CN106153506A

CN106153506A - 一种含钆羟基磷灰石纳米颗粒的检测方法

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Publication number: CN106153506A
Application number: CN201510177019.8A
Authority: CN
Inventors: 袁兰; 黄健; 袁帅军
Original assignee: Peking University
Current assignee: Peking University
Priority date: 2015-04-15
Filing date: 2015-04-15
Publication date: 2016-11-23
Anticipated expiration: 2035-04-15
Also published as: CN106153506B

Abstract

本发明提供了一种含钆羟基磷灰石纳米颗粒的检测方法，包括：准备待测样品，待测样品中含有含钆羟基磷灰石纳米颗粒和/或带有荧光标记的含钆羟基磷灰石纳米颗粒；用激光照射待测样品，并采集反射光；以及根据采集到的反射光形成图像或光谱曲线。本方法可对含钆羟基磷灰石纳米颗粒进行连续的、长时间的实时追踪和定位成像。

Description

一种含钆羟基磷灰石纳米颗粒的检测方法

技术领域

本发明涉及一种含钆羟基磷灰石纳米颗粒的检测方法，尤其是一种含钆羟基磷灰石纳米颗粒的激光成像检测方法。

背景技术

羟基磷灰石和人体及动物的骨骼和牙齿的无机成分相似，近年来吸引了生物材料各领域的广泛关注。三价钆离子（Gadolinium ions ，Gd³⁺）具有和钙离子（Ca²⁺）相似的生物无机化学性质和协调性。Gd³⁺能够影响骨骼的改造周期，并且具有潜在治疗骨质疏松症等等疾病。将羟基磷灰石和一定量的Gd³⁺结合，合成分子式为Ca_10-xGd_x(PO₄)₆(OH)_y的含钆羟基磷灰石，有望优化其生物化学特性。

含钆羟基磷灰石作用于生物体主要通过纳米颗粒的形式，对一系列含钆羟基磷灰石纳米颗粒分别进行成像和检测，正是对其生物化学特性研究的一个重要环节。现有针对纳米颗粒成像方法主要包括：扫描电镜、透射电镜、激光扫描共聚焦显微镜（Confocal laser scanning microscope，CLSM）等。然而，扫描电镜和透射电镜难以用于活细胞中纳米颗粒的检测。采用CLSM法，在对活细胞观察中，可以实时追踪定位生物粒子或者化学药物被活细胞或组织摄取的过程，多荧光通道定量分析生物粒子的数量及荧光强度，在一张图像里不同通道可选用不同的伪彩色，以及多层面采集图像合成三维立体图等。

在CLSM下检测纳米颗粒时，现有的方法是在纳米颗粒的表面进行荧光标记。针对含钆羟基磷灰石纳米颗粒（nano-HA-Gd）的检测，人们经常用一种荧光探针FITC（fluorescein isothiocyanate）结合APTS（（3-aminopropyl）triethoxysilane）标记在nano-HA-Gd上。这种方法存在以下两方面主要缺陷：第一，被荧光物质标记后的nano-HA-Gd的物理化学性质会改变，例如其表面的活性官能团被荧光化合物占据、表面电荷改变、粒径改变，与细胞的相互作用与未用荧光标记的nano-HA-Gd本身的作用有所不同，因此不能体现nano-HA-Gd生物效应最真实、原始的特性，从而影响对待测的nano-HA-Gd生物效应的判断；第二，存在光漂白的问题：由于绝大多数荧光物质在经过长时间、连续的激光照射后荧光强度会明显减弱，不能够长时间在CLSM下准确检测，因此成像、定量时不可避免地产生系统误差。为此，亟待建立一种准确的检测方法来实时追踪含钆羟基磷灰石纳米颗粒，同时不影响其生物化学特性。

发明内容

本发明的目的是提供一种含钆羟基磷灰石纳米颗粒的检测方法，可对含钆羟基磷灰石纳米颗粒进行连续的、长时间的实时追踪和定位成像。

本发明的另一个目的是提供一种含钆羟基磷灰石纳米颗粒的检测方法，可以实时动态监测活细胞中的含钆羟基磷灰石纳米颗粒。

本发明提供了一种含钆羟基磷灰石纳米颗粒的检测方法，包括：准备待测样品，待测样品中含有含钆羟基磷灰石纳米颗粒和/或带有荧光标记的含钆羟基磷灰石纳米颗粒；用激光照射待测样品，并采集反射光；以及根据采集到的反射光形成图像、光谱曲线和/或定量数据。

在含钆羟基磷灰石纳米颗粒的检测方法的另一种示意性实施方式中，用激光照射时，使用的激光的波长为200nm至1050nm范围内的任一波长。

在含钆羟基磷灰石纳米颗粒的检测方法的再一种示意性实施方式中，用激光照射时，使用的激光的波长为361nm，364nm，405nm，458nm，488nm，514nm，543nm，561nm和633nm中的任一波长。

在含钆羟基磷灰石纳米颗粒的检测方法的还一种示意性实施方式中，采集图像使用的扫描波长范围为200nm至1050nm，步距为0.2~50nm。

在含钆羟基磷灰石纳米颗粒的检测方法的还一种示意性实施方式中，准备待测样品的步骤包括：先将含有含钆羟基磷灰石纳米颗粒和/或带有荧光标记的含钆羟基磷灰石纳米颗粒的待测物悬浮于无水乙醇中，再滴加在容器表面，待乙醇挥发后，得到待测样品。

在含钆羟基磷灰石纳米颗粒的检测方法的还一种示意性实施方式中，准备待测样品的步骤包括：将含有含钆羟基磷灰石纳米颗粒和/或带有荧光标记的含钆羟基磷灰石纳米颗粒的待测物悬浮于水、盐溶液、缓冲液或液体培养基中，得到待测样品。

在含钆羟基磷灰石纳米颗粒的检测方法的还一种示意性实施方式中，准备待测样品的步骤包括：将含钆羟基磷灰石纳米颗粒和/或带有荧光标记的含钆羟基磷灰石纳米颗粒与细胞共培养，得到待测样品。

