发明内容
本发明所要解决的技术问题在于,提供一种高蛋白质含量的水稻新品 种选育方法,即通过在原有二倍体高蛋白含量水稻品种的基础上,通过进 行染色体加倍,从而选育出蛋白质含量较高的多倍体水稻品系。
为解决上述技术问题,本发明提供了一种高蛋白质水稻品系的选育方 法,通过在原有二倍体高蛋白含量水稻品种的基础上,通过染色体加倍技 术诱导成对应的四倍体,进而筛选蛋白质含量明显提高的稳定品系。
所述高蛋白质水稻品系的选育方法,优选包括以下步骤:
A选用蛋白质含量≥8%的籼稻或粳稻品系杂交,其中粳稻作母本, 籼稻作父本;
B将杂交种F1代同对应母本做回交,连续回交3-5代;
C将回交3-5代后的杂交种通过组织培养的方法加倍形成多倍体水稻 株;
D对形成的多倍体水稻株进行育种学特征选择,同时鉴定染色体倍数: 以染色体组鉴定技术确定多倍体新种质的染色体组型;
E筛选鉴定为四倍体的植株自交形成稳定的品系:大田种植3-5代至 形成稳定的品系。
所述步骤A或步骤B可以进一步包括:根据父本盛花期时间,安排 去雄时间,选取露出叶鞘2/3-4/5的母本稻穗,剪去剑叶,露出全穗,在 阳光下检查穗花发育情况,除去穗上部已经授粉花。
判断穗上部已经授粉花的方法可以为:颖花基部有一个小黑影点者为 已授粉花;颖花中部有一较大黑影点者为当天不能开的花;颖花顶端全是 黑影者为当天将开的花。
所述步骤A或步骤B可以进一步包括:留下之花,将花颖上部倾斜 剪去,外颖部分应剪去1/3~2/5,内颖部分应剪去1/4~1/5;然后在不损伤 雌蕊的前提下从切口处伸入将六个雄蕊全部除去。
所述步骤A或步骤B可以进一步包括:去雄时,由上部小穗依次而 下,防止花药落在下部的小穗上;去雄完毕,即套上透明纸袋,纸袋下方 折密,用回形针夹住;同时剪去其它未去雄的穗子。
所述步骤A或步骤B可以进一步包括:授粉时把正在开花的父本穗 小心剪下2-3个,放入纸袋内用手振动,使花粉均匀落在母本柱头上;授 粉后把套袋口折好用回形针别牢,以免非父本的花粉落入,同时系上杂交 挂牌。
所述步骤A或步骤B可以进一步包括:杂交后9~12天把套袋上端口 敞开,防止霉变,收获时只收剪颖粒。
所述步骤C优选进一步包括:
(1)种子消毒;
(2)光照培养;
(3)继代培养;
(4)分化培养;
(5)生根培养;
(6)炼苗移栽;
(7)多倍体高蛋白质水稻田间鉴定。
为解决上述技术问题,本发明还提供了一种如前述任一项高蛋白质水 稻品系的选育方法培育的高蛋白质水稻。
本发明有益效果包括:在原有二倍体高蛋白含量水稻品种的基础上, 通过染色体加倍技术诱导成对应的四倍体,基因组含量增加一倍,其染色 体数量的变化决定水稻的品质变化,因此蛋白质含量会比对应的二倍体有 大幅提高,进而筛选蛋白质含量明显提高的稳定品系即选育的蛋白质含量 高的多倍体稳定品系。
具体实施方式
下面结合实施例详述本发明。为使本发明的目的、技术方案及优点更 加清楚、明确,以下举实施例对本发明进一步详细说明,但本发明并不局 限于这些实施例。
在本发明的一实施例中,提供了一种高蛋白质多倍体水稻品系的选育 方法,具体实施步骤为:
A选用优质籼稻或粳稻品系杂交(蛋白质含量≥8%),每个品系选择 10个,组成10个组合其中粳稻作母本,籼稻作父本;
