量持续扩大而无偿献血增长量却相对落后，这使全国许多城市出现血液紧缺，无论是全血还是红细胞等成分血的供应都存在缺口，当中以血小板缺乏情况最为明显。因此，开发可以用于有效治疗慢性出血的方法，是对多种慢性疾病患者健康的重要的辅助。导致慢性出血的疾病，如血性胃炎，往往会在机体的相应组织造成毛细血管广泛和反复的破损，从而导致点状出血和局部糜烂的症状。因此除了止血，还需要对毛细血管进行修复。
目前对于慢性出血，临床并没有特别有效的治疗方法，而用于急性大出血的治疗方法，如输注血小板，对于慢性出血疾病而言是过度医疗，成本太高而且短效。
发明内容
本发明的目的在于针对上述现有技术的不足之处而提供一种对慢性出血提供综合性辅助治疗的方法及其应用。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种用于慢性出血辅助治疗的组合物，所述组合物由巨核祖细胞和内皮祖细胞外泌体组成。
巨核祖细胞(MKPC)在机体内能分化为血小板，有效提高凝血功能；内皮祖细胞(EPC)最早在外周血中被发现，随着内皮祖细胞的相关研究不断丰富， EPC可应用在心血管修复和下肢缺血性疾病等严重的疾病，具有显著的医疗价值。随着研究的不断深入，发现内皮祖细胞也通过释放外泌体参与了血管再生过程。在缺血/再灌注损伤等疾病中，内皮祖细胞外泌体中的microRNA分子起到促进血管再生，以降低缺血/缺氧微环境带来的损伤风险并促进组织再生修复的作用。使用内皮祖细胞外泌体相对于使用内皮细胞成本更低，且能有效节约 EPC资源，使其用于其他更严重病症治疗。
另外，使用巨核祖细胞和内皮祖细胞外泌体，其来源相对易得；且相对于传统的输血，其免疫原性低，用量小，更安全。二者兼顾凝血和血管修复的功能，发挥作用更佳，效果更持久。
所述组合物可根据病症的差异情况，按比例组合巨核祖细胞和内皮祖细胞外泌体的配比。
优选地，所述巨核祖细胞和内皮祖细胞外泌体来源于同一份供体，可避免免疫原性差别导致的安全问题，并有效降低成本。
具体地，将同一份来源的造血干/祖细胞分别分化为巨核祖细胞和内皮祖细胞，提取内皮祖细胞的外泌体；将制得的巨核祖细胞和内皮祖细胞外泌体按比例组合，即得本发明所述组合物。
作为本发明的一种优选实施方式，所述组合物中，所述巨核祖细胞与所述内皮祖细胞外泌体的比例为1*105个：0.07～0.27μg。
组合物中的巨核祖细胞和内皮祖细胞外泌体的量可根据不同适应症进行配比，更有效利用资源。
作为本发明的一种优选实施方式，所述组合物中，所述巨核祖细胞和所述内皮祖细胞外泌体的比例为1*105个：0.07～0.043μg。
本发明还要求保护所述的组合在制备慢性出血辅助治疗药物制剂中的应用。
作为本发明的一种优选实施方式，所述慢性出血包括慢性炎症引起的出血以及胃溃疡或肠溃疡引起的慢性出血。
所述慢性炎症包括宫颈糜烂性阴道炎。
作为本发明的优选实施方式，用于胃溃疡时，组合物中的MKPC与EPC外泌体的比例为1*105个：0.15～0.27μg；用于肠溃疡时，组合物中的MKPC与EPC 外泌体的比例为1*105个：0.07～0.043μg。
肠溃疡是消化道的常见病症，主要原因除了细菌感染、饮食不良习惯，还包括焦虑，压力大等精神和情绪的影响使大脑皮质接受外界的不良刺激，导致肠壁血管和肌肉发生痉挛，使肠壁细胞营养发生障碍和肠粘膜的抵抗力降低，从而使肠粘膜易受消化液的作用形成溃疡，由于肠道是消化系统的后段组织，而且非常长，成人小肠长达6米，消化系统的消化液都会与食物一起到达肠部，对肠部有着复杂而漫长的刺激作用，因此肠部溃疡在进食后疼痛感非常明显，对营养的吸收有着严重负面影响，所以治疗肠溃疡的组合物需要更高的MKPC 比例，以达到更快止血的效果。
