CN110161029A - 一种薄壳山核桃染色体核型分析方法 - Google Patents

一种薄壳山核桃染色体核型分析方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种薄壳山核桃染色体核型分析方法，包括以下步骤：在晴朗天气，于上午7:30～8:45或9:30，取植株侧芽或顶芽；将采集的侧芽或顶芽使用0.01％的秋水仙素处理4～6h，或使用0.01％的秋水仙素+2mmol 8‑羟基喹啉等体积混合液处理4～6h；将预处理后的侧芽或顶芽放入卡诺固定液中固定24h以上；倒去固定液，使用1mol/L盐酸60℃水浴加热解离7～9min；将材料转移至载玻片，用卡宝品红溶液染色2h；将材料和载玻片置于吸水纸上，盖上盖玻片，赶走气泡，使细胞分散压平；对压片进行镜检、拍照。上述技术方案中提供的薄壳山核桃染色体核型分析方法，通过压片法对薄壳山核桃染色体进行核型分析，为薄壳山核桃种植资源鉴定、遗传育种研究提供科学依据。

Description

一种薄壳山核桃染色体核型分析方法
技术领域
本发明涉及染色体核型分析技术领域，具体涉及一种薄壳山核桃染色体核型分析方法。
背景技术
薄壳山核桃(Carya illinoinensis)，胡桃科山核桃属植物，又名美国山核桃，长山核桃。原产美国和墨西哥北部，是世界上著名的干果树种之一。其坚果个大、壳薄，出仁率高，取仁容易，产量高；其果仁色美味香、无涩味、营养丰富，是理想的保健食品。薄壳山核桃亦是重要的木本油料植物，种仁油脂含量高达70％以上，其中不饱和脂肪酸含量高达97％，耐贮藏，是上等的食用油。薄壳山核桃还是优良的材用和绿化树种，集经济、生态、社会三大效益于一身。薄壳山核桃是重要的经济、木本油料树种，其营养丰富，蛋白质含量为6.0％～11.3％，脂类含量达65.9％～78.0％，总的可溶性糖为3.3％～5.3％，且富含维生素B1、B2及必需矿质元素等。薄壳山核桃树形高大，树势挺拔，是常用的观赏、遮阴和行道树种之一。我国引种薄壳山核桃已有百年历史，目前以江苏、浙江、云南较为集中。其中在亚热带东部和长江流域发展较好。据初步研究，国内外已选育了100多个品种，但是应用于生产栽培的仅有十几个品种。其中‘波尼’、‘马罕’、‘金华’、‘钟山25’由于其果实品质佳、抗病性好等特点，成为目前栽种面积最大的几个品种。
染色体是与遗传信息有关的一组生物大分子，在有丝分裂时期，细胞内的这些生物大分子可以被碱性染料染成深色，所以叫染色体。染色体是遗传信息的载体，控制遗传和变异，也调控着染色体的结构和行为。研究染色体数目和类型有助于我们更深入的了解物种的起源与进化。染色体核型(Karyotype)通常是指一个物种细胞内(一般是指体细胞内有丝分裂中期)染色体数目、染色体类型及染色体结构等形态特征的总和，描述染色体核型的参数主要包括染色体数目、染色体核型公式、相对长度组成、臂比、着丝点指数等。核型分析能够辨别每条染色体的特征，判断染色体是否异常，可用于基因定位以及定体观察，它是细胞分类学、遗传学、植物育种学等一个不可或缺的技术。
核型分析是细胞学研究中的一种基本方法，是对染色体数目、长度、形态和“解剖学”特征等进行定量和定性表述，是物种分类的基本依据。植物染色体制片是植物分类学、植物遗传学等不可缺少的技术，是核型分析的关键，其中预处理是染色体制片的关键技术之一。目前常用的染色体制片技术有两种，即压片法和去壁低渗法。压片法操作简便，机动性好，但在处理某些细胞壁较硬不易软化的材料时，压片效果较差；去壁低渗法在处理中、小型染色体时能获得较清楚的像，但操作繁琐，机动性差，对制片技术有较高要求。目前，仅有杨帆(2001)和吕芳德等(2002)通过去壁低渗法对薄壳山核桃实生苗进行核型分析，尚未有通过压片法对薄壳山核桃品种苗进行研究的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种薄壳山核桃染色体核型分析方法，通过压片法对薄壳山核桃染色体进行核型分析，为薄壳山核桃种植资源鉴定、遗传育种研究提供科学依据。
为解决上述技术问题，本发明采用了以下技术方案：
