CN102251054A - 通过两个dna重复序列鉴别杂草稻籼粳性的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种通过两个DNA重复序列鉴别杂草稻籼粳性的方法，是以含有小麦45SrDNA基因序列的克隆pTA71和水稻AA组染色体亚端粒串联重复序列的克隆pOs48，质粒DNA提取后，通过缺刻平移法，用地高辛-dUTP标记的pOs48和用生物素-dUTP标记的pTA71，形成45SrDNA和Os48探针，用于对杂草稻的籼粳性鉴别，具体步骤是：将被鉴定的杂草稻有丝分裂前中期染色体制片、变性，与含有探针的变性杂交液进行双色荧光原位杂交，在避光条件下对其信号进行检测，根据杂草稻有丝分裂前中期染色体上45SrDNA和Os48位点数目和分布特点，对不同来源的杂草稻进行籼粳分类。
Description
技术领域
本发明以两个DNA特异重复序列分别作探针，采用双色荧光原位杂交技术研究重复序列在杂草稻有丝分裂前中期染色体上分布，分析杂草稻的籼粳性，涉及一种杂草稻籼、粳分类的鉴定方法，属于植物分子细胞学技术领域。
背景技术
杂草稻(weedy rice)是普通野生稻和栽培稻经自然选择和人为干预产生的兼有野生稻和栽培稻特性的类型，又叫杂草型稻或杂草种系(王渭霞等，杂草科学，2005(2)：1-5)。在植物分类上，杂草稻属于禾本科(Poaceae)稻属(Oryza)，因其和栽培稻一样都属于AA基因组型(2n＝24)，而且形态上与亚洲栽培稻(O.sativa L.)极其相似，故通常被归在同一个拉丁名下。杂草稻是一年生草本，水生或陆生，苗期一般具有很强的耐低温特性和深水出苗的能力，须根系发达。与栽培稻相比，杂草稻具有较强的落粒性、休眠性、抗逆性和竞争能力，再加上杂草稻与栽培稻对除草剂的反应类似，很难对其进行有效控制(杨琳等，中国水稻科学，2009，23(5)：495-502)。
杂草稻最早发现于美国，因种皮红色而被当地人称为“红稻”(red rice)(余柳青等，植物保护学报，2005，32(3)：319-323)。杂草稻分布极为广泛，全球几乎所有稻作生产地都有发现，作为栽培稻的伴生杂草而存在，并主要集中在温带、热带地区，甚至没有野生稻存在的地区。杂草稻的危害表现在其竞争性强，在稻田与栽培稻争夺阳光、养分和水分，严重影响水稻产量，且自身早熟，落粒，部分未落粒的杂草稻，与栽培稻一起收获，又因其粒形小，果皮有色素沉淀，影响稻米加工及外观品质，从而降低了稻米的商品价值，给农民造成巨大的经济损失。据统计，稻田中杂草稻密度为15-20穗/m2时，水稻减产50％-60％；20-30穗/m2时，水稻减产70％-80％。美国每年因杂草稻损失约5000万美元，杂草稻在我国江苏省、辽宁省等地呈现逐年加重的趋势，给当地水稻生产带来了隐患。据统计，我国黑龙江省仅穞生稻一项因品质下降而造成的损失，每年至少3亿-4亿元人民币。(王黎明等，植物保护，2009，35(5)：14-17)
杂草稻表型变异非常丰富，尤以不同地域差异表现明显，弄清杂草稻的籼粳性，对于研究杂草稻的起源、分类、进化形成机制以及治理杂草稻具有重要意义，同时有助于研究野生稻、杂草稻和栽培稻的遗传亲缘关系，为更好地研究水稻基因的进化奠定基础。目前已经报道的杂草稻分类研究，主要是依据其形态特征、同工酶、分子标记。
利用同功酶谱分析、形态学和生理学特性、分子标记分析等方法，国内外学者对杂草稻的籼粳型进行了研究。Cho(Korean Journal of Breeding，1996，28(3)：309-316)利用RFLP标记分析了韩国24份杂草稻材料、2份其他国家的红稻以及5份来自不同国家的对照栽培稻，将韩国24份杂草稻归属为两组，分别与从形态和生理上鉴别的两类(长粒型和短粒型)相一致，推测韩国短粒型杂草稻属于粳稻类，而长粒型则更类似于籼稻。