CN104597016B - 倒置激光共聚焦显微镜动植物活体观测装置及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种倒置激光共聚焦显微镜动植物活体观测装置，属于微观组织及结构观测技术领域。本发明将传统细胞生物学的实验放到动植物活体上来进行，用本发明装置观察动植物活体局部器官组织内部，可获得高精度显微图像，结果更加可靠。同时获取多个指标，获取动植物组织细胞和组织层面动态的变化效果，为进一步的科学研究提供依据，并跟踪处理后机体变化，能够在最准确的时间采取针对性的措施。在动物药理学方面解决检测滞后于药物作用，检测效果不直观的问题，实时地检测药物在动物体内的作用时间和作用效果，对于药物剂量和给药时间都有直观的指导作用。

Description

倒置激光共聚焦显微镜动植物活体观测装置及方法

技术领域

本发明属于微观组织及结构观测技术领域，具体涉及一种倒置激光共聚焦显微镜动植物活体观测装置及方法。

背景技术

激光扫描共聚焦显微镜是二十世纪80年代发展起来的一项具有划时代意义的高科技产品，它是在荧光显微镜成像基础上加装了激光扫描装置，利用计算机进行图像处理，把光学成像的分辨率提高了30%~40%，使用紫外或可见光激发荧光探针，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像。激光扫描共聚焦显微镜在亚细胞水平上观察诸如Ca²⁺、pH值，膜电位等生理信号及细胞形态的变化，成为形态学、分子生物学、神经科学、药理学、遗传学等领域中新一代强有力的研究工具。

从一个点光源发射的探测光通过透镜聚焦到被观测物体上，如果物体恰在焦点上，那么反射光通过原透镜应当汇聚回到光源，这就是所谓的共聚焦，简称共焦。共焦显微镜[ConfocalLaserScanningMicroscope(CLSM或LSCM)]在反射光的光路上加上了一块半反半透镜(BeamSplitter)，将已经通过透镜的反射光折向其它方向，在其焦点上有一个带有针孔（Pinhole）的挡板，小孔就位于焦点处，挡板后面是一个光电倍增管（pHotomultipliertube，PMT）。可以想像，探测光焦点前后的反射光通过这一套共焦系统，必不能聚焦到小孔上，会被挡板挡住。于是光度计测量的就是焦点处的反射光强度。其意义是：通过移动透镜系统可以对一个半透明的物体进行三维扫描。

激光共聚焦成像系统能够用于观察各种染色、非染色和荧光标记的组织和细胞等，观察研究组织切片，细胞活体的生长发育特征，研究测定细胞内物质运输和能量转换。能够进行活体细胞中离子和pH值变化研究（RATIO），神经递质研究，微分干涉及荧光的断层扫描，多重荧光的断层扫描及重叠，荧光光谱分析荧光各项指标定量分析荧光样品的时间延迟扫描及动态构件组织与细胞的三维动态结构构件，荧光共振能量的转移的分析，荧光原位杂交研究（FISH），细胞骨架研究，基因定位研究，原位实时PCR产物分析，荧光漂白恢复研究（FRAP），胞间通讯研究，蛋白质间研究，膜电位与膜流动性等研究，完成图像分析和三维重建等分析。

但是共聚焦显微镜对样品要求较高，常规只能进行玻片和培养皿的观察，并且高倍的活细胞观察只能在特制的培养皿中完成，无法进行动植物活体成像，使得其本身具有的多通道荧光同时检测，以及多色荧光视频录制的功能在需要活体观察的领域使用范围受到了局限。近期我们移植的转染GFP的干细胞的成活和转移实验，只能通过杀死动物后制作玻片进行检测，必须在显微镜观察之前对样品进行固定切片等一系列操作，得到的结果因为操作步骤多，与动植物活体时的状态有较大差异。在药物效果监测方面的病理切片会受到药物体内代谢，动物体本身差异等影响导致检测结果可靠性较差。当我们获得了一个比较理想的切片结果，需要进行下一步实验的时候，原实验动物已经处死，无法执行，新的动物模型必然与原实验动物有差异，实验可重复性和结果可靠性较差。

因此如何克服现有技术的不足是目前微观组织及结构观测技术领域亟需解决的问题。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种倒置激光共聚焦显微镜动植物活体观测装置及方法，本发明将传统细胞生物学的实验放到动植物活体上来进行，并可用激光共聚焦显微镜观察动植物活体局部器官组织内部的高精度显微图像，结果更加可靠。