在含钆羟基磷灰石纳米颗粒的检测方法的还一种示意性实施方式中，准备待测样品的步骤还包括：将细胞的细胞质、细胞膜、细胞器和/或细胞核分别用荧光探针标记；当用激光照射待测样品时，同时采集反射光和荧光，并根据采集到的反射光和荧光形成图像及光谱曲线。

在含钆羟基磷灰石纳米颗粒的检测方法的还一种示意性实施方式中，准备待测样品的步骤包括：先将细胞的细胞质、细胞膜、细胞器和/或细胞核用荧光探针标记，再将细胞与含钆羟基磷灰石纳米颗粒和/或带有荧光标记的含钆羟基磷灰石纳米颗粒共培养；或是先将细胞与含钆羟基磷灰石纳米颗粒和/或带有荧光标记的含钆羟基磷灰石纳米颗粒共培养，再将细胞的细胞质、细胞膜、细胞器和/或细胞核用荧光探针标记。

在含钆羟基磷灰石纳米颗粒的检测方法的还一种示意性实施方式中，准备待测样品的步骤包括：先将细胞与含钆羟基磷灰石纳米颗粒和/或带有荧光标记的含钆羟基磷灰石纳米颗粒共培养，再将细胞用甲醛溶液固定，最后将细胞的细胞质、细胞膜、细胞器和/或细胞核用荧光探针标记。

在含钆羟基磷灰石纳米颗粒的检测方法的还一种示意性实施方式中，根据采集到反射光和荧光形成图像包括：成像、定量、实时定量及成像、三维成像、xyz/xzy切面成像、1~5个通道同时采集图像、光漂白实验、光谱扫描曲线。

在含钆羟基磷灰石纳米颗粒的检测方法的还一种示意性实施方式中，待测样品中含有带有荧光标记的含钆羟基磷灰石纳米颗粒；当用激光照射待测样品时，同时采集反射光和荧光，并根据采集到的反射光和荧光形成图像及光谱曲线。

在含钆羟基磷灰石纳米颗粒的检测方法的还一种示意性实施方式中，荧光标记为异硫氰酸荧光素。

在含钆羟基磷灰石纳米颗粒的检测方法的还一种示意性实施方式中，通过激光扫描共聚焦显微镜实施激光照射及采集。

在含钆羟基磷灰石纳米颗粒的检测方法的还一种示意性实施方式中，其包括：先用激光照射含钆羟基磷灰石纳米颗粒和/或带有荧光标记的含钆羟基磷灰石纳米颗粒的浓度梯度标准品，并采集反射光，根据采集到的反射光形成图像及光谱曲线，并提取光信号面积，结合浓度梯度标准品对应的浓度，绘制标准曲线；再用激光照射待测样品，并采集反射光，根据采集到的反射光形成图像及光谱曲线，并提取光信号面积；以及根据待测样品对应的光信号面积及标准曲线，得到待测样品中含钆羟基磷灰石纳米颗粒和/或带有荧光标记的含钆羟基磷灰石纳米颗粒的浓度。

本发明提供的含钆羟基磷灰石纳米颗粒的检测方法，通过激光照射待测样品并采集反射光，再根据反射光形成图像及光谱曲线，以此检测待测样品中的含钆羟基磷灰石纳米颗粒或带有荧光标记的含钆羟基磷灰石纳米颗粒。本发明的含钆羟基磷灰石纳米颗粒的检测方法有以下优点：

1) 含钆羟基磷灰石纳米颗粒和带有荧光标记的含钆羟基磷灰石纳米颗粒在激光照射下的反射光的波长和其激发波长相同，光谱中显示反射光的强度峰窄而锐，检测准确度高；

2) 光面积-浓度标准曲线的线性良好，证明反射光能够准确成像并定量含钆羟基磷灰石纳米颗粒和/或带有荧光标记的含钆羟基磷灰石纳米颗粒；

3) 在水、盐溶液、缓冲液、培养基中的含钆羟基磷灰石纳米颗粒和带有荧光标记的含钆羟基磷灰石纳米颗粒均能够在激光的反射光下稳定的成像、定量、实时定量及成像、三维成像、xyz/xzy切面成像、多通道共定位，且在光漂白实验中表现出较好的光稳定性；

4) 含钆羟基磷灰石纳米颗粒或带有荧光标记的含钆羟基磷灰石纳米颗粒与细胞共培养后，利用激光在含钆羟基磷灰石纳米颗粒或带有荧光标记的含钆羟基磷灰石纳米颗粒上的反射光，能够实时追踪、定位、观察含钆羟基磷灰石纳米颗粒或带有荧光标记的含钆羟基磷灰石纳米颗粒被细胞摄取的过程、颗粒的分布、聚集的状态、聚集的量，细胞的状态，还能进行成像、定量、实时定量及成像、三维成像、xyz/xzy切面成像、多通道共定位、光漂白实验；

5) 含钆羟基磷灰石纳米颗粒或带有荧光标记的含钆羟基磷灰石纳米颗粒与细胞共培养后，细胞质、细胞膜、细胞器和/或细胞核经过荧光探针标记，并不影响含钆羟基磷灰石纳米颗粒或带有荧光标记的含钆羟基磷灰石纳米颗粒的成像，激光在含钆羟基磷灰石纳米颗粒或带有荧光标记的含钆羟基磷灰石纳米颗粒上的反射光，能够与其他标记的荧光成像、定量、实时定量及成像、三维成像、xyz/xzy切面成像、多通道共定位、光漂白实验；

6) 含钆羟基磷灰石纳米颗粒或带有荧光标记的含钆羟基磷灰石纳米颗粒与细胞共培养后，将细胞固定后再将其细胞质、细胞膜、细胞器和/或细胞核经过荧光探针标记，激光在含钆羟基磷灰石纳米颗粒或带有荧光标记的含钆羟基磷灰石纳米颗粒上的反射光仍能够与荧光探针成像、定量、实时定量及成像、三维成像、xyz/xzy切面成像、多通道共定位、光漂白实验。含钆羟基磷灰石纳米颗粒或带有荧光标记的含钆羟基磷灰石纳米颗粒经强烈的激光连续照射后，其反射光通道的图像仍然清晰可见，光强几乎不变，而来自其他荧光标记物的荧光强度则明显减弱，证实了反射光图像几乎不受光漂白的影响，具有很好的光稳定性；

