CN104316497A - 基于纳米金及lscm反射光模式的细胞成像方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种基于纳米金及LSCM反射光模式的细胞成像方法，该方法将特异性的靶向分子组装到纳米金颗粒表面，在LSCM下可直接观察到该探针，将其与细胞共培养后，可利用LSCM观察细胞内部及表面的纳米金生物探针的数量、分布及形态。本发明方法通过种子生长法制备40-50nm的纳米金，在其表面修饰与细胞表面的特异性受体相对应的靶向分子作为生物探针，该探针能大量的粘附在细胞表面或进入细胞内，将其与细胞共培养，洗涤并固定后，采用LSCM(激光扫描共聚焦显微镜)反射光的模式来观察纳米金的反射光，可以较为便捷的实现细胞的LSCM成像。
Description
技术领域
本发明涉及纳米材料的功能化及应用领域，尤其是一种基于纳米金及LSCM(激光扫描共聚焦显微镜)反射光模式的细胞成像方法。
背景技术
目前，已有许多研究表明纳米金可以作为探针进入生物组织内部探测生物分子的生理功能，进而在分子水平上解释生命过程。由于其良好的生物相容性和无毒副作用，被广泛的应用在生物化学分析，生物分子标记和检测等领域。如纳米金探针在免疫分析中的应用，纳米金探针在单细胞分析中的应用，纳米金探针在靶向药物中的应用，纳米金探针在DNA检测中的应用等，然而在众多应用中，纳米金的光学检测灵敏度仍受到限制，需要结合荧光染料标记法，表面增强拉曼散射等技术来使用，对于其应用造成了局限。
LSCM(Lsaer scanning confocal microscope，激光扫描共聚焦显微镜)是一种先进的分子生物学和细胞生物学研究仪器。它在荧光显微镜成像的基础上加装激光扫描装置，结合数据化图像处理技术，采集组织和细胞内荧光标记图像，在亚细胞水平观察钙等离子水平的变化，并结合电生理等技术观察细胞生理活动与细胞形态及运动变化的相互关系。由于它的应用范围较广泛，已成为形态学、分子细胞生物学、神经科学和药理学等研究领域中很重要的研究技术。但在上述应用中，大部分都需要对目标进行荧光标记，在这过程中，荧光探针在装载及成像过程中易发生荧光淬灭，影响实验结果，并且实验步骤复杂，不易操作。而纳米金作为一种较为稳定的体系，只要在其表面接上靶向分子，则能使其对细胞有特异性的靶向作用，能大量的粘附在细胞表面或进入细胞内，然后采用激光共聚焦反射光的模式来观察纳米金的反射光，可以较为便捷地实现细胞的激光扫描共聚焦显微镜成像。在现有的研究中，尚未见利用激光扫描共聚焦显微镜反射光模式观察纳米金生物探针与细胞相互作用及细胞成像的研究。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种基于纳米金及LSCM反射光模式的细胞成像方法。
本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明提供一种基于纳米金及LSCM反射光模式的细胞成像方法，将特异性的靶向分子组装到纳米金颗粒表面构成探针，在LSCM下可直接观察到该探针，将其与细胞共培养后，可利用LSCM观察细胞内部及表面的纳米金生物探针的数量、分布及形态。
优选地，所述方法包括如下步骤：
(1)采用柠檬酸三钠还原制得金种溶液；
(2)采用种子生长法制得大粒径的纳米金溶液；
(3)将靶向分子加入到步骤(2)制备的纳米金溶液中，混合均匀，进行组装；
(4)组装好的溶液离心洗涤；
(5)洗涤后得到纳米金生物探针，将该探针用细胞培养基重悬浮；
(6)将(5)处理后的纳米金生物探针加入到细胞中，于培养箱中与细胞共培养；
(7)将细胞用缓冲液洗涤并用多聚甲醛固定后，即可在激光共聚焦扫描显微镜下观察成像。
优选地，所述纳米金溶液所用纳米金的粒径为40-50nm；粒径过小，超过激光共聚焦显微镜分辨率；粒径过大，导致所制备探针过大，引起聚集或影响后期应用。