Suh等(Theor Appl Genet，1997，94：316-321)从全世界收集到152个杂草稻资源，对其主要的6个形态生理特性和14个同功酶谱带进行了分析，并从中选出6个杂草稻，对其Est-10基因位点、核基因的6个限制性片段长度多态位点和1个叶绿体位点进行了研究，结果表明不同国家来源的杂草稻具有不同的遗传多样性，遗传背景差异较大，杂草稻与普通栽培稻亲缘较近，有些更近于普通野生稻。利用微卫星标记对145个典型的栽培种和来自法国Camargue地区的杂草稻比较研究表明，杂草稻比地中海品种(温带粳稻)具有更丰富的遗传多样性(Genet Sel Evol，2001，33：425-440)。Tang等(Rice Genetics Newsletter，1988，5：70-72)对来源于不同国家的24份杂草稻同野生稻和栽培稻从落粒性、种子休眠特性、千粒重方面进行了比较分析，初步将杂草稻分为拟野生型和拟栽培型两大类，同时依据籼粳稻的分类标准通过酚反应、KC1O抗性和稃毛长3个指标的分析以及11个位点同工酶的分析，进一步将24份杂草稻分为三组：第一组为拟籼型，主要来自于日本、巴西、美国和中国长江上游；第二组为籼型自生型，表现为易于落粒，种子休眠性强，主要分布于亚洲热带地区；第三组为粳型自生型，主要源于韩国和中国长江下游。
马殿荣等(作物学报，2008，34(4)：403-411)采用SSR分子标记方法，对来自于辽宁的93份杂草稻的遗传多样性和群体分化进行了研究，结果表明，中国辽宁杂草稻具有较高的遗传多样性，杂草稻群体间的遗传分化较大，杂草稻与当地粳型栽培稻血缘关系很近，与籼稻和野生稻的遗传关系较远。按照程侃声的形态指数法对92份杂草稻进行籼粳亚种分类研究，大部分杂草稻属粳型和偏粳型，只有少数为偏籼型(马殿荣等，沈阳农业大学学报，2008，39(3)：265-269)。李茂柏等(辽宁农业科学，2008，4：1-5)分析了92份辽宁稻区杂草稻的亚种特性，结果发现杂草稻程氏指数总体呈连续变异，大部分为粳型和偏粳型，只有极少数为偏籼型或籼型，在亚种属性上并无明显分开的界限，但有偏向粳型的趋势。施勇烽等(中国稻米，2007，4：7-11)采用19对籼粳特异性水稻微卫星标记，分析比较了4份丹东杂草稻(WS、WL、BS和BL)与标准籼粳对照品种之间的差异，分析结果表明，WL属粳型，另外3份杂草稻属于偏粳型，而且和粳稻测验种的亲缘关系比东乡野生稻更近，属于粳偏栽培型。
在江苏最早发现的“杂草稻”是连云港的“橹稻”，其稻壳为黑色，为粳稻类型(Tang和Hiroko，Breeding Science，1997，47：153-160)。仲维功等(江苏农业学报，2006，22(3)：238-242)对江苏扬中杂草稻的形态特征进行了观察，并利用稻谷稃毛长、酚反应和幼苗对KCIO抗性3项形态、生理指标和SSR标记对其进行了籼粳分类，扬中杂草稻的稻谷稃毛长与籼稻品种南京11号、南京16号的相近；杂草稻的稻谷酚反应、幼苗对KClO抗性以及SSR标记指纹特征与籼稻品种南京11号、南京16号一致，确定江苏扬中杂草稻为籼稻类型，并指出江苏最早发现的杂草稻(“穞稻”)是粳型。杨杰等(中国水稻科学，2009，23(4)：391-397)对22份江淮流域杂草稻叶绿体DNA鉴定的结果表明，7份早年发现的杂草稻，即江苏省连云港稽稻和安徽省怀远、来安、全椒、肥东的塘稻的叶绿体DNA为非缺失带型，属粳型，而近年来在江苏省扬中、高邮、灌云、洪泽、盐都、兴化、如皋等地直播稻田发现的15份红米杂草稻的叶绿体DNA为缺失带型，属籼型。
上述对杂草稻籼粳分类研究，主要是根据其形态学和生理学特征、分子标记进行分析，比较费时、繁杂，有时需要调查几个性状，都难以确定杂草稻的籼粳性，对田间新出现的杂草稻植株，更不容易快速鉴别。如：仲维功等(江苏农业学报，2006，22(3)：238-242)通过测定稻谷稃毛长、酚反应和幼苗对KCIO抗性3项形态、生理指标和SSR标记对杂草稻进行籼粳分类，该方法所需检测的性状多、花费时间较长，而且需要有对照品种。杨杰等(中国水稻科学，2009，23(4)：391-397)根据水稻叶绿体DNA ORF100(Open Reading Frame100)序列在籼粳间存在69bp差异的特征(多数籼稻品种的cpDNA有69bp的缺失，而粳稻品种则没有)，设计了InDel标记cpDNA69，利用该分子标记对杂草稻的籼粳特性进行研究，可以用作叶绿体籼粳鉴定标记，存在标记单一、少数籼型杂草稻品种可能存在鉴别误差、需要对照品种等不足之处。