本发明采用的技术方案如下：

倒置激光共聚焦显微镜动植物活体观测装置，包括共聚焦样品平台、负压产生装置和倒置式显微镜；

所述的负压产生装置包括电机、负压泵和废液罐；所述电机用于驱动负压泵，所述负压泵的进气口通过第一耐压软管与废液罐的出气口相连通，负压泵的出口连通大气；

废液罐的进气口通过第二耐压软管与钢管相连通，所述的共聚焦样品平台中间设有凹槽，凹槽底部设有通孔，通孔处设有玻片，玻片通过凡士林与通孔密封连接；

所述的钢管与凹槽相连通；倒置式显微镜位于共聚焦样品平台的正下方。

进一步，优选的是所述的钢管通过环氧树脂固定与共聚焦样品平台固定连接。

进一步，优选的是所述的钢管的弯折部分采用圆角折弯，保持内部畅通。钢管的作用为导流气体及废液。

进一步，优选的是所述的凹槽为倒置的圆台形。

用上述倒置激光共聚焦显微镜动植物活体观测装置进行动植物活体观测方法，包括如下步骤：

步骤（1），确认荧光指示剂标记方案并进行相应标记；

步骤（2），小动物按照体重比例由血管注入相应计量麻醉剂，全身麻醉，并作观测部位相应手术，使观测部位暴漏出来，并进行相应的止血工作；

步骤（3），小动物肢体终端稳定固定在共聚焦样品平台上，通过观测部位实施手术的创口，将观测器官置于观测平台玻片部位，排除气泡；

步骤（4），观测部位血管显微镜初检，确认血液流通良好，然后进行预扫描；

步骤（5），根据预扫描结果对观测部位进行牵拉压迫固定，但不能影响到血液流通，直至观测画面稳定；

步骤（6），共聚焦timelapse扫描，对观测动物进行荧光指示剂标记和给药，获取实时的共聚焦图片；

步骤（7），数据分型，并形成相应视频文件。

本发明的共聚焦样品平台可适合作为组织高倍放大观察的倒置式显微镜观测平台，使得共聚焦能够获取活体内部组织细胞图像，并可记录视频图像，此平台利用负压使观测组织紧密贴在观测平面上并排出组织积液。

负压产生装置，包括电机、负压泵和废液罐。负压泵产生负压。废液罐也兼作负压罐，不仅用来维持压力稳定，还用来储存组织积液。

本发明与现有技术相比，其有益效果为：

利用本发明技术方案，共聚焦可以用于观察动植物活体内部局部组织的高精度显微图像。所有已进行的细胞层面的实验，可以扩展到细胞与组织层面，甚至来反映活体整体的状况。同时，利用本发明技术方案可以将细胞层面的实验放到动植物活体上来进行，观察动植物活体局部组织内部的高精度显微图像，同时获取多个指标，观察动植物组织细胞和组织层面动态变化在动植物活体上的效果。

共聚焦显微镜传统的用途主要是：观察研究组织切片，细胞活体的生长发育特征，研究测定细胞内物质运输和能量转换，细胞形态学分析，荧光原位杂交研究，基因定位研究及三维重建分析，这些都是细胞或者更细微层面的研究。本发明保持共聚焦的原有优势，并将这些优势扩展到动植物活体的层面。

将传统细胞生物学的实验放到动植物活体上来进行，并可用激光共聚焦显微镜观察动植物活体局部器官组织内部的高精度显微图像，结果更加可靠。同时获取多个指标，获取动植物组织细胞和组织层面动态的变化效果，为进一步的科学研究提供依据，并跟踪处理后机体变化，能够在最准确的时间采取针对性的措施。在动物药理学方面解决检测滞后于药物作用，检测效果不直观的问题，实时地检测药物在动物体内的作用时间和作用效果，对于药物剂量和给药时间都有直观的指导作用。

本发明最直接的利用有：

一、细胞生物学：可以研究细胞在机体内生长、迁移、凋亡这一系列的过程。

二、药理学：药物对细胞的作用及动力学观察，药物在机体内起作用的直观结果以及副作用，并可准确跟踪药物到达目的部位的准确时间，不同剂量药物的作用效果，对药物的使用方法和计量都有指导作用。