优选地，所述金种溶液的制备方法为：所述金种溶液的制备方法为：将1～5mM柠檬酸三钠溶液100mL加热搅拌，冷凝回流至沸腾，快速注入10～30mM HAuCl4溶液400μL，得到10nm的金种溶液。
优选地，所述纳米金溶液的制备方法为：将所述的金种溶液在原容器中降温至90℃，注入10-30mM HAuCl4溶液400μL，30min反应结束后，重复以上步骤两次；取出22mL样品，注入1-5mM的柠檬酸三钠22mL，作为种子溶液，重复本步骤4-6次，得40-50nm的纳米金溶液。
优选地，所述靶向分子为叶酸、透明质酸、多肽分子中的一种。
优选地，所述离心洗涤的条件为4℃，12000-5000r/min，5min，洗涤液为去离子水；转速过低造成探针的损失，过高可能会引起探针的聚集。
优选地，所述纳米金生物探针与细胞于37℃，体积含量5％CO2的培养箱中共培养时间为30-120min。
优选地，所述激光的波长为488-633nm。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
(1)本发明利用制备的纳米金-靶向分子生物探针应用于细胞的LSCM反射光模式成像，不需要荧光标记，操作简便。纳米金-靶向分子生物探针与细胞表面受体结合明显，在LSCM下能看到细胞表面附着有亮点(激光波长不同，颗粒反射光颜色不同)，而作为对照组的未经靶向分子标记的纳米金细胞与共培养时，细胞表面无明显亮点出现。
(2)本发明方法无需对目标进行荧光标记，避免荧光探针在装载及成像过程中发生淬灭，能直观地观察到纳米生物探针与细胞的识别及相互作用。
(3)本发明采用纳米金作为一种生物相容性极佳的材料，为作为肿瘤细胞靶向治疗的药物载体提供了可能。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为未经靶向分子修饰的纳米金生物探针与细胞共培养后，在LSCM反射光模式下拍摄的照片；
图2为纳米金-靶向分子生物探针与细胞共培养后，在LSCM反射光模式下拍摄的照片。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例1
本实施例涉及一种基于纳米金及LSCM反射光模式的细胞成像方法：具体步骤如下：
(1)2.2mM柠檬酸三钠溶液100mL加热搅拌，冷凝回流至沸腾，快速注入25mMHAuCl4溶液400μL，得到10nm的金种；
(2)在原容器中降温至90℃，注入25mM HAuCl4溶液400μL，约30min后反应结束，该过程重复两次；吸出22mL样品，注入2.2mM的柠檬酸三钠22mL，作为种子溶液，重复以上步骤，约4-6次，可得40-50nm的金胶溶液；
(3)取金胶100μL与100μL 1mM巯基修饰的HA溶液室温下搅拌60min，所得溶液于4℃，8000r/min离心5min，去上清；
(4)用去离子水洗涤3遍；
(5)用100μL细胞培养基重悬；
(6)将纳米金-HA生物探针及未经HA修饰的纳米金分别加入到两个含900μL培养基的结肠癌细胞培养皿中，于37℃，5％CO2的培养箱中培养60min培养；
(7)用pH＝7.4的PBS缓冲液洗涤三遍，并用多聚甲醛固定30min后洗涤；将细胞放置LSCM下，调反射光模式，采用488nm激光拍摄。
实施例2
本实施例涉及一种基于纳米金及LSCM反射光模式的细胞成像方法：具体步骤如下：
(1)2.2mM柠檬酸三钠溶液100mL加热搅拌，冷凝回流至沸腾，快速注入25mMHAuCl4溶液400μL，得到10nm的金种；
(2)在原容器中降温至90℃，注入25mM HAuCl4溶液400μL，约30min后反应结束，该过程重复两次；吸出22mL样品，注入2.2mM的柠檬酸三钠22mL，作为种子溶液，重复以上步骤，约4-6次，可得45nm的金胶溶液；