DNA特异重复序列是在分子水平上研究物种起源和进化最有效手段之一。水稻基因组中有50％的DNA为重复序列，许多重复序列只存在稻属内一定的种或染色体组中，明确这些重复序列在不同稻种中的分布，对于研究稻属基因组进化具有重要的意义。
编码18S-5.8S-28S核糖体RNA的基因(45S rDNA)具有高度保守性和多样性，是一类高度串联重复序列，集中分布在一个位点或数个位点。Gerlach和Bedbrook(Nucleic AcidsResearch，1979，7：1869-1885)对小麦核糖体RNA基因进行了克隆和特性研究，其DNA片段长度为9kb，编号为pTA71。Chung等(TAG，2008，116：745-753)利用含有小麦45SrDNA序列的克隆pTA71作探针，研究了在15个稻种中的染色体分布，并对四倍体稻种的进化机制进行了讨论，在这些稻种中有1-8对位点，其中在第9染色体短臂末端的位点是保守的，有些稻种中的第10染色体上位点会丢失，同时发现在BB组第4染色体和CC组的第5染色体有45S rDNA位点；在稻种进化过程中，有可能发生染色体倒位和45S rDNA拷贝数增加和位点转移现象。
Os48序列为水稻AA组染色体亚端粒的、长度为355bp的串联重复序列(T Wu和R Wu，Nucleic Acids Research，1987，15(15)：5913-5923)，Cheng等(Chromosoma，2001，110：24-31)研究表明Os48主要位点常常与异染色质纽相联系，同时发现Os48序列的FISH信号在减数分裂不同时期发生动态变化，这种现象在其他真核生物中没有报道过，即该序列的FISH信号在减数分裂细线期至粗线期早期处于浓缩状态，在粗线期中期至终变期开始解浓缩，在中期I又回到浓缩状态。
DNA特异重复序列比较保守，在物种进化过程中，主要位点变化较小，是在分子水平上研究物种起源和进化有效工具。已有学者分别利用这两个DNA重复序列进行染色体定位，以研究不同稻种之间的进化关系和水稻减数分裂的染色体行为，没有报道利用这两个重复序列作为鉴定稻种的籼、粳性指标，也没有报道这两个重复序列单独或组合起来作为杂草稻籼粳性分类指标。由于杂草稻初期生长旺盛，苗期很难与普通稻鉴别，加上杂草稻抽穗早、易落粒，因而杂草稻比稻田中的其它杂草更难防除；同时杂草稻与栽培稻争水争肥，本身产量水平低，种皮为棕红色，对栽培水稻的产量和品质影响较大，造成产量损失和商品品质下降，给农民造成巨大的经济损失。杂草稻的来源尚未清楚，其亲本来源更无从得知，不同地区和不同田块出现的杂草稻类型各异，遗传分化较大，分散性和特异性明显。因此，一种快速、简便的杂草稻籼、粳性鉴别方法，可以准确分析杂草稻的籼粳性，有利于研究杂草稻的来源、控制杂草稻的发生，同时对于阐明杂草稻的起源进化机制具有重要意义。本发明以分别含有45S rDNA和Os48序列的克隆作探针，进行有丝分裂前中期染色体双色荧光原位杂交，根据这两个DNA重复序列的数目和分布特点，对杂草稻的籼粳性进行快速、准确鉴别，可以为研究杂草稻起源和分化提供分子细胞学依据。利用DNA特异重复序列，以分子细胞学方法来鉴别杂草稻的籼粳性，目前还未见报道。
发明内容
本发明的目的在于：针对目前杂草稻籼粳分类方法，主要是根据其形态学和生理学特征、分子标记进行分析。形态学和生理学特性方法所需要分析的目的性状较多、所需的时间长，比较繁杂。分子标记分析方法大多用于杂草稻的遗传多样性研究，用于杂草稻籼粳性鉴别的特异分子标记还很少，单一标记鉴别杂草稻的籼粳性，容易产生误差。本发明以两个DNA特异重复序列为探针，采用双色荧光原位杂交方法，根据DNA重复序列在染色体上的位点数目和分布特点，提供一种直观、简便、快速鉴别杂草稻籼粳性的分子细胞学方法。