三、生理学：膜受体、离子通道、细胞内离子含量和分布动态。

四、可在植物活体层面进行长时间的观察。

附图说明

图1是倒置激光共聚焦显微镜动植物活体观测装置不显示倒置激光共聚焦显微镜的结构示意图；

图2是共聚焦样品平台仰视图；

图3是共聚焦样品平台的俯视图；

图4是本发明装置带有倒置激光共聚焦显微镜的结构示意图；

图5是本发明应用实例的兔肠系膜血管荧光标记活体图片；

其中，1、电机；2、负压泵；3、第一耐压软管；4、废液罐；5、第二耐压软管；6、钢管；7、共聚焦样品平台；8、通孔；9、凹槽；10、倒置式显微镜。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。

本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。

如图1-3所示，倒置激光共聚焦显微镜动植物活体观测装置，包括共聚焦样品平台7、负压产生装置和倒置式显微镜10；

所述的负压产生装置包括电机1、负压泵2和废液罐4；所述电机1用于驱动负压泵2，所述负压泵2的进气口通过第一耐压软管3与废液罐4的出气口相连通，负压泵2的出口连通大气；

废液罐4的进气口通过第二耐压软管5与钢管6相连通，所述的共聚焦样品平台7中间设有凹槽9，凹槽9底部设有通孔8，通孔8处设有玻片，玻片通过凡士林与通孔8密封连接，确保接触面不漏液；

所述的钢管6与凹槽9相连通；倒置式显微镜10位于共聚焦样品平台的正下方。

所述的钢管6通过环氧树脂固定与共聚焦样品平台7固定连接。钢管6的弯折部分采用圆角折弯，保持内部畅通。钢管6的作用为导流气体及废液。

应用实例：

利用本发明倒置激光共聚焦显微镜动植物活体观测装置进行兔肠粘膜血管渗漏情况的研究

目的：动物受到大的损伤时，如手术后，动物的血管终端可能会出现渗漏情况，这对于动物的术后恢复和治疗是不利的。本方案可以直观的观测肠粘膜血管在动物本体受到创伤情况下血管内物质渗漏的情况，为改善这种渗漏和更有效地进行药物治疗提供参考信息，并观察渗漏治疗方案的直接效果。

1.检查倒置激光共聚焦显微镜动植物活体观测装置中的各部件是否连接完好，玻片干净通透，确保接触面不漏液；然后开启本发明装置；

2.荧光指示剂可采用各种成熟的荧光染料，本次试验采用绿色的荧光素FITC作为荧光指示剂；

3.实验动物按照体重比例由血管注入相应计量麻醉剂，全身麻醉，备皮，作腹部中线切开，根据手术情况进行相应的止血工作；将兔肠道轻轻拉出体外，避免损伤肠系膜，肠和手术创口位置用纱布隔开，进行位置相对固定避免压迫血管并且吸收渗出液；渗出液依次通过钢管、第二耐压软管进入废液罐；

4.小动物肢体终端稳定固定在共聚焦样品平台上，将肠铺展在装置中心观测部位，使肠系膜贴在玻片上，并排除玻片和肠系膜中间的气泡；

5.观测部位血管显微镜初检，确认血液流通良好，进行预扫描；

6.根据预扫描结果对观测部位进行牵拉压迫固定，不能影响到血液流通，直至观测画面稳定；

7.共聚焦timelapse扫描，由兔耳缘静脉注入荧光指示剂，获取实时的共聚焦图片；

8.数据分型，并形成相应视频文件。

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (2)

1.倒置激光共聚焦显微镜动植物活体观测装置，其特征在于，包括共聚焦样品平台、负压产生装置和倒置式显微镜；

所述的负压产生装置包括电机、负压泵和废液罐；所述电机用于驱动负压泵，所述负压泵的进气口通过第一耐压软管与废液罐的出气口相连通，负压泵的出口连通大气；

废液罐的进气口通过第二耐压软管与钢管相连通，所述的共聚焦样品平台中间设有凹槽，凹槽底部设有通孔，通孔处设有玻片，玻片通过凡士林与通孔密封连接；

所述的钢管与凹槽相连通；倒置式显微镜位于共聚焦样品平台的正下方；

所述的钢管通过环氧树脂固定与共聚焦样品平台固定连接；

所述的钢管的弯折部分采用圆角折弯。

2.根据权利要求1 所述的倒置激光共聚焦显微镜动植物活体观测装置，其特征在于，所述的凹槽为倒置的圆台形。