7) 在含钆羟基磷灰石纳米颗粒或带有荧光标记的含钆羟基磷灰石纳米颗粒与细胞共培养后，培养物中的含钆羟基磷灰石纳米颗粒或带有荧光标记的含钆羟基磷灰石纳米颗粒通过激光照射所得的反射光，结合细胞中的多种荧光标记物质（例如对细胞质和细胞核进行荧光标记的物质）产生的荧光，可用于定位含钆羟基磷灰石纳米颗粒或带有荧光标记的含钆羟基磷灰石纳米颗粒，能够反应出最真实、准确的含钆羟基磷灰石纳米颗粒或带有荧光标记的含钆羟基磷灰石纳米颗粒被活细胞或组织摄取的全部过程。

附图说明

以下附图仅对本发明做示意性说明和解释，并不限定本发明的范围。

图1为nano-HA-Gd(a)，nano-HA-Gd-FITC(b) 和 FITC 溶液(c)在CLSM下400至650nm波长范围内的光谱图。

图2为CLSM的反射光通道和FITC通道光路示意图以及nano-HA-Gd(a)，nano-HA-Gd-FITC(b) 和 FITC 溶液(c)在上述通道下的成像。

图3 为nano-HA-Gd和nano-HA-Gd-FITC在CLSM的反射光通道和FITC通道下各呈现的成像面积和浓度之间的线性关系。(a) 反射光通道测量的nano-HA-Gd标准曲线，(b) 反射光通道测量的nano-HA-Gd-FITC标准曲线，(c) FITC通道测量的nano-HA-Gd-FITC标准曲线。

图4为 nano-HA-Gd与BMSCs共培养2、6、12、24小时CLSM的反射光通道的实时成像图。

图5为 nano-HA-Gd-FITC与BMSCs共培养2、6、12、24小时的实时成像图。(A)反射光通道，(B)FITC通道。

图6为nano-HA-Gd与BMSCs共培养一段时间后，CLSM采集细胞微丝-细胞核-nano-HA-Gd成像图。(b)是(a)的放大图像， (c)是(b)的xzy纵切图像。

图7 为nano-HA-Gd被BMSCs摄取后，CLSM采集细胞微丝-细胞核-nano-HA-Gd延z轴连续扫描各层细胞样品的图像。(a) Rhodamine phalloidin通道，(b) Hoechst33258通道，(c) 反射光通道，（d）a，b，c的叠加图。

图8 nano-HA-Gd-FITC与BMSCs共培养一段时间后，CLSM采集细胞质-细胞核-nano-HA-Gd-FITC成像图。(a)CMTMR通道，(b)Hoechst33342通道，(c) 反射光通道，(d) FITC通道，（e）a，b，c，d的叠加图。(II)是(I)的xzy纵切图像。

图9为nano-HA-Gd-FITC被BMSCs摄取后，CLSM采集细胞质-细胞核-nano-HA-Gd-FITC延z轴连续扫描各层细胞样品的图像。(a)CMTMR通道，(b)Hoechst33342通道，(c) 反射光通道，(d) FITC通道，（e）a，b，c，d的叠加图。

图10为光漂白前后各个通道图像，(a)CMTMR通道，(b)Hoechst33342通道，(c) 反射光通道，(d) FITC通道，（e）a，b，c，d的叠加图。

图11为光漂白区域的实时动态监测图像，(a)CMTMR通道，(b)Hoechst33342通道，(c) 反射光通道，(d) FITC通道，（e）a，b，c，d的叠加图。

图12为光漂白区域的各通道光强度的定量曲线，(a)CMTMR通道，(b)Hoechst33342通道，(c) 反射光通道，(d) FITC通道。

具体实施方式

为了对发明的技术特征、目的和效果有更加清楚的理解，现结合以下实施例说明本发明的具体实施方式。

本发明使用的nano-HA-Gd（含钆羟基磷灰石纳米颗粒）的制备：以CaHPO₄ 和Ca(OH)₂为起始原料，按Ca：P=1.67：1 的配比混合，加一定量的GdCl₃(8 x10^-5 mol/mol, Gd³⁺/Ca²⁺)，溶解于去离子水，分别用冰醋酸溶液或KOH溶液调pH值为9，搅拌30min，然后放入聚四氟乙烯的高压釜中，水热条件下加热至140℃反应24小时，然后将高压釜冷却至室温，离心，用无水乙醇洗涤, 在60至100 ℃下烘干。使用前经120℃高压灭菌30分钟。

此外，也可通过市购获得nano-HA-Gd。

nano-HA-Gd的荧光标记：取nano-HA-Gd 10mg，混悬于装有10ml无水乙醇的圆底烧瓶中，超声30分钟后，加入0.25mlAPTS（3-氨丙基三乙氧基硅烷）及50ul三蒸水，密封后室温搅拌24小时。收集全部液体，10000r/min离心30分钟，甲醇洗沉淀3遍。将沉淀加入到5ml无水甲醇中，超声10分钟后转移至圆底烧瓶中，加5mgFITC（异硫氰酸荧光素）（用DMSO稀释50mgFITC粉末至50mg/ml），密封，避光室温搅拌24小时。收集全部液体，10000r/min离心30分钟，甲醇洗沉淀5次，室温挥干，得到荧光标记的羟基磷灰石纳米颗粒（nano-HA-Gd-FITC）。整个过程须在避光下操作，所得产物在-20℃避光保存。

以下实施例中使用的激光扫描共聚焦显微镜（CLSM）为Leica TCS SP2。

实施例 1 ：干燥的 nano-HA-Gd 用 CLSM 检测及光谱扫描。

将少量nano-HA-Gd悬浮于少量无水乙醇中，滴加在CLSM玻璃皿中，待无水乙醇挥干，置于CLSM镜下。在光谱扫描过程，激发光波长可设置为200nm至1050nm范围内的任何一个或者几个激发波长，检测波长范围可设置为200nm至1050nm范围内的、包含激发波长的检测波长范围。此实施例中选择四种波长的激光：UV-405nm，Ar-488nm，Kr-561nm，HeNe-633nm，检测波长范围设为400nm至650nm，步距为2nm，绘制光强-波长曲线。