本发明的目的是这样实现的：通过两个DNA重复序列鉴别杂草稻籼粳性的方法，其特征在于：以含有小麦45S rDNA基因序列的克隆pTA71和水稻AA组染色体亚端粒串联重复序列的克隆pOs48，质粒DNA提取后，通过缺刻平移法，用地高辛-dUTP标记的pOs48和用生物素-dUTP标记的pTA71，形成45S rDNA和Os48探针，用于对杂草稻的籼粳性鉴别，具体步骤是：
a)将被鉴定的杂草稻有丝分裂前中期染色体制片，在染色体制片上加150ul 70％formamide/2×SSC，用22×40mm盖玻片盖片，置于90℃热台上变性3-4min后，揭去盖玻片，迅速将载玻片置于-20℃的70％酒精中洗涤5min，然后在90％、100％酒精中分别洗涤5min，取出载玻片，在空气中干燥；
b)配制含有探针的杂交液，在含有探针的22ul杂交液中：10ul去离子甲酰胺，2ul 20×SSC，2ul浓度为10mg/ml的ssDNA，2ul pOs48探针，2ul pTA71探针，4ul浓度为50％的硫酸葡聚糖；将配制好的杂交液置于100℃水浴中变性，变性后杂交液置于冰上；
c)在每张经过变性的染色体制片上，加上22ul含有pOs48和pTA71探针的变性杂交液，盖上盖玻片，置于保湿盒内，在37℃恒温箱中，8-10h，进行双色荧光原位杂交，获得杂交后的染色体制片；
d)揭去盖玻片，用1×PBS对杂交后的染色体制片洗涤三次，在避光条件下对其信号进行检测；
e)根据重复序列Os48和45S rDNA在杂草稻有丝分裂前中期染色体上杂交信号的数目和分布特点，来鉴别其籼、粳性，其中：
45S rDNA位点数目为显示绿色杂交信号的1对，Os48位点数目为显示红色杂交信号的2-3对，在有45S rDNA位点的染色体上无Os48杂交信号，为粳型；
45S rDNA位点数目为显示绿色杂交信号的2对，Os48位点数目为显示红色杂交信号6-7对，在有45S rDNA位点的染色体上均有Os48杂交信号，为籼型。
在本发明中：45S rDNA探针是这样获得的：pTA71克隆含有小麦45S rDNA基因序列，它的质粒DNA的抽提按QIAGEN plasmid miniprep kit进行；用缺刻平移法标记探针，该方法为在2ug DNA于1.5ml的Eppendorf管中，加入10×Buffer 10ul、0.5mM dNTP 10ul、0.5mMbiotin-dUTP 10ul、DNA polymerase I 2.4ul、DNase I 4ul，用无菌超纯水补足至100ul，充分混匀；置于15℃水浴2h后，加入10ul 0.2M EDTA以终止反应；
Os48探针是这样获得的：pOs48克隆含有355bp水稻AA组染色体亚端粒串联重复序列，它的质粒DNA的抽提按QIAGEN plasmid miniprep kit进行；用缺刻平移法标记探针，该方法为在2ug DNA于1.5ml的Eppendorf管中，加入10×Buffer 10ul、0.5mM dNTP 10ul、0.5mMdig-dUTP 10ul、DNA polymerase I 2.4ul、DNase I 4ul，用无菌超纯水补足至100ul，充分混匀；置于15℃水浴2h后，加入10ul 0.2M EDTA以终止反应；
其中：所述的10×Buffer中，0.5M Tris HCl pH 7.5，50mM MgCl2；所述的DNA polymeraseI中，8unit/ul；所述的DNase I中，0.1unit/ul；
45S rDNA和Os48探针片段的大小为100bp-500bp。
在本发明中：将被鉴定的杂草稻有丝分裂前中期染色体制片是指：被鉴定的杂草稻种子发芽后或将移栽于田间的杂草稻植株，取其幼根经8-羟基喹啉溶液预处理，然后用卡诺氏固定液固定，固定后的幼根根尖经纤维素酶和果胶酶混合液酶解后，用火焰干燥法进行有丝分裂中期染色体制片；所述的将配制好的杂交液置于100℃水浴中变性，变性后杂交液置于冰上是指：将配制好的杂交液置于100℃水浴中变性10min，然后迅速将变性杂交液置于冰上，10min后用于后续的荧光原位杂交。