(3)取金胶100μL与100μL 1mM巯基修饰的HA溶液室温下搅拌60min，所得溶液于4℃，8000r/min离心5min，去上清；
(4)用去离子水洗涤3遍；
(5)用100μL细胞培养基重悬；
(6)将纳米金-HA生物探针及未经HA修饰的纳米金分别加入到两个含900μL培养基的结肠癌细胞培养皿中，于37℃，5％CO2的培养箱中培养60min；
(7)用pH＝7.4的PBS缓冲液洗涤三遍，并用多聚甲醛固定30min后洗涤，将细胞放置LSCM下，调反射光模式，采用532nm激光拍摄。
实施例3
本实施例涉及一种基于纳米金及LSCM反射光模式的细胞成像方法：具体步骤如下：
(1)2.2mM柠檬酸三钠溶液100mL加热搅拌，冷凝回流至沸腾，快速注入25mMHAuCl4溶液400μL，得到10nm的金种；
(2)在原容器中降温至90℃，注入25mM HAuCl4溶液400μL，约30min后反应结束，该过程重复两次；吸出22mL样品，注入2.2mM的柠檬酸三钠22mL，作为种子溶液，重复以上步骤，约4-6次，可得40-50nm的金胶溶液；
(3)取金胶100μL与100μL 1mM巯基修饰的HA溶液室温下搅拌60min，所得溶液于4℃，8000r/min离心5min，去上清；
(4)用去离子水洗涤3遍；
(5)用100μL细胞培养基重悬；
(6)将纳米金-HA生物探针及未经HA修饰的纳米金分别加入到两个含900μL培养基的结肠癌细胞培养皿中，于37℃，5％CO2的培养箱中培养60min；
(7)用pH＝7.4的PBS缓冲液洗涤三遍，并用多聚甲醛固定30min后洗涤，将细胞放置LSCM下，调反射光模式，采用633nm激光拍摄。
实施例4
本实施例涉及一种基于纳米金及LSCM反射光模式的细胞成像方法：具体步骤如下：
(1)1mM柠檬酸三钠溶液100mL加热搅拌，冷凝回流至沸腾，快速注入10mMHAuCl4溶液400μL，得到10nm的金种；
(2)在原容器中降温至90℃，注入10mM HAuCl4溶液400μL，约30min后反应结束，该过程重复两次；吸出22mL样品，注入1mM的柠檬酸三钠22mL，作为种子溶液，重复以上步骤，约4-6次，可得40-50nm的金胶溶液；
(3)取金胶100μL与100μL 1mM巯基修饰的HA溶液室温下搅拌60min，所得溶液于4℃，8000r/min离心5min，去上清；
(4)用去离子水洗涤3遍；
(5)用100μL细胞培养基重悬；
(6)将纳米金-HA生物探针及未经HA修饰的纳米金分别加入到两个含900μL培养基的结肠癌细胞培养皿中，于37℃，5％CO2的培养箱中培养60min培养；
(7)用pH＝7.4的PBS缓冲液洗涤三遍，并用多聚甲醛固定30min后洗涤；将细胞放置LSCM下，调反射光模式，采用488nm激光拍摄。
实施例5
本实施例涉及一种基于纳米金及LSCM反射光模式的细胞成像方法：具体步骤如下：
(1)5mM柠檬酸三钠溶液100mL加热搅拌，冷凝回流至沸腾，快速注入50mMHAuCl4溶液400μL，得到10nm的金种；
(2)在原容器中降温至90℃，注入50mM HAuCl4溶液400μL，约30min后反应结束，该过程重复两次；吸出22mL样品，注入5mM的柠檬酸三钠22mL，作为种子溶液，重复以上步骤，约4-6次，可得40-50nm的金胶溶液；
(3)取金胶100μL与100μL 1mM巯基修饰的HA溶液室温下搅拌60min，所得溶液于4℃，8000r/min离心5min，去上清；
(4)用去离子水洗涤3遍；
(5)用100μL细胞培养基重悬；
(6)将纳米金-HA生物探针及未经HA修饰的纳米金分别加入到两个含900μL培养基的结肠癌细胞培养皿中，于37℃，5％CO2的培养箱中培养60min培养；