检测结果如图1中(a)所示，为nano-HA-Gd在400-650nm的接收波长范围内的发射光谱图。在nano-HA-Gd光谱图上405，488，561，633nm处都有一个尖锐的峰，峰宽只有约5nm，这些峰都处在其激发波长的位置。

实施例 2 ：干燥的 nano-HA-Gd-FITC 用 CLSM 检测及光谱扫描。

将少量nano-HA-Gd-FITC悬浮于少量无水乙醇中，滴加在CLSM玻璃皿中，待无水乙醇挥干，置于CLSM镜下。以FITC溶液作为对照组。在光谱扫描过程，激发光波长可设置为200nm至1050nm范围内的任何一个或者几个激发波长，其中包括FITC的激发波长，检测波长范围可设置为200nm至1050nm范围内的、包含激发波长及FITC检测波长的检测波长范围。此实施例中选择四种波长的激光：UV-405nm，Ar-488nm，Kr-561nm，HeNe-633nm，检测波长范围设为400nm至650nm，步距为2nm，绘制光强-波长曲线。

检测结果如图1中 (b) 和(c)所示，分别为nano-HA-Gd-FITC和FITC溶液在400-650nm的接收波长范围内的发射光谱图。其中(b)代表nano-HA-Gd-FITC，(c)代表FITC溶液。在nano-HA-Gd-FITC光谱图上405，488，561，633nm处都有一个尖锐的峰，峰宽只有约5nm，这些峰都处在其激发波长的位置。在nano-HA-Gd-FITC光谱图中，除了这四组峰，在520nm处有一个很宽的峰，这组峰的位置和形状与FITC溶液的光谱中的峰一致，是FITC的发射光谱（FITC于488nm处激发）。

图2是CLSM的反射光通道（561nm处激发，561nm处检测其反射光）和FITC通道（488nm处激发，520nm附近检测其荧光）光路示意图，以及实施例1和2中nano-HA-Gd(a)，nano-HA-Gd-FITC(b) 和 FITC溶液(c)在上述通道下的成像。当被激光照射时，nano-HA-Gd能够用激光的反射光波长成像，FITC荧光通道下无任何荧光；nano-HA-Gd-FITC既能够在激发光位置处检测到反射光图像，又能表现出FITC荧光性质得到荧光图像；而FITC溶液只呈现荧光图像。

将nano-HA-Gd或nano-HA-Gd-FITC悬浮于溶液（例如磷酸盐缓冲液或液体培养基）中，置于CLSM镜下。在光谱扫描过程中打开CLSM四组激发光源通道，发出四种波长的激光：UV-405nm，Ar-488nm，Kr-561nm，HeNe-633nm，检测波长范围设为400nm至650nm，步距为3nm，绘制光强-波长曲线。其检测结果与干燥的nano-HA-Gd或nano-HA-Gd-FITC的CLSM光谱扫描结果一致。

实施例 3 ：干燥的 nano-HA-Gd 的定量分析。

1、操作步骤：

1.1、将nano-HA-Gd用乙醇对其逐级稀释，分别依次向CLSM玻璃皿中加一滴混悬乙醇液，待乙醇挥发，在CLSM下用反射光通道（以一组激发光的反射光为例，561nm处激发，561nm处检测其反射光）对其成像；通过图像分析仪对图像提取光信号面积，结合对应的浓度比率，绘制标准曲线；

1.2、将含有nano-HA-Gd的待测物用乙醇稀释，向CLSM玻璃皿中加一滴混悬乙醇液，待乙醇挥发，在CLSM下用反射光通道对其成像；通过图像分析仪对图像提取光信号面积，并对应标准曲线，得出待测物中nano-HA-Gd的浓度。

用反射光通道能检测到nano-HA-Gd的光面积随浓度呈现良好的线性，这些结果表明反射光信号能够用于定量分析，且本方法具有较好的检测回收率。

实施例 4 ：干燥的 nano-HA-Gd-FITC 的定量分析。

1、操作步骤：

1.1、将nano-HA-Gd-FITC用乙醇对其逐级稀释，分别依次向CLSM玻璃皿中加一滴混悬乙醇液，待乙醇挥发，在CLSM下用FITC通道（488nm处激发，在520nm附近检测其荧光）和反射光通道（以一组激发光的反射光为例，561nm处激发，561nm处检测其反射光）对其成像；通过图像分析仪对图像提取光信号面积，结合对应的浓度比率，分别绘制对应于FITC通道和反射光通道的两个标准曲线；

1.2、将含有nano-HA-Gd-FITC的待测物用乙醇稀释，向CLSM玻璃皿中加一滴混悬乙醇液，待乙醇挥发，在CLSM下用FITC通道和反射光通道对其成像；通过图像分析仪对图像提取光信号面积，并分别对应FITC通道和反射光通道的两个标准曲线，得出待测物中nano-HA-Gd的浓度。FITC通道和反射光通道得出的检测结果可以相互验证。

用反射光通道能检测到nano-HA-Gd-FITC的光面积随浓度呈现良好的线性，这些结果表明反射光信号能够用于定量分析，且本方法具有较好的检测回收率。

实施例 5 ：溶液中 nano-HA-Gd 的定量分析。

1、操作步骤：

1.1、将nano-HA-Gd混悬于三蒸水中得到初始浓度为64mg/mL的混悬液，用三蒸水对其逐级稀释，分别依次向CLSM玻璃皿中加20ul混悬液，在CLSM下用反射光通道（以一组激发光的反射光为例，561nm处激发，561nm处检测其反射光）对其成像；通过图像分析仪对图像提取光信号面积，结合对应的浓度，绘制标准曲线；

1.2、将含有nano-HA-Gd的水溶液、磷酸盐缓冲液或液体培养基作为待测物，滴加至CLSM玻璃皿中，在CLSM下用反射光通道对其成像；通过图像分析仪对图像提取光信号面积，并对应标准曲线，分别得出待测物中nano-HA-Gd的浓度。

2、标准曲线：

图3中（a）为溶液中的nano-HA-Gd在CLSM的反射光通道下呈现的成像面积和浓度之间的线性关系。如图所示，用反射光通道能检测到nano-HA-Gd的光面积随浓度呈现良好的线性，这些结果表明反射光信号能够用于定量分析。