一种薄壳山核桃染色体核型分析方法，包括以下步骤：
步骤S1.取材：在晴朗天气，于上午7:30～8:45或9:30，取薄壳山核桃植株侧芽或顶芽；
步骤S2.预处理：将采集的侧芽或顶芽使用0.01％的秋水仙素处理4～6h，或使用0.01％的秋水仙素+2mmol 8-羟基喹啉等体积混合液处理4～6h；
步骤S3.固定：将预处理后的侧芽或顶芽放入卡诺固定液中固定24h以上(不超过半年)；
步骤S4.解离：倒去固定液，使用1mol/L盐酸60℃水浴加热解离7～9min；
步骤S5.染色：将材料转移至载玻片，使用卡宝品红溶液染色2h；
步骤S6.压片：将染色后的材料和载玻片置于吸水纸上，用镊子盖上盖玻片，赶走气泡，使细胞分散压平；
步骤S7.镜检：将压片置于ZEISS Scope A1显微镜及Prog Res C5CCD下进行镜检、拍照。
其中，预处理过程是在4℃的遮光环境下进行的。
其中，卡诺固定液为无水乙醇和冰乙酸的混合液，且无水乙醇与冰乙酸的体积比为3:1。
上述技术方案中提供的薄壳山核桃染色体核型分析方法，采用上午7:30～8:45或9:30时间段的薄壳山核桃顶芽或侧芽，该时间段取材的材料处于分裂中期细胞最多，约占40～50％，最高能达到60％，便于后续观察；采用0.01％的秋水仙素处理4～6h，或使用0.01％的秋水仙素+2mmol 8-羟基喹啉等体积混合液预处理，整体染色体缢缩程度较好，形态清晰，着丝点清晰可见，适于计数与观察；解离7～9min时，细胞分散程度好，染色体染色效果最好，便于计数与观察；上述步骤处理后的染色体用于核型分析，为薄壳山核桃种植资源鉴定、遗传育种研究提供科学依据。
附图说明
图1为本发明实施例1预处理后的染色体显微镜像图；
图2为本发明实施例1中的染色体形态图；
图3为本发明实施例1中的染色体核型图；
图4为本发明实施例2中的染色体形态图；
图5为本发明实施例2中的染色体核型图；
图6为本发明实施例3中的染色体形态图；
图7为本发明实施例3中的染色体核型图；
图8为本发明实施例4中的染色体形态图；
图9为本发明实施例4中的染色体核型图。
具体实施方式
为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行具体说明。应当理解，以下文字仅仅用以描述本发明的一种或几种具体的实施方式，并不对本发明具体请求的保护范围进行严格限定。
实施例1
本实施例对‘波尼’薄壳山核桃染色体进行核型分析，具体包括以下步骤：
步骤S1.取材：在晴朗天气，于上午8:00，取‘波尼’薄壳山核桃植株侧芽；
步骤S2.预处理：将采集的侧芽使用0.01％的秋水仙素在4℃遮光环境下处理4h；
步骤S3.固定：将预处理后的侧芽放入卡诺固定液(V95％无水乙醇：V冰乙酸＝3:1)中固定24h；
步骤S4.解离：倒去固定液，使用1mol/L盐酸60℃水浴加热解离8min；
步骤S5.染色：将材料转移至载玻片，使用卡宝品红溶液染色2h；
步骤S6.压片：将染色后的材料和载玻片置于吸水纸上，用镊子盖上盖玻片，赶走气泡，使细胞分散压平；
步骤S7.镜检：将压片置于ZEISS Scope A1显微镜及Prog Res C5CCD下进行镜检、拍照。
实施例‘波尼’薄壳山核桃的染色体电镜图如图1中的a所示，染色体形态图如图2所示，核型模式图见图3，‘波尼’薄壳山核桃染色体分析结果如表1所示：
表1‘波尼’薄壳山核桃染色体分析结果
实施例2
本实施例对‘马罕’薄壳山核桃染色体进行核型分析，具体包括以下步骤：
步骤S1.取材：在晴朗天气，于上午7:30，取‘马罕’薄壳山核桃植株侧芽；
步骤S2.预处理：将采集的侧芽使用0.01％的秋水仙素+2mmol 8-羟基喹啉等体积混合液在4℃遮光环境下处理4h；
步骤S3.固定：将预处理后的侧芽放入卡诺固定液(V95％无水乙醇：V冰乙酸＝3:1)中固定26h；
步骤S4.解离：倒去固定液，使用1mol/L盐酸60℃水浴加热解离9min；
步骤S5.染色：将材料转移至载玻片，使用卡宝品红溶液染色2h；
步骤S6.压片：将染色后的材料和载玻片置于吸水纸上，用镊子盖上盖玻片，赶走气泡，使细胞分散压平；