剪颖去雄杂交方法:根据父本盛花期时间,安排去雄时间,选取露出 叶鞘2/3-4/5的母本稻穗,剪去剑叶,露出全穗,在阳光下检查穗花发育 情况,除去穗上部已经授粉花(,颖花基部有一个小黑影点着为已授粉花,颖 花中部有一较大黑影点者为当天不能开的花,颖花顶端全是黑影者为当天 将开的花),基部小穗常不能结实或发育不好,留下中部小穗50-100个(水 稻每一小穗只有一朵花)。留下之花,将花颖上部倾斜剪去,外颖部分应剪 去多些,约三分之一,内颖宜少些,因为内颖切除过多会妨碍子房的发育, 然后用小摄子从切口处伸入将六个雄蕊全部除去(,切勿损伤雌蕊),去雄时, 宜由上部小穗依次而下,以防花药落在下部的小穗上,去雄完毕,即套上 透明纸袋,纸袋下方折密,用回形针夹住。同时剪去其他未去雄的穗子。 授粉时把正在开花的父本穗轻轻剪下2-3个,放入纸袋内用手振动,使花 粉均匀落在母本柱头上。授粉后把套袋口折好用回形针别牢,以免非父本 的花粉落入,同时系上杂交挂牌。杂交后10天应把套袋上端口敞开,以 防霉变,收获时只收剪颖粒。
B将杂交种F1代同对应母本做回交,连续回交3-5代;
回交:同剪颖去雄法;
C将回交3-5代后的杂交种通过组织培养的方法加倍形成多倍体水稻 株;
(1)将杂交种子去壳,挑选胚完整的用于接种;
(2)将种子按照如下程序进行消毒:无菌水清洗3-5次,75%的乙醇 消毒1.5min,之后用17%-20%次氯酸钠消毒45min(时间可以适当调整), 再用无菌水清洗5次,每次3min。然后将水稻种子转移至无菌纸上,吸 干种子表面的水份并在超净工作台中彻底吹干,接种到愈伤诱导培养基上, 每个培养皿接种20-30粒种子;
(3)将接种有水稻种子的培养皿置于恒温箱中光照培养,温度设置 为28℃,光周期为16h光照,8h黑暗,定期观察统计愈伤组织诱导情况; 10-15d左右时,将诱导出的结构疏松、颜色浅而透明的橙黄愈伤组织切下 来,转移到新的培养基上进行继代培养,一个培养皿中放置15-20块,培 养条件同诱导培养;
(4)15d后,将继代出的愈伤组织进行第二次继代培养,继代时间 为7-10d。之后用灭菌的NB液体培养基+秋水仙素浸泡,500mg/L秋水仙 素,在70转/分摇床上浸泡48h。
(5)诱导后的材料从摇床上取出,在无菌环境下无菌钢网滤过,无 菌水冲洗三次,每次大于等于3min,置于无菌纸上吹干1h左右,再次接 种到继代培养基上恢复愈伤活性并淘汰褐化愈伤,7-10天时接到含有分化 培养基的培养瓶中,一个培养瓶中放置3-4块,将接有愈伤组织的分化培 养基置于光照箱中培养,光照时间16h,黑暗8h,温度设置为28℃;。
(6)将分化培养基中已长4-5cm的苗接到生根培养基上;一个培养 瓶中放置2-3颗苗;
(7)将接有苗的生根培养基置于光照箱中培养,光照时间16h,黑 暗8h,温度设置为28℃,定期观察统计苗的生长状况,待苗长根并且有 3叶一心时,进行炼苗、移栽到大田。
D对形成的多倍体水稻株进行育种学特征选择,同时鉴定染色体倍数: 以染色体组鉴定技术确定多倍体新种质的染色体组型(2n=4x=48);
染色体组鉴定技术:
取材:上午9点到10点(此时细胞分裂旺盛,中期分裂相多),水稻 田中剪取所需材料生长旺盛的根尖(大约0.5-1em,用清水洗净)。
预处理:根尖经过预处理可以抑制纺锤体形成,使细胞分裂停止在中 期阶段,从而获得较多的中期分裂相,有4种预处理办法:一是把洗净的 根尖放入冰水混合物中,然后在4℃冰箱放置24小时;二是用0.05%-0.2% 的秋水仙素处理根尖,大约3小时;三是用0.002-0.004的8-羟基喹啉处 理根尖,(0.002低温4℃处理4h)(大约3小时);四是用饱和α-溴萘预处 理(把饱和α-溴萘放入管中,上下摇动,最后吸取下面的澄清作为最后的 预处理液体),大约3小时。