在非进食期间胃部处于空置状态，胃酸不断刺激胃部组织，所以胃溃疡患者通常在进食前感到疼痛，在配合其他胃溃疡药物进行治疗时，需要更快的修复血管，所以组合物需要更高的内皮祖细胞外泌体比例。
本发明还要求保护一种慢性出血辅助治疗药物制剂，所述药物包括所述的复合物。
进一步地，所述药物的剂型为注射剂。
由于本发明的有效成分为细胞和包含蛋白、核酸等分子的细胞微囊泡，是具有生物活性的成分，其储存和运输均需要专业设施，如液氮储存设备，可以长期保存巨核祖细胞和内皮祖细胞；使用过程采取静脉输注或者局部注射的方法，通过输注用液重悬，巨核祖细胞和内皮祖细胞外泌体直接进入血液，通过血液循环到达伤口，迅速开始修复作用。
作为本发明的一种优选实施方式，所述药物制剂还包括药学上可接受的辅料或载体。
所述辅料包括NMPA批准的药学和临床上可用的试剂。
作为本发明的一种优选实施方式，所述载体为生理盐水。
本发明还提供了所述注射剂的制备方法，方法如下：按配比取一定量的巨核祖细胞、内皮祖细胞外泌体和辅料，加入载体中，混匀即可。
巨核祖细胞和内皮祖细胞外泌体使用前可分别储存，使用时可根据不同的病症对巨核祖细胞及外泌体的数量再进行配比，使用便捷，且能有效避免资源浪费。
本发明的有益之处在于：
1、本发明用于慢性出血辅助治疗组合物兼顾了制备成本的经济性和安全性，避免因输血带来的感染或免疫排斥问题；本发明使用EPC的外泌体，通过EPC超高速离心等方法获得，可把更有临床治疗价值的EPC留给其他重症疾病，更全面的利用生物资源，简便安全和高效；
2、本发明使用了具有细胞活性的MKPC对于传统的血小板输注而言更灵活，且MKPC在机体内分化血小板的效果更持久；另外，EPC具有毛细血管修复功能，二者结合组成的组合物兼顾凝血和血管修复，使用成本低，安全性好，疗效佳且更持久，具有重要的临床应用价值。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
根据不同的适应症将MKPC和EPC外泌体按不同的比例混合得到用于慢性出血辅助治疗的药物制剂。MKPC以1*105个细胞溶解于1mL生理盐水得到的MKPC溶液为1个MKPC使用单位，EPC外泌体以每1*105个EPC所提取的外泌体(为0.1～0.18μg)溶解于1mL生理盐水得到的EPC溶液为1个EPC外泌体使用单位，应对于不同的慢性出血情况，组合不同比例的MKPC溶液和EPC溶液得到辅助治疗的药物制剂，总体积为4mL。具体如表1。
表1不同适应症的组合物中MKPC和EPC外泌体含量比例(按体积计算)
Figure RE-GDA0002392134420000051
实施例2
取上述实施例1的药物制剂胃溃疡动物实验，所述药物制剂含有体积比例为40％的MKPC溶液和体积比例为60％EPC外泌体溶液。
胃粘膜损伤动物模型：24只健康Wistar大鼠，按体重随机分为对照组、MKPC 组、EPC外泌体组和MKPC+EPC外泌体组。
采用乙酸涂抹法制备实验性乙酸致大鼠胃溃疡模型。采用静脉输注进行动物模型治疗。对照组输注4mL生理盐水，MKPC组输注含有MKPC的等量生理盐水溶液(即含有4*105个MKPC的生理盐水溶液)，EPC外泌体组输注含有 EPC外泌体的等量生理盐水溶液(即含有培养4*105个EPC的培养基所分离获得的外泌体的生理盐水溶液)，MKPC+EPC外泌体组按实施例1胃溃疡的比例输注等量的含有MKPC和EPC外泌体(即含有1.6*105个MKPC及培养2.4*105个EPC的培养基所分离获得的外泌体的生理盐水溶液)的生理盐水溶液。
治疗前的胃溃疡指数及治疗后的溃疡抑制率结果如表2。
表2胃溃疡动物实验结果
Figure RE-GDA0002392134420000052