步骤S7.镜检：将压片置于ZEISS Scope A1显微镜及Prog Res C5CCD下进行镜检、拍照。
实施例‘马罕’薄壳山核桃的染色体形态图如图4所示，核型模式图见图5，‘马罕’薄壳山核桃染色体分析结果如表2所示：
表2‘马罕’薄壳山核桃染色体分析结果
实施例3
本实施例对‘金华’薄壳山核桃染色体进行核型分析，具体包括以下步骤：
步骤S1.取材：在晴朗天气，于上午8:45，取‘金华’薄壳山核桃植株顶芽；
步骤S2.预处理：将采集的顶芽使用0.01％的秋水仙素+2mmol 8-羟基喹啉等体积混合液在4℃遮光环境下处理5h；
步骤S3.固定：将预处理后的顶芽放入卡诺固定液(V95％无水乙醇：V冰乙酸＝3:1)中固定24h；
步骤S4.解离：倒去固定液，使用1mol/L盐酸60℃水浴加热解离7min；
步骤S5.染色：将材料转移至载玻片，使用卡宝品红溶液染色2h；
步骤S6.压片：将染色后的材料和载玻片置于吸水纸上，用镊子盖上盖玻片，赶走气泡，使细胞分散压平；
步骤S7.镜检：将压片置于ZEISS Scope A1显微镜及Prog Res C5CCD下进行镜检、拍照。
实施例‘金华’薄壳山核桃的染色体形态图如图6所示，染色体核型图如图7所示，‘金华’薄壳山核桃染色体分析结果如表3所示：
表3‘金华’薄壳山核桃染色体分析结果
实施例4
本实施例对‘钟山25’薄壳山核桃染色体进行核型分析，具体包括以下步骤：
步骤S1.取材：在晴朗天气，于上午9:30，取‘钟山25’薄壳山核桃植株顶芽；
步骤S2.预处理：将采集的顶芽使用0.01％的秋水仙素在4℃遮光环境下处理6h；
步骤S3.固定：将预处理后的顶芽放入卡诺固定液(V95％无水乙醇：V冰乙酸＝3:1)中固定26h；
步骤S4.解离：倒去固定液，使用1mol/L盐酸60℃水浴加热解离9min；
步骤S5.染色：将材料转移至载玻片，使用卡宝品红溶液染色2h；
步骤S6.压片：将染色后的材料和载玻片置于吸水纸上，用镊子盖上盖玻片，赶走气泡，使细胞分散压平；
步骤S7.镜检：将压片置于ZEISS Scope A1显微镜及Prog Res C5CCD下进行镜检、拍照。
实施例‘钟山25’薄壳山核桃的染色体形态图如图8所示，染色体核型图如图9所示，‘钟山25’薄壳山核桃染色体分析结果如表4所示：
表4‘钟山25’薄壳山核桃染色体分析结果
对实施例1～4中的四种薄壳山核桃进行比较汇总，如表5所示：
表5四种薄壳山核桃比较汇总
以下为四个品种薄壳山核桃的具体分析：
(1)‘波尼’染色体数目32，相对长度变幅4.536～9.822，最长染色体与最短染色体比为2.18，臂比大于2的染色体占全体染色体比值19％，核型不对称系数为62.07％，核型类型为2B。共6条染色体为近中部着丝点染色体(sm)，9条染色体为中部着丝点染色体(m)，仅16号染色体为端部着丝点染色体。染色体相对长度组成2S+16M1+12M2+2L，核型公式：2n＝32＝12sm+18m+2T，核型模式图见图3。
(2)‘马罕’染色体数目32，相对长度变幅3.758～9.401，最长染色体与最短染色体比为2.50，臂比大于2的染色体占全体染色体比值19％，核型不对称系数为64.68％，核型类型为2B。共8条染色体为近中部着丝点染色体(sm)，7条染色体为中部着丝点染色体(m)，仅16号染色体为端部着丝点染色体。染色体相对长度组成6S+12M1+8M2+6L，核型公式：2n＝32＝16sm+14m+2T，核型模式图见图5。
(3)‘金华’染色体数目32，相对长度变幅5.006～11.84，最长染色体与最短染色体比为2.37，臂比大于2的染色体占全体染色体比值13％，核型不对称系数为62.47％，核型类型为2B。共5条染色体为近中部着丝点染色体(sm)，10条染色体为中部着丝点染色体(m)，仅16号染色体为端部着丝点染色体。染色体相对长度组成4S+12M1+14M2+2L，核型公式：2n＝32＝10sm+20m+2T，核型模式图见图7。