(7)用pH＝7.4的PBS缓冲液洗涤三遍，并用多聚甲醛固定30min后洗涤；将细胞放置LSCM下，调反射光模式，采用488nm激光拍摄。
实施例6
本实施例涉及一种基于纳米金及LSCM反射光模式的细胞成像方法：具体步骤如下：
(1)2.2mM柠檬酸三钠溶液100mL加热搅拌，冷凝回流至沸腾，快速注入25mMHAuCl4溶液400μL，得到10nm的金种；
(2)在原容器中降温至90℃，注入25mM HAuCl4溶液400μL，约30min后反应结束，该过程重复两次；吸出22mL样品，注入2.2mM的柠檬酸三钠22mL，作为种子溶液，重复以上步骤，约4-6次，可得40-50nm的金胶溶液；
(3)取金胶100μL与100μL 1mM巯基修饰的FA溶液室温下搅拌60min，所得溶液于4℃，8000r/min离心5min，去上清；
(4)用去离子水洗涤3遍；
(5)用100μL细胞培养基重悬；
(6)将纳米金-FA生物探针及未经FA修饰的纳米金分别加入到两个含900μL培养基的肺腺癌细胞培养皿中，于37℃，5％CO2的培养箱中培养60min；
(7)用pH＝7.4的PBS缓冲液洗涤三遍，并用多聚甲醛固定30min后洗涤，将细胞放置LSCM下，调反射光模式，采用488nm激光拍摄。
实施例7
本实施例涉及一种基于纳米金及LSCM反射光模式的细胞成像方法：具体步骤如下：
(1)2.2mM柠檬酸三钠溶液100mL加热搅拌，冷凝回流至沸腾，快速注入25mMHAuCl4溶液400μL，得到10nm的金种；
(2)在原容器中降温至90℃，注入25mM HAuCl4溶液400μL，约30min后反应结束，该过程重复两次；吸出22mL样品，注入2.2mM的柠檬酸三钠22mL，作为种子溶液，重复以上步骤，约4-6次，可得40-50nm的金胶溶液；
(3)取金胶100μL与100μL 1mM巯基修饰的FA溶液室温下搅拌60min，所得溶液于4℃，8000r/min离心5min，去上清；
(4)用去离子水洗涤3遍；
(5)用100μL细胞培养基重悬；
(6)将纳米金-FA生物探针及未经FA修饰的纳米金分别加入到两个含900μL培养基的肺腺癌细胞培养皿中，于37℃，5％CO2的培养箱中培养60min；
(7)用pH＝7.4的PBS缓冲液洗涤三遍，并用多聚甲醛固定30min后洗涤，将细胞放置LSCM下，调反射光模式，采用633nm激光拍摄。
实施例8
本实施例涉及一种基于纳米金及LSCM反射光模式的细胞成像方法：具体步骤如下：
(1)2.2mM柠檬酸三钠溶液100mL加热搅拌，冷凝回流至沸腾，快速注入25mMHAuCl4溶液400μL，得到10nm的金种；
(2)在原容器中降温至90℃，注入25mM HAuCl4溶液400μL，约30min后反应结束，该过程重复两次；吸出22mL样品，注入2.2mM的柠檬酸三钠22mL，作为种子溶液，重复以上步骤，约4-6次，可得40-50nm的金胶溶液；
(3)取金胶100μL，用0.1M的NaOH调节pH为10，加入2％的多肽溶液10μL，室温下组装30min，所得溶液于4℃，8000r/min离心5min，去上清；
(4)用去离子水洗涤3遍；
(5)用100μL细胞培养基重悬；
(6)将纳米金-多肽生物探针及未经多肽修饰的纳米金分别加入到两个含900μL培养基的神经胶质瘤细胞培养皿中，于37℃，5％CO2的培养箱中培养60min；
(7)用pH＝7.4的PBS缓冲液洗涤三遍，并用多聚甲醛固定30min后洗涤，将细胞放置LSCM下，调反射光模式，采用488nm激光拍摄。
实施例9
本实施例涉及一种基于纳米金及LSCM反射光模式的细胞成像方法：具体步骤如下：
(1)2.2mM柠檬酸三钠溶液100mL加热搅拌，冷凝回流至沸腾，快速注入25mMHAuCl4溶液400μL，得到10nm的金种；