在本发明中：取其幼根经8-羟基喹啉溶液预处理是指：将不同杂草稻品种种子分别置于垫有两层滤纸的培养皿中，加适量蒸馏水，在25℃恒温箱中催芽，露白后吸去多余水份，继续在25℃恒温箱中生长，待根长至1-2cm时，用剪刀剪取幼根，或直接剪取移栽至大田的杂草稻的幼根，浸于2mM 8-羟基喹啉中，20℃水浴条件下预处理2h后，用蒸馏水洗涤2次；
所述的固定后的幼根根尖经纤维素酶和果胶酶混合液酶解是指：固定12h后，取出幼根，用蒸馏水洗涤2-3次；切取幼根根尖置于2％纤维素酶和1％果胶酶的混合液中，37℃，酶解30-45min，用蒸馏水清洗酶解根尖2次；
所述的火焰干燥法进行有丝分裂中期染色体制片是指：用卡诺氏固定液固定5min；取一个根尖置于载玻片上，加适量固定液于载玻片上，用镊子尖端迅速敲碎根尖，再加几滴固定液于载玻片上，点燃载玻片后，斜置玻片，在空气中干燥；
卡诺氏固定液中，甲醇与乙酸的体积比为3∶1。
在本发明中：在避光条件下对其信号进行检测是指：在避光条件将每张杂交后的染色体制片加100ul含有抗地高辛抗体与荧光剂Rhodamine的复合物和抗生物素与荧光剂Fluorescein的复合物的1×TNB检测液，以分别检测用地高辛-dUTP标记的pOs48和用生物素-dUTP标记的pTA71，盖上盖玻片，置于保湿盒内，37℃恒温箱中，60min。揭去盖玻片后，用1×PBS洗涤三次，在空气中晾干载玻片，加入含有DAPI的抗褪色剂，盖上盖玻片，在Olympus BX60荧光显微镜下使用不同滤光片分别观察染色体和杂交信号，Os48位点显示红色信号，45S rDNA位点显示绿色信号，染色体显示蓝色信号，并用CCD摄像机将图像输入到计算机中，用IPL 4.0软件合成图片，获得检测结果
本发明的优点在于：(1)剪取幼根简便，可以通过杂草稻种子发芽后取根，也可以在田间剪取杂草稻植株的幼根；(2)对田间出现的新的杂草稻植株，取其幼根，直接、快速鉴定其籼粳性；(3)利用两个DNA特异重复序列进行双色荧光原位杂交，可靠性高；(4)重复性好，不同时期、植株不同发育阶段的幼根，分析获得的结果一致；(5)所需的时间短，一般1-2天；(6)与其他鉴定方法(如：形态学鉴定、分子标记鉴定)的结果吻合度高；(7)不需要同时检测籼、粳对照品种。
具体实施方式
实施例1
配制含有探针的杂交液
a)45S rDNA探针是这样获得的：所用pTA71克隆含有小麦45S rDNA基因序列，它的质粒DNA的抽提按QIAGEN plasmid miniprep kit进行。缺刻平移法标记探针，45S rDNA探针标记方法为，2ug质粒DNA于1.5ml的Eppendorf管中，加入10×Buffer(0.5M Tris HCl pH7.5，50mM MgCl2)10ul、0.5mM dNTP 10ul、0.5mM biotin-dUTP 10ul、DNA polymerase I 2.4ul(8unit/ul)、DNase I 4ul(0.1unit/ul)，用无菌超纯水补足至100ul，充分混匀；置于15℃水浴2h后，加入10ul 0.2M EDTA以终止反应；取3ul标记的探针溶液，经1％的琼脂糖胶电泳检测，标记探针片段的大小为100bp-500bp。
Os48探针是这样获得的：pOs48克隆含有355bp水稻AA组染色体亚端粒串联重复序列，它的质粒DNA的抽提按QIAGEN plasmid miniprep kit进行；用缺刻平移法标记探针，Os48探针标记方法为，2ug质粒DNA于1.5ml的Eppendorf管中，加入10×Buffer(0.5M Tris HClpH 7.5，50mM MgCl2)10ul、0.5mM dNTP 10ul、0.5mM dig-dUTP 10ul、DNA polymerase I2.4ul(8unit/ul)、DNase I 4ul(0.1unit/ul)，用无菌超纯水补足至100ul，充分混匀；置于15℃水浴2h后，加入10ul 0.2M EDTA以终止反应；取3ul标记的探针溶液，经1％的琼脂糖胶电泳检测，标记探针片段的大小为100bp-500bp。