Figure RE-GDA0002392134420000061
由上表可得，MKPC+EPC外泌体组，无论输注后24h还是72h，溃疡抑制率均明显高于单独使用MKPC组或EPC外泌体组；说明MKPC+EPC外泌体的组合能有效抑制胃溃疡，对胃溃疡的治疗效果明显更佳。
实施例3
取上述实施例1的药物制剂肠溃疡动物实验，所述药物制剂含有体积比例为70％的MKPC溶液和体积比例为30％EPC外泌体溶液。
溃疡性结肠炎动物模型：32只健康Wistar大鼠，按体重随机分为对照组、 MKPC组、EPC外泌体组和MKPC+EPC外泌体组。
使用含有150mg/kg三硝基苯磺酸(TNBS)的50％乙醇溶液制备实验性大鼠肠溃疡模型。采用静脉输注进行动物模型治疗，治疗期间为7天，通过PGE2的检测鉴定治疗的结果。对照组输注4mL生理盐水，MKPC组输注含有MKPC 的等量生理盐水溶液(即含有4*105个MKPC的生理盐水溶液)，EPC外泌体组输注含有EPC外泌体的等量生理盐水溶液(即含有培养4*105个EPC的培养基所分离获得的外泌体的生理盐水溶液)，MKPC+EPC外泌体组输注含有70％ MKPC和30％EPC外泌体组合物(即含有2.8*105个MKPC及培养1.2*105个 EPC的培养基所分离获得的外泌体的生理盐水溶液)的生理盐水溶液。对比肠溃疡治疗前后的PGE2含量，结果如下表。
表3肠溃疡动物实验结果
Figure RE-GDA0002392134420000062
Figure RE-GDA0002392134420000071
由上表可得，经过7天的治疗周期，MKPC+EPC外泌体组，治疗后PGE2的下降比例最大，均高于单独使用MKPC组或EPC外泌体组，已接近正常值。说明MKPC+EPC外泌体的组合能有效修复肠部溃疡，对肠溃疡的治疗效果明显更佳。而且EPC外泌体获得的成本远低于MKPC，因此MKPC+EPC外泌体组具有实质性的治疗价值。
所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.一种用于慢性出血辅助治疗的组合物，其特征在于，所述组合物由巨核祖细胞和内皮祖细胞的外泌体组成，所述巨核祖细胞与所述内皮祖细胞外泌体的比例为1*105个：0.07~0.27μg或1*105个：0.07~0.043μg。
2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物中，所述巨核祖细胞与所述内皮祖细胞外泌体的比例为1*105个：0.07~0.27μg。
3.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物中，所述巨核祖细胞和所述内皮祖细胞外泌体的比例为1*105个：0.07~0.043μg。
4.如权利要求1所述的组合在制备慢性出血辅助治疗药物制剂中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述慢性出血包括慢性炎症引起的出血以及胃溃疡或肠溃疡疾病导致的慢性出血。
6.一种慢性出血辅助治疗药物制剂，其特征在于，包括如权利要求1所述的组合物。
7.如权利要求6所述的药物制剂，其特征在于，所述药物制剂为注射剂。
8.如权利要求6所述的药物制剂，其特征在于，还包括药学上可接受的辅料或载体。
9.如权利要求8所述的药物制剂，其特征在于，所述载体为生理盐水。
10.如权利要求6所述药物制剂的制备方法，其特征在于，按配比取一定量的巨核祖细胞、内皮祖细胞外泌体和辅料，加入载体中，混匀即可。
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