(2)在原容器中降温至90℃，注入25mM HAuCl4溶液400μL，约30min后反应结束，该过程重复两次；吸出22mL样品，注入2.2mM的柠檬酸三钠22mL，作为种子溶液，重复以上步骤，约4-6次，可得40-50nm的金胶溶液；
(3)取金胶100μL，用0.1M的NaOH调节pH为10，加入2％的多肽溶液10μL，室温下组装30min，所得溶液于4℃，8000r/min离心5min，去上清；
(4)用去离子水洗涤3遍；
(5)用100μL细胞培养基重悬；
(6)将纳米金-多肽生物探针及未经多肽修饰的纳米金分别加入到两个含900μL培养基的神经胶质瘤细胞培养皿中，于37℃，5％CO2的培养箱中培养60min；
(7)用pH＝7.4的PBS缓冲液洗涤三遍，并用多聚甲醛固定30min后洗涤，将细胞放置LSCM下，调反射光模式，采用633nm激光拍摄。
对比例
每个实施例步骤(6)中均设有对照组。图1为未经修饰的金与细胞共培养后的LSCM反射光模式成像，图2为经靶向分子修饰后的金与细胞共培养后的LSCM反射光模式成像。从图1-2对比可看出，由于细胞表面含有靶向分子的受体，经该靶向分子修饰后的金与受体识别并大量富集到细胞表面(即图2中白色亮点区域)，实现了细胞的成像；作为对比，图1中基本看不到白色亮点的富集区。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。
Claims (8)
1.一种基于纳米金及LSCM反射光模式的细胞成像方法，其特征在于，将特异性的靶向分子组装到纳米金颗粒表面构成探针，在LSCM下可直接观察到该探针与细胞共培养后，利用LSCM观察细胞内部及表面的纳米金生物探针的数量、分布及形态；所述方法包括如下步骤：
(1)采用柠檬酸三钠还原制得金种溶液；
(2)采用种子生长法制得大粒径的纳米金溶液；
(3)将靶向分子加入到步骤(2)制备的纳米金溶液中，混合均匀，进行组装；
(4)组装好的溶液离心洗涤；
(5)洗涤后得到纳米金生物探针，将该探针用细胞培养基重悬浮；
(6)将(5)处理后的纳米金生物探针加入到细胞中，于培养箱中与细胞共培养；
(7)将细胞用缓冲液洗涤并用多聚甲醛固定后，即可在激光共聚焦扫描显微镜下观察成像。
2.如权利要求1所述的基于纳米金及LSCM反射光模式的细胞成像方法，其特征在于，所述纳米金溶液所用纳米金的粒径为40-50nm。
3.如权利要求1所述的基于纳米金及LSCM反射光模式的细胞成像方法，其特征在于，所述金种溶液的制备方法为：将1-5mM柠檬酸三钠溶液100mL加热搅拌，冷凝回流至沸腾，快速注入10-30mM HAuCl4溶液400μL，得到10nm的金种溶液。
4.如权利要求1所述的基于纳米金及LSCM反射光模式的细胞成像方法，其特征在于，所述纳米金溶液的制备方法为：将所述的金种溶液在原容器中降温至90℃，注入10-30mM HAuCl4溶液400μL，30min反应结束后，重复以上步骤两次；取出22mL样品，注入1-5mM的柠檬酸三钠22mL，作为种子溶液，重复本步骤4-6次，得40-50nm的纳米金溶液。
5.如权利要求1任一项所述的基于纳米金及LSCM反射光模式的细胞成像方法，其特征在于，所述靶向分子为叶酸、透明质酸、多肽分子中的一种。
6.如权利要求1-5任一项所述的基于纳米金及LSCM反射光模式的细胞成像方法，其特征在于，所述离心洗涤的条件为4℃，12000-5000r/min，5min，洗涤液为去离子水。
7.如权利要求1-5任一项所述的基于纳米金及LSCM反射光模式的细胞成像方法，其特征在于，所述纳米金生物探针与细胞于37℃，体积含量5％CO2的培养箱中共培养时间为30-120min。
8.如权利要求1-5任一项所述的基于纳米金及LSCM反射光模式的细胞成像方法，其特征在于，所述激光的波长为488-633nm。
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