b)配制含有探针的杂交液
每22ul杂交液，其组成为10ul去离子甲酰胺，2ul 20×SSC，2ul浓度为10mg/ml的ssDNA(鲑鱼精DNA)，2ul pOs48探针，2ul pTA71探针，4ul浓度为50％的硫酸葡聚糖(dextransulfate)。杂交液变性：将配制好的杂交液置于100℃水浴中变性10min，然后迅速将杂交液置于冰上，10min后用于荧光原位杂交。
实施例2
将被鉴定的杂草稻的标本制备
a)鉴定的杂草稻
杂草稻材料19份，其中：来源于安徽的肥东塘稻1份、怀远塘稻1份，来源于江苏的橹稻1份、扬中杂草稻5份、楚州杂草稻1份、高邮杂草稻1份、盐都杂草稻1份、灌云杂草稻1份、如皋杂草稻2份、阜宁杂草稻1份、姜堰杂草稻2份，来源于辽宁的杂草稻2份。
b)将被鉴定的杂草稻有丝分裂前中期染色体制片、变性
将不同杂草稻品种种子分别置于垫有两层滤纸的培养皿中，加适量蒸馏水，在25℃恒温箱中催芽，露白后吸去多余水份，继续在25℃恒温箱中生长，待根长至1-2cm时，用剪刀剪取幼根，或直接剪取移栽至大田的杂草稻的幼根，浸于2mM 8-羟基喹啉中，20℃水浴条件下预处理2h后，将幼根用蒸馏水洗涤2次，然后用卡诺氏固定液(甲醇∶乙酸的体积比为3∶1)固定。固定12h后，取出幼根，用蒸馏水洗涤2-3次。切取幼根根尖置于2％纤维素酶和1％果胶酶的混合液中，37℃，酶解30-45min。用蒸馏水清洗酶解根尖2次，用卡诺氏固定液(甲醇∶乙酸为3∶1)固定5min。取一个根尖置于载玻片上，加适量固定液于载玻片上，用镊子尖端迅速敲碎根尖，再加适量固定液于载玻片上，点燃载玻片后，斜置玻片。在空气中干燥后，加150ul 70％ formamide(甲酰胺)/2×SSC，用22×40mm盖玻片盖片，置于90℃热台上变性3-4min后，揭去盖玻片，迅速将载玻片置于-20℃的70％酒精中洗涤5min，然后分别在90％、100％酒精中洗涤5min。取出载玻片，在空气中干燥后用于荧光原位杂交。
实施例3
a)荧光原位杂交
将实施例2获得的每张经过变性的染色体制片上加入实施例1提供的22ul变性杂交液，盖上22×40mm盖玻片，置于湿盒内，37℃恒温箱中，8-10h。杂交后，揭去盖玻片，用1×PBS洗涤三次，每次5min。
b)检测
杂交信号检测过程在避光条件下进行，杂交后的染色体制片，加100ul含有抗地高辛抗体与荧光剂Rhodamine的复合物(anti-dig-Rhodamine)和抗生物素与荧光剂Fluorescein的复合物(anti-biotin-Fluorescein)的1×TNB检测液，盖上盖玻片，置于避光保湿盒内，37℃条件下60min后，用1×PBS洗涤三次，每次5min。晾干载玻片，加入20ul含有2ug/ml DAPI的抗褪色剂，盖上盖玻片，在Olympus BX60荧光显微镜下使用不同滤光片分别观察染色体和杂交信号，Os48位点显示红色信号，45S rDNA位点显示绿色信号，染色体显示蓝色。用CCD(charge coupled device)摄像机将图像输入到计算机中，用IPL 4.0软件合成图片，用Adobe Photoshop 6.0调节对比度和亮度。
c)鉴定
根据杂草稻有丝分裂前中期染色体上45S rDNA和Os48位点数目和分布特点，对不同来源的杂草稻进行籼粳分类。其中粳型杂草稻，1对45S rDNA位点(显示绿色信号)，2-3对Os48位点(显示红色信号，在有45S rDNA位点的染色体上无Os48杂交信号)；籼型杂草稻，2对45S rDNA位点(显示绿色信号)，6-7对Os48位点(显示红色信号，在有45S rDNA位点的染色体上均有Os48杂交信号)。