3、方法回收率：

分别向空白磷酸盐缓冲液和培养基中添加一定量的nano-HA-Gd粉末，使其分别达到如下表所示的nano-HA-Gd浓度，制成空白加样样本。利用本检测方法对空白加样样本进行检测，根据检测结果计算本检测方法的回收率。计算结果如下表所示（为方便计算，计算过程中将空白液体体积设为1mL）；

空白溶液	添加水平（mg/mL）	平均回收率（%）
			磷酸盐缓冲液	7	101.1
培养基	7	105.2

实施例 6 ：溶液中 nano-HA-Gd-FITC 的定量分析。

1、操作步骤：

1.1、将nano-HA-Gd-FITC混悬于三蒸水中得到初始浓度为180mg/mL的混悬液，用三蒸水对其逐级稀释，分别依次向CLSM玻璃皿中加20ul混悬液，在CLSM下用FITC通道（488nm处激发，在520nm附近检测其荧光）和反射光通道（以一组激发光的反射光为例，561nm处激发，561nm处检测其反射光）对其成像；通过图像分析仪对图像提取光信号面积，结合对应的浓度，分别绘制对应于FITC通道和反射光通道的两个标准曲线；

1.2、将含有nano-HA-Gd-FITC的水溶液、磷酸盐缓冲液或液体培养基作为待测物，滴加至CLSM玻璃皿中，在CLSM下用FITC通道（488nm处激发，在520nm附近检测其荧光）和反射光通道（以一组激发光的反射光为例，561nm处激发，561nm处检测其反射光）对其成像；通过图像分析仪对图像提取光信号面积，并分别对应FITC通道和反射光通道的两个标准曲线，得出待测物中nano-HA-Gd-FITC的浓度。FITC通道和反射光通道得出的检测结果可以相互验证。

2、标准曲线：

图3中（b）和（c）分别为CLSM的反射光通道和FITC通道下各呈现的成像面积和nano-HA-Gd-FITC浓度之间的线性关系。如图所示，用反射光通道和FITC通道均能检测到nano-HA-Gd-FITC的光面积随浓度梯度呈现良好的线性，两组标准曲线的线性方程差别不大，但反射光通道检测到的线性比FITC通道的好。这些结果表明反射光信号能够用于定量分析。

3、方法回收率：

分别向空白磷酸盐缓冲液和培养基中添加一定量的nano-HA-Gd-FITC粉末，使其分别达到如下表所示的nano-HA-Gd-FITC浓度，制成空白加样样本。利用本检测方法对空白加样样本进行检测，根据检测结果计算本检测方法的回收率。计算结果如下表所示（为方便计算，计算过程中将空白液体体积设为1mL）；

检测通道	空白溶液	添加水平（mg/mL）	平均回收率（%）
				反射光通道	磷酸盐缓冲液	7	99.2
反射光通道	培养基	7	105.1
				FITC通道	磷酸盐缓冲液	7	102.0
FITC通道	培养基	7	104.3

实施例 7 ：与细胞共培养的 nano-HA-Gd 用 CLSM 实时动态检测。

1、操作方法：

1.1、分离大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs细胞）：SD大鼠(三周周龄，雌雄不限)经乙醚麻醉后，脊椎脱臼法处死，浸泡于75%乙醇消毒5分钟，无菌条件下取出股骨和腓骨置于盛有10mlPBS的玻璃皿中，手术刀剔去骨表面的组织及软骨后将其置于含有10ml完全培养基的玻璃皿中，剪开骨骺两端，用注射器吸取完全培养基将骨髓腔中的物质全部吹出并反复吹打呈单细胞悬液，收集至15ml离心管中，1000r/min离心5分钟，弃上清液，完全培养基重悬以1×106/mL的细胞浓度接种于100 cm²培养瓶中，置37 ℃、5% CO₂饱和湿度培养箱中培养。原代培养过程中，每隔3d半量更换培养基，一周后每3 d全量更换新鲜培养基。待细胞在瓶底融合密度至80%时，用EDTA-0.25%胰酶消化，1∶2的比例稀释细胞进行传代培养；

1.2、第三代的BMSCs细胞以10⁴cells/cm²的密度种于CLSM玻璃皿中，待细胞完全贴壁，加入nano-HA-Gd使其终浓度为100μg/cm²，置37 ℃5%CO₂饱和湿度培养箱中培养。培养过程中，在2、6、12、24小时取出细胞样品，置于CLSM下通过反射光通道以及光镜成像；该方法利用CLSM采集图像的条件是，激发光波长可设置为200nm至1050nm范围内的任何一个或者几个波长（例如361nm，364nm，405nm，458nm，488nm，514nm，543nm，561nm和633nm中的任意一个或几个的组合），采集相应的反射光，使用任意伪彩色成像。以一组激发光的反射光为例，反射光通道采用561nm处激发光，561nm处检测其反射光，伪彩色选择红色，对nano-HA-Gd成像。

2、检测结果：

图4呈现了nano-HA-Gd和BMSCs共培养2、6、12、24小时的实时成像图，反射光图像显示nano-HA-Gd和BMSCs共培养2小时，少部分纳米颗粒吸附在颗粒表面或者被细胞摄取。随培养时间的延长，越来越多的纳米颗粒聚集成1-2um的球状体，并形成细胞轮廓，这说明nano-HA-Gd不断的聚集，能够被BMSCs摄取进入细胞。此组图像证明在细胞存在下反射光能够定位nano-HA-Gd，并能实时动态成像。

实施例 8 ：与细胞共培养的 nano-HA-Gd-FITC 用 CLSM 实时动态检测。

1、操作方法：

1.1、分离BMSCs细胞：与实施例7所述相同；

1.2、第三代的BMSCs细胞以10⁴cells/cm²的密度种于CLSM玻璃皿中，待细胞完全贴壁，加入nano-HA-Gd-FITC使其终浓度为100μg/cm²，置37 ℃5%CO₂饱和湿度培养箱中培养。培养过程中，在2、6、12、24小时取出细胞样品，置于CLSM下通过FITC通道、反射光通道以及光镜成像；该方法利用CLSM采集图像的条件是，激发光波长可设置为200nm至1050nm范围内的任何一个或者几个波长（例如361nm，364nm，405nm，458nm，488nm，514nm，543nm，561nm和633nm中的任意一个或几个的组合），其中应包括FITC的激发波长，采集相应的反射光和荧光，使用任意伪彩色成像。以一组激发光的反射光为例，反射光通道采用561nm处激发光，561nm处检测其反射光，伪彩色选择红色。FITC通道采用488nm处激发光，在520nm附近检测其荧光，伪彩色选择绿色。