(4)‘钟山25’染色体数目32，相对长度变幅4.008～9.262，最长染色体与最短染色体比为2.31，臂比大于2的染色体占全体染色体比值25％，核型不对称系数为62.38％，核型类型为2B。共4条染色体为近中部着丝点染色体(sm)，10条染色体为中部着丝点染色体(m)，仅16号染色体为端部着丝点染色体。染色体相对长度组成6S+12M1+8M2+6L，核型公式：2n＝32＝8sm+22m+2T，核型模式图见图9。
附注：1.镜检图片分析主要采用Adobe Photoshop CS5、Microsoft Excel等软件进行数据采集和图片处理，参考周洲和乔永刚的方法(参考周洲,顾曙余.核型分析实验中的图像处理[J].生物学杂志,2010,27(6):95-96.以及乔永刚,宋芸.利用EXCLE制作核型模式图[J].农业网络信息,2006,(10):97-98.)来进行数据采集与制图；
2.核型分析参照：臂比值(臂比值＝长臂/短臂)等于1的染色体为正中着丝点染色体(M)，臂比值介于1.01～1.70的染色体为中部着丝粒染色体(m)，臂比值介于1.71～3.00的染色体为近中着丝粒染色体(sm)，臂比值介于3.01～7.00的染色体为近端着丝粒染色体(st)，臂比值＞7.00的染色体为端部着丝粒染色体(t)，臂比值趋于无穷大的染色体为端部着丝点染色体(T)；
3.核型分类依据Stebbins(Levan A,Fredga K,Sandberg AA.Nomenclature forCentromeric Position on Chromosomes[J].Hereditas,2010,52(2):201-220.)的分类标准进行，核不对称系数采用Arano(Arano H.Cytological studies in subfamilyCarduoideae(Compositae)of Japan IX.The karyotype analysis and phylogenicconsiderations on pertya and ainsliaea(2)[J].Botanical Magazine Tokyo,1963,76(895):32-39.)的方法计算，染色体相对长度参照Kuo(Kuo S R,Wang T T,Huang TC.Karyotype analysis of some Foromsan gymnosperms[J].Taiwania,1972.17(1):66-80.)的方法计算。
上面结合实施例对本发明的实施方式作了详细说明，但是本发明并不限于上述实施方式，对于本技术领域的普通技术人员来说，在获知本发明中记载内容后，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对其作出若干同等变换和替代，这些同等变换和替代也应视为属于本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一种薄壳山核桃染色体核型分析方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤S1.取材：在晴朗天气，于上午7:30～8:45或9:30，取薄壳山核桃植株侧芽或顶芽；
步骤S2.预处理：将采集的侧芽或顶芽使用0.01％的秋水仙素处理4～6h，或使用0.01％的秋水仙素+2mmol8-羟基喹啉等体积混合液处理4～6h；
步骤S3.固定：将预处理后的侧芽或顶芽放入卡诺固定液中固定24h以上、且不超过半年；
步骤S4.解离：倒去固定液，使用1mol/L盐酸60℃水浴加热解离7～9min；
步骤S5.染色：将材料转移至载玻片，使用卡宝品红溶液染色2h；
步骤S6.压片：将染色后的材料和载玻片置于吸水纸上，用镊子盖上盖玻片，赶走气泡，使细胞分散压平；
步骤S7.镜检：将压片置于ZEISS Scope A1显微镜及Prog Res C5CCD下进行镜检、拍照。
2.根据权利要求1所述的薄壳山核桃染色体核型分析方法，其特征在于：所述预处理过程是在4℃的遮光环境下进行的。
3.根据权利要求1所述的薄壳山核桃染色体核型分析方法，其特征在于：所述卡诺固定液为无水乙醇和冰乙酸的混合液，且无水乙醇与冰乙酸的体积比为3:1。
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