从表1可以看出，19份不同来源的杂草稻有两类，即籼型杂草稻和粳型杂草稻，16份杂草稻分类结果与已知的形态学特性、分子标记等方法的分类结果相吻合。粳型杂草稻中，橹稻、肥东塘稻、怀远塘稻均含有1对45S rDNA位点(显示绿色信号)，2对Os48位点(显示红色信号，在有45S rDNA位点的染色体上无Os48杂交信号)；2份来源于辽宁的杂草稻含有1对45S rDNA位点(显示绿色信号)，3对Os48位点(显示红色信号，在有45S rDNA位点的染色体上无Os48杂交信号)。籼型杂草稻中，阜宁杂草稻、1份如皋杂草稻和2份姜堰杂草稻均含有2对45S rDNA位点(显示绿色信号)，6对Os48位点(显示红色信号，在有45S rDNA位点的染色体上均有Os48杂交信号)；高邮杂草稻、楚州杂草稻、盐都杂草稻、灌云杂草稻、1份如皋杂草稻和5份扬中杂草稻含有2对45S rDNA位点(显示绿色信号)，7对Os48位点(显示红色信号，在有45S rDNA位点的染色体上均有Os48杂交信号)。鉴定结果记录在表1中。
表1 19份杂草稻45S rDNA和Os48位点数目及籼粳分类
表1的19份杂草稻品种中16份杂草稻品种籼粳性是已知的，资料分别来源于文献Tang和Hiroko，Breeding Science，1997，47：153-160；魏兴华等，中国农业科学，2004，37(7)：937-942；仲维功等，江苏农业学报，2006，22(3)：238-242；杨杰等，中国水稻科学，2009，23(4)：391-397。
通过表1的比对，可见本方法的籼粳性鉴定结果与公众已知的、采用形态学方法或分子标记方法鉴定结果具有较高的吻合度。
以上各实施例不是对本发明的具体限制，只要利用本发明涉及的方法，通过两个DNA重复序列对杂草稻籼粳性鉴别，都属于本发明的保护范围。
Claims (5)
1.通过两个DNA重复序列鉴别杂草稻籼粳性的方法，其特征在于：以含有小麦45S rDNA基因序列的克隆pTA71和水稻AA组染色体亚端粒串联重复序列的克隆pOs48，质粒DNA提取后，通过缺刻平移法，用地高辛-dUTP标记的pOs48和用生物素-dUTP标记的pTA71，形成45S rDNA和Os48探针，用于对杂草稻的籼粳性鉴别，具体步骤是：
a) 将被鉴定的杂草稻有丝分裂前中期染色体制片，在染色体制片上加150 ul 70% formamide/2×SSC，用22×40mm盖玻片盖片，置于90℃热台上变性3-4min后，揭去盖玻片，迅速将载玻片置于-20℃的70％酒精中洗涤5min，然后在90％、100％酒精中分别洗涤5min，取出载玻片，在空气中干燥；
b) 配制含有探针的杂交液，在含有探针的22 ul杂交液中：10 ul去离子甲酰胺，2 ul 20×SSC，2 ul浓度为10 mg/ml 的ssDNA，2ul pOs48探针，2ul pTA71探针，4 ul浓度为50％的硫酸葡聚糖；将配制好的杂交液置于100℃水浴中变性，变性后杂交液置于冰上；
c) 在每张经过变性的染色体制片上，加上22 ul含有pOs48和pTA71探针标记的变性杂交液，盖上盖玻片，置于保湿盒内，在37℃恒温箱中，8-10h，进行双色荧光原位杂交，获得杂交后的染色体制片；
d) 揭去盖玻片，用1×PBS对杂交后的染色体制片洗涤三次，在避光条件下对其信号进行检测；
e) 根据重复序列Os48和45S rDNA在杂草稻有丝分裂前中期染色体上杂交信号的数目和分布特点，来鉴别其籼、粳性，其中：
45S rDNA位点数目为显示绿色杂交信号的1对，Os48位点数目为显示红色杂交信号的2-3对，在有45S rDNA位点的染色体上无Os48杂交信号，为粳型；
45S rDNA位点数目为显示绿色杂交信号的2对，Os48位点数目为显示红色杂交信号6-7对，在有45S rDNA位点的染色体上均有Os48杂交信号，为籼型。
2.根据权利要求1所述的通过两个DNA重复序列鉴别杂草稻籼粳性的方法，其特征在于：45S rDNA探针是这样获得的：pTA71克隆含有小麦45S rDNA基因序列，它的质粒DNA的抽提按QIAGEN plasmid miniprep kit进行；用缺刻平移法标记探针，该方法为在2ug DNA于1.5 ml的Eppendorf管中，加入10×Buffer 10 ul、0.5 mM dNTP 10 ul、0.5 mM biotin-dUTP 10 ul、DNA polymerase I 2.4 ul、DNase I 4 ul，用无菌超纯水补足至100 ul，充分混匀；置于15℃水浴2 h后，加入10 ul 0.2M EDTA以终止反应；