2、检测结果：

图5呈现了nano-HA-Gd-FITC和BMSCs共培养2、6、12、24小时的实时成像图，其中：(A)反射光通道，(B)FITC通道。反射光图像显示nano-HA-Gd-FITC和BMSCs共培养2小时，少部分纳米颗粒吸附在颗粒表面或者被细胞摄取。随培养时间的延长，越来越多的纳米颗粒分布在细胞质中，并聚集成1-2um的球状体，这说明nano-HA-Gd-FITC能够被BMSCs摄取进入细胞，并且不断的聚集。FITC图像和反射光图像趋势一致，证明二者能共同定位nano-HA-Gd-FITC。

实施例 9 ：与细胞共培养的 nano-HA-Gd 用 CLSM 检测，其中细胞的细胞质与细胞核分别用荧光探针标记。

1、本实施例中待测样品的制备方法包括三种：

1.1、活细胞荧光标记方法一：细胞种在CLSM玻璃皿中贴壁后，先将细胞质和细胞核用荧光探针标记，具体步骤为：小心吸走培养液，在细胞样品上均匀滴加200ul Hoechst33342 (4μg/ml)，并在37 ℃5%CO₂饱和湿度培养箱中孵育60 min，小心吸走上述染色液并均匀滴加200ul CMTMR (2μmol/ml)，同样条件孵育30 min后，PBS缓冲液小心冲洗细胞2遍，加入含有100μg/cm²nano-HA-Gd的完全培养基，避光，在孵育箱培养，可随时取出进行CLSM检测；

1.2、活细胞荧光标记方法二：nano-HA-Gd与细胞共培养一定时间后，先加入nano-HA-Gd，避光，在孵育箱培养，可随时取出，按照方案1.1的方法给细胞质和细胞核用荧光探针标记，进行CLSM检测；

1.3、固定后的细胞荧光标记：nano-HA-Gd与细胞共培养一定时间后，弃去培养液，用37℃的PBS洗玻片2次；4%甲醛固定液固定细胞15分钟，PBS洗2次；加-20℃丙酮覆盖全部细胞，-20℃冰箱放置5分钟，PBS洗三次；每个样品加Rhodamine phalloidin（罗丹明标记的鬼笔环肽）应用液200ul，室温放置20分钟，PBS洗三次。载玻片标记后，中间位置加一滴封片液，盖玻片有细胞的一侧朝下，盖在载玻片的封片液上，注意不能有气泡。若为共聚焦小皿，可用PBS覆盖细胞样品。每个样品加Hoechst33258应用液200ul，37℃孵育30分钟，PBS洗三次，进行CLSM检测。

2、针对上述待测样品CLSM检测图像采集项目：

2.1、采集条件：激发光波长可设置为200nm至1050nm的任何一个或者几个波长（例如361nm，364nm，405nm，458nm，488nm，514nm，543nm，561nm和633nm中的任意一个或几个的组合），其中应包括Rhodamine phalloidin和Hoechst33258/ Hoechst33342的激发波长，采集相应的反射光和荧光，使用任意伪彩色成像。针对1.3的细胞样品，发射光波长选择570~620nm，伪彩色选择红色，采集细胞微丝的Rhodamine phalloidin荧光图像；发射光波长选择400~480nm，伪彩色选择蓝色，采集细胞核区的Hoechst33258荧光图像；选择 200nm至1050nm范围内的任意一种波长（例如361nm，364nm，405nm，458nm，488nm，514nm，543nm，561nm和633nm中的任意一个或几个的组合），发射波长与选择的激发波长一致，本实施例的检测结果以一组激发光的反射光为例，反射光通道采用561nm处激发光，561nm处检测其反射光，伪彩色选择绿色，采集nano-HA-Gd纳米颗粒的反射光图像；

2.2、实时动态监测：针对活细胞样品可以根据实验设计，随时进行CLSM检测，观察孵育不同时间颗粒聚集状态、被摄取的程度、颗粒的位置、细胞状态；

2.3、三维成像：实时动态监测的同时可以采集延z轴或y轴采集各个细胞层的图像，通过软件，合成三维立体图像。

3、检测结果：

图6为nano-HA-Gd与BMSCs共培养一定时间后，经细胞固定、细胞微丝和细胞核荧光标记后，利用CLSM进行平面成像，其中：(b)是(a)的局部放大图像， (c)是(b)的xzy纵切图像。如图所示反射光通道能够结合细胞微丝和细胞核的荧光通道共同定位nano-HA-Gd颗粒清晰的出现在交错的细胞微丝骨架间，细胞核中没有颗粒存在。在xzy纵切图中反射光通道仍然能够结合细胞微丝和细胞核的荧光通道共同定位nano-HA-Gd存在细胞质中。

图7 为CLSM下延z轴连续扫描各层细胞样品的图像，其中：(a) Rhodamine phalloidin通道，(b) Hoechst33258通道，(c) 反射光通道，(d) a，b，c的叠加图。如图所示，反射光通道和荧光通道在样品延Z轴各层面的横切图像中均能清晰的成像，并且反射光通道能够结合细胞各部分的荧光通道共同定位nano-HA-Gd颗粒清晰的出现在交错的细胞微丝骨架间。这些切面可以组合成三维立体图像，用于nano-HA-Gd颗粒在细胞中的空间定位。

实施例 10 ：与细胞共培养的 nano-HA-Gd-FITC 用 CLSM 检测，其中细胞的细胞质与细胞核分别用荧光探针标记。

1、准备待测样品：

1.1、活细胞荧光标记方法一：细胞种在CLSM玻璃皿中贴壁后，先将细胞质和细胞核用荧光探针标记，具体步骤为：小心吸走培养液，在细胞样品上均匀滴加200ul Hoechst33342 (4μg/ml)，并在37 ℃5%CO2饱和湿度培养箱中孵育60 min，小心吸走上述染色液并均匀滴加200ul CMTMR (2μmol/ml)，同样条件孵育30 min后，PBS缓冲液小心冲洗细胞2遍，加入含有100μg/cm²的nano-HA-Gd-FITC的完全培养基，避光，在孵育箱培养，可随时取出进行CLSM检测；