前低渗:将经过预处理的根尖用蒸馏水冲洗几次。
固定:把预处理好的根尖放入新鲜的固定液(甲醇:冰乙酸=3∶1) 中,然后放4℃冰箱,可以保存半年。
酶解:从固定液中取一定数量的根尖放入无菌水中,把根尖上的固定 液冲洗干净,然后用刀片切取根尖前部大约0.5mm(根尖留取太长,不利 于根尖吸收酶解液,以致影响解离效果,同时也会使后面的涂片杂质较多, 背景不清晰),用滤纸吸干上面的蒸馏水后放入酶解液中,每个装有酶解 液的管中放1-2个根尖即可,随后放进28℃的恒温箱。针对不同的材料, 酶解液的浓度和酶解时间也不同。2%纤维素酶+2%果胶酶,时间大约 4.5-5h;4%纤维素酶+3%或4%果胶酶,时间大约5h。
后低渗:用无菌水把根尖上的酶解液冲洗干净。
二次固定:把根尖放进固定液中再固定10多分钟。
制片:取2-3个根尖置于预先清洗好的干净载玻片上,滴半滴固定液 用镊子夹住根尖迅速敲打,若根尖酶解完全,则一敲即碎,且没有残余的 表皮。分散敲打,使染色体散开,玻片的两个边缘再分别滴一滴固定液, 迅速在酒精灯火焰上烤两下,然后甩掉玻片上的残余液体。
染色体观察
用相差显微镜观察玻片,20倍目镜即可观察到染色体。若用普通显微 镜观察,可以提前用扣染法进行染色,染液可选用卡宝品红。少量玻片扣 染法:将做好的玻片倒扣(有染色体的一面朝下)于一个干净的培养皿中, 从玻片的两边滴卡宝品红染液,大约15min后取出玻片,然后用细微的水 流稍加冲洗,在火焰上烤一下即成,此时应注意接触火焰的一面为无染色 体的一面。
将处理好的材料置于载玻片的中央,用滤纸吸去多余的溶液,加1滴 卡宝品红染色液,用解剖针将材料压碎并染色4-5min,盖上盖玻片,并在 盖玻片上盖一层滤纸,左手固定载玻片,右手用铅笔的橡皮头轻敲盖玻片, 然后用拇指在滤纸上方对材料进行施压,使材料尽量分散;以两指夹持载 玻片的2个长边,在酒精灯外焰上烤,但不能沸腾。镜检时先在低倍体镜 下观察,可见有丝分裂各时期的染色体,然后转换高倍镜观察。
E筛选鉴定为四倍体的植株自交形成稳定的品系,即大田种质约3-5 代至形成稳定的品系;
F对稳定的多倍体水稻品系种子进行蛋白质含量初评;蛋白质含量测 定方法如下:
1.标准曲线的制作:
取6只10ml刻度试管,编号,按下表数据配制牛血清白蛋白标准溶 液。准确吸取上述各管溶液0.1ml,对应放于另外6支10ml刻度试管中, 加入5ml考马斯亮兰G-250溶液,盖塞,将试管中溶液给向倒转混合,放 置2分钟后,用10mm光径的比色杯在595nm波长下比色。以光密度值为 纵坐标,以蛋白质浓度值为横坐标,制作出标准曲线。
2.样品中蛋白质提取:
(1)准确称取稻米粉0.5克,放入研钵中,加2ml0.1mol/LNaOH, 研磨成匀浆,转入到10ml离心管中,再用6ml 0.1mol/LNaOH分三次洗涤 研钵,洗液一并转入10ml离心管中,
用玻棒搅拌,放置30分钟,放置过程间断搅动数次。3500rpm离心 15分钟,上清液转入50ml容量瓶中,用蒸馏水定容到刻度,摇匀,得碱 溶性蛋白。
(2)将上述沉淀用70%乙醇重复提取,操作步骤同上,得醇溶性蛋 白。
3.测定:
吸取提取液0.1ml,放入10ml具塞刻度试管中,加5ml考马斯亮兰 G-250试剂,混匀,放置2分钟,用10mm光径的比色杯在595nm波长下 比色(比色空白用0.1ml蒸馏水代替提取液与5ml考马斯亮兰G-250试剂 混合),记录OD值。然后根据所测OD595nm在标准曲线上查出所对应的 蛋白质浓度(C)。
4.结果计算:
蛋白质含量(%)=查表所得蛋白质浓度(ug/ml)×提取液总体积(ml) /样品重(g)×106
G选取蛋白质含量高于10%的优质水稻品系种植,即为高蛋白多倍体 稳定品系新品种。
在本发明另一实施例中,提供了一种高蛋白质水稻品系的选育方法, 通过在原有二倍体高蛋白含量水稻品种的基础上,通过染色体加倍技术诱 导成对应的四倍体,进而筛选蛋白质含量明显提高的稳定品系。
所述高蛋白质水稻品系的选育方法,优选包括以下步骤:
A选用蛋白质含量≥8%的籼稻或粳稻品系杂交,其中粳稻作母本, 籼稻作父本;
B将杂交种F1代同对应母本做回交,连续回交3-5代;
C将回交3-5代后的杂交种通过组织培养的方法加倍形成多倍体水稻 株;
D对形成的多倍体水稻株进行育种学特征选择,同时鉴定染色体倍数: 以染色体组鉴定技术确定多倍体新种质的染色体组型;
E筛选鉴定为四倍体的植株自交形成稳定的品系:大田种植3-5代至 形成稳定的品系。
所述步骤A或步骤B可以进一步包括:根据父本盛花期时间,安排 去雄时间,选取露出叶鞘2/3-4/5的母本稻穗,剪去剑叶,露出全穗,在 阳光下检查穗花发育情况,除去穗上部已经授粉花。
判断穗上部已经授粉花的方法可以为:颖花基部有一个小黑影点者为 已授粉花;颖花中部有一较大黑影点者为当天不能开的花;颖花顶端全是 黑影者为当天将开的花。
所述步骤A或步骤B可以进一步包括:留下之花,将花颖上部倾斜 剪去,外颖部分应剪去1/3~2/5,内颖部分应剪去1/4~1/5;然后在不损伤 雌蕊的前提下从切口处伸入将六个雄蕊全部除去。
所述步骤A或步骤B可以进一步包括:去雄时,由上部小穗依次而 下,防止花药落在下部的小穗上;去雄完毕,即套上透明纸袋,纸袋下方 折密,用回形针夹住;同时剪去其它未去雄的穗子。
所述步骤A或步骤B可以进一步包括:授粉时把正在开花的父本穗 小心剪下2-3个,放入纸袋内用手振动,使花粉均匀落在母本柱头上;授 粉后把套袋口折好用回形针别牢,以免非父本的花粉落入,同时系上杂交 挂牌。
所述步骤A或步骤B可以进一步包括:杂交后9~12天把套袋上端口 敞开,防止霉变,收获时只收剪颖粒。
所述步骤C优选进一步包括:
(1)种子消毒;
(2)光照培养;
(3)继代培养;
(4)分化培养;
(5)生根培养;
(6)炼苗移栽;
(7)多倍体高蛋白质水稻田间鉴定。
在本发明再一实施例中,还提供了一种如前述任一项高蛋白质水稻品 系的选育方法培育的高蛋白质水稻。
选取本身蛋白含量高的优质粳稻和籼稻杂交,利用杂种优势和多倍体 效应,从而选取蛋白含量高的多倍体品系,这为优质多倍体水稻品种选育 提供了一个新的途径,并且经过这种方法培育的多倍体品系蛋白质含量平 均提高30%左右,达到蛋白含量高品种标准(大于10%)。
杂交水稻具有杂种优势效应,这种优势效应不仅表现在产量上,也体 现在稻米品质上,因此杂交种本身就具有父母本二者的优势,再通过与母 本的回交3-5代可形成稳定二倍体品系,之后通过染色体加倍技术诱导成 对应的四倍体,基因组含量增加一倍,其染色体数量的变化决定水稻的品 质变化,因此蛋白质含量会比对应的二倍体有大幅提高,进而筛选蛋白质 含量明显提高的稳定品系即选育的蛋白质含量高的多倍体稳定品系。
以上所述,仅是本发明的几个实施例,并非对本发明做任何形式的限 制,虽然本发明以较佳实施例揭示如上,然而并非用以限制本发明,任何 熟悉本专业的技术人员,在不脱离本发明技术方案的范围内,利用上述揭 示的技术内容做出些许的变动或修饰均等同于等效实施案例,均属于本发 明技术方案保护范围内。