Os48探针是这样获得的：pOs48克隆含有355bp水稻AA组染色体亚端粒串联重复序列，它的质粒DNA的抽提按QIAGEN plasmid miniprep kit进行；用缺刻平移法标记探针，该方法为在2ug DNA于1.5 ml的Eppendorf管中，加入10×Buffer 10 ul、0.5 mM dNTP 10 ul、0.5 mM dig-dUTP 10 ul、DNA polymerase I 2.4 ul、DNase I 4 ul，用无菌超纯水补足至100 ul，充分混匀；置于15℃水浴2 h后，加入10 ul 0.2M EDTA以终止反应；
其中：所述的10×Buffer中，0.5 M Tris HCl pH 7.5, 50 mM MgCl2；所述的DNA polymerase I 中，8 unit/ ul；所述的DNase I 中，0.1 unit/ ul；
45S rDNA和Os48探针片段的大小为100 bp-500bp。
3.根据权利要求1所述的通过两个DNA重复序列鉴别杂草稻籼粳性的方法，其特征在于：将被鉴定的杂草稻有丝分裂前中期染色体制片是指：被鉴定的杂草稻种子发芽后或将移栽于田间的杂草稻植株，取其幼根经8-羟基喹啉溶液预处理，然后用卡诺氏固定液固定，固定后的幼根根尖经纤维素酶和果胶酶混合液酶解后，用火焰干燥法进行有丝分裂中期染色体制片；所述的将配制好的杂交液置于100℃水浴中变性，变性后杂交液置于冰上是指：将配制好的杂交液置于100℃水浴中变性10min，然后迅速将变性杂交液置于冰上，10min后用于后续的荧光原位杂交。
4.根据权利要求3所述的通过两个DNA重复序列鉴别杂草稻籼粳性的方法，其特征在于：取其幼根经8-羟基喹啉溶液预处理是指：将不同杂草稻品种种子分别置于垫有两层滤纸的培养皿中，加适量蒸馏水，在25℃恒温箱中催芽，露白后吸去多余水份，继续在25℃恒温箱中生长，待根长至1-2 cm时，用剪刀剪取幼根，或直接剪取移栽至大田的杂草稻的幼根，浸于2mM 8-羟基喹啉中，20℃水浴条件下预处理2 h后，用蒸馏水洗涤2次；
所述的固定后的幼根根尖经纤维素酶和果胶酶混合液酶解是指：固定12h后，取出幼根，用蒸馏水洗涤2-3次；切取幼根根尖置于2%纤维素酶和1%果胶酶的混合液中，37℃，酶解30-45min，用蒸馏水清洗酶解根尖2次；
所述的火焰干燥法进行有丝分裂中期染色体制片是指：用卡诺氏固定液固定5min；取一个根尖置于载玻片上，加适量固定液于载玻片上，用镊子尖端迅速敲碎根尖，再加几滴固定液于载玻片上，点燃载玻片后，斜置玻片，在空气中干燥；
卡诺氏固定液中，甲醇与乙酸的体积比为3：1。
5.根据权利要求1所述的通过两个DNA重复序列鉴别杂草稻籼粳性的方法，其特征在于：在避光条件下对其信号进行检测是指：在避光条件将每张杂交后的染色体制片加100ul 含有抗地高辛抗体与荧光剂Rhodamine的复合物和抗生物素与荧光剂Fluorescein的复合物的1×TNB检测液，以分别检测用地高辛-dUTP标记的pOs48和用生物素-dUTP标记的pTA71，盖上盖玻片，置于保湿盒内，37℃恒温箱中，60 min；揭去盖玻片后，用1×PBS洗涤三次，在空气中晾干载玻片，加入含有DAPI的抗褪色剂，盖上盖玻片，在Olympus BX60荧光显微镜下使用不同滤光片分别观察染色体和杂交信号，Os48位点显示红色信号，45S rDNA位点显示绿色信号，染色体显示蓝色信号，并用CCD摄像机将图像输入到计算机中，用IPL 4.0软件合成图片，获得检测结果。
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