1.2、活细胞荧光标记方法二：nano-HA-Gd-FITC与细胞共培养一定时间后，先加入nano-HA-Gd-FITC，避光，在孵育箱培养，可随时取出，按照方案一的方法给细胞质和细胞核用荧光探针标记，进行CLSM检测；

1.3、固定后的细胞荧光标记：nano-HA-Gd-FITC与细胞共培养一定时间后，弃去培养液，用37℃的PBS洗玻片2次；4%甲醛固定液固定细胞15分钟，PBS洗2次；加-20℃丙酮覆盖全部细胞，-20℃冰箱放置5分钟，PBS洗三次；每个样品加Rhodamine phalloidin（罗丹明标记的鬼笔环肽）应用液200ul，室温放置20分钟，PBS洗三次。载玻片标记后，中间位置加一滴封片液，盖玻片有细胞的一侧朝下，盖在载玻片的封片液上，注意不能有气泡。若为共聚焦小皿，可用PBS覆盖细胞样品。每个样品加Hoechst33258应用液200ul，37℃孵育30分钟，PBS洗三次，进行CLSM检测。

2、针对上述待测样品CLSM检测图像采集项目：

2.1、采集条件：激发光波长可设置为200nm至1050nm的任何一个或者几个波长（例如361nm，364nm，405nm，458nm，488nm，514nm，543nm，561nm和633nm中的任意一个或几个的组合），其中应包括FITC、Rhodamine phalloidin和Hoechst33258/Hoechst33342的激发波长，采集相应的反射光和荧光.，使用任意伪彩色成像。针对1.1和1.2的细胞样品，发射光波长选择570~650nm，伪彩色选择红色，采集细胞质CMTMR荧光图像；发射光波长选择400~480nm，伪彩色选择蓝色，采集细胞核区的Hoechst33342荧光图像；选择 200nm至1050nm范围内的任意一种波长（例如361nm，364nm，405nm，458nm，488nm，514nm，543nm，561nm和633nm中的任意一个或几个的组合），发射波长与选择的激发波长一致，本实施例的检测结果以一组激发光的反射光为例，反射光通道采用561nm处激发光，561nm处检测其反射光，伪彩色选择绿色，采集nano-HA-Gd纳米颗粒的反射光图像；选择488nm激发光，发射光波长选择500~547nm，伪彩色选择绿色，采集nano-HA-Gd-FITC的FITC荧光图像；

3、检测结果。

图8为nano-HA-Gd-FITC与BMSCs共培养一定时间后，对活细胞的细胞质、细胞核进行荧光标记，利用CLSM进行成像，其中：(a)CMTMR通道，(b)Hoechst33342通道，(c) 反射光通道，(d) FITC通道，（e）a，b，c，d的叠加图。II为I的xzy纵切图像。如图所示反射光通道能够结合细胞质和细胞核的荧光通道共同定位nano-HA-Gd-FITC颗粒，nano-HA-Gd-FITC颗粒以微米级别的球形聚集体存在细胞质、细胞核周围。在xzy纵切图中反射光通道仍然能够结合细胞质和细胞核的荧光通道共同定位nano-HA-Gd-FITC。

图9 nano-HA-Gd-FITC与BMSCs共培养一定时间后，对活细胞的细胞质、细胞核进行荧光标记，利用CLSM延z轴连续扫描各层细胞样品的图像，其中：(a)CMTMR通道，(b)Hoechst33342通道，(c) 反射光通道，(d) FITC通道，（e）a，b，c，d的叠加图。如图所示，反射光通道和荧光通道在样品延Z轴各层面的横切图像中均能清晰的成像，并且反射光通道能够结合细胞各部分的荧光通道共同定位nano-HA-Gd-FITC颗粒，nano-HA-Gd-FITC颗粒以微米级别的球形聚集体存在细胞质、细胞核周围。这些切面可以组合成三维立体图像，用于nano-HA-Gd-FITC颗粒在细胞中的空间定位。

4、光漂白实验。

光漂白现象是荧光标记物的一个不可避免的缺陷，因此不能用于在CLSM下用激光连续的、长时间照射，不利于追踪定位荧光颗粒。但是根据反射光技术的成像原理，反射光信号具有很好的光稳定性。

操作步骤：按照2.1的检测条件对1.1的细胞样品成像，圈定细胞样品中某一区域(A specific region of interest ，ROI)提高检测的激发光波长的强度，连续照射ROI160s并实时动态监测光强度的变化并拍照，并用CLSM的FITC通道、反射光通道、CMTMR通道、Hoechst33342通道同时成像并记录光强度。

图10至图12为本实施例反射光信号和荧光信号光稳定性的对比。图10为光漂白前后各个通道图像；图11为光漂白区域的实时动态监测图像；图12为光漂白区域的各通道光强度的定量曲线，(a)CMTMR通道，(b)Hoechst33342通道，(c) 反射光通道，(d) FITC通道。如图所示，在连续照射选定区域后，标记在细胞上的荧光探针CMTMR，Hoechst33342和颗粒物表面的FITC的荧光强度明显减弱，而反射光采集的图像仍然很清晰地呈现颗粒的形态，强度几乎不改变。标准化的荧光强度-时间曲线图中定量体现了上述趋势，在160s激光连续照射后，三组荧光强度下降了70%，而反射光强度仅下降了不到5%。总之反射光信号强度不受连续激光照射的影响，说明了其具有非常好的光稳定性。

虽然以上实施例中，用激光照射待测样品时，使用的激光的波长为405nm，488nm，514nm，543nm，561nm或633nm，但不限于此，其他波长的激光也可作为本发明激光照射的光源。

虽然以上实施例中，仅公开了带有异硫氰酸荧光素（FITC）标记的含钆羟基磷灰石纳米颗粒，但不限于此，也可选用其他荧光标记，例如Alex系列荧光探针或者罗丹明类荧光探针等。

虽然以上实施例中，仅公开了用Hoechst33324和Hoechst33258标记细胞核，但不限于此，也可选用其他荧光标记。

虽然以上实施例中，仅公开了用CMTMR标记细胞质，但不限于此，也可选用其他荧光标记。

虽然以上实施例中，仅公开了用Rhodamine phalloidin标记细胞微丝，但不限于此，也可选用其他荧光标记。

虽然以上实施例中，仅公开了对细胞质、细胞核、和细胞微丝荧光标记，但不限于此，也可对细胞膜、细胞器进行荧光标记。

在本文中，“示意性”表示“充当实例、例子或说明”，不应将在本文中被描述为“示意性”的任何实施方式解释为一种更优选的或更具优点的技术方案。

在本文中，“相等”、“相同”等并非严格的数学和/或几何学意义上的限制，还包含本领域技术人员可以理解的且生产或使用等允许的误差。除非另有说明，本文中的数值范围不仅包括其两个端点内的整个范围，也包括含于其中的若干子范围。

应当理解，虽然本说明书是按照各个实施例描述的，但并非每个实施例仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施例的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施方案或变更，如特征的组合、分割或重复，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种含钆羟基磷灰石纳米颗粒的检测方法，其特征在于，包括：

准备待测样品，所述待测样品中含有含钆羟基磷灰石纳米颗粒和/或带有荧光标记的含钆羟基磷灰石纳米颗粒；

用激光照射所述待测样品，并采集反射光；以及根据采集到的所述反射光形成图像、光谱曲线和/或定量数据。

2.如权利要求1所述的含钆羟基磷灰石纳米颗粒的检测方法，其中所述用激光照射时，使用的激光的波长为200nm至1050nm范围内的任一波长。

3.如权利要求2所述的含钆羟基磷灰石纳米颗粒的检测方法，其中所述用激光照射时，使用的激光的波长为361nm，364nm，405nm，458nm，488nm，514nm，543nm，561nm和633nm中的任一波长。

4.如权利要求2所述的含钆羟基磷灰石纳米颗粒的检测方法，其中所述采集图像使用的扫描波长范围为200nm至1050nm，步距为0.2~50nm。

5.如权利要求1所述的含钆羟基磷灰石纳米颗粒的检测方法，其中准备所述待测样品的步骤包括：先将含有含钆羟基磷灰石纳米颗粒和/或带有荧光标记的含钆羟基磷灰石纳米颗粒的待测物悬浮于无水乙醇中，再滴加在容器表面，待乙醇挥发后，得到所述待测样品。

6.如权利要求1所述的含钆羟基磷灰石纳米颗粒的检测方法，其中准备所述待测样品的步骤包括：将含有含钆羟基磷灰石纳米颗粒和/或带有荧光标记的含钆羟基磷灰石纳米颗粒的待测物悬浮于水、盐溶液、缓冲液或液体培养基中，得到所述待测样品。

7.如权利要求1所述的含钆羟基磷灰石纳米颗粒的检测方法，其中准备所述待测样品的步骤包括：将含钆羟基磷灰石纳米颗粒和/或带有荧光标记的含钆羟基磷灰石纳米颗粒与细胞共培养，得到所述待测样品。

8.如权利要求7所述的含钆羟基磷灰石纳米颗粒的检测方法，其中准备所述待测样品的步骤还包括：将所述细胞的细胞质、细胞膜、细胞器和/或细胞核分别用荧光探针标记；当用激光照射所述待测样品时，同时采集反射光和荧光，并根据采集到的所述反射光和所述荧光形成图像及光谱曲线。

9.如权利要求8所述的含钆羟基磷灰石纳米颗粒的检测方法，其中准备所述待测样品的步骤包括：先将所述细胞的细胞质、细胞膜、细胞器和/或细胞核用荧光探针标记，再将所述细胞与含钆羟基磷灰石纳米颗粒和/或带有荧光标记的含钆羟基磷灰石纳米颗粒共培养；或是先将所述细胞与含钆羟基磷灰石纳米颗粒和/或带有荧光标记的含钆羟基磷灰石纳米颗粒共培养，再将所述细胞的细胞质、细胞膜、细胞器和/或细胞核用荧光探针标记。

10.如权利要求8所述的含钆羟基磷灰石纳米颗粒的检测方法，其中准备所述待测样品的步骤包括：先将所述细胞与含钆羟基磷灰石纳米颗粒和/或带有荧光标记的含钆羟基磷灰石纳米颗粒共培养，再将所述细胞用甲醛溶液固定，最后将所述细胞的细胞质、细胞膜、细胞器和/或细胞核用荧光探针标记。

11.如权利要求8所述的含钆羟基磷灰石纳米颗粒的检测方法，其中根据采集到的所述反射光和所述荧光形成图像包括：成像、定量、实时定量及成像、三维成像、xyz/xzy切面成像、1~5个通道同时采集图像、光漂白实验、光谱扫描曲线。

12.如权利要求1所述的含钆羟基磷灰石纳米颗粒的检测方法，其中，所述待测样品中含有带有荧光标记的含钆羟基磷灰石纳米颗粒；当用激光照射所述待测样品时，同时采集反射光和荧光，并根据采集到的所述反射光和所述荧光形成图像及光谱曲线。

13.如权利要求1所述的含钆羟基磷灰石纳米颗粒的检测方法，其中，所述荧光标记为异硫氰酸荧光素。

14.如权利要求1所述的含钆羟基磷灰石纳米颗粒的检测方法，其中，通过激光扫描共聚焦显微镜实施所述激光照射及所述采集。

15.如权利要求1所述的含钆羟基磷灰石纳米颗粒的检测方法，其包括：

先用激光照射含钆羟基磷灰石纳米颗粒和/或带有荧光标记的含钆羟基磷灰石纳米颗粒的浓度梯度标准品，并采集反射光，根据采集到的反射光形成图像及光谱曲线，并提取光信号面积，结合所述浓度梯度标准品对应的浓度，绘制标准曲线；

再用激光照射所述待测样品，并采集反射光，根据采集到的反射光形成图像及光谱曲线，并提取光信号面积；以及

根据所述待测样品对应的光信号面积及所述标准曲线，得到所述待测样品中含钆羟基磷灰石纳米颗粒和/或带有荧光标记的含钆羟基磷灰石纳米颗粒的浓度。